JPS63295599A - 蛋白質及びその製法、ｄｎａ配列、抗体及びその用途、ポックスウイルス、形質転換又は感染された細胞、住血吸虫症予防剤及びグルタチオン　ｓ−トランスフェラ−ゼ活性薬剤としての用途 - Google Patents

蛋白質及びその製法、ｄｎａ配列、抗体及びその用途、ポックスウイルス、形質転換又は感染された細胞、住血吸虫症予防剤及びグルタチオン　ｓ−トランスフェラ−ゼ活性薬剤としての用途

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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、住血吸虫症に対するワクチンの開発に関する
。
住血吸虫症（又はピルハルチア病）は、北米を除く世界
の熱帯又は亜熱帯地域の寄生虫病であるが、今や化アフ
リカにも広がりつつある。その実質的感染源はエジプト
にあり、スペイン及びポルトガルにある数種の感染源に
も注意が向けられている。
この病気は、２億から４億のヒトを冒す。原因寄生虫で
ある住血吸虫は小さな偏平な形の虫で、その複雑な生活
環は、淡水軟体動物の中間宿主を必要とする。この理由
で、この病気は、熱帯地方の開発を目的として計画され
たダムや潅厩ネットワークの建設に伴い広がっている。
ヒトの病因となる住血吸虫は５種のタイプが知られてい
る。即ち、最も広域なのが、マンソン住血吸虫（Ｓ、　
、ｍａｎｓｏｎｉ　）でアフリカ及びアメリカで見出さ
れ、ビルハルツ住血吸虫（Ｓ。
ｈａｅｍｏｔｏｂｉｕｍ　）及びニス　インターカラダ
ム（Ｓ。
ｉｎｔｅｒｃａｌａｔｕｍ）はアフリカでのみ見出され
、他の２種の日本住血吸虫（Ｓ、　ｊａｐｏｎｉｃｕｍ
　）及びエスメコンギ（Ｓ、　ｍｅｋｏｎｇｉ　）はア
ジアで見られる。
この寄生虫の生活環を知ることは、この病気の予防法を
開発する上で必要である。
事実、住血吸虫は、宿主の自然防御にほぼ完全な適応を
する。即ち、成虫に達すると、免疫機構を完全に回避し
、腸管壁又は膀胱に近接する血管中で、種類に応じて（
マンソン住血吸虫又はとルハルツ住血吸虫）、５〜１０
年生存する。この寄生虫はヒトの中で増殖しないが、メ
スは１日に最大３０００個の卵を産む。これらの卵及び
代謝排泄物は、宿主の循環器に現われ、種々の障害（消
化管及び尿管障害、無力症、貧血、組織線維症を起こす
毛細血管の閉塞を伴う肉芽腫形成及び特に、重篤な肝炎
）をもたらす。
虫卵は鯨をもち、腸管壁や膀胱壁を通過して、微小病変
を起こし、排泄される。卵が速やかに水と接触する場合
、幼虫、即ちミラキジラム（ｍｉｒａｃｉｄｉｕｍ）が
生まれ、軟体動物（中間宿主）に入り込むまで泳ぐ。中
間宿主中で、ミラキジラムは無性増殖し、セル力リア（
ｃｅｒｃａｒｉａ）になりセルカリアは水中に遊出する
。１匹のミラキジラムで感染された軟体動物は８〜１０
力月の存命中５００００以上のセルカリアを生産する。
セル力リアは泳幼虫で、１〜２日間のみ生きる。
セル力リアが哺乳類、特にヒトに接触する場合、皮膚を
貫通して入り込む。皮膚内で、スキストツムラム（ｓｃ
ｈｉｓｔｏｓｏｍｕｌｕｍ）という住血吸虫の未熟体と
なり、血液循環内、次いで、心臓、肺、最後に肝臓に運
ばれる。これが成虫になるのは肝内である。雌雄異体で
、雌は雄虫内でヒダを作って形成された抱雌管に入り、
ベアーで、雌が産卵を開始する場所である腹部血管内に
永久に住む。
スキストツムラムの成虫への完全な成熟は、約１５日間
かかる。成虫になると、住血吸虫は、吸着により得た宿
主の分子をその表皮上に有し、この偽装により宿主の免
疫認識及び防御機構を回避する。更に、この寄生虫は免
疫抑制能を有する物質を分泌する。このように保護され
て、住血吸虫の各ペアーは、毎日数千の卵を産卵しなが
ら、長年に亘り宿主に寄生する。
該寄生虫の成虫に有効である薬物は、ブラシカンチル（
ｐｒａｚｌｑｕａｎｔｅｌ）という名で存在するが、開
発途上国で予想される広範囲の使用には高価でありすぎ
、再感染を防ぐことができない。事実、流行感染地域で
は、住民は幼虫で汚染された水に常に接触している。
住血吸虫症を予防する唯一の有望な見込みは、該寄生虫
の未熟体、即ちスキストツムラムに有効なワクチンの開
発にある。このワクチンは、初期感染を避けるために幼
児に投与されたり、再感染を防ぐためにブラシカンチル
投与後の既に感染した者にも投与され得る。
該ワクチンは、スキストツムラムの主要抗原を１つ以上
含有し、幼虫が宿主の防御機構を回避する前に、幼虫に
対して有効な免疫反応を発現する。
最近の研究（カプロン（Ｃａｐｒｏｎ　）及びデセント
（Ｄｅｓｓａｉｎｔ　）によるレヴユー記事、１９８５
）で、該寄生虫及びその幼虫の表面にあるわずかな数の
蛋白抗原の同定を可能にした。該抗原は免疫応答の発現
に重要な役割を果たす。
これらの抗原の１つがバロール（Ｂ　ａｔ　１ｏｕｔ）
等（１９８５）により公表されている。即ち、ゲル上で
精製したマンソン住血吸虫の抽出物でラットを免疫化後
、発現抗体は、該寄生虫の成虫及び幼虫に存在する２８
−ｋｄの抗原（以下ｒｐ２８Ｊと称する）を認識する。
同抗体は、成寄生虫から抽出したｍ　ＲＮ　Ａの生体外
の翻訳による産物及びスキストツムラムの外部蛋白の１
つを認識する。
該蛋白は１２５工で標識され、同定される。
抗ｐ２８抗体は、それ自身スキストツムラムを無効にす
ることはできないが、スキストツムラムを死滅させる細
胞毒性反応を活性化する。
ラット及びマウスに精製したｐ２８蛋白の試料を接種し
た。免疫化された動物はスキストツムラムによる実験的
感染に高い防御を獲得した（バロール（Ｂ　ａｌ　１ｏ
ｕｌ）等、１９８６）。
この一連の観察は、防御免疫応答の発現におけるｐ２８
抗原の重要性を示唆するものである。
本発明は、ｐ２８抗原又は、少なくとも、天然ｐ２８蛋
白質に対抗して生産された抗体により認識されるｐ２８
のエピトープを含むポリペプチドをコードするｃＤＮＡ
配列の同定及び決定に関する。
従って、本発明はまず、第１図に示される如き、成熟ｐ
２８蛋白質をコードするＤＮＡ配列に関する。
また本発明は、その合成が該ｃＤＮＡにより指示（ｄｉ
ｒｅｃｔ）される蛋白質、ｃＤＮＡが挿入されるベクタ
ーによって異なる宿主細胞（バクテリア、酵母又はもっ
と高度の細胞）で行われる合成及び蛋白の下に位置する
発現制御シグナルに関する。
本発明の蛋白質は、スキストツムラム中に存在する天然
ｐ２８蛋白の一次構造と同一の一次構造を有することが
できるが、天然ｐ２８蛋白質の誘導体、又は、不完全体
だが、抗体による認識−即ち免疫発現に重要なエピトー
プを含むｐ２８蛋白質であることもできる。更に、該蛋
白質又はその不完全蛋白質は、宿主細胞における蛋白質
の発現を改善し、更に細胞外に適当に排泄されるように
作成された対応するＤＮＡ断片の遺伝的操作の結果、他
の蛋白質（又は蛋白質フラグメント）に融合させること
もできる。
外来遺伝子をクローン化し、異なる宿主細胞で発現させ
る方法による技術は、この分野では既知のものである。
該技術については下記の実施例で述べるが、他のベクタ
ー及び宿主を用いても良い。
バクテリア、特に大腸菌中でのｐ２８に対応する遺伝子
の発現は、λＰＬプロモーター及びリポソーム結合部位
としてのｃＩＩｒｂｓを有するベクターにより得られた
。得られたハイブリッド蛋白質はｃＩＩ蛋白質の一部及
びｐ２８蛋白質又はその一部を含む。
宿主がニス　セレヴイシアエ（Ｓ　、　ｃｅｒｅｖｉｓ
ｉａｅ）等の酵母である場合、２μプラスミドの複製起
点等の酵母中の機能的複製起点及びＵＲＡ３等の選択遺
伝子（ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ　ｇｅｎｅ）を有する酵母用
のプラスミドベクターを用いることができる。本発明の
場合、用いられたプロモーターは、融合蛋白質又は成熟
蛋白質になるＰＧＫ遺伝子の５′部分を持つＰＧＫ遺伝
子のプロモーターである。
最後に、宿主が哺乳類の細胞である場合、ワクシニアラ
イスル（ｖａｃｃｌｎｉａ　ｖｉｒｕｓ）等のポックス
ウィルス（ｐｏｘｖｉｒｕｓ）　　（該ポックスウィル
スにおいて本発明の蛋白質をコードする遺伝子はポック
スウィルスによる該遺伝子の発現のための配列の制御下
に置かれる）が、発現ベクターとして好ましく用いられ
る。この組換えウィルスは、本発明の蛋白質をコードす
る遺伝子を有し、該遺伝子は、好ましくは、ワクシニア
の７．５Ｋ蛋白質プロモーター等の強力なプロモーター
の支配下に、ワクシニア（ｖａｃｃｉｎｉａ）のＴＫ遺
伝子中に挿入される。
本発明の蛋白質をコードする遺伝子は、細胞外への該蛋
白質の分泌のために、インターロイキン−２−又は狂犬
病糖蛋白質をコードするシグナル配列等の機能的シグナ
ル配列をコードする領域に融合されても良い。この場合
、対応する蛋白質は、スキストツムラムに由来しない蛋
白質の一部を含有するハイブリッド蛋白質である。
又、本発明の蛋白質をコードする遺伝子は、感染細胞の
細胞膜中の蛋白質の固定（ａｎｃｈｏｒｉｎｇ　）をさ
せるために、狂犬病ウィルス糖蛋白質のトランスメンブ
レン領域をコードする領域に融合しても良い。
更に、本発明は、本発明の蛋白質の発現ベクターにより
形質転換された宿主細胞及び、これら宿主細胞を培養し
、本発明の蛋白質を回収することを特徴とする該蛋白質
の製造方法に関する。
培養法及び蛋白質の回収・分離法は、宿主により明白に
異なるが、いずれも当業者に公知の技術である。
加えて、本発明は、住血吸虫症に対するワクチンとして
有用な製剤に関する。該ワクチンは、本発明の蛋白質又
はポックスウィルスを少くとも１つ含有し、薬剤学的に
許容できる賦形剤を有する。
特に、本発明は、生ワクチンに関し、該ワクチンは本発
明・の蛋白質を発現する組換え生ワクシニアウィルス（
ｖａｃｃｉｎｉａ　ｖｉｒｕｓ）を有し、薬剤学的に許
容できる賦形剤を含有する。
これらワクチンは、注射剤等の投与形態にすることが好
ましい。注射剤の場合、薬剤学的に許容できる賦形剤は
水性賦形剤である。
種痘方法は使用ワクチン（蛋白質又は生ウィルス）のタ
イプにより適宜選択すればよい。
また、本発明は、本発明の蛋白質に対して生じる抗血清
にも関する。
本発明は、組換えｐ２８蛋白質（又はｐ２８Ｉ）がグル
タチオン　Ｓ−トランスフェラーゼ活性を有することを
示すものでもある。
グルタチオン　Ｓ−トランスフェラーゼは、広範囲に分
布した酵素で、動植物に存在し、種々の分子（疎水性求
電子性化合物、内因性超酸化物、アルキル化剤、除草剤
等）の解毒に役立つものである。
スミス（Ｓ　ｍ１ｔｈ）等の研究（１９８６）で、日本
住血吸虫は、感染した宿主の免疫のエフェクターである
細胞により産生された遊離ラジカルから該寄生虫を保護
する役割を担うグルタチオン　Ｓ−トランスフェラーゼ
を合成することが示されている。
本発明は、特に、マンソン住血吸虫由来であり、大腸菌
（Ｅ、　ｃｏｌｔ）又はニス　セレヴイシアエ中で合成
され、且つそのワクチン抗原としての価値が上記のよう
に示されているｐ２８蛋白質が、グルタチオン　Ｓ−ト
ランスフェラーゼ活性を有することを示すものである。
更に詳しくは、本発明は、ｐ２８蛋白のような蛋白質を
、グルタチオン　Ｓ−トランスフェラーゼ活性を有する
薬剤として適用することに関する。
本発明は、上記の蛋白質発現ブロックにより形質転換又
は感染された細胞を、グルタチオン　Ｓ−トランスフェ
ラーゼ活性を持つ薬剤として適用することに関する。
該蛋白質及び該細胞は、グルタチオン　ｓ−トランスフ
ェラーゼ活性を用いた微生物学的転換方法における転換
剤（ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ　ａｇｅｎｔ）として用いる
ことができる。
本発明は、天然ｐ２８蛋白質に対抗して生じた抗体によ
り認識される第二のｐ２８蛋白質をコードするｃＤＮＡ
配列の同定及び決定を含む。
事実、本発明は、第１６図に示される成熟ｐ・２８■蛋
白質をコードするＤＮＡ配列に関する。
又、本発明は、その合成が該ｃＤＮＡ又はその一部によ
り支配される蛋白であって、且つ、天然ｐ２８蛋白質に
対抗した生じた抗体により認識される蛋白質にも関する
。
本発明は、上記の成熟ｐ２８ＩＩ蛋白質又はその断片を
コードするｃＤＮＡを組み込む細胞にも関する。
下記実施例中、該蛋白質は、バクテリア、即ち大腸菌で
のみ発現されているが、その合成は前記したように、ｃ
ＤＮＡが挿入されるベクターに応じて、バクテリア、酵
母又はより高度な細胞等の種々の宿主細胞中で達成され
ても良い。
ｐ２８ＩＩに対応する遺伝子の発現は、λＰＬプロモー
ター及びｃＩＩｒｂｓリポソーム結合部位を含む上記の
ベクターにより得られた。
本発明は、上記の細胞を培養することによる該蛋白質の
製造にも関する。
最後に、本発明は、活性薬物として上記の蛋白質を少く
とも１種含有する住血吸虫症の治療又は予防用製剤に関
する。
もちろん、ｃＤＮＡをワクシニア等のポックスウィルス
に組み込む場合、このポックスウィルスを種痘薬剤とし
て直接用いて良い場合もある。
これら蛋白質に対抗する抗体を生産することも可能であ
る。これらの抗体及び蛋白質は、住血吸虫症の診断薬と
して用いることができる。
本発明中で、図中に示される遺伝子のヌクレオチド配列
又は蛋白質のアミノ酸配列については再述しないが、本
発明の一部分である。
下記の実施例は、本発明の他の特性及び長所について説
明する。
説明は添付の図面を用いて行う。
実施例１ ｐ２８蛋白質をコードするｃＤＮＡの同定及びクローニ
ング 配列不明のｐ２８抗原をコードする遺伝子をクローニン
グするために選ばれた方法は、ｐ２８に対し特異的に生
成したポリクローナル抗体を用いて、住血吸虫ｃＤＮＡ
ライブラリーの大腸ａ　（Ｅ。
ｃｏｌｔ）中での発現産物を同定するものである。上記
抗体は、成虫のマンソン住血吸虫の抽出物（ゲル上で分
画された）でウサギ及びラットを免疫化することにより
得られたものである。
ｃＤＮＡライブラリーの調製 成虫の住血吸虫から抽出されたＲＮＡから、ＭＬＶ逆転
写酵素を作用させて、相補的ＤＮＡ鎖を合成する。この
ＤＮＡをコリ（ｃｏｌｔ）ポリメラーゼのフレノウ（Ｋ
ｌｅｎｏｗ）フラグメントを作用させて二本鎖とし、次
いでＳ１ヌクレアーゼで処理してその末端を平滑末端と
する。所望のサイズ、即ち、５００〜４０００ｂｐに対
応するフラグメントを、スクロースグレーディエンド上
で選択する。ｄＧ残渣の尾部（テイル、ｔａｉｌ）を、
これらフラグメントに加え、それらを合成アダプター５
’　−ＡＡＴＴＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣＣ−３’　　（ル
　ボウク（Ｌｅ　　Ｂｏｕｃ）ら、１９８６）を介して
、ファージλの誘導体ｇｔｌｏ（フィン（Ｈｕｙｎｈ）
　、１９８４）のＥｃｏＲＩサイトに挿入する６リゲー
シヨン後、組換えファージをイン・ビトロでパッケージ
する。こうして得られる２×１０６フアージのライブラ
リーを、次いで、イー。
コリ　（Ｅ、　ｃｏｌｔ）　ＰＯＰ　　１０１　　（ラ
セ（Ｌａｔｈｅ）　、１９７７）中へ接種することによ
り増幅（ａｍｐｌｉｆｙ　）する。
増幅後、ファージをＰＥＧで濃縮し、ＣｓＣＩ２グレー
ディエンド遠心分離２回により精製し、そのＤＮＡを抽
出する。ｃＤＮＡ挿入物を、ＥｃｏＲＩで消化すること
により回収し、スクロースグレーディエンド上で精製す
る。次いで、５００〜２０００ｂｐのフラクションを、
該ｃＤＮＡとイー。
コリ（Ｅ、　ｃｏｌｌ）のβ−ガラクトシダーゼ遺伝子
との融合（ヤング（Ｙ　ｏｕｎｇ）及びデービス（Ｄａ
ｖｉｓ）　、１９８３）後、ｌａｃプロモーターの制御
下に外来遺伝子の発現を可能とする発現ベクター、即ち
、ファージλ誘導体ｇｔｌｌ中へ挿入する。
ライブラリーのスクリーニング及び候補の選択λ　ｇｔ
ｌｌ中のこのライブラリーのサンプルを、大腸菌Ｙ１０
９０　（ヤング（Ｙ　ｏｕｎｇ）及びデービス（Ｄａｖ
ｉｓ）　、１９８３）中に、直径９０ａｖ＋のディツシ
ュ当り、Ｉ　Ｘ　１０’フアージに相当する希釈度で、
接種する。
ｌａｃプロモーターの制御下での蛋白質の発現の誘導（
ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ　）が、イソプロピル−β−Ｄ−チ
オガラクトピラノシドの存在下４２℃にて惹起される。
合成された蛋白質をニトロセルロースフィルター上に吸
着させて、ｐ２８に特異的なうさぎの抗　一体の存在下
にインキュベートする。結合した抗体を、第二のビオチ
ン−標識化抗うさぎ抗体で認識させ、得られた複合体を
、ストレプトアビジン（ｓｔｒｅｐｔａｖｉｄｉｎ）−
パーオキシダーゼ反応及び引続（ＨＲＰ（ホースラディ
ツシュ　パーオキシダーゼ、バイオ−ラド（Ｂｉｏ−Ｒ
ａｄ）社）で染色することにより顕現化する。
この抗体による検出により、上記ｃＤＮＡ挿入物が、特
異的抗−ｐ２８抗体により認識されるエピトープ（複数
）を含む蛋白質又は蛋白質フラクションの合成を指令（
ｄｉｒｅｃｔ）　している組換えファージが同定できる
。
最初の選択により３つの独立した単離物、即ち、λ　Ｔ
ＧＯ６、λ　ＴＧＯ８及びλ　ＴＧＯ９が得られ、これ
らは、夫々、６５０．７５０及び３５０塩基対のｃＤＮ
Ａ挿入物を含んでいる。
これら候補により保有される挿入物のヌクレオチド配列
は、重複しており、２８ｋｄの分子量を有する仮説上（
ｈｙｐｏｔｈｅｔｉｃａｌ）の蛋白質のＣ−末端領域に
対応するかも知れない領域を含んでいる。
λ　ＴＧＯ６の挿入物のコーディング領域の５′端に相
補的な３２　ｐ−標識化合成ヌクレオチド５’−ＧＧＡ
ＡＴＡＧＴＴＧＧＴＴＴＧＡＴＴ−３’を合成し、λｇ
ｔｌＯ中のｃＤＮＡライブラリーの新たなスクリーニン
グに用いた。
こうして、二つの新たな候補、即ち、λ　ＴＧｌｏ及び
λ　ＴＧｌｌを単離することができた。
これらは、いずれも、２８ｋｄの分子量に相当する、２
１１個のアミノ酸からなる蛋白質をコードする完全なヌ
クレオチド配列を含むものである。
完全なｃＤＮＡ配列（異なる複数の候補について配列を
決定することにより確認）及びそれから生じる一次アミ
ノ酸構造（ｐｒｉｍａｒｙ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓｔ
ｒｕｃｔｕｒｅ）を第１図に示す。
この結果及び現在刊行されている研究は、天然遺伝子の
翻訳の最初の産物（ｉｎｉｔｉａｌ　ｐｒｏｄｕｅｔ　
）のＮ−末端配列についても、また、成熟蛋白質（ｍａ
ｔｕｒｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ）の前のシグナルペプチド及
びプリカーサ−（ｐｒｅｃｕｒｓｏｒ　）の存在可能性
についても、何らの情報をも与えない。
しかし、本発明においては、最初のアミノ酸の正確な位
置決定（１ｏｃａｌ　１ｓａｔｉｏｎ）は必須ではない
。
なぜなら、この遺伝子の単離及びその発現について採用
される戦略は、ｐ２８に存在し、宿主の免疫系により認
識される主たるエピトープ（複数）を捜すことにあるか
らである。
この理由が、各種微生物中での主たるエピトープの発現
について記載する以下の実施例においても用いられる。
ｐ２８抗原の発現 ｐ２８中に存在する抗原性エピトープの発現について開
発された一般的戦略は、正確なリーディング−フレーム
中のクローン化されたｃＤＮＡフラグメントを、効率良
く発現され、良く解明された蛋白質のＮ−末端領域をコ
ードするヌクレオチド配列に融合させるものであった。
こうして得られるハイブリッド蛋白質は、一般に、天然
の成熟ｐ２８に対して生じる抗体により認識され、寄生
虫に対し免疫応答を誘発すると期待できる。この仮説に
従い、各種宿主システムを用いて、上記融合蛋白質の免
疫原的特性を、イン・ビボ及びイン・ビトロで分析する
。これを、以下の実施例に示す。
実施例２ 大腸菌（Ｅ、　ｃｏｉｌ）中での発現 大腸菌中でのｐ２８抗原の発現を得るために、フランス
国特許出願８３１００，９０９号に記載の発現プラスミ
ドｐＴＧ９０８の誘導体を用いて、融合蛋白質を合成し
た。その構造を第３図に示す。
ベクターｐＴＧ９０８は、複製起源、バクテリオファー
ジλのＰ　ブロモ°−ター及び翻訳開始シグナルから下
流の適当な制限部位を有するｃＩＩ遺伝子のＮ−末端を
含むｃＩＩリポソーム結合配列を含む。ＡＴＧコドンか
ら３９ｂｐ下流のＢａｍＨＩ部位は、下記オリゴマー ５’　−ｄＧＡＴｃｃＧＡＡＴＴｃＧ　−３’３’　−
ＧＣＴＴＡＡＧＣＣＴＡＧｄ−５’を含有する二本鎖ア
ダプターによりＥｃｏＲＩ部位を挿入するのに用いた。
得られたプラスミドｐＴＧ１９２４は、ｃＩＩ遺伝子の
開始コドンと相の合ったＧＡＡコドンを有する単−Ｅｃ
ｏＲＩ部位を含む。抗−ｐ２８血清を用いて選択後ポジ
ティブなシグナルを与えたλｇｔ１１組換え体由来のｃ
ＤＮＡ挿入物の全てを、直接この部位に挿入した。挿入
物が正しいオリエンテーションで存在する場合、ｃＩＩ
遺伝子のＮ−末端をコードし、ｐ２８抗原又はその一部
をコードするｃＤＮＡ配列と相の合った状態で続くヌク
レオチド配列を与える。
得られたプラスミド構築物の一つｐＴＧ４４は、このＥ
ｃｏＲＩ部位中にλ　ＴＧ０６由来のフラグメントを含
んでおり、第２図に示されている。ＣＩＩ／ｐ２８融合
蛋白質の配列は、分子量２５ｋｄの計算値を有し、第３
図に示されている。
ｐＴＧ４４で形質転換された大腸菌Ｎ４８３０の培養物
を、ＬＢ培地上ＯＤ６００が０．２となるまで増殖させ
、次いで上記融合蛋白質の合成を温度を４２℃に８時間
上昇することにより誘発させる。
培養終了後、細胞抽出物をクーマシープル−（Ｃｏｏｍ
ａｓｓｉｅ　ｂｌｕｅ　）で染色することにより５ＤＳ
−アクリルアミドゲル上で分析した（第４図）。
ｃＩＩ／ｐ２８融合産物は、音波処理による細胞溶解後
に得られる不溶性フラクション中に回収される。該蛋白
質は、該不溶性フラクションを０．２％ＳＤＳ存在下で
抽出することにより、８０％のオーダーの純度で回収さ
れる。この最終調製物を“ウェスタン　プロッティング
（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ　）”法により分析
したところ、この特定の蛋白質は、天然のｐ２８抗原に
対して生じるうさぎ抗体により効率よく認識されること
が認められた（第５図）。
実施例３ イースト中でｐ２８ｃＤＮＡを発現させるべく、２種の
構築を行なった。即ち、第一の構築により、Ｎ−末端側
に、イーストのホスフォグリセレートキナーゼ（ＰＧＫ
）の最初の２２個のアミノ酸を含有する融合蛋白質が得
られ、第二の構築により、天然の成熟蛋白質に類似の蛋
白質が得られる。
８６）の構築 ＩＬｐ２８蛋白質のｃＤＮＡを含むλ　ＴＧｌｏのＥｃ
ｏＲＩ挿入物を、コリ（ｃｏｌｔ）　／イーストシャト
ルプラスミドｐＴＧ８３６中へ導入した。
Ｑこのプラスミドは、イーストの２−ミクロンプラスミ
ドの複製起源、ＵＲＡ３遺伝子（フランス国特許第８４
／１２，５９８号）及びイーストのＰＧＫ遺伝子（ヒッ
ツエマン （Ｈｉ　ｔｚｅｍａｎｎ）ら、１９８２）を含むｐＢＲ
３２２の誘導体である。
ＯＢａｍＨＩ部位（ＰＧＫ開始コドンから２０コドン下
流に位置する）と５ａｌＩ部位（ｐＢＲ３２２配列中に
存在する）との間に、合成アダプター　二 ５’　−ＧＡＴＣＴＧＡＡＴＴＣＡＧＡＴＣＴＣ−３’
３’　−ＡＣＴＴＡＡＧＴＣＴＡＧＡＧＡＧＣＴ−５’
を挿入することにより、単−ＥｃｏＲＩ部位を導入する
。得られたプラスミドは、ｐＴＧ１８８０である。
ｏｐＴＧ１８８０のＥｃｏＲＩ部位にλ　ＴＧｌｏのＥ
ｃｏＲＩフラグメントを、正しいオリエンタージョンで
挿入すると、ｐＴＧ１８８３が得られる。
２）このプラスミドにより保有されるＰ　Ｇ　Ｋ　／　
ｐ２８発現ブロックを、回収し、イースト用の発現ベク
ターｐＴＧ８４８　（フランス国特許第８５１０６．６
７２号）中に挿入する。これには、中間的にファージＭ
１３中での操作 （ｍａｎｉｐｕｌａｔｌｏｎ）を必要とする：ｏＰＧＫ
／ｐ２８発現ブロックを含むＨｉｎｄｍ−ＢｇｌＩ［フ
ラグメントを、Ｍ１３７Ｇ１３１　（キーニー　（Ｋｉ
ｅｎｙ）ら、１９８３）のＨ１ｎｄｍ部位とＢａｍＨＩ
部位との間に挿入し、Ｍ１３７０１８８４を得る。
０近傍に制限部位が存在する結果、この構築により、同
発現ブロックは、ＳｍａＩ−８ｇｌｌｌフラグメントと
して回収される。
Ｏこのフラグメントを、次いで、発現ベクターｐＴＧ８
４８のＳｍａＩ部位とＢｇｌＩ［部位との間に導入する
。
０得られるプラスミドは、ｐＴ０１８８６である。
３）このプラスミドｐＴＧ１８８６で、イーストＴＧＹ
１ｓｐ４を形質転換した。
これら培養物の粗細胞抽出物を、５ＤＳ−アクリルアミ
ドゲル上の電気泳動及び“ウェスタンプロット”法によ
り分析した。第５図及び第６図は、Ｐ　Ｇ　Ｋ　／　ｐ
　２８融合蛋白質について予想され、住血吸虫から抽出
された天然型ｐ２８に対し生じる抗体により認識される
分子量３０ｋｄの新たな蛋白質のバンドが出現したこと
を明瞭に示す。
１）上記Ｍ１３７０１８８４の構築において、ｐ２８蛋
白質の開始コドンの前に、ＰＧＫ遺伝子の最初の２２コ
ドン及びクローニングテクニックによる８コドン（特に
ｄＣレジデユー）を設ける。
これら、９０の付加的な塩基対を、ｐ２８コーディング
配列の最初のヌクレオチドが続＜ＰＧＫｍＲＮＡリーダ
ー配列（ｌｅａｄｅｒ　５ｅｑｕｅｎｃｅ　）の最初の
１６ヌクレオチドに対応するオリゴヌクレオチド： ５’　−ＣＡＡＣＡＡＡＡＴＡＴＡＡＡＣＡ社悼ＣＴＧ
ＧＣＧＡＧＣＡＴＡＴＣ−３’の存在下、一本鎖Ｍ１３
７Ｇ１８８４のインビトロでの突然変異誘発により欠失
させた。上記２つの配列間には、ＰＧＫの開始ＡＴＧ及
びｐ２８のそれと一致（ｃｏｔ　ｎｃｌｄｅ）するＡＴ
Ｇがある。
２）正確に欠失された誘導体Ｍ１３７Ｇ１８８４ｍを、
ＳｍａＩ及びＢ　ＩｇＩＩで消化し、ＰＧＫプロモータ
ーの制御下に置かれた非融合ｐ２８ｃＤＮＡを含有する
フラグメントを、上記発現ベクターｐＴＧ８４８中に挿
入し、ｐＴ０１８８５を得た。
３）イーストＴ　Ｇ　Ｙ　１　ｓｐ４を、このプラスミ
ドｐＴＧ１８８５で形質転換した。
これらの培養物の粗細胞抽出物を、５ＤＳ−アクリルア
ミドゲル上の電気泳動及び“ウェスタンプロット”法に
より分析した。第５図及び第６図から明らかなように、
分子ｆｆ１２８ｋｄを有する新たな蛋白質バンドが出現
し、これが住血吸虫から抽出された天然のｐ２８に対し
生成した抗体により認識されることが判る。
実施例４ 組換えワクシニアウィルス中での発現 ａ）ＩＬ−２の最初のアミノ酸（複数）に融合されたｐ
２８を発現する組換えワクシニアウィルスの構築。
ファージλ　ＴＧＯ６及びＴＧＯ９が有するＣＤＮＡを
適当なベクターに導入した。次いでこれをワクシニアウ
ィルスのゲノム中に挿入し、哺乳類細胞中で発現させる
。
本発明のベクターは、ヒトインターロイキン−２の発現
に用いられたベクター由来のものである（フランス国特
許第８５１０９，４８０号参照）。
ｐＴＧ１８８の誘導体をこうして構築した。これは、天
然のインターロイキン−２のＮ−末端アラニン残基から
下流の９アミノ酸に対応するヌクレオチド配列の領域中
にＥｃｏＲＩ部位を含んでいる（第７図）。λ　ＴＧＯ
６及びλ　ＴＧＯ９のＣＤＮＡ挿入片をｐＴＧ１８８−
１の両ＥｃｏＲＩ部位間に正しいオリエンテーションで
挿入し、プラスミドｐＴＧ４５及びｐＴＧ４６を得た。
第９図及び第１０図に示すように、これらプラスミドは
、夫々、２４ｋｄ及び１６ｋｄの分子盆を有するＩＬ−
２／ｐ２８融合蛋白質をコードするものである（第８図
）。構築物から上流のシグナルペプチドの存在により、
蛋白質が培養培地中に分泌される。
プラスミドｐＴＧ４５及びｐＴＧ４６の主要部分は、Ｉ
Ｌ−２／ｐ２８融合蛋白質をコードする配列で中断され
たＴＫウィルス遺伝子を含んでいる。該配列は、効率的
なプロモーター即ち、７．５Ｋワクシニア蛋白質のため
のプロモーターの制御下に置かれている。
ワクシニアのＴＫ遺伝子中に挿入されたこれら配列は、
既知の方法（パニカリ（Ｐ　ａｎｌｃａｌ　１１）及び
パオレッティ（Ｐａｏｌｅｔｔｉ　）　、１９８２　；
マケット（Ｍａｃｋｅｔｔ）ら、１９８２．キーニー（
Ｋ　１ｅｎｙ）ら、１９８４）に従い、二重相互組換え
（ｄｏｕｂｌｅ　ｒｅｃｉｐｒｏｃａｌ　ｒｅｃｏｍｂ
ｉｎａｔｉｏｎ　）　　（第１１図）により、ワクシニ
アウィルスのゲノム中に移動することができる。
夫々λ　ＴＧＯ６及びλ　ＴＧＯ９由来のｃＤＮＡを含
む組換えウィルスＶＶ、ＴＧ、ｐ２８ｓｍ−１及びＶＶ
、ＴＧ、ｐ２８Ｓｍ−２を、単層（ｍｏｎｏｌａｙｅｒ
　）のＢＨＫ２１細胞を感染するのに用いる。３７℃で
２４時間後、培養上清を試験し、ＩＬ−２／ｐ２８融合
蛋白質の存在を測定する。
これは、ニトロセルロースフィルター上へ吸着させ、天
然のｐ２８に特異的なラット又はウサギの抗体と共にイ
ンキュベートすることにより行なう。
結合した抗体の検出は、ラット又はウサギの全免疫グロ
ブリン（ｗｈｏｌｅ　ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｌｎｓ
　）に対して生じたビチオン−結合抗血清と共にインキ
ュベートすることにより行なう。この複合体を、次いで
、ストレプトアビジン−パーオキシダーゼ反応及びＨＲ
Ｐ染色試薬（バイオ−ラド）Ｂｉｏ−Ｒｏｄ）社製）の
存在下での最終染色により顕現化する。
ＶＶ、ＴＧ、ｐ２８Ｓｍ−１及びＶＶ、ＴＧ。
ｐ２８Ｓｍ−２の双方について、培養培地中に特異抗原
（１００ｎｇ／ｍＱ以上）を検出することができ（第１
２図）、これは各種独立した組換え体についても同様で
ある。一方、野生型ウィルスでのみ感染された細胞上清
は、有意なシグナルを与えない。
ｂ）狂犬病の糖蛋白質のシグナルペプチドに融合された
ｐ２８を発現する組換えワクシニアウィルスノ構築（Ｖ
Ｖ、ＴＧ、１１８４）。
ＯバクテリオファージＭ１３７Ｇ１７７の構築バクテリ
オファージＭ１３７Ｇ１６９　（フランス国特許第８６
１０５，０４３）は、５′末端において狂犬病の糖蛋白
質のシグナルペプチドを、３′末端において狂犬病の糖
蛋白質の細胞質内領域（ｉｎｔｒａｃｙｔｏｐｌａｓｉ
ｍｉｃ　ｒｅｇｉｏｎ）及びトランスメンブレン領域を
コードする配列を夫々側方に有する、ＨＩ　Ｖ−Ｉウィ
ルスのｅｎｖ遺伝子のコーディング配列を含むものであ
る。
Ｍ１３ＴＧ１６９のＫｐｎＩ部位とＨ１ｎｄＩＩＩ部位
との間にＥｃｏＲＩ部位を導入し、下記構造を酊するＭ
１３ＴＧ１７６を得る。
Ｓ　：狂犬病糖蛋白質のシグナル ＴＭ：狂犬病糖蛋白質のトランスメンブレン領域 シグナルペプチドから下流に位置するＥｃｏＲＩ部位を
、次いで、下記オリゴヌクレオチド＝５’　ＧＧＧＧＡ
ＡＡＴＣＧＴＡＡＴＣ３’を用いて局在性突然変異誘発
（１ｏｃａｌ　ｉｚｅｄｍｕｔａｇｃｎｃｓｉｓ　）に
より除去した。
従って、得られたバクテリオファージＭ１３ＴＧ１７７
は、単一のＥｃｏＲＩ部位を有する。
０バクテリオフア一ジＭ１３７Ｇ１１０５の構築ｐ２８
のコーディング配列を含むλ　ＴＧＩＯのＥｃｏＲＩ制
限フラグメントを、Ｍ１３７Ｇ１７７に導入し、下記構
造を有するＭ１３ＴＧ１１０５を得る。
０バクテリオフア一ジＭ１３ＴＧ１１０８の構築シグナ
ルペプチドＳに続く最初の２つのアミノ酸を、下記オリ
ゴヌクレオチド； ５’　ＣＴＴＧＡＴＡＴＧＣＴＣＧＣＣＡＧＣＡＡＴＡ
ＧＧＧＡＡＴＴＴＣＣＣＡＡＡ　３’を用いて局在性突
然変異誘発により、ｐ２８のコーディング配列に同位相
で（ｉｎ　ｐｈａｓｅνｉｔｈ　）融合させる。
得られたバクテリオファージを、Ｍ１３ＴＧ１１０８と
呼ぶ。
ＱプラスミドｐＴＧ１１８４の構築 バクテリオファージＭ１３ＴＧ１１０８をＰｓｔＩで部
分的に消化して、ｐ２８をコードする配列の全てを含む
フラグメントを単離し、プラスミドｐＴＧ１８６ＰＯＬ
ＹのＰｓｔＩ部位に挿入し、ｐＴＧ１１８４を得る。
Ｃ）シグナルペプチド及び狂犬病糖蛋白質のトランスメ
ンブレン領域に融合されたｐ２８を発現する組換えワク
シニアウィルスの構築（ＶＶ。
ＴＧ、１１８５） ＯバクテリオファージＭ１３７Ｇ１１０９の構築バクテ
リオファージＭ１３７Ｇ１１０８において、翻訳停止コ
ドンの前の最後のアミノ酸を、下記オリゴヌクレオチド
： ５’　ＴＧＣＡＣＴＣＡＧＴＡＡＴＡＣＡＴＡＧＡＡＧ
ＧＧＡＧＴＴＧＣＡＧＧＣＣＴ　３’を用いて、トラン
スメンブレン領域ＴＭの最初のアミノ酸に同位相で融合
させる。
得られたバクテリオファージをＭ１３ＴＧ１１０９と呼
ぶ。
０プラスミドｐＴＧ１１８５の構築 ｐＴＧ１１８４の構築に関し、バクテリオファージＭ１
３ＴＧ１１０９をＰｓｔＩによる部分的消化に供し、ｐ
２８をコードする配列の全てを含むフラグメントをｐＴ
Ｇ１８６ＰＯＬＹのＰｓｔＩ部位に挿入し、ｐＴＧ１１
８５を得る。
ｄ）　ウィルスＶＶ、ＴＧ、１１８４及び１１８５の特
定 プラスミドｐＴＧ１１８４及び１１８５を用い、上記と
同様にしてワクシニアウィルスのゲノム中に、ｐ２８を
コードする遺伝子を移す。
ウィルスｖ■、ＴＧ、１１８４は、狂犬病ノ糖蛋白質の
シグナルペプチドに融合されたｐ２８を発現する。
ウイ／１．スＶＶ、ＴＧ、１１８５は、シグナルペプチ
ド及び狂犬病の糖蛋白質のトランスメンブレン領域に融
合されたｐ２８を発現する。
ＢＨＫ２１細胞を、ＶＶ、ＴＧ、１１８４又は１１８５
ウイルス（０，２ｐｕｆ　／ｃｅｌｌ）で１６時間感染
する。（３５Ｓ）メチオニンを４時間添加後、標識化さ
れた蛋白質を、ｐ２８に対するウサギの抗体を用いて免
疫沈降させる。ウィルス■■。
ＴＧ、１１８４の場合、２８ｋｄの分子量に相当するバ
ンドが示される。この蛋白質は、培養上清中にも豊富に
存在しており、このことより、該蛋白質が分泌されたこ
とが判る。
ウィルスＶｖ、ＴＧ、１１８５の場合、３５ｋｄの分子
量に相当するバンドが示される。この蛋白質は、培養上
清には存在せず、このことより、該蛋白質が狂犬病の糖
蛋白質のトランスメンブレン領域により細胞膜中に保持
されていることが判る。
実施例５ 遺伝子操作により製造されたｐ２８２重抗原る動物のワ
クチン接種 天然ｐ２８の主たるエピトープを１以上含む組換え蛋白
質の生物学的効果を、成虫の寄生虫を全抽出して単離さ
れた成熟天然ｐ２８でラットを免疫化した後に観察され
る応答と比較して分析した。
大腸菌（イー、コリ、Ｅ、　ｃｏｌｉ）又はニス、セレ
ヴイシアエ（Ｓ、　ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）等の微生物
により、又は組換えワクシニアウィルスにより生産され
た融合蛋白質は、いずれもそのようなアプローチに使用
できるが、以下では、ｃＩＩ／ｐ２８融合蛋白質を用い
て得られた結果について詳述する。
ラットの免疫化 ２０匹の３ケ月令の“フィッシャー（Ｐｉ　５ｃｈｅｒ
）”雄性ラットを、フロイントのアジュバント（Ｆ　ｒ
ｅｕｎｄ’ｓ　　ａｄｊｕｖａｎｔ　）の存在下、ｃＩ
Ｉ／Ｉ）２重融合蛋白質（実施例２）５０μｇを腹腔内
注射することによって免疫化する。２週間後に第二の投
与を行ない、８日目から抗血清を採集する。
夫々５つのサンプルからなる血清の４つのプールを、天
然のｐ２８２重蛋白質載する抗体の存在及び該血清のス
キストツムラム（ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｔｎｕｌａ　）に
対する細胞毒性を３重に試験する。
特異的抗体の検出 大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｔ）から抽出されたｃＩＩ／１）
２８蛋白質で免疫化されたラットの血清を、ウェスタン
プロット（Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔ　）試験において
、成虫の寄生虫の全抽出物のｐ２８に対するその反応性
について試験する。該ｐ２８は、５ＤＳ−ポリアクリル
アミドゲル上の電気泳動により分離されたものである。
第１３図は、これら血清により天然ｐ２８２重蛋白質確
に認識されることを示す。
この応答の最大強度は、２３日目に達成され、天然の抗
原で免疫化された動物の血清について観察されたものと
実質上向等である。
好酸球−依存性細胞毒性の評価 上記と同一の血清を、カプロン（Ｃａｐｒｏｎ　）ら（
１９８１）に記載の好酸球−依存性細胞毒性の試験法に
より試験した。
即ち、マンソン住血吸虫の５０のスキストツムラムを、
各試験血清（非加熱）又は適当な対照物の存在下、及び
好酸球（４０〜７０％の好酸球を含むロウ（Ｌ　ｏｕ）
ラットの非粘着性腹膜細胞（ｎｏｎ−ａｄｈｅｒｅｎｔ
　ｐｅｒｉｔｏｎｅａｌ　ｃｅｌｌ）の存在下にインキ
ュベートする。反応混合物は、総容量２００μρ中、１
スキストツムラムに対し６０００のエフェクター細胞を
含有する。３７℃にて４８時間インキュベートした後、
スキストツムラムの死滅率を顕微鏡観察により測定する
。
第１表に示す結果より、スキストツムラムの高レベルの
死滅率を誘発し得る細胞毒性因子の存在が明らかであり
、該レベルは、マンソン住血吸虫で感染されたラットの
血清により誘発されたものと非常に近いものであった。
細胞毒性反応における特異的ＩｇＥの役割の証明同様の
細胞毒性テストを加熱血清（５６℃で２時間）及び補体
を加えた加熱血清について行った。
第■表に示す結果は、細胞毒性の原因となるファクター
は、温度感受性であり、この活性の喪失は、補体の添加
によっても、補償されないことを明らかにしている。
更に、セファローズＢに結合された、ラットＩｇＨに対
して特異的な山羊抗血清による吸着によっても、試験血
清からＩｇＥの選択性を除去することが、可能である。
このようにして処理され、次いで透析された血清は、好
酸球依存性（ｅｏｓｉｎｏｐｈｉ　１−ｄｅｐｅｎｄｅ
ｎｔ）細胞毒性について、試験された。
第■表は、ＩｇＥについてのラット血清の選択的枯渇（
ｓｅｌｅｃｔｌｖｅ　ｄｅｐｌｅｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈ
ｅ　ｒａｔ　５ｅｒａｉｎ　ｒｅｓｐｅｃｔ　ｏｆ　Ｉ
　ｇ　Ｅ）は、細胞毒性の発現ヲ妨げることを示してい
る。従って、後者は、ｃＩＩ／ｐ２８蛋白で免疫された
ラットの血清のＩｇＥに対して極めて特異的である。
セルカリアの試験的注射に対する動物保護の証明前述の
ようにして、フィッシャー　ラットに対し、水酸化アル
ミニウムの存在下に、大腸菌又は酵母で生成されたｐ２
８抗原を、又はｐ２８抗原を発現するワクシニア　ウィ
ルス、ｖｖ、Ｔｏ。
１１８５（動物当たり５ＸＩＱ７ｐｆｕの組換えウィル
ス）を注射した。対照動物には、水酸化アルミニウムの
みを注射した。
免疫６週間後に、動物に、１０００匹のセル力リア（住
血吸虫の感染性幼虫形態）を皮下的に感染させた。
接種２１日後に、ラットを解剖し、成虫寄生虫の内容を
調べた。成虫は、肝臓門脈を生理食塩水で潅流すること
により、採集し、数を読んだ。
対照動物と比較して、寄生虫の数は、以下のように減少
していた： ・・・大腸菌中で得られた抗原の場合、６４±４％、・
・・酵母中で得られた抗原の場合、７０±１０％、・・
・ワクシニアにより得られた抗原の場合、６０±８％。
第　　Ｉ　　表 第　　■　　表 補体関与の研究 第　　■　　表 実施例６ マンソン住血吸虫のｐ２８Ｉ蛋白質を発現する、大腸菌
　ＴＧＥ９０１／ｐＴＧ５４及びニス、セレヴイシアエ
ＴＧＹ２ｓ　ｐ　１３ｂ／ｐＴＧ２８００の抽出物にお
けるグルタチオン　Ｓ−トランスフェラーゼ活性を証明
した（ｐＴ（，２８００と実施例３で述べたｐＴＧ１８
９４との相違は、ｕｒａ３　　遺伝子プロモーター領域
における１７０ｂｐの欠失という点のみである）。
培地を遠心分離に供し、得られたペレットをバフｙ−液
（１００ｍＭ）リス−ＨＣ１ｐＨ７，５，１ｍＭＤＴＴ
）に懸濁させる。酵母は、ガラスピーズを使用して、粉
砕し、大腸菌は、超音波で処理した。抽出物を遠心処理
して、細胞残渣を取り除き、上澄液の活性を測定した［
ムーア（Ｍ　ｏｏｒｅ）等（１９８６）、ハビッヒ（Ｈ
ａｂｉｇ）等（１９７４）の方法による］。粗抽出物４
０〜１００μｍ、１００ｍＭのＣＤＮＢ試薬（１００％
エタノールに溶解した１−クロロ−２，４−ジニトロベ
ンゼン）１０μｇ、及び１００　ｍ　Ｍ　Ｋ　Ｈ２Ｐ　
Ｏ４（ｐＨ６，５）／２．５ｍＭ還元グルタチオン１鵬
を分光光度計セル中で混合した。
積極的対照（ｐｏｓｉｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ）とし
て、ラットのグルタチオン　ｓ−トランスフェラーゼ（
シグマ社より供給）を各テスト毎に最終濃度９μｇ及び
６μｇで使用した。
消極的対照（ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ）とし
て、ｐ２８の配列を欠くベクターを含む大腸菌ＴＧＥ９
０１／ｐＴＧ９５９の抽出物、及びｐ２８の配列を欠く
ベクターを含むニス、セレヴイシアエＴＧＹ２ｓｐ１３
ｂ及びＴＧＹ２ｓｐ１３ｂ／ｐＴＧ８４８の抽出物を使
用した。
全ての大腸菌及び酵母の抽出物は、全蛋白質濃度０．３
３ｍｇ／戎に調整された。
セル中のグルタチオン　トランスフェラーゼ活性の存在
する箇所には、黄色が現れた。ＯＤ（光学的濃度）の変
化は、１５分間にわたり、１分毎に３４０ｎｍの波長で
分光光度計中で測定した。
第１５図に示す結果は、組み替えｐ２８蛋白を含む大腸
菌及び酵母の抽出物は、強力なグルタチオン　Ｓ−トラ
ンスフェラーゼ活性を示すことを明らかにしている。
実施例７ ライブラリーのスクリーニング及びλＴｃ０７候補体の
選択 実施例１で述べたλ　ｇｔｌｌ中のｃＤＮＡのスクリー
ニングは、幾つかの候補を予測することを可能とする。
ラットのポリクローナル抗体（住血吸虫から精製取得し
たｐ２８を注射することにより誘起されたもの）を使用
する免疫検知（ｉｍｍｕｎｏｄｅｔｅｃｔｉｏｎ　）に
より、新たな候補体、λ　ＴＧＯ７が選択された。これ
は、実施例１で述べた候補体λ　ＴＧｌｏ及びλ　ＴＧ
ＩＩの選択のために使用された合成プローブによっては
認識されず、従ってその配列は、異なっているものであ
る。蛋白質は、同じ抗−ｐ２８抗体により認識されるの
で、この新しい蛋白をｐ２８ＩＩと呼ぶ（前記で同定し
た蛋白をｐ２８Ｉと呼ぶ）。
実施例８ ｃＤＮＡのさまざまな制限フラグメントをＭ２Ｓ内で再
度クローン化し、配列を決めた。
完全なｃＤＮＡ配列及びそれから推定される一次アミノ
酸構造（３−リーディングフレームにおいて）を第１６
ａ図及び第１６ｂ図に示す。
実施例９ ｃＤＮＡ配列の始端におけるＢａｍ）（Ｉサイトの創造 適切な発現ベクターに対するｃＤＮＡの挿入を容易なら
しめるために、特定部位性突然変異誘発（ｄｉｒｅｃｔ
ｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）により、コーディング
シーケンスの始端にＢａｍＨＩサイトを創った。
特定部位性突然変異誘発は、下記の合成オリゴマーと共
にＭ１３中にクローン化されたＤＮＡ上で行われた。該
合成オリゴマーは、変異さるべきヌクレオチド以外の点
では第１ａ図に示すシーケンスのヌクレオチド１８乃至
３８・に対し相補性の２１全体である： ５−　ＧＴＡＡＧＧＡＧＣＧＧＡＴＣＣＡＣＧＡＴＧ　
３　”ＢａｍＨＩサイト ｃＤＮＡシーケンスは、従って、ＢａｍＨＩフラグメン
トの形態で回収可能であり、第２のＢａｍＨＩサイトは
、コーディング　シーケンスの下流側のＭ１Ｂポリリン
カー中に存在する。
実施例１０ 大腸菌中でのｐ２８ＩＩ蛋白質の発現 ｐ２８ＩＩをコードするｃＤＮＡシーケンスが、Ｂａｍ
ＨＩ　　フラグメントの形態で回収され、発現ベクター
Ｔ）ＴＧ９０８のＢａｗｌ（Ｉサイトに導入された。
得られた組換え体の構造は、第２図に図式的に示すそれ
と同じである。
このベクターは、複製開始点、ファージ　λのＰｔ、プ
ロモーター及び、ｃＩＩ遺伝子のＮ末端を含むｃＩＩリ
ポソーム結合シーケンスを含有し、ＢａｍＨＩ制限サイ
トは、翻訳開始サイトから３９ｂｐ下流にある。
ｐ２８ＩｔｃＤＮＡインサートは、従って、ｃＩＩ遺伝
子のＮ末端と同位相に存在する。
正しいオリエンテーションでインサートを担持する組換
えプラスミド、ｐＴＧ５６が選択され、構造は、シーケ
ンシングにより確認された。
このプラスミドにより形質転換された大腸菌ＴＧＥ９０
１を、ＯＤ６００で０．２となるまでＬＢメディウム上
で培養する：　ｃ　Ｉ　１．／ｐ２８ＩＩ蛋白の合成は
、次いで、その後の８時間にわたり温度を４２°Ｃに上
昇させることにより、誘起される。
培養が完結すると、超音波で処理した後、細胞抽出物を
回収し、５ＤＳ−アクリルアミドゲル上で電気泳動し、
クーマーシー　ブルーにより染色後、分析される（第１
７図）。
見掛は分子ｆｆ１２８にのバンドが、ＴＧＥ９０１／　
ｐ　Ｔ　Ｇ　５６抽出物中に明確に認められる（第１７
図：バンドＡ１ＢＳＣ及びＤ）。
大腸菌から抽出された該蛋白の精製物の“ウェスターン
　ブロッティング″による分析の結果、該精製物は、住
血吸虫から精製された天然ｐ２８に対するラット抗体に
より認識されることが判明した。
グルタチオン　Ｓ−トランスフェラーゼ酵素活性の可能
性について試験が行われたが、試験結果は、否定的なも
のであった。この否定的な結果は、２つのｐ２８蛋白質
のシーケンス間の相同性の不存在を考慮すれば、予期さ
れたところであった。
実施例１１ ラットを、実施例５のプロトコールに従い免疫化し、そ
れらの血清を好酸球−依存性細胞毒性試験において試験
する。
第■表に示す結果より、これら血清の細胞毒性の能力が
、最初の抗原ｐ２８Ｉで又は天然のｐ２８で免疫化され
たラットのそれと同様であることが判る。
第　　■　　表 好酸球−依存性細胞毒性試験：天然ｐ２８蛋白質、及び
大腸菌中で生産されたｃＩＩ／ｐ２８及びｃＩＩ／ｐ２
８ＩＩで免疫化されたラットの血清の試験（血清の希釈
度１八６）注：ＢＳＡ＝牛血清アルブミン Ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ＝　Ｉ　ｇ　Ｅ産生を増大させルト
キシン大腸菌（Ｅ、　ｃｏｌｔ）中で生産されたｐ２８
ＩＩ蛋白質で免疫化されたラットの抗体は、ｐ２８Ｉ蛋
白質を認識しない。同様に、大腸菌中で生産されたｐ２
８工蛋白質で免疫化されたラットの抗体は、ｐ２８■蛋
白質を認識しない。しかし、いずれのタイプの抗体も、
住血吸虫から精製された天然のｐ２８抗原調製物を認識
し、天然のｐ２８に対して生じた抗体はいずれの組換え
蛋白質をも認識する。
この結果は、住血吸虫から精製された天然のｐ２８の調
製物の異質性（ｈｅｔｅｒｏｇｅｎｅｉｔｙ　）により
説明される。天然のｐ２８蛋白質又は住血吸虫のｍＲＮ
Ａ上でインビトロで翻訳されたもののゲル上での２次元
泳動後の免疫沈降を注意深く観察することにより、２８
にバンドの分裂（ｓｐｌｉｔｔｉｎｇ　’）を示すマイ
ナーなバンドの存在が判明した（図は、ジエイ、エム、
バロール（ＪｏＭ、Ｂａ１ｌｏｕｌ）、アール、ジェイ
、ピアス（Ｒ，Ｊ、　　Ｐｉｅｒｃｅ）、ジエイ、エム
、グルライク（Ｊ、　Ｍ、Ｇｒｚｙｃｈ　）及びニー、
カプロン（Ａ、　Ｃａｐｒｏｎ　）　、Ｍｏｌ。
Ｂｉｏｅｈｅｍ、　　Ｐａｒａｓｉｔｏｌｏｇｙ、　　
１７．　　（１９８５）１０５−１１４により発表され
ている）。このマイナーバンドは、ｐ２８ＩＩに対応す
るに違いない。
菌株の寄託 下記菌株は、７５７２４　　パリ　リュ　デュドクトル
　ルー　２８のコレクシオンΦナシオナル・ド・クルチ
ュール・ド・ミクロオルガニスム（Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏ
ｎ　Ｎａｔｉｏｎａｌｅ　ｄｅ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　ｄ
ｅＭｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｅｓ、　Ｎａｔｉｏｎａ
ｌ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ　ｏｆＭｉｃｒｏｏｒｇａｎ
ｉｓｍ　　Ｃｕ１ｔｕｒｅｓ　）に寄託された。
プラスミドｐＴＧ４４で形質転換された実施例２に記載
のイー、コリ（Ｅ、　ｃｏｌｔ）株Ｎ４８３０は、１９
８６年７月６日に寄託番号ｌ５６２として寄託された。
株ＴＧＥ９０１／ｐＴＧ５６は、７５７２４パリ　リュ
　デュ　ドクトル　ルー　２５のコレクシオン・ナシオ
ナル・ド・クルチュール舎ド・ミクロオルガニスムに、
１９８７年４月３日に寄託番号１．６５６として寄託さ
れた。
参考文献 ０カプロン　ニー、　　（Ｃａｐｒｏｎ　、　Ａ、　）
及びデセントジエー、ビー、　　（Ｄｅｓｓａｉｎｔ　
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ー　オンイムノロジ−（Ａｎｎｕａｌ　Ｒｅｖｉｅｗ　
ｏｆＩ　ｍｍｕｎｏｌｏｇｙ　）　３．４５５−４７６
０バロール、ジュー。エム、（Ｂａｌｌｏｕｌ、　　Ｊ
、　Ｍ、）、ピアス、アール、ジエ−，（Ｐｉｅｒｃｅ
　、　Ｒ。
Ｊ、）、グルチッヒ、ジエー、エム。
（Ｇｒｚｙｃｈ　、　Ｊ、　Ｍ、　）及びカブＣｌン：
に−−０（Ｃａｐｒｏｎ　、　Ａ、　）　　（１９８５
）　Ｍｏｌ。
Ｂｉｏｃｈｅｍ、　　Ｐａｒａｓｉｔｏｌ、　　１７．
　１０５−１１４０バロール、ジュー。エム、（Ｂａｌ
ｌｏｕｌ、　　Ｊ、　Ｍ、）、グルチッヒ、ジエー、エ
ム、　　（Ｇｒｚｙｃｈ　＊　　Ｊ　−Ｍ、　）及びカ
プロン　：Ｉ−−、（Ｃａｐｒｏｎ　、　Ａ、　）（１
９８６）出版準備中 ０ヤング、アール、ニー（Ｙｏｕｎｇ、　Ｒ，Ａ、　）
及びデイヴイス、アール、ダブリュー、　　（Ｄ　ａｖ
ｉｓ。
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ｅ）２２２，７７８−７８２０ヒュン、ティー、ヴイ、
　　（Ｈｕｙｎｈ、　　Ｔ、Ｖ、　）、ディーエヌエー
　クローニング　テクニクス：ア　プラクティカル　ア
プローチ（ＤＮＡＣｌｏｎｉｎｇ　　Ｔｅｃｈｎｉｑｕ
ｅｓ　　：Ａ　　ＰｒａｃｔｉｃａｌＡｐｌ）ｒｏａｃ
ｈ　）　、グローバー、ディー。
（Ｇｌｏｖｅｒ　、　Ｄ、　）編集、アイアールエル　
プレス（ＩＲＬ　　ＰｒｅＳＳ）、オックス７ｔ−Ｆ（
Ｏｃｆｏｒｄ）（１９８４） ０ル　ボウク、ワイ、　　（Ｌｅ　Ｂｏｕｃ　、　Ｙ、
　）　、ドレーヤー、ディ＋、　　（Ｄｒｅｙｅｒ　、
　Ｄ、　）　、イエーガー、エフ、　　（Ｊａｅｇｅｒ
　、　　Ｆ、　）　、ピノ−。
エム（Ｂｉｎｏｕｘ　、　Ｍ、　）及びサンターメーヤ
。
ビー。
（Ｓｏｎｄｃｒｍｅｙｅｒ、　　Ｐ、　）　　（１９８
６）　、エフイービーニス　レターズ（Ｆ　Ｅ　Ｂ　Ｓ
　　Ｌｅｔｔｅｒｓ）、１９６．１０８−１１２ ０ラセ、アール、　　（Ｌａｔｈｅ、　Ｒ，）　、及び
ルコック、ジェー−ピー（Ｌｅｃｏｃｑ、　　Ｊ−Ｐ、
　）　　（１９７７）ヴアイラロジ−（Ｖｉｒｏｌｏｇ
ｙ　）　８３゜０ヒッチェマン、アール−エ、　　（Ｈ
ｌｔｚｅｍａｎｎ。
Ｒ，Ａ、）、ハーギー、エフ、イー、（Ｈａｇｉｅ。
Ｆ、Ｅ、）　、ヘイフリック、ジュー。ニス。
（Ｈａｙｆｌｉｃｋ　、　　Ｊ、　　Ｓ、　）　、チェ
ン、シー、ワイ、　　（Ｃｈｅｎ　、　　Ｃ，Ｙ、）　
、シーバーグ、ピー。
エイチ、　　（Ｓｅｅｂｕｒｇ、　　Ｐ、　　Ｈ，）及
びプリンク。
アール（Ｄｅｒｙｎｃｋ、　Ｒ，）　　（１９８２）ヌ
クレイツク　アシッズ　リサーチ（ＮｕｃｌｅｉｃＡｃ
ｉｄｓ　　Ｒｅ５ｅａｒｃｋ）　１０．　７７９１−７
８００キーニー、エム、ビー、　　（Ｋｉｅｎｙ、　Ｍ
、Ｐ、　）、ラセ、アール、　　（Ｌａｔｈｅ、　Ｒ，
）及びルコック。
ジエーーピ−（Ｌｅｃｏｃｑ、　　Ｊ−Ｐ、　）　　（
１９８３）、ジーン（Ｇｅｎｅ）２６，９１−９９０ス
ミス、ジー、エル、　　（Ｓｍ１ｔｈ　　Ｇ、　　Ｌ、
　）、マケット、エム（Ｍａｃｋｅｔｔ、　Ｍ、　）及
びモス。
ビー（Ｍｏｓｓ　、　　Ｂ、　）、（１９８３）、ネイ
チ−？−（Ｎａｔｕｒｅ　）３０２，４９０−４９５０
パニカリ、ディ（Ｐａｎｉｃａｌｌｉ、　Ｄ、　）及び
パオレッテイ、イー（Ｐａｏｌｅｔｔｉ　、　Ｅ、　）
　　（１９８２）、プロシーディンゲス　オン　ザ　ナ
ショナル・アカデミ−オン　サイエンス　オンザ　ユナ
イテッド　ステイツ　オン　アメリカ（Ｐｒｏｃｅｅｄ
ｉｎｇｓ　ｏｆ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　
ｏｆＳｃｉｅｎｃｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　５
ｔａｔｅｓ　ｏｆＡｍｅｒｉｃａ）　７９．４９２７−
４９３１０マケット、エム、　　（Ｍａｃｋｅｔｔ、　
Ｍ、　）　、スミス。
ジュー。エル、　　（Ｓｍｉｔｈ、　　Ｊ、　　Ｌ−、
）及びモス。
と−（Ｍｏｓｓ、Ｂ、）（１９８２）プロシーディンゲ
ス　オン　ザ　ナショナル　アカデミーオン　サイエン
ス　オン　ザ　ユナイテッドステイツ　オン　アメリカ
（Ｐ　ｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　
　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　　　５ｃｉｅｎｃｅ　ｏｆｔ
ｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　　５ｔａｔｅｓ　ｏｆ　　Ａｍｅ
ｒｉｃａ）７９．　７０キーニー、エム、ビー、　　（
Ｋｉｅｎｙ、　Ｍ、　　Ｐ、　）、ラセ、アール、　　
（Ｌａｔｈｅ、　　Ｒ，）　、トリリーン。
アール、　　（Ｄｒｉｌｌｉｅｎ　、　Ｒ，）　、スペ
ーナー。
ディー、　　（Ｓｐｅｈｎｅｒ、　Ｄ、　）　、スコリ
ー、ニス。
（Ｓｋｏｒｙ、　　Ｓ、　）　、シュミット、ディー。
（Ｓｃｈｎ＋ｉｔｔ、　　Ｄ、　）　、ヴイクター、テ
ィー（Ｗｉｋｔｏｒ　、　Ｔ、　）　、：］プロウスキ
ー、エイチ（Ｋｏｐｒｏｖｓｋｉ、　Ｈ，）及びルコッ
ク、シエ一ピー（Ｌｅｃｏｃｑ、Ｊ−Ｐ、）（１９８４
）ネイチ−？−（Ｎａｔｕｒｅ）３１２．１６３−１６
６０カプロン　エム、　　（Ｃａｐｒｏｎ　、　Ｍ、　
）　、バジン。
エイチ（Ｂａｚｉｎ、Ｈ，）　、）−ピア、ジー。
（Ｔｏｒｐｉｅｒ、　Ｇ、　）　、ジ＝１セフ　エム。
（Ｊｏｓｅｐｈ　、　Ｍ、　）及びカプロン　ニー。
（Ｃａｐｒｏｎ　、　Ａ、　）　　（１９８１）　Ｊ、
　　Ｉｍｍｕｎｏｌ。
１２６．１７６４−１７６８ ０ハビッヒ、ダブり二一、エイチ、　　（Ｈａｂｌｇ、
　Ｗ。
Ｈｏ）、バブスト、エム、ジェ−，（Ｐ　ａｂｓｔ。
Ｍ、Ｊ、）及びヤコビ、ダブリュー、ビー（Ｊａｃｏｂ
ｙ　、　Ｗ、　Ｂ、　）　’）ヤｆ−ルオフハイオロジ
カル　ケミストリー（Ｊ　ｏｕｒｎａｌ　ｏｆＢｉｏｌ
ｏｇｌｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）　２４９．　７１
３００ムーア、アール、イー、（Ｍｏｏｒｅ、　Ｒ，Ｅ
、　）、ダヴイーズ、エム、ニス、　　（Ｄａｖｌｅｓ
　、　Ｍ、　　ｓ。
）、オコンネル、ケー、エム、　　（０’　Ｃｏｎｎｅ
ｌ　ｌ。
Ｋ、Ｍ、）　、バーディング、イー、アイ。
（Ｈａｒｄｉｎｇ、　　Ｅ、１．）　、ヴイーガント、
アール、シー、　　（Ｗｉｅｇａｎｄ、　Ｒ，Ｃ，）及
びチーマイエル、ディー、シー、　　（Ｔｉｅｍｅｉｅ
ｒ　、　Ｄ。
Ｃ０）、ヌクレイツク　アシッズ　リサーチ（Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ　　Ａｃ１ｄｓ　　Ｒｅ５ｅａｒｅｈ　）　１４
．７２０スミス、ディー、ビー、　　（Ｓｍｉｔｈ、　
　Ｄ、　　Ｂ、　）、ダバーン、アール、エム、　　（
Ｄａｖｅｒｎ　、　　Ｒ，Ｍ。
）、ボード、ビー、ジー、　　（Ｂｏａｒｄ、　　Ｐ、
　　Ｇ、）、チーニー、ダグリュー。ニー、　　（Ｔｉ
ｕ、　Ｗ。
Ｕ、）、ガルシア、イー、ジー。
（Ｇａｒｃｉａ　、　　Ｅ、　Ｇ、　）及びミツｆ　ｘ
、　）Ｌ／、　　シー　。
エフ、　　（Ｍｉｔｃｈｅｌｌ　、　　Ｇ、　　Ｆ、）
　、プロシーディンゲス　オン　ザ　ナショナル　アカ
デミーオン　サイエンス　オン　ザ　ユナイテッドステ
イツ　オン　アメリカ（Ｐ　ｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆ
　ｔｈｅ　Ｎａｔｌｏｎａｌ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　
５ｃｉｅｎｃｅ　ｏｆｔｈｅ　Ｕｎｉｔｅｄ　５ｔａｔ
ｅｓ　ｏｆ　　Ａｍｅｒｉｃａ）　８３．８
【図面の簡単な説明】
第１図は、λ　ＴＧＯ６、λ　ＴＧＯ８、λＴＧＯ９、
λ　ＴＧＩＯ及びλ　ＴＧｌｌの配列から推定されるｃ
ＤＮＡの完全な配列を示す。 ７番目のヌクレオチドで開始するオープンリーディング
フレームは、分子ｆｆ１２８ｋｄの２１１個のアミノ酸
を持つポリペプチドをコードする。 第２図は、ｐＴＧ１９２４中のλ　ＴＧＯ６のＥｃｏＲ
Ｉ挿入物の組み込みによるｐＴＧ４４の構築を示す。ｐ
ＴＧ１９２４は、ｃＩＩの開始コドンから４６ｂｐ下流
に位置する、同位相にＥｃｏＲＩ部位を有するｐＴＧ９
０８の誘導体でである。ｐＴＧ４４は、分子量２５ｋｄ
を有するｃ　ＩＩ　／　ｐ２８融合蛋白質をコードする
。 第３図は、ｐＴＧ４４に挿入された発現ブロックにより
コード化されたｃＩ［／ｐ２８融合蛋白質の配列を示す
。 第４図は、５ＤＳ−アクリルアミドゲル上で電気泳動し
、クーマシープル−（Ｃｏｏｍａｓｉｅ　ｂｌｕｅ）で
染色後の大腸菌ＴＧＥ９０１／ｐＴＧ４４の全抽出物及
び抽出物の不溶性フラクションを示す。 矢印は、２５ｋｄ蛋白質の位置を示す。 Ａ、３０℃でのＴＧＥ９０１／ｐＴＧ４４の全抽出物 Ｂ、同上抽出物の不溶性フラクション Ｃ１３７℃で７時間病発後のＴＧＥ９０１／ｐＴＧ４４
の全抽出物 り、同上抽出物の不溶性フラクション Ｅ、４２℃で７時間病発後のＴＧＥ９０１／ｐＴＧ４４
の全抽出物 Ｆ、同上抽出物の不溶性フラクション Ｇ、０．２％ＳＤＳに溶解したフラクションＦＨ１４２
℃で７時間後のＴＧＥ９０１／ｐＴＧ１９２４対照培養
物（ｃｏｎｔｒｏｌ　ｃｕＨｕｒｅ　）の全抽出物 ■、同上フラクションの不溶性抽出物 第５図は、５ＤＳ−アクリルアミドゲル上で電気泳動し
、クーマシーブルーで染色後、構築物ｐＴＧ１８８５及
び１）ＴＧ１８８６によりコードされたｐ２８蛋白質を
生産するニス　セレヴイシアエＴＧＹＩｓｐ４の抽出物
を示す。 Ａ、ＴＧＹ１ｓｐ４／ｐＴＧ１８８５の抽出物（融合さ
れていない２８ｋｄ蛋白質） Ｂ、ＴＧＹ１ｓｐ４対照培養物の抽出物Ｃ，ＴＧＹ１ｓ
ｐ４／ｐＴＧ１８８６の抽出物（融合された３０ｋｄ蛋
白質） 第６図は、融合又は成熟２８ｋｄ蛋白質を生産する大腸
菌及びニス　セレヴイシアエの抽出物を示し、該抽出物
を、天然ｐ２８に対して特異性を持つウサギ抗体で“ウ
ェスターン　ブロッティング（Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏ
ｔｔｉｎｇ　）　”により分析した結果を示す。結合抗
体を、ビオチン標識化量ウサギ抗体で認識し、この複合
体をストレプトアビジン−パーオキシダーゼ（ｓｔｒｅ
ｐｔａｖｉｄｉｎ　ｐｅｒｏｘｌｄａｓｅ　）試薬及び
ＨＲＰ　（Ｂｉｏ−Ｒａｄ社製）染色により、視覚化す
る。 Ａ、大腸菌ＴＧＥ９０１／ｐＴＧ４４の全抽出物Ｂ、同
上抽出物の不溶性フラクション Ｃ６成熟蛋白質を生産するニス　セレヴイシアエＴＧＹ
Ｉｓｐ４／ｐＴＧ１８８５の全抽出物り、ＰＧＫ遺伝子
の最初の２２個のアミノ酸に融合された成熟蛋白質を生
産するニス　セレヴイシアｚＴＧＹ１ｓ　ｐ４／ｐＴＧ
１８８６の全抽出物 Ｅ、負対照（ｎｅｇａｔｉｖｅ　ｃｏｎｔｒｏｌ）ニス
　セレヴイシアエの抽出物 Ｆ、　Ｇ、　ｌ／２濃度でのＣ及びＤ同様の抽出物第７
図は、ヒトインターロイキン−２の最初の９個のアミノ
酸に相当するｃＤＮＡの領域において、定方向突然変異
（ｄｉｒｅｃｔｅｄ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）により
ＥｃｏＲＩサイトが同位相に位置することを示す。 第８図は、ｐＴＧ１８８−ＩのＥｃｏＲＩサイト（第７
図の構築参照）におけるλ　ＴＧＯ６及びλ　ＴＧＯ９
のＥｃｏＲＩフラグメントの挿入によるｐＴＧ４５及び
ｐＴＧ４６の構築を示す。 第９図は、ｐＴＧ４５Ｋよりコード化された■Ｌ２／ｐ
２８融合蛋白質の構造を示す。ｐ２８の大部分を含む２
４ｋｄ蛋白質の分泌を可能とするシグナルペプチドの存
在が示される。 第１０図は、ｐＴＧ４６によりコード化されたＩＬ２／
ｐ２８融合蛋白質の構造を示す。シグナルペプチドは、
ｐ２８抗原の中心部分を有する１６ｋｄ蛋白質の排泄を
可能とする。 第１１図は、ワクシニア７．５Ｋプロモーターの支配下
にある、ＩＬ２／ｐ２８をコードする遺伝子の、ワクシ
ニアＴＫ遺伝子を担うプラスミドへの挿入を示す。この
発現ブロックのウィルスゲノムへの挿入は、ＴＫ配列間
の二重組換え（ｄｏｕｂｌｅ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉ
ｏｎ）により行われる。 第１２図は、二重組換えウィルスＶＶ、　ＴＧ。 ｐ２８Ｓｍ−１及びＶＶ、ＴＧ、ｐ２８Ｓｍ−２で感染
したＢＨＫ２１細胞の培地に分泌された蛋白質の、天然
ｐ２８に特異的なウサギ又はラット抗体による検出を示
す。 Ａ及びＤ　　ＶＶ、ＴＧ、ｐ２８Ｓｍ−１の上清Ｂ及び
Ｅ　　ＶＶ、ＴＧ、ｐ２８Ｓｍ−２の上清Ｃ及びＦ　野
生型Ｖｖで感染させた培養上清Ａ、Ｂ、Ｃウサギ抗体に
よる検出 り、Ｅ、Ｆ　　ラッド抗体による検出 第１３図は、大腸菌により合成されたｃ　Ｕ　／　ｐ２
８蛋白質で免疫化されたラットの血清において、天然ｐ
２８蛋白質を用いたウェスターンプロット法による抗ｐ
２８抗体の検出を示す。 ＮＲ８：免疫化されていない対照ラットの血清５Ｒ−２
８−２０，Ｄ８．Ｄｌｌ、Ｄ１６．Ｄ２３：ｃｌＩ／ｐ
２８蛋白質を接種後８，１１．１６及び２３日目に採血
したラットの血清５Ｒ２８：天然ｐ２８蛋白質を接種し
たラットの血清 第１４図は、第１３図と同一の血清の生物学的活性を示
し、スキストツムラムに対する好酸球依存性細胞毒性試
験において測定された（第Ｉ、第■表及び第工表参照）
。 一３Ｒ２８−２０は、２度目の接種後異なった時に回収
したマンソン住血吸虫の２８ｋｄ抗原に対応する２０ｋ
ｄのクローン化されたフラグメントに対抗する血清を示
す。 一８Ｒ−２８は、２度目の接種１４日後に回収され、天
然ｐ２８に対抗する抗血清を示す。 第１５図は下記曲線を示す。 一ラット肝臓のＧＴ　（９μｇム、・６μｇ）−大腸菌
の粗抽出物、対照（○）及びＴＧＥ９０１／ｐＴＧ５４
　（■） 一ニス　セレヴイシアエの粗抽出物、対照（ロ）、プラ
スミドベクター（Δ）で、及びＴＧＹ２ｓｐ１３ｂ／ｐ
ＴＧ２８００　（＋）で形質転換されたもの 第１６ａ及び１６ｂ図は、ｐ２８ＩＩ蛋白質のＣＤＮＡ
配列及び３　リーディングフレームによる対応する蛋白
質配列を示す。 第１７図は、クーマーシーブルーで染色後のアクリルア
ミドゲル上での大腸菌抽出物の電気泳動を示す。 Ａ、　Ｃ及びＦ　全抽出物 Ｂ、Ｄ及びＥ　同上抽出物の不溶性フラクションＡ、Ｂ
、Ｃ，Ｄ　　大腸菌ＴＧＥ９０１／ｐＴＧ５Ｅ、Ｆ　　
大腸菌ＴＧＥ９０１／ｐＴＧ９０８（対照ベクター） Ｇ　　　分子量マーカー （以　上） ＴＧＣＡＡＧＦｔＱ・　１（キ′）ｌ）ＡＴＧ　　ＧＣ
Ｔ　　ＧＧＣＧＡＧ　　ＣＡＴ　　ＡＴＣＡＡＧ　　Ｇ
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＾ｘ＊ｘＴｙｒＬｅｕＰｒｏｚｚｘＬｙｓＬｙｓ■発明
者　アンドレ　カプロン ■゛発明者　　　ジャン−ビニール　ルコック フランス国　５９１１３　　ファレンピン　リュ　デュ
　力ピテーヌ　ジャスマン　５８ フランス国　６７１１６　　ライヒステート　リュ　デ
ュ　シャン　デュ　フオ　６ 手続辛甫正書（方式） １　事件の表示 昭和６２年特許願第２０９１０４号 ２　発明の名称 蛋白質及びその製法、ＤＮＡ配列、抗体及びグルタチオ
ン　Ｓ−トランスフェラーゼ事件との関係　　特許出願
人 トランスジーン　ソシェテ　アノニム ４代理人 大阪市東区平野町２の１０　沢の鶴ビル６　補正の対象 明細書中「発明の詳細な説明」の項及び図面補正の内容 明細書第６４頁第１行「参考文献」とあるを次の通りに
訂正する。 「文献 上記記載において参照した文献を下記に列記する。」 図面中箱１．　９．　１０及び１６図を別紙の通り訂正
する。 （以　上） １　事件の表示 昭和６２年特許願第２０９１０４号 ２　発明の名称 蛋白質及びその製法、ＤＮＡ配列、抗体及びその用途、
ポックスウィルス、形質転換又は感染された細胞、住血
吸虫症予防剤及びグルタチオン　Ｓ−トランスフェトラ
ンスジーン　ソシエテ　アノニム ４代理人 大阪市東区平野町２の１０　沢の鶴ビル８０Ｂ−２０３
−０９４１昭和６３年６月２８日 ６　補正の対象

Claims (29)

    【特許請求の範囲】
  1. （１）天然のｐ２８蛋白質に対して生じる抗体により認
    識されるｐ２８蛋白質のエピトープを含む蛋白質。
  2. （２）スキストソムラ（ｓｃｈｉｓｔｏｓｏｍｕｌａ）
    に由来しない蛋白質部分を含むハイブリッド蛋白質であ
    る特許請求の範囲第１項に記載の蛋白質。
  3. （３）完全なｐ２８蛋白質配列を含む特許請求の範囲第
    １項又は第２項に記載の蛋白質。
  4. （４）その合成が第１図又は第１６図のｃＤＮＡ又は該
    ｃＤＮＡのフラグメントにより指示され、且つ、天然の
    ｐ２８蛋白質に対して生じる抗体により認識される蛋白
    質に対応する特許請求の範囲第１項に記載の蛋白質。
  5. （５）バクテリアから製造される特許請求の範囲第１項
    乃至第４項のいずれかに記載の蛋白質。
  6. （６）酵母から又は細胞培養物から製造される特許請求
    の範囲第１項乃至第４項のいずれかに記載の蛋白質。
  7. （７）特許請求の範囲第１項乃至第６項のいずれかに記
    載の蛋白質の発現のためのブロック又はベクターを含む
    細胞。
  8. （８）バクテリアのプロモーターの制御下に特許請求の
    範囲第１項乃至第６項のいずれかに記載の蛋白質をコー
    ドする遺伝子を含むプラスミドで形質転換されたバクテ
    リアである特許請求の範囲第７項に記載の細胞。
  9. （９）酵母のプロモーターの制御下に特許請求の範囲第
    １項乃至第４項及び第６項のいずれかに記載の蛋白質を
    コードする遺伝子を含むプラスミドで形質転換された酵
    母である特許請求の範囲第７項に記載の細胞。
  10. （１０）コーディング遺伝子が、第１図又は第１６図の
    ｃＤＮＡ配列の全て又は一部から成る特許請求の範囲第
    ８項又は第９項に記載の細胞。
  11. （１１）特許請求の範囲第１項乃至第４項のいずれかに
    記載の蛋白質をコードする遺伝子を含むポックスウイル
    スであって、該遺伝子がポックスウイルスによる該遺伝
    子の発現を可能とする要素の制御下にあることを特徴と
    するポックスウイルス。
  12. （１２）ポックスウイルスがワクシニアウイルスである
    特許請求の範囲第１１項に記載のポックスウイルス。
  13. （１３）上記遺伝子の発現を可能とする要素が、ワクニ
    シアの７．５Ｋ遺伝子のウイルス性プロモーターを含む
    特許請求の範囲第１２項に記載のポックスウイルス。
  14. （１４）上記遺伝子の発現を可能とする要素が、シグナ
    ル配列及び狂犬病糖蛋白質のトランスメンブレン領域を
    コードする配列を含む特許請求の範囲第１３項に記載の
    ポックスウイルス。
  15. （１５）特許請求の範囲第１１項乃至第１４項のいずれ
    かに記載のポックスウイルスで感染された哺乳類の細胞
    。
  16. （１６）特許請求の範囲第７項乃至第１０項及び第１５
    項のいずれかに記載の細胞を適当な培地中で培養し、第
    １項乃至第６項のいずれかに記載の蛋白質を回収するこ
    とを特徴とする特許請求の範囲第１項乃至第６項のいず
    れかに記載の蛋白質の製造法。
  17. （１７）特許請求の範囲第１項乃至第６項のいずれかに
    記載のｐ２８蛋白質をコードするＤＮＡ配列。
  18. （１８）第１図に示すＤＮＡ配列。
  19. （１９）第１６図に示すＤＮＡ配列。
  20. （２０）特許請求の範囲第１項乃至第６項のいずれかに
    記載の蛋白質の少なくとも１種又は特許請求の範囲第１
    １項乃至第１４項のいずれかに記載のポックスウイルス
    を活性成分として含有する、特に住血吸虫症の予防用製
    剤。
  21. （２１）活性成分として、特許請求の範囲第１１項乃至
    第１４項のいずれかに記載のポックスウイルスであって
    、生きているウイルスを含有する特許請求の範囲第２０
    項に記載の製剤。
  22. （２２）活性成分として、特許請求の範囲第１１項乃至
    第１４項のいずれかに記載のポックスウイルスであって
    、死滅したウイルスを含有する特許請求の範囲第２０項
    に記載の製剤。
  23. （２３）人又は動物に注射し得る形態にある特許請求の
    範囲第２０項乃至第２２項のいずれかに記載の製剤。
  24. （２４）特許請求の範囲第１項乃至第６項のいずれかに
    記載の蛋白質に対して生じた又は特許請求の範囲第１１
    項乃至第１４項のいずれかに記載のポックスウイルスに
    より誘発された抗体。
  25. （２５）特許請求の範囲第２４項に記載の抗体又は特許
    請求の範囲第１項乃至第６項のいずれかに記載の蛋白質
    を含有することを特徴とする住血吸虫症診断剤。
  26. （２６）特許請求の範囲第１項乃至第６項のいずれかに
    記載の蛋白質を含有するグルタチオンＳ−トランスフェ
    ラーゼ活性薬剤。
  27. （２７）蛋白質が、ｐ２８Ｉ蛋白質である特許請求の範
    囲第２６項に記載の薬剤。
  28. （２８）特許請求の範囲第７項乃至第１０項及び第１５
    項のいずれかに記載の細胞を含有するグルタチオンＳ−
    トランスフェラーゼ活性薬剤。
  29. （２９）特許請求の範囲第２６項又は第２７項に記載の
    薬剤に用いられる蛋白質又は特許請求の範囲第２８項に
    記載の薬剤に用いられる細胞を転換剤として用いること
    を特徴とするグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ活性
    を用いる微生物学的転換方法。
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