FI67368C - Foerfarande foer framstaellning av nya terapeutiskt anvaendbara polypeptider - Google Patents

Description

Ι».^^·Ι M ««ν KOULUTUSJULKAISU r n 7 /L o 3®· W <">UTt.Ä«!OHllic$SKIllfT 67368 C (45) Γ -'ty H Γ3 1795 ^ ^ (51) K*Jt/tocCL3 C 07 C 103/52 SUOMI—FINLAND pi) ^κμκμ^-^μμ^ι 73376? (22) HakMttaptM—AMStcningedag 07.12.73 (23) AHntplhrl—GlklglMttcUf 07.12.78 (41) TuMuc |ulkbalnl — Blhrtt oUmtUlg 0?. 06.79

Patentti- ja rekisterihallitus ... .......... . .. . .

_ 1 (44) NJktMtalpsnon J* kmiL|trikalMn pvm. — ?n 11 8Λ

Patent-och re^sterstyralsen f Alaskan uthgd odi utLskrtft·* pubUcararf J

(32)(33)(31) t>rrit*tY «tuoik*/*—Baglrt prtorttet 08.12.77 08.09.78, Γ/.11.78 USA(U5) 858996, 990531, 960550 Toteennäytetty-Styrkt (71) Ortho Pharmaceutical Corporation, Raritan, New Jersey, USA(US) (72) Gideon Goldstein, Short Hills, New Jersey, USA(US) (79) Oy Koister Ab (59) Menetelmä uusien, terapeuttisesti käyttökelpoisten polypeptidien valmistamiseksi - Förfarande för framstälining av nya, terapeu-tiskt användbara polypeptider

Keksinnön kohteena on menetelmä uusien, terapeuttisesti käyttökelpoisten polypeptidien valmistamiseksi.

Eläinten eri kudoksista ja elimistä (esim. verestä) on eristetty monia polypeptideja. Useilla näistä polypeptideistä on vaikutusta kehon immuuni-funktioon, esimerkiksi eri immunoglobuli.init , kateenkorvahormonl-tymopoietiini jne. Hakija en todella eristänyt ja syntetisoinut useita näistä polypeptideistä, kuten on selostettu US-patenttijulkaisussa 4 002 602 ja 9 002 740 sekä useissa tieteellisissä kirjoituksissa.

Suunnilleen viime vuosikymmeneen asti tiedettiin kateenkor-vasta hyvin vähän, vaikka nyt on ymmärretty, että kateenkorva on eräs niistä elimistä, jotka pääasiallisesti vastaavat nisäkkäiden ja lintujen immuuni-funktiosta. Huolimatta suuresta mielenkiinnosta kateenkorvan mahdollisiin toimintoihin ja aikaisempiin teorioihin ja kokeiluihin, tiedettiin hyvin vähän kateenkorvan toiminnasta ennen 2 67368 kuin viime aikoina. Nyt on kuitenkin oivallettu, että kateenkorva on yhdyselin, jossa on sekä epiteeli- (umpieritys-) että imu- (immunologiset) komponentit ja siten kateenkorva on osallisena kehon immuunisuustoiminnoissa. Kateenkorva käsittää epiteeliperuskudok-sen, joka on peräisin kolmannesta kiduskaaresta, ja imusoluista, jotka ovat peräisin kantasoluista, jotka saavat alkunsa verta muodostavissa kudoksissa, Goldstein, et ai., The Human Thymus, Heinemann, Lontoo, 1969. Imusolut erilaistuvat kateenkorvassa ja poistuvat kypsinä kateenkorva-peräisinä soluina, joita sanotaan T-soluiksi, jotka kiertävät vereen, imunesteeseen, pernaan ja imusolmukkeisiin. Kantasolun erilaistumisen aiheutuminen kateenkorvan sisällä näyttää olevan kateenkorvan epiteeli-solujen eritteiden välittämä.

Jonkin aikaa on ollut tunnettua, että kateenkorva liittyy kehon immuunius-ominaisuuksiin ja sen tähden on osoitettu suurta mielenkiintoa aineisiin, jotka on eristetty kateenkorvasta. Tässä suhteessa on viime vuosina julkaistu suhteellisen suuri määrä kirjoituksia, jotka pohjautuvat tieteelliseen työhön, joka koskee naudan kateenkorvassa läsnäolevia aineita. Itseasiassa hakija on julkaissut joukon kirjoituksia, jotka kohdistuvat tämän alan tutkimuksiin. Tätä koskevia kirjoituksia löytyy esimerkiksi julkaisuissa The Lancet, heinäkuu 20, 1968, s. 119-122; Triangle, Voi. II, n:o 1, s. 7-14, 1972; Annals of the New York Academy of Sciences, Voi. 183, s. 230-240, 1971; sekä Clinical and Experimental Immunology, Voi. 4, n:o 2, s. 181-189, 1969; Nature, Vei. 247, s. 11-14, 1974; Proceeding of the National Academy of Sciences USA, Voi. 71, s. 1474-1478, 1974; Cell, Voi. 5, s. 361-365 ja 367-370, 1975; Lancet, Voi. 2, s. 256-259, 1975; Proceedings of the National Academy of Sciences USA, Voi. 72, s. 11-15, 1975; Biochemistry, Voi. 14, s. 2214-2218, 1974; Nature, Voi. 255, s. 423-424, 1975.

Toisen luokan imusoluja, joilla on immuuni-toiminto, muodostavat B-imusolut eli B-solut. Nämä erilaistuvat linnuilla "Fabriciuk-sen pussissa" (Bursa of Fabricius) ja nisäkkäillä toistaiseksi tunnistamattomassa elimessä. T-solut ja B-solut toimivat yhdessä monissa immuunisuus-näkökohdissa. Ks. esimerkiksi hakijan kirjoitukset julkaisuissa Science, 19 3, 319 (heinäkuu 23 , 1 976 ), ja Cold Spring Harbor· Symposia on Quantitative Biology, Voi. XLI, 5 (1 977).

II

67368 Äskettäin ovat J.F.Bach, et ai. sian seerumista eristäneet erään nonapeptidi-aineen, josta käytetään nimitystä "facteur thy-mique serique" (FTS). Tämän aineen eristäminen ja sen rakenne on esitetty julkaisuissa C. R. Acad. Sc. Paris, t. 283 (marraskuu 29, 1976), Series D-1605 ja Nature 266, 55 (maaliskuu 3., 1977). Tämän nonapeptidin rakenteeksi on määritetty GLX-ALA-LYS-SER-GLN-GLY-SER-ASN, jossa "GLX" edustaa joko glutamiinia tai pyroglutamiinihappoa. Aine, jossa GLX on glutamiini tai pyroglutamiinihappo, on syntetisoitu. Näissä kirjoituksissa Bach esitti, että tämä nonapeptidi FTS erilaisti selektiivisesti T-soluja (eikä B-soluja) käyttäen E-roset-ti-analyysia (rosette assay). Niinpä Bach päätteli, että tämä aine oli kateenkorva-hormoni. Äskettäin on tämän nonapeptidin aktiivisuuden perusteellisempi tutkimus osoittanut, että FTS erilaisti sekä T- että B-soluja ja oli aktiivisuudeltaan sen tähden enemmän ubikitiinin kuin tymopoietiinin kaltainen, Brand, Gilmour ja Foldstein, Nature, 269:597 (1977).

Nyt on keksitty, että tämän FTS-nonapeptidin syntetisoidulla 4-aminohappo-polypeptidi-segmentillä on monia edellä mainituissa julkaisuissa esitetyn nonapeptidin ominaisuuksia.

Niinpä tämän keksinnön kohteena on menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen polypeptidin valmistamiseksi, jonka kaava on

R-X-LYS-Y-GLN-R' I

jossa R' on OH tai NH2, X on sarkosyyli, L-alanyyli tai D-alanyyli, Y on seryyli, sarkosyyli, 2-metyylialanyyli tai D-alanyyli ja R on H, GLN tai SAR.

Keksinnön mukaiselle menetelmälle on tunnusomaista, että L-glutamiini, jonka aminoryhmä on suojattu, esteröidään kovalent-tisella sidoksella liukenemattomaan hartsipolymeeriin, L-glutamii-niryhmästä poistetaan o^-aminosuojaryhmä, Y-aminohappo, jonka oC -aminosuojaryhmä on suojattu, saatetaan reagoimaan L-glutamiini-hartsin kanssa Y-aminohapporyhmän liittämiseksi siihen, Y-amino-' happoryhmästä poistetaan -aminosuojaryhmä, L-lysiini, jonka <* -aminoryhmä on suojattu, saatetaan reagoimaan Y-aminohappo-L-glutamiini-hartsin kanssa L-lysiinin liittämiseksi siihen, L-ly-siiniryhmästä poistetaan oC-aminosuojaryhmä, N-R-substituoitu-X- 4 67368 aminohappo, jonka oC-aminoryhmä on suojattu, saatetaan reagoimaan L-lys iini-Y-aminohappo-L-glutamiini-harts in kanssa N-R-substituoi-dun-X-aminohapon liittämiseksi siihen, hartsi lohkaistaan peptidistä hapolla tai ammoniakilla, ja kaikki suojaryhmät poistetaan, jolloin saadaan kaavan I mukainen yhdiste, jossa R' on OH tai NH2, jolloin kun käytettään bentshydryyliamiinihartsipolymeeria, R' on NH2 riippumatta siitä, mitä lohkaisaainetta käytetään.

Kaavan I mukaisten polypeptidien asemassa olevat ryhmät eivät olennaisesti vaikuta aktiivisen ^-aminohappo-segmentin biologiseen aktiivisuuteen, joka mitataan kyvyllä aiheuttaa Th-1+ T-imusolujen ja Bu-1+ B-imusolujen erilaistuminen seuraa-vassa kuvatussa kananpojan induktio-kokeessa.

Koska aktiivinen tetrapeptidi-segmentti sisältyy pitempään sarjaan luonnossa esiintyvässä aineessa, jonka Bach eristi, on ymmärrettävä, että pääte-amino- ja karboksyylihapporyhmät eivät ole olennaisia tetrapeptidi-segmentin biologiselle aktiivisuudelle, kuten asia on joillakin polypeptideillä. Sen tähden on ajateltu, että tämän keksinnön piiri ci käsitä ainoastaan niitä tetrapeptidi-segmenttejä, jotka ovat substituoituja H:11a ja vastaavasti 0H:lla, vaan myös ne, jotka ovat päistään substituoituja yhdellä tai useammilla muilla funktionaalisilla ryhmillä, jotka eivät olennaisesti vaikuta tässä esitettyyn biologiseen aktiivisuuteen.

Molekyylin aktiivisuuden uskotaan riippuvan sen stereoke-miasta, ts. molekyylin "poimuuntumisesta". Popypeptidi-sidokset eivät ole jäykkiä, vaan joustavia ja polypeptid.it voivat esiintyä levyinä, kierukoina jne., minkä seurauksena koko molekyyli on joustava ja "taittuu" tietyllä tavalla. On havaittu, että nämä uudet tetrapeptidi-segmentit todennäköisesti "taittuvat" samalla tavalla kuin vastaava tetrapeptidi-segmentti luonnon nonapeptidissä, ja että tästä johtuen niillä on samat biologiset ominaisuudet kuin luonnon 9-aminohappopeptidillä, jonka J.F.Bach on esittänyt FTSrna edellä esitetyissä kirjoituksissa. Tässä nonapeptidissä voidaan yksi tämän keksinnön tetrapeptidisarja tunnistaa molekyylin sisällä, mutta ainoastaan yhdessä muiden tässä selostettujen aminohappojen kanssa. Koska tämän keksinnön tetrapeptidi-segmentit antavat saman biologisen aktiivisuuden kuin nonapeptidi FTS, on selvää, että aminohapot ja peptidi-ketjut, jotka on substituoitu tetra- 6 7368 peptidi-segmentin pääte-aminohappotähteillä, eivät vaikuta sen biologisiin ominaisuuksiin.

Eräässä keksinnön edullisessa suoritusmuodossa on X L-ala-nyyli, Y on L-seryyli, R on vety ja R' on OH. Tämän edullisen suoritusmuodon kaava on seuraava:

H N-CH-CONH-CH-CONH-CH-CONG-CH-COOH

^ t 1 T T

CH3 (CH2)4 CH2 (CH2)2 1 » t nh2 oh conh2

H - ALA - LY S - SEP - GLN - OH

Tässä patenttihakemuksessa peptidin aminohappokomponenteista on käytetty seuraavia lyhennyksiä: D-aminohapot osoitetaan sijoittamalla "D" ennen lyhennystä, esim., D-alaniinia edustaa "D-ALA".

Aminohappo Lyhennetty merkintä

L-alaniini ALA

L-seriini SER

L-glutarniini GLN

sarkosiini SAR

2-metyylia.laniini 2-HE-ALA

Keksinnön mukaisesti valmistetuilla polypeptideillä on samanlaiτLa ominaisuuksia kuin sian verestä eristetyllä 9—amino-happopolypeptidillä FTS, kuten on esitetty edellä mainituissa Bach'in et ai. kirjoituksissa. Näille tetrapeptideille en erityisesti ominaista, että ne pystyvät aiheuttamaan sekä T-prekursori-solujen että myös B-prekursorisolujen erilaistumisen. Eräät näistä poiypeptideistä ovat aktiivisia niinkin alhaisessa väkevyydessä kuin 1 pikograsnma (pg)/ml seuraavassa selitettävässä kananpojan induktio-kokeessa.

On havaittu, että tämän keksinnön polypeptidit aiheuttavat immunosyytti-prekursorisolujen erilaistumisen in vitro samalla tavalla kuin Bachin esittämät nonapeptidit. Siten tämän keksinnön polypeptidien on havaittu aiheuttavan sekä T-prekursori-soiujen erilaistumisen, mitattuna kateenkorva-differentiaatic-antigeenin TH-1 saannilla, että myös B-prekursorisolujen erilaistumisen, mitattuna differentiaatioantigeenin Bu-1 saannilla.

67368

Toisin ilmaistuna näillä polypeptideillä on kyky aiheuttaa sekä Th-1+ T-imusolujen että Bu-1+ B-imusolujen erilaistuminen.

On myös havaittu, että nämä polypeptidit lisäävät sytotok-sisten imusolujen in vivo tuotantokykyä allogeenisillä antigeeneillä kiihotettaessa. Ts. näiden polypeptidien antaminen esim. rotille edistää sytotoksisten imusolu-prekursorien tuotantoa mitattuna in vitro-kokee11a rottien pernasoluissa. Koska sytotoksisten imusolujen kehittyminen ja siirteen hylkiminen allogeenisessa siirre vastaan isäntä-reaktiossa vastaavat toisiaan, antaa edellä mainittu havainto lisäkannatusta näiden polypeptidien immunologiselle käyttökelpoisuudelle.

Tämän keksinnön polypeptidien biologisten ominaisuuksien erilaistamisen tärkeyden ymmärtämiseksi olisi huomattava, että kateenkorvan toiminta suhteessa immuuniuteen voidaan laajasti katsoa kateenkorvaperäisten solujen tai imusolujen, joita sanotaan T-soluiksi, tuottamiseksi. T-solut muodostavat suuren osan kiertävien pienten imusolujen keräymästä. T-soluilla on immunologinen spesifisyys ja ne ovat suoraan osallisena soluvälitteisissä immuuni-reaktioissa (kuten omalajisiirteen reaktiossa) tehostinso-luina. T-solut eivät kuitenkaan eritä humoraalivasta-aineita.

Näitä vasta-aineita erittävät solut (nimitetään B-soluiksi), jotka ovat peräisin suoraan luuytimestä riippumatta kateenkorvan vaikutuksesta. Monilla antigeeneillä B-solut kuitenkin tarvitsevat sopivasti reaktiivisten T-solujen läsnäoloa ennen kuin ne voivat tuottaa vasta-aineita. Solujen yhteistoimintaprosessin mekanismia ei vielä täysin ymmärretä.

Tämän selostuksen perusteella voidaan käytännössä sanoa, että kateenkorva on tarpeen solu-immuunisuuden ja monien humo-raalivasta-ainereaktioiden kehittymiselle ja vaikuttaa näihin järjestelmiin aiheuttamalla kateenkorvan sisällä verta muodostavien kantasolujen erilaistuminen T-soluiksi. Tämän vaikutuksen välittävät kateenkorvan epiteelisolujen eritteet, ts. kateenkorva-hormonit.

Kateenkorvan ja imusolujen solujärjestelmän sekä imusolujen kierron ymmärtämiseksi olisi lisäksi mainittava, että kantasolut syntyvät luuytimessä ja tulevat kateenkorvaan verivirran mukana. Kateenkorvan sisällä kantasolut erilaistuvat immunologisesti n 67368 pystyviksi T-soluiksi, jotka kulkeutuvat verenkiertoon ja yhdessä B-solujen kanssa kiertävät kudosten, imusolmukkeiden ja verivirran välillä.

Kehon solut, jotka erittävät vasta-ainetta (B-soluja) kehittyvät myös verta synnyttävistä kantasoluista, mutta niiden erilaistuminen ei ole kateenkorvan määräämä. Linnuilla ne erilaistuvat kateenkorvan kaltaisessa elimessä, jota nimitetään Fabriciuksen pussiksi (Bursa of Fabricius). Nisäkkäiillä ei vastaavaa elintä ole löydetty ja on ajateltu, että nämä solut erilaistuvat luuyti-messä. Tästä syystä niitä nimitetään luuydinsyntyisiksi soluiksi eli B-soluiksi. Fysiologiset aineet, jotka määräväät erilaistumisen, ovat täysin tuntemattomia.

Kuten edellä mainittiin, keksinnön polypeptidit ovat terapeuttisesti käyttökelpoisia hoidettaessa ihmisiä ja eläimiä. Koska nämä uudet polypeptidit pystyvät aiheuttamaan verta muodostavissa kudoksissa syntyvien lymfopoeettisten kantasolujen erilaistumisen sekä kateenkorvaperäisiksi imusoluiksi (T-soluiksi) että immuno-päteviksi B-soluiksi, jotka pystyvät osallistumaan kehon immuuni-reaktioihin, katsotaan tämän keksinnön tuotteilla olevan monenlaista terapeuttista käyttöä. Ensinnäkin, koska näillä yhdisteillä on kyky suorittaa tiettyjä kateenkorvan toimintoja, niille on käyttöä erilaisilla kateenkorvan toiminta- ja immuunisuusalueilla. Ensimmäinen käyttöalue on DiGeorgen oireitten hoidossa, tilan, jossa kateenkorva synnynnäisesti puuttuu.Injektoimalla keksinnön mukasita polypeptidiä, kuten seuraavassa esitetään, voitetaan tämä vajavuus. Eräs toinen käyttöalue on veren gammaglobuliinin puutoksessa, joka johtuu kehon otaksutun B-soluja erilaistavan hormonin vajavuudesta. Tämä puutos voitetaan ruiskuttamalla jotakin kohde-polypeptideistä. Koska nämä polypeptidit ovat äärimmäisen aktiivisia alhaisissa väkevyyksissä, ne ovat käyttökelpoisia lisäämään kehon kokonaisimmuunisuutta sikäli, että ne stimuloivat soluimmuunisuuden ja humoraali-immuunisuuden kehittymistä ja ovat siten käyttökelpoisia hoidettaessa sairauksia, jotka käsittävät kroonisen infektion in vivo, kuten sieni- tai mykoplasma-infekti-oita, tuberkuloosia, lepraa, äkillisiä tahi kroonisia virusinfektioita jne. Lisäksi näitä peptidejä pidetään käyttökelpoisina millä tahansa alueella, jolla solu- tai humoraali-immuuniudessa 8 67368 on vajavuuksia, kuten edellä mainitussa DiGeorge-o'ireistcssa. Polypeptidien ominaisuuksista johtuen niillä on lisäksi käyttöä in vitro saatettaessa T-solujen pinta-antigeenit kehittymään, saatettaessa toiminnallinen kapasiteetti kehittymään herkyyden saavuttamiseksi mitogeeneille ja antigeeneille, sekä solujen yhteistyökyvyssä parantamalla B-solujen kykyä tuottaa vasta-aineita. Niillä on in vitro käyttöä saattamalla B-solut kehittymään, mikä mitataan pinnan komplementtiresesptorien kehittymisellä. Nämä peptidit ovat myös käyttökelpoisia estettäessä ubikitiinille herkkien imusolujen rajatonta uudiskasvua (.kuvattu hakijan US-patentissa n:o 4 002 602). Eräs näiden polypeptidien tärkeä ominaisuus on niiden in vivo kyky elvyttää solujen T-soluominaisuudet ja myös niiden in vivo kyky elvyttää solujen 3-soluominaisuudet.

Ne ovat sen tähden käyttökelpoisia hoidettaessa suhteellisia tai absoluuttisia B-solupuutteitä sekä myös suhteellisia ja absoluuttisia T-solupuutteita, johtuvatpa nämä vajavuudet sitten vajavuuksista B-soluja erilaistavassa kudoksessa tai vastaavasti kateen-korvassa tai jostain muusta syystä.

Vielä eräs tämän keksinnön polypeptidien tärkeä ominaisuus on, että ne ovat erittäin aktiivisia hyvin alhaisissa väkevyyksissä. Niinpä on havaittu, että polypeptidit ovat yleensä aktiivisia n. 1 ng/ml:n väkevyyksissä, kun taas tietyt erityisen tehokkaat polypeptidit (H-SAR-LYS-D-ALA-GLN-NH2 ja H-SAR-LYS-SAR-GLN-NH^) ovat aktiivisia väkevyyksissä lähtien n. 0,1 pg/ml:sta.

Kaavan H-ALA-LYS-SER-GLN-OH mukaisen tetrapeptidin aktiivisuuden ja ominaisuuksien määrittämiseksi suoritettiin seuraava kananpojan induktio-koe. Tämä koe on selitetty yksityiskohtaisemmin Brad'in et ai. kirjoituksessa,Science 193, 319-321 (heinäkuu 23. 1976) ja siinä esitetyissä kirjallisuusviitteissä.

Vastakuoriutuneiden kananpoikasten luuydin valittiin indusoituvien solujen lähteeksi, koska siinä on tuskin lainkaan Bu-1^· -j· . f , , , tai Th-1 -soluja. Yhdistetyt solut viiden vastakuoriutuneen SC (Hy-Line)-kannan kananpeikasen reisi- ja sääri-nilkkaluista fraktioitiin ultrasentifugissa viisikerroksisella epäjatkuvalla nau-danseerumialbumiini- (BSA)-gradientilia. Solut kahdesta kevyemmäs-tä kerroksesta yhdistettiin, pestiin ja suspendoitiin inkubointia g varten 5 x 10 solun/ml väkevyydessä polypeptidin sopivan pitoi-

II

67368 suuden kanssa RPMI 163O-väliaineessa, johon oli lisätty 15 mM HEPES'ia, 5 % Y’-globuliini-vapaata vasikan sikiöseerumia, deoksi-ribonukleaasia (14-18 yksikköä/ml), hepariinia (5 yksikköä/ml), penisilliiniä (100 yksikköä/ml) ja streptomysiiniä (100 yug/ml). Vertailukohteita inkuboitiin BSA:n (1 yug/ml) kanssa tai pelkän väliaineen kanssa. Inkuboinnin jälkeen soluille suoritettiin syto-toksisuus-analyysi käyttäen kananpojan Cl ja marsun C2-C9-komplementit ifraktioita , kuten viitekirjoituksessa on kuvattu. Bu-1+- tai Th-l+-solujen osuus kussakin kerroksessa laskettiin sytotoksisuus-kertoimena, 100 (a-b)/a, jossa a ja b ovat elinvoimaisten solujen prosentit komplementti- ja vastaavasti koevalmisteessa. Indusoitujen solujen prosentti saatiin vähentämällä keskimääräiset vertai-luinkubointien arvot (ilman indusoimisaineita, tavallisesti 1-3 %) koeinduktioiden keskiarvoista.

Koe-polypeptidien vaikutuksen spesifisyys ja sen samanlaisuus ubikitiinin kanssa osoitettiin estämällä Bu-lf B-soIujen ja Th-1+ T-solujen induktio koe-polypeptideillä ubikitiinin lisäämisen jälkeen väkevyydessä 100 yug/ml· Tämä suuri ubikitiini-annos inaktivoi ubikitiini-reseptorit ja estää siten solujen indusoitu-misen millä tahansa aineella, joka vaikuttaa näiden reseptoreiden kautta.

Tuloksena tästä kokeesta havaittiin, että esimerkin I tetrapeptidillä oli samanlainen biologinen aktiivisuus kuin ubiki-tiiniilä san aiheuttaessa sekä Th-1+ T- ja 3u-l+ B-imusolujen erilaistuminen ng/ml-väkevyyksissä.

Polypeptidien käyttökelpoisuuden valaisemiseksi lähemmin kuvataan seuraavassa mixroviljelykoetta allogeenisten antigeenien sytotoksister. imusolujen, jotka on valmistettu kiihottamalla» esiin tyrni stiheyksien arvioimiseksi. Sytotoksisxen prekursorien esiintymistiheyksiä vertailueläinten ja eläinten välillä, joihin eli ruiskutettu lääkettä eri väkevyyksissä, verrattiin rajoittavalla laimennuskokeella.

Aineet ja menetelmät

Hiiret

Sukusiitos C57 BL/6J (naaraspuolisia, 8 viikkoa) saatiin Jackson Laboratory'sta, Bar Harbor, Maine.

Sukusiitos DBA/2J (uros- ja naaraspuolisia) saatiin myös Jackson Laboratory 'sta, Bar Harbor, Maine.

10 67368 Väliaineet

Fosfaatilla puskuroitua suolaliuosta (PBS), RPMI 1640, sikiö-asteista vasikan seerumia (FCS) - (eränumero R776116), N-2-hydrok-sietyylipiperatsiini-N'-2-etaanisulfonihappo (HEPES)-puskuria saatiin firmasta Gibo, Grand Island; 2-merkaptoetanolia saatiin Eastman Kodak'ista, Rochester, N.Y. Solut pestiin PBS:lla ja viljeltiin RPMI:ssa, joka sisälsi 10 % FCS, 10 mM HEPES-puskuria ja 5 x 10 2-merkaptoetanolia.

Lääkekäsittely

Koeläimiin (C57 BL/6J) injektoitiin (laskimonsisäisesti tai vatsaontelon sisäisesti) 0,2 ml eri väkevyyksiä H-SAR-LYS-SAR-GLN-NH2 (lääkkeellä; tunnusnumero G040) 24 tuntia ennen niiden tappamista kokeita varten.

Solupreparaatit C57/6J-hiirien tai DBA/2J-hiirien pernoista valmistettiin solususpensioita hienontamalla elimet ja puristamalla ne metalli-lankaverkon (numero SO) läpi 5 ml:n ruiskun männällä falcon-petri-maljaan (falcon 3002, 15 x 60 mm). Solususpensioiden annettiin seistä huoneen lämpötilassa 10 minuuttia ja suurten kudosmöykkyjen annettiin laskeutua. Solususpensiot siirrettiin sitten 15 ml:n Corning-sentrifugiputkiin (Corning 25310) ja niitä lingottiin 10 minuuttia kierrosnopeudella 1 500 r/min Beckman TJ-6-sentrifugissa. Kaikki solususpensiot pestiin ainakin vielä kolme kertaa PBS:lla. Kolmannen pesun jälkeen vastesolut (C57 BL/6J) suspendoitiin uudelleen viljelyväliaineeseen ja laskettiin Coulter-laskimella DBA/2J (stimuloivat solut) suspendoitiin uudelleen RPMI:iin väke-7 vyyteen 10 solua/ml 3 0 yug mitomysiiniä C lisättiin jokaiseen ml:aan DBA/2J pernasoluja ja inkuboitiin 37°C:ssa 30 minuuttia. Mitomysiini C-käsittelyn jälkeen pernasolut pestiin kolme kertaa PBS:lla ylimääräisen miromysiini C:n poistamiseksi. DBA-solut suspendoitiin sitten uudelleen viljelyväliaineeseen ja laskettiin Coulter-laskimella.

Imusolujen sekaviljelyt (MLC) tehtiin mikrotiitterikennois-sa (Linbro Chemicals, New Haven, Conn., IS-MCV-96). Jokainen kenno sisälsi 96-V-pohjasyvennystä. Ulkosivun syvennyksiä, jotka ympä- 11 67368 röivät levyn reunaa, ei käytetty soluviljelyyn, vaan täytettiin PBS:lla haihtumisen välttämiseksi viljelysyvennyksistä. Jokaiseen V-pohjakennoon pantiin 60 näytettä. Tavallisesti jokainen kenno sisälsi kolmea vastasolupitoisuutta (20 toistoa jokaisesta) ja yhtä stimulaatiosolupitoisuutta. Vastesolut suspendoitiin tavallisesti väkevyyksiksi 7,5 x 10^ , 5 x 10^ ja 2,5 x 10^/ml, ja 0,1 ml suspensiota lisättiin jokaiseen syvennykseen. Käytetyt stimu-laatiosolupitoisuudet olivat 10°, 2,5 x 10° ja 5 x 10 /ml, myös niitä lisättiin 0,1 ml jokaiseen syvennykseen. Samaa stimulaatiosolupitoisuutta käytettiin kautta koko levyn. Vertailulevy sisälsi ainoastaan vastesoluja ilman stimulaatiosoluja väliaineesta aiheutuvan pöhjakiihotuksen arvioimiseksi. Soluja viljeltiin kuusi päivää 37°C:ssa kostutetussa imbukoimislaitteessa, joka sisälsi 5 % C02.

Merkkisolut

Sytotoksisessa kokeessa käytetty merkkisolu oli DBA mastosy-toma solulinja P815. Tämä solulinja ylläpidettiin tavanomaisella

O

kululla DBA/2J-hiirien läpi. 5 x 10 P815 solua käytettiin jokais ta läpikulkua varten ja kasvainsoluja kantajien vatsakalvon ontelosta käytettiin 4-5 päivää läpikulun jälkeen. Kasvainsolut vatsa- kalvon ontelosta pestiin kolme kertaa PBS:llä ja merkittiin sitten 51 7

Cr :llä väkevyydessä 100 /uci/10 solua. Merkitseminen suoritettiin tunnin aikana 37°C:ssa kostutetussa inbukoimislaitteessa. Merkityt merkkisolut pestiin sitten kolme kertaa BPS:llä ylimääräisen merkkiaineen poistamiseksi.

Sytotoksinen koetus

Kuusi päivää viljelyn jälkeen 0,1 ml väliainetta poistettiin jokaisesta syvennyksestä sekoittamalla solupellettejä. Käyttäen automaattista mikropipettiä (MLA-pipettiä) pipetoitiin sitten • 4 51 100 μΐ merkkisoluja, jotka sisälsivät 2,5 x 10 Cr -merkittyjä merkkisoluja kuhunkin syvennykseen, suspendoiden solupelletti uudelleen prosessin aikana (uutta pipettikärkeä oli käytettävä jokaista syvennystä varten). Mikrotiitterikennoja lingottiin sitten huoneen lämpötilassa kierrosluvulla 1 000 r/min seitsemän minuuttia 12 67368

Sorvali GLC-2B:ssä. Kennoja inkuboitiin neljä tuntia 37°C:ssa.

100 mikrolitraa sakan päällä olevaa nestettä poistettiin sitten Gamma-laskuputkiin (Amershen 196271). Putket laskettiin sitten Beckman Gamma Counter (Beckman 310)-laskimessa. Putket laskettiin tavallisesti yhdessä minuutissa.

Sytotoksisten imusolujen (CLP) prekursorien esiintymistiheyksien määritys

Rajoittava laimennusanalyysi on kokonais- tai 0-vastekoe-tus, joka selittyy Poisson'in todennäköisyysjakautumalla. Vasteen esiintymättömyyden todennäköisyys annetaan nollajärjestysjärjes-tystermillä Po=e jossa <£ - CLP:n esiintymistiheys ja N = imu- solujen määrä syvennystä kohti. Siten reagoimattomien viljelyjen/ soluannos-suhteen logaritmin merkitseminen koordinaatistoon antaisi suoran, jonka kaltevuus on - , CLP:n esiintymistiheys.

Esimerkissä laskettiin taustan kromin vapautus (spontaaninen vapautus) 20 syvennyksestä, jotka sisälsivät vain vastesoluja (C57 BL/6J) eikä ollenkaan stimuiaatiosoluja . Testisyvennykset arvioitiin positiivisiksi, jos niiden lasketut luvut olivat suurempia kuin keskimääräinen spontaaninen arvo enemmällä kuin 2,07 standar-dipoikkeamalla (P 0,05). Spontaaninen lyysi oli tavallisesti 9-15 % merkkisoluihin yhdistetyistä kokonaislaskuista. Poisson'in yhtälön po = ^^ ^, kun PO = e ^ = 0,37 (vastaa 37 % vastetta anta-mattomia vilje lyjä), & - 1/N, siten vastesolujen lukumäärän, joka vastaa 37 i ei-reagcivia viljelyjä, käänteisarvo on CLP-esiintymis-tiheys. Yleensä solujen lukumäärä syvennystä kohti ja niiden vastaava arvo ei-reagoivien solujen prosenttia varten sovitettiin tietokoneeseen, joka laskee parhaiten sopivan regressioviivan näiden pisteiden kautta ja solujen lukumäärän syvennystä kohti, jotka vastaavat 37 %:n ei-reagoivia viljelyjä, jolloin tämän arvon käänteisarvo on CLP:n esiintymistiheys.

Tulokset

Sytotoksisten imusolu-prekursorien esiintymistiheydet jokaista stimulaatiosoluväkevyyttä varten merkittiin koordinaatistoon lääkeannoksen funktiona. 20 toiston keskimääräinen ja standardipoik-keama laskettiin myös vertailun vuoksi. Kolme käytettyä stimulaatio- 5 13 67368 solupitoisuutta olivat 10 (alioptimaalinen stimulaatio), 2,5 κ 5 5 10 (optimaalinen stimulaatio) ja 5 x 10 (ylioptimaalinen stimulaatio). Havaittiin, että testilääke edisti sytotoksisten imusolu-prekursorien tuotantoa väkevyyksillä 1 pg/hiiri - 100 ng/hiiri (vastaa n. 50 pg/kg - n. 5 yug/kg kehon painoa) alioptimaalisten stimulaatiosolupitoisuuksien läsnäollessa. Testilääke toimii sen tähden immuno-säätelijänä näissä pitoisuuksissa käsiteltyjen hiirien solu-immuunireaktioiden lisäämiseksi.

Keksinnön mukaisesti polypeptidejä valmistettiin Merri-field'in julkaisussa Journal of American Chemical Society, 85, s. 2149-2154, 1963 esittämällä menetelmällä. Synteesi käsitti suojattujen aminohappojen vaiheittaisen lisäämisen kasvavaan pepti-diketjuun , joka oli kovalenttisin sidoksin sidottu kiinteään hart-siosaan. Tässä menetelmässä reagoivat aineet ja sivutuotteet poistettiin suodattamalla ja välituotteiden uudelleenkiteyttäminen jätettiin pois. Tässä menetelmässä ketun C-pääteaminohappo liitetään kiinteään polymeeriin kovalenttisellä sidoksella ja seuraavia aminohappoja lisätään yksi kerrallaan, vaiheittain, kunnes haluttu sarja on koossa, hopuksi peptidi poistetaan kiinteästä polymeeristä ja suojaryhmät poistetaan. Tällä menetelmällä saadaan kasvava pep-tiöiketju liittyneenä liukenemattomaan kiinteään alustaan, joten se on helppo suodattaa ja pestä vapaaksi reagensseista ja sivutuotteissa .

Aminohapot voidaan liittää mihin tahansa sopivaan polymeeriin, jonka on vain oltava helposti erotettavissa reagoimattomista reagensseista. Polymeeri on liukenematon käytettyyn liuottimeen tai se voi olla liukoinen tiettyihin liuottimiin ja liukenematon muihin. Polymeerillä tulisi olla pysyvä fysikaalinen muoto, jotta se olisi helppo suodattaa. Sen täytyy sisältää funktionaalinen ryhmä, hon ensimmäinen suojattu aminohappo voi lujasti sitoutua kovalent-tisellä sidoksella. Erilaisia liukenemattomia tähän tarkoitukseen sopivaia polymeerejä ovat esim. selluloosa, polyvinyylialkoholi, polymetakrylaatti ja sulfonoitu polystyreeni. Keksinnön mukaisessa synteesissä käytettiin yleensä kloorimetyloitua styreenin ja divi-nyylibentseenin kopclymeeriä. Polymeerejä, jotka ovat liukoisia orgaanisiin liuottimiin, mutta liukenemattomia vesipitoisiin liuottimiin, voidaan myös käyttää. Eräs tällainen polymeeri on poly-etyleeniglykoli, jonka molekyylipaino on n. 20 000 ja joka on “ 67368 liukoinen metyleenikloridiin, mutta liukenematon veteen. Tämän polymeerin käyttöä peptidi-synteesissä on kuvattu F. Bayer'in ja M. Mutter'in kirjoituksessa julkaisussa Nature 237, 512 (1972) ja sen sisältämissä kirjallisuusviitteissä.

Aminohapossa olevat erilaiset funktionaaliset ryhmät suojattiin tavanomaisilla polypeptidikemiassa käytetyillä suojaryh-millä. Esim. lysiinin funktionaalinen ryhmä suojattiin suojaryh-mällä, joka voitiin poistaa sarjaa täydennettäessä vaikuttamatta haitallisesti lopulliseen polypeptidituotteeseen. Synteesissä käytettiin fluoreskamiinia määritettäessä liitännän onnistumista, jota osoitti positiivinen fluoresenssi (ks. Felix, et ai., Analyt, Biochem., 52, 377, 1973). Ellei liitäntä ollut täydellinen, liittäminen toistettiin samalla suojatulla aminohapolla ennen suojauksen purkamista.

C-pääte-aminohappo voidaan liittää polymeeriin monella erilaisella hyvin tunnetulla tavalla. Yhteenvetoja menetelmistä käytettäessä halogeenimetyylihartseja ovat julkaisseet Horiki, et ai. julkaisussa Chem. Letters, s. 165-168 (1978) ja Gisin julkaisussa Helv. Chim. Acta, 56_, 1476 (1973).

Yleisesti menenetellään seuraavasti: L-glutamiini, jonka aminoryhmät on suojattu, esteröidään amiinia sisältävässä absoluuttisessa alkoholissa. Kytketty aminohappohartsi suodatetaan, pestään alkoholilla ja vedellä ja kuivataan. Glutamiiniaminohapon ©£-amino-ryhmässä oleva suojaryhmä (esim. t-BOC, ts. t-butyylioksikarbo-nyyli) poistetaan sitten. Saatu kytketty aminohappohartsi, jossa on vapaa aminoryhmä, saatetaan sitten reagoimaan suojatun L-serii-nin kanssa edullisesti alfa-t-BOC-O-bentsyyli-L-seriinin kanssa L-seriinin liittämiseksi. Reaktiot toistetaan sitten suojatulla L-lysiinillä ja L-alaniinilla, kunnes täydellinen molekyyli on valmistettu. Reaktiosarja suoritettiin seuraavasti:

II

15

Har.tsi 673 6 8

at'-R^Gln-OH

cC -R^-Gln-hartsi

Poistetaan o^-amino-I suojaryhmä H-Gln-hartsi σ ,?2

oC -R-, -L-Ser-OH

*2 i c*(-R^-Ser-Gln-hartsi

Poistetaan o£-amino-D suojaryhmä ,2 + H-Ser-Gln-hartsi ?3

oC-R^-Lys-OH

R0 R0 t 3 t 2 oC -R1~Lys-Ser-Gln-hartsi

Poistetaan οό-amino-suojaryhmä *3 h 1 H-Lys-Ser-Gln-hartsi

06-R, -Ala-OH

R R

I I * cC -R^-Ala-Lys-Ser-Gln-hartsi

Poistetaan kaikki suojaryhmät ja hartsi

V

H-Ala-Lys-Ser-Gln-OH

Tässä reaktiosarjassa R^ on cxi-aminoryhmän suojaryhmä ja R2 ja R^ ovat L-seriinin ja vastaavasti L-lysiinin reaktiivisten sivuketjujen suojaryhmiä, joita ei poisteta, kun R^ poistetaan seuraavan reaktion suorittamiseksi. Edellä esitetyssä pentapeptidi-hartsi-välituotteessa termi on edullisesti tert-butyylioksi-karbonyyli, R2 on bentsyyli tai substituoitu bentsyyli, (esim.

4-klooribentsyyli), ja R^ on substituoitu bentsyylioksikarbonyyli (esim. 2,6-diklooribentsyylioksikarbonyyli). Hartsi on joku edellä mainituista hartseista.

16 67368

Kun lopullinen välituote on valmistettu, peptidihartsista lohkaistaan siinä olevat R^, ja R^-suojaryhmät ja hartsi. Suo-jaryhmät poistetaan tavanomaisin menetelmin, esim. käsittelemällä vedettömällä fluorivedyllä, ja saatu vapaa peptidi otetaan sitten talteen.

Kuten edellä mainittiin, menetelmää toteutettaessa amino-ryhmät on suojattava. Vahvasti emäksiset aminoryhmät voidaan suojata suolan muodostuksella tai käyttäen p-metoksibentsyylioksi-karbonyyli-/ tai tert-butyylioksikarbonyylisuojaryhmiä. On edullista käyttää tert-butyylioksikarbonyyliä (BOC) tai tert-amyylioksi-karbonyyliä (AOC) o6-aminoryhmän suojaamiseksi aminohapoissa, joissa reaktio tapahtuu molekyylin karboksyyli-päässä, koska BOC- ja AOC-suojaryhmät voidaan helposti poistaa tällaisen reaktion jälkeen ja ennen seuraavaa vaihetta (jossa tällainen o^'-amino ryhmä itse joutuu reaktioon) antamalla hapon (esim. trifluorietikkana-pon) vaikuttaa lievissä olosuhteissa, mikä käsittely ei vaikuta muihin ryhmiin, jotka suojaavat muita reaktiivisia sivuketjuja. Siten on ymmärrettävä, että o(,- amino ryhmät voidaan suojata reaktiolla minkä tahansa aineen kanssa, joka suojaa aminoryhmiä jäl-keentulevan reaktion (reaktioiden) suhteen, mutta joka voidaan myöhemmin poistaa olosuhteissa, jotka eivät muuten vaikuta molekyyliin. Tällaisia aineita ovat esimerkiksi orgaaniset karboksyyli-happojohdannaiset, jotka asyloivat aminoryhmän.

Yleensä aminoryhmät voidaan suojata reaktiolla yhdisteen kanssa, joka sisältää ryhmittymän, jolla on kaava: 0 \_0__C__, jossa on ryhmittymä, joka estää aminoryhmän reagoimisen seuraavansa liittämisreaktiossa ja joka voidaan poistaa molekyyliä hajottamatta. voi olla suora- tai haaraketjuinen alxyyli, joka voi olla tyydyttämätön ja sisältää 1-1G hiiliatomia ja on edullisesti halogeeni- tai syaanisubstituoitu; aryyli, jossa edullisesti on 6-15 hiiliatomia; sykloalkyyli, joka edullisesti sisältää 5-8 hiiliatomia; edullisesti 7-13 hiiliatomia sisältävä aralkyyli; edullisesti 7-13 hiiliatomia sisältävä alkaryyli; tai heterosyk-linen yhdiste, esim. isonikotinyyli. Aryyli-, aralkyyli- ja aika- 17 67368 ryyliosat voivat myös olla substituoituja, kuten yhdellä tai useammalla alkyyliryhmällä, jossa on 1 - n. H hiiliatomia. Edullisia ryhmittymiä ovat tert-butyyli, tert-amyyli, tolyyli, ksylyyli ja bentsyyli. Erittäin edullisia spesifisiä amino-suojaryhmiä ovat bentsyylioksikarbonyyli; substituoitu bentsyylioksikarbonyyli, jossa fenyylirengas on substituoitu yhdellä tai useammalla halogeenillä, esim. Cl:lla tai Br:lla; nitro; alempi alhoksi, esim. metoksi; alempi alkyyli; tert-butyylioksikarbonyyli, tert-amyyli-oksikarbonyyli; sykloheksyylioksikarbonyyli; vinyylioksikarbonyyli ; adamantyylioksikarbonyyli; bifenyyli-isopropoksikarbonyyli; jne. Muita käyttökelpoisia suojaryhmiä ovat isonikotinyylioksi-karbonyyli, ftaloyyli, p-tolyylisulfonyyli, formyyli jne.

Toteutettaessa keksinnön yleistä menetelmää, peptidi rakennetaan vapaani-aminoryhmän reaktiolla yhdisteen kanssa, jossa on suojattuja amino ryhmiä. Reaktiota eli liittämistä varten liitettävän yhdisteen karboksyyliryhmä aktivoidaan niin, että se voi reagoida liitettävän peptidikatjun vapaan od-aminoryhmän kanssa. Karboksyyliryhmä voidaan aktivoida muuttamalla se reaktiiviseksi ryhmäksi, kuten esteriksi, anhydridiksi, atsidiksi, happoklori-diksi jne. Vaihtoehtoisesti reaktiossa voidaan käyttää sopivaa liittävää reagenssia. Sopivia liittämisreagensseja ovat esittäneet esim. Bodanszky et ai. teoksessa Peptide Synthesis, Interscience, toinen painos, 1975, luku 5, ja näitä ovat karbodi-imidit (esim. disyklokarbodi-imidi), karbonyyli-di-imidatsoli jne.

On myös ymmärrettävä, että näiden reaktioiden aikana aminohappo-osat sisältävät sekä amincryhmiä että karboksyyliryhmää ja tavallisesti toinen ryhmittymä osallistuu reaktioon, Kun taas toinen on suojattu. Ennen liittämisvaihetta peptidin alfa- tai pääte-aminoryhmän suojaryhmä poistetaan olosuhteissa, jotka eivät olennaisesti vaikuta muihin suojaryhmiin esim. lysiinimolekyylin epsi-Icn-aminon suojaryhmään. Edullisesti tämä vaihe toteutetaan käsittelemällä hapolla, kuten trifluorietikkahapolla huoneen lämpötilassa .

Valmistetut peptidit identifioitiin ja niiden puhtaus määritettiin tunnetuilla menetelmillä, kuten ohutlevykromatografiällä, elektroforeesilla, aminohappo-analyysilla jne.

Seuraavat esimerkit esitetään keksinnön valaisemiseksi.

18 67368

Esimerkeissä ja koko selityksessä osat ovat paino-osia ellei toisin ole ilmoitettu.

Esimerkki I

Polypeptidin valmistuksessa seuraavat aineet olivat kaupallisia tuotteita: yL -BOC-L-glutamiini-o-nitrof enyyli-esteri oi-BOC-i-2-kloori-bentsyylioksikarbonyyli-L-lysiini ->C -BOC-O-bentsyyli-L-seriini u6-B0C-L-alaniini.

Näissä reagensseissa BOC on t-butyylioksikarbonyyli. "Seque-nal"-reagenssit aminohapposarjan määrityksiä varten, disyklohek-syyli-karbodi-imidi,fluoreskamiini ja hartsi hankittiin myös kaupallisesti. Käytetty hartsi oli polystyreeni-divinyylibentseeni-hartsi, raekoko 200-400 mesh, ja se sisälsi 1 %:n divinyylibentsee-niä ja 0,75 mM kloridia grammaa kohti hartsia.

Polypeptidiä valmistettaessa 2 mmoolia <<,-BOC-L-glutamiinia liitettiin esteröimällä 2 mmooliin kloori-metyloitua hartsia absoluuttisessa alkoholissa, joka sisälsi 1 mM tietyyliamiinia, kuumentaen 24 tuntia 80°C:ssa. Saatu aminohappo-hartsi-esteri suodatettiin, pestiin absoluuttisella alkoholilla ja kuivattiin. Sen jälkeen muut «G-BOC-aminohapot liitettiin samalla tavalla käyttäen ekvivalenttisia määriä disykloheksyyli-karbodi-imidiä peptidi-hartsin o6-aminoryhmään, joka suojaryhmät oli poistettu oikeassa järjestyksessä, jolloin saatiin haluttu polypeptidi. Jokaisen liittämisreaktion jälkeen hartsinäyte tutkittiin fluoreskamiinilla ja jos positiivinen fluoresenssi havaittiin, pidettiin liittämistä epätäydellisenä ja se toistettiin samalla suojatulla aminohapolla. Seurauksina useista liittämisreaktloista valmistui välituote-tetrapeptidi-hartsi.

Tämä peptidi-hartsi lohkaistiin ja suojaryhmät poistettiin Kel-F-lohkaisulaitteessa (Peninsula Laboratories, Inc.) käyttäen vedetöntä fluorivetyä 0°C:ssa 60 minuuttia 1,2 ml:n kanssa anisolia grammaa peptidihartsiä. Peptidi-seos pestiin vedettömällä eetterillä ja uutettiin vesipitoisella hapolla. Uute lyofilisoitiin ja peptidi kromatografoitiin P-6 Bio-Gel:illä etikkahapossa (1 mol/1). Saatu polypeptidi oli puhtaudeltaan 94-%:ista ja se käsitti seu-raavan sarjan:

II

67368 19 H-ALA-LYS-SER-GLN-OH.

Tunnistamista varten suoritettiin ohutlevykromatografointi ja elektroforeesi seuraavasti.

Ohutlevykromatografia suoritettiin 30 yug:n näytteellä pii- happogeelillä (Brinkman Silica Gel + fluoresoiva indikaattori, 20 x 30 cm, 0,1 mm paksu) käyttäen seuraavia eluentteja.

n-butanoli:pyridiini:etikkahappo:vesi; 30:15:3:12

Rf : etyyliasetaatti:pyriduni:etikkahappo:vesi; 5:5:1:3 r 3 R^ : etyyliasetaatti:n-butanoli:etikkahappo:vesi; 1:1:1:1.

Elektroforeesi suoritettiin 100 /ug:n näytteellä Whatman 3 mm:n paperilla (11,5 x 56,5 cm) käyttäen pH 5,6 pyridiini-ase-taatti-puskuriliuosta ja 1 000 V jännitettä yhden tunnin ajan.

Suihkereagenssit sekä ohutlevykromatografiaa että elektroforeesia varten olivat Pauly-reagenssi ja ninhydriini.

1 2

Saatiin seuraavat tulokset: R- = liikkumaton, Rf = luk- 3 . . - kumaton ja = 0,336. Elektroforeesi antoi 9,4 cm:n kulkeutumi sen katodia kohti.

Esimerkit II-IV

Käyttäen edellä kuvattuja reaktiomenetelmiä substituoitujen polypeptidien valmistamiseksi valmistetaan polypeptidejä, joilla on seuraava kaava: R-X-LYS-Y-GLN-R' Nämä peptidi-ainidit valmistettiin bentshydryyliamiini-hartsilla alalla tunnetulla kiintofaasi-synteesimenetelmällä.

Esimerkki numero R X Y R ’ II H SAR D-ALA NH2 I IA H SAR SAR NH2 III H D-ALA D-ALA NH2 IIIA H D-ALA SAR NH2 IV H SAR 2-Me-ALA NH2

IVA H SAR SAR OH

Tunnistamista varten suoritettiin ohutlevykromatografia ja elektroforeesi seuraavasti.

20 6 7 3 6 8

Ohutlevykromatografia tehtiin 2 0 yug:n näytteillä piihappo-geelillä (Kieselgel, 5 x 20 cm) käyttäen eluenttina n-butanoli: etikkahappo:etyyliasetaatti:vettä suhteessa 1:1:1:1 (R^) ja selluloosalla 6064 (Eastman, 20 x 20 cm) käyttäen eluenttina n-butanoli: . 2 pyridiim:etikkahappo:vettä suhteessa 15:10:3:12 (R^ ).

Elektroforeesi tehtiin 50 |Ug:n näytteillä Whatman paperilla n:o 3 (5,7 x 55 cm) käyttäen pH 5,6 pyridiini-asetaatti-puskuri-liuosta ja 1000 V jännitettä yhden tunnin ajan. Yhdisteet liikkuvat kohti katodia.

Suihkereagenssit sekä ohutlevykromatografiaa että elektroforeesia varten olivat Pauly-reagenssi ja ninhydriini.

Saatiin seuraavat tulokset (sekä R^-arvot että elektroforeesi on suhteessa H-ARG-LYS-ASP-VAL-TYR-OH:hon): ^ . 12 esimerkki R^ Elektroforeesi liikkuminen puhtaus II 0,44 0,68 2,07 98% IIA 0,88 0,60 1,78 98 % III 0,56 0,71 2,10 98 %

Noudattaen esimerkissä I kuvattua ohutlevykromatografia-ja elektroforeesimenetelmää, saatiin seuraavat tulokset esimerkin IV yhdisteelle: = (0,155), Rf2 = liikkumaton, R^3 = 0,265 ja elektroforeesiliike katodia kohti on 13,1 cm.

Esimerkit V-VI

Käyttäen edellä kuvattuja reaktiomenetelmiä polypeptidi-ketjun pidentämiseksi valmistettiin seuraavat kaavan mukaiset pclypeptidit: K-ALA-LYS-SER-GLN-Rf

Esimerkin R R' numero

V GLN OH

VI SAR OH

Esimerkeissä V ja VI valmistetut polypeptidi-johdannaiset säilyttivät hyvin biologisen aktiivisuutensa.

Noudattaen esimerkin I ohutlevykromatografia- ja elektro-foreesimenetelmää, esimerkkien V ja VI yhdisteille saatiin seuraavat tuloksen: 21 67368 1 2 3

Esimerkki R^. Elektoroforeesi- liikkuminen köliti katodia V liikkumaton liikkumaton 0,303 7,4 cm VI liikkumaton liikkumaton 0,18 6 8 , 3 cm

Claims (1)

1. 22 Patenttivaatimus 6 7 3 6 8 Menetelmä terapeuttisesti käyttökelpoisen polypeptidin valmistamiseksi, jonka kaava on R-X-LYS-Y-GLN-R' I jossa R' on OH tai NH^, X on sarkosyyli, L-alanyyli tai D-ala-nyyli, Y on seryyli, sarkosyyli, 2-metyylialanyyli tai D-alanyyli, ja R on H, GLN tai SAR, tunnettu siitä, että L-gluta-miini, jonka aminoryhmä on suojattu, esteröidään kovalenttisella sidoksella liukenemattomaan hartsipolymeeriin, L-glutamiiniryhmäs-tä poistetaan 06-aminosuo jaryhmä, Y-aminohappo, jonka ^-aminoryhmä on suojattu, saatetaan reagoimaan L-glutamiini-hartsin kanssa Y-aminohapporyhmän liittämiseksi siihen, Y-aminohapporyhmästä poistetaan o^-aminosuo jaryhmä , L-lysiini, jonka v>0-amino ryhmä on suojattu, saatetaan reagoimaan Y-aminohappo-L-glutamiini-hartsin kanssa L-lysiinin liittämiseksi siihen, L-lysiiniryhmästä poistetaan -ami-nosuo jaryhmä, N-R-substituoitu-X-aminohappo , jonka <*.-aminoryhmä on suojattu, saatetaan reagoimaan L-lysiini-Y-aminohappo-L-glutamiini-hartsin kanssa N-R-substituoidun-X-aminohapon liittämiseksi siihen, hartsi lohkaistaan peptidistä hapolla tai ammoniakilla, ja kaikki suojaryhmät poistetaan, jolloin saadaan kaavan I mukainen yhdiste, jossa R' on OH tai NH2, jolloin kun käytetään bentshydryyliamiini-hartsipolymeeria, R' on NH^ riippumatta siitä, mitä lohkaisuainet-ta käytetään. Il