CN1060498A - 能够在沙门氏疫苗菌株表面表达酸免疫疟疾抗原的重组表达载体 - Google Patents

能够在沙门氏疫苗菌株表面表达酸免疫疟疾抗原的重组表达载体 Download PDF

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Abstract

本发明叙述了能够在可诱导哺乳动物体液免疫 应答的革兰氏阴性菌表面表达疟疾抗原HRPII或 SERP或其一部分的重组表达载体。另外也叙述了 相应的沙门氏菌疫苗。

Description

本发明涉及新的重组表达载体，它能够在沙门氏疫苗菌株表面表达疟疾抗原HRPⅡ或SERP的致免疫肽。本发明还涉及含有该沙门氏菌并在通过口服接种后诱导哺乳动物体液免疫应答的疫苗。
疟疾抗原HRPⅡ和SEPR已在下列文献中进行过特征鉴定：EP-A2  0  315  085，Wellems  and  Howard，Proc.Natl，Acad.Sci.USA  83（1986），6065-6069，Knapp等人，Behring  Res.Commun.82（1988），349-359，EP-A1  0  283  882，Knapp等人，Mol.Biochem.Paras.32（1989），73-84，以及Higgins等人，Nature  340（1989），604。虽然部分上述文献也公开过含有该抗原或其免疫活性部分的疫苗，但仍然需要提供一种适于诱发具有保护作用且可靠的体液免疫反应以对付引起疟疾的原生动物如恶性疟原虫（P.falciparum）的改良疫苗。
在DE-A38  28  666和EP-A0357208中公开了可作为活疫苗应用的被转化的细菌菌株。Hackett，Vaccine  8（1990），5-11总结了有关沙门氏菌疫苗领域的现有技术状况。
构成本发明的技术问题是提供遗传工程生产的沙门氏菌株，它适于在口服后通过诱导高水平的体液免疫应答而产生对疟疾的保护性和可靠的预防作用。
以上技术问题是通过提供权利要求书中所定义的实施方案而得以解决的。
因此，本发明提供了包括以下成分的重组表达载体：
（a）一个强诱导启动子;
（b）一个编码革兰氏阴性细菌杂化的OmpA蛋白的杂化基因;
（c）一个定位于OmpA基因中相应在OmpA蛋白的第三外环的克隆位点;和
（d）一个DNA序列，即
（da）被整体插入克隆位点（c），
（db）编码能够在哺乳动物中诱发体液免疫应答的疟疾抗原HRPⅡ或SERP或其一部分，该疟疾抗原最好得自恶性疟原虫。
术语“强诱导启动子”是指在转录水平上对位于其下游的序列所编码的蛋白质的表达具有高效控制作用的一个核苷酸序列，它可通过温度转移或加入化学物质（如IPTG）而被诱发。该强诱导启动子的一个优选实例是受控于lac阻遏物的tac启动子。
术语“克隆位点”是指含有限制性内切酶切割位点、适于整合所需DNA片段的一个DNA序列。
术语“在哺乳动物中能够诱导体液免疫应答反应的疟疾抗原HRPⅡ或SERP的一部分”是指对生产疫苗有用的HRPⅡ或SERP的区域。这种区域本领域熟练技术人员按照传统方法可确定，例如应用传统的计算机程序（可通过实验证实T-细胞抗原决定基）。对于SERP，这种区域最好是与SH蛋白酶同源的区域，或含有T-细胞抗原决定基。在本文中术语“SH蛋白酶”是指在其活性部位带有必需的半胱氨酸残基的蛋白酶。术语“T-细胞抗原决定基”是指刺激由T-淋巴细胞介导的细胞免疫应答的一个氨基酸序列。
由本发明的重组表达型载体编码的融合蛋白在表达后被转运至细菌细胞壁，并按使疟疾抗原HRPⅡ或SERP或其所说部分出现于外部环境的方式插入到细胞壁中。该表现方式通过使暴露于该转化细菌宿主的哺乳动物免疫系统识别该疟疾抗原并产物保护性免疫应答而发挥作用。该疟疾抗原最好以与其天然形式相似的构象存在于本发明的转化细菌宿主的表面。
在本发明的一优选实施方案中，重组表达型载体还包括：
（ca）被插入到所说克隆位点（c）的一个编码流感血凝素（HA）蛋白1-48氨基酸和279-515氨基酸的DNA序列，在编码HA蛋白的第46个氨基酸处含有第一克隆位点，在编码HA蛋白的第400氨基酸处含有第二克隆位点，其中该DNA序列（d）被插入到DNA序列（ca）的至少一个所说的克隆位点。
在本发明的一个更优选实施方案中，所说的部分HRPⅡ由存在于重组表达载体pOmpA-6中的189个氨基酸组成，该载体的限制性内切酶的酶切图谱示于图1。
在本发明的另一优选实施方案中，重组表达型载体编码由177个氨基酸组成的HRPⅡ的部分，它存在于具有图1所示限制性酶切图谱的重组表达型载体pOmpA-3中。
在本发明重组表达型载体的另一优选实施方案中，所说的SERP的部分含有一个与SH蛋白酶同源的区域。
在一最佳实施方案中，与SH蛋白酶有同源区域含有SERP的442-892、573-595或745-787位氨基酸。
在本发明重组表达型载体的一更优选实施方案中，所说的SERP的部分含有至少两个T-细胞抗原决定基。
在其最佳实施方案中，含有T-细胞抗原决定基的该部分含有SERP的442-892或640-700位氨基酸。
本发明重组表达载体的更优选实施方案已在权利要求书中进行了描述。
本发明也涉及用本发明任一重组表达型载体所转化的沙门氏疫苗菌菌株。
在一优选实施方案中，该沙门氏疫苗菌得自伤塞沙门氏菌或鼠伤塞沙门氏菌，在本文中已经明确：鼠伤塞沙门氏菌对小鼠的感染性最强，且其在小鼠中的接种性质在现有技术中常常被用作伤塞沙门氏菌及其在人体中接种性质的模型系统。
编码疟疾HRPⅡ抗原189个氨基酸和疟疾SERP抗原451个氨基酸的核苷酸序列是与表达载体的多聚连接子克隆在一起，该表达型载体含有通过重组DNA技术从革兰氏阴性细菌E.coli和痢疾志贺氏菌OmpA基因获得的杂化OmpA基因。用这些重组载体转化鼠伤塞疫苗菌并诱导表达后将使该疟疾抗原或其部分在转化细菌表面表达。用本发明被转化的鼠伤塞沙门氏疫苗菌口服接种小鼠将导致显著的抗相应疟疾抗原的体液免疫应答。
在另一实施方案中，本发明涉及由本发明任一沙门氏疫苗菌所表达并能够在哺乳动物中诱导体液免疫应答的重组融合蛋白。
本发明还涉及含有本发明沙门氏疫苗菌株或本发明重组融合蛋白的预防疟疾疫苗。本发明疫苗中的这些免疫活性化合物通常与可药用载体和/或稀释剂结合服用。
在一优选实施方案中本发明的疫苗是通过口服应用。因此，本发明的疫苗最好以不被胃酸破坏而能保护免疫活性成分的形式提供。
本发明再一方面是涉及预防疟疾的方法，包括给需要治疗的哺乳动物服用需要剂量的本发明沙门氏疫苗菌株或重组融合蛋白，该剂量适于诱导保护性体液免疫应答。
图表表示：
表1：
（A）质粒pHS164-L的多聚连接子区。起始质粒pHS164的序列用小字母表示。在ClaI和StuI位点间插入一寡核苷酸后形成pHS164-L。
（B）质粒pinf4-49HA编码区中的连接子Ⅰ和连接子Ⅱ。
图1：本发明OmpA融合质粒的结构。它显示了OmpA、HA、HRPⅡ和SERP融合基因的编码区和大小。标出了相关的限制性酶切位点，尤其是基因融合连接处的切点。
图2：小鼠的抗体应答。通过口服鼠伤塞沙门氏菌SR-11菌株后在其表面表达的HRPⅡ和SERP  Omp融合蛋白而被免疫。小鼠口服免疫0、7、14、21天（箭头所示）。于第0、14、28和56天采集血样保存，通过ELISA测定HRPⅡ和SERP特异性抗体的存在。为了Ig定型，使用与抗IgG（A）和抗IgM（B）特异性POD结合的山羊抗血清。星号＝pOmpA-3;圆圈＝pOmpA-6;三角＝pOmpA-5;实心圆＝pOmpA-7。滴度指试验血清的A492与免疫前血清的A492之比大于2.0时试验血液的最高稀释度。
表2：583bp  HRPⅡ  cDNA片段的核苷酸序列和由它所产生的氨基酸序列（大写字母）。载体pUC8的序列用小写字母表示。用于构建pOmpA-3的代表Bal  31消化液5′端的C核苷酸用星号标明。其中还显示了与载体pOmpA-3和pOmpA-6的构建有关的限制性酶切位点。在pOmpA-6的构建中用于PCR反应的寡核苷酸对应于划线的序列。
表3：完整SERP基因的核苷酸序列及由其产生的氨基酸序列。
括弧中表示了通过KpnI和PstI消化（构建pOmpA-5）分离或通过PCR扩增（扩增片段用于构建pOmpA-7）的1.3kb  DNA片段。圆点表示潜在的糖基化位点。箭头表示内含子。划线区代表重复成分。
以下实施例进一步说明本发明。应用重组DNA技术方面的其它情况请看Sambrook等人，“Molecular  Clioing”，Cold  Spring  Harbour  Laboratory，Cold  Spring  Har-bour，2nd  edition，1989。
实施例1
携带编码HRPⅡ和SERP基因片段的OmpA载体的构建
OmpA表达载体pHS164和pinf4-49已被S.Pistor和G.Hobom（S.Pistor和G.Hobom，Klin.Wochenschr.66（1988），110-116，DE-A38  28  666）构建。pHS164编码由大肠杆菌OmpA蛋白的1-46位氨基酸和痢疾志贺氏菌OmpA蛋白的47-233位氨基酸组成的杂化OmpA蛋白。为了提供更多的克隆位点，将携带ClaI、NsiI、NdeI、SalI、NcoI、KpnI、SmaI和Stul特定限制性酶切位点的多聚连接子序列5′-ATCGATGCATATGTCGACCCATGGTACCCGGGGAGGCCT-3′插入到pHS164的特定ClaI和StuI位点之间，产生pHS164-L（表1a）。所有必需的克隆步骤均在大肠杆菌K12A490（recA、lac、met、thr、rk-、mk-）中完成。按常规方法（Sam-brook等，出处同前）分离质粒DNA、制备DNA片段、连接并转化大肠杆菌细胞。按照双脱氧终止法使用USB方案（Cleveland，Ohio）完成双链DNA上的核苷酸序列分析。由pHS164-L编码的OmpA蛋白在其第三外环上携带有9个附加氨基酸。来自OmpA蛋白的与翻译阅该框架相配的外源DNA插入到多聚连接子中后导致其在OmpA的第三外环中表达。质粒pinf4-49编码在OmpA的第三外环处的类茎（stem-like）结构，它由流感HA蛋白的1-48位和279-514位氨基酸组成的疏水片段形成。两个克隆位点的位置是：连接子Ⅰ位于与HA基因的46密码子相应的位置，连接子Ⅱ位于与HA基因的400密码子相对应的位置（Tap.16，DE-A38 28 666）。在两个连接子之间克隆DNA片段是为了改善表达抗原的暴露。
在OmpA载体中，OmpA基因的转录受tac-启动子控制，其活性被lac-阻遏物控制。lacIQ等位基因本身存在于载体之上，因此lac-阻遏物将顺式提供，而不管细菌菌株的实际遗传背景。
利用载体pHS164和pinf4-49构建了四个表达型质粒（图1）：
pOmpA-3：来自翻译终止密码子缺失的携带0.55kb的小的SmaI-XhoI-cDNA片段（表2）的pSK-HRPⅡ用SmaI和XhoI消化。分离该片段并将其克隆至pinf4-49的相应位点。更具体地说，是进行以下步骤：
1.用HindⅢ消化pUC8-HRPⅡ。
2.按照Sambrood等人的方法（出处同前）用Bal31进行消化。
3.用Klenow酶进行填充反应（fill-inreaction）。
4.用T4DNA多聚酶进行填充反应。
5.用EcoRI消化，导致插入子的释放.
6.凝胶电泳DNA片段，并分离DNA片段，它比插入子DNA短30-80bp。
7.用HindⅡ和EcoRI消化Bluescript  psk（+）载体DNA。
8.将Bal  31片段连接至HindⅡ/EcoRⅠ消化的psk（+）中。
9.用重组载体转化XL1蓝细胞。
10.用XhoI和EcoRI对DNA小剂量（minipreps）进行分析。
11.对来自20个不同克隆的小剂量（miniprep）DNA进行序列分析：没有一个DNA片段与载体pinf4-49nXhoI位点框架一致。
其中一个克隆在HRPⅡ的3′克隆位点具有以下序列：
Figure 911087281_IMG1
该构建物的XhoI位点与pinf4-49载体中的XhoI位点不在同一框架中。通过这一克隆步骤产生一个新的HpaⅡ限制性切点。
12.用KpnI和EcoRI消化该克隆的DNA。
13.分离插入子DNA。
14.用HpaⅡ限制性消化插入子DNA。
15.通过凝胶电泳分离600bp  EcoRI-HpaⅡ片段。
16.将插入子连接至用AccI和EcoRI消化的pSK（+）中。
以下流程概括了缺失HpaⅡ位点的5′c末端的设想：
a）用HpaⅡ消化重组载体
Figure 911087281_IMG2
b）用AccI消化载体pSK（+）
Figure 911087281_IMG3
c）将HRPⅡ的600bp  EcoRI  HpaⅡ片段连接至用AccI和EcoRI消化的pSK（+）中。
Figure 911087281_IMG4
缺失HPRⅡ位点中的碱基C导致新的重组载体的产生，其中pSK-HRPⅡ质粒的XhoI位点现在则与载体pinf4-49中的XhoI位点位于同一框架中。
17.通过序列分析构成新序列（缺失HRPⅡ3′末端的碱基c）
18.用SmaI和XhoI进行限制性消化，并分离600bp片段。
19.将该600bp片段克隆至用SmaI和XhoI消化的pinf4-49中，产生新的重组载体pOmpA-3。
pOmpA-5：用KpnI和PstI消化携带有5.8kb  XbaI片段上的完整SERP基因的pUC18-SERP（Knapp等人，Mol.Biochem，Para  sitol，32（1989），73-84）。分离出1.3kb的片段，并将其连接至psk载体的相应位点（Stratagene）。将SERP片段亚克隆至pSK以在SERP编码区3′末端产生正确的翻译阅读框架。所产生的质粒pSK-SERP用SmaI和KpnI消化，分离1.3kb的片段，并克隆至pHS164-L的相应位点。
pOmpA-6：将寡核苷酸序列（1∶5′-CGACCTGCAGGAACATGTAGCCGATGCCC-3′和2∶5′-GCAGAGTTATTAAATAAATTTGGTACCATGGCGTAGGCAATGTGTGGCGGCTTC-3′）与质粒pUC8-HRPⅡ（Knapp等，Behring  Res.Commun.82（1988）349-359）一起使用，以按照公开方法（Saiki等，Science  230（1988），1350-1354）通过PCR扩增0.6kb片段（表2）。将该片段克隆至用PstI和KpnI消化后的pHS164-L载体的NsiI和KpnI位点。
pOmpA-7：将两个寡脱氧核苷酸（1∶5′-AAGGGAACAAAATCTAGAGGTACCTTAGATAATTATGGG-3′和2∶5′-CTAGTGGATCCCGTCGACTGCAGATTCTAATGCAGTATTGCT-3′）与pSK-SERP一起用于PCR。所产生的1.3kb（表3）片段用XbaI和SalI消化，并克隆至pinf4-49的这些位点之间的框架中。
所产生的质粒pOmpA-3和pOmpA-6分别编码HRPⅡ抗原的177和189个氨基酸，pOmpA-5和pOmpA-7均编码SERP抗原的451个氨基酸。在pOmpA-5和pOmpA-6中，SERP和HRPⅡ部分序列分别被插入到OmpA的第三外环中，而在pOmpA-3和pOmpA-7中这些抗原则被OmpA第三外环中的HA疏水部分另外“夹心”。
构建重组载体之后，通过DNA序列分析发现：疟疾特异性片段分别位于OmpA和HA编码序列的框架中。根据双脱氧链终止法使用USB（Cleveland，Ohio）的方案完成双链DNA的核苷酸序列分析。使用在MicrovaxⅡ上完成的UWGCG序列软件（Devereaux等人，Nucl.Acids  Res.12（1984），387-395）分析序列数据并制作质粒图谱。表4分别列出了这些质粒，并详细介绍了OmpA融合蛋白的性质以及预期的和通过SDS-PAGE观察到的分子量。
实施例2
HRPⅡ和SERP  OmpA融合蛋白被有效地表达并暴露在鼠伤塞沙门氏菌表面。
使用BioRad  Gene  Pulser，通过电击穿用大肠杆菌的OmpA表达型质粒转化携带质粒pY248（鼠伤寒沙门氏菌株phi4072（py248））的鼠伤塞沙门氏菌phi3730（LT2-Z，leu，hsdLT，galE，trpD2，rpsL120，delta asdAl，delta[zhf-4：：Tn10]，met E551，metA22，hsdsA，hsdSB，ilv）和SR-11（pstsR100，gyrA1816，delta cya-1，delta crp-1，delta asdAl，delta[delta[zja-4：：Tn10]）（Nakajama等人，Biotechnology 6（1988），693-697）：用限制性缺失的易修饰（modification-proficient）的鼠伤塞沙门氏菌phi3730修饰pHS164-L和pinf4-49、OmpA-3、-5、-6和-7，并在再分离质粒后，将它们转化至熟练限制（restrictior-profi-cient），熟练修饰（modification-pro-ficient）的鼠伤塞沙门氏菌phi4072（py 248）：在预冷的小玻璃管中将1μgDNA与约2.5×108个细胞混合，并在约10KV/cm的电场强度中电击穿9毫秒。电击穿混合物稀释至1mlSOC培养基（0.5%Bacto醇母浸膏、2%Bacto胰酶解胨、10mMNaCl、2.5mMKCl、10mMMgCl2、10mMMgSO4、20mM葡萄糖）中，并于37℃振荡培养1小时。将等份试样放至缺乏二氨基庚二酸（DAP）的LB-AMP中并于37℃培养。转化株（ASD+/AMPr）含有两种质粒：存在于质粒pV248中的ASD标记物以及表4所示四个OmpA表达型质粒之一。转化效率为1×104/μg质粒DNA（大肠杆菌菌株490A的对照转化产生1×108/μg质粒DAN）。
将单个转化菌落在5ml  LB/AMP培养基中于37℃培养过夜。然后将100μg该培养物稀释到上述培养基的5ml中，并且细胞生长至OD600为0.5-0.6。通过加入1mM  IPTG诱导表达，并将培养物再培养3小时。离心收集细胞，按所述方法（Amann等，Gene69（1988），301-305）进行裂解。通过SDS-PAGE分析最终沉淀。对被表达型质粒转化的沙门氏菌培养物的膜成分所作的SDS-PAGE分析揭示和证实了IPTG诱导后具有预期分子量的新蛋白质带的存在。这些蛋白质仅存在于膜部分，占全部细胞蛋白质的10-15%。
分别使用抗OmpA的14C-末端氨基酸（作为半抗原与KLH偶联）的抗血清或使用单特异性抗SERP或抗-HRPⅡ免抗血清对同一样品进行Western印迹分析后证明了表达产物的同一性。除主带外，还观察到部分降解成分。
使用免疫荧光技术研究鼠伤塞沙门氏菌的菌表面是否存在HRPⅡ和SERP抗原。为此，离心200μl被诱导的细菌培养物。用300μlPBS洗涤细菌两次并悬浮于100μlPBS。以1/50的稀释度加入抗HRPⅡ或抗-SERP抗血清，于4℃将混合物过夜培养。离心收集细胞，按前述方法洗涤后悬浮于100μlPBS中。以1/50的稀释度加入取自山羊的FITC-标记的抗免IgG，并于黑暗条件下将该混合物于室温下培养2小时。再次收集细胞，按前述方法洗涤后再悬浮于50μlPBS中。吸取10μl该样品至显微镜盖玻片上，于37℃干燥。用蒸馏水仔细洗涤盖玻片，再次干燥，并用Moriol固定。于zeiss显微镜中于紫外光（300nm）下观察细菌并将材料拍照，其照片显示出被抗HRPⅡ抗血清探测的携带OmpA-3细胞的免疫荧光。当用相应的抗血清探测时携带OmpA-5、-6和-7的重组细菌显示出各个细胞的相似免疫荧光强度和相似的免疫荧光阳性细胞数（约90%）。当对携带载体质粒pHs164-L或pinf4-49的细胞或当表达作为包含体存在于细胞内的HRPⅡ或SERP抗原的大肠杆菌细胞进行测试时未观察到荧光。这些研究说明了疟疾抗原在被转化的鼠伤塞沙门氏菌表面有效表达。
实施例3
用重组沙门氏菌进行口服免疫后在小鼠中诱导抗-HRPⅡ和抗SERP抗体
为了研究重组沙门氏菌SR-11菌株对抗在细菌表面表达的HRPⅡ和SERP抗原的体液免疫应答的诱导能力，分别于第0、7、14和21天给NMRⅠ小鼠口服被IPTG所诱导的携带质粒OmpA-3、-5、-6或-7的细菌的约2×10g细胞。口服之前将小鼠饥饿5小时。在用细菌喂养之前给小鼠口服0.1ml碳酸氢钠（5%）以中和胃pH值。于0、14、28和56天从眶后吸取100μl血样，测定贮存血清中HRPⅡ和SERP特异性IgG和IgM的存在（图2）：将纯化的重组大肠杆菌产生的SERP或HRPⅡ-MS2融合蛋白（5μg/ml，Knapp等人（1988），出处同前;Knapp等，（1989），出处同前）涂布的ELISA平板于室温下过夜培养，然后洗涤。为了血清滴定，将系列稀释的血清样品加到ELISA平板上，并于37℃培养1小时，洗涤三次后于37℃与50μlPOD连接的抗鼠抗体一起培养1小时。洗涤之后用50μl邻苯二胺/H2O2溶液观测结合抗体。测定492nm处的光密度。
抗HRPⅡ的IgG应答比抗SERP的IgG应答快（图2a）。毗邻HRPⅡ和SERP抗原（存在于被pOmpA-3和pOmpA-7表达的相应融合蛋白中）的HA疏水部分并未导致增高的IgG滴度。抗HRPⅡ和抗SERP的IgM应答未显示出明显差别，并且在14天后开始下降（图2b）。对用重组沙门氏菌口服免疫后获得的抗-HRPⅡ和抗-SERP小鼠血清的恶性疟原虫多肽进行的Western印迹分析显示出相应的抗原。
这一实验说明：用在其表面表达疟疾抗原的沙门氏疫苗菌口服接种小鼠后诱导出特异性血清IgG抗体。
表1
表2
Figure 911087281_IMG6
表3
Figure 911087281_IMG7
Figure 911087281_IMG8

Claims (17)

1、一种制备包括以下成分在内的重组表达型载体的方法：
(a)强诱导启动子；
(b)编码革兰氏阴性细菌杂化OmpA蛋白的杂化基因；
(c)位于OmpA基因中相对于Ompa蛋白第三外环部分的克隆位点；
它是通过将编码能够在哺乳动物中诱导体液免疫应答的疟疾抗原HRPⅡ或SERP或其一部分的DNA序列(d)插入到克隆位点(c)，所说的疟疾抗原最好得自恶性疟原虫。
2、如权利要求1所述的制备重组表达型载体的方法，它另外将编码流感血凝素（HA）蛋白1-48位和279-515位氨基酸的DNA序列（e）插入到所说的克隆位点（c），该DNA序列（e）在编码HA蛋白的46位氨基酸处含有第一个克隆位点，在编码HA蛋白的400位氨基酸处含有第二个克隆位点，其中所说的DNA序列（d）被插入到DNA序列（e）的至少一个所说克隆位点。
3、如权利要求1或2所述的制备重组表达型载体的方法，其中所说的HRPⅡ的部分由存在于具有表1所示限制性图谱的重组表达载体pOmpA-6中的189个氨基酸组成。
4、如权利要求1或2所述的制备重组表达型载体的方法，其中所说的HRPⅡ的一部分由存在于具有表1所示限制性图谱的重组表达载体pOmpA-3中的177个氨基酸组成。
5、如权利要求1或2所述的制备重组表达型载体的方法，其中所说的SERP的一部分含有与SH蛋白酶同源的区域。
6、如权利要求5所述的制备重组表达型载体的方法，它含有SERP的氨基酸442-892、573-595或745-787。
7、如权利要求1或2所述的制备重组表达型载体的方法，其中所说的SERP的部分含有至少一个T-细胞表面抗原。
8、如权利要求7所述的制备重组表达型载体的方法，它含有SERP的442-892氨基酸或640-700氨基酸。
9、按权利要求1-8中所述的任一项制备重组表达型载体的方法，其中所说的启动子是受控于存在于同一表达载体分子上游的lac-阻遏物的tac-启动子。
10、按权利要求1-9中所述任一项制备重组表达型载体的方法，其中所说的杂化基因（b）编码一杂化蛋白，其中
（ba）编码氨基酸1-233的DNA序列得自痢疾志贺氏菌OmpA基因;及
（bb）编码氨基酸234-325的DNA序列得自大肠杆菌OmpA基因。
11、按权利要求1-10中所述的任一项制备重组表达型载体的方法，其中所说的克隆位点是一个具有核苷酸序列5′-ATCGATGCATATGCTGACCCATGGTACCCGGGGAGGCCT-3′的多聚连接子。
12、通过用权利要求1-11中任一项的重组表达载体进行转化而制备转化的沙门氏疫苗菌株的方法。
13、按权利要求12所述的制备转化沙门氏疫苗菌株的方法，它得自伤塞沙门氏菌或鼠伤塞沙门氏菌。
14、制备能够在哺乳动物中诱导体液免疫应答的重组融合蛋白的方法，它是用权利要求1-11中所述的任一项重组表达型载体转化沙门氏疫苗菌株。
15、按权利要求14所述的制备重组融合蛋白的方法，其中所说的沙门氏疫苗菌得自伤塞沙门氏菌或鼠伤塞沙门氏菌。
16、用于预防疟疾的疫苗的制备方法，它是将权利要求12或13所述的沙门氏疫苗菌或权利要求12或13所述的重组融合蛋白或权利要求14的重组融合蛋白与任意结合的可药用载体或稀释剂结合使用。
17、按权利要求12或13的沙门氏疫苗菌株或按权利要求14或15的重组融合蛋白的剂量的使用方法，所说的剂量适于诱导保护性体液免疫应答，适用于疟疾的预防。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU670108B2 (en) * 1992-09-11 1996-07-04 Becton Dickinson & Company Improved antibodies to plasmodium falciparum
WO1994006911A2 (en) * 1992-09-16 1994-03-31 Board Of Regents, The University Of Texas System Mycoplasma pulmonis antigens and methods and compositions for use in cloning and vaccination
ZA94916B (en) * 1993-02-10 1995-08-10 Unilever Plc Immobilized proteins with specific binding capacities and their use in processes and products
GB9326425D0 (en) * 1993-12-24 1994-02-23 Secr Defence Vaccine compositions
US7256038B2 (en) 2003-08-18 2007-08-14 Regents Of The University Of California Polypeptide display libraries and methods of making and using thereof
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Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA1331355C (en) * 1986-04-21 1994-08-09 Bioenterprises Pty. Ltd Immunopotentation
DE3741057A1 (de) * 1987-03-18 1988-09-29 Behringwerke Ag Klonierung von malaria-spezifischen dna-sequenzen:isolierung des gens fuer das 140 kd protein
DE3737238A1 (de) * 1987-11-03 1989-05-18 Behringwerke Ag Rekombinantes histidinreiches protein (37 kd antigen) von plasmodium falciparum, seine herstellung und verwendung
DE3828666A1 (de) * 1988-08-24 1990-03-01 Behringwerke Ag Expression funktionsfaehiger homologer und heterologer proteine auf der aeusseren membran von e.coli und anderen gramnegativen bakterien

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