KR101150900B1 - 퇴행성 관절염 치료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 Nkx3.2(NK3 homeobox 2) 분자를 이용한 관절염 치료용 조성물, 관절염 진단 키트 및 관절염 치료제 조성물의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명은 관절 조직의 기능 유지 및 연골세포 생존성 향상을 통해 관절염의 근본적인 예방 및 치료에 이용될 수 있으며, 특히 원천적인 발병 요인을 제어함으로써 류마티스성 관절염과 그 병리학적인 병인이 확연히 구분되는 퇴행성 관절염의 치료에도 유용하게 이용될 수 있다.

Description

퇴행성 관절염 치료 조성물{Compositions for Treating Osteoarthritis}

본 발명은 Nkx3.2(NK3 homeobox 2) 분자를 이용한 퇴행성 관절염 치료제 개발에 관한 것이다.

관절염은 인류가 앓고 있는 질환 중 유병률 1위의 다발성 질환이다. 이 중 특히 퇴행성 관절염은 65세 이상 인구 중 70~80%가 75세 이상인 경우에는 거의 100%가 가지고 있는 대표적인 노인성 질환이다. 현재 우리나라는 전체 인구의 10% 이상이 퇴행성 관절염을 앓고 있으며, 이러한 유병률은 한국 사회의 급속한 고령화 추세로 인해 매우 빠르게 증가하고 있다. 또한 전 세계적으로는 약 5억 명 이상의 퇴행성 관절염 환자가 있는 것으로 추정된다. 또한 인간 평균수명의 연장과 함께 인간의 사회활동 기간이 늘어남에 따라, 인류 생활의 질적 측면에서 시급히 극복해야 할 노인성 질환 중에서 중요한 위치를 차지하고 있다.

관절조직 내 뼈의 끝부분에 막처럼 둘러져 있으면서 구조적인 완충역할을 하는 연골조직은 뼈끼리 직접 맞닿을 때 생길 수 있는 통증 유발이나 뼈의 마모 등을 예방해주고 있다. 연골세포는 연골조직 내의 유일한 세포 성분으로서 연골조직이 정상적인 기능을 유지하기 위해 필수적인 콜라겐 및 프로테오글리칸 등의 매트릭스를 합성, 분비하고 또한 적정속도로 분해하는 역할을 담당함으로써 관절 연골조직의 기능적 항상성을 유지시켜 주는 데에 필수적인 역할을 담당하고 있다. 따라서 이러한 연골세포의 활성 유지는 관절조직의 구조적 기능성 보존과 직결되어 있다.

연골조직 내 연골세포의 기능이 정상적으로 수행되기 위해서는 연골세포의 생성 및 분화가 적절히 이루어져야 하고, 생성된 연골세포의 생존이 잘 보호되어야 하며, 또한 존재하고 있는 연골세포의 석회화가 지속적으로 억제되어 연골조직의 경화현상이 방지되어야 한다. 퇴행성 관절염의 가장 원천적인 발병 요인은 이러한 관절 연골세포의 본질적인 기능성이 노화에 따라 상실되는 것이다(도 1).

퇴행성 관절염 유발의 핵심 요소 중의 하나는 관절 내 연골조직의 양적 손실이며, 이는 연골조직 내 연골세포의 분화 및 생존 유지와 밀접히 연관되어 있다(도 1). 퇴행성 관절염 유발의 또 다른 핵심 요소 중의 하나는 관절 내 연골조직의 경화현상이며, 이는 연골세포의 석회화 현상과 직접적으로 연관되어 있다(도 1). 퇴행성 관절염이 진행되면, 연골조직의 프로테오글리칸 매트릭스가 기계적으로 마모되면서 연골조직이 소실되고 그 결과로 연골 밑 뼈가 드러나게 된다. 또한 이 단계에서 연골세포의 석회화로 인해 신생되는 작은 돌기성 뼛조각들은 그 주변에 침착되어 연골조직의 경화 현상을 일으킴으로써 마모에 의한 연골조직의 소실을 더욱 가속화시키게 된다. 이와 같은 복합적인 관절조직 구조변형이 염증 및 통증을 유발하게 되고, 증상이 심해지면 관절변형과 운동제한을 초래하게 된다.

따라서 퇴행성 관절염의 치유를 위해 가장 근본적이고도 효율적인 접근은 연골세포의 생성 및 분화, 사멸, 석회화 등의 과정을 조절하는 표적을 확보하고 이에 대한 효과적인 제어 기술을 개발하는 것이다(도 2).

현존하는 관절염 치료 표적은 주로 염증제어과정과 연관되어 있으며, 류마티스성 관절염 치료에 초점이 맞추어져 있는 것이 대부분이다. 그러나 연골조직의 소실로 인해 통증과 염증이 유발되는 퇴행성 관절염과 면역기능의 이상으로 인한 염증반응의 결과로 관절조직이 파괴되는 류마티스성 관절염은 그 병리학적인 원인과 증상에서 명확히 구분 된다(도 3). 퇴행성 관절염의 경우, 염증발현 자체를 질병의 유발 요인이라고 볼 수 없으므로 염증 제어적 접근을 통해서는 퇴행성 관절염에 대한 근본적인 치유책이 도출되어 질 수 없다.

지금까지 퇴행성 관절염 치료를 위해 상용화된 효과적인 표적물질은 전 세계적으로 개발되어진 바가 없으며, 현재 퇴행성 관절염의 근본적인 치유책은 부재하고 있다. 따라서 염증 제어와 같은 대증적 접근이 아닌 퇴행성 관절염의 원천적 유발 요인 자체에 직접적으로 작용하는 근본적인 치료 기술의 개발이 절실히 필요하다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자는 관절염에 대한 기존의 대증적인 염증 제어적 치료가 아닌 보다 근본적인 예방 및 치료를 위한 조성물을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, Nkx3.2 단백질 및 유전자가 관절 조직의 기능 유지에 필수적인 연골세포 생존 유지와 관련되어 있다는 사실을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 관절염 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적은 인간의 관절염 진단 키트를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 관절염 치료제 조성물의 스크리닝 방법을 제공하는 데 있다.

본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 관절염 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명자는 관절염에 대한 기존의 대증적인 염증 제어적 치료가 아닌 보다 근본적인 예방 및 치료를 위한 조성물을 개발하기 위하여 예의 연구 노력하였다. 그 결과, Nkx3.2(Nk3 homeobox 2) 단백질 및 유전자가 관절 조직의 기능 유지에 필수적인 연골세포 생존 유지와 관련되어 있다는 사실을 발견함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.

본 명세서에서 용어 “폴리펩타이드”는 펩타이드 결합에 의해 아미노산 잔기들이 서로 결합되어 형성된 선형의 분자를 의미한다. 서열목록 제2서열의 아미노산 서열은 Nkx3.2 단백질의 아미노산 서열이다.

본 발명에 따르면, 본 발명자는 관절 연골세포에서 Nkx3.2의 발현을 확인하였으며, 관절 연골세포에서의 Nkx3.2 발현 정도는 성장판 연골세포에 비하여 현저히 높은 수준임을 관찰하였다(도 4). 이는 Nkx3.2가 가지는 생리학적 기능이 관절 연골세포에서 매우 중요할 수 있음을 시시하고 있다.

또한, RNA 녹다운(knock-down)을 통한 Nkx3.2 발현 억제가 인간 관절 연골세포의 효과적인 세포사멸을 유도한다는 사실과(도 6 및 7), 정상인에 비하여 퇴행성 관절염 환자조직에서 분리된 연골세포에서 Nkx3.2의 발현이 RNA와 단백질 수준에서 모두 확연히 저하되어 있음을 확인하였다(도 8 및 9). 나아가 Nkx3.2를 관절 조직 내에 과발현 시켜준 마우스의 경우 퇴행성 관절염의 유도가 현저히 억제됨을 확인하였다(도 11). 이는 퇴행성 관절염의 발병과 함께 그 발현이 감소되는 Nkx3.2의 발현을 인위적으로 복원시켜준 환경에서는 퇴행성 관절염의 진행이 효과적으로 제어될 수 있음을 보여주는 결과이다.

본 발명의 Nkx3.2 단백질은 서열목록 제2서열의 아미노산 서열에 대하여 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 아미노산 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 아미노산 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 80%의 상동성, 보다 바람직하게는 최소 90%의 상동성, 가장 바람직하게는 최소 95%의 상동성을 나타내는 아미노산 서열을 의미한다.

또한, 본 발명에서 이용되는 Nkx3.2 단백질은 이의 천연형 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다. Nkx3.2 단백질의 변이체란 Nkx3.2 단백질의 천연 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지는 단백질을 의미한다. 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979). 가장 통상적으로 일어나는 교환은 아미노산 잔기 Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu 및 Asp/Gly 간의 교환이다.

경우에 따라서는 Nkx3.2 단백질은 인산화(phosphorylation), 황화(sulfation), 아크릴화(acrylation), 당화(glycosylation), 메틸화(methylation) 또는 파네실화(farnesylation) 등으로 수식(modification)될 수도 있다.

상기 Nkx3.2 단백질 또는 이의 변이체는 천연에서 추출하거나 합성(Merrifleld, J. Amer. chem. Soc.. 85:2149-2156, 1963) 또는 DNA 서열을 기본으로 하는 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다(Sambrook, J. et al., Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001).

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 유효성분으로 포함하는 관절염 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진다. 본 발명이 따르면, 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열은 Nkx3.2 유전자의 뉴클레오타이드 서열이다.

본 발명에서 이용되는 뉴클레오타이드 서열은 첨부한 서열목록에 기재된 뉴클레오타이드 서열에 한정되지 않는다는 것은 당업자에게 명확하다.

뉴클레오타이드에서의 변이는 단백질에서 변화를 가져오지 않는 것도 있다. 이러한 핵산은 기능적으로 균등한 코돈 또는 동일한 아미노산을 코딩하는 코돈 (예를 들어, 코돈의 축퇴성에 의해, 아르기닌 또는 세린에 대한 코돈은 여섯 개이다), 또는 생물학적으로 균등한 아미노산을 코딩하는 코돈을 포함하는 핵산분자를 포함한다.

상술한 생물학적 균등 활성을 갖는 변이를 고려한다면, 본 발명에서 이용되는 핵산 분자는 서열목록에 기재된 서열과 실질적인 동일성(substantial identity)을 나타내는 서열도 포함하는 것으로 해석된다. 상기의 실질적인 동일성은, 상기한 본 발명의 서열과 임의의 다른 서열을 최대한 대응되도록 얼라인하고, 당업계에서 통상적으로 이용되는 알고리즘을 이용하여 얼라인된 서열을 분석한 경우에, 최소 60%의 상동성, 보다 바람직하게는 70%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 80%의 상동성, 가장 바람직하게는 90%의 상동성을 나타내는 서열을 의미한다.

서열비교를 위한 얼라인먼트 방법은 당업계에 공지되어 있다. 얼라인먼트에 대한 다양한 방법 및 알고리즘은 Smith and Waterman, Adv . Appl . Math . 2:482(1981); Needleman and Wunsch, J. Mol . Bio. 48:443(1970); Pearson and Lipman, Methods in Mol . Biol . 24: 307-31(1988); Higgins and Sharp, Gene 73:237-44(1988); Higgins and Sharp, CABIOS 5:151-3(1989); Corpet et al., Nuc . Acids Res . 16:10881-90(1988); Huang et al., Comp . Appl . BioSci . 8:155-65(1992) and Pearson et al., Meth . Mol . Biol . 24:307-31(1994)에 개시되어 있다. NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST)(Altschul et al., J. Mol . Biol . 215:403-10(1990))은 NBCI(National Center for Biological Information) 등에서 접근 가능하며, 인터넷 상에서 blastp, blasm, blastx, tblastn 및 tblastx와 같은 서열 분석 프로그램과 연동되어 이용할 수 있다. BLSAT는 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/에서 접속 가능하다. 이 프로그램을 이용한 서열 상동성 비교 방법은 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html에서 확인할 수 있다.

본 발명의 조성물은 본 발명의 폴리펩타이드 또는 뉴클레오타이드 분자의 약제학적 유효량이 포함된 약제학적 조성물로 제조될 수 있다.

본 명세서에서 용어 “약제학적 유효량”은 상술한 본 발명의 관절염 예방, 경감 또는 치료 효능 또는 활성을 달성하는 데 충분한 양을 의미한다.

본 발명의 약제학적 조성물에 포함되는 약제학적으로 허용되는 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약제학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약제학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences (19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 경구 또는 비경구, 바람직하게는 비경구로 투여할 수 있고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 국소 투여, 경피 투여, 관절강 투여 등으로 투여할 수 있다. 가장 바람직하게는 관절강(joint cavity) 투여로 투여 된다.

본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약제학적 조성물의 바람직한 투여량은 1일 당 0.0001-100 mg/kg이다.

본 발명의 약제학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약제학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화 함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 보다 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 유전자 전달체(gene delivery system)에 포함되어 있다.

본 명세서에서 용어 “유전자 전달체”는 원하는 타겟 유전자를 대상 세포에 도입하여 발현시키기 위한 매개체를 의미한다. 이상적인 유전자 전달체는 인체에 무해하고 대량생산이 용이하며 효율적으로 유전자를 전달할 수 있어야 한다.

본 명세서에서, 용어“유전자 전달”은 유전자가 세포 내로 운반되는 것을 의미하며, 유전자의 세포내 침투(transduction)와 동일한 의미를 가진다. 조직 수준에서, 상기 용어 유전자 전달은 유전자의 확산(spread)과 동일한 의미를 가진다. 따라서, 본 발명의 유전자 전달체는 유전자 침투 시스템 및 유전자 확산 시스템으로 기재될 수 있다.

본 발명의 유전자 전달체을 제조하기 위해, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 적합한 발현 컨스트럭트(expression construct) 내에 존재하는 것이 바람직하다. 상기 발현 컨스트럭트에서, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 프로모터에 작동적으로 연결되는 것이 바람직하다. 본 명세서에서, 용어 “작동적으로 결합된”은 핵산 발현 조절 서열 (예: 프로모터, 시그널 서열, 또는 전사조절인자 결합 위치의 어레이)과 다른 핵산 서열사이의 기능적인 결합을 의미하며, 이에 의해 상기 조절 서열은 상기 다른 핵산 서열의 전사 및/또는 해독을 조절하게 된다. 본 발명에 있어서, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열에 결합된 프로모터는, 바람직하게는 동물세포, 보다 바람직하게는 포유동물 세포에서 작동하여 릴랙신 유전자의 전사를 조절할 수 있는 것으로서, 포유동물 바이러스로부터 유래된 프로모터 및 포유동물 세포의 지놈으로부터 유래된 프로모터를 포함하며, 예컨대 CMV(포유동물 사이토 메갈로 바이러스) 프로모터, 아데노바이러스 후기 프로모터, 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터, SV40 프로모터, HSV의 tk 프로모터, RSV 프로모터, EF1 알파 프로모터, 메탈로티오닌 프로모터, 베타-액틴 프로모터, 인간 IL-2 유전자의 프로모터, 인간 IFN 유전자의 프로모터, 인간 IL-4 유전자의 프로모터, 인간 림포톡신 유전자의 프로모터 및 인간 GM-CSF 유전자의 프로모터를 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 가장 바람직하게는, 본 발명에서 사용되는 프로모터는 CMV 프로모터이다.

본 발명의 유전자 전달체는 다양한 형태로 제작할 수 있는 데, 이는 (ⅰ) 내이키드(naked) 재조합 DNA 분자, (ⅱ) 플라스미드, (ⅲ) 바이러스 벡터, 그리고, (ⅳ) 상기 내이키드 재조합 DNA 분자 또는 플라스미드를 내포하는 리포좀 또는 니오좀의 형태로 제작할 수 있다. 또한 경우에 따라서는 세포내 전달 신호 펩타이드와의 공유결합을 통한 세포내 이행 시스템의 이용도 가능하다.

Nkx3.2 뉴클레오타이드 서열은 통상적인 유전자 치료에 이용되는 모든 유전자 전달 시스템에 적용될 수 있으며, 바람직하게는 플라스미드, 아데노바이러스(Lockett LJ, et al., Clin . Cancer Res . 3:2075-2080(1997)), 아데노-관련 바이러스(Adeno-associated viruses: AAV, Lashford LS., et al., Gene Therapy Technologies , Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), 레트로바이러스(Gunzburg WH, et al., Retroviral vectors. Gene Therapy Technologies , Applications and Regulations Ed. A. Meager, 1999), 렌티바이러스(Wang G. et al., J. Clin . Invest . 104(11):R55-62(1999)), 헤르페스 심플렉스 바이러스(Chamber R., et al., Proc . Natl . Act . Sci USA 92:1411-1415(1995)), 배시니아 바이러스(Puhlmann M. et al., Human Gene Therapy 10:649-657(1999)), 리포좀(Metho s in Molecular Biology, Vol 199, S.C. Basu and M. Basu (Eds.), Human Press 2002) 또는 니오좀에 적용될 수 있다. 가장 바람직하게는, 본 발명의 유전자 전달체는 본 발명의 뉴클레오타이드 분자를 렌티바이러스에 적용하여 제조된다.

본 발명에서, 유전자 전달체가 바이러스 벡터에 기초하여 제작된 경우에는, 상기 접촉시키는 단계는 당업계에 공지된 바이러스 감염 방법에 따라 실시된다. 바이러스 벡터를 이용한 숙주 세포의 감염은 상술한 인용문헌에 기재되어 있다.

본 발명에서 유전자 전달체가 내이키드(naked) 재조합 DNA 분자 또는 플라스미드인 경우에는, 미세 주입법(Capecchi, M.R., Cell, 22:479(1980); 및 Harland와 Weintraub, J. Cell Biol . 101:1094-1099(1985)), 칼슘 포스페이트 침전법 (Graham, F.L. et al., Virology, 52:456(1973); 및 Chen과 Okayama, Mol . Cell . Biol . 7:2745-2752(1987)), 전기 천공법(Neumann, E. et al., EMBO J., 1:841(1982); 및 Tur-Kaspa et al., Mol . Cell Biol ., 6:716-718(1986)), 리포좀-매개 형질감염법(Wong, T.K. et al., Gene, 10:87(1980); Nicolau 및 Sene, Biochim . Biophys . Acta, 721:185-190(1982); 및 Nicolau et al., Methods Enzymol ., 149:157-176(1987)), DEAE-덱스트란 처리법(Gopal, Mol . Cell Biol ., 5:1188-1190(1985)) 및 유전자 밤바드먼트(Yang et al., Proc . Natl . Acad. Sci ., 87:9568-9572(1990)) 방법에 의해 유전자를 세포내로 이입시킬 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명에 의해 예방 또는 치료될 수 있는 관절염은 퇴행성 관절염이다.

본 명세서에서 용어 “퇴행성 관절염(Osteoarthritis)”은 관절 운동에 필요한 관절 조직이 연골조직의 양적 손실에 기인하여 손상되는 질환을 의미한다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 조성물은 연골세포의 기능 이상을 제어함으로써 연골조직의 회복을 활성화시킨다. 따라서 종래의 염증제어와 같은 대증적인 접근방법이 면역기능 이상에 기인한 염증반응으로 관절조직이 파괴되는 류마티스성 관절염을 치료하는 데에 그치는 것과 달리, 본 발명의 조성물은 퇴행성 관절염에 대한 근본적인 치료방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드에 특이적으로 결합하는 항체 또는 앱타머를 포함하는 인간의 관절염 진단 키트를 제공한다.

본 명세서에서 용어 “진단”은 특정 질병 또는 질환에 대한 한 객체의 감수성(susceptibility)을 판정하는 것, 한 객체가 특정 질병 또는 질환을 현재 가지고 있는 지 여부를 판정하는 것(예컨대, 대사 이상 또는 당뇨병의 동정), 특정 질병 또는 질환에 걸린 한 객체의 예후(prognosis)를 판정하는 것, 또는 테라메트릭스(therametrics)(예컨대, 치료 효능에 대한 정보를 제공하기 위하여 객체의 상태를 모니터링 하는 것)을 포함한다. 본 발명에 따르면, 본 발명의 폴리펩타이드를 마커로 하여, 이의 발현량이 정상인에 비하여 유의하게 높다는 사실이 상술한 방법을 통해 확인되면 뼈 성장판 연골세포의 생존성 및 활성이 증가되어 관절염의 발병 위험도가 낮은 것으로 판단된다.

본 발명에 따르면, 본 발명의 폴리펩타이드를 항원-항체 반응을 이용한 면역분석(immunoassay) 방법에 따라 검출하여 관절염을 진단하는 데 이용될 수 있다.

이러한 면역분석은 종래에 개발된 다양한 면역분석(immunoassay) 또는 면역염색(immunostaining) 프로토콜에 따라 실시될 수 있다.

예를 들어, 본 발명의 방법이 방사능면역분석 방법에 따라 실시되는 경우, 방사능동위원소(예컨대, C¹⁴, I¹²⁵, P³² 및 S³⁵)로 레이블링된 항체가 본 발명의 폴리펩타이드를 검출하는 데 이용될 수 있다.

본 발명에서 이용되는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드에 대한 항체는 폴리클로날 또는 모노클로날 항체이며, 바람직하게는 모노클로날 항체이다.

본 발명의 폴리펩타이드에 대한 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,567호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol . Biol ., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies : A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies : A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan , CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다.

상술한 면역분석 과정에 의한 최종적인 시그널의 세기를 분석함으로써, 관절염을 진단할 수 있다. 즉, 인간의 시료에서 서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드에 대한 시그널이 정상 시료 보다 약하게 나오는 경우에는 관절염의 발병 위험도가 높은 것으로 진단된다.

본 발명의 키트는 항체 대신에 서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 마커에 특이적으로 결합하는 앱타머를 이용할 수 있다. 본 명세서에서 용어“앱타머”는 단일 줄기의(single-stranded) 핵산(RNA 또는 DNA) 분자 또는 펩타이드 분자로서 특정 표적물질에 높은 친화력과 특이성으로 결합하여 작용을 나타내는 것을 의미한다. 앱타머의 일반적인 내용은 Bock LC et al., Nature 355(6360):5646(1992); Hoppe-Seyler F, Butz K "Peptide aptamers: powerful new tools for molecular medicine". J Mol Med . 78(8):42630(2000); Cohen BA, Colas P, Brent R . "An artificial cell-cycle inhibitor isolated from a combinatorial library". Proc Natl Acad Sci USA . 95(24):142727(1998)에 상세하게 개시되어 있다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 관절염 진단 키트를 제공한다.

본 명세서에서, 용어“뉴클레오타이드”는 단일가닥 또는 이중가닥 형태로 존재하는 디옥시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클레오타이드이며, 다르게 특별하게 언급되어 있지 않은 한 자연의 뉴클레오타이드의 유사체를 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 명세서에서 사용되는 용어 “프라이머”는 올리고뉴클레오타이드를 의미하는 것으로, 핵산쇄(주형)에 상보적인 프라이머 연장 산물의 합성이 유도되는 조건, 즉, 뉴클레오타이드와 DNA 중합효소와 같은 중합제의 존재, 그리고 적합한 온도와 pH의 조건에서 합성의 개시점으로 작용할 수 있다. 바람직하게는, 프라이머는 디옥시리보뉴클레오타이드이며 단일쇄이다. 본 발명에서 이용되는 프라이머는 자연(naturally occurring) dNMP(즉, dAMP, dGMP, dCMP 및 dTMP), 변형 뉴클레오타이드 또는 비-자연 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 또한, 프라이머는 리보뉴클레오타이드도 포함할 수 있다.

본 발명의 프라이머는 타겟 핵산에 어닐링 되어 주형-의존성 핵산 중합효소에 의해 타겟 핵산에 상보적인 서열을 형성하는 연장 프라이머(extension primer)일 수 있으며, 이는 고정화 프로브가 어닐링 되어 있는 위치까지 연장되어 프로브가 어닐링 되어 있는 부위를 차지한다.

본 발명에서 이용되는 연장 프라이머는 타겟 핵산의 제1위치에 상보적인 혼성화 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 용어 “상보적”은 소정의 어닐링 또는 혼성화 조건하에서 프라이머 또는 프로브가 타겟 핵산 서열에 선택적으로 혼성화할 정도로 충분히 상보적인 것을 의미하며, 실질적으로 상보적(substantially complementary) 및 완전히 상보적(perfectly complementary)인 것을 모두 포괄하는 의미를 가지며, 바람직하게는 완전히 상보적인 것을 의미한다. 본 명세서에서, 프라이머 서열과 관련하여 사용되는 용어, “실질적으로 상보적인 서열”은 완전히 일치되는 서열뿐만 아니라, 특정 서열에 어닐링하여 프라이머 역할을 할 수 있는 범위 내에서, 비교 대상의 서열과 부분적으로 불일치되는 서열도 포함되는 의미이다.

프라이머는, 중합제의 존재 하에서 연장 산물의 합성을 프라이밍시킬 수 있을 정도로 충분히 길어야 한다. 프라이머의 적합한 길이는 다수의 요소, 예컨대, 온도, 응용분야 및 프라이머의 소스(source)에 따라 결정되지만 전형적으로 15-30 뉴클레오타이드이다. 짧은 프라이머 분자는 주형과 충분히 안정된 혼성 복합체를 형성하기 위하여 일반적으로 보다 낮은 온도를 요구한다. 용어 “어닐링” 또는 “프라이밍”은 주형 핵산에 올리고디옥시뉴클레오타이드 또는 핵산이 병치(apposition)되는 것을 의미하며, 상기 병치는 중합효소가 뉴클레오타이드를 중합시켜 주형 핵산 또는 그의 일부분에 상보적인 핵산 분자를 형성하게 한다.

프라이머의 서열은 주형의 일부 서열과 완전하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 주형과 혼성화 되어 프라이머 고유의 작용을 할 수 있는 범위 내에서의 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 따라서 본 발명에서의 프라이머는 주형인 상술한 뉴클레오티드 서열에 완벽하게 상보적인 서열을 가질 필요는 없으며, 이 유전자 서열에 혼성화되어 프라이머 작용을 할 수 있는 범위 내에서 충분한 상보성을 가지면 충분하다. 이러한 프라이머의 디자인은 상술한 뉴클레오티드 서열을 참조하여 당업자에 의해 용이하게 실시할 수 있으며, 예컨대, 프라이머 디자인용 프로그램(예: PRIMER 3 프로그램)을 이용하여 할 수 있다.

본 명세서에서, 용어 “핵산 분자”는 DNA(gDNA 및 cDNA) 그리고 RNA 분자를 포괄적으로 포함하는 의미를 갖으며, 핵산 분자에서 기본 구성 단위인 뉴클레오타이드는 자연의 뉴클레오타이드뿐만 아니라, 당 또는 염기 부위가 변형된 유사체 (analogue)도 포함한다(Scheit, Nucleotide Analogs, John Wiley, New York(1980); Uhlman 및 Peyman, Chemical Reviews, 90:543-584(1990)).

본 발명의 키트에서 출발물질이 gDNA인 경우, gDNA의 분리는 당업계에 공지된 통상의 방법에 따라 실시될 수 있다(참조: Rogers & Bendich (1994)).

출발물질이 mRNA인 경우에는, 당업계에 공지된 통상의 방법에 총 RNA를 분리하여 실시된다(참조: Sambrook, J. et al., Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001); Tesniere, C. et al., Plant Mol . Biol . Rep ., 9:242(1991); Ausubel, F.M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Willey & Sons(1987); 및 Chomczynski, P. et al., Anal. Biochem . 162:156(1987)). 분리된 총 RNA는 역전사효소를 이용하여 cDNA로 합성된다. 상기 총 RNA는 인간(예컨대, 비만 또는 당뇨 환자)으로부터 분리된 것이기 때문에, mRNA의 말단에는 폴리-A 테일을 갖고 있으며, 이러한 서열 특성을 이용한 올리고 dT 프라이머 및 역전사 효소를 이용하여 cDNA을 용이하게 합성할 수 있다(참조: PNAS USA, 85:8998(1988); Libert F, et al., Science, 244:569(1989); 및 Sambrook, J. et al., Molecular Cloning . A Laboratory Manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Press(2001)).

본 발명의 키트에 있어서, 상기 특정 서열을 규명하는 것은 당업계에 공지된 다양한 방법을 응용하여 실시될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 응용될 수 있는 기술은, 형광 인 시투 혼성화 (FISH), 직접적 DNA 서열결정, PFGE 분석, 서던 블롯 분석, 단일-가닥 컨퍼메이션 분석(SSCA, Orita et al., PNAS , USA 86:2776(1989)), RNase 보호 분석(Finkelstein et al., Genomics, 7:167(1990)), 닷트 블롯 분석, 변성 구배 젤 전기영동(DGGE, Wartell et al., Nucl . Acids Res ., 18:2699(1990)), 뉴클레오타이드 미스매치를 인식하는 단백질(예: E. coli의 mutS 단백질)을 이용하는 방법(Modrich, Ann . Rev . Genet ., 25:229-253(1991)), 및 대립형-특이 PCR을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

다른 기술들은 일반적으로 본 발명의 뉴클레오타이드 서열에 상보적인 프로브 또는 프라이머를 이용한다.

예를 들어, RNase 보호 분석에서, 본 발명의 뉴클레오타이드를 포함하는 서열에 상보적인 리보프로브가 이용된다. 상기 리보프로브와 인간으로부터 분리한 DNA 또는 mRNA를 혼성화시키고, 이어 미스매치를 검출할 수 있는 RNase A 효소로 절단한다. 만일, 미스매치가 있어 RNase A가 인식을 한 경우에는, 보다 작은 밴드가 관찰된다.

혼성화 시그널을 이용하는 분석에서, 본 발명의 뉴클레오타이드를 포함하는 서열에 상보적인 프로브가 이용된다. 이러한 기술에서, 프로브와 타깃 서열의 혼성화 시그널을 검출하여 직접적으로 질환의 위험도를 결정한다.

본 명세서에서, 용어 “프로브”는 특정 뉴클레오타이드 서열에 혼성화될 수 있는 디옥시리보뉴클레오타이드 및 리보뉴클레오타이드를 포함하는 자연 또는 변형되는 모노머 또는 결합을 갖는 선형의 올리고머를 의미한다. 바람직하게는, 프로브는 혼성화에서의 최대 효율을 위하여 단일가닥이다. 프로브는 바람직하게는 디옥시리보뉴클레오타이드이다.

본 발명에 이용되는 프로브로서, 상기 뉴클레오타이드를 포함하는 서열에 완전하게(perfectly) 상보적인 서열이 이용될 수 있으나, 특이적 혼성화를 방해하지 않는 범위 내에서 실질적으로(substantially) 상보적인 서열이 이용될 수도 있다. 바람직하게는, 본 발명에 이용되는 프로브는 본 발명의 뉴클레오타이드를 포함하는 서열에 혼성화될 수 있는 서열을 포함한다. 보다 바람직하게는, 상기 프로브의 3’-말단 또는 5’-말단은 상기 뉴클레오타이드에 상보적인 염기를 갖는다. 일반적으로, 혼성화에 의해 형성되는 듀플렉스(duplex)의 안정성은 말단의 서열의 일치에 의해 결정되는 경향이 있기 때문에, 3’-말단 또는 5’-말단에 상기 뉴클레오타이드 염기에 상보적인 염기를 갖는 프로브에서 말단 부분이 혼성화되지 않으면, 이러한 듀플렉스는 엄격한 조건에서 해체될 수 있다.

혼성화에 적합한 조건은 Joseph Sambrook, et al., Molecular Cloning , A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y.(2001) 및 Haymes, B. D., et al., Nucleic Acid Hybridization , A Practical Approach, IRL Press, Washington, D.C. (1985)에 개시된 사항을 참조하여 결정할 수 있다. 혼성화에 이용되는 엄격한 조건(stringent condition)은 온도, 이온세기(완충액 농도) 및 유기 용매와 같은 화합물의 존재 등을 조절하여 결정될 수 있다. 이러한 엄격한 조건은 혼성화되는 서열에 의존하여 다르게 결정될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진다.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 관절염은 퇴행성 관절염이다.

본 발명의 바람직한 구현 예에 따르면, 본 발명의 뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드가 저발현된 인간은 증가된 관절염 위험도를 나타낸다.

본 명세서에서 용어“저발현”은 본 발명의 뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 발현량이 정상인에 비하여 유의하게 낮은 경우를 의미하며, 바람직하게는 본 발명의 뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드의 발현량이 정상인의 5-65%인 경우를 의미한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 관절염 치료제 조성물의 스크리닝 방법을 제공한다:

(a) 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시키는 단계; 및

(b) 상기 뉴클레오타이드 서열의 발현량을 측정하는 단계, 상기 뉴클레오타이드 서열의 발현이 증가되는 경우에는 상기 시료는 관절염 치료제 조성물로 판정된다.

본 발명의 방법에 따르면, 우선 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 세포에 분석하고자 하는 시료를 접촉시킨다. 바람직하게는, 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 상기 세포는 인간의 연골 세포(chondrocyte)이다. 본 발명의 스크리닝 방법을 언급하면서 사용되는 용어 “시료”는 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열의 발현량에 영향을 미치는지 여부를 검사하기 위하여 스크리닝에서 이용되는 미지의 물질을 의미한다. 상기 시료는 화학 물질, 뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, siRNA(small interference RNA) 및 천연물 추출물을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 이어, 시료가 처리된 세포에서 서열목록 제1서열의 뉴클레오티드 서열의 발현량을 측정한다. 발현량의 측정은 상기 기재한 바와 같으며, 측정 결과, 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열의 발현이 억제되는 경우에는 상기 시료는 관절염 치료제 조성물로 판정될 수 있다.

본 발명의 바람직한 구현예에 따르면, 본 발명의 관절염은 퇴행성 관절염이다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 세포내에서 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열을 발현을 증가시키는 물질을 제공한다.

본 명세서에서 용어 “발현의 증가”란 정상인에 비하여 유전자의 발현이 측정 가능할 정도로 유의하게 증가하는 것을 말하며, 보다 바람직하게는 정상인에 비하여 발현량이 130% 이상이 되는 것을 말한다.

뉴클레오타이드 서열의 발현을 증가시키는 물질은 전사(transcription)의 효율을 증대시키는 물질(예를 들어 전사인자), mRNA의 안정성(stability)를 높여주는 물질(예를 들어 CAP-binding protein) 또는 mRNA의 번역(translation)을 촉진시키는 물질(예를 들어 TIF:translation initiation factor)을 포함하나 이에 제한되지 않고 유전자의 발현을 증대시키는 것으로 당업계에 알려진 모든 물질을 포함한다.

본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 세포내에서 서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드의 활성을 증가시키는 물질을 제공한다.

본 명세서에서 용어 “활성의 증가”란 정상인에 비하여 단백질의 생체내 고유한 기능이 측정 가능할 정도로 유의하게 증가하는 것을 말하며, 보다 바람직하게는 정상인에 비하여 단백질의 생체내 고유의 기능이 130% 이상이 되는 것을 말한다. 활성(activity)의 증가는 단순한 기능(function)의 증가 뿐 아니라 안정성(stability)의 증가로 기인한 궁극적인 활성 증가를 포함한다. 본 발명의 폴리펩타이드의 활성 또는 안정성을 증가시키는 물질은 예를 들어 α-helix 구조를 견고하게 하는 각종 단백질, PEGylation을 위한 PEG(polyethylene glycol) 또는 인간 혈청 알부민을 포함하나 이에 제한되지 않고 단백질의 활성 또는 안정성을 증대시키는 것으로 당업계에 알려진 모든 물질을 포함한다.

본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:

(a) 본 발명은 관절염 치료용 조성물, 관절염 진단 키트 및 관절염 치료제 조성물의 스크리닝 방법을 제공한다.

(b) 본 발명은 관절 조직의 기능 유지 및 연골세포 생존성 향상을 통해 관절염의 근본적인 예방 및 치료에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1은 연골조직 기능성 유지 측면에서 분석한 퇴행성 관절염의 병인 기전을 도식적으로 설명한 그림이다.
도 2는 본 발명이 퇴행성 관절염 예방 및 치료에 활용될 수 있는 논리적 근거를 도식적으로 설명한 그림이다.
도 3은 퇴행성 관절염 치유 측면에서 현재 관절염 치료기술의 문제점을 도식적으로 설명한 그림이다.
도 4는 관절 연골세포에서의 Nkx3.2 발현을 RT-PCR을 통해 확인한 결과를 나타낸 그림이다. E16.5 마우스 배아의 연골 성장판으로부터 분리한 총 RNA를 이용해 cDNA를 합성한 후 GAPDH 또는 Nkx3.2에 대한 PCR을 수행하고(1번 레인), 인간 관절 연골조직에서 분리한 연골세포로부터 총 RNA를 추출하여 cDNA를 합성한 후 GAPDH 또는 Nkx3.2에 대한 PCR을 수행하였다(2번 레인). GAPDH의 발현 정도를 기준으로 한 정량적인 비교 결과, 성장판 연골세포에 비해 관절 연골세포에서의 Nkx3.2 발현이 현저히 높은 수준으로 관찰되었다.
도 5는 관절 연골세포에서 Nkx3.2의 shRNA를 통한 Nkx3.2의 발현 억제를 RT-PCR을 통해 확인한 결과를 나타낸 그림이다. 4번 레인은 인간 관절 연골조직으로부터 분리 배양된 연골세포에 인간 Nkx3.2 shRNA 바이러스를 감염시켜 해당 유전자의 발현을 녹다운시킨 결과를 나타낸다. 1번 레인은 RT(-) PCR 결과를, 2번 레인은 감염시키지 않은 관절 연골세포에 대한 결과를, 3번 레인은 pLKO 대조군 shRNA 바이러스가 감염된 관절 연골세포에 대한 결과를 각각 나타낸다.
도 6은 Nkx3.2가 발현억제를 통해 유도되는 관절 연골세포의 사멸을 광학 현미경 관찰을 통해 확인한 결과를 나타낸 그림이다. 좌측 패널의 대조군 shRNA 바이러스를 감염시킨 관절 연골세포에 비하여, 우측 패널의 Nkx3.2 shRNA 바이러스가 감염된 관절 연골세포들의 생존 상태가 현저히 불량해짐을 확인할 수 있었다.
도 7은 Nkx3.2가 발현억제를 통해 유도되는 관절 연골세포의 사멸을 FACS 분석을 통해 확인한 결과를 나타낸 그림이다. Nkx3.2의 발현이 특이적으로 억제된 연골세포의 생존도를 Annexin-V의 결합 정도를 측정함으로써 확인하였다. 좌측 패널의 대조군 shRNA 바이러스를 감염시킨 관절 연골세포에 비하여, 우측 패널의 Nkx3.2 shRNA 바이러스가 감염된 관절 연골세포들의 Annexin-V의 결합 정도가 현저히 증가함을 확인할 수 있었다.
도 8은 퇴행성 관절염 환자 관절 연골세포에서 Nkx3.2의 발현 변화를 RT-PCR을 통해 확인한 결과를 나타낸 그림이다. 1번 레인은 정상인과 퇴행성 관절염 환자의 관절 연골로부터 분리된 연골세포들의 총 RNA를 이용하여 합성한 cDNA를 가지고 GAPDH 또는 Nkx3.2에 대한 PCR을 수행한 결과이며, 2번 레인은 인간 관절 연골조직의 연골세포에서 분리한 총 RNA를 이용해 cDNA를 합성한 후 GAPDH 및 Nkx3.2에 대한 PCR을 수행한 결과이다. 3번 레인은 대조군인 RT(-) PCR을 나타낸다.
도 9는 퇴행성 관절염 환자 관절 연골세포에서 Nkx3.2의 발현 변화를 Western blot을 통해 확인한 결과를 나타낸 그림이다. 정상인과 퇴행성 관절염 환자의 관절 연골로부터 분리된 연골세포들의 총 단백질을 분리하고, 이를 이용해 GAPDH 및 Nkx3.2에 대한 웨스턴 블롯팅 분석을 수행하였다. GAPDH의 발현 정도를 기준으로 정량적인 비교를 하였을 경우, 퇴행성 관절염 환자의 관절 연골세포에서 Nkx3.2 단백질 level이 현저히 낮은 수준으로 관찰되었다.
도 10은 정상과 퇴행성 관절염 연골세포의 세포사멸을 FACS 분석을 통해 비교한 결과를 나타낸 그림이다. 연골세포들의 생존도를 Annexin-V의 결합 정도를 측정함으로써 확인하였다. 좌측 레인들에서 보이는 바와 같이 정상(5.15%)에 비해 퇴행성 관절염 환자(24.3%)의 연골세포에서 훨씬 높은 수준의 세포 사멸이 관찰되었으며, 또한 NF-kappaB 활성 저해에 의해 추가적으로 유도시킨 세포 사멸에 대해서도 정상(19.93%)에 비해 퇴행성 관절염 환자(68.11%)의 연골세포가 현격히 높은 수준의 세포 사멸 현상을 일으켰다.
도 11은 Safranin-O 염색을 이용하여 퇴행성 관절염 모델 마우스에서의 Nkx3.2의 인 비보 효능을 확인한 결과를 나타낸 그림이다. 좌측 패널은 아무런 시술을 수행하지 않은 13주령의 정상 마우스 뒷다리 관절 절편의 Safranin-O 염색 사진으로, 붉은색 염색 부분이 정상적인 관절 연골조직의 형태를 보여주고 있다. 중앙 패널은 9주령 시기에 인대 절제시술법으로 퇴행성 관절염을 유도하고 같은 시기에 GFP 단백질을 과발현하는 렌티바이러스를 감염시킨 마우스가 13 주령이 된 시기 뒷다리를 적취하고 관절 절편에 대해 Safranin-O 염색을 한 사진이다. 우측 패널은 중안 패널과 동일하나, GFP 대신 Nkx3.2의 과발현을 유도해 준 경우이다. 중앙과 우측 패널을 비교해 보면 Nkx3.2의 과발현이 인위적으로 제공된 환경에서 퇴행성 관절염 유도에 따른 연골조직의 소실이 현저히 보호됨을 관찰할 수 있다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실험방법

성장판 연골세포와 관절 연골세포간의 유전자 발현 비교

E16.5 마우스 배아로부터 연골 성장판을 절개하여 이로부터 총 RNA를 분리하고, 이를 이용해 cDNA를 합성한 후 GAPDH 또는 Nkx3.2에 대한 PCR을 수행하였다. 또한 인간 관절 연골조직으로부터 연골세포를 분리하여 이로부터 총 RNA를 분리하고, 이를 이용해 cDNA를 합성한 후 GAPDH 또는 Nkx3.2에 대한 PCR을 수행하였다.

본 발명에 포함된 RT-PCR 실험들은 아래와 같이 수행되었다. 각 실험 별로 명시된 세포 배양에서 총 RNA를 분리하였으며, 이 때 Qiagen사의 RNeasy kit를 사용자 지침에 따라 사용하였다. 얻어진 총 RNA 중 5μg을 사용하여 cDNA를 합성하였고, 이 때 Invitrogen사의 cDNA synthesis kit를 사용자 지침에 따라 사용하였다. 이와 같이 얻어진 cDNA 주형을 동량 사용하여 해당 유전자에 대한 PCR 실험을 수행함으로써 각 유전자에 대한 mRNA 존재량을 정량적으로 비교하였다. 본 발명에 사용된 PCR 반응 혼합물은 1X Taq 버퍼(Invitrogen), 125 μM dNTP, 1 mM 탑(top) 프라이머, 1 mM 바텀(bottom) 프라이머, 2X 인핸서 용액(Invitrogen)을 포함하였으며, 각 반응마다 0.5 유닛의 Taq 중합효소를 사용하였다.

유전자에 대한 프라이머 서열, 프라이머 어닐링 온도 및 PCR 사이클 수

	유전자	프라이머 서열	어닐링 온도 / 사이클 수
마우스	GAPDH	센스 프라이머 : tttgtgatgggtgtgaaccacg	58 ℃ / 22 사이클
		안티센스 서열 : ttgtgagggagatgctcagtgttg
	Nkx3.2	센스 프라이머 : aaccgtcgctacaagaccaaacg	61 ℃ / 35 사이클
		안티센스 서열 : gggacgcaggaatccttctttg
인간	GAPDH	센스 프라이머 : acctgacctgccgtctagaaaa	59 ℃ / 22 사이클
		안티센스 서열 : tgatggtacatgacaaggtgcg
	Nkx3.2	센스 프라이머 : tgcacaagcaggaagcgcct	60 ℃ / 25 사이클
		안티센스 서열 : taaggaggcgaaaagcggcg

RNA 녹다운(knockdown)에 의한 연골세포의 생존성 변화 측정

인간 관절 연골조직으로부터 분리 배양된 연골세포에 인간 Nkx3.2 shRNA 바이러스를 감염시켜 Nkx3.2 유전자의 발현을 녹다운시켰다.

본 발명에 포함된 RNA 녹다운 실험들을 위한 shRNA 렌티바이러스 용액들은 아래와 같이 준비되었다. ATCC로부터 구입한 HEK293T(CRL-11268)세포를 페니실린-스트렙토마이신이 포함되지 않은 DMEM(10% FBS 포함) 배지를 사용하여 24시간 동안 배양시켜 60%의 컨플루언시에 도달하도록 한 뒤, pLKO.1 대조군 벡터(Openbiosystems Cat. No. RHS4080) 또는 인간 Nkx3.2에 특이적인 shRNA 컨스트럭트(Openbiosystems Cat. No. RHS4533-NM_001189/TRCN0000013602, 헤어핀(hairpin) 서열:CCGGTCCAAAGACCTAGAGGAGGAACTCGAGTTCCTCCTCTAGGTCTTTGGATTTTT)를 형질도입하였다. 다음날, 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 DMEM(10% FBS 포함) 배지 10ml로 교체한 뒤, 48 시간 후 상층액을 취하여 RNA 녹다운 실험에 사용하였다. RNA 녹다운을 위해 사용할 세포 배양은 실험 당일 60-70%의 컨플루언시가 되도록 준비하고 위에서 준비된 shRNA 녹다운 렌티 바이러스 1 ml을 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 DMEM(10% FBS 포함)에 8μg/ml의 폴리브렌이 첨가된 배지 1ml과 혼합하여 감염시켰다. 24 시간 이후, 페니실린-스트렙토마이신이 포함된 신선한 DMEM(10% FBS 포함) 1ml로 배지를 교체하고, 24 시간 이후 해당 세포 배양을 각 종 분석에 사용하였다.

Nkx3.2 유전자의 발현을 녹다운시킨 관절 연골세포, 렌티바이러스를 감염시키지 않은 관절 연골세포 및 pLKO 대조군 shRNA 바이러스가 감염된 관절 연골세포의 연골세포의 사멸 정도를 올림푸스사의 CKX41 광학 현미경을 이용한 40배 확대 관찰 또는 FACS 분석을 통하여 비교하였다.

FACS 분석들은 다음과 같이 수행하였다. TUNEL 분석을 수행할 배양 세포를 트립신(Invitrogen)으로 처리 한 뒤, 5% 우아 혈청과 0.09% NaN₃이 포함된 PBS로 2차례 세척하고, 10mM HEPES(pH 7.4), 140 mM NaCl 및 2.5 mM CaCl₂가 포함된 1x Annexin-V 결합 완충액(BD Science)으로 한 번 더 세척하였다. 이 상태에서 Annexin-V-FITC(BD Science)를 세포와 상온에서 20분간 반응시킨 후, FACScaliber(BD Science) 기기를 이용해 형광 표지된 세포들을 정량적으로 측정하였다.

연골세포의 Nkx3 .2 RNA 발현 측정

정상인과 퇴행성 관절염 환자의 관절 연골로부터 분리된 연골세포들의 총 RNA를 분리하고, 이를 이용해 cDNA를 합성한 후 GAPDH 및 Nkx3.2에 대한 PCR을 수행하였으며, 인간 관절 연골조직으로부터 연골세포를 분리하여 총 RNA를 분리하고, 이를 이용해 cDNA를 합성한 후 GAPDH 및 Nkx3.2에 대한 PCR을 수행하였다. RT-PCR 실험과정은 상술한 바와 같다.

연골세포의 Nkx3 .2 단백질 발현 측정

정상인과 퇴행성 관절염 환자의 관절 연골로부터 분리된 연골세포들의 총 단백질을 분리하고, 이를 이용해 GAPDH 및 Nkx3.2에 대한 웨스턴 블롯팅 분석을 수행하였다. 웨스턴 블롯팅 실험은 통상적인 기법으로 수행되었으며(8), 각 항체 별 특이 사항은 아래와 같이 요약할 수 있다

1) 항-GAPDH : AbFrontier사, Cat. No. LF-PA0018, 희석 배수 1:5000, 2% milk 포함 PBST

2) 항-Nkx3.2 : Abcam사, Cat. No. ab56029, 희석 배수 1:2000, 1% 밀크 포함 TBST

퇴행성 관절염 환자의 연골세포의 사멸 측정

정상인과 퇴행성 관절염 환자들의 연골세포들의 생존도를 Annexin-V의 결합 정도를 이용한 FACS 분석을 통해 비교하였다. 또한 Nkx3.2가 연골세포의 생존을 위해 활성화시키는 NF-κB에 대한 활성 저해제인 BAY 11-7085(Calbiochem)를 10 mM로 2시간 동안 각 세포에 처리함으로써 추가적인 세포사멸 정도를 관찰하였다. FACS 분석 방법은 상술한 바와 같다.

렌티바이러스 과발현 마우스의 연골 조직 관찰

Nkx3.2가 실제로 퇴행성 관절염을 치료에 활용될 수 있을지에 대한 가능성을 인 비보 마우스 모델을 통하여 최종 검증하였다. 이를 위해 퇴행성 관절염을 유도하는 마우스 모델을 선택하였다. 즉, 본 발명에서 사용한 퇴행성 관절염 모델 마우스는 무릎관절의 내측 연골판(medial meniscus)을 외과적 수술을 통해 절단해줌으로써 구축하였다(1). 관절 조직 내 GFP 또는 Nkx3.2의 과발현은 해당 유전자를 발현하고 있는 50 μl의 렌티바이러스 용액을 인대 절제 시술 부위에 점적하고 봉합 전 약 30분 간 상온에서 방치하여 감염을 유도하였다. 인대 절제 시술 4주 이후, 마우스의 뒷 무릎 관절을 적취하여 조직학적 분석을 수행하였다. 형질도입에 사용된 렌티바이러스는 pLentiM1.4 백본을 이용하여 제조하였으며, 1ml 당 10⁶-10⁷ 형질전환 유닛을 포함하는 바이러스 용액이 실험을 사용하였다. 전체적인 바이러스 생산은 (주)마크로젠사에 의뢰하여 주문 제작 되었다.

13주령의 정상 마우스, 9주령 시기에 인대 절제시술법으로 퇴행성 관절염을 유도하고 같은 시기에 GFP 단백질을 과발현하는 렌티바이러스를 감염시킨 후 13 주령이 된 마우스 및 9주령 시기에 역시 인대 절제로 퇴행성 관절염을 유도한 뒤 하고 같은 시기에 Nkx3.2의 과발현을 유도한 후 13 주령이 된 마우스의 관절 조직을 각각 Safranin-O(Sigma-Aldrich)로 염색하였다.

실험결과

성장판 연골세포와 관절 연골세포간의 유전자 발현 비교

E16.5 마우스 배아의 연골 성장판 및 인간 관절 연골조직의 연골세포에서 분리한 총 RNA로 각각 cDNA를 합성한 후 GAPDH 및 Nkx3.2에 대한 PCR을 수행하였다. GAPDH의 발현 정도를 기준으로 정량적인 비교를 하였을 경우, 성장판 연골세포에 비해 관절 연골세포에서의 Nkx3.2 발현이 현저히 높은 수준으로 관찰되었다(도 4).

RNA 녹다운( knockdown )에 의한 연골세포의 생존성 변화

인간 관절 연골조직으로부터 분리 배양된 연골세포에 인간 Nkx3.2 shRNA 바이러스를 감염시켜 해당 유전자의 발현을 녹다운시킨 결과(도 5), 감염시키지 않은 관절 연골세포 및 pLKO 대조군 shRNA 바이러스가 감염된 관절 연골세포에 비하여 연골세포의 사멸이 현저히 억제됨을 현미경 관찰(도 6) 및 FACS 분석을 통하여 확인하였다. 이러한 결과는 Nkx3.2가 관절 연골세포의 생존 유지에 필수적으로 연관되어 있음을 증명해 주고 있다.

Nkx3 .2의 RNA 발현

정상인과 퇴행성 관절염 환자의 관절 연골로부터 분리된 연골세포들의 총 RNA를 이용하여 GAPDH 및 Nkx3.2에 대한 PCR을 수행한 결과, GAPDH의 발현 정도를 기준으로 정량적인 비교를 하였을 때 퇴행성 관절염 환자의 관절 연골세포에서 Nkx3.2 mRNA 발현이 현저히 낮은 수준으로 관찰되었다(도 8). 이는 앞선 RNA 녹다운 실험 결과와 정확히 일관되는 결과로서 퇴행성 관절염의 발병에 따른 Nkx3.2의 발현 저하가 관절 연골세포의 생존을 저해하였음을 추론할 수 있는 중요한 발견일 뿐만 아니라 Nkx3.2가 퇴행성 관절염에 대한 신규 바이오마커로서 활용될 수 있음을 보여 주고 있다.

Nkx3 .2의 단백질 발현

정상인과 퇴행성 관절염 환자의 관절 연골로부터 분리된 연골세포를 이용하여 GAPDH 및 Nkx3.2에 대한 웨스턴 블롯팅 분석을 수행하였다. GAPDH의 발현 정도를 기준으로 정량적인 비교를 하였을 경우, 퇴행성 관절염 환자의 관절 연골세포에서 Nkx3.2 단백질이 현저히 낮은 수준으로 관찰되었다(도 9).

퇴행성 관절염 환자의 연골세포의 사멸

연골세포들의 생존도를 Annexin-V의 결합 정도를 통해 측정한 결과, 정상(5.15%)에 비해 퇴행성 관절염 환자(24.3%)의 연골세포에서 훨씬 높은 수준의 세포 사멸이 관찰되었다(도 10). 또한 BAY 11-7085의 처리를 각 세포에 처리하여 추가적인 세포사멸 정도를 관찰한 결과, 정상(19.93%)에 비해 퇴행성 관절염 환자(68.11%)의 연골세포가 현격히 높은 수준의 세포 사멸 현상을 일으켰다(도 10).

렌티바이러스 과발현 마우스의 연골 조직 관찰

아무런 시술을 수행하지 않은 정상 마우스, 인대 절제시술법을 시행한 뒤 GFP 단백질을 과발현하는 렌티바이러스를 감염시킨 마우스 및 인대 절제 뒤 Nkx3.2의 과발현을 유도한 마우스의 관절 조직을 각각 Safranin-O으로 염색한 결과, Nkx3.2의 과발현이 인위적으로 제공된 마우스가 GFP를 과발현시킨 대조군 마우스와 비교하여 퇴행성 관절염 유도에 따른 연골조직의 소실이 현저히 억제됨을 확인하였다(도 11). 이는 퇴행성 관절염의 발병과 함께 그 발현이 감소되는 Nkx3.2의 발현을 인위적으로 복원시켜준 환경에서는 퇴행성 관절염의 진행이 효과적으로 제어될 수 있음을 보여주는 결과이다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

참고문헌

1. Glasson, S.S. et al. Deletion of active ADAMTS5 prevents cartilage degradation in a murine model of osteoarthritis. Nature 434:644648(2005).

2. Li, Q., Withoff, S., and Verma, I.M. Inflammation-associated cancer: NF-kappaB is the lynchpin. Trends Immunol. 26:318-325(2005).

3. Meffert, M.K., and Baltimore, D. Physiological functions for brain NF-kappaB. Trends Neurosci. 28:37-43(2005).

4. Vallabhapurapu, S., and Karin, M. Regulation and function of NF-kappaB transcription factors in the immune system. Annu . Rev . Immunol. 27:693-733(2009).

5. Chen, Z., Hagler, J., Palombella, V.J., Melandri, F., Scherer, D., Ballard, D., and Maniatis, T. Signal-induced site-specific phosphorylation targets I kappa B alpha to the ubiquitin-proteasome pathway. Genes Dev. 9:1586-1597(1995).

6. Hayden, M.S., and Ghosh, S. Signaling to NF-kappaB. Genes Dev. 18:2195-2224(2004).

7. Park, M., Yong, Y., Choi, S.W., Kim, J.H., Lee, J.E., and Kim, D.W. Constitutive RelA activation mediated by Nkx3.2 controls chondrocyte viability. Nat . Cell Biol. 9:287-298(2007).

8. Harlow E., and Lane D. In: Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York (1988).

서열목록 전자파일 첨부

Claims (15)

1. 서열목록 제2서열의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드를 유효성분으로 포함하는 퇴행성 관절염 예방 또는 치료용 조성물.
   
2. 서열목록 제2서열의 아미노산 서열을 코딩하는 뉴클레오타이드 서열을 유효성분으로 포함하는 퇴행성 관절염 예방 또는 치료용 조성물.
   
3. 제 2 항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 서열목록 제1서열의 뉴클레오타이드 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 퇴행성 관절염 예방 또는 치료용 조성물.
   
4. 제 3 항에 있어서, 상기 뉴클레오타이드 서열은 유전자 전달체(gene delivery system)에 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 퇴행성 관절염 예방 또는 치료용 조성물.
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