DK149595B - Analogifremgangsmaade til fremstilling af fts-analoge tetra- og pentapeptidderivater - Google Patents

Description

i 149595

Den foreliggende opfindelse angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte FTS-analoge tetra- og penta-peptid-derivater.

Det er velkendt, at mange polypeptider er blevet isoleret 05 fra forskellige væv og organer (herunder blodet) hos dyr.

Mange af disse polypeptider har relation til legemets immunfunktion, som fx. de forskellige immun-globuliner, thymus-hormonet thomopoietin o.l. Ansøgeren har selv isoleret og syntetiseret adskillige af disse polypeptider som beskrevet 10 i USA-patenter nr. 4,002,602 og 4,002,740 samt i adskillige videnskabelige artikler.

Indtil for ca. 10 år siden vidste man meget lidt om thymus, mens man idag forstår, at thymus er et af de organer, son er primært ansvarligt for immunfunktionen i pattedyr og fugle.

15 På trods af stor interesse for mulige funktioner af thymus og tidlige spekulationer og forsøg vidste man indtil for nyligt kun lidt om thymusfunktion. Idag har man imidlertid indset, at thymus er et sammensat organ med både epitheliale (endokrine) og lymphoide (immunologiske) komponenter og at 20 thymus således er involveret i legemets immunitetsfunktioner. Thymus består af en epithelial stroma afledt af den tredje bronchial-bue og lymphocyter afledt af stam-celler hidrørende fra haanopoietisk væv, Goldstein, et al, The Human Thymus, Heinemann, London, 1969. Lymphocyter differentieres inde i 25 thymus og forlader den som modne thymus-afledte celler, kaldet T-celler, der cirkulerer til blodet, lymphen, milten og lymphekirtlerne. Induktionen af stam-celle differentiering i selve thymus synes at blive medieret af sekretioner af thymus-epitheliale celler.

30 Det har i nogen tid været kendt at thymus har forbindelse med legemets immunitetsegenskaber, og der har derfor været udtrykt stor interesse for stoffer, der er blevet isoleret fra thymus. I denne henseende er der i de senere år blevet publiceret en forholdsvis stor mængde artikler, baseret på 149595 2 videnskabeligt arbejde vedrørende materialer, som er tilstede i okse-thymus. Ansøgeren har selv publiceret en række artikler, som vedrører undersøgelser indenfor dette område. Relevante publikationer kan fx. findes i The Lancet, 20.

05 juli 1968, sider 119-122J Triangle, Bind II, Nr. 1, sider r 7-14, 1972. Annals of the New York Academy of Sciences, r

Bind 183, sider 230-240, 1971. og Clinical and Experimental i

Immunology, Bind 4, Nr. 2, sider 181-189, 1969. Nature, f

Bind 247, sider 11-14, 1974. Proceedings of the National 10 Academy of Sciences USA, Bind 71, sider 1474-1478, 1974.

Cell, Bind 5, sider 361-365 og 367-370, 1975. Lancet, Bind / 2, sider 256-259, 1975. Proceedings of the National Academy r of Sciences USA, Bind 72, sider 11-15, 1975. Biochemistry, f

Bind 14, sider 2214-2218, 1974. Nature, Bind 255, sider 15 423-424, 1975.

En anden gruppe af lymphocyter med immun-funktion er B-lym-phocyterne eller B-cellerne. Disse differentieres i bursa fabricii hos fugle og ved hjælp af et endnu uidentificeret organ i pattedyr. T-celler og B-celler samvirker i mange 20 immunitetsaspekter. Se fx. artikler af ansøgeren i Science, 193, 319 (23. juli 1976) og Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology, Bind XLI, 5 (1977).

25 I US-patentskrift nr. 4.002.602 omhandler et langkædet poly-peptid, der beskrives som ‘'Ubiquitous Immunopoietic Polypeptide “(UBIP). Dette polypeptid har senere fået navnet Ubiqui-tin. Ubiquitin indeholder 74 aminosyrer og udmærker sig ved dets evne til i nanogramkoncentrationer in vitro at inducere 30 differentiering af både T-celle- og B-celleimmunocyter fra præ -kursorer, som er til stede i knoglemarv eller milt. Ubiquitin er således nyttigt inden for terapeutiske områder, som omfat -ter nedsat thymusfunktion eller immunitetsmangel og lignende.

35 Et nonapeptid-materiale er for nyligt blevet isoleret fra svineserum af J.F. Bach, et al og identificeret som "facteur thymique serique" (FTS). Isoleringen af dette materiale og dets struktur er beskrevet i C.R. Acad. Sc. Paris, side 283 (29. november 1976), Series D-1605 og Nature 266, 55 (3.

3 1:49595 marts 1977). Strukturen af dette nonapeptid er blevet identificeret som GLX-ALA-LYS-SER-GLN-GLY-GLY-SER-ASN, hvor "GLX" representerer enten glutamin eller pyroglutaminsyre. Materialet, hvor GLX er glutamin eller pyroglutaminsyre er 05 blevet syntetiseret. I disse artikler anførte Bach, at hans nonapeptid FTS selektivt differentierede T-celler (og ikke B-celler) ved anvendelse af en E-rosette-prøve. Bach konkluderede derfor, at hans materiale var et thymushormon.

10 Fornylig har en mere indgående undersøgelse af aktiviteten af dette nonapeptid af nærværende ansøger vist, at FTS differentierede både T-celler og B-celler og derfor snarere lignede ubiquitin end thomopoeitin i aktiviteten. Brand,

Gilmour and Goldstein, Nature, 269:597 (1977).

15 Det har nu uvéntet vist sig, at tetrapeptid-segmentet FTS

(2-5) og pentapeptidet GLN1-FTS (1-5) samt analoge af disse besidder FTS-nonapeptidets ubiquitinlignende aktivitet.

Den foreliggende opfindelse bygger på denne erkendelse og 20 angår en analogifremgangsmåde til fremstilling af hidtil ukendte tetra- og pentapeptidderivater med den almene formel R-X-LYS-Y-GLN-R1, hvori X er udvalgt fra gruppen bestående af L-alanyl, D-alanyl og sarcosyl, Y er udvalgt fra gruppen bestående af D-og L-seryl, sarcosyl, 2-methyl-alany1 og D-alanyl, R er H, GLN 25 eller SAR, og R' er OH eller NH2 eller farmaceutisk acceptable syreadditionssalte deraf, i krav 1's kendetegnende del anførte.

Tetra- og pentapeptiderne, som fremstilles ifølge den foreliggende opfindelse, er især i stand til at inducere differentie-30 ring af både T-lymfocytter og B-lymfocytter, hvorfor de formodes at være værdifulde for immunsystemet hos mennesker og dyr.

En liste over naturlige aminosyrer kan findes ± mange referencebøger, fx. R.T. Morrison og R.N. Boyd, "Organic Chemistry", 35 Allyn og Bacon, 1959, kapitel 33. Udover de naturlige aminosyrer (som er de der findes i proteiner) findes der også en række såkaldte "ikke-naturlige" aminosyrer, som ikke findes i proteiner, selvom de undertiden forekommer naturligt som metaboliske mellemprodukter eller lignende. Disse ikke-na-turlige aminosyrer kan være D-isomerene svarende til de optisk aktive (L-former) naturlige aminosyrer eller de kan være 149595 4 helt andre kemiske forbindelser såsom sarcosin (N-methylgly-cin) eller 2-methylalanin omtalt ovenfor. Opremsninger af sådanne ikke-naturlige aminosyrer findes også i mange referencearbejder.

05 De omhandlede tetra- og pentapeptidderivater er usædvanlige ved, at de udviser den samme biologiske aktivitet som det naturlige nonapeptid, der indeholder en aminosyresekvens svarende til sekvensen i tetrapeptidet H-Ala-Lys-Ser-Gln-OH fremstillet ifølge opfindelsen. Det antages på denne baggrund, at molekylets 10 aktivitet udvikles af dets stereokemi, d.v.s. den særlige "foldning" af molekylet. 1 denne henseende skal man være klar over, at polypeptid-bindinger ikke er stive, men fleksible, cg poly-peptider kan forekomme som flader, spiraler o.l. Som følge heraf er hele molekylet fleksibelt, og det vil "folde" på en be-15 stemt måde. I forbindelse med den foreliggende opfindelse har det vist sig, at de hidtil ukendte tetrapeptid-segmenter formentlig "folder" på tilsvarende måde som det naturlige tetrapep-tid-segment i det naturlige nonapeptid, hvorfor de udviser de samme biologiske egenskaber. Af denne grund kan tetrapeptid-20 derivaterne være terminalt substitueret med de nævnte aminosyrer, idet disse ikke væsentligt indvirker på den biologiske aktivitet eller interfererer med den naturlige "foldning" af molekylet.

25 Hvorvidt en forbindelse har den biologiske virkning, kan let bestemmes ved testning af forbindelsen for differentiering af Th-1+ T-lymfocytter og Bu-1+ B-lymfocytter i den nedenfor beskrevne kyllinge-induktionsprøve. Forbindelser, som er specifikt aktive i nanogram (ng)/milliliter (ml) koncentrationer (ca. 1 ng/ml) eller mindre i denne prøve betragtes som biolo-30 gisk aktive.

Molekylets evne til at bibeholde den biologiske aktivitet og den naturlige foldning belyses klart af det forhold, at de omhandlede tetrapeptid-segmenter udviser de samme biologiske egenskaber som det naturlige nona-peptid, der er beskrevet som FTS 35 af J.F. Bach i de ovennævnte artikler. I dette nonapeptid kan en tetrapeptid-sekvens fremstillet ifølge opfindelsen identificeres inden for molekylet, men kun i kombination med de andre 5 149595 deri beskrevne aminosyrer. Da tetrapeptid-derivaterne ifpige opfindelsen tilvejebringer samme biologiske aktivitet som nona-peptidet FTS, er det klart, at aminosyrerne, som er substitueret på den ene terminale aminosyrerest af tetrapeptid-derivatet, O5 ikke indvirker på de biologiske egenskaber.

Inden for opfindelsens rammer falder endvidere de farmaceutisk acceptable syreadditions s al te af tetra- og pentapeptideme. Sam syrer,der er i stand til at danne salte med polypeptiderne, kan nævnes uorganiske syrer såsom saltsyre, hydrogenbromidsyre, per-10 chlorsyre, salpetersyre, thiocyansyre, svovlsyre, fosforsyre etc. og organiske syrer såsom myresyre, eddikesyre, propionsyre, glykolsyre, mælkesyre, pyrodruesyre, oxalsyre, malonsyre, ravsyre, maleinsyre, fumarsyre, antranilsyre, kanelsyre, naftalinsulfonsyre eller fx. sulfanilsyre.

15 Af nemhedsgrunde er peptidets aminosyrekomponenter i det foreliggende forkortede. Disse forkortelser har følgende betydninger. D-aminosyrerne er angivet ved anbringelse af "D" før forkortelsen, idet fx. D-alanin er angivet ved "D-ALA" .

20 Aminosyrer Forkortet betegnelse

L-alanin ALA

L-serin SER

L-glutamin GLN

L-lysin LYS

25 Sarcosin SAR

2-methylalanin 2-Me-ALA

De omhandlede peptider har som nævnt vist sig at udvise egenskaber svarende til egenskaberne af nona-peptidet FTS isoleret fra svineblod som omhandlet i de ovennævnte artikler af Bach 30 et al. Peptiderne fremstillet ifølge opfindelsen er især karakteristiske ved deres evne til at inducere differentieringen af både T-prækursor og B-prækursorceller. Visse af de omhandlede tetra- og pentapeptider er aktive i en koncentration på så lidt 35 som et picogram (pg)/ml i den nedenfor beskrevne kyllinge-induktionsprøve.

6 U9595

Det har vist sig, at de omhandlede tetra- og. pentapeptider inducerer differentieringen af immunocyt-prekursorceller in vitro på samme måde som de af Bach beskrevne nonapeptider. De her omhandlede polypeptider har således vist sig at inducere 05 differentieringen af såvel B-prekursorceller, målt ved tilegnelsen af thymus-differentieringsantigenet TH-1, som B-prekursorceller målt ved tilegnelsen af differentieringsantigenet Bu-1. Sagt nå en anden måde, har de omhandlede poly-10 peptider evnen til at inducere differentieringen af både Th-1 T-lymphocyter og Bu-1 B-lymphocyter.

Det har også vist sig, at de omhandlede tetra-og pentapeptider forøger evnen til in vivo frembringelse af cytotoksiske lym-phocyter ved stimulering med allogene antigener. D.v.s. at 15 administrering af de omhandlede tetra- og pentapeptider til fx. rotter fremmer produktionen af cytotoksiske lymphocyt-prekursorer, som målt ved en in vitro prøve på rotte-miltceller. Da udviklingen af cytotoksiske lymphocyter direkte svarer til omfanget af transplantationsafvisning ved allogenisk transplan-20 tations-versus værtsreaktion giver den ovennævnte opdagelse yderligere underbygning for de omhandlede polypeptiders immunologiske anvendelighed.

Til forståelse af vigtigheden af de differenterende biologiske egenskaber af de omhandlede tetra- og. pentapeptider skal det be-25 mærkes, at funktionen af thymus i relation til immunitet bredt kan angives som produktionen af thymus-afledte celler eller lymphocyter, der kaldes T-celler. T-celler udgør en stor del af den samlede mængde af recirkulerende små lymphocyter. T-celler har immunologisk specificitet og er di-30 rekte involverede i celle-medierede immun-reaktioner (såsom homotransplantations-reaktion) som effektor-celler. T-celler udskiller imidlertid ikke humorale antistoffer. Disse antistoffer udskilles af celler (kaldet B-celler), der af- 149595 7 ledes direkte af benmarven uafhængigt af indvirkningen fra thymus. For mange antigener kræver B-celler imidlertid tilstedeværelse af passende reaktionsdygtige T-celler, før de kan producere antistoffer. Mekanismen for denne process ved 05 celle-samarbejde forstås endnu ikke fuldt ud.

På baggrund af ovenstående forklaring kan det i praksis siges, at thymus er nødvendig for udviklingen af cellulær immunitet og mange humorale antistof-reaktioner og den påvir-10 ker disse systemer ved indenfor thymus at inducere differentieringen af haemopoietiske stam-celler til T-celler. Denne induktive påvirkning medieres af sekretioner af de epithe-tiale celler i thymus, d.v.s. thymus-hormonernei 15 Til yderligere forståelse af virkningen af thymus og lym-phocyternes cellesystem samt cirkulationen af lymphocyter i legemet bør det bemærkes, at stam-celler opstår i benmarven og når thymus ved hjælp af blodstrømmen. Inde i thymus differentieres stam-celler til immunologisk kompetente T-20 celler, der migrerer til blodstrømmen og sammen med B-cel-ler cirkulerer mellem væv, lymphe og blodbaner.

De legemsceller der udskiller antistof (B-celler) udvikles også fra hamopoietiske stam-celler, men deres differentie-25 ring bestemmes ikke af thymus. I fugle differentieres de i et organ, som er analogt med thymus, kaldet bursa fabricii.

I pattedyr har man ikke fundet et ekvivalent organ og det antages, at disse celler differentierer i benmarven. De betegnes derfor som benmarvsafledte celler eller B-celler. De 30 fysiologiske stoffer som dikterer denne differentiering, er fortsat helt ukendte.

Som anført ovenfor, er de omhandlede tetra- og pentapeptider terapeutisk værdifulde i behandlingen af mennesker og dyr. Da de nye-tetra-35 og pentapeptider er i stand til at inducere differentieringen af lymphpoietiske stam-celler hidrørende fra hæmopoie- 149595 8 tisk væv til både thymusafledte lymphocyter (T-celler) og immunokompetente B-celler, der er i stand til at deltage i légemets immun-reaktion, antages de her omhandlede forbindelser at have talrige terapeutiske anvendelser. Da for-05 bindeiserne er i stand til at udføre visse af de angive funktioner hos thymus, har de primært anvendelighed indenfor forskellige thymusfunktions- og immunitetsområder. Et primært anvendelsesområde ligger i behandlingen af DiGeorge syndrom, en tilstand hvor der er en medfødt mangel på thy-10 mus. Injektion af et af de omhandlede tetra- og pentapeptider son nærmere anført nedenfor, vil overvinde denne mangel. En anden anvendelse er ved agammaglobulinemia, der skyldes en defekt hos legemets formodede B-celledifferentierende hormon. Injektion af et af de omhandlede tetra- og pentapeptider vil'overvin-15 de denne defekt. Da de omhandlede tetra- og pentapeptider er ekstremt aktive ved lave koncentrationer er de værdifulde til forhøjelse af legemets kollektive immunitet ved at de forøger terapeutisk stimulering af cellulær immunitet og humoral immunitet og de er herved værdifulde i behandlingen af. syg-20 domme der involverer kronisk infektion in vivo såsom fungal- eller mycoplasma-infektioner, tuberkulose, leprosis, akute og kroniske virusinfektioner o.l. Endvidere antages de omhandlede peptider at være værdifulde indenfor ethvert område, hvor cellulær eller humoral immunitet er af betyd-25 ning og især, hvor der er immunitetsmangler såsom ved DiGeorge syndrom- omtalt ovenfor. På grund af tetra- og pentapeptidemes egenskaber har de endvidere in vitro anvendelighed ved in-ducering af udviklingen af overflade-antigener af B-celler, ved inducering af udviklingen af den funktionelle evne til 30 at opnå reaktionsevne overfor mitogener og antigener, samt celle-kollaboration ved at forbedre evnen hos B-celler til at producere antistoffer. De har in vitro anvendelighed ved at inducere udviklingen af B-celler som målt ved udviklingen af overflade-receptorer for komplement. De omhandlede peptider er også værdifulde til hæmning af den ukontrolle-rede proliferation af lymphocyter der reagerer på ubiquitin 149595 9 (USA-patentskrift nr. 4,002,602). En vigtig egenskato ved de omhandlede tetra- og pentapeptider er deres' in vivo evne til at gen-opbygge celler med T-cellernes egenskaber og endvidere deres in vivo evne til at genopbygge celler med B-cellernes 05 egenskab. De er derfor værdifulde til behandling af relative eller absolute B-celle-mangler samt relative eller absolute T-celle-mangler uanset om disse mangler skyldes mangler i enten de vævs-differentierende B-celler eller i thy-r mus eller en helt anden grund.

10

En anden vigtig egenskab ved de her arihandlede tetra- og pentapeptider er deres høje aktivitet i meget lave koncentrationer. Det har således vist sig, at tetra- og pentapeptideme i almindelighed er aktive i koncentrationer på ca. 1 ng/ml, mens visse særligt 15 kraftige tetrapeptider (H-SAR-LYS-D-ALA-GLN-NH2 og H-SAR-LYS -SAR-GLN-NE^) er aktive i koncentrationer varierende fra ca.

0,1 pg/ml. Bæreren kan være en vilkårlig af de velkendte bærere til dette formål, herunder normale saltopløsninger, fortrinsvis med et proteinfortyndingsmiddel såsom okseserumal-20 bumin for at hindre adsorptionstab til glasgenstande ved disse lave koncentrationer. De arihandlede tetra- og pentapeptider er i almindelighed aktive i området over ca. 1 yg/kg legemsvægt, mens visse særligt kraftige tetrapeptider er aktive fraca.

1 ng/kg legemsvægt. Til behandling af DiGeorge syndrom kan tetra-2^ og pentapeptidemeadministreres i en mængde på ca. 1 til ca.

100 yg/kg legemsvægt, mens de særligt kraftige tetrapeptider kan administreres i en mængde på ca. 1 til ca. 100 ng/kg legemsvægt. I almindelighed kan de samme dosis-intervaller anvendes til behandling af de øvrige omtalte tilstande eller 30 sygdomme. Selvom diskussionen ovenfor vedrører parenteral administrering, er oral administrering også mulig i dosisintervaller der i almindelighed er ca. 100 til 1000 gange højere end ved injektion.

35 ίο 149595

De omhandlede tetra- og pentapeptider er blevet fremstillet -under anvendelse af lignende principper som beskrevet af Merrifield i Journal of American Chemical Society, 85, sider 2149-2154, 1963. Syntesen involverede trinvis addition af beskyttede 05 aminosyrer til en voksende peptidkæde, der med covalente bindinger var bundet til en fast harpiks-partikel. Ved denne metode fjernedes reagenser og biprodukter ved filtrering og omkrystallisationen af mellemprodukter blev undgået. Det almene princip for denne fremgangsmåde afhænger af fastgørelse Ί0 af den C-terminale aminosyre i kæden til en fast polymer ved hjælp af en covalent binding og tilføjelse af de efterfølgende aminosyrer én ad gangen på trinvis måde indtil den ønskede sekvens er blevet samlet. Endelig fjernes peptidet fra den faste bærer og beskyttende grupper fjernes. Denne ^5 fremgangsmåde tilvejebringer en voksende peptidkæde fastgjort til en fuldstændig uopløselig fast partikel, således at den foreligger på en bekvem form til filtrering og udvaskning for reagenser og biprodukter. Aminosyrerne kan fastgøres til hvilken som helst egnet polymer, der alene 20 skal være let adskillelig fra de uomsatte reagenser. Polymeren kan være uopløselig i de anvendte opløsningsmidler eller opløselig i visse opløsningsmidler og uopløselig i andre. Polymeren bør have en stabil fysisk form som tillader let filtrering. Den skal indeholde en funktionel gruppe, hvor-25 til den første beskyttede aminosyre kan bindes fast ved hjælp af en covalent binding. Forskellige uopløselige polymere som er egnede til dette formål er sådanne som cellulose, polyvinylalkohol, polymetakrylat og sulfoneret poly-^ styren, men ved syntesen ifølge opfindelsen blev i almindelighed anvendt en chlormetyleret copolymer af styren og di-vinylbenzen. Polymere som er opløselige i organiske opløsningsmidler, men uopløselige i vandige opløsningsmidler, kan også anvendes. En sådan polymer er polyethylen/glykol med en molekylvægt på ca. 20.000, der er opløselig i methylen-chlorid, men uopløselig i vand. Anvendelse af denne polymer i peptid-synteser er beskrevet af F. Bayer og M. Mutter i Nature 237, 512 (1972) og de deri angivne referencer.

11 149596

De forskellige funktionelle grupper på aminosyren, som var aktive, men som ikke skulle indgå i reaktionerne, beskyttedes under hele reaktionen ved hjælp af konventionelle beskyttende grupper, som anvendes indenfor polypeptid-teknik-05 ken. Således beskyttedes den funktionelle gruppe på lysin ved hjælp af beskyttende grupper, der kunne fjernes efter afslutning af sekvensen uden at indvirke uheldigt på det færdige tetra- eller pentapépti<^produkt»Under syntesen anvendtes fluo-rescamin til bestemmelse af, om koblingen var komplet ved 10 en indikation af positiv fluorescens (se Felix, et al, Ana-lyt, Biochem., 52, 377, 1973). Hvis prøven ikke viste komplet kobling, gentoges koblingen med den samme beskyttede aminosyre før afbeskyttelse.

15 Den C-terminale aminosyre kan fastgøres til polymeren på en række velkendte måder. Resumeer af metoder til fastgørelse til halomethylharpikser er givet i Horiki, et al, Chem.

Letters, sider 165-168 (1978) og Gisin, Helv. Chim. Acta, 56, 1476 (1973) samt de deri anførte referencer.

20

Den almene metode indebar først esterificering af L-glutamin, beskyttet på α-aminogruppen til harpiksen i absolut alkohol indeholdende en amin. Den koblede aminosyreharpiks filtreredes dernæst, vaskedes med alkohol, og vand og tørredes. Den 25 beskyttende gruppe på d-aminogruppen i glutamin-aminosyren (fx. t-BOC, d.v.s. t-butyloxycarbonyl) fjernedes dernæst.

Den resulterende koblede aminosyreharpiks med den frie aminogruppe omsattes dernæst f.éks. med en beskyttet L-serin, fortrinsvis alpha-t-BOC-O-benzyl-L-serin til kobling af L-se-30 rinen. Reaktionerne gentoges dernæst med beskyttet L-lysin og f.eks. L-alanin, indtil det komplette molekyle var fremstillet. Sekvensen af reaktionerne udførtes, som følger: 35 149595 12

Harpiks

a-R1-Gln-OH

α-R^-Gln-harpiks

Fjernelse af a-amino beskyttende gruppe Ί/ H-Gln-harpiks 9 R^

„ a-R1-L-Ser-OH

R^ 1 ' α-R -Ser-Gln-harpiks

Fjernelse af a-amino 0 beskyttende gruppe R^ i H-Ser-Gln-harpiks R3

a-R1-Lys-OH

'32 RJ R ^ ι ι α-R -Lys-Ser-Gln-harpiks

Fjernelse af a-amino .3 9 beskyttende gruppe RJ R^ 5 I Φ* H-Lys-Ser-Gln-harpiks

a-R1-Ala-rOH

3 2

R RZ

T I '•''l α-R -Ala-Lys-Ser-Gln-harpiks

Fjernelse af alle beskyttende grupper og harpiks

H-Ala-Lys-Ser-Gln-OH

149595 13 I ovenstående reaktionssekvens betyder Rx en beskyttende 2 3 gruppe for α-aminogruppen og R og R er beskyttende grupper på de reaktionsdygtige sidekæder af henholdsvis L-serin og L-lysin, der ikke påvirkes eller fjernes når R^ fjernes 05 for at tillade yderligere reaktion. I ovennævnte tetrapep- tidharpiks-mellemprodukt står udtrykket for en beskytten- 2 de gruppe såsom t-butyloxycarbonyl, R står for benzyl eller 3 substitueret benzyl (fx. 4-chlorbenzyl) og R står for sub-10 stitueret benzyloxycarbonyl (fx. 2,6-dichlorbenzyloxycarbo- nyl) . Harpiksen kan være en vilkårlig af de ovenfor som anvendelige véd fremgangsmåden omtalte harpikser.

Efter fremstilling af det sidste mellemprodukt spaltedes pepti dharpiksen til fjernelse af de beskyttende grupper R1, R2 og 15 R3 samt harpiksen. Fraspaltningen af de beskyttende grupper skete f. eks. ved behandling med vandfri hydrogenfluorid, og det resulterende frie peptid blev dernæst udvundet.

Som anført ovenfor, er det ved udøvelsen af fremgangsmåden nødvendigt at beskytte eller blokere aminogrupperne for at 20 kontrollere reaktionen og opnå de ønskede produkter. Egnede aminobeskyttende grupper, som med fordel kan anvendes, omfatter saltdannelse til beskyttelse af stærkt basiske amino-grupper, eller urethanbeskyttende substituenter såsom p-methoxy-benzyloxycarbonyl og t-butyloxycarbonyl. Det fore-25 trækkes at anvende t-butyloxycarbonyl (BOC) eller t-amyl-oxycarbonyl (AOC) til beskyttelse af α-aminogruppen i de aminosyrer som undergår reaktion ved molekylets carboxyl- ende, eftersom de BOC- og AOC- (t-amyloxycarbonyl)-beskyttende grupper fjernes let efter sådanne reaktioner og inden 30 det efterfølgende trin (hvor en sådan α-aminogruppe selv undergår reaktion) ved relativt mild indvirkning af syrer (fx. trifluor-eddikesyre), hvilken behandling ikke på anden

14959S

14 måde påvirker de til beskyttelse af andre reaktionsdygtige sidekæder anvendte grupper. Det vil således kunne indses at a-aminogrupperne kan beskyttes ved reaktion med et hvilket som helst materiale, der vil beskytte aminogrupperne mod 05 den eller de efterfølgende reaktioner, men som senere kan fjernes under betingelser, der ikke på anden måde vil påvirke molekylet. Eksempler på sådanne materialer er organiske carboxylsyre-derivater, der acylerer aminogruppen.

10 I almindelighed kan en vilkårlig af aminogrupperne beskyttes ved omsætning med en forbindelse indeholdende en gruppe med formlen:

O

4 " R-O-C- 15 hvori R4 er en vilkårlig gruppe, der vil hindre aminogruppen i at indgå efterfølgende . koblingsreaktioner og som kan fjernes uden ødelæggelse af molekylet. R4 kan således være en ligekædet eller forgrenet alkylgruppe, som kan være umættet, 20 fortrinsvis med 1-10 carbonatomer, og fortrinsvis halogeneller cyanosubstitueret, aryl, fortrinsvis med 6-15 carbonatomer,. cycloalkyl, fortrinsvis med .5-8 carbonatomer, aralkyl, fortrinsvis med 7-18 carbonatomer, alkaryl, fortrinsvis med 7-18 carbonatomer eller heterocyclisk, fx. isonico-25 tinyl. Aryl-aralkyl og alkaryl grupperne kan også være yderligere substituerede såsom med en eller flere alkylgrupper med· 1 til ca. 4 carbonatomer. Foretrukne betydninger for R omfatter t-butyl, t-amyl, tolyl, xylyl og benzyl. Særligt foretrukne specifikke amino-beskyttende grupper omfatter 30 benzyloxycarbony1, substitueret benzyloxycarbonyl, hvori phenyIringen er substitueret med et eller flere halogenatomer, fx. Cl eller Br, og endvidere nitro, lavere alkoxy, fx. methoxy, lavere alkyl, t-butyloxycarbony1, t-amyloxycar-bonyl, cyclohexyloxycarbonyl, vinyloxycarbony1, adamantyl-35 oxycarbonyl, biphenylisopropoxycarbonyl o.l. Andre beskyttende grupper, som kan anvendes, omfatter isonikotinyloxy-carbonyl, phthaloyl, p-tolylsulfonyl, formyl o.l.

149595 15

Ved udøvelse af den almene fremgangsmåde ifølge opfindelsen opbygges peptidet ved reaktion af en forbindelse med en fri amino-gruppe med en forbindelse, der besidder en beskyttet aminogruppe. Til reaktion eller kobling aktiveres forbindelsen, som skal 05 angribes, ved carboxylgruppen, således at carboxylgruppen derefter kan reagere med den frie aminogruppe på den til harpiksen knyttede peptidkæde. Til opnåelse af aktiveringen kan carboxylgruppen omdannes til en hvilken som helst reaktionsdygtig gruppe, såsom en ester, et anhydrid, et azid, et sy-10 rechlorid eller lignende. Alternativt kan et passende kob·? lingsreagens tilsættes under reaktionen. Egnede koblingsreagenser er fx. omhandlet i Bodanszky, et al, Peptide Synthesis, Interscience, 2. udgave, 1976, kapitel 5, inklusive karbodiimider (fx. dicyclokarbodiimid), carbonyldiimidizol 15 o.l.

Det skal endvidere fremhæves, at aminosyrerne under koblingsreaktionen indeholder både en aminogruppe og en carboxylgrup-pe, og sædvanligvis indgår den ene gruppe i reaktionen, mens 20 den anden er beskyttet. Inden næste koblingstrin bliver den beskyttende gruppe på α-aminogruppen eller den terminale aminogruppe af det angrebne peptid fjernet under betingelser, som ikke i væsentlig grad indvirker på andre beskyttende grupper, f.eks. gruppen på epsilon-amino af lysin-molekylet. Den fore-25 trukne metode til udførelse af dette trin er mild acidolyse, såsom reaktion ved stuetemperatur med trifluoreddikesyre.

Som det vil kunne indses, resulterer den ovenfor beskrevne række proces-trin i fremstillingen af f.eks. tetrapeptidet med 30 formel III, som følger: III. H-ALA-LYS-SER-GLN-OH 35

14959S

16

Dette tetrapeptid har den påpegede biologiske aktivitet. Substituering med en naturlig eller ikke-naturlig aminosyrerest i stedet for enten L-alanyl eller L-seryl eller begge eller med et dipeptid i stedet for L-alanyl kan ske ved at erstatte enten 05 alanin eller serin eller begge med den passende beskyttede natur lige eller ikke-naturlige aminosyre eller det passende beskyttede dipeptid i ovenstående syntese-skema til dannelse af tetrapepti-det med følgende formel:

IIIa. R-X-LYS-Y-GLN-OH

10 hvori X og Y har de foran anførte betydninger.

Identiteten og renheden af de omhandlede peptider blev bestemt ved hjælp af velkendte metoder såsom tyndlagskromatografi, elektrophorese, aminosyreanalyse o.l.

15 Opfindelsen belyses nærmere i de følgende eksempler, hvor alle dele er vægtdele med mindre andet er anført.

149596 17

Eksempel 1

Til fremstilling af et tetrapeptid med formlen H-ALA-LYS-SER-GLN-OH indkøbtes følgende materialer kommercielt: Øg Alpha-BOC-L-glutamin-o-nitrophenyl-ester

Alpha-B0C-e-2-chlor-benzyloxycarbonyl-L-lysin Alpha-BOC-O-benzyl-L-serin Alpha-BOC-L-alanin.

*10 I disse reagenser betyder BOC t-butyloxycarbonyl. Reagenser af "sequenal"-kvalitet til aminosyre-sekvens-bestemmelser, dicyclohexylcarbodiimid, fluorescamin og harpiksen indkøbtes også kommercielt. Den anvendte harpiks var' en polysty-ren-divinylbenzenharpiks, 200-400 sigtestørrelse indeholden--15 de 1% divinylbenzen og 0,75 mM chlorid per gram harpiks.

Til fremstilling af tetrapeptidet esterificeredes to mmol af α-BOC-L-glutamin til 2 mmol chlormethyleret harpiks i absolut alkohol indeholdende 1 mM triethylamin i 24 timer, ved 80° 20 C. Den resulterende aminosyreharpiksester filtreredes, vaskedes med absolut alkohol og tørredes. Derefter kobledes de øvrige α-BOC-aminosyrer på tilsvarende måde til den afbeskyttede α-aminogruppe i peptidharpiksen i korrekt rækkefølge til dannelse af det omhandlede tetrapeptidharpiksmellemprodukt un-25 der anvendelse af ekvivalente mængder dicyclohexylcarbodiimid. Efter hver koblingsreaktion testedes en portion af harpiksen med fluorescamin og hvis der fandtes positiv fluorescens, blev koblingen antaget for at være ukomplet og den gentoges med den samme beskyttede aminosyre. Som følge af 30 rækken af koblingsreaktioner fremstilledes tetrapeptidhar-piksmellemproduktet.

35 149595 18

Denne peptid-harpiks spaltedes og de beskyttende grupper fjernedes i et "Kel-F"-spaltningsapparat (Peninsula Laboratories/ Inc.) under anvendelse af vandfri hydrogenfluorid 05 ved 0°C i 60 minutter med 1,2 ml anisol per gram peptidharpiks som rensemiddel. Peptidblandingen vaskedes med vandfri ether og ekstraheredes med vandig syre. Ekstrakten lyofili-seredes og peptidet kromatograferedes på "P-6 Bio-Gel" i 1 N eddikesyre. Det resulterende tetrap sptid bestemtes at være 10 94% rent og bestemtes til at have følgende sekvens:

H-ALA-LYS-SER-GLN-OH

Til identifikation foretoges tyndlags-kromatografi og elektrofor ese som følger:

Tyndlags-kromatografi foretoges på en 30 ug prøve på silika-15 gel (Brinkman Silikagel med fluorescent indikator, 20 x 20 cm, 0,1 mm tyk) under anvendelse af følgende elueringsmidler: n-butanol:pyridin:eddikesyre:vand. 30:15:3:12 r / 2 R^ : ethylacetat:pyridin:eddikesyre:vand. 5:5:1:3 3 R^ :. ethylacetat:n-butanol:eddikesyre:vand. 1:1:1:1 <S> 20 Elektroforese foretoges på en 100 ug prøve på Whatman 3 mm papir (11,5 x 56,5 cm) under anvendelse af en pH 5,6 pyri-din-acetat-pufferopløsning og 1000 V spænding i en time.

Spray-reagenser til både tyndlags-kromatografi og elektrofor ese var Pauly og Ninhydrin.

1 2 25 Følgende resultater opnåedes: R^ = immobil, R2 = immobil og R^3 = 0,336. Elektroforøse resulterede i en migrering på 9,4 cm mod katoden.

149596 19

Eksempel 2

Til bestemmelse af aktiviteten og egenskaberne af det i eksempel 1 fremstillede tetrapeptid anvendtes følgende kyllinge-induktionsprøve. Denne prøve er beskrevet mere detaljeret 05 i Brand, et al, Science, 193 319-321 (23. juli 1976) og de deri indeholdte referencer.

Benmarv fra nyudklækkede kyllinger valgtes som kilde for indu-cerbareceller, fordi den mangler et væsentligt antal Bu-1+ eller Th-1 celler. Opsamlede celler fra femur og tibiotar-10 sus af fem nyudklækkede kyllinger af stammen SC (HY-line) fraktioneredes ved ultracentrifugering på en 5-lags diskontinuert okseserum-albumin (BSA) gradient. Celler fra de to letteste lag forenedes, vaskedes og suspenderedes til in- kubering ved en koncentration på 5 x 106 celler per mil-15 liliter med den passende koncentration af test-polypeptid i RPMI 1630 medium suppleret med 15 mM N-2-hydroxyethylpi-perazin-N'-2-ethansulfonsyre (hepes), 5 procent y-globu-linfri foetal kalveserum, deoxyribonuclease (14-18 en-heder /ml), heparin (5 enheder/ml), penicillin (100 enhe-20 der/ml) og streptomycin (100 yg/ml). Kontrolpræparater inkuberedes med BSA (1 yg/ml) eller medium alene. Efter in-kubering testedes cellerne ved cytotoksicitetprøven under anvendelse af kylling Cl og marsvin C2 til C9 komplementfraktioner som beskrevet i referenceartiklen. Procenten af 25 Bu-1+ eller Th-1+ celler i hvert lag beregnedes som et cyto- toksitetsindeks, 100 (a-b)/a, hvori a og b er procenterne af levende celler i henholdsvis komplement-kontrol- og testpræparat. Den procentuelle mængde af inducerede celler opnåedes ved at subtrahere middelværdierne i kontrolinkubatio-30 nerne uden inducerende midler (sædvandigvis 1-3%) fra værdierne ved test-induktionerne.

Virkningsspecificiteten af test-tetrapeptidet og dets lighed med ubiquitin påvistes ved inhibering af induktionen af Bu-+ + 1 B-celler og Th-1 τ-celler ved hjælp af test-polypeptidet 35 efter tilsætning af ubiquitin i en koncentration på 100 ]ig/ ml. Denne høje dosis af ubiquitin inaktiverer ubiquitin-re- ceptorerne og hindrer således induktionen af celler ved et hvert middel der virker gennem disse receptorer.

20 143595

Som resultat af denne undersøgelse opdagedes det, at tetra- peptidet fra eksempel 1 udviste biologisk aktivitet svaren- 05 de til ubiquitins ved at inducere differentieringen af både + + TH-1 T- og Bu-1 B-lymphocyter i ng/ml koncentrationer.

Eksempel 3 A. Prøven fra eksempel 2 blev gentaget under anvendelse af - et af følgende som test- pentapeptid: 10

H-GLN-ALA-LYS-SER-GLN-OH

H-SAR-ALA-LYS-SER-GLN-OH

I hvert tilfælde iagttoges biologisk aktivitet svarende til ubiquitins.

15 B. Prøven fra eksempel 2 gentoges under anvendelse af et af følgende som test-tetrapeptid: h-sar-lys-d-ala-gln-nh2 h-sar-lys-sar-gln-nh2 H-D-ALA-LYS-D-ALA-GLN-NH2 20 I hvert tilfælde iagttoges biologisk aktivitet svarende til ubiquitins. For det første af disse tetrapeptider iagttoges denne aktivitet i koncentrations-intervallet fra ca. 1 pg/ ml til ca. 100 pg/ml. For det andet tetrapeptid iagttoges aktivitet ved en koncentration så lav som 0,1 pg/ml.

25 Eksempel 4-6

Under anvendelse af de her beskrevne reaktionsmetoder til fremstilling af substituerede tetr^eptider fremstilledes te-brapeptider med følgende almene formel: 149595 21 R-X-LYS-Y-GLN-R1

Eksempel nr. R X Y R/_ 4 H SAR D-ALA NH2 4 A H SAR SAR NH2 05 5 H D-ALA D-ALA NH2 5 A H D-ALA SAR NH2 6 H SAR 2-Me-ALA NH2

6 A H SAR SAR OH

Disse peptid-amider fremstilledes på en benzhydrylamin-har-10 piks ved hjælp af i og for sig kendt fastfase-synteseteknik.

De i eksemplerne 4-6 fremstillede tetrapeptider bevarer den her beskrevne biologiske aktivitet for det aktive polypep-tid-segment.

Til identifikation foretoges tyndlags-kromatografi og elek-15 troforese som følger:

Tyndlags-kromatografi foretoges på 20 pg prøver på silikagel (kieselgel 5 x 20 cm) under anvendelse som eluent af n-bu-tanol:eddikesyre:ethylacetatjgand i forhold på 1:1:1:1 (R^1 ) og på cellulose 6064 (Eastman, 20 x 20 cm) under anvendelse 20 som eluent af n-butanol:pyridin:eddikesyre:vand i forhold på 15:10:3:12 (Rf2).

Elektroforese foretoges på 50 pg prøver på Whatman nr. 3 papir (5,7 x 55 cm) under anvendelse af en pH 5,6 pyridin-acetat-pufferopløsning og 1000 V spænding i en time. For-25 bindeiserne migrerer mod katoden.

Spray-reagenser til både tyndlags-kromatografi og elektroforese var Pauly og Ninhydrin.

Følgende resultater opnåedes (både Rf-værdier og elektrofotorese opgives i forhold til H-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-OH) : 149595 22 , 5 Elektroforese

Eksempel R, R_ Migrering Renhed f f cm mod katoden 4 0,44 0,68 2,07 98% 4 A 0,88 0,60 1,78 98% 05 5 0,56 0,71 2,10 98%

Efter tyndlags-kromatografering og elektroforese som i eksempel 1 opnåedes følgende resultater for forbindelsen ifølge eksempel 6: 1° R^1 = (0,155), Rf2 = immobil, Rf3 = 0,265 og elektroforese- migreringer 13,1 cm mod katoden.

Eksempel 7-8

Under anvendelse af de passende dipeptider ved koblingsreaktionen som ovenfor omhandlet fremstilles følgende pentapeptider, 15 der indeholder den aktive aminosyre-sekvens, men som er substitueret på den terminale aminogruppe med formlen: R-ALA-LYS-SER-GLN-R' som er substitueret med de i efterfølgende tabel anførte 20 aminosyrer.

Eksempel nr. R R^

7 GLN OH

8 SAR OH

25 De i eksempel 4-8 fremstillede tetra- og pentapeptid-derivater beholder den biologiske aktivitet som her beskrevet for det aktive polypeptid-segment.

Efter tyndlags-kromatografering og elektroforese som beskrevet i eksempel 1 opnåedes følgende resultater for forbindel-30 serne i eksempel 7 og 8.

149595 23

Eksempel Rp1 Rf2 Rf3 Elektroforase- 1 migrering mod _katode_ η Immobil immobil 0/303 7f4 cm 8 immobil immobil 0f186 8,3 cm

Eksempel 9

Til yderligere belysning af anvendeligheden af de omhandlede te-tra- og pentapeptider beskriver dette eksempel en mikrokultur-prøve til foretagelse af et skøn over frekvenserne af de cyto-toksiske lymphocyter produceret ved stimulering med halogene antigener. Frekvenserne af cytotoksiske prekursorer mellem kontroldyr og dyr injiceret med forskellige koncentrationer af testforbindelsen sammenlignedes ved hjælp af en grænsefortyndingsprøve .

Materialer og metoder Mus

Indavlede C57 BL/6J (hunner, 8 uger) opnåedes fra Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine.

Indavlede DBA/2J (hanner eller hunner) opnåedes også fra Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine.

Medier

Fosfat-pufret saltopløsning (PBS),"RPMI 1640¾ foetal kalveserum (FCS) - (portion nr. R776116), N-2-hydroxyethylpipera-zin-N'-2-ethansulfonsyre (HEPES) puffer opnåedes fra Gibo,

Grand Island. 2-mercaptoethanol fra Eastman Kodak, Rochester, / N.Y. Celler vaskedes med PBS og dyrkedes i RPMI indeholden- -5 de 10% FCS, 10 mM HEPES puffer og 5x10 M 2-mercaptoethanol.

149595 2 4

Behandling med testforbindelser

Testdyrene (C57 BL/6J) injiceredes (i.v. eller i.p.) med forskellige koncentrationer af H-SAR-LYS-SAR-GLN-N^ (testforbindelsen. identifikations-nr. GO40) i 0,2 ml volumen 24 i 05 timer før de offredes til forsøgene.

Cellepraeparater

Celle-suspensioner fra milten hos C57 BL/6J mus eller DBA/ 2J mus prepareredes ved finskæring af organet og presning gennem et trådvæv (nr. 60) med stemplet fra en 5 cm sprøj-10 te i en "falcon" petriskål (falcon 3002, 15x60 mm). Cellesuspensionerne henstod ved stuetemperatur i 10 minutter for at tillade sætning af de større vævs-stykker. Celle-suspen-sionerne overførtes dernæst til 15 ml Corning centrifugeglas (Corning 25310) og centrifugeredes i 10 minutter ved 15 1500 OPM i en Beckmen TJ-6 centrifuge. Alle celle-suspen sioner vaskedes mindst tre gange mere med PBS. Efter den tredje udvaskning resuspenderedes respons-cellerne (C57 BL/ 6J) i dyrkningsmedium og tæltes på Coulter -tæller. DBA/ 7 2J (stimulator-celler) resuspenderedes i RPMI til 10 cel-20 ler per ml. 30 yg mitomycin C sattes til hver ml DBA/2J miltceller og blandingerne inkuberedes ved 37° i 30 minutter.

Efter behandlingen med mitomycin C vaskedes milt-cellerne tre gange med PBS til fjernelse af eventuelt overskud af mitomycin C. DBS-cellerne resuspenderedes dernæst i dyrk-25 ningsmediet og taltes på Coulter -tælleren.

Blandede lymphocyt-kulturer (MLC) MLC anbragtes i mikrotiter-bakker (Linbro Chemicals, New Haven, Conn., IS-MVC-96). Hver bakke indeholdte 96-V bundkilder. De yderste kilder som omgav kanten af pladen, an-30 vendtes ikke til celle-kultur, men fyldtes med PBS for at undgå fordampning fra kultur-kilderne. 60 prøver anbragtes i hver V-bunds-bakke. Sædvanligvis indeholdt hver bakke tre respons-celle koncentrationer (20 gentagelser af hver) og en stimulator-celler koncentration. Respons-cellerne sus- 5 35 penderedes sædvenligvis til koncentrationer på 7,5x10 , 25 149596 5 5 5x10 og 2,5x10 per ml og 0,1 ml sattes til hver kilde.

Den samme stimulator-celle koncentration anvendtes på hele pladen. Kontrolplader, som kun indeholdte respons-celler uden stimulator-celler, udformedes også for at vurdere bag-05 grundstimuleringen som følge af mediet. Cellerne dyrkedes i 6 dage ved 37°C i en befugtet inkubator indeholdende 5% CC^·

Angrebs-celler

Den ved den cytotoksiske prøve anvendte angrebs-celle var en DBA mastocytoma celle linie P815. Celle-linien opretholdtes g 10 ved rutine-passage gennem DBA/2J mus. 5x10 P815 celler an vendtes for hver passage og tumor-cellerne fra basrernes peri-toneale kavitet anvendtes 4 til 5 dage efter passagen. Tumorcellerne fra den peritoneale kavitet vaskedes tre gange med 51 PBS og mærkedes dernæst med Cr ved en koncentration på 7 15 100 yci per 10 celler. Mærkningen foretoges i en time ved 37°C i en befugtet inkubator. De mærkede angrebs-celler vaskedes dernæst tre gange med PBS til fjernelse af eventuelt overskydende mærkning.

Cytotoksisk prøve 20 Efter 6 dages dyrkning fjernedes 0,1 ml af mediet fra hver kilde uden at forstyrre celle-pletten. Dernæst afpipetteredes under anvendelse af en automatisk mikropipette (MLA-pipette) 4 51 100 yl angrebs-celler indeholdende 2,5x10 Cr -mærkede angrebs-celler i hver kilde, idet celle-pletten resuspendere-25 des under processen (en ny pipettespids skal anvendes for hver kilde). Mikrotiter-bakker centrifugeredes dernæst ved stuetemperatur ved 1000 OPM i syv minutter på "Sorvall GLC-2B". Bakkerne inkuberedes dernæst i 4 timer ved 37°C. 100 mikroliter ovenstående væske førtes dernæst over i „gamma-tælle-30 rør . ("Amershen 196271") «-Rørene taltes dernæst på Beckman® gamma-tæller (Beckman 310). Rørene taltes almindeligvis i et minut.

Bestemmelse af frekvenserne af prekursorerne af cytotoksiske lymphocyter (CLP) 149595 26

Grænse-fortyndningsanalysen er en alt eller intet response-prøve beskrevet ved hjælp af Poisson-sandsynlighedsfordelin-gen. Sandsynligheden for et non-respons er givet ved nulte-ordens udtrykket Po=e'" hvor δ = frekvensen af CLP og N = 05 antallet af lymphocyter per kilde. En afbildning af logaritmen til mængden af non-responderende kulturer overfor celledosis bør således give en ret linie med en hældning på - 6, som er frekvensen af CLP.

I eksemplet beregnedes gennemsnittet af baggrunds-chrom fri-10 gøreisen (spontan frigørelse) fra 20 kilder, der kun indeholdt respons-celler (C57 BL/6J) uden stimulator-celler. Test-kilderne blev markeret som positive hvis deres tælnin-ger var større end middel-spontanværdien ved mere end 2,07 standardafvigelser (P<0,05). Den spontane lysis varierede 15 sædvanligvis fra 9-15% af de totale tælninger inkorporeret

-6N

i angrebs-cellerne. I henhold til Poissons ligning Po=e er, når Po=e ^ = 0,37 (svarende til 37% non-responderende kulturer), δ = 1/N således at den reciproke værdi af det responderende celletal svarende til 37% non-responderende 20 kulturer er CLP-frekvensen. Sædvanligvis blev antallet af celler per kilde og deres tilsvarende værdi for procent non-respons indført i komputeren, som beregner den bedst passende regressionslinie gennem disse punkter og antal af celler per kilde som svarer til 37% non-responderende kulturer, 25 hvorved den reciproke værdi heraf er frekvensen af CLP.

Resultater

Frekvenserne af cytotoksiske lymphocyt-prekursorer fra hver stimulator-celle -koncentration blev afbildet som en funktion af testforbindelsens dosis. Middel- og standardafvigelsen 30 ved de 20 gentagelser beregnedes også til sammenligning. De 5 anvendte tre stimulator-celle koncentrationer var 10 (sub- 5 5 optimal stimulering) 2,5x10 (optimal stimulering) og 5x10 (over-optimal stimulering). Det blev fundet, at testforbindelsen fremmede produktion af cytotoksiske lymphocyt-prekur-35 sorer ved koncentrationer fra ca. 1 pg/mus til ca. 100 ng/

Claims (1)

149595 mus (ekvivalent med ca. 50 pg/kg til ca. 5 ug/kg legemsvægt) i nærværelse af sub-optimale stimulator-celle koncentratio ner. Testforbindelsen virker derfor som en immuno-regulator ved disse koncentrationer til forøgelse af den cellulære 05 immun-reaktion hos de behandlede mus. 10 l. Analogifremgangsmåde til fremstilling af FTS-analoge tetra- eller pentapeptidderivater med den almene formel R-X-LYS-Y-GLN-R', hvori X er udvalgt fra gruppen bestående af L-alanyl, D-alanyl og sarcosyl, Y er udvalgt fra gruppen bestående af D- og L-seryl, sarcosyl, 2-methyl-alanyl og 15 D-alanyl, R er H, GLN eller SAR, og R' er OH eller NH2 eller farmaceutisk acceptable syreadditionssalte deraf, KENDETEGNET ved, at man esterificerer L-glutamin, som er beskyttet på ami-nogruppen, til en uopløselig harpiks-polymer ved hjælp af covalent binding, fjerner den α-aminobeskyttende gruppe fra L-20 glutamin-delen, omsætter med Y-aminosyren, som er beskyttet på aminogruppen, til kobling af Y-aminosyren til L-glutamin-har-piksen, fjerner den α-aminobeskyttende gruppe fra Y-aminosyre-delen, omsætter med «-aminobeskyttet L-lysin til kobling af L-lysin til Y-aminosyre-L-glutamin-harpiksen, fjerner den cr-25 aminobeskyttende gruppe fra L-lysin-delen, omsætter med den nødvendige X-aminosyre eller det nødvendige R-X-dipeptid, som er beskyttet på a-aminogruppen, til kobling af aminosyre eller dipeptid til L-lysin-Y-aminosyre-L-glutamin-harpiksen, hvorhos alle reaktionsdygtige sidekæder på de indgående aminosyrer er 30 beskyttede under reaktionen, hvorefter man spalter harpiksen og samtlige beskyttelsesgrupper fra peptidet med en syre eller ammoniak, hvorefter en fremstillet sekvens om ønsket omdannes til et farmaceutisk acceptabelt syreadditionssalt deraf. 35