CN112409454B - 一种法氏囊七肽及其制备方法和应用 - Google Patents

一种法氏囊七肽及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种从法氏囊中发现一种新的七肽，氨基酸序列为SEQ ID NO:1 APKPRKK，该七肽是第一次从禽类的中枢体液免疫器官中分离出来。本发明还提供了上述法氏囊七肽的分离方法。本发明提供的法氏囊七肽在实验动物体内具有明显的免疫调节作用，法氏囊七肽对体液免疫具有诱导效应(如调节抗体的产生和分型。

Description

一种法氏囊七肽及其制备方法和应用
技术领域：
本发明涉及生物制品技术领域，具体涉及一种具有免疫调节作用的法氏囊七肽，及其在免疫中的应用。
背景技术：
法氏囊(bursa of Fabricus，BF)最早是由Hieronymus Fabricus于1961年发现，同时并明确了腔上囊的形态和位置，由此而命名为bursa of Fabricus。法氏囊是禽类特有的体液免疫的中枢淋巴器官，位于泄殖腔背侧，其盲端呈囊状，朝向躯体前端，颈部以短柄朝向躯体后下方，开口于泄殖腔。早期的研究者观察到法氏囊随性成熟而逐渐退化，所以一直认为它是与生殖生理有关的器官。自1956年，Glick等发现摘除法氏囊会降低雏鸡对沙门氏菌“O”抗原的抗体生成以来，法氏囊被人们确认为禽类特有的中枢淋巴器官，是B细胞的最早发生场所，B细胞由它迁移到外周淋巴器官定居和繁衍，执行免疫功能。
1960年，Glick等报道了注射6次丙酮处理9小时法氏囊粗提物的生理盐水悬液，可以提高摘除法氏囊的雏鸡对绵羊红细胞(SRBC)的抗体水平。Baba等1976年报道用鸡法氏囊提取液给切除法氏囊的雏鸡注射后，可使这些鸡获得产生IgG的能力并提高抗体水平。1976年，Brand发现法氏囊提取物能诱导雏鸡骨髓细胞表达Th-1抗原，并还存在有促进早期B细胞表达Bu-1抗原的因子，而且囊提取液浓度越低，对诱导B细胞分化的能力就越强。1981年，高舜德等进行了鸡胚法氏囊提取液对法氏囊复生的研究。1982年，Eerola等报道了由体外培养的法氏囊上皮细胞及无血清的培养上清具有促进B淋巴细胞分化的生物学特性。Audhya等在1986年首次报道了从160g鸡的法氏囊中分离到1.3mg囊素(bursin，BS)。经质谱鉴定分析，认为得到BS是一种三肽排列结构的物质，其氨基酸组成顺序为Lys-His-Gly-NH2，其中Lys∶His∶Gly∶NH2为1∶0.9∶1∶0.8，并证明它能诱导B细胞前体的分化，且能特异性地提高人Daudi B细胞中cAMP和cGMP的水平，而对T细胞较弱。当用浓度为100ug/ml的BS进行刺激时，B淋巴细胞内的cAMP和cGMP的水平可达最高值8-15pmol/ml，而对T淋巴细胞则只能使其cGMP水平升高，不能使其cAMP水平升高。这是从法氏囊得到且有关B细胞发育的第一个结构明确的活性因子。
在公开号为CN109134613A和CN101830968A的中国发明专利申请中分别发现了具有免疫增强功能的两种法氏囊七肽BP7。
发明内容：
本发明首次发现了一条新的法氏囊七肽，与前面发现的两种法氏囊七肽相比，此次发现的BP7除能显著提高疫苗免疫效力，还能明显促进B细胞的分化，本申请提供了一种天然法氏囊七肽。
本发明提供如下技术方案：
本发明提供了一种新型法氏囊七肽，氨基酸序列为SEQ ID NO:1APKPRKK。
本发明还提供了上述法氏囊七肽的制备方法，包括：
1)取健康青年鸡的法氏囊组织，于生理盐水中碾碎，以g:ml计，法氏囊与生理盐水的比例为2：3；反复冻融三次，并在0-10℃下10000-16000g离心60分钟，采用截流分子量为1000Da的超滤膜过滤，真空冷冻干燥，得法氏囊七肽冻干样品；
2)冻干样品以PBS稀释，12000g离心10分钟，经0.22μm滤膜过滤，并冻干，得二次冻干样品；
3)二次冻干样品用B液稀释，12000g离心10分钟，然后用0.22um滤膜过滤；取滤液经反向高效液相纯化分析，收获滞留时间为10钟的活性峰，即得；所述B液为含有2％乙腈和0.065％三氟乙酸的水溶液。
本发明进一步提供了上述的法氏囊七肽在制备免疫增强剂中的应用。
本发明提供的法氏囊七肽的制备方法具有以下有益效果：
1、从法氏囊中发现一种新的七肽，氨基酸序列为SEQ ID NO:1APKPRKK，该七肽是第一次从禽类的中枢体液免疫器官中分离出来。
2、在实验动物体内具有明显的免疫调节作用，法氏囊七肽对体液免疫具有诱导效应(如调节抗体的产生和分型)，还能明显促进B细胞的分化。
附图说明：
图1：法氏囊七肽的分离和纯化的高效液相色谱图，箭头所指，BP7
的洗脱峰；
图2为小鼠淋巴细胞增殖分析图，与空白对照组比较，差异显著(P＜0.01)；
图3为AIV抗体IgG测定，与AIV免疫组比较，差异显著(P＜0.01)；
图4为细胞因子分析图，与空白对照组比较，差异显著(P＜0.01)；
图5为B细胞分化实验结果示意图。
具体实施方式：
下面结合附图对本发明的较佳实施例进行详细阐述，以使本发明的优点和特征能更易被本领域人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
实施例1、法氏囊素七肽的分离与鉴定：
取健康4～6周龄鸡的法氏囊(AA肉鸡，上海农业科学院附属养殖场)4000克，用6000ml生理盐水碾碎、混匀，反复冻融三次。在4℃，12000g离心60分钟，上清转入另一个管中，再次离心一次。然后经1000Da超滤膜，超滤，并冻干滤液。冻干样品用PBS稀释，12000g离心10分钟，然后用0.22um滤膜过，并冻干。冻干样品用B液(2％乙腈，0.065％三氟乙酸)稀释，12000g离心10分钟，然后用0.22um滤膜过滤。取滤液经反向高效液相纯化分析，收获滞留时间为10钟的活性峰(见图1)。收获的洗脱液经MALDI-TOF-MS分析，氨基酸序列APKPRKK(SEQ ID NO:1)，这是第一次从法氏囊中分离发现。
采用固相化学合成方法，合成氨基酸结构相同的七肽，纯度在97％以上。
实施例2、BP7作为免疫增强剂使用
1、BP7合成
采用固相化学合成方法，合成法氏囊七肽(APKPRKK)，纯度在98％以上。
2、产品使用
以4-6周龄BALB/c小鼠(购自扬州大学试验动物中心)与40μg/ml的法氏囊七肽联合免疫两次，分别在两次次免疫后14天，采血，分离血清，检测抗体IgG的变化情况，分析法氏囊七肽对体液免疫的调节功能(见表1)。通过该实验可以发现法氏囊七肽可以在小鼠上提高抗体水平，并且具有调节细胞免疫反应的功能。
表1：小鼠免疫程序
Figure BDA0002760304290000041
2)抗体IgG检测，采用间接ELISA方法，具体操作方法为：分别于免疫后14天、28天和42天，采血分离血清检测特异的亚型抗体。将102.5EID50/ml灭活AIV抗原包被板条，100μl/孔，4℃作用过夜，或37℃作用2小时，洗涤三次，然后1％BSA封闭37℃作用2个小时，或4℃作用过夜。然后加入血清，分别按1:10–1:105四个梯度，37℃作用2个小时，然后分别加入1:1000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，37℃作用2个小时，充分洗涤后，加入TMB底物显色液，37℃作用10～15min，然后加入2M H2SO4终止，450nm读值，分析结果。
结果表明法氏囊七肽(BP7)能明显调节抗体IgG的水平(见图2)。
3)脾细胞增殖试验，在2nd boost免疫后1周，无菌分离小鼠血液淋巴细胞，分装到96孔细胞板上(105个细胞/孔)。用AIV抗原刺激48小时后，加入100μg/孔MTT(Sigma，USA)，作用4小时，弃去上清，加入DMSO(Sigma，USA)100μl/孔，OD570 nm读值，分析结果。结果，BP7能增加脾脏淋巴细胞的活性，见图3。
4)细胞因子试验，采用ELISA方法，用试剂盒(RD,USA)检测血清中IL-4和IFN-γ的含量。在第二次次免疫后1周，采血分离血清。按说明书操作。结果表明，BP7能促进细胞因子的分泌，在鸡体实验中，IL-4和IFN-γ量均明显高于疫苗对照组。如图4所示，法氏囊七肽不仅能提高代表Th1类型免疫反应得细胞因子IFN-γ的水平，同时能显著提高代表Th2类型的细胞因子IL-4的水平。在小鼠实验中，IL-4明显高于疫苗对照组(见图4)
实施例3、B细胞分化试验
1、BP7合成
采用固相化学合成方法，合成法氏囊七肽(APKPRKK)，纯度在98％以上。
2、产品使用
①获得1×106细胞/ml骨髓单核细胞(选用C57/BL6老鼠)，加入IL-7(10ng/ml)，分装至6孔细胞板上；
②试验组BP7(1g/ml-25g/ml)刺激7天，对照组BSA(1g/ml)刺激；
③结果判定依据：大于40个细胞的集落进行计数；
结果如图5所示，BP7能明显提高B细胞的集落形成，并具有剂量依赖性。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 青岛农业大学
<120> 一种法氏囊七肽及其制备方法和应用
<130> 11531
<141> 2020-11-04
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 7
<212> PRT
<213> bursa
<400> 1
Ala Pro Lys Pro Arg Lys Lys
1 5

Claims (2)

1.一种法氏囊七肽，其特征在于，氨基酸序列为SEQ ID NO:1APKPRKK。
2.如权利要求1所述的法氏囊七肽在制备免疫增强剂中的应用。
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