CN104450626B

CN104450626B - 抗chMDA5蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用

Info

Publication number: CN104450626B
Application number: CN201410697397.4A
Authority: CN
Inventors: 张瑞莉; 葛铭; 王成成; 李广兴; 刘超男; 栾亚男; 赵霞
Original assignee: Northeast Agricultural University
Current assignee: Northeast Agricultural University
Priority date: 2014-11-26
Filing date: 2014-11-26
Publication date: 2017-02-22
Anticipated expiration: 2034-11-26
Also published as: CN104450626A

Abstract

本发明公开了抗chMDA5蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用。本发明采用原核表达系统，用大肠杆菌表达的chMDA5蛋白作为免疫原，免疫小鼠，经细胞融合，筛选得到多株稳定分泌抗chMDA5蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其中，杂交瘤细胞株AE8F3所分泌的单克隆抗体的效价最高、特异性最强，其微生物保藏号为CGMCC NO.9597。本发明杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体能与鸡体内MDA5蛋白发生特异性反应，能应用于检测chMDA5蛋白或IBDV感染，还可将其作为实验工具研究chMDA5蛋白在鸡组织细胞的分布定位、表达变化以及在IBDV感染过程中的作用等方面。

Description

抗chMDA5蛋白单克隆抗体及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及杂交瘤细胞株及由其分泌的单克隆抗体，尤其涉及抗chMDA5蛋白单克隆抗体以及分泌该单克隆抗体的杂交瘤细胞株，本发明进一步涉及该单克隆抗体在检测鸡黑色素瘤分化相关基因5(chicken melanoma differentiation associated gene 5,chMDA5)蛋白或传染性法氏囊病病毒(infection bursal disease virus，IBDV)感染以及将其作为实验工具研究chMDA5蛋白在鸡组织细胞的分布定位、表达变化以及在IBDV感染过程中的作用等方面的应用，属于模式识别受体MDA5蛋白的检测领域。

背景技术

机体的天然免疫系统在抵抗病毒感染方面发挥着重要作用。病毒感染宿主细胞后，宿主细胞可以通过模式识别受体(pattern recognition receptors，PRR)识别病原相关分子模式(pathogen associated molecule patterns，PAMP)，从而区别病原生物与机体自身(AKIRA S,UEMATSU S,TAKEUCHIA O.Pathogen recognition and innate immunity[J].Cell,2006,124(4):783-801.)。RIG-I样受体(RIG-I like receptors,RLRs)是一类新发现的能够特异性识别细胞质中病毒dsRNA的模式识别受体，黑色素瘤分化相关基因5(melanoma differentiation associated gene 5,MDA5)是RLRs家族成员之一，属于DExD/H box RNA解旋酶，可表达于病毒感染的各种细胞。MDA5含有两个天冬酰胺富集域样的结构域(CARD-like结构域)，能够识别进入胞质中的dsRNA，通过衔接蛋白分子即IFN-β启动子激活因子1(IFN-β-promoter stimulator 1,IPS1)启动特异性的信号通路，激活促炎症因子基因和I型干扰素基因(NF-κB和IRF₃)，诱导干扰素和促炎症细胞因子的产生(KATO H,TAKEUCHI O,STOA S,et al.Differential roles of MDA5and RIG-I helicases in therecognition of RNA viruses[J].Nature,2006,441(7089):101-105.TAKEUCHI O,AKIRAS.MDA5/RIG-I and virus recognition[J].Curr Opin Immunol,2008,20(1):17-22.)。最新研究发现，在鸡细胞内是MDA5活化介导IFN-β的合成分泌而发挥抗病毒作用(LERINIG M,SUMMERFIELD A,ZIMMER G,et al.Chicken cells sense influenza A virus infectionthrough MDA5and CARDIF signaling involving LGP2[J].J Virol,2012,86(2):705-717.)。然而，模式识别受体表达是一把双刃剑，一方面可以通过诱导先天性和获得性免疫反应抑制病毒复制并最终清除病毒感染，另一方面又可以诱导组织细胞损伤，促进病毒的扩散。

鸡传染性法氏囊病(infection bursal disease，IBD)是由双链RNA病毒科禽双链RNA病毒属法氏囊炎病毒(infection bursal disease virus，IBDV)引起的一种鸡的急性高度接触性免疫抑制传染病。IBDV主要侵害2-15周龄鸡，在感染雏鸡法氏囊B淋巴细胞内迅速复制，导致以淋巴细胞衰竭坏死为主要特征的严重的免疫抑制,引起免疫失败和增加对其他细菌病和病毒病的易感性，从而造成巨大的经济损失(Rodríguez-Lecompte JC,R,Lopez A,et al.Infectious bursal disease virus(IBDV)inducesapoptosis in chicken B cells[J].Comp Immunol Microbiol Infect Dis,2005,28(4):321-337.)。研究已证实，相对较长的dsRNA(>1kb)可被MDA5选择性识别(KATO H,TAKEUCHIO,et al.Length-dependent recognition of double-stranded ribonucleic acids byretinoic acid-inducible gene-I and melanoma differentiation-associated gene 5[J].J Exp Med,2008,205(7):1601-1610.)。IBDV基因序列全长A段为3.2～3.4kb，B段为2.4kb(PETKOV D,LINNEMANN E,KAPCZYNSKI D R,et al.Full-length sequence analysisof four IBDV strains with different pathogenicities[J].Virus Genes,2007,34(3):315-326.)，Lee等最新体外研究发现，DF-1细胞内MDA5能够识别IBDV(LEE C C,WU CC,LIN T L.Chicken melanoma differentiation-associated gene 5(MDA5)recognizesinfectious bursal disease virus infection and triggers MDA5-related innateimmunity[J].Arch Virol,2014,159(7):1671-86.)。那么，导致雏鸡免疫抑制的免疫损伤是否与MDA5对IBDV特异性识别及其信号转导通路激活而导致促炎症因子过度分泌有关？迄今为止，尚无准确的定论。可见，研究鸡MDA5(chicken melanoma differentiationassociated gene 5，chMDA5)在IBDV感染雏鸡体内的表达变化，对进一步阐明IBDV致病机制具有重要意义。

示踪chMDA5表达和研究其功能的前提是制备效价高、特异性强的单克隆抗体。然而，迄今为止还未有关于抗chMDA5蛋白单克隆抗体研究的报道，更无效价高、特异性强的抗chMDA5蛋白单克隆抗体成功获取的报道。

发明内容

本发明的目的之一是提供一株稳定、高效分泌抗chMDA5蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株；

本发明的目的之二是提供由该杂交瘤细胞株所分泌的效价高、特异性强的抗chMDA5蛋白单克隆抗体；

本发明的目的之三是将所述的抗chMDA5蛋白单克隆抗体应用于检测chMDA5蛋白或IBDV感染、作为实验工具研究chMDA5蛋白在鸡组织细胞的分布定位、表达变化以及在IBDV感染过程中的作用等方面。

本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

本发明采用原核表达系统，用大肠杆菌表达的chMDA5蛋白作为免疫原，免疫小鼠，经细胞融合，筛选得到四株稳定分泌抗chMDA5蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，分别命名为AE8F3、AE8F5、BE12A4和BE12B5。本发明采用间接ELISA法检测四株分泌抗chMDA5蛋白的阳性杂交瘤细胞株的培养上清，测定这四株阳性杂交瘤细胞株的效价，从效价测定结果来看，阳性杂交瘤细胞株AE8F3所分泌的单克隆抗体诱导小鼠产生的腹水效价为1：25600，细胞上清的效价达到1:1024；另外三株杂交瘤细胞株AE8F5、BE12A4和BE12B5分泌的单克隆抗体诱导小鼠产生的腹水效价分别为1:3200、1:6400和1:6400；从效价测定结果来看，阳性杂交瘤细胞株AE8F3所分泌的单克隆抗体诱导小鼠产生的腹水效价要显著高于其它3株阳性杂交瘤细胞株的分泌的单克隆抗体诱导小鼠产生的腹水效价。

本发明进一步将四株阳性杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体分别与原核重组蛋白pET30a-chMDA5进行Western blot检测；试验结果发现，阳性杂交瘤细胞株AE8F3分泌的单抗能够特异性识别重组pET30a-chMDA5蛋白，而与空载体无反应性，而其它三株阳性杂交瘤细胞株所分泌的单克隆抗体与重组pET30a-chMDA5蛋白反应条带不单一或与空载体存在反应，特异性较差；Western blot检测结果说明阳性杂交瘤细胞株AE8F3分泌的单克隆抗体的特异性最强。

鉴于杂交瘤细胞株AE8F3所分泌的抗chMDA5蛋白单克隆抗体效价最高、特异性最好，本发明将该杂交瘤细胞株AE8F3提交专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号为：CGMCC NO.9597；分类命名为：杂交瘤细胞株；保藏单位：中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心；保藏时间是2014年9月9日：保藏地址：中国北京朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。

经检测，由杂交瘤细胞株AE8F3所分泌的单克隆抗体AE8F3，其重链为IgG1，轻链为κ链。

Western blot、体外瞬时转染及IFA检测结果表明，由杂交瘤细胞株AE8F3所分泌的单克隆抗体效价最高，特异性最强；免疫活性试验结果表明，本发明制备的单克隆抗体能够检测到传染性法氏囊病病毒(infection bursal disease virus，IBDV)感染雏鸡外周血液淋巴细胞内chMDA5蛋白的存在及含量变化，具有良好的免疫活性。

本发明提供的抗chMDA5蛋白单克隆抗体具有良好的特异性，可制备成检测或诊断chMDA5的诊断试剂或者是制备成诊断IBDV感染的检测试剂盒；还可作为实验工具研究chMDA5蛋白在鸡组织细胞的分布定位、表达变化以及在病毒感染过程中的作用等方面，为示踪chMDA5蛋白表达及其在IBDV感染乃至病毒感染过程中的作用奠定了重要的物质基础。

附图说明

图1杂交瘤细胞株AE8F3株所分泌的单克隆抗体亚类鉴定结果。

图2应用Western blot分析杂交瘤细胞株AE8F3株分泌的单克隆抗体与重组pET30a-chMDA5蛋白的反应性结果；M：预染蛋白质分子量；1：AE8F3；2：pET-30a空载体。

图3应用Western blot分析杂交瘤细胞株AE8F5、BE12A4、BE12B5株分泌的单克隆抗体与重组pET30a-chMDA5蛋白的反应性结果；1:AE8F5，3:BE12A4；5:BE12B5；M:预染蛋白mark；2，4，6：pET-30a空载体。

图4应用体外瞬时转染及间接免疫荧光试验检测杂交瘤细胞株AE8F3株分泌的单克隆抗体与重组pVAX-chMDA5蛋白的反应性；A：抗chMDA5单抗检测重组质粒pVAX-chMDA5体外转染；B：细胞对照；C：空载体对照。

图5应用Western blot检测IBDV感染雏鸡外周血液淋巴细胞chMDA5蛋白表达的动态变化。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

1.生物材料和试剂

1.1细胞及实验动物

SP2/0细胞由本发明人实验室保存；8周龄实验用雌性BALB/c小鼠购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所实验动物中心。

1.2主要试剂

标准胎牛血清、培养基DMEM购于Gibco公司；弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、选择性培养基HAT和HT、细胞融合用PEG(MW1450)购于Sigma公司；单克隆抗体亚类鉴定试剂盒购自Southern Biotechnology公司；辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠IgG购自金桥生物技术有限公司进口分装产品。

实验例1抗chMDA5蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

1、实验方法

1.1免疫原的准备

根据GenBank上公布的chMDA5(NM_001193638.1)基因序列，应用DNAStar软件对chMDA5全长序列进行分析，并对其表达的蛋白进行预测，根据蛋白质的二级结构(主要是β转角)、亲水性、可及性、柔韧性及抗原性，选取抗原性较好的基因片段(1409-3070bp)，设计特异性引物，克隆出大小为1682bp chMDA5部分基因片段(SEQ ID No.1)，并成功构建重组原核质粒pET30a-chMDA5，转化Rosseta大肠杆菌后，在IPTG诱导下表达出大小约为72KD的重组蛋白，以纯化过的蛋白作为抗原免疫小鼠。

1.2动物免疫

取纯化后的重组蛋白与等体积的弗氏完全佐剂乳化，经腹腔接种8周龄BALB/c小鼠，100μg/只。以后每间隔两周将免疫原与等体积的弗氏不完全佐剂乳化进行免疫。共免疫3次。在3免后第7～10d，尾部静脉采血测抗体效价，当抗体效价达到1:10000以上时，用不加佐剂的抗原100μg/只于腹腔加强免疫，3d后取小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合。

1.3间接ELISA方法的建立

取9～10周龄健康BALB/c小鼠，与免疫小鼠在相同条件下饲养，作为阴性对照小鼠。融合前分别将免疫小鼠和对照小鼠摘除眼球放血，5000r/min离心10min分离血清，-20℃保存备用。以纯化的重组蛋白作为包被抗原，设置矩阵建立间接ELISA检测方法，通过酶标仪读取D₄₉₀值。取阳性孔D₄₉₀接近1.0、P/N值最大的抗原、抗体稀释度作为二者的最佳工作浓度。1.4细胞融合、杂交瘤细胞的筛选及亚型鉴定

将免疫鼠的脾细胞与SP2/0用PEG 3350进行融合，用建立的间接ELISA方法进行筛选。经4次亚克隆后，选择D₄₉₀值最高且能稳定分泌抗体的细胞扩大培养。每次亚克隆前都要及时进行细胞冻存。采用单克隆抗体亚类鉴定试剂盒进行亚型鉴定。

1.5单克隆抗体腹水的制备

选取8～10周龄健康雌性BALB/c小鼠，腹腔注射高压蒸气灭菌矿物油0.5mL/只，7～14d后接种2×10⁵～1×10⁶个/只杂交瘤细胞。约7～10d后收集腹水。间接ELISA方法测定杂交瘤细胞上清和腹水效价，SP2/0细胞培养上清和SP2/0腹水作为阴性对照，以P/N≥2.1的最高稀释倍数为单克隆抗体的效价，采用辛酸-饱和硫酸铵沉淀法对腹水进行纯化。

1.6单克隆抗体特性鉴定

1.6.1单克隆抗体特异性分析

采用Western blot分析单克隆抗体与重组pET30a-chMDA5蛋白的反应活性。体外瞬时转染及间接免疫荧光分析单克隆抗体与重组pVAX-chMDA5蛋白的反应活性。

1.6.2单克隆抗体免疫活性检测

将40只SPF雏鸡随机分为感染组和对照组，每组20只。其中，感染组雏鸡于14日龄经点眼、滴鼻方式给予IBDV(购自中国兽医药品监察所)液，0.6mL/只，对照组雏鸡于相同日龄、相同途径给予相同剂量PBS。两组雏鸡分别严格隔离饲养。在感染IBDV后第1、4、7、21天，每组随机抽取5只雏鸡，心脏采血，经抗凝处理后按照淋巴细胞分层液说明书分离淋巴细胞。离心、去上清后，在细胞沉淀中加入细胞裂解液，再用细胞超声仪破碎细胞1s，4℃、12000r/min离心5min，取上清，用增强型BCA蛋白质浓度测定试剂盒测定蛋白质量浓度，再加入5×上样缓冲液，煮沸后离心进行SDS-PAGE电泳。电泳后将蛋白转印至硝酸纤维素膜上，以50g/L脱脂乳室温封闭2h后加入一抗，4℃过夜，TBST洗涤3次后加入TBST 1:800稀释的山羊抗鼠IgG-HRP二抗，室温作用1h，以TBST洗涤后，用Western blot超敏发光试剂盒显影。

2实验结果

2.1间接ELISA方法的建立

以纯化的重组pET30a-chMDA5蛋白为检测抗原，通过矩阵法确定抗原的最佳浓度为1μg/mL，阴阳性血清的最佳稀释度均为1:64000，作用时间1h。HRP标记抗鼠IgG最佳稀释度为1：5000，作用时间为45min。

2.2杂交瘤细胞株的建立及亚类鉴定

经过4次细胞克隆，最终获得四株能够稳定分泌抗chMDA5蛋白的杂交瘤细胞株，分别命名为AE8F3、AE8F5、BE12A4和BE12B5。

抗体亚类试剂盒鉴定结果显示：AE8F3重链为IgG1，轻链为κ链(图1)。2.3单克隆抗体腹水的制备及效价测定

采用间接ELISA方法测定AE8F3腹水效价为1：25600，明显高于杂交瘤细胞上清液的效价1:1024；另外三株杂交瘤细胞株AE8F5、BE12A4和BE12B5株分泌的单克隆抗体诱导小鼠产生的腹水效价分别为1:3200、1:6400和1:6400，从效价测定结果来看，阳性杂交瘤细胞株AE8F3所分泌的单克隆抗体诱导小鼠产生的腹水效价要显著高于其它三株阳性杂交瘤细胞株的分泌的单克隆抗体诱导小鼠产生的腹水效价。

采用辛酸-饱和硫酸铵沉淀法对AE8F3腹水进行纯化，纯化后浓度为9mg/mL。

2.4单克隆抗体特性鉴定

2.4.1特异性分析

Western blot分析结果显示，AE8F3分泌的单克隆抗体能够特异性识别重组pET30a-chMDA5蛋白，而与pET30a空载体无反应性(图2)；AE8F5、BE12A4和BE12B5株分泌的单克隆抗体不能特异性识别重组pET30a-chMDA5蛋白，特异性较差(图3)。

重组质粒pVAX-chMDA5经体外瞬时转染至BHK-21细胞后采用间接免疫荧光技术检测到BHK细胞内可见特异性的绿色荧光信号，且主要分布在胞浆，转染pVAX空载体、未转染质粒的BHK-21细胞均未见明显的荧光信号(图4)，表明该单克隆抗体AE8F3具有良好的特异性。

2.4.2免疫活性分析

Western blot方法检测IBDV感染雏鸡外周血液淋巴细胞chMDA5蛋白表达的动态变化，结果显示本发明单克隆抗体能够特异性识别雏鸡外周血液淋巴细胞chMDA5蛋白，并能够检测到雏鸡体内chMDA5蛋白在IBDV感染后4d表达量最高，以后逐渐下降；而未感染IBDV对照雏鸡外周血液淋巴细胞chMDA5蛋白随着日龄的增长表达逐渐减少(图5)，提示IBDV感染可激活chMDA5表达。

上述检测结果表明，本发明制备的单克隆抗体能够识别雏鸡体内天然chMDA5蛋白，可用于雏鸡chMDA5蛋白表达及IBDV感染检测。

Claims

1.一株稳定、高效分泌抗鸡黑色素瘤分化相关基因5(chicken melanomadifferentiation associated gene 5,chMDA5)蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，其微生物保藏号为：CGMCC NO.9597。

2.由权利要求1所述杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体。

3.权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测或诊断chMDA5蛋白的试剂及药物中的用途。

4.权利要求2所述的单克隆抗体在制备检测或诊断IBDV感染的试剂及药物中的用途。

5.一种诊断或检测chMDA5蛋白的试剂盒，其特征在于：含有权利要求2所述的单克隆抗体。

6.一种诊断或检测IBDV感染的试剂盒，其特征在于：含有权利要求2所述的单克隆抗体。