JPS62501355A - アドヒシン抗原類 - Google Patents
アドヒシン抗原類Info
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
アドヒシン抗原類
この発明は特に、例えば哺乳類の免疫感作に有用な抗原、その抗原に対して生成
される抗体及びその抗原から製造されるワクチンに関する。
病原性細菌菌株もしくは種において、明確な表現型(phenotype )を
形成するいくつかの蛋白で構成され、それ故に多数の免疫原性を有する抗原決定
基を有すると当然考えられる抗原類は広く知られている。しかし、かような抗原
類及びそれらから製造されろワクチン類はいくつもの不利な点がある。特にそれ
らは、免疫感作を行う際に、抗体が、抗原が得られたひとつの特定細菌菌株を鉦
明するこれらの免疫原性抗原決定基(immunogenic determi
nant)に対して形成されるが、同一種の他の細菌菌株に対しては形成されず
、その結果免疫感作がこの特定菌株1こ対してだけ行われ他の同一の種の極めて
関連の深い菌株に対しては行われないという点で著しく選択性であるという傾向
がある。
この発明は、所望の免疫をもたらす免疫原性抗原決定基だけを実質的に汀し、さ
らに問題の病原性細菌の一つの特定菌株に限定されない抗原を提供することによ
って、これらの不利な点を克服するのを目的とするものである。
多くの病原性細菌の、細胞表面lこ接合する能力は多くの伝染病の発病に極めて
重要であるということがますます明らかになってきた〔ビーチエイ(Beach
eY ) + ジャーナル□ オブ イ′フエクシャス ディジージズ(J、
Infect、Dis、 )、第143巻、1981年、第825〜345頁〕
。この接合能力(adhesion capacity )はと皮細胞のごとき
哺乳類のMi織柵胞もしくは哺乳類の赤血球とに存在する受容体によっても1こ
らされるもので、その受容体はその配置構造(configuration )
にしたがってアドヒシン ポリペプチド類と結合する。〔この明細菫において、
″アドヒシン ポリペブチF (adhesinpolypeptiae )
”という用語は、接合の表現型を特に必要とするペプチド及びより一般的にいえ
ばそれが存在しなければ接合が(いかなる理由があろうとも)起らないポリペプ
チドの両者ヲ示ス1こめのものである。〕各受容体は異なるアドヒシン構造体と
結合すると考えられる。この受容体は、糖または、より一般的lこはノイラミン
酸−(2−3)−ガラクトース、マンノース−α(1→2)−マンノースもしく
はジガラクトシド〔この明細書において時々グロボシドと呼称さnるグリコリピ
ド類のグロボシリーズ(globoseries )中に存在するa −D −
Galp−(1−4)−β−D−Galp基〕fζ存在するアミノ酸のようなペ
プチド受容体であってもよい。
多くの病原性細菌1こおいて、適切なアドヒシン ポリペプチドは、いずれにし
てもすべてが接合機能に関連するポリペプチド類(例えば細胞壁を通じてアドヒ
シンの速段を仲介するかもしくはアドヒシンを細胞壁の外表面などに固着させる
ポリペプチド類)の大きな塩基配列(5equence )の一部だけを形成す
ると信じられ、そしてこの発明の目的に従って、特定のアドヒシン ポリペプチ
ドはその塩基配列の他のポリペプチド類中に見出され抗原として使用される。こ
れは選択性のより小さな同定マーカーを溝底すると考えられ、その結果、抗体は
抗原が得られる菌株に対して生成するのみならず、同じ細菌種の他の病原性菌株
に対しても生成される。
従ってこの発明は、その免疫感作を行う主要構成要素として、アドヒシン ポリ
ペプチドもしくはその免疫原性的に活性す部分配列(5ubsequence
)もしくは免疫学的に活性な形態に変換しうるその前駆体の、抗原決定基からな
り、その抗原決定基に対する抗体が、呵乳類組織と接合する病原性アドヒシン形
成細菌によ、って産生されたアドヒシン ポリペプチドと反応するものである抗
原に関する。この抗原は、アドヒシン ポリペプチドの少なくとも五つのアミノ
酸から全アミノ葭までのアミノ酸塩基配列を有していてもよい。
アドヒシン ポリペプチドはアドヒシン形成細菌より簡単に得ることができる。
この群の細菌にはダラム陽性菌とグラム陰性菌の両者が含まれ、そしてこの明細
書において最も興味深い細菌種は、1以との特定の7ドヒシン ポリペプチド類
が有利にえられる細菌種であり、すなわち泌尿器病原性もしくは腸内病原性菌株
である、エシェリヒア・つり(Escherichia C○li)もしくは他
の腸内細菌もしくは口内細菌、不イセリア・ゴノルホニ(Ne1sseria
gonorhoeae )、不イセリア・メニンギデイテイス(Neisser
ia meningjfflitis)、 不イセリア゛キャタルハリス(Ne
:Lsseria catarrhalis ) 、イニルシニア゛ニスピーピ
ー(Yersinia spp、 )、スートモナス・ニルギノーサ(Pseu
domonas aeruginosa )もしくは他のスートモナス・ニスピ
ーピー(Pseudomonas spp、 )+ モラキセラ°ボビ7(Mo
raxella bovis )もしくは他のモラキセラ・エスピービー (M
oraxalla spp、 )、バクテロイデス・ノドスス(Bactero
ides nodosus )、スタフィロコッカス・エスピービ(5taph
ylococcus spp、 )、ストレプトコッカス・エスピーピー(5t
reptococcus 、 Spp、 )、ヨfコはボルデテラ゛6ルソ′ス
(Bordet、ella pertussis )のごときボルデテラ・エス
ピービー(Bordetella spp、 ) である。
一方アドヒシン ポリペプチドは下記のようにして合成的1こ製造することがで
きる。
この群のいくつかの病原性細菌については、細胞壁から突出する線毛(pili
(fizbriae ))と呼称される繊維状構造物があるいみて接合と関連
しており、それ故1こま1こ線毛は容易に精製できるので、全線毛製剤(who
le pili preparations)がワクチン中の抗原として使用さ
れてき1こ。例えばゴノコツカス線毛抗原(gonococcus pili
antigen)(米国陸軍で実地テストされた)がある。
線毛製剤を研究している従来の研究者達は、蛋白の特性づけと免疫感作の1こめ
に“純粋な”線毛蛋白を作製しようと永年研究してきた。そして彼等の努力は彼
等の製剤がSDSゲル中に一つのバンドを示すだけであるという点で成功し1こ
ことは明らかである〔米国特許第4,448,431号(ブキャナン・ティ・エ
ムら< Buchanan T、 M、 et al ) ) ;サリートーフ
イ・イー及びイー・シー・ゴツトリソシー+−(5aliet 1. E、 a
nd E、 O。
Gottlisch )、ジャーナル オブ エクスペリメンタル メデイスン
(J、 Exp、 Mea、 )第146巻、1977年、第1169頁;クレ
ム・ビイ、アイ・オルスコツおよびエフ・オルスコツ、I(Kム°アエPシ・、
12ツ°v、a、;d、、F・qゞザ7蛍、カイ(工。、。。、□。。
and Immunity) M 36巻、1982年、第462頁;スクール
ニック・シイ・ケイら(5choolnik G、 K、 et al )、ジ
ャーナル オブ エクスメンタル メデイスン(J、 Exp、 Med、 )
。
第159巻、1984年、第1351頁;スバンボルグ・イー・シー(Svan
borg E、 O,)、プログ・アレルギイ(Prog −、ulergy)
。
第38巻、1988年、第189頁 。得られ1こ線毛蛋白製剤は少なくとも三
つの機能を示した。第一の機能は、おそらく疎水性結合プロセスを通じてポリマ
ーを形成する能力であり、すなわちモノマーのサブユニットから線毛フィラメン
トを形成するために必須の性質である。第二の性質は抗体を発生させる能力であ
り、すなわちその蛋白をワクチンとして用いようとする場合に必須の性質である
。第三の性質は細胞表面の受容体に接合する能力である。研究者らは、線毛自体
の中はもとより、彼等の線毛蛋白製剤中にひとつの蛋白しか同定できなかつ1こ
ので線毛は同一のモノマーの蛋白サブユニットの高分子状集合体でエムら(Bu
chanan T、 M、 et al) ) ; 0 スバード・シエイ・ビ
イ(Rothbard J、 B、 )、 P N A S 第82巻 198
5年第915頁〕。しかし前記のように、単一の種から得た完全な全線毛は大き
な抗原の多様性を有する。加うるにワクチンとして用いると、卓−抗原型の完全
な全線毛は、シェアーされた( 5hared )線毛抗原よりもむしろ単−抗
原型に対して主とじて抗体を産生ずる。従来の研究者らは、精製された線毛サブ
ユニットを化学的に切断して指名された機能二重合機能、共通する抗原機能及び
結合機能を葡するフラグメントとした。それぞれ個々の機能は精製され1こ線毛
のサブユニットの別個のフラグメントで同定され1こ。かくして精製され1こ線
毛蛋白製剤は単一の蛋白−ビリンモノマー(pilin monomer )を
含有すると考えられてき1こ。このビリンモノマーは化学的に分解されたが結合
機能と主要な抗原性−毘分化された純粋な線毛蛋白と同−物一を含有すると考え
られてき1こ。
しかし、本願出願人らによって行われ1こ広範な研究は、仮定丘の純粋の線毛蛋
白が実際に、別個の機能を葡するいくつかの蛋白フラクションで構成されている
ことを示している。事実、線毛フィラメントは細胞表面での接合の原因ではなく
て、該フィラメントにおそらく結合している汚染物とみなされる少量成分が、細
胞表面での接合の原因物質である。この独特の所見は線毛の構造形成およびその
ジガラクトシド受容体への接合性が遺伝子的に除去されうるという事実だけを根
拠にしているものである。認識しうる程度の線毛構造を残しているが接合できな
い他の突然変異微生物はさらにこの所見を確認している。この所見は、さら1こ
、以前純粋であると考えられていた線毛蛋白が少なくとも二つのフラクション、
すなわち線毛の実際の形成時に含有されている構成要素の一つ及びその接合性の
原因のフラクションであるもう一つのフラクションを含有しているにちがいない
ということを意味する。両フラクションが抗原性を葡するという事実は、接合性
の原因であるフラクションだけに対して抗体を生成する可能性を開いたのである
。
線毛運搬細菌の場合も、もし存在するならば小さな菌株選択性を示す抗原を産生
するのが汀利である。そしてかような抗原は、全線毛の構造の一部を形成し、持
にその接合能力を仲介する1以七のザ素を確認し産生ずることによって得られる
。この明8書において、かような成分は線毛アドヒシン ポリペプチド(pil
us adhesin polypeptide )と呼称される。立起事項に
よれば、線毛アドヒシン ポリペプチドは、通常、病原性の線毛形成細菌から得
られる線毛の全線毛アミノ酸配列の少数の成分からなり、ビリン(線毛繊維の大
部分を形成する、精製線毛のサブユニット)とは異なるうこの目的に吾用な線毛
形成細菌の例は、泌尿器病原性もしくは鳴門病原性菌株の、エシェリヒア・コリ
、不イセリア・コ゛ノルホエ、不イセリア・メニンギデイテス、不イセリア・キ
ャタルハリス、モラキセラ・ボビスまたは他のモラキセラ・エスピーピーおよび
ボルデテラ・ペルッシスである。
この発明の1こめの、この明日身に開示さnfコ研究は主として、腎孟炎を起こ
す尿路病原性菌株のエシェリヒア・コリに関するものである。しかし、線毛アド
ヒシンの遺伝情報を指定する種々のエシェリヒア・コリの遺伝子システムは非常
に類似しており、その結果、接合を仲介するかような少数の線毛成分がすべての
タイプの線毛に存在し、すなわちエシェリヒア・コリ以外の細菌由来の綿毛にも
存在することは理解さるべきである。受容体(もしくはその受容体の一部)とア
ドヒシン分子との連結構造による、病原性線毛形成細菌の結合にあずかる受容体
は、泌尿器病原性エシェリヒア・コリについては、グリコリピドのグロボシド受
容体fこ存在するα−D−Galp −(1−4)−β−D−Galp部分であ
るジガラクトシドであると同定されtこ。
そしてこのジガラクトシドは、前記細菌のウロエピセリウム(uroepith
elium )に連結していてもよく、またヒト赤血球にP血液型抗戦の一部と
して存在する。
この発明をも1こらず研究経過において発明者らは、少なくとも八つの異なるポ
リペプチドの遺伝情報を指定することが分かった8、5kb長の部位のPap
pili (腎孟炎に関連する線毛)をインコード(encode)する、泌尿
器病原性のエシェリヒア・コリ菌株の染色体部位を同定し1こ。よ1ここの発明
の発明者らは、それが存在しないとエシェリヒア・コリが接合しないポリペプチ
ドを完成し1こ。それ故にこれらのポリペプチド類は泌尿器病原性エシェリヒア
・コリの接合表現型の原因であると考えられる。し1こがって、この発明は次の
アミノ酸配列の抗原に関する。
?Jet−Lys −Lys −Ile −Arg−Gly−Leu −Cys
−Leu −Pro −Val−hx=t −Leu−G撃凵|Ala−Va
l −
Leu−Met−S er −Gln −EJ’is ’−Val −Hls
−Ala −Val −Asp −Asn −Letl −shr−Phe −
Arg −G:ty −Lys−Leu−11e−工1e −p ro−A、1
a−0’JS −Thr−Val −Ser −Asn −Thr−Thr−
Va戟@〜Asp 岬rp −
Gln−Asp−Val−Glu(le −Gln−’I−ト1r−Leu−8
er−G1 計Asn−G1y−iへ−c;n−H1s−G撃普|Lys −
Glu−Phe−Thr−Val−A、Sn−Me t−ATg (!yS −
Pro −’I¥r −Asn−Leu 41’l’−Th秩|Met −
Lys−Val−Thr−11e−Thr−Ala−Thr−Asn−Thr’
ryr−zへxn−Asn−Ala−11e −Leu−V≠戟@−
Gln−AF+n−Thr −5er−ASn−Thr−8er−8er−AS
p −Gly−Leu−Lell −Val −Tyr−L■普|
Tyr−Asn−8er−Asn41a −Gly−Asn−11e−Gly−
Thr−u a−Ile −Thr−Leu−Gly−Th秩|
PrO−Phe −Thr−Pro−Gly−Lys −I le −Thr−
Gl”)r −ASn−Asn−Ala−Asp −LYS@−Thr −Il
e −
8er−Leu−His−Ala−Lys −Leu −GIY−Tyr−Ly
s−Gly−Asrhう1et−Gln−Asn−Leu−P1e−
Ala −Gly −p ro −Phe −S er −Ala −Thr−
Ala−Thr−Leu−Val −−Ala−Ser■’凾秩|8er
もしくはその免疫原性的に活性な部分配列、まtコはMet−I le −Ar
g−Leu−5er−Leu−Phe −I 1e−8er−Leu−Leu−
Leu −Thr−8er −V≠戟@−、ua −
Val −Leu−Ala−ASp −#al−Gln−11e −Asn−I
le−Axg−Gly−Asn −Val −Tyr −1Pe −Pro −
Pro −CyS −Thr−Ile −Asn −Asn−ely −Gin
−kfsn−Ile −Val −Val −Asp −垂■■@41Y −
Asn −
I le −Asn −Pro −Glu−LTiS −Val −Asp −
Asn−8er−Arg−Gl/−Glu−Val −Th秩|Lys −Th
r −
I 1e−8er−I 1e−8er−Oys −Pro −Tyr −LYS
−8er−Gly−8er−Leu−Trp −I le@−Lys −Va
l −
Thr−Gly−Asn−Thr−Met −Gly−Gly −Gly (3
1n−Asn−Asn −#al −Leu−Ala −T■秩@−
A Sn −11e−Thr−His −Phe −Gly−11e −Ala
−Leu −Tyr−Gln−Gly−LyS−cay −le t−5er
−
’rhr−Pro−Leu−Ile−Leu−GIy−ASn −GIY−8e
r −GIY −Asn −GIy−Tyr −GIY −ual −Thr−
Ala −G1’)’ −Leu−Asp −Thr −Ala−Arg−8e
r−Thr−Phe −Thr−phe −Thr−s ■秩|Val −
P ro−Phe −AXg −Asn−Gly−5er−Gly−11e −
Leu −AEn−Gly−Gly−Asp −Phe nPn−
Thr −Thr −Ala −s er−Met−ser −Met −11
e Jpyr−Asnもしくはその免疫原性的に活性な部分配列、ま1こは
Met−Lys −Lys −Trp −Phe −Pro −Ala −Ph
e −Leu−Phe −Leu −8er −Leu−8■秩|Gly−
Gly−ASn−Asp−Ala−Leu−Ala−Gly−Trp−I(is
−Asn−Val−uet−phe−Tyr−Ala−Phe −Asn −A
sp−Tyr−Leu−Thr−Thr −Asn−Ala−Gly−Asn
−Val −Lys −Val −hle −
Asp−Gln−Pro−Gln−Leu −’Pyr−Ile −Pro ”
rrp −Asn−Thr 41y−8er−Ala−Th秩@−Ala −
Thr−Tyr−T”)rr−8er−Cys −8er−Gly−pro −
Glu −Phe −Ala−8er Gly−Val −sYr −
Phe −Gln −Glu−T’1r−Leu−Allla −’rrp q
Met−Val −Val −PrO−L”)’8−Hl3|Val Jlly
r ’I’hr−
Asn −Glu−Gly−Phe −ASn −I le −Phe −Le
u −Asp −Val −Gln −8Sr −LyS iIlyr−ely
−
’rrp −ser−Met −Glu−Asn −Glu −Asn −As
p −LyS −Asp −Phe −’ryr −Phe@−Phe −Va
l −
Asn−Gly−Tyr−Glu−Trp −Asp −’I’hr−Trp−
Thr−Asn−ASn −Gly−Ala−Axg −I@1e −
0ys−Phe−Tyr−Pro −Gly−Asn−hイet−Lys−Gl
n−Leu=Asn−Asn−Lys−Phe −ノ(JS氏|
Asp −Leu−Val−Phe −Arg −Val −Leu −Leu
−pro −Val −Asp −Leu −Pro −L凾刀@−GIM −
ffis −Tyr −ASn −Phe−Pro −Val −Arg −T
yr−I 1e −Arg−Gly−I 1e −Gln−高刀@−i S −
Tyr −
Tyr−Asp −Leu −Trp −Gln −Asp =His −1p
yr −LyS −Met −Pro−’II’/r−As吹@−Gln (l
e −
L:)’8−G1 n −Leu −P rO−Ala −Thr −Asn
−Th r−Leu −Me t −Tj3u−Se r |Phe −Asp
−As n −
Val −GI M (31:)’ −0yS (31n −P ro −8e
3 r −Thr −e:tn −Val −Leu −Aan −I 1 e
−Asp −[1B −Gly −8er−11e−Val、−11e4qp
−Arg−Ala−Asn−Gly−Asn−11e−Ala−8er−Gln
−Thr−Leu|
8er −I le −Ty r −cyS −Asp −Val −pro
−Val −8er −Val −L’7B −I le |8er −Leu
−Leu −Arg −As n −Thr −p rO−P rO−I l
e ”ryr −ASn −Asn −Asn、−L’)’5−Phe −s
e r@−Val −Gly −Leu −
Gly−Asn−Gly−’I’rp −ABp −8er−11e −11e
−8er−Leu−Asp ()ly−Val −Glu |Gln−8er−
Glu −Glu −I le −Leu −Arg −Trp ’ryr −
Thr −Ala −Gly−Ser −Lys −Thr@−Val −Ly
s −I le −
Glu −8e r−Ari: −Leu −’ryr−Gly−Glu−Gl
u−Gly−Lys−Arg −Lys −Pro−Gly|Glu −
Leu−8er−Gly−8er−Met−Thr−Δfet−Val−Leu
−8er−Phe−PrOもしくはその免疫原性的に活性な部分配列である。
これらのアミノ酸配列は実施例5に記載の公知の方法によって確認され1こ。
後者の二つの抗原がないと、すべての場合に(下記実施例3参照)グロボシド受
容体への結合がなくなることを明確に示し、それ故にこれらの雨音はアドヒシン
ポリペプチド プロパーであると考んられる。一方前者の抗原はある種の環境
内だけで結合がなくなることを示しく下記実施例3参照)、それ故細胞壁の外表
面に形成され1こアドヒシン ポリペプチドを固定スるのに必要であると考えら
れる。
上記アミノ酸配列は、N−ターミナル・シグナル・ペプチド様配列を含む線毛ア
ドヒシン ポリペプチドの前駆体の形態であり、その配列はポリペプチドが細菌
内膜を通じて外部へ輸送されるときに分割されることに留意すべきである。
この発明1こついて、この発明の抗原は、その抗原が免疫感作に用いられる際に
多種類の抗体を形成しその結果、前記要約のような不利益かも1こらされるのを
避ける1こめに、線毛の他の成分のごとき接合機能1こ関連する成分以外の成分
を実質的に存していないのが好ましい。最も好ましいのは、抗原が実質おに純粋
な形態であり、すなわち、いずれにしてもアドヒシン形成に関係しないが、好ま
しくない免疫学的な反応を起こすかもしれない他の抗原決定基を含まない抗原で
ある0他の態様として、この発明は、その主要な免疫感作成分として、アドヒシ
ン ポリペプチドもしくはその免疫原性的に活性な部分配列もしくは兄敷学的に
活性な形態に変換しうるその前駆体の、抗原決定基からなる前記抗原に対しもし
くは実質的に前記抗原に対してのみ生成される抗体1こ関する。かような抗体は
、前記定義の抗原で免疫にされうる動物を免疫にし、それ自体公知のしか1こで
、動物から免疫グロブリンのごとき抗血清を漫ることによって得られるものであ
ってもよい。その免疫感作は抗原の安定化された水溶液によって行うのが好まし
い。すなわち、安定化剤はリン酸塩緩衝液もしくは補助剤(抗原性をさら1こ増
大させる1こめに)であってもよく、適切な補助剤はフロイントの補助剤(Fr
eund’s adjuvant)もしくは水酸化アルF。
ニウムである。免疫感作するのに豚の免疫グロブリンも抗体として用いられるが
、好ましい動物はマウス、ラビット、山羊および羊である。動物を出血させ抗血
清を分離するのは公知の方法によって行われる。
この発明による抗体も実質的に純粋な形態が好ましく、この形態の抗体は下記の
ように診断用に有用になる。
一方、その抗体も、抗体類の公知の製造法であるハイブリドーマ技術fこよって
製造することができる。例えば免疫感され1こ動物としてマウスを使用するハイ
ブリドーマ技術lこおいで、マウスは問題の抗原で免疫にされ、免疫にされ1こ
マウスから得1こ牌臓細胞が骨髄腫細胞と融合され次いで融合ハイブリドーマ細
胞がクローンされ、抗体産生細胞が適切な増殖培地中で培養され、抗体がその培
養物から回収される。ハイブリドーマ技術で得られ1こ抗体は大きな特異性を奮
し、それ故に例えば一層優れ1こ精度の診断ができるという利点をnする。また
さらに進んだ段階においては、組換えDNA技術を用い、その抗体をインコード
する単一もしくは複数の遺伝子がハイブリドーマ細胞クローンから適切なベクタ
ーに転移され(transfer )、ソノハイブリッドベクターが適切な細菌
の宿主に形質転換され、該宿主は適切な培体で培養され、次いで得られ1こ抗体
が培養物から回収される。この方法では抗体を改善された収率で得られる。
ああ−−その宿主は、エシェリヒア・コリもしくはバチルス・ズブチリスのごと
き組換えDNA技術の分野で通常用いられるものであってもよい。
この発明の非常に重要な態様は哺乳類の組織fこ接合する病原性i菌が原因で起
る疾病1ζ対して、その哺乳類を免疫にするjコめのワクチンに関するものであ
る。そしてそのワクチンは、任意に適切な担体1こ結合されたと記抗原の免疫原
性的に冑効量と、免疫学的に受容な賦形剤とを含有する。この賦形剤は、稀釈剤
、分散剤、補助剤などのごときワクチンの製造に通常用いられるいずれの賦形剤
であってもよい。
い(つかのケースでは、抗原がそれ自体で重合する傾向がある場合、担体を用い
ることは必要でないが、このような場合以外には、抗原を担体に共有結合的lζ
結合させるのが育利である。
この担体は通常高分子物の担体であり、特にワクチンがヒトを免疫化するのに用
いられるときには、それは生理的に受容であることが重要である。抗原の固定化
用の非毒性および/ま1こは非アレルゲン性担体は公知である。例えばアーノン
(Arnon )。
ジャーナル オブ インムノロジカル メソッズ(J。
Immunological Methods )、第61巻、1988年、第
261〜273頁である。この目的のため現在有用であると注目されているこの
タイプの担体は例えばポリーL−リシンおよびポリ−D、L−アラニンである。
天然の担体も非毒性で非アレルゲン性であれば用いてもよい。
この発明はさらに、かようなワクチンの製造法に関し、すなわちそのワクチン中
の、免疫原性的に有効な鰍の前記抗原が、任意に適切な担体に結合され、ワクチ
ン製剤(こ所望濃度の抗原を付与する量の免疫学的に受容な賦形剤と合せられ、
1コとえば混合されるワクチンの製造法に関する。
この発明の方法の特別な態様において、少なくとも五つのアミノ酸からなる免疫
原性的に活性なアミノ酸配列はと記の担体の一つのごとき生理的に受容な担体に
共有結合的に結合されている。融合ポリペプチド製造の技術は、例えばキャサダ
バンら(Oasadaban et al)、イソッズ イン エンザイモロジ
イ(Methods in Bnzymology L第100巻、1988年
、第293〜308頁によって公知である。
この発明の方法の他の態様では、立起抗原をインコードするヌクレオチド配列が
生理的に受容な担体のポリペプチドをインコードするヌクレオチド配列に融合さ
れ、その融合されたDNA配列が適切なベクターに挿入され、得られたハイブリ
ッドベクターが適切な細菌宿主(C形質転換され、得られた宿主が適当な培地中
で培養され、融合ポリペプチドがその培養物から回収され、任意に精製される。
さらに他の態様では、この発明は、前記抗原をインコードするヌクレオチド配列
から少なくともなるDNAフラグメントに関する。このDNAフラグメントは実
質的に他の抗原をインコードしないものが好ましい。そのヌクレオチド配列は、
実質的に全アドヒシン ポリペプチドをインコードするものか、免疫原性的に活
性な形態に変換しうるアドヒシン ポリペプチドの前駆体をインコードするもの
か、またはアドヒシン ポリペプチドの免疫原性的に活性な部分配列をインコー
ドするものであってもよい。免疫原性的活性を有するアミノ酸配列の情報を指定
する1こめには、そのDNAフラグメントは少なくとも5コドン(トリブレット
)の長さを胃していなければならない。このDNAは、病原性のアドヒシン形成
細菌類の、染色体もしくはプラスミドに存在する遺伝情報の一部であってもよく
、これら細菌の代表例は、泌尿器病原性菌株もしくは腸内病原性菌株である、エ
シェリヒア・コリもしくは他の腸内細菌もしくは口内細菌、ネイセリア・ゴノル
ホエ、ネイセリア・メニンギデイテイス、ネイセリア・キャタルハリス、イエル
シニア・エスピービー、スートモナス・エルギノーザもしくは他のスートモナス
・エスピービー、モラキセラ・ボビスもしくは他のモラキセラ・エスピービ+、
バクテロイデス・ノドスス、スタフィロコッカス・エスピービー、ストレプトコ
ッカス・エスピービー、ま1こはボルデテラ・ベルッシスのごときボルデテラ・
エスピービーが挙げられる。
かくしてそのD N Aフラグメントは、泌尿器病原性もしくは腸内病原性菌株
である、エシェリヒア・コリ、不イセリア・ゴノルホエ、不イセリア・、メニン
ギディティス、不イセリア・キャタルハリス、モラキセラ・ボビスもしくは他の
モラキセラ・エスピービー、まTこはボルデテラ・ペルッシスのごとき、病原性
線毛形成細菌白米であってもよい線毛アドヒシン ポリペプチドの遺伝情報を指
定するDNAもしくはそのDNA配列の一部であってもよい。
例示の1こめに、DNAフラグメントはエシェリヒア・コリの病N性菌株から得
られる1以七のアドヒシン ポリペブチI’(7)遺伝情報を指定するDNA配
列を全部もしくは部分的に含有するものであってもよい。し1こがってこの発明
は、主要構成要素として下記DNA配列で構成されているDNAフラグメントに
ACTGATTATTCOTGOOTGTACTGTAAGOAA(:!AOA
A、C!’IGTTGACTαIAG−GATGTAGAGATTCAGACC
OTGAGTOAAAATGGんBTC!ACGAAAAAGA胛−TTAOT
GTGAATATGOGGTGTCCoTATAATOTGGGAAOAATG
晶替TT’AC! −G、1]請CGGCAA CA!A請OAO’rTAT、
LAOAATGO’T’ATTTTAGTTCAGAATAOA−TOA=uC
AO−A、TCTTOTGAT(T’、GGTTAOT CGTTTATG!T
TTATAAOAGTAATG−CAGGAA、A、’LATTGGGACTG
CGATAAC!TTTA(EGG、へCTCCATTTACGCCCGG−A
AA−’L4TCACAGGTAATAATGOAG、’1TAA、AA、CT
−A−TATCACTTOATC’=OCA AA−CTTGGATATQAA
(X’−GAATAT(DA、GAATTTGATAGCCGGTCCT’l’
TCT(、!T−(遭:しへ−4,0A(X!AACGOT(ンGTT(ン0A
TOATATTOGTAA 、ま1こはATGATTCGTTTATCATTA
TTTATATCGTTC=CTTCTGACA、TC(EGTCGCT−GT
ACTGGC!TGATG’[’GCAGA、TTAACATCA(K;GGG
AA’JX3TTTATATCCOC−ACGGGAAA’I’AOTAT G
GGAGGAGGTCAGAATAATGTA、OT 0GOAAOAAAT−
ATAAC’11’C! ATTTTGG TATAGoGC! TGTATC
A(E(’JGAA、AAGGAATGTG!AACAO−0TTATATTA
GGTAA’TGGTT CA(EGA、AAT GGTTkCGGAGTGA
OA(XI!AGGT−TGA(30ATGATTTATAAOTGA 、ま1
こはATGAAAAAATIGG’I”TOOCT(ECTTTTTTATTT
TTAT C00TGTCA(E(’aX裡−AATGAT GOTTTAGC
TGGATGGOAC!AATGTOATGTTTTAT(K!TTTTAAO
−GAC!TATTTAACTAOA4ATGCT(FG’PAATGTTAA
GGTTATTGACCAACCT−CAGOTATATATAC! CCT(
FGAA、TACAGGOTCTGCTACAGOAACTTATTAT−GA
AAAT(子AC尤υ、GATTTTTACTTCTTTGTTAATG(迂T
ATG尤ムTαIAT−ACATGGACAAATAA、TGGTGCO(:!
GTATATGTTT CTATCICTGGA請ATATG−CCC(EGG
GAGCTATOTTGGTT CTATGACTAGTGTTOTGAGTT
TCCCCTGAまたは、表現され1こ場合に、を記の全DNA配列のいずれか
ひとつによってインコードされるアドヒシン ポリペプチドの免疫原性的に活性
な部分配列を構成する、そのいずれかの部分配列。
それぞれのDNAフラグメントの配列は、実施例4に記載の公知の方法で樹立さ
れtコ。
別の重要な態様において、この発明は、少なくとも後記定義の抗原をインコード
するヌクレオチドタイプ配列からなり、また実質的に他の抗原をインコードしな
いDNAフラグメントが挿入されたハイブリッドベクターを収容する細菌宿主が
培養され、前記DNAフラグメントから表現されt4:産物を回収し次いで任意
に精製されることからなるその主要な免疫感作成分としてアドヒシン ポリペプ
チドの抗原決定基を有する抗原の製造法に関する。
アドヒシン ポリペプチドもしくはその免疫原性的に活性な部分配列もしくは遺
伝学的に活性な形態に変換しうるその前駆体をインコードするDNAフラグメン
トは、例えば、該フラグメントが実際に存在する細菌DNA、から該フラグメン
トを例えば次のような組換えDNA技術で切りとることによって得ることができ
る。
一つのアドヒシンーポリペプチド産生細菌から染色体DNAが制限酵素を用いて
切りとられ、個々のDNAフラグメントが適切なベクターとリリゲート(rel
igate ) され、次いでそのベクターが適切な細菌宿主に形質転換される
。次いでベクターを受けとつに細菌のクローンは、特定の受容体をイアするいず
れかの固体表面に結合する性能によって評価されるアドヒシン機能について、例
えば標準法の赤血球との凝集法によって試験される。次いでアドヒシン機能を保
持してきたクローンから#:DN Aフラグメントを適切なベクターにサブクロ
ーンし、次いでトランスポゾン変異法(transposon mutagen
esis )およびる性質を保持する最小のDNAフラグメントを有するサブク
ローンを作製できる。これによって、細胞表面アドヒシン機能を表現するDNA
オペロンの、必要な最小のピースが得られる。
さらに、組換えDNA技術を利用するトランスポゾン変異法もしくは欠失法によ
る操作が、アドヒシン ポリペプチドを表現できる性能を保時または保持しない
、オペロン中の個々の遺伝子を同定するのに用いられる。次いでアドヒシン ポ
リペプチドを表現する単一もしくは複数の遺伝子が適切なベクターに挿入され、
また任意に適切なブロモ−クーを挿入して単一もしくは複数の7ドヒシン ポリ
ペプチドの表現を増大させる。次いでそのベクターは細菌、例えばエシェリヒア
・コリもしくはバチルス・ズブチリスのごときグラム陰性細菌のごとき適切な宿
主生物に形質転換される。この最後の段階での他の方策はアドヒシン ポリペプ
チド産生に必須でない遺伝子を選択的にブロックするか脱離する方法であり、そ
の遺伝子はエシェリヒア・コリの場合、DNAオペロンの上記の必要な最小ピー
ス中のpap Aとpap Oである。
主要な(major )線毛構成成分と混合して小さな(m1nor )線毛ア
ドヒシン ポリペプチドが存在している(通常同じオペロンから産生される)製
剤からその小さな線毛アドヒシン ポリペプチドを古典的な化学的方法によって
M1!Aすることは、本来、免疫原性である前記構成成分が非常に大量存在して
いる事実によって、不可能ではないまでも極めて難かしいので、小さな線毛アド
ヒシン ポリペプチド製造の組換えDNA技術は、好ましくない抗原をインコー
ドするかもしくは他のしかたで表現される遺伝子を選択的に除去し、所望の小さ
なアドヒシンポリペプチドをインコードする単一もしくは複数の遺伝子を選択す
ることができて、この発明用として、免疫原性的に有効かつ十分純粋な抗原を得
ることが決定的に重要なことである。単一もしくは複数のこの遺伝子を適切なベ
クターに挿入し、任意に、この明細書に記載のようにして他の遺伝子と融合させ
ることによって、公知の線毛製剤中には、免疫原性的に実質的に無効で従来なら
無視される小比率でしか存在していなかつ1こ小さな線毛アドヒシン ポリペプ
チドを大量Iこ得ることができる。
特定の態様fこよれば、一つもしくはいくつかの所望の7ドヒシン ポリペプチ
ドを同じベクターに挿入することができる。
その結果、微生物によって産生された産物は、問題の橋季母抗原の抗原決定基を
再発ししtコがってその免疫原性もしくは受容体結合効率を増大させる産物であ
る。
これらの操作はすべて組換えDNA技術の分野で公知の方法にしたがって行われ
、下記の実施例1〜8でより詳細に説明される。この方法に用いられるベクター
は、pER822誘導体類、lac U V 5プロモーターベクター類、Ta
cプロモーターベクター類のごとき広範囲宿主のベクター類、シャトルベクター
類、ランアウェイプラスミド誘導体類などのごとき、この目的に通常用いられる
いずれのベクターでもよい。細菌宿主が培養される増殖培地は、L−ブロスもし
くはM9グリセロール培地のごとき醗酵法に通常用いられるいずれの増殖培地で
あってもよい。細菌宿主は、エシェリヒア・コリもしくはバチルス・ズブチリス
のごとき醗酵中の挙動が知られている宿主の中から簡便に選択される。
と記のようfこ、多くの場合、宿主細菌1こよって形成されることのある有毒物
質、例えばリポポリサッカライドが抗体と同時に投与されるので、精製は、不適
切な抗体類、すなわち問題の抗原に対する免疫感作に関与せずしかもそれが形成
される動物の一部に好ましくない反応を起こしさえする抗体類の形成が避けられ
るから葡利である。しかし問題があることが分かつてき1こ。精製を容易にする
ために、融合されたポリペプチドの使用を伴う方法が考案された。この方法では
、アドヒシン ポリペプチドもしくはその免疫原性的に活性な部分配列もしくは
免疫学的に活性な形態に変換しうるその前駆体からなる第一ポリペプチドをイン
コードするDNAフラグメントが第二ポリペプチドをインコードするDNA配列
に融合され、その融合されたDNA配列が適切な細菌宿主に挿入され、その宿主
が適切な培地テ培養され、その融合ポリペプチドは培養物から回収され、第二ポ
リペプチドに対して生成する抗体の検査法 (assay )を利用して精製さ
れ、そして第二ポリペプチドは任意に適切なプロテアーゼ1こよって切断され、
次いでその二つのポリペプチドは分離される。
この目的に有利に採用しうるDNA配列の例はβ−ガラクト’、i ’;f −
セftインコードする1acZ遺伝子である。というのはこの遺伝子産物したが
って7ドヒシン ポリペプチドもしくはその部分配列もしくはその前駆体の表現
が、例えばラクトース・インディケータ−・プレートとで細菌宿主を培養し、陽
性(Lac+)コロニイを選択することによって容易に検出されるからである。
精製後、第二ポリペプチドはトリプシンまたはキモトリプシンのごときプロテア
ーゼによって切断できる。第二ポリペプチドの遺伝情報を指定する遺伝子が融合
された第一ポリペプチドをインコードするDNAフラグメントからだけ得られる
所望のペプチドフラグメントは、例えば缶体外で試験される、それらの免疫原性
活性に基づいて選択される。この二つのポリペプチドの分離は、イオン交換クロ
マトグラフィ、HPLO逆相クロマトグラフィ、又はインムノアフィニティ ク
ロマトグラフィ(immunoaffinity chromatograpb
y )もしくは受容体アフイニテイ クロマトグラフィのごときアフィニティ
クロマトグラフィのような標準方法で行うことができる。インムノアフイニテイ
クロマトグラフィの場合、この発明の抗原(i −、te’リヘフチトからな
る)に対して形成される抗体または第二ポリペプチドに対して生成する抗体のい
ずれかをカラムに固定化された抗体として用いることができる。受容体アフィニ
ティ クロマトグラフィにおいては、産生されたアドヒシンの受容体が同様に利
用できる。第二ポリペプチドをインコードするDNA配列との融合に用いられる
DNAフラグメントは、上記のいずれのDNAフラグメントであってもよい。
この発明の抗体の他の製造法では、線毛アドヒシン ポリペプチドのごときアド
ヒシン ポリペプチドもしくはその免疫原性的に活性な部分配列は、液相ペプチ
ド合成法とか同相ペプチド合成法によるといった公知方法〔例えば、スチュノー
トおよびヤング(Stewart and Young ) 、同相ペプチド合
成法(SolidPhase Peptide 5ynthesis )、 :
7リーマン アンドカンバニイ(Freeman & Co、)+サンフランジ
スコツ米国。
1969年〕によって製造することができる。同相ペプチド合成法が好ましい方
法である。固相ペプチド合成法では、アミノ酸配列がイニシャルアミノ酸を担体
にカップリングさせ次いで引続き他のアミノ酸をこの場合少なくとも五つのアミ
ノ酸の長さまで、ペプチド結合によってその配列に付加することによって組立て
られる。アドヒシン ポリペプチドもしくはその部分配列を固相ペプチド合成法
で製造する場合、その配列中のイニシャルアミノ酸がカップルされる担体と同様
にワクチン中の抗原用の担体として有用な生理的に受容なポリマーを使用するの
が有利であろう。ワクチンとしての用途用の合成ペプチドの製造ハ、シニック(
5hinnick ) 、“シンセティック ペプチドズ、インムノゲンズ ア
ンド ヴアクノンズ(Synthetic peptiaes。
immunogens and vaccins”) 、 Ann、 Rev、
Microbiol、 、第37巻、1988年、第425〜446頁に記載
され1このと特に同様にして行うことができる。
この発明によれば、アドヒシン ポリペプチドもしくはその免疫原性的に活性な
部分配列もしくは免疫学的に活性な形態に変換しうろその前駆体からなる抗原に
対して生成するかもしくは実質的に生成する抗体は、任意に適切な担体に結合さ
れ1こ前記抗体の免疫学的に有効な量と気炎学的に受容な賦形剤とからなる、哺
乳類の組織に接合する病原性細菌によって起こる疾病に対する哺乳類の受動免疫
用組成物に用いろことができろ。この組成物は、免疫原性的に有効な址の抗体と
免疫学的に受容な賦形体とを、例えば副成分を混合することによって合すること
からなる方法によって製造することができる。
抗体が任意に共有結合的に結合される担体はワクチンについての記載に関連して
t記した担体のいずれでもよい。抗体が混合される賦形剤は、組成物中の抗体の
濃度を所望の濃度にする量で添加されろ稀釈剤、分散剤、補助剤などのごときこ
の目的のために通常用いられるいずれの賦形剤であってもよい。
前記抗原よりも免疫感作の効率が低いけれども、その抗体は免疫感作の1こめに
用いることができる。しかしその主要な用途は哺乳類例えばヒトの組織に接合す
る病原性アドヒシン形成柵菌fこよって起こる疾病の診断用診断剤としての用途
であり、その細菌の例は、泌尿器病原性もしくは腸内病原性菌株である、エンエ
リヒア・コリもしくは他の腸内細菌もしくは口内細菌、不イセリア・コ゛ノルホ
エ、イ、イセリア・メニンギディティス、不イセリア・キャタルハリス、イエル
シニア エスピーピー、スートモナス・エルギノーザもしくは他のスートモナス
・エスピーピー、モラキセラ・ボビスもしくは他のモラキセラ・ニスL’−ヒ−
、バタテロイデス・ノドスス、スタフィロコッカス・エスピーピー、ストレプト
コッカス・エスピーピー、またはボルデテラ・ペルソシスのごときボルデテラ・
エスピーピーである。それ故にま1ここの発明は、線毛アドヒシン ポリペプチ
ドの免疫原性のある抗原決定基に対して生成する抗体またはアドヒシン ポリペ
プチドもしくはその部分配列もしくはその前駆体ではない、抗原の免疫原性抗原
決定基1こ対して生成する抗体のごとき前記抗体からなる診断剤に関する。この
抗原は例えばアドヒシン遺伝子クラスターによってインコードされる他のポリペ
プチドでもよい(その遺伝子を仔する細菌の接合性能を仲介するのに若干必要な
遺伝子配列)。例えば泌尿器病原性エシェリヒア・コリ白米の線毛ポリペプチド
、例えば18kd、81kdおよび28.5 kdそれぞれのポリペプチドをイ
ンコードする、遺伝子papB、 papDもしくはpap D (第1図およ
び/ま1こは第2図に示す)の遺伝子産物の場合の、例えば線毛の形成に必要な
他の一つのポリペプチドである。pap OAびpapD遺伝子の産物は、ビリ
ン(pilin )の分泌と爪台工程(線毛の形成のfこめの)中に、ビリン・
サブユニットの組立ておよび/または固定(遺伝子pap A lζよってイン
コードされている)を仲介すると現在信じられる。
その抗体は、診断剤として用いられる際、例えば診断試験において、検出すべき
抗原を介する細菌が着色凝塊として見えるように着色剤で92を付けてもよい。
エンザイムーリンクトインムノソーベント検査法(enzyza−1inked
iIilmunosorbentassay)(ET、 I S A ;原料
および方法の須参照)または放射能標識された抗体を甲いるレイディオインムノ
アセイ〔radioimmunoassay (RI A ) :)のような他
の漂準方法も用いろことができる。
一方、その診断剤は、存在するか存在しないかが診断試論によって証明されるべ
き細菌中のDNA配列と少なくとも約60%が同じの、安定な、標識のつけられ
丁: D N A配列で構成されていてもよい。この明硅1こおいて、“安定な
″という用語は、そのヌクレオチド配列が比較的一定であること、すなわち一つ
の塩基対が他の塩基対と置きかえられる塩基対置換は当然まれであることを示す
のを目的とするものである。多くの遺伝子]ζおいて、かような塩基対置換は、
遺伝子から表現される遺伝子産物のアミノ酸組成には必らずしも影響を与えず、
比較的普通のことである。しかしこの塩基対置換は、プローブ(probe )
のDNA (部分)配列は、同じ配列、または細菌DNA中のよく似た配列を認
識するので、プローブからのDNAと試験されるべき試料として用いられる細菌
DNAとの相同性がかなり高いことに依存する前記妙所方法に影響を与える。そ
の診断法においてプローブDNAには標識が付され、そのDNAは変性されプロ
ーブと細菌DNAの両者のストランドを分離する;それらのDNAを混合後、ス
トランドは二重らせん構造を再形成する1こめに残されるが、相同の場合(DN
A配列の認識)、プローブDNAのいくつかは細菌DNA内に導入されたであろ
う。
この技術はハイブリッド形成法として知られ、例えば、サザーン(5outhe
rn ) lメソッズ イン エンザイモロジイ(Methodsin Enz
ymology L第68巻、1980年、第151〜176頁に記載されてい
る。診断剤として十分な特異性を有するため、プローブとして用いられるDNA
は特定のヌクレオチド配列で構成されるべきであり、それ故少なくとも12のヌ
クレオチドの長さを仔するべきである。そのプローブDNAは、本来公知のしか
たでHもしくは Cのごとき放射線同位元素で標識されるのが有利である。
プローブDNAとして用いられるDNA配列は、アドヒシン遺伝子クラスターの
一部であるがアドヒシン ポリペプチド自体をインコードしない遺伝子からなる
配列かまたはその妙所用に有効な部分配列であってもよい。この遺伝子は、例え
ば線毛アドヒシン ポリペプチドでない、病原性線毛形成細菌によって産生され
る線毛ポリペプチドの遺伝情報を指定する遺伝子か、またはその診断用にり効な
部分配列であってもよい。この明細書lζ例示するシステムにおいて、その線毛
ポリペプチドをインコードするDNA配列もしくはその部分配列は泌尿器病原性
菌株のエシェリヒア・コリ白米のものである。このシステムで特に有利な診断剤
は、を記の遺伝子安定性からみて遺伝子pap B 。
pap OおよびpapDであるか、ま1こはこれら遺伝子のいずれかの診断用
として葡効な部分配列であることが見出された。
上記のように、この発明による抗原はワクチンの成分として用いろことができる
。したがってこの発明は、任意に適切な担体に結合された前記抗原の免役原性的
に冑効な量を含膏するワクチン、または任意に適切な担体に結合された前記抗体
および免疫学的に受容な賦形剤を含葡する受動免疫用組成物を投与することから
なる、哺乳類例えばヒトの組織に接合する病原性細菌によって起こる疾病に対す
るヒトのごとき哺乳類の免疫感作方法を包含するものである。その投与は、抗原
もしくは抗体を等張性食塩水のごとき適切な注射用賦形剤と混合して注射するよ
うなそれ自体公知の方法で行うことができる。
これらの病原性m菌はアドヒシン類もしくはアドヒシン様のポリペプチド類を形
成するいずれの細菌であってもよい。それらの例は、泌尿器病原性もしくは腸内
病原性の菌株である、エシェリヒア・コリもしくは他の腸内細菌もしくは口内細
菌、不イセリア・ゴノルホエ、不イセリア・メニンギデイテイス、不イセリア・
キャタルハリス、イエルシニア・エスピーピー、スートモナス・エルギノーザも
しくは他のスートモナス・エスピーピー、モラキセラ・ボビスもしくは他のモラ
キセラ・エスピー ヒー 、t<クチロイデス・ノドスス、スタフィロコッカス
・エスピーピー、ストレプトコッカス・エスピービー、まtこはボルデテラ・ペ
ルツシスのごときボルデテラ・エスピービーである。
かような細菌の興味深い種類は線毛形成細菌で構成されている。
その重要な例は、泌尿器病原性もしくは腸内病原性菌株である、エシェリヒア・
コリ、不イセリア・ゴノルホエ、不イセリア・メニンギデイテイス、不イセリア
・キャタルハリス、モラキセラ・ボビスもしくは他のモラキセラ・エスピービー
、ま1こはボルデテラ・ペルッシスである。
最後に、この発明による抗原は、と皮細胞のごとき哺乳類の組ak、にある、特
定の7ドヒシン ポリペプチドもしくはその活性部の受容体の存在を測定するの
に用いることができる。この抗原は、高い危険度にある人間、すなわち問題の感
染症をおこす病原性細菌が自ら産生ずるアドヒシンによって結合する受容体を大
量に産生しそのためある種の感染症にかかりやすいと思われる人間を同定するこ
とは非常に重要であるっかような人間が同定されたならば、予防治療すなわち主
として免疫感作/予防接種を行うことができる。アドヒシン受容体の存在および
存在するアドヒシン受容体の量の測定法は、組織の試料もしくは細胞スクレイビ
ング(cell scrapings )からなる試料をアドヒシンととも1こ
培養し次いで洗浄することから構成されている。アドヒシンに対して生成し、例
えば蛍光もしくはl−125のような放射性アイソトープで標識が付された抗体
が試料とともに培養されてもよく、または一方ではこのようにS識の付されたア
ドヒシンは直接試験に用いてもよい。次いで試料のアドヒシン受容体の量は、そ
れ自体公知のしかたで試料の放射能もしくは蛍光の量を測定することによって測
定することができる。
具体的1こ述べれば、エシェリヒア・コリの泌尿器病原性菌株のアドヒシン ポ
リペプチド類、すなわち前記のアミノ酸配列はし1こがって、泌尿器管中1こ大
量のグロボシド受容体を産生しそのため泌尿器管の感染症にかかりやすいと考え
られる女性を同定するのに用いることができると考えられる。
この発明のこの態様は一般に、ヒトのごとき宿土浦乳類からの組織試料を受容体
−特異性ビリペプチドで処理し、未結合の受容体−特異性ビリペプチドを除去し
、結合され1こ受容体−特異性ビリペプチドの量を測定することからなる前記宿
主における受容体の密度もしくは分布の測定法として示すことができる。
結合され1こポリペプチドの量の測定はそのポリペプチドに標識をつけるか、ま
1こは上記のごとき標識をつけ1こ抗体と試料とを培養するかによって行うこと
ができる。
この発明の方法は、受容体密度もしくは受容体分布が特定の受容体に対して誂導
された抗体によって測定された以前の方法にくらべて非常に有利である。という
のは、アドヒシン ポリペプチドによって例示される受容体−特異性ビリペプチ
ドは、通常一つもしくは二つの糖である受容体自体が糖の鎖の端部にあってもま
1こはその二つの糖の系が塘の鎖のいくぶん中央部にあっても特定の受答体に結
合しうるが、一方抗体は前記鎖の端部の二つの糖を認識するだけで中央部の二つ
の糖を認識しないからである。それ故に抗体の積台範囲はアドヒシン ポリペプ
チドと比較して限定されており、受容体密度を定量する試みは、受容体と直接結
合させるtコめに抗体を用いるといつも低く評価されている。
最後に、この発明の一つの態様は、ヒトもしくは他の哺乳類が病原性のアドヒシ
ンー結合微生物1こ感染する可能性を防止するかもしくは減少させる方法に関す
るものであり、すなわち、ヒトもしくは他の哺乳類を、特定の細菌の感染が防止
されるべき細胞表面にポリペプチドを分布させる適切な方法にて、1以とのアド
ヒシン ポリペプチドによって処理することからなる方法であり、使用されるア
ドヒシン ポリペプチドは、病原性細胞によって産生されるアドヒシンが結合す
る受容体と結合するアドヒシン ビリペプチドである。この場合、そのアドヒシ
ン ポリペプチドは、抗原としては使用されないが受容体をふさぐ直接予防的治
療剤として使用され、したがって病原性細菌が受容体と結合できなくなる。最も
局所的な感染症において、第1段階は特定の細菌からのアドヒシン ポリペプチ
ドの特定細胞の表面への特異的な結合であり、このことは受容体がすでにふさが
れている場合、感染を進行させる工程の第一段階は起ることはないことを意味す
る。また細菌が結合できなければ感染は起こらない。
図面の説明
下記の図面を参照してこの発明をさらに説明する。
第1図はp RBU 845中のPapDNA(2)遺伝子構成を示す地図であ
る。上方の線はプラスミドpAOY0184に挿入されたEcoRIフラグメン
トのサイズ(キロベース・ペア)を示t。
種々のTn5挿入の位置は上部に示しである。pRHU845の制限地図と同定
されたpap遺伝子類の位置が示されている。厚みのある垂直Oバーはシグナル
ペプチドの遺伝子情報を指定する領域を示す。前記バーの下に示したのは成熟ポ
リペプチド類の分子tcxiosドルトン単位)を示す。
第2図は生体外の突然変異誘発に用いられるpapミルミルハイブリッドプラス
ミド図と遺伝子構成を示す。プラスミドpPAP5はPap線毛の表現とヒト赤
血球のジガラクトシドー特異性凝集度応に必要な全EcoRI−BamHIフラ
グメントを有している。プラスミドpPAP16は1acUV5プロモーターか
らの転写調節下のSmall−BamHIだけを有する。 プラスミドpPAP
9は、1acUV5プロモーターを有していないことを除けばpPAP16と同
一である。水平線の下のApRはアンピシリン耐性(100μm7m1)を示す
。
第8図は、pPAP5もしくはpPAP 22中に見出された全pap領域を示
す(上部の半分)。pPAP 22は、ベクターDNAのBamHi −Pvu
11部を欠いていることを除けばpPAP5と同一である。このプラスミドはp
apA1誘導体pPAP2B の親である。またpapA1突然変異の位置が示
されている。この図の下部はSmail−BamHI領域の物理的地図を示す。
この領域でのTn5 挿入の位置が示されている。すべてが血球凝集反応を仲介
する容シを破壊する。この下に1)aI) E%pap Fおよび上のシグナル
ペプチドを示す。papEl、papF! およびpapGlの突然変異の位置
が示されている。それらはpPAP5とpPAP16 との両者に別個に導入さ
れた。
図面に示されたプラスミド類の構造と特性づけは、実施例1〜8のみならず原料
と方法の項に記載されている。
一般的原料と方法
化学試薬類と酵素類
制限酵素類とTADN人リガーゼはベーリンガーマンハイム社(Boehrin
ger Mannheim GmbH)もしくはニュー イングランド バイオ
ラプス(New England Biolobs) から購入し製造メーカー
のすすめたのと同様にして使用した。8−劣性末端(8’−recessive
ends) Oフィリング(filling)は、必要なdNTP類をそれぞ
れ200μM添加した連結緩衝液(ligation buffer) VCイ
レタ9 しtつ75 リj 7 )(Klenow fragment) (ニ
ュー イングランド バイオラブ社)を用いて行った。XhoIリンカ−(5−
CCTOGAGG−8)およびBamuIリンカ−(6−CGOATOCG−8
’)はコラボレイテイプ リサーチ社(Co11aborative Re5e
ach)から入手し、そのメイ力−が述べるとおりに、ニュー イングランド
バイオラプスから入手したポリヌクレオチドキナーゼを用い、5−ホスホリル化
した。化学試薬はすべて市販の最高純度のものであった。p−赤血球はビイ、セ
ダーグレン博士CDr、B。
Cedergren) *ブラッド、バンク、大学病院、ウメア(Umei)の
御好意で入手した。
線毛のM製
線毛は、プリントンら(Brinton et al)、インムノビオロジイ
オブ ネイセリア・ゴノルホエ(Immunobiology ofNeiss
eria gonorrhoeae) 、ワシントン ディジー、米国。
1978年、第155−178頁に記載の方法の修正方法によって精製された。
細胞は22時間、87°Cで、グルコースなしのL−ニガーの入った五つのトレ
イ(400X250m)中で培養された。細胞をトレイ力)らけずりとり、84
0rn/の氷冷5rnM)!Jススー酸緩衝液(pH8,0)中に分散させ、4
にセットしf;−7−ハ/L/ オムニミキサー(8orval l Omni
mixer)中の水上で10分間混合した。細胞および細胞破砕片をベレテーシ
ョン(pelletation) シだ後(80分間20,000Xgで2回)
、脆酸アンモニウムを上澄液に55%飽和度まで添加し、−夜氷上において線毛
を沈澱させた。得られた沈澱を遠心分離で収集し5mM )!Iス緩衡液cpu
s、o)中に再分赦させた。
同じ緩衝液に対して4℃で一夜透析させた後、不溶物を80分間40.000x
gで遠心分離して除去した。この沈澱−透析操作をさらに8回繰返しく8時間の
沈澱)、その後130fgcI!2−1.5MNaCj!!−100mM )リ
ス−HC!!(pH7,5)の0.2 容量郁を添加することによって線毛を沈
澱させた。得られた沈澱は、ローリイら(工、owry et al )・ジャ
ーナル オブ バイ第1ジカル ケミストリイ(J、 Biol 、Chem、
) 、第198巻、1951年、第920〜929頁によって測定して蛋白濃度
2ml/mlに溶解した。収率は、野性型で約15m、9変異株では2〜80m
yであった。
受容体結合性の検査法
スライド凝集試験(slide agglutination) 用ニ、クルコ
ースなしのL−ニガー培地上22時間培養された細菌細胞を、8%のヘパリン化
し洗浄したヒト赤血球含有の凝集緩衝液(150mM NaC1,10mM T
ris−HO1!、pH7−5)中に1約10” Ce11s/m/の濃度で分
散させた。その反応は、陽性の場合、通常60秒以内に現われてくる。この陽性
反応は赤血球の肉眼で見える凝集反応であった。この半定量的検査法において上
記のように培養された細胞は人600 =20 に再度分散された。次いでコニ
カル底のウェル(we l 1 )を有するマイクロタイター・プL/ −)
(mierotiter plate) [リ ンプロ/タイターチック社(L
inbro/Ti tertek) 、カタログ番号76−821−05、コネ
チカット、米国〕を用いて、50al!の凝集緩衝液で連続的に2倍稀釈を行っ
た。これに1同じ緩衝液による8%赤血球分散液の10μlを加えた。4℃で2
時間後に陽性の凝集を示す最後のウェルの稀釈度を凝集力価(aggluLin
ationtiger)とした。もとの分散液の細胞数算定をこの力価とともに
用いて、凝集に必要な最小細菌濃度を計算した。
精製線毛の凝集力価は、全細胞に用いたのと本質的に同じ方法で測定した。しか
し凝集緩衝液を用いる5合、凝集に必要な綿毛濃度は非常に高いので、この検査
法の感度を増加させるために種々のこころみかなされた。線毛は生理的pH中で
は負に帯電し、167mMΔ(Hot2の存在下で凝集するので(線毛の精製の
項参照)、野生型の線毛製剤は、グロボシド受容体(ジガラクトシド含有)を含
有するPI−赤血球およびこの炭水化物を金談ないp−赤血球を用い、Mg01
sの濃度を上げながら滴定した。その凝集力価は、MgO!2濃度を100mM
に増大すると128倍増大することが見出された。このことは同じ緩?jr液
による200μm1/ml線毛溶液のA 40Gの増加と平行している。CaC
l2と10倍の高濃度のNH<Clを用いても同じ結果が得られる。このことは
その効果は綿毛−線毛間の相互作用についてであり特定受容体の結合についてで
はないということを示唆している。加うるに、全ピリエイテッドセル(whol
epilliated cells) ノfi集力価はMgCl2を200mM
まで添加しても余り影響されない。またp−赤血球を用いると凝集力価が増大
するということは、この検査法の特異性(pl−titerover p−ti
ter)は変化しないようであ、るけれども、不特定の線毛−赤血球凝集がΔf
g イオンの添加によって促進されるということを示している。それ故に線毛製
剤の滴定はすべて、100mMMgC12含有の凝集緩衝液中でなされ、特定の
凝集反応について半定量的な値を与える。
抗体の産生
免疫前の血清を二匹の健康な1.8KFの雌のニューシーラント・ホワイト・ラ
ビットから心!?刺によって得、濾過殺菌し、−20℃で貯蔵した。等張性食塩
水1.0 ml!に入れた精Wrap線毛7.5μIを同容積のフロイントの完
全助剤でエマルジョン化し、その0.5 ml!ずつを四つの部位に、すなわち
肩甲下の2部位と2本の後足の筋肉に注射した。6週間後、完全70インド ア
ジュバントでブースター注射を行った。第二免疫感作後の10日間、前記動物か
ら心gii9刺によって採血し、その血清を濾過殺菌し、0.02%のアジドナ
トリウムとともに一20℃で貯蔵した。
線毛抗原の検査法
スライド凝集法試験用に、細菌を、血球凝集性検査法について記載したのと同様
にして培養して作製した。全細胞の凝集試験は精製Pap線毛に対して生成した
抗血清の500倍稀釈(PBS pE[7,5)したもの(上記参照)で行った
。この陽性反応は60秒以内に現われる、肉眼で見える細菌の細胞集合として測
定された。
ミニ細胞中の蛋白の表現
プラスミドpPAP5とその誘導体をミニ細胞産生菌株P678−54に形質転
換させた〔アドラーら(ムdler et al)、プロシーディング オブ
ナショナル ア力デミイ オブ サイエンス オブ ユナイテッド ステイソ
オブ アメリカ(Proc。
Natl、Acad、 8ci、USA) *第57巻、1967年、第821
〜826頁〕。プラスミド含有のミニ細胞の製造と[858)メチオニンによる
標識づけはトンプソン及びアクトマン(Thompsonand Achtma
n)、モレキュラー アンド ジエネナル ジェネテイ7 ス(Mol 、Ge
n−Genet、)、第165巻、1978年、第295〜304頁に記載した
のと同様にしてなされた。得られた放射性試料を8DS−ポリアクリルアミド電
気泳動法に付した(下記参照)。そのゲルを固定し、染色し、エンハンスし〔エ
ンハンス、ニュー イングランド ヌクリアー(Enhance 、 NewE
ngland Nuclear) :l、 オートラジオグラフィに付した。分
子jiiK準品Cファーマシャ ファイン ケミカルズ、アブサラ。
スエーデン(Pharmacia Fine Chemicals、 Upps
ala。
8weden) と精!!i!線毛を平行して電気激動法に付した。
8D8−ポリアクリルアミド ゲル 電気汰動法放射性試料を、62.5mM
Tr 1s−HOf (plI 6JS)、 1%ドデシル硫酸ナトリウム(S
D8)、0.5%β−メルカプトエタノールおよび10%グリセロール含有のサ
ンプリング緩衝液の100#j’ 中に分散させた。5分間沸騰後、抽出物(e
xtracts)カ0.1%8D8含有の15%ポリアクリルアミド・スラブゲ
ル中で電気激動に付され〔レム!J −(Laemmli) 、ネイチャー(N
ature) *第227巻、1970年、第680〜685頁。
分子量が8000〜94,000の範囲の蛋白標準品を平行にはしらせた。固定
、染色および脱色後(グランドストロムら(Grundstr;m et al
>、ジャーナル オブ ハクテリ、tc+シイ(J、 Bacteriol
、> 、第148巻、1980年、第1127〜1184頁〕、そのゲルを、E
n8Hance (ニュー イングランド ニュークリアー コーポレーション
、ボストン マサチューセッツ)を用いることによってフルオログラフィに付し
た。
トランスポゾン変異発生法(transposon mutagenesis)
Tn5によるトランスポゾン変異発生法を、ファージλC1857b221re
x ::Tn 5を用いて、ビョルクおよびオルセン(Bj6°rkand 0
1sen ) + 7クタ ケミ力 スカンジナビ力(AcLa Chem。
8can、) 、第B 88巻、1979年、第591〜59B頁に記載された
のと本質的に同様にして行った。
細胞抽出物
種々のハイブリッド プラスミドを含有するP67B−54菌株の細胞を、適当
な抗性物質の存在下、トリブチツク・ンイ・ニガー(tryptic soy
agr)上で培養した。 細菌は、−夜37℃で培養後採集し、PBS (pE
I 7.2 )−Brij■−85中に560 nm において1.5 r!!
に収度単位の細胞密度で分散され、次いで遠心分離して収集した(12.OOO
xg 、10分間)。次いで細胞ペレットを、リゾチームをl mJi/ml!
含有する、1%ノニデットP −40(Nonidet P−40) −1%ナ
トリウムデオキ’yすoレート−0,1%8D8−0.15mNaCJ!−0,
01MTris−Hot (pH7,2) (7) 400 lit中に分散さ
せ、1o分間4℃(26)テ培養した。pap抗血清o1/15,000稀釈の
試料400μEを細胞抽出物に添加した。4℃で16時間培養後、細胞抽出物抗
体混合物を遠心分11(12,000Xg、10分間)で透明化した。
コンペテイテイブ エンザイムーリンクド イムノソーベントアセイ(Comp
etitive enzyme−1inked immunosorbenta
ssay、ELI8A)
使いすてミクロ滴定用血球凝集プレー) (Cooke (クーチ)ポリスチレ
ン、96Uウエル)を、ひとつのウェル当り、0.1五f炭酸ナトリウム緩衝液
(pH9,6)による精製Pap線毛のL p1i/ml溶液の100μ!!に
25℃で16時間さらした。つ・・■
エルを、0.05%(v/v)Brs3−85 (シダ7 * Sigma)を
含有するO、 l 5 A1Na0!!で8回洗浄して、未結合の線毛を除去し
た。抗−Papミルミルラビット清をPB S (pH7,2)中1.@
0.05%(v/v) Br33−85で、50%の最大結合となる濃度にまで
3釈しく1/8,000稀釈)、次いで全細菌、細胞なしの抽出物もしくはPa
p線毛(正のコントロール)を、まf:1!線毛を添加せずに(負のコントロー
ル) PB8−Bri j Iysate中で連続稀釈物を混合した。16時間
4℃で培養した後100slの試料を感作されたマイクロタイターウェルに移し
た。そのプレートを8時間37℃で培夢し次いでNaC1!−BriJ41で8
回洗浄した。PBS−Brij■中1/1.000に稀釈され、アルカリホスフ
ァクーゼをコンジュゲートシた山羊の抗−ラビット免疫グロブリンGを全ウェル
に添加し、1時間37℃で培養した。
これらプレートをPBX−Brij■で8回洗浄し、1.OMジェタノールアミ
ン株鷲液(pnv、8)溶液として1m/C1p−二トロフェニルホスフエート
(シグマ社)を各ウェルに添加して1時間87℃で培養した。2NのNaOHを
添加して反応をとめ、405nmにおける吸光度をMR580Micro EL
I8人autoreader (Dynatech 011−960−0000
; DynatechLaboratories、アレキサンドリア、バージ
ニア)で測定した。
イムノブリシビテイション(Irnmunoprecipi tation)(
8epharose■)に結合された純粋なスタフィロコッカス・アウレウス蛋
白Aをスタフィロコッカス・アウレウスの細胞の代わりに用いたことを除いて、
ダラス アンド ファルコウ(Dallas and Falkow) 、ネイ
チャー(Nature) 、第277巻。
1979年+g406〜407頁に記載されているのと本質的に同様にして行っ
た。
v”y工xター:/ プロッティング法(Western blotting)
精製線毛を8D8−ポリアクリルアミド ゲル 電気泳動に付した後に、スワン
ソンら(8wanson et am) *インフエクション アンド イムニ
テイ(Infect 、ImrQun 、) 888 巻。
1982年第668〜672頁に記載しであるのと同様にしてウェスターン ブ
ロッティング法に付した。プラスミドpRHIJ845を182容するP678
−5!菌株からM製された線毛に対して生成するPap抗血清のiff物(エン
ザイムー リンクド イムーン ソーベント アセイ タイター、1:t、cO
o)を使用した。
プラスミド誘導体の組立て
Pap線毛の表現に必要なすべての遺伝子とジガラクトシドー特異性結合性を有
する、pREU8009.6Kb長のEeoRI−BarnHXフラグメントを
%1)PAP5(42図参照)を与えるBco RIまたはBamHIで消化さ
れたp B Ra 22 Cポリバーら(Bolivaret al) *ジイ
ーン(Gene) * Ig 2巻、1977年。
第96〜118頁〕にクローンした。分子のpEK822 部分にPvun 廃
位を欠く誘導体を正、l立てるために、ベクターは、Fvu p が消化され2
0倍過剰のBam’n 11Jンカーにリゲイトされた。次いでこのf)NAは
Eco RiおよびBamHIで切断され、pBR822のヌクレオチド206
5〜4360を有する最大のフラグメント〔ストクリツフエ(8utcliff
e) 、DNA: Repl 1caLion and Recom bina
tion、 p 43 Q 、 Cold8pring Harbor Lab
oratory Presa 、 ニューヨーク、1978年、第77〜90頁
〕を0.7%アガロース ゲルから単離した。
このフラグメントはpgntyaoからのEco RI −BamHI に連結
され、エシェリヒア・コリ菌株)iBlo1cボイヤーアンド ローランド ダ
ッソー(Boyer and Roulland Dussoix)。
ジャーナル オブ モレキュラー バイオロジイ(J、Mol。
Biol、) e 第419,1969年、第459〜472頁〕に形質転換し
た〔マンデル アンド ヒガ(Mandel and Hlga) *ジャーナ
ル オブ モレキュラー バイオロジイ、第58巻。
1970年第159〜162頁)。その単離されたクローンはpPAP22と命
名され、そ0クローンがBarnHI−p vu■セグメントを欠いていること
を除けばpPAP5 と同一物である。pap A中の単一のPvu II座位
にフレームシフト変異を有する誘導体のpPAP2Bを、pPAP22をPvu
II で直線状にしてそれを20倍過剰のXholリンカ−でリゲイトして組
立でた。DNAのXho IIμ9の20桓位を用いて8時間消化(diges
tion) j、た後、フラグメントを、10mM Tris−HCI pH8
,0とimM EI)TAで平衡にしたセファデックス<Bephadex■)
G150カラム (ファーマシア ファイン ケミカルズ、アブサラ、スエーデ
ン)で精製した。リゲイション(ligation)とエシェリヒア・コリ菌株
HB l 01への形質転換の後、六つのクローンから(DDN人を単流し〔バ
ーンボイムアンド ドリイ(Birnboim and Doly) 、 Nu
cleic Ac1dsRes、、第7@、1971:、第1518−1528
頁〕分析した。五つのクローンが前者のPvu II座位に新たなXhoI座位
を有していた。これらのうちの一つはpPAP2B と呼称され後の研究に使用
された。
下記の操作はプラスミドpPAP16(第2図)およびこのプラスミドと8ma
l l−BamHI領域に変異を有するpPAP5との両者の誘導体を組立て
るためになされた。プラスミドラグメントおよびdGTPとcic’rpそれぞ
れ200μMずつで作製した〔連結(リゲイション)緩衝液中80℃で15分間
〕。
このDNAは、酵素を熱不活性化した後、pPAP5 のゲルで精製された8m
a i 1−8m I 2フラグメント(第2図)に連結され、次いでスモール
−スケールのプラスミド製剤をスクリーニングすることによって、ベクターに関
してpPAP5 と同配向にフラグメントを有するプラスミドを単離した。その
クローンpPAP1はわずかに先端が切れた形態で最後のポリペプチド(85k
d )を表現した。したがってこのポリペプチドの遺伝子は8maI2座位を超
えて伸び、pPAPlの先端がきれた形態で存在している。この突然変異体は、
これらの酵素で切断されたpPAF5に連結されたKpnI−BamHI フラ
グメント上に分離された。したがってこのようくして得られた誘導体のpPAP
7は8ma 工2座位にまでpapDNAt=有する。全Smail−Barr
+III領域を有するプラスミドpPAP9は、KpnI−BamHIで消化さ
れたpPAPlに過卿JのpPAP5のKpnI−BanoHIフラグメントを
連結することによって組立てられた。
pPAP9の挿入部(insert) にフレームシフト変異体を作るために、
このプラスミドは150 ttj;i/rrJlのエチジウム プロミドの存在
下Hinallで部分的に消化された〔グリーンフィールドら(Greenfi
eld et al) 、sイオキミカエハイオフイジカ アクタ(Bioch
jm、Biophys、人cta) 、 第407巻。
1975年、第865〜875頁)。直線化サレf: (lineariz−e
d)プラスミドは次いで0.7%アガロースゲルから単離され、過剰のXho
I !jメメンに連結された。Xho 1消化、セファデックス0150ゲルク
ロマトグラフイ及び連結の後、そのDNAは、アンピシリン耐性を選択しなから
エシェリヒア・コリ菌株:EIB 101に形質転換された。2Bのクローンか
ら精製されたDNAはXho Iおよび8alIでの消化によって分析された。
挿入部内の16の突然変異のうち18はFIinc112座位におけるリンカ−
挿入であり2はHincIII座位であった。HincIIgするpPAP5誘
導体はpPAP7と類似のしかたで組立てられた。これらのプラスミドはpFA
PI5(Hincnl)およびpFAPI4(Hinc112)と命名された。
pFAPI9はプラスミドpPAP14のXhoI−8al Iダイジェストを
、再連結(re−1igating)することによりpFAPI4のXhoI−
8allフラグメントを欠失させて組立てられた。pPAP20はpFAPI5
から同様のしかたで組立てられた。プラスミドpPAP 26 (papA 1
、 papE に重突然変異体)を作るために、pPAP2B(Pal)AI
)の大きなKpn I −Bam HIフラグメメンをppApto(papE
t)の小さなKpnI−BamHIフラグメントに連結された。
プラスミドpPAP9は8mail−BamHItjf戚内へのTn5挿入を相
補(complement) シなかった。これはその挿入部の不充分な転写に
よるのではないかと思われる。それ故に1acUV5プロモーターを有するEc
oRIフラグメントはpsK8106から単離され(キャサバダンら、 Met
hods Enzymol 、。
第100巻、1981年、第298〜808頁)、EcoRIで直線化されたp
PAP9に過剰に連結された。次いで正しい配向のフラグメントを有するクロー
ンのpFAPI6がPst I消化を用いてDNAH剤をスクリーニングするこ
とによって単離された。というのはそめプロモーターフラグメントがこの酵素に
対して不斉に位置する座位を有するからである。同じ操作が他のpPAP9誘導
体にも適用されてpPAP4(8mai2−BamHI欠失)、pPAP 1
g (Hincnl突然変異)およびpFAPI 7 (Hinc II2突然
変異)が得られた。
実施例1
大きな線毛サブユニットの遺伝子のクローニングと同定エシェリヒア・コIJ
J 96の泌尿器病原性単離物(isolate)の自然発生的に得られるLa
c−誘導体から高分子量の染色体DNA(アー/1/ h ハAtら(LHul
l et al)、インフエクション アンド イムニテイ、第88巻、198
1年、g9B8〜988頁;マンノース耐性血T$凝集反応(MHRA)および
ジガラクトシドー特異性結合参照〕が棲準の方法で単離された。
このDNAは次いで部分的に制限酵素8au 8人で消化された。
この制限フラグメントは前記の制限酵素BamHIで先に直線化されたプラスミ
ドベクターpH079[:2リンズ(C!oiling)。
Methods Enzymol 、 、第68巻、1979年、第809〜8
26頁〕に連結された。このDNAは、ビイ ホルム(B、Ho1m) 、 メ
ンツズ インエンザイモロジイ(Methodsin Enzymology)
、第68巻、1979年、第1127−1134頁に記載された操作によって、
生体外でλフアージ粒子中にパッケージされた。これらの粒子はエシェリヒア・
コリ菌株P678−54を感染させるのに用いられた〔アドラーら(Adler
et al)の前記文献〕。 次いでその細菌は、アンピシリン耐性の組換え
プラスミドを含有するコロニイの形成をもたらすアンピシリン含有のプレート上
に流延された。
個々のコロニイを、1%マンノースの存在下でのヒト赤血球の凝集反応でスクリ
ーニングし、マンノース耐性の血球凝集反応を起こすクローン(pRHU807
)が選別された。pRHU807のサブクローン(pRHU80およびpRHU
845)は、アール ハルらの前記文献に記載されているのと同様にしてMRH
A を残して組立てられた。またエシェリヒア・コリ菌株HB 101 中にこ
れらサブクローンの両者が存在すると線毛を形成させる。pRH845含有のエ
シェリヒア・コリ菌株困101によって起こる血:Et凝集反応は、マンノース
が存在していても存在していなくても溶解性ジガラクトシドの存在によって完全
に陽春された。したがってこの場合、この菌株で表現されるMHRA 表現型は
ジガラクトシド特異性の結合と同一であることを示している。
Pap (腎孟炎に関連のある線毛)線毛(papA)を形成する主要なポリペ
プチドの構成遺伝子は、サブクローンからウェスターン・プロッティング法やイ
ムノプリシピティション法によって同定され、第1図に示すごとく約2.2Kb
で地図に示されている。papA遺伝子の位置は、大きなPapミルミルサブユ
ニット−終末配列と比べて〔オーハンリイら(OHanley et al)。
ジャーナル サブ エクスベリメンタル メディスン(J、Exp。
Med、)、第158巻、1988年11月、第1718〜1719頁参照)、
そのDNA配列から推論される遺伝子産物のアミノ酸配列間の同一性によってm
r!された〔エム バガら(M、B4gaet al) 、ジャーナル サブ
バクテリオロジイ(J。
Bacteriol 、) 、第157巻、1984年1月、第380〜88B
頁〕。
実施例2
線毛DNA配列の同定
Pap線毛の形成およびジガラクトシドー特異性の凝集反応に必要な遺伝子を特
徴づけるために、pRHU845のサブクロンおよびトランスポゾンTn5挿入
突然変異体をツルマークら(Normark et al ) 、インフエクシ
ョン アンド イムニティ、第41巻、1988年9月、第942〜949頁に
記載しであるのと同様にして組立て分析した。Tn5挿入突然変異体およびサブ
クローンをさらに分析することによって、左側のEcoRI座位から約1. O
Kbと約9.4KbQ間の位置にあるDNAだけゴ(第1図参照)rap線毛形
成とジガラクトシドー特異性結合の遺伝子情報を指定するのに必要であることが
示された。そのEcoRI座位から7.9 Kbと9.2 Kb との間の挿入
突然変異体は、rap線毛の形成を阻害することなく ジガラクトシドー特異性
の結合性を消失させた。
実施例3
線毛アドヒシンDNAの遺伝子的特徴づけPap線毛形成とジガラクトシド特異
性結合に必要であるとして実施例2で同定された領域は、原料と方法の項に記載
されているのと同様にして、プラスミドpPAP5(第2図参照)およびpPA
P22を与えるpBR822に、p RIIU 80の9.6Kb長EcoRI
−BamHIフラグメントとして再クローンされた。
pPAP22は、ベクターDNA中の欠失によって、そのpapA構成遺伝子中
に唯・−のPvuU座位を有するけれども、pP−4,P5とpPAP22の両
者は全EcoRニーEamIIIT挿入部を有している。フレームシフト突然変
異部papA1を有するpPAP28は、pPAP22中の唯一のpvul座位
中に8bp長のXho Iリンカ−を導入して組立てられた(第8図参照)。エ
シェリヒア・コリ菌株1(B101においてこのフレームシフト突然変異体は、
野生型とことなり精製されたPap線毛に対仄生成1−る抗面清によって凝集さ
れなかった。
pPAP2Bを収容するエシェリヒア・コリ菌株IIBIOLは、ジガラクトシ
ドで被覆されたラテックス・ビーズの・みならずヒトのPl−赤血球を凝集させ
る。したがってpPAP2B/HB101は、野生型papミルミルオペロンP
22もしくはpPAPb上に有するHBIOI と同じ受容体結合特異性を表現
すると考えられる。かくして線毛遺伝子pap人の不活性化は、用(、sられる
分析法におけるジガラクトシドー特異性凝集反応の度合を低下させなかった。
parl DN人の末端部へのTa2を挿入すると血球凝集反応を消失させるが
、rap線毛は形成される。かくしてg隼反応を伝達する遺伝子はこの領域に存
在するである・うと推量される。
ここにインコー ドされたポリペプチドの重要性をさらに研究するために、第2
図に示すように、Small−BamHI・フラグメントがpBR822中にサ
ブクローンされた(原料と方法の項参照)。得られたプラスミドはSma 11
−Bam HI@斌へのTn5挿入を相補しなかったので、クローンされたフラ
グメントは、psK8106由来のE e o −RIフラグメント(fg、u
と方法の項参照)としてそのプラスミドに挿入された1aeUy5ブロモ・−タ
ー(フラグメント上の遺伝子を確実&−十分転写するために)の転写コントロー
ル下に置かれた。この構成物pPAP16(第2図参照)は、Sma 11−B
amHlフラグメント中メン入位置に四つの血球凝集反応をしないTn5突然変
異体を相補した。これら突然変異体の局在状況を第8図に示す。
Sma 11−BamHIフラグメント上メンq伝子をさらに明確にするために
pPAP16挿入部の詳細な制限地図を、関連のTn5n5挿入正確な醋置位i
を付して作成した(第3図参照)。この飴岐に傷を有するpPAP5の三つのフ
レームシフト変異誘導体(第8図3よび原料と方法の項参照)も作製された。二
つの突然変異プラスミドのpPAP14とpPAP15はHin Cfl 2と
HincU1座位それぞれにXhoIjlンカーを有する。第三の突然変異体p
PAP7に−)いては、SmaI2からBam1(IKかけてのpapDNA(
第8図参照)は削除された。
pPAP5から表現されるポリペプチド類とその三つの変異誘導体類は、エシェ
リヒア・コリのミニ細胞中、Ca5s)メチオニンで標識され、表現されたポリ
ペプチドは5D8−ポリアクリルアミド ゲル法で分析された。pPAP5と比
較したところ、プラスミドp’PAP7は85 kd (2)プラスミドを表現
しなかった。その代わりに84 kdの新規のポリペプチドが現われた。pPA
P7中の突然変異によって8maI2座位におけるpap領戚が切りとられたの
で、Sma工2とBamHI座位の間に35kdのポリペプチドの遺伝情報を指
定する遺伝子paI) Gの3末端が存在するであろう(第3図参照)。これは
pap領戚の最後の遺伝子である。
Tn5m入の002と021を行った際のpPAPL4におけるHinc112
変異は、自らをインコードする遺伝子papFを明確に示している(第旦図参照
)ところの15kdポリペプチドの表現をなくしてしまった。他のポリペプチド
類はいずれもpPAP14におけるHincU2変異(papF)によってE5
されなかった。Hinclll’Jンカー挿入突然変異体のpPAP15のミニ
細胞製剤は16.5kdポリペプチドを産生しない。このポリペプチドの遺伝子
はI)apEと呼称され、そのフレームシフト突然変異はpaphiと呼称され
る。papG遺伝子産物のSma I2−Bam HIの欠失による切りとりは
この殻伝子が第3図において左から右へ転写されることを示す。papG上への
Tn5挿入によってpapEと1)apEにもたらされる極性効果(polar
ity effect)は三つの遺伝子の全部の転写はこの方向であることを示
す。
papyとpapG遺伝子に関するTn5度異度付0を確認するため、Tn5変
異の002.021,026および042(第8図参照)が、変異された8rn
aIl・〜BamIT:I領域で相補された。
この目的のために、1a c U ■5プロモーターのコントロール下にあるS
ma I 1−BarnHI領域を有するpPAP16のpapEl、papF
lおよびpapG1誘導体を原料と方法の項で記載したのと同様にして作製した
。次いでこれらをplU845のTn5誘導体を有するエシェリヒア・コリ菌株
BIB 101 に形質転換しくツルマークらの前記文献)、Plおよびp−赤
血球を用いるグロボシド−特異性血球凝集反応について検査した。papEL誘
導体は、親プラスミドのpPAP16が行ったのと同様にすべてのTn6変異を
相補した。papF 1プラスミドはTn6変異の026と042を相補し、一
方papoiを有するプラスミドは002と021の変異を相補した。これは0
02と0210Tn5挿入をpapB’中の突然変異と定義しており、そしてT
n5挿入の026と042がpapo遺伝子遺伝在中するということを示してい
る。またpapFとI)apGは別々の独立したトランス−コンプリメンタプル
な(trans −complementable)遺伝子であることを明確に
示している。この領域の遺伝子地図(第3図に示す)はこれらのデータに基づい
て作成された。
上記のように、papFとpapoへTnSを挿入すると、 線毛は形成される
けれども血球凝集性を全くなくしてしすう。
paI)E−papFおよびpapoの遺伝子産物の血球凝集性についての固有
の重要性を評価するためのものとして、血球凝集試験における。pPAP5の非
極性リンカ−挿入変異体の誘導体がある。papF6papGの両者の遺伝子産
物は凝集に必要であるごとを示しているがpapF1誘導体とpapGl 誘導
体はいずれもPl−赤血球の凝集を示さないことが見出された。papE1変異
体はそれ自体血球凝集性力価に影響しなかったが、驚くべきことにはpapAl
、papEに二重変異体、pPAP26は、エシェリヒア・コリ菌株HB I
Q 1に形質転換してもPl−赤血球を凝集させなかった。
エシェリヒア・コリ菌株HB 101中のpPAP5もしくはpPAP22の各
種変異体誘導体の線毛抗原形成性およびジガラクトシドー特異性結合性を第1表
に示す。
第1表
地図作成に用いたプラスミド類の特性とpapA% 1)apE% papF’
およびpapGの機能分析psNプラスミド類はpAOY0184誘導体類(p
RHU845白米のEcoR1フラグメントを有し、各プラスミドは、第1図に
示すように異なるTn5挿入部を胃する)であり、一方pP AP プラスミド
類はpBR822の誘導体である。線毛抗原は、Pap線毛に対して生成する抗
血清での細胞分散物のスライド凝集性によって測定しtご。
pPAP2B中の変異pap A 1は、ジガラクトシドー特異性結合性に影響
を与えることなく大きなPapミルミルサブユニットap人遺伝子産物)の形成
を全くなくしてしまつ1こことはこの表から明らかである。逆1こpPAP 1
4中の変異papF1およびpPAPT中の変異papG1はPap線毛の形成
を阻害することなしにジガラクトシドー特異性結合性をなくしてしまった。
遺伝子のpap OとpapDの変異は線毛形成とジガラクトシドー特異性結合
性の両者を消失させた。pap FとpapGにおける変異だけが、Pap線毛
の形成を阻害することなくシカラクトシト−特異性結合性の消失をもたらした。
唯一の例外は前記のように凝集に対して陰性の二重変異体のpapAl−pap
Elである。pap Aもしくはpap Eにおける変異だけが接合性である。
コcD効果は、pap AもしくはpapEポリペプチドは(多分)細胞壁ヘア
ドヒシンを固定するの1と必要であるという事実に起因していると考えられる。
それ故にpap Fおよび/またはpapG遺伝子がジガラクトシドー特異性接
合をインコードすると結論することができる。
実施例4
線毛アドヒシンDNAのDNA配列の樹立pPAP9(第2図に示すように、原
料と方法の項に記載したのと同様にして組立られた)の100μfをEcoRI
とB amH■で消化し、Small−EamHl 領域を有するEcoRI−
BamHIフラグメント(第8図参照)を単離するため、分離相アガロースゲル
電気泳動法(preparatiye agarose gelelectro
phoresis )に付した。
このフラグメントの一部を、エンドヌクレアーゼのHaeLRsa)、人1.u
l、Hpal、8au3ASTaql、Hincl[およびBgllで別々にも
しくは組合わせて消化し1こ。得られたフラグメントは、直接ま1こは分離用ア
ガロースゲル眠気泳動法に付した後にクローンされ、フラグメントの分離はファ
ージM1Bベクター中になされた(M18mp8およびM13mp9;メリック
ら(Messing et al )、 Nucleic Ac1ds Res
、 l 第9巻。
1981年、第309〜321頁〕。その挿入物は、サングラ−ら(Sangl
er et al)、プロシーディング オブ ナショナル アカデミイ オブ
サイエンス オブ ユナイテッド ステイソ オブ アメリカ、第74巻、
1977年、第5468〜5467頁(ジデオキシ配列法)の方法を用いて配列
され、Small−BamHl フラグメントのDNA配列の明確な重複が両ス
トランドについて読みとることができた。
実施例5
線毛アドヒシンfζついてのアミノ酸の配列性可能性のある読とりフレーム中に
、遺伝子pap E 、 pap Fおよびpap Gが、リンカ−およびトラ
ンスポゾンTn5の挿入(第8図参照)によって達成されたこれら遺伝子の知ら
れている位置およびこれらそれぞれの遺伝子の産物の公知の大きさ16.5 k
(1,15kdおよび85kdからそれぞれ同定されf:。
これらの遺伝子のN−ターミナル末端が同定され1こ。そのアミノ酸配列は、エ
シェリヒア・コリについて達成され1こ遺伝暗号を用いてDNA配列から誘導さ
れた。それらの遺伝子産物はすべて、単一のペプチドを含付する前駆体として作
られるのでその遺伝子の5′−末端は、シグナルペプチド状配列が続くメチオニ
ンであると考えられろ〔シイ フォノ ヘイネ(GVonHeijne)、イオ
ロビアン ジャーナル オブ バイオケミストシイ、第188巻、1988年、
@17〜21頁〕。
実施例6
他の泌尿器病原性エシェリヒア・コ!1DNAとの相同性Sma111−Bam
H1領域からいくつかのフラグメントが単離され、ニック トランスレーション
(n1ck translation )によって82pで標識をつけ1こ。そ
のフラグメントは小さなセグメントの全領域をカバーする1こめに選択され1こ
。次にこれらのフラグメントはプラスミドpDO5(フレラグ アンド ピアー
ス(Clegg and Pierce)、インフエクション 7:/ド イム
ニテイ、第42巻、1983年、第900〜90G頁〕およびpPILloo−
85(パン ディら(Van Die et a、l)、 FEMSMicro
biol、 Letters+ jjM 19巻、1988年、第77−82頁
〕のダイジェスト(ciigest )のサザンプロット中のプローブとして、
緊縮条件下で用いられた。papG遺伝子領域からは全く信号は碍られなかつt
コが、強い雑種形成信号が、papEおよびpap F遺伝子からのプローブに
よつ′C得られtコ。緊縮条件下での強い4棟形成は、EcoR,l座位から約
3.2へ−8,4’kbのとこ、ろに位置するHpa、l座位の間にJ)るpa
p O1i1伝子のプローブからも得られf:、(第1図参照)。
pDC5とpPILllo−85の詳細な制限地図が作成され1こが、papa
とpap Dの領域についてのpPAP5の制限地図とほぼ同一であることが見
出されy、:opapl:とpapF遺伝子については高度の類似性が認められ
1こがより小さいものであった。それ故に、エシェリヒア・コリの他の泌尿器病
原性菌株中のMRHA rインコードするDNAはpPAP5(エシェリヒア・
コリJ96由来)にインコードされたDNAに極めて類似しており、Pap系1
こおいて得られる結果はほとA、どの腎孟炎病原性菌株に普遍することができる
と結論できる。ま1こpPILllo−35については、そのDNAから表現さ
れるMR,HAがジガラ染色体DNAについ°C得られl’、: (0つら(L
ow et al)、 インフエクション ア:ノド イムニテイ、第4a巻、
x9s4年。
第353〜358頁〕。
プラスミドpPAP9がBgllと5all (pPAPe中のBamHI座位
の右側約a 75 bpの位@1こある)で消化され1こ。得られ1こフラグメ
ントは予めB amHlと5allで消化されたプラスミドpMo 874に連
結され1こ(キャサバダンら、ジャーナルオブ バクテリオロジイ、第148巻
、1980年、第971〜980頁)。pMo 1061へ形質転換しくキャサ
バダンらの前記文献)アンピシリンを10μI/d含冑のプレートにプレートシ
tこ後組換え体を分析した。そのEgll −Sal lフラグメントがpMo
874からの1ac−カセット(Ban)(l −8al lフラグメント)
によって置換されfニーpPAP9で構成され1こプラスミドpHMG51が単
離され、原料と方法の項に記載しtコのと同じミニ細胞分析法によって、pap
G −1a、c Z融合ペプチドの遺伝情報を指定することが示された。まt
ここの結果はpapG遺伝子の公知の配例およびpMO874中に存在するla
c Z遺伝子の配列からも予想された。
指示事項
A、他の融合遺伝子類の製造
実施例7に記載方法に代わる方法で、papF遺伝子からなるN−ターミナルD
NAフラグメントがpPAP9をBgllで直線化することによって得られる。
次いでこのDNAは、エキソヌクレアーゼExo璽とともに長時間培養され、次
いでヌクレアーゼs1で処理されるとBgll座位からの欠失が増加した。
H1ncl璽リンカ−が連結される。次にこのDNAはSmalおよびHind
Iで再消化され(redigest )、分離用アガロースゲル電気泳動法に
付される。1,400bpから1,000bpにかけて並ぶフラグメント(第3
図参照)が分離され、下記のようにしてSmaiとHinduで予め消化され1
こ適当な融合ベクターに連結される。 ゛
pap a遺伝子を■するフラグメントは、下記の方法でflEうnルカ・Bg
llO代わりにBamHlで消化することによって行われる。ゲル上の2,40
0bpから1,500bpにかけて並ぶフラグメント(第3図参照)が選択され
る。papE遺伝子を有するフラグメントは、800〜400b+pfこかけて
並ぶフラグメント(第8図参照)を選択して同様のしか1こで作られる。
psKs104、psKs105もしくはpsK8106のごとき融合ベクター
中にクローンされる(午ヤサダバンら、メソッズイン エンザイモロジイ、第1
00巻、1988年、第298〜308頁)。これらの構造体中の融合され1こ
遺伝子は1acUV5プロモーターによって転写される。
この構造体は、アンピシリン耐性をセレクトしながら、Laclqm伝子を汀す
る菌株、例えばエシェリヒア・コリ菌株JM103(フレラグら、 Nucle
ic ACidsRes、、第9巻。
1981年、第309〜321頁)に形質転換される。この菌株は次いでLB−
ブロスのごとき適切な培地〔シイ・ベルタニG、 Bertani :Lジャー
ナル 4ブ バクテリオロジイ、第62巻、1951年、第298〜308頁〕
中で、光学密度が0D600=0.4になるまで培養される。次いで融合遺伝子
の転写はIPTGを添加する0とによって誘導される〔ジエイ・ミラー (J、
Miller)、 Experiments In Mo1ecula、r
Genetics J:l−ルF x フ!Jングハーバー、ニューヨーク、1
972年)。
培養は融合遺伝子の産物の最大設現が得られるまで続けられる。
次いで細胞が収穫され、融合遺伝子産物はβ−ガラクトシグーゼ活性の検査法(
ジエイ・ミラーの前記文献参照)を用いる標準法で精製される。次いでこの精製
融合産物は、例えばげつし動物類、さる類もしくは豚についてのワクチン試験に
直接使用できる。
B、ワクチンの製造
ワクチンとして用いられる、全papB%pap FもしくはpapG遺伝子産
物またはその適当なフラグメントは下記のいずれかの方法で作製される。
1、1acZ遺伝子と、papE、 papFもしくはpap G遺伝子の精製
ンのごとき化学試薬で消化される。得られたポリペプチド混合物から、所望のペ
プチドが、標準の技術、例えばイオン交換クロマトグラフィもしくはHPLO逆
相クロマトグラフィによって得られる。
2、一方その融合蛋白に対する抗体がこれらをラビットに注射することによって
生成される。得られた抗体は、融合されていない純粋のpapE%pap Fも
しくはpapG遺伝子の産物を、これらの遺伝子を有するプラスミドを合方する
lac Z−細菌から精製するのに用いることができる。このプラスミドは、p
PAP5もしくはpPAP16のごときpBR822誘導体、またはPBEU2
8のごときランフつエイプラスミド誘導体〔ニーリンら(Uhlin et a
l)、 Gene、 fA 22巻、1988年、第255〜265頁〕であっ
てもよい。
この精製は、イムノアフイニテイ ゲル リロマトグラフイによって行われろか
、その抗体は精製方法を開発する際1こポリペプチド類を検出するのに用いられ
るEL I S A分析法を開発するのに用いられる(原料および方法の項づ照
)。
これらの精製ポリペプチド類のフラグメントは、所ulこより、立起1に記載の
プロテアーゼなどで分割することによって得られる。
8.5〜30のアミノ酸で構成されるフラグメント、またはより大量のpapE
、 papFおよびpapG遺伝子産物は固相ペプチド合成法(スチュノート
アンド ヤング、 5olidPhasePeptide 5ynthesi
s、フリーマン アンド カンバニイ、サンフランシスコ、米国、 、1969
年)で合成される。次いでそれらは、それ自体か、またはポリーL−リシンもし
くはポリ−D、L−アラニンのごとき生理的に受容な担体の担体分子に、助剤と
ともにもしくは助剤なしで、アルノン、 J、 ImmunologicalM
ethoa 、第61巻、1988年、第261〜273頁に記載されているの
と実質的に同じようにしてカップリングされて、予防接種に用いることができる
。
C,スートモナス系
線毛形成と接合がスートモナス種牛にリンクされていると仮定してスートモナス
の接合性菌株からの染色体DNAが、p、BR’122 誘導体、スートモナス
/エシェリヒア・コリのシャトルベクター、プラスミドベクターもしくはファー
ジベクターにクローンされ、ついでエシェリヒア・コリに形質転換/トランスフ
ェクトされるフラグメントを作製するfこめに制限エンドヌクレアーゼで消化さ
れる。そのハイブリッドベクターを収容する細菌は、精製スートモナス線毛に対
して生成する抗体を用いて大きなスートモナス線毛サブユニットの産生の1こめ
にスクリーニングされる〔このことはベクタートしてpBR822を用いるエヌ
・ゴノルホエについてなされている。メイヤーら、(Me/er et al)
+ Ce11. 第30巻、1982年、第45〜52頁を参照〕。
次いでこのクローンは、直接にか、または線毛遺伝子含有のより大きなりNAフ
ラグメメンを得るためのプローグとして用いられる。このフラグメントは、次い
でスートモナス/エシェリヒア・コリのシャトルベクターにクローンされ、ノン
−ピリエイトされた( nOn −piliated )非接合性のスートモナ
ス菌株に転移され次いで接合性と線毛形成性が検査される。次いでこのフラグメ
ントの突然度付誘発は、代わりに表現型の検査がスートモナスについて行われる
ことを除けば、泌尿器病原性エシェリヒア・コリについて実施例2に記載したの
と本質的に同じ方法で行われる。
一方、その染色体DNAが、スートモナスベクターモジくハス−トモナス/エシ
ェリヒア・コリ シャトルベクターfこ直接クローンされ、非接合性のスートモ
ナス菌株に形質転換されるならば、そのクローンは接合性について直接スクリー
ニングすることができる。他の検査法例えば俗解性受容体の結合性を用いること
ができる。
エシェリヒア・コリ中での融合蛋白生産と蛋白生産は、おこリウル転写信号と翻
訳開始信号を人工的に灰えなければならな′Sと記の方法と類似のしかたで行わ
れる。一方、蛋白生産は、例えば、バグダサリアンら(Bagdasarian
et al)、 Gene。
第26巻、1988年、第278〜282頁に泥除の例えば広域宿主範囲のTa
cプロモーターベクターを用い、スートモナスの相同システム中で行うことがで
きる。DNAの配列とアミノ酸分析はL記実施例4と5に記載し1このと本質的
に同じに行われ、そしてその纂基配列分析法に基づいて合成ペプチド類をと記記
載のようにして生産することができる。
スートモナスについて要約し1こ方法のみならず実施例1〜5(こ記載の方法と
類似の方法は、不イセリ7種などのごとき他の接合性細菌から得られると考えら
れるアドヒシン ポリペプチド類を同定および生産するのに用いることができる
。
原則として、すべての研究は蛋白化学を用いて行うことができる。アドヒシン
ポリペプチド類は、例えばジガラクトシドといつ1こ受容体、アフィニティ リ
ロマトグラフィまたは他のいずれの適切な方法(抗体アフィニティ リロマトグ
ラフィのごとき)によってJ[を1こかめ、精製することができる。蛋白の純度
は、原料と方法の項に記載し1こ5DS−ポリアクリルアミド ゲルl気泳勧法
によって検査できるつアドヒシン類が製剤の大きなフラクションを構成するとい
うことを確認する1こめに、放射能漂識のされ1こ受容体を用いる平衡透析実験
法を用いて、存在する蛋白の1分子当りの結合座位を計算してもよい。
これは蛋白1分子当り0.1〜10リガンドであると考えられる。
実施例8
この実施例に用いられtコ原料と方法
細菌菌株、プラスミドおよび培養条件
細菌菌株はすべ′C,第2表1ζ記載の臨床′ζ7の単離物を除いて′、エシェ
リヒア・コリに、 12の誘導体ひJ)る。蛋白表現分析用(こP678−54
(1)のrec A m導体のA、 A 10が用いられた。M13のクローニ
ングとノアー:−ンの増殖はJM108中で行われ1こ。
HBIOIは他のすべての実験における宿3f′cあ−)fHH。
プラスミドpPAP5(前記の一般原料と方法の項参照)はエシェリヒア・コリ
J96から単離され1こ。9.5kbのECO几1−BamHi染色体フラグメ
ントを有するpBR322の誘導体である。このクローンは血清学的にF12に
関連するF”0134.8”線毛抗原を表現する。papミルミルクラスター蝕
子地図1図に示す。プラスミドpDO5はエシェリヒア・コリIA2の8.Ok
b 01al −EamHl 7ラグメントを合するpAOYo 184 i1
導体であり、一方pPIL110−85は、F72 線毛抗原形成の原因である
エシェリヒア・コリAD 110から分離されたl 6 kbのBcoRIフラ
グメントを葡するpACYO184の誘導体である。
下記濃度の抗生物質が選別に用いられf−、。すなわち100μノ/ wlのカ
ルベニシリン、15μ9/wlのテトラサイクリン、20Il!’/mlのカナ
マイシンおよび20μf//mlのクロラムフェニコールである。細菌は37°
Cでルリア・ブロスもしくはルリア寒天上で培養され1こ。
一般的な処理法
C!a012処理が形質転換に用いられた。プラスミドDNAは、バーンボイム
エイチ シイおよびジエイ ドリイ(Eirnboim H,C,and J
、 Doly) (”A rapid alkalineex”cra、ctj
−on procedure for r、crae+t、i−pg y、QC
:)1111)lLTlan’t。
pla)Eml(i D N −4” + Nucl Ca、r 、l(C1(
上ff:l 1%P:f+ 、 、117! 、1979年、第1518−15
23頁、11お、ミ(″ぐり一了スベルドら(Gror;veld at al
)(“ Is○]、at:i、On o’j) β−globin −rela
te+1genes from a huma、n cosmj−d ]−xi
−brary” * Gene + F5J 18巻、1981年、第227〜
237頁)のアルカリシ クリアー ライゼイト処理法(alkali、ne
clear 1ysate procedure)につづいて二つの連続しすこ
ごチジウノ・ブf:l’;、ド/CsC11u衡遠心分離法を行う、改良法で単
離されf、制限エンドヌクトアーゼ類は製造メーカーの推せんする条件下で使用
し1コ〔ニューイングランド バイオラブズ、米国、ベーリンガー マンハイス
シイエムビイ;イチま1こはベセスダ リサーチ ラボラ1−リイズ ジイエム
ビイエイチ(Ee=、basda Re5earch Laboratorie
sGmbH) )。消化され* D N Aは0.5%−1,5%(wt/vo
l )アガロースゲル上で分離された。HjncllおよびHaeiでそれぞれ
分割されたファージλDNAとファージφX17.1DNA(二、1−イングラ
ンド バイオラブズ)は分子fffi串として用いられた。DNAフラグメント
は、5%(wt 、、/vol ) eリアクリルアミドゲルからエレクトロエ
リューション(electroelutiorx )によって純粋な形態で1@
られtこ。
プロッティングおよび雑種形成手順
(82p )で標識されたDNAプローブを、ニックトランスレーションによる
かま1こはトイ18雑種形成フロ−fプライマーにニューイングランド バイオ
ラブズ)での、クローンされたM2S−ff1鎖DNA鋳型(colonecl
M 18 single 5trandedDNA templates )
のブライミングDNA合成法(1)rimingDNA 5ynthesis
)によって製造される。〔a P)dGTP〔アマ−ジャム(Amersham
)、イングランド〕は約1X10”cpm/μノの比活性Iこまで組入れられ
た。プラスミドDNAは、アガロースゲル上でサイズフラクションされ、サザン
、イーエム(5outhern、 E、 M、)、“Det8CtiOn of
5peCificSequenCeEi among DNA fragme
nts 5eparatea ’by gelelectrophore si
s”、ジャーナル オブ モレキュラー バイオロジイ、第9g4.x9’ir
s年、第503〜517頁にしtこがって、ニトロセルロースフィルター〔シュ
ライへル アンドシュJl/ (5chleicher and ScMill
)、 Bλ85〕に移された。
そのプロットされ1こフィルターは、4XSSC(1X5SOは150mM N
aG!1.15mMクエン酸ナトリウムpH7,0である)、10×デンハルト
i8H(Denhardt’s 5olution ) 、 0.1%SDS、
2mM EDTAおよび晋波処理されに小午胸線DNA(50μf15it)か
らなる雑種形成溶液中2時間68°Cで予備雑種形成がなされfコ(prehy
’bridized )。次いで新しい雑種形成溶液中の放射能標識され1こプ
ローブ(L X I Ocpm/g?) カフイルター?こ添加されプラスチッ
ク ノ(ソゲ中18時間@養された。緊縮条件下で維挿形成が68°Cで行われ
、洗浄は同温度で2XSSC;0.1%SDSから0.1X5SOiO,1%S
DSへかけての塩濃度で行われ1こ。非緊縮碓種形成は、雑種形成温度が55°
C″C−洗浄が2XS SOでなされることを除いて同じ条件下で行われた。フ
ィルターを一夜増感板つきのデュポン クロネツクス4 エックス線フィルムに
露光シtこ。
ミニ細胞中の蛋白表現の分析
プラスミドpFAP5.pPAP502.pDO5およびpPILl。
−35を、ミニ細胞産生の菌株人AIOに形質転換し1こ。ミニ細胞の製造と、
〔S〕Sノーオニン(7マージヤム)での標識付けは、トンプソン アール ア
ンド エム アヒトマン(’rhompsOn、 R,ana M、 Acht
man )、“The Control regionof the F Se
X factor DNA transrer cistrons :rest
riction mapping and D NA cloni−ng” 、
モレキュラー第165巷、1978年、第295〜304頁に記載されているの
と同じである。放射性の試料はリニアーの15%(wt/vol )SDS−ポ
リアクリルアミド ゲル丘で分離され1こ。次いでそのゲルは固着され、染色さ
れ、脱色されエンハンスされ〔エンハンス(Enh、ance )、 New
England Nuclear GmbH)、次いでエックス線フィルムに1
〜6日間露光し1こ。分子量標準はファーマシャ ファイン ヶミカルズ(Ph
armacia FineOhem:Lcals ) 、スエーデンからのもの
であつtこ。
ヌクレオチド配列の測定
関連のあるフラグメントはフr−ジΔ113クローニングベクターのbi13m
p8とM18zp91こり[]−ンされ、次いでエシェリヒア・コリ菌株Jλ1
103に形質転換された。−直鎖鋳型DNAは、メリックら(Messing
et al )、“A System forshotgurx DNA se
quencing”、 Nucleic Ac1d Res、 +第9巻、1.
981年+g309〜321頁1こ記載のようにしてファージから単離さnlこ
。そのDNA配列は、サンガーら(S卸geretal)、“DNA sequ
encing with chain−terminatinginhibit
ors”、ブロシーデング オブ ナショナル ア力デミイ オブ サイエンス
オブ USA、第74巻、1977年。
第5468〜5467頁に記載の、M2S ペンタデカマーシーケンシング ブ
ライv (M 18 pentadecamersequencing pri
mer) にューイングランド バイオラブズ)を利用するジデオキシ チェイ
ンーターミ不イション法(dideoxy chain−terminatio
n method )によって測定された。
受容体結合性検量法
第1表と第2表に挙げたプラスミド類によってインコードされる遺伝子産物の結
合性は、上記の一般原料と方法の項に記載され1こ、グロボシド受容体含有のP
I−赤血球とグロボシドを欠くp−赤血球とを用いるスライド凝集法によって測
定された。
線毛抗原検量法
精製Pap線毛(87)に対して生成する抗血清を利用するスライド凝集法は上
記の一般原料と方法の項に記載し1このと同様にして行われ1こ。抗血清はPB
S(pH7,5)に500倍稀釈して使用された。
相補性分析用プラスミド誘導体の組立てプラスミドpPAP48は、 amal
消化とこれにつづく低DNA?!!度での連結によって得られるpPAP5の誘
導体である。このプラスミドはpPAP5のSmall−8ma14領域を欠い
ており(第1図)、シ1コがってpapEとpap Aの遺伝子のみをりする。
カットバック誘導体pPAP502を組立てる1こめに、プラスミドpDO5(
第1図)をBgllで完全に消化し、BamHlで部分的に消化し、次いでリリ
ゲーション(、religati○n)され、HB 101に形質転換された。
プラスミドDNAは形質転換細胞から分離され計算され1こサイズでスクリーニ
ングされた。適切な大きさの一つのクローンpPAP502をさらに分析し1こ
ところ、予想どおりにpapG遺伝子はなかっ1こ(第3図番照)。プラスミド
pPAP503は、lacプロモーターを何するp 5に8106由米のEco
Rl−H1nd置”)ラグメントと、EcoRl とBamHIとで消化された
pBR822に対してのpDo5の最も右側のHind厘〜EamH1フラグメ
ントとを連結することによって組立てられた。プラスミドpPAP504は、p
PAP 50 F3をEgllとEamHi によって消化し、次いで低D N
A 濃度でリリゲーションすることによって得られ1こ。プラスミドpPAP
507は、アンピシリン耐性を選択し、血球凝集反応をスクリーニングするpP
AP503の唯一のHir+a I座位にpap A 5papHおよびpap
Oと同等の遺伝子を胃するpDC5(7)Hindlフラグメントをクローニ
ングすることによって組立てられた。
この中間体(pPAP506 )は次いでEgllとBamHlとで消化され、
次いでpPAP50gからpPAP504を朝立てる際と同様のしかたでリリゲ
イトされpPAP507が得られた。
電子顕微鏡法
電子顕微鏡法は、2%フオームバー(for迅var )の薄いフィルムで被覆
された100メツシュ銅グリッド付きJEOL100E顕微鏡を用いて行ツtコ
。祷菌をI OmM Tris HOl(pH7,5)中1ζ再分散させ、10
mM Mg012 と前記グリッド上に置いた。過剰分を直ちにP紙で除去し
た。次いでグリッドを緩衝液で洗浄し、8.55%のモリブデン酸アンモニウム
で5秒間ネガティブ染色を行ない、再蒸留し1こ水で洗浄し1こ。
結果
pPAP5の、pDo5およびpPII、10−85との構造比較三つのプラス
ミドはすべてグロボシド−結合特異性をインコードすることを示した(第2表)
。これらプラスミドの染色体挿入部分はいくつかの制限エンドヌクレアーゼによ
って地図が作成され1こ。フラグメントの大きさの小さな不一致でも検出しうる
ように、異なるプラスミドの制限酵素による消化物が7ガロースゲル電気泳動法
による平行スロットで分析され1こ。第1図に示すように中央のSmall−K
pnlフラグメントは三つのプラスミド全部について同じ大きさく 4.6 k
b )である。pPAP5中ではこのフラグメントは、papoとpapD遺伝
子のみならず付加された遺伝子の一部の遺伝子情報を指定する。この中央のフラ
グメントの物理的地図には全く若異が認められなかった。
さらにpPAP5中のpap Cのコーディング領域(codingregiO
n)由来で大きさがほぼ370bpのPstl 7ラグメントは、pDo5やp
PJLllo−85中の同じサイズのPst)フラグメントと雑種形成がなされ
る( h/bridize )。同様に、papoのN−ターミナル領域からの
128bpのHpa lフラグメントはpDo5やpPILllo−85からの
同じサイズのHpalルミlルミlフラグメントなされろ。これらの観察結果は
、グロボシド−結合性遺伝子クラスターの中央領域は輸出および組立ての機能を
インコードすると信じられ、高度に保存されている( conversed )
ことがわかる。
プラスミドpPIL110−85は、保存されたSmart−Kpnl領域の左
方向に延びる5、7kbのDNAフラグメントを有している。この領域はF72
線毛の構造遺伝子を取囲んでおり、papAと同等の位置を占めている。その制
限座位相同性は、この領域では保存されていない(第1図)。まr、:papA
の中央部からの221のヌクレオチドの長さのプローブは、papAのまさに5
′部分が緊縮条件下で強く雑種形成したけれども、低い緊縮状態でさえもpPI
Lllo−85とのよりい雑種形成信号しか与えなかった。これは二っのビリン
遺伝子の5′末端が高度に保存されていることを意味し、一方中央部は著しく分
岐し1こようである。
papBのコーディング部から通常得られるDNAプローブは、pPILllo
−35の6.0 kb Hlndi 7ラグメントとの強い雑種形成信号(hy
bridization signal )を与えた。このことは、この遺伝子
が保存され、その二つのクローン中同じ位置に存在していることを示唆している
。
三つの遺伝子papE、 papFとpapGはpPAP5のSmalg−Ea
fnHJフラグメントにあることが分かった。このフラグメントの制限パターン
は、中央のSmall−xpnlよりもpDo 5およびpP(LIIO−85
中では保存のでいとか少ない。pPAP5のSmala−EglNフラグメント
はpapE 、 1)ap FおよびpapGの5′末潟側の半分ををしている
。このフラグメントをサザンプロッティング実験でプローブとして用いると、同
じ強匣の信号が、分析された三つのプラスミド全部Iこ検出された。雑種形成す
るフラグメ:/トは三つのプラスミドの物理的地図中間等の位置を占めている。
一方、pap Gの8′末端側の半分を倉ず−るBgll −8ma 14プロ
ーブはpPAP5DNAで逢い(g号を与えるが、低い緊縮条件でさえもpDC
5もしくはpP iL 110−3’SDN人とM種形成しない。これらの二つ
のプラスミドはこの領域からのpapGと類似のサイズを持つ蛋白をインコード
するということに留意すべきである。まtこそれらはpap G領域にpPAP
5とは異なる、類似の制限パターンを汀するようである。
相同性と非相同性との間の境界線をより正確に定義する1こめに、papE%p
ap Fおよびpap Gの限定され1こ領域を有する多数のM18クローンが
用いられjこ。ニックトランスレートされ1こpDc5とpPILllo−85
がプローブとして用いられた。
papEとpapFDNAを合するRf 1 Bプローブすべてについて陽性の
雑種形成性が検出された。papGDNAだけを有するM13クローンはいずれ
も陽性の信号を勾えなかつtコ。し1こがってpapEとpa、p l”は保存
されているが、pap Fの端部とpapGのスタート部との近傍において相同
性の急激な低Fがある。
ミニ細胞における蛋白の表現
pPAP5、pD05およびpP[,110−85から表現される蛋白は、エシ
ェリヒア・コリのミニ細胞中で(8)−メチオニンの標識が付けられており、そ
の放射能で標1忌の付され1こ遺伝子産物は15%5DS−ポリアクリルアミド
ゲル上で分析されtコ。pPAP5のpapBとpap Aと類似の分子量の蛋
白はpPILllo−35からは表現され1こがpDc5からは表現されなかつ
tこ。pDC5とpPILllo−85の両者は、pI’AP5のpap Cと
ほぼ同じ位置1ζ位置しており、−っの蛋白7l−75Kを表現するこ七は分か
つていた〔フレラグ・ニス アンド ジニイ・ゲイ・ピアース((:!legg
、 S、 a、nd J、 K、 Pierce )。
”Organization of (ger+es respons:1−b
le for theproauctionofmannosereslsta
ntfj−mbrxaeOfuropatnoger+(−3ic Esche
richj−a coli 1solate”、インフエクション アンド イ
ムニティ、第42巻、1983年、第900〜906頁、並ヒニハンYイ、 フ
イラ(van Die、 I。
etal)、“MOlecular organisation of the
genesinvolved in the production of
F72 fimbriae。
causing mannose resistant haemaggl、u
tination+ Ofa uropathogenic Escheric
hia coli 06 :に2 :Hl :F7Sjral−n−モレキュラ
ー アンド ジェネラル ジエ不ヂイソクス、第194巻、1984年、第52
8=533頁〕。
pDC!5とpPiI、110−85のpapO遺伝子産物は、pPAP5のP
apC蛋白よりもわずかに低い分子量を汀する弱く表現されtこ蛋白として出湯
するが、一方pDO5とpP[Lllo−45の両者はPapD蛋自と同じ分子
量を有する蛋白を表現する。pP ILllo−351こついで、この蛋白をイ
ンフードする遺伝子はpapDに対応する領域1こあることが分かつてい1コ(
パン ディ アイら、 ”Mo1ecu18r organisation o
f the genesinvolved in tne productio
n of F72 fimbriae。
causing mannose resist、ant 11aemagg1
utinatiOn、 ofa uropathogenlc Escheri
chia coli 06 :に、2 :Hl : F7strain ”、モ
レキュラー アンド ジェネラル ジエ不ティックス、第194巻、1984年
、第528〜588頁)。
pPAP5のPapE蛋白は16.5にの見掛けの分子量を督する。
pDO5とpPILllo−35中tζは同Qサイズの蛋白を検出できなかつ1
こが、両プラスミドから表現されたわずかに小さい蛋白はこれらの遺伝子のクラ
スターのpapE遺伝子産物であったのかも知れない。三つのプラスミド全部が
、グロボシド結合には必須のpap Fによってインコードされていることが知
られている15にの蛋白を表現し1こ。pPAP5(7)PapG蛋白は35K
。
のポリペプチドであり、pDO5とpprLtio−asの両者中にはわずかに
分子量の大きい蛋白が見出された。pDO5,pPAP502のBgll−Ba
mHIカットバック誘導体は36にのポリペプチドを表現しなかっ1こ。これは
、pPAPS中のpapGと同じ領域にこの蛋白の遺伝子を局在させている。
pD05とppB、tto−asから高度1?Ft現され1:17K(11)ポ
リペプチドはこれらのプラスミドの末端のF3mB、(−BamHiフラグメン
ト1こ与えられた(フレラグ・ニス アンド ジエイ・’yイーピy−ス、 ”
Organization of genes responsiblefor
the production of mannoseresistant
fimbriaeof a uropathogenic Escherich
ia coli 1solate ”、インフエクション アンド イムニティ
、第42巻、1983年。
第900〜906頁、並びにパン ディ、アイら、 ” Molecularo
rganizatior* of the genes 1nvolved i
n theproauction of F72 fimbriae、 cau
sing mannO8e!resistant haemagglutina
tiOn、 Of a uropathogenicEscherichia
coli 06 :に2 :Hl :F75train”、モレキュラー アン
ド ジェネラル ジェ不ティックス、第1948゜1984年、第528−53
3頁)。pPAP5の構成はこの領域1こ同等のDNAを欠いており、このfこ
め17に蛋白はこれらのプラスミドもしくはpPAP502からは表現されない
。
pPAP5とpDc5.1:の遺伝子クラスター間の相補性(Compleme
ntation )
pDC!5はpapC,papD、 papEおよびpap F に高度に相同
のDNAを葡するので、pD05がpPAP5中のpap Aによって相補され
てpapA線毛の形成をも1こらずならば問題が起こる。そのため、papBと
papA遺伝子だけを汀し、papA抗原を表面に局在することのできないpP
AP43が作製された。このプラスミドを付するHB 101もpDc5を仔す
る同じ菌株も抗線毛抗血清によって凝集しなかった。これらの適合性のみるプラ
スミドは両方とも、同じ綿胞中に存在するが、抗血清凝集法によって示されるよ
うに、pap Aビリンは表面に局在してぃtコ。重子顕微鏡によって、pap
Aビリンが線毛の形態に組立てられたことが確認され1こ(データは示さず)。
pPAP48もpDO5も単独では、HE 101に収容された際には表面に局
在する線毛を表現しなかった。
アドヒシン機能も遺伝子クラスター間で相補されうるのがどうかを知るために、
pDO5の右端にあるEglll座位からBamHI座位トこかけてのDNAを
欠<pPAP502が作製され1こ。pDc!5と比較して、この誘導体はミニ
細胞中に86にと17K(7)rffリペプチドを表現できなかっ1こ。マツピ
インクおよび雑種形成データと一致して、36にの蛋白がpap遺伝子クラスタ
ーのpap Gによってインコードされるa5Kf白に対応すると考えられる。
プラスミドpPAP502は、pDC5と著しく異なり、血球凝集性を伝達しな
かっ1こ。pap E 、 papFおよびpapGepPAP5中に表現する
プラスミドのpPAP16を用いて、欠失誘導体pPAP502を相補して血球
凝集性にすることはトランス配置では可能でみる。かくして、アドヒシン機能は
一つの遺伝子クラスターからもうひとつの遺伝子クラスターにトランス相補する
ことができる。このことは、papG領域はクローン間では十分1こ保存されて
いないので警くべきことである。pPAP16の、papE 1 、 papF
1およびpapG1突然斐異体であるプラスミドpPAP18、pPAP17
およびpPAP4(前記の一般原料と方法の項参照)はそれぞれ、pPAP 5
02丘の欠失を相補できなかった。lacプロモーターのコントロール下にある
、pDo5のHincl i−BamHIフラグメントを有するプラスミドpP
AP503も血球凝集できなかつ1こ。しかしpPAP503はpPAP502
の欠陥を相補できた。これは両者のプラスミドを有する細胞によって陽性の血球
凝集反応が得られたことによって分かつ1こ。予想通りに、pPAP508のB
gll[−BamHI欠失誘導体はこの相補を達成できなかっ1こ(第3表中の
pPAP504 )。これらのプラスミドは、papミルミルクローンる補体突
然要具(complement mutation ) tこ用いられ1こ。p
PAP503は、Tn5挿入体全部をpapFとpapGにおいて相補し、一方
力ソドパツク誘導体pPAP504だけはpap Fにおいてこれらを相補した
。papO% pal)D 、 PapB 。
pap F遺伝子同等物をインコードするpD05誘導体のpPAP507は、
pap F遺伝子中にTn5変異を胃するpsNO21を相補した。これらの結
果は、pap FとpapG遺伝子産物と機能が類似している蛋白は、pDO5
J:の対応する領域によってインコードされることを示す。この実施例fこおけ
る実験から、papA遺伝子と、ある程度pap G遺伝子は三つのエシェリヒ
ア・コリ菌株に可変性(variability )を示すが一方papF遺伝
子はほとんど可変性を示さないと結論することができる。papGもしくはpa
p Fが特定の結合蛋白質の遺伝情報を指定するがどうかを決定することはでき
ない。
第 2 表
エシェリヒア・コリUT工菌株類とそれらそれぞれのアドヒノンをインコードす
るプラスミドクローン類の特徴グロボシド結合特異性は、グロボシド受容体を育
するPl−赤血球の陽性スライド血球凝集法(HA)とグロボシドを欠<p−赤
血球の陰性HAによって測定され1こ。検査条件は、前記の一般原料と方法fこ
記載し1このと同じである。N、D、:211定されなかつ1こことを意味する
。
第3表
pPAP5とpDO5とのpap遺伝子間の相補にHB 101に収容され1こ
プラスミド変異における相補性を、前記の原料と方法並びに一般原料と方法に記
載し1このと同様にしてPl−赤血球のスライド血球凝集法によってモニターし
1こ。
pap、ElとpapF1突然度異はリンカ−挿入突然変異誘発法(1inke
r 1nsertion mutagenesis)によってなされる非極性の
突然変異である(前記の一般原料と方法参照)。pap、G1突然変異はSma
)4−EamHlフラグメントの欠失であり、これによってpap G蛋白をI
Kまできりとる(前記の一般原料と方法参照)。Tn5突然変異papF::T
n5−021とpapG::Tn5−042がpapFとpapG遺伝子それぞ
れにあることが分かつ1こ。
はpPAP5誘導体である。左欄のプラスミドはpER’322 (1)MBI
)レブリ:+ンをHし、一方、と段の欄にあるプラスミドはpAOYO184(
p15A)レプリコンを胃する。角括弧〔〕円の遺伝子は、pPAPs中の対応
するpapl伝子と同等のpDO5である。
実施例9
エシェリヒア・コリの臨床単離物の雑種形成この実施例Iこ用いられた原料と方
法
細菌菌株とプラスミド
試料は、重症の細菌尿症の患者の尿(>l O5細菌/ml)から収集し1こエ
シェリヒア・コリの66のアイソレイト、および健康な個体から得られた96の
糞便のエシェリヒア・コリ アイソレイトで構成されていた。プラスミドpPA
P5は、全pap遺伝子クラスターを膏するエシェリヒア・コリJ96(0:4
)白米のaXkbの大きさのEcoRl−BamHlフラグメントを葡する。そ
の遺伝子構成を第2図に示す。プラスミドpDC5は泌尿器病原性エシェリヒア
・コリ菌株IA2(0:6)のグロボシド特異性アドヒシンの遺伝情報を指定す
る。これらの二つのプラスミドがpapミルミル子クラスター要部分にわ1こっ
て広い相同性を示すことが最近判明しtコ。しかしpap G遺伝子白米のpP
AP5のDNAはpDO5と雑種形成しなかった。DNA配列法(D N A
sequencing) tコよって、二つのクローンのpa−pG遺伝子間に
大きな差異のあることが確認され1コ〔ルンドら(Lund et al)未発
表〕。
児全な培地は、培地Fと0.2%グ・レコースとを補充しtこベルタニ(Ber
tani )のルリアブロス培地であっtこ、、細菌は37°Cで振禮しながら
培養されj、:っグルコース4ζしのルリアブOスエガープレートを皿球凝集検
査にf7−1い1:。
受蚕体−結合性の検査
ジガラクトンド債合性の同定のためfこ、グルコースなしのルリアブロスエガー
七で22時間培養され1こエシェリヒア・コリ咄菌■、泡カ、ジガラクトシド受
容体で被覆され1こラテックスビーズの溶液中に再分散されTコ。その細胞は、
1分間以内にビーズを凝集させるならばアドヒシンを表現するとみなし1こ。
染色体D N A O)製造
各@菌のアイソレイトは、100q?LB培地中で4x10/cell、//ま
で培養され1こ。その細菌を遠心分離で収集し、4゜+glPBS(100mM
リン酸カリウノ・緩衝液、p王(7,2,150mM Na11 >甲1こ分
散させ、再遠心分離に付し1.5 ygl P B S ”。
0、L!’9/mlプロテイナーゼK、5mMEDTAおよび0.5%5DS(
ドデシル硫酸ナトリ・クム)中に分散させf、+oその分散液を一夜室温で@養
し1、最後にフェノールで抽出シフ、エタノールでα澱させ、これを2買繰返し
1こ。
””P −4射能標識されfニー D N Aフラグメントの製造プラスミドp
PAP5とpDO5が適当な制限酵素で消化され、]) N Aフラグメントが
精製され、ニックトランスレーション法で82P標識を行つ1こ。
プロッティングと雑種形成の手順
ドットーブD ット法(dot−blot procedure)にしたがって
行1)1こ。211!の染色体D N Aを170μでの0. I M Fリス
miH(pH7、4) lこ溶解した。8011gの2M NaOHと100μ
#の3M Na11−0,8Mクコン酸ナトリウムを添11DJt、配合物を8
0°Cで20分1ハ)培養し1こ。その変性J) N A 1.!冷却され、4
0μlの2Mト!Jス緩衝液(I汀i7)で中和され、ニトロヤルロース゛、フ
ィルター1−の7−の区域1こ吸引さtll、風乾され、MBE 下65°Cで
12h丁ベイクされtこ。これらのフィルターを10×デンハルト(Denha
rdt ) (′j’ンハルトー=0.02%2ごリビニルビロリドン、002
%フィ:l−ル(Ficoll )、0.02%BSA )中、2hr培養され
1こ。それらをもう一度、4XSSC。
0.1%SDS、2mM EDTA、、10Xデ、、/ ハ)’、r l、、お
、よび5o lノ9/算lの小牛胸線DNA (95°Cで3分間加熱)を含有
する溶液中で、1 hr 65°Cで培養され1こ。I辱後tこぞれらは、前記
しt=のと同じ溶液中の放射能標識され1.=プローブとともに16hr16°
Cで給養し、4 ×S S Cで2×5分間および2×SSCで2×20分間6
0°Cで洗浄し、次いで風乾しfコ。得られfこフィルムは、増感フイルノ・付
きの一チ゛ユボンクロ不ソクス4エックス線フィルAlこ一70°C″′7:′
露光され欠いて為現像され1こ。
第4表
MRアドヒシン類と、papE、papFおよびpapGDNAへの雑種形成の
分布
第4表続き(1)
第4表続き(2)
第4表続き(3)
以下余白
第4表続き(4)
第4表続き(5)
第4表続き(6)
第4表続き(7)
菌株番号 1 ア ド L′ シ ン 類 I DNA翅楠形成プローブ第4表
続き(8)
この研究に用いられ1こエシェリヒア・コリ アイソレイトについての雑種形成
血球凝集性の結果
アイソレイト
尿 糞便
P−spec MRHA17 4
p−8peCMRHA 7 8
Z−5peCMRI(A 10 3
Total MRm 341O
Non hiRHA 8286
尿細菌 糞便細菌
(66st) (965t)
2Z種形成結果
Pap E、F Pap G Pap E、F Pap GpPAP5 pDc
5 pPAP5 pDC5P−specMRHA 1611614081p−s
pecMRHA 344 a 3021Z−specMRHA 8273121
2Tota1MRHA 2772778264NonMRHA 032 B 2
9284977菌株合計@ 2739 BO3610861581ラテックスビ
ーズ陽性 26 0 24 2 5ラテックスビーズ陰性 1396345P−
8peCMRHA :動物の赤血球をも凝集させる菌株を含む。
p 5peCMRHA :ヒトp−血液を凝集させる赤血球Z−spec MR
HA :ヒト赤血球には全く血球凝集を起こさないが、次の動物:豚、山羊、雌
牛の赤血球のいずれにも血球凝集を起こす。
この実施例で得られ1こ結果は、ジガラクトシドに結合するエシェリヒア・コリ
菌株の多数の臨床アイソレイト(単離物)がそれらのpapミルオペロン%Fお
よびG領域を胃すること、並びにジガラクトシドに結合しない菌株はそのオペロ
ン中に他の領域を有するけれどもpapミルオペロン%FおよびG領域を有して
いないことを示す。
国際調査報告
1+葎+y111ealAa6hcaM+NoρrTノl’lk’R’i/n1
1nムへI、、1.、jN6MI AIalle&m* m、PCT/DKB5
700015lMvpsa+laM1^−−m−”・ PCT/DK85100
045
Claims (81)
- 1.その免疫感作を行う主要な構成要素として、アドヒシンポリベプチドもしく はその免疫原性的に活性な部分配列もしくは免疫学的に活性な形態に変換しうる その前駆体の、抗原決定基からなり、その抗原決定基に対する抗体が、哺乳動物 の組織と接合する病原性のアドヒシン形成細菌によって産生されたアドヒシンポ リベプチドと反応する抗原。
- 2.少なくとも五つのアミノ酸のアミノ酸配列とアドヒシンポリペプチドの全ア ミノ酸配列までからなる請求の範囲第1項による抗原。
- 3.哺乳類の組織細胞上の炭水化物もしくは蛋白の受容体、または哺乳類の赤血 球と結合する請求の範囲第1項または第2項による抗原。
- 4.炭水化物受容体と結合する請求の範囲第3項の抗原。
- 5.ジガラクトシド含有のグリコリピドもしくはグリコプロテインと結合する請 求の範囲第4項の抗原。
- 6.アドヒシン形成細菌由来の請求の範囲第1〜5項のいずれひとつによる抗原 。
- 7.細菌が、泌尿器病原性もしくは腸内病原性菌株の、エシエリヒア・コリ、も しくは他の腸内細菌もしくは口内細菌、ネイセリア・ゴノルホエ、ネイセリア・ メニンギデイテイス、ネイセリア・キヤタルハリス、イエルシニア・エスピーピ ー、スードモナス・エルギノーサもしくは他のスードモナス・エスピーピー、モ ラキセラ・ボビスもしくは他のモラキセラ・エスピーピー、バクテロイデス・ノ ドスス、スタフイロコッカス、エスピーピー、ストレプトコッカス・エスピーピ ー、またはボルデテラ・ペルツシスのごときボルデテラ・エスピーピーである請 求の範囲第6項による抗原。
- 8.アドヒシンポリペプチドが線毛アドヒシンポリペプチドである請求の範囲第 1〜7項のいずれかひとつによる抗原。
- 9.線毛アドヒシンポリペプチドが少量の線毛成分である請求の範囲第8項によ る抗原。
- 10.病原性の線毛形成細胞由来のものである請求の範囲第9項による抗原。
- 11.細菌が泌尿器病原性もしくは腸内病原性菌株のエシエリヒア・コリ、ネイ セリア・ゴノルホエ、ネイセリア・メニンギデイテイス、ネイセリア・キャタル ハリス、モラキセラ・ボビスもしくは他のモラキセラ・エスピーピー、またはボ ルデテラ・ペルツシスである請求の範囲第10項による抗原。
- 12.病原性菌株のエシエリヒア・コリが泌尿器病原性菌株である請求の範囲第 11項による抗原。
- 13.下記アミノ酸配列: 【配列があります】 【配列があります】 またはその免疫原性的に活性な部分配列のいずれかを有する請求の範囲第1〜1 2項のいずれかひとつによる抗原。
- 14.下記アミノ酸配列: 【配列があります】 またはその免疫原性的に活性な部分配列のいずれかを有する請求の範囲第1〜1 .2項のいずれかひとつによる抗原。
- 15.下記アミノ酸配列: 【配列があります】 またはその免疫原性的に活性な部分配列のいずれかを有する請求の範囲第1〜1 2項のいずれかひとつによる抗原。
- 16.線毛の他の成分を実質的に含有しない請求の範囲第8〜15項のいずれか ひとつによる抗原。
- 17.実質的に純粋な形態である請求の範囲第1〜16項のいずれかひとつによ る抗原。
- 18.請求の範囲第1〜17項のいずれかひとつに定義された抗原に対して生成 するか、または実質的にこの抗原に対してのみ生成する抗体。
- 19.請求の範囲第1〜17項のいずれかひとつに定義された抗原で、免疫化さ れうる動物を免疫にすることによって得られる請求の範囲第18項による抗体。
- 20.実質的に純粋な形態である請求の範囲第18項また第19項による抗体。
- 21.免疫化されうる動物が請求の範囲第1〜17項のいずれかひとつに定義さ れた抗原で免疫化され、次いでその動物から抗血清が得られる請求の範囲第18 項または第19項の抗体の製造方法。
- 22.免疫化が請求の範囲第1〜17項のいずれかひとつに定義された抗原の安 定化された水溶液で行われる請求の範囲第21項による方法。
- 23.安定化剤が緩衝液または補助剤である請求の範囲第22項による方法。
- 24.補助剤がフロイントの補助剤もしくは水酸化アルミニウムである請求の範 囲第23項による方法。
- 25.請求の範囲第1〜17項のいずれかひとつに定義された抗原に対して生成 する抗体を産生するハイブリドーマ細胞クローンが適切な増殖培地で培養され、 形成された抗体が培養物から回収される請求の範囲第18項の抗体の製造方法。
- 26.抗体をインコードする単一もしくは複数の遺伝子がバイプリドーマ細胞ク ローンから適切なベクターに転移され、そのハリブリッドベクターが適切な細菌 宿主に形質転換され、その宿主が適当な培地で培養され、抗体が培養物から回収 される請求の範囲第25項による方法。
- 27.細菌宿主がエシエリヒア・コリまたはバチルス・ズブチリスである請求の 範囲第26項による方法。
- 28.任意に適切な担体に結合された請求の範囲第1〜17項のいずれかひとつ の抗原の免疫原性的有効量と免疫学的に受容な賦形剤とを含有する、哺乳類の組 織に接合する病原性細菌によって起こる疾病に対して哺乳類を免疫化するための ワクチン。
- 29.担体が生理的な受容なポリマーである請求の範囲第28項によるワクチン 。
- 30.任意に適切な担体に結合された請求の範囲第1〜17項のいずれかひとつ の抗原の免疫原性的有効量が免疫学的に受容な賦形剤と合せられる請求の範囲第 28項また第29項のワクチンの製造法。
- 31.抗原が少なくとも五つのアミノ酸のアミノ酸配列からなり、担体がそのア ミノ酸配列が共有結合的に結合される生理的に受容なポリマーである請求の範囲 第30項による方法。
- 32.請求の範囲第1〜17項のいずれかひとつに定義された抗原をインコード するヌクレオチド配列が生理的に受容な担体のポリペプチドをインコードするヌ クレオチド配列に融合され、その融合されたDNA配列が適切なベクターに挿入 され、そのハイブリッドベクターが適切な細菌宿主に形質転換され、その宿主が 適切な媒体中で培養され、そしてその融合されたポリペプチドが培養物から回収 される請求の範囲第30項による方法。
- 33.請求の範囲第1項に定義された抗原をインコードするヌクレオチド配列を 少なくとも有し、好ましくはそのDNAフラグメントが他のいずれの抗原もイン コードしないDNAフラグメント。
- 34.全アドヒシンポリペプチドをインコードするヌクレオチド配列からなる請 求の範囲第33項によるDNAフラグメント。
- 35.免疫原性的に活性な形態に変換しうる、アドヒシンポリペプチドの前駆体 をインコードするヌクレオチド配列からなる請求の範囲第33項によるDNAフ ラグメント。
- 36.アドヒシンポリペプチドの免疫原性的に活性な部分配列をインコードする ヌクレオチド配列からなる請求の範囲第33項によるDNAフラグメント。
- 37.少なくとも5ドンの長さを有する請求の範囲第33〜36項のいずれかひ とつによるDNAフラグメント。
- 38.アドヒシン形成細菌由来である請求の範囲第33〜37項のいずれかひと つによるDNAフラグメント。
- 39.泌尿器病原性もしくは腸内病原性の、エシエリヒア・コリもしくは他の腸 内細菌もしくは口内細菌、ネイセリア・ゴノルホエ、ネイセリア・メニンギデイ テイス、ネイセリア・キヤタルハリス、イエルシニア・エスピーピー、スードモ ナス・エルギノーサもしくは他のスードモナス・エスピーピー、モラキセラ・ボ ビスもしくは他のモラキセラ・エスピーピー、バクテロイデス・ノドスス、スタ フイロコッカス・エスピーピー、ストレプトコッカス・エスピーピー、またはボ ルデテラ・ペルツシスのごときボルデテラ・エスピーピー由来である請求の範囲 第38項によるDNAフラグメント。
- 40.アドヒシンポリペプチドが線毛アドヒシンポリペプチドである請求の範囲 第33〜37項のいずれかひとつによるDNAフラグメント。
- 41.線毛アドヒシンポリペプチドが少量の線毛成分である請求の範囲第40項 によるDNAフラグメント。
- 42.病原性の線毛形成細菌由来である請求の範囲第33〜41項のいずれかひ とつによるDNAフラグメント。
- 43.細菌が泌尿器病原性もしくは腸内病原性菌株のエシエリヒア・コリ、ネイ セリア・ゴノルホエ、ネイセリア・メニンギデイテイス、ネイセリア・キヤタル ハリス、モラキセラ・ボビスもしくは他のモラキセラ・エスピーピーまたはボル デテラ・ベルスシスである請求の範囲第42項によるDNAフラグメント。
- 44.病原性菌株のエシリヒア・コリが泌尿器病原性の菌株である請求の範囲第 43項によるDNAフラグメント。
- 45.下記DNA配列: 【配列があります】 または、表現される際に、全DNA配列によってインコードされるアドヒシンポ リペプチドの免疫原性的に活性な部分配列を構成する、そのいずれかの部分配列 を有する請求の範囲第44項によるDNAフラグメント。
- 46.下記配列: 【配列があります】 または、表現される際に、全DNA配列によつてインコードされるアドヒシンポ リペプチドの免疫原性的に活性な部分配列を構成する、そのいずれかの部分配列 を有する請求の範囲第44項によるDNAフラグメント。
- 47.下記DNA配列: 【配列があります】 または、表現される際に、全DNA配列によってインコードされるアドヒシンポ リペプチドの免疫原性的に活性な部分配列を構成する、そのいずれかの部分配列 を有する請求の範囲第44項によるDNAフラグメント。
- 48.請求の範囲第1項に定義された抗原をインコードするヌクレオチド配列を 少なくとも有し実質的に他のいずれの抗原もインコードしないDNAフラグメン トが挿入されて含有するハイブリッドベクターを収容する細菌宿主が培養され、 次いでそのDNAフラグメントから表現される産物を回収し、次いで任意に精製 される、その免疫感作を行う主要な構成要素としてアドヒシンポリペプチドの抗 原決定基を有する抗原の製造方法。
- 49.アドヒシンポリベプチドもしくはその免疫原性的に活性な部分配列もしく は免疫学的に活性な形態に変換しうるその前駆体からなる第一ポリペプチドをイ ンコードするDNAフラグメントが、第二ポリペプチドをインコードするDNA 配列に融合され、その融合されたDNA配列が適切な細菌宿主に挿入され、その 宿主が適当な培地で培養され、融合ポリペプチドがその培養物から回収され、第 二ポリペプチドに対する抗体を使う分析法を用いて精製され、そして第二ポリペ プチドが、適切なプロテアーゼによって任意に分割され次いで二つのポリペプチ ドに分離される、請求の範囲第48項による方法。
- 50.第二ポリペプチドをインコードするDNA配列がβ−ガラクトシダーゼを インコードするlacZ遺伝子である請求の範囲第49項による方法。
- 51.DNAフラグメントが請求の範囲第33〜47項のいずれかひとつのDN Aフラグメントである請求の範囲第48〜50項のいずれかひとつによる方法。
- 52.ポリペプチドもしくはその免疫原性的に活性な部分配列がペプチド合成法 で製造される、その免疫化を行う主要な構成要素としてアドヒシンポリペプチド の抗原決定基を有する抗原の製造方法。
- 53.アドヒシンポリペプチドが線毛アドヒシンポリペプチドである請求の範囲 第52項による方法。
- 54.合成されるポリペプチドが少なくとも五つのアミノ酸の長さを有する請求 の範囲第52項または第53項による方法。
- 55.ポリペプチドが固相ペプチド合成法によって製造される請求の範囲第52 〜54項のいずれかひとつによる方法。
- 56.最初のアミノ酸が合成中にカップリングされる担体が、請求の範囲第28 項または第29項によるワクチン中の抗原の担体として有用な生理的に受容なポ リマーである請求の範囲第55項による方法。
- 57.任意に適切な担体に結合された請求の範囲第18〜20項のいずれかひと つによる抗体の免疫学的に有効な量と、免疫学的に受容な賦形剤とからなる、哺 乳類の組識に接合する病原性細菌によって起こる疾病に対する哺乳類の受動免疫 用組成物。
- 58.担体が生理的に受容なポリマーである請求の範囲第57項による組成物。
- 59.任意に適切な担体に結合された請求の範囲第18〜20項のいずれかひと つによる抗体の免疫学的に有効な量が免疫学的に受容な賦形剤と合せられている 請求の範囲第57項または第58項による組成物。
- 60.請求の範囲第18〜20項のいずれかひとつによる抗体からなる診断剤。
- 61.抗体が、線毛アドヒシンポリペプチドの免疫原性抗原決定基に対する抗体 である請求の範囲第60項による診断剤。
- 62.請求の範囲第1〜17項のいずれかひとつに定義された抗原以外の、免疫 原性抗原決定基に対する抗体からなる診断剤。
- 63.アドヒシン遺伝子クラスターによってインコードされる他のポリペプチド に対する抗体からなる請求の範囲第62項による診断剤。
- 64.抗体が他の線毛ポリペプチドに対する抗体である請求の範囲第63項によ る診断剤。
- 65.検出されるべき細菌中のDNA配列と少なくとも約60%が相同である、 安定で標識の付されたDNA配列からなる診断剤。
- 66.DNA配列が少なくとも12のヌクレオチドの長さを有する請求の範囲第 65項による診断剤。
- 67.放射能標識試薬で標識が付される請求の範囲第65項または第66項によ る診断剤。
- 68.DNA配列が、アドヒシン遺伝子クラスターの一部であるがアドヒシンポ リペプチド自体をインコードしない遺伝子またはその診断的に有効な部分配列か らなる請求の範囲第65〜67項のいずれかひとつによる診断剤。
- 69.DNA配列が、線毛アドヒシンポリペプチドではなく病原性線毛形成細菌 によって産生された線毛ポリペプチドの遺伝情報を指定する遺伝子、またはその 診断的に有効な部分配列からなる請求の範囲第68項による診断剤。
- 70.線毛ポリペプチドをインコードするDNA配列またはその部分配列が泌尿 器病原性エシエリヒア・コリ由来のものである請求の範囲第69項による診断剤 。
- 71.DNA配列が、この明細書に定義された遺伝子papCまたはその診断的 に有効な部分配列からなる請求の範囲第70項による診断剤。
- 72.DNA配列が、この明細書に定義された遺伝子papDまたはその診断的 に有効な部分配列からなる請求の範囲第70項による診断剤。
- 73.DNA配列が、この明細書に定義された遺伝子papBまたはその診断的 に有効な部分配列からなる請求の範囲第70項による診断剤。
- 74.任意に適切な担体に結合された請求の範囲第1〜17項のいずれかひとつ による抗原の免疫原性的有効量を含有するワクチン、または任意に適切な担体に 結合された請求の範囲第18〜20項のいずれかひとつによる抗体を含有しかつ 免疫学的に受容な賦形剤を有する組成物を投与することからなる、哺乳類の組織 に接合する病原性のアドヒシン形成細菌によって起こる疾病に対して哺乳類を免 疫化する方法。
- 75.細菌が、泌尿器病原性もしくは腸内病原性菌株の、エシエリヒア・コリも しくは他の腸内細菌もしくは口内細菌、ネイセリア・ゴノルホエ、ネイセリア・ メニンギデイテイス、ネイセリア・キャタルハリス、イエルシニア・エスピーピ ー、スードモナス・エルギノーサもしくは他のスードモナス・エスピーピー、モ ラキセラ・ボビスもしくは他のモラキセラ・エスピーピー、バクテロイデス・ノ ドスス、スタフイロコッカス・エスピーピー、ストレプトコッカス・エスピーピ ー、またはボルデテラ・ペルッシスのごときボルデテラ・エスピーピーである請 求の範囲第74項による方法。
- 76.病原性細菌が線毛形成細菌である請求の範囲第75項による方法。
- 77.病原性細菌が、泌尿器病原性もしくは腸内病原性菌株の、エシエリヒア・ コリ、ネイセリア・ゴノルホエ、ネイセリア・メニンギデイテイス、ネイセリア ・キヤタルハリス、モラキセラ・ボビスもしくは他のモラキセラ・エスピーピー 、またはボルデテラ・ペルツシスである請求の範囲第76項による方法。
- 78.宿主からの組織の試料を受容体−特異性ポリペプチドで処理し、未結合の 受容体−特異性ポリペプチドを除去し、結合した受容体−特異性ポリペプチドを 測定することからなる、ヒトのごとき宿主哺乳類における受容体密度もしくは分 布を測定する方法。
- 79.受容体−特異性ポリペプチドがアドヒシンポリベプチドである請求の範囲 第78項による方法。
- 80.アドヒシンポリベプチドが、泌尿器病原性菌株のエシエリヒア・コリのア ドヒシンポリペプチドである請求の範囲第79項による方法。
- 81.特定の病原性細菌の感染が防止されるよう細胞表面にアドヒシンポリペプ チドを分布させるために、1以上のアドヒシンポリペプチドでヒトもしくは他の 哺乳類を処理することからなり、使用されるアドヒシンポリペプチドが、病原性 細菌によって生成されたアドヒシンの結合する受容体と結合するアドヒシンポリ ペプチドである、ヒトもしくは他の哺乳類が病原性のアドヒシン結合性微生物に 感染する可能性を防止もしくは減少させる方法。
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4736017A (en) * | 1984-04-30 | 1988-04-05 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Chemically defined vaccine against urinary infections |
US4584195A (en) * | 1984-06-21 | 1986-04-22 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Broad spectrum vaccine against gonorrhea |
US4740585A (en) * | 1984-07-30 | 1988-04-26 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Synthetic vaccine against urinary infections |
US5288617A (en) * | 1984-10-31 | 1994-02-22 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organization | Method of producing an antigenic preparation |
AU590230B2 (en) * | 1984-10-31 | 1989-11-02 | Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation | Improved antigenic preparation |
IL78775A (en) * | 1985-05-15 | 1992-06-21 | Biotech Australia Pty Ltd | Oral vaccines |
DE3689713T2 (de) * | 1985-08-01 | 1994-07-07 | Miles Inc | Schützende Antikörper gegen serotypische Determinanten von flagellären Antigenen. |
US4900659A (en) * | 1986-01-30 | 1990-02-13 | Enzo Biochem, Inc. | Nucleotide sequence composition and method for detection of Neisseria gonorrhoeae and method for screening for a nucleotide sequence that is specific for a genetically distinct group |
US4801690A (en) * | 1986-03-24 | 1989-01-31 | Bactex, Inc. | Novel lectins derived from bacterial pili |
SE8601940D0 (sv) * | 1986-04-25 | 1986-04-25 | Kabigen Ab | Preparation of fused proteins, antibodies and processes therefor |
US4786592A (en) * | 1986-06-18 | 1988-11-22 | Scripps Clinic And Research Foundation | Neisseria gonorrhoeae lectin useful as a vaccine and diagnostic marker and means for producing this lectin |
US7138516B1 (en) | 1986-11-24 | 2006-11-21 | Gen-Probe Incorporated | Oligonucleotide probes for the detection and/or quantitation of non-viral organisms |
US7087742B1 (en) | 1986-11-24 | 2006-08-08 | Gen-Probe Incorporated | Oligonucleotide probes for the detection and/or quantitation of non-viral organisms |
US5036003A (en) * | 1987-08-21 | 1991-07-30 | Monsanto Company | Antibodies to VPF |
AU601510B2 (en) * | 1987-11-06 | 1990-09-13 | Immunomed Corporation | Preparation of bacterium pili subunits and vaccines containing pili subunits |
SE8801894D0 (sv) * | 1988-05-20 | 1988-05-20 | Alfa Laval Agri Int | Fibronektinbindande protein |
US5055455A (en) * | 1988-09-28 | 1991-10-08 | Brigham And Women's Hospital | Capsular polysaccharide adhesin antigen, preparation, purification and use |
US7172863B1 (en) | 1988-12-09 | 2007-02-06 | Gen-Probe Incorporated | Nucleic acid probes and methods for detecting Neisseria gonorrhoeae |
CA1340530C (en) * | 1989-04-28 | 1999-05-04 | Kok Kheong Lee | Synthetic pseudomonas aeruginosa pilin peptide and related vaccines and diagnostics |
SE8901687D0 (sv) * | 1989-05-11 | 1989-05-11 | Alfa Laval Agri Int | Fibronectin binding protein as well as its preparation |
US5202113A (en) * | 1990-04-30 | 1993-04-13 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Plaque-inhibiting protein from bacteroides loeschei and methods for using the same |
ES2127198T3 (es) * | 1990-08-02 | 1999-04-16 | Antex Biolog Inc | Receptores de adhesion para microorganismos patogenos u oportunistas. |
US5440014A (en) * | 1990-08-10 | 1995-08-08 | H+E,Uml/Oo/ K; Magnus | Fibronectin binding peptide |
US5843463A (en) * | 1990-12-21 | 1998-12-01 | Antexbiologics, Inc. | Adhesin-oligosaccharide conjugate vaccine for Haemophilus influenzae |
WO1992011367A2 (en) * | 1990-12-21 | 1992-07-09 | Microcarb Inc. | Lipid receptors for microorganisms and corresponding adhesins, dna sequences encoding adhesins, and use thereof |
US5834591A (en) * | 1991-01-31 | 1998-11-10 | Washington University | Polypeptides and antibodies useful for the diagnosis and treatment of pathogenic neisseria and other microorganisms having type 4 pilin |
US5980908A (en) * | 1991-12-05 | 1999-11-09 | Alfa Laval Ab | Bacterial cell surface protein with fibronectin, fibrinogen, collagen and laminin binding ability, process for the manufacture of the protein and prophylactic treatment |
AU662783B2 (en) * | 1992-01-08 | 1995-09-14 | De Staat Der Nederlanden Vertegenwoordigd Door De Minister Van Welzijn, Volksgezonheid En Cultuur | Whooping cough vaccine |
ES2185658T3 (es) * | 1993-05-18 | 2003-05-01 | Univ Ohio State Res Found | Vacuna para la otitis media. |
US5648240A (en) * | 1994-05-24 | 1997-07-15 | Texas A&M University | MHC II analog from Staphylococcus aureus |
WO1996000233A1 (en) * | 1994-06-24 | 1996-01-04 | Children's Hospital And Medical Center | Escherichia coli o157:h7 epithelial adhesin |
DE19534579C2 (de) * | 1995-09-18 | 2000-06-08 | Max Planck Gesellschaft | Nucleinsäure-Moleküle codierend Proteine, die die Adhäsion von Neisseria-Zellen an humane Zellen vermitteln |
US6872398B2 (en) * | 1995-12-22 | 2005-03-29 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Army | Conjugate vaccine against gram-negative bacterial infections |
NZ333250A (en) * | 1996-06-10 | 2000-05-26 | Thomas Boren | Helicobacter pylori blood group antigen binding adhesion protein |
EP2278011A3 (en) * | 1998-01-14 | 2012-03-07 | Novartis Vaccines and Diagnostics S.r.l. | Neisseria meningitidis antigens |
US7252828B2 (en) | 1998-07-15 | 2007-08-07 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Polysaccharide vaccine for staphylococcal infections |
US6692739B1 (en) | 1998-08-31 | 2004-02-17 | Inhibitex, Inc. | Staphylococcal immunotherapeutics via donor selection and donor stimulation |
AU762978B2 (en) * | 1998-08-31 | 2003-07-10 | Inhibitex, Inc. | Staphylococcal immunotherapeutics via donor selection and donor stimulation |
US20040001863A1 (en) * | 1998-12-03 | 2004-01-01 | Shau-Chi Chi | Immortal cell line derived from grouper Epinephelus coioides and its applications therein |
GB9924351D0 (en) | 1999-10-14 | 1999-12-15 | Brennan Frank | Immunomodulation methods and compositions |
EP1248646B1 (en) * | 1999-12-21 | 2008-02-13 | Merial | Compositions and vaccines containing antigen(s) of cryptosporidium parvum and of another enteric pathogen |
MX357775B (es) * | 2000-10-27 | 2018-07-20 | J Craig Venter Inst Inc | Acidos nucleicos y proteinas de los grupos a y b de estreptococos. |
EP1377314B1 (en) | 2001-01-26 | 2011-09-14 | Inhibitex, Inc. | Monoclonal antibodies to the clfa protein and method of use in treating or preventing infections |
US20030194798A1 (en) | 2001-05-24 | 2003-10-16 | Surber Mark W. | Minicell compositions and methods |
US7396822B2 (en) | 2001-05-24 | 2008-07-08 | Vaxiion Therapeutics, Inc. | Immunogenic minicells and methods of use |
US7132101B2 (en) * | 2002-02-27 | 2006-11-07 | Duquesne University Of The Holy Ghost | Compositions and methods for eliciting an immune response to gram-negative bacterial infections |
AU2003256329A1 (en) * | 2002-06-27 | 2004-01-19 | University Of Washington | Use of adhesion molecules as bond stress-enhanced nanoscale binding switches |
PL229487B1 (pl) | 2002-11-12 | 2018-07-31 | Brigham & Womens Hospital Inc | Kompozycja zawierająca polimer β-1,6-glukozaminy, kompozycja zawierająca przeciwciało, kompozycja farmaceutyczna, sposób wytwarzania wyodrębnionego polisacharydu, sposób identyfikacji obecności deacetylowanej poli-N-acetyloglukozaminy (dPNAG) i/ lub poli-N-acetyloglukozaminy (PNAG), wyodrębniony polisacharyd do zastosowania w leczeniu lub profilaktyce zakażenia, wyodrębniony polisacharyd do zastosowania do wytwarzania przeciwciał, w tym przeciwciał monoklonalnych, wyodrębniony polisacharyd do zastosowania w identyfikacji przeciwciała monoklonalnego |
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US20060002956A1 (en) * | 2004-04-05 | 2006-01-05 | Surber Mark W | Minicells as vaccines |
EP2455402A1 (en) | 2004-04-21 | 2012-05-23 | The Brigham and Women's Hospital, Inc. | Poly-N-acetyl glucosamine (PNAG/DPNAG)-binding peptides and methods of use thereof |
US7585236B2 (en) * | 2006-08-02 | 2009-09-08 | Wilson Sporting Goods Co. | Game ball having optimally positioned grooves and/or ridges |
US8251846B2 (en) * | 2006-08-02 | 2012-08-28 | Wilson Sporting Goods Co. | Game ball having optimally positioned grooves |
US7686713B2 (en) * | 2007-04-11 | 2010-03-30 | Wilson Sporting Goods Co. | Racquet stringing machine |
CN101784655A (zh) * | 2007-04-27 | 2010-07-21 | 菲尼克斯股份有限公司 | 可溶性重组二十面体病毒样颗粒的改良生成和体内装配 |
CA2731384C (en) | 2008-07-21 | 2015-03-10 | The Brigham And Women's Hospital, Inc. | Methods and compositions relating to synthetic beta-1,6 glucosamine oligosaccharides |
AU2012217728B2 (en) | 2011-02-15 | 2017-04-27 | Vaxiion Therapeutics, Llc | Therapeutic compositions and methods for antibody and Fc-containing targeting molecule-based targeted delivery of bioactive molecules by bacterial minicells |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS51151322A (en) * | 1975-06-12 | 1976-12-25 | Unilever Nv | Antigen composition |
JPS5899423A (ja) * | 1981-10-19 | 1983-06-13 | モレキュラー、ジェネティックス、インコーポレーテッド | 細菌性アドヒシンに対するモノクロ−ン抗体の製造方法 |
Family Cites Families (25)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU853813B (en) | 1913-03-31 | 1914-04-11 | George Reid Angus | Improvements in the manufacture of filter frames for beer and other liquids |
GB1472624A (en) * | 1974-09-02 | 1977-05-04 | Canadian Patents Dev | Enteric disease vaccine |
US4461838A (en) * | 1975-04-25 | 1984-07-24 | Bactex, Inc. | Gonococcal Pili processes for the preparation thereof and the use thereof for the detection of and prevention of infections caused by Neisseria gonorrhoeae |
IL49459A (en) * | 1975-04-25 | 1980-02-29 | Bactex Inc | Gonococcal pilin and other materials isolated from pili of neisseria gonorrhoeae compositions and vaccines containing them and method of testing the presence of antibodies to n. gonorrhoeae pili |
US4136167A (en) * | 1975-06-12 | 1979-01-23 | Internationale Octrooi Maatschappij "Octropa" B.V. | Process for reducing the incidence of neonatal diarrhoea in pigs |
US4237115A (en) * | 1977-11-23 | 1980-12-02 | Bactex, Inc. | Method of immunization against enterotoxogenic infection by Escherichia coli |
US4336336A (en) * | 1979-01-12 | 1982-06-22 | President And Fellows Of Harvard College | Fused gene and method of making and using same |
FR2466251B1 (fr) * | 1979-10-03 | 1983-03-18 | Agronomique Inst Nat Rech | Vaccin animal anticolibacillaire, obtention et application |
US4311797A (en) * | 1979-09-18 | 1982-01-19 | University Of Saskatchewan | Anucleated live E. coli vaccine |
SE8001748L (sv) * | 1980-03-05 | 1981-09-06 | Kaellenius Gunilla | Kompositioner for terapeutisk eller diagnostisk anvendning jemte forfarande for terapeutik |
US4454117A (en) * | 1980-09-15 | 1984-06-12 | Bactex, Inc. | Immunization against infection by Escherichia coli |
GB2094314A (en) * | 1981-02-05 | 1982-09-15 | Wellcome Found | Recombinant DNA |
WO1982003088A1 (en) * | 1981-03-09 | 1982-09-16 | Corp Cetus | Vaccines |
US4443431A (en) * | 1981-05-27 | 1984-04-17 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Neisseria gonorrhoeae vaccine |
US4443549A (en) * | 1981-10-19 | 1984-04-17 | Molecular Genetics, Inc. | Production of monoclonal antibodies against bacterial adhesins |
FR2516385A1 (fr) * | 1981-11-19 | 1983-05-20 | Merieux Inst | Vaccin anti-aphteux et anti-colibacillaire et son procede de preparation |
JPS58502181A (ja) * | 1982-01-18 | 1983-12-22 | サンド・アクチエンゲゼルシヤフト | 新規プラスミドと細菌株並びにその製造法 |
EP0089940A1 (en) * | 1982-03-23 | 1983-09-28 | BioCarp AB | Compositions for therapeutic or diagnostic use containing oligosaccharides |
US4597967A (en) * | 1982-07-27 | 1986-07-01 | The University Of Tennessee Research Corp. | Synthetic polypeptide fragments |
US4521334A (en) * | 1982-07-27 | 1985-06-04 | The University Of Tennesse Research Corporation | Synthetic polypeptide fragments |
ZA836349B (en) * | 1982-09-02 | 1985-04-24 | Unilever Plc | Production of antibodies |
US4652448A (en) * | 1982-10-07 | 1987-03-24 | Molecular Genetics, Inc. | Use of monoclonal antibodies against bacterial adhesins |
US4736017A (en) * | 1984-04-30 | 1988-04-05 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Chemically defined vaccine against urinary infections |
US4801690A (en) * | 1986-03-24 | 1989-01-31 | Bactex, Inc. | Novel lectins derived from bacterial pili |
US4786592A (en) * | 1986-06-18 | 1988-11-22 | Scripps Clinic And Research Foundation | Neisseria gonorrhoeae lectin useful as a vaccine and diagnostic marker and means for producing this lectin |
-
1984
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1986
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1995
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1996
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1998
- 1998-05-11 US US09/075,396 patent/US6291649B1/en not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS51151322A (en) * | 1975-06-12 | 1976-12-25 | Unilever Nv | Antigen composition |
JPS5899423A (ja) * | 1981-10-19 | 1983-06-13 | モレキュラー、ジェネティックス、インコーポレーテッド | 細菌性アドヒシンに対するモノクロ−ン抗体の製造方法 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP0179887A1 (en) | 1986-05-07 |
FI93310B (fi) | 1994-12-15 |
FI860015A (fi) | 1986-01-02 |
JPH09183791A (ja) | 1997-07-15 |
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CA1340847C (en) | 1999-12-14 |
KR950000688B1 (ko) | 1995-01-27 |
IE59826B1 (en) | 1994-04-06 |
DK609985A (da) | 1985-12-30 |
DE3587468T2 (de) | 1993-12-02 |
DK219084D0 (da) | 1984-05-02 |
EP0179887B1 (en) | 1993-07-21 |
RU1787165C (ru) | 1993-01-07 |
DK171258B1 (da) | 1996-08-12 |
WO1985005037A1 (en) | 1985-11-21 |
US4795803A (en) | 1989-01-03 |
US5804198A (en) | 1998-09-08 |
KR860700090A (ko) | 1986-03-31 |
DE3587468D1 (de) | 1993-08-26 |
US6291649B1 (en) | 2001-09-18 |
JP2974028B2 (ja) | 1999-11-08 |
AU593770B2 (en) | 1990-02-22 |
IE851102L (en) | 1985-11-02 |
FI860015A0 (fi) | 1986-01-02 |
DK609985D0 (da) | 1985-12-30 |
FI93310C (fi) | 1995-03-27 |
ATE91629T1 (de) | 1993-08-15 |
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