CN111533813B

CN111533813B - 牛病毒性腹泻病毒重组亚单位疫苗

Info

Publication number: CN111533813B
Application number: CN202010654138.9A
Authority: CN
Inventors: 曹文龙; 孔迪; 滕小锘; 易小萍; 张大鹤
Original assignee: Suzhou Shinuo Biotechnology Co ltd
Current assignee: Suzhou Womei Biology Co ltd
Priority date: 2020-07-09
Filing date: 2020-07-09
Publication date: 2020-10-16
Anticipated expiration: 2040-07-09
Also published as: CN111533813A

Abstract

本发明公开了一种牛病毒性腹泻病毒重组亚单位疫苗，其包含作为有效成分的重组牛病毒性腹泻病毒融合蛋白（BVDV‑Fu），所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。本发明的疫苗能够在牛体内产生较强体液免疫，免疫后的牛能够抵御强毒攻毒，并且本发明的疫苗能够大规模工业化制备，成本低廉，质量稳定，安全性高。

Description

牛病毒性腹泻病毒重组亚单位疫苗

技术领域

本发明涉及一种基因工程疫苗，具体涉及一种牛病毒性腹泻病毒重组亚单位疫苗、其制备方法与应用，属于人用疫苗和人用生物制品领域。

背景技术

牛病毒性腹泻(Bovine viral diarrhea，BVD)是由牛病毒性腹泻病毒(Bovineviral diarrhea virus，BVDV)引起的一种急性、接触性传染病。BVDV除感染牛外，还可感染猪、鹿、羊、骆驼及其他野生动物，甚至还有感染人的报道，宿主相当广泛。该病以消化道黏膜糜烂、发热、咳嗽、腹泻以及怀孕母牛流产或产生畸形胎儿为主要特征。一旦感染，可造成持续感染，持续感染的牛处于免疫耐受状态时，临床上不表现任何症状，但仍然带毒、排毒，可严重损坏机体的免疫机能，造成生产性能下降，还可以诱发其他病原体的感染而导致继发感染或混合感染等，急性BVDV致死率可高达90%。BVDV的高突变率以及复杂的临床症状，给全球畜牧产业的发展带来了重大危害和无法估量的经济损失。世界动物卫生组织（OIE）将BVD列入OIE B类动物疫病目录，我国将其列为二类传染病。

BVDV是黄病毒科瘟病毒属的成员，为单股正链RNA病毒。BVDV仅有一种血清型，但同一血清型之间存在着显著的遗传和抗原异质性。BVDV 5’UTR是高度保守的序列，是BVDV基因型分型的依据，根据BVDV 5’UTR序列遗传进化分析分成BVDV I型和BVDV II型两个基因型（HEINZ F X，COLLETY M S，PURCELL R H，et al，Family flaviridae．Virustaxonomy: seventh report of the international committee on taxonomy of virus[M]．San Diego: Academic Press，2000:859-878.）。近年来，在牛血清中检测到了非典型性牛的瘟病毒BVDV-Ⅲ基因型，该基因型可分为两个基因亚型（Brazilian源和Thai源），但BVDV-Ⅲ的病毒还未被国际病毒分类委员会确认（Bauermann FV, Ridpath JF, WeiblenR, et al. HoBi-like viruses: an emerging group of pestiviruses[J].J Vet DiagnInvest, 2013,25(1):6-15.）。BVDV I型已被国内外广泛地研究报道，它包括很多经典株和多种常见疫苗株，在大多数地区分离的BVDV I型均为低毒力，致病性BVDV I型常引起发热、下痢和急慢性粘膜病。BVDV II型包括高致病力毒株和低致病力毒株，BVDV II型和BVDV I型感染表现的临床症状很相似，但还能引起严重的血小板减少症和出血综合症，另外它还能引起怀孕后期母牛的流产、死胎和新生小牛的先天畸形、免疫抑制等。根据BVDV基因组中5’UTR、Npro和E2序列的比较，BVDV I型可以分为22个亚型(Ia-Iv)；BVDV II型分为4个亚型(2a-2d)。研究证明，不同亚型的抗原不同，中和反应不同，与单克隆抗体的结合不同，牛接种疫苗的反应也不同。

BVDV粒子电镜观察病毒颗粒大小40-60nm，呈二十面体对称，有囊膜，病毒衣壳的直径约25-30nm。基因组全长约12.3-12.5 kb，包括一个开放阅读框、5’非翻译区 (5’UTR)和3’非翻译区(3’UTR)。BVDV通过网格蛋白介导的内吞作用进入宿主细胞，在病毒和宿主的蛋白酶共同水解和切割作用下，会形成12种成熟蛋白，包括P14 (Core)、gp48(ERNS)、gp25(E1)和gp53(E2)4种结构蛋白和Npro、p7、NS2、NS3、NS4A、NS4B、NS5A和NS5B 8种非结构蛋白（BRANZA-NICHITA N, DURANTEL D, CARROUEE-DUR-ANTEL S, et al. Antiviral effectof N-butyldeoxynojirimycin a-gainst bovine viral diarrhea virus correlateswith misfolding of E2 envelope proteins and impairment of their associationinto E1-E2 heterodimers[J]. Journal of Virology, 2001, 75(8):3527-3536.）。在这些糖蛋白中，结构蛋白Erns和E2是最具免疫原性的蛋白质。Erns蛋白是一种高度糖基化蛋白质，与受感染的细胞分泌可溶可以抑制核糖核酸酶活性。同时Erns蛋白有少量的中和表位，可以调控宿主的免疫反应。Erns蛋白是一个同源二聚体，诱导机体产生抗Erns的中和抗体（Tews BA, Meyers G. The pestivirus glycoprotein Erns is anchored in planein the membrane via an amphipathic helix.[J]. J Biol Chem. 2007,282(45):32730-32741.）。E2蛋白位于病毒粒子的外表面，含有病毒重要的抗原决定簇，是病毒主要的免疫保护性抗原，能诱导机体产生保护性的中和抗体（Harpin S, David J H, MbikayM, et a1. Vaccination of cattle with a DNA plasmid encoding the bovine viraldiarrhoea virus maior glycoprotein E2[J]. J Gen Virol, 1999, 80:3137-3144;Kalaycioglu A T，Russell P H，Howard C R．The characterization of theneutralizing bovine viral diarrhea virus monoclonal antibodies and antigenicdiversity of E2 glycoprotein[J]．J Vet Med Sci，2012，4(9)：1117-1120．）。E2蛋白对病毒RNA的装配或病毒粒子的组装、病毒与受体或感染的细胞之间的互相作用非常重要。

由于BVDV存在不同的生物型、不同的基因型且不同的毒株上毒力差异很大，多数弱毒或无毒的BVDV II型毒株都可能对牛产生持续性的感染，目前传统的BVDV疫苗只包括了BVDV Ⅰ型，如CN105949286A就公开了一种单独表达了Ⅰ型BVDV E2蛋白的方法。而且，研究表明，BVDV Ⅰ型与BVDV Ⅱ型E2蛋白核苷酸同源性在60％以下，氨基酸同源性低于65％，BVDV Ⅱ型E2蛋白还存在两个氨基酸残基的缺失，这一缺失导致BVDV Ⅱ型与BVDV Ⅰ型有不同的抗原表位，说明BVDV Ⅰ型疫苗对BVDV II的感染没有有效的保护作用。CN107823639A公布了一种由BVDV I a、BVDV I b、BVDV II a、BVDV II b四种基因亚型灭活抗原制备的全病毒灭活疫苗，其制备抗原过程繁琐，成本较高，且灭活疫苗虽然安全程度较高，但仍然存在滴度低，散毒风险高，与流行毒株匹配度不高等问题。

发明内容

本发明的主要目的在于提供一种牛病毒性腹泻病毒重组亚单位疫苗、其制备方法与应用，以克服现有技术中的不足。

为实现前述发明目的，本发明采用的技术方案包括：

本发明的一些实施例提供了一种重组牛病毒性腹泻病毒融合蛋白的制备方法，其包括：

克隆包含重组牛病毒性腹泻病毒融合蛋白编码基因的真核表达载体；

以所述真核表达载体转染CHO细胞，并筛选获得能够悬浮稳定高效表达所述重组牛病毒性腹泻病毒融合蛋白的CHO细胞株，之后发酵培养所述CHO细胞株，再分离获得所述重组牛病毒性腹泻病毒融合蛋白；

所述融合蛋白具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:2的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列。

本发明的一些实施例还提供了一种免疫组合物的制备方法，其包括：

采用前述的任一种方法制备重组牛病毒性腹泻病毒融合蛋白；

将所述重组牛病毒性腹泻病毒融合蛋白与佐剂充分混合。

本发明的一些实施例还提供了一种重组牛病毒性腹泻病毒融合蛋白，其具有SEQID NO:2所示的氨基酸序列或者与SEQ ID NO:2的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列。

本发明的一些实施例还提供了所述重组牛病毒性腹泻病毒融合蛋白的编码基因。

本发明的一些实施例还提供了包含所述编码基因的重组载体。

本发明的一些实施例还提供了包含所述编码基因或所述重组载体的重组细胞。

本发明的一些实施例还提供了所述重组牛病毒性腹泻病毒融合蛋白、所述编码基因、所述重组载体或所述重组细胞在检测、预防和/或治疗牛病毒性腹泻病毒感染中的用途。

本发明的一些实施例还提供了一种牛病毒性腹泻病毒重组亚单位疫苗，其包括所述重组牛病毒性腹泻病毒融合蛋白和药学上可接受的载体。

较之现有技术，本发明实施例通过将基因Ⅰ型和基因Ⅱ型BVDV E2蛋白抗原片段优化融合，使得基因Ⅰ型和Ⅱ型两种BVDV都能够被保护，进一步的，通过融合Erns蛋白抗原表位还对前述两种基因型病毒都形成有效保护，以及，还通过使用截短的Erns蛋白片段与基因Ⅰ型和基因Ⅱ型BVDV E2蛋白抗原片段融合，可以更好地辨别病毒感染和免疫，最终使得所获重组牛病毒性腹泻病毒融合蛋白（BVDV-Fu）具有与天然蛋白质相似的抗原性、免疫原性和功能，在用于制备疫苗时，免疫原性强，对牛没有致病性，能够在牛体内产生较强的体液免疫，免疫后的牛能够抵御强毒攻毒，同时其表达水平较高，可以使用生物反应器大规模无血清悬浮培养制备，生产成本低、质控容易、安全性高、批次间稳定。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施方式的技术方案，下面将对实施方式中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。

图1是本发明实施例1中BVDV-Fu基因扩增产物的凝胶电泳图；

图2是本发明实施例1中菌落PCR产物的凝胶电泳图；

图3是构建好的真核表达载体pCI-Fu-GS的示意图；

图4为实施例3中的细胞培养物上清进行SDS-PAGE凝胶电泳的结果；

图5为实施例4中表达BVDV-Fu蛋白重组CHO上清样品Western Blot检测结果。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本说明书使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。

本发明实施例的一个方面提供了一种重组牛病毒性腹泻病毒融合蛋白（BVDV-Fu融合蛋白），其具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列或者其增加、截短的序列，例如与SEQ IDNO:2的全长氨基酸序列95％以上相同的氨基酸序列。

其中，所述BVDV-Fu融合蛋白之中，通过融合基因Ⅰ型和基因Ⅱ型BVDV E2蛋白抗原片段，使得基因Ⅰ型和Ⅱ型两种BVDV都能够被保护。以及，所述BVDV-Fu融合蛋白之中，通过融合Erns蛋白抗原表位，虽然激发的抗体水平低，但是这个表位非常保守，对于两种基因型病毒都有保护。进一步的，所述BVDV-Fu融合蛋白之中，没有使用全长的Erns蛋白，而是使用了截短的Erns蛋白片段，与基因Ⅰ型和基因Ⅱ型BVDV E2蛋白抗原片段最终形成的融合蛋白，这样可以更好地辨别病毒感染和免疫。

本发明实施例的一个方面还提供了所述重组牛病毒性腹泻病毒融合蛋白的编码基因。

在一些实施方式中，所述编码基因包括序列如SEQ ID NO:1所示的核酸分子或者与SEQ ID NO:1的核苷酸序列95％以上相同的核酸分子。

本发明实施例的一个方面还提供了包含所述编码基因的重组载体。

在一些实施方式中，所述重组载体为真核表达载体，包括但不限于pSV2-GS、pCI-GS或pcDNA4-GS等，优选为pCI-GS。

本发明实施例的一个方面还提供了包含所述编码基因或所述重组载体的重组细胞。

在一些实施方式中，所述CHO细胞包括但不限于DG44、DXB11、CHO-K1或CHO-S细胞株等，优选为CHO-S细胞株。

本发明实施例的一个方面还提供了一种重组牛病毒性腹泻病毒融合蛋白的制备方法，其包括：

在一些实施方式中，所述真核表达载体包括但不限于pSV2-GS、pCI-GS或pcDNA4-GS等，优选为pCI-GS。

将所述重组牛病毒性腹泻病毒融合蛋白与佐剂充分混合。

在一些较为具体的实施方式中，所述制备方法包括：

本发明实施例的一个方面还提供了一种牛病毒性腹泻病毒重组亚单位疫苗的制备方法，其包括如下步骤：

1）克隆包含优化后的BVDV-Fu融合蛋白编码基因的真核表达载体；

2）转染CHO细胞，通过选择、筛选得到悬浮稳定高效表达BVDV-Fu融合蛋白的CHO细胞株；

3）发酵培养步骤2）最终所获细胞株，纯化后得到重组BVDV-Fu融合蛋白；

4）将重组BVDV-Fu融合蛋白与佐剂充分混匀，得到所述疫苗。

在一些实施方式中，所述佐剂包括但不限于MONTANIDE ISA 206 VG（Seppic公司）、MONTANIDE ISA 15 VG（Seppic公司）、液体石蜡、樟脑油、植物细胞凝集素等的任意一种或者两种以上的组合，优选为MONTANIDE ISA 15 VG。

本发明实施例的一个方面还提供了所述重组牛病毒性腹泻病毒融合蛋白、所述编码基因、所述重组载体或所述重组细胞在制备牛病毒性腹泻病毒检测试剂中的用途。

本发明实施例的一个方面还提供了所述重组牛病毒性腹泻病毒融合蛋白、所述编码基因、所述重组载体或所述重组细胞在制备预防和/或治疗牛病毒性腹泻病毒感染的药物中的用途。

本发明实施例的一个方面还提供了所述重组牛病毒性腹泻病毒融合蛋白或者所述免疫组合物在制备牛病毒性腹泻病毒重组亚单位疫苗中的用途。

本发明实施例的一个方面还提供了一种牛病毒性腹泻病毒重组亚单位疫苗，其包括所述重组牛病毒性腹泻病毒融合蛋白和药学上可接受的载体。

所述的药学上可接受的载体指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。例如，在Remington’s Pharmaceutical Sciences(Mack Pub.Co.，N.J.1991)等诸多文献中均可找到关于药学上可接受的载体的充分说明。

在本发明实施例提供的疫苗中，所述药学上可接受的载体可含有液体，如水、盐水、甘油和山梨醇。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如润滑剂、助流剂、润湿剂或乳化剂、pH缓冲物质和稳定剂，如白蛋白等。

在一些实施方案中，所述药学上可接受的载体还可以含有免疫刺激剂、细胞转染试剂等其它类型的佐剂。优选的，其中部分的佐剂采用苏州世诺生物技术有限公司生产的佐剂，以提高疫苗效果。

在本发明实施例中，可以将所述的疫苗制成各种适合于哺乳动物给药的剂型，所述剂型包括但不限于：注射剂、胶囊剂、片剂、乳剂、栓剂；较佳地为注射剂。

本发明实施例提供的疫苗在使用时，其中的重组牛病毒性腹泻病毒融合蛋白（BVDV-Fu）能够快速的诱导体液免疫，只需很少剂量就可以给哺乳动物，特别是牛提供完全保护。具体的，在使用时，是将安全有效量的本发明所述的疫苗施用于哺乳动物(如牛)，其中该BVDV-Fu的安全有效量通常至少约1微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约10毫克/千克体重，较佳地该剂量是约1微克/千克体重-约1毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、使用者健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

本发明以上实施例使用CHO细胞表达融合蛋白BVDV-Fu，产品的抗原性、免疫原性和功能与天然蛋白质相似，表达水平较高，免疫原性强，对牛没有致病性，并且本发明的疫苗可以使用生物反应器大规模无血清悬浮培养制备，不仅质控容易，安全性高，免疫原性好，批次间稳定，而且还大大降低了疫苗生产成本，能够很好的满足大规模工业化生产的需求。

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中所用试剂和原料均市售可得，而其中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件，或者按照各制造商所建议的条件。又及，除非另外说明，本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术。这些技术在现有文献中已有完善说明，具体可参见Sambrook等MOLECULAR CLONING：A LABORATORYMANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Thirdedition，2001；Ausubel等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY，John Wiley&Sons，New York，1987 and periodic updates；the series METHODS IN ENZYMOLOGY，Academic Press，San Diego；Wolffe，CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION，Thirdedition，Academic Press，San Diego，1998；METHODS IN ENZYMOLOGY，Vol.304，Chromatin(P.M.Wassarman and A.P.Wolffe，eds.)，Academic Press，San Diego，1999；和METHODSIN MOLECULAR BIOLOGY，Vol.119，Chromatin Protocols(P.B.Becker，ed.)Humana Press，Totowa，1999等。

实施例1重组真核表达载体pCI-Fu-GS的构建

1. BVDV-Fu基因扩增与纯化在南京金斯瑞生物科技有限公司合成了密码子优化后的BVDV-Fu基因（SEQ ID NO:1）并克隆到pUC-57载体上，酶切位点为Kpn Ⅰ、Xho Ⅰ，得到pUC-Fu质粒载体。以pUC-Fu作为模板，Fu-F、Fu-R作为引物进行PCR扩增（Fu-F、Fu-R的基因序列如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示），扩增体系见表1。反应条件为：94℃预变性5分钟；95℃变性45秒，60℃复性45秒，72℃延伸2分钟，30个循环；72℃延伸10分钟，4℃保藏。

表1 BVDV-Fu基因扩增体系

将PCR产物进行凝胶电泳，以鉴定目的基因大小，如图1所示，在1.3kbp附近的位置出现条带，表明目的基因扩增成功，继而可以用凝胶回收纯化试剂盒对目的基因（BVDV-Fu基因）进行回收纯化。

2. 酶切将pCI-GS质粒和纯化后的BVDV-Fu基因PCR产物分别使用Xho Ⅰ、Kpn Ⅰ37℃酶切3小时，反应体系见表2、表3。酶切产物凝胶电泳后分别回收，并用凝胶回收纯化试剂盒进行纯化。

表2 BVDV-Fu基因酶切反应体系

表3 pCI-GS质粒酶切反应体系

3. 连接将酶切过的pCI-GS质粒和BVDV-Fu基因酶切产物使用T4 DNA 连接酶16℃水浴连接过夜，连接体系见表4。

表4 BVDV-Fu基因与pCI-GS质粒连接体系

4. 转化取10 μl连接产物加入100 μl的DH5α感受态细胞，混匀，42℃热休克90秒，冰浴2分钟，加入900 μl 不含Amp的LB培养基，37℃培养1小时。取1.0 ml菌液离心浓缩成100 μl涂布于含有Amp的LB固体培养基上，37℃培养16小时。

5. 菌落PCR和测序鉴定挑取平板上的单菌落分别接种LB液体培养基，37℃培养2小时，以菌液作为模板，Fu-F和Fu-R作为引物进行菌落PCR。将PCR产物进行凝胶电泳验证目的基因大小，如图2所示，出现1.3kbp附近条带的样品为阳性样品。将菌落PCR鉴定阳性的菌液送测序公司测序，选择测序正确的菌液进行保存。该步骤获得的真核表达载体pCI-Fu-GS如图3所示。

实施例2 表达BVDV-Fu蛋白的重组CHO细胞的构建与筛选

1. 细胞转染

1.1 准备细胞取对数生长期的CHO细胞，取样计数，以1×10⁶cells/ml的细胞密度继续传代，维持种子，剩余细胞离心，1000 rpm离心4分钟后，弃上清，用20 ml左右的新鲜CHO-WM培养基重悬，再次离心，1000 rpm离心4分钟，弃上清后用少量培养基重悬计数，最终将细胞密度调整为1.43×10⁷cells/ml。

1.2 质粒与细胞混合取实施例1所获pCI-Fu-GS载体5μg，加入至EP管中，添加0.7ml细胞，混合均匀后，静置15分钟。

1.3 电转 280V 20 ms电击2个脉冲，电击完成后，立刻将细胞转入至摇瓶中，悬浮培养，48h后观察细胞状态，换液培养，等细胞密度生长到0.6×10⁶cells/ml时，添加50μMMSX（L-methionine sulphoximine，MCE公司）加压筛选。

2. 单克隆筛选

2.1 用苏州沃美生物技术有限公司的CHO细胞无血清无蛋白培养基CHO-WM细胞培养基+50μM MSX重新悬浮细胞，计数。

2.2 铺板稀释细胞至5个/mL，取200μl混匀的细胞加入到96孔板中，放置到37℃，5% CO₂细胞培养箱中孵育4-6 h。记录单个细胞的孔。

2.3 待96孔板中单个细胞的孔长起来时，弃掉培养基，PBS洗一次，100 μl 0.25%trypsin-EDTA，室温消化2 min左右，加入2 mL CHO-WM 培养基 (含10% FBS+50μM MSX)终止消化反应，并用移液器将细胞吹散。将细胞转移至12孔板，待12孔板长满时，取上清，Elisa检测克隆是否为阳性，高效表达的阳性克隆继续扩大培养，冻存。

3. 细胞摇瓶发酵

3.1 传代培养基的配置：使用CHO-WM培养基添加50μM MSX作为传代培养基，置于37℃水浴锅预热至37℃。

3.2 从CO₂恒温摇床取出摇瓶细胞，进行计数。

3.3 稀释细胞至2.5-3.5×10⁵个细胞/mL接种30 mL培养基于一个125mL摇瓶中。细胞培养瓶放置到37℃，5% CO₂恒温摇床中100 rpm/min孵育过夜。

3.4 每隔24 h计数细胞密度以及活力，测葡萄糖，当糖低于2g/L的时候，添加葡萄糖到4g/L；每天取1 mL样品，上清用于检测蛋白表达情况。

另外，按照以上实施例的方法构建表达如表5所示蛋白的细胞株：

表5

实施例3 SDS-PAGE检测

将实施例2中收获的BVDV-Fu细胞培养物上清进行SDS-PAGE检测，同时使用空的CHO细胞作为阴性对照。具体操作如下：取40 μl收获的细胞培养物，加入10 μl的5×SDS 凝胶上样缓冲液（取1mol/L Tris-HCI(pH6.8)1.25 mL，溴酚蓝25 mg，甘油2.5 mL，SDS 0.5g溶于 ddH₂O中，定容至5mL，0.5mL/管分装，室温保存，使用前每管加入25μLβ-巯基乙醇混匀，沸水浴5分钟，12000 r/min离心1分钟，取上清进行SDS-PAGE凝胶（12%浓度凝胶）电泳，电泳后取凝胶经染色、脱色后观察目的条带。

检测结果如图4所示，在分子量约48kDa附近出现目的条带，阴性对照在对应位置没有条带。

实施例4 Western Blot检测

将实施例3中所获SDS-PAGE电泳后的产物分别转印到NC（硝酸纤维素）膜上，用5%脱脂牛奶封闭2小时，牛源抗BVDV多抗血清孵育2小时，漂洗，HRP标记的羊抗牛多克隆抗体二抗孵育2小时，漂洗，然后滴加增强型化学发光荧光底物，使用化学发光成像仪拍照。结果如图5所示，图中重组CHO上清样品有细胞条带，阴性对照没有目的条带，说明目的抗原蛋白在重组CHO细胞中得到正确表达。

实施例5 蛋白含量与琼扩检测

将实施例2中收获的CHO细胞培养上清液中BVDV-Fu蛋白含量使用Elisa方法检测。操作方式如下：用包被缓冲液稀释牛抗BVDV多抗血清至合适浓度，每孔100 µl，4℃过夜，PBST洗涤三次，1%BSA封闭1 h。加入不同浓度的抗原标准品和梯度稀释待检样品，37℃孵育1小时，PBST洗三次。每孔加入HRP标记的兔抗BVDV多抗血清，37℃孵育1小时，PBST洗三次。TMB显色10分钟，2M H₂SO₄终止反应。酶标仪读数，通过标准曲线计算待检样品中BVDV-Fu蛋白的量。

按照实施例5，大规模制备的BVDV-Fu蛋白，Elisa检测结果如下，疫苗原液中蛋白的平均含量达到450mg/L。

使用琼扩方法检测表达的E2蛋白效价，在琼脂糖凝胶板上打梅花孔，在梅花孔中间加入DTMUV琼扩检测标准血清，周围分别加入稀释了2的0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10次方的表达抗原。倒置孵育72 h后观察沉淀线。出现沉淀线的最大稀释比例为其琼扩效价。琼扩效价检测结果如下：BVDV-Fu蛋白琼扩效价为1:256。

实施例6 疫苗制备

将适量CHO细胞表达的BVDV-Fu蛋白稀释后加入到MONTANIDE ISA15 VG佐剂中（体积比为85:15），使得最终乳化好的疫苗中蛋白浓度为50µg/ml，乳化，质检合格后置于4℃保存。以同样的方法将实施例2中的细胞培养物分别制备Ⅰ型-E2组疫苗、Ⅱ型-E2组和Erns蛋白组疫苗。

实施例7 免疫实验

试验一：

用4~5月龄小牛50头（BVDV抗原抗体阴性），随机分为5组，其中4组为免疫组，分别肌肉注射实施例6中制备的亚单位疫苗2ml（100µg/头份），另外1组为对照组，肌肉注射2mlMONTANIDE ISA 15 VG佐剂，首次免疫三周后加强免疫一次，分别于免疫前、首免后21日（二免前）、二免后14日、二免后21日采集血清，使用IDXEE试剂盒测定抗体效价，结果如表6所示。

表6

试验二：

将试验一中的动物于二免后21日分别采血，分离血清，56℃灭活30min，用分离的血清做中和试验。方法如下：将加热灭活完全的血清进行2¹至2¹¹次方稀释，然后取每个稀释度的每组血清分别加入96孔板中，50µl/孔，每个平行组设3个复孔，然后每孔加入稀释后的病毒溶液（含100个TCID₅₀），振荡混匀，37℃反应1h后将MDBK细胞悬液（5×10⁵cell/ml，采用含有10%FBS的DMEM细胞培养液配制）加入96孔板中，100µl/孔，轻轻振荡混匀后，细胞在37℃、5%CO₂条件下静置培养72h，丙酮固定过夜。用PBS漂洗3遍，吸干，然后用BVDV荧光抗体液染色检测，有典型绿色荧光信号的孔表示未中和。按照上述方法分别以BVDV JL02株病毒溶液和BVDV2/JZ05-2毒株病毒溶液进行试验，结果如表7所示。

表7 中和抗体检测

应当理解，以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

序列表

<110> 苏州世诺生物技术有限公司

<120> 牛病毒性腹泻病毒重组亚单位疫苗

<140> 7

<141> 2020-05-20

<160> 7

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1308

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 1

atgaaactgg cggcgaccat ggaaaccgat accctgctgc tgtgggtgct gctgctgtgg 60

gtgccgggca gcaccggcgc ggatattgtg gaaatggatg ataactttga atttgcgatt 120

tgcccgtgcg atagcaaacc ggtggtgcgc ggcaaattta acaccaccct gctgaacggc 180

ccggcgtttc agatggtgtg cccgattggc tggaccggca gcgtgagctg caccctggcg 240

aacaaagata ccctggatac cgcggtggtg cgcacctata aacgcgtggt gccgtttccg 300

aaccgccagg gctgcgtgac ccagaaactg ctgggcgaag atctgtatga ttgcattctg 360

ggcggcaact ggacctgcat tgtgggcgat cagctgcgct ataccggcgg caccattgaa 420

agctgcaaat ggtgcggcta taaatttctg aaaagcgaag gcctgccgca ttatccgatt 480

ggcaaatgcc gcctgaaaaa cgaaaccggc tatcgcctgg tggatgatac cagctgcaac 540

gtggatggcg tggcgattgt gccgaacggc ctggtgaaat gcaaaattgg cgataccctg 600

gtgcaggtgg tggcgatgga agtgattgat atgccggatg attttgaatt tggcctgtgc 660

ccgtgcgata gcaaaccgat tattaaaggc aaatttaaca ccagcctgct gaacggcccg 720

gcgtttcaga tggtgtgccc gcagggctgg accggcacca ttgaatgcac cctggcgaac 780

caggataccc tggataccac cgtgattcgc acctatcgcc gcaccacccc gtttcagcgc 840

cgcaaatggt gcgcgtatga aaaaattatt ggcgaagata ttcatgaatg cattctgggc 900

ggcaactgga cctgcattat tggcgatcat agcaaactga aagatggccc gattaaaaaa 960

tgcaaatggt gcggctatga ttttagcagc ccggaaggcc tgccgcatta tccgattggc 1020

aaatgcatgc tgagcaacga aagcggctat cgctatgtgg atgataccag ctgcgatcgc 1080

ggcggcgtgg cgattgtgcc gaccggcacc gtgaaatgcc gcattggcaa cgtgaccgtg 1140

caggtgattg cgaccggcat gatggatgcg agcgaaaaaa ccaactatac ctgctgccgc 1200

ctgcagcgcc atgaatggaa caaacatggc tggtgcaact ggtataacat tgaaccgtgg 1260

attctgctga tgaacaaaac ccagcatcac catcaccatc actaatga 1308

<210> 2

<211> 435

<212> PRT

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 2

Met Lys Leu Ala Ala Thr Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val

1 5 10 15

Leu Leu Leu Trp Val Pro Gly Ser Thr Gly Ala Asp Ile Val Glu Met

20 25 30

Asp Asp Asn Phe Glu Phe Ala Ile Cys Pro Cys Asp Ser Lys Pro Val

35 40 45

Val Arg Gly Lys Phe Asn Thr Thr Leu Leu Asn Gly Pro Ala Phe Gln

50 55 60

Met Val Cys Pro Ile Gly Trp Thr Gly Ser Val Ser Cys Thr Leu Ala

65 70 75 80

Asn Lys Asp Thr Leu Asp Thr Ala Val Val Arg Thr Tyr Lys Arg Val

85 90 95

Val Pro Phe Pro Asn Arg Gln Gly Cys Val Thr Gln Lys Leu Leu Gly

100 105 110

Glu Asp Leu Tyr Asp Cys Ile Leu Gly Gly Asn Trp Thr Cys Ile Val

115 120 125

Gly Asp Gln Leu Arg Tyr Thr Gly Gly Thr Ile Glu Ser Cys Lys Trp

130 135 140

Cys Gly Tyr Lys Phe Leu Lys Ser Glu Gly Leu Pro His Tyr Pro Ile

145 150 155 160

Gly Lys Cys Arg Leu Lys Asn Glu Thr Gly Tyr Arg Leu Val Asp Asp

165 170 175

Thr Ser Cys Asn Val Asp Gly Val Ala Ile Val Pro Asn Gly Leu Val

180 185 190

Lys Cys Lys Ile Gly Asp Thr Leu Val Gln Val Val Ala Met Glu Val

195 200 205

Ile Asp Met Pro Asp Asp Phe Glu Phe Gly Leu Cys Pro Cys Asp Ser

210 215 220

Lys Pro Ile Ile Lys Gly Lys Phe Asn Thr Ser Leu Leu Asn Gly Pro

225 230 235 240

Ala Phe Gln Met Val Cys Pro Gln Gly Trp Thr Gly Thr Ile Glu Cys

245 250 255

Thr Leu Ala Asn Gln Asp Thr Leu Asp Thr Thr Val Ile Arg Thr Tyr

260 265 270

Arg Arg Thr Thr Pro Phe Gln Arg Arg Lys Trp Cys Ala Tyr Glu Lys

275 280 285

Ile Ile Gly Glu Asp Ile His Glu Cys Ile Leu Gly Gly Asn Trp Thr

290 295 300

Cys Ile Ile Gly Asp His Ser Lys Leu Lys Asp Gly Pro Ile Lys Lys

305 310 315 320

Cys Lys Trp Cys Gly Tyr Asp Phe Ser Ser Pro Glu Gly Leu Pro His

325 330 335

Tyr Pro Ile Gly Lys Cys Met Leu Ser Asn Glu Ser Gly Tyr Arg Tyr

340 345 350

Val Asp Asp Thr Ser Cys Asp Arg Gly Gly Val Ala Ile Val Pro Thr

355 360 365

Gly Thr Val Lys Cys Arg Ile Gly Asn Val Thr Val Gln Val Ile Ala

370 375 380

Thr Gly Met Met Asp Ala Ser Glu Lys Thr Asn Tyr Thr Cys Cys Arg

385 390 395 400

Leu Gln Arg His Glu Trp Asn Lys His Gly Trp Cys Asn Trp Tyr Asn

405 410 415

Ile Glu Pro Trp Ile Leu Leu Met Asn Lys Thr Gln His His His His

420 425 430

His His His

435

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 3

aaactggcgg cgaccatgga aaccgatacc ctgc 34

<210> 4

<211> 44

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 4

tcattactga tgctgatgct gatgctgggt tttgttcatc agca 44

<210> 5

<211> 540

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 5

gcggatattg tggaaatgga tgataacttt gaatttgcga tttgcccgtg cgatagcaaa 60

ccggtggtgc gcggcaaatt taacaccacc ctgctgaacg gcccggcgtt tcagatggtg 120

tgcccgattg gctggaccgg cagcgtgagc tgcaccctgg cgaacaaaga taccctggat 180

accgcggtgg tgcgcaccta taaacgcgtg gtgccgtttc cgaaccgcca gggctgcgtg 240

acccagaaac tgctgggcga agatctgtat gattgcattc tgggcggcaa ctggacctgc 300

attgtgggcg atcagctgcg ctataccggc ggcaccattg aaagctgcaa atggtgcggc 360

tataaatttc tgaaaagcga aggcctgccg cattatccga ttggcaaatg ccgcctgaaa 420

aacgaaaccg gctatcgcct ggtggatgat accagctgca acgtggatgg cgtggcgatt 480

gtgccgaacg gcctggtgaa atgcaaaatt ggcgataccc tggtgcaggt ggtggcgatg 540

<210> 6

<211> 537

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 6

gaagtgattg atatgccgga tgattttgaa tttggcctgt gcccgtgcga tagcaaaccg 60

attattaaag gcaaatttaa caccagcctg ctgaacggcc cggcgtttca gatggtgtgc 120

ccgcagggct ggaccggcac cattgaatgc accctggcga accaggatac cctggatacc 180

accgtgattc gcacctatcg ccgcaccacc ccgtttcagc gccgcaaatg gtgcgcgtat 240

gaaaaaatta ttggcgaaga tattcatgaa tgcattctgg gcggcaactg gacctgcatt 300

attggcgatc atagcaaact gaaagatggc ccgattaaaa aatgcaaatg gtgcggctat 360

gattttagca gcccggaagg cctgccgcat tatccgattg gcaaatgcat gctgagcaac 420

gaaagcggct atcgctatgt ggatgatacc agctgcgatc gcggcggcgt ggcgattgtg 480

ccgaccggca ccgtgaaatg ccgcattggc aacgtgaccg tgcaggtgat tgcgacc 537

<210> 7

<211> 129

<212> DNA

<213> 人工序列(人工序列)

<400> 7

ggcatgatgg atgcgagcga aaaaaccaac tatacctgct gccgcctgca gcgccatgaa 60

tggaacaaac atggctggtg caactggtat aacattgaac cgtggattct gctgatgaac 120

aaaacccag 129

Claims

1.一种重组牛病毒性腹泻病毒融合蛋白的制备方法，其特征在于包括：

所述融合蛋白的序列如SEQ ID NO:2所示。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述真核表达载体包括pSV2-GS、pCI-GS或pcDNA4-GS。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：所述真核表达载体为pCI-GS。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：所述CHO细胞包括DG44、DXB11、CHO-K1或CHO-S细胞株。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于：所述CHO细胞为CHO-S细胞株。

6.一种免疫组合物的制备方法，其特征在于包括：

采用权利要求1-5中任一项所述的方法制备重组牛病毒性腹泻病毒融合蛋白；

将所述重组牛病毒性腹泻病毒融合蛋白与佐剂充分混合。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于：所述佐剂包括MONTANIDE ISA 206VG、MONTANIDE ISA 201 VG、液体石蜡、樟脑油、植物细胞凝集素中的任意一种或者两种以上的组合。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述佐剂为MONTANIDE ISA 201 VG。

9.一种重组牛病毒性腹泻病毒融合蛋白，其序列如SEQ ID NO:2所示。

10.如权利要求9所述重组牛病毒性腹泻病毒融合蛋白的编码基因。

11.根据权利要求10所述的编码基因，其特征在于：所述编码基因的序列如SEQ ID NO:1所示。

12.包含权利要求10或11所述编码基因的重组载体。

13.包含权利要求10或11所述编码基因或权利要求12所述重组载体的宿主细胞。

14.如权利要求9所述的重组牛病毒性腹泻病毒融合蛋白、权利要求10或11所述的编码基因、权利要求12所述的重组载体或权利要求13所述的宿主细胞在制备预防和/或治疗牛病毒性腹泻病毒感染的药物中的用途。

15.一种牛病毒性腹泻病毒重组亚单位疫苗，其特征在于包括权利要求9所述的重组牛病毒性腹泻病毒融合蛋白和药学上可接受的载体。