CN110036023B - Nkx3.2片段和包含其作为活性成分的药物组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及在关节炎的组织病理学环境下具有改善的稳定性的Nkx3.2片段和含有其作为活性成分的药物组合物。本发明的Nkx3.2片段具有与全长Nkx3.2相似水平的激活NF‑κB的功能和Siah1对蛋白水解的抗性。此外，在基于动物模型的体内功效评价中，与Nkx3.2相比，Nkx3.2片段在退行性关节炎治疗效果方面至少提高10倍。因此，Nkx3.2片段可以有利地用于预防或治疗关节炎。

Description

Nkx3.2片段和包含其作为活性成分的药物组合物
技术领域
本发明涉及在关节炎的病理组织环境下具有改善的稳定性的Nkx3.2片段，以及包含其作为活性成分的药物组合物。
背景技术
退行性关节炎是最常发生的关节炎之一，它是这样的疾病，其中退行性变化损害软骨组织，所述软骨组织保护形成关节的关节、骨骼和韧带等，从而导致炎症和疼痛。通常，主要通过控制炎症来进行退行性关节炎的治疗。然而，已经证明炎症的控制不是基本的治疗技术。
因此，为了治疗退行性关节炎的病因，需要鉴定调节软骨细胞的产生、分化、死亡、钙化等过程的靶标，以及开发控制靶标的方法。
同时，已经显示过表达的Nkx3.2(NK3同源框2)抑制由退行性关节炎引起的软骨组织的丧失，因此该蛋白质可用于治疗退行性关节炎。在这方面，韩国专利号为10-1150900的专利描述了用于治疗关节炎的组合物，关节炎诊断试剂盒，或使用Nkx3.2蛋白筛选关节炎治疗剂的方法。
此外，已经显示Nkx3.2蛋白的降解由印度刺猬因子(Ihh)信号传导促进，其在软骨细胞的肥大和钙化过程中被激活，这种现象由蛋白水解酶Siah1介导。此外，已经显示印度刺猬因子信号传导随着伴随软骨细胞钙化的退行性关节炎的发展而增加，并且控制印度刺猬因子信号传导抑制动物模型中退行性关节炎的进展。
具体实施方式
技术问题
本发明人进行了研究以使用能够在退行性关节炎的病理环境下有效起作用的Nkx3.2变体开发用于退行性关节炎的治疗剂。因此，本发明人产生了对Siah1诱导的蛋白水解具有抗性的Nkx3.2片段。本发明人还发现上述Nkx3.2片段可以在与全长Nkx3.2相当的水平诱导NF-κB活化。此外，本发明人发现，与全长Nkx3.2相比，Nkx3.2片段显示出显著改善的针对退行性关节炎的治疗功效。
解决方案
为了实现上述目的，本发明提供了由下式(I)表示的多肽：
N末端延伸结构域-核心结构域-C末端延伸结构域(I)，
在上式(I)中，
核心结构域是包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽；
N末端延伸结构域是包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的多肽，其中从SEQ ID NO：35的第1位氨基酸开始，1至53个氨基酸从N末端至C末端方向连续缺失；和
C末端延伸结构域是包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的多肽，其中从SEQ ID NO：5的第24位氨基酸开始，1至23个氨基酸从C末端至N末端方向连续缺失。
本发明还提供了由下式(II)表示的多肽：
N末端延伸结构域-核心结构域-C-末端延伸结构域(II)，
在上式(II)中，
核心结构域是包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的多肽；
N末端延伸结构域是包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的多肽，其中从SEQ ID NO：39的第1位氨基酸开始，1至41个氨基酸从N末端至C末端方向连续缺失；和
C末端延伸结构域是包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的多肽，其中从SEQ ID NO：41的第16位氨基酸开始，1至15个氨基酸从C末端至N末端方向连续缺失。
此外，本发明提供了编码上述多肽的多核苷酸。
此外，本发明提供了包含上述多核苷酸的表达载体。
此外，本发明提供了含有上述表达载体的宿主细胞。
此外，本发明提供用于预防或治疗关节炎的药物组合物，其包含任何上述多肽作为活性成分。
此外，本发明提供了包含上述多核苷酸的重组病毒。
此外，本发明提供用于预防或治疗关节炎的药物组合物，其包含任何上述重组病毒作为活性成分。
此外，本发明提供预防或治疗关节炎的方法，包括将上述药物组合物给予有需要的受试者的步骤。
本发明的有益效果
本发明的Nkx3.2片段具有以与全长Nkx3.2相当水平的激活NF-κB的功能，并且对Siah1介导的蛋白水解具有抗性。此外，与基于动物模型的体内功效评价中的全长Nkx3.2相比，上述Nkx3.2片段表现出改善的抗退行性关节炎的治疗效果。因此，Nkx3.2片段可以有效地用于预防或治疗关节炎。
附图简要说明
图1显示了Nkx3.2片段对Siah1介导的蛋白水解的抗性的照片说明。
图2显示了Nkx3.2片段与IκBα结合的照片说明。
图3显示了Nkx3.2片段诱导IκBα降解的照片说明。
图4显示了Nkx3.2片段激活NF-κB转录活性的图。
图5描绘了由Nkx3.2诱导的NF-κ活化过程的分子机制的示意图。
图6是使用退行性关节炎诱导的动物模型评估Nkx3.2片段的治疗效果的动物实验程序的示意图。
图7显示了对受影响区域中表达的Nkx3.2或Nkx3.2片段的退行性关节炎的治疗功效的组织病理学评价的照片说明。
图8显示了基于通过组织学分析获得的总体数据的定量评估，在0至5的范围内退行性关节炎的严重性的图。
实施本发明的最佳方式
在下文中，将详细描述本发明。
本发明提供由下式(I)表示的多肽：
N末端延伸结构域-核心结构域-C末端延伸结构域(I)，
在上式(I)中
核心结构域是包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽；
N末端延伸结构域是包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的多肽，其中从SEQ ID NO：35的第1位氨基酸开始，1至53个氨基酸从N末端至C末端方向连续缺失；和
C末端延伸结构域是包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的多肽，其中从SEQ ID NO：5的24位氨基酸开始，1至23个氨基酸从C末端至N末端方向连续缺失。
核心结构域是包含全长Nkx3.2蛋白的第166位至第309位的氨基酸序列的多肽。全长Nkx3.2蛋白可包括SEQ ID NO：7的氨基酸序列，并且核心结构域可包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
N-末端延伸结构域是与上述核心结构域的N-末端结合的结构域，并且是包含全长Nkx3.2蛋白的第112位至第165位的氨基酸序列的多肽。N-末端延伸结构域可包括SEQ IDNO：35的氨基酸序列。
N-末端延伸结构域可以是包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的多肽，或包含SEQ IDNO：35的氨基酸序列的多肽，其中从SEQ ID NO：35的第1位氨基酸开始，从N末端至C末端方向缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、或53个氨基酸。在本发明的一些实施方案中，N-末端延伸结构域可以是包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的多肽，或包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的多肽，其中从SEQ ID NO：35的第1位氨基酸开始，11、18、38、41、44、47、50、或53个氨基酸残基从N末端至C末端方向缺失。
C末端延伸结构域是与上述核心结构域的C末端结合的结构域，并且是包含全长Nkx3.2蛋白质的310至333位氨基酸序列的多肽。C末端延伸结构域可包括SEQ ID NO：5的氨基酸序列。
C末端延伸结构域可以是包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的多肽，或包含SEQ IDNO：5的氨基酸序列的多肽，其中从SEQ ID NO：5的第24位氨基酸开始，从C末端至N末端方向缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、或23个氨基酸残基。
具体地，C末端延伸结构域可以是包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的多肽，或包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的多肽，其中从SEQ ID NO：5的第24位氨基酸开始，从C末端至N末端方向缺失13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、或23个氨基酸残基。
在本发明的一些实施方案中，C末端延伸结构域可以是包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的多肽，或包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的多肽，其中从SEQ ID NO：5的第24位氨基酸开始，从C-末端到N末端方向缺失13、15、17、19、21或23个氨基酸残基。
氨基酸残基的缺失可以发生在N-末端延伸结构域和C-末端延伸结构域中的任一个或两个中。在某些实施方案中，多肽可包括SEQ ID NO：13、14、20、21、22、23、24、25、26、27或28的氨基酸序列。
本发明提供了包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列或其片段的多肽。该片段可以是包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的多肽，其中从SEQ ID NO：13的第1位氨基酸开始，从N末端到C末端方向连续缺失1至53个氨基酸。另外，该片段可以是包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的多肽，其中从SEQ ID NO：13的第333位氨基酸开始，从C末端到N末端方向连续缺失1至23个氨基酸。
在本发明的其他实施方案中，多肽可包括SEQ ID NO：13的氨基酸序列。此外，多肽可以是包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的多肽，其中从SEQ ID NO：13的第1位氨基酸开始，从N末端到C末端方向缺失11、18、38、41、44、47、50或53个氨基酸残基。另外，多肽可以是包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的多肽，其中从SEQ ID NO：13的第333位氨基酸开始，从C末端到N末端方向缺失13、15、17、19、21或23个氨基酸残基。另外，多肽可以是包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的多肽，其中从SEQ ID NO：13的第333位氨基酸开始，从C末端到N末端方向缺失13、15、17、19、21或23个氨基酸残基。
此外，本发明提供由下式(II)表示的多肽：
N末端延伸结构域-核心结构域-C-末端延伸结构域(II)，
在上式(II)中，
核心结构域是包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的多肽；
N末端延伸结构域是包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的多肽，其中从SEQ ID NO：39的第1位氨基酸开始，1至41个氨基酸从N末端到C末端方向连续缺失；和
C末端延伸结构域是包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的多肽，其中从SEQ ID NO：41的第16位氨基酸开始，1至15个氨基酸从C末端到N末端方向连续缺失。
核心结构域是包含全长Nkx3.2蛋白的第154位至第317位的氨基酸序列的多肽。全长Nkx3.2蛋白可包括SEQ ID NO：7的氨基酸序列，并且核心结构域可包括SEQ ID NO：37的氨基酸序列。
N-末端延伸结构域是与上述核心结构域的N-末端结合的结构域，并且是包含全长Nkx3.2蛋白的第112位至第153位的氨基酸序列的多肽。N-末端延伸结构域可包括SEQ IDNO：39的氨基酸序列。
N-末端延伸结构域可以是包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的多肽，或包含SEQ IDNO：39的氨基酸序列的多肽，其中从SEQ ID NO：39的第1位氨基酸开始，从N末端到C末端方向缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40或41个氨基酸残基。在本发明的实施方案中，N-末端延伸结构域可以是包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的多肽，或包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的多肽，其中从SEQ ID NO：39的第1位氨基酸开始，从N末端到C末端方向缺失11、18、38或41个氨基酸残基。
C末端延伸结构域是与上述核心结构域的C末端结合的结构域，并且是包含全长Nkx3.2蛋白质的第318位至第333位的氨基酸序列的多肽。C末端延伸结构域可包括SEQ IDNO：41的氨基酸序列。
C末端延伸结构域可以是包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的多肽，或包含SEQ IDNO：41的氨基酸序列的多肽，其中从SEQ ID NO：41的第16位氨基酸开始，从C末端到N末端方向缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸残基。
具体地，C末端延伸结构域可以是包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的多肽，其中从SEQ ID NO：41的第16位氨基酸开始，从C末端到N末端方向缺失13或15个氨基酸残基。
在本发明的实施方案中，C末端延伸结构域可以是包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的多肽，或包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的多肽，其中从SEQ ID NO：41的第16位氨基酸开始，从C末端至N末端方向缺失3、6、9、13或15个氨基酸残基。
由上式(I)或(II)表示的多肽是Nkx3.2蛋白的片段，并且不天然存在于活体中。然而，多肽在体内不易降解，同时具有与全长Nkx3.2蛋白相当的活性，因此可以比全长Nkx3.2在体内存在更长，表现出优异的活性。
本发明提供了编码由上式(I)或(II)表示的多肽的多核苷酸。
本发明的多核苷酸编码核心结构域、N-末端延伸结构域、C末端延伸结构域，其可分别包括SEQ ID NO：2或38、SEQ ID NO：36或40、和SEQ ID NO：6或42的核苷酸序列。
多核苷酸可包括如上所述的多核苷酸，其编码通过缺失N-末端延伸结构域和C-末端延伸结构域中的氨基酸残基而获得的片段。此处，多核苷酸可包括用表达SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：5的多肽的另一核苷酸序列取代的多核苷酸。
另外，多核苷酸可包括如上所述的多核苷酸，其编码通过缺失N-末端延伸结构域和C-末端延伸结构域中的氨基酸残基而获得的片段。此处，多核苷酸可包括用另一种表达SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：41的多肽的核苷酸序列取代的多核苷酸。
本发明提供了包含多核苷酸的表达载体。
表达载体可以是质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体或病毒载体。表达载体可以由本领域普通技术人员构建，使得本发明的多核苷酸可以在其中表达和分泌。
此外，本发明提供了携带表达载体的宿主细胞。
宿主细胞是用包含本发明的多核苷酸的表达载体转染的细胞，并且可以是原核细胞或真核细胞。具体地，宿主细胞可以是哺乳动物细胞。可以使用本领域已知的方法进行转染。同时，原核细胞的实例可以是大肠杆菌，真核细胞的实例可以是酵母。另外，哺乳动物细胞可以是NS/0骨髓瘤细胞、293细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、HeLa细胞、CapT细胞(人羊水来源细胞)或COS细胞。
本发明提供了包含本文提供的多核苷酸的重组病毒。
病毒可以是选自腺病毒、腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒和痘苗病毒中的任何一种。具体地，病毒可以是腺相关病毒(AAV)。腺相关病毒不限于特定血清型，并且在一些实施方案中，AAV可以是AAV1至AAV9中的任何一种。
由于腺相关病毒(AAV)能够感染非分裂细胞并且具有感染各种类型细胞的能力，因此腺相关病毒适合用作本发明的基因传递系统。例如，在美国专利号5,139,941和4,797,368中描述了AAV载体的制备和用途的细节。
通常，AAV可以通过共转染质粒来产生，所述质粒包含侧翼为两个AAV末端重复序列的目的基因序列和包含不包含末端重复序列的野生型AAV编码序列的表达质粒。
在本发明的实施方案中，本发明人生产了Nkx3.2片段，并发现片段不被Siah1降解(图1)。本发明人还发现本文提供的Nkx3.2片段通过与IκBα结合诱导IκBα的降解(图2和3)并诱导NF-κB的转录激活(图4)。此外，本发明人发现，当将包含编码Nkx3.2片段的多核苷酸的腺相关病毒给予退行性关节炎诱导的小鼠时，恢复受损的软骨组织(图7和8)。因此，本发明的Nkx3.2片段可以有效地用于预防或治疗关节炎。
本发明提供用于预防或治疗关节炎的药物组合物，其包含本文提供的多肽作为活性成分。具体地，本发明提供用于预防或治疗关节炎的药物组合物，其包含本文提供的Nkx3.2片段作为活性成分。
Nkx3.2片段可以是由下式(I)表示的多肽：
N-末端延伸结构域-核心结构域-C末端延伸结构域(I)，
在上式(I)中，
核心结构域是包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽；
N-末端延伸结构域是包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的多肽，其中从SEQ ID NO：35的第1位氨基酸开始，1至53个氨基酸从N-末端到C-末端方向连续缺失；和
C末端延伸结构域是包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的多肽，其中从SEQ ID NO：5的第24位氨基酸开始，1至23个氨基酸从C末端到N末端方向连续缺失。
核心结构域是包含全长Nkx3.2蛋白的第166位至第309位的氨基酸序列的多肽。全长Nkx3.2蛋白可包括SEQ ID NO：7的氨基酸序列，并且核心结构域可包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
N-末端延伸结构域是与上述核心结构域的N-末端结合的结构域，并且是包含全长Nkx3.2蛋白的第112位至第165位的氨基酸序列的多肽。N-末端延伸结构域可包括SEQ IDNO：35的氨基酸序列。
N-末端延伸结构域可以是包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的多肽，或包含SEQ IDNO：35的氨基酸序列的多肽，其中从SEQ ID NO：35的第1位氨基酸开始，从N末端到C末端方向缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52或53个氨基酸残基。在本发明的实施方案中，N-末端延伸结构域可以是包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的多肽，或包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的多肽，其中从SEQ ID NO：35的1位氨基酸开始，从N末端到C末端方向缺失11、18、38、41、44、47、50或53个氨基酸残基。
C末端延伸结构域是与上述核心结构域的C末端结合的结构域，并且是包含全长Nkx3.2蛋白质的310位至333位的氨基酸序列的多肽。C末端延伸结构域可包括SEQ ID NO：5的氨基酸序列。
C末端延伸结构域可以是包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的多肽，或包含SEQ IDNO：5的氨基酸序列的多肽，其中从SEQ ID NO：5的第24位氨基酸开始，从C-末端到N-末端方向缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23个氨基酸残基。
具体地，C末端延伸结构域可以是包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的多肽，或包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的多肽，其中从SEQ ID NO：5的第24位氨基酸开始，从C-末端到N-末端方向缺失13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23个氨基酸残基。
在某些实施方案中，C末端延伸结构域可以是包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的多肽，或包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的多肽，或包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的多肽，其中从SEQ ID NO：5的第24位氨基酸开始，从C末端到N末端方向缺失13、15、17、19、21或23个氨基酸残基。
氨基酸残基的缺失可以发生在N-末端延伸结构域和C-末端延伸结构域中的任一个或两个中。在一些实施方案中，多肽可包括SEQ ID NO：13、14、20、21、22、23、24、25、26、27或28的氨基酸序列。
本发明提供了包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列或其片段的多肽。该片段可以是包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的多肽，其中从SEQ ID NO：13的第1位氨基酸开始，从N末端到C末端方向连续缺失1至53个氨基酸。另外，该片段可以是包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的多肽，其中从SEQ ID NO：13的333位氨基酸开始，从C末端到N末端方向连续缺失1至23个氨基酸。
在本发明的实施方案中，多肽可包括SEQ ID NO：13的氨基酸序列。此外，多肽可以是包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的多肽，其中，从SEQ ID NO：13的第1位氨基酸开始，从N末端到C末端方向缺失11、18、38、41、44、47、50或53个氨基酸残基。另外，多肽可以是包含SEQ ID NO：13的氨基酸序列的多肽，其中从SEQ ID NO：13的第333位氨基酸开始，从C末端到N末端方向缺失13、15、17、19、21或23个氨基酸残基。
另外，Nkx3.2片段可以是由下式(II)表示的多肽：
N末端延伸结构域-核心结构域-C-末端延伸结构域(II)，
在上式(II)中，
核心结构域是包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的多肽；
N末端延伸结构域是包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的多肽，其中，从SEQ ID NO：39的第1位氨基酸开始，1至41个氨基酸从N末端到C末端方向连续缺失；和
C末端延伸结构域是包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的多肽，其中从SEQ ID NO：41的16位氨基酸开始，1至15个氨基酸从C末端至N末端方向连续缺失。
核心结构域是包含全长Nkx3.2蛋白的第154位至第317位的氨基酸序列的多肽。全长Nkx3.2蛋白可包括SEQ ID NO：7的氨基酸序列，并且核心结构域可包括SEQ ID NO：37的氨基酸序列。
N-末端延伸结构域是与上述核心结构域的N-末端结合的结构域，并且是包含全长Nkx3.2蛋白的第112位至第153位的氨基酸序列的多肽。N-末端延伸结构域可包括SEQ IDNO：39的氨基酸序列。
N-末端延伸结构域可以是包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的多肽，或包含SEQ IDNO：39的氨基酸序列的多肽，其中从SEQ ID NO：39的第1位的氨基酸开始，从N末端到C末端方向缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40或41个氨基酸残基。在本发明的实施方案中，N-末端延伸结构域可以是包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的多肽，或包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的多肽，其中从SEQ ID NO：39的1位氨基酸开始，11、18、38或41个氨基酸残基从N-末端到C-末端方向缺失。
C末端延伸结构域是与上述核心结构域的C末端结合的结构域，并且是包含全长Nkx3.2蛋白质的第318位至第333位的氨基酸序列的多肽。C末端延伸结构域可包括SEQ IDNO：41的氨基酸序列。
C末端延伸结构域可以是包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的多肽，或包含SEQ IDNO：41的氨基酸序列的多肽，其中从SEQ ID NO：41的第16位氨基酸开始，从C-末端到N-末端方向缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸残基。
具体地，C末端延伸结构域可以是包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的多肽，其中从SEQ ID NO：41的第16位氨基酸开始，13或15个氨基酸残基从C末端到N末端方向缺失。
在本发明的实施方案中，C末端延伸结构域可以是包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的多肽，或者包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的多肽，其中从SEQ ID NO：41的16位氨基酸开始，3、6、9、13个或15个氨基酸残基从C末端到N末端方向缺失。
由上式(I)或(II)表示的多肽是Nkx3.2蛋白的片段，并且不天然存在于活体中。然而，该多肽在体内不易降解，同时具有与全长Nkx3.2蛋白相当的活性，因此可以比全长Nkx3.2在体内存在更长，表现出优异的活性。
Nkx3.2片段可以通过用表达载体转染的宿主细胞获得，所述表达载体包括编码由(I)或(II)表示的多肽的多核苷酸。
多核苷酸编码上述核心结构域、N-末端延伸结构域和C-末端延伸结构域，其可包括SEQ ID NO：2或38、SEQ ID NO：36或40的核苷酸序列，和SEQ ID NO：6或42的核苷酸序列。
多核苷酸可包括如上所述的多核苷酸，其编码通过缺失N-末端延伸结构域和C-末端延伸结构域中的氨基酸残基而获得的片段。此处，多核苷酸可包括用表达SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：5的多肽的另一核苷酸序列取代的多核苷酸。
另外，多核苷酸可包括如上所述的多核苷酸，其编码通过缺失N-末端延伸结构域和C-末端延伸结构域中的氨基酸残基而获得的片段。此处，多核苷酸可包括用另一种表达SEQ ID NO：37，SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：41的多肽的核苷酸序列取代的多核苷酸。
表达载体可以是质粒载体、粘粒载体、噬菌体载体或病毒载体。表达载体可以由本领域普通技术人员构建，使得本发明的多核苷酸可以在其中表达和分泌。
宿主细胞是用包含本发明的多核苷酸的表达载体转染的细胞，并且可以是原核细胞或真核细胞。具体地，宿主细胞可以是哺乳动物细胞。转染可以通过本领域已知的方法进行。同时，原核细胞的实例可以是大肠杆菌，真核细胞的实例可以是酵母。另外，哺乳动物细胞可以是NS/O骨髓瘤细胞、293细胞、中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)、HeLa细胞、CapT细胞(人羊水来源细胞)或COS细胞。
关节炎可以是选自骨关节炎、类风湿性关节炎、退行性关节炎、痛风性关节炎、幼年型关节炎、衰老性关节炎、反应性关节炎及其组合中的任何一种。
相对于药物组合物的总重量，药物组合物可以包含0.1％至99％重量、1％至90％重量、和10％至80％重量的本发明多肽作为活性成分。此外，本发明的药物组合物还可包含一种或多种除上述活性成分外还具有相同或相似功能的活性成分。
除了上述活性成分之外，本发明的药物组合物还可以包含一种或多种药学上可接受的给药载体。
用于预防或治疗关节炎的药物组合物的剂量，其包括Nkx 3.2片段作为活性成分，可以根据各种因素进行调整，包括疾病类型、疾病严重程度、药物组合物中包含的活性成分和其他成分的类型和含量、制剂类型、患者年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食、给药时间、给药途径、治疗时间和同时使用的药物。
然而，为了期望的效果，包含在本发明的药物组合物中的多肽的剂量可以是0.0001至100mg/kg。此处，给药可以每天进行一次或分成几次。
本发明提供用于预防或治疗关节炎的药物组合物，其包含重组病毒作为活性成分。具体地，本发明提供用于预防或治疗关节炎的药物组合物，其包含作为活性成分的重组病毒，其包含编码Nkx3.2片段的多核苷酸。
装载在重组病毒上的多核苷酸可以编码由下式(I)表示的多肽：
N-末端延伸结构域-核心结构域-C-末端延伸结构域(I)，
在上式(I)中，
核心结构域是包含SEQ ID NO：1的氨基酸序列的多肽；
N-末端延伸结构域是包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的多肽，其中从SEQ ID NO：35的1位氨基酸开始，1至53个氨基酸从N末端至C末端方向连续缺失；和
C末端延伸结构域是包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的多肽，其中从SEQ ID NO：5的24位氨基酸开始，1至23个氨基酸从C末端到N末端方向连续缺失。
核心结构域是包含全长Nkx3.2蛋白的第166位至第309位的氨基酸序列的多肽。全长Nkx3.2蛋白可包括SEQ ID NO：7的氨基酸序列，并且核心结构域可包括SEQ ID NO：1的氨基酸序列。
N-末端延伸结构域是与上述核心结构域的N-末端结合的结构域，并且是包含全长Nkx3.2蛋白的第112位至第165位的氨基酸序列的多肽。N-末端延伸结构域可包括SEQ IDNO：35的氨基酸序列。
N-末端延伸结构域可以是包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的多肽，或者包含SEQID NO：35的氨基酸序列的多肽，其中从SEQ ID NO：35的第1位氨基酸开始，从N末端到C末端方向缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52或53个氨基酸残基。在本发明的实施方案中，N-末端延伸结构域可以是包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的多肽，或者包含SEQ ID NO：35的氨基酸序列的多肽，其中从SEQ ID NO：35的第1位氨基酸开始，从N末端到C末端方向缺失11、18、38、41、44、47、50或53个氨基酸残基。
C末端延伸结构域是与上述核心结构域的C末端结合的结构域，并且是包含全长Nkx3.2蛋白质的310位至333位的氨基酸序列的多肽。C末端延伸结构域可包括SEQ ID NO：5的氨基酸序列。
C末端延伸结构域可以是包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的多肽，或者包含SEQ IDNO：5的氨基酸序列的多肽，其中从SEQ ID NO：5的第24位氨基酸开始，从C-末端到N-末端方向缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23个氨基酸残基。
具体地，C末端延伸结构域可以是包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的多肽，或者包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的多肽，其中从SEQ ID NO：5的第24位氨基酸开始，从C-末端到N-末端方向缺失13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23个氨基酸残基。
在本发明的实施方案中，C末端延伸结构域可以是包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的多肽，或包含SEQ ID NO：5的氨基酸序列的多肽，其中从氨基酸开始在SEQ ID NO：5的第24位，从C-末端到N末端方向缺失13、15、17、19、21或23个氨基酸残基。
氨基酸残基的缺失可以发生在N-末端延伸结构域和C-末端延伸结构域中的任一个或两个中。在本发明的实施方案中，多肽可包括SEQ ID NO：13、14、20、21、22、23、24、25、26、27或28的氨基酸序列。
另外，加载在重组病毒上的多核苷酸可以编码由下式(II)表示的多肽：
N末端延伸结构域-核心结构域-C-末端延伸结构域(II)，
在上式(II)中，
核心结构域是包含SEQ ID NO：37的氨基酸序列的多肽；
N末端延伸结构域是包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的多肽，其中从SEQ ID NO：39的第1位氨基酸开始，1至41个氨基酸从N末端到C末端方向连续缺失；和
C末端延伸结构域是包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的多肽，其中从SEQ ID NO：41的第16位氨基酸开始，1至15个氨基酸从C末端至N末端方向连续缺失。
核心结构域是指包含全长Nkx3.2蛋白的第154位至第317位的氨基酸序列的多肽。全长Nkx3.2蛋白可包括SEQ ID NO：7的氨基酸序列，并且核心结构域可包括SEQ ID NO：37的氨基酸序列。
N-末端延伸结构域是与上述核心结构域的N-末端结合的结构域，并且是包含全长Nkx3.2蛋白的第112位至第153位的氨基酸序列的多肽。N-末端延伸结构域可包括SEQ IDNO：39的氨基酸序列。
N-末端延伸结构域可以是包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的多肽，或包含SEQ IDNO：39的氨基酸序列的多肽，其中从SEQ ID NO：39的第1位的氨基酸开始，从N末端到C末端方向缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40或41个氨基酸残基。在本发明的实施方案中，N-末端延伸结构域可以是包含SEQ ID NO：39的氨基酸序列的多肽，或者包含SEQ IDNO：39的氨基酸序列的多肽，其中从SEQ ID NO：39的1位氨基酸开始，11、18、38或41个氨基酸残基从N-末端到C-末端方向缺失。
C末端延伸结构域是与上述核心结构域的C末端结合的结构域，并且是包含全长Nkx3.2蛋白质的第318位至第333位的氨基酸序列的多肽。C末端延伸结构域可包括SEQ IDNO：41的氨基酸序列。
C末端延伸结构域可以是包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的多肽，或包含SEQ IDNO：41的氨基酸序列的多肽，其中从SEQ ID NO：41的第16位氨基酸开始，从C-末端到N-末端方向缺失1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15个氨基酸残基。
具体地，C末端延伸结构域可以是包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的多肽，其中从SEQ ID NO：41的第16位氨基酸开始，13或15个氨基酸残基从C末端到N末端方向缺失。
在本发明的一个实施方案中，C末端延伸结构域可以是包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的多肽，或包含SEQ ID NO：41的氨基酸序列的多肽，其中从SEQ ID NO：41的16位氨基酸开始，从C末端至N末端方向缺失3、6、9、13或15个氨基酸残基。
由上式(I)或(II)表示的多肽是Nkx3.2蛋白的片段，并且不存在于体内。然而，该多肽在体内不易降解，同时具有与全长Nkx3.2蛋白相同的活性，因此比全长Nkx3.2存在于体内更长以显示出优异的活性。
包含编码Nkx3.2片段的多核苷酸的重组病毒可以通过用表达载体转染的宿主细胞获得，所述表达载体包括编码由(I)或(II)表示的多肽的多核苷酸。
多核苷酸编码上述核心结构域、N-末端延伸结构域和C-末端延伸结构域，其可以分别包括SEQ ID NO：2或38、SEQ ID NO：36或40和SEQ ID NO：6或42的核苷酸序列。
多核苷酸可包括如上所述的多核苷酸，其编码通过缺失N-末端延伸结构域和C-末端延伸结构域中的氨基酸残基而获得的片段。此处，多核苷酸可包括用表达SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：35或SEQ ID NO：5的多肽的另一核苷酸序列取代的多核苷酸。
另外，多核苷酸可包括如上所述的多核苷酸，其编码通过缺失N-末端延伸结构域和C-末端延伸结构域中的氨基酸残基而获得的片段。此处，多核苷酸可包括用另一种表达SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：39或SEQ ID NO：41的多肽的核苷酸序列取代的多核苷酸。
多核苷酸可包括编码SEQ ID NO：13、14、20、21、22、23、24、25、26、27或28的氨基酸序列的核苷酸序列。
病毒可以是选自腺病毒、腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒、慢病毒、单纯疱疹病毒和痘苗病毒中的任何一种。具体地，病毒可以是腺相关病毒(AAV)。腺相关病毒不限于特定血清型，并且优选地，可以是AAV1至AAV9中的任何一种。
由于腺相关病毒(AAV)能够感染非分裂细胞并且具有感染各种类型细胞的能力，因此腺相关病毒适合用作本发明的基因传递系统。AAV载体的制备和用途的细节描述于美国专利号5,139,941和4,797,368中。
通常，AAV可以通过共转染质粒来产生，所述质粒包含侧翼为两个AAV末端重复序列的目的基因序列和包含不具有末端重复序列的野生型AAV编码序列的表达质粒。
关节炎可以是选自骨关节炎、类风湿性关节炎、退行性关节炎、痛风性关节炎、幼年型关节炎、衰老性关节炎、反应性关节炎及其组合中的任何一种。
除了上述活性成分之外，本发明的药物组合物还可以包含一种或多种药学上可接受的给药载体。
用于预防或治疗关节炎的药物组合物的剂量，其包括Nkx 3.2片段作为活性成分，可以根据各种因素进行调整，包括疾病类型、疾病严重程度、药物组合物中包含的活性成分和其他成分的类型和含量、制剂类型、患者年龄、体重、一般健康状况、性别和饮食、给药时间、给药途径、治疗时间和同时使用的药物。
然而，对于期望的效果，在成人的情况下，包含在本发明的药物组合物中的重组病毒可以每天1.0×105至1.0×1015个病毒基因组的量施用。具体地，本发明的药物组合物的剂量可以是这样的，在成人的情况下，每天给药量为1.0×105-1.0×1015、1.0×107-1.0×1013、1.0×108-1.0×1012、或1.0×109-1.0×1010。
本发明提供预防或治疗关节炎的方法，包括将药物组合物给予有需要的受试者的步骤。具体地，本发明提供预防或治疗关节炎的方法，包括向有需要的受试者施用用于预防或治疗关节炎的药物组合物的步骤，其包括作为活性成分的Nkx3.2片段或包含编码Nkx3.2片段的多核苷酸的重组病毒。
受试者可以是哺乳动物，特别是人。考虑到给药方法、体液的体积和粘度等，本领域技术人员可以适当地选择给药途径。具体地，可以关节内施用药物组合物。
药物组合物可以是关节内给药的。如本文所用，术语“关节内”是指通过关节囊封闭的腔进行给药，关节囊是关节中骨之间的间隙。有各种方法进行关节内给药。例如，存在一种方法，要求患者在躺着看天花板的姿势躺下时将膝盖弯曲90度，并在关节内插入注射器。在该姿势中，可以相对容易地手动区分内侧和外侧关节边界。注射可以在内部和外部关节边界中的任一个或两个处进行，并且主要朝向内侧关节边界进行。另外，还有一种以膝盖伸展的姿势进行注射的方法。对于这两种姿势，当注射器正确地插入预定的注射部位时，可以以很小的阻力注射注射溶液。然而，当按压注射器时，药物不能很好地进入，并且认识到耐药性或患者抱怨剧烈疼痛，应调整注射器的注射部位。
本发明提供了一种产生体内稳定性增加的Nkx3.2片段的方法，包括删除包含SEQID NO：7的氨基酸序列的多肽的任何一个区域的步骤，所述多肽选自下组：N端区域和C端区域，以及它们的组合。
从SEQ ID NO：7的第1位氨基酸开始，N末端区域的缺失可以是从N末端到C末端方向连续缺失1至165个氨基酸。具体地，缺失可以是从SEQ ID NO：7的第112位的氨基酸开始，从N末端到C末端方向连续缺失1至53个氨基酸。在本发明的一个实施方案中，从SEQ ID NO：7的第112位氨基酸开始，N末端区域的缺失可以使得从N末端到C末端方向缺失11、18、38、41、44、47、50或53个氨基酸残基。
从SEQ ID NO：7的第333位氨基酸开始，C末端区域的缺失可以是从C末端到N末端方向连续缺失1至23个氨基酸。在本发明的一个实施方案中，从SEQ ID NO：7的第333位氨基酸开始，C末端区域的缺失可以是从C末端到N末端方向缺失13、15、17、19、21或23个氨基酸残基。
氨基酸残基的缺失可以发生在N-末端区域和C-末端区域中的任一个或两个上。在本发明的一个实施方案中，Nkx3.2片段可包括SEQ ID NO：13、14、20、21、22、23、24、25、26、27或28的氨基酸序列。
氨基酸残基的缺失可以由本领域技术人员通过适当的方法进行。通过上述方法产生的体内稳定性增加的Nkx3.2片段在体内不易被Siah1降解，因此可以比野生型Nkx3.2蛋白存在于体内更长。
具体实施方式
在下文中，将通过以下实施例详细描述本发明。然而，以下实施例仅用于说明本发明，并且本发明不限于此。
实施例1.表达Nkx3.2片段的载体的构建
为了获得对Siah1介导的蛋白水解具有抗性的变体，通过以下方法构建表达Nkx3.2片段的载体。
具体地，使用具有SEQ ID NO：8所示核苷酸序列的Nkx3.2基因作为模板，并使用Lamp Pfu DNA聚合酶(Cat.#LP116-250，BIOFACT Co.，Ltd.，韩国)根据制造商的方案进行扩增。用限制酶EcoRI(Cat.#FD0274，赛默飞世尔科技公司，美国)和XhoI(Cat.#FD0694，赛默飞世尔科技公司，美国)或XbaI(Cat.#FD0684，赛默飞世尔科技公司，美国)切割每个扩增的PCR产物，分别使用T4连接酶(Cat.#EL0011，赛默飞世尔科技公司，美国)插入pCS表达载体(Addgene Cat#17095)中。
因此，构建表达20种Nkx3.2片段的表达载体，如下表1所示。
[表1]
名称 特征 SEQ ID NO
Nkx3.2(1-333) 全长Nkx3.2 SEQ ID NO:7
Nkx3.2(1-320) 第1至第320个氨基酸的Nkx3.2片段 SEQ ID NO:9
Nkx3.2(1-307) 含有第1至第307个氨基酸的Nkx3.2片段 SEQ ID NO:10
Nkx3.2(42-333) 含有第42至第333个氨基酸的Nkx3.2片段 SEQ ID NO:11
Nkx3.2(99-333) 含有第99至第333个氨基酸的Nkx3.2片段 SEQ ID NO:12
Nkx3.2(112-333) 含有第112至第333个氨基酸的Nkx3.2片段 SEQ ID NO:13
Nkx3.2(123-333) 含有第123至第333个氨基酸的Nkx3.2片段 SEQ ID NO:14
Nkx3.2(99-330) 含有第99至第330个氨基酸的Nkx3.2片段 SEQ ID NO:15
Nkx3.2(99-327) 含有第99至第327个氨基酸的Nkx3.2片段 SEQ ID NO:16
Nkx3.2(99-320) 含有第99至第320个氨基酸的Nkx3.2片段 SEQ ID NO:17
Nkx3.2(105-327) 含有第105至第327个氨基酸的Nkx3.2片段 SEQ ID NO:18
Nkx3.2(110-324) 含有第110至第324个氨基酸的Nkx3.2片段 SEQ ID NO:19
Nkx3.2(112-320) 含有第112至第320个氨基酸的Nkx3.2片段 SEQ ID NO:20
Nkx3.2(123-320) 含有第123至第320个氨基酸的Nkx3.2片段 SEQ ID NO:21
Nkx3.2(130-320) 含有第130至第320个氨基酸的Nkx3.2片段 SEQ ID NO:22
Nkx3.2(150-320) 含有第150至第320个氨基酸的Nkx3.2片段 SEQ ID NO:23
Nkx3.2(153-318) 含有第153至第318个氨基酸的Nkx3.2片段 SEQ ID NO:24
Nkx3.2(156-316) 含有第156至第316个氨基酸的Nkx3.2片段 SEQ ID NO:25
Nkx3.2(159-314) 含有第159至第314个氨基酸的Nkx3.2片段 SEQ ID NO:26
Nkx3.2(162-312) 含有第162至第312个氨基酸的Nkx3.2片段 SEQ ID NO:27
Nkx3.2(165-310) 含有第165至第310个氨基酸的Nkx3.2片段 SEQ ID NO:28
实施例2.选择对Siah1介导的蛋白水解具有抗性的Nkx3.2片段
使用表达实施例1中构建的Nkx3.2片段的表达载体，通过以下方法选择未被Siah1降解的Nkx3.2片段。
首先，以与实施例1中所述相同的条件和方法通过PCR扩增Siah1(SEQ ID NO：29；GenBank登录号AAH35562.1)，并用EcoRI和NcoI切割扩增的PCR产物。将所得产物插入pCS3HA表达载体(Addgene质粒#17095，在pCS2P+的EcoRI和ClaI位点之间插入具有3-HA表位标签的载体)，已经用相同的限制酶切割并且包含人流感血凝素(HA)氨基酸序列(SEQ ID NO：33；YPYDVPDYA)重复三次的标签，以构建表达Siah1的表达载体。
同时，将293T肾细胞系(Cat.#CRL-3216，ATCC，美国)在补充有10％(v/v)胎牛血清(FBS)的DMEM(Dulbecco改良的Eagle培养基)培养基中在37℃和5％CO2的条件下培养。将制备的细胞分配在60×15mm的细胞培养板上，使细胞数为5×105。使用2μg表达Nkx3.2的表达载体和4μg分别表达Nkx3.2片段的表达载体和2μg表达Siah1的表达载体瞬时转染细胞。根据制造商的方案使用VivaMagic(Cat.#VM001，VIVAGEN CO.，LTD.，韩国)进行转染。
从转染的细胞中分离整个蛋白质，并使用Bio-Rad Laboratories蛋白质试剂盒定量(Cat.#500-0116，Bio-Rad Laboratories，Inc.，美国)。然后，通过常规方法对Nkx3.2、Siah1和β-肌动蛋白中的每一种进行蛋白质印迹检测。此处，抗Nkx3.2抗体(Cat.#Ab83288，Abcam，英国)、抗HA抗体(Cat.#11583816001，罗氏，瑞士)、抗Myc抗体(Cat.#11667149001，罗氏，瑞士)和抗-β-肌动蛋白抗体(Cat.#LF-PA0207，AbFrontier，韩国)分别以1：1,000、1：5,000、1：5,000和1：5,000稀释，在含有3％(v/v)牛血清白蛋白(BSA)的TBST缓冲液中使用。结果，蛋白质印迹带的照片示于图1中，其总结于下表2中。
[表2]
Figure BDA0002054983640000201
Figure BDA0002054983640000211
如图1所示和表2所示，与全长Nkx3.2(1-333)不同，在片段Nkx3.2(1-320)、Nkx3.2(1-307)、Nkx 3.2(123-333)、Nkx 3.2(99-320)、Nkx 3.2(112-320)、Nkx 3.2(123-320)、Nkx 3.2(130-320)、Nkx3.2(150-320)和Nkx3.2(153-318)中没有发生Siah1对Nkx3.2蛋白质的降解。
实施例3.鉴定Nkx3.2片段是否与IκBα结合
Nkx3.2通过与IκBα结合诱导NF-κB活化。因此，免疫沉淀用于鉴定片段Nkx3.2(112-320)、Nkx 3.2(123-320)、Nkx 3.2(130-320)、Nkx 3.2(150-320)和Nkx 3.2(153-318)是否与IκBα结合。
首先，在与实施例1所述相同的条件和方法中通过PCR扩增IκBα(SEQ ID NO：31；GenBank登录号CAB65556)，并用EcoRI和XbaI切割扩增的PCR产物。将所得产物插入pCS6Myc表达载体(Addgene质粒#17095，在pCS2P+的EcoRI和ClaI位点之间插入6-Myc表位标签的载体)，该载体已用相同的限制酶切割并包含其中Myc氨基酸序列(SEQ ID NO：34：EQKLISEEDL)重复六次的标签，以构建表达表达IκBα的载体。
然后，使用8μg表达Nkx3.2(1-333)的表达载体和表达该片段的每种表达载体，以与实施例2中所述相同的条件和方法转染293T肾细胞系，如实施例1中制备的，与等量的表达IκBα的表达载体一起。此处，为了防止IκBα蛋白质被Nkx3.2蛋白质降解，以20μM的浓度添加作为蛋白酶体降解抑制剂的MG132(Cat.#474790，默克密理博，德国)。6小时后，从细胞中分离出整个蛋白质，免疫沉淀通过常规方法使用抗Myc抗体进行，所述抗Myc抗体识别用IκBα标记的Myc。然后，使用如上所述的抗体进行蛋白质印迹。获得的结果的照片示于图2中。
如图2所示，类似于全长Nkx3.2(1-333)，片段Nkx 3.2(112-320)、Nkx 3.2(123-320)、Nkx 3.2(130-320)、Nkx 3.2(150-320)和Nkx 3.2(153-318)形成条带。因此，Nkx3.2片段被鉴定为具有与IκBα结合形成复合物的功能，这是激活NF-κB所必需的。
实施例4.鉴定IκBα蛋白是否被Nkx3.2片段降解
Nkx3.2与IκBα结合，从而促进蛋白酶体对IκBα的泛素化和降解。因此，进行蛋白质印迹以鉴定片段Nkx3.2(112-320)、Nkx3.2(123-320)、Nkx3.2(130-320)、Nkx3.2(150-320)和Nkx3.2(153-318)是否保持这种活性。
同时，ATDC5软骨细胞系(Cat.#RCB0565，Riken，日本)在补充有10％(v/v)胎牛血清的DMEM/F12(Dulbecco改良的Eagle培养基：营养混合物F-12)培养基中在37℃和5％CO2的条件下培养。将制备的细胞分配在90×20mm的细胞培养板上，使细胞数为5×105。分别使用4μg表达Nkx3.2(1-333)的表达载体和8μg的各表达Nkx3.2片段的表达载体和1μg表达IκBα的表达载体瞬时转染细胞。根据制造商的方案使用VivaMagic(Cat.#VM001，VIVAGEN CO.，LTD.，韩国)进行转染。
随后的过程使得蛋白质印迹以与实施例2中所述相同的条件和方法进行，获得的结果的照片示于图3中。
如图3所示，片段Nkx 3.2(112-320)、Nkx 3.2(123-320)、Nkx 3.2(130-320)、Nkx3.2(150-320)和Nkx3.2(153-318)形成强度类似于全长Nkx3.2(1-333)的条带。因此，鉴定Nkx3.2片段以诱导IκBα的蛋白水解与全长Nkx3.2处于同一水平。
实施例5.鉴定NF-κB的转录功能是否被Nkx3.2片段激活
Nkx3.2通过诱导NF-κB激活来抑制软骨细胞的细胞死亡。因此，为了测定Nkx3.2片段对NF-κB的激活，使用MluI和XhoI将其中NF-κB特异性DNA结合位点(SEQ ID NO：35：GGGAATTTCC)重复四次的多核苷酸序列插入到pGL3-Basic载体(Cat.#E1751，Promega，美国)中以构建4x-κB-Luc表达载体。此外，表达载体用于通过分析荧光素酶活性来测定Nkx3.2对NF-κB的转录功能的激活。
首先，分别使用200ng表达全长Nkx3.2(1-333)的表达载体和表达Nkx3.2片段的每种表达载体、100ng 4x-κB-Luc表达载体和20ng pRL-TK表达载体(Cat.#E2241，Promega，美国)瞬时转染293T肾细胞系。
根据制造商的方案使用VivaMagic进行转染。24小时后，根据制造商的方案，使用双荧光素酶报告基因检测系统(Cat.#E1910，Promega，美国)进行荧光素酶测定。
具体地，除去转染的293T肾细胞系的培养物并用1×PBS洗涤。向其中加入150μl的1×被动裂解缓冲液(PLB)，并将细胞在室温下裂解15分钟。向10μl细胞裂解物中加入50μlLARII，使所得物反应。然后，测定萤火虫荧光素酶活性。向其中加入50μl的Stop&Glo并测定海肾荧光素酶活性。在实验结果中，对于每个样品，将海肾荧光素酶活性标准化为萤火虫荧光素酶活性，并且其平均百分比示于图4中。
如图4所示，当仅用pCS2载体作为阴性对照转染的细胞中的荧光素酶活性设定为1时，不仅全长Nkx3.2(1-333)而且片段Nkx3.2(112-320)、Nkx3.2(123-320)、Nkx3.2(130-320)、Nkx3.2(150-320)和Nkx3.2(153-318)表现出显著增加的荧光素酶活性。因此，Nkx3.2片段被鉴定为具有激活NF-κB转录功能的功能，其水平与全长相似。
实施例6：鉴定Nkx3.2片段对退行性关节炎的改善的治疗功效
通过上述体外实验，鉴定了Nkx3.2片段与全长Nkx3.2相比的功能优势。因此，为了鉴定Nkx3.2片段的体内功能的改善，比较和分析Nkx3.2片段(123-320)和全长Nkx3.2(1-333)对退行性关节炎的治疗效果。为此目的，选择一种通过称为内侧半月板不稳定(DMM)的外科手术诱导退行性关节炎的小鼠模型。在图6中示意性地示出了进行实验的过程。
具体地，切割膝盖组织中的内侧半月板韧带以引起内侧半月板的结构不稳定，从而使股骨软骨和胫骨软骨相互碰撞，从而诱导软骨损伤，从而诱导退行性关节炎。对于对照，使用通过模拟手术解剖并缝合膝盖的外皮和内皮的动物组。诱导退行性关节炎的动物组和进行模拟手术的对照生长8周。然后，将表达Nkx3.2片段(123-320)或全长Nkx3.2(1-333)的腺相关病毒(AAV)或空载体AAV关节内注射到相应的膝关节中，让动物组生长4周。通过组织病理学分析分析退行性关节炎的进展程度。
对于组织病理学分析，采用了番红-O染色方法。番红-O是阳离子化合物染色剂，有效地粘附于软骨硫酸乙酰肝素蛋白多糖的阴离子基团，从而呈现红色。红色深色染色区域被评估为健康状态下的软骨组织。相反，表现出弱或没有番红-O染色的部分和具有受损组织的部分被解释为退行性关节炎的病理学已经发展的病变。
如图7所示，在关节内注射空载体AAV的对照组的情况下，无论施用的病毒颗粒的量如何，都观察到极其严重的软骨损伤和变性现象。
在关节内注射表达全长Nkx3.2(1-333)的AAV的比较组的情况下，仅在A10施用组中以1×1010观察到显著的抗退行性关节炎的治疗功效。
相反，在关节内注射表达Nkx3.2片段(123-320)的AAV的实验组的情况下，AAV给药组在1.25×109处表现出对退行性关节炎的优异治疗效果，这是最低剂量。也就是说，在Nkx3.2片段(123-320)的情况下，与全长Nkx3.2(1-333)相比，鉴定抗退行性关节炎的治疗效果提高至少10倍。
定量评估通过组织病理学分析获得的所有数据，结果在图8中图示。每个实验组分析的动物数量为3，以0至5的等级评估退行性关节炎的严重程度。结果中准备了条形图。SEM的平均值由误差条表示。病毒颗粒剂量A，B，C和D分别为1.25×109、2.5×109、5×109和1×1010，以此递增顺序。
如图8所示，在关节内注射空载体AAV的对照组中，无论施用的病毒颗粒的量如何，都评估了4.5至5的高分。另外，在关节内注射表达全长Nkx3.2(1-333)的AAV的比较组中，在1×1010的AAV给药组中仅评估了1.5的低分。相反，在关节内注射表达Nkx3.2片段(123-320)的AAV的实验组中，从1.25×109的最低剂量的AAV施用组开始评估了1或更低的极低评分。即，与全长Nkx3.2(1-333)相比，Nkx3.2片段(123-320)被鉴定为具有优异的抗退行性关节炎的治疗功效。
序列表
<110> ICM株式会社
<120> Nkx3.2片段和包含其作为活性成分的药物组合物
<130> PCB710052ICM
<150> KR 2016/0149090
<151> 2016-11-09
<160> 42
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 144
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val Ser Ala Leu Cys Ser Gly Ala
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala Glu Glu Glu Glu
20 25 30
Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser Arg Ala Ala Phe
35 40 45
Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg Phe Asn His Gln Arg
50 55 60
Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala Ala Ser Leu Lys Leu
65 70 75 80
Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Tyr Lys Thr
85 90 95
Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser Ala Pro Ala Ala
100 105 110
Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val Arg Asp Asp Gln Arg Gln Tyr
115 120 125
Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu Pro Leu Gln Pro
130 135 140
<210> 2
<211> 432
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
ggtgttggcc ccagaggtgc acacgtgtcc gcgctgtgca gcggggccgg cggcgggggc 60
ggcagcgggc cggcaggcgt cgcggaggag gaggaggagc cggcggcgcc caagccacgc 120
aagaagcgct cgcgggccgc tttctcccac gcgcaggtct tcgagctgga gcgccgcttt 180
aaccaccagc gctacctgtc cgggcccgag cgcgcagacc tggccgcgtc gctgaagctc 240
accgagacgc aggtgaaaat ctggttccag aaccgtcgct acaagacaaa gcgccggcag 300
atggcagccg acctgctggc ctcggcgccc gccgccaaga aggtggccgt aaaggtgctg 360
gtgcgcgacg accagagaca atacctgccc ggcgaagtgc tgcggccacc ctcgcttctg 420
ccactgcagc cc 432
<210> 3
<211> 43
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Leu Ser Leu Gly Gln Pro Val Cys Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu
1 5 10 15
Glu Glu Glu Ala Ala Gly Arg Ser Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val
20 25 30
Ser Gly Asp Arg Ser Pro Arg Thr Glu Asp Asp
35 40
<210> 4
<211> 129
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ttgagcctcg gccagccggt ctgtgagctg gccgcttcca aagacctaga ggaggaagcc 60
gcgggccgga gcgacagcga gatgtccgcc agcgtctcag gcgaccgcag cccaaggacc 120
gaggacgac 129
<210> 5
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Ser Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Cys Leu Pro Gly Trp Ala Leu Ser Thr
1 5 10 15
Cys Ala Ala Ala Ala Gly Thr Gln
20
<210> 6
<211> 72
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
tcctactatt acccgtacta ctgcctccca ggctgggcgc tctccacctg cgcagctgcc 60
gcaggcaccc ag 72
<210> 7
<211> 333
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 7
Met Ala Val Arg Gly Ala Asn Thr Leu Thr Ser Phe Ser Ile Gln Ala
1 5 10 15
Ile Leu Asn Lys Lys Glu Glu Arg Gly Gly Leu Ala Ala Pro Glu Gly
20 25 30
Arg Pro Ala Pro Gly Gly Thr Ala Ala Ser Val Ala Ala Ala Pro Ala
35 40 45
Val Cys Cys Trp Arg Leu Phe Gly Glu Arg Asp Ala Gly Ala Leu Gly
50 55 60
Gly Ala Glu Asp Ser Leu Leu Ala Ser Pro Ala Gly Thr Arg Thr Ala
65 70 75 80
Ala Gly Arg Thr Ala Glu Ser Pro Glu Gly Trp Asp Ser Asp Ser Ala
85 90 95
Leu Ser Glu Glu Asn Glu Ser Arg Arg Arg Cys Ala Asp Ala Arg Gly
100 105 110
Ala Ser Gly Ala Gly Leu Ala Gly Gly Ser Leu Ser Leu Gly Gln Pro
115 120 125
Val Cys Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ala Gly
130 135 140
Arg Ser Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val Ser Gly Asp Arg Ser Pro
145 150 155 160
Arg Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val Ser Ala
165 170 175
Leu Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val
180 185 190
Ala Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg
195 200 205
Ser Arg Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg
210 215 220
Phe Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala
225 230 235 240
Ala Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn
245 250 255
Arg Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala
260 265 270
Ser Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val Arg Asp
275 280 285
Asp Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu
290 295 300
Leu Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Cys Leu Pro Gly
305 310 315 320
Trp Ala Leu Ser Thr Cys Ala Ala Ala Ala Gly Thr Gln
325 330
<210> 8
<211> 1002
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 8
atggctgtgc gcggcgccaa caccttgacg tccttctcca tccaggcgat cctcaacaag 60
aaagaggagc gcggcgggct ggccgcgcca gaggggcgcc cggcgcccgg gggcacagcg 120
gcatcggtgg ccgcggctcc cgctgtctgc tgttggcggc tctttgggga gagggacgcg 180
ggcgcgttgg ggggcgccga ggactctctg ctggcgtctc ctgccggtac cagaacagct 240
gcggggcgga ctgcggagag cccggaaggc tgggactcgg actccgcgct cagcgaggag 300
aacgagagca ggcggcgctg cgcggacgcg cggggggcca gcggggccgg ccttgcgggg 360
ggatccttga gcctcggcca gccggtctgt gagctggccg cttccaaaga cctagaggag 420
gaagccgcgg gccggagcga cagcgagatg tccgccagcg tctcaggcga ccgcagccca 480
aggaccgagg acgacggtgt tggccccaga ggtgcacacg tgtccgcgct gtgcagcggg 540
gccggcggcg ggggcggcag cgggccggca ggcgtcgcgg aggaggagga ggagccggcg 600
gcgcccaagc cacgcaagaa gcgctcgcgg gccgctttct cccacgcgca ggtcttcgag 660
ctggagcgcc gctttaacca ccagcgctac ctgtccgggc ccgagcgcgc agacctggcc 720
gcgtcgctga agctcaccga gacgcaggtg aaaatctggt tccagaaccg tcgctacaag 780
acaaagcgcc ggcagatggc agccgacctg ctggcctcgg cgcccgccgc caagaaggtg 840
gccgtaaagg tgctggtgcg cgacgaccag agacaatacc tgcccggcga agtgctgcgg 900
ccaccctcgc ttctgccact gcagccctcc tactattacc cgtactactg cctcccaggc 960
tgggcgctct ccacctgcgc agctgccgca ggcacccagt ga 1002
<210> 9
<211> 320
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Met Ala Val Arg Gly Ala Asn Thr Leu Thr Ser Phe Ser Ile Gln Ala
1 5 10 15
Ile Leu Asn Lys Lys Glu Glu Arg Gly Gly Leu Ala Ala Pro Glu Gly
20 25 30
Arg Pro Ala Pro Gly Gly Thr Ala Ala Ser Val Ala Ala Ala Pro Ala
35 40 45
Val Cys Cys Trp Arg Leu Phe Gly Glu Arg Asp Ala Gly Ala Leu Gly
50 55 60
Gly Ala Glu Asp Ser Leu Leu Ala Ser Pro Ala Gly Thr Arg Thr Ala
65 70 75 80
Ala Gly Arg Thr Ala Glu Ser Pro Glu Gly Trp Asp Ser Asp Ser Ala
85 90 95
Leu Ser Glu Glu Asn Glu Ser Arg Arg Arg Cys Ala Asp Ala Arg Gly
100 105 110
Ala Ser Gly Ala Gly Leu Ala Gly Gly Ser Leu Ser Leu Gly Gln Pro
115 120 125
Val Cys Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ala Gly
130 135 140
Arg Ser Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val Ser Gly Asp Arg Ser Pro
145 150 155 160
Arg Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val Ser Ala
165 170 175
Leu Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val
180 185 190
Ala Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg
195 200 205
Ser Arg Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg
210 215 220
Phe Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala
225 230 235 240
Ala Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn
245 250 255
Arg Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala
260 265 270
Ser Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val Arg Asp
275 280 285
Asp Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu
290 295 300
Leu Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Cys Leu Pro Gly
305 310 315 320
<210> 10
<211> 307
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Met Ala Val Arg Gly Ala Asn Thr Leu Thr Ser Phe Ser Ile Gln Ala
1 5 10 15
Ile Leu Asn Lys Lys Glu Glu Arg Gly Gly Leu Ala Ala Pro Glu Gly
20 25 30
Arg Pro Ala Pro Gly Gly Thr Ala Ala Ser Val Ala Ala Ala Pro Ala
35 40 45
Val Cys Cys Trp Arg Leu Phe Gly Glu Arg Asp Ala Gly Ala Leu Gly
50 55 60
Gly Ala Glu Asp Ser Leu Leu Ala Ser Pro Ala Gly Thr Arg Thr Ala
65 70 75 80
Ala Gly Arg Thr Ala Glu Ser Pro Glu Gly Trp Asp Ser Asp Ser Ala
85 90 95
Leu Ser Glu Glu Asn Glu Ser Arg Arg Arg Cys Ala Asp Ala Arg Gly
100 105 110
Ala Ser Gly Ala Gly Leu Ala Gly Gly Ser Leu Ser Leu Gly Gln Pro
115 120 125
Val Cys Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ala Gly
130 135 140
Arg Ser Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val Ser Gly Asp Arg Ser Pro
145 150 155 160
Arg Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val Ser Ala
165 170 175
Leu Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val
180 185 190
Ala Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg
195 200 205
Ser Arg Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg
210 215 220
Phe Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala
225 230 235 240
Ala Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn
245 250 255
Arg Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala
260 265 270
Ser Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val Arg Asp
275 280 285
Asp Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu
290 295 300
Leu Pro Leu
305
<210> 11
<211> 292
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Ser Val Ala Ala Ala Pro Ala Val Cys Cys Trp Arg Leu Phe Gly Glu
1 5 10 15
Arg Asp Ala Gly Ala Leu Gly Gly Ala Glu Asp Ser Leu Leu Ala Ser
20 25 30
Pro Ala Gly Thr Arg Thr Ala Ala Gly Arg Thr Ala Glu Ser Pro Glu
35 40 45
Gly Trp Asp Ser Asp Ser Ala Leu Ser Glu Glu Asn Glu Ser Arg Arg
50 55 60
Arg Cys Ala Asp Ala Arg Gly Ala Ser Gly Ala Gly Leu Ala Gly Gly
65 70 75 80
Ser Leu Ser Leu Gly Gln Pro Val Cys Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp
85 90 95
Leu Glu Glu Glu Ala Ala Gly Arg Ser Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser
100 105 110
Val Ser Gly Asp Arg Ser Pro Arg Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro
115 120 125
Arg Gly Ala His Val Ser Ala Leu Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala
145 150 155 160
Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser Arg Ala Ala Phe Ser His Ala Gln
165 170 175
Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg Phe Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly
180 185 190
Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala Ala Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln
195 200 205
Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln
210 215 220
Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala
225 230 235 240
Val Lys Val Leu Val Arg Asp Asp Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu
245 250 255
Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr
260 265 270
Pro Tyr Tyr Cys Leu Pro Gly Trp Ala Leu Ser Thr Cys Ala Ala Ala
275 280 285
Ala Gly Thr Gln
290
<210> 12
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Glu Glu Asn Glu Ser Arg Arg Arg Cys Ala Asp Ala Arg Gly Ala Ser
1 5 10 15
Gly Ala Gly Leu Ala Gly Gly Ser Leu Ser Leu Gly Gln Pro Val Cys
20 25 30
Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ala Gly Arg Ser
35 40 45
Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val Ser Gly Asp Arg Ser Pro Arg Thr
50 55 60
Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val Ser Ala Leu Cys
65 70 75 80
Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala Glu
85 90 95
Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser Arg
100 105 110
Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg Phe Asn
115 120 125
His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala Ala Ser
130 135 140
Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser Ala
165 170 175
Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val Arg Asp Asp Gln
180 185 190
Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu Pro
195 200 205
Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Cys Leu Pro Gly Trp Ala
210 215 220
Leu Ser Thr Cys Ala Ala Ala Ala Gly Thr Gln
225 230 235
<210> 13
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
Gly Ala Ser Gly Ala Gly Leu Ala Gly Gly Ser Leu Ser Leu Gly Gln
1 5 10 15
Pro Val Cys Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ala
20 25 30
Gly Arg Ser Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val Ser Gly Asp Arg Ser
35 40 45
Pro Arg Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val Ser
50 55 60
Ala Leu Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly
65 70 75 80
Val Ala Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys
85 90 95
Arg Ser Arg Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg
100 105 110
Arg Phe Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu
115 120 125
Ala Ala Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln
130 135 140
Asn Arg Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu
145 150 155 160
Ala Ser Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val Arg
165 170 175
Asp Asp Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser
180 185 190
Leu Leu Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Cys Leu Pro
195 200 205
Gly Trp Ala Leu Ser Thr Cys Ala Ala Ala Ala Gly Thr Gln
210 215 220
<210> 14
<211> 211
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 14
Leu Ser Leu Gly Gln Pro Val Cys Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu
1 5 10 15
Glu Glu Glu Ala Ala Gly Arg Ser Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val
20 25 30
Ser Gly Asp Arg Ser Pro Arg Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg
35 40 45
Gly Ala His Val Ser Ala Leu Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro
65 70 75 80
Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser Arg Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val
85 90 95
Phe Glu Leu Glu Arg Arg Phe Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro
100 105 110
Glu Arg Ala Asp Leu Ala Ala Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val
115 120 125
Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met
130 135 140
Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val
145 150 155 160
Lys Val Leu Val Arg Asp Asp Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val
165 170 175
Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr Pro
180 185 190
Tyr Tyr Cys Leu Pro Gly Trp Ala Leu Ser Thr Cys Ala Ala Ala Ala
195 200 205
Gly Thr Gln
210
<210> 15
<211> 232
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 15
Glu Glu Asn Glu Ser Arg Arg Arg Cys Ala Asp Ala Arg Gly Ala Ser
1 5 10 15
Gly Ala Gly Leu Ala Gly Gly Ser Leu Ser Leu Gly Gln Pro Val Cys
20 25 30
Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ala Gly Arg Ser
35 40 45
Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val Ser Gly Asp Arg Ser Pro Arg Thr
50 55 60
Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val Ser Ala Leu Cys
65 70 75 80
Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala Glu
85 90 95
Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser Arg
100 105 110
Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg Phe Asn
115 120 125
His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala Ala Ser
130 135 140
Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser Ala
165 170 175
Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val Arg Asp Asp Gln
180 185 190
Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu Pro
195 200 205
Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Cys Leu Pro Gly Trp Ala
210 215 220
Leu Ser Thr Cys Ala Ala Ala Ala
225 230
<210> 16
<211> 229
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 16
Glu Glu Asn Glu Ser Arg Arg Arg Cys Ala Asp Ala Arg Gly Ala Ser
1 5 10 15
Gly Ala Gly Leu Ala Gly Gly Ser Leu Ser Leu Gly Gln Pro Val Cys
20 25 30
Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ala Gly Arg Ser
35 40 45
Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val Ser Gly Asp Arg Ser Pro Arg Thr
50 55 60
Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val Ser Ala Leu Cys
65 70 75 80
Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala Glu
85 90 95
Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser Arg
100 105 110
Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg Phe Asn
115 120 125
His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala Ala Ser
130 135 140
Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser Ala
165 170 175
Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val Arg Asp Asp Gln
180 185 190
Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu Pro
195 200 205
Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Cys Leu Pro Gly Trp Ala
210 215 220
Leu Ser Thr Cys Ala
225
<210> 17
<211> 222
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 17
Glu Glu Asn Glu Ser Arg Arg Arg Cys Ala Asp Ala Arg Gly Ala Ser
1 5 10 15
Gly Ala Gly Leu Ala Gly Gly Ser Leu Ser Leu Gly Gln Pro Val Cys
20 25 30
Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ala Gly Arg Ser
35 40 45
Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val Ser Gly Asp Arg Ser Pro Arg Thr
50 55 60
Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val Ser Ala Leu Cys
65 70 75 80
Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala Glu
85 90 95
Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser Arg
100 105 110
Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg Phe Asn
115 120 125
His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala Ala Ser
130 135 140
Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg
145 150 155 160
Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser Ala
165 170 175
Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val Arg Asp Asp Gln
180 185 190
Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu Pro
195 200 205
Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Cys Leu Pro Gly
210 215 220
<210> 18
<211> 223
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 18
Arg Arg Cys Ala Asp Ala Arg Gly Ala Ser Gly Ala Gly Leu Ala Gly
1 5 10 15
Gly Ser Leu Ser Leu Gly Gln Pro Val Cys Glu Leu Ala Ala Ser Lys
20 25 30
Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ala Gly Arg Ser Asp Ser Glu Met Ser Ala
35 40 45
Ser Val Ser Gly Asp Arg Ser Pro Arg Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly
50 55 60
Pro Arg Gly Ala His Val Ser Ala Leu Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly
65 70 75 80
Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala
85 90 95
Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser Arg Ala Ala Phe Ser His Ala
100 105 110
Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg Phe Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser
115 120 125
Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala Ala Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr
130 135 140
Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg
145 150 155 160
Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val
165 170 175
Ala Val Lys Val Leu Val Arg Asp Asp Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly
180 185 190
Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr
195 200 205
Tyr Pro Tyr Tyr Cys Leu Pro Gly Trp Ala Leu Ser Thr Cys Ala
210 215 220
<210> 19
<211> 215
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 19
Ala Arg Gly Ala Ser Gly Ala Gly Leu Ala Gly Gly Ser Leu Ser Leu
1 5 10 15
Gly Gln Pro Val Cys Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Glu
20 25 30
Ala Ala Gly Arg Ser Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val Ser Gly Asp
35 40 45
Arg Ser Pro Arg Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His
50 55 60
Val Ser Ala Leu Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro
65 70 75 80
Ala Gly Val Ala Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg
85 90 95
Lys Lys Arg Ser Arg Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu
100 105 110
Glu Arg Arg Phe Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala
115 120 125
Asp Leu Ala Ala Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp
130 135 140
Phe Gln Asn Arg Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp
145 150 155 160
Leu Leu Ala Ser Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu
165 170 175
Val Arg Asp Asp Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro
180 185 190
Pro Ser Leu Leu Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Cys
195 200 205
Leu Pro Gly Trp Ala Leu Ser
210 215
<210> 20
<211> 209
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 20
Gly Ala Ser Gly Ala Gly Leu Ala Gly Gly Ser Leu Ser Leu Gly Gln
1 5 10 15
Pro Val Cys Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ala
20 25 30
Gly Arg Ser Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val Ser Gly Asp Arg Ser
35 40 45
Pro Arg Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val Ser
50 55 60
Ala Leu Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly
65 70 75 80
Val Ala Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys
85 90 95
Arg Ser Arg Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg
100 105 110
Arg Phe Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu
115 120 125
Ala Ala Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln
130 135 140
Asn Arg Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu
145 150 155 160
Ala Ser Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val Arg
165 170 175
Asp Asp Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser
180 185 190
Leu Leu Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Cys Leu Pro
195 200 205
Gly
<210> 21
<211> 198
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 21
Leu Ser Leu Gly Gln Pro Val Cys Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu
1 5 10 15
Glu Glu Glu Ala Ala Gly Arg Ser Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val
20 25 30
Ser Gly Asp Arg Ser Pro Arg Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg
35 40 45
Gly Ala His Val Ser Ala Leu Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro
65 70 75 80
Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser Arg Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val
85 90 95
Phe Glu Leu Glu Arg Arg Phe Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro
100 105 110
Glu Arg Ala Asp Leu Ala Ala Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val
115 120 125
Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met
130 135 140
Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val
145 150 155 160
Lys Val Leu Val Arg Asp Asp Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val
165 170 175
Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr Pro
180 185 190
Tyr Tyr Cys Leu Pro Gly
195
<210> 22
<211> 191
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 22
Cys Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ala Gly Arg
1 5 10 15
Ser Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val Ser Gly Asp Arg Ser Pro Arg
20 25 30
Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val Ser Ala Leu
35 40 45
Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala
50 55 60
Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser
65 70 75 80
Arg Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg Phe
85 90 95
Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala Ala
100 105 110
Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg
115 120 125
Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser
130 135 140
Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val Arg Asp Asp
145 150 155 160
Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu
165 170 175
Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Cys Leu Pro Gly
180 185 190
<210> 23
<211> 171
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 23
Met Ser Ala Ser Val Ser Gly Asp Arg Ser Pro Arg Thr Glu Asp Asp
1 5 10 15
Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val Ser Ala Leu Cys Ser Gly Ala
20 25 30
Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala Glu Glu Glu Glu
35 40 45
Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser Arg Ala Ala Phe
50 55 60
Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg Phe Asn His Gln Arg
65 70 75 80
Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala Ala Ser Leu Lys Leu
85 90 95
Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Tyr Lys Thr
100 105 110
Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser Ala Pro Ala Ala
115 120 125
Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val Arg Asp Asp Gln Arg Gln Tyr
130 135 140
Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu Pro Leu Gln Pro
145 150 155 160
Ser Tyr Tyr Tyr Pro Tyr Tyr Cys Leu Pro Gly
165 170
<210> 24
<211> 166
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 24
Ser Val Ser Gly Asp Arg Ser Pro Arg Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly
1 5 10 15
Pro Arg Gly Ala His Val Ser Ala Leu Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala
35 40 45
Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser Arg Ala Ala Phe Ser His Ala
50 55 60
Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg Phe Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser
65 70 75 80
Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala Ala Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr
85 90 95
Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg
100 105 110
Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val
115 120 125
Ala Val Lys Val Leu Val Arg Asp Asp Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly
130 135 140
Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr
145 150 155 160
Tyr Pro Tyr Tyr Cys Leu
165
<210> 25
<211> 161
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 25
Gly Asp Arg Ser Pro Arg Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly
1 5 10 15
Ala His Val Ser Ala Leu Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser
20 25 30
Gly Pro Ala Gly Val Ala Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys
35 40 45
Pro Arg Lys Lys Arg Ser Arg Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val Phe
50 55 60
Glu Leu Glu Arg Arg Phe Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu
65 70 75 80
Arg Ala Asp Leu Ala Ala Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys
85 90 95
Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala
100 105 110
Ala Asp Leu Leu Ala Ser Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val Lys
115 120 125
Val Leu Val Arg Asp Asp Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu
130 135 140
Arg Pro Pro Ser Leu Leu Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr Pro Tyr
145 150 155 160
Tyr
<210> 26
<211> 156
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 26
Ser Pro Arg Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val
1 5 10 15
Ser Ala Leu Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala
20 25 30
Gly Val Ala Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys
35 40 45
Lys Arg Ser Arg Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu
50 55 60
Arg Arg Phe Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp
65 70 75 80
Leu Ala Ala Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe
85 90 95
Gln Asn Arg Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu
100 105 110
Leu Ala Ser Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val
115 120 125
Arg Asp Asp Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro
130 135 140
Ser Leu Leu Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr Pro
145 150 155
<210> 27
<211> 151
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 27
Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val Ser Ala Leu
1 5 10 15
Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala
20 25 30
Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser
35 40 45
Arg Ala Ala Phe Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg Phe
50 55 60
Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala Ala
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg
85 90 95
Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser
100 105 110
Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val Arg Asp Asp
115 120 125
Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu
130 135 140
Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr
145 150
<210> 28
<211> 146
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 28
Asp Gly Val Gly Pro Arg Gly Ala His Val Ser Ala Leu Cys Ser Gly
1 5 10 15
Ala Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala Glu Glu Glu
20 25 30
Glu Glu Pro Ala Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser Arg Ala Ala
35 40 45
Phe Ser His Ala Gln Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg Phe Asn His Gln
50 55 60
Arg Tyr Leu Ser Gly Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala Ala Ser Leu Lys
65 70 75 80
Leu Thr Glu Thr Gln Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Tyr Lys
85 90 95
Thr Lys Arg Arg Gln Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser Ala Pro Ala
100 105 110
Ala Lys Lys Val Ala Val Lys Val Leu Val Arg Asp Asp Gln Arg Gln
115 120 125
Tyr Leu Pro Gly Glu Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu Pro Leu Gln
130 135 140
Pro Ser
145
<210> 29
<211> 282
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 29
Met Ser Arg Gln Thr Ala Thr Ala Leu Pro Thr Gly Thr Ser Lys Cys
1 5 10 15
Pro Pro Ser Gln Arg Val Pro Ala Leu Thr Gly Thr Thr Ala Ser Asn
20 25 30
Asn Asp Leu Ala Ser Leu Phe Glu Cys Pro Val Cys Phe Asp Tyr Val
35 40 45
Leu Pro Pro Ile Leu Gln Cys Gln Ser Gly His Leu Val Cys Ser Asn
50 55 60
Cys Arg Pro Lys Leu Thr Cys Cys Pro Thr Cys Arg Gly Pro Leu Gly
65 70 75 80
Ser Ile Arg Asn Leu Ala Met Glu Lys Val Ala Asn Ser Val Leu Phe
85 90 95
Pro Cys Lys Tyr Ala Ser Ser Gly Cys Glu Ile Thr Leu Pro His Thr
100 105 110
Glu Lys Ala Asp His Glu Glu Leu Cys Glu Phe Arg Pro Tyr Ser Cys
115 120 125
Pro Cys Pro Gly Ala Ser Cys Lys Trp Gln Gly Ser Leu Asp Ala Val
130 135 140
Met Pro His Leu Met His Gln His Lys Ser Ile Thr Thr Leu Gln Gly
145 150 155 160
Glu Asp Ile Val Phe Leu Ala Thr Asp Ile Asn Leu Pro Gly Ala Val
165 170 175
Asp Trp Val Met Met Gln Ser Cys Phe Gly Phe His Phe Met Leu Val
180 185 190
Leu Glu Lys Gln Glu Lys Tyr Asp Gly His Gln Gln Phe Phe Ala Ile
195 200 205
Val Gln Leu Ile Gly Thr Arg Lys Gln Ala Glu Asn Phe Ala Tyr Arg
210 215 220
Leu Glu Leu Asn Gly His Arg Arg Arg Leu Thr Trp Glu Ala Thr Pro
225 230 235 240
Arg Ser Ile His Glu Gly Ile Ala Thr Ala Ile Met Asn Ser Asp Cys
245 250 255
Leu Val Phe Asp Thr Ser Ile Ala Gln Leu Phe Ala Glu Asn Gly Asn
260 265 270
Leu Gly Ile Asn Val Thr Ile Ser Met Cys
275 280
<210> 30
<211> 1540
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 30
gtcccgtcgg tctcggcgcc gggaagaggc ggtggcgctg cccgcggtgg cgggggttgg 60
cgacggagcg cgttggtgcc aggaccgggg tccgaggcgc gctctccgcc cacagaaatg 120
agccgtcaga ctgctacagc attacctacc ggtacctcga agtgtccacc atcccagagg 180
gtgcctgccc tgactggcac aactgcatcc aacaatgact tggcgagtct ttttgagtgt 240
ccagtctgct ttgactatgt gttaccgccc attcttcaat gtcagagtgg ccatcttgtt 300
tgtagcaact gtcgcccaaa gctcacatgt tgtccaactt gccggggccc tttgggatcc 360
attcgcaact tggctatgga gaaagtggct aattcagtac ttttcccctg taaatatgcg 420
tcttctggat gtgaaataac tctgccacac acagaaaaag cagaccatga agagctctgt 480
gagtttaggc cttattcctg tccgtgccct ggtgcttcct gtaaatggca aggctctctg 540
gatgctgtaa tgccccatct gatgcatcag cataagtcca ttacaaccct acagggagag 600
gatatagttt ttcttgctac agacattaat cttcctggtg ctgttgactg ggtgatgatg 660
cagtcctgtt ttggctttca cttcatgtta gtcttagaga aacaggaaaa atacgatggt 720
caccagcagt tcttcgcaat cgtacagctg ataggaacac gcaagcaagc tgaaaatttt 780
gcttaccgac ttgagctaaa tggtcatagg cgacgattga cttgggaagc gactcctcga 840
tctattcatg aaggaattgc aacagccatt atgaatagcg actgtctagt ctttgacacc 900
agcattgcac agctttttgc agaaaatggc aatttaggca tcaatgtaac tatttccatg 960
tgttgaaatg gcaatcaaac attttctggc cagtgtttaa aacttcagtt tcacagaaaa 1020
taaggcaccc atctgtctgc caacctaaaa ctctttcggt aggtggaagc tagacacatg 1080
aaggtaaata aaaagaaagg ctgttaaata caggaaacag ttgcatgtag taacactaat 1140
atatttaaaa ataagtcaac agtaaaccac tgaaaaaata tatgtatata cacccaagat 1200
gggcatcttt tgtattaaga aaggaagcat tgtaaaataa ttctgagttt tgtgtttgtt 1260
gtagattgat tgtattgttg aaaaagtttg tttttgcgtg ggagtgtgtg cctgcgtggg 1320
tgtgtgcgtg tttgggtttt tttcctttaa ctgacaagcc atcttgagtg gtcatgggcc 1380
actgcttttc cctttgtgag tcaatacata gtgctgctgt gtgctttttt tgtgtgtatt 1440
tgctaatttt tattaatttt agtttttcat taaataaatt tgacttttct gtaaaaaaaa 1500
aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1540
<210> 31
<211> 317
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 31
Met Phe Gln Ala Ala Glu Arg Pro Gln Glu Trp Ala Met Glu Gly Pro
1 5 10 15
Arg Asp Gly Leu Lys Lys Glu Arg Leu Leu Asp Asp Arg His Asp Ser
20 25 30
Gly Leu Asp Ser Met Lys Asp Glu Glu Tyr Glu Gln Met Val Lys Glu
35 40 45
Leu Gln Glu Ile Arg Leu Glu Pro Gln Glu Val Pro Arg Gly Ser Glu
50 55 60
Pro Trp Lys Gln Gln Leu Thr Glu Asp Gly Asp Ser Phe Leu His Leu
65 70 75 80
Ala Ile Ile His Glu Glu Lys Ala Leu Thr Met Glu Val Ile Arg Gln
85 90 95
Val Lys Gly Asp Leu Ala Phe Leu Asn Phe Gln Asn Asn Leu Gln Gln
100 105 110
Thr Pro Leu His Leu Ala Val Ile Thr Asn Gln Pro Glu Ile Ala Glu
115 120 125
Ala Leu Leu Gly Ala Gly Cys Asp Pro Glu Leu Arg Asp Phe Arg Gly
130 135 140
Asn Thr Pro Leu His Leu Ala Cys Glu Gln Gly Cys Leu Ala Ser Val
145 150 155 160
Gly Val Leu Thr Gln Ser Cys Thr Thr Pro His Leu His Ser Ile Leu
165 170 175
Lys Ala Thr Asn Tyr Asn Gly His Thr Cys Leu His Leu Ala Ser Ile
180 185 190
His Gly Tyr Leu Gly Ile Val Glu Leu Leu Val Ser Leu Gly Ala Asp
195 200 205
Val Asn Ala Gln Glu Pro Cys Asn Gly Arg Thr Ala Leu His Leu Ala
210 215 220
Val Asp Leu Gln Asn Pro Asp Leu Val Ser Leu Leu Leu Lys Cys Gly
225 230 235 240
Ala Asp Val Asn Arg Val Thr Tyr Gln Gly Tyr Ser Pro Tyr Gln Leu
245 250 255
Thr Trp Gly Arg Pro Ser Thr Arg Ile Gln Gln Gln Leu Gly Gln Leu
260 265 270
Thr Leu Glu Asn Leu Gln Met Leu Pro Glu Ser Glu Asp Glu Glu Ser
275 280 285
Tyr Asp Thr Glu Ser Glu Phe Thr Glu Phe Thr Glu Asp Glu Leu Pro
290 295 300
Tyr Asp Asp Cys Val Phe Gly Gly Gln Arg Leu Thr Leu
305 310 315
<210> 32
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 32
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
1 5
<210> 33
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 33
Glu Gln Lys Leu Ile Ser Glu Glu Asp Leu
1 5 10
<210> 34
<211> 10
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 34
gggaatttcc 10
<210> 35
<211> 54
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 35
Gly Ala Ser Gly Ala Gly Leu Ala Gly Gly Ser Leu Ser Leu Gly Gln
1 5 10 15
Pro Val Cys Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ala
20 25 30
Gly Arg Ser Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser Val Ser Gly Asp Arg Ser
35 40 45
Pro Arg Thr Glu Asp Asp
50
<210> 36
<211> 162
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 36
ggggccagcg gggccggcct tgcgggggga tccttgagcc tcggccagcc ggtctgtgag 60
ctggccgctt ccaaagacct agaggaggaa gccgcgggcc ggagcgacag cgagatgtcc 120
gccagcgtct caggcgaccg cagcccaagg accgaggacg ac 162
<210> 37
<211> 164
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 37
Val Ser Gly Asp Arg Ser Pro Arg Thr Glu Asp Asp Gly Val Gly Pro
1 5 10 15
Arg Gly Ala His Val Ser Ala Leu Cys Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly
20 25 30
Gly Ser Gly Pro Ala Gly Val Ala Glu Glu Glu Glu Glu Pro Ala Ala
35 40 45
Pro Lys Pro Arg Lys Lys Arg Ser Arg Ala Ala Phe Ser His Ala Gln
50 55 60
Val Phe Glu Leu Glu Arg Arg Phe Asn His Gln Arg Tyr Leu Ser Gly
65 70 75 80
Pro Glu Arg Ala Asp Leu Ala Ala Ser Leu Lys Leu Thr Glu Thr Gln
85 90 95
Val Lys Ile Trp Phe Gln Asn Arg Arg Tyr Lys Thr Lys Arg Arg Gln
100 105 110
Met Ala Ala Asp Leu Leu Ala Ser Ala Pro Ala Ala Lys Lys Val Ala
115 120 125
Val Lys Val Leu Val Arg Asp Asp Gln Arg Gln Tyr Leu Pro Gly Glu
130 135 140
Val Leu Arg Pro Pro Ser Leu Leu Pro Leu Gln Pro Ser Tyr Tyr Tyr
145 150 155 160
Pro Tyr Tyr Cys
<210> 38
<211> 492
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 38
gtctcaggcg accgcagccc aaggaccgag gacgacggtg ttggccccag aggtgcacac 60
gtgtccgcgc tgtgcagcgg ggccggcggc gggggcggca gcgggccggc aggcgtcgcg 120
gaggaggagg aggagccggc ggcgcccaag ccacgcaaga agcgctcgcg ggccgctttc 180
tcccacgcgc aggtcttcga gctggagcgc cgctttaacc accagcgcta cctgtccggg 240
cccgagcgcg cagacctggc cgcgtcgctg aagctcaccg agacgcaggt gaaaatctgg 300
ttccagaacc gtcgctacaa gacaaagcgc cggcagatgg cagccgacct gctggcctcg 360
gcgcccgccg ccaagaaggt ggccgtaaag gtgctggtgc gcgacgacca gagacaatac 420
ctgcccggcg aagtgctgcg gccaccctcg cttctgccac tgcagccctc ctactattac 480
ccgtactact gc 492
<210> 39
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 39
Gly Ala Ser Gly Ala Gly Leu Ala Gly Gly Ser Leu Ser Leu Gly Gln
1 5 10 15
Pro Val Cys Glu Leu Ala Ala Ser Lys Asp Leu Glu Glu Glu Ala Ala
20 25 30
Gly Arg Ser Asp Ser Glu Met Ser Ala Ser
35 40
<210> 40
<211> 126
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 40
ggggccagcg gggccggcct tgcgggggga tccttgagcc tcggccagcc ggtctgtgag 60
ctggccgctt ccaaagacct agaggaggaa gccgcgggcc ggagcgacag cgagatgtcc 120
gccagc 126
<210> 41
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 41
Leu Pro Gly Trp Ala Leu Ser Thr Cys Ala Ala Ala Ala Gly Thr Gln
1 5 10 15
<210> 42
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 42
ctcccaggct gggcgctctc cacctgcgca gctgccgcag gcacccag 48

Claims (10)

1.一种多肽，其由SEQ ID NO：21的氨基酸序列构成。
2.一种多核苷酸，其编码如权利要求1所述的多肽。
3.一种表达载体，其包含如权利要求2所述的多核苷酸。
4.一种宿主细胞，其包含如权利要求3所述的表达载体。
5.一种用于预防或治疗关节炎的药物组合物，其包含作为活性成分的权利要求1所述的多肽，其中所述关节炎为类风湿性关节炎或退行性关节炎。
6.一种重组病毒，其包含如权利要求2所述的多核苷酸。
7.如权利要求6述的重组病毒，
其中所述病毒是选自下组的任何一种病毒：腺病毒、腺相关病毒(AAV)、逆转录病毒、单纯疱疹病毒和痘苗病毒。
8.一种用于预防或治疗关节炎的药物组合物，其包含权利要求6所述的重组病毒作为活性成分，其中所述关节炎为类风湿性关节炎或退行性关节炎。
9.权利要求5或8所述的药物组合物的用途，用于制备预防或治疗关节炎的药物，其中该药物组合物被给药于有需要的受试者，其中所述关节炎为类风湿性关节炎或退行性关节炎。
10.如权利要求9所述的用途，
其中给药通过关节内给药进行。
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