JP2019535310A - Nkx3.2断片及び活性成分としてNkx3.2断片を含む医薬組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明者らは、変形性関節炎の病理学的環境下で効果的に機能できるNkx3.2バリアントを使用する変形性関節炎の治療法を開発する研究を行った。その結果、本発明者らは、Siah1により誘導されるタンパク質分解に耐性のあるNkx3.2断片を作製した。本発明者らは、上述したNkx3.2断片が、全長Nkx3.2と同程度のレベルでNF−κB活性化を誘導できることも同定した。さらに、本発明者らは、Nkx3.2断片が、変形性関節炎に対して全長Nkx3.2と比較して著しく改善された治療的効能を呈することを発見した。
上記の目的を達成するために、
本発明は、式(I):
N末端伸長ドメイン−コアドメイン−C端末伸長ドメイン(I)
により表されるポリペプチドを提供し、
上記式(I)において、
コアドメインは、配列番号1のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり;
N末端伸長ドメインは、1〜53個のアミノ酸が配列番号35の1位のアミノ酸から開始してN末端からC末端方向に連続して削除可能である配列番号35のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり;
C末端伸長ドメインは、1〜23個のアミノ酸が配列番号5の24位のアミノ酸から開始してC末端からN末端方向に連続して削除可能である配列番号5のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
N末端伸長ドメイン−コアドメイン−C端末伸長ドメイン(II)
により表されるポリペプチドも提供し、
上記式(II)において、
コアドメインは、配列番号37のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり;
N末端伸長ドメインは、1〜41個のアミノ酸が配列番号39の1位のアミノ酸から開始してN末端からC末端方向に連続して削除可能である配列番号39のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり;
C末端伸長ドメインは、1〜15個のアミノ酸が配列番号41の16位のアミノ酸から開始してC末端からN末端方向に連続して削除可能である配列番号41のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
本発明のNkx3.2断片は、全長Nkx3.2と同程度のレベルでNF−κBを活性化する機能があり、Siah1により媒介されるタンパク質分解に耐性がある。加えて、上述したNkx3.2断片は、動物モデルに基づくin vivo有効性評価において全長Nkx3.2と比較して変形性関節炎に対して改善された治療的効果を呈する。したがって、Nkx3.2断片は、関節炎を予防又は治療するために効果的に使用され得る。
N末端伸長ドメイン−コアドメイン−C端末伸長ドメイン(I)
により表されるポリペプチドを提供し、
上記式(I)において、
コアドメインは、配列番号1のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり;
N末端伸長ドメインは、1〜53個のアミノ酸が配列番号35の1位のアミノ酸から開始してN末端からC末端方向に連続して削除可能である配列番号35のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり;
C末端伸長ドメインは、1〜23個のアミノ酸が配列番号5の24位のアミノ酸から開始してC末端からN末端方向に連続して削除可能である配列番号5のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
N末端伸長ドメイン−コアドメイン−C端末伸長ドメイン(II)
により表されるポリペプチドを提供し、
上記式(II)において、
コアドメインは、配列番号37のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり;
N末端伸長ドメインは、1〜41個のアミノ酸が配列番号39の1位のアミノ酸から開始してN末端からC末端方向に連続して削除可能である配列番号39のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり;
C末端伸長ドメインは、1〜15個のアミノ酸が配列番号41の16位のアミノ酸から開始してC末端からN末端方向に連続して削除可能である配列番号41のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
N末端伸長ドメイン−コアドメイン−C端末伸長ドメイン(I)
により表されるポリペプチドであってもよく、
上記式(I)において、
コアドメインは、配列番号1のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり;
N末端伸長ドメインは、1〜53個のアミノ酸が配列番号35の1位のアミノ酸から開始してN末端からC末端方向に連続して削除可能である配列番号35のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり;
C末端伸長ドメインは、1〜23個のアミノ酸が配列番号5の24位のアミノ酸から開始してC末端からN末端方向に連続して削除可能である配列番号5のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
N末端伸長ドメイン−コアドメイン−C端末伸長ドメイン(II)
により表されるポリペプチドであってもよく、
上記式(II)において、
コアドメインは、配列番号37のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり;
N末端伸長ドメインは、1〜41個のアミノ酸が配列番号39の1位のアミノ酸から開始してN末端からC末端方向に連続して削除可能である配列番号39のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり;
C末端伸長ドメインは、1〜15個のアミノ酸が配列番号41の16位のアミノ酸から開始してC末端からN末端方向に連続して削除可能である配列番号41のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
N末端伸長ドメイン−コアドメイン−C端末伸長ドメイン(I)
によって表されるポリペプチドをコードしてもよく、
上記式(I)において、
コアドメインは、配列番号1のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり;
N末端伸長ドメインは、1〜53個のアミノ酸が配列番号35の1位のアミノ酸から開始してN末端からC末端方向に連続して削除可能である配列番号35のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり;
C末端伸長ドメインは、1〜23個のアミノ酸が配列番号5の24位のアミノ酸から開始してC末端からN末端方向に連続して削除可能である配列番号5のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
N末端伸長ドメイン−コアドメイン−C端末伸長ドメイン(II)
によって表されるポリペプチドをコードしてもよく、
上記式(II)において、
コアドメインは、配列番号37のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり;
N末端伸長ドメインは、1〜41個のアミノ酸が配列番号39の1位のアミノ酸から開始してN末端からC末端方向に連続して削除可能である配列番号39のアミノ酸配列を含むポリペプチドであり;
C末端伸長ドメインは、1〜15個のアミノ酸が配列番号41の16位のアミノ酸から開始してC末端からN末端方向に連続して削除可能である配列番号41のアミノ酸配列を含むポリペプチドである。
Nkx3.2断片を発現するベクターの構築
Siah1によって媒介されるタンパク質分解に耐性のあるバリアントを得るために、Nkx3.2断片を発現するベクターを以下の方法により構築した。
Siah1により媒介されるタンパク質分解に耐性のあるNkx3.2断片の選択
例1において構築したNkx3.2断片を発現する発現ベクターを使用して、Siah1によって分解されないNkx3.2断片を、以下の方法により選択した。
Nkx3.2断片がIκBαに結合するかどうかの同定
Nkx3.2は、IκBαに結合することによってNF−κB活性化を誘導する。したがって、免疫沈降を使用して、断片Nkx3.2(112〜320)、Nkx3.2(123〜320)、Nkx3.2(130〜320)、Nkx3.2(150〜320)及びNkx3.2(153〜318)が、IκBαに結合するかどうか同定した。
IκBαタンパク質が、Nkx3.2断片により分解されるかどうかの同定
Nkx3.2は、IκBαに結合し、したがってプロテアソームによるIκBαのユビキチン化及び分解を促進する。したがって、ウェスタンブロッティングを実施して、断片Nkx3.2(112〜320)、Nkx3.2(123〜320)、Nkx3.2(130〜320)、Nkx3.2(150〜320)及びNkx3.2(153〜318)が、これらの活性を維持するかどうか同定した。
NF−κBの転写機能が、Nkx3.2断片により活性化されるかどうかの同定
Nkx3.2は、NF−κB活性化を誘導することにより軟骨細胞の細胞死を抑制する。したがって、Nkx3.2断片によるNF−κB活性化を測定するために、NF−κB特異的DNA結合部位(配列番号35:GGGAATTTCC)が4回繰り返されるポリヌクレオチド配列を、MluI及びXhoIを使用してpGL3−Basicベクター(カタログ番号E1751、Promega、米国)に挿入して、4x−κB−Luc発現ベクターを構築した。さらに、発現ベクターを使用して、ルシフェラーゼ活性を分析することによりNkx3.2によるNF−κBの転写機能の活性化を測定した。
変形性関節炎に対するNkx3.2断片の改善された治療的効能の同定
上記のin vitro実験によって、全長Nkx3.2と比較したNkx3.2断片の機能的優位性が同定された。したがって、Nkx3.2断片のin vivo機能の改善を同定するために、変形性関節炎に対するNkx3.2断片(123〜320)及び全長Nkx3.2(1〜333)の治療的効能を比較し、分析した。この目的のために、内側半月の不安定化(DMM)と呼ばれる外科的手順によって変形性関節炎を誘導したマウスモデルを選択した。実験を実施する過程を、図6に図式的に例示する。
Claims (37)
- 以下の式(I):
N末端伸長ドメイン−コアドメイン−C端末伸長ドメイン(I)
により表されるポリペプチドであり、
上記式(I)において、
前記コアドメインが、配列番号1のアミノ酸配列を有するポリペプチドであり;
前記N末端伸長ドメインが、1〜53個のアミノ酸が配列番号35の1位のアミノ酸から開始してN末端からC末端方向に連続して削除可能である配列番号35のアミノ酸配列を有するポリペプチドであり;
前記C末端伸長ドメインが、1〜23個のアミノ酸が配列番号5の24位のアミノ酸から開始してC末端からN末端方向に連続して削除可能である配列番号5のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、ポリペプチド。 - 前記N末端伸長ドメインが、11個のアミノ酸が配列番号35の1位のアミノ酸から開始してN末端からC末端方向に連続的に削除されている配列番号35のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記N末端伸長ドメインが、18個のアミノ酸が配列番号35の1位のアミノ酸から開始してN末端からC末端方向に連続的に削除されている配列番号35のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記N末端伸長ドメインが、38個のアミノ酸が配列番号35の1位のアミノ酸から開始してN末端からC末端方向に連続的に削除されている配列番号35のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記N末端伸長ドメインが、41個のアミノ酸が配列番号35の1位のアミノ酸から開始してN末端からC末端方向に連続的に削除されている配列番号35のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記N末端伸長ドメインが、44個のアミノ酸が配列番号35の1位のアミノ酸から開始してN末端からC末端方向に連続的に削除されている配列番号35のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記N末端伸長ドメインが、47個のアミノ酸が配列番号35の1位のアミノ酸から開始してN末端からC末端方向に連続的に削除されている配列番号35のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記N末端伸長ドメインが、50個のアミノ酸が配列番号35の1位のアミノ酸から開始してN末端からC末端方向に連続的に削除されている配列番号35のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記N末端伸長ドメインが、53個のアミノ酸が配列番号35の1位のアミノ酸から開始してN末端からC末端方向に連続的に削除されている配列番号35のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記C末端伸長ドメインが、13個のアミノ酸が配列番号5の24位のアミノ酸から開始してC末端からN末端方向に連続的に削除されている配列番号5のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記C末端伸長ドメインが、15個のアミノ酸が配列番号5の24位のアミノ酸から開始してC末端からN末端方向に連続的に削除されている配列番号5のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記C末端伸長ドメインが、17個のアミノ酸が配列番号5の24位のアミノ酸から開始してC末端からN末端方向に連続的に削除されている配列番号5のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記C末端伸長ドメインが、19個のアミノ酸が配列番号5の24位のアミノ酸から開始してC末端からN末端方向に連続的に削除されている配列番号5のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記C末端伸長ドメインが、21個のアミノ酸が配列番号5の24位のアミノ酸から開始してC末端からN末端方向に連続的に削除されている配列番号5のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記C末端伸長ドメインが、23個のアミノ酸が配列番号5の24位のアミノ酸から開始してC末端からN末端方向に連続的に削除されている配列番号5のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項1に記載のポリペプチド。
- 前記ポリペプチドが、配列番号13、14、20、21、22、23、24、25、26、27又は28のアミノ酸配列を有する、請求項1に記載のポリペプチド。
- 以下の式(II):
N末端伸長ドメイン−コアドメイン−C端末伸長ドメイン(II)
により表されるポリペプチドであり、
上記式(II)において、
前記コアドメインが、配列番号37のアミノ酸配列を有するポリペプチドであり;
前記N末端伸長ドメインが、1〜41個のアミノ酸が配列番号39の1位のアミノ酸から開始してN末端からC末端方向に連続して削除可能である配列番号39のアミノ酸配列を有するポリペプチドであり;
前記C末端伸長ドメインが、1〜15個のアミノ酸が配列番号41の16位のアミノ酸から開始してC末端からN末端方向に連続して削除可能である配列番号41のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、ポリペプチド。 - 前記N末端伸長ドメインが、11個のアミノ酸が配列番号39の1位のアミノ酸から開始してN末端からC末端方向に連続的に削除されている配列番号39のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項17に記載のポリペプチド。
- 前記N末端伸長ドメインが、18個のアミノ酸が配列番号39の1位のアミノ酸から開始してN末端からC末端方向に連続的に削除されている配列番号39のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項17に記載のポリペプチド。
- 前記N末端伸長ドメインが、38個のアミノ酸が配列番号39の1位のアミノ酸から開始してN末端からC末端方向に連続的に削除されている配列番号39のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項17に記載のポリペプチド。
- 前記N末端伸長ドメインが、41個のアミノ酸が配列番号39の1位のアミノ酸から開始してN末端からC末端方向に連続的に削除されている配列番号39のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項17に記載のポリペプチド。
- 前記C末端伸長ドメインが、3個のアミノ酸が配列番号41の16位のアミノ酸から開始してC末端からN末端方向に連続的に削除されている配列番号41のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項17に記載のポリペプチド。
- 前記C末端伸長ドメインが、6個のアミノ酸が配列番号41の16位のアミノ酸から開始してC末端からN末端方向に連続的に削除されている配列番号41のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項17に記載のポリペプチド。
- 前記C末端伸長ドメインが、9個のアミノ酸が配列番号41の16位のアミノ酸から開始してC末端からN末端方向に連続的に削除されている配列番号41のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項17に記載のポリペプチド。
- 前記C末端伸長ドメインが、13個のアミノ酸が配列番号41の16位のアミノ酸から開始してC末端からN末端方向に連続的に削除されている配列番号41のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項17に記載のポリペプチド。
- 前記C末端伸長ドメインが、15個のアミノ酸が配列番号41の16位のアミノ酸から開始してC末端からN末端方向に連続的に削除されている配列番号41のアミノ酸配列を有するポリペプチドである、請求項17に記載のポリペプチド。
- 請求項1又は17に記載のポリペプチドをコードするポリヌクレオチド。
- 請求項27に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。
- 請求項28に記載の発現ベクターを含む宿主細胞。
- 活性成分として、請求項1又は17に記載のポリペプチドを含む、関節炎を予防又は治療するための医薬組成物。
- 前記関節炎が、骨関節炎、関節リウマチ、変形性関節炎、痛風関節炎、若年性関節炎、反応性関節炎、及びその組合せからなる群から選択されるいずれか1つである、請求項30に記載の医薬組成物。
- 請求項27のポリヌクレオチドを含む組換えウイルス。
- 前記ウイルスが、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス(AAV)、レトロウイルス、レンチウイルス、単純ヘルペスウイルス及びワクシニアウイルスからなる群から選択されるいずれか1つである、請求項32に記載の組換えウイルス。
- 活性成分として、請求項32に記載の組換えウイルスを含む、関節炎を予防又は治療するための医薬組成物。
- 前記関節炎が、骨関節炎、関節リウマチ、変形性関節炎、痛風関節炎、若年性関節炎、反応性関節炎、及びその組合せからなる群から選択されるいずれか1つである、請求項34に記載の医薬組成物。
- それを必要とする対象に請求項30又は34に記載の医薬組成物を投与することを含む、関節炎を予防又は治療するための方法。
- 前記投与が、関節内投与により実施される、請求項36に記載の方法。
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