CN1049523A

CN1049523A - 大肠杆菌疫苗

Info

Publication number: CN1049523A
Application number: CN90107108A
Authority: CN
Inventors: 约翰·富朗西斯科·凡·单·博石
Original assignee: Akzo N
Current assignee: Akzo Nobel NV; Intervet International BV
Priority date: 1989-08-18
Filing date: 1990-08-18
Publication date: 1991-02-27
Anticipated expiration: 2005-08-18
Also published as: HUT59612A; HU210965B; JPH03184996A; DE69016129D1; TW204353B; IL95175A; EP0413378A1; ZA906100B; KR910004209A; CA2022420A1; AU6109990A; CN1062605C; NZ234933A; GR3015782T3; JP3031561B2; EP0413378B1; KR0177510B1; HU905053D0; AU635062B2; CA2022420C

Abstract

本发明发现一种新颖E·Coli毒素或一种免疫原片段，该毒素或片段能用于制备温血动物，尤其是鸟类的疫苗。所说毒素存在于粘附在细菌上的鞭毛结构中，这些鞭毛或游离毒素在失活后，能用于免疫动物，使之免受E·Coli感染。

Description

本发明涉及一种保护个体免受大肠杆菌（E.Coli）感染的疫苗，在该疫苗中使用的一种毒素以及该毒素纯化的方法。

大肠杆菌（E.Coli）是一种普遍存在的细菌，它们群集于大多数动物的消化道。通常，这种菌的繁殖不会产生严重的反作用，在大多数情况下，该细菌起着对寄主有利的作用。但是，大肠杆菌（E.Coli）偶尔也引起严重的疾病，尤其是在年幼动物。这种情况在鸟类和商业上进行的家禽繁殖中也会出现。感染后引起传染病，导致严重的弱质病或年幼鸟类的大批死亡。

自然，已经尝试过用接种方法控制E.Coli感染家禽。为实现这个目的，已用菌苗（失活的大肠杆菌）接种成年鸡（Avian Disease 29（4），1108-17（1985））。菌苗的缺点是伴随有严重副作用。再者，菌苗接种后开始时产生抗脂多糖的抗体，该抗体仅对E.Coli O血清型有特异性，因而不能保护个体免受其它血清型的E.Coli的感染。

另外，常使用以E.Coli菌的繖毛为基础的疫苗抵抗该菌的感染。但是，这些疫苗仅产生有限的保护作用，受保护的个体数不超过接种个体的80%，基于这个原因，大肠杆菌疫苗常包含另外一种毒性因子成份：失活的E.Coli毒素。

许多种类的E.Coli含有对菌体游动起作用的鞭毛，以前由于没有认识到E.Coli的鞭毛可作为一种毒性因子，因而没有用于E.Coli疫苗中。

根据本发明，业已发现大肠杆菌鞭毛与对Vero细胞的极强毒性有关（这种相关性至今没有被认识），且这些鞭毛蛋白毒素是一个重要的毒性因子。

基于上述发现，已制备出源于E.Coli鞭毛的疫苗。根据本发明所述，可利用E.Coli的完整鞭毛，也可以是所说鞭毛的亚结构单位，如鞭毛蛋白或鞭毛蛋白片段或集合体，它们能保护接种个体免受E.Coli感染。

在用大量E.Coli菌株进行的实验中（这些菌株主要是从鸡也包括从其它动物和人体中分离到的），发现鞭毛与对Vero细胞的毒性有关。这种毒性能被该鞭毛的抗体中和。经进一步证明发现，用于研究的所有E.Coli菌株的鞭毛毒性可被一种菌株的鞭毛的单一抗血清所中和。

基于这一发现，期望能用来自于单一E.Coli菌株的鞭毛接种个体而使之免受所有具有鞭毛的E.Coli菌株的感染。

基于上述考虑，本发明所述的疫苗是以在E.Coli中发现的一类新毒素为基础的，其特征是它们具有蛋白质的性质，且存在于鞭毛中和/或与鞭毛相关联，由SDS-PAGE测得的分子量在30～100KD之间，没有结合糖残基，对Vero细胞和一日龄小鸡有毒，在100℃加热1小时仍保持毒性。

兼有上述特性使这些新毒素和本领域内已知的E.Coli毒素相区别。

在大量E.Coli菌株中存在有上述的毒素，由于该毒素明显地存在于鞭毛结构中，本文将此命名为鞭毛毒素（FT）。一般情况，这些鞭毛比正常繖毛（典型繖毛直径为7nm，最长长度为1μm）大得多，最大可达25nm粗，7μm长。

根据实施例1概述的步骤，本发明所述的毒素种类之一是从小鸡E.Coli CH7（015∶K14∶H10）菌株中分离到的。分离出的CH7-FT以几种形式存在：可以是H10型的天然鞭毛，或是游离毒素，或由游离的毒素重新结合成的针状细丝。除前面介绍的一般特性外，CH7-FT的典型特性是由SDS-PAGE测得的亚单位的分子量约47KD，等电点PH值约为4.8，NH₂-末端的部分氨基酸序列：Ala-Gln-Val-Ile-Asn-Thr-Asn-Ser-Leu-Ser-Leu-（？）-Thr-Gln。（CH7-FT的特性见实施例2的描述）。

抗CH7-FT的抗血清与用于试验的所有其它E.Coli菌株的FT发生交叉反应（见实施例3），因此，CH7-FT的抗血清能用于对本发明所述的所有其它FT进行定性。再者，制备的单克隆抗体或者是特异性的或者与试验用的所有其它E.Coli菌株的FT发生交叉反应。

本发明也包括具抗E.Coli感染的免疫活性的疫苗，该疫苗的活性成分是一种本发明所述的失活的毒素。

该疾苗适当地含有所说的毒性鞭毛，通过在有利于鞭毛形成的条件下培养E.Coli细菌，从细菌中分离出鞭毛或不含细胞的上清液可很容易地获得这种鞭毛;然后利用超过滤和/或分子筛色谱法除去上清液中低分子量成分进一步纯化FT。

在纯化过程中，利用FT与CH7-FT的单克隆抗体的反应性监测富含FT的部分。

本发明所述疫苗还包括能保护接种个体免受E.Coli感染的FT的一个片段。

根据本发明，疫苗中掺入的FT可通过化学合成，从E.Coli细胞培养物中纯化或通过重组DNA技术得到。

在后一种情况，例如可通过用诱导出的抗FT的多克隆或单克隆抗体进行特异性反应，筛选E.Coli基因组DNA文库中含有所说核酸序列的各个克隆而识别出编码上述蛋白质或其片段的核酸序列。将该核酸序列连接到能进行各种表达的DNA序列上，产生一个能转化到合适寄主的所谓的重组核酸分子。这样的杂交DNA分子来自于，例如：质粒、噬菌体或病毒核酸序列。寄主细胞可以是原核细胞，如细菌，也可以是真核细胞如哺乳动物细胞。转化后的寄主细胞能产生FT，分离该蛋白质，随后将它掺入本发明的疫苗中。

在另一个实施例中，制备的一种活载体疫苗，含有非病原性微生物，如：含有编码FT基因的病毒或细菌。

除了FT，本发明疫苗还可含有一种水介质或一种水悬液和/或如：为提高活性和/或延长活性成分寿命而加入的其它成分。这些成分可以是盐，以及使FT毒性失活而保持免疫特性的试剂（如：福尔马林），PH缓冲液，乳化剂和增强免疫应答的佐剂（如矿物油，胞壁酰双肽，氢氧化铝，皂苷、聚阴离子和两亲物质）。

本发明疫苗用于免疫温血动物（包括人），免受E..Coli感染，尤其是用于鸟类抗E.Coli感染。

为达到上述目的，优选方法是将该疫苗通过非肠胃方法施用于个体，如通过皮下或肌肉。以这种方式施用疫苗，使接种后的鸟类获得主动免疫，对下蛋的鸟类接种后，可使后代获得被动免疫能力。对下蛋鸟类免疫后，它的体内产生的抗体理所当然地引入到鸟蛋蛋黄中，随后，进入孵化出的小鸟中。

疫苗组成和接种系统可根据需要保护的动物类型、动物的年龄和体重，需要保护的时期，用药方式，以及期望产生主动免疫或借助母体的抗体产生被动免疫这些情况而变化。用于家禽非肠胃接种时，疫苗活性成分的最适有效量大约是10-100μg/剂量。本发明疫苗也可以和其他适当的疫苗结合使用。

实施例1

E.ColiCH7菌株鞭毛毒素的分离

A.鞭毛毒素的制备

E.Coli CH7（015∶K14∶H10）菌株在装有12升含有14%PO₂的胰蛋白酶豆汤（B.B.L）的BiostatE发酵器（Braun）中以100-500rpm变速搅拌培养一夜，在带有HVLP滤器的Pellicon滤器系统（Millipore）中将培养物浓缩至约1升，将细菌以10，000rpm（GSA转头，Sorvall）离心30分钟，得到的上清液通过0.45μm滤器过滤后，加到HVLP滤液中。

将滤液浓缩至大约1升并利用PTTK滤器，用1升0.2mol/升TrisHCl缓冲液洗浓缩物3次。

将大约110-160ml的部分PTTK浓缩物通过高度为10Cm，面积为154cm²（Amicon model P140×250），用含有0.1%NaN₃作为保存剂，PH＝7.2的50mmol/升磷酸缓冲液（PB）平衡过的Sepharose 4B-Cl柱（Pharmacia，Uppsala Sweden）后，反复洗脱。柱子用PB洗脱至记录仪上的基线为零。

收集含有高分子量分子的第一峰的洗脱物，然后在YM-100超过滤器（φ62mm Amicon，With Amicon UF model 202）上浓缩到蛋白质浓度约为2-3mg/ml，浓缩物在含有0.1%NaN₃作为保存剂的5升20mmol/升PH7.5的Tris.Hcl缓冲液中透析两次。

B：游离毒素的制备

利用Laemmli的方法（Nature 227，680-4;1970）将浓缩物进行制备电泳。将浓缩物在含有20ml甘油，20ml Tris-HCl缓冲液（0.5mol/l，PH6.8），20ml 10%SDS，5ml 2-巯基乙醇（ME）和2ml0.05%溴酚蓝的样品缓冲液中以1∶1.67稀释。

然后，在水中将样品煮沸5分钟，冷却，在16×0.6cm的12%（Acr∶bis＝30∶0.8）制备聚丙烯酰胺平板胶上电泳。典型的样品负载量大约是15-23mg蛋白质/胶（7.5ml浓缩物和5.0ml样品缓冲液）。在Protean细胞模型1423（Bio-Rad，Richmond USA）或模型SE600（Hoefer，San Francisco，USA）上进行电泳。当前沿物质从凝胶中走出后，继续在220V进行电泳1小时。从胶上切下宽约1.5-2mm的薄片。

在室温下用10ml 0.89%Nacl溶液+0.1%NaN₃浸提蛋白质3小时，在4℃连续搅拌过夜。取出薄片，将溶液通过一个0.45μ的滤器过滤。收集含有纯毒素亚单位的部分，贮存于-20℃。

用改良Folin-Ciocalteu分析方法（J.Biol.Chem.73，627;1927），测定样品中蛋白质含量，根据Dubois利用的苯酚硫酸酯分析方法（Anal.Chem.28，350-6，1956）测定多糖量。

实施例2

E.Coli CH7菌株的毒素的特性

A.对一日龄小鸡的致死率

第一个实验是用0.2-0.5ml各种E.coli毒素制剂给一日龄SPF的小鸡（GVP，Doorn）进行腹膜内注射。第二个实验，将0.5ml毒素制剂静脉内注射到3周龄小鸡体内。注射后7天记录死亡数。

结果

如表1所示，来自于鸡E.Coli菌株CH₂和CH7的毒素制剂通过腹膜内注射后能使一日龄小鸡死亡对于CH7菌株，不论是它的上清液或胞溶物都有毒，而对于CH2菌株，胞溶物尤其有毒性。

表1

一日龄小鸡的致死率：腹膜注射E.Coli菌株的上清液或胞溶物

^＊菌株CH2和CH7是从鸡中分离出的E.Coli菌株;

菌株ZF24是来自人粪的无毒E.Coli分离株。

用同样试剂静脉注射3周龄小鸡完全没有作用（数据未列出）。

B.Vero试验

在5%CO₂气体和补充有5%胎牛血清（FCS）和200μ/ml青霉素和200μg/ml链霉素，过滤除菌后再补充2μg/ml两性霉素B的基质6（每升含有85mlMEM Eagle，100ml胰蛋白

磷酸盐肉汤，50ml4.4%NaHCO₃）中37℃培养Vero细胞，胰蛋白酶作用后，以在每孔中加入200μl含有2×10⁵个细胞/升的完全培养基6，而将细胞接种于96孔的平底聚苯乙烯培养平板（Greiner）。培养一夜后形成单层细胞。移走培养基，加入200μl/孔不含FCS但补充了10μg/ml黄嘌呤（3-异丁基-1-甲基-黄嘌呤，Sigma）的培养基6。随后，每孔中加入20μl系列稀释毒素制剂。培养5天后记录细胞病理学作用（CPE）。

筛选产毒菌株的试验，首先在每孔中加入20μl未稀释或稀释了1∶2的上清液。其次，对于在Vero试验中上清液显示阴性的菌株，将该菌株的50μl未稀释或1∶2稀释的溶菌物加入每孔中，测定这些菌株产生的细胞内毒素。

结果：

首先将列于表2的菌株进行产毒试验。其中一些菌株分泌毒素于上清液中，其他菌株产生细胞内毒素和/或具有用超声波破碎细胞后才能检测到的毒素。对Vero细胞的细胞病理学影响的测定值是近似的，且有不同程度的波动。但在大多数情况下，细胞单层仍保持完整。

表2

不同E.Coli菌株对Vero细胞的毒性

^＊JA221是一个E.Coli K-12菌株;ZF24见表1;CH菌株是鸡中分离出的菌株。

^＊＊毒素效价定义为：具毒性作用的最后稀释度的倒数值。

C.毒素的稳定性

通过测定毒素制剂对各种处理的敏感度，对已识别的毒素进行初步定性。pH敏感度试验是将毒素PH值调至3-10，在室温下培养一夜后中和，然后进行毒性试验。

对热敏感性试验，是将毒素制剂在各种温度下加热进行的。SDS和ME对毒素的影响的测定是分别在1%SDS和1%SDS+2.5%ME存在时加热毒素，然后在盐水中透析。对ureum（尿素）敏感性的试验，是将6M ureum加入到毒素制剂中1小时后，在盐水中透析。

对福尔马林的敏感度试验是将不同浓度的福尔马林加到毒素制剂中，在不同温度培养一夜，透析，用Vero细胞分析试验进行毒性测定。胰蛋白酶敏感度试验是加入100μg/ml胰蛋白酶（来自牛胰，Millipore），在37℃培养4小时，然后加入150μg/ml胰蛋白酶抑制剂（黄豆，Sigma）在37℃抑制30分钟，再进行毒性试验。

结果：

在对Vero细胞的毒性试验中，由于不同龄的Vero细胞的状况不同，不能重复地测得精确的鸡毒素效价。这里列出的结果仅证明典型实验的情况。

将CH5和CH7的上清液PH值调至3到10（包括10）时毒性不受影响，毒素效价是不变的值分别是32-64和128-256。

对热敏感性和对SDS或SDS+ME处理的敏感性显示在表3中。

在长时间置于较高温度下，CH2胞溶物（Lys）和CH5以及CH7上清液（Sup）的毒性稍有下降，在120℃加热后，毒性完全消失，但仍认为该毒素具相对热稳定性。在SDS或SDS+ME存在时，加热10分钟对CH5和CH7上清液的毒性没有影响。

用6M ureum处理后CH2胞溶物和CH5、CH7上清液对各个的VT效价丝毫没有影响。

如表4所示，在室温和37℃时加入福尔马林能使CH7上清液毒性消失。

用胰蛋白酶处理后，CH5和CH7上清液毒性完全消失，假处理和单独用胰蛋白酶抑制剂处理后，对毒性没有丝毫影响。

D：分子量测定

利用Laemmli的方法在12%凝胶（Acr：Bis 30：0.8）进行分析凝胶电冰后，与标准分子量相比，决定CH7菌株毒素的分子量。

用考马斯亮兰（CBB）染色凝胶，利用凝胶扫描器CS-930型和DR-2记录仪（Shimadzu，Kyoto Japan）进行扫描。

图1表示，载有分子量标记物的凝胶电冰后，用考马斯亮兰染色后的扫描图。与1-6个峰相应的标准分子量分别是78000，66000，45000，30000，17200和12300dal（LKB1860-12 Bromma，Sweden）。

图2和图3分别表示从实施例1的步骤A和步骤B得到的产品的扫描图。

在这些实验中测得的E.ColiCH7菌株的毒素亚单位的分子量约为47KD。

E.等电点测定

毒素等电点的测定是将从实施例1步骤A得到的3ml E.ColiCH7菌株毒素与PH3-7的0.5ml Servalytes（分析纯级，Hei delberg Germany）和46.5ml水的混合物在12W振动5小时（Rotofor，Bio-Rad Richmond USA）进行等电聚焦。分析凝胶电泳结果测定毒素含量。

该实验结果概括于表5中

从实验结果可知，E.ColiCH7菌株的毒素的等电点pH值为4.8。

结果：

F.糖含量

从实施例1步骤B得到的E.ColiCH7菌株的毒素既不含多糖也没有用Dubois等的苯酚硫酸酯分析（Analytical Chemistry 28，350-356;1956）测得的糖存在。在LimulusAmoebocyte（鲎变形细胞）溶解物试验（Pyrotell，MA，USA）中没有检测到有效的LPS（内毒素）活性。

G：氨基酸分析

利用Chang的液相DABITC方法（Methods Enzymology 91，455-466;1983）测定N-末端氨基酸序列。利用薄层层析法识别DABTH-氨基酸。用Janssen等人描述的PTC技术（Chromatographia 22，345-358;1986）测定氨基酸组成，假定亚单位分子量为47KD的CH7-FT相对应的氨基酸总数为446个。

结果：

从实施例1步骤A和步骤B得到的E.ColiCH7菌株的毒素的N末端氨基酸序列如下：

Ala-Gln-Val-Ile-Asn-Thr-Asn-Ser-Leu-Ser-Leu-（？）-Thr-Gln

该序列与Kuwajima等（Journal of Bacteriology 168，1479-1483;1986）描述的E.Coli K-12鞭毛蛋白的N末端氨基酸序列相同。

表6显示毒素的氨基酸组成，也表示与E.Coli K-12鞭毛蛋白具有很大程度的同源性。

表6

CH7-FT氨基酸组成的测定和与E.Coli K-12鞭毛蛋白的氨基酸组成的比较：每个亚单位的氨基酸数目（%）

^KPTC方法测定（Chromatographia 22，345-358;1986）

²DNA序列分析法测定（Journal of Bocteriology 168 1479-1483;1986）

实施例3

筛选FT表达型鸡E.Coli菌株和FT血清学特征

检测来自于世界各地的总计为124个鸡E.Coli分离菌的毒性、游动性和细菌表面FT抗原的表达，用多克隆和单克隆抗体显现FT且研究交叉反应。

方法：

毒性试验和毒素中和作用

如实施例2B描述的方法，测定各菌株对Vero细胞的毒性。中和作用试验，是将毒素制剂与稀释后的抗血清在37℃一起培养2小时，然后进行毒性试验。

游动性试验：

在含有低琼脂浓度（0.25%）的营养肉汤的U形试管中测定菌株的游动性。在这些U形管一端接种一个E.Coli菌株，37℃培养一夜后，记录菌株向试管另一端的迁移情况。

抗血清的制备

根据实施例1A描述的方法，在兔和鸡中制备抗E.ColiCH7菌株的FT的抗血清。用按实施例1B中描述的方法制得的CH5和CH7菌株毒素生产单克隆抗体（MoAb）。在制备MoAb时，将来自于免疫鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，用ELISA方法，从得到的杂交瘤中分离出抗毒素抗体分泌物。将克隆后的杂交瘤由腹膜内注射到鼠体，取出腹水液，在56℃加热10分钟使腹水失活后，用1，1，2-三氯三氟乙烷（Merck）萃取脂类，用50%饱和度的硫酸铵沉淀MoAbs。

E.Coli菌株的FT抗原表达

在室温下用无毒E.Coli RDEC-1（O15：K14）菌株吸附CH7菌株（O15：K14：H10）FT的兔抗血清24小时，根据下面进行的完整细菌ELISA方法，用这些吸附的抗血清筛选表达FT的菌株。

将细菌在TSB中不搅拌培养6小时，然后3000rpm离心15分钟（Sorvall RT6000）再悬浮于CBB缓冲液（1.59g/l Na₂CO₃，2.93g/l NaHCO₃;0.2g/l NaN₃，pH9.6），达到在660nm处OD值为0.140-0.180。将该细菌悬液以每孔100μl的浓度接种于平底聚苯乙烯微滴平板，在50℃干燥一夜。用自来水冲洗平板，在室温下，在每孔中加入100μlPBS-T-N（0.04M PBS;PH7.2;0.5%Tween80;15%新生牛的血清）阻遏1小时。随后，每孔中加入100μl系列稀释的吸附过的血清（在PBS-T-N中稀释，起始稀释度为1：100），每个菌株设置加入PBS-T-N的2个孔作为空白对照。37℃培养1小时后，洗涤平板，每孔中加入100μl在PBS-T-N中适当稀释的过氧化物酶结合的羊抗兔IgG（H+L），37℃培养30分钟后，再次洗涤平板。所结合的抗体通过在每孔中加入100μl含有脲过氧化氢（Ureum Peroxide）（Organon Teknika，Oss）和溶于NaAc-柠檬酸缓冲液（PH5.5）的3，3′，5，5′-四甲基联苯胺的TMB底物缓冲液，然后用比色法测定。在黑暗中放置10分钟进行显色反应，加入50μl4N H₂SO₄中止反应，用Microelisa读数器在450nm处测定，测得的最高稀释度为抗血清的效价，此时A450值至少是空白A450的2倍。

在每一个试验中，CH7和RDEC-1菌株分别作为阳性和阴性对照。

Western吸印试验

基本上按照Muilerman等（Anal.Biochem.120，46-51;1982）描述的方法，进行免疫吸印和Western吸印试验。将细菌在胰蛋白酶豆汤中搅拌培养6小时，制备菌体的FT粗制品。在充分混合后，离心移走菌体，通过乙醇测定法将上清液浓缩约40倍（1份上清液+2份96%乙醇，4℃培养过夜，离心后，将沉淀溶于0.04mol/升PBS，PH7.2），得到的FT粗制品进行SDS-PAGE，转吸到硝酸纤维滤膜上，通过与抗体，过氧化物酶结合的适当种类的抗IgG（H+L）以及脲过氧化氢和3，3′-二氨基联苯胺.4HCl一起连续培养后，检测抗原。

Immunogold-电子显微术（IG-EN）

基本上按照Alphen等（Infect.Immun.56，1800-6;1988）描述的方法进行IG-EM试验，简单地说，在胰蛋白酶豆汤中生长的细菌与在PBS+1%BSA+0.05%Tween20（PBS-B-T）稀释的抗体一起培养，用PBS洗三次，然后与用金颗粒标记的蛋白质A一起在PBS-B-T中培养，用PBS再洗三次后，将细菌转移到聚乙烯醇缩甲醛树脂包裹的网格中，用1%乙酸双氧铀或磷钨酸进行负染色。

结果：

从世界各地收集的124个鸡E.Coli菌株中，73个菌株（占59%）能分泌对Vero细胞有毒性的可检测量的毒素活性成分。另有37个菌株（占30%）在细菌细胞溶解后对Vero细胞有毒。在完整细菌ELISA试验中，52个菌株（占42%）与CH7-FT的抗血清反应，在ELISA试验中显示阳性的所有菌株也产生胞外Vero毒素（表7）。

在Vero毒素的分泌和菌株游动性之间具强烈相关性（见表8）。

上述结果进一步证明Vero毒性存在于鞭毛中，也发现细菌经过U形管迁移后提高了Vero毒性。上述结果也表明不同菌株的毒素具血清学交叉反应。

进一步研究不同菌株毒素的交叉反应。表9中显示菌株CH7的FT兔和鸡抗血清能中和试验的所有其它有毒菌株的Vero毒性。抗菌株CH5和CH7FT的MoAbs丝毫不中和该毒性。

表10显示FT粗制品与不同抗血清的Western吸印试验结果。CH7-FT的兔和鸡抗血清（分别是K07577和BB1-2）与所有试验中其余FT制剂反应，虽然这些菌株的谱带分子量不同。利用抗H10鞭毛凝集抗血清能得到同样结果。CH5-FT的MoAb Int12-13在Western吸印反应中也显示相同型式。CH7-FT的MoAb Int1-7仅与47KD的CH7-FT谱带反应。显然，与各种具H型鞭毛菌株相应的鞭毛蛋白的分子量几乎与各自的FTs的表观分子量相一致。许多带H10型鞭毛的菌株，来自于RIVM（Bilthoven），在用多克隆抗血清进行的Western吸印试验中显示有45KD或47KD的谱带。MoAb Int1-7仅与H10型鞭毛菌株的47KD谱带反应。当将菌株先经过U形管迁移，再制备的FT粗制品，用于Western吸印试验中能提高出现的谱带强度。

在IG-EM试验中，利用CH7-FT的多克隆抗血清，将CH5和CH7菌株的类鞭毛丝状体用金颗粒标记。用CH7-FT的MoAb Int1-7进行的同样试验中，只有CH7菌株的类鞭毛丝状体能用金颗粒标记，而不能标记CH5菌株的此类鞭毛。利用实施例1B描述的制备SDS-PAGE制备CH5-FT的MoAb Int12-13进行IG-ME试验时，不能有效地标记类鞭毛丝状体，仅在CH5和CH7菌株细胞表面能观察到这样的金颗粒。事实上，MoAb Int12-13仅与离解的FT反应（Western吸印试验，ELISA）而不与完整FT反应（IG-EM，ELISA）。

所有这些结果表明Vero毒性存在于鞭毛中，或者FT与鞭毛完全相同。再者，不同菌株的FTs具有血清学上的高度交叉反应性和交叉中和作用。

实施例4

通过被动免疫对小鸡的保护作用

用按实施例1A描述的方法制得的CH7-FT接种小鸡制备CH7-FT的抗血清。收集来自于不同鸡的抗血清，在56℃加热10分钟使之失活。

用1ml上述CH7-FT抗血清静脉注射三周龄小鸡（Euribrid，Boxmeer，The Netherlands）。在抗血清注入小鸡后1小时内，将0.2ml细菌悬液注射入右后胸气囊中使鸡感染。细菌在血琼脂基质平板（Oxoid）上培养一夜后，悬浮于PBS中，稀释至适当的浓度。实验所用的E.Coli菌株全是从患有大肠杆菌病的鸡的感染心脏中分离到的。用同样剂量的细菌感染作为对照的鸡，该对照用的鸡没有施用抗血清或仅注射阴性对照血清，在鸡中注入抗原激发（免疫应答）后，将它们安置于有一般食物和水的减压隔离器中。接种后7天，记录死亡率。

如表11所示，由CH7-FT抗血清给鸡带来的被动免疫作用能有效地保护鸡免受由5个试验的E.Coli菌株中的3个菌株进行的免疫激发。三个菌株对鸡的感染由于抗血清的有效保护作用而受阻，该三个菌株中的2个菌株在培养上清液中分泌毒性，一个菌株对Vero细胞的毒性仅在于细菌溶胞物中。也可看到二个菌株对鸡的感染不能被抗血清有效地保护，这两菌株的毒性都只存在于细菌溶胞物中。显然，抗血清仅对游动菌株的感染能提供有效保护。

Claims

1、保护个体免受E·Co1i感染的疫苗，其特征在于它来源于E·Co1i的鞭毛。

2、根据权利要求1所说的疫苗，其特征在于其中的鞭毛具有抗Vero细胞毒性。

3、具有抗E.Coli感染温血动物的免疫活性的毒素，其特征在于：

a）由一条单一多肽链组成;

b）用SDS-PAGE测得的分子量为30-100KD;

c）以丝状集合体形式存在和/或与之有关;

d）天然状态不与糖残基结合;

e）对Vero细胞和一日龄小鸡具毒性;

f）在100℃加热1小时仍保持毒性，

或者是该毒素的片段。

4、根据权利要求3所说的毒素，可通过下列方法从E.Coli血清型H₁₀菌株中得到

a.在胰蛋白酶豆汤中培养所说的细菌;

b.用截止值为30KD的滤器浓缩培养物的不含细胞上清液;

c.用20mmol/升Tris.HCl缓冲液冲洗滤器上面的物质;

d.将上述洗过的物质在一个Sepharose4B柱子上分离;

e.收集高分子量洗脱物;

f.将上述洗脱物在预制的凝胶上进行SDS-PAGE，或是该毒素的片段。

5、保护个体免受大肠杆菌感染的疫苗，其特征在于它来源于权利要求3-5所说的毒素。

6、保护个体免受大肠杆菌感染的疫苗，其特征在于它含有一个转化的微生物，该转化体能表达一个编码权利要求3-5的毒素的DNA序列;或是该毒素的片段。

7、纯化权利要求3的毒素的方法，其特征在于利用如超过滤，离心和/或分子筛色谱法除去上清液中低分子量成分，而纯化出与CH7菌株毒素的抗体具反应性的E.Coli的不含细胞的洗脱物，通过它与所说抗体的反应性选出含有毒素的部分。