CN113382770A

CN113382770A - 用于治疗色素性视网膜炎的组合物和方法

Info

Publication number: CN113382770A
Application number: CN201980075626.XA
Authority: CN
Inventors: G·S·鲁滨逊; T·昂吉
Original assignee: NightstaRx Ltd
Current assignee: NightstaRx Ltd
Priority date: 2018-09-21
Filing date: 2019-09-23
Publication date: 2021-09-10
Also published as: JP2022501376A; US20210348193A1; PE20220747A1; TW202028225A; KR20210094518A; WO2020061574A1; CL2021000689A1; EP3852877A1; IL281577A; SG11202102800YA; EP3852877A4; BR112021004830A2; PH12021550594A1; AU2019345330A1; JOP20210054A1; CO2021004934A2; CR20210187A; CA3112821A1; MX2021002982A

Abstract

本公开涉及用于通过施用包含RPGR^ORF15序列的rAAV载体来治疗色素性视网膜炎的组合物和方法。

Description

用于治疗色素性视网膜炎的组合物和方法

相关申请

本申请要求2019年4月5日提交的美国临时专利申请号62/830,106以及2018年9月21日提交的美国临时专利申请号62/734,746的优先权，所述临时专利申请的内容以全文的形式并入本文中。

关于序列表的陈述

与本申请相关的序列表以文本格式代替纸质拷贝形式提供，并且以引用的方式并入本说明书中。含有序列表的文本文件的名称为NIGH-016_N01WO_ST25.txt。所述文本文件为约32KB，创建于2019年9月19日，并且经由EFS-Web以电子方式提交。

技术领域

本公开涉及人治疗剂、生物药物产品、人DNA序列的病毒递送以及这些物质的制造方法。

背景技术

色素性视网膜炎为一种罕见的遗传性疾病，估计影响全世界1/4,000的人。色素性视网膜炎涉及视网膜的进行性变性，导致包括以下的视觉症状：夜间视觉损失、周边视觉损失、色彩感觉降低、视敏度降低、中央视觉损失以及最终失明。目前色素性视网膜炎没有治愈方法。因此，本领域中对色素性视网膜炎的治疗有迫切需要。本发明提供了用于治疗色素性视网膜炎的组合物和方法。

发明内容

本公开提供了一种包含多个重组血清型8腺相关病毒(rAAV8)粒子的组合物，其中所述多个rAAV8粒子中的每个rAAV8为非复制性的，并且其中所述多个rAAV8粒子中的每个rAAV8包含多核苷酸，所述多核苷酸从5'到3'包含：(a)编码5'反向末端重复序列(ITR)的序列；(b)编码G蛋白偶联受体激酶1(GRK1)启动子的序列；(c)编码色素性视网膜炎GTP酶调控因子ORF15同种型(RPGR^ORF15)的序列；(d)编码聚腺苷酸化(polyA)信号的序列；(e)编码3'ITR的序列；并且其中组合物包含5x10⁹个载体基因组(vg)/毫升(mL)至2x10¹³vg/mL，端点包括在内。

在一些实施方案中，组合物包含1.0x10¹⁰个载体基因组(vg)/毫升(mL)至1x10¹³vg/mL，端点包括在内。在一些实施方案中，组合物包含5x10¹⁰个基因组粒子(gp)至5x10¹²g。在一些实施方案中，组合物包含1.25x10¹²vg/mL至1x10¹³vg/mL，端点包括在内。在一些实施方案中，组合物包含1x10¹²vg/mL。在一些实施方案中，组合物包含2.5x10¹²vg/mL。在一些实施方案中，组合物包含5x10¹²vg/mL。在一些实施方案中，组合物包含5x10⁹gp、1x10¹⁰gp、5x10¹⁰gp、1x10¹¹gp、2.5x10¹¹gp5x10¹¹gp、1.25x10¹²gp、2.5x10¹²gp、5x10¹²gp或1x10¹³。

在本公开的组合物的一些实施方案中，组合物包含0.5x10¹¹vg/mL至1x10¹²vg/mL，端点包括在内。在一些实施方案中，组合物包含0.5x10¹¹vg/mL。在一些实施方案中，组合物包含5x10⁹vg/mL。在一些实施方案中，组合物包含1x10¹⁰vg/mL。在一些实施方案中，组合物包含5x10¹⁰vg/mL。在一些实施方案中，组合物包含1x10¹¹vg/mL。在一些实施方案中，组合物包含2.5x10¹¹vg/mL。在一些实施方案中，组合物包含5x10¹¹vg/mL。在一些实施方案中，组合物包含5x10¹²vg/mL。在一些实施方案中，组合物包含1x10¹³vg/mL。在一些实施方案中，组合物包含2x10¹³vg/mL。

在本公开的组合物的一些实施方案中，组合物包含5x10⁹个基因组粒子(gp)至5x10¹¹gp，端点包括在内。在一些实施方案中，组合物包含5x10⁹gp。在一些实施方案中，组合物包含1x10¹⁰gp。在一些实施方案中，组合物包含5x10¹⁰gp。在一些实施方案中，组合物包含1x10¹¹gp。在一些实施方案中，组合物包含2.5x10¹¹gp。在一些实施方案中，组合物包含5x10¹¹gp。

在本公开的组合物的一些实施方案中，组合物还包含药学上可接受的载体。在一些实施方案中，药学上可接受的载体包含Tris、MgCl₂以及NaCl。在一些实施方案中，药学上可接受的载体包含20mM Tris、1mM MgCl₂以及200mM NaCl，pH 8.0。在一些实施方案中，药学上可接受的载体还包含0.001％的泊洛沙姆188(poloxamer 188)。

在本公开的组合物的一些实施方案中，编码GRK1启动子的序列包含以下序列或由其组成：

1 gggccccaga agcctggtgg ttgtttgtcc ttctcagggg aaaagtgagg cggccccttg

61 gaggaagggg ccgggcagaa tgatctaatc ggattccaag cagctcaggg gattgtcttt

121 ttctagcacc ttcttgccac tcctaagcgt cctccgtgac cccggctggg atttagcctg

181 gtgctgtgtc agccccggg。(SEQ ID NO:1)

在本公开的组合物的一些实施方案中，编码RPGR^ORF15的序列包含编码以下RPGR^ORF15氨基酸序列的核苷酸序列或由其组成：

1 MREPEELMPD SGAVFTFGKS KFAENNPGKF WFKNDVPVHL SCGDEHSAVV TGNNKLYMFG

61 SNNWGQLGLG SKSAISKPTC VKALKPEKVK LAACGRNHTL VSTEGGNVYA TGGNNEGQLG

121 LGDTEERNTF HVISFFTSEH KIKQLSAGSN TSAALTEDGR LFMWGDNSEG QIGLKNVSNV

181 CVPQQVTIGK PVSWISCGYY HSAFVTTDGE LYVFGEPENG KLGLPNQLLG NHRTPQLVSE

241 IPEKVIQVAC GGEHTVVLTE NAVYTFGLGQ FGQLGLGTFL FETSEPKVIE NIRDQTISYI

301 SCGENHTALI TDIGLMYTFG DGRHGKLGLG LENFTNHFIP TLCSNFLRFI VKLVACGGCH

361 MVVFAAPHRG VAKEIEFDEI NDTCLSVATF LPYSSLTSGN VLQRTLSARM RRRERERSPD

421 SFSMRRTLPP IEGTLGLSAC FLPNSVFPRC SERNLQESVL SEQDLMQPEE PDYLLDEMTK

481 EAEIDNSSTV ESLGETTDIL NMTHIMSLNS NEKSLKLSPV QKQKKQQTIG ELTQDTALTE

541 NDDSDEYEEM SEMKEGKACK QHVSQGIFMT QPATTIEAFS DEEVEIPEEK EGAEDSKGNG

601 IEEQEVEANE ENVKVHGGRK EKTEILSDDL TDKAEVSEGK AKSVGEAEDGPEGRGDGTCE

661 EGSSGAEHWQ DEEREKGEKD KGRGEMERPG EGEKELAEKE EWKKRDGEEQ EQKEREQGHQ

721 KERNQEMEEG GEEEHGEGEE EEGDREEEEE KEGEGKEEGE GEEVEGEREK EEGERKKEER

781 AGKEEKGEEE GDQGEGEEEE TEGRGEEKEE GGEVEGGEVE EGKGEREEEE EEGEGEEEEG

841 EGEEEEGEGE EEEGEGKGEE EGEEGEGEEE GEEGEGEGEE EEGEGEGEEE GEGEGEEEEG

901 EGEGEEEGEG EGEEEEGEGK GEEEGEEGEG EGEEEEGEGE GEDGEGEGEE EEGEWEGEEE

961 EGEGEGEEEG EGEGEEGEGE GEEEEGEGEG EEEEGEEEGE EEGEGEEEGE GEGEEEEEGE

1021 VEGEVEGEEG EGEGEEEEGE EEGEEREKEG EGEENRRNRE EEEEEEGKYQETGEEENERQ

1081 DGEEYKKVSK IKGSVKYGKH KTYQKKSVTN TQGNGKEQRS KMPVQSKRLLKNGPSGSKKF

1141 WNNVLPHYLE LK。(SEQ ID NO:2)

在本公开的组合物的一些实施方案中，编码RPGR^ORF15氨基酸序列的序列包含密码子优化序列。在一些实施方案中，编码RPGR^ORF15的序列包含以下核苷酸序列或由其组成：

1 atgagagagc cagaggagct gatgccagac agtggagcag tgtttacatt cggaaaatct

61 aagttcgctg aaaataaccc aggaaagttc tggtttaaaa acgacgtgcc cgtccacctg

121 tcttgtggcg atgagcatag tgccgtggtc actgggaaca ataagctgta catgttcggg

181 tccaacaact ggggacagct ggggctggga tccaaatctg ctatctctaa gccaacctgc

241 gtgaaggcac tgaaacccga gaaggtcaaa ctggccgctt gtggcagaaa ccacactctg

301 gtgagcaccg agggcgggaa tgtctatgcc accggaggca acaatgaggg acagctggga

361 ctgggggaca ctgaggaaag gaataccttt cacgtgatct ccttctttac atctgagcat

421 aagatcaagc agctgagcgc tggctccaac acatctgcag ccctgactga ggacgggcgc

481 ctgttcatgt ggggagataa ttcagagggc cagattgggc tgaaaaacgt gagcaatgtg

541 tgcgtccctc agcaggtgac catcggaaag ccagtcagtt ggatttcatg tggctactat

601 catagcgcct tcgtgaccac agatggcgag ctgtacgtct ttggggagcc cgaaaacgga

661 aaactgggcc tgcctaacca gctgctgggc aatcaccgga caccccagct ggtgtccgag

721 atccctgaaa aagtgatcca ggtcgcctgc gggggagagc atacagtggt cctgactgag

781 aatgctgtgt ataccttcgg actgggccag tttggccagc tggggctggg aaccttcctg

841 tttgagacat ccgaaccaaa agtgatcgag aacattcgcg accagactat cagctacatt

901 tcctgcggag agaatcacac cgcactgatc acagacattg gcctgatgta tacctttggc

961 gatggacgac acgggaagct gggactggga ctggagaact tcactaatca ttttatcccc

1021 accctgtgtt ctaacttcct gcggttcatc gtgaaactgg tcgcttgcggcgggtgtcac

1081 atggtggtct tcgctgcacc tcataggggc gtggctaagg agatcgaatttgacgagatt

1141 aacgatacat gcctgagcgt ggcaactttc ctgccataca gctccctgacttctggcaat

1201 gtgctgcaga gaaccctgag tgcaaggatg cggagaaggg agagggaacgctctcctgac

1261 agtttctcaa tgcgacgaac cctgccacct atcgagggaa cactgggactgagtgcctgc

1321 ttcctgccta actcagtgtt tccacgatgt agcgagcgga atctgcaggagtctgtcctg

1381 agtgagcagg atctgatgca gccagaggaa cccgactacc tgctggatgagatgaccaag

1441 gaggccgaaa tcgacaactc tagtacagtg gagtccctgg gcgagactaccgatatcctg

1501 aatatgacac acattatgtc actgaacagc aatgagaaga gtctgaaactgtcaccagtg

1561 cagaagcaga agaaacagca gactattggc gagctgactc aggacaccgccctgacagag

1621 aacgacgata gcgatgagta tgaggaaatg tccgagatga aggaaggcaaagcttgtaag

1681 cagcatgtca gtcaggggat cttcatgaca cagccagcca caactattgaggctttttca

1741 gacgaggaag tggagatccc cgaggaaaaa gagggcgcag aagattccaaggggaatgga

1801 attgaggaac aggaggtgga agccaacgag gaaaatgtga aagtccacggaggcaggaag

1861 gagaaaacag aaatcctgtc tgacgatctg actgacaagg ccgaggtgtccgaaggcaag

1921 gcaaaatctg tcggagaggc agaagacgga ccagagggac gaggggatggaacctgcgag

1981 gaaggctcaa gcggggctga gcattggcag gacgaggaac gagagaagggcgaaaaggat

2041 aaaggccgcg gggagatgga acgacctgga gagggcgaaa aagagctggcagagaaggag

2101 gaatggaaga aaagggacgg cgaggaacag gagcagaaag aaagggagcagggccaccag

2161 aaggagcgca accaggagat ggaagagggc ggcgaggaag agcatggcgagggagaagag

2221 gaagagggcg atagagaaga ggaagaggaa aaagaaggcg aagggaaggaggaaggagag

2281 ggcgaggaag tggaaggcga gagggaaaag gaggaaggag aacggaagaaagaggaaaga

2341 gccggcaaag aggaaaaggg cgaggaagag ggcgatcagg gcgaaggcgaggaggaagag

2401 accgagggcc gcggggaaga gaaagaggag ggaggagagg tggagggcggagaggtcgaa

2461 gagggaaagg gcgagcgcga agaggaagag gaagagggcg agggcgaggaagaagagggc

2521 gagggggaag aagaggaggg agagggcgaa gaggaagagg gggagggaaagggcgaagag

2581 gaaggagagg aaggggaggg agaggaagag ggggaggagg gcgagggggaaggcgaggag

2641 gaagaaggag agggggaagg cgaagaggaa ggcgaggggg aaggagaggaggaagaaggg

2701 gaaggcgaag gcgaagagga gggagaagga gagggggagg aagaggaaggagaagggaag

2761 ggcgaggagg aaggcgaaga gggagagggg gaaggcgagg aagaggaaggcgagggcgaa

2821 ggagaggacg gcgagggcga gggagaagag gaggaagggg aatgggaaggcgaagaagag

2881 gaaggcgaag gcgaaggcga agaagagggc gaaggggagg gcgaggagggcgaaggcgaa

2941 ggggaggaag aggaaggcga aggagaaggc gaggaagaag agggagaggaggaaggcgag

3001 gaggaaggag agggggagga ggagggagaa ggcgagggcg aagaagaagaagagggagaa

3061 gtggagggcg aagtcgaggg ggaggaggga gaaggggaag gggaggaagaagagggcgaa

3121 gaagaaggcg aggaaagaga aaaagaggga gaaggcgagg aaaaccggagaaatagggaa

3181 gaggaggaag aggaagaggg aaagtaccag gagacaggcg aagaggaaaacgagcggcag

3241 gatggcgagg aatataagaa agtgagcaag atcaaaggat ccgtcaagtacggcaagcac

3301 aaaacctatc agaagaaaag cgtgaccaac acacagggga atggaaaagagcagaggagt

3361 aagatgcctg tgcagtcaaa acggctgctg aagaatggcc catctggaagtaaaaaattc

3421 tggaacaatg tgctgcccca ctatctggaa ctgaaataa。(SEQ ID NO:3)

在本公开的组合物的一些实施方案中，编码polyA信号的序列包含牛生长激素(BGH)polyA序列。在一些实施方案中，编码BGH polyA信号的序列包含以下核苷酸序列：

1t cgctgatca gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc

61 cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga

121 aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga

181 cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat

241 ggcttctgag gcggaaagaa ccagctgggg。(SEQ ID NO:4)

在本公开的组合物的一些实施方案中，编码5'ITR的序列来源于AAV的血清型2(AAV2)的5’ITR序列。在一些实施方案中，编码5'ITR的序列包含与AAV2的5'ITR的序列相同的序列。在一些实施方案中，编码5'ITR的序列包含以下核苷酸序列或由其组成：

CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT。(SEQ ID NO:5)

在本公开的组合物的一些实施方案中，编码3'ITR的序列来源于AAV2的3’ITR序列。在一些实施方案中，编码3'ITR的序列包含与AAV2的3'ITR的序列相同的序列。在一些实施方案中，编码3'ITR的序列包含以下核苷酸序列或由其组成：

AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAG。(SEQ ID NO:6)

在本公开的组合物的一些实施方案中，多核苷酸还包含Kozak序列。在一些实施方案中，Kozak序列包含GGCCACCATG(SEQ ID NO:7)的核苷酸序列或由其组成。

在本公开的组合物的一些实施方案中，多核苷酸包含以下序列或由其组成：

1 CTGCGCGCTC GCTCGCTCAC TGAGGCCGCC CGGGCGTCGG GCGACCTTTG GTCGCCCGGC

61 CTCAGTGAGC GAGCGAGCGC GCAGAGAGGG AGTGGCCAAC TCCATCACTAGGGGTTCCTG

121 CGGCAATTCAGTCGATAACT ATAACGGTCC TAAGGTAGCG ATTTAAATAC GCGCTCTCTT

181 AAGGTAGCCC CGGGACGCGT CAATTGGGGC CCCAGAAGCC TGGTGGTTGT TTGTCCTTCT

241 CAGGGGAAAA GTGAGGCGGC CCCTTGGAGG AAGGGGCCGG GCAGAATGAT CTAATCGGAT

301 TCCAAGCAGC TCAGGGGATT GTCTTTTTCT AGCACCTTCT TGCCACTCCT AAGCGTCCTC

361 CGTGACCCCG GCTGGGATTT AGCCTGGTGC TGTGTCAGCC CCGGGGCCAC CATGAGAGAG

421 CCAGAGGAGC TGATGCCAGA CAGTGGAGCA GTGTTTACAT TCGGAAAATC TAAGTTCGCT

481 GAAAATAACC CAGGAAAGTT CTGGTTTAAA AACGACGTGC CCGTCCACCT GTCTTGTGGC

541 GATGAGCATA GTGCCGTGGT CACTGGGAAC AATAAGCTGT ACATGTTCGG GTCCAACAAC

601 TGGGGACAGC TGGGGCTGGG ATCCAAATCT GCTATCTCTA AGCCAACCTG CGTGAAGGCA

661 CTGAAACCCG AGAAGGTCAA ACTGGCCGCT TGTGGCAGAA ACCACACTCT GGTGAGCACC

721 GAGGGCGGGA ATGTCTATGC CACCGGAGGC AACAATGAGG GACAGCTGGG ACTGGGGGAC

781 ACTGAGGAAA GGAATACCTT TCACGTGATC TCCTTCTTTA CATCTGAGCA TAAGATCAAG

841 CAGCTGAGCG CTGGCTCCAA CACATCTGCA GCCCTGACTG AGGACGGGCG CCTGTTCATG

901 TGGGGAGATA ATTCAGAGGG CCAGATTGGG CTGAAAAACG TGAGCAATGT GTGCGTCCCT

961 CAGCAGGTGA CCATCGGAAA GCCAGTCAGT TGGATTTCAT GTGGCTACTA TCATAGCGCC

1021 TTCGTGACCA CAGATGGCGA GCTGTACGTC TTTGGGGAGC CCGAAAACGGAAAACTGGGC

1081 CTGCCTAACC AGCTGCTGGG CAATCACCGG ACACCCCAGC TGGTGTCCGAGATCCCTGAA

1141 AAAGTGATCC AGGTCGCCTG CGGGGGAGAG CATACAGTGG TCCTGACTGAGAATGCTGTG

1201 TATACCTTCG GACTGGGCCA GTTTGGCCAG CTGGGGCTGG GAACCTTCCTGTTTGAGACA

1261 TCCGAACCAA AAGTGATCGA GAACATTCGC GACCAGACTA TCAGCTACATTTCCTGCGGA

1321 GAGAATCACA CCGCACTGAT CACAGACATT GGCCTGATGT ATACCTTTGGCGATGGACGA

1381 CACGGGAAGC TGGGACTGGG ACTGGAGAAC TTCACTAATC ATTTTATCCCCACCCTGTGT

1441 TCTAACTTCC TGCGGTTCAT CGTGAAACTG GTCGCTTGCG GCGGGTGTCACATGGTGGTC

1501 TTCGCTGCAC CTCATAGGGG CGTGGCTAAG GAGATCGAAT TTGACGAGATTAACGATACA

1561 TGCCTGAGCG TGGCAACTTT CCTGCCATAC AGCTCCCTGA CTTCTGGCAATGTGCTGCAG

1621 AGAACCCTGA GTGCAAGGAT GCGGAGAAGG GAGAGGGAAC GCTCTCCTGACAGTTTCTCA

1681 ATGCGACGAA CCCTGCCACC TATCGAGGGA ACACTGGGAC TGAGTGCCTGCTTCCTGCCT

1741 AACTCAGTGT TTCCACGATG TAGCGAGCGG AATCTGCAGG AGTCTGTCCTGAGTGAGCAG

1801 GATCTGATGC AGCCAGAGGA ACCCGACTAC CTGCTGGATG AGATGACCAAGGAGGCCGAA

1861 ATCGACAACT CTAGTACAGT GGAGTCCCTG GGCGAGACTA CCGATATCCTGAATATGACA

1921 CACATTATGT CACTGAACAG CAATGAGAAG AGTCTGAAAC TGTCACCAGTGCAGAAGCAG

1981 AAGAAACAGC AGACTATTGG CGAGCTGACT CAGGACACCG CCCTGACAGAGAACGACGAT

2041 AGCGATGAGT ATGAGGAAAT GTCCGAGATG AAGGAAGGCA AAGCTTGTAAGCAGCATGTC

2101 AGTCAGGGGA TCTTCATGAC ACAGCCAGCC ACAACTATTG AGGCTTTTTCAGACGAGGAA

2161 GTGGAGATCC CCGAGGAAAA AGAGGGCGCA GAAGATTCCA AGGGGAATGGAATTGAGGAA

2221 CAGGAGGTGG AAGCCAACGA GGAAAATGTG AAAGTCCACG GAGGCAGGAAGGAGAAAACA

2281 GAAATCCTGT CTGACGATCT GACTGACAAG GCCGAGGTGT CCGAAGGCAAGGCAAAATCT

2341 GTCGGAGAGG CAGAAGACGG ACCAGAGGGA CGAGGGGATG GAACCTGCGAGGAAGGCTCA

2401 AGCGGGGCTG AGCATTGGCA GGACGAGGAA CGAGAGAAGG GCGAAAAGGATAAAGGCCGC

2461 GGGGAGATGG AACGACCTGG AGAGGGCGAA AAAGAGCTGG CAGAGAAGGAGGAATGGAAG

2521 AAAAGGGACG GCGAGGAACA GGAGCAGAAA GAAAGGGAGC AGGGCCACCAGAAGGAGCGC

2581 AACCAGGAGA TGGAAGAGGG CGGCGAGGAA GAGCATGGCG AGGGAGAAGAGGAAGAGGGC

2641 GATAGAGAAG AGGAAGAGGA AAAAGAAGGC GAAGGGAAGG AGGAAGGAGAGGGCGAGGAA

2701 GTGGAAGGCG AGAGGGAAAA GGAGGAAGGA GAACGGAAGA AAGAGGAAAGAGCCGGCAAA

2761 GAGGAAAAGG GCGAGGAAGA GGGCGATCAG GGCGAAGGCG AGGAGGAAGAGACCGAGGGC

2821 CGCGGGGAAG AGAAAGAGGA GGGAGGAGAG GTGGAGGGCG GAGAGGTCGAAGAGGGAAAG

2881 GGCGAGCGCG AAGAGGAAGA GGAAGAGGGC GAGGGCGAGG AAGAAGAGGGCGAGGGGGAA

2941 GAAGAGGAGG GAGAGGGCGA AGAGGAAGAG GGGGAGGGAA AGGGCGAAGAGGAAGGAGAG

3001 GAAGGGGAGG GAGAGGAAGA GGGGGAGGAG GGCGAGGGGG AAGGCGAGGAGGAAGAAGGA

3061 GAGGGGGAAG GCGAAGAGGA AGGCGAGGGG GAAGGAGAGG AGGAAGAAGGGGAAGGCGAA

3121 GGCGAAGAGG AGGGAGAAGG AGAGGGGGAG GAAGAGGAAG GAGAAGGGAAGGGCGAGGAG

3181 GAAGGCGAAG AGGGAGAGGG GGAAGGCGAG GAAGAGGAAG GCGAGGGCGAAGGAGAGGAC

3241 GGCGAGGGCG AGGGAGAAGA GGAGGAAGGG GAATGGGAAG GCGAAGAAGAGGAAGGCGAA

3301 GGCGAAGGCG AAGAAGAGGG CGAAGGGGAG GGCGAGGAGG GCGAAGGCGAAGGGGAGGAA

3361 GAGGAAGGCG AAGGAGAAGG CGAGGAAGAA GAGGGAGAGG AGGAAGGCGAGGAGGAAGGA

3421 GAGGGGGAGG AGGAGGGAGA AGGCGAGGGC GAAGAAGAAG AAGAGGGAGAAGTGGAGGGC

3481 GAAGTCGAGG GGGAGGAGGG AGAAGGGGAA GGGGAGGAAG AAGAGGGCGAAGAAGAAGGC

3541 GAGGAAAGAG AAAAAGAGGG AGAAGGCGAG GAAAACCGGA GAAATAGGGAAGAGGAGGAA

3601 GAGGAAGAGG GAAAGTACCA GGAGACAGGC GAAGAGGAAA ACGAGCGGCAGGATGGCGAG

3661 GAATATAAGA AAGTGAGCAA GATCAAAGGA TCCGTCAAGT ACGGCAAGCACAAAACCTAT

3721 CAGAAGAAAA GCGTGACCAA CACACAGGGG AATGGAAAAG AGCAGAGGAGTAAGATGCCT

3781 GTGCAGTCAA AACGGCTGCT GAAGAATGGC CCATCTGGAA GTAAAAAATTCTGGAACAAT

3841 GTGCTGCCCC ACTATCTGGA ACTGAAATAA GAGCTCCTCG AGGCGGCCCGCTCGAGTCTA

3901 GAGGGCCCTT CGAAGGTAAG CCTATCCCTA ACCCTCTCCT CGGTCTCGATTCTACGCGTA

3961 CCGGTCATCA TCACCATCAC CATTGAGTTT AAACCCGCTG ATCAGCCTCGACTGTGCCTT

4021 CTAGTTGCCA GCCATCTGTT GTTTGCCCCT CCCCCGTGCC TTCCTTGACCCTGGAAGGTG

4081 CCACTCCCAC TGTCCTTTCC TAATAAAATG AGGAAATTGC ATCGCATTGTCTGAGTAGGT

4141 GTCATTCTAT TCTGGGGGGT GGGGTGGGGC AGGACAGCAA GGGGGAGGATTGGGAAGACA

4201 ATAGCAGGCA TGCTGGGGAT GCGGTGGGCT CTATGGCTTC TGAGGCGGAAAGAACCAGAT

4261 CCTCTCTTAA GGTAGCATCG AGATTTAAAT TAGGGATAAC AGGGTAATGGCGCGGGCCGC

4321 AGGAACCCCT AGTGATGGAG TTGGCCACTC CCTCTCTGCG CGCTCGCTCGCTCACTGAGG

4381 CCGGGCGACC AAAGGTCGCC CGACGCCCGG GCTTTGCCCG GGCGGCCTCAGTGAGCGAGC

4441 GAGCGCGCAG。(SEQ ID NO:8)

在本公开的组合物的一些实施方案中，多核苷酸还包含编码土拨鼠翻译后调控元件(WPRE)的序列。在一些实施方案中，WPRE包含以下核苷酸序列：

1 atcaacctct ggattacaaa atttgtgaaa gattgactgg tattcttaac tatgttgctc

61 cttttacgct atgtggatac gctgctttaa tgcctttgta tcatgctatt gcttcccgta

121 tggctttcat tttctcctcc ttgtataaat cctggttgct gtctctttat gaggagttgt

181 ggcccgttgt caggcaacgt ggcgtggtgt gcactgtgtt tgctgacgca acccccactg

241 gttggggcat tgccaccacc tgtcagctcc tttccgggac tttcgctttc cccctcccta

301 ttgccacggc ggaactcatc gccgcctgcc ttgcccgctg ctggacaggg gctcggctgt

361 tgggcactga caattccgtg gtgttgtcgg ggaaatcatc gtcctttcct tggctgctcg

421 cctgtgttgc cacctggatt ctgcgcggga cgtccttctg ctacgtccct tcggccctca

481 atccagcgga ccttccttcc cgcggcctgc tgccggctct gcggcctctt ccgcgtcttc

541 gccttcgccc tcagacgagt cggatctccc tttgggccgc ctccccgc。(SEQ ID NO:9)

在本公开的组合物的一些实施方案中，rAAV8粒子中的每一者包含从AAV血清型8(AAV8)Rep蛋白分离或衍生的Rep蛋白。

在本公开的组合物的一些实施方案中，rAAV8粒子中的每一者包含从AAV血清型8(AAV8)Cap蛋白分离或衍生的病毒Cap蛋白。

本公开提供了一种装置，所述装置包含本公开的组合物。

在本公开的装置的一些实施方案中，装置包括微量递送装置。在一些实施方案中，微量递送装置包括微针。在一些实施方案中，微针适合于视网膜下递送。在一些实施方案中，装置包含至少50μL的体积。在一些实施方案中，装置包含5μL、10μL、15μL、20μL、25μL、50μL、75μL、100μL、150μL、200μL、250μL、300μL、350μL、400μL、450μL、500μL、550μL、600μL、650μL、700μL、750μL、800μL、850μL、900μL 950μL、1000μL或其间任何数目的μL的体积。

在本公开的装置的一些实施方案中，装置包括微量递送装置。在一些实施方案中，微量递送装置包括微导管。在一些实施方案中，装置适合于脉络膜上腔递送。在一些实施方案中，装置包含至少50μL的体积。在一些实施方案中，装置包含5μL、10μL、15μL、20μL、25μL、50μL、75μL、100μL、150μL、200μL、250μL、300μL、350μL、400μL、450μL、500μL、550μL、600μL、650μL、700μL、750μL、800μL、850μL、900μL 950μL、1000μL或其间任何数目的μL的体积。

本公开提供了一种治疗有需要的受试者的色素性视网膜炎的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本公开的组合物。

本公开提供了一种治疗有需要的受试者的色素性视网膜炎的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的组合物，其中所述施用使用本公开的装置进行。

在本公开的治疗色素性视网膜炎的方法的一些实施方案中，施用治疗有效量的组合物改善受试者中的色素性视网膜炎迹象。

在本公开的治疗色素性视网膜炎的方法的一些实施方案中，色素性视网膜炎迹象包括当与健康椭圆体带(EZ)相比时EZ的变性。在一些实施方案中，EZ变性包括当与健康EZ相比时感光细胞密度降低、感光纤毛数目减少或它们的组合。在一些实施方案中，EZ变性包括当与健康EZ相比时EZ的宽度减小，其中宽度包含内部感光段与外部感光段之间的距离。在一些实施方案中，EZ变性包括当与健康EZ相比时EZ的长度减小，其中长度包含沿眼睛的前-后(A/P)轴、背-腹(D/V)轴或内-外(M/L)轴中的一者或多者的距离。在一些实施方案中，EZ变性包括当与健康EZ相比时EZ的面积减小，其中面积包含π乘以沿眼睛的前-后(A/P)轴、背-腹(D/V)轴或内-外(M/L)轴中的一者或多者的距离的平方。

在本公开的治疗色素性视网膜炎的方法的一些实施方案中，健康EZ包括不具有色素性视网膜炎迹象或症状的年龄和性别匹配的个体的EZ。在一些实施方案中，不具有色素性视网膜炎迹象或症状的年龄和性别匹配的个体不具有发展色素性视网膜炎的风险因素。在一些实施方案中，健康EZ包括预定对照或阈值。在一些实施方案中，预定对照或阈值包括由来自多个个体的多个健康EZ的测量确定的均值或平均值。在一些实施方案中，多个个体的年龄和性别与受试者相匹配。在一些实施方案中，健康EZ包括受试者的未受影响的眼睛。在一些实施方案中，未受影响的眼睛不具有可检测的色素性视网膜炎迹象。在一些实施方案中，未受影响的眼睛不具有可检测的EZ变性。

在本公开的治疗色素性视网膜炎的方法的一些实施方案中，色素性视网膜炎迹象包括当与基线椭圆体带(EZ)相比时EZ的变性。在一些实施方案中，基线EZ包括在施用组合物之前对个体的EZ变性的测量。在一些实施方案中，受试者的EZ变性的测量包括测定EZ的一部分中的活的或有活力的光感受器的数目、EZ的一部分中的纤毛的数目、EZ的一部分的宽度、沿EZ的一部分中的一个或多个轴的EZ长度、EZ的一部分的面积或它们的任何组合。

在本公开的治疗色素性视网膜炎的方法的一些实施方案中，施用治疗有效量的组合物使色素性视网膜炎迹象或症状得以改善，其中色素性视网膜炎迹象包括当与健康EZ或基线EZ相比时椭圆体带(EZ)的变性，并且其中改善包括EZ的宽度增加1μm至20μm，端点包括在内。在一些实施方案中，改善包括使EZ的宽度增加3μm至15μm，端点包括在内。在一些实施方案中，改善包括使EZ的宽度增加0.8μm至320μm，端点包括在内。

在本公开的治疗色素性视网膜炎的方法的一些实施方案中，改善包括当与基线EZ相比时使EZ的宽度增加1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或其间任何百分比。在一些实施方案中，改善包括使眼睛的一个或多个扇区中的EZ宽度均匀地增加。在一些实施方案中，改善包括使眼睛的一个或多个扇区的EZ宽度不均匀地增加，其中在黄斑处或一个或多个中心扇区内增加的宽度最大并且其中在一个或多个外周扇区处增加的宽度最小。

在本公开的治疗色素性视网膜炎的方法的一些实施方案中，改善包括使EZ沿A/P轴的长度增加。在一些实施方案中，改善包括使EZ沿D/V轴的长度增加。在一些实施方案中，改善包括使EZ沿M/L轴的长度增加。

在本公开的治疗色素性视网膜炎的方法的一些实施方案中，改善包括当与基线EZ相比时使EZ的长度增加1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或其间任何百分比。

在本公开的治疗色素性视网膜炎的方法的一些实施方案中，当与基线EZ相比时，施用治疗有效量的组合物使EZ进一步变性的速率降低或抑制进一步变性。在一些实施方案中，在施用组合物之后，EZ的一部分中的活的或有活力的光感受器的数目、EZ的一部分中的纤毛的数目、EZ的一部分的宽度、沿EZ的一部分中的一个或多个轴的EZ长度、EZ的一部分的面积或它们的任何组合等于当与基线EZ相比时EZ的所述部分中的活的或有活力的光感受器的数目、EZ的所述部分中的纤毛的数目、EZ的所述部分的宽度、沿EZ的所述部分中的一个或多个轴的EZ长度或它们的任何组合。

在本公开的治疗色素性视网膜炎的方法的一些实施方案中，使用光学相干断层扫描(OCT)来测量受试者的EZ的一部分的宽度或长度或者健康EZ的一部分的宽度或长度。

在本公开的治疗色素性视网膜炎的方法的一些实施方案中，色素性视网膜炎迹象包括当与健康视网膜厚度和/或健康外核层(ONL)厚度相比时视网膜厚度和/或ONL厚度减小。

在本公开的治疗色素性视网膜炎的方法的一些实施方案中，健康视网膜厚度或健康ONL厚度为不具有色素性视网膜炎迹象或症状的年龄和性别匹配的个体的视网膜厚度或ONL厚度。在一些实施方案中，不具有色素性视网膜炎迹象或症状的年龄和性别匹配的个体不具有发展色素性视网膜炎的风险因素。在一些实施方案中，健康视网膜厚度或健康ONL厚度包括预定对照或阈值。在一些实施方案中，预定对照或阈值包括由来自多个个体的多个健康视网膜厚度或健康ONL厚度的测量确定的均值或平均值。在一些实施方案中，多个个体的年龄和性别与受试者相匹配。在一些实施方案中，健康视网膜厚度或健康ONL厚度包括受试者的未受影响的眼睛。在一些实施方案中，未受影响的眼睛不具有可检测的色素性视网膜炎迹象。在一些实施方案中，未受影响的眼睛不具有可检测的视网膜厚度或ONL厚度减小。

在本公开的治疗色素性视网膜炎的方法的一些实施方案中，色素性视网膜炎迹象的改善包括当与基线视网膜厚度和/或ONL厚度相比时视网膜厚度和/或ONL厚度有所增加。在一些实施方案中，基线视网膜厚度和/或ONL厚度包括在施用组合物之前对视网膜厚度和/或ONL厚度的测量。

在本公开的治疗色素性视网膜炎的方法的一些实施方案中，施用治疗有效量的组合物改善色素性视网膜炎迹象或症状，其中色素性视网膜炎迹象包括当与健康EZ相比时视网膜厚度和/或ONL厚度有所减小。

在本公开的治疗色素性视网膜炎的方法的一些实施方案中，改善包括当与基线视网膜厚度和/或ONL厚度相比时使视网膜厚度和/或ONL厚度增加1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或其间任何百分比。在一些实施方案中，改善包括使眼睛的一个或多个扇区的视网膜厚度和/或ONL厚度均匀地增加。在一些实施方案中，改善包括使眼睛的一个或多个扇区的视网膜厚度和/或ONL厚度不均匀地增加，其中在黄斑处或一个或多个中心扇区内增加的厚度最大并且其中在一个或多个外周扇区处增加的厚度最小。

在本公开的治疗色素性视网膜炎的方法的一些实施方案中，当与基线视网膜厚度和/或ONL厚度相比时，施用治疗有效量的组合物使视网膜厚度和/或ONL厚度进一步变性的速率降低或抑制进一步变性。

在本公开的治疗色素性视网膜炎的方法的一些实施方案中，使用OCT来测量受试者的视网膜厚度和/或ONL厚度或健康个体的视网膜厚度和/或ONL厚度。

在本公开的治疗色素性视网膜炎的方法的一些实施方案中，当与施用组合物之前受试者的光感受器外段相比时，施用治疗有效量的组合物诱导光感受器外段的再生。

在本公开的治疗色素性视网膜炎的方法的一些实施方案中，色素性视网膜炎迹象包括与健康视网膜敏感度水平相比视网膜敏感度水平有所降低。在一些实施方案中，使用微视野检查来测量视网膜敏感度水平。在一些实施方案中，测量视网膜敏感度水平包括：(a)产生受试者的眼睛的眼底图像；(b)将点栅格投射至(a)的图像上；(c)在(b)的栅格上的每个点处用光刺激眼睛，其中每次后续刺激与前一刺激相比具有更大的强度；(d)将步骤(c)重复至少一次；(e)对(b)的栅格上的每个点测定最小阈值，其中最小阈值为受试者可首次感知(c)中的光时的光强度；以及(f)将来自(e)的最小阈值从asb转化为分贝(dB)，其中光的最大强度等于0dB并且光的最小强度等于dB量表的最大dB值，或其中光的最大强度等于0dB的视网膜敏感度并且光的最小强度等于定量视网膜敏感度的dB量表的最大dB值。在一些实施方案中，(c)的刺激步骤包括在约4至1000阿熙提(apostilb)(asb)范围内的光刺激。在一些实施方案中，栅格包含至少37个点。在一些实施方案中，栅格包含68个点或由其组成。在一些实施方案中，点在直径涵盖10°的眼睛的圆上均匀地隔开。在一些实施方案中，圆以黄斑为中心。在一些实施方案中，测量视网膜敏感度水平还包括对(b)的栅格中的每个点处的最小阈值取均值以产生平均视网膜敏感度。

在本公开的治疗色素性视网膜炎的方法的一些实施方案中，使用不具有色素性视网膜炎迹象或症状的年龄和性别匹配的个体测定健康视网膜敏感度水平。在一些实施方案中，不具有色素性视网膜炎迹象或症状的年龄和性别匹配的个体不具有发展色素性视网膜炎的风险因素。在一些实施方案中，使用预定对照或阈值确定健康视网膜敏感度水平。在一些实施方案中，预定对照或阈值包括由来自多个个体的多个健康视网膜敏感度水平的测量确定的均值或平均值。在一些实施方案中，多个个体的年龄和性别与受试者相匹配。在一些实施方案中，从受试者的未受影响的眼睛测量健康视网膜敏感度水平。在一些实施方案中，未受影响的眼睛不具有可检测的色素性视网膜炎迹象。在一些实施方案中，未受影响的眼睛不具有可检测的视网膜敏感度水平降低。在一些实施方案中，色素性视网膜炎迹象包括当与基线视网膜敏感度水平相比时视网膜敏感度水平有所降低。在一些实施方案中，基线视网膜敏感度水平包括在施用组合物之前对受试者的视网膜敏感度水平的测量。

在本公开的治疗色素性视网膜炎的方法的一些实施方案中，当与健康视网膜敏感度水平相比时，施用治疗有效量的组合物使受试者的视网膜敏感度得以恢复。在一些实施方案中，恢复视网膜敏感度包括当与健康视网膜敏感度水平相比时视网膜的一部分中的平均视网膜敏感度有所增加。在一些实施方案中，受试者的视网膜的一部分中的平均视网膜敏感度等于处于健康视网膜敏感度水平的视网膜的所述部分中的平均视网膜敏感度。

在本公开的治疗色素性视网膜炎的方法的一些实施方案中，当与基线视网膜敏感度水平相比时，施用治疗有效量的组合物使受试者的视网膜敏感度得以改善。在一些实施方案中，改善视网膜敏感度包括当与基线视网膜敏感度水平相比时使视网膜的一部分中的平均视网膜敏感度增加。在一些实施方案中，改善视网膜敏感度包括平均视网膜敏感度水平增加1至30分贝(dB)，端点包括在内。在一些实施方案中，改善视网膜敏感度包括平均视网膜敏感度水平增加1至15dB，端点包括在内。在一些实施方案中，改善视网膜敏感度包括平均视网膜敏感度水平增加2至10dB，端点包括在内。在一些实施方案中，改善视网膜敏感度包括平均视网膜敏感度水平增加至少5dB、至少6dB、至少7dB、至少8dB、至少9dB或至少10dB。在一些实施方案中，改善视网膜敏感度包括平均视网膜敏感度水平增加至少7dB。

在一些实施方案中，改善视网膜敏感度包括在1-68个点(端点包括在内)中敏感度增加至少5dB、至少6dB、至少7dB、至少8dB、至少9dB或至少10dB。在一些实施方案中，改善视网膜敏感度包括在至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个、至少60个或至少65个点中敏感度增加至少7dB。

在一些实施方案中，改善视网膜敏感度包括在68点栅格的中心16个点中的至少5个点中敏感度增加至少5dB、至少6dB、至少7dB、至少8dB、至少9dB或至少10dB。

在一些实施方案中，改善视网膜敏感度包括在68点栅格的中心16个点中的至少5个点中敏感度增加至少7dB。在一些实施方案中，改善视网膜敏感度包括在68点栅格的至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个、至少60个或至少65个点中敏感度增加至少7dB。在一些实施方案中，改善视网膜敏感度包括在68点栅格的至少60个或至少65个点中敏感度增加至少7dB。在一些实施方案中，改善视网膜敏感度包括在68点栅格的所有点中敏感度增加至少5dB、至少6dB、至少7dB、至少8dB、至少9dB或至少10dB。在一些实施方案中，改善视网膜敏感度包括在68点栅格的所有点中敏感度增加至少7dB。

在一些实施方案中，改善视网膜敏感度包括当与基线视网膜敏感度水平相比时在平均视网膜敏感度水平中平均视网膜敏感度水平增加1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或其间任何百分比。在一些实施方案中，在微视野检查栅格内的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个或其间任何数目的点中发生了平均视网膜敏感度水平增加。在一些实施方案中，在微视野检查栅格内的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或其间任何百分比中发生了平均视网膜敏感度水平增加。

在本公开的治疗色素性视网膜炎的方法的一些实施方案中，当与基线视网膜敏感度水平相比时，施用治疗有效量的组合物抑制受试者的视网膜敏感度进一步降低或预防视网膜敏感度损失。在一些实施方案中，在施用组合物之后受试者中的视网膜敏感度水平等于基线视网膜敏感度水平。

本公开提供了一种预防受试者的色素性视网膜炎的方法，所述方法包括向受试者施用预防有效量的本公开的组合物，其中受试者处于发展色素性视网膜炎的风险中。在一些实施方案中，受试者具有发展色素性视网膜炎的风险因素。在一些实施方案中，所述因素包括以下中的一者或多者：基因标记物、色素性视网膜炎家族史、色素性视网膜炎症状或它们的组合。在一些实施方案中，色素性视网膜炎症状包含视敏度降低或损失。在一些实施方案中，视敏度涉及夜间视觉、周边视觉、颜色视觉或它们的任何组合。

在本公开的方法的一些实施方案中，通过视网膜下途径施用组合物。在一些实施方案中，通过视网膜下注射或输注施用组合物。在一些实施方案中，通过视网膜下注射施用组合物并且其中注射包含50μL至1000μL的体积，端点包括在内。在一些实施方案中，通过视网膜下注射施用组合物并且其中注射包含50μL至300μL的体积，端点包括在内。在一些实施方案中，通过视网膜下注射施用组合物并且其中注射包含100μL或至多100μL(例如25-100μL、50-100μL、75-100μL)的体积。在一些实施方案中，视网膜下注射包括两步注射。在一些实施方案中，两步注射包括：(a)将微针插入受试者眼睛中的感光细胞层与视网膜色素上皮(RPE)层之间；(b)将溶液以足以使视网膜从RPE部分脱离而形成泡的量注射在受试者眼睛中的感光细胞层与视网膜色素上皮层之间；以及(c)将组合物注射至(b)的泡中。在一些实施方案中，溶液包括平衡盐溶液。

在本公开的方法的一些实施方案中，通过脉络膜上腔途径施用组合物。在一些实施方案中，通过脉络膜上腔注射或输注施用组合物。在一些实施方案中，通过脉络膜上腔注射施用组合物并且其中注射包含50至1000μL的体积，端点包括在内。在一些实施方案中，注射包含50至300μL的体积，端点包括在内。在一些实施方案中，注射包含50至200μL的体积，端点包括在内。在一些实施方案中，注射包含50至100μL的体积，端点包括在内。在一些实施方案中，脉络膜上腔注射包括：(a)使微量递送装置的中空端与受试者眼睛的脉络膜上腔空间接触，其中中空端包含开口；以及(b)使组合物流过微量递送装置的中空端以将组合物引入脉络膜上腔空间中。在一些实施方案中，脉络膜上腔注射包括其中微量递送装置的中空端刺穿巩膜，其中微量递送装置的中空端或其延伸部横穿脉络膜上腔空间的一部分，以及其中微量递送装置的中空端至少一次横穿脉络膜。

附图说明

本专利或申请文件含有至少一个以彩色显示的图式。在有要求并且支付必要费用后，办公室将提供此具有彩色图式的专利申请公布的副本。

图1为示出在通过在一只眼睛中注射AAV-RPGR^ORF15基因疗法载体治疗色素性视网膜炎的7个受试者中测量的最佳矫正视敏度(BCVA)的表格。在基线(注射之前)、注射AAVRPGR^ORF15载体之后1周、1个月、3个月、6个月以及9个月中的每一时间在每只眼睛中使用早期治疗糖尿病性视网膜病变(EDTRS)字母评估BCVA。底部指示了3个月和6个月的变化。

图2为示出来自通过在一只眼睛中注射AAV-RPGR^ORF15组合物来治疗色素性视网膜炎的7个受试者的平均阈值视网膜敏感度(分贝(dB))的微视野检查测量的表格。在注射之前(在基线处)并且至少在注射AAV RPGR^ORF15载体之后1个月时，在两只眼睛中评估平均阈值。在一些情况下，在6个月和9个月时进行额外的测量。底部指示了3个月和6个月的变化。

图3为3个月时视网膜敏感度变化的图。在Y轴上为相较于基线的视网膜敏感度变化(分贝(dB))。在X轴上，通过队列示出了处理和未处理的眼睛。TE＝处理的眼睛，CE＝对照眼睛。

图4A至4B各自为示出JH90 OD(对照眼睛)在基线处在注射AAV-RPGR^ORF15之前(图4A)以及在另一只处理的眼睛中注射AAV-RPGR^ORF15之后3个月时(图4B)的微视野检查数据的一系列图像和图。基线(图4A)的平均阈值(dB)为0.9，而3个月的平均阈值(dB)为0.8。固视稳定性为在基线处稳定(P1＝100％，P2＝100％，图4A)，并且在3个月时稳定(P1＝100％，P2＝100％，图4B)。基线(图4A)的二元轮廓椭圆面积(BCEA)为：63％BCEA：0.7°x0.4°，面积＝0.2°²，角度＝-3.1°；95％BCEA：1.2°x0.7°，面积＝0.7°²，角度＝-3.1°。3个月(图4B)的BCEA为：63％BCEA：0.5°x0.3°，面积＝0.1°²，角度＝0.2°；95％BVCEA：0.9°x0.5°，面积＝0.3°²，角度＝0.2°。

图5A至5B各自为示出JH90 OS(处理的眼睛)在基线处在注射AAV-RPGR^ORF15之前(图5A)以及注射AAV-RPGR^ORF15之后3个月时(图5B)的微视野检查数据的一系列图像和图。基线(图5A)的平均阈值(dB)为0，而3个月的平均阈值(dB)为0.9。固视稳定性为在基线处相对不稳定(P1＝37％，P2＝82％，图5A)，并且在3个月时稳定(P1＝99％，P2＝100％，图5B)。基线(图5A)的BCEA为：63％BCEA：4.4°x2.3°，面积＝8.0°²，角度＝0.2°；95％BCEA：7.6°x4.0°，面积＝24.0°²，角度＝0.2°。3个月(图5B)的BCEA为：63％BCEA：0.6°x0.2°，面积＝8.0°²，角度＝-5.7°；95％BCEA：1.0°x0.7°，面积＝0.5°²，角度＝-5.7°。

图6A至6B各自为示出AH85 OD(对照眼睛)在基线处在注射AAV-RPGR^ORF15之前(图6A)以及在另一只处理的眼睛中注射AAV-RPGR^ORF15之后3个月时(图6B)的微视野检查数据的一系列图像和图。基线(图6A)的平均阈值(dB)为0.8，而3个月的平均阈值(dB)为1.4。固视稳定性为在基线处稳定(P1＝83％，P2＝88％，图6A)，并且在3个月时稳定(P1＝96％，P2＝100％，图6B)。基线(图6A)的BCEA为：63％BVCEA：4.1°x2.3°，面积＝5.0°²，角度＝-13.6°；95％BVCEA：7.1°x2.7°，面积＝15.0°²，角度＝-13.6°。3个月(图6B)的BCEA为：63％BVCEA：1.1°x0.7°，面积＝0.6°²，角度＝-0.6°；95％BCEA：1.9°x1.2°，面积＝1.7°²，角度＝-0.6°。

图7A至7B各自为示出AH85 OS(处理的眼睛)在基线处在注射AAV-RPGR^ORF15之前(图6A)以及注射AAV-RPGR^ORF15之后3个月时(图6B)的微视野检查数据的一系列图像和图。基线(图7A)的平均阈值(dB)为0.9，而3个月的平均阈值(dB)为4.3。固视稳定性为在基线处稳定(P1＝98％，P2＝100％，图7A)，并且在3个月时稳定(P1＝98％，P2＝100％，图7B)。基线(图7A)的BCEA为：63％BCEA：0.8°x0.9°，面积＝0.6°²，角度＝50.4°；95％BCEA：1.4°x1.6°，面积＝1.8°²，角度＝50.4°。3个月(图7B)的BCEA为：63％BCEA：0.8°x0.8°，面积＝0.5°²，角度＝-9.0°；95％BCEA：1.5°x1.4°，面积＝1.6°²，角度＝-9.0°。

图8A至8B各自为示出KL94 OS(对照眼睛)在基线处在注射AAV RPGR^ORF15之前(图8A)以及在另一只处理的眼睛中注射AAV RPGR^ORF15之后1个月时(图8B)的微视野检查数据的一系列图像和图。基线(图8A)的平均阈值(dB)为0.7，而1个月的平均阈值(dB)为0.5。固视稳定性为在基线处稳定(P1＝95％，P2＝100％，图8A)，并且在1个月时稳定(P1＝99％，P2＝100％，图8B)。基线(图8A)的BCEA为：63％BCEA：1.1°x0.8°，面积＝0.7°²，角度＝12.1°；95％BCEA：2.0°x1.4°，面积＝2.2°²，角度＝12.1°。1个月(图8B)的BCEA为：63％BCEA：0.9°x0.6°，面积＝0.4°²，角度＝-13.5°；95％BCEA：1.6°x1.1°，面积＝1.3°²，角度＝-13.5°。

图9A至9B各自为示出KL94 OD(处理的眼睛)在基线处在注射AAV RPGR^ORF15之前(图9A)以及注射AAV RPGR^ORF15之后1个月时(图9B)的微视野检查数据的一系列图像和图。基线(图9A)的平均阈值(dB)为0.5，而1个月的平均阈值(dB)为3.4。固视稳定性为在基线处稳定(P1＝90％，P2＝97％，图9A)，并且在1个月时稳定(P1＝100％，P2＝100％，图9B)。基线(图9A)的BCEA为：63％BCEA：1.2°x1.4°，面积＝1.3°²，角度＝51.2°；95％BCEA：2.2°x2.4°，面积＝4.0°²，角度＝51.2°。1个月(图9B)的BCEA为：63％BCEA：0.7°x0.6°，面积＝0.4°²，角度＝-16.7°；95％BCEA：1.3°x1.1°，面积＝1.1°²，角度＝-16.7°。

图10为描述在通过在一只眼睛中注射AAV-RPGR^ORF15组合物来治疗色素性视网膜炎3个受试者中测量的平均视网膜厚度(中心1mm ETDRS圆的平均值)的表格。通过光学相干断层扫描(OCT)测量平均视网膜厚度。在基线处在注射AAV-RPGR^ORF15之前并且在注射AAV-RPGR^ORF15之后1个月和3个月时测量平均视网膜厚度。底部示出了3个月的变化。

图11A至11B各自为示出X连锁色素性视网膜炎的基因疗法之后的视网膜敏感度和结构变化的一系列图像。(图11A)从基线到处理后4个月时在治疗的眼睛中，平均视网膜敏感度(分贝，dB)和视野(由敏感度热图表示)如通过微视野检查所测量经历逐渐改善，而未处理的眼睛保持稳定。如通过早期治疗糖尿病性视网膜病变研究图表阅读(字母数目)所测量，在两只眼睛中视敏度均保持稳定。(图11B)黄斑上视网膜外核层(ONL)的完整节段(每次OCT线性扫描)揭示ONL局部变厚(如热图上的红色所示)，对应于与未处理的眼睛中没有显著变化相比，在处理的眼睛中敏感区域增加。中间列：1、3以及6mm ETDRS黄斑栅格上的平均扇区ONL厚度变化(μm)。右侧列：改变的ONL厚度的热图(红色表示厚度增加并且绿色表示厚度减小)。

图12A至12B各自为示出遵循使用1.0x10¹¹ gp AAV8.RPGR对右眼进行视网膜下基因疗法(图12A)并且对左眼不进行处理(图12B)的患者的原始微视野检查数据的一系列图像和图。对于每个微视野检查数据集，对在68个测试位点中的每一者处的阈值敏感度进行颜色编码并且覆盖在视网膜的扫描激光器检眼镜检查(SLO)图像(顶部右侧图)上。还将阈值敏感度数据显示为热图(中间左侧图)以及敏感度频率的柱状图，正常参考曲线以绿色显示(中间右侧图)。在整个测试中通过眼球跟踪器实时地评估患者的固视情况并且在顶部右侧图中绘制为精细的青色点。底部右侧图中示出了测试期间的固视稳定性(如由偏离中央凹的程度所指示)。如通过在两只眼中一致的头三次处理前基线视野测试所证明，没有学习效应，正如未处理的眼睛在手术之前和手术之后一般。仅处理的眼睛显示视网膜功能显著改善，在基因疗法之后约3-4个月时达到最大。

图13为AAV RPGR^ORF15多核苷酸的实施方案的图。多核苷酸从5'到3'包含5'反向末端重复序列(ITR)、视紫红蛋白激酶(RK)启动子、密码子优化的RPGR^ORF15序列(coRPGR)、牛生长激素聚腺苷酸化信号(bGH)以及3'ITR。

图14为人眼图解的剖视图。

图15为图14的人眼沿线2-2所取得的一部分的剖视图。

图16为图14的人眼沿线3.3所取得的一部分的剖视图，说明在不存在流体情况下的脉络膜上腔空间。

图17为图14的人眼沿线3-3所取得的一部分的剖视图，说明在存在流体情况下的脉络膜上腔空间。

图18A为展示包括将基因疗法组合物施用至脉络膜上腔空间的微针的装置的示意图。

图18B为展示穿过巩膜并且进入脉络膜上腔空间以递送基因疗法组合物的微针的示意图。

图19为本公开的说明性微导管端部的照片。在一些实施方案中，可使用诸如显示在devicepharm.net/iscience/US/itrack.htm的那些微导管。

图20为本公开的说明性微套管的示意图。

图21为用于AAV8-RPGR剂量递增研究的递增方案的示意图。DLT＝剂量限制毒性；MTD＝最大耐受剂量。

图22A至22B为展示AAV8-RPGR的视网膜下注射的示意图。(图22A)通过

操作系统进行标准玻璃体切除术以移除玻璃体凝胶，随后(图22B)在必要时通过注射BSS进行视网膜脱离，并且通过41号套管将0.1mL载体悬浮液注射至视网膜下空间中。

图23为RPGR基因的替代剪接的示意图。

图24A至24C为示出为产生普遍存在的RPGR mRNA而进行的RPGR基因的替代剪接的一系列示意图。

图25A至25C为示出为产生光感受器特异性RPGR mRNA-RPGR^ORF15而进行的RPGR基因的替代剪接的一系列示意图。

图26A至26D为示出为产生潜在毒性的截短RPGR mRNA而进行的RPGR基因的替代剪接的一系列示意图。

图27A至27C为示出为从AAV8载体产生恰当全长RPGR^ORF15 mRNA而进行的RPGR基因的密码子优化和替代剪接的一系列示意图。

图28为RPGR^ORF15密码子优化方案(SEQ ID NO:16和17)的示意图。

图29A为来自转染的HEK293T细胞的全蛋白溶解产物的蛋白质印迹。将未转染的细胞用作阴性对照(nc)，所述阴性对照仅显示在47kDa下的阳性条带，指示加载对照GAPDH。(图29B和图29C)以交替方式加载密码子优化和野生型质粒转染的细胞，并且定量在220kDa(指示RPGR)下的条带的信号强度。(图29B)针对加载对照(GAPDH)规范化之后的强度(任意单位(AU))的箱须图(中值，箱描绘下四分位数和上四分位数，须为最小和最大值)。(图29C)关于呈递变化倍数针对野生型水平规范化之后的柱状图(平均值±SD)。在证实数据集的正态分布(n＝4)之后，针对不等方差的成对样品通过单尾t检验来检验显著性。*p<0.005。参见Fischer等Mol Ther.2017；25(8):1854-1865。

图30A至30C为示出在RPGR基因翻译之后所产生的官能性ORF15区域的一系列示意图。

图31A为使用TTL5的RPGR谷氨酰化的示意图。图31B为谷氨酰化经由感光纤毛中的微管蛋白将RPGR移动至光感受器的外段的示意图。

图32A为RPGR ORF15缺失对蛋白质的谷氨酰化的效应的示意图。图32B为缺陷型RPGR^ORF15因缺失而具有降低的谷氨酰化的示意图。

图33A为表明与未转染的样品(UNT)相比，在用含有密码子优化的RPGR^ORF15(coRPGR^ORF15；co)或wtRPGR^ORF15(wt)的质粒转染的HEK293T细胞中检测到RPGR^ORF15表达(黑色箭头)的蛋白质印迹。与用密码子优化的质粒转染的细胞相比，在用WT质粒转染的细胞中在N端引导的RPGR抗体的情况下检测到截短的80kDa蛋白质(白色箭头)。图33A示出了在用密码子优化的质粒转染的细胞中的恰当剪接(在密码子优化的RPGR构建体中没有剪接变体的全长RPGR蛋白(白色箭头))。图33B为表明在用RPGR^ORF15的密码子优化和WT序列转染的HEK293T细胞中在GT335抗体情况下检测到谷氨酰化RPGR^ORF15的蛋白质印迹。图33B示出了在用密码子优化的质粒转染的细胞中恰当的谷氨酰化(在密码子优化的RPGR中在GT335免疫染色情况下观察到的全长和完全谷氨酰化的ORF15)。(图33A)中的80kDa条带在(图33B)中未谷氨酰化并且因此可表示具有C端缺失的截短的RPGR变体。参见Fischer等MolTher.2017；25(8):1854-1865。

图34为在使用密码子优化的RPGR^ORF15对人眼进行基因疗法之后产生的一系列图像。

图35A至35D为表明体内RPGR谷氨酰化需要C端碱性结构域与富Glu-Gly区域两者的一系列示意图、免疫印迹、图以及表格。(图35A)包装至AAV载体中的人RPGR^ORF15表达构建体的图。将富Glu-Gly区域以红色标记并且C端碱性结构域以洋红色标记。在全长(FL)构建体的示意图中示出了谷氨酰化共同基序的位置。(图35B)从注射了RPGR表达构建体的Rpgr^-/-小鼠提取的视网膜的免疫印迹。泳道1-5匹配图35A中所示的构建体编号，并且泳道6为未注射的对照。如由使用GT335的检测(中间)所指示，全长RPGR发生谷氨酰化并且RPGRΔ864-989在较轻程度上发生谷氨酰化。使用RPGR抗体的探测显示重组RPGR的表达水平(顶部)。使用β-肌动蛋白的再探测印迹提供了加载对照(底部)。(图35C)在针对RPGR水平标准化之后通过密度测定法定量谷氨酰化水平，其中样品4水平任意设定为1。图35D中概述了这些结果。ND，未测得。从两次独立实验获得类似结果。参见Sun等PNAS,2016,113(21)E2925-E2934。

图36为用于RPGR^ORF15的密码子优化的智人(Homo sapiens)的密码子频率表。每个密码子由3核苷酸序列(例如TTT)指示，随后为其每1000个的频率(例如16.9)和总数目(例如336,562)。已从使用UniProtKB/SwissProt编号的来自Ensembl数据库(发行本57)的一组19,250个人基因计算得到人密码子使用表并且在以下公共域可获得：

genomes.urv.cat/CAIcal/CU_human_nature.html。

图37A至37B为提供沿(图37A)wtRPGR^ORF15和(图37B)coRPGRORF15编码序列的测序引物比对的综述的示意图。设计额外的引物并且应用于wtRPGR^ORF15 cds的ORF15区域内以实现序列的完全覆盖。这是归因于引物退火困难并且归因于测序反应因wtRPGR^ORF15的ORF15区域中的poly-G运行而频繁过早终止。

图38为提供wtRPGR^ORF15的ORF15内高度重复并且富含嘌呤(腺嘌呤/鸟嘌呤)的序列(SEQ ID NO:18)的实例的示意图。

图39A至39B为表明RPGR^ORF15的密码子优化引起主要编码序列的显著变化的图和示意图。图39A)沿RPGR^ORF15的全部cds的GC频率，wtRPGR^ORF15在顶部指示(黑色)并且coRPGR^ORF15在底部指示(红色)，灰色断裂线指示相对于野生型序列的变化。图39B)coRPGR^ORF15(SEQ IDNO:3)在顶部的完全序列展示，以红色指示沉默取代。wtRPGR^ORF15(SEQ ID NO:10)序列在下面展示作为参考。

图40A至40C为展示密码子优化功效实验的结果的一系列图。图40A)含有质粒DNA的coRPGR^ORF15小型制剂：浓度显著较高(n＝24，未配对，2尾t检验：p＝0.0004)。图40B)coRPGR^ORF15小型制剂：260/280比率的质粒DNA浓度保持不变。图40C)coRPGR^ORF15小型制剂：证实大型制剂中总质粒中的质粒DNA浓度使coRPGRORF15的克隆功效增加。注意：n＝1时没有误差柱。

图41为示出HEK293T细胞中的RPGR^ORF15转基因表达的照片。将细胞用wtRPGR^ORF15(wt)和coRPGR^ORF15(co)质粒构建体转染或仅用培养基处理(阴性对照)。在免疫细胞化学之后使用抗RPGR和Hoechst 33342的共焦显微镜分析展示在转染的细胞中高水平的RPGR^ORF15表达。

图42A至42D为提供RPGR^ORF15表达的蛋白质印迹分析结果的一系列照片、一系列蛋白质印迹以及一对图。(图42A)将HEK293T细胞用wtRPGR^ORF15(wt)或coRPGR^ORF15(co)质粒构建体转染。使用对照质粒(GFP)来对照转染(顶部右侧)，并且使用DMEM作为阴性对照(nc)。蛋白质印迹条带的强度。(图42B)对蛋白质印迹条带的强度进行定量。(图42C)针对加载对照(GABDH)规范化之后的强度(任意单位[AU])的箱须图(中值，箱描绘下四分位数和上四分位数，须为最小和最大值)。(图42D)针对野生型呈递变化倍数水平规范化之后的柱状图(平均值±标准偏差)。

图43A至43C为提供RPGR^ORF15表达的流式细胞术分析的结果的照片和一系列图。(图43A)将HEK293T细胞用wtRPGR^ORF15(wt)、coRPGR^ORF15(co)质粒构建体转染。使用对照质粒(GFP)来对照转染(顶部右侧)并且使用DMEM作为阴性对照(图中未示)。比例尺＝20μM。(图43B)使用原初细胞来设定适当的敏感度和特异性阈值(左侧图)。使用这些阈值，对用wtRPGR^ORF15或coRPGR^ORF15转染的测试样品进行定量。(图43C)中值荧光强度(任意单位[AU])的箱须图(中值，箱描绘下四分位数和上四分位数，须为最小和最大值)(n＝9)。

图44为示出对用本公开的组合物处理有反应的受试者在第1个月时的总黄斑敏感度的图。使用本公开的微视野检查方法测定敏感度。

图45为示出对用本公开的组合物处理有反应的受试者的黄斑内的16个中心点在第1个月时的敏感度的图。使用本公开的微视野检查方法测定敏感度。

图46为示出在第1个月时在5个位点处改善大于或等于7分贝的患者数目的图。分析是基于基线与处理之后跟踪一个月之间的平均敏感度差异。使用本公开的微视野检查方法测定敏感度。

图47为示出在第1个月时在16个中心位点中的5个位点处改善大于或等于7分贝的患者数目的图。分析是基于基线与处理之后跟踪一个月之间的平均敏感度差异。使用本公开的微视野检查方法测定敏感度。

图48为示出对用本公开的组合物处理有反应的受试者在第3个月时的敏感度的图。使用本公开的微视野检查方法测定敏感度。

图49为示出对用本公开的组合物处理有反应的受试者在第3个月时黄斑的16个中心位点内的敏感度的图。使用本公开的微视野检查方法测定敏感度。

图50为示出在第3个月时在5个位点处改善大于或等于7分贝的患者数目的图。分析是基于基线与处理之后跟踪三个月之间的平均敏感度差异。使用本公开的微视野检查方法测定敏感度。

图51为示出在第3个月时在16个中心位点中的5个位点处改善大于或等于7分贝的患者数目的图。分析是基于基线与处理之后跟踪三个月之间的平均敏感度差异。使用本公开的微视野检查方法测定敏感度。

图52为提供通过作为Xirius临床试验的一部分的OCT评估的受试者的描述性概述的表格。

图53为提供受试者1(如图52中所示)的视网膜截面的低放大倍数(左侧)和高放大倍数(右侧)图像的一对照片。

图54为提供受试者2(如图52中所示)的视网膜截面的低放大倍数(左侧)和高放大倍数(右侧)图像的一对照片。黄色箭头指向视网膜内对应于内段和外段的双线，它的出现或厚度增加为治疗功效的标志。

图55为提供受试者3(如图52中所示)的视网膜截面的低放大倍数(左侧)和高放大倍数(右侧)图像的一对照片。

图56为提供受试者4(如图52中所示)的视网膜截面的低放大倍数(左侧)和高放大倍数(右侧)图像的一对照片。黄色箭头指向视网膜内对应于内段和外段的双线，它的出现或厚度增加为治疗功效的标志。

图57为提供受试者5(如图52中所示)的视网膜截面的低放大倍数(左侧)和高放大倍数(右侧)图像的一对照片。

图58为提供受试者6(如图52中所示)的视网膜截面的低放大倍数(左侧)和高放大倍数(右侧)图像的一对照片。黄色箭头指向视网膜内对应于内段和外段的双线，它的出现或厚度增加为治疗功效的标志。

图59为提供受试者7(如图52中所示)的视网膜截面的低放大倍数(左侧)和高放大倍数(右侧)图像的一对照片。黄色箭头指向视网膜内对应于内段和外段的双线，它的出现或厚度增加为治疗功效的标志。

图60为提供受试者8(如图52中所示)的视网膜截面的低放大倍数(左侧)和高放大倍数(右侧)图像的一对照片。黄色箭头指向视网膜内对应于内段和外段的双线，它的出现或厚度增加为治疗功效的标志。

图61为提供受试者9(如图52中所示)的视网膜截面的低放大倍数(左侧)和高放大倍数(右侧)图像的一对照片。黄色箭头指向视网膜内对应于内段和外段的双线，它的出现或厚度增加为治疗功效的标志。

图62为提供受试者10(如图52中所示)的视网膜截面的低放大倍数(左侧)和高放大倍数(右侧)图像的一对照片。黄色箭头指向视网膜内对应于内段和外段的双线，它的出现或厚度增加为治疗功效的标志。

图63为提供受试者11(如图52中所示)的视网膜截面的低放大倍数(左侧)和高放大倍数(右侧)图像的一对照片。

图64为提供受试者12(如图52中所示)的视网膜截面的低放大倍数(左侧)和高放大倍数(右侧)图像的一对照片。

图65为提供受试者13(如图52中所示)的视网膜截面的低放大倍数(左侧)和高放大倍数(右侧)图像的一对照片。黄色箭头指向视网膜内对应于内段和外段的双线，它的出现或厚度增加为治疗功效的标志。

图66为提供受试者14(如图52中所示)的视网膜截面的低放大倍数(左侧)和高放大倍数(右侧)图像的一对照片。黄色箭头指向视网膜内对应于内段和外段的双线，它的出现或厚度增加为治疗功效的标志。

图67为提供受试者15(如图52中所示)的视网膜截面的低放大倍数(左侧)和高放大倍数(右侧)图像的一对照片。

图68为示出在通过OCT评估的受试者中的每一者中所鉴定的各种特征的一系列照片。

具体实施方式

本公开提供了一种包含多个重组血清型8腺相关病毒(rAAV8)粒子的组合物，其中所述多个rAAV8粒子中的每个rAAV8为非复制性的，并且其中所述多个rAAV8粒子中的每个rAAV8包含多核苷酸，所述多核苷酸从5'到3'包含：(a)编码5'反向末端重复序列(ITR)的序列；(b)编码G蛋白偶联受体激酶1(GRK1)启动子的序列；(c)编码色素性视网膜炎GTP酶调控因子ORF15同种型(RPGR^ORF15)的序列；(d)编码聚腺苷酸化(polyA)信号的序列；(e)编码3'ITR的序列；并且其中组合物包含5x10¹⁰个载体基因组(vg)/毫升(mL)至2x10¹³vg/mL，端点包括在内。

在一些实施方案中，本公开提供了一种包含多个重组血清型8腺相关病毒(rAAV8)粒子的组合物，其中所述多个rAAV8粒子中的每个rAAV8为非复制性的，并且其中所述多个rAAV8粒子的每个rAAV8包含多核苷酸，所述多核苷酸从5'到3'包含：(a)编码5'反向末端重复序列(ITR)的序列；(b)编码G蛋白偶联受体激酶1(GRK1)启动子的序列；(c)编码色素性视网膜炎GTP酶调控因子ORF15同种型(RPGR^ORF15)的序列；(d)编码聚腺苷酸化(polyA)信号的序列；以及(e)编码3'ITR的序列；并且其中组合物包含1.0x10¹⁰个载体基因组(vg)/毫升(mL)至1x10¹³vg/mL，端点包括在内。

在一些实施方案中，组合物还包含药学上可接受的载体。在一些实施方案中，药学上可接受的载体包含Tris、MgCl₂以及NaCl，任选为20mM Tris、1mM MgCl₂以及200mM NaCl，pH 8.0。在一些实施方案中，药学上可接受的载体还包含0.001％的泊洛沙姆188。

本公开提供了一种装置，所述装置包含本公开的组合物。在一些实施方案中，装置包括微量递送装置。在一些实施方案中，微量递送装置包括微针并且微针适合于视网膜下注射。在一些实施方案中，微量递送装置包括微导管并且微导管适合于脉络膜上腔注射。

本公开提供了一种治疗有需要的受试者的色素性视网膜炎的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本公开的组合物。在一些实施方案中，向受试者施用治疗有效量的向受试者施用的组合物改善色素性视网膜炎迹象或症状。在一些实施方案中，色素性视网膜炎迹象包括当与健康或对照EZ或视网膜敏感度相比时椭圆体带(EZ)变性和/或视网膜敏感度降低。在一些实施方案中，色素性视网膜炎迹象包括当与健康或对照视敏度、视网膜厚度和/或外核层(ONL)厚度相比时视敏度、视网膜厚度和/或ONL厚度降低。在一些实施方案中，视网膜厚度涵盖或包含ONL厚度。在本公开的方法的一些实施方案中，治疗色素性视网膜炎使EZ、视网膜敏感度、视敏度、视网膜厚度和/或ONL厚度恢复。在本公开的方法的一些实施方案中，治疗色素性视网膜炎使色素性视网膜炎迹象或症状，包括但不限于EZ变性或者视网膜敏感度、视敏度、视网膜厚度和/或外核层(ONL)厚度降低的严重程度有所降低。在本公开的方法的一些实施方案中，治疗色素性视网膜炎使色素性视网膜炎迹象或症状，包括但不限于EZ变性或者视网膜敏感度、视敏度、视网膜厚度和/或ONL厚度降低的发作延迟。在本公开的方法的一些实施方案中，治疗色素性视网膜炎使色素性视网膜炎迹象或症状，包括但不限于EZ变性或者视网膜敏感度、视敏度、视网膜厚度和/或ONL厚度降低的进展速率降低或抑制其进展。健康或对照EZ、视网膜敏感度、视敏度、视网膜厚度和/或ONL厚度可包括实验测定的例如性别和年龄与受试者匹配的个体的基于群体的阈值、均值、平均值或标准。健康或对照EZ、视网膜敏感度、视敏度、视网膜厚度和/或ONL厚度可包括受试者的未受影响的眼睛的EZ、视网膜敏感度、视敏度、视网膜厚度和/或ONL厚度。对照EZ、视网膜敏感度、视敏度、视网膜厚度和/或ONL厚度可包括在受试者中在施用本公开的组合物之前形成基线的时间点，以便在整个治疗中进行比较从而确定组合物改善色素性视网膜炎迹象或症状的有效性。

AAV组合物

本公开的组合物可包含适合向哺乳动物并且优选向人全身性或局部施用的包含色素性视网膜炎GTP酶调控因子ORF 15(RPGR^ORF15)的多核苷酸。本公开的说明性RPGR^ORF15多核苷酸包含编码RPGR^ORF15或其部分的序列。优选地，本公开的RPGR^ORF15多核苷酸包含编码人RPGR^ORF15或其部分的序列。本公开的说明性RPGR^ORF15多核苷酸可还包含编码调控元件的一个或多个序列以实现或增强基因或其部分的表达。说明性调控元件包括但不限于启动子、内含子、增强子元件、反应元件(包括转录后反应元件或转录后调控元件)、聚腺苷酸(polyA)序列以及用于促使转录高效终止的基因片段(包括β-球蛋白基因片段和兔β-球蛋白基因片段)。

在本公开的组合物的一些实施方案中，RPGR^ORF15多核苷酸包含对应于人色素性视网膜炎GTP酶调控因子(RPGR)蛋白质或其部分的人基因或其部分。人RPGR包含多个剪接同种型。同种型ORF15 RPGR(RPGR^ORF15)局部化至光感受器。在一些实施方案中，RPGR蛋白为RPGR^ORF15。在一些实施方案中，RPGR^ORF15多核苷酸包含密码子优化的序列。在一些实施方案中，针对在哺乳动物中表达对序列进行密码子优化。在一些实施方案中，针对在人中表达对序列进行密码子优化。

在本公开的组合物的一些实施方案中，RPGR^ORF15多核苷酸由编码RPGR^ORF15的cDNA的纯化的重组血清型2(rAAV)组成。在一些实施方案中，每个20nm AAV病毒体含有包含以下的单链DNA插入序列：119bp AAV2 5'反向末端重复序列(ITR)、199bp G蛋白偶联视紫红蛋白激酶1(GRK1)启动子、3459bp人RPGR^ORF15 cDNA、270bp牛生长激素聚腺苷酸化序列(BGH-polyA)以及130bp AAV2 3'ITR，以及侧接所述元件的短克隆序列。

在一些实施方案中，RPGR^ORF15多核苷酸包含编码RPGR^OR15的序列。在一些实施方案中，编码RPGR^ORF15的序列为人RPGR^ORF15序列。在一些实施方案中，编码RPGR^ORF15的序列包含编码与以下氨基酸序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性或相同的氨基酸序列的核苷酸序列：

1 MREPEELMPD SGAVFTFGKS KFAENNPGKF WFKNDVPVHL SCGDEHSAVV TGNNKLYMFG

61 SNNWGQLGLG SKSAISKPTC VKALKPEKVK LAACGRNHTL VSTEGGNVYA TGGNNEGQLG

121 LGDTEERNTF HVISFFTSEH KIKQLSAGSN TSAALTEDGR LFMWGDNSEG QIGLKNVSNV

181 CVPQQVTIGK PVSWISCGYY HSAFVTTDGE LYVFGEPENG KLGLPNQLLG NHRTPQLVSE

241 IPEKVIQVAC GGEHTVVLTE NAVYTFGLGQ FGQLGLGTFL FETSEPKVIE NIRDQTISYI

301 SCGENHTALI TDIGLMYTFG DGRHGKLGLG LENFTNHFIP TLCSNFLRFI VKLVACGGCH

361 MVVFAAPHRG VAKEIEFDEI NDTCLSVATF LPYSSLTSGN VLQRTLSARM RRRERERSPD

421 SFSMRRTLPP IEGTLGLSAC FLPNSVFPRC SERNLQESVL SEQDLMQPEE PDYLLDEMTK

481 EAEIDNSSTV ESLGETTDIL NMTHIMSLNS NEKSLKLSPV QKQKKQQTIG ELTQDTALTE

541 NDDSDEYEEM SEMKEGKACK QHVSQGIFMT QPATTIEAFS DEEVEIPEEK EGAEDSKGNG

601 IEEQEVEANE ENVKVHGGRK EKTEILSDDL TDKAEVSEGK AKSVGEAEDG PEGRGDGTCE

661 EGSSGAEHWQ DEEREKGEKD KGRGEMERPG EGEKELAEKE EWKKRDGEEQ EQKEREQGHQ

721 KERNQEMEEG GEEEHGEGEE EEGDREEEEE KEGEGKEEGE GEEVEGEREK EEGERKKEER

781 AGKEEKGEEE GDQGEGEEEE TEGRGEEKEE GGEVEGGEVE EGKGEREEEE EEGEGEEEEG

841 EGEEEEGEGE EEEGEGKGEE EGEEGEGEEE GEEGEGEGEE EEGEGEGEEE GEGEGEEEEG

901 EGEGEEEGEG EGEEEEGEGK GEEEGEEGEG EGEEEEGEGE GEDGEGEGEE EEGEWEGEEE

961 EGEGEGEEEG EGEGEEGEGE GEEEEGEGEG EEEEGEEEGE EEGEGEEEGE GEGEEEEEGE

1021 VEGEVEGEEG EGEGEEEEGE EEGEEREKEG EGEENRRNRE EEEEEEGKYQETGEEENERQ

1081 DGEEYKKVSK IKGSVKYGKH KTYQKKSVTN TQGNGKEQRS KMPVQSKRLLKNGPSGSKKF

1141 WNNVLPHYLE LK。(SEQ ID NO:2)

在一些实施方案中，编码RPGR^ORF15的序列包含野生型核苷酸序列。在一些实施方案中，编码RPGR^ORF15的序列包含与以下核苷酸序列具有至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少97％、至少99％或其间任何百分比的同一性的核苷酸序列：

1 atgagggagc cggaagagct gatgcccgat tcgggtgctg tgtttacatt tgggaaaagt

61 aaatttgctg aaaataatcc cggtaaattc tggtttaaaa atgatgtccc tgtacatctt

121 tcatgtggag atgaacattc tgctgttgtt accggaaata ataaacttta catgtttggc

181 agtaacaact ggggtcagtt aggattagga tcaaagtcag ccatcagcaa gccaacatgt

241 gtcaaagctc taaaacctga aaaagtgaaa ttagctgcct gtggaaggaa ccacaccctg

301 gtgtcaacag aaggaggcaa tgtatatgca actggtggaa ataatgaagg acagttgggg

361 cttggtgaca ccgaagaaag aaacactttt catgtaatta gcttttttac atccgagcat

421 aagattaagc agctgtctgc tggatctaat acttcagctg ccctaactga ggatggaaga

481 ctttttatgt ggggtgacaa ttccgaaggg caaattggtt taaaaaatgt aagtaatgtc

541 tgtgtccctc agcaagtgac cattgggaaa cctgtctcct ggatctcttg tggatattac

601 cattcagctt ttgtaacaac agatggtgag ctatatgtgt ttggagaacc tgagaatggg

661 aagttaggtc ttcccaatca gctcctgggc aatcacagaa caccccagct ggtgtctgaa

721 attccggaga aggtgatcca agtagcctgt ggtggagagc atactgtggt tctcacggag

781 aatgctgtgt atacctttgg gctgggacaa tttggtcagc tgggtcttgg cacttttctt

841 tttgaaactt cagaacccaa agtcattgag aatattaggg atcaaacaat aagttatatt

901 tcttgtggag aaaatcacac agctttgata acagatatcg gccttatgta tacttttgga

961 gatggtcgcc acggaaaatt aggacttgga ctggagaatt ttaccaatca cttcattcct

1021 actttgtgct ctaatttttt gaggtttata gttaaattgg ttgcttgtggtggatgtcac

1081 atggtagttt ttgctgctcc tcatcgtggt gtggcaaaag aaattgaattcgatgaaata

1141 aatgatactt gcttatctgt ggcgactttt ctgccgtata gcagtttaacctcaggaaat

1201 gtactgcaga ggactctatc agcacgtatg cggcgaagag agagggagaggtctccagat

1261 tctttttcaa tgaggagaac actacctcca atagaaggga ctcttggcctttctgcttgt

1321 tttctcccca attcagtctt tccacgatgt tctgagagaa acctccaagagagtgtctta

1381 tctgaacagg acctcatgca gccagaggaa ccagattatt tgctagatgaaatgaccaaa

1441 gaagcagaga tagataattc ttcaactgta gaaagccttg gagaaactactgatatctta

1501 aacatgacac acatcatgag cctgaattcc aatgaaaagt cattaaaattatcaccagtt

1561 cagaaacaaa agaaacaaca aacaattggg gaactgacgc aggatacagctcttactgaa

1621 aacgatgata gtgatgaata tgaagaaatg tcagaaatga aagaagggaaagcatgtaaa

1681 caacatgtgt cacaagggat tttcatgacg cagccagcta cgactatcgaagcattttca

1741 gatgaggaag tagagatccc agaggagaag gaaggagcag aggattcaaaaggaaatgga

1801 atagaggagc aagaggtaga agcaaatgag gaaaatgtga aggtgcatggaggaagaaag

1861 gagaaaacag agatcctatc agatgacctt acagacaaag cagaggtgagtgaaggcaag

1921 gcaaaatcag tgggagaagc agaggatggg cctgaaggta gaggggatggaacctgtgag

1981 gaaggtagtt caggagcaga acactggcaa gatgaggaga gggagaagggggagaaagac

2041 aagggtagag gagaaatgga gaggccagga gagggagaga aggaactagcagagaaggaa

2101 gaatggaaga agagggatgg ggaagagcag gagcaaaagg agagggagcagggccatcag

2161 aaggaaagaa accaagagat ggaggaggga ggggaggagg agcatggagaaggagaagaa

2221 gaggagggag acagagaaga ggaagaagag aaggagggag aagggaaagaggaaggagaa

2281 ggggaagaag tggagggaga acgtgaaaag gaggaaggag agaggaaaaaggaggaaaga

2341 gcggggaagg aggagaaagg agaggaagaa ggagaccaag gagagggggaagaggaggaa

2401 acagagggga gaggggagga aaaagaggag ggaggggaag tagagggaggggaagtagag

2461 gaggggaaag gagagaggga agaggaagag gaggagggtg agggggaagaggaggaaggg

2521 gagggggaag aggaggaagg ggagggggaa gaggaggaag gagaagggaaaggggaggaa

2581 gaaggggaag aaggagaagg ggaggaagaa ggggaggaag gagaaggggagggggaagag

2641 gaggaaggag aaggggaggg agaagaggaa ggagaagggg agggagaagaggaggaagga

2701 gaaggggagg gagaagagga aggagaaggg gagggagaag aggaggaaggagaagggaaa

2761 ggggaggagg aaggagagga aggagaaggg gagggggaag aggaggaaggagaaggggaa

2821 ggggaggatg gagaagggga gggggaagag gaggaaggag aatgggagggggaagaggag

2881 gaaggagaag gggaggggga agaggaagga gaaggggaag gggaggaaggagaaggggag

2941 ggggaagagg aggaaggaga aggggagggg gaagaggagg aaggggaagaagaaggggag

3001 gaagaaggag agggagagga agaaggggag ggagaagggg aggaagaagaggaaggggaa

3061 gtggaagggg aggtggaagg ggaggaagga gagggggaag gagaggaagaggaaggagag

3121 gaggaaggag aagaaaggga aaaggagggg gaaggagaag aaaacaggaggaacagagaa

3181 gaggaggagg aagaagaggg gaagtatcag gagacaggcg aagaagagaatgaaaggcag

3241 gatggagagg agtacaaaaa agtgagcaaa ataaaaggat ctgtgaaatatggcaaacat

3301 aaaacatatc aaaaaaagtc agttactaac acacagggaa atgggaaagagcagaggtcc

3361 aaaatgccag tccagtcaaa acgactttta aaaaacgggc catcaggttccaaaaagttc

3421 tggaataatg tattaccaca ttacttggaa ttgaagtaa。(SEQ ID NO:10)

在一些实施方案中，编码RPGR^ORF15的序列包含密码子优化的核苷酸序列。RPGR^ORF15含有在3'端的高度重复富嘌呤区以及上游紧挨着的剪接位点，这可在克隆AAV.RPGR载体中形成显著挑战。在一些实施方案中，可使用密码子优化来使内源性剪接位点失能并且稳定RPGR^ORF15转录物中富含嘌呤的序列而不改变RPGR^ORF15蛋白的氨基酸序列。在一些实施方案中，在密码子优化之后保留翻译后修饰，诸如RPGR蛋白的谷氨酰化。在一些实施方案中，针对在哺乳动物中的表达对RPGR^ORF15核苷酸序列进行密码子优化。在一些实施方案中，针对在人中的表达对RPGR^ORF15核苷酸序列进行密码子优化。

在一些实施方案中，密码子优化的3459bp人RPGR^ORF15 cDNA包含与以下核苷酸序列具有至少70％同一性、至少75％同一性、至少80％同一性、至少85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少97％同一性、至少99％同一性或其间任何百分比的同一性的核苷酸序列：

1 atgagagagc cagaggagct gatgccagac agtggagcag tgtttacatt cggaaaatct

61 aagttcgctg aaaataaccc aggaaagttc tggtttaaaa acgacgtgcc cgtccacctg

121 tcttgtggcg atgagcatag tgccgtggtc actgggaaca ataagctgta catgttcggg

181 tccaacaact ggggacagct ggggctggga tccaaatctg ctatctctaa gccaacctgc

241 gtgaaggcac tgaaacccga gaaggtcaaa ctggccgctt gtggcagaaa ccacactctg

301 gtgagcaccg agggcgggaa tgtctatgcc accggaggca acaatgaggg acagctggga

361 ctgggggaca ctgaggaaag gaataccttt cacgtgatct ccttctttac atctgagcat

421 aagatcaagc agctgagcgc tggctccaac acatctgcag ccctgactga ggacgggcgc

481 ctgttcatgt ggggagataa ttcagagggc cagattgggc tgaaaaacgt gagcaatgtg

541 tgcgtccctc agcaggtgac catcggaaag ccagtcagtt ggatttcatg tggctactat

601 catagcgcct tcgtgaccac agatggcgag ctgtacgtct ttggggagcc cgaaaacgga

661 aaactgggcc tgcctaacca gctgctgggc aatcaccgga caccccagct ggtgtccgag

721 atccctgaaa aagtgatcca ggtcgcctgc gggggagagc atacagtggt cctgactgag

781 aatgctgtgt ataccttcgg actgggccag tttggccagc tggggctggg aaccttcctg

841 tttgagacat ccgaaccaaa agtgatcgag aacattcgcg accagactat cagctacatt

901 tcctgcggag agaatcacac cgcactgatc acagacattg gcctgatgta tacctttggc

961 gatggacgac acgggaagct gggactggga ctggagaact tcactaatca ttttatcccc

1021 accctgtgtt ctaacttcct gcggttcatc gtgaaactgg tcgcttgcggcgggtgtcac

1081 atggtggtct tcgctgcacc tcataggggc gtggctaagg agatcgaatttgacgagatt

1141 aacgatacat gcctgagcgt ggcaactttc ctgccataca gctccctgacttctggcaat

1201 gtgctgcaga gaaccctgag tgcaaggatg cggagaaggg agagggaacgctctcctgac

1261 agtttctcaa tgcgacgaac cctgccacct atcgagggaa cactgggactgagtgcctgc

1321 ttcctgccta actcagtgtt tccacgatgt agcgagcgga atctgcaggagtctgtcctg

1381 agtgagcagg atctgatgca gccagaggaa cccgactacc tgctggatgagatgaccaag

1441 gaggccgaaa tcgacaactc tagtacagtg gagtccctgg gcgagactaccgatatcctg

1501 aatatgacac acattatgtc actgaacagc aatgagaaga gtctgaaactgtcaccagtg

1561 cagaagcaga agaaacagca gactattggc gagctgactc aggacaccgccctgacagag

1621 aacgacgata gcgatgagta tgaggaaatg tccgagatga aggaaggcaaagcttgtaag

1681 cagcatgtca gtcaggggat cttcatgaca cagccagcca caactattgaggctttttca

1741 gacgaggaag tggagatccc cgaggaaaaa gagggcgcag aagattccaaggggaatgga

1801 attgaggaac aggaggtgga agccaacgag gaaaatgtga aagtccacggaggcaggaag

1861 gagaaaacag aaatcctgtc tgacgatctg actgacaagg ccgaggtgtccgaaggcaag

1921 gcaaaatctg tcggagaggc agaagacgga ccagagggac gaggggatggaacctgcgag

1981 gaaggctcaa gcggggctga gcattggcag gacgaggaac gagagaagggcgaaaaggat

2041 aaaggccgcg gggagatgga acgacctgga gagggcgaaa aagagctggcagagaaggag

2101 gaatggaaga aaagggacgg cgaggaacag gagcagaaag aaagggagcagggccaccag

2161 aaggagcgca accaggagat ggaagagggc ggcgaggaag agcatggcgagggagaagag

2221 gaagagggcg atagagaaga ggaagaggaa aaagaaggcg aagggaaggaggaaggagag

2281 ggcgaggaag tggaaggcga gagggaaaag gaggaaggag aacggaagaaagaggaaaga

2341 gccggcaaag aggaaaaggg cgaggaagag ggcgatcagg gcgaaggcgaggaggaagag

2401 accgagggcc gcggggaaga gaaagaggag ggaggagagg tggagggcggagaggtcgaa

2461 gagggaaagg gcgagcgcga agaggaagag gaagagggcg agggcgaggaagaagagggc

2521 gagggggaag aagaggaggg agagggcgaa gaggaagagg gggagggaaagggcgaagag

2581 gaaggagagg aaggggaggg agaggaagag ggggaggagg gcgagggggaaggcgaggag

2641 gaagaaggag agggggaagg cgaagaggaa ggcgaggggg aaggagaggaggaagaaggg

2701 gaaggcgaag gcgaagagga gggagaagga gagggggagg aagaggaaggagaagggaag

2761 ggcgaggagg aaggcgaaga gggagagggg gaaggcgagg aagaggaaggcgagggcgaa

2821 ggagaggacg gcgagggcga gggagaagag gaggaagggg aatgggaaggcgaagaagag

2881 gaaggcgaag gcgaaggcga agaagagggc gaaggggagg gcgaggagggcgaaggcgaa

2941 ggggaggaag aggaaggcga aggagaaggc gaggaagaag agggagaggaggaaggcgag

3001 gaggaaggag agggggagga ggagggagaa ggcgagggcg aagaagaagaagagggagaa

3061 gtggagggcg aagtcgaggg ggaggaggga gaaggggaag gggaggaagaagagggcgaa

3121 gaagaaggcg aggaaagaga aaaagaggga gaaggcgagg aaaaccggagaaatagggaa

3181 gaggaggaag aggaagaggg aaagtaccag gagacaggcg aagaggaaaacgagcggcag

3241 gatggcgagg aatataagaa agtgagcaag atcaaaggat ccgtcaagtacggcaagcac

3301 aaaacctatc agaagaaaag cgtgaccaac acacagggga atggaaaagagcagaggagt

3361 aagatgcctg tgcagtcaaa acggctgctg aagaatggcc catctggaagtaaaaaattc

3421 tggaacaatg tgctgcccca ctatctggaa ctgaaataa。(SEQ ID NO:3)

在一些实施方案中，密码子优化的3459bp人RPGR^ORF15 cDNA包含以下核苷酸序列或由其组成：

1 atgagagagc cagaggagct gatgccagac agtggagcag tgtttacatt cggaaaatct

61 aagttcgctg aaaataaccc aggaaagttc tggtttaaaa acgacgtgcc cgtccacctg

121 tcttgtggcg atgagcatag tgccgtggtc actgggaaca ataagctgta catgttcggg

181 tccaacaact ggggacagct ggggctggga tccaaatctg ctatctctaa gccaacctgc

241 gtgaaggcac tgaaacccga gaaggtcaaa ctggccgctt gtggcagaaa ccacactctg

301 gtgagcaccg agggcgggaa tgtctatgcc accggaggca acaatgaggg acagctggga

361 ctgggggaca ctgaggaaag gaataccttt cacgtgatct ccttctttac atctgagcat

421 aagatcaagc agctgagcgc tggctccaac acatctgcag ccctgactga ggacgggcgc

481 ctgttcatgt ggggagataa ttcagagggc cagattgggc tgaaaaacgt gagcaatgtg

541 tgcgtccctc agcaggtgac catcggaaag ccagtcagtt ggatttcatg tggctactat

601 catagcgcct tcgtgaccac agatggcgag ctgtacgtct ttggggagcc cgaaaacgga

661 aaactgggcc tgcctaacca gctgctgggc aatcaccgga caccccagct ggtgtccgag

721 atccctgaaa aagtgatcca ggtcgcctgc gggggagagc atacagtggt cctgactgag

781 aatgctgtgt ataccttcgg actgggccag tttggccagc tggggctggg aaccttcctg

841 tttgagacat ccgaaccaaa agtgatcgag aacattcgcg accagactat cagctacatt

901 tcctgcggag agaatcacac cgcactgatc acagacattg gcctgatgta tacctttggc

961 gatggacgac acgggaagct gggactggga ctggagaact tcactaatca ttttatcccc

1021 accctgtgtt ctaacttcct gcggttcatc gtgaaactgg tcgcttgcggcgggtgtcac

1081 atggtggtct tcgctgcacc tcataggggc gtggctaagg agatcgaatttgacgagatt

1141 aacgatacat gcctgagcgt ggcaactttc ctgccataca gctccctgacttctggcaat

1201 gtgctgcaga gaaccctgag tgcaaggatg cggagaaggg agagggaacgctctcctgac

1261 agtttctcaa tgcgacgaac cctgccacct atcgagggaa cactgggactgagtgcctgc

1321 ttcctgccta actcagtgtt tccacgatgt agcgagcgga atctgcaggagtctgtcctg

1381 agtgagcagg atctgatgca gccagaggaa cccgactacc tgctggatgagatgaccaag

1441 gaggccgaaa tcgacaactc tagtacagtg gagtccctgg gcgagactaccgatatcctg

1501 aatatgacac acattatgtc actgaacagc aatgagaaga gtctgaaactgtcaccagtg

1561 cagaagcaga agaaacagca gactattggc gagctgactc aggacaccgccctgacagag

1621 aacgacgata gcgatgagta tgaggaaatg tccgagatga aggaaggcaaagcttgtaag

1681 cagcatgtca gtcaggggat cttcatgaca cagccagcca caactattgaggctttttca

1741 gacgaggaag tggagatccc cgaggaaaaa gagggcgcag aagattccaaggggaatgga

1801 attgaggaac aggaggtgga agccaacgag gaaaatgtga aagtccacggaggcaggaag

1861 gagaaaacag aaatcctgtc tgacgatctg actgacaagg ccgaggtgtccgaaggcaag

1921 gcaaaatctg tcggagaggc agaagacgga ccagagggac gaggggatggaacctgcgag

1981 gaaggctcaa gcggggctga gcattggcag gacgaggaac gagagaagggcgaaaaggat

2041 aaaggccgcg gggagatgga acgacctgga gagggcgaaa aagagctggcagagaaggag

2101 gaatggaaga aaagggacgg cgaggaacag gagcagaaag aaagggagcagggccaccag

2161 aaggagcgca accaggagat ggaagagggc ggcgaggaag agcatggcgagggagaagag

2221 gaagagggcg atagagaaga ggaagaggaa aaagaaggcg aagggaaggaggaaggagag

2281 ggcgaggaag tggaaggcga gagggaaaag gaggaaggag aacggaagaaagaggaaaga

2341 gccggcaaag aggaaaaggg cgaggaagag ggcgatcagg gcgaaggcgaggaggaagag

2401 accgagggcc gcggggaaga gaaagaggag ggaggagagg tggagggcggagaggtcgaa

2461 gagggaaagg gcgagcgcga agaggaagag gaagagggcg agggcgaggaagaagagggc

2521 gagggggaag aagaggaggg agagggcgaa gaggaagagg gggagggaaagggcgaagag

2581 gaaggagagg aaggggaggg agaggaagag ggggaggagg gcgagggggaaggcgaggag

2641 gaagaaggag agggggaagg cgaagaggaa ggcgaggggg aaggagaggaggaagaaggg

2701 gaaggcgaag gcgaagagga gggagaagga gagggggagg aagaggaaggagaagggaag

2761 ggcgaggagg aaggcgaaga gggagagggg gaaggcgagg aagaggaaggcgagggcgaa

2821 ggagaggacg gcgagggcga gggagaagag gaggaagggg aatgggaaggcgaagaagag

2881 gaaggcgaag gcgaaggcga agaagagggc gaaggggagg gcgaggagggcgaaggcgaa

2941 ggggaggaag aggaaggcga aggagaaggc gaggaagaag agggagaggaggaaggcgag

3001 gaggaaggag agggggagga ggagggagaa ggcgagggcg aagaagaagaagagggagaa

3061 gtggagggcg aagtcgaggg ggaggaggga gaaggggaag gggaggaagaagagggcgaa

3121 gaagaaggcg aggaaagaga aaaagaggga gaaggcgagg aaaaccggagaaatagggaa

3181 gaggaggaag aggaagaggg aaagtaccag gagacaggcg aagaggaaaacgagcggcag

3241 gatggcgagg aatataagaa agtgagcaag atcaaaggat ccgtcaagtacggcaagcac

3301 aaaacctatc agaagaaaag cgtgaccaac acacagggga atggaaaagagcagaggagt

3361 aagatgcctg tgcagtcaaa acggctgctg aagaatggcc catctggaagtaaaaaattc

3421 tggaacaatg tgctgcccca ctatctggaa ctgaaataa。(SEQ ID NO:3)

在本公开的组合物的一些实施方案中，RPGR^ORF15多核苷酸包含启动子。在一些实施方案中，启动子包括视紫红蛋白激酶启动子。在一些实施方案中，从G蛋白偶联受体激酶1(GRK1)基因的启动子分离或衍生视紫红蛋白激酶启动子。在一些实施方案中，启动子为GRK1启动子。在一些实施方案中，编码GRK1启动子的序列包含与以下序列具有至少80％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少97％同一性或至少99％同一性的序列：

1 gggccccaga agcctggtgg ttgtttgtcc ttctcagggg aaaagtgagg cggccccttg

61 gaggaagggg ccgggcagaa tgatctaatc ggattccaag cagctcaggg gattgtcttt

121 ttctagcacc ttcttgccac tcctaagcgt cctccgtgac cccggctggg atttagcctg

181 gtgctgtgtc agccccggg。(SEQ ID NO:1)

在一些实施方案中，GRK1启动子包含以下序列或由其组成：

1 gggccccaga agcctggtgg ttgtttgtcc ttctcagggg aaaagtgagg cggccccttg

61 gaggaagggg ccgggcagaa tgatctaatc ggattccaag cagctcaggg gattgtcttt

121 ttctagcacc ttcttgccac tcctaagcgt cctccgtgac cccggctggg atttagcctg

181 gtgctgtgtc agccccggg。(SEQ ID NO:1)

在本公开的组合物的一些实施方案中，RPGR^ORF15多核苷酸包含聚腺苷酸化信号。在一些实施方案中，编码polyA信号的序列包含从牛生长激素(BGH)polyA信号分离或衍生的polyA信号。在一些实施方案中，BGH polyA信号包含与以下核苷酸序列具有至少80％同一性、至少97％同一性或100％同一性的核苷酸序列：

1 tcgctgatca gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc

61 cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga

121 aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga

181 cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat

241 ggcttctgag gcggaaagaa ccagctgggg。(SEQ ID NO:4)

在一些实施方案中，编码BGH polyA的序列包含以下核苷酸序列或由其组成：

1 tcgctgatca gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc

61 cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga

121 aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga

181 cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat

241 ggcttctgag gcggaaagaa ccagctgggg。(SEQ ID NO:4)

在本公开的组合物的一些实施方案中，RPGR^ORF15多核苷酸还包含Kozak序列。在一些实施方案中，Kozak序列包含GGCCACCATG(SEQ ID NO:7)的核苷酸序列或由其组成。

在本公开的组合物的一些实施方案中，RPGR^ORF15多核苷酸还由编码RPGR^ORF15的cDNA的纯化的重组血清型2(rAAV)组成。在一些实施方案中，每个20nm AAV病毒体含有包含以下的单链DNA插入序列：119bp AAV2 5'反向末端重复序列(ITR)、199bp G蛋白偶联视紫红蛋白激酶1(GRK1)启动子、10bp Kozak序列、3459bp人RPGR^ORF15cDNA、270bp牛生长激素聚腺苷酸化序列(BGH-polyA)以及130bp AAV2 3'ITR，以及侧接所述元件的短克隆序列。Kozak序列可与RPGR^ORF15序列的开头重叠，例如重叠3bp。

在一些实施方案中，RPGR^ORF15多核苷酸包含以下序列或由其组成：

1 CTGCGCGCTC GCTCGCTCAC TGAGGCCGCC CGGGCGTCGG GCGACCTTTG GTCGCCCGGC

61 CTCAGTGAGC GAGCGAGCGC GCAGAGAGGG AGTGGCCAAC TCCATCACTA GGGGTTCCTG

121 CGGCAATTCA GTCGATAACT ATAACGGTCC TAAGGTAGCG ATTTAAATAC GCGCTCTCTT

181 AAGGTAGCCC CGGGACGCGT CAATTGGGGC CCCAGAAGCC TGGTGGTTGT TTGTCCTTCT

241 CAGGGGAAAA GTGAGGCGGC CCCTTGGAGG AAGGGGCCGG GCAGAATGAT CTAATCGGAT

301 TCCAAGCAGC TCAGGGGATT GTCTTTTTCT AGCACCTTCT TGCCACTCCT AAGCGTCCTC

361 CGTGACCCCG GCTGGGATTT AGCCTGGTGC TGTGTCAGCC CCGGGGCCAC CATGAGAGAG

421 CCAGAGGAGC TGATGCCAGA CAGTGGAGCA GTGTTTACAT TCGGAAAATC TAAGTTCGCT

481 GAAAATAACC CAGGAAAGTT CTGGTTTAAA AACGACGTGC CCGTCCACCT GTCTTGTGGC

541 GATGAGCATA GTGCCGTGGT CACTGGGAAC AATAAGCTGT ACATGTTCGG GTCCAACAAC

601 TGGGGACAGC TGGGGCTGGG ATCCAAATCT GCTATCTCTA AGCCAACCTG CGTGAAGGCA

661 CTGAAACCCG AGAAGGTCAA ACTGGCCGCT TGTGGCAGAA ACCACACTCT GGTGAGCACC

721 GAGGGCGGGA ATGTCTATGC CACCGGAGGC AACAATGAGG GACAGCTGGG ACTGGGGGAC

781 ACTGAGGAAA GGAATACCTT TCACGTGATC TCCTTCTTTA CATCTGAGCA TAAGATCAAG

841 CAGCTGAGCG CTGGCTCCAA CACATCTGCA GCCCTGACTG AGGACGGGCG CCTGTTCATG

901 TGGGGAGATA ATTCAGAGGG CCAGATTGGG CTGAAAAACG TGAGCAATGT GTGCGTCCCT

961 CAGCAGGTGA CCATCGGAAA GCCAGTCAGT TGGATTTCAT GTGGCTACTA TCATAGCGCC

1021 TTCGTGACCA CAGATGGCGAGCTGTACGTC TTTGGGGAGC CCGAAAACGG AAAACTGGGC

1081 CTGCCTAACC AGCTGCTGGG CAATCACCGG ACACCCCAGC TGGTGTCCGAGATCCCTGAA

1141 AAAGTGATCC AGGTCGCCTG CGGGGGAGAG CATACAGTGG TCCTGACTGAGAATGCTGTG

1201 TATACCTTCG GACTGGGCCA GTTTGGCCAG CTGGGGCTGG GAACCTTCCTGTTTGAGACA

1261 TCCGAACCAA AAGTGATCGA GAACATTCGC GACCAGACTA TCAGCTACATTTCCTGCGGA

1321 GAGAATCACA CCGCACTGAT CACAGACATT GGCCTGATGT ATACCTTTGGCGATGGACGA

1381 CACGGGAAGC TGGGACTGGG ACTGGAGAAC TTCACTAATC ATTTTATCCCCACCCTGTGT

1441 TCTAACTTCC TGCGGTTCAT CGTGAAACTG GTCGCTTGCG GCGGGTGTCACATGGTGGTC

1501 TTCGCTGCAC CTCATAGGGG CGTGGCTAAG GAGATCGAAT TTGACGAGATTAACGATACA

1561 TGCCTGAGCG TGGCAACTTT CCTGCCATAC AGCTCCCTGA CTTCTGGCAATGTGCTGCAG

1621 AGAACCCTGA GTGCAAGGAT GCGGAGAAGG GAGAGGGAAC GCTCTCCTGACAGTTTCTCA

1681 ATGCGACGAA CCCTGCCACC TATCGAGGGA ACACTGGGAC TGAGTGCCTGCTTCCTGCCT

1741 AACTCAGTGT TTCCACGATG TAGCGAGCGG AATCTGCAGG AGTCTGTCCTGAGTGAGCAG

1801 GATCTGATGC AGCCAGAGGA ACCCGACTAC CTGCTGGATG AGATGACCAAGGAGGCCGAA

1861 ATCGACAACT CTAGTACAGT GGAGTCCCTG GGCGAGACTA CCGATATCCTGAATATGACA

1921 CACATTATGT CACTGAACAG CAATGAGAAG AGTCTGAAAC TGTCACCAGTGCAGAAGCAG

1981 AAGAAACAGC AGACTATTGG CGAGCTGACT CAGGACACCG CCCTGACAGAGAACGACGAT

2041 AGCGATGAGT ATGAGGAAAT GTCCGAGATG AAGGAAGGCA AAGCTTGTAAGCAGCATGTC

2101 AGTCAGGGGA TCTTCATGAC ACAGCCAGCC ACAACTATTG AGGCTTTTTCAGACGAGGAA

2161 GTGGAGATCC CCGAGGAAAA AGAGGGCGCA GAAGATTCCA AGGGGAATGGAATTGAGGAA

2221 CAGGAGGTGG AAGCCAACGA GGAAAATGTG AAAGTCCACG GAGGCAGGAAGGAGAAAACA

2281 GAAATCCTGT CTGACGATCT GACTGACAAG GCCGAGGTGT CCGAAGGCAAGGCAAAATCT

2341 GTCGGAGAGG CAGAAGACGG ACCAGAGGGA CGAGGGGATG GAACCTGCGAGGAAGGCTCA

2401 AGCGGGGCTG AGCATTGGCA GGACGAGGAA CGAGAGAAGG GCGAAAAGGATAAAGGCCGC

2461 GGGGAGATGG AACGACCTGG AGAGGGCGAA AAAGAGCTGG CAGAGAAGGAGGAATGGAAG

2521 AAAAGGGACG GCGAGGAACA GGAGCAGAAA GAAAGGGAGC AGGGCCACCAGAAGGAGCGC

2581 AACCAGGAGA TGGAAGAGGG CGGCGAGGAA GAGCATGGCG AGGGAGAAGAGGAAGAGGGC

2641 GATAGAGAAG AGGAAGAGGA AAAAGAAGGC GAAGGGAAGG AGGAAGGAGAGGGCGAGGAA

2701 GTGGAAGGCG AGAGGGAAAA GGAGGAAGGA GAACGGAAGA AAGAGGAAAGAGCCGGCAAA

2761 GAGGAAAAGG GCGAGGAAGA GGGCGATCAG GGCGAAGGCG AGGAGGAAGAGACCGAGGGC

2821 CGCGGGGAAG AGAAAGAGGA GGGAGGAGAG GTGGAGGGCG GAGAGGTCGAAGAGGGAAAG

2881 GGCGAGCGCG AAGAGGAAGA GGAAGAGGGC GAGGGCGAGG AAGAAGAGGGCGAGGGGGAA

2941 GAAGAGGAGG GAGAGGGCGA AGAGGAAGAG GGGGAGGGAA AGGGCGAAGAGGAAGGAGAG

3001 GAAGGGGAGG GAGAGGAAGA GGGGGAGGAG GGCGAGGGGG AAGGCGAGGAGGAAGAAGGA

3061 GAGGGGGAAG GCGAAGAGGA AGGCGAGGGG GAAGGAGAGG AGGAAGAAGGGGAAGGCGAA

3121 GGCGAAGAGG AGGGAGAAGG AGAGGGGGAG GAAGAGGAAG GAGAAGGGAAGGGCGAGGAG

3181 GAAGGCGAAG AGGGAGAGGG GGAAGGCGAG GAAGAGGAAG GCGAGGGCGAAGGAGAGGAC

3241 GGCGAGGGCG AGGGAGAAGA GGAGGAAGGG GAATGGGAAG GCGAAGAAGAGGAAGGCGAA

3301 GGCGAAGGCG AAGAAGAGGG CGAAGGGGAG GGCGAGGAGG GCGAAGGCGAAGGGGAGGAA

3361 GAGGAAGGCG AAGGAGAAGG CGAGGAAGAA GAGGGAGAGG AGGAAGGCGAGGAGGAAGGA

3421 GAGGGGGAGG AGGAGGGAGA AGGCGAGGGC GAAGAAGAAG AAGAGGGAGAAGTGGAGGGC

3481 GAAGTCGAGG GGGAGGAGGG AGAAGGGGAA GGGGAGGAAG AAGAGGGCGAAGAAGAAGGC

3541 GAGGAAAGAG AAAAAGAGGG AGAAGGCGAG GAAAACCGGA GAAATAGGGAAGAGGAGGAA

3601 GAGGAAGAGG GAAAGTACCA GGAGACAGGC GAAGAGGAAA ACGAGCGGCAGGATGGCGAG

3661 GAATATAAGA AAGTGAGCAA GATCAAAGGA TCCGTCAAGT ACGGCAAGCACAAAACCTAT

3721 CAGAAGAAAA GCGTGACCAA CACACAGGGG AATGGAAAAG AGCAGAGGAGTAAGATGCCT

3781 GTGCAGTCAA AACGGCTGCT GAAGAATGGC CCATCTGGAA GTAAAAAATTCTGGAACAAT

3841 GTGCTGCCCC ACTATCTGGA ACTGAAATAAGAGCTCCTCG AGGCGGCCCG CTCGAGTCTA

3901 GAGGGCCCTT CGAAGGTAAG CCTATCCCTAACCCTCTCCT CGGTCTCGAT TCTACGCGTA

3961 CCGGTCATCA TCACCATCAC CATTGAGTTT AAACCCGCTG ATCAGCCTCGACTGTGCCTT

4021 CTAGTTGCCA GCCATCTGTT GTTTGCCCCT CCCCCGTGCC TTCCTTGACCCTGGAAGGTG

4081 CCACTCCCAC TGTCCTTTCC TAATAAAATG AGGAAATTGC ATCGCATTGTCTGAGTAGGT

4141 GTCATTCTAT TCTGGGGGGT GGGGTGGGGC AGGACAGCAA GGGGGAGGATTGGGAAGACA

4201 ATAGCAGGCA TGCTGGGGAT GCGGTGGGCT CTATGGCTTC TGAGGCGGAAAGAACCAGAT

4261 CCTCTCTTAA GGTAGCATCG AGATTTAAAT TAGGGATAAC AGGGTAATGGCGCGGGCCGC

4321 AGGAACCCCT AGTGATGGAG TTGGCCACTC CCTCTCTGCG CGCTCGCTCGCTCACTGAGG

4381 CCGGGCGACC AAAGGTCGCC CGACGCCCGG GCTTTGCCCG GGCGGCCTCAGTGAGCGAGC

4441 GAGCGCGCAG。(SEQ ID NO:8)

在本公开的组合物的一些实施方案中，RPGR^ORF15多核苷酸还包含土拨鼠肝炎转录后调控元件。在一些实施方案中，RPGR^ORF15多核苷酸由编码RPGR^ORF15的cDNA的纯化的重组血清型2(rAAV)组成。在一些实施方案中，每个20nm AAV病毒体含有包含以下的单链DNA插入序列：119bp AAV2 5'反向末端重复序列(ITR)、199bp G蛋白偶联视紫红蛋白激酶1(GRK1)启动子、10bp Kozak序列、3459bp人RPGR^ORF15 cDNA、588bp WPRE、270bp牛生长激素聚腺苷酸化序列(BGH-polyA)以及130bp AAV2 3'ITR，以及侧接所述元件的短克隆序列。在一些实施方案中，编码WPRE的序列包含与以下核苷酸序列具有至少80％同一性、至少97％同一性或100％同一性的核苷酸序列：

1 atcaacctct ggattacaaa atttgtgaaa gattgactgg tattcttaac tatgttgctc

61 cttttacgct atgtggatac gctgctttaa tgcctttgta tcatgctatt gcttcccgta

121 tggctttcat tttctcctcc ttgtataaat cctggttgct gtctctttat gaggagttgt

181 ggcccgttgt caggcaacgt ggcgtggtgt gcactgtgtt tgctgacgca acccccactg

241 gttggggcat tgccaccacc tgtcagctcc tttccgggac tttcgctttc cccctcccta

301 ttgccacggc ggaactcatc gccgcctgcc ttgcccgctg ctggacaggg gctcggctgt

361 tgggcactga caattccgtg gtgttgtcgg ggaaatcatc gtcctttcct tggctgctcg

421 cctgtgttgc cacctggatt ctgcgcggga cgtccttctg ctacgtccct tcggccctca

481 atccagcgga ccttccttcc cgcggcctgc tgccggctct gcggcctctt ccgcgtcttc

541 gccttcgccc tcagacgagt cggatctccc tttgggccgc ctccccgc。

在一些实施方案中，编码WPRE的序列包含以下核苷酸序列或由其组成：

1 atcaacctct ggattacaaa atttgtgaaa gattgactgg tattcttaac tatgttgctc

61 cttttacgct atgtggatac gctgctttaa tgcctttgta tcatgctatt gcttcccgta

121 tggctttcat tttctcctcc ttgtataaat cctggttgct gtctctttat gaggagttgt

181 ggcccgttgt caggcaacgt ggcgtggtgt gcactgtgtt tgctgacgca acccccactg

241 gttggggcat tgccaccacc tgtcagctcc tttccgggac tttcgctttc cccctcccta

301 ttgccacggc ggaactcatc gccgcctgcc ttgcccgctg ctggacaggg gctcggctgt

361 tgggcactga caattccgtg gtgttgtcgg ggaaatcatc gtcctttcct tggctgctcg

421 cctgtgttgc cacctggatt ctgcgcggga cgtccttctg ctacgtccct tcggccctca

481 atccagcgga ccttccttcc cgcggcctgc tgccggctct gcggcctctt ccgcgtcttc

541 gccttcgccc tcagacgagt cggatctccc tttgggccgc ctccccgc。(SEQ ID NO:9)

在本公开的组合物的一些实施方案中，RPGR^ORF15多核苷酸还包含对应于5'反向末端重复序列(ITR)的序列和对应于3'反向末端重复序列(ITR)的序列。在一些实施方案中，编码5'ITR的序列和编码3’ITR的序列相同。在一些实施方案中，编码5'ITR的序列和编码3’ITR的序列不相同。在一些实施方案中，从血清型2腺相关病毒载体(AAV2)分离或衍生编码5'ITR的序列和编码3’ITR的序列。在一些实施方案中，编码5'ITR的序列和编码3’ITR的序列包含野生型序列。在一些实施方案中，编码5'ITR的序列和编码3'ITR的序列包含截短的野生型AAV2序列。在一些实施方案中，编码5'ITR的序列和编码3'ITR的序列当与野生型AAV2序列相比时包含变异。在一些实施方案中，变异包括取代、插入、缺失、倒位或调换。在一些实施方案中，变异包括野生型或变体序列的截短或延长。

在本公开的组合物的一些实施方案中，AAV包含对应于5'反向末端重复序列(ITR)的序列和对应于3'反向末端重复序列(ITR)的序列。在一些实施方案中，编码5'ITR的序列和编码3’ITR的序列相同。在一些实施方案中，编码5'ITR的序列和编码3’ITR的序列不相同。在一些实施方案中，从血清型2腺相关病毒载体(AAV2)分离或衍生编码5'ITR的序列和编码3’ITR的序列。在一些实施方案中，编码5'ITR的序列和编码3’ITR的序列包含野生型序列。在一些实施方案中，编码5'ITR的序列和编码3'ITR的序列包含截短的野生型AAV2序列。在一些实施方案中，编码5'ITR的序列和编码3'ITR的序列当与野生型AAV2序列相比时包含变异。在一些实施方案中，变异包括取代、插入、缺失、倒位或调换。在一些实施方案中，变异包括野生型或变体序列的截短或延长。

在本公开的组合物的一些实施方案中，AAV包含形成复制缺陷型AAV所必需的病毒序列。在一些实施方案中，从血清型与编码5'ITR的序列或编码3'ITR的序列中的一者或两者相同的AAV分离或衍生病毒序列。在一些实施方案中，从AAV2分离或衍生病毒序列、编码5'ITR的序列或编码3'ITR的序列。

在本公开的组合物的一些实施方案中，AAV包含形成复制缺陷型AAV所必需的病毒序列、编码5'ITR的序列以及编码3'ITR的序列，但不包含从AAV分离或衍生的任何其他序列。在一些实施方案中，AAV为重组AAV(rAAV)，所述重组AAV包含形成复制缺陷型AAV所必需的的病毒序列、编码5'ITR的序列、编码3'ITR的序列以及编码本公开的RPGR^ORF15多核苷酸的序列。

在一些实施方案中，用于在宿主细胞中形成rAAV的质粒DNA包含选择标记物。说明性选择标记物包括但不限于抗生素抗性基因。说明性抗生素抗性基因包括但不限于安比西林(ampicillin)和卡那霉素(kanamycin)。说明性选择标记物包括但不限于药物或小分子抗性基因。说明性选择标记物包括但不限于dapD和可抑制操纵子，包括但不限于控制或抑制dapD表达的lacO/P构建体，其中通过施用能够进行操纵子抑制子滴定(ORT)的质粒或使其与转化的细胞接触来进行质粒选择。说明性选择标记物包括但不限于ccd选择基因。在一些实施方案中，ccd选择基因包含编码拯救经工程化以表达毒性ccdB基因的宿主细胞系的ccdA选择基因的序列。说明性选择标记物包括但不限于sacB，其中施用RNA或使其与宿主细胞接触以抑制sacB基因在蔗糖培养基中的表达。说明性选择标记物包括但不限于分离杀伤机构，诸如由Hok(杀宿主基因)和Sok(抑制杀伤)组成的parAB+基因座。

AAV-RPGR^ORF15结构

AAV-RPGR^ORF15由编码RPGR^ORF15 cDNA的纯化的重组血清型2腺相关病毒载体(rAAV)组成。

在一些实施方案中，AAV-RPGR^ORF15包含以下中的一者或多者：编码5'ITR的序列、编码3'ITR的序列以及编码从血清型8腺相关病毒载体(AAV8)分离和/或衍生的衣壳蛋白的序列。在一些实施方案中，AAV-RPGR^ORF15包含编码5'ITR的截短序列和编码从血清型2腺相关病毒载体(AAV2)分离和/或衍生的3'ITR的序列以及编码从血清型8腺相关病毒载体(AAV8)分离和/或衍生的衣壳蛋白的序列。在一些实施方案中，AAV-RPGR^ORF15包含野生型AAV2 ITR(野生型5'ITR和野生型3'ITR)。

在一些实施方案中，每个20nm AAV病毒体含有单链DNA插入序列(加上侧接每个元件的短克隆位点)，所述单链DNA插入序列包含：(a)5'反向末端重复序列(ITR)，(b)适合在哺乳动物细胞中表达的启动子，(c)编码RPGR^ORF15的cDNA，以及(d)3'ITR。

在一些实施方案中，每个20nm AAV病毒体含有单链DNA插入序列(加上侧接每个元件的短克隆位点)，所述单链DNA插入序列包含：(a)5'反向末端重复序列(ITR)，(b)适合在哺乳动物细胞中表达的启动子，(c)编码RPGR^ORF15的cDNA，(c)聚腺苷酸化信号，以及(d)1bp3'ITR。

在一些实施方案中，每个20nm AAV病毒体含有单链DNA插入序列(加上侧接每个元件的短克隆位点)，所述单链DNA插入序列包含：(a)5'反向末端重复序列(ITR)，(b)适合在哺乳动物细胞中表达的启动子，(c)Kozak序列，(d)编码RPGR^ORF15的cDNA，(e)聚腺苷酸化信号，以及(f)1bp 3'ITR。

在一些实施方案中，每个20nm AAV病毒体含有单链DNA插入序列(加上侧接每个元件的短克隆位点)，所述单链DNA插入序列包含：(a)5'反向末端重复序列(ITR)，(b)适合在哺乳动物细胞中表达的启动子，(c)编码RPGR^ORF15的cDNA，(d)转录后调控元件(PRE)，(e)聚腺苷酸化序列(polyA)，以及(f)3'ITR。

在一些实施方案中，每个20nm AAV病毒体含有单链DNA插入序列(加上侧接每个元件的短克隆位点)，所述单链DNA插入序列包含：(a)119bp 5'反向末端重复序列(ITR)，(b)启动子，任选为199bp GRK1启动子，(c)编码RPGR^ORF15的cDNA，(d)270bp牛生长激素聚腺苷酸化序列(BGH-polyA)，以及(e)130bp 3'ITR。

在一些实施方案中，每个20nm AAV病毒体含有单链DNA插入序列(加上侧接每个元件的短克隆位点)，所述单链DNA插入序列包含：(a)119 5'反向末端重复序列(ITR)，(b)启动子，任选为199bp GRK1启动子，(c)Kozak序列，(d)编码RPGR^ORF15的cDNA，(e)270bp牛生长激素聚腺苷酸化序列(BGH-polyA)，以及(f)130 3'ITR。

在一些实施方案中，每个20nm AAV病毒体含有单链DNA插入序列(加上侧接每个元件的短克隆位点)，所述单链DNA插入序列包含：(a)119 5'反向末端重复序列(ITR)，(b)启动子，任选为199bp GRK1启动子，(c)编码RPGR^ORF15的cDNA，(d)588bp土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)，(e)270bp牛生长激素聚腺苷酸化序列(BGH-polyA)，以及(f)130 3'ITR。

在一些实施方案中，每个20nm AAV病毒体含有单链DNA插入序列(加上侧接每个元件的短克隆位点)，所述单链DNA插入序列包含：(a)119bp 5'反向末端重复序列(ITR)，(b)启动子，任选为199bp GRK1启动子，(c)10bp Kozak序列，(d)编码RPGR^ORF15的cDNA，(e)588bp土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)，(f)270bp牛生长激素聚腺苷酸化序列(BGH-polyA)，以及(g)130bp 3'ITR。

本公开的AAV-RPGR^ORF15可包含编码能够在哺乳动物细胞中表达的启动子的序列。优选地，本公开的AAV或AAV-RPGR^ORF15构建体可包含编码能够在人细胞中表达的启动子的序列。本公开的说明性启动子包括但不限于组成活性启动子、细胞类型特异性启动子、病毒启动子、哺乳动物启动子以及杂合或重组启动子。在本公开的组合物的一些实施方案中，RPGR^ORF15 cDNA在G蛋白偶联受体激酶1(GRK1)启动子的控制下。

本公开的AAV-RPGR^ORF15可包含编码转录后调控元件(PRE)的序列。本公开的说明性PRE包括但不限于土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE)。在本公开的组合物的一些实施方案中，AAV包含588bp WPRE，所述588bp WPRE来源于病毒S转录物的3'区，紧接在编码本公开的治疗性RPGR^ORF15的cDNA的下游。此WPRE对于天然mRNA转录物的高水平表达为重要的，从而起到增强mRNA加工和转运无内含子基因的作用。在本公开的组合物的一些实施方案中，已通过消除翻译起始位点对WPRE进行修饰以阻止病毒X抗原表达。这已通过使We2启动子/增强子缺失并且使We1启动子突变实现。

本公开的AAV-RPGR^ORF15可包含聚腺苷酸(polyA)序列。本公开的说明性polyA序列包括但不限于牛生长激素聚腺苷酸化(BGH-polyA)序列。使用BGH-polyA序列来增强基因表达并且已显示与其他polyA序列(诸如SV40和人胶原蛋白polyA)相比得到三倍高的表达水平。这种增加的表达很大程度上与上游启动子或转基因的类型无关。使用BGH-polyA与WPRE序列增加表达水平允许注射较低总剂量的AAV或质粒载体，这种较低总剂量不太可能会产生宿主免疫反应。

剂型

可将本公开的AAV-RPGR^ORF15组合物配制成用于全身或局部施用。优选地，可将本公开的AAV-RPGR^ORF15组合物配制成用于局部施用。

可将本公开的AAV-RPGR^ORF15组合物配制成用于注射或输注的悬浮液。

可将本公开的AAV-RPGR^ORF15组合物配制成用于通过任何途径进行注射或输注，包括但不限于玻璃体内注射或输注、视网膜下注射或输注或者脉络膜上腔注射或输注。

在本文所描述的组合物中的任一者中，组合物中的AAV-RPGR^ORF15的量可表示为绝对量(基因组粒子数(gp或pg))或浓度(载体基因组数(vg)/毫升(mL))。“基因组粒子数”的值等效于“载体基因组数”的值。

可将本公开的AAV-RPGR^ORF15组合物配制成浓度为0.5x10¹⁰个载体基因组(vg)/毫升(mL)至1x10¹³vg/mL，例如0.5x10¹⁰vg/mL至1x10¹³vg/mL、0.5x10¹¹vg/mL至1x10¹³vg/mL、0.5x10¹²vg/mL至1x10¹³vg/mL、1x10¹²vg/mL至1x10¹³vg/mL、2x10¹²vg/mL至1x10¹³vg/mL，端点包括在内。如本文所用，vg/mL是指如通过诸如qPCR或ddPCR等定量分析所测量的每mL溶液的rAAV载体基因组数目。在一些实施方案中，可将本公开的组合物配制成浓度为0.5x10¹¹vg/mL或1x10¹²vg/ml。在一些实施方案中，可将本公开的组合物配制成浓度为约0.5x10¹¹vg/mL。在一些实施方案中，可将本公开的组合物配制成浓度为约1x10¹²vg/mL。在一些实施方案中，可将本公开的组合物配制成浓度为约5x10¹²vg/mL。在一些实施方案中，可将本公开的组合物配制成浓度为约1x10¹³vg/mL。在一些实施方案中，可将本公开的组合物配制成浓度为约5x10⁹gp/mL和1x10¹³gp/mL，例如0.5x10¹⁰gp/mL和1x10¹³gp/mL、0.5x10¹¹gp/mL和1x10¹³gp/mL、0.5x10¹²gp/mL和1x10¹³gp/mL、1x10¹²gp/mL和1x10¹³gp/mL、2x10¹²gp/mL和1x10¹³gp/mL。在一些实施方案中，可将本公开的组合物配制成浓度为约1x10¹⁰gp/ml。在一些实施方案中，可将本公开的组合物配制成浓度为约5x10¹⁰gp/mL。在一些实施方案中，可将本公开的组合物配制成浓度为约1x10¹¹gp/mL。在一些实施方案中，可将本公开的组合物配制成浓度为约2.5x10¹¹gp/mL。在一些实施方案中，可将本公开的组合物配制成浓度为约5x10¹¹gp/mL。在一些实施方案中，在用DNA酶处理粒子之后(即以DNA酶抗性粒子(DRP)形式)通过定量分析(诸如qPCR或ddPCR)测定载体基因组数(vg)。

可将本公开的AAV-RPGR^ORF15组合物配制成浓度为0.5x10¹⁰个DNA酶抗性粒子(DRP)/毫升(mL)至1x10¹³DRP/mL，例如0.5x10¹⁰DRP/mL至1x10¹³DRP/mL、0.5x10¹¹DRP/mL至1x10¹³DRP/mL、0.5x10¹²DRP/mL至1x10¹³DRP/mL、1x10¹²DRP/mL至1x10¹³DRP/mL、2x10¹²DRP/mL至1x10¹³DRP/mL，端点包括在内。如本文所用，DRP/mL是指如通过本文所公开的方法所测量的每mL溶液的rAAV DNA酶抗性粒子数目。在一些实施方案中，可将本公开的组合物配制成浓度为0.5x10¹¹DRP/mL或1x10¹²DRP/mL。在一些实施方案中，可将本公开的组合物配制成浓度为约0.5x10¹¹DRP/mL。在一些实施方案中，可将本公开的组合物配制成浓度为约1x10¹²DRP/mL。在一些实施方案中，可将本公开的组合物配制成浓度为约5x10¹²DRP/mL。在一些实施方案中，可将本公开的组合物配制成浓度为约1x10¹³DRP/mL。

在一些实施方案中，可将本公开的组合物配制成浓度为约5x10⁹DRP/mL和1x10¹³DRP/mL，例如0.5x10¹⁰DRP/mL和1x10¹³DRP/mL、0.5x10¹¹DRP/mL和1x10¹³DRP/mL、0.5x10¹²DRP/mL和1x10¹³DRP/mL、1x10¹²DRP/mL和1x10¹³DRP/mL、2x10¹²DRP/mL和1x10¹³DRP/mL。在一些实施方案中，可将本公开的组合物配制成浓度为约1x10¹⁰DRP/mL。在一些实施方案中，可将本公开的组合物配制成浓度为约5x10¹⁰DRP/mL。在一些实施方案中，可将本公开的组合物配制成浓度为约1x10¹¹DRP/mL。在一些实施方案中，可将本公开的组合物配制成浓度为约2.5x10¹¹DRP/mL。在一些实施方案中，可将本公开的组合物配制成浓度为约5x10¹¹DRP/mL。

在一些实施方案中，本公开的组合物包含1.25x10¹²DRP/mL至1.0x10¹³DRP/mL，例如1.25x10¹²DRP/mL、1.5x10¹²DRP/mL、1.75x10¹²DRP/mL、2.0x10¹²DRP/mL、2.5x10¹²DRP/mL、3.0x10¹²DRP/mL、3.5x10¹²DRP/mL、4.0x10¹²DRP/mL、4.5x10¹²DRP/mL、5.0x10¹²DRP/mL、5.5x10¹²DRP/mL、6.0x10¹²DRP/mL、6.5x10¹²DRP/mL、7.0x10¹²DRP/mL、7.5x10¹²DRP/mL、8.0x10¹²DRP/mL、8.5x10¹²DRP/mL、9.0x10¹²DRP/mL、9.5x10¹²DRP/mL或1.0x10¹³DRP/mL。

可在施用之前将本公开的组合物使用本公开的稀释剂稀释。在一些实施方案中，稀释剂与用于制备AAV-RPGR^ORF15组合物的配制缓冲液相同。在一些实施方案中，稀释剂与用于制备AAV-RPGR^ORF15组合物的配制缓冲液不相同。

本公开的组合物可包含满的和空的AAV粒子。在一些实施方案中，满的AAV粒子包含编码本公开的AAV-RPGR^ORF15的单链DNA。一般熟练技工可通过例如透射电子显微术分析、qPCR或ddPCR确定AAV粒子是满的还是空的。在本公开的组合物的一些实施方案中，组合物包含至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、65％、至少67％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少76％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％的满的AAV粒子。在一些实施方案中，组合物包含至少70％的满的AAV粒子。

施用

可通过视网膜下递送、直接视网膜递送、脉络膜上腔递送或玻璃体内递送向受试者的眼睛施用本公开的AAV-RPGR ^ORF15组合物。

视网膜下施用

视网膜下递送可包括注射或输注至视网膜下空间中。在本公开的一些实施方案中，视网膜下递送包括注射或输注至视网膜下空间中。在一些实施方案中，视网膜下递送包括一次或多次注射或输注至视网膜下空间中。在一些实施方案中，视网膜下递送包括至少一次注射或输注至视网膜下空间中。在一些实施方案中，视网膜下递送包括多次注射或输注至视网膜下空间中。

视网膜下递送可包括注射或输注至视网膜下空间中流体填充的泡中。在本公开的一些实施方案中，视网膜下递送包括注射或输注至视网膜下空间中。在一些实施方案中，视网膜下递送包括一次或多次注射或输注至视网膜下空间中流体填充的泡中。在一些实施方案中，视网膜下递送包括至少一次注射或输注至视网膜下空间中流体填充的泡中。在一些实施方案中，视网膜下递送包括多次注射或输注至视网膜下空间中流体填充的泡中。

视网膜下空间为视网膜感觉神经层(neurosensory retina)下面的空间。在视网膜下注射期间，将材料注射至感光细胞与视网膜色素上皮(RPE)层之间并且形成空间。当通过小视网膜切开术进行注射时，可形成视网膜脱离。由所注射的材料产生的脱离的拱起的视网膜层称为“泡”。在一些实施方案中，通过视网膜下注射形成的孔足够小，使得在施用之后所注射的溶液不显著回流至玻璃体腔中。优选地，注射在视网膜感觉神经层中形成自密封入口点，即在移除注射针头后，由针头形成的孔再次密封使得极少或基本上没有所注射的材料通过孔释放。

在一些实施方案中，用于视网膜下注射的装置包括微量递送装置。在一些实施方案中，微量递送装置包括适合于视网膜下注射的微针。适合的微针为可商购获得的。在一些实施方案中，微针包括DORC 41G特氟隆视网膜下注射针头(Dutch Ophthalmic ResearchCenter International BV,Zuidland,The Netherlands)。在一些实施方案中，装置包含至少50μL的体积。在一些实施方案中，装置包含至少100μL或至多100μL(例如25-100μL、50-100μL、75-100μL)的体积。在一些实施方案中，装置包含至少200μL的体积。在一些实施方案中，除将向受试者施用的AAV-RPGR ^ORF15的体积之外，装置还包含80-110μL的死体积(即，用于引发装置但不能注射或回收的组合物的体积)。

在一些实施方案中，可通过使用手术显微镜(Leica Microsystems,Germany)在直接目视引导下递送包含AAV粒子的组合物来进行视网膜下注射。一种说明性方法为用汉密尔顿注射器和34号针头使用巩膜隧道法通过后极到达上视网膜的方法(ESS labs,UK)。或者，可使用前房穿刺术用33G针头进行视网膜下注射，然后使用WPI注射器和斜切35G针头系统(World Precision Instruments,UK)进行视网膜下注射。另一替代方案为WPI Nanofil注射器(WPI，部件号NANOFIL)和34号WBI Nanofil针头(WPI，部件号NF34BL-2)。

在一些实施方案中，视网膜下注射包括两步视网膜下注射。在一些实施方案中，两步视网膜下注射包括：(a)将视网膜下注射针头插入受试者眼睛中的感光细胞层与视网膜色素上皮层之间；(b)将溶液以足以使视网膜从RPE部分脱离并且形成泡的量注射在受试者眼睛中的感光细胞层与视网膜色素上皮层之间；以及(c)将组合物注射至泡中。在一些实施方案中，溶液包括平衡盐溶液。

在一些实施方案中，视网膜下递送包括玻璃体切除术以及注射至视网膜下空间中。在一些实施方案中，可使用

(双目镜间接检眼显微镜)玻璃体切除术系统进行手术。举例来说，受试者可经历玻璃体切除术以及玻璃体后脱离(图22A)。在一些实施方案中，在视网膜下注射之前，可使用至多0.5mL的平衡盐溶液(BSS)使视网膜脱离。在一些实施方案中，在视网膜下注射之前，可使用0.05-0.5mL的BSS使视网膜脱离。在一些实施方案中，在视网膜下注射之前，可使用0.1-0.5mL的BSS使视网膜脱离。在一些实施方案中，在视网膜下注射之前，可使用通过连接至玻璃体注射设备的41号视网膜下套管注射的0.1-0.5mL的平衡盐溶液(BSS)使视网膜脱离(图22B)。在一些实施方案中，在视网膜下注射之前，可使用0.01-1.0mL、0.05-1.0mL、0.1-1mL、0.01-0.5mL、0.05-0.5mL或0.1-0.5mL的BSS使视网膜脱离。在一些实施方案中，在视网膜下注射之前，可使用约0.05mL、约0.1mL、约0.2mL、约0.3mL、约0.4mL、约0.5mL或约0.6mL的BSS使视网膜脱离。然后可通过相同进入位点将单个剂量的病毒载体注射至视网膜下流体中。如果在较小体积的流体情况下发生黄斑脱离，那么还可选择在眼球后侧(例如鼻至视盘)的额外视网膜下位点来递送最多整个剂量(例如0.1mL)的载体。这避免了过量中央凹延伸。如果遇到视网膜脱离的意外并发症(例如形成的黄斑裂孔需要用气体处理)，那么可将载体注射推迟到较晚的日期。

在一些实施方案中，视网膜下递送包括超过一次视网膜下注射。在一些实施方案中，视网膜下递送包括在眼睛中的不同位置施以多次视网膜下注射。在一些实施方案中，视网膜下递送包括在不同时间向眼睛中的相同位置施以多次视网膜下注射。在一些实施方案中，在前一次视网膜下注射之后至少1周、2周、3周、1个月、2个月、3个月、4个月、5个月6个月、12个月、18个月、24个月或3年时进行再一次视网膜下注射。在一些实施方案中，视网膜下递送包括在眼睛的不同位置并且在不同时间施以多次视网膜下注射。

脉络膜上腔施用

脉络膜上腔递送可包括注射或输注至脉络膜上腔空间中。在本公开的一些实施方案中，脉络膜上腔递送包括注射或输注至脉络膜上腔空间中。在一些实施方案中，脉络膜上腔递送包括一次或多次注射或输注至脉络膜上腔空间中。在一些实施方案中，脉络膜上腔递送包括至少一次注射或输注至脉络膜上腔空间中。在一些实施方案中，脉络膜上腔递送包括多次注射或输注至脉络膜上腔空间中。

脉络膜上腔递送可包括注射或输注至脉络膜上腔空间中流体填充的泡中。在本公开的一些实施方案中，脉络膜上腔递送包括注射或输注至脉络膜上腔空间中。在一些实施方案中，脉络膜上腔递送包括一次或多次注射或输注至脉络膜上腔空间中流体填充的泡中。在一些实施方案中，脉络膜上腔递送包括至少一次注射或输注至脉络膜上腔空间中流体填充的泡中。在一些实施方案中，脉络膜上腔递送包括多次注射或输注至脉络膜上腔空间中流体填充的泡中。

脉络膜上腔空间为视网膜的巩膜与脉络膜之间的空间。在脉络膜上腔注射期间，将材料注射至此空间中。脉络膜上腔空间穿过眼睛后段的圆周。通过将组合物递送至脉络膜上腔空间，可将组合物以高浓度(并且在空间中没有稀释)直接递送至脉络膜、视网膜色素上皮细胞以及视网膜(包括感光细胞)，从而保留或维持组合物在注射或输注位点的生物利用率。

图14至17为人眼10的各种视图(其中图15至17为剖视图)。虽然标示了特定区域，但本领域技术人员将认识到继续标示的区域不构成眼睛10的整体，相反地所标示的区域是作为适合于论述本文的实施方案的简化实例存在。眼睛10包括前段12(在晶状体前面并且包括晶状体的眼睛部分)与后段14(晶状体后面的眼睛部分)。前段12以角膜16和晶状体18为边界，而后段14以巩膜20和晶状体18为边界。前段12进一步再分成在虹膜24与角膜16之间的前房22以及在晶状体18与虹膜24之间的后房26。角膜16和巩膜20在它们相遇的点共同形成角膜缘38。眼睛的前段12上巩膜20的暴露部分由称为结膜45的透明膜保护(参见例如图15和16)。在巩膜20下面为脉络膜28和视网膜27，统称为视网膜脉络膜组织。玻璃体液30(也称为“玻璃体”)位于睫状体32(包括睫状肌和睫状突)与视网膜27之间。视网膜27的前面部分形成锯齿缘34。脉络膜28与巩膜20之间的疏松结缔组织或潜在空间称为脉络膜上层。图15说明了角膜16，所述角膜16由上皮40、鲍曼氏层(Bowman's layer)41、基质42、德斯密氏膜(Descemet's membrane)43以及内皮44组成。图16说明了巩膜20加上周围的特农氏囊(Tenon's Capsule)46或结膜45、脉络膜上腔空间36、脉络膜28以及视网膜27，脉络膜上腔空间36中基本上没有流体和/或组织分离(即，在此构造中，空间为“潜在”脉络膜上腔空间)。如图3中所示，巩膜20具有介于约500μm与700μm之间的厚度。图17说明了巩膜20加上周围的特农氏囊46或结膜45、脉络膜上腔空间36、脉络膜28以及视网膜27，脉络膜上腔空间36中具有流体50。

如本文所用，术语“脉络膜上腔空间”描述了在眼睛10中位于巩膜20与脉络膜28之间的区域中的空间(或体积)和/或潜在空间(或潜在体积)。此区域由来源于两个相邻组织中的每一者的长着色突起的紧密堆积层组成；然而，在此区域中可形成空间，因为流体或其他材料在脉络膜上腔空间和相邻组织中积累。脉络膜上腔空间可因由于眼睛中的一些疾病状态或由于一些外伤或手术干预引起的流体积累而扩大。在一些实施方案中，通过将药物制剂递送、注射和/或输注至脉络膜上层中来有意地形成流体积累，从而形成和/或进一步扩大脉络膜上腔空间36(即，通过在其中安置本公开的基因疗法组合物)。此体积可充当葡萄膜巩膜外流的通道(即，流体通过非压力依赖性过程离开眼睛的自然过程)并且在脉络膜从巩膜脱离的情况下可成为空间。

图14中的虚线表示眼睛10的赤道。在一些实施方案中，接触步骤可包括在赤道与角膜缘38之间的位置(即，在眼睛10的前面部分12中)刺穿巩膜的外表面。举例来说，在一些实施方案中，所述位置介于角膜缘38后侧约两毫米与10毫米(mm)之间。在其他实施方案中，所述位置位于眼睛10的赤道周围。在其他实施方案中，所述位置为眼睛10的赤道后侧。以此方式，可通过巩膜中的至少一个通道将本公开的基因疗法组合物引入(例如经由针头、微针、导管或微导管)脉络膜上腔空间36中，并且可在输注事件期间(例如在注射期间)远离所述至少一个通道流过脉络膜上腔空间36。

脉络膜上腔途径

本公开的组合物在通过视网膜下途径施用它们时提供治疗益处，然而，在患有视网膜疾病或病症的受试者中(特别是当视网膜损伤严重并且组织变弱时)，可能难以在不对因疾病而弱化的视网膜造成额外损伤的情况下通过视网膜下途径施用。此外，即使在视网膜下注射不会对视网膜造成永久性损伤时，归因于注射的物理约束，每次注射可施用的最大体积也有限。

脉络膜上腔注射或输注克服了使用玻璃体内或视网膜下途径所面临的许多挑战。可使用脉络膜上腔注射或输注来治疗视网膜疾病，并且在不用任何医学装置接触视网膜或RPE本身的情况下到达视网膜色素上皮(RPE)的细胞。通过脉络膜上腔途径进行注射或输注可靶向RPE和视网膜的区域。部分取决于基因疗法组合物的配制和所用的分散方法(被动与主动)，与靶向的注射位点相比，组合物可均匀地散布在更大的视网膜或RPE表面上。在单一程序内或历经多个程序的过程，脉络膜上腔施用容许在视网膜的外表面的多个位置进行多次注射或输注。

脉络膜上腔空间可容纳至多1mL的所注射或输注的组合物。此外，注射或输注至脉络膜上腔空间中的组合物可快速扩散至眼睛后段。然而，组合物从脉络膜上腔空间扩散至玻璃体中随组合物的亲脂性和分子量的增加而减少。在本公开的组合物的优选实施方案中，组合物包含病毒载体，并且因此，这些组合物不经过RPE扩散到达玻璃体。

本公开提供了出于改善椭圆体带(EZ)、视网膜敏感度、视敏度、视网膜厚度或ONL厚度或它们的组合的目的通过脉络膜上腔途径将本公开的AAV-RPGR^ORF15组合物施用至视网膜的多个病灶区域的方法。视网膜神经元形成每只眼睛中整个视野的空间图。相对于每只人眼(左眼和右眼)，并且从受试者的观点来看，左半边视野由右半边视网膜上的神经元感知。相反地，相对于每只人眼(左眼和右眼)，并且从受试者的观点来看，右半边视野由左半边视网膜上的神经元感知。

在一些实施方案中，用于脉络膜上腔注射的装置包括微量递送装置。在一些实施方案中，微量递送装置包括适合于脉络膜上腔注射的微导管。适合的微导管为可商购获得的。在一些实施方案中，装置包含至少50μL的体积。在一些实施方案中，装置包含至少100μL或至多100μL(例如25-100μL、50-100μL、75-100μL)的体积。在一些实施方案中，装置包含至少200μL的体积。在一些实施方案中，除将向受试者施用的AAV-RPGR ^ORF15的体积之外，装置还包含50-200μL的死体积(即，用于引发装置但不能注射或回收的组合物的体积)。

为改善视野的左-右轴上的EZ、视网膜敏感度、视敏度、视网膜厚度或ONL厚度或它们的组合，根据本公开的方法的一些实施方案，可通过脉络膜上腔途径将本公开的AAV-RPGR^ORF15组合物施用至眼睛的左半边视网膜的至少一个病灶位置上以及右半边视网膜的至少一个病灶位置上，以改善视网膜的能力并且因此改善受试者的目视系统，从而使用这两个区域中改善的视敏度相对区分光源，并且因此，改善视觉。此原理适用于视野的任何轴，通常包括视野的上半部分和下半部分以及视野的左半部分和右半部分。

在具有更大精确性的情况下，视网膜将被分区为至少两个部分，在本公开的方法的一些实施方案中，可通过脉络膜上腔途径将本公开的AAV-RPGR^ORF15组合物施用至第一部分视网膜中的至少一个病灶位置以及第二部分视网膜中的至少一个病灶位置。优选地，第一部分视网膜中的至少一个病灶位置以及第二部分视网膜中的至少一个病灶位置位于视网膜的相对侧，所述位置可由在视网膜的中心处二等分的理论上的线连接。在一些实施方案中，视网膜的中心为覆盖视网膜图像的圆的中心，其中所述圆包含360度。在一些实施方案中，视网膜的中心为视网膜的中央凹，其中通过合并一张或多张照片将视网膜在物理上展平或在理论上展平。在一些实施方案，包括其中视网膜的中心为覆盖视网膜图像的圆的中心，其中所述圆包含360度的那些实施方案中，可将视网膜分区为1个至360个部分，端点包括在内，可通过脉络膜上腔途径将AAV-RPGR^ORF15组合物施用至第一部分视网膜中的至少一个病灶位置以及第二部分视网膜中的至少一个病灶位置，并且第一和第二部分的视网膜在圆上彼此正相对(例如0°和180°或90°和270°)。在一些实施方案，包括其中视网膜的中心为覆盖视网膜图像的圆的中心，其中所述圆包含360度的那些实施方案中，可将视网膜分区为1个至360个部分，端点包括在内，可通过脉络膜上腔途径将AAV-RPGR^ORF15组合物施用至第一部分视网膜中的至少一个病灶位置以及第二部分视网膜中的至少一个病灶位置，并且第一和第二部分的视网膜在圆上在一定范围的位置内彼此相对(例如0-30°和180-210°或90-120°和270-300°)。

在本公开的方法的一些实施方案中，可通过脉络膜上腔途径将本公开的AAV-RPGR^ORF15组合物施用至视网膜的至少一对相对位置。在一些实施方案中，可通过脉络膜上腔途径将本公开的基因疗法载体施用至视网膜的至少2对、3对、4对、5对、6对、7对、8对、9对、10对、11对、12对、13对、14对、15对、16对、17对、18对、19对、20对、25对、30对、35对、40对、45对、50对、55对、60对、65对、70对、75对、80对、85对、90对、95对、100对、120对、140对、140对、160对、180对或其间任何数目的对数的相对位置。

在本公开的方法的一些实施方案，包括其中可通过脉络膜上腔途径将本公开的AAV-RPGR^ORF15组合物施用至视网膜的至少一对相对位置的那些实施方案中，在第一位置提供的剂量与在配对的第二位置提供的剂量为相同的。

在本公开的方法的一些实施方案，包括其中可通过脉络膜上腔途径将本公开的AAV-RPGR^ORF15组合物施用至视网膜的至少一对相对位置的那些实施方案中，在第一位置提供的剂量与在配对的第二位置提供的剂量不相同。在一些实施方案中，在第一位置提供的剂量与在配对的第二位置提供的剂量包含不同的注射或输注体积。在一些实施方案中，在第一位置提供的剂量包含的体积比在配对的第二位置提供的剂量大。在一些实施方案中，在第二位置提供的剂量包含的体积比在配对的第一位置提供的剂量大。在一些实施方案中，在第一位置提供的剂量与在配对的第二位置提供的剂量包含不同的AAV-RPGR^ORF15组合物浓度。在一些实施方案中，在第一位置提供的剂量包含的浓度比在配对的第二位置提供的剂量大。在一些实施方案中，在第一位置提供的剂量包含的浓度比在配对的第二位置提供的剂量大。在一些实施方案中，在第二位置提供的剂量包含的浓度比在配对的第一位置提供的剂量大。

在本公开的方法的一些实施方案，包括其中可通过脉络膜上腔途径将本公开的AAV-RPGR^ORF15组合物施用至视网膜的至少两对相对位置的那些实施方案中，提供至第一对相对位置的剂量与提供至第二对相对位置的剂量为相同的。

在本公开的方法的一些实施方案，包括其中可通过脉络膜上腔途径将本公开的AAV-RPGR^ORF15组合物施用至视网膜的至少两对相对位置的那些实施方案中，提供至第一对相对位置的剂量与提供至第二对相对位置的剂量不相同。在一些实施方案中，提供至第一对相对位置的剂量与提供至第二对相对位置的剂量包含不同的注射或输注体积。在一些实施方案中，提供至第一对相对位置的剂量包含的体积比提供至第二对相对位置的剂量大。在一些实施方案中，提供至第二对相对位置的剂量包含的体积比提供至第一对相对位置的剂量大。在一些实施方案中，提供至第一对相对位置的剂量与提供至第二对相对位置的剂量包含不同浓度的基因疗法浓度。在一些实施方案中，提供至第一对相对位置的剂量包含的浓度比提供至第二对相对位置的剂量大。在一些实施方案中，提供至第二对相对位置的剂量包含的浓度比提供至第一对相对位置的剂量大。

脉络膜上腔装置

可使用标准小号针头进行脉络膜上腔施用。然而，还涵盖专门用于脉络膜上腔施用的装置。

微针

微针可用于向任何年龄的受试者施用，然而，微针可特别适用于将本公开的组合物递送至儿童(儿科患者)，因为解剖学尺寸较小。

本公开的微针可包括斜角，所述斜角允许便于以最小附加损伤刺入巩膜和/或脉络膜上腔空间。微针的斜切面界定了小于约20度的顶角以及小于约2.5的斜角高度与斜角宽度比。在一个实施方案中，斜切微针允许准确并且可重现地将药物递送至眼睛的脉络膜上腔空间。

在一些实施方案中，微针具有第一末端和第二末端，它们之间的空间界定一个管腔。微针的第一末端可包括斜切面。斜面界定了第一斜切角和不同于第一斜切角的第二斜切角。在一些实施方案中，第一斜切角小于第二斜切角。在一些实施方案中，第一斜切角小于约20度并且第二斜切角小于约30度。

在一些实施方案中，本公开的微针可界定窄管腔(例如规格尺寸大于或等于30号、32号、34号、36号等)，以允许脉络膜上腔药物递送，同时使通过由微针刺入巩膜形成的通道的直径最小。在一些实施方案中，本公开的微针的管腔和斜角纵横比与用于其他眼内注射途径的标准小号针头(例如27号和30号针头)不同。举例来说，本文所描述的实施方案中所包括的微针可为国际专利申请公布号WO2014/036009、美国专利号9,636,253、美国专利号9,788,995、美国专利号8,808,225以及美国专利号8,197,435(所述专利的内容各自以全文引用的方式并入本文中)中所描述的那些微针中的任一者。

套管

在一些实施方案中，微量递送装置包括套管或由其组成，并且微量递送装置的中空第一末端包括针头或由其组成。套管可包括伸长的管状管腔。伸长的管状管腔可还包括力元件，诸如弹簧或气体储集器，所述力元件提供力，从而推进或部署套管穿过管腔并且从针头的中空第一末端出来。或者或此外，力元件可提供力，从而使基因疗法组合物流过针头的中空第一末端和/或套管。

可通过推杆或推杆与套管之间的活塞使力元件机械偶合至套管。或者，可使力元件的末端与套管的一部分直接配合。可通过接口衬套或其他形式的连接方式使力元件、力元件活塞或力元件推杆连接至套管。

在使用之前，套管的第一末端在针头和微量递送装置的主体内。将套管配置成在由力元件部署后从针头的中空第一末端伸出。套管的长度允许当部署时套管的远端从针头的远端端部伸出。将套管配置成从针头的中空第一末端到基因疗法组合物的预期递送位点具有部署的长度。在一个实施方案中，在部署状态中从针头的中空第一末端起的套管长度在2至15mm范围内。极短长度的部署套管可用于引导用于相对于针头刺穿位点以优选取向施用的材料。特别地，从针头的远端端部起的部署长度在6至12mm范围内允许在平坦部将套管引入眼睛，从而避免对视网膜的潜在损伤并且将套管的远端端部放置在后侧视网膜附近以递送用于向眼睛的视觉最重要的部分施用的材料。

将套管的尺寸调节为具有小于或等于针头管腔的内径的直径并且可滑动地安置于针头管腔中。套管具有用于接收基因疗法组合物的第二末端以及用于递送基因疗法组合物的第一末端。在一个实施方案中，将套管的第一末端配置成具有圆形型态以提供在进入组织(例如眼睛的巩膜的外表面和/或内表面)时防止损伤的端部。

可针对所要递送的组合物的体积适当地配置储集器的大小。可将储集器的尺寸调节为用于递送在例如0.1微升至1000微升范围内的体积。可通过活塞或通过揿压作用于活塞以使活塞在储集器中移动并且对用于施用的材料提供递送力的力元件来人工递送本公开的组合物。对于小的施用体积，套管的管腔还可充当用于基因疗法组合物的储集器。对于小的施用体积，套管的管腔还可充当用于基因疗法组合物的储集器，并且可将活塞配置成在套管的管腔远端移动以对用于施用的材料提供递送力。

在一个实施方案中，在针头的第一末端推入组织中(刺入巩膜的外表面)之后立即地或与此同时将部署力激活。可通过由使用者或由在装置的第一末端的机构释放力元件来进行激活。

在一个实施方案中，微量递送装置还包括具有紧固至微量递送装置由此在施加部署力期间密封针头管腔的第一末端的密封件的组织接口。通过用插管装置的第一末端在组织表面上施加压力，远端密封件可由针头的第一末端刺穿，并且刺穿的组织接口变得可在针头上滑动，从而允许将针头推入组织。刺穿密封件打开了用于从针头的第一末端递送套管的路径。在密封件由针头刺穿以及针头的第一末端推入巩膜的外表面之前或与此同时将具有力元件的插管装置激活。所得自驱动部署机构确保当针头被放置于组织上或组织中时无论针头插入(例如刺入)的取向和速度如何均立即打开套管的递送路径。自驱动机构使得能够简单地单手操作插管装置以将套管施用至眼睛的脉络膜上腔空间。

在一个实施方案中，将组织接口和密封件安装于管状外壳上。管状外壳对针头外部来说为适合的并且可在沿其长度的某一点处密封至针头的表面。在一个实施方案中，可借助于弹性元件将外壳密封，所述弹性元件被压缩在外壳与针头之间。因此，弹性元件可为环形的。在一个实施方案中，弹性元件可被压缩在外壳与装置主体之间。弹性元件可位于或靠近外壳的近端。在一个实施方案中，弹性元件充当外壳与针头之间的密封件。在一个实施方案中，弹性元件充当摩擦元件或组件，所述摩擦元件或组件限制外壳沿近端方向行进，从而由此在针头刺穿组织时通过组织接口对组织表面施加力。在一些实施方案中，远端元件包含组织接口和远端密封件，并且在没有远端外壳的情况下可滑动地连接至针头外部。

在通过针头刺穿密封件并且插入眼中将从针头管腔第一末端起的路径打开后，套管不能从针头的第一端延伸或部署，直到针头的远端到达用于接收套管的空间为止。特别地，巩膜组织极具弹性并且在将针头端部传送至脉络膜上腔空间期间有效地密封针头端部，因此巩膜的独特特性不允许套管进入巩膜。在针头的第一末端到达潜在空间(诸如脉络膜上腔空间)后，套管能够从针头推出并且部署至所述空间中。通过此机制，将套管定向至可在针头的第一末端接收套管的位置。在部署套管之后，可通过套管的管腔将本公开的组合物递送至眼睛。

将插管装置的柔性套管设计成具有适当的机械特性，其中适合的挠曲模量允许套管弯曲从而推入脉络膜上腔空间中，并且适合的轴向压缩刚度允许通过在套管的近段上的部署力将套管推入所述空间中。可通过选择套管材料和套管尺寸适当地调节机械特性。此外，套管可具有用于调节机械特性的特征。可将加强元件(诸如金属线)置于套管的管腔或壁中以增加轴向抗弯强度。还可例如用线圈或涂层来增强套管的第一端部以调节抗弯强度与套管远端部分的揉曲性。可从金属或高模量聚合物制作线圈并且置于套管的外表面上、套管的内表面上或套管的壁内。可从诸如以下的聚合物制作套管：聚醚嵌段酰胺(PEBA)、聚酰胺、全氟烷氧基聚合物、氟化乙烯丙烯聚合物、乙烯四氟乙烯共聚物、乙烯三氟氯乙烯共聚物聚苯乙烯、聚四氟乙烯、聚乙二烯、聚乙烯、聚丙烯、聚乙烯-丙烯嵌段共聚物、聚氨基甲酸酯、聚对苯二甲酸乙二酯、聚二甲基硅氧烷、聚氯乙烯、聚醚酰亚胺以及聚酰亚胺。对于一些应用，可从诸如镍钛超级弹性合金(镍钛诺(nitinol))等柔性金属制作套管。

可通过组织接口辅助本公开的组合物的递送。组织接口可任选施加力至眼睛表面以辅助密封巩膜外表面的至少一个通道，从而防止基因疗法组合物回流。使用适当的针头长度和取向，可使用微量递送装置来部署套管并且将本公开的组合物递送至脉络膜上腔空间中。

在本公开的一些实施方案中，针头包含硬材料，其直径允许套管穿过针头的管腔，典型地在20号至40号范围内(例如小于0.91mm外径/0.6mm内径)，其中针头的长度适合于达到眼睛巩膜的外表面。将针头固定至装置的主体或套桶并且通常相对于主体不滑动或移动，从而在刺穿组织期间提供对针头深度的精确控制。

针头的中空第一末端可为斜切或削尖的以辅助刺穿。可将斜切角设计成有助于进入特定靶标。举例来说，可使用18度斜切角的短斜角插管至较窄空间中。可使用15度斜切角的中等斜角针头插管至诸如脉络膜上腔空间等空间中。可使用诸如12度斜切角等较长斜角插管至眼睛的前房或后房中。

可从金属、陶瓷、高模量聚合物或玻璃构建针头。对组织中的针头长度进行选择以匹配插管的靶位置以及归因于解剖学可变性的靶位置变化。针头的有效全长为针头的第一末端到组织接口的表面的长度。在针头推入组织中期间，组织接口在针头上可滑动地移动，从而允许通过组织接口伸出的针头长度逐渐增加并且在推入组织中期间密封。在针头到达适当位置后套管自动部署，所述适当位置可小于针头的有效全长。根据套管的部署长度以及来自力元件的力的量，力的释放以及所得部署时间在约0.1至3秒内快速发生。还可通过所连接的用于推进套管的阻尼或摩擦机构限制套管推进或部署的速度来控制部署时间。从力元件释放的力以可见与可触反馈传送至医师，从而不需要再推进针头。快速部署事件给予医师充足的时间来停止针头推进，从而产生有效可变针头长度以适应不同患者在组织厚度中的差异。可变针头长度和自驱动部署尤其可用于插管至通常不打开的空间(诸如脉络膜上腔空间)中。对于脉络膜上腔空间，根据插入角度，针头有效全长在1mm至4mm范围内。有效完全针头长度可例如为0.3mm至3mm、0.35至2mm、1mm至4mm、10至15mm。

在本公开的一些实施方案中，微量递送装置包括用于向套管提供部署力的构件。在本公开的一些实施方案中，装置包括用于提供递送来自装置内的储集器的基因疗法组合物的力的构件。如本文所描述的构件可为例如可由使用者“挤压”或按压(直接或间接)以实现部署套管或递送用于施用的材料的可压缩储集器或杆。或者，在一个实施方案中，构件为具有偏移构件或力元件(诸如压缩弹簧或加压气体)的机构。

装置可为一次性的和/或用于一次性使用。或者，装置可为可重复使用的。

例如WO 2017/158366(所述专利的内容以引用的方式全文并入本文中)中描述了预期由本公开的方法使用的额外插管装置。

微导管

在本公开的一些实施方案中，微量递送装置包括微导管。本公开的微导管类似于本公开的微套管，然而，微导管可刺入巩膜的外表面并且接触脉络膜上腔空间，然后将内部端部进一步延伸至脉络膜上腔空间中，从而将基因疗法组合物递送至靶位置。

本公开的说明性微导管包括但不限于任选连接至iLumin^TM激光-二极管基微照明系统(iScience Interventional,Menlo Park,CA)的iTrackTM 250A微导管(iScienceInterventional,Menlo Park,CA)(参见例如Peden等(2011)PLoS One 6(2):e17140)。

两步注射

可通过两步程序施用本公开的AAV-RPGR^ORF15组合物。由有适当资格并且有经验的视网膜外科医师进行AAV-RPGR^ORF15组合物的注射。举例来说，为经由脉络膜上腔途径将组合物注射至视网膜下空间中，可首先使视网膜从脉络膜(脉络膜可能极薄并且多处融合)脱离。这涉及以2个步骤进行组合物递送。2步程序的优点为可保守地管理视网膜脱离的任何意外并发症，从而使关于组合物逃脱至玻璃体中的担忧最小化。由于使中央凹脱离所需的流体体积为可变的，所以通过从第一步移除载体，仍可将就基因组粒子来说精确一致的剂量施加至视网膜下空间中。

最初，受试者在相应研究眼中经历玻璃体后脱离。可使用例如注射至视网膜下空间(形成“泡”)的0.1-0.5mL的平衡盐溶液(BSS)使视网膜脱离。可通过相同进入位点将至少一个剂量的AAV-RPGR^ORF15组合物注射至视网膜下流体中。

在程序的第二步中，制备AAV-RPGR^ORF15组合物用于注射。通过相同进入位点将至少一个剂量的AAV-RPGR^ORF15组合物注射至视网膜下空间中并且注射至泡中。递送至视网膜下空间可靶向黄斑的任何区域(包括黄斑的多个区域)，而且包括中央凹(如果可能的话)。在每种情况下，注射载体，使得视网膜下流体覆盖中央区的所有边缘边界，中央区又如通过眼底自体荧光所鉴定经历脉络膜视网膜变性。

在其他实施方案中，使用两步程序如下将AAV-RPGR^ORF15组合物递送至脉络膜上腔空间：首先注射充足量的缓冲液或其他液体以产生“泡”或扩大紧凑的空间，并且在第2步中，将基因疗法组合物注射至通过引入额外液体所形成的泡中或扩大的空间中。

为经由脉络膜上腔途径递送至眼睛的任何部分，可通过例如微针、微套管或微导管来递送AAV-RPGR^ORF15组合物。在一些实施方案中，可通过微导管递送基因疗法组合物。

皮质类固醇

在本公开的方法的一些实施方案中，可在施用AAV-RPGR^ORF15组合物之前、期间和/或之后向受试者施用一定疗程的皮质类固醇(例如经口皮质类固醇)。举例来说，可在施用AAV-RPGR^ORF15组合物的日期之前2天或3天开始21天疗程的皮质类固醇。在一些实施方案中，施用经口皮质类固醇持续约9周(例如以60mg施用21天，随后施用六周的渐减剂量)。在一些实施方案中，皮质类固醇为去炎松(tetriamcinolone)、泼尼松龙(prednisolone)和/或泼尼松(prednisone)。皮质类固醇可减轻由手术和/或载体/转基因引起的炎症。或者或除此皮质类固醇外，还可在手术时间或大致手术时间例如经由深特农氏囊下方法(deep sub-Tenon approach)对受试者施用曲安西龙(triamcinolone)。在一些实施方案中，在手术时间或大致手术时间施用多达约1mL的曲安西龙。在一些实施方案中，施用的曲安西龙的浓度为10mg/mL至200mg/mL、20mg/mL至100mg/mL或约30mg/mL、约40mg/mL或约50mg/mL。在一个实施方案中，在手术时间或大致手术时间向受试者施用浓度为约40mg/mL的多达或约1mL的曲安西龙。

椭圆体带

椭圆体带(EZ)为视网膜中光感受器内段/外段(IS/OS)边界处的结构。在患有色素性视网膜炎的受试者中，当沿眼睛的前-后轴测量时EZ变性并且宽度减小。在患有色素性视网膜炎的受试者中，EZ为视网膜的可用视野的标志，因为它的消失标志着健康视网膜与随色素性视网膜炎进展而患病的视网膜之间的边界。在不希望受理论限制的情况下，患有色素性视网膜炎的受试者中EZ的破坏可因光感受器数目减少、光感受器中纤毛数目减少或它们的组合而出现。RPGR基因的突变解释了70-90％的X连锁形式的RP(XLRP)，其中RPGR的ORF15同种型在光感受器中表达。与光感受器内段的接合点为EZ的光感受器外段含有特化的感觉纤毛。这些感觉纤毛为光感受器功能的关健并且因此为视觉的关健。RPGR^ORF15局部化至光感受器受体纤毛，并且在患有色素性视网膜炎的受试者中观测到的视网膜变性包括纤毛缺陷。此外，光感受器外段处的蛋白质运输中也涉及RPGR，这对光感受器活力来说为重要的。因此，EZ宽度或EZ面积为可用于评估疗法治疗色素性视网膜炎的功效的有价值的客观临床测量。

本公开提供了一种治疗有需要的受试者的色素性视网膜炎的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本公开的AAV-RPGR^ORF15组合物。在一些实施方案中，向受试者施用治疗有效量的AAV-RPGR^ORF15组合物使色素性视网膜炎的迹象或症状得以改善。在一些实施方案中，色素性视网膜炎迹象包括椭圆体带(EZ)变性。在一些实施方案中，EZ变性包括感光细胞密度降低、光感受器纤毛数目减少或它们的组合。在一些实施方案中，可将EZ变性测量为在以眼睛的中央凹为中心的OCT z-stack图的横向视图中沿前-后(A/P)轴的EZ宽度的减小。在一些实施方案中，EZ变性包括眼睛的一个或多个扇区沿背-腹轴和内-外轴的变性。图11B中可见到扇形分区的眼睛的实例。

在本公开的方法的一些实施方案中，受试者具有当与对照EZ相比时可检测的EZ变性。在一些实施方案中，对照EZ包括来自年龄和性别与受试者相匹配的健康个体的EZ，因为EZ的厚度可随健康受试者的年龄和性别而改变。在一些实施方案中，对照EZ包在来自年龄和性别与受试者相匹配的个体的多个EZ的测量的均值。在一些实施方案中，在施用治疗有效量的AAV-RPGR^ORF15组合物之前SD-OCT上的受试者的EZ在任何B型扫描的鼻颞边界内，并且在大多数下方和上方B型扫描上不可见。

在本公开的方法的一些实施方案中，施用治疗有效量的AAV-RPGR^ORF15组合物使具有可检测的EZ变性的受试者的EZ恢复。在一些实施方案中，恢复EZ包括增加光感受器的数目、纤毛的数目或它们的组合。在一些实施方案中，恢复EZ包括在施用AAV-RPGR^ORF15组合物之后使EZ的宽度增加。在一些实施方案中，此宽度增加为增加至正常EZ带的宽度(即达到来自对照受试者的完全健康的EZ)。在一些实施方案中，EZ带的宽度部分恢复。在一些实施方案中，EZ宽度增加包括宽度增加至健康EZ宽度的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在一些实施方案中，恢复EZ包括在施用AAV-RPGR^ORF15组合物之后使EZ的面积增加。在一些实施方案中，此面积增加为增加至正常EZ带的面积(即达到来自对照受试者的完全健康的EZ)。在一些实施方案中，EZ带的面积部分恢复。在一些实施方案中，EZ面积增加包括面积增加至健康EZ面积的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。

在本公开的方法的一些实施方案中，施用治疗有效量的AAV-RPGR^ORF15组合物诱导光感受器外段的再生。在不希望受理论限制的情况下，光感受器外段的再生可与纤毛运输的基因恢复有关。在一些实施方案中，在施用治疗有效量的AAV-RPGR^ORF15组合物之后OCT上在先前变性黄斑的区域上再出现EZ可与光感受器外段的再生有关。在一些实施方案中，施用治疗有效量的AAV-RPGR^ORF15组合物诱导如通过OCT目视观察的视网膜变厚和/或ONL变厚。

可通过将施用本公开的AAV-RPGR^ORF15组合物之前的EZ宽度(‘基线’测量)与施用AAV-RPGR^ORF15组合物之后的EZ宽度相比较来测量宽度增加。在一些实施方案中，在基线处以及施用AAV-RPGR^ORF15组合物之后至少1周、1个月、2个月、3个月、4个月、6个月、9个月或12个月中的一个时间测量EZ的宽度。在一些实施方案中，在基线处以及施用AAV-RPGR^ORF15组合物之后1个月时测量EZ宽度。在一些实施方案中，在基线处以及施用AAV-RPGR^ORF15组合物之后3个月时测量EZ宽度。在一些实施方案中，在基线处以及施用本公开的AAV-RPGR^ORF15组合物之后1个月、3个月以及4个月时测量EZ宽度。

在一些实施方案中，恢复EZ包括当将施用AAV-RPGR^ORF15组合物之后的EZ宽度与基线处的EZ相比时使EZ宽度有所增加。在一些实施方案中，使EZ宽度增加包括沿A/P轴的宽度增加1至20μm，端点包括在内。在一些实施方案中，使EZ宽度增加包括沿A/P轴的宽度增加3-15μm，端点包括在内。在一些实施方案中，使EZ宽度增加包括沿A/P轴的宽度增加至少1μm。

在一些实施方案中，恢复EZ包括当将施用AAV-RPGR^ORF15组合物之后的EZ宽度与基线处的EZ宽度相比时使EZ宽度有所增加。在一些实施方案中，在眼睛的超过一个扇区上沿A/P轴的EZ宽度增加为均匀的。在一些实施方案中，在眼睛的超过一个扇区上沿A/P轴的EZ宽度增加为不均匀的。

在一些实施方案中，恢复EZ包括当将施用AAV-RPGR^ORF15组合物之后的EZ面积与基线处的EZ相比时使EZ面积有所增加。在一些实施方案中，使EZ面积增加包括面积增加0.8至324μm²，端点包括在内。在一些实施方案中，使EZ面积增加包括面积增加7-180μm²，端点包括在内。在一些实施方案中，使EZ面积增加包括增加至少0.8μm²。

在一些实施方案中，恢复EZ包括当将施用AAV-RPGR^ORF15组合物之后的EZ面积与基线处的EZ面积相比时使EZ面积有所增加。在一些实施方案中，在眼睛的超过一个扇区上，EZ面积的增加为均匀的。在一些实施方案中，在眼睛的超过一个扇区上，EZ面积的增加为不均匀的。

在一些实施方案中，当将施用组合物之后的EZ与基线处的EZ相比时，施用治疗有效量的AAV-RPGR^ORF15组合物抑制EZ进一步变性。在施用治疗有效量的AAV-RPGR^ORF15组合物抑制EZ进一步变性的那些实施方案中，当将基线处与施用AAV-RPGR^ORF15组合物之后的测量相比较时EZ宽度没有变化。

在一些实施方案中，EZ厚度的变化与视网膜敏感度的变化有关。举例来说，患有色素性视网膜炎的受试者中EZ宽度的增加与视网膜敏感度增加正相关。

光学相干断层扫描

在本公开的方法的一些实施方案中，使用光学相干断层扫描(OCT)使EZ、视网膜厚度和/或ONL厚度成像。OCT为使用相干光来捕获眼睛的微米分辨率二维和三维图像的成像技术。在一些实施方案中，OCT成像捕获包含以中央凹为中心的眼睛区域的图像的z-stack图。图像的x-y平面沿眼睛的背-腹轴和内-外轴。然后将图像的z-stack图输入处理软件(例如Heidelberg Eye Explorer，1.9.10.0版；Heidelberg Engineering)以产生3维和横向视图。在一些实施方案中，在视网膜的横向视图中人工描绘EZ的边界。在一些实施方案中，测量横向视图中EZ的最大宽度。在一些实施方案中，人工测量横向视图中EZ的最大宽度。在一些实施方案中，从一系列B型扫描(数目取决于取得了多少)测量EZ面积，然后计算面积。在一些实施方案中，通过正面法测量EZ面积。

在一些实施方案中，可在施用AAV-RPGR^ORF15组合物之前(在“基线”处)以及施用AAV-RPGR^ORF15组合物之后约3个月、约6个月、约12个月、约18个月和/或约24个月时进行OCT(例如谱域OCT或SD-OCT)。可将施用之后的测量与基线测量相比较，以观察在施用AAV-RPGR^ORF15组合物之后经由OCT成像的EZ测量、视网膜厚度和/或ONL厚度是否改善。

视野检查

微视野检查与眼底图像、视网膜敏感度作图以及固定分析组合。通过扫描激光器检眼镜检查(SLO)获得视网膜图像，并且眼球跟踪器实时补偿眼球运动。说明性微视野检查系统包括MAIA(CenterVue SpA,Padova,Italy)。说明性自动化静态视野检查系统包括Octopus 900(Haag-Streit Diagnostics,Bern,Switzerland)。

在一些实施方案中，可在施用AAV-RPGR^ORF15组合物之前(在“基线”处)以及施用AAV-RPGR^ORF15组合物之后约3个月、约6个月、约12个月、约18个月和/或约24个月时对微视野检查进行测量。可将施用之后的测量与基线测量相比较，以观察在施用AAV-RPGR^ORF15组合物之后微视野检查是否改善。

视网膜敏感度

视网膜敏感度为受试者可感知的最小亮度级。使用视野检查(例如微视野检查和/或自动化静态视野检查)来测量在视网膜区域上的视网膜敏感度。在一些实施方案中，使用扫描激光器检眼镜(SLO)来形成视网膜的高分辨率图像。然后将点刺激的栅格投射至SLO图像中的视网膜区域上，并且测量患者对栅格的每个点处的每个刺激的反应以确定在所述位置的最小可感知刺激。

在本公开的用于进行微视野检查的组合物和方法的一些实施方案，包括其中使用MAIA装置进行微视野检查的那些实施方案中，栅格包含至少30个点。在一些实施方案中，栅格为37点栅格。在一些实施方案中，栅格为68点栅格。在一些实施方案中，刺激的大小为Goldmann III(直径为0.43°的视觉范围)。在一些实施方案中，背景亮度为4阿熙提(asb)。在一些实施方案中，用作刺激的最大亮度为约1000asb。在一些实施方案中，所分析的眼睛区域包含黄斑的全部或一部分。在一些实施方案中，所分析的眼睛区域为黄斑。在一些实施方案中，所分析的区域为黄斑内的眼睛的10°直径区域。在一些实施方案中，所分析的区域为以中央凹为中心的眼睛的10°直径区域。

在本公开的用于进行视野检查的组合物和方法的一些实施方案，包括其中使用Octopus 900装置进行自动化静态视野检查的那些实施方案中，栅格包含至少30个点。在一些实施方案中，栅格为37点栅格。在一些实施方案中，栅格为68点栅格。在一些实施方案中，刺激的大小为Goldmann III(直径为0.43°的视觉范围)。在一些实施方案中，背景亮度为4阿熙提(asb)。在一些实施方案中，用作刺激的最大亮度为约1000asb。在一些实施方案中，所分析的眼睛区域包含黄斑的全部或一部分。在一些实施方案中，所分析的眼睛区域为黄斑。在一些实施方案中，所分析的区域为黄斑内的眼睛的10°直径区域。在一些实施方案中，所分析的区域为以中央凹为中心的眼睛的10°直径区域。

在本公开的用于进行微视野检查的组合物和方法的一些实施方案，包括其中使用MAIA装置进行微视野检查的那些实施方案中，以阿熙提(asb)来测量刺激亮度。asb为绝对亮度单位，并且每一asb等于0.3183坎德拉(candela)/m²。分贝(dB)量表为基于log 10的量表，用于报告视网膜敏感度评估中所用的刺激的动态范围。在一些实施方案中，将由微视野检查仪器递送的最小和最大刺激强度分别设定为36dB和0dB，并且计算这些值之间的dB度量。在一些实施方案中，对dB报告进行颜色编码，并且黑色表示无反应(暗点)，红色为异常，黄色为疑似，并且绿色为正常。

在本公开的用于进行视野检查的组合物和方法的一些实施方案，包括其中使用Octopus 900装置进行视野检查的那些实施方案中，以阿熙提(asb)来测量刺激亮度。asb为绝对亮度单位，并且每一asb等于0.3183坎德拉/m²。分贝(dB)量表为基于log 10的量表，用于报告视网膜敏感度评估中所用的刺激的动态范围。在一些实施方案中，将由视野检查仪器递送的最小和最大刺激强度分别设定为47dB和0dB，并且计算这些值之间的dB度量。在一些实施方案中，对dB报告进行颜色编码，并且黑色表示无反应(暗点)，红色为异常，黄色为疑似，并且绿色为正常。

为了测量视网膜敏感度，可使用各种刺激投射策略。在一些实施方案中，在每个点处以增加4dB的步骤重复递送每一刺激，直到反应有变化(例如从看不见到看见)。在一些实施方案中，刺激则变为2dB步骤，直到反应有另一变化(即从看见到看不见)。视网膜敏感度的阈值为最小值(dB)，在所述最小值处当以增加的强度将刺激投射至视网膜的单一点上时受试者看见了所述刺激。

在一些实施方案中，平均视网膜敏感度为点刺激栅格中所有点的阈值(dB)的均值。在一些实施方案中，在至少3、4、5、6、7、8或9或16个中心位点中观测到视网膜敏感度改善。在一些实施方案中，在16个中心位点中的至少5个中观测到视网膜敏感度改善。

本公开提供了一种治疗有需要的受试者的色素性视网膜炎的方法，所述方法包括向受试者施用治疗有效量的本公开的AAV-RPGR^ORF15组合物。在一些实施方案中，向受试者施用治疗有效量的AAV-RPGR^ORF15组合物使色素性视网膜炎的迹象或症状得以改善。在一些实施方案中，色素性视网膜炎迹象包括视网膜敏感度损失。在一些实施方案中，使用微视野检查来测量视网膜敏感度。在一些实施方案中，使用微视野检查测量视网膜敏感度包括(a)使受试者的眼睛的眼底成像；(b)将点栅格投射至受试者的眼睛的眼底的图像上；(c)使用光刺激在栅格上的每个点处重复刺激眼睛，其中每次渐进刺激的强度大于前一刺激，并且其中刺激在约4至1000阿熙提(asb)范围内；(d)测定栅格上每个点的最小阈值，其中最小阈值为受试者可首次感知刺激时的光刺激强度；以及(e)将最小阈值从asb转化为dB量表上的分贝(dB)，其中将最大刺激设定为0dB并且将最小刺激设定为量表的最大dB值。在一些实施方案中，最大刺激为约1000asb并且设定为0dB，并且最小刺激为约4asb并且设定为36dB。在一些实施方案中，栅格包含68个点或由其组成。在一些实施方案中，点在直径涵盖10°的眼睛的圆上均匀地隔开。在一些实施方案中，圆以黄斑为中心。在一些实施方案中，圆以中央凹为中心。在一些实施方案中，视网膜敏感度的微视野检查测量还包括对在栅格中的每个点处所测量的最小阈值取均值以产生平均视网膜敏感度。

在一些实施方案中，当与对照受试者中的视网膜敏感度相比时，受试者具有可检测的视网膜敏感度损失。对照受试者为例如年龄和性别与受试者相匹配的未患色素性视网膜炎的健康受试者。

在本公开的方法的一些实施方案中，施用治疗有效量的AAV-RPGR^ORF15组合物使受试者的视网膜敏感度得以恢复。可在施用AAV-RPGR^ORF15组合物之前(在“基线”处)以及施用AAV-RPGR^ORF15组合物之后测量视网膜敏感度，并且将两次测量相比较，以观察在施用AAV-RPGR^ORF15组合物之后视网膜敏感度是否改善。在一些实施方案中，使视网膜敏感度损失恢复包括当将施用AAV-RPGR^ORF15组合物之后的视网膜敏感度与基线视网膜敏感度相比较时平均视网膜敏感度有所增加。在一些实施方案中，平均视网膜敏感度增加包括增加1至30分贝(dB)，端点包括在内。在一些实施方案中，平均视网膜敏感度增加包括增加1至15dB，端点包括在内。在一些实施方案中，平均视网膜敏感度增加包括增加2至10dB，端点包括在内。

在本公开的方法的一些实施方案中，恢复视网膜敏感度包括当将施用AAV-RPGR^ORF15组合物之后的视网膜敏感度与基线处的视网膜敏感度相比较时在栅格的至少一个点处阈值敏感度有所增加。在一些实施方案中，在至少一个点处阈值敏感度增加包括增加1至36分贝(dB)，端点包括在内。在一些实施方案中，在至少一个点处阈值敏感度增加包括增加1至15分贝(dB)，端点包括在内。在一些实施方案中，在至少一个点处阈值敏感度增加包括增加2至10分贝(dB)，端点包括在内。在一些实施方案中，阈值敏感度增加至少1dB包括在1-68个点中增加至少1dB，端点包括在内。在一些实施方案中，阈值敏感度增加至少1dB包括在至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少10个、至少15个、至少20个、至少至少25个、至少30个、至少35个、至少40个、至少45个、至少50个、至少55个、至少60个或至少65个点中增加至少1dB。

在本公开的方法的一些实施方案中，恢复视网膜敏感度包括当将施用本公开的RPGR^ORF15组合物之后的视网膜敏感度与基线处的视网膜敏感度相比较时阈值视网膜敏感度为至少1Db的点的数目有所增加。在一些实施方案中，在施用AAV-RPGR^ORF15之后，阈值敏感度大于1dB的点的数目增加1至68个点，端点包括在内。在一些实施方案中，在施用AAV-RPGR^ORF15之后，阈值敏感度大于1dB的点的数目增加至少1个点。在一些实施方案中，在施用AAV-RPGR^ORF15之后，阈值敏感度大于1dB的点的数目增加至少15个点。在一些实施方案中，在施用AAV-RPGR^ORF15之后，阈值敏感度大于1dB的点的数目增加至少20个点。在一些实施方案中，在施用AAV-RPGR^ORF15之后，阈值敏感度大于1dB的点的数目增加至少25个点。在一些实施方案中，在施用AAV-RPGR^ORF15之后，在中心16个位点中的至少5个位点处观测到增加至少5db。在一些实施方案中，在施用AAV-RPGR^ORF15之后，在中心16个位点中的至少5个位点处观测到增加至少6db。在一些实施方案中，在施用AAV-RPGR^ORF15之后，在中心16个位点中的至少5个位点处观测到增加至少7db。在一些实施方案中，在施用AAV-RPGR^ORF15之后，在中心16个位点中的至少5个位点处观测到增加至少8db。

在本公开的方法的一些实施方案中，当施用AAV-RPGR^ORF15组合物之后的视网膜敏感度与基线处的视网膜敏感度相比较时，施用治疗有效量的AAV-RPGR^ORF15组合物抑制受试者的视网膜敏感度的任何进一步损失。

可通过使用微视野检查比较施用本公开的AAV-RPGR^ORF15组合物之前的视网膜敏感度('基线'测量)与施用AAV-RPGR^ORF15组合物之后的视网膜敏感度来测量视网膜敏感度增加。在一些实施方案中，在基线处并且至少在施用本公开的AAV-RPGR^ORF15组合物之后1周、1个月、2个月、3个月、4个月、6个月、9个月、12个月、18个月、24个月或3年中的一个时间测量视网膜敏感度。在一些实施方案中，在基线处以及施用AAV-RPGR^ORF15组合物之后1个月时测量视网膜敏感度。在一些实施方案中，在基线处以及施用本公开的AAV-RPGR^ORF15组合物之后3个月时测量视网膜敏感度。在一些实施方案中，在基线处以及施用AAV-RPGR^ORF15组合物之后1个月、3个月以及4个月时测量视网膜敏感度。

视野

视野为当眼睛聚焦于中心点时眼睛中可看见目标的整个区域。可通过视网膜敏感度分析来测定视野的范围。在一些实施方案中，视野为如通过视野检查所测量的视网膜区域中测量对至少1dB的刺激的反应的部分。

固视

微视野检查还可测量固视，或试图看着所选目视目标(有时称为优选视网膜位点(PRL))的过程。在正常受试者中，中央凹为视网膜中固视的优选区域。当中央凹受影响时，固视降低并且受试者使用中央凹外区域。可通过跟踪眼球运动来评估固视，例如每秒25次并且在SLO图像上绘制所得分布。总体点云描述了PRL。

固视稳定性

还可使用微视野检查来测量固视稳定性。可以两种方式测量固视稳定性。第一，通过分别计算在固视尝试期间定位在1°或2°距离内的固视点(P1和P2)的百分比来测量固视稳定性。如果超过75％的固视点定位于P1内，那么将固视归类为稳定的。如果小于75％的固视点定位于P1内，但超过75％的固视点定位于P2内，那么将固视归类为相对不稳定的。如果小于75％的固视点定位于P2内，那么固视为不稳定的。第二，计算涵盖在固视尝试期间基于水平和竖直眼位的标准划分的给定比例的固视点云的椭圆的面积(二元轮廓椭圆面积)。

视敏度

视敏度是指视觉锐度，并且通过根据固定标准鉴别在给定距离的字母或数字的能力来测量。在一些实施方案中，视敏度是在固视的同时进行测量，并且为中心或中央凹视敏度的度量。可使用早期治疗糖尿病性视网膜病变研究(ETDRS)图表来测量最佳矫正视敏度(BCVA)。EDTRS图表为每个相等难度的行5个字母的图表，所述图表的行间和行内间隔按对数尺度减小。在一些实施方案中，BCVA测试包括使受试者向下阅读图表(从最大字母到最小字母)，直到达到最少三个字母不能读的一行。在一些实施方案中，BCVA测试包括使受试者阅读所有字母可辨别的最小的一行字母，然后继续向下阅读图表，直到达到最少三个字母不能读的一行。在一些实施方案中，通过测定患者可正确识别行中所有5个字母的最后一行来计算BCVA得分，从ETDRS图表测定该行的对数得分，并且对于超出正确识别所有字母的最后一行的正确识别的每个字母，扣除0.02对数单位。

在一些实施方案中，可在施用AAV-RPGR^ORF15组合物之前(在“基线”处)以及施用AAV-RPGR^ORF15组合物之后约3个月、约6个月、约12个月、约18个月和/或约24个月时测量BCVA。可将施用之后的测量与基线测量相比较，以观察在施用AAV-RPGR^ORF15组合物之后BCVA是否改善。

自体荧光

为评估有活力的视网膜组织区域中的变化，可测量眼底自体荧光。在一些实施方案中，可使用共焦扫描激光器检眼镜记录眼底自体荧光。在一些实施方案中，可在施用AAV-RPGR^ORF15组合物之前(在“基线”处)以及施用AAV-RPGR^ORF15组合物之后约3个月、约6个月、约12个月、约18个月和/或约24个月时测量眼底自体荧光。可将施用之后的测量与基线测量相比较，以观察在施用AAV-RPGR^ORF15组合物之后眼底自体荧光是否改善。

风险因素

本公开提供了一种预防处于发展色素性视网膜炎风险中的受试者的色素性视网膜炎的方法，所述方法包括向受试者施用预防有效量的本公开的AAV-RPGR^ORF15组合物。

在一些实施方案中，受试者具有一种或多种色素性视网膜炎风险因素。在一些实施方案中，所述一种或多种风险因素包括遗传风险因素、色素性视网膜炎家族史或色素性视网膜炎症状。

色素性视网膜炎为一种遗传性基因疾病。在X连锁色素性视网膜炎(XLRP)中，使得色素性视网膜炎发展的基因突变位于X染色体上。据估计在15,000个人中约1人发生XLRP。因为XLRP为X连锁的，祖父患有XLRP的男性有50％的几率遗传与X连锁色素性视网膜炎相关的突变。因此，在一些实施方案中，发展色素性视网膜炎风险因素为色素性视网膜炎家族史。具有色素性视网膜炎家族史的受试者可通过施用预防有效量的本公开的AAV-RPGR^ORF15组合物来预防XLRP发作。

在一些实施方案中，发展色素性视网膜炎的风险因素包括遗传风险因素。发展色素性视网膜炎的示例性遗传风险因素包括但不限于引起XLRP的突变(例如RPGR中的突变)。因此，在本公开的方法的一些实施方案中，在具有已知引起色素性视网膜炎的突变(诸如RPGR中的突变)的受试者中，可通过施用预防有效量的本公开的AAV-RPGR^ORF15组合物来预防色素性视网膜炎的发展。

在一些实施方案中，发展色素性视网膜炎的风险因素包括色素性视网膜炎症状。在一些实施方案中，色素性视网膜炎症状包括夜间视觉损失、周边视觉损失、视敏度损失、颜色视觉损失或它们的组合。轻度色素性视网膜炎症状可在疾病过程中的早期出现并且出现在诊断为色素性视网膜炎之前。因此，在本公开的方法的一些实施方案中，在具有与色素性视网膜炎相关的症状(诸如轻度夜间视觉或周边视觉损失)的受试者中，可预防色素性视网膜炎的发展，可通过施用预防有效量的本公开的AAV-RPGR^ORF15组合物来预防色素性视网膜炎。

近黑暗敏捷迷宫

可通过使受试者通过以低亮或暗条件为特征并且包括供受试者避让的一个或多个障碍的围场来测量本公开的受试者的基线或改善的视敏度。受试者可能需要任选通过本公开的治疗方法提供的本公开组合物。受试者可已在一只或两只眼睛中并且以一个或多个剂量和/或程序/注射接受任选通过本公开的治疗方法提供的本公开组合物。围场可为在室内或户外的。围场的特征为在描述日光的等级至模拟完全黑暗的等级范围内的受控亮度级。在此范围内，可优选将围场的受控亮度级设定为描述天然黄昏或夜晚亮度级，在所述亮度级下本公开的受试者在接受本公开的组合物之前可具有降低的视敏度。在施用本公开的组合物之后，受试者可在所有亮度级下具有改善的视敏度和/或功能视觉，但优选在较低亮度级，包括描述天然黄昏或夜晚亮度级(在室内或户外)的那些亮度级下测量改善。可例如使用诸如Chung等Clin.Exp.Opthalmol.46:247-59(2018)中所描述的多亮度可移动测试(MLMT)来评估功能视觉。

在围场的一些实施方案中，将一个或多个障碍与围场内的一个或多个指定路径和/或路线对齐。受试者成功穿过围场可包括穿过指定路径并且避免穿过非指定路径。受试者成功穿过围场可包括穿过包括指定路径的任何路径，同时避免与安置于路径内或路径附近的一个或多个障碍接触。受试者成功或改善地穿过围场可包括穿过包括指定路径的任何路径，同时避免与安置于路径内或路径附近的一个或多个障碍接触，并且穿过从指定开始位置到指定终点位置的路径所需的时间减少(例如当与具有正常视敏度的健康个体相比时或当与先前由受试者穿过相比时)。在一些实施方案中，围场可包含至少1、2、3、4、5、6、7、8、9或10条路径或指定路径。指定路径可因实验者将指定路径鉴定为含有预期开始位置和预期终点位置而不同于非指定路径。

在围场的一些实施方案中，所述一个或多个障碍未固定至本公开的表面。在一些实施方案中，所述一个或多个障碍固定至本公开的表面。在一些实施方案中，所述一个或多个障碍固定至围场的内表面，包括但不限于围场的地板、墙壁以及顶板。在一些实施方案中，所述一个或多个障碍包括固体物件。在一些实施方案中，所述一个或多个障碍包括液体物件(例如“水障碍”)。在一些实施方案中，所述一个或多个障碍沿至少一条路径或紧靠路径以任何组合或顺序包括：要由受试者绕过的物件；要由受试者跨过的物件；要通过行走或站立进行权衡的物件；具有斜面、斜坡或它们的组合的物件；要触摸(例如以确定受试者看见和/或判断深度感的能力)的物件；以及要通过在下方行走或站立(例如包括在一个或多个方向弯腰以避开物件)横穿的物件。在围场的一些实施方案中，所述一个或多个障碍必须被受试者按指定顺序遇到。

在某些实施方案中，可通过使受试者通过以低亮或暗条件为特征并且包括供受试者避让的一个或多个障碍的路线或围场来测量受试者的基线或改善的视敏度和/或功能视觉，其中所述路线或围场存在于一种设备中。在特定实施方案中，所述设备包括模块照明系统和一系列不同的可移动性路线地板布置。在某些实施方案中，一个房间容纳了所有可移动路线加上一组照明装备。举例来说，可在可移动测试期间的一个时间对单一路线进行设置，并且不论所用的路线(地板布置)如何，均可使用相同的房间/照明装备进行可移动测试。在特定实施方案中，对为测试而提供的不同的可移动性路线进行设计以改变困难程度，其中较困难的路线具有低反差路径并且难以看见障碍，而较容易的路线具有高反差路径并且容易看见障碍。

在围场的一些实施方案中，可在施用本公开的组合物之前对受试者进行测试，以建立例如准确性和/或速度的基线测量，或将受试者诊断为患有视网膜疾病或处于发展视网膜疾病风险中。在一些实施方案中，可在施用本公开的组合物之后对受试者进行测试，以确定相对于基线测量的变化或与健康个体的得分相比较(例如用于监测/测试组合物改善视敏度的功效)。

自适应光学元件和扫描激光器检眼镜检查(AOSLO)

本公开的受试者的基线或改善的视网膜细胞活力测量可通过一种或多种AOSLO技术来测量。可使用扫描激光器检眼镜检查(SLO)来观察受试者眼睛的视网膜的独特层。优选地，将自适应光学元件(AO)合并在SLO中(AOSLO)，以对来自单独SLO的图像中典型地由前眼结构(包括但不限于眼睛的角膜和晶状体)引起的伪影进行校正。单独使用SLO所产生的伪影使所得图像的分辨率降低。自适应光学元件允许分辨视网膜层的单一细胞并且定向检测来自正常或完整视网膜细胞(例如正常或完整感光细胞)的反向散射的光(波导光)。

在本公开的一些实施方案中，使用AOSLO技术，完整细胞产生波导和/或可检测信号。在一些实施方案中，非完整细胞不产生波导和/或可检测信号。

可使用AOSLO来成像，并且优选地，评估受试者中的视网膜或其部分。在一些实施方案中，使用AOSLO技术将受试者的一个或两个视网膜成像。在一些实施方案中，在施用本公开的组合物之前，使用AOSLO技术将受试者的一个或两个视网膜成像(例如用于确定基线测量以在治疗之后进行后续比较和/或用于确定视网膜疾病的存在和/或严重程度)。在一些实施方案中，在施用本公开的组合物之后，使用AOSLO技术将受试者的一个或两个视网膜成像(例如用于确定组合物的功效和/或用于在施用之后针对由治疗引起的改善对受试者进行监测)。

在本公开的一些实施方案中，通过共焦或非共焦(分离检测器)AOSLO将视网膜成像以评估一种或多种视网膜细胞的密度。在一些实施方案中，一种或多种视网膜细胞包括但不限于感光细胞。在一些实施方案中，一种或多种视网膜细胞包括但不限于锥形感光细胞。在一些实施方案中，一种或多种视网膜细胞包括但不限于棒状感光细胞。在一些实施方案中，将密度测量为每毫米的细胞数目。在一些实施方案中，将密度测量为每毫米的活细胞或有活力细胞的数目。在一些实施方案中，将密度测量为每毫米的完整细胞(包含AAV粒子或本公开的转基因序列的细胞)的数目。在一些实施方案中，将密度测量为每毫米的反应性细胞的数目。在一些实施方案中，反应性细胞为功能细胞。

在一些实施方案中，可使用AOSLO来捕获受试者视网膜内的感光细胞的马赛克(mosaic)图像。在一些实施方案中，马赛克包括完整细胞、非完整细胞或它们的组合。在一些实施方案中，马赛克图像包含整个视网膜、内段、外段或其部分的图像。在一些实施方案中，马赛克图像包括含有或接触本公开的组合物的视网膜部分。在一些实施方案中，马赛克图像包括与包含或接触本公开的组合物的视网膜部分并列的视网膜部分。在一些实施方案中，马赛克图像包括已治疗的区域和未治疗的区域，其中已治疗的区域包含或接触本公开的组合物，而未治疗的区域不包含或接触本公开的组合物。

在一些实施方案中，可将AOSLO单独地或与光学相干断层扫描(OCT)组合使用，以直接目视观察受试者的视网膜、视网膜部分或视网膜细胞。在一些实施方案中，可将自适应光学元件与OCT组合使用(AO-OCT)以直接目视观察受试者的视网膜、视网膜部分或视网膜细胞。

在本公开的一些实施方案中，通过共焦或非共焦(分离检测器)AOSLO将外段或内段成像，以评估其中的细胞密度或者外段、内段或它们的组合的完整程度。在一些实施方案中，可使用AOSLO来检测内段、外段或它们的组合的直径。

图57中示出了说明性AOSLO系统。

AOSLO和各种技术的额外描述可描述于至少Georgiou等Br J Opthalmol 2017；0:1-8；Scoles等Invest Opthalmol Vis Sci.2014；55:4244-4251；以及Tanna等InvestOpthalmol Vis Sci.2017；58:3608-3615中。

药物制剂

本公开的组合物可包含原料药。在一些实施方案中，原料药包含AAV-RPGR^ORF15或由其组成。在一些实施方案中，原料药包含AAV-RPGR^ORF15和配制缓冲液或由其组成。在一些实施方案中，配制缓冲液包含20mM Tris、1mM MgCl₂以及200mM NaCl，pH 8。在一些实施方案中，配制缓冲液包含20mM Tris、1mM MgCl₂以及200mM NaCl，pH 8加上0.001％的泊洛沙姆188。

赋形剂

本公开的组合物可包含AAV-RPGRO^RF15药物产品。在一些实施方案中，药物产品包含原料药和配制缓冲液或由其组成。在一些实施方案中，药物产品包含在配制缓冲液中稀释的原料药或由其组成。在一些实施方案中，药物产品包含在配制缓冲液中稀释至最终药物产品AAV-RPGR^ORF15载体基因组(vg)浓度的AAV2-RPGR^ORF15原料药或由其组成。

眼部制剂

可将本公开的组合物配制成包含用于眼部注射或输注的最佳浓度的AAV-RPGR^ORF15原料药、大体上由其组成或由其组成。

本公开的组合物可包含增加或增强本公开的AAV的稳定性的一种或多种缓冲剂。在一些实施方案中，本公开的组合物可包含确保或增强本公开的AAV的稳定性的一种或多种缓冲剂。或者或此外，本公开的组合物可包含防止、减少AAV粒子聚集或使其减至最少的一种或多种缓冲剂。在一些实施方案中，本公开的组合物可包含防止、减少AAV粒子聚集或使其减至最少的一种或多种缓冲剂。

本公开的组合物可包含诱导或维持中性或略碱性pH值的一种或多种组分。在一些实施方案中，本公开的组合物包含诱导或维持中性或7与9之间(端点包括在内)的略碱性pH值的一种或多种组分。在一些实施方案中，本公开的组合物包含诱导或维持约8的pH值的一种或多种组分。在一些实施方案中，本公开的组合物包含诱导或维持7.5与8.5之间的pH值的一种或多种组分。在一些实施方案中，本公开的组合物包含诱导或维持7.7与8.3之间的pH值的一种或多种组分。在一些实施方案中，本公开的组合物包含诱导或维持7.9与8.1之间的pH值的一种或多种组分。在一些实施方案中，本公开的组合物包含诱导或维持pH 8的一种或多种组分。

在本公开的组合物与细胞接触之后，AAV-RPGR^ORF15表达一种基因或其部分，从而使得产生由所述基因或其部分编码的产物。在一些实施方案中，细胞为靶细胞。在一些实施方案中，靶细胞为视网膜细胞。在一些实施方案中，视网膜细胞为神经元。在一些实施方案中，神经元为光感受器。在一些实施方案中，细胞为体内、体外、离体或原位细胞。在一些实施方案，包括其中细胞为体内细胞的那些实施方案中，在向受试者施用组合物之后发生接触。在一些实施方案中，AAV-RPGR^ORF15表达RPGR^ORF15或其部分，使得以治疗有效的RPGR^ORF15蛋白质表达水平产生由所述基因或其部分编码的产物。

物理滴定度：使用qPCR测定基因组滴定度。此方法允许定量基因组拷贝数。将载体储备物的样品在缓冲液中稀释。将样品用DNA酶处理并且将病毒衣壳用蛋白酶K溶解以释放基因组DNA。然后制备稀释系列。使用对CAG序列具特异性的Taqman基引物/探针组对每个样品的重复进行qPCR。通过对标准质粒稀释系列的线性范围内的每个点取均值并且针对每个点的平均C_T值对拷贝数的对数作图来产生标准曲线。在一些实施方案中，标准曲线中所用的质粒DNA呈超螺旋构象。在一些实施方案中，标准曲线中所用的质粒DNA呈线性构象。可例如通过用HindIII限制酶消化来制备线性化质粒，通过琼脂糖凝胶电泳目视观察，并且遵循制造商的说明书使用QIAquick凝胶提取试剂盒(Qiagen)进行纯化。在用于产生标准曲线的质粒内进行切割的其他限制酶也可能为适当的。在一些实施方案中，与使用线性化质粒相比，使用超螺旋质粒作为标准物使AAV载体的滴定度增加。可由标准曲线计算rAAV载体的滴定度并且表示为DNA酶抗性粒子(DRP)/mL。

微滴式数字PCR(ddPCR)：ddPCR可用作qPCR的替代方案或除qPCR外也用于测量基因组滴定度。ddPCR在标准PCR反应中使用Taq聚合酶使用预验证的引物或引物/探针分析从复合样品扩增靶DNA片段。将PCR反应分区为数千个个别反应容器，然后扩增，并且在反应终点获得数据。ddPCR在没有标准曲线的情况下提供直接并且独立的DNA定量，并且可给出精确并且可重现的数据。终点测量使核酸定量能够独立于反应效率。可将ddPCR用于可变污染样品的极低靶标定量。

满:空比(分析超速离心)：可使用分析超速离心(AUC)测定AAV8粒子的满:空比。AUC相较于其他方法具有非破坏性的优势，意味着在AUC之后样品可回收用于额外的测试。将包含空和满AAV8粒子的样品施加于液体组合物，在超离心期间AAV8移动穿过所述液体组合物。一个或多个AAV8粒子的沉降速度的测量提供关于AAV粒子的尺寸和形状的水动力信息。沉降平衡的测量提供关于溶液摩尔质量、化学计量、缔合常数以及AAV8粒子的溶液非理想性的热力学信息。AUC期间获得的说明性测量为半径浓度分布，或“扫描”。在一些实施方案中，以数分钟(对于速度沉降)至数小时(对于平衡沉降)范围内的间隔获得扫描。本公开的方法的扫描可含有光学测量(例如吸光度、干扰和/或荧光)。超离心速度可在10,000转/每分钟(rpm)至75,000rpm范围内，端点包括在内。由于满AAV8粒子和空AAV8粒子通过AUC展示独特的测量，所以可使用此方法来测定样品的满/空比。

载体身份(DNA)：此分析提供对病毒DNA序列的确认。通过消化病毒衣壳并且纯化病毒DNA来进行分析。对DNA进行测序，在可能的情况下(一些区域，例如ITR对测序来说是有问题的)使用正向与反向最少2倍覆盖度。将DNA测序重叠群与预期序列相比较以确认身份。

复制胜任型AAV：在存在或不存在野生型腺病毒的情况下，使用测试物品来转导HEK293细胞。将进行连续三轮细胞扩增并且在每个扩增步骤提取总基因组DNA。

通过实时定量PCR检测rcAAV8。两个序列为分离的基因组DNA；一个对AAV2 Rep基因具特异性，并且另一个对HEK293细胞的内源性基因(人白蛋白)具特异性。测定每个细胞的Rep基因相对拷贝数。阳性对照为单独或在存在rAAV载体制备的情况下测试的野生型AAV病毒血清型8。

在每个所测试的批次中，分析的检测限受到挑战。检测限为每1x10^8或1x10^10个基因组拷贝的测试样品10个rcAAV。如果对于Rep序列测试样品为阴性，那么此样品的结果将报告为：没有复制，1x10^8(或1x10^10)个基因组拷贝的测试样品＜10个rcAAV。如果对于Rep序列测试样品为阳性，那么此样品的结果将报告为：复制。

总DNA：Picogreen试剂为一种超敏性荧光核酸染色剂，所述超敏性荧光核酸染色剂结合双链DNA并且形成高度发光复合物(λ激发＝480nm-λ发射＝520nm)。此荧光发射强度与溶液中的dsDNA量成比例。使用具有已知浓度的DNA标准曲线，通过转化所测量的荧光获得测试样品中的DNA含量。

AAV组合物的稳定性

本公开的组合物当储存在＜-60℃下时维持长期稳定性。举例来说，本公开的组合物当储存在-80℃至40℃(约人体温度)(端点包括在内)的温度下时维持长期稳定性。举例来说，本公开的组合物当储存在-80℃至5℃(端点包括在内)的温度下时维持长期稳定性。举例来说，本公开的组合物当储存在-80℃、-20℃或5℃下时维持长期稳定性。在一些实施方案中，将本公开的组合物配制成液体或悬浮液，等分至一个或多个容器(例如小瓶)中，并且储存在＜-60℃下。在一些实施方案中，将本公开的组合物配制成液体或悬浮液，等分至一个或多个容器(例如小瓶)中，并且储存在-80℃、-20℃或5℃下。

可将本公开的组合物提供于对于当储存在＜-60℃下时维持长期稳定性来说具有最佳表面积与体积比的容器中。可将本公开的组合物提供于对于当储存在-80℃、-20℃或5℃下时维持长期稳定性来说具有最佳表面积与体积比的容器中。在一些实施方案中，将本公开的组合物配制成液体或悬浮液，等分至一个或多个容器(例如小瓶)中，并且储存于一个或多个具有当考虑所有储存要求时尽可能大的表面积与体积比的容器中。

本公开的组合物当储存在周围相对湿度下时维持长期稳定性。

实施例

实施例1：用于人受试者中的色素性视网膜炎的基因疗法

为以基因方式确诊色素性视网膜炎(RP)的18岁和更年长的男性受试者视网膜下注射单个剂量的AAV RPGR^ORF15基因疗法载体。研究涉及6个剂量队列，其中AAV8-RPGR剂量为5×10⁹gp(队列1)、1×10¹⁰gp(队列2)、5×10¹⁰gp(队列3)和1x10¹¹gp(队列4)、2.5x10¹¹gp(队列5)以及5x10¹¹gp(队列6)。随后对受试者跟踪12个月并且经由微视野检查评估最佳矫正视敏度(BCVA)、视网膜敏感度以及固视情况，并且经由光学相干断层扫描(OCT)评估视网膜厚度。实施例3中提供了用于受试者处理和分析的方法。

基因疗法手术

经由两步视网膜下注射将AAV8.RK.coRPGR载体递送至黄斑下空间中。简单来说，使用爱尔康星座视觉系统(Alcon Constellation Vision System)(Alcon Inc,FortWorth,USA)进行标准23号三孔平坦部玻璃体切除术。诱导玻璃体后脱离，随后进行核心和外周玻璃体切除术。首先通过使用连接至玻璃体注射设备的41G视网膜下套管(DutchOphthalmic Research Center BV,Zuidland,Netherlands)视网膜下注射平衡盐溶液来形成小视网膜下流体泡。然后通过经相同进入位点再视网膜下注射0.1ml的适当浓度的病毒载体将泡扩大，从而引起黄斑的医原性脱离。所有巩膜造口术使用可吸收的polyglactin缝合线缝紧并且使玻璃体腔在程序结束时充以流体。作为标准方案的一部分，从基因疗法之前2天开始，受试者接受21天疗程的经口泼尼松/泼尼松龙：以1mg/kg/天持续10天，随后0.5mg/kg持续7天，0.25mg/kg持续3天，并且0.125mg/kg持续3天。

视觉功能测试

在每次预定访视时使用早期治疗糖尿病性视网膜病变研究(ETDRS)图表测量最佳矫正视敏度(BCVA)(图1)。

使用涵盖中心10度的黄斑的标准68刺激(10-2)栅格通过中间微视野检查(MAIA，CenterVue SpA,Padova,Italy)测量视网膜敏感度。图4至9中公开了原始微视野检查数据。在每组图中，从上部左侧顺时针示出了：扫描激光器检眼镜检查(SLO)眼底图像；敏感度值图(36dB量表，从紫色＝0到绿色＝36进行颜色编码)以及放大的SLO图像上的优选视网膜位置(PRL)；在从36(左)到0(右)的标尺上示出平均阈值(dB)的长条；阈值的柱状图，检验以灰色显示并且正态分布以绿色显示；示出稳定(绿色)、相对不稳定(黄色)以及不稳定(红色)的固视稳定性并且公开P1和P2中的固视点百分比的长条；以相较于时间(分钟)(x轴)的距离(度)(y轴)的形式示出眼球运动幅度的固视图形；对应于上方固视图中的点云的所计算的二元轮廓椭圆面积；示出PRL区域、P1以及P2的放大的SLO图像上的固视图；完整SLO图像上的内插敏感度图，覆盖敏感度为0dB(紫色)至36dB(绿色)的热图。

结果

在队列3和4患者的处理的眼睛中在平均视网膜敏感度、敏感度柱状图以及视野(参见热图)中观察到显著增加。在3个月时在AH85(队列3)的处理的眼睛中观察到视网膜厚度增加11μm(图10)。在所有所处理的眼睛中视敏度回到基线或最低限度地改善。没有有害事件，除了1例在高度近视者中的手术后持久性视网膜下流体(JH90)，在空气填充之后此情况消除(在图10中指示)。在用AAV-RPGR^ORF15处理之后，在3M下，一个受试者在中心1mm EDTRS圆中显示平均视网膜厚度增加11mm(图10)。

实施例2：在用于色素性视网膜炎的基因疗法之后受试者中的视野损失逆转

色素性视网膜炎(RP)为一种影响视网膜中的光感受器的神经退行性病症。它引起渐进性视野收缩以及最终失明。色素性视网膜炎GTP酶调控因子(RPGR)基因中的功能丧失性突变解释了所有RP中的15-20％。虽然RPGR在腺相关病毒(AAV)载体的编码能力范围内，但在3'端的高度重复富嘌呤区以及紧接在其上游的剪接位点已在克隆AAV.RPGR载体中形成显著挑战，若干团体在临床前测试期间报道了遗漏剪接或截短的变体。可使用密码子优化使内源性剪接位点失能并且在不改变氨基酸序列的情况下稳定光感受器特异性RPGR转录物中的富嘌呤序列。RPGR蛋白的谷氨酰化(主要翻译后修饰)在密码子优化之后也保留，并且更重要地，在人RPGR疾病的两个小鼠模型中，当使用AAV8载体递送时观察到功能效应。

AAV载体用于RPGR基因疗法的验证

RPGR的视网膜剪接同种型RPGR^ORF15含有高度重复富嘌呤外显子(或开放阅读框)15，所述高度重复富嘌呤外显子15在病毒载体克隆期间易于突变以及发生错误。为形成用于人基因疗法的稳定载体，AAV血清型8载体构建体含有由人光感受器特异性视紫红蛋白激酶启动子(RK)驱动的密码子优化型式的人RPGR^ORF15(coRPGR)。在Rpgr-/-小鼠中对载体进行测试，并且显示产生具有与野生型RPGR^ORF15相同的谷氨酰化模式的全长RPGR蛋白，并且如通过视网膜电描记(ERG)幅度所测量拯救视网膜功能达6个月。在Rpgr-/-小鼠中通过视网膜下注射验证临床级AAV8.RK.coRPGR载体。免疫染色显示人RPGR与其已知相互作用配偶体RPGR相互作用蛋白1(RPGRIP1)共定位于光感受器连接纤毛的区域中。

基因疗法手术

经由两步视网膜下注射将AAV8.RK.coRPGR载体递送至黄斑下空间中。简单来说，使用爱尔康星座视觉系统(Alcon Inc,Fort Worth,USA)进行标准23号三孔平坦部玻璃体切除术。诱导玻璃体后脱离，随后进行核心和外周玻璃体切除术。首先通过使用连接至玻璃体注射设备的41G视网膜下套管(Dutch Ophthalmic Research Center BV,Zuidland,Netherlands)视网膜下注射平衡盐溶液来形成小视网膜下流体泡。然后通过经相同进入位点再视网膜下注射0.1ml的适当浓度的病毒载体将泡扩大，从而引起黄斑的医原性脱离。所有巩膜造口术使用可吸收的polyglactin缝合线缝紧并且使玻璃体腔在程序结束时充以流体。作为标准方案的一部分，从基因疗法之前2天开始，患者接受21天疗程的经口泼尼松/泼尼松龙：以1mg/kg/天持续10天，随后0.5mg/kg持续7天，0.25mg/kg持续3天，并且0.125mg/kg持续3天。

视觉功能测试

在每次预定访视时使用早期治疗糖尿病性视网膜病变研究(ETDRS)图表测量最佳矫正视敏度(BCVA)。使用涵盖中心10度的黄斑的标准68刺激(10-2)栅格通过中间微视野检查(MAIA，CenterVue SpA,Padova,Italy)测量视网膜敏感度。为使学习效应最小化，在基线处在每只眼睛中历时两天进行三次微视野检查测试，并且取第三次尝试的结果进行数据分析。

结果

先前的自然史研究表明RPGR相关色素性视网膜炎中的视网膜变性的特征为在OCT上以外核层(ONL)变薄形式被观察到的光感受器外段缩短，最终导致椭圆体带(EZ)和视野的损失。

视网膜下注射AAV RPGR^ORF15使因RPGR相关RP而经历视网膜基因疗法的患者中的视网膜变性逆转(Clinicaltrials.gov:NCT03116113)。此观测的新颖性对其他临床研究有一定的启示。虽然预期在视网膜基因疗法之后视野长期维持，但在接受1x10¹¹gp的AAV8.RPGR的24岁患者中观测到历时三个月的时间的意外视野损失逆转。在2周时，患者描述了在所处理的眼睛中视觉清晰度和视野的主观改善。功能评估显示视敏度相较于基线未改变，然而在所处理的眼睛中历时4个月视网膜敏感度逐渐从0.7改善至7.5dB(图11)。黄斑OCT的完整节段揭示外核层变厚，位置对应于敏感度增加的区域并且量值(约20μm)与光感受器外段的长度相符合。在接受最低剂量(0.5x10¹⁰gp)的患者的所处理的眼睛中未观察到此变厚，所述患者没有观测到任何视觉功能改善。

到目前为止，通常在干细胞治疗的领域中想到改善RP中的视觉的理念，然而，这些早期观测使基因疗法不仅能减慢变性速率，而且能通过拯救‘休眠’(功能失调)光感受器逆转一些功能和解剖学缺陷的可能性增加。

表1示出了在高剂量基因疗法之后观测到视网膜敏感度增加的患者以及接受最低剂量的对照参与者的人员统计以及被证实的病原性RPGR突变。

表1.试验参与者为患有临床证实的X连锁色素性视网膜炎并且具有以基因方式证实的RPGR内突变的高加索男性。

患者经历对一只眼睛给予高剂量(1.0x10¹¹gp)的没有事故的RPGR基因疗法，并且到手术后第1天，视网膜下流体消除。实施例3中提供了用于受试者处理和分析的方法。处理之后两周，患者描述了所处理的眼睛中的视觉清晰度和视野的主观改善，此通过在第1个月跟踪时的视网膜敏感度的微视野检查测试得到印证(图11，并且原始数据在图12中)。在5周时，患者注意到所处理的眼睛中的部分视觉退化以及主观的旁中心暗点。微视野检查测试证实在所处理的眼睛中视网膜敏感度降低(平均阈值敏感度＝0.0dB)。

实施例3：用于色素性视网膜炎的基因疗法的临床试验

1.0：研究计划

1.1：总研究设计

在患有X连锁色素性视网膜炎(XLRP)的受试者中对单一视网膜下注射编码色素性视网膜炎GTP酶调控因子(AAV8-RPGR)的腺相关病毒载体的安全性、耐受性以及功效进行评估。在患有以基因方式证实的XLRP的男性受试者中进行AAV8-RPGR的1期/2期首次人体多中心剂量递增干预性研究。以两个部分进行研究：第I部分为剂量递增研究，第II部分为最大耐受剂量(MTD)扩展研究(如第I部分中所测定)。

研究由历经24个月评估期的11次访视组成。在筛选/基线访视时，针对两眼的合格性对每个受试者进行评估。仅一只眼睛接受处理(“研究眼”)，并且将未处理的眼睛指定为“对侧眼”。在临床基础上选择“研究眼”并且通常为受影响的更糟的眼睛。对此详细论述并且作为知情同意过程的一部分与每个受试者达成一致。

在注射日访视(访视2，第0天)时，受试者经历玻璃体切除术和医原性视网膜脱离作为用于在其研究眼中施用AAV8-RPGR的视网膜下注射程序的一部分。为使由手术和/或载体/转基因引起的炎症程度最轻，从计划手术日之前2天开始给予所有受试者21天疗程的经口皮质类固醇(例如泼尼松龙/泼尼松)(细节参见章节3.8)。

如研究程序时间表(参见表2)中所指示在整个研究中针对安全性和功效对受试者进行评估。安全性评价是基于有害事件(AE)报告(包括剂量限制毒性(DLT))的发生；全面眼科检查(包括直接检眼镜检查、裂隙灯检查、眼内压[IOP]、前房和玻璃体炎症评级和晶状体不透明度分类系统III[LOCS III]白内障评级)；眼底照相术；生命体征；以及实验室评估(包括实验室安全参数、病毒脱落以及免疫原性)。功效评估是基于BCVA、SD-OCT、眼底自体荧光、微视野检查、视野、对比敏感度、低亮度视敏度(LLVA)、全视野刺激阈值测试(FST)、颜色视觉以及阅读测试。还在适用时将作为功效评估(例如BCVA)的结果所收集的任何安全性信息用于总安全性评估。

如果认为临床上有必要，那么发展白内障的受试者可经历白内障手术；如果进行手术，那么它应在访视9(第1年)或访视11(第2年)之前至少4周时进行。

表2.研究程序时间表

表2.研究程序时间表(续)

缩写：AE＝有害事件；BCVA＝最佳矫正视敏度；ET＝提前终止；ETDRS＝早期治疗糖尿病性视网膜病变研究；IOP＝眼内压；LOCS III＝晶状体不透明度分类系统III；FST＝全视野刺激阈值测试；LLVA＝低亮度视敏度；SAE＝严重有害事件；SD-OCT＝谱域光学相干断层扫描

除非另外指明，否则所有程序将对两只眼睛进行。

a筛选/基线访视必须在访视2的8周(±2周)内进行。

b如果受试者在任何时间停止，那么应进行提前终止(ET)访视。

c如果临床上有指示，那么受试者可能需要回到研究地点进行未预定访视。至少将进行以下评估：全面眼科检查、BCVA、SD-OCT、眼底自体荧光、AE/SAE监测以及伴随药物考察。

d包括血液学和临床化学。

e仅在访视1时不可获得时才应进行。

f包括间接检眼镜检查、裂隙灯检查、IOP、前房和玻璃体炎症评级以及LOCS III白内障评级。

g仅研究眼。

h将给予受试者21天疗程的经口泼尼松/泼尼松龙并且指示在访视2之前2天开始摄入药物。受试者将每天每千克摄入1mg的泼尼松/泼尼松龙持续总共10天(从载体注射之前2天开始，在注射当天进行，然后持续7天)；随后0.5mg/kg/天持续7天；0.25mg/kg/天持续2天；并且0.125mg/kg/天持续2天(总计21天)。

i对于对比敏感度，将使用佩里罗布森图表(Pelli Robson chart)。

j将收集血液、眼泪(两只眼睛)、唾液以及尿液样品进行病毒脱落分析。

k仅在第1年访视之前进行访视时才应进行ET访视时的免疫原性取样。

l将从受试者提供书面知情同意/认可的时间到访视11(或如果适用则为ET访视)收集SAE。将从访视2到访视11(或如果适用则为ET访视)收集非严重AE

m应一式三份地进行

n仅第II部分

如果受试者完成了第2年评估，那么将他视为已完成研究。试验结束为最后一个受试者完成他的第2年评估(或倘若过早终止，则为提前终止[ET]评估)的日期，或者如果最后一个受试者失去跟踪，那么为最后一次数据收集的日期。

1.2：剂量限制毒性

DLT定义为被认为与AAV8-RPGR有关的以下事件中的任一者：

·与基线相比早期治疗糖尿病性视网膜病变研究(ETDRS)图表上的BCVA持续降低≥30个字母；持续定义为持续48小时或更久直到恢复，恢复定义为视敏度(VA)回到基线VA的10个字母以内。对与手术在时间上紧密关联(<24小时内)发生的手术相关事件破例。

·玻璃体炎症、玻璃体炎(使用标准化的努森布莱特玻璃体炎症量表(Nussenblatt vitreous inflammation scale)评级为>3级)(Nussenblatt等,Ophthalmology.1985；92(4):467-471)。

·所观测到的不直接归因于手术并发症的任何临床上显著的视网膜损伤(例如视网膜萎缩)。

·任何临床上相关的疑似意外严重有害反应，除了视觉损失或危及视觉的事件(如章节6.2.1.2中所定义)

当在筛选时进行三次重复的BCVA评估时，使用中值BCVA结果进行相较于基线BCVA的变化的计算。

1.3：第I部分：剂量递增研究

研究使用3+3递增方案(Storer,Biometrics.1989；45(3):925-937)进行AAV8-RPGR的施用；图21中展示了递增方案的示意图。

研究涉及多达6个剂量队列，其中AAV8-RPGR剂量为5×10⁹gp(队列1)、1×10¹⁰gp(队列2)、5×10¹⁰gp(队列3)和1x10¹¹gp(队列4)、2.5x10¹¹gp(队列5)以及5x10¹¹gp(队列6)。每个合格的受试者在其研究眼中接受AAV8-RPGR并且监测DLT。

使用独立数据监测委员会(DMC)来考察安全性数据，然后确认递增至更高剂量水平是否能进行。有可能发生导致满足针对DLT的准则的安全性事件的手术并发症。在此类情况下，DMC将作出事件是否为DLT的最终判决。

DMC考察了当至少3个受试者已按特定水平给药时每个队列的安全性数据。然而，如果队列内2个受试者具有一种或多种DLT，那么将不对后续受试者进行给药，直到由DMC考察了安全性数据为止。

出于作出关于剂量递增的决定的目的，DMC考察了从最后给药的队列中的每个受试者收集至少4周的安全性数据。此外，DMC考察了从所有先前给药的队列收集的累积安全性数据并且当关于剂量递增作决定时将这些发现考虑在内。

在队列1中给药的每个受试者之间有最少4周。除非由DMC另外指明，否则对队列2起给药的受试者之间的间隔没有限制。

每个剂量队列计划三到6个受试者；然而，招募至每个队列中的实际受试者数目取决于所观测的毒性。如果在队列内所处理的头3个受试者中未观测到DLT，那么可继续递增至下一剂量队列。如果在3受试者队列内报告了一次DLT，那么将以相同剂量对另外3个受试者进行处理。如果在另外3个受试者中不再报告DLT，那么可继续递增至下一剂量队列。如果队列内≥2个受试者(3或6个受试者)具有DLT，那么最大耐受剂量(MTD)将被确定为前一(较低)剂量。如果在队列1内报告≥2个受试者(3或6个受试者)具有DLT，那么在此方案下给药将停止并且可在方案修正之后进行进一步的研究。

1.4：第II部分：最大耐受剂量扩展研究

在鉴定MTD后，将多达45个额外受试者以2:1分配比率随机化。受试者接受MTD(MTD队列)或低剂量(活性对照队列)的AAV8-RPGR，所述低剂量为MTD以下的三个剂量水平(例如如果MTD＝5x10¹¹gp，那么低剂量＝5x10¹⁰gp)。研究的第II部分为随机化的并且对分配的剂量为双盲的，并且对治疗施用来说为开放标签的。

1.5：受试者的数目

总的说来，研究预期招募约63个受试者：第I部分中18个并且第II部分中45个。

1.6：研究设计和剂量选择的论述

在此研究的设计中使用由欧洲药品管理局(European Medicines Agency，EMA)以及食品和药物管理局(Food and Drug Administration，FDA)出版的关于缓解首次人体研究中的风险以及将基因疗法用于临床试验中的指南(ICH-E4,Guideline forIndustry.Dose-Response Information to Support Drug Registration.1994年11月；EMA Committee for Medicinal Products for Human Use,Guideline on strategies toidentify and mitigate risks for first-in-human clinical trials withinvestigational medicinal products.2007年7月,Concept paper on the revision ofthe‘Guideline on 4strategies to identify and mitigate risks for first-in-human 5clinical trials with investigational medicinal products’.2016年9月；EMACommittee for Advanced Therapies.Guideline on the quality,non-clinical andclinical aspects of gene therapy medicinal products.2015年3月；FDA Guidancefor Industry.Considerations for the design of early-phase clinical trials ofcellular and gene therapy products.2015年6月)。使用独立的DMC来考察安全性数据，然后作出任何剂量递增决定。

研究中所包括的受试者代表活动性XLRP疾病并且被选择来优化对结果测量中的有意义变化的遵守。计划的样品尺寸与3+3递增方案一致。将24个月的预期试验时间视为足够监测与载体和/或转基因/施用程序有关的任何AE的时间段。

此临床研究中所用的起始剂量为5×10⁹gp AAV8-RPGR。此剂量主要是基于来自由此研究的主办者(NightstaRx)进行的AAV8-RPGR 26周单剂量毒性和生物分布研究以及在牛津大学进行的小鼠研究(Fischer等,Mol Ther.2017；25(8):1854-1865)的人等效剂量(基于玻璃体体积计算)。在Fischer研究中，在C57BL/6JWT中用1.5×10⁹gp AAV8-RPGR处理未引起毒性眼部效应。主办者的毒性和生物分布研究的结果表明AAV8-RPGR在雄性C57BL/6J小鼠中在每只眼睛1×10⁹和3.54×10⁹gp的剂量水平下为良好耐受的。在小鼠中，NOAEL(未观测到有害效应水平)经测定大于每只眼睛3.54×10⁹gp，与起始剂量相比提供700倍安全限度。

此研究中的第二和第三剂量水平为1×10¹⁰和5×10¹⁰gp。考虑RPGR表达的窄安全范围的可能性，这些剂量增量为相较于前一剂量水平增加小于1-log(即分别为5×10⁹和1×10¹⁰gp)。更小的剂量增量预期不增加有意义的信息。另外，在猴研究中，鉴定了AAV8-GFP(编码绿色荧光蛋白的AAV8病毒粒子)将基因产物有效递送至靶细胞而没有毒性的剂量阈值，并且最高安全剂量经鉴定为1×10¹⁰gp(Vandenberghe等,Sci Transl Med.2011；3(88):88ra54)。在正在进行的在患有CNGA3相关色盲的患者中评估视网膜下AAV-CNGA3载体(rAAV8.hCNGA3)的安全性和耐受性的1期/2期临床试验中，患者以1×10¹⁰与1×10¹¹gp之间的剂量接受载体(ClinicalTrials.gov标识：NCT02610582)。正如高达1x10¹¹gp的更高剂量一般，在给予1×10¹⁰gp的受试者中此临床研究的初步结果也展示可接受的安全性(Fischer等,摘要5207.2016年视觉和眼科学研究协会年会(2016Annual Meeting of theAssociation for Research in Vision and Ophthalmology))。

第四(1×10¹¹gp)、第五以及第六(2.5×10¹¹以及5×10¹¹gp)剂量水平为相较于前一剂量水平增加小于0.5-log，从而确保在剂量探索范围的上端方法更保守。在小鼠中NOAEL提供了与临床最大剂量(5×10¹¹gp)相比7倍安全限度。

表3中呈现了毒理学物种中的AAV8-RPGR剂量的概述。还包括了来自使用AAV8载体进行视网膜下递送的其他临床前和临床研究的安全性和功效结果用于比较。

表3.临床试验的毒理学安全限度

*：使用玻璃体体积来计算安全限度以校正视网膜下注射载体之后的物种差异。人:小鼠的玻璃体体积比为1:1000，而人:猴则为1:2.4(Atsumi等,2013)。

根据用于计算眼适应症中的HED的玻璃体体积准则(小鼠与人之间玻璃体体积相差1000倍)以及对在视网膜下注射AAV8载体情况下的安全的更高剂量的施用(Vandenberghe等,2011)的了解，如果通过转基因的安全RPGR表达在剂量的下端不展现窄范围，那么在AAV8-RPGR情况下更高的剂量为可能的。

将AAV8-RPGR施加至视网膜的下表面需要玻璃体切除术之后的视网膜脱离。因而，视网膜下注射AAV8-RPGR带来了与玻璃体切除术和视网膜脱离相关的风险，所述风险包括手术中和手术后并发症：感染(最值得注意地为感染性眼内炎)；低的和升高的IOP；脉络膜脱离；黄斑水肿；玻璃体出血；视觉受损；视物变形；以及火花幻视(Park等,Ophthalmology.1995；102:775-781；Thompson等,Am J Ophthalmol.1996；121(6):615-622；Banker等,Ophthalmology 1997；104(9):1442-1452；论述1452-1453；Cheng等,Am JOphthalmol.2001；132(6):881-887；Anderson等,Ophthalmology.2006；113(1):42-47.Epub2005年12月19日；Stein等,Arch Ophthalmol.2009；127(12):1656-1663；Recchia等,Ophthalmology 2010；117(9):1851-1857)。由玻璃体切除术引起的手术后眼内炎症常常与瞬时视觉受损相关。玻璃体切除术的长期并发症为白内障形成，这可能需要另一手术程序(白内障摘除术)(Park等,1995；Cheng等,2001；Recchia等,2010)。为使由对载体的潜在免疫反应引起的炎症减至最轻，将给予接受AAV8-RPGR的受试者一定疗程的经口皮质类固醇。

在确定了MTD并且AAV8-RPGR在成人中展现安全性和耐受性后，在研究的第II部分中招募年龄≥10岁的受试者。参与到儿科受试者中的10岁截止保护者将能够遵从，适当进行研究评估，并且患有足够晚期的侵害黄斑(即AAV8-RPGR处理施用区域)的疾病。

在第II部分中，将受试者随机化至“MTD队列”、“活性对照队列”或未处理的对照。这允许具有平行活性对照组以及对处理剂量设盲，这增强了功效和安全性结果的稳固性。活性对照队列为MTD以下的三个剂量水平。这确保这两个队列之间的剂量相差1-1.5-log，并且允许鉴定剂量反应，同时降低亚治疗低剂量的可能性。

1.7：终点

主要终点.主要安全性终点为剂量限制毒性(DLT)的发生率以及历时24个月时间的处理紧急有害事件(TEAE)。

次要和探索性终点.研究的次要终点包括：

·在3、6、12、18以及24个月时微视野检查相较于基线的变化。

·在3、6、12、18以及24个月时最佳矫正视敏度(BCVA)相较于基线的变化。

·在3、6、12、18以及24个月时谱域光学相干断层扫描(SD-OCT)相较于基线的变化。

·在3、6、12、18以及24个月时自体荧光相较于基线的变化。

研究的探索性终点包括：

·在3、6、12、18以及24个月时其他解剖学和功能结果相较于基线的变化。

2.0：受试者的选择和退出

2.1：纳入准则

如果受试者满足所有以下纳入准则，那么他们适合参与研究。

1.受试者/父母(如果适用)愿意并且能够对于参与研究提供知情同意

2.为男性并且能够遵从和适当进行所有研究评估

·第I部分：年龄≥18岁

·第II部分：年龄≥10岁

3.以基因方式确诊了XLRP(具有RPGR突变)

4.患有在两只眼睛中的黄斑区内临床上可见的活动性疾病并且界定如下：

在筛选时在SD-OCT上测量的椭圆体带(EZ)必须在任何B型扫描的鼻颞边界内，并且在大多数下方和上方B型扫描中不可见

5.在两只眼睛中患有满足以下准则的BCVA(基于队列水平)：

·队列1：优于或等于光感

·队列2-3：BCVA为34-73个ETDRS字母(等效于斯内伦敏锐度(Snellen acuity)劣于或等于6/12或20/40，但斯内伦敏锐度优于或等于6/60或20/200)。

·队列4-6和第II部分：优于或等于BCVA为34个ETDRS字母(等效于斯内伦敏锐度优于或等于6/60或20/200)。

2.2：排除准则

如果受试者满足以下排除准则中的任一者，那么他们不适合参与研究：

1.在任一眼睛中具有弱视史

2.在用AAV8-RPGR处理之后3个月的时间内不愿意使用屏障避孕方法(如果适用)

3.患有研究者认为可能因参与研究而将受试者置于风险中、可能影响研究结果、可能影响受试者进行研究诊断测试的能力或影响受试者参与研究的能力的任何其他显著眼部或非眼部疾病/病症。这将包括但不限于以下各项：

·临床上显著的白内障

·对经口皮质类固醇有禁忌

4.在过去12周内已参与涉及研究产品的另一研究性研究或先前在任何时间接受了基于基因/细胞的疗法(包括但不限于智能视网膜植入系统植入、纤毛神经营养因子疗法、神经生长因子疗法)。

2.3：受试者退出准则

每个受试者均有仅在任何时间退出研究，没有偏见。此外，如果研究者出于包括以下的任何原因认为有必要，那么研究者可在任何时间停止受试者进行研究：

·显著方案偏差

·显著不遵从研究要求

·AE使得不能继续符合研究评估

·失去跟踪

·死亡

·其他(应在电子病例报告表格[eCRF]上指定)。

在受试者停止研究的情况下，应在eCRF中记录退出的原因。在受试者早期停止研究的情况下，研究地点应使用一切合理的努力来确保如研究程序时间表(参见表2)中所概述进行ET访视。如果受试者因AE而退出，那么研究者将安排跟踪直到事件消除或稳定。对于退出同意/认可的受试者，将通过他们最后一次可获得的研究访视收集数据。退出MTD队列的受试者可能会被替换。

从研究中退出将不会使得受试者到退出点所获得的数据被排除在外。

3.0：研究处理

3.1：所施用的处理

在注射日访视(访视2，第0天)时，受试者在其研究眼中经历玻璃体切除术和视网膜脱离，然后接受单一视网膜下注射AAV8-RPGR(细节参见章节3.4)。受试者接受了5×10⁹gp(队列1)、1×10¹⁰gp(队列2)、5×10¹⁰gp(队列3)、1x10¹¹gp(队列4)、2.5×10¹¹gp(队列5)或5x10¹¹gp(队列6)的AAV8-RPGR剂量。(细节参见章节1.3)。

3.2：研究药物的描述

原料药为含有编码RPGR的重组人互补脱氧核糖核酸(cDNA)的AAV8载体(AAV8-RPGR)。载体基因组(AAV8-coRPGR-BGH，称为AAV8-RPGR)包含强组成性表达盒、视紫红蛋白激酶启动子、编码RPGR的密码子优化的人cDNA(coRPGR)以及侧接AAV2反向末端重复序列的牛生长激素(BGH)-polyA序列。合成了视网膜特异性同种型RPGR^ORF15的密码子优化的人编码序列；还合成了RPGR^ORF15的WT序列并且提供于pCMV6-XL载体骨架中或pUC57载体骨架中用于克隆。

AAV8-RPGR药物产品在无菌20mM Tris缓冲溶液，pH 8.0中配制并且含有1mMMgCl2、200mM NaCl以及0.001％PF68。药物产品为透明至轻微发乳白光的无色无菌过滤悬浮液，目标浓度为5×10¹²gp/mL。

3.3：包装、标记、制备以及储存

将AAV8-RPGR供应于标记的无菌聚丙烯管中，每个管子含有0.3mL载体悬浮液。因此，每个管子含有总计1.5×10¹²gp。

以至多0.1mL的总体积递送AAV8-RPGR。研究程序手册中提供了用于制备和稀释药物产品以递送所需剂量的AAV8-RPGR的说明书。

在运输之前，将每个小瓶放置于标记的二级容器中。应将药物产品在<-60℃(<-76℉)下储存于控制存取温度监测冷冻器中。

按照管理标准(关于一级或二级容器)对研究性医学产品进行标记，并且包括方案研究编号、主办者名称、产品名称、效价、小瓶和批号、截止日期、储存条件以及注意声明。

3.4：玻璃体切除术程序和AAV8-RPGR的注射

要用于此研究中的视网膜下注射技术类似于主办者在牛津的无脉络膜规划中以及其他国际研究者在美国、加拿大以及德国主办的试验中所研发的视网膜下注射技术。迄今为止，超过185个受试者已由四个视网膜外科医师使用下文所描述的技术进行了注射。

AAV8-RPGR的注射应由有适当资格并且有经验的视网膜外科医师进行。最初，受试者经历标准玻璃体切除术和玻璃体后脱离(图26A至26B)。所有手术使用标准

(双目镜间接检眼显微镜)(OCULUS Surgical,Inc.)玻璃体切除术系统进行。23号缝合方法通常有利于避免伤口渗漏的任何潜在风险。如果认为更容易，那么在视网膜下注射AAV8-RPGR之前，使用通过连接至玻璃体注射设备的41号视网膜下套管注射的0.1-0.5mL的平衡盐溶液(BSS)使视网膜脱离。通过相同进入位点将单个剂量的AAV8-RPGR注射至视网膜下流体中。如果在较小体积的流体情况下发生黄斑脱离，那么还可选择在眼球后侧(例如鼻至视盘)的额外视网膜下位点来递送最多全部0.1ml的载体。这避免了过量中央凹延伸。

如果遇到视网膜脱离的意外并发症(例如形成的黄斑裂孔需要用气体处理)，那么可将载体注射推迟到较晚的日期。

针对围手术期和手术后AE的发生对受试者进行监测。不管与研究药物和/或手术程序的关系如何，将所有AE均记在受试者的医疗记录中并且在eCRF中报告。

3.5：随机化

此研究的剂量递增部分不为随机化的。

在第II部分中，在分配研究眼之后，将受试者以2:1比率随机化为接受AAV8-RPGRMTD或较低剂量的AAV8-RPGR，对于活性对照队列为来自MTD的三个剂量水平(例如如果MTD＝5x10¹¹gp，那么低剂量＝5x10¹⁰gp)。

使用经过验证的系统产生随机化，所述经过验证的系统使将处理组随机分配至随机化编号自动化。在受试者被认为合格后，研究地点(或批准的指派人员)使用系统，并且使用标准分区随机化将受试者随机化。随机化编号包括中心编号和受试者编号。

3.6：研究设盲

研究的第I部分为开放标签的。

第II部分为双盲的(受试者、外科医师、研究者/研究地点团队、主办者不知晓所分配的剂量，并且就处理施用来说为开放标签的)。

3.7：研究药物责任

由每个研究中心保管收到和分配研究药物的记录，直到研究结束，以提供所有使用和未使用的研究药物的完整叙述。由主办者(或其指派人员)检查分配日志。研究中心根据当地程序毁坏所有使用过的小瓶，并且在研究结束时将所有未使用的研究药物归还给主办者(或其指派人员)。由主办者(或其指派人员)查检最终药物责任。

3.8：伴随疗法

受试者不能在过去12周内已参与涉及研究产品的另一研究性研究或先前在任何时间接受了基于基因/细胞的疗法(包括但不限于IRIS植入、纤毛神经营养因子疗法、神经生长因子疗法)。

在整个研究中，研究者被开出认为是提供充足支持护理所必需的任何伴随药物或治疗。在筛选/基线访视时收集伴随药物的细节并且在每次研究访视(如果适用则包括ET访视)时进行更新。研究期间所摄入的伴随药物(包括泼尼松/泼尼松龙)应记录在受试者的医疗记录和eCRF中；这种情况的例外为进行研究程序的过程所用的任何药物(例如麻醉、扩张性滴眼剂)。

为使由手术以及对载体/转基因的潜在或意外免疫反应引起的炎症减至最轻，从手术之前3天开始给予成人受试者9周疗程的经口皮质类固醇：60mg 21天，随后6周为渐减剂量。对于II部分中所处理的儿科受试者，对剂量方案进行调整(参见章节9.8)。还可在手术时用经由深特农氏囊下方法施用的至多1mL的曲安西龙(40mg/mL)对受试者进行处理。

3.9：处理遵从性

此研究涉及单一视网膜下注射至多0.1mL AAV8-RPGR。因此，AAV8-RPGR情况下的处理遵从性的测量并非必需的。将使用泼尼松/泼尼松龙情况下的遵从性记在eCRF中。

4.0：研究访视和程序

表2中呈现了研究程序时间表。下文对访视进行更详细描述。

4.1：访视1(筛选/基线访视)

研究者向每个潜在研究受试者解释研究目的、程序以及受试者职责。确定受试者的意愿和满足方案要求的能力。

在任何研究特异性程序之前，获得书面知情同意。受试者或父母在研究者或他/她的指派人员在场的情况下对同意表格的一个副本进行签名并且签上日期。原始签名表格保留在研究地点并且另一副本保留在受试者的医疗记录中；一个副本给受试者或父母。在适当时，由受试者完成认可表格。

在已获得知情同意/认可之后，对受试者进行评估以确定合格性。筛选评估被视为基线测量并且由以下各项组成：

·人员统计

·病史，包括眼科史和现有药物

·血压和脉搏

·安全性血液样品(血液学和临床化学)的收集

·RPGR突变筛选(仅在先前未进行时)

·全面眼科检查，包括间接检眼镜检查、裂隙灯检查、IOP、前房和玻璃体炎症评级以及晶状体LOCS III白内障评级

·ETDRS BCVA*

·SD-OCT

·LLVA*

·眼底自体荧光

·微视野检查*

·眼底照相术

·视野*

·对比敏感度测试

·颜色视觉测试

·快速阅读测试

·FST

·病毒脱落

·免疫原性取样

·SAE监测

·伴随药物考察

·随机化**

*一式三份地收集评估。为促成三次重复测试，历时2天进行访视。建议在第一天测量BCVA和LLVA两次并且在第二天测量一次(在瞳孔扩张之前)。必须将所有3个BCVA和所有3个LLVA值记录在eCRF中。使用最高BCVA得分来确定受试者合格性。每次BCVA评估之后立即进行LLVA。将视野和微视野检查输出送至CRC进行考察。产生数据并且在CRC内校对并且输出给主办者或指派人员以纳入研究数据库中。

**仅对第II部分进行随机化。

满足所有纳入准则并且不满足任何排除准则的受试者被分配研究眼并且招募至研究中。在第II部分中，然后将受试者随机化至AAV8-RPGR处理组(MTD队列、活性对照队列或未处理的对照)，并且保持不知晓处理剂量。关于随机化和受试者编号分配的细节参见章节3.5。

下一研究访视(访视2)应预定在筛选/基线访视的8周(±2周)内。给予受试者21天疗程的经口泼尼松/泼尼松龙并且指示其在下一研究访视(访视2)之前2天开始摄入药物。在适当时，还指示受试者从他们被处理的时间3个月时间内使用屏障避孕。

4.2：访视2(第0天，手术/注射日访视)

在访视2时，在手术之前进行以下评估：

·血压和脉搏

·AE/SAE监测

·伴随药物考察

·皮质类固醇遵从性考察

然后，受试者经历玻璃体切除术并且接受视网膜下注射AAV8-RPGR(细节参见章节3.4)。针对程序期间AE的发生对受试者进行仔细监测。受试者可留宿或在手术之后1天时回到研究地点，然后在7天时进行手术后跟踪(分别为访视3[第1天]和4[第7天])。

4.3：访视3(第1天手术后访视)

在访视3(第一次手术后访视)时，进行以下评估：

·血压和脉搏

·全面眼科检查，包括间接检眼镜检查、裂隙灯检查、IOP、前房和玻璃体炎症评级以及LOCS III白内障评级

·ETDRS BCVA

·SD-OCT

·病毒脱落

·免疫原性取样

·AE/SAE监测

·伴随药物考察

·皮质类固醇遵从性考察

在适当时，提醒受试者从处理时间起3个月的时间内使用屏障避孕的要求。

4.4：访视4(第7天手术后访视±3天)

在访视4(第二次手术后访视)时，进行以下评估：

·血压和脉搏

·安全性血液样品(血液学和临床化学)的收集

·ETDRS BCVA

·SD-OCT

·病毒脱落

·免疫原性取样

·AE/SAE监测

·伴随药物考察

·皮质类固醇遵从性考察

4.5：访视5(第1个月±7天)

在访视5时，进行以下评估：

·安全性血液样品(血液学和临床化学)的收集

·ETDRS BCVA

·SD-OCT

·LLVA

·眼底自体荧光

·微视野检查

·病毒脱落

·免疫原性取样

·AE/SAE监测

·伴随药物考察

·皮质类固醇遵从性考察

4.6：访视6(第3个月±7天)

在访视6时，进行以下评估：

·安全性血液样品(血液学和临床化学)的收集

·ETDRS BCVA

·SD-OCT

·LLVA

·眼底自体荧光

·微视野检查

·对比敏感度测试

·颜色视觉测试

·免疫原性取样

·AE/SAE监测

·伴随药物考察

4.7：访视7(第6个月±14天)

在访视7时，进行以下评估：

·ETDRS BCVA

·SD-OCT

·LLVA

·眼底自体荧光

·微视野检查

·眼底照相术

·视野

·对比敏感度测试

·颜色视觉测试

·快速阅读测试

·FST

·免疫原性取样

·AE/SAE监测

·伴随药物考察

4.8：访视8(第9个月±14天)

在访视8时，进行以下评估：

·ETDRS BCVA

·SD-OCT

·LLVA

·眼底自体荧光

·微视野检查

·AE/SAE监测

·伴随药物考察

4.9：访视9(第1年±14天)

在访视9时，进行以下评估：

·安全性血液样品(血液学和临床化学)的收集

·ETDRS BCVA*

·SD-OCT

·LLVA*

·眼底自体荧光

·微视野检查

·眼底照相术

·视野

·对比敏感度测试

·颜色视觉测试

·快速阅读测试

·FST

·免疫原性取样

·AE/SAE监测

·伴随药物考察

*一式三份地收集评估。为促成三次重复测试，历时2天进行访视。建议在第一天测量BCVA和LLVA两次并且在第二天测量一次(在瞳孔扩张之前)。将所有3个BCVA和所有3个LLVA值记录在eCRF中。每次BCVA评估之后应立即进行LLVA。

如果认为临床上为必需的，那么发展白内障的受试者可经历白内障手术；如果进行手术，那么它应在访视9(第1年)或访视11(第2年)之前至少4周时进行。

4.10：访视10(第18个月±14天)

在访视10时，进行以下眼部评估：

·ETDRS BCVA

·SD-OCT

·LLVA

·眼底自体荧光

·微视野检查

·眼底照相术

·AE/SAE监测

·伴随药物考察

4.11：访视11(第2年±14天，研究访视结束)

在访视11时，进行以下眼部评估：

·ETDRS BCVA*

·SD-OCT

·LLVA*

·眼底自体荧光

·微视野检查

·眼底照相术

·视野

·对比敏感度测试

·颜色视觉测试

·快速阅读测试

·FST

·AE/SAE监测

·伴随药物考察

*一式三份地收集评估。为促成三次重复测试，历时2天进行访视。建议在第一天测量BCVA和LLVA两次并且在第二天测量一次(在瞳孔扩张之前)。将所有3个BCVA和所有3个LLVA值记录在eCRF中。每次BCVA评估之后立即进行LLVA。

4.12：提前终止(ET)访视

在受试者在任何时间停止研究的情况下，研究地点应使用一切合理的努力来确保进行ET访视。应进行以下评估：

·ETDRS BCVA*

·SD-OCT

·LLVA*

·眼底自体荧光

·微视野检查

·眼底照相术

·视野

·对比敏感度测试

·颜色视觉测试

·快速阅读测试

·FST

·免疫原性取样

·AE/SAE监测

·伴随药物考察

*一式三份地收集评估。为促成三次重复测试，应历时2天进行访视。建议在第一天测量BCVA和LLVA两次并且在第二天测量一次(在瞳孔扩张之前)。必须将所有3个BCVA和所有3个LLVA值记录在eCRF中。每次BCVA评估之后应立即进行LLVA。

4.13：未预定访视

如果临床上有指示，那么受试者可能需要回到研究地点进行未预定访视。至少应进行以下评估。

·ETDRS BCVA

·SD-OCT

·AE/SAE监测

·伴随药物考察

5.0：功效的评估

5.1：最佳矫正视敏度(BCVA)

为评估研究时间内的VA变化，在表2中所指示的时间使用ETDRS VA图表评估两只眼睛的BCVA。

在瞳孔扩张之前进行BCVA测试，并且在测量BCVA之前进行距离折射。最初，在离图表4米的距离处阅读字母。如果在4米处读了<20个字母，那么应进行在1米处的测试。将BCVA报告为受试者正确阅读的字母数目。在筛选/基线访视时，如果眼睛满足以下条件，那么它们适合于研究：

·优于或等于光感(仅队列1)，或

·BCVA为34-73个ETDRS字母(等效于斯内伦敏锐度劣于或等于6/12或20/40，但斯内伦敏锐度优于或等于6/60或20/200)(队列2-3)

·BCVA优于或等于34个ETDRS字母(等效于斯内伦敏锐度优于或等于6/60或20/200)(队列4[如果适用则为5和6]和MTD队列)

对于BCVA，评估者有适当资格进行评估。在访视1、9以及11(或ET访视)时历时2天时间一式三份地对所有受试者进行BCVA。建议在第一天进行BCVA两次并且在第二天进行一次。将所有值输入eCRF中。

5.2：谱域光学相干断层扫描(SD-OCT)

在表2中所指示的时间对两只眼睛进行SD-OCT。在受试者的瞳孔扩张之后由注册技术人员在研究地点进行SD-OCT测量。所有OCT扫描由研究地点提交给对扫描进行评估的集中读取中心(CRC)；CRC将把数据输入电子数据捕获(EDC)系统。使用SD-OCT来定量椭圆体带的完整性以及来自外核层和脉络膜的信号减少。此外，评估了中央凹变化。

5.3：眼底自体荧光

为评估有活力的视网膜组织的区域内的变化，在表2中所指示的时间对两只眼睛进行眼底自体荧光分析。在受试者的瞳孔扩张之后由注册技术人员在研究地点获得所有眼底自体荧光图像并且送至CRC进行考察；CRC将数据输入EDC系统。

5.4：微视野检查

在表2中所指示的时间对两只眼睛进行微视野检查。在访视1时历时2天时间一式三份地对所有受试者进行微视野检查。由注册技术人员进行微视野检查以评估黄斑内视网膜敏感度的变化。由研究地点将所有微视野检查图像送至CRC进行考察；CRC将数据输入EDC系统。

5.5：视野

仅在可获得所需视野检查设备的研究地点在表2中所指示的时间在两只眼睛中对视野进行评估。在访视1时历时2天时间一式三份地对所有受试者的视野进行评估。将视野输出送至CRC进行考察。产生数据并且在CRC内校对并且输出给主办者或指派人员以纳入研究数据库中。

5.6：对比敏感度

在表2中所指示的时间对两只眼睛测量对比敏感度。在瞳孔扩张之前使用佩里罗布森图表测量对比敏感度。对于对比敏感度，评估者有适当资格进行评估。

5.7：低亮度视敏度(LLVA)

在表2中所指示的时间对两只眼睛测量LLVA。在BCVA测试之后并且在瞳孔扩张之前进行测试。通过将2.0对数单位中性密度滤光片放在每只眼睛前面并且让受试者阅读正常照射的ETDRS图表来测量LLVA。最初，在离图表4米的距离处阅读字母。如果在4米处读了<20个字母，那么应进行在1米处的测试。将LLVA报告为受试者正确阅读的字母数目。在访视1以及访视9和11(或ET访视)时历时2天时间一式三份地对所有受试者进行LLVA。建议在第一天进行LLVA两次并且在第二天进行一次。将所有值输入eCRF中。

5.8：全视野刺激阈值测试(FST)

仅在可获得所需FST设备的研究地点在暗适应时间之后并且在表2中所指示的时间对两只眼睛测量FST。由有适当资格的技术人员进行FST测量。

5.9：颜色视觉

在表2中所指示的时间在瞳孔扩张之前对两只眼睛测试颜色视觉。分开地并且在每次评估时按相同的顺序对眼睛进行测试。对于颜色视觉测试，评估者有适当资格进行评估。

5.10：阅读测试

在表2中所指示的时间在瞳孔扩张之前对两只眼睛评估阅读表现。由主办者将阅读测试提供给每个研究地点。对于阅读测试，评估者有适当资格进行评估。

6.0：安全性的评估

6.1：剂量限制毒性

DLT的定义参见章节1.2。

6.2：评估、记录以及报告有害事件

6.2.1定义

6.2.1.1有害事件

AE为临床研究受试者中的任何不幸的医学情况的发生，所述不幸的医学情况的发生不一定与研究药物/手术程序具有因果关系。因此，AE可为时间上与研究药物/手术程序的使用相关的任何不利和非故意的迹象(包括异常实验室结果)、症状或疾病，无论是否与研究产品或与此方案中所描述的手术程序有关。

AE将还包括任何在研究期间恶化(即，频率或强度增加)的预先存在的疾患(除了XLRP)或疾病。

6.2.1.2严重有害事件

SAE定义为任何不幸的医学情况的发生，所述任何不幸的医学情况的发生：

·导致死亡

·危及生命

·需要住院治疗或延长现有住院时间

·导致持久或显著的残疾/无能力

·为先天异常/出生缺陷的

·导致视觉损失或危及视觉

·为一种或多种其他重要医学事件。

‘严重’定义中的术语‘危及生命’是指事件使受试者在事件发生时处于死亡风险中。它不指假设可能会致死的事件(如果它更严重)。

尚未恶化的预先存在的疾患的住院治疗(包括选择性程序)不构成SAE。

可能不会导致死亡、不危及生命或不需要住院治疗的其他事件当基于适当的医学判断可能会使受试者遭受危险并且可能需要医学或手术干预来防止上文所列的结果中的一者时，可将所述事件视为SAE。

以下视觉损失或危及视觉的事件应报告为SAE：

·与基线相比ETDRS图表上VA持续降低≥15个字母，除了手术相关事件。持续定义为持续48小时或更久，直到恢复；恢复定义为VA回到基线VA的10个字母以内。

·手术相关VA降低事件定义为与手术在时间上紧密关联(<24小时内)发生的VA降低。如果研究者认为，这些事件在持续时间或严重程度方面的演化对于手术程序来说为非典型性，那么它们将不报告为SAE，然而，它们应报告为AE。这将包括但不局限于以下情况，其中手术后VA降低的异常过程与可归因于手术或研究药物的另一并发症相关，或其中手术后VA降低的异常过程可归因于另一可识别的原因。

·研究者认为AE实际上或可能需要任何手术或医学干预来防止永久视觉损失。

6.2.2有害事件的记录

应从受试者或父母(在适当时)提供书面知情同意的时间到访视11(或如果适用则为ET访视或非预定访视)收集SAE。应从访视2到访视11(或如果适用则为ET访视或非预定访视)收集非严重AE。在包括任何非预定访视的每次访视时，通过使用非引导性询问(诸如‘从上一次访视以来你感觉如何？’)关于AE的发生对受试者提问。

由研究者观察或由受试者报告的在研究期间发生的所有AE，无论是否归因于研究药物或手术程序均应记录在受试者的医疗记录中以及eCRF中。实验室结果或生命指征测量中的任何临床显著变化(如由研究者测定)均应记录为AE。

对于每种AE，以下信息应记录在eCRF中：描述、发作日期和结束日期、结果、严重程度、与研究药物/研究程序的相关性的评估、所采取的行动以及确认是否事件被认为是严重的(严重性的定义参见章节6.2.1.2)。应根据需要提供跟踪信息(关于跟踪程序的具体情况参见章节6.2.3)。应基于以下量表对事件的严重程度进行评估：1.＝轻度(意识到迹象或症状，但容易忍受)2.＝中度(不适足以对正常活动造成干扰)3.＝重度(使无能力，并且不能进行正常活动)。当分配AE的相关性时，将考虑是否与研究药物或手术程序存在似乎合理的关系。

以下为此研究中所用的相关性界定：不相关：在时间上与研究药物/手术程序的施用不适当相关或研究药物/手术程序的暴露尚未发生；不太可能相关：存在解释事件发生的因素(证据)(例如基础疾病的进展或伴随药物更可能与事件相关)或令人信服的对事件的替代解释；有可能相关：相对于研究药物/手术程序的施用为临床或生物学合理的，但事件可能是归因于另一种同样可能的原因；很可能相关：相对于研究药物/手术程序的施用为临床/生物学合理的，并且与通过其他因素和原因相比，事件更可能通过暴露于/施用研究药物/手术程序得到解释；确定相关：事件发作相对于研究药物/手术程序的施用具有因果关系并且没有其他原因来解释事件。

AE严重程度以及与研究药物或手术程序的关系应由研究者或医学上有资格的指派人员在研究地点进行评估。

6.2.3有害事件的跟踪

应对AE进行跟踪，直到受试者已恢复或受试者参与研究已完成。

将对因药物相关AE而退出研究的受试者进行跟踪，直到事件已消除、消退、稳定或者受试者或父母(在适当时)同意退出或失去跟踪为止。

与归因于研究药物或手术程序无关，应对所有SAE进行跟踪，直到事件已消除、消退、稳定或者受试者或父母(在适当时)同意退出或失去跟踪为止。主办者(或指派人员)将跟踪SAE报告至完成。研究者被期望及时提供完整评估和记录SAE报告所需要的额外信息。

6.2.4严重有害事件和DLT的报告

研究者应立即(在获悉事件24小时内)向主办者(或其指派人员)报告任何SAE(和/或DLT)。应以提供关于受试者和事件的具体情况的更详细报告对初始报告进行迅速跟踪。应提供医院报告、尸体解剖报告以及其他文件的副本(如果适用)。

主办者将按照当前法规向研究地点、机构审查委员会/独立伦理委员会(IRB/IEC)以及管理机构报告疑似意外严重有害反应(SUSAR)。致命或危及生命的所有案例均应在主办者从研究者收到初始报告之后不迟于7天进行报告。所有非致命或非危及生命案例均应在初始研究者报告之后最多十五天内进行报告。在适用时，主办者还将向IRB/IEC和管理机构提供定期安全报告。

6.2.5数据监测委员会(DMC)

此研究中使用独立DMC来保护研究受试者的安全和利益，并且对基因疗法干预在试验期间的安全性和风险/收益进行评估。DMC在研究期间以规则间隔考察进展和累积的研究数据，并且向主办者提供关于研究安全性方面的建议，包括剂量递增的建议(参见章节1.3)。DMC应告知主办者是否有以下共识：正在产生的数据表明基因疗法、其施用方法和/或研究设计不再符合研究受试者的最佳利益。

6.3：妊娠

在临床研究期间在研究受试者的女性伴侣中发生的任何妊娠均应记录在妊娠告示表格上。研究者应立即(在获悉事件24小时内)向主办者(或其指派人员)报告所述妊娠。此外，如果可能的话，应记录由受试者作为父亲的妊娠的结果并且对先天异常或出生缺陷进行跟踪，直到分娩。

6.4：全面眼科检查

在表2中所指示的时间对两只眼睛进行全面眼科检查。眼科检查包括间接检眼镜检查、裂隙灯检查、IOP、前房和玻璃体炎症评级以及LOCS III白内障评级。对于任何给定受试者，在各研究访视间应使用相同裂隙灯机器和照明条件。

6.5：眼底照相术

为帮助对视网膜外周的渐进性视网膜变化作出客观临床评估，在表2中所指示的时间对两只眼睛进行眼底照相术。在瞳孔扩张后由注册技术人员进行眼底照相术。由研究地点将所有眼底照片发送给CRC进行考察；CRC将数据输入EDC系统。

6.6：生命体征

在表2中所指示的时间获取生命体征(脉搏以及收缩和舒张压)。在受试者坐下至少5分钟之后获取生命体征。

6.7：实验室评估

6.7.1实验室安全参数

在表2中所指示的时间收集血液样品用于测量血液学和临床化学参数。将样品送至中心实验室进行分析。

表4中概括了所要评估的血液学和临床化学参数。

表4.实验室安全参数

6.7.2病毒脱落

在表2中所指示的时间收集血液、眼泪(两只眼睛)、唾液以及尿液样品并且通过载体基因组的聚合酶链反应扩增进行测试以分析载体脱落和分散的证据。将样品送至中心实验室进行分析。

6.7.3免疫原性

为进行免疫原性评估，在表2中所指示的时间收集血液。计划免疫分析以评估针对AAV8-RPGR的基于抗体和细胞的反应。针对T细胞介导的对转基因的免疫反应使用酶联免疫墨点分析，并且使用基于酶联免疫吸附分析的方法对抗体反应进行分析。将所有免疫原性样品送至中心实验室并且储存在中心实验室用于将来的分析。

7.0：统计考虑因素

7.1：样品尺寸

归因于研究设计的性质，不进行正式的样品尺寸计算。在MTD剂量下30个受试者的样品尺寸确保将以95％可能性鉴定发生率≥10％的事件。

7.2：解释遗漏数据的程序

将作出一切合理的努力来获得所有受试者的两只眼睛的完整数据。然而，可能出现遗漏观测。漏失和遗漏观测的管理将取决于其性质和频率。将仅基于所观测的数据对安全性和功效数据进行分析。将不输入遗漏数据。

7.3：分析集合

7.3.1安全性分析集合

安全性分析集合由接受研究处理(玻璃体切除术/AAV8-RPGR)的所有受试者组成。安全性分析集合为人员统计、基线特征以及安全性分析的主要群体。

7.3.2全分析集合

全分析集合包括在至少一只眼睛中可获得至少1次基线后功效评估的数据的所有受试者。功效分析中使用全分析集合。

7.4：描述统计学

呈现两只眼睛(研究眼与对侧眼)的概述统计。未进行正式的统计比较。对于类别/二元数据，随时间推移呈现与每个类别有关的受试者的数目和比例以及其95％置信区间(CI)。使用平均值以及其95％CI、标准偏差、中值、最小值以及最大值随时间推移概述连续数据。95％CI为双侧的。在第I部分中根据剂量和总计并且在第II部分中根据组(MTD剂量和低剂量)来进行概述。

7.5：人员统计和基线特征

针对安全性分析集合和全分析集合对人员统计和基线眼部特征进行概述。

7.6：安全性分析

由于研究处理(手术/研究药物)对相对侧眼睛的潜在全身效应，根据眼睛(研究眼和对侧眼)来概述眼部评估和AE，同时在受试者水平对全身性评估进行分析。对于安全性分析，未进行正式的统计测试。对安全性分析集合进行了安全性分析。

7.6.1有害事件

使用监管活动医学词典(Medical Dictionary for Regulatory Activities)对AE进行编码。使用当前数据库锁定时的辞典版本。通过系统器官类别和优先术语对AE进行概述。对经历AE的眼睛/受试者的数目与事件数目两者进行概述。对研究药物/程序相关的AE、导致停止的AE以及SAE产生类似概述。还通过最大严重程度、与研究药物/程序的关系以及到发作的时间来概述AE。

制备根据受试者的DLT列表。

7.6.2眼部安全性评估

根据访视和眼睛对IOP和IOP相较于基线的变化、异常裂隙灯检查结果和间接检眼镜检查结果以及前房和玻璃体炎症评级进行概述。

根据访视和眼睛对晶状体混浊类别和相较于基线的改变进行概述。

根据访视和眼睛对眼底照相术结果的类别(无/轻度/中度/重度)进行概述。

根据访视并且根据眼睛将BCVA相较于基线降低10个和15个字母的受试者的数目列入表内。

7.6.3实验室评估和生命体征

以描述方式对实验室评估和生命体征进行概述。

7.7：功效分析

功效评估在本质上为眼部的并且因此根据眼睛(研究眼和对侧眼)列入表内。使用描述统计学对功效数据进行概述。

根据访视并且根据眼睛将BCVA相较于基线的变化列入表内。

7.7.1α调节

在此探索性1期/2期研究中α调节不适用。

7.8：中期分析

在第I部分中，在每个剂量队列之后进行探索性中期分析。在第II部分中，在不知晓所维持的处理剂量的情况下，在3、6、12、18以及24个月时对次要终点进行分析。

实施例4：用于针对色素性视网膜炎的基因疗法的RPGR^ORF15转基因的制备

对RPGR基因进行替代剪接(图23)。两种主要RPGR同种型为由外显子1-19编码的组成性变体(RPGR^Ex1-19)和RPGR^ORF15同种型，RPGR^ORF15同种型由RPGR^Ex1-19的外显子1-14继之以称为开放阅读框15的独特C端外显子组成。图24A至24C中示出了产生普遍存在的RPGR mRNA的剪接事件。图25A至25C中示出了产生光感受器特异性RPGR mRNA-RPGR^ORF15的剪接事件。RPGR^ORF15同种型在脊椎动物的感光纤毛中表达。

RPGR^ORF15同种型含有高度重复富嘌呤外显子(或开放阅读框)15，所述高度重复富嘌呤外显子15易于在病毒载体克隆期间发生突变以及错误(图26A至26D)。虽然RPGR在腺相关病毒(AAV)载体的编码能力范围内，但在3'端的高度重复富嘌呤区以及紧接在此区域上游的剪接位点已在克隆AAV.RPGR载体中形成显著挑战，若干团体在临床前测试期间报告了遗漏剪接或截短的变体。

以下提供密码子优化的RPGR^ORF15的序列：

ATGAGAGAGCCAGAGGAGCTGATGCCAGACAGTGGAGCAGTGTTTACATTCGGAAAATCTAAGTTCGCTGAAAATAACCCAGGAAAGTTCTGGTTTAAAAACGACGTGCCCGTCCACCTGTCTTGTGGCGATGAGCATAGTGCCGTGGTCACTGGGAACAATAAGCTGTACATGTTCGGGTCCAACAACTGGGGACAGCTGGGGCTGGGATCCAAATCTGCTATCTCTAAGCCAACCTGCGTGAAGGCACTGAAACCCGAGAAGGTCAAACTGGCCGCTTGTGGCAGAAACCACACTCTGGTGAGCACCGAGGGCGGGAATGTCTATGCCACCGGAGGCAACAATGAGGGACAGCTGGGACTGGGGGACACTGAGGAAAGGAATACCTTTCACGTGATCTCCTTCTTTACATCTGAGCATAAGATCAAGCAGCTGAGCGCTGGCTCCAACACATCTGCAGCCCTGACTGAGGACGGGCGCCTGTTCATGTGGGGAGATAATTCAGAGGGCCAGATTGGGCTGAAAAACGTGAGCAATGTGTGCGTCCCTCAGCAGGTGACCATCGGAAAGCCAGTCAGTTGGATTTCATGTGGCTACTATCATAGCGCCTTCGTGACCACAGATGGCGAGCTGTACGTCTTTGGGGAGCCCGAAAACGGAAAACTGGGCCTGCCTAACCAGCTGCTGGGCAATCACCGGACACCCCAGCTGGTGTCCGAGATCCCTGAAAAAGTGATCCAGGTCGCCTGCGGGGGAGAGCATACAGTGGTCCTGACTGAGAATGCTGTGTATACCTTCGGACTGGGCCAGTTTGGCCAGCTGGGGCTGGGAACCTTCCTGTTTGAGACATCCGAACCAAAAGTGATCGAGAACATTCGCGACCAGACTATCAGCTACATTTCCTGCGGAGAGAATCACACCGCACTGATCACAGACATTGGCCTGATGTATACCTTTGGCGATGGACGACACGGGAAGCTGGGACTGGGACTGGAGAACTTCACTAATCATTTTATCCCCACCCTGTGTTCTAACTTCCTGCGGTTCATCGTGAAACTGGTCGCTTGCGGCGGGTGTCACATGGTGGTCTTCGCTGCACCTCATAGGGGCGTGGCTAAGGAGATCGAATTTGACGAGATTAACGATACATGCCTGAGCGTGGCAACTTTCCTGCCATACAGCTCCCTGACTTCTGGCAATGTGCTGCAGAGAACCCTGAGTGCAAGGATGCGGAGAAGGGAGAGGGAACGCTCTCCTGACAGTTTCTCAATGCGACGAACCCTGCCACCTATCGAGGGAACACTGGGACTGAGTGCCTGCTTCCTGCCTAACTCAGTGTTTCCACGATGTAGCGAGCGGAATCTGCAGGAGTCTGTCCTGAGTGAGCAGGATCTGATGCAGCCAGAGGAACCCGACTACCTGCTGGATGAGATGACCAAGGAGGCCGAAATCGACAACTCTAGTACAGTGGAGTCCCTGGGCGAGACTACCGATATCCTGAATATGACACACATTATGTCACTGAACAGCAATGAGAAGAGTCTGAAACTGTCACCAGTGCAGAAGCAGAAGAAACAGCAGACTATTGGCGAGCTGACTCAGGACACCGCCCTGACAGAGAACGACGATAGCGATGAGTATGAGGAAATGTCCGAGATGAAGGAAGGCAAAGCTTGTAAGCAGCATGTCAGTCAGGGGATCTTCATGACACAGCCAGCCACAACTATTGAGGCTTTTTCAGACGAGGAAGTGGAGATCCCCGAGGAAAAAGAGGGCGCAGAAGATTCCAAGGGGAATGGAATTGAGGAACAGGAGGTGGAAGCCAACGAGGAAAATGTGAAAGTCCACGGAGGCAGGAAGGAGAAAACAGAAATCCTGTCTGACGATCTGACTGACAAGGCCGAGGTGTCCGAAGGCAAGGCAAAATCTGTCGGAGAGGCAGAAGACGGACCAGAGGGACGAGGGGATGGAACCTGCGAGGAAGGCTCAAGCGGGGCTGAGCATTGGCAGGACGAGGAACGAGAGAAGGGCGAAAAGGATAAAGGCCGCGGGGAGATGGAACGACCTGGAGAGGGCGAAAAAGAGCTGGCAGAGAAGGAGGAATGGAAGAAAAGGGACGGCGAGGAACAGGAGCAGAAAGAAAGGGAGCAGGGCCACCAGAAGGAGCGCAACCAGGAGATGGAAGAGGGCGGCGAGGAAGAGCATGGCGAGGGAGAAGAGGAAGAGGGCGATAGAGAAGAGGAAGAGGAAAAAGAAGGCGAAGGGAAGGAGGAAGGAGAGGGCGAGGAAGTGGAAGGCGAGAGGGAAAAGGAGGAAGGAGAACGGAAGAAAGAGGAAAGAGCCGGCAAAGAGGAAAAGGGCGAGGAAGAGGGCGATCAGGGCGAAGGCGAGGAGGAAGAGACCGAGGGCCGCGGGGAAGAGAAAGAGGAGGGAGGAGAGGTGGAGGGCGGAGAGGTCGAAGAGGGAAAGGGCGAGCGCGAAGAGGAAGAGGAAGAGGGCGAGGGCGAGGAAGAAGAGGGCGAGGGGGAAGAAGAGGAGGGAGAGGGCGAAGAGGAAGAGGGGGAGGGAAAGGGCGAAGAGGAAGGAGAGGAAGGGGAGGGAGAGGAAGAGGGGGAGGAGGGCGAGGGGGAAGGCGAGGAGGAAGAAGGAGAGGGGGAAGGCGAAGAGGAAGGCGAGGGGGAAGGAGAGGAGGAAGAAGGGGAAGGCGAAGGCGAAGAGGAGGGAGAAGGAGAGGGGGAGGAAGAGGAAGGAGAAGGGAAGGGCGAGGAGGAAGGCGAAGAGGGAGAGGGGGAAGGCGAGGAAGAGGAAGGCGAGGGCGAAGGAGAGGACGGCGAGGGCGAGGGAGAAGAGGAGGAAGGGGAATGGGAAGGCGAAGAAGAGGAAGGCGAAGGCGAAGGCGAAGAAGAGGGCGAAGGGGAGGGCGAGGAGGGCGAAGGCGAAGGGGAGGAAGAGGAAGGCGAAGGAGAAGGCGAGGAAGAAGAGGGAGAGGAGGAAGGCGAGGAGGAAGGAGAGGGGGAGGAGGAGGGAGAAGGCGAGGGCGAAGAAGAAGAAGAGGGAGAAGTGGAGGGCGAAGTCGAGGGGGAGGAGGGAGAAGGGGAAGGGGAGGAAGAAGAGGGCGAAGAAGAAGGCGAGGAAAGAGAAAAAGAGGGAGAAGGCGAGGAAAACCGGAGAAATAGGGAAGAGGAGGAAGAGGAAGAGGGAAAGTACCAGGAGACAGGCGAAGAGGAAAACGAGCGGCAGGATGGCGAGGAATATAAGAAAGTGAGCAAGATCAAAGGATCCGTCAAGTACGGCAAGCACAAAACCTATCAGAAGAAAAGCGTGACCAACACACAGGGGAATGGAAAAGAGCAGAGGAGTAAGATGCCTGTGCAGTCAAAACGGCTGCTGAAGAATGGCCCATCTGGAAGTAAAAAATTCTGGAACAATGTGCTGCCCCACTATCTGGAACTGAAATAA。(SEQ ID NO:3)

使用密码子优化来使内源性剪接位点失能，并且在不改变氨基酸序列的情况下使光感受器特异性RPGR转录物中的富嘌呤序列稳定(图27A至27C)。使用密码子优化来(1)移除重复嘌呤序列和隐蔽剪接位点；(2)移除polyA信号并且减少框外终止密码子；以及(3)考虑最小CpG情况下的最佳人tRNA密码子偏好性(图28)。密码子优化型式的人RPGR^ORF15(coRPGR)产生如经由蛋白质印迹所示的恰当大小的蛋白质(图29A至29C)。参见Fischer等Mol Ther.2017；25(8):1854-1865。

在密码子优化后RPGR蛋白的谷氨酰化(主要翻译后修饰)也保留。体内RPGR谷氨酰化需要C端碱性结构域与富Glu-Gly区域两者(图35A至35D)。参见Sun等PNAS,2016,113(21)E2925-E2934。使RPGR用TTLL5谷氨酰化，并且谷氨酰化沿感光纤毛中的微管蛋白移动RPGR(图30A至30C以及图31A至31B)。具有ORF15缺失的RPGR具有减少的谷氨酰化；因此，缺失的RPGR为缺陷型的(图32A至32B)。体外产生的密码子优化的RPGR展现恰当剪接和恰当谷氨酰化(图33A至33B)。参见Fischer等Mol Ther.2017；25(8):1854-1865。将密码子优化型式的人RPGR^ORF15(coRPGR)用于人RPGR基因疗法中(图34)。

实施例5：AAV-RPGR组合物的优化

此研究展示了RPGR^ORF15编码序列(cds)的密码子使用的优化。对密码子进行优化在困难序列(诸如RPGR^ORF15)中的最重要的优点在于可能改善序列保真度。在不改变所得氨基酸序列的情况下改变核苷酸带来使序列更稳定并且在制备用于基因疗法的载体期间不太易于发生自发突变的可能性。此优化可能在不使用转基因盒中的辅助调控元件的情况下进一步导致更高的转基因表达。在建立密码子序列后，进行额外体外研究以研发和优化基因疗法策略，目标为使用来自AAV8血清型的衣壳对假型重组腺相关病毒(AAV)载体进行工程化，同时在具有RPGR^ORF15中的突变的患者中，对于用于基因替代疗法的优化的AAV载体，使用充分表征的来自AAV2的空壳基因组。

基因的cds充当将核酸序列翻译为肽的模板。此方法涉及信使核糖核酸(mRNA)转录物、核糖体复合物以及氨基酸中所含的cds，它们结合至转移核糖核酸(tRNA)分子。cds中的三个连续核苷酸(例如UUA)构成密码子。tRNA分子具有互补抗密码子序列(例如AAU)，并且简单地结合至核糖体复合物内的密码子序列并且将它们携带的单一氨基酸(例如亮氨酸)贡献给氨基酸的生长链，从而形成由cds编码的生长肽。在使用AAV作为载体系统并且其包装容量有限的基因疗法的情形中，密码子优化提供在表达盒中没有额外顺式作用调控元件(诸如土拨鼠肝炎病毒转录后调控元件(WPRE))的情况下增加转基因表达的可能，从而产生更简洁的设计并且在AAV制造周期中产生更高的效率。此外，可在不改变转基因的翻译的氨基酸序列(沉默取代)的情况下改变核苷酸序列，以便改善胞嘧啶/鸟嘌呤含量，从而移除不想要的重复序列和/或可能妨碍克隆的限制位点。这些常常为优化密码子在诸如RPGR^ORF15等困难序列中的最重要的优点：可能改善序列保真度。在不改变所得氨基酸序列的情况下改变核苷酸带来使序列更稳定并且在制备用于基因疗法的载体期间不太易于发生自发突变的可能性。

重组AAV已成为视网膜基因疗法的金标准，从而在过去几十年里促成了多个成功临床试验。临床前模型以及人患者中的优良安全性型态以及其组分适合于新的靶基因的通用性为选择AAV作为用于RPGR^ORF15递送的载体系统中的重要因素。

不同AAV血清型归因于AAV表面蛋白与靶细胞受体之间的特定相互作用而产生独特表达模式。举例来说，天然存在的血清型AAV2对于转导视网膜色素上皮细胞来说非常高效，但在将转基因递送至感光细胞中不太有效。相比之下，AAV8衣壳结构使得哺乳动物感光细胞快速并且高效地摄入病毒体。

光感受器表达RPGR^ORF15并且引导它局部化至连接纤毛，其中它沿称为连接纤毛的瓶颈结构组织细胞内蛋白转运。没有功能性RPGR^ORF15的光感受器发生高度表达的蛋白质(诸如视蛋白)的累积，这导致光感受器功能障碍和最终的细胞死亡。

光感受器为RPGR^ORF15基因递送的靶细胞群体；因此，选择AAV8衣壳蛋白作为用于XLRP基因疗法的候选病毒血清型。归因于基于AAV2的转基因盒在所有视网膜基因疗法试验的成功，研发了将AAV8衣壳蛋白与基于AAV2的基因组相组合的假型构建体AAV2/8。简单来说，治疗性转基因盒侧接AAV2反向末端重复(ITR)序列，所述AAV2反向末端重复序列协调载体制备期间基因组包装，并且在将治疗性转基因成功递送至靶细胞的核中之后充当第二链合成的起始点。

材料和方法

表5提供了研究中所用的测试和对照物品的描述。

测试系统

使用包括HEK293T、SH-SY5Y以及661W细胞的若干细胞培养物来：

·研究野生型或优化的密码子序列的RPGR^ORF15表达水平

·过表达RPGR蛋白用于序列分析

·产生重组AAV

·测试AAV转导效率

除非另外说明，否则在定期保养的II类细胞培养罩中进行所有细胞培养工作，并且将烧瓶在37℃和5％CO2下在Galaxy R孵育器(Eppendorf AG,Hamburg,Germany)中孵育。除非另外说明，否则所有培养基为新制备的并且在水浴中预升温至37℃。下文描述了所用的个别细胞培养系统。

人胚胎肾293T细胞(HEK293T)：HEK293T为人胚胎肾细胞系。从欧洲认证细胞培养物保藏中心(European Collection of Authenticated Cell Cultures)(ECACC，PublicHealth England,Porton Down,Salisbury,SP4 0JG,UK)获得细胞。

将细胞以2×10⁶个细胞的等分试样在-196℃下在液氮中储存于1.5mL 90％FBS10％二甲亚砜(DMSO)中。必要时，使等分试样在10mL完全细胞培养基(88％DMEM[Invitrogen,Carlsbad,CA]，用2mM L-谷氨酰胺、100IU/mL青霉素以及100μg/mL链霉素以及10％FBS[全部来自Sigma-Aldrich Company Ltd.,Dorset,UK]取代)中复苏，然后快速解冻并且将它们混合至单一细胞悬浮液中。然后将细胞在1200×g下在4℃下离心5分钟，再悬浮于1mL培养基中，并且移液以获得单细胞悬浮液，然后将细胞接种至含所需体积的培养基的T75烧瓶(Sarstedt Inc.,Newton NC,USA)中。24小时之后为细胞馈送新鲜培养基以移除受损并且非附着的细胞并且每天监测，直到实现正常增殖速率(3至5天)。

在已建立稳定增殖后，每2至3天使用新制备的培养基培养HEK293T细胞并且在75％至80％汇合下传代：移除旧培养基，并且将细胞用5mL预升温0.01M磷酸盐缓冲盐水(PBS；Invitrogen Life Technologies Ltd.,Paisley,UK)洗涤一次，然后添加含0.25％胰蛋白酶(Sigma-Aldrich)的2mL的PBS持续2分钟。将细胞加入溶液中并且添加8mL的完全细胞培养基(参见上文)。然后将两毫升此悬浮液转移至新的T75烧瓶并且添加13mL培养基。

人成神经细胞瘤源性细胞：SH-SY5Y细胞为附着的神经母细胞源性细胞。它们是来自从具有成神经细胞瘤的年龄为4岁的雌性的骨髓活检体分离的原始SK-N-SH细胞的亚克隆。最初从ECACC,Public Health England,Porton Down,Salisbury,SP4 0JG,UK获得了SH-SY5Y细胞。

将细胞以2×10⁶个细胞的等分试样在-196℃下在液氮中储存于1.5mL 90％FBS10％DMSO中。如上文关于HEK293T细胞所描述进行复苏，除了培养基组成为：汉姆氏F12(Ham's F12)与伊格尔最小必需培养基(Eagle minimum essential media)的1比1混合物加厄尔氏平衡盐溶液(Earle's Balanced Salt Solution，EMEM[EBSS])加上2mM谷氨酰胺、1％非必需氨基酸、15％FBS、100μg/mL青霉素以及100μg/mL链霉素(全部来自Sigma-Aldrich)。将细胞维持在T75烧瓶中并且以1:50比率分裂为亚汇合培养物(70％至80％)，即以约5×10⁴个细胞/cm²进行接种。除细胞培养基的构成外，如关于HEK293T细胞所描述再次进行分裂。为诱导神经元特异性分化，在接种之后24小时将培养基换成含有1.6×10^-8M十四烷酰佛波醇-13-乙酸酯(TPA)和10-5M视黄酸(RA，两者均来说Sigma-Aldrich)的培养基。

小鼠锥形光感受器样细胞：最初从在人光感受器间视黄醇结合蛋白(IRBP)启动子的控制下表达猿猴病毒(SV)40T抗原的转基因小鼠品系的视网膜肿瘤克隆661W细胞系。它被描述为‘锥形光感受器样细胞系’，因为它被报告展示锥形感光细胞的细胞和生物化学特性，诸如表达短波长和中波长敏感性锥形视蛋白。

根据材料转移协议从Dr Muayyad R.Al-Ubaidi(Oklahoma,USA)进口细胞系并且严格根据其建议进行培养。已将等分试样冷冻保存以便长期储存并且在必要时如关于HEK293T和SH-SY5Y细胞所描述进行复苏，除了培养基组成如下：DMEM(Gibco,ThermoFisher Scientific)加上40μg/L氢化可的松、40μg/L孕酮、0.032g/L腐胺、40μL/Lβ-巯基乙醇、100mg/L青霉素、100mg/L链霉素(全部来自Sigma-Aldrich)以及7.5％FBS(Gibco)。

将细胞维持在T75烧瓶中并且除细胞培养基的构成外，如关于HEK293T细胞所描述再次以1:5比率分裂为亚汇合培养物(70％至80％)。

测试系统的基本原理：这些研究中所用的细胞系HEK293T、SH SY5Y以及661W代表正常人细胞、人神经细胞以及感光细胞。

人HEK293T为用腺病毒5稳定转化的正常人胚胎肾细胞并且从293rd实验(293T)分离单一克隆。293T细胞系含有SV40大T抗原，从而允许高效质粒复制。腺病毒已知比非神经元细胞更高效地转导神经元谱系的细胞，并且HEK293细胞具有不成熟神经元的许多特性。通过转录组分析，发现这些细胞最密切类似于肾上腺细胞(具有一些神经元特征的肾脏相关细胞)。因此，HEK293/HEK293T细胞为由腺病毒或AAV高效转导的胚胎肾上腺前体细胞(具有神经元特性)。人SH-SY5Y来源于骨髓源性细胞系(SK-N-SH)并且常常用作神经元功能的细胞模型。此外，SH-SY5Y细胞具有沿神经元谱系分化的能力。因此，SH-SY5Y细胞代表具有更大数目的神经元特征的模型。

从在光感受器间视黄醇结合蛋白启动子(IRBP)控制下表达SV-40T抗原的视网膜肿瘤克隆鼠661W细胞系。尽管661W细胞的状态为高度转化的，但已显示它们表达感光细胞的若干标记物。因此，这些细胞可用于检验光感受器特异性蛋白同种型RPG-ORF15的表达，并且在移动至动物中之前可提供高度可用的测试系统。

实验方法

转基因检测：将HEK293T细胞用CAG.coRPGRORF15和CAG.wtRPGRORF15质粒构建体转染以通过基于抗体的检测方法对转基因表达水平进行评估。除非另外说明，否则所有基于抗体的检测方法均利用给定稀释度的以下第一和第二抗体。将抗体根据制造商的说明书以等分试样形式加以储存以避免冷冻-解冻循环。表6和表7中描述了所用的抗体。

表6：转基因表达水平的评估中所用的第一抗体.

表7：转基因表达水平的评估中所用的第二抗体

免疫细胞化学和流式细胞术：使用HEK293T细胞通过用相应表达质粒转染来表达转基因(RPGRORF15)RPGRORF15的间接标记需要2个孵育步骤，首先使用针对RPGRORF15的第一抗体，然后使用相容的第二抗体，以及以下浓度的缀合荧光染料(表8)。

表8：用于间接标记RPGR^ORF15的第一和第二抗体组合.

转染之后四十八小时，洗涤细胞，然后在冰冷的0.01M PBS中再悬浮至约1至5×10⁶个细胞/mL。在4℃下在1％(v/v)多聚甲醛(PFA)中固定10分钟之后，在4℃下使细胞在120×g下温和地向下集结成粒持续5分钟。小心地吸出水溶液并且将细胞再悬浮于封闭溶液(含10％[w/v]驴血清的PBS-T[含0.1％Triton-X的0.01M PBS])中。30分钟之后，如上文一般将细胞再次离心并且移除上清液。以适当的浓度添加第一抗体溶液并且将样品在室温下孵育2小时。在3个洗涤步骤(使细胞在4℃下在120×g下向下集结成粒持续5分钟，移除上清液，将细胞再悬浮于冰冷的PBS-T中)之后，在黑暗中在室温下添加荧光染料标记的第二抗体(任选地，将Hoechst 33342染料以1:5000添加至第二抗体溶液中)持续30分钟，随后进行相同洗涤程序。使细胞保持在冰上，直到在同一天进一步加工。

将细胞悬浮液逐滴添加于聚L-细胞溶素包被的载玻片(Gerhard Menzel GmbH,Braunschweig,Germany)上或安装在

Gold(Life Technologies)上用于荧光显微术。或者，在牛津大学的流式细胞计研究室(Flowcytometry Facility of the Universityof Oxford)(The Jenner Institute,Nuffield Department of Medicine)使用CyAn高级数字处理(ADP)LX高效研究流式细胞仪(DakoCytomation,Beckman Coulter Ltd,HighWycombe,UK)对细胞进行流式细胞术。此9色数字流式分析仪具有3个固态激光器(488、635以及405nm)并且每秒分析多达500,000个事件。基于从阳性对照得到的关于＜1的假发现率以及中值荧光强度的数据来选择门控设定。

液相色谱串联质谱法：根据下文所描述的方法，在用相应表达质粒转染HEK293T细胞之后通过液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)对转基因(RPGR^ORF15)的表达进行评估。

转染之后四十八小时，洗涤细胞并且加入含有0.01M PBS的悬浮液中，然后在120×g和4℃下离心10分钟。在将集结粒再悬浮于500μL的0.01M PBS中之后重复进行离心。弃去上清液并且对细胞集结粒进行单一冷冻-解冻循环，然后添加200μL冰冷的放射免疫沉淀分析(RIPA)缓冲液，每10mL的RIPA缓冲液含1片溶解的完整微型的不含EDTA的蛋白酶抑制剂混合片剂(Roche Products Ltd.,Welwyn Garden City,UK)。在电动研磨机(Sigma-Aldrich)上将细胞集结粒用聚丙烯集结粒棒以机械方式破碎并且将细胞片段在14,000rpm和4℃下离心30分钟。使用Pierce^TM二喹啉甲酸(BCA)蛋白质分析试剂盒(ThermoScientific)根据制造商的说明书对上清液进行定量。使用微板程序进行总蛋白的比色定量：首先，制备工作试剂和9种BSA标准物，最终浓度在25至2000μg/mL范围内。在将25μL的每种标准物或未知样品重复移液至白色96微板孔中之后，添加200μL的工作试剂，并且将板在振荡器上混合30秒，然后在37℃下孵育30分钟。将板冷却至室温之后，在Biochrom EZ Read400读板仪上评估562nm下的吸光度。

将样品稀释至1μg/μL总蛋白浓度并且在室温下在利姆里缓冲液(Laemmlibuffer)(Sigma-Aldrich)中变性20分钟。使用7.5％十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶(Criterion^TM TGX^TM预制凝胶，Bio-Rad Laboratories Ltd.,Hemel Hempstead,UK)，每孔加载10μg总蛋白以便在100V下进行电泳持续2小时(SDS-PAGE)。根据制造商的说明书使用EZBlue^TM凝胶染色试剂(SIGMA)将蛋白质染色：将SDS-PAGE凝胶在过量水中冲洗3次，每次持续5分钟以移除SDS，然后将凝胶在室温下在振荡器上在EZBlue凝胶染色试剂中孵育2小时。然后将凝胶在过量水中洗涤2小时，然后获取图像并且用一次性解剖刀切割适当的条带。将条带转移至1.5-mL艾本德管(Eppendorf tube)并且储存在4℃下，直到在牛津大学的蛋白质组学中心(Proteomics Centre of the University of Oxford)(Dunn School ofPathology)进一步加工。将样品使用胰蛋白酶、赖氨酸C、赖氨酸N、胃蛋白酶、甲酸、弹性酶以及V8蛋白酶消化，随后进行LC-MS/MS。顺着序列同一性记录肽片段并且与人蛋白质组相匹配。根据蛋白质组学中心所建立的程序进行所有测试。

蛋白质印迹：根据以下方案通过蛋白质印迹分析对RPGR在转染的HEK293T细胞中的表达水平进行评估。制备来自质粒转染实验的蛋白质样品并且使用SDS-PAGE分离。

将凝胶小心地放至具有0.2μM孔径的聚偏氟乙烯(PVDF)膜(Trans-

Turbo^TMMidi PVDF,Bio-Rad)上，并且使用midi设定(7分钟，在25V下)，根据制造商的说明书使用Trans-Blot Turbo转移启动系统(Bio-Rad)形成蛋白质的印迹。然后根据靶蛋白和加载对照的大小将PVDF膜切成切片，以独立地用相应第一(表6)和/或第二(表7)抗体染色。

将PVDF膜封闭、洗涤并且根据制造商的说明书在SNAP i.d.^TM蛋白质检测系统(Millipore(U.K.)Ltd.,Feltham,UK)中与抗体溶液一起孵育。简单来说，将膜放在适当大小的孔中，加载蛋白质的一侧面向孔的开放室。将含0.1％Triton-X的0.01M PBS(PBS-T)与1％BSA组合。为阻断非特异性结合，将含1％BSA的10mL PBS-T添加至每个孔中并且施加真空以将溶液牵引穿过PVDF膜。将第一抗体溶液(3mL)施加至孔中并且使其在室温下孵育10分钟，然后施加真空，随后用约30mL PBS-T洗涤3次。辣根过氧化物酶(HRP)连接的第二抗体情况下的孵育遵循与第一抗体溶液情况下相同的步骤。在最后的洗涤步骤之后，将膜从孔移去并且与Luminata forte ELISA HRP底物一起孵育以允许激活化学发光。将膜切片在BAS盒2040(FUJIFILM UK Ltd.,Bedford,UK)中小心地再组装，以便暴露于暗室中的CL-Xposure^TM薄膜(Thermo Scientific)上。使薄膜在紧凑型X4自动X射线薄膜处理器(XographHealthcare,Gloucestershire,UK)中显影，并且使用Epson Perfection V30平板扫描器(Epson(UK)Ltd.,Hertfordshire,UK)使用16位颜色深度和1200-dpi分辨率以未压缩标记图像文件模式(TIFF)对所得薄膜进行扫描。

RPGR的密码子优化中所用的方法

对于参考人RPGRORF15核苷酸序列，使用Geneious软件(6.1.6版，用于Mac OSX10.7.5；Biomatters Ltd,Auckland,New Zealand)来检索国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)的共同cd数据库(CCDS)。对完整cds进行OptimumGene^TM算法(GenScript,Piscataway,USA)，以优化对基因表达效率来说至关重要的多个参数，包括密码子使用偏好性、GC含量、CpG二核苷酸含量、mRNA二级结构、隐蔽剪接位点、早熟poly-A位点、内部chi位点和核糖体结合位点、阴性CpG岛、RNA不稳定性基序(ARE)、重复序列(正向重复序列、反向重复序列以及Dyad重复序列)以及可能妨碍克隆的限制位点。图36中展示了所用的密码子频率表。

通过GenScript合成视网膜特异性同种型RPGR^ORF15的密码子优化的人cds。通过OriGene合成RPGR^ORF15的野生型序列并且提供于pCMV6-XL载体骨架中并且在pUC57载体骨架中通过GenScript合成用于克隆。

由牛津大学生物化学系(Department of Biochemistry,University of Oxford)的Source BioScience服务中心通过Sanger测序验证序列。对此，在100ng/μL质粒DNA下制备多个样品并且以3.2pmol/μL添加适当测序引物以启始沿预测序列在不同位置的读段(图37)。根据标准实验室程序分析样品。

密码子优化

基因的cds充当将核酸序列翻译为肽的模板。此过程涉及mRNA转录物、核糖体复合物以及氨基酸中所含的cds，它们结合至tRNA分子。cds中的三个连续核苷酸(例如UUA)构成密码子。tRNA分子具有互补抗密码子序列(例如AAU)，简单地结合至核糖体复合物内的密码子序列并且将它们携带的单一氨基酸(例如亮氨酸)贡献给氨基酸的生长链，从而形成由cds编码的生长肽。

在具有4个可用于编码密码子中3个位置中的每一者的核苷酸的情况下，可形成4³＝64个密码子。因为3个组合编码终止信号(UAA、UAG、UGA)，对于20种氨基酸来说可获得61种可能的组合。此冗余使得在密码子序列UUA、UUG、CUU、CUC、CUA或CUG处添加了翻译成相同氨基酸(例如亮氨酸)的多个密码子。高度表达的基因优先使用所谓的主要密码子。

人RPGR^ORF15 cds编码具有高度重复的富嘌呤突变热点作为C端外显子的1152氨基酸蛋白质。如对富腺嘌呤/鸟嘌呤区域进行直接测序一般，在不引入随机突变的情况下克隆此同种型是困难的，这是因为聚合酶具有在鸟嘌呤重复序列处停止的倾向。对RPGR^ORF15 cds的密码子使用进行优化以增加克隆过程期间的序列保真度，并且提供有可能在临床载体设计中回避先前问题的构建体。另外，通过引入同义主要密码子增加RPGR^ORF15 cds的密码子适应指数(CAI)，其中可能会在不使用转基因盒中的辅助调控元件的情况下产生更高的转基因表达。这是重要的，因为即使没有启动子或聚腺苷酸化位点，RPGR^ORF15的cds也已将空壳AAV基因组的反向末端重复序列之间的可用空间填充了超过四分之三。

针对人RPGR^ORF1的数据库查询的结果为3459-bp长cds(CCDS 35229.1)，称为X连锁色素性视网膜炎GTP酶调控因子同种型C，在X染色体的负链上在Xp21.1处从基因编号6103转录和剪接。

序列具有47.2％的均衡GC含量以及84.1℃的Tm，但相较于具有36％腺嘌呤和35.5％鸟嘌呤的嘧啶，嘌呤过多(72％)。此不平衡甚至在cds内区域性地最显著。在中心ORF15区的一个特定959碱基对片段(图38)中，93％的核苷酸为嘌呤(56％鸟嘌呤＞37％腺嘌呤＞＞6％胞嘧啶＞1％胸苷)。

此有限变异性导致cds的2458与2799之间的区域中的15至33bp长核苷酸序列的高重复率以及多个聚鸟嘌呤运行段(run)(5′-GGGGAGGGG-3′)，它们非常难测序，因为G的长运行段抑制聚合酶展开模板的能力。

重复富嘌呤核苷酸序列的另一结果为氨基酸频率朝向谷氨酸(26.6％)和甘氨酸(15.4％)倾斜，并且所有17种其他氨基酸(不计算甲硫氨酸)在所述情况中仅占0.7％至6.6％。野生型人RPGR^ORF15 cds的这些特性几乎定然会促成基因的基因不稳定性，由此导致在患者群体中发现的突变的高发生率。

RPGR的优化编码序列

wtRPGRORF15的CAI的分析显示0.73的中等CAI有10％使用次要密码子(低丰度密码子)，但仅32％使用主要密码子，即对于智人中的给定氨基酸来说具有最高使用频率的密码子。改变此最佳密码子频率(FOP)，以在密码子优化期间有利于较高密码子质量基团：仅1％次要密码子保持未变并且主要密码子的频率增加至56％。对于coRPGR^ORF15，这使CAI改善至0.87。

除增加CAI之外，密码子优化还移除了MfeI限制位点和若干顺式作用元件，诸如潜在剪接位点(GGTGAT)、4个聚腺苷酸化信号(3个AATAAA和1个ATTAAA)、2个polyT(TTTTTT)以及1个polyA(AAAAAAA)位点。对GC含量和不利峰进行优化以延长mRNA的半衰期。使得不能形成降低核糖体结合几率并且使mRNA不太稳定的二级结构(茎-环)。在大多数改变发生在ORF15区中的情况下，wtRPGR^ORF15与coRPGR^ORF15之间的成对同一性％为77.2％(图39)。

密码子优化的RPGR显示比野生型RPGR更高的序列保真度

在将合成的coRPGR^ORF15序列成功亚克隆至载体BioLabs pAAV2质粒中以便进行下游AAV载体制备的必要步骤中，所述序列未显示序列偏差。在GenScript合成含有coRPGR^ORF15的原始质粒产物耗时约6周。与coRPGR^ORF15相比，通过GenScript合成wtRPGR^ORF15消耗了约双倍的时间(约12周)。在亚克隆至pAAV2质粒中的过程中涉及wtRPGR^ORF15的所有后续步骤均显示具有恰当片段尺寸的克隆的数目较少：在用wtRPGR^ORF15转化之后在XL10-Gold细菌的24个菌落中，仅3个样品具有预期片段尺寸(图40)。相比之下，coRPGR^ORF15的克隆产生了24个阳性克隆中的18个。此外，来自coRPGR^ORF15微制剂的质粒DNA浓度高约50％(n＝24，未配对，2尾t检验：p＝0.0004)，而260/280比率保持未变。

在亚克隆的各个阶段对wtRPGR^ORF15构建体进行测序因ORF15区内的重复性和聚G运行段而成为重大挑战。一些区域需要使用脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)测序来改善在具有长鸟嘌呤运行段的富嘌呤区(例如图38)中的通读。虽然此技术提供了更好的通读，但更可能引入条带压缩(标准桑格反应(Sanger reaction)中使用类似分子脱氧次黄苷三磷酸[dITP]替代dGTP的原因)。

在8个独立的克隆实验(每个构建体n＝4)中，平均30次序列运行为得到野生型构建体的完全覆盖所必需，而对于coRPGR^ORF15序列来说，平均8次序列运行就足够了。序列数据与参考物的比对揭示了wtRPGR^ORF15中的(主要地)单一核苷酸的许多缺失、插入以及点突变，但coRPGR^ORF15中没有(表9)。

表9提供了克隆期间DNA质粒改变的变化的比较。

	wtRPGR<sup>ORF15</sup>	coRPGR<sup>ORF15</sup>
			缺失(平均值[范围])	1.5(0-4)	无
插入(平均值[范围])	0.5(0-1)	无
			点突变(平均值[范围])	17.8(9-33)	无
总计(平均值[范围])	19.75(9-38)	无

相较于coRPGR^ORF15，在wtRPGR^ORF15中，包括Phred质量得分Q20、Q30以及Q40(Q20指示碱基识别(base call)准确性为99％，Q30为99.9％，并且Q40为99.99％)(表10)；平均置信度；以及预期错误的数目的关键参数显著较弱(表11)。数据显示为平均值±标准偏差，针对多重比较使用假发现率(FDR)校正法对p值进行校正。

表10提供了Phred质量得分

表11提供了平均置信度和预期错误

	wtRPGR<sup>ORF15</sup>	coRPGR<sup>ORF15</sup>	p值[FDR校正]
				置信度平均值	49.1±1.2	52.4±1.0	0.0044
预期错误	82.9±25.1	14.4±5.1	0.0023

coRPGRORF15的优良序列保真度的最后证据由曼彻斯特的国家遗传学示范实验室(National Genetics Reference Laboratory，NGRL)给出。在将CAG启动子区(1527bp)换为小得多的人视紫红蛋白激酶启动子(199bp)以帮助重组制备AAV，以及定位至感光细胞之后，将两种构建体(RK.coRPGR^ORF15和RK.wtRPGR^ORF15)与适当的引物一起送至NGRL并且使员工不知晓序列的身份。在作为模板的RK.wtRPGR^ORF15上运行34个序列反应之后，累积数据显示74个不明确的核苷酸识别(例如鸟嘌呤与腺嘌呤的信号相同)以及6个潜在插入/缺失突变(4个潜在插入和2个潜在缺失)，这些全部在富嘌呤ORF15区(RPGR^ORF15的突变热点)中发现。相比之下，coRPGRORF15构建体经测序具有至少2倍覆盖度，并且在质粒中发现刚好一半数目的序列反应并且未发现突变。

密码子优化的RPGR产生比野生型RPGR更高的表达水平

为了分析增加的密码子适应指数(CAI)对RPGR^ORF15的表达水平的影响，在头对头比较中使用CAG.coRPGR^ORF15和CAG.wtRPGR^ORF15质粒构建体对HEK293T细胞进行转染实验。HEK293T细胞来源于人，并且因此共享物种特异性密码子频率分布，这充当针对智人的优化的基础。假定与用野生型构建体CAG.wtRPGR^ORF15转染的细胞相比，用CAG.coRPGR^ORF15转染的细胞产生更多的RPGR^ORF15。为测试此假设，采用若干实验途径，以便定量转染细胞中的RPGR^ORF15。首先，将HEK293T细胞用CAG.coRPGR^ORF15和CAG.wtRPGR^ORF15质粒构建体转染，并且加以处理用于免疫细胞化学(ICC)分析，以确定转基因检测是否可通过抗体结合来进行检测。图41示出了此类实验的代表图，其中将细胞用仅培养基(阴性对照)、CAG.wtRPGR^ORF15(wt)或CAG.coRPGR^ORF15(co)转染，并且用抗RPGR染色。

使用蛋白质印迹分析来评估在来自转染HEK293T细胞的全细胞溶解产物中的表达水平。四次独立的6孔板转染(每次均具有针对wtRPGR和coRPGR的技术重复)产生每种构建体8个中的总计n个。将来自这些溶解产物的等分试样平行地在2份凝胶上运行，并且比较所得条带的平均信号强度(图42)。夏皮罗-威克尔检验(Shapiro-Wilk test)维持了关于数据集合的正态性的零假设(p＝0.06至0.19)，并且单因素方差分析显示反映密码子优化的构建体的平均信号强度＝32.0±8.28任意单位[AU](平均值±标准误差)与来自用野生型构建体转染的细胞的信号＝8.11±1.63AU之间的差异的统计显著性(p＝0.01，n＝8)。

还使用荧光激活细胞分选(FACS)来测量RPGR^ORF15在转染HEK293T细胞中的表达水平。在如上文所提到的类似装备中，进行使用6孔板的3个独立实验，每个实验均具有含有用CAG.wtRPGR^ORF15、CAG.coRPGR^ORF15、CAG.eGFP(作为转染的阳性对照)或仅培养基(作为阴性对照)转染的HEK293T细胞的孔的3个技术重复。

用CAG.eGFP转染的细胞在收获时显示eGFP表达，表明转染为成功的并且细胞具有足够的时间来产生质粒编码的转基因。在ICC方案之后，使用这些细胞来设定针对远红外范围内的荧光的FACS门控的下端，因为它们仅与第二抗体一起孵育。然后使用阳性对照(暴露于兔抗β-肌动蛋白和驴抗兔加上缀合的Alexa-Fluor 635的原初HEK293T细胞)来确定荧光门控设定的上端。与用野生型构建体CAG.wtRPGR^ORF15转染的细胞相比，用CAG.coRPGR^ORF15构建体转染的细胞显示更高的荧光强度(图43)。夏皮罗-威克尔检验排除了关于数据集合的正态性的零假设(p＜0.05)，并且克鲁斯卡尔沃利斯非参数检验(Kruskal Wallis non-parametric test)证实了队列之间的稳固统计差异(p＜0.01，n＝9)。

实施例6：黄斑内和黄斑附近的治疗功效的微视野检查测量

用本公开的包含AAV-coRPGR^ORF15粒子的组合物对受试者进行处理。在处理之前，进行所有68个位点的基线微视野检查测量。在处理之后在各个时间点，进行所有68个位点的跟踪微视野检查测量。图44至51提供了此研究的结果，其中针对治疗功效对68个位点的整个视野与中心16位点集合进行了评估。

实施例7：如由视网膜厚度所示的治疗功效的OCT测量

如由根据OCT分析的视网膜厚度的双线的出现所证实，Xirius分析的结果揭示了接受处理的参与者的改善的治疗结果。图52至68中提供了证实此发现的数据。

实施例8：用于色素性视网膜炎的基因疗法的临床试验

6.0 研究目标和终点

6.1 目标

研究的目标为评估在患有XLRP的受试者中单一视网膜下注射AAV8-RPGR的安全性、耐受性以及功效。

终点

主要功效终点

主要功效终点为在12个月时通过黄斑完整性评估(MAIA)微视野检查评估的10-2栅格的16个中心位点中的≥5个位点处相较于基线改善≥7dB的研究眼的比例。

安全性终点

主要安全性终点为在12个月时间内TEAE的发生率。

次要终点

·在1、2、3、6以及9个月时通过MAIA微视野检查评估的10-2栅格的16个中心位点中的≥5个位点处相较于基线改善≥7dB的研究眼的比例

·在1、2、3、6、9以及12个月时通过MAIA微视野检查评估的10-2栅格的68个位点中的≥5个位点处相较于基线改善≥7dB的研究眼的比例

·在1、2、3、6、9以及12个月时微视野检查相较于基线的变化

·在1、2、3、6、9以及12个月时BCVA相较于基线的变化

·在1、2、3、6、9以及12个月时由Octopus 900视野计评估的视野相较于基线的变化

探索性端点

·在6和12个月时多亮度可移动测试(MLMT)相较于基线的变化

·在3和12个月时25项视觉功能问卷(VFQ-25)相较于基线的变化(仅在成人中)

·在1、2、3、6、9以及12个月时SD-OCT相较于基线的变化

·在1、2、3、6、9以及12个月时眼底自体荧光相较于基线的变化

·在1、3、6、9以及12个月时其他解剖学和功能结果相较于基线的变化

研究性计划

剂量扩展，型式9

将受试者以1:1:1分配比随机化至高剂量组(2.5×10^11gp)、低剂量组(5×10^10gp)以及未处理组。在处理组内，主办者、研究者以及受试者将不知晓(即双盲的)分配的剂量。为进一步使处理和未处理眼睛的评估的潜在偏差减至最小，在筛选/基线访视(访视1)时以及从第3个月(访视6)起的所有主观眼科评估将由设盲的评估者进行。

将对每个受试者的两只眼睛收集研究数据。由于处理需要在全身麻醉下进行侵入性手术程序，对于研究程序(即玻璃体切除术和视网膜下注射)将不对主办者、研究者以及受试者设盲，然而在处理组内，主办者、研究者以及受试者将不知晓分配的剂量。为进一步使处理和未处理眼睛的评估的潜在偏差减至最小，在筛选/基线访视(访视1)时以及从第3个月(访视6)起的所有主观眼科评估将由设盲的评估者进行。

纳入准则

1.受试者/父母/法定监护人(如果适用)愿意并且能够提供关于参与研究的知情同意/认可

2.为男性，年龄≥10岁，并且能够遵从并且适当地进行所有研究评估

3.有RPGR基因中的病原性突变的记录

4.两只眼睛中的BCVA满足以下准则：

·优于或等于34个ETDRS字母的BCVA(等效于斯内伦敏锐度优于或等于6/60或20/200)。

5.如通过微视野检查所评估研究眼中的平均总视网膜敏感度≥0.1dB并且≤8dB

排除准则∶

1.在任一眼睛中具有弱视史

2.在用AAV8-RPGR处理之后3个月的时间内不愿意使用屏障避孕方法(如果适用)或戒除性交

a.临床上显著的白内障

b.对经口皮质类固醇有禁忌

c.不适合进行视网膜手术

研究处理

将受试者分配给以下中的一者：高剂量(2.5×10^11gp)、低剂量(5×10^10gp)或未处理对照实验组。研究药物与实施例3.9.5随机化中相同。

研究设盲

由有适当资格的设盲评估者进行用作功效终点(BCVA、LLVA、微视野检查、对比敏感度以及VFQ-25)的眼部评估。对于手术后立即访视，对评估者设盲将不可行，因为手术的临床迹象将为明显的(即，发红、膨胀)。因此，在访视3(第1天)、访视4(第7天)、访视5(第1个月)以及访视5.9(第2个月)时，未设盲的评估者进行所有眼部评估。从访视6(第3个月)起，使用设盲的评估者，因为手术的迹象将已消散并且在临床上将不可能将尚未进行手术的那些受试者与已进行手术并且接受活性处理的那些受试者区分开。

用AAV8-RPGR处理后第3、6、9以及12个月时的设盲评估

·最佳矫正视敏度

·低亮度视敏度

·微视野检查

·对比敏感度

·25项视觉功能问卷

9.8伴随疗法

为受试者开出一定疗程的经口皮质类固醇。此外，在手术时，可用至多1mL的曲安西龙(40mg/mL溶液)对受试者(成人和儿科)进行处理，所述溶液必须经由深特农氏囊下方法进行施用。

对于成人，最初21天(从手术之前3天起)开出60mg的经口泼尼松/泼尼松龙，随后如下每周渐减，每种处理总计9周：

第-3天至第17天(21天)：60mg，口服，每天一次

第18天至第24天(7天)：50mg，口服，每天一次

第25天至第31天(7天)：40mg，口服，每天一次

第32天至第38天(7天)：30mg，口服，每天一次

第39天至第45天(7天)：20mg，口服，每天一次

第46天至第52天(7天)：10mg，口服，每天一次

第53天至第59天(7天)：5mg，口服，每天一次。

如果在第2个月访视(访视5.9)时观测到炎症，那么应基于受试者的临床情况和研究者的判断经由经口和/或眼内途径重新开始皮质类固醇疗法。

对于儿科受试者，在手术之前3天开始经口泼尼松龙/泼尼松。起始剂量将以受试者的千克重量为基础，达到最大60mg起始剂量(四舍五入至最靠近的1mg)。后续剂量将具有乘数，以在再一个6周内提供适当的渐减，处理总计9周。参见以下用于儿科受试者的渐减方案：

第-3天至第17天(21天)：起始剂量(SD)1mg/kg，口服/每天一次(最大剂量为60mg，每天一次)

第18天至第24天(7天)：SD x0.83mg，口服，每天一次

第25天至第31天(7天)：SD x0.67mg，口服，每天一次

第32天至第38天(7天)：SD x0.5mg，口服，每天一次

第39天至第45天(7天)：SD x0.33mg，口服，每天一次

第46天至第52天(7天)：SD x0.17mg，口服，每天一次

第53天至第59天(7天)：SD x0.08mg，口服，每天一次

功效的评估

最佳矫正视敏度

为评估在研究时间内VA的变化，使用ETDRS VA图表评估两只眼睛的BCVA。

在瞳孔扩张之前进行BCVA测试，并且应在测量BCVA之前进行距离折射。最初，在离图表4米的距离处阅读字母。如果在4米处读了<20个字母，那么应进行在1米处的测试。BCVA应报道为受试者正确阅读的字母数目。

在筛选/基线访视时，如果眼睛BCVA的优于或等于34个ETDRS字母，那么它们将适合进行研究。

对于BCVA，评估者将有适当资格进行评估。

如果与XOLARIS研究访视(如果适用)相比，在研究眼中访视1(筛选/基线)时的BCVA值增加或减小≥±10个字母，那么必须将BCVA再重复2次，从而在访视1时产生总共3次BCVA测量。为有助于额外的BCVA测量，此访视应历时2天进行，其中在第1天测量两次BCVA并且在第2天测量一次(在瞳孔扩张之前)。所有3个BCVA值必须均记录在eCRF中。将使用最高得分来确定受试者合格性。

如果与先前XOLARIS研究访视相比，研究眼中访视1(筛选/基线)时的BCVA值相差＜±10个字母，那么将收集一次BCVA并且将不重复。

如果受试者先前不在XOLARIS研究中，那么必须一式三份地进行基线处的BCVA评估。

谱域光学相干断层扫描(SD-OCT)

如实施例3中一般进行SD-OCT。

眼底自体荧光

如实施例3中一般获取眼底自体荧光图像。

MAIA微视野检查

如实施例3中一般进行MAIA微视野检查。

视野测试(视野检查)

在两只眼睛中对视野进行评估。将在访视1时历时2天时间一式三份地对所有受试者的视野进行评估。使用Octopus 900视野计来评估视野。

对比敏感度

如实施例3中一般测量对比敏感度。

低亮度视敏度

如实施例3中一般测量低亮度视敏度。

多亮度可移动测试

在访视1(筛选/基线)、访视7(第6个月)以及访视9(第12个月)时进行MLMT。评估包括通过路线的时间、碰到障碍的次数以及在不同照明条件下通过的能力。

视觉功能问卷

成人受试者在访视1(筛选/基线)、访视6(第3个月)以及访视9(第12个月)或ET访视(如果适用)时完成VFQ-25。

安全性的评估

如实施例312.2.4中一般进行安全性评估。

功效分析

功效评估在本质上为眼部的并且因此根据眼睛(研究眼和对侧眼)列入表内。将使用描述统计学对功效数据进行概述。

根据访视并且根据眼睛将视网膜敏感度的改善以及视网膜敏感度相较于基线的变化列入表内。

对于中心栅格(即，中心16个位点)与整个栅格(即，所有68个位点)两者来说，使用费舍尔精确-博世卢检验(Fisher Exact-Boschloo test)加上β＝0.001的伯杰-布斯校正(Berger-Boos correction)(Berger 1994)，将视网膜敏感度改善的眼睛的比例在研究实验组(高剂量相较于未处理；低剂量相较于未处理)之间进行比较。此外，将研究实验组之间的比例的差异与其使用Miettinen和Nurminen(Miettinen 1985)的方法计算的对应95％CI一起呈现。

在中心栅格与整个栅格两者中，使用包括基线值和研究实验组(高剂量、低剂量以及未处理组)作为协变量的ANCOVA模型，将平均敏感度相较于基线的变化在研究实验组之间相比较。研究实验组之间的平均值的差异以及其95％CI将来源于相同的ANCOVA模型。

以引用的方式并入

除非明确排除或以其他方式限制，否则本文中引用的每个文件包括任何交叉引用或相关的专利或申请在此以全文引用的方式并入本文中。对任何文件的引用并非承认它相对于本文公开或要求的任何发明为先前技术，或者它单独或以与任何其他一个或多个参考文献的任何组合的形式教示、建议或公开任何此类发明。另外，在此文件中的术语的任何含义或定义与以引用的方式并入的文件中的相同术语的任何含义或定义冲突的情况下，应以此文件中分配给所述术语的含义或定义为准。

其他实施方案

虽然已对本公开的特定实施方案进行了说明和描述，但可在不背离本公开的精神和范围的情况下作出各种其他改变和修改。随附权利要求的范围包括在本发明范围内的所有此类改变和修改。

序列表

<110> 夜星克有限公司(NightstaRx Limited)

G·S·鲁滨逊(Robinson, Gregory S.)

T·昂吉(Ong, Tuyen)

<120> 用于治疗色素性视网膜炎的组合物和方法

<130> NIGH-016/N01WO 330366-2144

<150> US 62/830,106

<151> 2019-04-05

<150> US 62/734,746

<151> 2018-09-21

<160> 18

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 199

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 1

gggccccaga agcctggtgg ttgtttgtcc ttctcagggg aaaagtgagg cggccccttg 60

gaggaagggg ccgggcagaa tgatctaatc ggattccaag cagctcaggg gattgtcttt 120

ttctagcacc ttcttgccac tcctaagcgt cctccgtgac cccggctggg atttagcctg 180

gtgctgtgtc agccccggg 199

<210> 2

<211> 1152

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 2

Met Arg Glu Pro Glu Glu Leu Met Pro Asp Ser Gly Ala Val Phe Thr

1 5 10 15

Phe Gly Lys Ser Lys Phe Ala Glu Asn Asn Pro Gly Lys Phe Trp Phe

20 25 30

Lys Asn Asp Val Pro Val His Leu Ser Cys Gly Asp Glu His Ser Ala

35 40 45

Val Val Thr Gly Asn Asn Lys Leu Tyr Met Phe Gly Ser Asn Asn Trp

50 55 60

Gly Gln Leu Gly Leu Gly Ser Lys Ser Ala Ile Ser Lys Pro Thr Cys

65 70 75 80

Val Lys Ala Leu Lys Pro Glu Lys Val Lys Leu Ala Ala Cys Gly Arg

85 90 95

Asn His Thr Leu Val Ser Thr Glu Gly Gly Asn Val Tyr Ala Thr Gly

100 105 110

Gly Asn Asn Glu Gly Gln Leu Gly Leu Gly Asp Thr Glu Glu Arg Asn

115 120 125

Thr Phe His Val Ile Ser Phe Phe Thr Ser Glu His Lys Ile Lys Gln

130 135 140

Leu Ser Ala Gly Ser Asn Thr Ser Ala Ala Leu Thr Glu Asp Gly Arg

145 150 155 160

Leu Phe Met Trp Gly Asp Asn Ser Glu Gly Gln Ile Gly Leu Lys Asn

165 170 175

Val Ser Asn Val Cys Val Pro Gln Gln Val Thr Ile Gly Lys Pro Val

180 185 190

Ser Trp Ile Ser Cys Gly Tyr Tyr His Ser Ala Phe Val Thr Thr Asp

195 200 205

Gly Glu Leu Tyr Val Phe Gly Glu Pro Glu Asn Gly Lys Leu Gly Leu

210 215 220

Pro Asn Gln Leu Leu Gly Asn His Arg Thr Pro Gln Leu Val Ser Glu

225 230 235 240

Ile Pro Glu Lys Val Ile Gln Val Ala Cys Gly Gly Glu His Thr Val

245 250 255

Val Leu Thr Glu Asn Ala Val Tyr Thr Phe Gly Leu Gly Gln Phe Gly

260 265 270

Gln Leu Gly Leu Gly Thr Phe Leu Phe Glu Thr Ser Glu Pro Lys Val

275 280 285

Ile Glu Asn Ile Arg Asp Gln Thr Ile Ser Tyr Ile Ser Cys Gly Glu

290 295 300

Asn His Thr Ala Leu Ile Thr Asp Ile Gly Leu Met Tyr Thr Phe Gly

305 310 315 320

Asp Gly Arg His Gly Lys Leu Gly Leu Gly Leu Glu Asn Phe Thr Asn

325 330 335

His Phe Ile Pro Thr Leu Cys Ser Asn Phe Leu Arg Phe Ile Val Lys

340 345 350

Leu Val Ala Cys Gly Gly Cys His Met Val Val Phe Ala Ala Pro His

355 360 365

Arg Gly Val Ala Lys Glu Ile Glu Phe Asp Glu Ile Asn Asp Thr Cys

370 375 380

Leu Ser Val Ala Thr Phe Leu Pro Tyr Ser Ser Leu Thr Ser Gly Asn

385 390 395 400

Val Leu Gln Arg Thr Leu Ser Ala Arg Met Arg Arg Arg Glu Arg Glu

405 410 415

Arg Ser Pro Asp Ser Phe Ser Met Arg Arg Thr Leu Pro Pro Ile Glu

420 425 430

Gly Thr Leu Gly Leu Ser Ala Cys Phe Leu Pro Asn Ser Val Phe Pro

435 440 445

Arg Cys Ser Glu Arg Asn Leu Gln Glu Ser Val Leu Ser Glu Gln Asp

450 455 460

Leu Met Gln Pro Glu Glu Pro Asp Tyr Leu Leu Asp Glu Met Thr Lys

465 470 475 480

Glu Ala Glu Ile Asp Asn Ser Ser Thr Val Glu Ser Leu Gly Glu Thr

485 490 495

Thr Asp Ile Leu Asn Met Thr His Ile Met Ser Leu Asn Ser Asn Glu

500 505 510

Lys Ser Leu Lys Leu Ser Pro Val Gln Lys Gln Lys Lys Gln Gln Thr

515 520 525

Ile Gly Glu Leu Thr Gln Asp Thr Ala Leu Thr Glu Asn Asp Asp Ser

530 535 540

Asp Glu Tyr Glu Glu Met Ser Glu Met Lys Glu Gly Lys Ala Cys Lys

545 550 555 560

Gln His Val Ser Gln Gly Ile Phe Met Thr Gln Pro Ala Thr Thr Ile

565 570 575

Glu Ala Phe Ser Asp Glu Glu Val Glu Ile Pro Glu Glu Lys Glu Gly

580 585 590

Ala Glu Asp Ser Lys Gly Asn Gly Ile Glu Glu Gln Glu Val Glu Ala

595 600 605

Asn Glu Glu Asn Val Lys Val His Gly Gly Arg Lys Glu Lys Thr Glu

610 615 620

Ile Leu Ser Asp Asp Leu Thr Asp Lys Ala Glu Val Ser Glu Gly Lys

625 630 635 640

Ala Lys Ser Val Gly Glu Ala Glu Asp Gly Pro Glu Gly Arg Gly Asp

645 650 655

Gly Thr Cys Glu Glu Gly Ser Ser Gly Ala Glu His Trp Gln Asp Glu

660 665 670

Glu Arg Glu Lys Gly Glu Lys Asp Lys Gly Arg Gly Glu Met Glu Arg

675 680 685

Pro Gly Glu Gly Glu Lys Glu Leu Ala Glu Lys Glu Glu Trp Lys Lys

690 695 700

Arg Asp Gly Glu Glu Gln Glu Gln Lys Glu Arg Glu Gln Gly His Gln

705 710 715 720

Lys Glu Arg Asn Gln Glu Met Glu Glu Gly Gly Glu Glu Glu His Gly

725 730 735

Glu Gly Glu Glu Glu Glu Gly Asp Arg Glu Glu Glu Glu Glu Lys Glu

740 745 750

Gly Glu Gly Lys Glu Glu Gly Glu Gly Glu Glu Val Glu Gly Glu Arg

755 760 765

Glu Lys Glu Glu Gly Glu Arg Lys Lys Glu Glu Arg Ala Gly Lys Glu

770 775 780

Glu Lys Gly Glu Glu Glu Gly Asp Gln Gly Glu Gly Glu Glu Glu Glu

785 790 795 800

Thr Glu Gly Arg Gly Glu Glu Lys Glu Glu Gly Gly Glu Val Glu Gly

805 810 815

Gly Glu Val Glu Glu Gly Lys Gly Glu Arg Glu Glu Glu Glu Glu Glu

820 825 830

Gly Glu Gly Glu Glu Glu Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu Glu Gly Glu

835 840 845

Gly Glu Glu Glu Glu Gly Glu Gly Lys Gly Glu Glu Glu Gly Glu Glu

850 855 860

Gly Glu Gly Glu Glu Glu Gly Glu Glu Gly Glu Gly Glu Gly Glu Glu

865 870 875 880

Glu Glu Gly Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu Gly Glu Gly Glu Gly Glu

885 890 895

Glu Glu Glu Gly Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu Gly Glu Gly Glu Gly

900 905 910

Glu Glu Glu Glu Gly Glu Gly Lys Gly Glu Glu Glu Gly Glu Glu Gly

915 920 925

Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu Glu Gly Glu Gly Glu Gly Glu Asp Gly

930 935 940

Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu Glu Gly Glu Trp Glu Gly Glu Glu Glu

945 950 955 960

Glu Gly Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu Gly Glu Gly Glu Gly Glu Glu

965 970 975

Gly Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu Glu Gly Glu Gly Glu Gly Glu Glu

980 985 990

Glu Glu Gly Glu Glu Glu Gly Glu Glu Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu

995 1000 1005

Gly Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu Glu Glu Gly Glu Val Glu Gly

1010 1015 1020

Glu Val Glu Gly Glu Glu Gly Glu Gly Glu Gly Glu Glu Glu Glu

1025 1030 1035

Gly Glu Glu Glu Gly Glu Glu Arg Glu Lys Glu Gly Glu Gly Glu

1040 1045 1050

Glu Asn Arg Arg Asn Arg Glu Glu Glu Glu Glu Glu Glu Gly Lys

1055 1060 1065

Tyr Gln Glu Thr Gly Glu Glu Glu Asn Glu Arg Gln Asp Gly Glu

1070 1075 1080

Glu Tyr Lys Lys Val Ser Lys Ile Lys Gly Ser Val Lys Tyr Gly

1085 1090 1095

Lys His Lys Thr Tyr Gln Lys Lys Ser Val Thr Asn Thr Gln Gly

1100 1105 1110

Asn Gly Lys Glu Gln Arg Ser Lys Met Pro Val Gln Ser Lys Arg

1115 1120 1125

Leu Leu Lys Asn Gly Pro Ser Gly Ser Lys Lys Phe Trp Asn Asn

1130 1135 1140

Val Leu Pro His Tyr Leu Glu Leu Lys

1145 1150

<210> 3

<211> 3459

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 在实验室制备-密码子优化的RPGR ORF15

<400> 3

atgagagagc cagaggagct gatgccagac agtggagcag tgtttacatt cggaaaatct 60

aagttcgctg aaaataaccc aggaaagttc tggtttaaaa acgacgtgcc cgtccacctg 120

tcttgtggcg atgagcatag tgccgtggtc actgggaaca ataagctgta catgttcggg 180

tccaacaact ggggacagct ggggctggga tccaaatctg ctatctctaa gccaacctgc 240

gtgaaggcac tgaaacccga gaaggtcaaa ctggccgctt gtggcagaaa ccacactctg 300

gtgagcaccg agggcgggaa tgtctatgcc accggaggca acaatgaggg acagctggga 360

ctgggggaca ctgaggaaag gaataccttt cacgtgatct ccttctttac atctgagcat 420

aagatcaagc agctgagcgc tggctccaac acatctgcag ccctgactga ggacgggcgc 480

ctgttcatgt ggggagataa ttcagagggc cagattgggc tgaaaaacgt gagcaatgtg 540

tgcgtccctc agcaggtgac catcggaaag ccagtcagtt ggatttcatg tggctactat 600

catagcgcct tcgtgaccac agatggcgag ctgtacgtct ttggggagcc cgaaaacgga 660

aaactgggcc tgcctaacca gctgctgggc aatcaccgga caccccagct ggtgtccgag 720

atccctgaaa aagtgatcca ggtcgcctgc gggggagagc atacagtggt cctgactgag 780

aatgctgtgt ataccttcgg actgggccag tttggccagc tggggctggg aaccttcctg 840

tttgagacat ccgaaccaaa agtgatcgag aacattcgcg accagactat cagctacatt 900

tcctgcggag agaatcacac cgcactgatc acagacattg gcctgatgta tacctttggc 960

gatggacgac acgggaagct gggactggga ctggagaact tcactaatca ttttatcccc 1020

accctgtgtt ctaacttcct gcggttcatc gtgaaactgg tcgcttgcgg cgggtgtcac 1080

atggtggtct tcgctgcacc tcataggggc gtggctaagg agatcgaatt tgacgagatt 1140

aacgatacat gcctgagcgt ggcaactttc ctgccataca gctccctgac ttctggcaat 1200

gtgctgcaga gaaccctgag tgcaaggatg cggagaaggg agagggaacg ctctcctgac 1260

agtttctcaa tgcgacgaac cctgccacct atcgagggaa cactgggact gagtgcctgc 1320

ttcctgccta actcagtgtt tccacgatgt agcgagcgga atctgcagga gtctgtcctg 1380

agtgagcagg atctgatgca gccagaggaa cccgactacc tgctggatga gatgaccaag 1440

gaggccgaaa tcgacaactc tagtacagtg gagtccctgg gcgagactac cgatatcctg 1500

aatatgacac acattatgtc actgaacagc aatgagaaga gtctgaaact gtcaccagtg 1560

cagaagcaga agaaacagca gactattggc gagctgactc aggacaccgc cctgacagag 1620

aacgacgata gcgatgagta tgaggaaatg tccgagatga aggaaggcaa agcttgtaag 1680

cagcatgtca gtcaggggat cttcatgaca cagccagcca caactattga ggctttttca 1740

gacgaggaag tggagatccc cgaggaaaaa gagggcgcag aagattccaa ggggaatgga 1800

attgaggaac aggaggtgga agccaacgag gaaaatgtga aagtccacgg aggcaggaag 1860

gagaaaacag aaatcctgtc tgacgatctg actgacaagg ccgaggtgtc cgaaggcaag 1920

gcaaaatctg tcggagaggc agaagacgga ccagagggac gaggggatgg aacctgcgag 1980

gaaggctcaa gcggggctga gcattggcag gacgaggaac gagagaaggg cgaaaaggat 2040

aaaggccgcg gggagatgga acgacctgga gagggcgaaa aagagctggc agagaaggag 2100

gaatggaaga aaagggacgg cgaggaacag gagcagaaag aaagggagca gggccaccag 2160

aaggagcgca accaggagat ggaagagggc ggcgaggaag agcatggcga gggagaagag 2220

gaagagggcg atagagaaga ggaagaggaa aaagaaggcg aagggaagga ggaaggagag 2280

ggcgaggaag tggaaggcga gagggaaaag gaggaaggag aacggaagaa agaggaaaga 2340

gccggcaaag aggaaaaggg cgaggaagag ggcgatcagg gcgaaggcga ggaggaagag 2400

accgagggcc gcggggaaga gaaagaggag ggaggagagg tggagggcgg agaggtcgaa 2460

gagggaaagg gcgagcgcga agaggaagag gaagagggcg agggcgagga agaagagggc 2520

gagggggaag aagaggaggg agagggcgaa gaggaagagg gggagggaaa gggcgaagag 2580

gaaggagagg aaggggaggg agaggaagag ggggaggagg gcgaggggga aggcgaggag 2640

gaagaaggag agggggaagg cgaagaggaa ggcgaggggg aaggagagga ggaagaaggg 2700

gaaggcgaag gcgaagagga gggagaagga gagggggagg aagaggaagg agaagggaag 2760

ggcgaggagg aaggcgaaga gggagagggg gaaggcgagg aagaggaagg cgagggcgaa 2820

ggagaggacg gcgagggcga gggagaagag gaggaagggg aatgggaagg cgaagaagag 2880

gaaggcgaag gcgaaggcga agaagagggc gaaggggagg gcgaggaggg cgaaggcgaa 2940

ggggaggaag aggaaggcga aggagaaggc gaggaagaag agggagagga ggaaggcgag 3000

gaggaaggag agggggagga ggagggagaa ggcgagggcg aagaagaaga agagggagaa 3060

gtggagggcg aagtcgaggg ggaggaggga gaaggggaag gggaggaaga agagggcgaa 3120

gaagaaggcg aggaaagaga aaaagaggga gaaggcgagg aaaaccggag aaatagggaa 3180

gaggaggaag aggaagaggg aaagtaccag gagacaggcg aagaggaaaa cgagcggcag 3240

gatggcgagg aatataagaa agtgagcaag atcaaaggat ccgtcaagta cggcaagcac 3300

aaaacctatc agaagaaaag cgtgaccaac acacagggga atggaaaaga gcagaggagt 3360

aagatgcctg tgcagtcaaa acggctgctg aagaatggcc catctggaag taaaaaattc 3420

tggaacaatg tgctgcccca ctatctggaa ctgaaataa 3459

<210> 4

<211> 270

<212> DNA

<213> 家牛(Bos taurus)

<400> 4

tcgctgatca gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt gcccctcccc 60

cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat aaaatgagga 120

aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg tggggcagga 180

cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg tgggctctat 240

ggcttctgag gcggaaagaa ccagctgggg 270

<210> 5

<211> 119

<212> DNA

<213> 腺相关病毒2 (Adeno-associated virus 2)

<400> 5

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcgtcgg gcgacctttg gtcgcccggc 60

ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac tccatcacta ggggttcct 119

<210> 6

<211> 130

<212> DNA

<213> 腺相关病毒2 (Adeno-associated virus 2)

<400> 6

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 60

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 120

gagcgcgcag 130

<210> 7

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 共同Kozak序列

<400> 7

ggccaccatg 10

<210> 8

<211> 4450

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 质粒构建体

<400> 8

ctgcgcgctc gctcgctcac tgaggccgcc cgggcgtcgg gcgacctttg gtcgcccggc 60

ctcagtgagc gagcgagcgc gcagagaggg agtggccaac tccatcacta ggggttcctg 120

cggcaattca gtcgataact ataacggtcc taaggtagcg atttaaatac gcgctctctt 180

aaggtagccc cgggacgcgt caattggggc cccagaagcc tggtggttgt ttgtccttct 240

caggggaaaa gtgaggcggc cccttggagg aaggggccgg gcagaatgat ctaatcggat 300

tccaagcagc tcaggggatt gtctttttct agcaccttct tgccactcct aagcgtcctc 360

cgtgaccccg gctgggattt agcctggtgc tgtgtcagcc ccggggccac catgagagag 420

ccagaggagc tgatgccaga cagtggagca gtgtttacat tcggaaaatc taagttcgct 480

gaaaataacc caggaaagtt ctggtttaaa aacgacgtgc ccgtccacct gtcttgtggc 540

gatgagcata gtgccgtggt cactgggaac aataagctgt acatgttcgg gtccaacaac 600

tggggacagc tggggctggg atccaaatct gctatctcta agccaacctg cgtgaaggca 660

ctgaaacccg agaaggtcaa actggccgct tgtggcagaa accacactct ggtgagcacc 720

gagggcggga atgtctatgc caccggaggc aacaatgagg gacagctggg actgggggac 780

actgaggaaa ggaatacctt tcacgtgatc tccttcttta catctgagca taagatcaag 840

cagctgagcg ctggctccaa cacatctgca gccctgactg aggacgggcg cctgttcatg 900

tggggagata attcagaggg ccagattggg ctgaaaaacg tgagcaatgt gtgcgtccct 960

cagcaggtga ccatcggaaa gccagtcagt tggatttcat gtggctacta tcatagcgcc 1020

ttcgtgacca cagatggcga gctgtacgtc tttggggagc ccgaaaacgg aaaactgggc 1080

ctgcctaacc agctgctggg caatcaccgg acaccccagc tggtgtccga gatccctgaa 1140

aaagtgatcc aggtcgcctg cgggggagag catacagtgg tcctgactga gaatgctgtg 1200

tataccttcg gactgggcca gtttggccag ctggggctgg gaaccttcct gtttgagaca 1260

tccgaaccaa aagtgatcga gaacattcgc gaccagacta tcagctacat ttcctgcgga 1320

gagaatcaca ccgcactgat cacagacatt ggcctgatgt atacctttgg cgatggacga 1380

cacgggaagc tgggactggg actggagaac ttcactaatc attttatccc caccctgtgt 1440

tctaacttcc tgcggttcat cgtgaaactg gtcgcttgcg gcgggtgtca catggtggtc 1500

ttcgctgcac ctcatagggg cgtggctaag gagatcgaat ttgacgagat taacgataca 1560

tgcctgagcg tggcaacttt cctgccatac agctccctga cttctggcaa tgtgctgcag 1620

agaaccctga gtgcaaggat gcggagaagg gagagggaac gctctcctga cagtttctca 1680

atgcgacgaa ccctgccacc tatcgaggga acactgggac tgagtgcctg cttcctgcct 1740

aactcagtgt ttccacgatg tagcgagcgg aatctgcagg agtctgtcct gagtgagcag 1800

gatctgatgc agccagagga acccgactac ctgctggatg agatgaccaa ggaggccgaa 1860

atcgacaact ctagtacagt ggagtccctg ggcgagacta ccgatatcct gaatatgaca 1920

cacattatgt cactgaacag caatgagaag agtctgaaac tgtcaccagt gcagaagcag 1980

aagaaacagc agactattgg cgagctgact caggacaccg ccctgacaga gaacgacgat 2040

agcgatgagt atgaggaaat gtccgagatg aaggaaggca aagcttgtaa gcagcatgtc 2100

agtcagggga tcttcatgac acagccagcc acaactattg aggctttttc agacgaggaa 2160

gtggagatcc ccgaggaaaa agagggcgca gaagattcca aggggaatgg aattgaggaa 2220

caggaggtgg aagccaacga ggaaaatgtg aaagtccacg gaggcaggaa ggagaaaaca 2280

gaaatcctgt ctgacgatct gactgacaag gccgaggtgt ccgaaggcaa ggcaaaatct 2340

gtcggagagg cagaagacgg accagaggga cgaggggatg gaacctgcga ggaaggctca 2400

agcggggctg agcattggca ggacgaggaa cgagagaagg gcgaaaagga taaaggccgc 2460

ggggagatgg aacgacctgg agagggcgaa aaagagctgg cagagaagga ggaatggaag 2520

aaaagggacg gcgaggaaca ggagcagaaa gaaagggagc agggccacca gaaggagcgc 2580

aaccaggaga tggaagaggg cggcgaggaa gagcatggcg agggagaaga ggaagagggc 2640

gatagagaag aggaagagga aaaagaaggc gaagggaagg aggaaggaga gggcgaggaa 2700

gtggaaggcg agagggaaaa ggaggaagga gaacggaaga aagaggaaag agccggcaaa 2760

gaggaaaagg gcgaggaaga gggcgatcag ggcgaaggcg aggaggaaga gaccgagggc 2820

cgcggggaag agaaagagga gggaggagag gtggagggcg gagaggtcga agagggaaag 2880

ggcgagcgcg aagaggaaga ggaagagggc gagggcgagg aagaagaggg cgagggggaa 2940

gaagaggagg gagagggcga agaggaagag ggggagggaa agggcgaaga ggaaggagag 3000

gaaggggagg gagaggaaga gggggaggag ggcgaggggg aaggcgagga ggaagaagga 3060

gagggggaag gcgaagagga aggcgagggg gaaggagagg aggaagaagg ggaaggcgaa 3120

ggcgaagagg agggagaagg agagggggag gaagaggaag gagaagggaa gggcgaggag 3180

gaaggcgaag agggagaggg ggaaggcgag gaagaggaag gcgagggcga aggagaggac 3240

ggcgagggcg agggagaaga ggaggaaggg gaatgggaag gcgaagaaga ggaaggcgaa 3300

ggcgaaggcg aagaagaggg cgaaggggag ggcgaggagg gcgaaggcga aggggaggaa 3360

gaggaaggcg aaggagaagg cgaggaagaa gagggagagg aggaaggcga ggaggaagga 3420

gagggggagg aggagggaga aggcgagggc gaagaagaag aagagggaga agtggagggc 3480

gaagtcgagg gggaggaggg agaaggggaa ggggaggaag aagagggcga agaagaaggc 3540

gaggaaagag aaaaagaggg agaaggcgag gaaaaccgga gaaataggga agaggaggaa 3600

gaggaagagg gaaagtacca ggagacaggc gaagaggaaa acgagcggca ggatggcgag 3660

gaatataaga aagtgagcaa gatcaaagga tccgtcaagt acggcaagca caaaacctat 3720

cagaagaaaa gcgtgaccaa cacacagggg aatggaaaag agcagaggag taagatgcct 3780

gtgcagtcaa aacggctgct gaagaatggc ccatctggaa gtaaaaaatt ctggaacaat 3840

gtgctgcccc actatctgga actgaaataa gagctcctcg aggcggcccg ctcgagtcta 3900

gagggccctt cgaaggtaag cctatcccta accctctcct cggtctcgat tctacgcgta 3960

ccggtcatca tcaccatcac cattgagttt aaacccgctg atcagcctcg actgtgcctt 4020

ctagttgcca gccatctgtt gtttgcccct cccccgtgcc ttccttgacc ctggaaggtg 4080

ccactcccac tgtcctttcc taataaaatg aggaaattgc atcgcattgt ctgagtaggt 4140

gtcattctat tctggggggt ggggtggggc aggacagcaa gggggaggat tgggaagaca 4200

atagcaggca tgctggggat gcggtgggct ctatggcttc tgaggcggaa agaaccagat 4260

cctctcttaa ggtagcatcg agatttaaat tagggataac agggtaatgg cgcgggccgc 4320

aggaacccct agtgatggag ttggccactc cctctctgcg cgctcgctcg ctcactgagg 4380

ccgggcgacc aaaggtcgcc cgacgcccgg gctttgcccg ggcggcctca gtgagcgagc 4440

gagcgcgcag 4450

<210> 9

<211> 588

<212> DNA

<213> 土拨鼠肝炎病毒(Woodchuck hepatitis virus)

<400> 9

atcaacctct ggattacaaa atttgtgaaa gattgactgg tattcttaac tatgttgctc 60

cttttacgct atgtggatac gctgctttaa tgcctttgta tcatgctatt gcttcccgta 120

tggctttcat tttctcctcc ttgtataaat cctggttgct gtctctttat gaggagttgt 180

ggcccgttgt caggcaacgt ggcgtggtgt gcactgtgtt tgctgacgca acccccactg 240

gttggggcat tgccaccacc tgtcagctcc tttccgggac tttcgctttc cccctcccta 300

ttgccacggc ggaactcatc gccgcctgcc ttgcccgctg ctggacaggg gctcggctgt 360

tgggcactga caattccgtg gtgttgtcgg ggaaatcatc gtcctttcct tggctgctcg 420

cctgtgttgc cacctggatt ctgcgcggga cgtccttctg ctacgtccct tcggccctca 480

atccagcgga ccttccttcc cgcggcctgc tgccggctct gcggcctctt ccgcgtcttc 540

gccttcgccc tcagacgagt cggatctccc tttgggccgc ctccccgc 588

<210> 10

<211> 3459

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 10

atgagggagc cggaagagct gatgcccgat tcgggtgctg tgtttacatt tgggaaaagt 60

aaatttgctg aaaataatcc cggtaaattc tggtttaaaa atgatgtccc tgtacatctt 120

tcatgtggag atgaacattc tgctgttgtt accggaaata ataaacttta catgtttggc 180

agtaacaact ggggtcagtt aggattagga tcaaagtcag ccatcagcaa gccaacatgt 240

gtcaaagctc taaaacctga aaaagtgaaa ttagctgcct gtggaaggaa ccacaccctg 300

gtgtcaacag aaggaggcaa tgtatatgca actggtggaa ataatgaagg acagttgggg 360

cttggtgaca ccgaagaaag aaacactttt catgtaatta gcttttttac atccgagcat 420

aagattaagc agctgtctgc tggatctaat acttcagctg ccctaactga ggatggaaga 480

ctttttatgt ggggtgacaa ttccgaaggg caaattggtt taaaaaatgt aagtaatgtc 540

tgtgtccctc agcaagtgac cattgggaaa cctgtctcct ggatctcttg tggatattac 600

cattcagctt ttgtaacaac agatggtgag ctatatgtgt ttggagaacc tgagaatggg 660

aagttaggtc ttcccaatca gctcctgggc aatcacagaa caccccagct ggtgtctgaa 720

attccggaga aggtgatcca agtagcctgt ggtggagagc atactgtggt tctcacggag 780

aatgctgtgt atacctttgg gctgggacaa tttggtcagc tgggtcttgg cacttttctt 840

tttgaaactt cagaacccaa agtcattgag aatattaggg atcaaacaat aagttatatt 900

tcttgtggag aaaatcacac agctttgata acagatatcg gccttatgta tacttttgga 960

gatggtcgcc acggaaaatt aggacttgga ctggagaatt ttaccaatca cttcattcct 1020

actttgtgct ctaatttttt gaggtttata gttaaattgg ttgcttgtgg tggatgtcac 1080

atggtagttt ttgctgctcc tcatcgtggt gtggcaaaag aaattgaatt cgatgaaata 1140

aatgatactt gcttatctgt ggcgactttt ctgccgtata gcagtttaac ctcaggaaat 1200

gtactgcaga ggactctatc agcacgtatg cggcgaagag agagggagag gtctccagat 1260

tctttttcaa tgaggagaac actacctcca atagaaggga ctcttggcct ttctgcttgt 1320

tttctcccca attcagtctt tccacgatgt tctgagagaa acctccaaga gagtgtctta 1380

tctgaacagg acctcatgca gccagaggaa ccagattatt tgctagatga aatgaccaaa 1440

gaagcagaga tagataattc ttcaactgta gaaagccttg gagaaactac tgatatctta 1500

aacatgacac acatcatgag cctgaattcc aatgaaaagt cattaaaatt atcaccagtt 1560

cagaaacaaa agaaacaaca aacaattggg gaactgacgc aggatacagc tcttactgaa 1620

aacgatgata gtgatgaata tgaagaaatg tcagaaatga aagaagggaa agcatgtaaa 1680

caacatgtgt cacaagggat tttcatgacg cagccagcta cgactatcga agcattttca 1740

gatgaggaag tagagatccc agaggagaag gaaggagcag aggattcaaa aggaaatgga 1800

atagaggagc aagaggtaga agcaaatgag gaaaatgtga aggtgcatgg aggaagaaag 1860

gagaaaacag agatcctatc agatgacctt acagacaaag cagaggtgag tgaaggcaag 1920

gcaaaatcag tgggagaagc agaggatggg cctgaaggta gaggggatgg aacctgtgag 1980

gaaggtagtt caggagcaga acactggcaa gatgaggaga gggagaaggg ggagaaagac 2040

aagggtagag gagaaatgga gaggccagga gagggagaga aggaactagc agagaaggaa 2100

gaatggaaga agagggatgg ggaagagcag gagcaaaagg agagggagca gggccatcag 2160

aaggaaagaa accaagagat ggaggaggga ggggaggagg agcatggaga aggagaagaa 2220

gaggagggag acagagaaga ggaagaagag aaggagggag aagggaaaga ggaaggagaa 2280

ggggaagaag tggagggaga acgtgaaaag gaggaaggag agaggaaaaa ggaggaaaga 2340

gcggggaagg aggagaaagg agaggaagaa ggagaccaag gagaggggga agaggaggaa 2400

acagagggga gaggggagga aaaagaggag ggaggggaag tagagggagg ggaagtagag 2460

gaggggaaag gagagaggga agaggaagag gaggagggtg agggggaaga ggaggaaggg 2520

gagggggaag aggaggaagg ggagggggaa gaggaggaag gagaagggaa aggggaggaa 2580

gaaggggaag aaggagaagg ggaggaagaa ggggaggaag gagaagggga gggggaagag 2640

gaggaaggag aaggggaggg agaagaggaa ggagaagggg agggagaaga ggaggaagga 2700

gaaggggagg gagaagagga aggagaaggg gagggagaag aggaggaagg agaagggaaa 2760

ggggaggagg aaggagagga aggagaaggg gagggggaag aggaggaagg agaaggggaa 2820

ggggaggatg gagaagggga gggggaagag gaggaaggag aatgggaggg ggaagaggag 2880

gaaggagaag gggaggggga agaggaagga gaaggggaag gggaggaagg agaaggggag 2940

ggggaagagg aggaaggaga aggggagggg gaagaggagg aaggggaaga agaaggggag 3000

gaagaaggag agggagagga agaaggggag ggagaagggg aggaagaaga ggaaggggaa 3060

gtggaagggg aggtggaagg ggaggaagga gagggggaag gagaggaaga ggaaggagag 3120

gaggaaggag aagaaaggga aaaggagggg gaaggagaag aaaacaggag gaacagagaa 3180

gaggaggagg aagaagaggg gaagtatcag gagacaggcg aagaagagaa tgaaaggcag 3240

gatggagagg agtacaaaaa agtgagcaaa ataaaaggat ctgtgaaata tggcaaacat 3300

aaaacatatc aaaaaaagtc agttactaac acacagggaa atgggaaaga gcagaggtcc 3360

aaaatgccag tccagtcaaa acgactttta aaaaacgggc catcaggttc caaaaagttc 3420

tggaataatg tattaccaca ttacttggaa ttgaagtaa 3459

<210> 11

<400> 11

000

<210> 12

<211> 20

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 12

Glu Lys Ser Leu Lys Leu Ser Pro Val Gln Lys Gln Lys Lys Gln Gln

1 5 10 15

Thr Ile Gly Glu

20

<210> 13

<211> 17

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 13

Lys Ser Lys Phe Ala Glu Asn Asn Pro Gly Lys Phe Trp Phe Lys Asn

1 5 10 15

Asp

<210> 14

<211> 17

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 14

Gly Asn Asn Glu Gly Gln Leu Gly Leu Gly Asp Thr Glu Glu Arg Asn

1 5 10 15

Thr

<210> 15

<211> 131

<212> PRT

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 15

Glu Ile Asn Asp Thr Cys Leu Ser Val Ala Thr Phe Leu Pro Tyr Ser

1 5 10 15

Ser Leu Thr Ser Gly Asn Val Leu Gln Arg Thr Leu Ser Ala Arg Met

20 25 30

Arg Arg Arg Glu Arg Glu Arg Ser Pro Asp Ser Phe Ser Met Arg Arg

35 40 45

Thr Leu Pro Pro Ile Glu Gly Thr Leu Gly Leu Ser Ala Cys Phe Leu

50 55 60

Pro Asn Ser Val Phe Pro Arg Cys Ser Glu Arg Asn Leu Gln Glu Ser

65 70 75 80

Val Leu Ser Glu Gln Asp Leu Met Gln Pro Glu Glu Pro Asp Tyr Leu

85 90 95

Leu Asp Glu Met Thr Lys Glu Ala Glu Ile Asp Asn Ser Ser Thr Val

100 105 110

Glu Ser Leu Gly Glu Thr Thr Asp Ile Leu Asn Met Thr His Ile Met

115 120 125

Ser Leu Asn

130

<210> 16

<211> 225

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 16

gaggaggaag gagaagggaa aggggaggaa gaaggggaag aaggagaagg ggaggaagaa 60

ggggaggaag gagaagggga gggggaagag gaggaaggag aaggggaggg agaagaggaa 120

ggagaagggg agggagaaga ggaggaagga gaaggggagg gagaagagga aggagaaggg 180

gagggagaag aggaggaagg agaagggaaa ggggaggagg aagga 225

<210> 17

<211> 225

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 在实验室制备-密码子优化的RPGR ORF15

<400> 17

gaggaagagg gggagggaaa gggcgaagag gaaggagagg aaggggaggg agaggaagag 60

ggggaggagg gcgaggggga aggcgaggag gaagaaggag agggggaagg cgaagaggaa 120

ggcgaggggg aaggagagga ggaagaaggg gaaggcgaag gcgaagagga gggagaagga 180

gagggggagg aagaggaagg agaagggaag ggcgaggagg aaggc 225

<210> 18

<211> 944

<212> DNA

<213> 智人(Homo sapiens)

<400> 18

gaggagggag acagagaaga ggaagaagag aaggagggag aagggaaaga ggaaggagaa 60

ggggaagaag tggagggaga acgtgaaaag gaggaaggag agaggaaaaa ggaggaaaga 120

gcggggaagg aggagaaagg agaggaagaa ggagaccaag gagaggggga agaggaggaa 180

acagagggga gaggggagga aaaagaggag ggaggggaag tagagggagg ggaagtagag 240

gaggggaaag gagagaggga agaggaagag gaggagggtg agggggaaga ggaggaaggg 300

gagggggaag aggaggaagg ggagggggaa gaggaggaag gagaagggaa aggggaggaa 360

gaaggggaag aaggagaagg ggaggaagaa ggggaggaag gagaagggga gggggaagag 420

gaggaaggag aaggggaggg agaagaggaa ggagaagggg agggagaaga ggaggaagga 480

gaaggggagg gagaagagga aggagaaggg gagggagaag aggaggaagg agaagggaaa 540

ggggaggagg aaggagagga aggagaaggg gagggggaag aggaggaagg agaaggggaa 600

ggggaggatg gagaagggga gggggaagag gaggaaggag aatgggaggg ggaagaggag 660

gaaggagaag gggaggggga agaggaagga gaaggggaag gggaggaagg agaaggggag 720

ggggaagagg aggaaggaga aggggagggg gaagaggagg aaggggaaga agaaggggag 780

gaagaaggag agggagagga agaaggggag ggagaagggg aggaagaaga ggaaggggaa 840

gtggaagggg aggtggaagg ggaggaagga gagggggaag gagaggaaga ggaaggagag 900

gaggaaggag aagaaaggga aaaggagggg gaaggagaag aaaa 944

Claims

1.一种组合物，所述组合物包含多个重组血清型8腺相关病毒(rAAV8)粒子，

其中所述多个rAAV8粒子中的每个rAAV8为非复制性的，并且

其中所述多个rAAV8粒子中的每个rAAV8包含多核苷酸，所述多核苷酸从5'到3'包含：

(a)编码5'反向末端重复序列(ITR)的序列；

(b)编码G蛋白偶联受体激酶1(GRK1)启动子的序列；

(c)编码色素性视网膜炎GTP酶调控因子ORF15同种型(RPGR^ORF15)的序列；

(d)编码聚腺苷酸化(polyA)信号的序列；

(e)编码3'ITR的序列；并且

其中所述组合物包含

(i)1.0x10¹⁰个载体基因组(vg)/毫升(mL)至1x10¹³vg/mL，端点包括在内；

(ii)1.25x10¹²个DNA酶抗性粒子(DRP)/毫升(mL)至1.0x10¹³DRP/mL；或

(ii)5x10¹⁰个基因组粒子(gp)至5x10¹²gp，端点包括在内。

2.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含1.25x10¹²vg/mL至1x10¹³vg/mL，端点包括在内。

3.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含1x10¹²vg/mL。

4.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含2.5x10¹²vg/mL。

5.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含5x10¹²vg/mL。

6.如权利要求1所述的组合物，其中所述组合物包含5x10⁹gp、1x10¹⁰gp、5x10¹⁰gp、1x10¹¹gp、2.5x10¹¹gp5x10¹¹gp、1.25x10¹²gp、2.5x10¹²gp、5x10¹²gp或1x10¹³。

7.如权利要求1至6中任一项所述的组合物，所述组合物还包含药学上可接受的载体。

8.如权利要求7所述的组合物，其中所述药学上可接受的载体包含Tris、MgCl₂以及NaCl。

9.如权利要求8所述的组合物，其中所述药学上可接受的载体包含20mM Tris、1mMMgCl₂以及200mM NaCl，pH 8.0。

10.如权利要求8或9所述的组合物，其中所述药学上可接受的载体还包含0.001％的泊洛沙姆188。

11.如权利要求1至10任一项的组合物，其中所述编码GRK1启动子的序列包含以下序列或由其组成：

12.如权利要求11所述的组合物，其中所述编码RPGR^ORF15的序列包含编码以下RPGR^ORF15氨基酸序列的核苷酸序列或由其组成：

13.如权利要求12所述的组合物，其中编码所述RPGR^ORF15氨基酸序列的序列包含密码子优化序列。

14.如权利要求13所述的组合物，其中所述编码RPGR^ORF15的序列包含以下核苷酸序列或由其组成：

15.如权利要求1至14中任一项所述的组合物，其中所述编码polyA信号的序列包含牛生长激素(BGH)polyA序列。

16.如权利要求15所述的组合物，其中所述编码BGH polyA信号的序列包含以下核苷酸序列：

17.如权利要求1至16中任一项所述的组合物，其中所述编码5'ITR的序列来源于血清型2AAV(AAV2)的5'ITR序列。

18.如权利要求1至16中任一项所述的组合物，其中所述编码5'ITR的序列包含与AAV2的5'ITR的序列相同的序列。

19.如权利要求1至16中任一项所述的组合物，其中所述编码5'ITR的序列包含以下核苷酸序列或由其组成：

CTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGCCCGGGCGTCGGGCGACCTTTGGTCGCCCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAGAGAGGGAGTGGCCAACTCCATCACTAGGGGTTCCT(SEQ ID NO:5)。

20.如权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中所述编码3'ITR的序列来源于AAV2的3'ITR序列。

21.如权利要求1至19中任一项所述的组合物，其中所述编码3'ITR的序列包含与AAV2的3’ITR的序列相同的序列。

22.如权利要求1至21中任一项所述的组合物，其中所述编码3'ITR的序列包含以下核苷酸序列或由其组成：

AGGAACCCCTAGTGATGGAGTTGGCCACTCCCTCTCTGCGCGCTCGCTCGCTCACTGAGGCCGGGCGACCAAAGGTCGCCCGACGCCCGGGCTTTGCCCGGGCGGCCTCAGTGAGCGAGCGAGCGCGCAG(SEQ ID NO:6)。

23.如权利要求1至22中任一项所述的组合物，其中所述多核苷酸还包含Kozak序列。

24.如权利要求23所述的组合物，其中所述Kozak序列包含GGCCACCATG(SEQ IDNO:7)的核苷酸序列或由其组成。

25.如权利要求1至24中任一项权利要求所述的组合物，其中所述多核苷酸包含以下序列或由其组成：

26.如权利要求1至25中任一项所述的组合物，其中所述多核苷酸还包含编码土拨鼠翻译后调控元件(WPRE)的序列。

27.如权利要求26所述的组合物，其中编码所述WPRE的序列包含以下核苷酸序列：

28.如权利要求1至27中任一项所述的组合物，其中所述rAAV8粒子中的每一者包含从AAV血清型8(AAV8)Rep蛋白分离或衍生的病毒Rep蛋白。

29.如权利要求1至28中任一项所述的组合物，其中所述rAAV8粒子中的每一者包含从AAV血清型8(AAV8)Cap蛋白分离或衍生的病毒Cap蛋白。

30.一种装置，所述装置包含如权利要求1至29中任一项所述的组合物。

31.如权利要求30所述的装置，其中所述装置包括微量递送装置。

32.如权利要求31所述的装置，其中所述微量递送装置包括微针。

33.如权利要求32所述的装置，其中所述微针适合于视网膜下递送。

34.如权利要求33所述的装置，其中所述装置包含至少50μL的体积。

35.如权利要求32所述的装置，其中所述微量递送装置包括微导管。

36.如权利要求35所述的装置，其中所述装置适合于脉络膜上腔递送。

37.如权利要求36所述的装置，其中所述装置包含至少50μL的体积。

38.一种治疗有需要的受试者的色素性视网膜炎的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的如权利要求1至29中任一项所述的组合物。

39.一种治疗有需要的受试者的色素性视网膜炎的方法，所述方法包括向所述受试者施用治疗有效量的组合物，其中所述施用使用如权利要求30至38中任一项所述的装置进行。

40.如权利要求38或39所述的方法，其中施用所述治疗有效量的所述组合物改善所述受试者中的色素性视网膜炎迹象。

41.如权利要求40所述的方法，其中所述色素性视网膜炎迹象包括当与健康椭圆体带(EZ)相比时EZ的变性。

42.如权利要求41所述的方法，其中所述EZ的变性包括当与健康EZ相比时感光细胞密度降低、感光纤毛数目减少或它们的组合。

43.如权利要求41或42所述的方法，其中所述EZ的变性包括当与健康EZ相比时所述EZ的宽度和/或面积减小。

44.如权利要求41至43中任一项所述的方法，其中所述EZ的变性包括当与健康EZ相比时所述EZ的长度减小，其中所述长度包含沿眼睛的前-后(A/P)轴、背-腹(D/V)轴或内-外(M/L)轴中的一者或多者的距离；和/或其中所述EZ的变性包括当与健康EZ相比时所述EZ的面积减小，其中所述面积包含π乘以沿眼睛的前-后(A/P)轴、背-腹(D/V)轴或内-外(M/L)轴中的一者或多者的距离的平方。

45.如权利要求41至44中任一项所述的方法，其中所述健康EZ包含不具有色素性视网膜炎迹象或症状的年龄和性别匹配的个体的EZ。

46.如权利要求45所述的方法，其中所述不具有色素性视网膜炎迹象或症状的年龄和性别匹配的个体不具有发展色素性视网膜炎的风险因素。

47.如权利要求41至44中任一项所述的方法，其中所述健康EZ包括预定对照或阈值。

48.如权利要求47所述的方法，其中所述预定对照或阈值包括由来自多个个体的多个健康EZ的测量确定的均值或平均值。

49.如权利要求47所述的方法，其中所述多个个体的年龄和性别与所述受试者相匹配。

50.如权利要求41至44中任一项所述的方法，其中所述健康EZ包括所述受试者的未受影响的眼睛。

51.如权利要求50所述的方法，其中所述未受影响的眼睛不具有可检测的色素性视网膜炎迹象。

52.如权利要求51所述的方法，其中所述未受影响的眼睛不具有可检测的所述EZ的变性。

53.如权利要求40所述的方法，其中所述色素性视网膜炎迹象包括当与基线椭圆体带(EZ)相比时EZ的变性。

54.如权利要求53所述的方法，其中所述基线EZ包括在施用所述组合物之前对所述受试者的EZ的变性的测量。

55.如权利要求54所述的方法，其中所述受试者的EZ的变性的所述测量包括测定所述EZ的一部分中的活的或有活力的光感受器的数目、所述EZ的一部分中的纤毛的数目、所述EZ的一部分的宽度、沿所述EZ的一部分中的一个或多个轴的所述EZ的长度、所述EZ的一部分的面积或它们的任何组合。

56.如权利要求43至55中任一项所述的方法，其中施用所述治疗有效量的所述组合物改善色素性视网膜炎迹象或症状，其中所述色素性视网膜炎迹象包括当与健康椭圆体带(EZ)或基线EZ相比时EZ的变性，并且其中所述改善包括使所述EZ的宽度增加1μm至20μm，端点包括在内；和/或使所述EZ的宽度增加0.8μm至320μm，端点包括在内。

57.如权利要求56所述的方法，其中所述改善包括使所述EZ的宽度增加3μm至15μm，端点包括在内；和/或使所述EZ的宽度增加7μm至180μm，端点包括在内。

58.如权利要求43至55中任一项所述的方法，其中所述改善包括当与基线EZ相比时使所述EZ的宽度和/或面积增加1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或其间任何百分比。

59.如权利要求43至58中任一项所述的方法，其中所述改善包括使眼睛的一个或多个扇区的所述EZ的宽度均匀地增加。

60.如权利要求43至58中任一项所述的方法，其中所述改善包括使眼睛的一个或多个扇区的所述EZ的宽度不均匀地增加，其中在黄斑处或一个或多个中心扇区内增加的宽度最大并且其中在一个或多个外周扇区处增加的宽度最小。

61.如权利要求43至60中任一项所述的方法，其中所述改善包括使沿A/P轴的所述EZ的长度增加。

62.如权利要求43至61中任一项所述的方法，其中所述改善包括使沿D/V轴的所述EZ的长度增加。

63.如权利要求43至62中任一项所述的方法，其中所述改善包括使沿M/L轴的所述EZ的长度增加。

64.如权利要求59至63中任一项所述的方法，其中所述改善包括当与基线EZ相比时使所述EZ的长度和/或面积增加1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或其间任何百分比。

65.如权利要求41至64中任一项所述的方法，其中当与基线EZ相比时，施用所述治疗有效量的所述组合物使所述EZ进一步变性的速率降低或抑制所述EZ进一步变性。

66.如权利要求65所述的方法，其中在施用所述组合物之后，所述EZ的一部分中的活的或有活力的光感受器的数目、所述EZ的一部分中的纤毛的数目、所述EZ的一部分的宽度、沿所述EZ的一部分中的一个或多个轴的所述EZ的长度、所述EZ的一部分的面积或它们的任何组合等于当与基线EZ相比时所述EZ的所述部分中的活的或有活力的光感受器的数目、所述EZ的所述部分中的纤毛的数目、所述EZ的所述部分的宽度、沿所述EZ的所述部分中的一个或多个轴的所述EZ的长度或它们的任何组合。

67.如权利要求43至66中任一项所述的方法，其中所述受试者的所述EZ的一部分的宽度或长度或健康EZ的一部分的宽度或长度使用光学相干断层扫描(OCT)来测量。

68.如权利要求40和45-55中任一项所述的方法，其中所述色素性视网膜炎迹象包括与健康视网膜敏感度水平相比视网膜敏感度水平降低。

69.如权利要求68所述的方法，其中所述视网膜敏感度水平使用微视野检查来测量。

70.如权利要求69所述的方法，其中所述测量视网膜敏感度水平包括：

(a)产生所述受试者的眼睛的眼底的图像；

(b)将点栅格投射至(a)的所述图像上；

(c)用光在(b)的所述栅格上的每个点处刺激所述眼睛，其中每次后续刺激与前一次刺激相比具有更大的强度；

(d)将步骤(c)重复至少一次；

(e)针对(b)的所述栅格上的每个点测定最小阈值，其中所述最小阈值为所述受试者可首次感知来自(c)中的光时所述光的强度；以及

(f)将来自(e)的所述最小阈值从asb转化为分贝(dB)，其中最大光强度等于0dB并且最小光强度等于dB量表的最大dB值。

71.如权利要求70所述的方法，其中(c)的所述刺激步骤包括在约4至1000阿熙提(asb)范围内的光刺激。

72.如权利要求70或71所述的方法，其中所述栅格包含至少37个点。

73.如权利要求72所述的方法，其中所述栅格包含68个点或由其组成。

74.如权利要求70至73中任一项所述的方法，其中所述点在直径涵盖所述眼睛的10°的圆上均匀地隔开。

75.如权利要求74所述的方法，其中所述圆以黄斑为中心。

76.如权利要求69至75中任一项所述的方法，其中测量所述视网膜敏感度水平还包括对在(b)的所述栅格中每个点处的所述最小阈值取均值以产生平均视网膜敏感度。

77.如权利要求69至76中任一项所述的方法，其中所述健康视网膜敏感度水平使用不具有色素性视网膜炎迹象或症状的年龄和性别匹配的个体来测定。

78.如权利要求77所述的方法，其中所述不具有色素性视网膜炎迹象或症状的年龄和性别匹配的个体不具有发展色素性视网膜炎的风险因素。

79.如权利要求69至76中任一项所述的方法，其中所述健康视网膜敏感度水平使用预定对照或阈值来测定。

80.如权利要求79所述的方法，其中所述预定对照或阈值包括由来自多个个体的多个健康视网膜敏感度水平的测量所确定的均值或平均值。

81.如权利要求80所述的方法，其中所述多个个体的年龄和性别与所述受试者相匹配。

82.如权利要求69至81中任一项所述的方法，其中所述健康视网膜敏感度水平是从所述受试者的未受影响的眼睛测量。

83.如权利要求82所述的方法，其中所述未受影响的眼睛不具有可检测的色素性视网膜炎迹象。

84.如权利要求83所述的方法，其中所述未受影响的眼睛不具有可检测的视网膜敏感度水平降低。

85.如权利要求84所述的方法，其中所述色素性视网膜炎迹象包括当与基线视网膜敏感度水平相比时视网膜敏感度水平降低。

86.如权利要求85所述的方法，其中所述基线视网膜敏感度水平包括在施用所述组合物之前对所述受试者的视网膜敏感度水平的测量。

87.如权利要求79至86中任一项所述的方法，其中当与健康视网膜敏感度水平相比时，施用所述治疗有效量的所述组合物恢复所述受试者的视网膜敏感度。

88.如权利要求87所述的方法，其中恢复视网膜敏感度包括当与健康视网膜敏感度水平相比时所述视网膜的一部分中的平均视网膜敏感度有所增加。

89.如权利要求88所述的方法，其中在所述受试者的视网膜的一部分中的平均视网膜敏感度等于所述视网膜的所述部分中处于所述健康视网膜敏感度水平的平均视网膜敏感度。

90.如权利要求85至89中任一项所述的方法，其中当与健康或基线视网膜敏感度水平相比时，施用所述治疗有效量的所述组合物改善所述受试者的视网膜敏感度。

91.如权利要求90所述的方法，其中改善视网膜敏感度包括当与健康或基线视网膜敏感度水平相比时所述视网膜的一部分中的平均视网膜敏感度有所增加。

92.如权利要求91所述的方法，其中改善视网膜敏感度包括平均视网膜敏感度水平增加1至30分贝(dB)，端点包括在内。

93.如权利要求92所述的方法，其中改善视网膜敏感度包括平均视网膜敏感度水平增加1至15dB，端点包括在内。

94.如权利要求93所述的方法，其中改善视网膜敏感度包括平均视网膜敏感度水平增加2至10dB，端点包括在内。

95.如权利要求91所述的方法，其中改善视网膜敏感度包括当与健康或基线视网膜敏感度水平相比时在平均视网膜敏感度水平方面平均视网膜敏感度水平增加1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、100％或其间任何百分比。

96.如权利要求91所述的方法，其中在微视野检查栅格内的至少1个、2个、3个、4个、5个、6个、7个、8个、9个、10个、15个、20个、25个、30个、35个或其间任何数目的点中发生了所述平均视网膜敏感度水平增加。

97.如权利要求96所述的方法，其中在微视野检查栅格内的至少1％，2％，3％，4％，5％，6％，7％，8％，9％，10％，15％，20％，25％，30％，35％，40％，45％，50％，55％，60％，65％，70％，75％，80％，85％，90％，95％，100％或其间任何百分比中发生了所述平均视网膜敏感度水平增加。

98.如权利要求85至89中任一项所述的方法，其中当与基线视网膜敏感度水平相比时，施用所述治疗有效量的所述组合物抑制所述受试者的视网膜敏感度进一步降低或预防视网膜敏感度损失。

99.如权利要求98所述的方法，其中在施用所述组合物之后所述受试者的视网膜敏感度水平等于所述基线视网膜敏感度水平。

100.一种预防受试者的色素性视网膜炎的方法，所述方法包括向所述受试者施用预防有效量的如权利要求1至29中任一项所述的组合物，其中所述受试者处于发展色素性视网膜炎的风险中。

101.如权利要求100所述的方法，其中所述受试者具有发展色素性视网膜炎的风险因素。

102.如权利要求101所述的方法，其中所述因素包括以下中的一者或多者：基因标记物、色素性视网膜炎家族史、色素性视网膜炎症状或它们的组合。

103.如权利要求102所述的方法，其中所述色素性视网膜炎症状包括视敏度降低或损失。

104.如权利要求102所述的方法，其中所述视敏度涉及夜间视觉、周边视觉、颜色视觉或它们的任何组合。

105.如权利要求40至104中任一项所述的方法，其中所述组合物通过视网膜下途径施用。

106.如权利要求105所述的方法，其中所述组合物通过视网膜下注射或输注施用。

107.如权利要求106所述的方法，其中所述组合物通过视网膜下注射施用并且其中所述注射包含100μL或至多100μL的体积。

108.如权利要求106或107所述的方法，其中所述视网膜下注射包括两步注射。

109.如权利要求108所述的方法，其中所述两步注射包括：

(a)将微针插入所述受试者的眼睛中的感光细胞层与视网膜色素上皮(RPE)层之间；

(b)将溶液以足以使视网膜从所述RPE部分脱离而形成泡的量注射在所述受试者的眼睛中的感光细胞层与视网膜色素上皮层之间；以及

(c)将所述组合物注射至(b)的所述泡中。

110.如权利要求109所述的方法，其中所述溶液包括平衡盐溶液。

111.如权利要求40至105中任一项所述的方法，其中所述组合物通过脉络膜上腔途径施用。

112.如权利要求111所述的方法，其中所述组合物通过脉络膜上腔注射或输注施用。

113.如权利要求111或112所述的方法，其中所述组合物通过脉络膜上腔注射施用并且其中所述注射包含50至1000μL的体积，端点包括在内。

114.如权利要求113所述的方法，其中所述注射包含50至300μL的体积，端点包括在内。

115.如权利要求111至114中任一项所述的方法，其中所述脉络膜上腔注射包括：

(a)使微量递送装置的中空端与所述受试者的眼睛的脉络膜上腔空间接触，其中所述中空端包括开口；以及

(b)使所述组合物流过所述微量递送装置的中空端以将所述组合物引入所述脉络膜上腔空间中。

116.如权利要求115所述的方法，其中所述微量递送装置的中空端刺穿巩膜，

其中所述微量递送装置的中空端或其延伸部横穿脉络膜上腔空间的一部分，和/或

其中所述微量递送装置的中空端至少一次横穿脉络膜。

117.如权利要求90所述的方法，其中改善视网膜敏感度包括在68点栅格的中心16个点中的至少5点中敏感度增加至少5dB、至少6dB、至少7dB、至少8dB、至少9dB或至少10dB。

118.如权利要求117所述的方法，其中改善视网膜敏感度包括在68点栅格的所述中心16点中的至少5个点中敏感度增加至少7dB。