PT98896A

PT98896A - Processo para a preparacao de vectores de expressao recombinantes capazes de expressar antigenes de malaria imunogenicos sobre a superficie de estirpes de vacina de salmonella

Info

Publication number: PT98896A
Application number: PT98896A
Authority: PT
Inventors: Hans Kupper; Egon Amann; Joachim Schorr; Bernhard Knapp; Erika Hundt
Original assignee: Behringwerke Ag
Priority date: 1990-09-08
Filing date: 1991-09-06
Publication date: 1992-07-31
Also published as: IE913138A1; CA2050876A1; KR920006503A; ZA917094B; AU8368991A; CN1060498A; EP0474891A1; BR9103856A

Description

1 1

Descrição referente à patente de invenção de BEHRINGWERKE AKT3ENGESELLSCHAFT, alemã, industrial e comercial, com sede em D--3550 Marburg, República Federal Alemã, (inventores: Dr· Joachim Schorr, Dr. Sernh&rd Knapp, Dr. Erika Hundt, Dr. Hans Kttpper e Dr. Egom. Amann, residentes na República Federal Alemã) para, "PROCESSO PARA A PREPARAÇÃO DE VEC·· TORES DE EXPRESSÃO RECOMBINANTBS CAPAZES DE EXPRESSAR ANTIGENES DE MALÁRIA IMUNOGgNICOS SOBRE A SUPERFÍCIE DE ESTIRPES DE VACINA DE SAL-MONELLA",

Descrição A invenção refere-se a novos vectores de expressão recombinantes que são capazes de expressar péptidos imunogénicos dos antigenes da malária HRPII ou SERP sobre a superfície de estirpes de vacina de Salmonella. A invenção refere -se ainda a uma vacina contendo as referidas estirpes de Salmonella e que provoca uma resposta imune humoral em mamíferos por vacinação por via oral.

Os antigenes da malária HRPII e SERP são caracterizados em Patente de Invenção Europeia EP-A2 0 315 085 $ Wellems e Howard, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83 (1986) 6065- J.M. 1 =

-6069? Knapp · outros, Behring Res, Commun. 82 (1988), 349--359» Patente de Invenção Europeia EP-A1 0 283 882, Knapp e outros, Mol. Biochem. Paras. 32 (1989)» 73-84 e Higgins e outros, Nature 340 (1989)» 6θ4, Embora alguns destes documentos refiram também vacinas que contêm os antigenes ou partes imu-nologicamente activas dos mesmos, existe ainda a necessidade de preparar vacinas aperfeiçoadas adequadas para estimular uma resposta imune humoral de protecção digna de confiança contra protozoários que provocam malária, tal como Plasmodium falcipa-rum (P. falciparum),

Estirpes de bactérias transformadas que são aplicáveis como vacinas vivas são descritas nas Patentes de Invenção Alemã DE-A 38 28 666 e Europeia EP-A 0 357 208. Hackett, Vacoine 8 (1990) 5-H» resume o estado da técnica no campo das vacinas baseadas em Salmonella. 0 problema técnico subjacente à presente invenção é proporcionar estirpes de Salmonella manipuladas por engenharia genética que são adequadas para uma profilaxia de protecção e digna de confiança da malária, mediante indução de um alto nível de resposta imune humoral depois de administração por via oral. A solução do problema técnico acima mencionado é conseguida proporcionando as formas de realização carac-terizadas nas reivindicaçães.

Consequentemente, a presente invenção proporciona um vector de expressão recombinante que compreende os seguintes componentess (a) um promotor indutível forte; (b) um gene híbrido que codifica uma proteína híbrida OmpA de bactérias gram-negativas; (c) um sítio de clonação situado na parte do gene OmpA que corresponde ao terceiro laço externo da proteí na OmpA; e U) uma sequência de ADN que é (da) inserida na estrutura no sítio de clo-a 2 * e nação (c) , (db) codifica o antigene da malária HRPII ou SERP ou uma sua parte que e capaz de induzir utna resposta imune humoral em um mamífero, sendo o referido antigene da malária preferivelmente derivado de Plasmodium falciparum. A expressão “promotor indutível forte" refere-se a uma sequência de nucleótidos que, ao nível de transcrição, controla a expressão de uma proteína codificada por tuna sequência localizada a Jusante com uma alta eficiência e que um processo que pode ser induzida por meio de uma alteração da temperatura ou por adição de uma substância química (por exemplo, IPTG). Um exemplo preferido de um promotor indutível forte 4 o promotor tac que está sob o controle do repressor lac« A expressão "sítio de clonação" refere-se a uma sequência de ADN que contem um sítio de clivagem com enzima de restrição que 4 adequado para a incorporação de um fragmento de ADN pretendido. A expressão "uma parte do antigene da malária HRPII ou SERP que 4 capaz de induzir tuna resposta imune hu-moral num mamífero" refere-se a regimes de HRPII ou SERP que são uteis para a produção de vacinas. Essas regiães podem ser determinadas por um perito na técnica procedendo de acordo com métodos convencionais, por exemplo, aplicando programas de computador convencionais (epítopos de células T podem ser confirmados experimentalmente). No caso do SERP, essas regiães são preferivelmente regiões que são homologas de proteases SH ou que contêm epítopos de células T. Neste contexto, o termo, "protease SH" refere-se a uma protease que possui um resíduo essencial de cis-teína no seu sítio activo. Além disso, a expressão "epítopo de células T" refere-se a uma sequência de aminoácidos que estimula a resposta imune celular mediada por linfécitos T,

As proteínas de fusão codificadas pelo vec-tor de expressão recombinante de acordo com a presente invenção são transportadas após a expressão para a parede da célula das . bactérias e são inseridas de tal maneira que apresentam os anti- = 3 =

genes da malária HRPII ou SERP ou parte dos mesmos ao ambiente externo. Essa apresentação é efectuada de tal maneira que o sijs tema imunológico de um mamífero exposto a esses hospedeiros bac· terianos transformados reconhece o referido antigene da malária e provoca uma resposta imune protectora. Preferivelmente os an-tigenes da malária são apresentados na superfície dos hospedeiros bacterianos transformados da presente invenção com uma conformação semelhante à sua forma natural.

Em uma forma de realização preferida da presente invenção, o vector de expressão recombinante compreende adicionalmente: (ca) inserida no referido sítio de clonação (c), uma sequência de ADN que codifica os aminoácidos 1 a 48 e 279 a 515 da proteína hemaglutinina (HA) da Influenza, contendo um primeiro sítio de clonação em uma posição que codifica o arai noácido 46 da proteína HA e o segundo sítio de clonação em uma posição que codifica o aminoácido 400 da proteína HA, em que a mencionada sequência (d) de ADN e inserida em pelo menos um dos sítios de clonação da sequência (ca) de ADN,

Na forma de realização preferida adicional da presente invenção, a referida parte de HRPII consiste nos 189 aminoácidos contidos no vector de expressão recombinante pOmpA-6 que possui o mapa de restrição representado na Figura 1,

Era uma outra forma de realização preferida da presente invenção, o vector de expressão recombinante codifica uma parte de HRPII que consiste nos 177 aminoácidos contidos no vector de expressão recombinante pOmpA-3 que possui o mapa de restrição representado na Figura 1,

Em uma outra forma de realização preferida do vector de expressão recombinante da presente invenção, a referida parte de SERP contém uma região que é homóloga de protea-ses SH,

Em uma forma de realização particularmente preferida, a região que é homóloga de proteases SH contém os ) aminoácidos 442 a 892, 573 a 595 ou 745 a 787 de SERP, 8 4 «

Em uma outra forma de realização adicionalmente preferida do vector de expressão recombinante da presente invenção, a referida parte de SERP contém pelo menos dois epítopos de células T.

Em uma forma de realização particularmente preferida, essa parte que contém epítopos de células T contém os aminoacidos 442 a 892 ou 640 a 700 de SERP·

Outras formas de realização adicionalmente preferidas do vector de expressão recombinante da presente invenção são caracterizadas nas reivindicações, A presente invenção refere-se também a estirpes de vacina de Salmonella que são transformadas com um qualquer dos vectores de expressão recombinantes da presente invenção.

Em uma forma de realização preferida, as referidas estirpes de vacina de Oalmonella são derivadas de Sal-monella typhi ou de Salmonella typhimurium. Nesse contexto, tem de ser entendido que a Salmonella typhimurium é mais infecciosa para ratos e que suas propriedades de vacinação em ratos são frequentemente usadas na técnica como um sistema-modelo para Samonella typhi e as suas propriedades de vacinação em seres humanos.

Sequências de nucleotidos que codificam 189 aminoacidos do antigene da malária HRPII e que codificam os 451 aminoacidos do antigene da malária SERP foram clonadas na estru tura com o poliligante de vectores de expressão contendo um gene híbrido OmpA gerado por tecnologia de ADN recombinante, a partir dos genes OmpA das bactérias gram-negativas E, coli e Shigella dysenteriae, A transformação de estirpes da vacina de S, typhimurium com estes vectores recombinantes e a indução de expressão resultam na expressão dos referidos antigenes da malária ou de partes dos mesmos na superfície das bactérias transformadas. A vacinação oral de ratos NMRI com estirpes de vacina de S> typhimurium transformadas de acordo com a presente invenção resulta em lima considerável resposta Imunológica humoral contra 5

os respectivos antigenes da malária.

Numa forma de realização adicional, a presente invenção refere-se a uma proteína de fusão recombinante capaz de induzir imuno-resposta humoral em mamíferos que se manifesta através de aualauer das estirpes de vacina de Salmonel- ' ..... la da presente invenção*

Numa outra forma de realização a presente invenção refere-se a uma vacina para a profilaxia da malária contendo uma estirpe de vacina de Salmonella da presente invenção ou uma proteína de fusão recombinante da presente invenção. Opcionalmente estes compostos imunologicamente activos são admi nistrados na vacina da presente invenção em combinação com um veículo e/ou com um diluente aceitáveis do ponto de vista farma cêutico.

Numa forma de realização preferida, a vaci na da presente invenção é aplicável oralmente· Assim, a vacina da presente invenção é preferivelmente fornecida sob uma forma que protege os componentes imunologicamente activos do ácido gástrico.

Numa forma de realização adicional, a presente invenção refere-se a um processo para a profilaxia da malária que compreende administrar a um mamífero que necessita esse tratamento tuna dosagem de estirpe de vacina de Salmonella ou de proteína de fusão recombinante de acordo com a presente invenção, sendo a dosagem adequada para induzir uma resposta imunolégica humoral protectora.

As tabelas e figuras mostram%

Tabela 1* (a) Região poliligadora do plasmídeo pHSl64-L. A sequência do plasmídeo original pHSl64 é representada em letras minúsculas. Um oligonucleotido foi inseri do entre um sítio de restrição Ciai e StuI para formar PHSl64-L. (b) Ligador I e Ligador II dentro da região de codificação HA do plasmídio pinf4-49. . Figura 1; Estrutura dos plasmídios de fusão OmpA da presente in- = 6 =

venção. São representadas regides de codificação e tamanhos de genes fundidos OmpA, HA, ERPII e SERP. São indicados sítios de restrição relevantes, em par ticular, os sítios nas junções de fusão de genes.

Figura Z% Resposta de anticorpos de ratos imunizados oralmente com a estirpe de SR-11 S. typhimurium. que expressam proteínas de fusão OmpA HRPII e SERP na sua superfície. Os ratos foram imunizados oralmente nos dias 0, 7, 14, 21 (indicados pelas setas). Amostras de sangue foram retiradas nos dias 0, 14, 28 e 56» tratadas e ensaiadas em relação à presença de anticorpos específicos de HRPII e SERP por meio de ELISA. Para a ti-pificação de Xg, usaram-se soros de anticorpos de cabra conjugados com POD específico de anti-lgG (A) e anti-Igíí (B). Asteriscos » pOmpA-3; círculos abertos» » pOmpA-6} triângulos = pOmpA-5; círculos cheios = » pOmpA-7. 0 título refere-se à maior diluição do soro de ensaio no qual a proporção de A^g de soro de ensaio para A^2 de soro pré-imunológico foi ^ 2,0.

Tabela 2« Sequência de nucleótidos e aminoácidos derivados do fragmento de cADN de 5&3 bp HRP XI (letras maiusculas) * As sequências do vector pUC8 são indicadas por letras minúsculas. 0 nucleótido C que indica a extremidade 5' do digesto Bal 31 usado para a construção de pOmpA-3 é assinalado com um asterisco. Sítios de restrição relevantes para a construção dos vectores pOmpA-3 e pOmpA-6 são mostrados. Os oligonucleótidos usados para a reacção PCR na construção do pOmpA-6 correspondem às sequências sublinhadas.

Tabela 3t Sequência de nucleótidos e aminoácidos derivados do gene SERP completo. 0 fragmento de ADN de 1,3 kb isolado por digestão com Κρη I e Pst I (construção de pOmpA-5) ou amplifi cado por PCR (o fragmento amplificado usado para a construção de pOmpA-7) é representado dentro de parêntesis, Os pontos indicam potenciais sítios de gli- = 7 =

cosilação. Os intrões são assinalados por setas· As regides sublinhadas representam elementos repetitivos.

Os exemplos seguintes ilustram a invenção.

Informações adicionais sobre as técnicas de ADN recombinante aplicadas pode ser encontrada em Sambrook e outros, HMolecular Cloning». Cold Spring Harbour Laboratory. Cold Spring Harbour. 2* edição, 1989.

Exemplo 1

Construção de vectores OmpA que transportam fragmentos dos genes que codificam HRPII e SERP.

Os vectores de expressão OmpA pHSl64 e pinf4-49 foram construídos por S. Pistor e G. Hobom (s. Pistor e G. Hobom, Klin. Wochenschr. 66 (1988), 110-116, Patente de Invenção Alemã DE-A 38 28 666). pHSl64 codifica uma proteína OmpA híbrida que consiste nos aminoácidos 1-46 da proteína OmpA de E» ooli © nos aminoácidos 47-233 da proteína OmpA de Shigella dysenteriae. A fim de proporcionar mais sítios de clo-naçâo, um poliligante com a sequência 5»-ATCGATGCATATGTCGACCC-ATGGTACCCGGGGAGGCCT-3' que transporta sítios únicos de restrição para Ciai, Nsil, Ndel, Sall, Ncol, Kpnl, Smal e StuI foi inserido entre os sítios únicos Ciai e StuI de pHSl64 originando pHSl64-L (Tab. la). Todas as operações de clonação necessárias foram feitas em E. coli K12 A490 (recA, lac, met, thr, rk”, mk”). 0 isolamento do ADN do plasmídio, a preparação dos fragmentos de ADN, a ligação e a transformação de células de B. coli foram realizados usando processos estandardizados (Sambrook e outros, loc. cit.). O sequenciamento de nucleóti-dos em ADN de dupla fita foi efectuado usando o protocolo da USB (Cleveland. Ohlo) baseado no processo da terminação de di-desoxi. A proteína OmpA codificada por pHSl64-L transporta 9 aminoácidos adicionais no seu terceiro laço externo. A inserção de ADN estranho que combina a estrutura de leitura de trans lação da proteína OmpA com o poliligante resulta desse modo na sua expressão no terceiro laço externo de OmpA. 0 plasmídio pinf4-49 codifica uma estrutura semelhante a haste no terceiro = 8 =

laço externo de OmpA formado pelos segmentos hidrofóbicos que consistem nos aminoácidos 1-48 e 279-514 da proteína HA da in-fluenza. Dois sítios de clonação estão presentes* ligador I em uma posição que corresponde ao codão 46 do gene HA e ligador XI em uma posiç&o que corresponde ao cod&o 400 do gene HA (Tab· lb, Patente de Invenç&o Alemã DE-A 38 28 666), A clona-ç&o de fragmentos de ADN entre ambos os ligadores tinha a intenção de melhorar a exposição do antigene expresso*

Nos vectores OmpA* a transcrição do gene OmpA está sob o controle do promotor tac, cuja actividade é controlada pelo repressor lac. 0 alelo lacIQ está ele próprio presente nos vectores e, portanto* o repressor lac é proporcionado na posição cis, independentemente do real fundamento genético das estirpes bacterianas*

Empregando os vectores pHSl64-L e pinf4--49* foram construídos quatro plasmídios de expressão (Figura D: pOmpA-3* pSK-HRPII que possui um pequeno fragmento Smal-Xhol-cDNA de 0*55 kb· (Tab. 2)* do qual foi suprimido o codão da interrupção de translação* foi digerido com Smal* Este fragmento foi isolado e clonado nos respectivos sítios de pinf4-4-9· Mais especificamente* foram realizadas as seguintes etapas* 1* Digestão de pUC8-HRPII com Hind III· 2, Digestão com Bal 31 de acordo com Sambrook e outros (loc* cit,)· 3, Reacção de intercalação com enzima

Klenow, 4* Reacção de intercalação com ADN polime- rase T4 5, Digestão com EcoRI resultando na libertação do inserto. 6. Eletroforese em gel dos fragmentos de j ADN e isolamento de fragmentos de ADN que são 30-80 bp mais cur- = 9 = tos que o ADN inserto 7· Digestão do ADN do vector Bluescript pSK (+) com Hlnd II e EcoRI. 8. Ligação dos fragmentos de Bal 31 em pSK (+) digerido com Hind Il/EcoRI. 9. Transformação de células azuis XL1 com o vector recombinante. 10. Minipreparaçães de ADN analisadas com

Xhol e EcoRI. 11. Sequenciamento de ADN minipreparados de 20 clones diferentes; nove dos fragmentos de ADN encontravam -se na estrutura com o vector pinf4-49 no sítio Xhol.

Um dos clones tinha a seguinte sequência no sítio de clonação 3' de HRPII;

Xhol

Hpall CTC GAG GTC pSK(+)

CGG

TGC ATG extremidade 3' de HRPII 0 sítio Xhol desta construção não está na estrutura com o sítio Xhol do vector pinf4-49. Por meio desta etapa de clonação, cria-se um novo sítio de restrição Hpall, 12. Digestão do ADN deste clone com Kpnl

e EcoRI 13· Isolamento do ADN inserto. 14. Digestão de restrição do ADN inserto com Hpall. 15. Isolamento de um fragmento EcoRI--Hpall de 600 bp por electroforese em gel, 16. Ligação do inserto em pSK (+) digeri do com Accl e EcoRI, 0 esquema seguinte sumariza a estratégia para suprimir o nucleótido 5* C do sítio Hpall. a) Digestão do vector recombinante com s 10 ·* » *

Hpall Xhol CTC GAG pSK(+)

Hpall

GTC

CHGC

TGC ATG HRPII b) Digestão do vector pSK (+) com Accl

Xhol Accl

CTC GAG GTC GAC GGT pSK (+) c) Ligação do fragmento EcoRI Hpall de 600 bp de HRPII em pSK (+) digerido com Accl e EcoRI,

Xhol

CTC GAC GTjG GGC TGC ATG pSK(+) I HRPII A supressão da base C no sítio HRPII tem como resultado um novo vector recombinante no qual o sítio Xhol do plasmídio pSK-HRPII está agora em estrutura com o sítio Xhol do vector pinf4-49, 17* Conformação da nova sequência (supres^ são da base C na extremidade 3* do HRPIl) por sequenciamento, 18, Digestão de restrição com Smal e Xhol e isolamento de um fragmento de 600 bp, 19· Clonaçâo deste fragmento de 600 bp em pinf4-49 digerido com Smal e Xhol resulta em novo vector recom-binante pOmpA-3. pOmpA-5* pUCl8-SERP que transporta o gene completo de SERP num fragmento Xbal de 5,8 kb (Knapp e outros, Mol, Biochem, Parasitol, 32 (1989), 73-84) foi digerido com Kpnl e PstI (Tab. 3), Um fragmento de 1,3 kb foi isolado e liga do nos respectivos sítios dos vectores pSK (stratagene), Reali-• zou-se a subclonação do fragmento SERP em pSK a fim de criar a

estrutura de leitura de translação correcta na extremidade 3* da região de codificação de SERP. O plasmídio pSK-SERP resultan te foi digerido com Smal e Kpnl; o fragmento de 1,3 kb foi isolado e clonado nos respectivos sítios de pHSl64-L.

p0mpA-6t As sequências de oligonucleóti-dos (l: 5·-CGACGTGCAGGAACATGTAGCCGATGCCC-3» e 2% 5»-GCAGAGTTATT AAATAAATTTGGTACCATGGCGTAGGCAATGTGTGGCGGCTTC-31) foram usadas juntamente com o plasmídio pUC8-HRPII (Knapp e outros, Behring Res. Commun. 82 (1988) 349-359) para amplificar um fragmento de 0,6 kb (Tab. 2) por intermédio de PGR de acordo com procedimentos publicados (Saiki e outros, Science 230 (1988), 1350-135*0« Este fragmento foi clonado nos sítios NsiL e Kpnl do vector pSHl64-L após digestão com PstI e Kpnl.

pQmpA-7t Dois oligodesoxinucleótidos (li 5«-AAGGGAACAAAATCTAGAGGTACCTTAGATAATTATGGG-3 * e 2* 51-CTAGTGGA TCCCGTCGACTGCAGATTCTAATGCAGTATTGCT-3 *) foram usados conjuntamente com pSK-SERP para a PCR. 0 fragmento de 1,3 kb (Tab. 3) resultante foi digerido com Xbal e Sall e clonado na estrutura entre estes sítios em pinf4-49*

Os plasmídios p0mpA-3 e pOmpA-6 resultantes codificam assim 177 ou 189 aminoácidos, respectivamente, do antigene HRPII e pOmpA-5 e p0mpA-7 codificam ambos 451 aminoáci. dos do antigene SERP. Em p0mpA-5 e p0mpA-6, as sequências parciais SERP e HRPII respectivamente, são inseridas no terceiro laço externo de OmpA e em pOmpA-3 e pOmpA-7 estes antigenes são adicionalmente "dispostos em sanduíche" pelos agrupamentos hi-drofóbicas HA no domínio do terceiro laço externo de OmpA.

Após a construção dos vectores recombinan tes, I mostrado pelo sequenciamento de ADN que os fragmentos específicos da malária se encontram em estrutura com as sequências de codificação OmpA e HA, respectivamente. 0 sequenciamento de nucleótidos no ADN de fita dupla foi realizado usando-se o protocolo da USB (Cleveland. Ohio) com base no processo da terminação de didesoxi de cadeia. Dados da sequência foram analisados e obtiveram-se mapas dos plasmídios usando a software de sequência UWGCG conforme implementado no MicroVax II (Devereaux e outros, Nucl. Acids Res. 12 (1984), 387-395)· A 12 ·

Tabela k lista estes plasmídios e pormenoriza a natureza das proteínas de fusão OmpA e os seus pesos moleculares esperados e observados por SDS-PAGE, respectivamente.

Exemplo 2

As proteínas de fusão OmpA HRPII e SERP são eficientemente expressas e expostas na superfície de Salmo-nella typhimurium.

As estirpes phi3730 de S. typhimurium (LT2-Z, leu, hsdLT, galE, trpD2, rpsL120, delta asdAl, delta £~zhf-kt Tnio/, metE551, metA22, hsdSA, hsdSB, ilv) e SR-11 (pStSR100+, gyrAl8l6, delta cya-1, delta crp-1, delta asdAl, delta r« ja-iit t TnlÒ/) transportando o plasmídio pY2^8 (estirpe de S. typhimurium phi^072 (pY248)), (Nakajama e outros, Biotechnology 6 (1988), 693-697)» foram transformadas com plasmídios de expressão OmpA a partir de B. coli por electroporação usando o BioRad Gene Pulser: A estirpe phi3730 de S. typhimurium deficiente em restrição e proficiente em modificação foi utilizada para modificar pHS 164-1» e pinf4-49, pOmpA-3» -5» -6 e -7 e, após o reisolamento dos plasmídios, estes plasmídios foram transportados na estirpe phi^072 (py248) de S. typhimurium proficiente em restrição e proficiente em modificaçãot 1 " 0 jug de ADN foi misturado com aproximadamente 2,5 x 10 células em uma cuvete, pré-arrefecida e eletroporado empregando uma intensidade de campo aproximadamente igual a 10 kV/cm durante 9 ms, A mistura de eletroporação foi diluída com 1 ml de meio de SOC (o,5# de extracto de levedura Bacto, 2$ de triptona Bacto. 10 mM de NaCl, 2,5 mM de KC1, 10 mM de MgCl2, 10 mM de MgSO^, 20 mM de glucose) e incubada durante 1 hora a 37 C em um banho sob agitação. Placaram-se alíquotas em LB-AMP carecendo de ácido diaminopimélico (DAP) e incubaram-se a 37° C, Transforman tes (ASD + AMPr) continham ambos os plasmídeos: 0 marcador ASD contido no plasmídio pY2^8 e um dos quatro plasmídios OmpA de expressão são mostrados na Tabela 4. A eficiência da transformação foi de 1 x loVpg de ADN de plasmídio (transformações do controle da estirpe ^90A de B. coli produziu 1 x 10 /pg de ADN • de plasmídio). = 13 =

Colónias únicas transformadas foram desenvolvidas em 5 ®1 do meio LB/AMP durante a noite a 37° C. 100 μΐ desta cultura foram diluídos com 5 ml do meio acima mencionado e as células foram desenvolvidas até D0g00 de 0,5 - 0,6. Λ expressão foi induzida pela adição de lmM de IPTG e as culturas foram desenvolvidas durante três horas adicionais. As células foram colectadas por centrifugação e lisadas conforme descrito (Amann e outros, Gene 69 (1988), 301-305). Os peletes finais foram analisadas por SDS-PAGE. A análise por SDS-PAGE de fracçSes da membrana de culturas de Salmonella transformada com o plasmí-dio de expressão revela e confirma o aparecimento de novas bandas de proteína com o peso molecular esperado após indução por 1PTG. Estas proteínas só estão presentes na fracção de membrana e constituem 10 - 15$ da proteína celular total.

Análise por transferência e manchamento de Western das mesmas amostras usando soro de anticorpos induzido contra os ik aminoácidos da extremidade C (acoplados como um hapteno a KLH) da OmpA ou usando antissoros de coelho monoespe-cíficos anti-SERP ou anti-HRPlI, respectivamente, provaram a i-dentidade dos produtos expressados. Além da banda principal, alguma degradação é observada. A técnica de imunofluorescência foi usada para investigar se as células de S. typhimurium apresentam os antigenes HRPII e SERP na superfície das bactérias. Para esta finalidade, centrifugaram-se 200 jul da cultura bacteriana induzida. As bactérias foram lavadas duas vezes com 300 μΐ de PBS e suspensas em 100 μΐ de PBS. 0 an tis soro anti-HRPXI ou anti--SERP foi adicionado a uma diluição de 1 t 50 e a mistura foi incubada durante a noite a 4o C, As células foram colectadas por centrifugação, lavadas conforme descrito acima e suspensas em 100 jul de PBS. IgG de cabra anticoelho marcada com PITO foi adicionada a uma diluição de 1 : 50 e a mistura incubada no escuro durante 2 h a temperatura ambiente. As células foram coletadas novamente, lavadas conforme se descreveu acima e suspensas outra vez em 50 μΐ de PBS. 10 μΐ destas amostras foram pipetados para , lâminas de microscópio recobertas com lamelas e secados a 37° C. = 14 =

As lâminas foram lavadas cuidadosamente com água destilada, secadas de novo e fixadas com Moviol. As bactérias foram visualizadas sob luz UY (300 nm) com um microscópio Zeiss e documentadas por fotografia que mostra a imunofluorescência das células que possuem OrapA-3, investigadas com um antissoro contra HRPII. As bactérias recombinantes que possuem OmpA-5, -6 e -7 mostraram intensidades semelhantes de imunofluorescência de células individuais e números semelhantes de células de imunofluo rescência positiva (aproximadamente 90$) quando investigadas com os correspondentes antissoros. Nenhuma fluorescência foi ob tida quando se ensaiaram células transportando os plasmídios vectores pHSl64-L ou pinf4-49 ou quando se ensaiaram células de E. coli expressando antigenes de HRPII ou SERP como corpos de inclusão dentro da célula. Estes estudos demonstram a expressão eficiente dos antigenes da malária na superfície de bactérias S, typhimurium transformadas.

Exemplo 3

Indução de anticorpo anti-HRPII e anti-SERP em ratos depois da imunização por via oral com estirpes de Salmonella recombinantes.

Para investigar o potencial de estirpes de Salmonella SR-11 recombinantes induzirem uma imuno-resposta hu-moral contra antigenes HRPII e SERP expressos na superfície ba£ teriana, cerca de 2 x 10^ células de bactérias induzidas por IPTG transportando os plasmídios 0mpA-3, -5» -6 ou -7 foram administradas por via oral a ratos NMRI nos dias O, 7» 1** e 21.

Os ratos foram mantidos sem alimentação durante cinco horas antes da administração. Imediatamente antes de alimentar com bactérias, foi dado oralmente aos ratos 0,1 ml de bicarbonato de sódio (3$) a fim de neutralizar o pH do estômago. Amostras de sangue de 100 μΐ foram extraídas retroorbitalmente nos dias 0, 14, 28 e 56 e os soros reunidos foram ensaiados em relação à presença de IgG e IgM específicos de HRPII e SERP (Figura 2)i chapas de ELISA revestidas com proteínas de fusão SERP- ou HRPII-MS2 derivadas de E, coli recombinante purifiçadas (5 }ig/ ) /ml, Knapp e outros, (1988), loc. cit.j Knapp e outros, (1989)» = 15 =

loc. cit.) foram incubadas durante a noite a temperatura ambien te e lavadas. Para a titulação do soro, diluiçães em série de amostras de soro foram adicionadas às chapas de ELISA e incubadas durante lha 37° C, lavadas três vezes e incubadas durante lha 37° C com 50 pl de anticorpo anti-rato POD conjugado*

Após lavagem, os anticorpos ligados foram visualizados com 50 jul de uma solução de o-fenilenodiamina/HgOg* A densidade óptica foi medida a 492 nm. A resposta de IgG contra HRPII foi mais rápida do que contra SERP (Figura 2a). Os agrupamentos hidrofóbi-cos HA que flanqueiam os antigenes HRPII e SERP quando presentes nas respectivas proteínas de fusão expressas por pOmpA-3 e pOmpA-7) não resultaram em títulos de IgG significativamente maiores. As respostas de IgM anti-HRPII e anti-SERP não mostraram qualquer diferença marcante e diminuiram após 14 dias (Figura 2b). Análises de transferência e manchamento sobre polipép-tidos de P. falciparum dos soros anti-HRPII e anti-SERP de rato obtidas após a imunização oral com estirpes de Salmonella recom-binantes mostram os antigenes correspondentes. Este ensaio demonstra que a vacinação oral de ratos com uma estirpe de vacina de Salmonella que expressa antigenes da malária na sua superfície resulta na indução de anticorpos IgG do soro específicos. 16 =

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60. . (d P 60 H O O 3 0) h3 Pi to

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A

PQ * 17 *

Tabela 2

EcoRISraal BamHI HindlIPstl gaattcccggggatccgtcgacctgcagga

CATGTAGCCGATGCCCATCATGCTCATCATGCAGCCGATGCCCATCATGCTCATCATGCA

HVAOAHHAHHAADAHHAHHA

GCCGATGCCCATCATGCTCATCATGCAGCCTATGCCCATCATGCTCATCATGCAGCCGAT

ADAHHAHHAAVAHHAHHAAD

GCCCATCATGCTCATCATGCTCACCATGCAGCCGATGCCCATCACGCTCATCATGCAGCC

AHHAHHAHHAADAH.HAHHAA

GATGCCCATCATGCTCACCATGCAGCTGATGCTCATCACGCTCATCATGCAGCCGATGCC DA H HA. HHAADAHHAHHAADA

CATCATGCTCATCATGCAGCCGATGCCCATCATGCTCACCATGCATCCGATGCTCATCAT Η Η A Η- H A-A DAHHAHHAS D A Η H

GCAGCTGATGCTCACCATGCAGCCTATGCCCATCATGCTCATCATGCTCATCATGCATCC AAD AHHAAYAHHAHHAHHAS

GATGCTCATCATGCAGCTGATGCTCACCATGCAGCTTATGCCCATCACGCTCATCATGCA D A H HAADAHHAAYAH HAHHA

GCTGATGCTCATCATGCAGCCGATGCCCATCATGCTCACCATGCAACCGATGCTCATCAC

ADAHHAADAHHAHHATDAHH . , , . . *Bal31 .

GCTCACCATGCAGCCGATGCTCACCATGCAACCGATGCTCACCATGCAGCCGCACACCAC AHH.AADAHHATDAHHAAAHH

. . , , PstI HindlII

GAAGCCGCCACACATTGCCTACGCCATTAAATTTATTTAATAActCtgcagCCaagCtt EA A THCLRH

Kpnl s= 18 =

1*01 CT^GXAAvAACíL*A^TAAAAATC^CCTATCTTXCAjysTACCJATCTCAACA7ATT0T>ACTAAATrCW>CAAATAAAACCTC*CACACAACATCATC*rcW.CA-TCATTA-rACTCrtATAT w»lCluLy*GluAtr,I,y*A*nAípv»iCytTyrX.ytTyrt.«uS»rCluA*pll«v»ls»t ly»rhtty*01uIl#Ly*Al*01uThrGluA»pA»pA«pGiuA«pA*pTyrThr01,uTyr 3í9 19 *

Tabela 3 (continuação)

JMX ACATTAAATGTATAC * 20 *

0 •H OHcd 0

Plasmídios OmpA que codificam os antigenes HRPII e SERP do -d·cd H Φ 4 0 a 73 Q q Q q <d 3 3 3 3 0 Pi P •H oo o 0\ ο 0 s H 0\ 00 Η Pt U H Η 0 Φ •P (d o Φ 73 W 73 (0 Pi 3 to d*i r·! 3 Φ 0 73 φ 0 H Ό q Ω Q 0 cd 3 3 3 S r-C 3 σ\ Mí o !>· 0 o 00 00 M0 Η to H Η Φ cd Qt_ 9 <5 & «4 s 0 o ε — ο aa aa < •a a á aa & aa 0 ta 0 H 0 ε aa M H ε o O* θ’ 04 o ta s P £3 #a ·· 8 H E aa H 03 •P — 04 H ·· 10 «a M 0 aa Pi <! 8 g < 0 » CG 3 w o a· ·· ta aa •a «· ta aa ·«$ -á *4 «4 s* 0 0 0 ε ε ε ε o o o o 0 1 d ctf a Φ «H Pi o H H Φ H H 0 H 0 W> td 04 04 0 0 •Η Φη K 8 m •P s m CG Pj * < 0 σ\ q C\ P< 1 1 tf 0 1 •3· 1 -P vo MO tf 0 <H H H Φ <0 « 3 !> •P Λ Λ •H 01 0 0 0 0 *rl r\ m V© t- d 1 1 1 1 M ◄ *4 *4 ε & 0 0 0 10 ε ε ε ε (d o o ο o H a 0 0 0 Pi a 21

Claims

REIVINDICAÇÕES — 1- — Processo para a preparação de um vector de expressão recorabinante que compreende os seguintes componentes: (a) um promotor indutível forte; (b) um gene híbrido que codifica uma proteína híbrida OmpA de bactérias gram-negativas; e (c) um sítio de clonação localizado na parte do gene OmpA correspondente ao terceiro laço externo da proteína OmpA, caracterizado por se inserir uma sequência de ADN (d) no sítio de clonação de (c) que codifica os antigenes HRPII ou SERP da malária ou uma parte dos mesmos que é capaz de induzir uma resposta imune humoral em um mamífero, sendo os referidos antigenes da malária preferivelmente derivados de Plasmodium falciparum.
- 2» - Processo para a preparação de um vector de expressão recombinantey de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por adicionalmente se inserir no referido sítio de cio nação (c), uma sequência de ADN (e) que codifica os aminoácidos 1 a 48 e 279 a 515 da proteína de hemaglutinina (HA) de gripe, contendo um primeiro sítio de clonação em uma posição que codifica o aminoácido k6 da proteína HA e o segundo sítio de clonação em uma posição que codifica o aminoácido 400 da proteína HA, sendo a mencionada sequência de ADN (d) inserida em pelo menos um dos citados sítios de clonação da sequência de ADN (e).
- 3? - Processo para a preparação de um vector de expressão recombinante, de acordo com as reivindicaçSes 1 ou 2, caracterizado pelo facto de a referida parte de HRPII consistir nos I89 aminoácidos contidos no vector de expressão recombinante pOmpA-6 que possui o mapa de restrição indicado na seguhte Tabela I 22 =

Ρ (Φ Η Λ C5 W) Ρ Φ Ο μ Η Ο XI Ο Μ α> Η Φ i n & Α Μ ◄ CÍJ ρ r-f tíJ ο >« ο η ϋ ζϋ ο ο φ ΡΟΗ Α Ο Φ S Α Ο 03 η <| <3{ φ Η Η Ο Η Ρ Η Ρ ί> φ 03 Α ο « (0 <ί cn «! ο Ρ (φ Ρ ο φ •Ρ φ φ 0 0) <! 0 Ρ Η Η Φ «φ (φ Η Ρ 1¾ Η «! % !» Φ •ρ· 03 • Η φ • Φ ο • ω L« § • • ί ο Η ◄ Ρ !Ρ {4 ο S X Q 03 Α Η <! χι Η Η Η Ρ 1Λ Η Φ α ν\ Φ Ο W • αι Η • •Η «ί Η • Μ Ο 0 • 0 U Ο »2! φ Ο XI ϋ Η Ρ Η <1 Η ◄ Ρ Φ η ο Φ ρ Η δ Η 03 Η Η ο ξ*ι •Η Ρ « +> ρ 03 φ «! 5¾ Φ Éj Η Η s <! Η <! η Ό Η Η U Ο 1 ω •Η
4 STH Ο •μ Φ Η •Η <0 S5 Φ Ό & 3 81-1 ο Η «< Ρ Η ί> Ο Ρ (Φ (Φ <! Φ 0 Η Ρ Φ 03 •Ρ Ρ <! <! Ρ Η Η <0 Ο Ρ η Ρ >» Ρ φ ο Λ 4 (φ 01 Ρ ΙΛ Η ί-ι Ο 1 (φ Η μ) mη a 23 = Ι».«ηΑ«ΜΜΙΙ*^ Processo pera a preparação de ^ vector de expressão recombinante de acordo com as reivindicações X ou 2, caracterizado pelo facto de a parte de HRPII consistir nos 177 aminoácidos contidos no vector de expressão recombinante pOmpA-3 que possui o mapa de restrição representado na Figura 1 seguinte*