JPS62501355A

JPS62501355A - アドヒシン抗原類

Info

Publication number: JPS62501355A
Application number: JP60502188A
Authority: JP
Inventors: リンドベルク、フレデリツク　カール　ピータ; ルンド，ビヨルン　オロフ; バガ，ブリツト　モニカ; ノルグレン，マリ　エリザベート; ゲランソン，ミカエル; ウーリン，バーント　エリツク　アヌンド; ノルマーク，ジヤン　スタフアン; ラーク、ダビツド　リー
Original assignee: エスワイエヌ−テイイ−ケイ　エイビイ
Priority date: 1984-05-02
Filing date: 1985-05-02
Publication date: 1987-06-04
Anticipated expiration: 2014-11-08
Also published as: EP0179887A1; FI93310B; FI860015A; JPH09183791A; AU4299485A; CA1340847C; KR950000688B1; IE59826B1; DK609985A; DE3587468T2; DK219084D0; EP0179887B1; RU1787165C; DK171258B1; WO1985005037A1; US4795803A; US5804198A; KR860700090A; DE3587468D1; US6291649B1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】アドヒシン抗原類この発明は特に、例えば哺乳類の免疫感作に有用な抗原、その抗原に対して生成される抗体及びその抗原から製造されるワクチンに関する。

病原性細菌菌株もしくは種において、明確な表現型（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ　）を形成するいくつかの蛋白で構成され、それ故に多数の免疫原性を有する抗原決定基を有すると当然考えられる抗原類は広く知られている。しかし、かような抗原類及びそれらから製造されろワクチン類はいくつもの不利な点がある。特にそれらは、免疫感作を行う際に、抗体が、抗原が得られたひとつの特定細菌菌株を鉦明するこれらの免疫原性抗原決定基（ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃ　ｄｅｔｅｒｍｉｎａｎｔ）に対して形成されるが、同一種の他の細菌菌株に対しては形成されず、その結果免疫感作がこの特定菌株１こ対してだけ行われ他の同一の種の極めて関連の深い菌株に対しては行われないという点で著しく選択性であるという傾向がある。

この発明は、所望の免疫をもたらす免疫原性抗原決定基だけを実質的に汀し、さらに問題の病原性細菌の一つの特定菌株に限定されない抗原を提供することによって、これらの不利な点を克服するのを目的とするものである。

多くの病原性細菌の、細胞表面ｌこ接合する能力は多くの伝染病の発病に極めて重要であるということがますます明らかになってきた〔ビーチエイ（ＢｅａｃｈｅＹ　）　＋　ジャーナル□　オブ　イ′フエクシャス　ディジージズ（Ｊ、　Ｉｎｆｅｃｔ、Ｄｉｓ、　）、第１４３巻、１９８１年、第８２５〜３４５頁〕。この接合能力（ａｄｈｅｓｉｏｎ　ｃａｐａｃｉｔｙ　）はと皮細胞のごとき哺乳類のＭｉ織柵胞もしくは哺乳類の赤血球とに存在する受容体によっても１こらされるもので、その受容体はその配置構造（ｃｏｎｆｉｇｕｒａｔｉｏｎ　）にしたがってアドヒシン　ポリペプチド類と結合する。〔この明細菫において、 ″アドヒシン　ポリペブチＦ　（ａｄｈｅｓｉｎｐｏｌｙｐｅｐｔｉａｅ　）　 ”という用語は、接合の表現型を特に必要とするペプチド及びより一般的にいえばそれが存在しなければ接合が（いかなる理由があろうとも）起らないポリペプチドの両者ヲ示ス１こめのものである。〕各受容体は異なるアドヒシン構造体と結合すると考えられる。この受容体は、糖または、より一般的ｌこはノイラミン酸−（２−３）−ガラクトース、マンノース−α（１→２）−マンノースもしくはジガラクトシド〔この明細書において時々グロボシドと呼称さｎるグリコリピド類のグロボシリーズ（ｇｌｏｂｏｓｅｒｉｅｓ　）中に存在するａ　−Ｄ　− Ｇａｌｐ−（１−４）−β−Ｄ−Ｇａｌｐ基〕ｆζ存在するアミノ酸のようなペプチド受容体であってもよい。

多くの病原性細菌１こおいて、適切なアドヒシン　ポリペプチドは、いずれにしてもすべてが接合機能に関連するポリペプチド類（例えば細胞壁を通じてアドヒシンの速段を仲介するかもしくはアドヒシンを細胞壁の外表面などに固着させるポリペプチド類）の大きな塩基配列（５ｅｑｕｅｎｃｅ　）の一部だけを形成すると信じられ、そしてこの発明の目的に従って、特定のアドヒシン　ポリペプチドはその塩基配列の他のポリペプチド類中に見出され抗原として使用される。これは選択性のより小さな同定マーカーを溝底すると考えられ、その結果、抗体は抗原が得られる菌株に対して生成するのみならず、同じ細菌種の他の病原性菌株に対しても生成される。

従ってこの発明は、その免疫感作を行う主要構成要素として、アドヒシン　ポリペプチドもしくはその免疫原性的に活性す部分配列（５ｕｂｓｅｑｕｅｎｃｅ　）もしくは免疫学的に活性な形態に変換しうるその前駆体の、抗原決定基からなり、その抗原決定基に対する抗体が、呵乳類組織と接合する病原性アドヒシン形成細菌によ、って産生されたアドヒシン　ポリペプチドと反応するものである抗原に関する。この抗原は、アドヒシン　ポリペプチドの少なくとも五つのアミノ酸から全アミノ葭までのアミノ酸塩基配列を有していてもよい。

アドヒシン　ポリペプチドはアドヒシン形成細菌より簡単に得ることができる。

この群の細菌にはダラム陽性菌とグラム陰性菌の両者が含まれ、そしてこの明細書において最も興味深い細菌種は、１以との特定の７ドヒシン　ポリペプチド類が有利にえられる細菌種であり、すなわち泌尿器病原性もしくは腸内病原性菌株である、エシェリヒア・つり（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　Ｃ○ｌｉ）もしくは他の腸内細菌もしくは口内細菌、不イセリア・ゴノルホニ（Ｎｅ１ｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｈｏｅａｅ　）、不イセリア・メニンギデイテイス（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ　ｍｅｎｉｎｇｊｆｆｌｉｔｉｓ）、　不イセリア゛キャタルハリス（Ｎｅ：Ｌｓｓｅｒｉａ　ｃａｔａｒｒｈａｌｉｓ　）　、イニルシニア゛ニスピーピー（Ｙｅｒｓｉｎｉａ　ｓｐｐ、　）、スートモナス・ニルギノーサ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ａｅｒｕｇｉｎｏｓａ　）もしくは他のスートモナス・ニスピーピー（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｓｐｐ、　）＋　モラキセラ°ボビ７（Ｍｏｒａｘｅｌｌａ　ｂｏｖｉｓ　）もしくは他のモラキセラ・エスピービー　（Ｍｏｒａｘａｌｌａ　ｓｐｐ、　）、バクテロイデス・ノドスス（Ｂａｃｔｅｒｏｉｄｅｓ　ｎｏｄｏｓｕｓ　）、スタフィロコッカス・エスピービ（５ｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ　ｓｐｐ、　）、ストレプトコッカス・エスピーピー（５ｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ　、　Ｓｐｐ、　）、ヨｆコはボルデテラ゛６ルソ′ス（Ｂｏｒｄｅｔ、ｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ　）のごときボルデテラ・エスピービー（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｓｐｐ、　）　である。

一方アドヒシン　ポリペプチドは下記のようにして合成的１こ製造することができる。

この群のいくつかの病原性細菌については、細胞壁から突出する線毛（ｐｉｌｉ　（ｆｉｚｂｒｉａｅ　））と呼称される繊維状構造物があるいみて接合と関連しており、それ故１こま１こ線毛は容易に精製できるので、全線毛製剤（ｗｈｏｌｅ　ｐｉｌｉ　ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）がワクチン中の抗原として使用されてき１こ。例えばゴノコツカス線毛抗原（ｇｏｎｏｃｏｃｃｕｓ　ｐｉｌｉ　ａｎｔｉｇｅｎ）（米国陸軍で実地テストされた）がある。

線毛製剤を研究している従来の研究者達は、蛋白の特性づけと免疫感作の１こめに“純粋な”線毛蛋白を作製しようと永年研究してきた。そして彼等の努力は彼等の製剤がＳＤＳゲル中に一つのバンドを示すだけであるという点で成功し１こことは明らかである〔米国特許第４，４４８，４３１号（ブキャナン・ティ・エムら＜　Ｂｕｃｈａｎａｎ　Ｔ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ　）　）　；サリートーフイ・イー及びイー・シー・ゴツトリソシー＋−（５ａｌｉｅｔ　１．　Ｅ、　ａｎｄ　Ｅ、　Ｏ。

Ｇｏｔｔｌｉｓｃｈ　）、ジャーナル　オブ　エクスペリメンタル　メデイスン（Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅａ、　）第１４６巻、１９７７年、第１１６９頁；クレム・ビイ、アイ・オルスコツおよびエフ・オルスコツ、Ｉ（Ｋム°アエＰシ・、１２ツ°ｖ、ａ、；ｄ、、Ｆ・ｑゞザ７蛍、カイ（工。、。。、□。。

ａｎｄ　Ｉｍｍｕｎｉｔｙ）　Ｍ　３６巻、１９８２年、第４６２頁；スクールニック・シイ・ケイら（５ｃｈｏｏｌｎｉｋ　Ｇ、　Ｋ、　ｅｔ　ａｌ　）、ジャーナル　オブ　エクスメンタル　メデイスン（Ｊ、　Ｅｘｐ、　Ｍｅｄ、　）。

第１５９巻、１９８４年、第１３５１頁；スバンボルグ・イー・シー（Ｓｖａｎｂｏｒｇ　Ｅ、　Ｏ，）、プログ・アレルギイ（Ｐｒｏｇ　−、ｕｌｅｒｇｙ）。

第３８巻、１９８８年、第１８９頁　。得られ１こ線毛蛋白製剤は少なくとも三つの機能を示した。第一の機能は、おそらく疎水性結合プロセスを通じてポリマーを形成する能力であり、すなわちモノマーのサブユニットから線毛フィラメントを形成するために必須の性質である。第二の性質は抗体を発生させる能力であり、すなわちその蛋白をワクチンとして用いようとする場合に必須の性質である。第三の性質は細胞表面の受容体に接合する能力である。研究者らは、線毛自体の中はもとより、彼等の線毛蛋白製剤中にひとつの蛋白しか同定できなかつ１こので線毛は同一のモノマーの蛋白サブユニットの高分子状集合体でエムら（Ｂｕｃｈａｎａｎ　Ｔ、　Ｍ、　ｅｔ　ａｌ）　）　；　０　スバード・シエイ・ビイ（Ｒｏｔｈｂａｒｄ　Ｊ、　Ｂ、　）、　Ｐ　Ｎ　Ａ　Ｓ　第８２巻　１９８５年第９１５頁〕。しかし前記のように、単一の種から得た完全な全線毛は大きな抗原の多様性を有する。加うるにワクチンとして用いると、卓−抗原型の完全な全線毛は、シェアーされた（　５ｈａｒｅｄ　）線毛抗原よりもむしろ単−抗原型に対して主とじて抗体を産生ずる。従来の研究者らは、精製された線毛サブユニットを化学的に切断して指名された機能二重合機能、共通する抗原機能及び結合機能を葡するフラグメントとした。それぞれ個々の機能は精製され１こ線毛のサブユニットの別個のフラグメントで同定され１こ。かくして精製され１こ線毛蛋白製剤は単一の蛋白−ビリンモノマー（ｐｉｌｉｎ　ｍｏｎｏｍｅｒ　）を含有すると考えられてき１こ。このビリンモノマーは化学的に分解されたが結合機能と主要な抗原性−毘分化された純粋な線毛蛋白と同−物一を含有すると考えられてき１こ。

しかし、本願出願人らによって行われ１こ広範な研究は、仮定丘の純粋の線毛蛋白が実際に、別個の機能を葡するいくつかの蛋白フラクションで構成されていることを示している。事実、線毛フィラメントは細胞表面での接合の原因ではなくて、該フィラメントにおそらく結合している汚染物とみなされる少量成分が、細胞表面での接合の原因物質である。この独特の所見は線毛の構造形成およびそのジガラクトシド受容体への接合性が遺伝子的に除去されうるという事実だけを根拠にしているものである。認識しうる程度の線毛構造を残しているが接合できない他の突然変異微生物はさらにこの所見を確認している。この所見は、さら１こ、以前純粋であると考えられていた線毛蛋白が少なくとも二つのフラクション、すなわち線毛の実際の形成時に含有されている構成要素の一つ及びその接合性の原因のフラクションであるもう一つのフラクションを含有しているにちがいないということを意味する。両フラクションが抗原性を葡するという事実は、接合性の原因であるフラクションだけに対して抗体を生成する可能性を開いたのである。

線毛運搬細菌の場合も、もし存在するならば小さな菌株選択性を示す抗原を産生するのが汀利である。そしてかような抗原は、全線毛の構造の一部を形成し、持にその接合能力を仲介する１以七のザ素を確認し産生ずることによって得られる。この明８書において、かような成分は線毛アドヒシン　ポリペプチド（ｐｉｌｕｓ　ａｄｈｅｓｉｎ　ｐｏｌｙｐｅｐｔｉｄｅ　）と呼称される。立起事項によれば、線毛アドヒシン　ポリペプチドは、通常、病原性の線毛形成細菌から得られる線毛の全線毛アミノ酸配列の少数の成分からなり、ビリン（線毛繊維の大部分を形成する、精製線毛のサブユニット）とは異なるうこの目的に吾用な線毛形成細菌の例は、泌尿器病原性もしくは鳴門病原性菌株の、エシェリヒア・コリ、不イセリア・コ゛ノルホエ、不イセリア・メニンギデイテス、不イセリア・キャタルハリス、モラキセラ・ボビスまたは他のモラキセラ・エスピーピーおよびボルデテラ・ペルッシスである。

この発明の１こめの、この明日身に開示さｎｆコ研究は主として、腎孟炎を起こす尿路病原性菌株のエシェリヒア・コリに関するものである。しかし、線毛アドヒシンの遺伝情報を指定する種々のエシェリヒア・コリの遺伝子システムは非常に類似しており、その結果、接合を仲介するかような少数の線毛成分がすべてのタイプの線毛に存在し、すなわちエシェリヒア・コリ以外の細菌由来の綿毛にも存在することは理解さるべきである。受容体（もしくはその受容体の一部）とアドヒシン分子との連結構造による、病原性線毛形成細菌の結合にあずかる受容体は、泌尿器病原性エシェリヒア・コリについては、グリコリピドのグロボシド受容体ｆこ存在するα−Ｄ−Ｇａｌｐ　−（１−４）−β−Ｄ−Ｇａｌｐ部分であるジガラクトシドであると同定されｔこ。

そしてこのジガラクトシドは、前記細菌のウロエピセリウム（ｕｒｏｅｐｉｔｈｅｌｉｕｍ　）に連結していてもよく、またヒト赤血球にＰ血液型抗戦の一部として存在する。

この発明をも１こらず研究経過において発明者らは、少なくとも八つの異なるポリペプチドの遺伝情報を指定することが分かった８、５ｋｂ長の部位のＰａｐ　ｐｉｌｉ　（腎孟炎に関連する線毛）をインコード（ｅｎｃｏｄｅ）する、泌尿器病原性のエシェリヒア・コリ菌株の染色体部位を同定し１こ。よ１ここの発明の発明者らは、それが存在しないとエシェリヒア・コリが接合しないポリペプチドを完成し１こ。それ故にこれらのポリペプチド類は泌尿器病原性エシェリヒア・コリの接合表現型の原因であると考えられる。し１こがって、この発明は次のアミノ酸配列の抗原に関する。

？Ｊｅｔ−Ｌｙｓ　−Ｌｙｓ　−Ｉｌｅ　−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ　−Ｃｙｓ　−Ｌｅｕ　−Ｐｒｏ　−Ｖａｌ−ｈｘ＝ｔ　−Ｌｅｕ−Ｇ撃凵|Ａｌａ−Ｖａｌ　− Ｌｅｕ−Ｍｅｔ−Ｓ　ｅｒ　−Ｇｌｎ　−ＥＪ’ｉｓ　’−Ｖａｌ　−Ｈｌｓ　 −Ａｌａ　−Ｖａｌ　−Ａｓｐ　−Ａｓｎ　−Ｌｅｔｌ　−sｈｒ−Ｐｈｅ　− Ａｒｇ　−Ｇ：ｔｙ　−Ｌｙｓ−Ｌｅｕ−１１ｅ−工１ｅ　−ｐ　ｒｏ−Ａ、１　ａ−０’ＪＳ　−Ｔｈｒ−Ｖａｌ　−Ｓｅｒ　−Ａｓｎ　−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ− Ｖａ戟@〜Ａｓｐ　岬ｒｐ　− Ｇｌｎ−Ａｓｐ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ（ｌｅ　−Ｇｌｎ−’Ｉ−ト１ｒ−Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ｇ１　計Ａｓｎ−Ｇ１ｙ−ｉへ−ｃ；ｎ−Ｈ１ｓ−Ｇ撃普|Ｌｙｓ　− Ｇｌｕ−Ｐｈｅ−Ｔｈｒ−Ｖａｌ−Ａ、Ｓｎ−Ｍｅ　ｔ−ＡＴｇ　（！ｙＳ　− Ｐｒｏ　−’Ｉ￥ｒ　−Ａｓｎ−Ｌｅｕ　４１’ｌ’−Ｔｈ秩|Ｍｅｔ　− Ｌｙｓ−Ｖａｌ−Ｔｈｒ−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ’ ｒｙｒ−ｚへｘｎ−Ａｓｎ−Ａｌａ−１１ｅ　−Ｌｅｕ−Ｖ≠戟@− Ｇｌｎ−ＡＦ＋ｎ−Ｔｈｒ　−５ｅｒ−ＡＳｎ−Ｔｈｒ−８ｅｒ−８ｅｒ−ＡＳｐ　−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｌｅｌｌ　−Ｖａｌ　−Ｔｙｒ−Ｌ■普| Ｔｙｒ−Ａｓｎ−８ｅｒ−Ａｓｎ４１ａ　−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−１１ｅ−Ｇｌｙ− Ｔｈｒ−ｕ　ａ−Ｉｌｅ　−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｔｈ秩| ＰｒＯ−Ｐｈｅ　−Ｔｈｒ−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ　−Ｉ　ｌｅ　−Ｔｈｒ− Ｇｌ”）ｒ　−ＡＳｎ−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ａｓｐ　−ＬＹＳ@−Ｔｈｒ　−Ｉｌｅ　− ８ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｈｉｓ−Ａｌａ−Ｌｙｓ　−Ｌｅｕ　−ＧＩＹ−Ｔｙｒ−Ｌｙｓ−Ｇｌｙ−Ａｓｒｈう１ｅｔ−Ｇｌｎ−Ａｓｎ−Ｌｅｕ−P１ｅ− Ａｌａ　−Ｇｌｙ　−ｐ　ｒｏ　−Ｐｈｅ　−Ｓ　ｅｒ　−Ａｌａ　−Ｔｈｒ− Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ　−−Ａｌａ−Ｓｅｒ■’凾秩|８ｅｒもしくはその免疫原性的に活性な部分配列、まｔコはＭｅｔ−Ｉ　ｌｅ　−Ａｒｇ−Ｌｅｕ−５ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ　−Ｉ　１ｅ−８ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ− Ｌｅｕ　−Ｔｈｒ−８ｅｒ　−Ｖ≠戟@−、ｕａ　− Ｖａｌ　−Ｌｅｕ−Ａｌａ−ＡＳｐ　−＃ａｌ−Ｇｌｎ−１１ｅ　−Ａｓｎ−Ｉｌｅ−Ａｘｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ　−Ｖａｌ　−Ｔｙｒ　−１Pｅ　−Ｐｒｏ　− Ｐｒｏ　−ＣｙＳ　−Ｔｈｒ−Ｉｌｅ　−Ａｓｎ　−Ａｓｎ−ｅｌｙ　−Ｇｉｎ　−ｋｆｓｎ−Ｉｌｅ　−Ｖａｌ　−Ｖａｌ　−Ａｓｐ　−垂■■@４１Ｙ　− Ａｓｎ　− Ｉ　ｌｅ　−Ａｓｎ　−Ｐｒｏ　−Ｇｌｕ−ＬＴｉＳ　−Ｖａｌ　−Ａｓｐ　− Ａｓｎ−８ｅｒ−Ａｒｇ−Ｇｌ／−Ｇｌｕ−Ｖａｌ　−Ｔｈ秩|Ｌｙｓ　−Ｔｈｒ　− Ｉ　１ｅ−８ｅｒ−Ｉ　１ｅ−８ｅｒ−Ｏｙｓ　−Ｐｒｏ　−Ｔｙｒ　−ＬＹＳ　−８ｅｒ−Ｇｌｙ−８ｅｒ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐ　−Ｉ　ｌｅ@−Ｌｙｓ　−Ｖａｌ　− Ｔｈｒ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｔｈｒ−Ｍｅｔ　−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ　−Ｇｌｙ　（３１ｎ−Ａｓｎ−Ａｓｎ　−＃ａｌ　−Ｌｅｕ−Ａｌａ　−Ｔ■秩@− Ａ　Ｓｎ　−１１ｅ−Ｔｈｒ−Ｈｉｓ　−Ｐｈｅ　−Ｇｌｙ−１１ｅ　−Ａｌａ −Ｌｅｕ　−Ｔｙｒ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＬｙＳ−ｃａｙ　−lｅ　ｔ−５ｅｒ　 − ’ｒｈｒ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ｉｌｅ−Ｌｅｕ−ＧＩｙ−ＡＳｎ　−ＧＩＹ−８ｅｒ　−ＧＩＹ　−Ａｓｎ　−ＧＩｙ−Ｔｙｒ　−ＧＩＹ　−uａｌ　−Ｔｈｒ− Ａｌａ　−Ｇ１’）’　−Ｌｅｕ−Ａｓｐ　−Ｔｈｒ　−Ａｌａ−Ａｒｇ−８ｅ　ｒ−Ｔｈｒ−Ｐｈｅ　−Ｔｈｒ−ｐｈｅ　−Ｔｈｒ−ｓ　■秩|Ｖａｌ　− Ｐ　ｒｏ−Ｐｈｅ　−ＡＸｇ　−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−５ｅｒ−Ｇｌｙ−１１ｅ　− Ｌｅｕ　−ＡＥｎ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ　−Ｐｈｅ　ｎPｎ− Ｔｈｒ　−Ｔｈｒ　−Ａｌａ　−ｓ　ｅｒ−Ｍｅｔ−ｓｅｒ　−Ｍｅｔ　−１１ｅ　Ｊｐｙｒ−Ａｓｎもしくはその免疫原性的に活性な部分配列、ま１こはＭｅｔ−Ｌｙｓ　−Ｌｙｓ　−Ｔｒｐ　−Ｐｈｅ　−Ｐｒｏ　−Ａｌａ　−Ｐｈｅ　−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ　−Ｌｅｕ　−８ｅｒ　−Ｌｅｕ−８■秩|Ｇｌｙ− Ｇｌｙ−ＡＳｎ−Ａｓｐ−Ａｌａ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ｔｒｐ−Ｉ（ｉｓ −Ａｓｎ−Ｖａｌ−ｕｅｔ−ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ａｌａ−Ｐｈｅ　−Ａｓｎ　−Ａｓｐ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒ　−Ａｓｎ−Ａｌａ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ　 −Ｖａｌ　−Ｌｙｓ　−Ｖａｌ　−hｌｅ　− Ａｓｐ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ　−’Ｐｙｒ−Ｉｌｅ　−Ｐｒｏ　” ｒｒｐ　−Ａｓｎ−Ｔｈｒ　４１ｙ−８ｅｒ−Ａｌａ−Ｔｈ秩@−Ａｌａ　− Ｔｈｒ−Ｔｙｒ−Ｔ”）ｒｒ−８ｅｒ−Ｃｙｓ　−８ｅｒ−Ｇｌｙ−ｐｒｏ　− Ｇｌｕ　−Ｐｈｅ　−Ａｌａ−８ｅｒ　Ｇｌｙ−Ｖａｌ　−sＹｒ　− Ｐｈｅ　−Ｇｌｎ　−Ｇｌｕ−Ｔ’１ｒ−Ｌｅｕ−Ａｌｌｌａ　−’ｒｒｐ　ｑＭｅｔ−Ｖａｌ　−Ｖａｌ　−ＰｒＯ−Ｌ”）’８−Ｈｌ３|Ｖａｌ　Ｊｌｌｙｒ　’Ｉ’ｈｒ− Ａｓｎ　−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｐｈｅ　−ＡＳｎ　−Ｉ　ｌｅ　−Ｐｈｅ　−Ｌｅｕ　−Ａｓｐ　−Ｖａｌ　−Ｇｌｎ　−８Ｓｒ　−ＬｙＳ　iＩｌｙｒ−ｅｌｙ　− ’ｒｒｐ　−ｓｅｒ−Ｍｅｔ　−Ｇｌｕ−Ａｓｎ　−Ｇｌｕ　−Ａｓｎ　−Ａｓｐ　−ＬｙＳ　−Ａｓｐ　−Ｐｈｅ　−’ｒｙｒ　−Ｐｈｅ@−Ｐｈｅ　−Ｖａｌ　− Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ｔｙｒ−Ｇｌｕ−Ｔｒｐ　−Ａｓｐ　−’Ｉ’ｈｒ−Ｔｒｐ− Ｔｈｒ−Ａｓｎ−ＡＳｎ　−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｘｇ　−Ｉ@１ｅ　− ０ｙｓ−Ｐｈｅ−Ｔｙｒ−Ｐｒｏ　−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−ｈイｅｔ−Ｌｙｓ−Ｇｌｎ−Ｌｅｕ＝Ａｓｎ−Ａｓｎ−Ｌｙｓ−Ｐｈｅ　−ノ（ＪＳ氏| Ａｓｐ　−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ｐｈｅ　−Ａｒｇ　−Ｖａｌ　−Ｌｅｕ　−Ｌｅｕ −ｐｒｏ　−Ｖａｌ　−Ａｓｐ　−Ｌｅｕ　−Ｐｒｏ　−Ｌ凾刀@−ＧＩＭ　− ｆｆｉｓ　−Ｔｙｒ　−ＡＳｎ　−Ｐｈｅ−Ｐｒｏ　−Ｖａｌ　−Ａｒｇ　−Ｔｙｒ−Ｉ　１ｅ　−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｉ　１ｅ　−Ｇｌｎ−高刀@−ｉ　Ｓ　− Ｔｙｒ　− Ｔｙｒ−Ａｓｐ　−Ｌｅｕ　−Ｔｒｐ　−Ｇｌｎ　−Ａｓｐ　＝Ｈｉｓ　−１ｐｙｒ　−ＬｙＳ　−Ｍｅｔ　−Ｐｒｏ−’ＩＩ’／ｒ−Ａｓ吹@−Ｇｌｎ　（ｌｅ　− Ｌ：）’８−Ｇ１　ｎ　−Ｌｅｕ　−Ｐ　ｒＯ−Ａｌａ　−Ｔｈｒ　−Ａｓｎ　 −Ｔｈ　ｒ−Ｌｅｕ　−Ｍｅ　ｔ　−Ｔｊ３ｕ−Ｓｅ　ｒ　|Ｐｈｅ　−Ａｓｐ　−Ａｓ　ｎ　− Ｖａｌ　−ＧＩ　Ｍ　（３１：）’　−０ｙＳ　（３１ｎ　−Ｐ　ｒｏ　−８ｅ３　ｒ　−Ｔｈｒ　−ｅ：ｔｎ　−Ｖａｌ　−Ｌｅｕ　−Ａaｎ　−Ｉ　１　ｅ　−Ａｓｐ　−［１Ｂ　−Ｇｌｙ　−８ｅｒ−１１ｅ−Ｖａｌ、−１１ｅ４ｑｐ −Ａｒｇ−Ａｌａ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−Ａｓｎ−１１ｅ−Ａｌａ−８ｅｒ−Ｇｌｎ −Ｔｈｒ−Ｌｅｕ| ８ｅｒ　−Ｉ　ｌｅ　−Ｔｙ　ｒ　−ｃｙＳ　−Ａｓｐ　−Ｖａｌ　−ｐｒｏ　 −Ｖａｌ　−８ｅｒ　−Ｖａｌ　−Ｌ’７Ｂ　−Ｉ　ｌｅ　|８ｅｒ　−Ｌｅｕ　−Ｌｅｕ　−Ａｒｇ　−Ａｓ　ｎ　−Ｔｈｒ　−ｐ　ｒＯ−Ｐ　ｒＯ−Ｉ　ｌｅ　”ｒｙｒ　−ＡＳｎ　−Ａｓｎ　−Ａｓｎ、−Ｌ’）’５−Ｐｈｅ　−ｓ　ｅ　ｒ@−Ｖａｌ　−Ｇｌｙ　−Ｌｅｕ　− Ｇｌｙ−Ａｓｎ−Ｇｌｙ−’Ｉ’ｒｐ　−ＡＢｐ　−８ｅｒ−１１ｅ　−１１ｅ −８ｅｒ−Ｌｅｕ−Ａｓｐ　（）ｌｙ−Ｖａｌ　−Ｇｌｕ　|Ｇｌｎ−８ｅｒ− Ｇｌｕ　−Ｇｌｕ　−Ｉ　ｌｅ　−Ｌｅｕ　−Ａｒｇ　−Ｔｒｐ　’ｒｙｒ　− Ｔｈｒ　−Ａｌａ　−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ　−Ｌｙｓ　−Ｔｈｒ@−Ｖａｌ　−Ｌｙｓ　−Ｉ　ｌｅ　− Ｇｌｕ　−８ｅ　ｒ−Ａｒｉ：　−Ｌｅｕ　−’ｒｙｒ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−Ａｒｇ　−Ｌｙｓ　−Ｐｒｏ−Ｇｌｙ|Ｇｌｕ　− Ｌｅｕ−８ｅｒ−Ｇｌｙ−８ｅｒ−Ｍｅｔ−Ｔｈｒ−Δｆｅｔ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ −８ｅｒ−Ｐｈｅ−ＰｒＯもしくはその免疫原性的に活性な部分配列である。

これらのアミノ酸配列は実施例５に記載の公知の方法によって確認され１こ。

後者の二つの抗原がないと、すべての場合に（下記実施例３参照）グロボシド受容体への結合がなくなることを明確に示し、それ故にこれらの雨音はアドヒシン　ポリペプチド　プロパーであると考んられる。一方前者の抗原はある種の環境内だけで結合がなくなることを示しく下記実施例３参照）、それ故細胞壁の外表面に形成され１こアドヒシン　ポリペプチドを固定スるのに必要であると考えられる。

上記アミノ酸配列は、Ｎ−ターミナル・シグナル・ペプチド様配列を含む線毛アドヒシン　ポリペプチドの前駆体の形態であり、その配列はポリペプチドが細菌内膜を通じて外部へ輸送されるときに分割されることに留意すべきである。

この発明１こついて、この発明の抗原は、その抗原が免疫感作に用いられる際に多種類の抗体を形成しその結果、前記要約のような不利益かも１こらされるのを避ける１こめに、線毛の他の成分のごとき接合機能１こ関連する成分以外の成分を実質的に存していないのが好ましい。最も好ましいのは、抗原が実質おに純粋な形態であり、すなわち、いずれにしてもアドヒシン形成に関係しないが、好ましくない免疫学的な反応を起こすかもしれない他の抗原決定基を含まない抗原である０他の態様として、この発明は、その主要な免疫感作成分として、アドヒシン　ポリペプチドもしくはその免疫原性的に活性な部分配列もしくは兄敷学的に活性な形態に変換しうるその前駆体の、抗原決定基からなる前記抗原に対しもしくは実質的に前記抗原に対してのみ生成される抗体１こ関する。かような抗体は、前記定義の抗原で免疫にされうる動物を免疫にし、それ自体公知のしか１こで、動物から免疫グロブリンのごとき抗血清を漫ることによって得られるものであってもよい。その免疫感作は抗原の安定化された水溶液によって行うのが好ましい。すなわち、安定化剤はリン酸塩緩衝液もしくは補助剤（抗原性をさら１こ増大させる１こめに）であってもよく、適切な補助剤はフロイントの補助剤（Ｆｒｅｕｎｄ’ｓ　ａｄｊｕｖａｎｔ）もしくは水酸化アルＦ。

ニウムである。免疫感作するのに豚の免疫グロブリンも抗体として用いられるが、好ましい動物はマウス、ラビット、山羊および羊である。動物を出血させ抗血清を分離するのは公知の方法によって行われる。

この発明による抗体も実質的に純粋な形態が好ましく、この形態の抗体は下記のように診断用に有用になる。

一方、その抗体も、抗体類の公知の製造法であるハイブリドーマ技術ｆこよって製造することができる。例えば免疫感され１こ動物としてマウスを使用するハイブリドーマ技術ｌこおいで、マウスは問題の抗原で免疫にされ、免疫にされ１こマウスから得１こ牌臓細胞が骨髄腫細胞と融合され次いで融合ハイブリドーマ細胞がクローンされ、抗体産生細胞が適切な増殖培地中で培養され、抗体がその培養物から回収される。ハイブリドーマ技術で得られ１こ抗体は大きな特異性を奮し、それ故に例えば一層優れ１こ精度の診断ができるという利点をｎする。またさらに進んだ段階においては、組換えＤＮＡ技術を用い、その抗体をインコードする単一もしくは複数の遺伝子がハイブリドーマ細胞クローンから適切なベクターに転移され（ｔｒａｎｓｆｅｒ　）、ソノハイブリッドベクターが適切な細菌の宿主に形質転換され、該宿主は適切な培体で培養され、次いで得られ１こ抗体が培養物から回収される。この方法では抗体を改善された収率で得られる。

ああ−−その宿主は、エシェリヒア・コリもしくはバチルス・ズブチリスのごとき組換えＤＮＡ技術の分野で通常用いられるものであってもよい。

この発明の非常に重要な態様は哺乳類の組織ｆこ接合する病原性ｉ菌が原因で起る疾病１ζ対して、その哺乳類を免疫にするｊコめのワクチンに関するものである。そしてそのワクチンは、任意に適切な担体１こ結合されたと記抗原の免疫原性的に冑効量と、免疫学的に受容な賦形剤とを含有する。この賦形剤は、稀釈剤、分散剤、補助剤などのごときワクチンの製造に通常用いられるいずれの賦形剤であってもよい。

い（つかのケースでは、抗原がそれ自体で重合する傾向がある場合、担体を用いることは必要でないが、このような場合以外には、抗原を担体に共有結合的ｌζ 結合させるのが育利である。

この担体は通常高分子物の担体であり、特にワクチンがヒトを免疫化するのに用いられるときには、それは生理的に受容であることが重要である。抗原の固定化用の非毒性および／ま１こは非アレルゲン性担体は公知である。例えばアーノン（Ａｒｎｏｎ　）。

ジャーナル　オブ　インムノロジカル　メソッズ（Ｊ。

Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ　Ｍｅｔｈｏｄｓ　）、第６１巻、１９８８年、第２６１〜２７３頁である。この目的のため現在有用であると注目されているこのタイプの担体は例えばポリーＬ−リシンおよびポリ−Ｄ、Ｌ−アラニンである。

天然の担体も非毒性で非アレルゲン性であれば用いてもよい。

この発明はさらに、かようなワクチンの製造法に関し、すなわちそのワクチン中の、免疫原性的に有効な鰍の前記抗原が、任意に適切な担体に結合され、ワクチン製剤（こ所望濃度の抗原を付与する量の免疫学的に受容な賦形剤と合せられ、１コとえば混合されるワクチンの製造法に関する。

この発明の方法の特別な態様において、少なくとも五つのアミノ酸からなる免疫原性的に活性なアミノ酸配列はと記の担体の一つのごとき生理的に受容な担体に共有結合的に結合されている。融合ポリペプチド製造の技術は、例えばキャサダバンら（Ｏａｓａｄａｂａｎ　ｅｔ　ａｌ）、イソッズ　イン　エンザイモロジイ（Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｂｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　Ｌ第１００巻、１９８８年、第２９３〜３０８頁によって公知である。

この発明の方法の他の態様では、立起抗原をインコードするヌクレオチド配列が生理的に受容な担体のポリペプチドをインコードするヌクレオチド配列に融合され、その融合されたＤＮＡ配列が適切なベクターに挿入され、得られたハイブリッドベクターが適切な細菌宿主（Ｃ形質転換され、得られた宿主が適当な培地中で培養され、融合ポリペプチドがその培養物から回収され、任意に精製される。

さらに他の態様では、この発明は、前記抗原をインコードするヌクレオチド配列から少なくともなるＤＮＡフラグメントに関する。このＤＮＡフラグメントは実質的に他の抗原をインコードしないものが好ましい。そのヌクレオチド配列は、実質的に全アドヒシン　ポリペプチドをインコードするものか、免疫原性的に活性な形態に変換しうるアドヒシン　ポリペプチドの前駆体をインコードするものか、またはアドヒシン　ポリペプチドの免疫原性的に活性な部分配列をインコードするものであってもよい。免疫原性的活性を有するアミノ酸配列の情報を指定する１こめには、そのＤＮＡフラグメントは少なくとも５コドン（トリブレット）の長さを胃していなければならない。このＤＮＡは、病原性のアドヒシン形成細菌類の、染色体もしくはプラスミドに存在する遺伝情報の一部であってもよく、これら細菌の代表例は、泌尿器病原性菌株もしくは腸内病原性菌株である、エシェリヒア・コリもしくは他の腸内細菌もしくは口内細菌、ネイセリア・ゴノルホエ、ネイセリア・メニンギデイテイス、ネイセリア・キャタルハリス、イエルシニア・エスピービー、スートモナス・エルギノーザもしくは他のスートモナス・エスピービー、モラキセラ・ボビスもしくは他のモラキセラ・エスピービ＋、バクテロイデス・ノドスス、スタフィロコッカス・エスピービー、ストレプトコッカス・エスピービー、ま１こはボルデテラ・ベルッシスのごときボルデテラ・エスピービーが挙げられる。

かくしてそのＤ　Ｎ　Ａフラグメントは、泌尿器病原性もしくは腸内病原性菌株である、エシェリヒア・コリ、不イセリア・ゴノルホエ、不イセリア・、メニンギディティス、不イセリア・キャタルハリス、モラキセラ・ボビスもしくは他のモラキセラ・エスピービー、まＴこはボルデテラ・ペルッシスのごとき、病原性線毛形成細菌白米であってもよい線毛アドヒシン　ポリペプチドの遺伝情報を指定するＤＮＡもしくはそのＤＮＡ配列の一部であってもよい。

例示の１こめに、ＤＮＡフラグメントはエシェリヒア・コリの病Ｎ性菌株から得られる１以七のアドヒシン　ポリペブチＩ’（７）遺伝情報を指定するＤＮＡ配列を全部もしくは部分的に含有するものであってもよい。し１こがってこの発明は、主要構成要素として下記ＤＮＡ配列で構成されているＤＮＡフラグメントにＡＣＴＧＡＴＴＡＴＴＣＯＴＧＯＯＴＧＴＡＣＴＧＴＡＡＧＯＡＡ（：！ＡＯＡＡ、Ｃ！’ＩＧＴＴＧＡＣＴαＩＡＧ−ＧＡＴＧＴＡＧＡＧＡＴＴＣＡＧＡＣＣＯＴＧＡＧＴＯＡＡＡＡＴＧＧんＢＴＣ！ＡＣＧＡＡＡＡＡＧＡ胛−ＴＴＡＯＴＧＴＧＡＡＴＡＴＧＯＧＧＴＧＴＣＣｏＴＡＴＡＡＴＯＴＧＧＧＡＡＯＡＡＴＧ晶替ＴＴ’ＡＣ！　−Ｇ、１］請ＣＧＧＣＡＡ　ＣＡ！Ａ請ＯＡＯ’ｒＴＡＴ、ＬＡＯＡＡＴＧＯ’Ｔ’ＡＴＴＴＴＡＧＴＴＣＡＧＡＡＴＡＯＡ−ＴＯＡ＝ｕＣＡＯ−Ａ、ＴＣＴＴＯＴＧＡＴ（Ｔ’、ＧＧＴＴＡＯＴ　ＣＧＴＴＴＡＴＧ！ＴＴＴＡＴＡＡＯＡＧＴＡＡＴＧ−ＣＡＧＧＡＡ、Ａ、’ＬＡＴＴＧＧＧＡＣＴＧＣＧＡＴＡＡＣ！ＴＴＴＡ（ＥＧＧ、へＣＴＣＣＡＴＴＴＡＣＧＣＣＣＧＧ−ＡＡＡ−’Ｌ４ＴＣＡＣＡＧＧＴＡＡＴＡＡＴＧＯＡＧ、’１ＴＡＡ、ＡＡ、ＣＴ −Ａ−ＴＡＴＣＡＣＴＴＯＡＴＣ’＝ＯＣＡ　ＡＡ−ＣＴＴＧＧＡＴＡＴＱＡＡ（Ｘ’−ＧＡＡＴＡＴ（ＤＡ、ＧＡＡＴＴＴＧＡＴＡＧＣＣＧＧＴＣＣＴ’ｌ’ ＴＣＴ（、！Ｔ−（遭：しへ−４，０Ａ（Ｘ！ＡＡＣＧＯＴ（ンＧＴＴ（ン０ＡＴＯＡＴＡＴＴＯＧＴＡＡ　、ま１こはＡＴＧＡＴＴＣＧＴＴＴＡＴＣＡＴＴＡＴＴＴＡＴＡＴＣＧＴＴＣ＝ＣＴＴＣＴＧＡＣＡ、ＴＣ（ＥＧＴＣＧＣＴ−ＧＴＡＣＴＧＧＣ！ＴＧＡＴＧ’［’ＧＣＡＧＡ、ＴＴＡＡＣＡＴＣＡ（Ｋ；ＧＧＧＡＡ’ＪＸ３ＴＴＴＡＴＡＴＣＣＯＣ−ＡＣＧＧＧＡＡＡ’Ｉ’ＡＯＴＡＴ　ＧＧＧＡＧＧＡＧＧＴＣＡＧＡＡＴＡＡＴＧＴＡ、ＯＴ　０ＧＯＡＡＯＡＡＡＴ− ＡＴＡＡＣ’１１’Ｃ！　ＡＴＴＴＴＧＧ　ＴＡＴＡＧｏＧＣ！　ＴＧＴＡＴＣＡ（Ｅ（’ＪＧＡＡ、ＡＡＧＧＡＡＴＧＴＧ！ＡＡＣＡＯ−０ＴＴＡＴＡＴＴＡＧＧＴＡＡ’ＴＧＧＴＴ　ＣＡ（ＥＧＡ、ＡＡＴ　ＧＧＴＴｋＣＧＧＡＧＴＧＡＯＡ（ＸＩ！ＡＧＧＴ−ＴＧＡ（３０ＡＴＧＡＴＴＴＡＴＡＡＯＴＧＡ　、ま１こはＡＴＧＡＡＡＡＡＡＴＩＧＧ’Ｉ”ＴＯＯＣＴ（ＥＣＴＴＴＴＴＴＡＴＴＴＴＴＡＴ　Ｃ００ＴＧＴＣＡ（Ｅ（’ａＸ裡−ＡＡＴＧＡＴ　ＧＯＴＴＴＡＧＣＴＧＧＡＴＧＧＯＡＣ！ＡＡＴＧＴＯＡＴＧＴＴＴＴＡＴ（Ｋ！ＴＴＴＴＡＡＯ −ＧＡＣ！ＴＡＴＴＴＡＡＣＴＡＯＡ４ＡＴＧＣＴ（ＦＧ’ＰＡＡＴＧＴＴＡＡＧＧＴＴＡＴＴＧＡＣＣＡＡＣＣＴ−ＣＡＧＯＴＡＴＡＴＡＴＡＣ！　ＣＣＴ（ＦＧＡＡ、ＴＡＣＡＧＧＯＴＣＴＧＣＴＡＣＡＧＯＡＡＣＴＴＡＴＴＡＴ−ＧＡＡＡＡＴ（子ＡＣ尤υ、ＧＡＴＴＴＴＴＡＣＴＴＣＴＴＴＧＴＴＡＡＴＧ（迂ＴＡＴＧ尤ムＴαＩＡＴ−ＡＣＡＴＧＧＡＣＡＡＡＴＡＡ、ＴＧＧＴＧＣＯ（：！ＧＴＡＴＡＴＧＴＴＴ　ＣＴＡＴＣＩＣＴＧＧＡ請ＡＴＡＴＧ−ＣＣＣ（ＥＧＧＧＡＧＣＴＡＴＯＴＴＧＧＴＴ　ＣＴＡＴＧＡＣＴＡＧＴＧＴＴＯＴＧＡＧＴＴＴＣＣＣＣＴＧＡまたは、表現され１こ場合に、を記の全ＤＮＡ配列のいずれかひとつによってインコードされるアドヒシン　ポリペプチドの免疫原性的に活性な部分配列を構成する、そのいずれかの部分配列。

それぞれのＤＮＡフラグメントの配列は、実施例４に記載の公知の方法で樹立されｔコ。

別の重要な態様において、この発明は、少なくとも後記定義の抗原をインコードするヌクレオチドタイプ配列からなり、また実質的に他の抗原をインコードしないＤＮＡフラグメントが挿入されたハイブリッドベクターを収容する細菌宿主が培養され、前記ＤＮＡフラグメントから表現されｔ４：産物を回収し次いで任意に精製されることからなるその主要な免疫感作成分としてアドヒシン　ポリペプチドの抗原決定基を有する抗原の製造法に関する。

アドヒシン　ポリペプチドもしくはその免疫原性的に活性な部分配列もしくは遺伝学的に活性な形態に変換しうるその前駆体をインコードするＤＮＡフラグメントは、例えば、該フラグメントが実際に存在する細菌ＤＮＡ、から該フラグメントを例えば次のような組換えＤＮＡ技術で切りとることによって得ることができる。

一つのアドヒシンーポリペプチド産生細菌から染色体ＤＮＡが制限酵素を用いて切りとられ、個々のＤＮＡフラグメントが適切なベクターとリリゲート（ｒｅｌｉｇａｔｅ　）　され、次いでそのベクターが適切な細菌宿主に形質転換される。次いでベクターを受けとつに細菌のクローンは、特定の受容体をイアするいずれかの固体表面に結合する性能によって評価されるアドヒシン機能について、例えば標準法の赤血球との凝集法によって試験される。次いでアドヒシン機能を保持してきたクローンから＃：ＤＮ　Ａフラグメントを適切なベクターにサブクローンし、次いでトランスポゾン変異法（ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ　）およびる性質を保持する最小のＤＮＡフラグメントを有するサブクローンを作製できる。これによって、細胞表面アドヒシン機能を表現するＤＮＡオペロンの、必要な最小のピースが得られる。

さらに、組換えＤＮＡ技術を利用するトランスポゾン変異法もしくは欠失法による操作が、アドヒシン　ポリペプチドを表現できる性能を保時または保持しない、オペロン中の個々の遺伝子を同定するのに用いられる。次いでアドヒシン　ポリペプチドを表現する単一もしくは複数の遺伝子が適切なベクターに挿入され、また任意に適切なブロモ−クーを挿入して単一もしくは複数の７ドヒシン　ポリペプチドの表現を増大させる。次いでそのベクターは細菌、例えばエシェリヒア・コリもしくはバチルス・ズブチリスのごときグラム陰性細菌のごとき適切な宿主生物に形質転換される。この最後の段階での他の方策はアドヒシン　ポリペプチド産生に必須でない遺伝子を選択的にブロックするか脱離する方法であり、その遺伝子はエシェリヒア・コリの場合、ＤＮＡオペロンの上記の必要な最小ピース中のｐａｐ　Ａとｐａｐ　Ｏである。

主要な（ｍａｊｏｒ　）線毛構成成分と混合して小さな（ｍ１ｎｏｒ　）線毛アドヒシン　ポリペプチドが存在している（通常同じオペロンから産生される）製剤からその小さな線毛アドヒシン　ポリペプチドを古典的な化学的方法によってＭ１！Ａすることは、本来、免疫原性である前記構成成分が非常に大量存在している事実によって、不可能ではないまでも極めて難かしいので、小さな線毛アドヒシン　ポリペプチド製造の組換えＤＮＡ技術は、好ましくない抗原をインコードするかもしくは他のしかたで表現される遺伝子を選択的に除去し、所望の小さなアドヒシンポリペプチドをインコードする単一もしくは複数の遺伝子を選択することができて、この発明用として、免疫原性的に有効かつ十分純粋な抗原を得ることが決定的に重要なことである。単一もしくは複数のこの遺伝子を適切なベクターに挿入し、任意に、この明細書に記載のようにして他の遺伝子と融合させることによって、公知の線毛製剤中には、免疫原性的に実質的に無効で従来なら無視される小比率でしか存在していなかつ１こ小さな線毛アドヒシン　ポリペプチドを大量Ｉこ得ることができる。

特定の態様ｆこよれば、一つもしくはいくつかの所望の７ドヒシン　ポリペプチドを同じベクターに挿入することができる。

その結果、微生物によって産生された産物は、問題の橋季母抗原の抗原決定基を再発ししｔコがってその免疫原性もしくは受容体結合効率を増大させる産物である。

これらの操作はすべて組換えＤＮＡ技術の分野で公知の方法にしたがって行われ、下記の実施例１〜８でより詳細に説明される。この方法に用いられるベクターは、ｐＥＲ８２２誘導体類、ｌａｃ　Ｕ　Ｖ　５プロモーターベクター類、Ｔａｃプロモーターベクター類のごとき広範囲宿主のベクター類、シャトルベクター類、ランアウェイプラスミド誘導体類などのごとき、この目的に通常用いられるいずれのベクターでもよい。細菌宿主が培養される増殖培地は、Ｌ−ブロスもしくはＭ９グリセロール培地のごとき醗酵法に通常用いられるいずれの増殖培地であってもよい。細菌宿主は、エシェリヒア・コリもしくはバチルス・ズブチリスのごとき醗酵中の挙動が知られている宿主の中から簡便に選択される。

と記のようｆこ、多くの場合、宿主細菌１こよって形成されることのある有毒物質、例えばリポポリサッカライドが抗体と同時に投与されるので、精製は、不適切な抗体類、すなわち問題の抗原に対する免疫感作に関与せずしかもそれが形成される動物の一部に好ましくない反応を起こしさえする抗体類の形成が避けられるから葡利である。しかし問題があることが分かつてき１こ。精製を容易にするために、融合されたポリペプチドの使用を伴う方法が考案された。この方法では、アドヒシン　ポリペプチドもしくはその免疫原性的に活性な部分配列もしくは免疫学的に活性な形態に変換しうるその前駆体からなる第一ポリペプチドをインコードするＤＮＡフラグメントが第二ポリペプチドをインコードするＤＮＡ配列に融合され、その融合されたＤＮＡ配列が適切な細菌宿主に挿入され、その宿主が適切な培地テ培養され、その融合ポリペプチドは培養物から回収され、第二ポリペプチドに対して生成する抗体の検査法　（ａｓｓａｙ　）を利用して精製され、そして第二ポリペプチドは任意に適切なプロテアーゼ１こよって切断され、次いでその二つのポリペプチドは分離される。

この目的に有利に採用しうるＤＮＡ配列の例はβ−ガラクト’、ｉ　’；ｆ　− セｆｔインコードする１ａｃＺ遺伝子である。というのはこの遺伝子産物したがって７ドヒシン　ポリペプチドもしくはその部分配列もしくはその前駆体の表現が、例えばラクトース・インディケータ−・プレートとで細菌宿主を培養し、陽性（Ｌａｃ＋）コロニイを選択することによって容易に検出されるからである。

精製後、第二ポリペプチドはトリプシンまたはキモトリプシンのごときプロテアーゼによって切断できる。第二ポリペプチドの遺伝情報を指定する遺伝子が融合された第一ポリペプチドをインコードするＤＮＡフラグメントからだけ得られる所望のペプチドフラグメントは、例えば缶体外で試験される、それらの免疫原性活性に基づいて選択される。この二つのポリペプチドの分離は、イオン交換クロマトグラフィ、ＨＰＬＯ逆相クロマトグラフィ、又はインムノアフィニティ　クロマトグラフィ（ｉｍｍｕｎｏａｆｆｉｎｉｔｙ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｂｙ　）もしくは受容体アフイニテイ　クロマトグラフィのごときアフィニティ　クロマトグラフィのような標準方法で行うことができる。インムノアフイニテイ　クロマトグラフィの場合、この発明の抗原（ｉ　−、ｔｅ’リヘフチトからなる）に対して形成される抗体または第二ポリペプチドに対して生成する抗体のいずれかをカラムに固定化された抗体として用いることができる。受容体アフィニティ　クロマトグラフィにおいては、産生されたアドヒシンの受容体が同様に利用できる。第二ポリペプチドをインコードするＤＮＡ配列との融合に用いられるＤＮＡフラグメントは、上記のいずれのＤＮＡフラグメントであってもよい。

この発明の抗体の他の製造法では、線毛アドヒシン　ポリペプチドのごときアドヒシン　ポリペプチドもしくはその免疫原性的に活性な部分配列は、液相ペプチド合成法とか同相ペプチド合成法によるといった公知方法〔例えば、スチュノートおよびヤング（Ｓｔｅｗａｒｔ　ａｎｄ　Ｙｏｕｎｇ　）　、同相ペプチド合成法（ＳｏｌｉｄＰｈａｓｅ　Ｐｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　）、　：７リーマン　アンドカンバニイ（Ｆｒｅｅｍａｎ　＆　Ｃｏ、）＋サンフランジスコツ米国。

１９６９年〕によって製造することができる。同相ペプチド合成法が好ましい方法である。固相ペプチド合成法では、アミノ酸配列がイニシャルアミノ酸を担体にカップリングさせ次いで引続き他のアミノ酸をこの場合少なくとも五つのアミノ酸の長さまで、ペプチド結合によってその配列に付加することによって組立てられる。アドヒシン　ポリペプチドもしくはその部分配列を固相ペプチド合成法で製造する場合、その配列中のイニシャルアミノ酸がカップルされる担体と同様にワクチン中の抗原用の担体として有用な生理的に受容なポリマーを使用するのが有利であろう。ワクチンとしての用途用の合成ペプチドの製造ハ、シニック（５ｈｉｎｎｉｃｋ　）　、“シンセティック　ペプチドズ、インムノゲンズ　アンド　ヴアクノンズ（Ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｐｅｐｔｉａｅｓ。

ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｓ　ａｎｄ　ｖａｃｃｉｎｓ”）　、　Ａｎｎ、　Ｒｅｖ、　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、　、第３７巻、１９８８年、第４２５〜４４６頁に記載され１このと特に同様にして行うことができる。

この発明によれば、アドヒシン　ポリペプチドもしくはその免疫原性的に活性な部分配列もしくは免疫学的に活性な形態に変換しうろその前駆体からなる抗原に対して生成するかもしくは実質的に生成する抗体は、任意に適切な担体に結合され１こ前記抗体の免疫学的に有効な量と気炎学的に受容な賦形剤とからなる、哺乳類の組織に接合する病原性細菌によって起こる疾病に対する哺乳類の受動免疫用組成物に用いろことができろ。この組成物は、免疫原性的に有効な址の抗体と免疫学的に受容な賦形体とを、例えば副成分を混合することによって合することからなる方法によって製造することができる。

抗体が任意に共有結合的に結合される担体はワクチンについての記載に関連してｔ記した担体のいずれでもよい。抗体が混合される賦形剤は、組成物中の抗体の濃度を所望の濃度にする量で添加されろ稀釈剤、分散剤、補助剤などのごときこの目的のために通常用いられるいずれの賦形剤であってもよい。

前記抗原よりも免疫感作の効率が低いけれども、その抗体は免疫感作の１こめに用いることができる。しかしその主要な用途は哺乳類例えばヒトの組織に接合する病原性アドヒシン形成柵菌ｆこよって起こる疾病の診断用診断剤としての用途であり、その細菌の例は、泌尿器病原性もしくは腸内病原性菌株である、エンエリヒア・コリもしくは他の腸内細菌もしくは口内細菌、不イセリア・コ゛ノルホエ、イ、イセリア・メニンギディティス、不イセリア・キャタルハリス、イエルシニア　エスピーピー、スートモナス・エルギノーザもしくは他のスートモナス・エスピーピー、モラキセラ・ボビスもしくは他のモラキセラ・ニスＬ’−ヒ− 、バタテロイデス・ノドスス、スタフィロコッカス・エスピーピー、ストレプトコッカス・エスピーピー、またはボルデテラ・ペルソシスのごときボルデテラ・エスピーピーである。それ故にま１ここの発明は、線毛アドヒシン　ポリペプチドの免疫原性のある抗原決定基に対して生成する抗体またはアドヒシン　ポリペプチドもしくはその部分配列もしくはその前駆体ではない、抗原の免疫原性抗原決定基１こ対して生成する抗体のごとき前記抗体からなる診断剤に関する。この抗原は例えばアドヒシン遺伝子クラスターによってインコードされる他のポリペプチドでもよい（その遺伝子を仔する細菌の接合性能を仲介するのに若干必要な遺伝子配列）。例えば泌尿器病原性エシェリヒア・コリ白米の線毛ポリペプチド、例えば１８ｋｄ、８１ｋｄおよび２８．５　ｋｄそれぞれのポリペプチドをインコードする、遺伝子ｐａｐＢ、　ｐａｐＤもしくはｐａｐ　Ｄ　（第１図および／ま１こは第２図に示す）の遺伝子産物の場合の、例えば線毛の形成に必要な他の一つのポリペプチドである。ｐａｐ　ＯＡびｐａｐＤ遺伝子の産物は、ビリン（ｐｉｌｉｎ　）の分泌と爪台工程（線毛の形成のｆこめの）中に、ビリン・サブユニットの組立ておよび／または固定（遺伝子ｐａｐ　Ａ　ｌζよってインコードされている）を仲介すると現在信じられる。

その抗体は、診断剤として用いられる際、例えば診断試験において、検出すべき抗原を介する細菌が着色凝塊として見えるように着色剤で９２を付けてもよい。

エンザイムーリンクトインムノソーベント検査法（ｅｎｚｙｚａ−１ｉｎｋｅｄ　ｉＩｉｌｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ）（ＥＴ、　Ｉ　Ｓ　Ａ　；原料および方法の須参照）または放射能標識された抗体を甲いるレイディオインムノアセイ〔ｒａｄｉｏｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ　（ＲＩ　Ａ　）　：）のような他の漂準方法も用いろことができる。

一方、その診断剤は、存在するか存在しないかが診断試論によって証明されるべき細菌中のＤＮＡ配列と少なくとも約６０％が同じの、安定な、標識のつけられ丁：　Ｄ　Ｎ　Ａ配列で構成されていてもよい。この明硅１こおいて、“安定な ″という用語は、そのヌクレオチド配列が比較的一定であること、すなわち一つの塩基対が他の塩基対と置きかえられる塩基対置換は当然まれであることを示すのを目的とするものである。多くの遺伝子］ζおいて、かような塩基対置換は、遺伝子から表現される遺伝子産物のアミノ酸組成には必らずしも影響を与えず、比較的普通のことである。しかしこの塩基対置換は、プローブ（ｐｒｏｂｅ　）のＤＮＡ　（部分）配列は、同じ配列、または細菌ＤＮＡ中のよく似た配列を認識するので、プローブからのＤＮＡと試験されるべき試料として用いられる細菌ＤＮＡとの相同性がかなり高いことに依存する前記妙所方法に影響を与える。その診断法においてプローブＤＮＡには標識が付され、そのＤＮＡは変性されプローブと細菌ＤＮＡの両者のストランドを分離する；それらのＤＮＡを混合後、ストランドは二重らせん構造を再形成する１こめに残されるが、相同の場合（ＤＮＡ配列の認識）、プローブＤＮＡのいくつかは細菌ＤＮＡ内に導入されたであろう。

この技術はハイブリッド形成法として知られ、例えば、サザーン（５ｏｕｔｈｅｒｎ　）　ｌメソッズ　イン　エンザイモロジイ（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　Ｌ第６８巻、１９８０年、第１５１〜１７６頁に記載されている。診断剤として十分な特異性を有するため、プローブとして用いられるＤＮＡは特定のヌクレオチド配列で構成されるべきであり、それ故少なくとも１２のヌクレオチドの長さを仔するべきである。そのプローブＤＮＡは、本来公知のしかたでＨもしくは　Ｃのごとき放射線同位元素で標識されるのが有利である。

プローブＤＮＡとして用いられるＤＮＡ配列は、アドヒシン遺伝子クラスターの一部であるがアドヒシン　ポリペプチド自体をインコードしない遺伝子からなる配列かまたはその妙所用に有効な部分配列であってもよい。この遺伝子は、例えば線毛アドヒシン　ポリペプチドでない、病原性線毛形成細菌によって産生される線毛ポリペプチドの遺伝情報を指定する遺伝子か、またはその診断用にり効な部分配列であってもよい。この明細書ｌζ例示するシステムにおいて、その線毛ポリペプチドをインコードするＤＮＡ配列もしくはその部分配列は泌尿器病原性菌株のエシェリヒア・コリ白米のものである。このシステムで特に有利な診断剤は、を記の遺伝子安定性からみて遺伝子ｐａｐ　Ｂ　。

ｐａｐ　ＯおよびｐａｐＤであるか、ま１こはこれら遺伝子のいずれかの診断用として葡効な部分配列であることが見出された。

上記のように、この発明による抗原はワクチンの成分として用いろことができる。したがってこの発明は、任意に適切な担体に結合された前記抗原の免役原性的に冑効な量を含膏するワクチン、または任意に適切な担体に結合された前記抗体および免疫学的に受容な賦形剤を含葡する受動免疫用組成物を投与することからなる、哺乳類例えばヒトの組織に接合する病原性細菌によって起こる疾病に対するヒトのごとき哺乳類の免疫感作方法を包含するものである。その投与は、抗原もしくは抗体を等張性食塩水のごとき適切な注射用賦形剤と混合して注射するようなそれ自体公知の方法で行うことができる。

これらの病原性ｍ菌はアドヒシン類もしくはアドヒシン様のポリペプチド類を形成するいずれの細菌であってもよい。それらの例は、泌尿器病原性もしくは腸内病原性の菌株である、エシェリヒア・コリもしくは他の腸内細菌もしくは口内細菌、不イセリア・ゴノルホエ、不イセリア・メニンギデイテイス、不イセリア・キャタルハリス、イエルシニア・エスピーピー、スートモナス・エルギノーザもしくは他のスートモナス・エスピーピー、モラキセラ・ボビスもしくは他のモラキセラ・エスピー　ヒー　、ｔ＜クチロイデス・ノドスス、スタフィロコッカス・エスピーピー、ストレプトコッカス・エスピービー、まｔこはボルデテラ・ペルツシスのごときボルデテラ・エスピービーである。

かような細菌の興味深い種類は線毛形成細菌で構成されている。

その重要な例は、泌尿器病原性もしくは腸内病原性菌株である、エシェリヒア・コリ、不イセリア・ゴノルホエ、不イセリア・メニンギデイテイス、不イセリア・キャタルハリス、モラキセラ・ボビスもしくは他のモラキセラ・エスピービー、ま１こはボルデテラ・ペルッシスである。

最後に、この発明による抗原は、と皮細胞のごとき哺乳類の組ａｋ、にある、特定の７ドヒシン　ポリペプチドもしくはその活性部の受容体の存在を測定するのに用いることができる。この抗原は、高い危険度にある人間、すなわち問題の感染症をおこす病原性細菌が自ら産生ずるアドヒシンによって結合する受容体を大量に産生しそのためある種の感染症にかかりやすいと思われる人間を同定することは非常に重要であるっかような人間が同定されたならば、予防治療すなわち主として免疫感作／予防接種を行うことができる。アドヒシン受容体の存在および存在するアドヒシン受容体の量の測定法は、組織の試料もしくは細胞スクレイビング（ｃｅｌｌ　ｓｃｒａｐｉｎｇｓ　）からなる試料をアドヒシンととも１こ培養し次いで洗浄することから構成されている。アドヒシンに対して生成し、例えば蛍光もしくはｌ−１２５のような放射性アイソトープで標識が付された抗体が試料とともに培養されてもよく、または一方ではこのようにＳ識の付されたアドヒシンは直接試験に用いてもよい。次いで試料のアドヒシン受容体の量は、それ自体公知のしかたで試料の放射能もしくは蛍光の量を測定することによって測定することができる。

具体的１こ述べれば、エシェリヒア・コリの泌尿器病原性菌株のアドヒシン　ポリペプチド類、すなわち前記のアミノ酸配列はし１こがって、泌尿器管中１こ大量のグロボシド受容体を産生しそのため泌尿器管の感染症にかかりやすいと考えられる女性を同定するのに用いることができると考えられる。

この発明のこの態様は一般に、ヒトのごとき宿土浦乳類からの組織試料を受容体 −特異性ビリペプチドで処理し、未結合の受容体−特異性ビリペプチドを除去し、結合され１こ受容体−特異性ビリペプチドの量を測定することからなる前記宿主における受容体の密度もしくは分布の測定法として示すことができる。

結合され１こポリペプチドの量の測定はそのポリペプチドに標識をつけるか、ま１こは上記のごとき標識をつけ１こ抗体と試料とを培養するかによって行うことができる。

この発明の方法は、受容体密度もしくは受容体分布が特定の受容体に対して誂導された抗体によって測定された以前の方法にくらべて非常に有利である。というのは、アドヒシン　ポリペプチドによって例示される受容体−特異性ビリペプチドは、通常一つもしくは二つの糖である受容体自体が糖の鎖の端部にあってもま１こはその二つの糖の系が塘の鎖のいくぶん中央部にあっても特定の受答体に結合しうるが、一方抗体は前記鎖の端部の二つの糖を認識するだけで中央部の二つの糖を認識しないからである。それ故に抗体の積台範囲はアドヒシン　ポリペプチドと比較して限定されており、受容体密度を定量する試みは、受容体と直接結合させるｔコめに抗体を用いるといつも低く評価されている。

最後に、この発明の一つの態様は、ヒトもしくは他の哺乳類が病原性のアドヒシンー結合微生物１こ感染する可能性を防止するかもしくは減少させる方法に関するものであり、すなわち、ヒトもしくは他の哺乳類を、特定の細菌の感染が防止されるべき細胞表面にポリペプチドを分布させる適切な方法にて、１以とのアドヒシン　ポリペプチドによって処理することからなる方法であり、使用されるアドヒシン　ポリペプチドは、病原性細胞によって産生されるアドヒシンが結合する受容体と結合するアドヒシン　ビリペプチドである。この場合、そのアドヒシン　ポリペプチドは、抗原としては使用されないが受容体をふさぐ直接予防的治療剤として使用され、したがって病原性細菌が受容体と結合できなくなる。最も局所的な感染症において、第１段階は特定の細菌からのアドヒシン　ポリペプチドの特定細胞の表面への特異的な結合であり、このことは受容体がすでにふさがれている場合、感染を進行させる工程の第一段階は起ることはないことを意味する。また細菌が結合できなければ感染は起こらない。

図面の説明下記の図面を参照してこの発明をさらに説明する。

第１図はｐ　ＲＢＵ　８４５中のＰａｐＤＮＡ（２）遺伝子構成を示す地図である。上方の線はプラスミドｐＡＯＹ０１８４に挿入されたＥｃｏＲＩフラグメントのサイズ（キロベース・ペア）を示ｔ。

種々のＴｎ５挿入の位置は上部に示しである。ｐＲＨＵ８４５の制限地図と同定されたｐａｐ遺伝子類の位置が示されている。厚みのある垂直Ｏバーはシグナルペプチドの遺伝子情報を指定する領域を示す。前記バーの下に示したのは成熟ポリペプチド類の分子ｔｃｘｉｏｓドルトン単位）を示す。

第２図は生体外の突然変異誘発に用いられるｐａｐミルミルハイブリッドプラスミド図と遺伝子構成を示す。プラスミドｐＰＡＰ５はＰａｐ線毛の表現とヒト赤血球のジガラクトシドー特異性凝集度応に必要な全ＥｃｏＲＩ−ＢａｍＨＩフラグメントを有している。プラスミドｐＰＡＰ１６は１ａｃＵＶ５プロモーターからの転写調節下のＳｍａｌｌ−ＢａｍＨＩだけを有する。　プラスミドｐＰＡＰ９は、１ａｃＵＶ５プロモーターを有していないことを除けばｐＰＡＰ１６と同一である。水平線の下のＡｐＲはアンピシリン耐性（１００μｍ７ｍ１）を示す。

第８図は、ｐＰＡＰ５もしくはｐＰＡＰ　２２中に見出された全ｐａｐ領域を示す（上部の半分）。ｐＰＡＰ　２２は、ベクターＤＮＡのＢａｍＨｉ　−Ｐｖｕ１１部を欠いていることを除けばｐＰＡＰ５と同一である。このプラスミドはｐａｐＡ１誘導体ｐＰＡＰ２Ｂ　の親である。またｐａｐＡ１突然変異の位置が示されている。この図の下部はＳｍａｉｌ−ＢａｍＨＩ領域の物理的地図を示す。

この領域でのＴｎ５　挿入の位置が示されている。すべてが血球凝集反応を仲介する容シを破壊する。この下に１）ａＩ）　Ｅ％ｐａｐ　Ｆおよび上のシグナルペプチドを示す。ｐａｐＥｌ、ｐａｐＦ！　およびｐａｐＧｌの突然変異の位置が示されている。それらはｐＰＡＰ５とｐＰＡＰ１６　との両者に別個に導入された。

図面に示されたプラスミド類の構造と特性づけは、実施例１〜８のみならず原料と方法の項に記載されている。

一般的原料と方法化学試薬類と酵素類制限酵素類とＴＡＤＮ人リガーゼはベーリンガーマンハイム社（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ　Ｍａｎｎｈｅｉｍ　ＧｍｂＨ）もしくはニュー　イングランド　バイオラプス（Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｂｉｏｌｏｂｓ）　から購入し製造メーカーのすすめたのと同様にして使用した。８−劣性末端（８’−ｒｅｃｅｓｓｉｖｅ　ｅｎｄｓ）　Ｏフィリング（ｆｉｌｌｉｎｇ）は、必要なｄＮＴＰ類をそれぞれ２００μＭ添加した連結緩衝液（ｌｉｇａｔｉｏｎ　ｂｕｆｆｅｒ）　ＶＣイレタ９　しｔつ７５　リｊ　７　）（Ｋｌｅｎｏｗ　ｆｒａｇｍｅｎｔ）　（ニュー　イングランド　バイオラブ社）を用いて行った。ＸｈｏＩリンカ−（５− ＣＣＴＯＧＡＧＧ−８）およびＢａｍｕＩリンカ−（６−ＣＧＯＡＴＯＣＧ−８ ’）はコラボレイテイプ　リサーチ社（Ｃｏ１１ａｂｏｒａｔｉｖｅ　Ｒｅ５ｅａｃｈ）から入手し、そのメイ力−が述べるとおりに、ニュー　イングランド　バイオラプスから入手したポリヌクレオチドキナーゼを用い、５−ホスホリル化した。化学試薬はすべて市販の最高純度のものであった。ｐ−赤血球はビイ、セダーグレン博士ＣＤｒ、Ｂ。

Ｃｅｄｅｒｇｒｅｎ）　＊ブラッド、バンク、大学病院、ウメア（Ｕｍｅｉ）の御好意で入手した。

線毛のＭ製線毛は、プリントンら（Ｂｒｉｎｔｏｎ　ｅｔ　ａｌ）、インムノビオロジイ　オブ　ネイセリア・ゴノルホエ（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ　ｏｆＮｅｉｓｓｅｒｉａ　ｇｏｎｏｒｒｈｏｅａｅ）　、ワシントン　ディジー、米国。

１９７８年、第１５５−１７８頁に記載の方法の修正方法によって精製された。

細胞は２２時間、８７°Ｃで、グルコースなしのＬ−ニガーの入った五つのトレイ（４００Ｘ２５０ｍ）中で培養された。細胞をトレイ力）らけずりとり、８４０ｒｎ／の氷冷５ｒｎＭ）！Ｊススー酸緩衝液（ｐＨ８，０）中に分散させ、４にセットしｆ；−７−ハ／Ｌ／　オムニミキサー（８ｏｒｖａｌ　ｌ　Ｏｍｎｉｍｉｘｅｒ）中の水上で１０分間混合した。細胞および細胞破砕片をベレテーション（ｐｅｌｌｅｔａｔｉｏｎ）　シだ後（８０分間２０，０００Ｘｇで２回）、脆酸アンモニウムを上澄液に５５％飽和度まで添加し、−夜氷上において線毛を沈澱させた。得られた沈澱を遠心分離で収集し５ｍＭ　）！Ｉス緩衡液ｃｐｕｓ、ｏ）中に再分赦させた。

同じ緩衝液に対して４℃で一夜透析させた後、不溶物を８０分間４０．０００ｘｇで遠心分離して除去した。この沈澱−透析操作をさらに８回繰返しく８時間の沈澱）、その後１３０ｆｇｃＩ！２−１．５ＭＮａＣｊ！！−１００ｍＭ　）リス−ＨＣ！！（ｐＨ７，５）の０．２　容量郁を添加することによって線毛を沈澱させた。得られた沈澱は、ローリイら（工、ｏｗｒｙ　ｅｔ　ａｌ　）・ジャーナル　オブ　バイ第１ジカル　ケミストリイ（Ｊ、　Ｂｉｏｌ　、Ｃｈｅｍ、）　、第１９８巻、１９５１年、第９２０〜９２９頁によって測定して蛋白濃度２ｍｌ／ｍｌに溶解した。収率は、野性型で約１５ｍ、９変異株では２〜８０ｍｙであった。

受容体結合性の検査法スライド凝集試験（ｓｌｉｄｅ　ａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉｏｎ）　用ニ、クルコースなしのＬ−ニガー培地上２２時間培養された細菌細胞を、８％のヘパリン化し洗浄したヒト赤血球含有の凝集緩衝液（１５０ｍＭ　ＮａＣ１，１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＯ１！、ｐＨ７−５）中に１約１０”　Ｃｅ１１ｓ／ｍ／の濃度で分散させた。その反応は、陽性の場合、通常６０秒以内に現われてくる。この陽性反応は赤血球の肉眼で見える凝集反応であった。この半定量的検査法において上記のように培養された細胞は人６００　＝２０　に再度分散された。次いでコニカル底のウェル（ｗｅ　ｌ　１　）を有するマイクロタイター・プＬ／　−）　（ｍｉｅｒｏｔｉｔｅｒ　ｐｌａｔｅ）　［リ　ンプロ／タイターチック社（Ｌｉｎｂｒｏ／Ｔｉ　ｔｅｒｔｅｋ）　、カタログ番号７６−８２１−０５、コネチカット、米国〕を用いて、５０ａｌ！の凝集緩衝液で連続的に２倍稀釈を行った。これに１同じ緩衝液による８％赤血球分散液の１０μｌを加えた。４℃で２時間後に陽性の凝集を示す最後のウェルの稀釈度を凝集力価（ａｇｇｌｕＬｉｎａｔｉｏｎｔｉｇｅｒ）とした。もとの分散液の細胞数算定をこの力価とともに用いて、凝集に必要な最小細菌濃度を計算した。

精製線毛の凝集力価は、全細胞に用いたのと本質的に同じ方法で測定した。しかし凝集緩衝液を用いる５合、凝集に必要な綿毛濃度は非常に高いので、この検査法の感度を増加させるために種々のこころみかなされた。線毛は生理的ｐＨ中では負に帯電し、１６７ｍＭΔ（Ｈｏｔ２の存在下で凝集するので（線毛の精製の項参照）、野生型の線毛製剤は、グロボシド受容体（ジガラクトシド含有）を含有するＰＩ−赤血球およびこの炭水化物を金談ないｐ−赤血球を用い、Ｍｇ０１ｓの濃度を上げながら滴定した。その凝集力価は、ＭｇＯ！２濃度を１００ｍＭ　に増大すると１２８倍増大することが見出された。このことは同じ緩？ｊｒ液による２００μｍ１／ｍｌ線毛溶液のＡ　４０Ｇの増加と平行している。ＣａＣｌ２と１０倍の高濃度のＮＨ＜Ｃｌを用いても同じ結果が得られる。このことはその効果は綿毛−線毛間の相互作用についてであり特定受容体の結合についてではないということを示唆している。加うるに、全ピリエイテッドセル（ｗｈｏｌｅｐｉｌｌｉａｔｅｄ　ｃｅｌｌｓ）　ノｆｉ集力価はＭｇＣｌ２を２００ｍＭ　まで添加しても余り影響されない。またｐ−赤血球を用いると凝集力価が増大するということは、この検査法の特異性（ｐｌ−ｔｉｔｅｒｏｖｅｒ　ｐ−ｔｉｔｅｒ）は変化しないようであ、るけれども、不特定の線毛−赤血球凝集がΔｆｇ　イオンの添加によって促進されるということを示している。それ故に線毛製剤の滴定はすべて、１００ｍＭＭｇＣ１２含有の凝集緩衝液中でなされ、特定の凝集反応について半定量的な値を与える。

抗体の産生免疫前の血清を二匹の健康な１．８ＫＦの雌のニューシーラント・ホワイト・ラビットから心！？刺によって得、濾過殺菌し、−２０℃で貯蔵した。等張性食塩水１．０　ｍｌ！に入れた精Ｗｒａｐ線毛７．５μＩを同容積のフロイントの完全助剤でエマルジョン化し、その０．５　ｍｌ！ずつを四つの部位に、すなわち肩甲下の２部位と２本の後足の筋肉に注射した。６週間後、完全７０インド　アジュバントでブースター注射を行った。第二免疫感作後の１０日間、前記動物から心ｇｉｉ９刺によって採血し、その血清を濾過殺菌し、０．０２％のアジドナトリウムとともに一２０℃で貯蔵した。

線毛抗原の検査法スライド凝集法試験用に、細菌を、血球凝集性検査法について記載したのと同様にして培養して作製した。全細胞の凝集試験は精製Ｐａｐ線毛に対して生成した抗血清の５００倍稀釈（ＰＢＳ　ｐＥ［７，５）したもの（上記参照）で行った。この陽性反応は６０秒以内に現われる、肉眼で見える細菌の細胞集合として測定された。

ミニ細胞中の蛋白の表現プラスミドｐＰＡＰ５とその誘導体をミニ細胞産生菌株Ｐ６７８−５４に形質転換させた〔アドラーら（ムｄｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ）、プロシーディング　オブ　ナショナル　ア力デミイ　オブ　サイエンス　オブ　ユナイテッド　ステイソ　オブ　アメリカ（Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、　８ｃｉ、ＵＳＡ）　＊第５７巻、１９６７年、第８２１〜８２６頁〕。プラスミド含有のミニ細胞の製造と［８５８）メチオニンによる標識づけはトンプソン及びアクトマン（Ｔｈｏｍｐｓｏｎａｎｄ　Ａｃｈｔｍａｎ）、モレキュラー　アンド　ジエネナル　ジェネテイ７　ス（Ｍｏｌ　、Ｇｅｎ−Ｇｅｎｅｔ、）、第１６５巻、１９７８年、第２９５〜３０４頁に記載したのと同様にしてなされた。得られた放射性試料を８ＤＳ−ポリアクリルアミド電気泳動法に付した（下記参照）。そのゲルを固定し、染色し、エンハンスし〔エンハンス、ニュー　イングランド　ヌクリアー（Ｅｎｈａｎｃｅ　、　ＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ）　：ｌ、　オートラジオグラフィに付した。分子ｊｉｉＫ準品Ｃファーマシャ　ファイン　ケミカルズ、アブサラ。

スエーデン（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　Ｆｉｎｅ　Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、　Ｕｐｐｓａｌａ。

８ｗｅｄｅｎ）　と精！！ｉ！線毛を平行して電気激動法に付した。

８Ｄ８−ポリアクリルアミド　ゲル　電気汰動法放射性試料を、６２．５ｍＭ　Ｔｒ　１ｓ−ＨＯｆ　（ｐｌＩ　６ＪＳ）、　１％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤ８）、０．５％β−メルカプトエタノールおよび１０％グリセロール含有のサンプリング緩衝液の１００＃ｊ’　中に分散させた。５分間沸騰後、抽出物（ｅｘｔｒａｃｔｓ）カ０．１％８Ｄ８含有の１５％ポリアクリルアミド・スラブゲル中で電気激動に付され〔レム！Ｊ　−（Ｌａｅｍｍｌｉ）　、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　＊第２２７巻、１９７０年、第６８０〜６８５頁。

分子量が８０００〜９４，０００の範囲の蛋白標準品を平行にはしらせた。固定、染色および脱色後（グランドストロムら（Ｇｒｕｎｄｓｔｒ；ｍ　ｅｔ　ａｌ　＞、ジャーナル　オブ　ハクテリ、ｔｃ＋シイ（Ｊ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　、＞　、第１４８巻、１９８０年、第１１２７〜１１８４頁〕、そのゲルを、Ｅｎ８Ｈａｎｃｅ　（ニュー　イングランド　ニュークリアー　コーポレーション、ボストン　マサチューセッツ）を用いることによってフルオログラフィに付した。

トランスポゾン変異発生法（ｔｒａｎｓｐｏｓｏｎ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）Ｔｎ５によるトランスポゾン変異発生法を、ファージλＣ１８５７ｂ２２１ｒｅｘ　：：Ｔｎ　５を用いて、ビョルクおよびオルセン（Ｂｊ６°ｒｋａｎｄ　０１ｓｅｎ　）　＋　７クタ　ケミ力　スカンジナビ力（ＡｃＬａ　Ｃｈｅｍ。

８ｃａｎ、）　、第Ｂ　８８巻、１９７９年、第５９１〜５９Ｂ頁に記載されたのと本質的に同様にして行った。

細胞抽出物種々のハイブリッド　プラスミドを含有するＰ６７Ｂ−５４菌株の細胞を、適当な抗性物質の存在下、トリブチツク・ンイ・ニガー（ｔｒｙｐｔｉｃ　ｓｏｙ　ａｇｒ）上で培養した。　細菌は、−夜３７℃で培養後採集し、ＰＢＳ　（ｐＥＩ　７．２　）−Ｂｒｉｊ■−８５中に５６０　ｎｍ　において１．５　ｒ！！に収度単位の細胞密度で分散され、次いで遠心分離して収集した（１２．ＯＯＯｘｇ　、１０分間）。次いで細胞ペレットを、リゾチームをｌ　ｍＪｉ／ｍｌ！含有する、１％ノニデットＰ　−４０（Ｎｏｎｉｄｅｔ　Ｐ−４０）　−１％ナトリウムデオキ’ｙすｏレート−０，１％８Ｄ８−０．１５ｍＮａＣＪ！−０，０１ＭＴｒｉｓ−Ｈｏｔ　（ｐＨ７，２）　（７）　４００　ｌｉｔ中に分散させ、１ｏ分間４℃（２６）テ培養した。ｐａｐ抗血清ｏ１／１５，０００稀釈の試料４００μＥを細胞抽出物に添加した。４℃で１６時間培養後、細胞抽出物抗体混合物を遠心分１１（１２，０００Ｘｇ、１０分間）で透明化した。

コンペテイテイブ　エンザイムーリンクド　イムノソーベントアセイ（Ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅ　ｅｎｚｙｍｅ−１ｉｎｋｅｄ　ｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙ、ＥＬＩ８Ａ）使いすてミクロ滴定用血球凝集プレー）　（Ｃｏｏｋｅ　（クーチ）ポリスチレン、９６Ｕウエル）を、ひとつのウェル当り、０．１五ｆ炭酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ９，６）による精製Ｐａｐ線毛のＬ　ｐ１ｉ／ｍｌ溶液の１００μ！！に２５℃で１６時間さらした。つ・・■ エルを、０．０５％（ｖ／ｖ）Ｂｒｓ３−８５　（シダ７　＊　Ｓｉｇｍａ）を含有するＯ、　ｌ　５　Ａ１Ｎａ０！！で８回洗浄して、未結合の線毛を除去した。抗−Ｐａｐミルミルラビット清をＰＢ　Ｓ　（ｐＨ７，２）中１．＠０．０５％（ｖ／ｖ）　Ｂｒ３３−８５で、５０％の最大結合となる濃度にまで３釈しく１／８，０００稀釈）、次いで全細菌、細胞なしの抽出物もしくはＰａｐ線毛（正のコントロール）を、まｆ：１！線毛を添加せずに（負のコントロール）　ＰＢ８−Ｂｒｉ　ｊ　Ｉｙｓａｔｅ中で連続稀釈物を混合した。１６時間４℃で培養した後１００ｓｌの試料を感作されたマイクロタイターウェルに移した。そのプレートを８時間３７℃で培夢し次いでＮａＣ１！−ＢｒｉＪ４１で８回洗浄した。ＰＢＳ−Ｂｒｉｊ■中１／１．０００に稀釈され、アルカリホスファクーゼをコンジュゲートシた山羊の抗−ラビット免疫グロブリンＧを全ウェルに添加し、１時間３７℃で培養した。

これらプレートをＰＢＸ−Ｂｒｉｊ■で８回洗浄し、１．ＯＭジェタノールアミン株鷲液（ｐｎｖ、８）溶液として１ｍ／Ｃ１ｐ−二トロフェニルホスフエート（シグマ社）を各ウェルに添加して１時間８７℃で培養した。２ＮのＮａＯＨを添加して反応をとめ、４０５ｎｍにおける吸光度をＭＲ５８０Ｍｉｃｒｏ　ＥＬＩ８人ａｕｔｏｒｅａｄｅｒ　（Ｄｙｎａｔｅｃｈ　０１１−９６０−００００　；　ＤｙｎａｔｅｃｈＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ、アレキサンドリア、バージニア）で測定した。

イムノブリシビテイション（Ｉｒｎｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉ　ｔａｔｉｏｎ）（８ｅｐｈａｒｏｓｅ■）に結合された純粋なスタフィロコッカス・アウレウス蛋白Ａをスタフィロコッカス・アウレウスの細胞の代わりに用いたことを除いて、ダラス　アンド　ファルコウ（Ｄａｌｌａｓ　ａｎｄ　Ｆａｌｋｏｗ）　、ネイチャー（Ｎａｔｕｒｅ）　、第２７７巻。

１９７９年＋ｇ４０６〜４０７頁に記載されているのと本質的に同様にして行った。

ｖ”ｙ工ｘター：／　プロッティング法（Ｗｅｓｔｅｒｎ　ｂｌｏｔｔｉｎｇ）精製線毛を８Ｄ８−ポリアクリルアミド　ゲル　電気泳動に付した後に、スワンソンら（８ｗａｎｓｏｎ　ｅｔ　ａｍ）　＊インフエクション　アンド　イムニテイ（Ｉｎｆｅｃｔ　、ＩｍｒＱｕｎ　、）　８８８　巻。

１９８２年第６６８〜６７２頁に記載しであるのと同様にしてウェスターン　ブロッティング法に付した。プラスミドｐＲＨＩＪ８４５を１８２容するＰ６７８ −５！菌株からＭ製された線毛に対して生成するＰａｐ抗血清のｉｆｆ物（エンザイムー　リンクド　イムーン　ソーベント　アセイ　タイター、１：ｔ、ｃＯｏ）を使用した。

プラスミド誘導体の組立てＰａｐ線毛の表現に必要なすべての遺伝子とジガラクトシドー特異性結合性を有する、ｐＲＥＵ８００９．６Ｋｂ長のＥｅｏＲＩ−ＢａｒｎＨＸフラグメントを％１）ＰＡＰ５（４２図参照）を与えるＢｃｏ　ＲＩまたはＢａｍＨＩで消化されたｐ　Ｂ　Ｒａ　２２　Ｃポリバーら（Ｂｏｌｉｖａｒｅｔ　ａｌ）　＊ジイーン（Ｇｅｎｅ）　＊　Ｉｇ　２巻、１９７７年。

第９６〜１１８頁〕にクローンした。分子のｐＥＫ８２２　部分にＰｖｕｎ　廃位を欠く誘導体を正、ｌ立てるために、ベクターは、Ｆｖｕ　ｐ　が消化され２０倍過剰のＢａｍ’ｎ　１１Ｊンカーにリゲイトされた。次いでこのｆ）ＮＡはＥｃｏ　ＲｉおよびＢａｍＨＩで切断され、ｐＢＲ８２２のヌクレオチド２０６５〜４３６０を有する最大のフラグメント〔ストクリツフエ（８ｕｔｃｌｉｆｆｅ）　、ＤＮＡ：　Ｒｅｐｌ　１ｃａＬｉｏｎ　ａｎｄ　Ｒｅｃｏｍ　ｂｉｎａｔｉｏｎ、　ｐ　４３　Ｑ　、　Ｃｏｌｄ８ｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｐｒｅｓａ　、　ニューヨーク、１９７８年、第７７〜９０頁〕を０．７％アガロース　ゲルから単離した。

このフラグメントはｐｇｎｔｙａｏからのＥｃｏ　ＲＩ　−ＢａｍＨＩ　に連結され、エシェリヒア・コリ菌株）ｉＢｌｏ１ｃボイヤーアンド　ローランド　ダッソー（Ｂｏｙｅｒ　ａｎｄ　Ｒｏｕｌｌａｎｄ　Ｄｕｓｓｏｉｘ）。

ジャーナル　オブ　モレキュラー　バイオロジイ（Ｊ、Ｍｏｌ。

Ｂｉｏｌ、）　ｅ　第４１９，１９６９年、第４５９〜４７２頁〕に形質転換した〔マンデル　アンド　ヒガ（Ｍａｎｄｅｌ　ａｎｄ　Ｈｌｇａ）　＊ジャーナル　オブ　モレキュラー　バイオロジイ、第５８巻。

１９７０年第１５９〜１６２頁）。その単離されたクローンはｐＰＡＰ２２と命名され、そ０クローンがＢａｒｎＨＩ−ｐ　ｖｕ■セグメントを欠いていることを除けばｐＰＡＰ５　と同一物である。ｐａｐ　Ａ中の単一のＰｖｕ　ＩＩ座位にフレームシフト変異を有する誘導体のｐＰＡＰ２Ｂを、ｐＰＡＰ２２をＰｖｕ　ＩＩ　で直線状にしてそれを２０倍過剰のＸｈｏｌリンカ−でリゲイトして組立でた。ＤＮＡのＸｈｏ　ＩＩμ９の２０桓位を用いて８時間消化（ｄｉｇｅｓｔｉｏｎ）　ｊ、た後、フラグメントを、１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　ｐＨ８，０とｉｍＭ　ＥＩ）ＴＡで平衡にしたセファデックス＜Ｂｅｐｈａｄｅｘ■）Ｇ１５０カラム　（ファーマシア　ファイン　ケミカルズ、アブサラ、スエーデン）で精製した。リゲイション（ｌｉｇａｔｉｏｎ）とエシェリヒア・コリ菌株ＨＢ　ｌ　０１への形質転換の後、六つのクローンから（ＤＤＮ人を単流し〔バーンボイムアンド　ドリイ（Ｂｉｒｎｂｏｉｍ　ａｎｄ　Ｄｏｌｙ）　、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓ、、第７＠、１９７１：、第１５１８−１５２８頁〕分析した。五つのクローンが前者のＰｖｕ　ＩＩ座位に新たなＸｈｏＩ座位を有していた。これらのうちの一つはｐＰＡＰ２Ｂ　と呼称され後の研究に使用された。

下記の操作はプラスミドｐＰＡＰ１６（第２図）およびこのプラスミドと８ｍａ　ｌ　ｌ−ＢａｍＨＩ領域に変異を有するｐＰＡＰ５との両者の誘導体を組立てるためになされた。プラスミドラグメントおよびｄＧＴＰとｃｉｃ’ｒｐそれぞれ２００μＭずつで作製した〔連結（リゲイション）緩衝液中８０℃で１５分間〕。

このＤＮＡは、酵素を熱不活性化した後、ｐＰＡＰ５　のゲルで精製された８ｍａ　ｉ　１−８ｍ　Ｉ　２フラグメント（第２図）に連結され、次いでスモール −スケールのプラスミド製剤をスクリーニングすることによって、ベクターに関してｐＰＡＰ５　と同配向にフラグメントを有するプラスミドを単離した。そのクローンｐＰＡＰ１はわずかに先端が切れた形態で最後のポリペプチド（８５ｋｄ　）を表現した。したがってこのポリペプチドの遺伝子は８ｍａＩ２座位を超えて伸び、ｐＰＡＰｌの先端がきれた形態で存在している。この突然変異体は、これらの酵素で切断されたｐＰＡＦ５に連結されたＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩ　フラグメント上に分離された。したがってこのようくして得られた誘導体のｐＰＡＰ７は８ｍａ　工２座位にまでｐａｐＤＮＡｔ＝有する。全Ｓｍａｉｌ−Ｂａｒｒ＋ＩＩＩ領域を有するプラスミドｐＰＡＰ９は、ＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩで消化されたｐＰＡＰｌに過卿ＪのｐＰＡＰ５のＫｐｎＩ−ＢａｎｏＨＩフラグメントを連結することによって組立てられた。

ｐＰＡＰ９の挿入部（ｉｎｓｅｒｔ）　にフレームシフト変異体を作るために、このプラスミドは１５０　ｔｔｊ；ｉ／ｒｒＪｌのエチジウム　プロミドの存在下Ｈｉｎａｌｌで部分的に消化された〔グリーンフィールドら（Ｇｒｅｅｎｆｉｅｌｄ　ｅｔ　ａｌ）　、ｓイオキミカエハイオフイジカ　アクタ（Ｂｉｏｃｈｊｍ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、人ｃｔａ）　、　第４０７巻。

１９７５年、第８６５〜８７５頁）。直線化サレｆ：　（ｌｉｎｅａｒｉｚ−ｅｄ）プラスミドは次いで０．７％アガロースゲルから単離され、過剰のＸｈｏ　Ｉ　！ｊメメンに連結された。Ｘｈｏ　１消化、セファデックス０１５０ゲルクロマトグラフイ及び連結の後、そのＤＮＡは、アンピシリン耐性を選択しなからエシェリヒア・コリ菌株：ＥＩＢ　１０１に形質転換された。２Ｂのクローンから精製されたＤＮＡはＸｈｏ　Ｉおよび８ａｌＩでの消化によって分析された。

挿入部内の１６の突然変異のうち１８はＦＩｉｎｃ１１２座位におけるリンカ− 挿入であり２はＨｉｎｃＩＩＩ座位であった。ＨｉｎｃＩＩｇするｐＰＡＰ５誘導体はｐＰＡＰ７と類似のしかたで組立てられた。これらのプラスミドはｐＦＡＰＩ５（Ｈｉｎｃｎｌ）およびｐＦＡＰＩ４（Ｈｉｎｃ１１２）と命名された。

ｐＦＡＰＩ９はプラスミドｐＰＡＰ１４のＸｈｏＩ−８ａｌ　Ｉダイジェストを、再連結（ｒｅ−１ｉｇａｔｉｎｇ）することによりｐＦＡＰＩ４のＸｈｏＩ− ８ａｌｌフラグメントを欠失させて組立てられた。ｐＰＡＰ２０はｐＦＡＰＩ５から同様のしかたで組立てられた。プラスミドｐＰＡＰ　２６　（ｐａｐＡ　１　、　ｐａｐＥ　に重突然変異体）を作るために、ｐＰＡＰ２Ｂ（Ｐａｌ）ＡＩ）の大きなＫｐｎ　Ｉ　−Ｂａｍ　ＨＩフラグメメンをｐｐＡｐｔｏ（ｐａｐＥｔ）の小さなＫｐｎＩ−ＢａｍＨＩフラグメントに連結された。

プラスミドｐＰＡＰ９は８ｍａｉｌ−ＢａｍＨＩｔｊｆ戚内へのＴｎ５挿入を相補（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ）　シなかった。これはその挿入部の不充分な転写によるのではないかと思われる。それ故に１ａｃＵＶ５プロモーターを有するＥｃｏＲＩフラグメントはｐｓＫ８１０６から単離され（キャサバダンら、　Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ　、。

第１００巻、１９８１年、第２９８〜８０８頁）、ＥｃｏＲＩで直線化されたｐＰＡＰ９に過剰に連結された。次いで正しい配向のフラグメントを有するクローンのｐＦＡＰＩ６がＰｓｔ　Ｉ消化を用いてＤＮＡＨ剤をスクリーニングすることによって単離された。というのはそめプロモーターフラグメントがこの酵素に対して不斉に位置する座位を有するからである。同じ操作が他のｐＰＡＰ９誘導体にも適用されてｐＰＡＰ４（８ｍａｉ２−ＢａｍＨＩ欠失）、ｐＰＡＰ　１　ｇ　（Ｈｉｎｃｎｌ突然変異）およびｐＦＡＰＩ　７　（Ｈｉｎｃ　ＩＩ２突然変異）が得られた。

実施例１大きな線毛サブユニットの遺伝子のクローニングと同定エシェリヒア・コＩＪ　Ｊ　９６の泌尿器病原性単離物（ｉｓｏｌａｔｅ）の自然発生的に得られるＬａｃ−誘導体から高分子量の染色体ＤＮＡ（アー／１／　ｈ　ハＡｔら（ＬＨｕｌｌ　ｅｔ　ａｌ）、インフエクション　アンド　イムニテイ、第８８巻、１９８１年、ｇ９Ｂ８〜９８８頁；マンノース耐性血Ｔ＄凝集反応（ＭＨＲＡ）およびジガラクトシドー特異性結合参照〕が棲準の方法で単離された。

このＤＮＡは次いで部分的に制限酵素８ａｕ　８人で消化された。

この制限フラグメントは前記の制限酵素ＢａｍＨＩで先に直線化されたプラスミドベクターｐＨ０７９［：２リンズ（Ｃ！ｏｉｌｉｎｇ）。

Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚｙｍｏｌ　、　、第６８巻、１９７９年、第８０９〜８２６頁〕に連結された。このＤＮＡは、ビイ　ホルム（Ｂ、Ｈｏ１ｍ）　、　メンツズ　インエンザイモロジイ（Ｍｅｔｈｏｄｓｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、第６８巻、１９７９年、第１１２７−１１３４頁に記載された操作によって、生体外でλフアージ粒子中にパッケージされた。これらの粒子はエシェリヒア・コリ菌株Ｐ６７８−５４を感染させるのに用いられた〔アドラーら（Ａｄｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ）の前記文献〕。　次いでその細菌は、アンピシリン耐性の組換えプラスミドを含有するコロニイの形成をもたらすアンピシリン含有のプレート上に流延された。

個々のコロニイを、１％マンノースの存在下でのヒト赤血球の凝集反応でスクリーニングし、マンノース耐性の血球凝集反応を起こすクローン（ｐＲＨＵ８０７）が選別された。ｐＲＨＵ８０７のサブクローン（ｐＲＨＵ８０およびｐＲＨＵ８４５）は、アール　ハルらの前記文献に記載されているのと同様にしてＭＲＨＡ　を残して組立てられた。またエシェリヒア・コリ菌株ＨＢ　１０１　中にこれらサブクローンの両者が存在すると線毛を形成させる。ｐＲＨ８４５含有のエシェリヒア・コリ菌株困１０１によって起こる血：Ｅｔ凝集反応は、マンノースが存在していても存在していなくても溶解性ジガラクトシドの存在によって完全に陽春された。したがってこの場合、この菌株で表現されるＭＨＲＡ　表現型はジガラクトシド特異性の結合と同一であることを示している。

Ｐａｐ　（腎孟炎に関連のある線毛）線毛（ｐａｐＡ）を形成する主要なポリペプチドの構成遺伝子は、サブクローンからウェスターン・プロッティング法やイムノプリシピティション法によって同定され、第１図に示すごとく約２．２Ｋｂで地図に示されている。ｐａｐＡ遺伝子の位置は、大きなＰａｐミルミルサブユニット−終末配列と比べて〔オーハンリイら（ＯＨａｎｌｅｙ　ｅｔ　ａｌ）。

ジャーナル　サブ　エクスベリメンタル　メディスン（Ｊ、Ｅｘｐ。

Ｍｅｄ、）、第１５８巻、１９８８年１１月、第１７１８〜１７１９頁参照）、そのＤＮＡ配列から推論される遺伝子産物のアミノ酸配列間の同一性によってｍｒ！された〔エム　バガら（Ｍ、Ｂ４ｇａｅｔ　ａｌ）　、ジャーナル　サブ　バクテリオロジイ（Ｊ。

Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ　、）　、第１５７巻、１９８４年１月、第３８０〜８８Ｂ頁〕。

実施例２線毛ＤＮＡ配列の同定Ｐａｐ線毛の形成およびジガラクトシドー特異性の凝集反応に必要な遺伝子を特徴づけるために、ｐＲＨＵ８４５のサブクロンおよびトランスポゾンＴｎ５挿入突然変異体をツルマークら（Ｎｏｒｍａｒｋ　ｅｔ　ａｌ　）　、インフエクション　アンド　イムニティ、第４１巻、１９８８年９月、第９４２〜９４９頁に記載しであるのと同様にして組立て分析した。Ｔｎ５挿入突然変異体およびサブクローンをさらに分析することによって、左側のＥｃｏＲＩ座位から約１．　ＯＫｂと約９．４ＫｂＱ間の位置にあるＤＮＡだけゴ（第１図参照）ｒａｐ線毛形成とジガラクトシドー特異性結合の遺伝子情報を指定するのに必要であることが示された。そのＥｃｏＲＩ座位から７．９　Ｋｂと９．２　Ｋｂ　との間の挿入突然変異体は、ｒａｐ線毛の形成を阻害することなく　ジガラクトシドー特異性の結合性を消失させた。

実施例３線毛アドヒシンＤＮＡの遺伝子的特徴づけＰａｐ線毛形成とジガラクトシド特異性結合に必要であるとして実施例２で同定された領域は、原料と方法の項に記載されているのと同様にして、プラスミドｐＰＡＰ５（第２図参照）およびｐＰＡＰ２２を与えるｐＢＲ８２２に、ｐ　ＲＩＩＵ　８０の９．６Ｋｂ長ＥｃｏＲＩ　−ＢａｍＨＩフラグメントとして再クローンされた。

ｐＰＡＰ２２は、ベクターＤＮＡ中の欠失によって、そのｐａｐＡ構成遺伝子中に唯・−のＰｖｕＵ座位を有するけれども、ｐＰ−４，Ｐ５とｐＰＡＰ２２の両者は全ＥｃｏＲニーＥａｍＩＩＩＴ挿入部を有している。フレームシフト突然変異部ｐａｐＡ１を有するｐＰＡＰ２８は、ｐＰＡＰ２２中の唯一のｐｖｕｌ座位中に８ｂｐ長のＸｈｏ　Ｉリンカ−を導入して組立てられた（第８図参照）。エシェリヒア・コリ菌株１（Ｂ１０１においてこのフレームシフト突然変異体は、野生型とことなり精製されたＰａｐ線毛に対仄生成１−る抗面清によって凝集されなかった。

ｐＰＡＰ２Ｂを収容するエシェリヒア・コリ菌株ＩＩＢＩＯＬは、ジガラクトシドで被覆されたラテックス・ビーズの・みならずヒトのＰｌ−赤血球を凝集させる。したがってｐＰＡＰ２Ｂ／ＨＢ１０１は、野生型ｐａｐミルミルオペロンＰ２２もしくはｐＰＡＰｂ上に有するＨＢＩＯＩ　と同じ受容体結合特異性を表現すると考えられる。かくして線毛遺伝子ｐａｐ人の不活性化は、用（、ｓられる分析法におけるジガラクトシドー特異性凝集反応の度合を低下させなかった。

ｐａｒｌ　ＤＮ人の末端部へのＴａ２を挿入すると血球凝集反応を消失させるが、ｒａｐ線毛は形成される。かくしてｇ隼反応を伝達する遺伝子はこの領域に存在するである・うと推量される。

ここにインコー　ドされたポリペプチドの重要性をさらに研究するために、第２図に示すように、Ｓｍａｌｌ−ＢａｍＨＩ・フラグメントがｐＢＲ８２２中にサブクローンされた（原料と方法の項参照）。得られたプラスミドはＳｍａ　１１ −Ｂａｍ　ＨＩ＠斌へのＴｎ５挿入を相補しなかったので、クローンされたフラグメントは、ｐｓＫ８１０６由来のＥ　ｅ　ｏ　−ＲＩフラグメント（ｆｇ、ｕと方法の項参照）としてそのプラスミドに挿入された１ａｅＵｙ５ブロモ・−ター（フラグメント上の遺伝子を確実＆−十分転写するために）の転写コントロール下に置かれた。この構成物ｐＰＡＰ１６（第２図参照）は、Ｓｍａ　１１−ＢａｍＨｌフラグメント中メン入位置に四つの血球凝集反応をしないＴｎ５突然変異体を相補した。これら突然変異体の局在状況を第８図に示す。

Ｓｍａ　１１−ＢａｍＨＩフラグメント上メンｑ伝子をさらに明確にするためにｐＰＡＰ１６挿入部の詳細な制限地図を、関連のＴｎ５ｎ５挿入正確な醋置位ｉを付して作成した（第３図参照）。この飴岐に傷を有するｐＰＡＰ５の三つのフレームシフト変異誘導体（第８図３よび原料と方法の項参照）も作製された。二つの突然変異プラスミドのｐＰＡＰ１４とｐＰＡＰ１５はＨｉｎ　Ｃｆｌ　２とＨｉｎｃＵ１座位それぞれにＸｈｏＩｊｌンカーを有する。第三の突然変異体ｐＰＡＰ７に−）いては、ＳｍａＩ２からＢａｍ１（ＩＫかけてのｐａｐＤＮＡ（第８図参照）は削除された。

ｐＰＡＰ５から表現されるポリペプチド類とその三つの変異誘導体類は、エシェリヒア・コリのミニ細胞中、Ｃａ５ｓ）メチオニンで標識され、表現されたポリペプチドは５Ｄ８−ポリアクリルアミド　ゲル法で分析された。ｐＰＡＰ５と比較したところ、プラスミドｐ’ＰＡＰ７は８５　ｋｄ　（２）プラスミドを表現しなかった。その代わりに８４　ｋｄの新規のポリペプチドが現われた。ｐＰＡＰ７中の突然変異によって８ｍａＩ２座位におけるｐａｐ領戚が切りとられたので、Ｓｍａ工２とＢａｍＨＩ座位の間に３５ｋｄのポリペプチドの遺伝情報を指定する遺伝子ｐａＩ）　Ｇの３末端が存在するであろう（第３図参照）。これはｐａｐ領戚の最後の遺伝子である。

Ｔｎ５ｍ入の００２と０２１を行った際のｐＰＡＰＬ４におけるＨｉｎｃ１１２変異は、自らをインコードする遺伝子ｐａｐＦを明確に示している（第旦図参照）ところの１５ｋｄポリペプチドの表現をなくしてしまった。他のポリペプチド類はいずれもｐＰＡＰ１４におけるＨｉｎｃＵ２変異（ｐａｐＦ）によってＥ５されなかった。Ｈｉｎｃｌｌｌ’Ｊンカー挿入突然変異体のｐＰＡＰ１５のミニ細胞製剤は１６．５ｋｄポリペプチドを産生しない。このポリペプチドの遺伝子はＩ）ａｐＥと呼称され、そのフレームシフト突然変異はｐａｐｈｉと呼称される。ｐａｐＧ遺伝子産物のＳｍａ　Ｉ２−Ｂａｍ　ＨＩの欠失による切りとりはこの殻伝子が第３図において左から右へ転写されることを示す。ｐａｐＧ上へのＴｎ５挿入によってｐａｐＥと１）ａｐＥにもたらされる極性効果（ｐｏｌａｒｉｔｙ　ｅｆｆｅｃｔ）は三つの遺伝子の全部の転写はこの方向であることを示す。

ｐａｐｙとｐａｐＧ遺伝子に関するＴｎ５度異度付０を確認するため、Ｔｎ５変異の００２．０２１，０２６および０４２（第８図参照）が、変異された８ｒｎａＩｌ・〜ＢａｍＩＴ：Ｉ領域で相補された。

この目的のために、１ａ　ｃ　Ｕ　■５プロモーターのコントロール下にあるＳｍａ　Ｉ　１−ＢａｒｎＨＩ領域を有するｐＰＡＰ１６のｐａｐＥｌ、ｐａｐＦｌおよびｐａｐＧ１誘導体を原料と方法の項で記載したのと同様にして作製した。次いでこれらをｐｌＵ８４５のＴｎ５誘導体を有するエシェリヒア・コリ菌株ＢＩＢ　１０１　に形質転換しくツルマークらの前記文献）、Ｐｌおよびｐ−赤血球を用いるグロボシド−特異性血球凝集反応について検査した。ｐａｐＥＬ誘導体は、親プラスミドのｐＰＡＰ１６が行ったのと同様にすべてのＴｎ６変異を相補した。ｐａｐＦ　１プラスミドはＴｎ６変異の０２６と０４２を相補し、一方ｐａｐｏｉを有するプラスミドは００２と０２１の変異を相補した。これは００２と０２１０Ｔｎ５挿入をｐａｐＢ’中の突然変異と定義しており、そしてＴｎ５挿入の０２６と０４２がｐａｐｏ遺伝子遺伝在中するということを示している。またｐａｐＦとＩ）ａｐＧは別々の独立したトランス−コンプリメンタプルな（ｔｒａｎｓ　−ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｂｌｅ）遺伝子であることを明確に示している。この領域の遺伝子地図（第３図に示す）はこれらのデータに基づいて作成された。

上記のように、ｐａｐＦとｐａｐｏへＴｎＳを挿入すると、　線毛は形成されるけれども血球凝集性を全くなくしてしすう。

ｐａＩ）Ｅ−ｐａｐＦおよびｐａｐｏの遺伝子産物の血球凝集性についての固有の重要性を評価するためのものとして、血球凝集試験における。ｐＰＡＰ５の非極性リンカ−挿入変異体の誘導体がある。ｐａｐＦ６ｐａｐＧの両者の遺伝子産物は凝集に必要であるごとを示しているがｐａｐＦ１誘導体とｐａｐＧｌ　誘導体はいずれもＰｌ−赤血球の凝集を示さないことが見出された。ｐａｐＥ１変異体はそれ自体血球凝集性力価に影響しなかったが、驚くべきことにはｐａｐＡｌ、ｐａｐＥに二重変異体、ｐＰＡＰ２６は、エシェリヒア・コリ菌株ＨＢ　Ｉ　Ｑ　１に形質転換してもＰｌ−赤血球を凝集させなかった。

エシェリヒア・コリ菌株ＨＢ　１０１中のｐＰＡＰ５もしくはｐＰＡＰ２２の各種変異体誘導体の線毛抗原形成性およびジガラクトシドー特異性結合性を第１表に示す。

第１表地図作成に用いたプラスミド類の特性とｐａｐＡ％　１）ａｐＥ％　ｐａｐＦ’ およびｐａｐＧの機能分析ｐｓＮプラスミド類はｐＡＯＹ０１８４誘導体類（ｐＲＨＵ８４５白米のＥｃｏＲ１フラグメントを有し、各プラスミドは、第１図に示すように異なるＴｎ５挿入部を胃する）であり、一方ｐＰ　ＡＰ　プラスミド類はｐＢＲ８２２の誘導体である。線毛抗原は、Ｐａｐ線毛に対して生成する抗血清での細胞分散物のスライド凝集性によって測定しｔご。

ｐＰＡＰ２Ｂ中の変異ｐａｐ　Ａ　１は、ジガラクトシドー特異性結合性に影響を与えることなく大きなＰａｐミルミルサブユニットａｐ人遺伝子産物）の形成を全くなくしてしまつ１こことはこの表から明らかである。逆１こｐＰＡＰ　１４中の変異ｐａｐＦ１およびｐＰＡＰＴ中の変異ｐａｐＧ１はＰａｐ線毛の形成を阻害することなしにジガラクトシドー特異性結合性をなくしてしまった。

遺伝子のｐａｐ　ＯとｐａｐＤの変異は線毛形成とジガラクトシドー特異性結合性の両者を消失させた。ｐａｐ　ＦとｐａｐＧにおける変異だけが、Ｐａｐ線毛の形成を阻害することなくシカラクトシト−特異性結合性の消失をもたらした。

唯一の例外は前記のように凝集に対して陰性の二重変異体のｐａｐＡｌ−ｐａｐＥｌである。ｐａｐ　Ａもしくはｐａｐ　Ｅにおける変異だけが接合性である。

コｃＤ効果は、ｐａｐ　ＡもしくはｐａｐＥポリペプチドは（多分）細胞壁ヘアドヒシンを固定するの１と必要であるという事実に起因していると考えられる。

それ故にｐａｐ　Ｆおよび／またはｐａｐＧ遺伝子がジガラクトシドー特異性接合をインコードすると結論することができる。

実施例４線毛アドヒシンＤＮＡのＤＮＡ配列の樹立ｐＰＡＰ９（第２図に示すように、原料と方法の項に記載したのと同様にして組立られた）の１００μｆをＥｃｏＲＩとＢ　ａｍＨ■で消化し、Ｓｍａｌｌ−ＥａｍＨｌ　領域を有するＥｃｏＲＩ− ＢａｍＨＩフラグメント（第８図参照）を単離するため、分離相アガロースゲル電気泳動法（ｐｒｅｐａｒａｔｉｙｅ　ａｇａｒｏｓｅ　ｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　）に付した。

このフラグメントの一部を、エンドヌクレアーゼのＨａｅＬＲｓａ）、人１．ｕｌ、Ｈｐａｌ、８ａｕ３ＡＳＴａｑｌ、Ｈｉｎｃｌ［およびＢｇｌｌで別々にもしくは組合わせて消化し１こ。得られたフラグメントは、直接ま１こは分離用アガロースゲル眠気泳動法に付した後にクローンされ、フラグメントの分離はファージＭ１Ｂベクター中になされた（Ｍ１８ｍｐ８およびＭ１３ｍｐ９；メリックら（Ｍｅｓｓｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ　）、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、　ｌ　第９巻。

１９８１年、第３０９〜３２１頁〕。その挿入物は、サングラ−ら（Ｓａｎｇｌｅｒ　ｅｔ　ａｌ）、プロシーディング　オブ　ナショナル　アカデミイ　オブ　サイエンス　オブ　ユナイテッド　ステイソ　オブ　アメリカ、第７４巻、　１９７７年、第５４６８〜５４６７頁（ジデオキシ配列法）の方法を用いて配列され、Ｓｍａｌｌ−ＢａｍＨｌ　フラグメントのＤＮＡ配列の明確な重複が両ストランドについて読みとることができた。

実施例５線毛アドヒシンｆζついてのアミノ酸の配列性可能性のある読とりフレーム中に、遺伝子ｐａｐ　Ｅ　、　ｐａｐ　Ｆおよびｐａｐ　Ｇが、リンカ−およびトランスポゾンＴｎ５の挿入（第８図参照）によって達成されたこれら遺伝子の知られている位置およびこれらそれぞれの遺伝子の産物の公知の大きさ１６．５　ｋ（１，１５ｋｄおよび８５ｋｄからそれぞれ同定されｆ：。

これらの遺伝子のＮ−ターミナル末端が同定され１こ。そのアミノ酸配列は、エシェリヒア・コリについて達成され１こ遺伝暗号を用いてＤＮＡ配列から誘導された。それらの遺伝子産物はすべて、単一のペプチドを含付する前駆体として作られるのでその遺伝子の５′−末端は、シグナルペプチド状配列が続くメチオニンであると考えられろ〔シイ　フォノ　ヘイネ（ＧＶｏｎＨｅｉｊｎｅ）、イオロビアン　ジャーナル　オブ　バイオケミストシイ、第１８８巻、１９８８年、＠１７〜２１頁〕。

実施例６他の泌尿器病原性エシェリヒア・コ！１ＤＮＡとの相同性Ｓｍａ１１１−ＢａｍＨ１領域からいくつかのフラグメントが単離され、ニック　トランスレーション（ｎ１ｃｋ　ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ　）によって８２ｐで標識をつけ１こ。そのフラグメントは小さなセグメントの全領域をカバーする１こめに選択され１こ。次にこれらのフラグメントはプラスミドｐＤＯ５（フレラグ　アンド　ピアース（Ｃｌｅｇｇ　ａｎｄ　Ｐｉｅｒｃｅ）、インフエクション　７：／ド　イムニテイ、第４２巻、１９８３年、第９００〜９０Ｇ頁〕およびｐＰＩＬｌｏｏ− ８５（パン　ディら（Ｖａｎ　Ｄｉｅ　ｅｔ　ａ、ｌ）、　ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ、　Ｌｅｔｔｅｒｓ＋　ｊｊＭ　１９巻、１９８８年、第７７−８２頁〕のダイジェスト（ｃｉｉｇｅｓｔ　）のサザンプロット中のプローブとして、緊縮条件下で用いられた。ｐａｐＧ遺伝子領域からは全く信号は碍られなかつｔコが、強い雑種形成信号が、ｐａｐＥおよびｐａｐ　Ｆ遺伝子からのプローブによつ′Ｃ得られｔコ。緊縮条件下での強い４棟形成は、ＥｃｏＲ，ｌ座位から約３．２へ−８，４’ｋｂのとこ、ろに位置するＨｐａ、ｌ座位の間にＪ）るｐａｐ　Ｏ１ｉ１伝子のプローブからも得られｆ：、（第１図参照）。

ｐＤＣ５とｐＰＩＬｌｌｏ−８５の詳細な制限地図が作成され１こが、ｐａｐａとｐａｐ　Ｄの領域についてのｐＰＡＰ５の制限地図とほぼ同一であることが見出されｙ、：ｏｐａｐｌ：とｐａｐＦ遺伝子については高度の類似性が認められ１こがより小さいものであった。それ故に、エシェリヒア・コリの他の泌尿器病原性菌株中のＭＲＨＡ　ｒインコードするＤＮＡはｐＰＡＰ５（エシェリヒア・コリＪ９６由来）にインコードされたＤＮＡに極めて類似しており、Ｐａｐ系１こおいて得られる結果はほとＡ、どの腎孟炎病原性菌株に普遍することができると結論できる。ま１こｐＰＩＬｌｌｏ−３５については、そのＤＮＡから表現されるＭＲ，ＨＡがジガラ染色体ＤＮＡについ°Ｃ得られｌ’、：　（０つら（Ｌｏｗ　ｅｔ　ａｌ）、　インフエクション　ア：ノド　イムニテイ、第４ａ巻、ｘ９ｓ４年。

第３５３〜３５８頁〕。

プラスミドｐＰＡＰ９がＢｇｌｌと５ａｌｌ　（ｐＰＡＰｅ中のＢａｍＨＩ座位の右側約ａ　７５　ｂｐの位＠１こある）で消化され１こ。得られ１こフラグメントは予めＢ　ａｍＨｌと５ａｌｌで消化されたプラスミドｐＭｏ　８７４に連結され１こ（キャサバダンら、ジャーナルオブ　バクテリオロジイ、第１４８巻、１９８０年、第９７１〜９８０頁）。ｐＭｏ　１０６１へ形質転換しくキャサバダンらの前記文献）アンピシリンを１０μＩ／ｄ含冑のプレートにプレートシｔこ後組換え体を分析した。そのＥｇｌｌ　−Ｓａｌ　ｌフラグメントがｐＭｏ　８７４からの１ａｃ−カセット（Ｂａｎ）（ｌ　−８ａｌ　ｌフラグメント）によって置換されｆニーｐＰＡＰ９で構成され１こプラスミドｐＨＭＧ５１が単離され、原料と方法の項に記載しｔコのと同じミニ細胞分析法によって、ｐａｐ　Ｇ　−１ａ、ｃ　Ｚ融合ペプチドの遺伝情報を指定することが示された。まｔここの結果はｐａｐＧ遺伝子の公知の配例およびｐＭＯ８７４中に存在するｌａｃ　Ｚ遺伝子の配列からも予想された。

指示事項Ａ、他の融合遺伝子類の製造実施例７に記載方法に代わる方法で、ｐａｐＦ遺伝子からなるＮ−ターミナルＤＮＡフラグメントがｐＰＡＰ９をＢｇｌｌで直線化することによって得られる。

次いでこのＤＮＡは、エキソヌクレアーゼＥｘｏ璽とともに長時間培養され、次いでヌクレアーゼｓ１で処理されるとＢｇｌｌ座位からの欠失が増加した。

Ｈ１ｎｃｌ璽リンカ−が連結される。次にこのＤＮＡはＳｍａｌおよびＨｉｎｄ　Ｉで再消化され（ｒｅｄｉｇｅｓｔ　）、分離用アガロースゲル電気泳動法に付される。１，４００ｂｐから１，０００ｂｐにかけて並ぶフラグメント（第３図参照）が分離され、下記のようにしてＳｍａｉとＨｉｎｄｕで予め消化され１こ適当な融合ベクターに連結される。　゛ｐａｐ　ａ遺伝子を■するフラグメントは、下記の方法でｆｌＥうｎルカ・ＢｇｌｌＯ代わりにＢａｍＨｌで消化することによって行われる。ゲル上の２，４００ｂｐから１，５００ｂｐにかけて並ぶフラグメント（第３図参照）が選択される。ｐａｐＥ遺伝子を有するフラグメントは、８００〜４００ｂ＋ｐｆこかけて並ぶフラグメント（第８図参照）を選択して同様のしか１こで作られる。

ｐｓＫｓ１０４、ｐｓＫｓ１０５もしくはｐｓＫ８１０６のごとき融合ベクター中にクローンされる（午ヤサダバンら、メソッズイン　エンザイモロジイ、第１００巻、１９８８年、第２９８〜３０８頁）。これらの構造体中の融合され１こ遺伝子は１ａｃＵＶ５プロモーターによって転写される。

この構造体は、アンピシリン耐性をセレクトしながら、Ｌａｃｌｑｍ伝子を汀する菌株、例えばエシェリヒア・コリ菌株ＪＭ１０３（フレラグら、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　ＡＣｉｄｓＲｅｓ、、第９巻。

１９８１年、第３０９〜３２１頁）に形質転換される。この菌株は次いでＬＢ− ブロスのごとき適切な培地〔シイ・ベルタニＧ、　Ｂｅｒｔａｎｉ　：Ｌジャーナル　４ブ　バクテリオロジイ、第６２巻、１９５１年、第２９８〜３０８頁〕中で、光学密度が０Ｄ６００＝０．４になるまで培養される。次いで融合遺伝子の転写はＩＰＴＧを添加する０とによって誘導される〔ジエイ・ミラー　（Ｊ、　Ｍｉｌｌｅｒ）、　Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　Ｉｎ　Ｍｏ１ｅｃｕｌａ、ｒ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｊ：ｌ−ルＦ　ｘ　フ！Ｊングハーバー、ニューヨーク、１９７２年）。

培養は融合遺伝子の産物の最大設現が得られるまで続けられる。

次いで細胞が収穫され、融合遺伝子産物はβ−ガラクトシグーゼ活性の検査法（ジエイ・ミラーの前記文献参照）を用いる標準法で精製される。次いでこの精製融合産物は、例えばげつし動物類、さる類もしくは豚についてのワクチン試験に直接使用できる。

Ｂ、ワクチンの製造ワクチンとして用いられる、全ｐａｐＢ％ｐａｐ　ＦもしくはｐａｐＧ遺伝子産物またはその適当なフラグメントは下記のいずれかの方法で作製される。

１、１ａｃＺ遺伝子と、ｐａｐＥ、　ｐａｐＦもしくはｐａｐ　Ｇ遺伝子の精製ンのごとき化学試薬で消化される。得られたポリペプチド混合物から、所望のペプチドが、標準の技術、例えばイオン交換クロマトグラフィもしくはＨＰＬＯ逆相クロマトグラフィによって得られる。

２、一方その融合蛋白に対する抗体がこれらをラビットに注射することによって生成される。得られた抗体は、融合されていない純粋のｐａｐＥ％ｐａｐ　ＦもしくはｐａｐＧ遺伝子の産物を、これらの遺伝子を有するプラスミドを合方するｌａｃ　Ｚ−細菌から精製するのに用いることができる。このプラスミドは、ｐＰＡＰ５もしくはｐＰＡＰ１６のごときｐＢＲ８２２誘導体、またはＰＢＥＵ２８のごときランフつエイプラスミド誘導体〔ニーリンら（Ｕｈｌｉｎ　ｅｔ　ａｌ）、　Ｇｅｎｅ、　ｆＡ　２２巻、１９８８年、第２５５〜２６５頁〕であってもよい。

この精製は、イムノアフイニテイ　ゲル　リロマトグラフイによって行われろか、その抗体は精製方法を開発する際１こポリペプチド類を検出するのに用いられるＥＬ　Ｉ　Ｓ　Ａ分析法を開発するのに用いられる（原料および方法の項づ照）。

これらの精製ポリペプチド類のフラグメントは、所ｕｌこより、立起１に記載のプロテアーゼなどで分割することによって得られる。

８．５〜３０のアミノ酸で構成されるフラグメント、またはより大量のｐａｐＥ　、　ｐａｐＦおよびｐａｐＧ遺伝子産物は固相ペプチド合成法（スチュノート　アンド　ヤング、　５ｏｌｉｄＰｈａｓｅＰｅｐｔｉｄｅ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ、フリーマン　アンド　カンバニイ、サンフランシスコ、米国、　、１９６９年）で合成される。次いでそれらは、それ自体か、またはポリーＬ−リシンもしくはポリ−Ｄ、Ｌ−アラニンのごとき生理的に受容な担体の担体分子に、助剤とともにもしくは助剤なしで、アルノン、　Ｊ、　ＩｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌＭｅｔｈｏａ　、第６１巻、１９８８年、第２６１〜２７３頁に記載されているのと実質的に同じようにしてカップリングされて、予防接種に用いることができる。

Ｃ，スートモナス系線毛形成と接合がスートモナス種牛にリンクされていると仮定してスートモナスの接合性菌株からの染色体ＤＮＡが、ｐ、ＢＲ’１２２　誘導体、スートモナス／エシェリヒア・コリのシャトルベクター、プラスミドベクターもしくはファージベクターにクローンされ、ついでエシェリヒア・コリに形質転換／トランスフェクトされるフラグメントを作製するｆこめに制限エンドヌクレアーゼで消化される。そのハイブリッドベクターを収容する細菌は、精製スートモナス線毛に対して生成する抗体を用いて大きなスートモナス線毛サブユニットの産生の１こめにスクリーニングされる〔このことはベクタートしてｐＢＲ８２２を用いるエヌ・ゴノルホエについてなされている。メイヤーら、（Ｍｅ／ｅｒ　ｅｔ　ａｌ）＋　Ｃｅ１１．　第３０巻、１９８２年、第４５〜５２頁を参照〕。

次いでこのクローンは、直接にか、または線毛遺伝子含有のより大きなりＮＡフラグメメンを得るためのプローグとして用いられる。このフラグメントは、次いでスートモナス／エシェリヒア・コリのシャトルベクターにクローンされ、ノン −ピリエイトされた（　ｎＯｎ　−ｐｉｌｉａｔｅｄ　）非接合性のスートモナス菌株に転移され次いで接合性と線毛形成性が検査される。次いでこのフラグメントの突然度付誘発は、代わりに表現型の検査がスートモナスについて行われることを除けば、泌尿器病原性エシェリヒア・コリについて実施例２に記載したのと本質的に同じ方法で行われる。

一方、その染色体ＤＮＡが、スートモナスベクターモジくハス−トモナス／エシェリヒア・コリ　シャトルベクターｆこ直接クローンされ、非接合性のスートモナス菌株に形質転換されるならば、そのクローンは接合性について直接スクリーニングすることができる。他の検査法例えば俗解性受容体の結合性を用いることができる。

エシェリヒア・コリ中での融合蛋白生産と蛋白生産は、おこリウル転写信号と翻訳開始信号を人工的に灰えなければならな′Ｓと記の方法と類似のしかたで行われる。一方、蛋白生産は、例えば、バグダサリアンら（Ｂａｇｄａｓａｒｉａｎ　ｅｔ　ａｌ）、　Ｇｅｎｅ。

第２６巻、１９８８年、第２７８〜２８２頁に泥除の例えば広域宿主範囲のＴａｃプロモーターベクターを用い、スートモナスの相同システム中で行うことができる。ＤＮＡの配列とアミノ酸分析はＬ記実施例４と５に記載し１このと本質的に同じに行われ、そしてその纂基配列分析法に基づいて合成ペプチド類をと記記載のようにして生産することができる。

スートモナスについて要約し１こ方法のみならず実施例１〜５（こ記載の方法と類似の方法は、不イセリ７種などのごとき他の接合性細菌から得られると考えられるアドヒシン　ポリペプチド類を同定および生産するのに用いることができる。

原則として、すべての研究は蛋白化学を用いて行うことができる。アドヒシン　ポリペプチド類は、例えばジガラクトシドといつ１こ受容体、アフィニティ　リロマトグラフィまたは他のいずれの適切な方法（抗体アフィニティ　リロマトグラフィのごとき）によってＪ［を１こかめ、精製することができる。蛋白の純度は、原料と方法の項に記載し１こ５ＤＳ−ポリアクリルアミド　ゲルｌ気泳勧法によって検査できるつアドヒシン類が製剤の大きなフラクションを構成するということを確認する１こめに、放射能漂識のされ１こ受容体を用いる平衡透析実験法を用いて、存在する蛋白の１分子当りの結合座位を計算してもよい。

これは蛋白１分子当り０．１〜１０リガンドであると考えられる。

実施例８この実施例に用いられｔコ原料と方法細菌菌株、プラスミドおよび培養条件細菌菌株はすべ′Ｃ，第２表１ζ記載の臨床′ζ７の単離物を除いて′、エシェリヒア・コリに、　１２の誘導体ひＪ）る。蛋白表現分析用（こＰ６７８−５４（１）のｒｅｃ　Ａ　ｍ導体のＡ、　Ａ　１０が用いられた。Ｍ１３のクローニングとノアー：−ンの増殖はＪＭ１０８中で行われ１こ。

ＨＢＩＯＩは他のすべての実験における宿３ｆ′ｃあ−）ｆＨＨ。

プラスミドｐＰＡＰ５（前記の一般原料と方法の項参照）はエシェリヒア・コリＪ９６から単離され１こ。９．５ｋｂのＥＣＯ几１−ＢａｍＨｉ染色体フラグメントを有するｐＢＲ３２２の誘導体である。このクローンは血清学的にＦ１２に関連するＦ”０１３４．８”線毛抗原を表現する。ｐａｐミルミルクラスター蝕子地図１図に示す。プラスミドｐＤＯ５はエシェリヒア・コリＩＡ２の８．Ｏｋｂ　０１ａｌ　−ＥａｍＨｌ　７ラグメントを合するｐＡＯＹｏ　１８４　ｉ１導体であり、一方ｐＰＩＬ１１０−８５は、Ｆ７２　線毛抗原形成の原因であるエシェリヒア・コリＡＤ　１１０から分離されたｌ　６　ｋｂのＢｃｏＲＩフラグメントを葡するｐＡＣＹＯ１８４の誘導体である。

下記濃度の抗生物質が選別に用いられｆ−、。すなわち１００μノ／　ｗｌのカルベニシリン、１５μ９／ｗｌのテトラサイクリン、２０Ｉｌ！’／ｍｌのカナマイシンおよび２０μｆ／／ｍｌのクロラムフェニコールである。細菌は３７° Ｃでルリア・ブロスもしくはルリア寒天上で培養され１こ。

一般的な処理法Ｃ！ａ０１２処理が形質転換に用いられた。プラスミドＤＮＡは、バーンボイム　エイチ　シイおよびジエイ　ドリイ（Ｅｉｒｎｂｏｉｍ　Ｈ，Ｃ，ａｎｄ　Ｊ、　Ｄｏｌｙ）　（”Ａ　ｒａｐｉｄ　ａｌｋａｌｉｎｅｅｘ”ｃｒａ、ｃｔｊ −ｏｎ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ　ｆｏｒ　ｒ、ｃｒａｅ＋ｔ、ｉ−ｐｇ　ｙ、ＱＣ：）１１１１）ｌＬＴｌａｎ’ｔ。

ｐｌａ）Ｅｍｌ（ｉ　Ｄ　Ｎ　−４”　＋　Ｎｕｃｌ　Ｃａ、ｒ　、ｌ（Ｃ１（上ｆｆ：ｌ　１％Ｐ：ｆ＋　、　、１１７！　、１９７９年、第１５１８−１５２３頁、１１お、ミ（″ぐり一了スベルドら（Ｇｒｏｒ；ｖｅｌｄ　ａｔ　ａｌ）（“　Ｉｓ○］、ａｔ：ｉ、Ｏｎ　ｏ’ｊ）　β−ｇｌｏｂｉｎ　−ｒｅｌａｔｅ＋１ｇｅｎｅｓ　ｆｒｏｍ　ａ　ｈｕｍａ、ｎ　ｃｏｓｍｊ−ｄ　］−ｘｉ −ｂｒａｒｙ”　＊　Ｇｅｎｅ　＋　Ｆ５Ｊ　１８巻、１９８１年、第２２７〜２３７頁）のアルカリシ　クリアー　ライゼイト処理法（ａｌｋａｌｉ、ｎｅ　ｃｌｅａｒ　１ｙｓａｔｅ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）につづいて二つの連続しすこごチジウノ・ブｆ：ｌ’；、ド／ＣｓＣ１１ｕ衡遠心分離法を行う、改良法で単離されｆ、制限エンドヌクトアーゼ類は製造メーカーの推せんする条件下で使用し１コ〔ニューイングランド　バイオラブズ、米国、ベーリンガー　マンハイスシイエムビイ；イチま１こはベセスダ　リサーチ　ラボラ１−リイズ　ジイエムビイエイチ（Ｅｅ＝、ｂａｓｄａ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　ＬａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓＧｍｂＨ）　）。消化され＊　Ｄ　Ｎ　Ａは０．５％−１，５％（ｗｔ／ｖｏｌ　）アガロースゲル上で分離された。ＨｊｎｃｌｌおよびＨａｅｉでそれぞれ分割されたファージλＤＮＡとファージφＸ１７．１ＤＮＡ（二、１−イングランド　バイオラブズ）は分子ｆｆｆｉ串として用いられた。ＤＮＡフラグメントは、５％（ｗｔ　、、／ｖｏｌ　）　ｅリアクリルアミドゲルからエレクトロエリューション（ｅｌｅｃｔｒｏｅｌｕｔｉｏｒｘ　）によって純粋な形態で１＠られｔこ。

プロッティングおよび雑種形成手順（８２ｐ　）で標識されたＤＮＡプローブを、ニックトランスレーションによるかま１こはトイ１８雑種形成フロ−ｆプライマーにニューイングランド　バイオラブズ）での、クローンされたＭ２Ｓ−ｆｆ１鎖ＤＮＡ鋳型（ｃｏｌｏｎｅｃｌ　Ｍ　１８　ｓｉｎｇｌｅ　５ｔｒａｎｄｅｄＤＮＡ　ｔｅｍｐｌａｔｅｓ　）のブライミングＤＮＡ合成法（１）ｒｉｍｉｎｇＤＮＡ　５ｙｎｔｈｅｓｉｓ　）によって製造される。〔ａ　Ｐ）ｄＧＴＰ〔アマ−ジャム（Ａｍｅｒｓｈａｍ　）、イングランド〕は約１Ｘ１０”ｃｐｍ／μノの比活性Ｉこまで組入れられた。プラスミドＤＮＡは、アガロースゲル上でサイズフラクションされ、サザン、イーエム（５ｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｅ、　Ｍ、）、“Ｄｅｔ８ＣｔｉＯｎ　ｏｆ　５ｐｅＣｉｆｉｃＳｅｑｕｅｎＣｅＥｉ　ａｍｏｎｇ　ＤＮＡ　ｆｒａｇｍｅｎｔｓ　５ｅｐａｒａｔｅａ　’ｂｙ　ｇｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅ　ｓｉｓ”、ジャーナル　オブ　モレキュラー　バイオロジイ、第９ｇ４．ｘ９’ｉｒｓ年、第５０３〜５１７頁にしｔこがって、ニトロセルロースフィルター〔シュライへル　アンドシュＪｌ／　（５ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ　ａｎｄ　ＳｃＭｉｌｌ　）、　Ｂλ８５〕に移された。

そのプロットされ１こフィルターは、４ＸＳＳＣ（１Ｘ５ＳＯは１５０ｍＭ　ＮａＧ！１．１５ｍＭクエン酸ナトリウムｐＨ７，０である）、１０×デンハルトｉ８Ｈ（Ｄｅｎｈａｒｄｔ’ｓ　５ｏｌｕｔｉｏｎ　）　、　０．１％ＳＤＳ、２ｍＭ　ＥＤＴＡおよび晋波処理されに小午胸線ＤＮＡ（５０μｆ１５ｉｔ）からなる雑種形成溶液中２時間６８°Ｃで予備雑種形成がなされｆコ（ｐｒｅｈｙ ’ｂｒｉｄｉｚｅｄ　）。次いで新しい雑種形成溶液中の放射能標識され１こプローブ（Ｌ　Ｘ　Ｉ　Ｏｃｐｍ／ｇ？）　カフイルター？こ添加されプラスチック　ノ（ソゲ中１８時間＠養された。緊縮条件下で維挿形成が６８°Ｃで行われ、洗浄は同温度で２ＸＳＳＣ；０．１％ＳＤＳから０．１Ｘ５ＳＯｉＯ，１％ＳＤＳへかけての塩濃度で行われ１こ。非緊縮碓種形成は、雑種形成温度が５５° Ｃ″Ｃ−洗浄が２ＸＳ　ＳＯでなされることを除いて同じ条件下で行われた。フィルターを一夜増感板つきのデュポン　クロネツクス４　エックス線フィルムに露光シｔこ。

ミニ細胞中の蛋白表現の分析プラスミドｐＦＡＰ５．ｐＰＡＰ５０２．ｐＤＯ５およびｐＰＩＬｌ。

−３５を、ミニ細胞産生の菌株人ＡＩＯに形質転換し１こ。ミニ細胞の製造と、〔Ｓ〕Ｓノーオニン（７マージヤム）での標識付けは、トンプソン　アール　アンド　エム　アヒトマン（’ｒｈｏｍｐｓＯｎ、　Ｒ，ａｎａ　Ｍ、　Ａｃｈｔｍａｎ　）、“Ｔｈｅ　Ｃｏｎｔｒｏｌ　ｒｅｇｉｏｎｏｆ　ｔｈｅ　Ｆ　ＳｅＸ　ｆａｃｔｏｒ　ＤＮＡ　ｔｒａｎｓｒｅｒ　ｃｉｓｔｒｏｎｓ　：ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎ　ｍａｐｐｉｎｇ　ａｎｄ　Ｄ　ＮＡ　ｃｌｏｎｉ−ｎｇ”　、モレキュラー第１６５巷、１９７８年、第２９５〜３０４頁に記載されているのと同じである。放射性の試料はリニアーの１５％（ｗｔ／ｖｏｌ　）ＳＤＳ−ポリアクリルアミド　ゲル丘で分離され１こ。次いでそのゲルは固着され、染色され、脱色されエンハンスされ〔エンハンス（Ｅｎｈ、ａｎｃｅ　）、　Ｎｅｗ　Ｅｎｇｌａｎｄ　Ｎｕｃｌｅａｒ　ＧｍｂＨ）、次いでエックス線フィルムに１〜６日間露光し１こ。分子量標準はファーマシャ　ファイン　ヶミカルズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ　ＦｉｎｅＯｈｅｍ：Ｌｃａｌｓ　）　、スエーデンからのものであつｔこ。

ヌクレオチド配列の測定関連のあるフラグメントはフｒ−ジΔ１１３クローニングベクターのｂｉ１３ｍｐ８とＭ１８ｚｐ９１こり［］−ンされ、次いでエシェリヒア・コリ菌株Ｊλ１１０３に形質転換された。−直鎖鋳型ＤＮＡは、メリックら（Ｍｅｓｓｉｎｇ　ｅｔ　ａｌ　）、“Ａ　Ｓｙｓｔｅｍ　ｆｏｒｓｈｏｔｇｕｒｘ　ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ”、　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄ　Ｒｅｓ、　＋第９巻、１．９８１年＋ｇ３０９〜３２１頁１こ記載のようにしてファージから単離さｎｌこ。そのＤＮＡ配列は、サンガーら（Ｓ卸ｇｅｒｅｔａｌ）、“ＤＮＡ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｗｉｔｈ　ｃｈａｉｎ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｎｇｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ”、ブロシーデング　オブ　ナショナル　ア力デミイ　オブ　サイエンス　オブ　ＵＳＡ、第７４巻、１９７７年。

第５４６８〜５４６７頁に記載の、Ｍ２Ｓ　ペンタデカマーシーケンシング　ブライｖ　（Ｍ　１８　ｐｅｎｔａｄｅｃａｍｅｒｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ　ｐｒｉｍｅｒ）　にューイングランド　バイオラブズ）を利用するジデオキシ　チェインーターミ不イション法（ｄｉｄｅｏｘｙ　ｃｈａｉｎ−ｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｍｅｔｈｏｄ　）によって測定された。

受容体結合性検量法第１表と第２表に挙げたプラスミド類によってインコードされる遺伝子産物の結合性は、上記の一般原料と方法の項に記載され１こ、グロボシド受容体含有のＰＩ−赤血球とグロボシドを欠くｐ−赤血球とを用いるスライド凝集法によって測定された。

線毛抗原検量法精製Ｐａｐ線毛（８７）に対して生成する抗血清を利用するスライド凝集法は上記の一般原料と方法の項に記載し１このと同様にして行われ１こ。抗血清はＰＢＳ（ｐＨ７，５）に５００倍稀釈して使用された。

相補性分析用プラスミド誘導体の組立てプラスミドｐＰＡＰ４８は、　ａｍａｌ消化とこれにつづく低ＤＮＡ？！！度での連結によって得られるｐＰＡＰ５の誘導体である。このプラスミドはｐＰＡＰ５のＳｍａｌｌ−８ｍａ１４領域を欠いており（第１図）、シ１コがってｐａｐＥとｐａｐ　Ａの遺伝子のみをりする。

カットバック誘導体ｐＰＡＰ５０２を組立てる１こめに、プラスミドｐＤＯ５（第１図）をＢｇｌｌで完全に消化し、ＢａｍＨｌで部分的に消化し、次いでリリゲーション（、ｒｅｌｉｇａｔｉ○ｎ）され、ＨＢ　１０１に形質転換された。

プラスミドＤＮＡは形質転換細胞から分離され計算され１こサイズでスクリーニングされた。適切な大きさの一つのクローンｐＰＡＰ５０２をさらに分析し１こところ、予想どおりにｐａｐＧ遺伝子はなかっ１こ（第３図番照）。プラスミドｐＰＡＰ５０３は、ｌａｃプロモーターを何するｐ　５に８１０６由米のＥｃｏＲｌ−Ｈ１ｎｄ置”）ラグメントと、ＥｃｏＲｌ　とＢａｍＨＩとで消化されたｐＢＲ８２２に対してのｐＤｏ５の最も右側のＨｉｎｄ厘〜ＥａｍＨ１フラグメントとを連結することによって組立てられた。プラスミドｐＰＡＰ５０４は、ｐＰＡＰ　５０　Ｆ３をＥｇｌｌとＥａｍＨｉ　によって消化し、次いで低Ｄ　Ｎ　Ａ　濃度でリリゲーションすることによって得られ１こ。プラスミドｐＰＡＰ５０７は、アンピシリン耐性を選択し、血球凝集反応をスクリーニングするｐＰＡＰ５０３の唯一のＨｉｒ＋ａ　Ｉ座位にｐａｐ　Ａ　５ｐａｐＨおよびｐａｐ　Ｏと同等の遺伝子を胃するｐＤＣ５（７）Ｈｉｎｄｌフラグメントをクローニングすることによって組立てられた。

この中間体（ｐＰＡＰ５０６　）は次いでＥｇｌｌとＢａｍＨｌとで消化され、次いでｐＰＡＰ５０ｇからｐＰＡＰ５０４を朝立てる際と同様のしかたでリリゲイトされｐＰＡＰ５０７が得られた。

電子顕微鏡法電子顕微鏡法は、２％フオームバー（ｆｏｒ迅ｖａｒ　）の薄いフィルムで被覆された１００メツシュ銅グリッド付きＪＥＯＬ１００Ｅ顕微鏡を用いて行ツｔコ。祷菌をＩ　ＯｍＭ　Ｔｒｉｓ　ＨＯｌ（ｐＨ７，５）中１ζ再分散させ、１０　ｍＭ　Ｍｇ０１２　と前記グリッド上に置いた。過剰分を直ちにＰ紙で除去した。次いでグリッドを緩衝液で洗浄し、８．５５％のモリブデン酸アンモニウムで５秒間ネガティブ染色を行ない、再蒸留し１こ水で洗浄し１こ。

結果ｐＰＡＰ５の、ｐＤｏ５およびｐＰＩＩ、１０−８５との構造比較三つのプラスミドはすべてグロボシド−結合特異性をインコードすることを示した（第２表）。これらプラスミドの染色体挿入部分はいくつかの制限エンドヌクレアーゼによって地図が作成され１こ。フラグメントの大きさの小さな不一致でも検出しうるように、異なるプラスミドの制限酵素による消化物が７ガロースゲル電気泳動法による平行スロットで分析され１こ。第１図に示すように中央のＳｍａｌｌ−Ｋｐｎｌフラグメントは三つのプラスミド全部について同じ大きさく　４．６　ｋｂ　）である。ｐＰＡＰ５中ではこのフラグメントは、ｐａｐｏとｐａｐＤ遺伝子のみならず付加された遺伝子の一部の遺伝子情報を指定する。この中央のフラグメントの物理的地図には全く若異が認められなかった。

さらにｐＰＡＰ５中のｐａｐ　Ｃのコーディング領域（ｃｏｄｉｎｇｒｅｇｉＯｎ）由来で大きさがほぼ３７０ｂｐのＰｓｔｌ　７ラグメントは、ｐＤｏ５やｐＰＪＬｌｌｏ−８５中の同じサイズのＰｓｔ）フラグメントと雑種形成がなされる（　ｈ／ｂｒｉｄｉｚｅ　）。同様に、ｐａｐｏのＮ−ターミナル領域からの１２８ｂｐのＨｐａ　ｌフラグメントはｐＤｏ５やｐＰＩＬｌｌｏ−８５からの同じサイズのＨｐａｌルミｌルミｌフラグメントなされろ。これらの観察結果は、グロボシド−結合性遺伝子クラスターの中央領域は輸出および組立ての機能をインコードすると信じられ、高度に保存されている（　ｃｏｎｖｅｒｓｅｄ　）ことがわかる。

プラスミドｐＰＩＬ１１０−８５は、保存されたＳｍａｒｔ−Ｋｐｎｌ領域の左方向に延びる５、７ｋｂのＤＮＡフラグメントを有している。この領域はＦ７２線毛の構造遺伝子を取囲んでおり、ｐａｐＡと同等の位置を占めている。その制限座位相同性は、この領域では保存されていない（第１図）。まｒ、：ｐａｐＡの中央部からの２２１のヌクレオチドの長さのプローブは、ｐａｐＡのまさに５ ′部分が緊縮条件下で強く雑種形成したけれども、低い緊縮状態でさえもｐＰＩＬｌｌｏ−８５とのよりい雑種形成信号しか与えなかった。これは二っのビリン遺伝子の５′末端が高度に保存されていることを意味し、一方中央部は著しく分岐し１こようである。

ｐａｐＢのコーディング部から通常得られるＤＮＡプローブは、ｐＰＩＬｌｌｏ −３５の６．０　ｋｂ　Ｈｌｎｄｉ　７ラグメントとの強い雑種形成信号（ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ　ｓｉｇｎａｌ　）を与えた。このことは、この遺伝子が保存され、その二つのクローン中同じ位置に存在していることを示唆している。

三つの遺伝子ｐａｐＥ、　ｐａｐＦとｐａｐＧはｐＰＡＰ５のＳｍａｌｇ−ＥａｆｎＨＪフラグメントにあることが分かった。このフラグメントの制限パターンは、中央のＳｍａｌｌ−ｘｐｎｌよりもｐＤｏ　５およびｐＰ（ＬＩＩＯ−８５中では保存のでいとか少ない。ｐＰＡＰ５のＳｍａｌａ−ＥｇｌＮフラグメントはｐａｐＥ　、　１）ａｐ　ＦおよびｐａｐＧの５′末潟側の半分ををしている。このフラグメントをサザンプロッティング実験でプローブとして用いると、同じ強匣の信号が、分析された三つのプラスミド全部Ｉこ検出された。雑種形成するフラグメ：／トは三つのプラスミドの物理的地図中間等の位置を占めている。

一方、ｐａｐ　Ｇの８′末端側の半分を倉ず−るＢｇｌｌ　−８ｍａ　１４プローブはｐＰＡＰ５ＤＮＡで逢い（ｇ号を与えるが、低い緊縮条件でさえもｐＤＣ５もしくはｐＰ　ｉＬ　１１０−３’ＳＤＮ人とＭ種形成しない。これらの二つのプラスミドはこの領域からのｐａｐＧと類似のサイズを持つ蛋白をインコードするということに留意すべきである。まｔこそれらはｐａｐ　Ｇ領域にｐＰＡＰ５とは異なる、類似の制限パターンを汀するようである。

相同性と非相同性との間の境界線をより正確に定義する１こめに、ｐａｐＥ％ｐａｐ　Ｆおよびｐａｐ　Ｇの限定され１こ領域を有する多数のＭ１８クローンが用いられｊこ。ニックトランスレートされ１こｐＤｃ５とｐＰＩＬｌｌｏ−８５がプローブとして用いられた。

ｐａｐＥとｐａｐＦＤＮＡを合するＲｆ　１　Ｂプローブすべてについて陽性の雑種形成性が検出された。ｐａｐＧＤＮＡだけを有するＭ１３クローンはいずれも陽性の信号を勾えなかつｔコ。し１こがってｐａｐＥとｐａ、ｐ　ｌ”は保存されているが、ｐａｐ　Ｆの端部とｐａｐＧのスタート部との近傍において相同性の急激な低Ｆがある。

ミニ細胞における蛋白の表現ｐＰＡＰ５、ｐＤ０５およびｐＰ［，１１０−８５から表現される蛋白は、エシェリヒア・コリのミニ細胞中で（８）−メチオニンの標識が付けられており、その放射能で標１忌の付され１こ遺伝子産物は１５％５ＤＳ−ポリアクリルアミドゲル上で分析されｔコ。ｐＰＡＰ５のｐａｐＢとｐａｐ　Ａと類似の分子量の蛋白はｐＰＩＬｌｌｏ−３５からは表現され１こがｐＤｃ５からは表現されなかつｔこ。ｐＤＣ５とｐＰＩＬｌｌｏ−８５の両者は、ｐＩ’ＡＰ５のｐａｐ　Ｃとほぼ同じ位置１ζ位置しており、−っの蛋白７ｌ−７５Ｋを表現するこ七は分かつていた〔フレラグ・ニス　アンド　ジニイ・ゲイ・ピアース（（：！ｌｅｇｇ、　Ｓ、　ａ、ｎｄ　Ｊ、　Ｋ、　Ｐｉｅｒｃｅ　）。

”Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　（ｇｅｒ＋ｅｓ　ｒｅｓｐｏｎｓ：１−ｂｌｅ　ｆｏｒ　ｔｈｅｐｒｏａｕｃｔｉｏｎｏｆｍａｎｎｏｓｅｒｅｓｌｓｔａｎｔｆｊ−ｍｂｒｘａｅＯｆｕｒｏｐａｔｎｏｇｅｒ＋（−３ｉｃ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｊ−ａ　ｃｏｌｉ　１ｓｏｌａｔｅ”、インフエクション　アンド　イムニティ、第４２巻、１９８３年、第９００〜９０６頁、並ヒニハンＹイ、　フイラ（ｖａｎ　Ｄｉｅ、　Ｉ。

ｅｔａｌ）、“ＭＯｌｅｃｕｌａｒ　ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅｓｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｆ７２　ｆｉｍｂｒｉａｅ。

ｃａｕｓｉｎｇ　ｍａｎｎｏｓｅ　ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｈａｅｍａｇｇｌ、ｕｔｉｎａｔｉｏｎ＋　Ｏｆａ　ｕｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　０６　：に２　：Ｈｌ　：Ｆ７Ｓｊｒａｌ−ｎ−モレキュラー　アンド　ジェネラル　ジエ不ヂイソクス、第１９４巻、１９８４年、第５２８＝５３３頁〕。

ｐＤＣ！５とｐＰｉＩ、１１０−８５のｐａｐＯ遺伝子産物は、ｐＰＡＰ５のＰａｐＣ蛋白よりもわずかに低い分子量を汀する弱く表現されｔこ蛋白として出湯するが、一方ｐＤＯ５とｐＰ［Ｌｌｌｏ−４５の両者はＰａｐＤ蛋自と同じ分子量を有する蛋白を表現する。ｐＰ　ＩＬｌｌｏ−３５１こついで、この蛋白をインフードする遺伝子はｐａｐＤに対応する領域１こあることが分かつてい１コ（パン　ディ　アイら、　”Ｍｏ１ｅｃｕ１８ｒ　ｏｒｇａｎｉｓａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅｓｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｔｎｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｆ７２　ｆｉｍｂｒｉａｅ。

ｃａｕｓｉｎｇ　ｍａｎｎｏｓｅ　ｒｅｓｉｓｔ、ａｎｔ　１１ａｅｍａｇｇ１ｕｔｉｎａｔｉＯｎ、　ｏｆａ　ｕｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｌｃ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　０６　：に、２　：Ｈｌ　：　Ｆ７ｓｔｒａｉｎ　”、モレキュラー　アンド　ジェネラル　ジエ不ティックス、第１９４巻、１９８４年、第５２８〜５８８頁）。

ｐＰＡＰ５のＰａｐＥ蛋白は１６．５にの見掛けの分子量を督する。

ｐＤＯ５とｐＰＩＬｌｌｏ−３５中ｔζは同Ｑサイズの蛋白を検出できなかつ１こが、両プラスミドから表現されたわずかに小さい蛋白はこれらの遺伝子のクラスターのｐａｐＥ遺伝子産物であったのかも知れない。三つのプラスミド全部が、グロボシド結合には必須のｐａｐ　Ｆによってインコードされていることが知られている１５にの蛋白を表現し１こ。ｐＰＡＰ５（７）ＰａｐＧ蛋白は３５Ｋ。

のポリペプチドであり、ｐＤＯ５とｐｐｒＬｔｉｏ−ａｓの両者中にはわずかに分子量の大きい蛋白が見出された。ｐＤＯ５，ｐＰＡＰ５０２のＢｇｌｌ−ＢａｍＨＩカットバック誘導体は３６にのポリペプチドを表現しなかっ１こ。これは、ｐＰＡＰＳ中のｐａｐＧと同じ領域にこの蛋白の遺伝子を局在させている。

ｐＤ０５とｐｐＢ、ｔｔｏ−ａｓから高度１？Ｆｔ現され１：１７Ｋ（１１）ポリペプチドはこれらのプラスミドの末端のＦ３ｍＢ、（−ＢａｍＨｉフラグメント１こ与えられた（フレラグ・ニス　アンド　ジエイ・’ｙイーピｙ−ス、　” Ｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｇｅｎｅｓ　ｒｅｓｐｏｎｓｉｂｌｅｆｏｒ　ｔｈｅ　ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　ｍａｎｎｏｓｅｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｆｉｍｂｒｉａｅｏｆ　ａ　ｕｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃ　Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　１ｓｏｌａｔｅ　”、インフエクション　アンド　イムニティ、第４２巻、１９８３年。

第９００〜９０６頁、並びにパン　ディ、アイら、　”　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒｏｒｇａｎｉｚａｔｉｏｒ＊　ｏｆ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅｓ　１ｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅｐｒｏａｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｆ７２　ｆｉｍｂｒｉａｅ、　ｃａｕｓｉｎｇ　ｍａｎｎＯ８ｅ！ｒｅｓｉｓｔａｎｔ　ｈａｅｍａｇｇｌｕｔｉｎａｔｉＯｎ、　Ｏｆ　ａ　ｕｒｏｐａｔｈｏｇｅｎｉｃＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ　ｃｏｌｉ　０６　：に２　：Ｈｌ　：Ｆ７５ｔｒａｉｎ”、モレキュラー　アンド　ジェネラル　ジェ不ティックス、第１９４８゜１９８４年、第５２８−５３３頁）。ｐＰＡＰ５の構成はこの領域１こ同等のＤＮＡを欠いており、このｆこめ１７に蛋白はこれらのプラスミドもしくはｐＰＡＰ５０２からは表現されない。

ｐＰＡＰ５とｐＤｃ５．１：の遺伝子クラスター間の相補性（Ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔａｔｉｏｎ　）ｐＤＣ！５はｐａｐＣ，ｐａｐＤ、　ｐａｐＥおよびｐａｐ　Ｆ　に高度に相同のＤＮＡを葡するので、ｐＤ０５がｐＰＡＰ５中のｐａｐ　Ａによって相補されてｐａｐＡ線毛の形成をも１こらずならば問題が起こる。そのため、ｐａｐＢとｐａｐＡ遺伝子だけを汀し、ｐａｐＡ抗原を表面に局在することのできないｐＰＡＰ４３が作製された。このプラスミドを付するＨＢ　１０１もｐＤｃ５を仔する同じ菌株も抗線毛抗血清によって凝集しなかった。これらの適合性のみるプラスミドは両方とも、同じ綿胞中に存在するが、抗血清凝集法によって示されるように、ｐａｐ　Ａビリンは表面に局在してぃｔコ。重子顕微鏡によって、ｐａｐＡビリンが線毛の形態に組立てられたことが確認され１こ（データは示さず）。

ｐＰＡＰ４８もｐＤＯ５も単独では、ＨＥ　１０１に収容された際には表面に局在する線毛を表現しなかった。

アドヒシン機能も遺伝子クラスター間で相補されうるのがどうかを知るために、ｐＤＯ５の右端にあるＥｇｌｌｌ座位からＢａｍＨＩ座位トこかけてのＤＮＡを欠＜ｐＰＡＰ５０２が作製され１こ。ｐＤｃ！５と比較して、この誘導体はミニ細胞中に８６にと１７Ｋ（７）ｒｆｆリペプチドを表現できなかっ１こ。マツピインクおよび雑種形成データと一致して、３６にの蛋白がｐａｐ遺伝子クラスターのｐａｐ　Ｇによってインコードされるａ５Ｋｆ白に対応すると考えられる。

プラスミドｐＰＡＰ５０２は、ｐＤＣ５と著しく異なり、血球凝集性を伝達しなかっ１こ。ｐａｐ　Ｅ　、　ｐａｐＦおよびｐａｐＧｅｐＰＡＰ５中に表現するプラスミドのｐＰＡＰ１６を用いて、欠失誘導体ｐＰＡＰ５０２を相補して血球凝集性にすることはトランス配置では可能でみる。かくして、アドヒシン機能は一つの遺伝子クラスターからもうひとつの遺伝子クラスターにトランス相補することができる。このことは、ｐａｐＧ領域はクローン間では十分１こ保存されていないので警くべきことである。ｐＰＡＰ１６の、ｐａｐＥ　１　、　ｐａｐＦ　１およびｐａｐＧ１突然斐異体であるプラスミドｐＰＡＰ１８、ｐＰＡＰ１７およびｐＰＡＰ４（前記の一般原料と方法の項参照）はそれぞれ、ｐＰＡＰ　５０２丘の欠失を相補できなかった。ｌａｃプロモーターのコントロール下にある、ｐＤｏ５のＨｉｎｃｌ　ｉ−ＢａｍＨＩフラグメントを有するプラスミドｐＰＡＰ５０３も血球凝集できなかつ１こ。しかしｐＰＡＰ５０３はｐＰＡＰ５０２の欠陥を相補できた。これは両者のプラスミドを有する細胞によって陽性の血球凝集反応が得られたことによって分かつ１こ。予想通りに、ｐＰＡＰ５０８のＢｇｌｌ［−ＢａｍＨＩ欠失誘導体はこの相補を達成できなかっ１こ（第３表中のｐＰＡＰ５０４　）。これらのプラスミドは、ｐａｐミルミルクローンる補体突然要具（ｃｏｍｐｌｅｍｅｎｔ　ｍｕｔａｔｉｏｎ　）　ｔこ用いられ１こ。ｐＰＡＰ５０３は、Ｔｎ５挿入体全部をｐａｐＦとｐａｐＧにおいて相補し、一方力ソドパツク誘導体ｐＰＡＰ５０４だけはｐａｐ　Ｆにおいてこれらを相補した。ｐａｐＯ％　ｐａｌ）Ｄ　、　ＰａｐＢ　。

ｐａｐ　Ｆ遺伝子同等物をインコードするｐＤ０５誘導体のｐＰＡＰ５０７は、ｐａｐ　Ｆ遺伝子中にＴｎ５変異を胃するｐｓＮＯ２１を相補した。これらの結果は、ｐａｐ　ＦとｐａｐＧ遺伝子産物と機能が類似している蛋白は、ｐＤＯ５Ｊ：の対応する領域によってインコードされることを示す。この実施例ｆこおける実験から、ｐａｐＡ遺伝子と、ある程度ｐａｐ　Ｇ遺伝子は三つのエシェリヒア・コリ菌株に可変性（ｖａｒｉａｂｉｌｉｔｙ　）を示すが一方ｐａｐＦ遺伝子はほとんど可変性を示さないと結論することができる。ｐａｐＧもしくはｐａｐ　Ｆが特定の結合蛋白質の遺伝情報を指定するがどうかを決定することはできない。

第　２　表エシェリヒア・コリＵＴ工菌株類とそれらそれぞれのアドヒノンをインコードするプラスミドクローン類の特徴グロボシド結合特異性は、グロボシド受容体を育するＰｌ−赤血球の陽性スライド血球凝集法（ＨＡ）とグロボシドを欠＜ｐ−赤血球の陰性ＨＡによって測定され１こ。検査条件は、前記の一般原料と方法ｆこ記載し１このと同じである。Ｎ、Ｄ、：２１１定されなかつ１こことを意味する。

第３表ｐＰＡＰ５とｐＤＯ５とのｐａｐ遺伝子間の相補にＨＢ　１０１に収容され１こプラスミド変異における相補性を、前記の原料と方法並びに一般原料と方法に記載し１このと同様にしてＰｌ−赤血球のスライド血球凝集法によってモニターし１こ。

ｐａｐ、ＥｌとｐａｐＦ１突然度異はリンカ−挿入突然変異誘発法（１ｉｎｋｅｒ　１ｎｓｅｒｔｉｏｎ　ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）によってなされる非極性の突然変異である（前記の一般原料と方法参照）。ｐａｐ、Ｇ１突然変異はＳｍａ）４−ＥａｍＨｌフラグメントの欠失であり、これによってｐａｐ　Ｇ蛋白をＩＫまできりとる（前記の一般原料と方法参照）。Ｔｎ５突然変異ｐａｐＦ：：Ｔｎ５−０２１とｐａｐＧ：：Ｔｎ５−０４２がｐａｐＦとｐａｐＧ遺伝子それぞれにあることが分かつ１こ。

はｐＰＡＰ５誘導体である。左欄のプラスミドはｐＥＲ’３２２　（１）ＭＢＩ）レブリ：＋ンをＨし、一方、と段の欄にあるプラスミドはｐＡＯＹＯ１８４（ｐ１５Ａ）レプリコンを胃する。角括弧〔〕円の遺伝子は、ｐＰＡＰｓ中の対応するｐａｐｌ伝子と同等のｐＤＯ５である。

実施例９エシェリヒア・コリの臨床単離物の雑種形成この実施例Ｉこ用いられた原料と方法細菌菌株とプラスミド試料は、重症の細菌尿症の患者の尿（＞ｌ　Ｏ５細菌／ｍｌ）から収集し１こエシェリヒア・コリの６６のアイソレイト、および健康な個体から得られた９６の糞便のエシェリヒア・コリ　アイソレイトで構成されていた。プラスミドｐＰＡＰ５は、全ｐａｐ遺伝子クラスターを膏するエシェリヒア・コリＪ９６（０：４）白米のａＸｋｂの大きさのＥｃｏＲｌ−ＢａｍＨｌフラグメントを葡する。その遺伝子構成を第２図に示す。プラスミドｐＤＣ５は泌尿器病原性エシェリヒア・コリ菌株ＩＡ２（０：６）のグロボシド特異性アドヒシンの遺伝情報を指定する。これらの二つのプラスミドがｐａｐミルミル子クラスター要部分にわ１こって広い相同性を示すことが最近判明しｔコ。しかしｐａｐ　Ｇ遺伝子白米のｐＰＡＰ５のＤＮＡはｐＤＯ５と雑種形成しなかった。ＤＮＡ配列法（Ｄ　Ｎ　Ａ　ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ）　ｔコよって、二つのクローンのｐａ−ｐＧ遺伝子間に大きな差異のあることが確認され１コ〔ルンドら（Ｌｕｎｄ　ｅｔ　ａｌ）未発表〕。

児全な培地は、培地Ｆと０．２％グ・レコースとを補充しｔこベルタニ（Ｂｅｒｔａｎｉ　）のルリアブロス培地であっｔこ、、細菌は３７°Ｃで振禮しながら培養されｊ、：っグルコース４ζしのルリアブＯスエガープレートを皿球凝集検査にｆ７−１い１：。

受蚕体−結合性の検査ジガラクトンド債合性の同定のためｆこ、グルコースなしのルリアブロスエガー七で２２時間培養され１こエシェリヒア・コリ咄菌■、泡カ、ジガラクトシド受容体で被覆され１こラテックスビーズの溶液中に再分散されＴコ。その細胞は、１分間以内にビーズを凝集させるならばアドヒシンを表現するとみなし１こ。

染色体Ｄ　Ｎ　Ａ　Ｏ）製造各＠菌のアイソレイトは、１００ｑ？ＬＢ培地中で４ｘ１０／ｃｅｌｌ、／／まで培養され１こ。その細菌を遠心分離で収集し、４゜＋ｇｌＰＢＳ（１００ｍＭ　リン酸カリウノ・緩衝液、ｐ王（７，２，１５０ｍＭ　Ｎａ１１　＞甲１こ分散させ、再遠心分離に付し１．５　ｙｇｌ　Ｐ　Ｂ　Ｓ　”。

０、Ｌ！’９／ｍｌプロテイナーゼＫ、５ｍＭＥＤＴＡおよび０．５％５ＤＳ（ドデシル硫酸ナトリ・クム）中に分散させｆ、＋ｏその分散液を一夜室温で＠養し１、最後にフェノールで抽出シフ、エタノールでα澱させ、これを２買繰返し１こ。

””Ｐ　−４射能標識されｆニー　Ｄ　Ｎ　Ａフラグメントの製造プラスミドｐＰＡＰ５とｐＤＯ５が適当な制限酵素で消化され、］）　Ｎ　Ａフラグメントが精製され、ニックトランスレーション法で８２Ｐ標識を行つ１こ。

プロッティングと雑種形成の手順ドットーブＤ　ット法（ｄｏｔ−ｂｌｏｔ　ｐｒｏｃｅｄｕｒｅ）にしたがって行１）１こ。２１１！の染色体Ｄ　Ｎ　Ａを１７０μでの０．　Ｉ　Ｍ　ＦリスｍｉＨ（ｐＨ７、４）　ｌこ溶解した。８０１１ｇの２Ｍ　ＮａＯＨと１００μ ＃の３Ｍ　Ｎａ１１−０，８Ｍクコン酸ナトリウムを添１１ＤＪｔ、配合物を８０°Ｃで２０分１ハ）培養し１こ。その変性Ｊ）　Ｎ　Ａ　１．！冷却され、４０μｌの２Ｍト！Ｊス緩衝液（Ｉ汀ｉ７）で中和され、ニトロヤルロース゛、フィルター１−の７−の区域１こ吸引さｔｌｌ、風乾され、ＭＢＥ　下６５°Ｃで１２ｈ丁ベイクされｔこ。これらのフィルターを１０×デンハルト（Ｄｅｎｈａｒｄｔ　）　（′ｊ’ンハルトー＝０．０２％２ごリビニルビロリドン、００２％フィ：ｌ−ル（Ｆｉｃｏｌｌ　）、０．０２％ＢＳＡ　）中、２ｈｒ培養され１こ。それらをもう一度、４ＸＳＳＣ。

０．１％ＳＤＳ、２ｍＭ　ＥＤＴＡ、、１０Ｘデ、、／　ハ）’、ｒ　ｌ、、お、よび５ｏ　ｌノ９／算ｌの小牛胸線ＤＮＡ　（９５°Ｃで３分間加熱）を含有する溶液中で、１　ｈｒ　６５°Ｃで培養され１こ。Ｉ辱後ｔこぞれらは、前記しｔ＝のと同じ溶液中の放射能標識され１．＝プローブとともに１６ｈｒ１６° Ｃで給養し、４　×Ｓ　Ｓ　Ｃで２×５分間および２×ＳＳＣで２×２０分間６０°Ｃで洗浄し、次いで風乾しｆコ。得られｆこフィルムは、増感フイルノ・付きの一チ゛ユボンクロ不ソクス４エックス線フィルＡｌこ一７０°Ｃ″′７：′ 露光され欠いて為現像され１こ。

第４表ＭＲアドヒシン類と、ｐａｐＥ、ｐａｐＦおよびｐａｐＧＤＮＡへの雑種形成の分布第４表続き（１）第４表続き（２）第４表続き（３）以下余白第４表続き（４）第４表続き（５）第４表続き（６）第４表続き（７）菌株番号　１　ア　ド　Ｌ′　シ　ン　類　Ｉ　ＤＮＡ翅楠形成プローブ第４表続き（８）この研究に用いられ１こエシェリヒア・コリ　アイソレイトについての雑種形成血球凝集性の結果アイソレイト尿　糞便Ｐ−ｓｐｅｃ　ＭＲＨＡ１７　４ｐ−８ｐｅＣＭＲＨＡ　７　８Ｚ−５ｐｅＣＭＲＩ（Ａ　１０　３Ｔｏｔａｌ　ＭＲｍ　３４１ＯＮｏｎ　ｈｉＲＨＡ　８２８６尿細菌　糞便細菌（６６ｓｔ）　（９６５ｔ）２Ｚ種形成結果Ｐａｐ　Ｅ、Ｆ　Ｐａｐ　Ｇ　Ｐａｐ　Ｅ、Ｆ　Ｐａｐ　ＧｐＰＡＰ５　ｐＤｃ５　ｐＰＡＰ５　ｐＤＣ５Ｐ−ｓｐｅｃＭＲＨＡ　１６１１６１４０８１ｐ−ｓｐｅｃＭＲＨＡ　３４４　ａ　３０２１Ｚ−ｓｐｅｃＭＲＨＡ　８２７３１２１２Ｔｏｔａ１ＭＲＨＡ　２７７２７７８２６４ＮｏｎＭＲＨＡ　０３２　Ｂ　２９２８４９７７菌株合計＠　２７３９　ＢＯ３６１０８６１５８１ラテックスビーズ陽性　２６　０　２４　２　５ラテックスビーズ陰性　１３９６３４５Ｐ− ８ｐｅＣＭＲＨＡ　：動物の赤血球をも凝集させる菌株を含む。

ｐ　５ｐｅＣＭＲＨＡ　：ヒトｐ−血液を凝集させる赤血球Ｚ−ｓｐｅｃ　ＭＲＨＡ　：ヒト赤血球には全く血球凝集を起こさないが、次の動物：豚、山羊、雌牛の赤血球のいずれにも血球凝集を起こす。

この実施例で得られ１こ結果は、ジガラクトシドに結合するエシェリヒア・コリ菌株の多数の臨床アイソレイト（単離物）がそれらのｐａｐミルオペロン％ＦおよびＧ領域を胃すること、並びにジガラクトシドに結合しない菌株はそのオペロン中に他の領域を有するけれどもｐａｐミルオペロン％ＦおよびＧ領域を有していないことを示す。

国際調査報告１＋葎＋ｙ１１１ｅａｌＡａ６ｈｃａＭ＋ＮｏρｒＴノｌ’ｌｋ’Ｒ’ｉ／ｎ１１ｎムへＩ、、１．、ｊＮ６ＭＩ　ＡＩａｌｌｅ＆ｍ＊　ｍ、ＰＣＴ／ＤＫＢ５７０００１５ｌＭｖｐｓａ＋ｌａＭ１＾−−ｍ−”・　ＰＣＴ／ＤＫ８５１０００４５

Claims

【特許請求の範囲】

１．その免疫感作を行う主要な構成要素として、アドヒシンポリベプチドもしくはその免疫原性的に活性な部分配列もしくは免疫学的に活性な形態に変換しうるその前駆体の、抗原決定基からなり、その抗原決定基に対する抗体が、哺乳動物の組織と接合する病原性のアドヒシン形成細菌によって産生されたアドヒシンポリベプチドと反応する抗原。
２．少なくとも五つのアミノ酸のアミノ酸配列とアドヒシンポリペプチドの全アミノ酸配列までからなる請求の範囲第１項による抗原。
３．哺乳類の組織細胞上の炭水化物もしくは蛋白の受容体、または哺乳類の赤血球と結合する請求の範囲第１項または第２項による抗原。
４．炭水化物受容体と結合する請求の範囲第３項の抗原。
５．ジガラクトシド含有のグリコリピドもしくはグリコプロテインと結合する請求の範囲第４項の抗原。
６．アドヒシン形成細菌由来の請求の範囲第１〜５項のいずれひとつによる抗原。
７．細菌が、泌尿器病原性もしくは腸内病原性菌株の、エシエリヒア・コリ、もしくは他の腸内細菌もしくは口内細菌、ネイセリア・ゴノルホエ、ネイセリア・メニンギデイテイス、ネイセリア・キヤタルハリス、イエルシニア・エスピーピー、スードモナス・エルギノーサもしくは他のスードモナス・エスピーピー、モラキセラ・ボビスもしくは他のモラキセラ・エスピーピー、バクテロイデス・ノドスス、スタフイロコッカス、エスピーピー、ストレプトコッカス・エスピーピー、またはボルデテラ・ペルツシスのごときボルデテラ・エスピーピーである請求の範囲第６項による抗原。
８．アドヒシンポリペプチドが線毛アドヒシンポリペプチドである請求の範囲第１〜７項のいずれかひとつによる抗原。
９．線毛アドヒシンポリペプチドが少量の線毛成分である請求の範囲第８項による抗原。
１０．病原性の線毛形成細胞由来のものである請求の範囲第９項による抗原。
１１．細菌が泌尿器病原性もしくは腸内病原性菌株のエシエリヒア・コリ、ネイセリア・ゴノルホエ、ネイセリア・メニンギデイテイス、ネイセリア・キャタルハリス、モラキセラ・ボビスもしくは他のモラキセラ・エスピーピー、またはボルデテラ・ペルツシスである請求の範囲第１０項による抗原。
１２．病原性菌株のエシエリヒア・コリが泌尿器病原性菌株である請求の範囲第１１項による抗原。
１３．下記アミノ酸配列：【配列があります】【配列があります】またはその免疫原性的に活性な部分配列のいずれかを有する請求の範囲第１〜１２項のいずれかひとつによる抗原。
１４．下記アミノ酸配列：【配列があります】またはその免疫原性的に活性な部分配列のいずれかを有する請求の範囲第１〜１．２項のいずれかひとつによる抗原。
１５．下記アミノ酸配列：【配列があります】またはその免疫原性的に活性な部分配列のいずれかを有する請求の範囲第１〜１２項のいずれかひとつによる抗原。
１６．線毛の他の成分を実質的に含有しない請求の範囲第８〜１５項のいずれかひとつによる抗原。
１７．実質的に純粋な形態である請求の範囲第１〜１６項のいずれかひとつによる抗原。
１８．請求の範囲第１〜１７項のいずれかひとつに定義された抗原に対して生成するか、または実質的にこの抗原に対してのみ生成する抗体。
１９．請求の範囲第１〜１７項のいずれかひとつに定義された抗原で、免疫化されうる動物を免疫にすることによって得られる請求の範囲第１８項による抗体。
２０．実質的に純粋な形態である請求の範囲第１８項また第１９項による抗体。
２１．免疫化されうる動物が請求の範囲第１〜１７項のいずれかひとつに定義された抗原で免疫化され、次いでその動物から抗血清が得られる請求の範囲第１８項または第１９項の抗体の製造方法。
２２．免疫化が請求の範囲第１〜１７項のいずれかひとつに定義された抗原の安定化された水溶液で行われる請求の範囲第２１項による方法。
２３．安定化剤が緩衝液または補助剤である請求の範囲第２２項による方法。
２４．補助剤がフロイントの補助剤もしくは水酸化アルミニウムである請求の範囲第２３項による方法。
２５．請求の範囲第１〜１７項のいずれかひとつに定義された抗原に対して生成する抗体を産生するハイブリドーマ細胞クローンが適切な増殖培地で培養され、形成された抗体が培養物から回収される請求の範囲第１８項の抗体の製造方法。
２６．抗体をインコードする単一もしくは複数の遺伝子がバイプリドーマ細胞クローンから適切なベクターに転移され、そのハリブリッドベクターが適切な細菌宿主に形質転換され、その宿主が適当な培地で培養され、抗体が培養物から回収される請求の範囲第２５項による方法。
２７．細菌宿主がエシエリヒア・コリまたはバチルス・ズブチリスである請求の範囲第２６項による方法。
２８．任意に適切な担体に結合された請求の範囲第１〜１７項のいずれかひとつの抗原の免疫原性的有効量と免疫学的に受容な賦形剤とを含有する、哺乳類の組織に接合する病原性細菌によって起こる疾病に対して哺乳類を免疫化するためのワクチン。
２９．担体が生理的な受容なポリマーである請求の範囲第２８項によるワクチン。
３０．任意に適切な担体に結合された請求の範囲第１〜１７項のいずれかひとつの抗原の免疫原性的有効量が免疫学的に受容な賦形剤と合せられる請求の範囲第２８項また第２９項のワクチンの製造法。
３１．抗原が少なくとも五つのアミノ酸のアミノ酸配列からなり、担体がそのアミノ酸配列が共有結合的に結合される生理的に受容なポリマーである請求の範囲第３０項による方法。
３２．請求の範囲第１〜１７項のいずれかひとつに定義された抗原をインコードするヌクレオチド配列が生理的に受容な担体のポリペプチドをインコードするヌクレオチド配列に融合され、その融合されたＤＮＡ配列が適切なベクターに挿入され、そのハイブリッドベクターが適切な細菌宿主に形質転換され、その宿主が適切な媒体中で培養され、そしてその融合されたポリペプチドが培養物から回収される請求の範囲第３０項による方法。
３３．請求の範囲第１項に定義された抗原をインコードするヌクレオチド配列を少なくとも有し、好ましくはそのＤＮＡフラグメントが他のいずれの抗原もインコードしないＤＮＡフラグメント。
３４．全アドヒシンポリペプチドをインコードするヌクレオチド配列からなる請求の範囲第３３項によるＤＮＡフラグメント。
３５．免疫原性的に活性な形態に変換しうる、アドヒシンポリペプチドの前駆体をインコードするヌクレオチド配列からなる請求の範囲第３３項によるＤＮＡフラグメント。
３６．アドヒシンポリペプチドの免疫原性的に活性な部分配列をインコードするヌクレオチド配列からなる請求の範囲第３３項によるＤＮＡフラグメント。
３７．少なくとも５ドンの長さを有する請求の範囲第３３〜３６項のいずれかひとつによるＤＮＡフラグメント。
３８．アドヒシン形成細菌由来である請求の範囲第３３〜３７項のいずれかひとつによるＤＮＡフラグメント。
３９．泌尿器病原性もしくは腸内病原性の、エシエリヒア・コリもしくは他の腸内細菌もしくは口内細菌、ネイセリア・ゴノルホエ、ネイセリア・メニンギデイテイス、ネイセリア・キヤタルハリス、イエルシニア・エスピーピー、スードモナス・エルギノーサもしくは他のスードモナス・エスピーピー、モラキセラ・ボビスもしくは他のモラキセラ・エスピーピー、バクテロイデス・ノドスス、スタフイロコッカス・エスピーピー、ストレプトコッカス・エスピーピー、またはボルデテラ・ペルツシスのごときボルデテラ・エスピーピー由来である請求の範囲第３８項によるＤＮＡフラグメント。
４０．アドヒシンポリペプチドが線毛アドヒシンポリペプチドである請求の範囲第３３〜３７項のいずれかひとつによるＤＮＡフラグメント。
４１．線毛アドヒシンポリペプチドが少量の線毛成分である請求の範囲第４０項によるＤＮＡフラグメント。
４２．病原性の線毛形成細菌由来である請求の範囲第３３〜４１項のいずれかひとつによるＤＮＡフラグメント。
４３．細菌が泌尿器病原性もしくは腸内病原性菌株のエシエリヒア・コリ、ネイセリア・ゴノルホエ、ネイセリア・メニンギデイテイス、ネイセリア・キヤタルハリス、モラキセラ・ボビスもしくは他のモラキセラ・エスピーピーまたはボルデテラ・ベルスシスである請求の範囲第４２項によるＤＮＡフラグメント。
４４．病原性菌株のエシリヒア・コリが泌尿器病原性の菌株である請求の範囲第４３項によるＤＮＡフラグメント。
４５．下記ＤＮＡ配列：【配列があります】または、表現される際に、全ＤＮＡ配列によってインコードされるアドヒシンポリペプチドの免疫原性的に活性な部分配列を構成する、そのいずれかの部分配列を有する請求の範囲第４４項によるＤＮＡフラグメント。
４６．下記配列：【配列があります】または、表現される際に、全ＤＮＡ配列によつてインコードされるアドヒシンポリペプチドの免疫原性的に活性な部分配列を構成する、そのいずれかの部分配列を有する請求の範囲第４４項によるＤＮＡフラグメント。
４７．下記ＤＮＡ配列：【配列があります】または、表現される際に、全ＤＮＡ配列によってインコードされるアドヒシンポリペプチドの免疫原性的に活性な部分配列を構成する、そのいずれかの部分配列を有する請求の範囲第４４項によるＤＮＡフラグメント。
４８．請求の範囲第１項に定義された抗原をインコードするヌクレオチド配列を少なくとも有し実質的に他のいずれの抗原もインコードしないＤＮＡフラグメントが挿入されて含有するハイブリッドベクターを収容する細菌宿主が培養され、次いでそのＤＮＡフラグメントから表現される産物を回収し、次いで任意に精製される、その免疫感作を行う主要な構成要素としてアドヒシンポリペプチドの抗原決定基を有する抗原の製造方法。
４９．アドヒシンポリベプチドもしくはその免疫原性的に活性な部分配列もしくは免疫学的に活性な形態に変換しうるその前駆体からなる第一ポリペプチドをインコードするＤＮＡフラグメントが、第二ポリペプチドをインコードするＤＮＡ配列に融合され、その融合されたＤＮＡ配列が適切な細菌宿主に挿入され、その宿主が適当な培地で培養され、融合ポリペプチドがその培養物から回収され、第二ポリペプチドに対する抗体を使う分析法を用いて精製され、そして第二ポリペプチドが、適切なプロテアーゼによって任意に分割され次いで二つのポリペプチドに分離される、請求の範囲第４８項による方法。
５０．第二ポリペプチドをインコードするＤＮＡ配列がβ−ガラクトシダーゼをインコードするｌａｃＺ遺伝子である請求の範囲第４９項による方法。
５１．ＤＮＡフラグメントが請求の範囲第３３〜４７項のいずれかひとつのＤＮＡフラグメントである請求の範囲第４８〜５０項のいずれかひとつによる方法。
５２．ポリペプチドもしくはその免疫原性的に活性な部分配列がペプチド合成法で製造される、その免疫化を行う主要な構成要素としてアドヒシンポリペプチドの抗原決定基を有する抗原の製造方法。
５３．アドヒシンポリペプチドが線毛アドヒシンポリペプチドである請求の範囲第５２項による方法。
５４．合成されるポリペプチドが少なくとも五つのアミノ酸の長さを有する請求の範囲第５２項または第５３項による方法。
５５．ポリペプチドが固相ペプチド合成法によって製造される請求の範囲第５２〜５４項のいずれかひとつによる方法。
５６．最初のアミノ酸が合成中にカップリングされる担体が、請求の範囲第２８項または第２９項によるワクチン中の抗原の担体として有用な生理的に受容なポリマーである請求の範囲第５５項による方法。
５７．任意に適切な担体に結合された請求の範囲第１８〜２０項のいずれかひとつによる抗体の免疫学的に有効な量と、免疫学的に受容な賦形剤とからなる、哺乳類の組識に接合する病原性細菌によって起こる疾病に対する哺乳類の受動免疫用組成物。
５８．担体が生理的に受容なポリマーである請求の範囲第５７項による組成物。
５９．任意に適切な担体に結合された請求の範囲第１８〜２０項のいずれかひとつによる抗体の免疫学的に有効な量が免疫学的に受容な賦形剤と合せられている請求の範囲第５７項または第５８項による組成物。
６０．請求の範囲第１８〜２０項のいずれかひとつによる抗体からなる診断剤。
６１．抗体が、線毛アドヒシンポリペプチドの免疫原性抗原決定基に対する抗体である請求の範囲第６０項による診断剤。
６２．請求の範囲第１〜１７項のいずれかひとつに定義された抗原以外の、免疫原性抗原決定基に対する抗体からなる診断剤。
６３．アドヒシン遺伝子クラスターによってインコードされる他のポリペプチドに対する抗体からなる請求の範囲第６２項による診断剤。
６４．抗体が他の線毛ポリペプチドに対する抗体である請求の範囲第６３項による診断剤。
６５．検出されるべき細菌中のＤＮＡ配列と少なくとも約６０％が相同である、安定で標識の付されたＤＮＡ配列からなる診断剤。
６６．ＤＮＡ配列が少なくとも１２のヌクレオチドの長さを有する請求の範囲第６５項による診断剤。
６７．放射能標識試薬で標識が付される請求の範囲第６５項または第６６項による診断剤。
６８．ＤＮＡ配列が、アドヒシン遺伝子クラスターの一部であるがアドヒシンポリペプチド自体をインコードしない遺伝子またはその診断的に有効な部分配列からなる請求の範囲第６５〜６７項のいずれかひとつによる診断剤。
６９．ＤＮＡ配列が、線毛アドヒシンポリペプチドではなく病原性線毛形成細菌によって産生された線毛ポリペプチドの遺伝情報を指定する遺伝子、またはその診断的に有効な部分配列からなる請求の範囲第６８項による診断剤。
７０．線毛ポリペプチドをインコードするＤＮＡ配列またはその部分配列が泌尿器病原性エシエリヒア・コリ由来のものである請求の範囲第６９項による診断剤。
７１．ＤＮＡ配列が、この明細書に定義された遺伝子ｐａｐＣまたはその診断的に有効な部分配列からなる請求の範囲第７０項による診断剤。
７２．ＤＮＡ配列が、この明細書に定義された遺伝子ｐａｐＤまたはその診断的に有効な部分配列からなる請求の範囲第７０項による診断剤。
７３．ＤＮＡ配列が、この明細書に定義された遺伝子ｐａｐＢまたはその診断的に有効な部分配列からなる請求の範囲第７０項による診断剤。
７４．任意に適切な担体に結合された請求の範囲第１〜１７項のいずれかひとつによる抗原の免疫原性的有効量を含有するワクチン、または任意に適切な担体に結合された請求の範囲第１８〜２０項のいずれかひとつによる抗体を含有しかつ免疫学的に受容な賦形剤を有する組成物を投与することからなる、哺乳類の組織に接合する病原性のアドヒシン形成細菌によって起こる疾病に対して哺乳類を免疫化する方法。
７５．細菌が、泌尿器病原性もしくは腸内病原性菌株の、エシエリヒア・コリもしくは他の腸内細菌もしくは口内細菌、ネイセリア・ゴノルホエ、ネイセリア・メニンギデイテイス、ネイセリア・キャタルハリス、イエルシニア・エスピーピー、スードモナス・エルギノーサもしくは他のスードモナス・エスピーピー、モラキセラ・ボビスもしくは他のモラキセラ・エスピーピー、バクテロイデス・ノドスス、スタフイロコッカス・エスピーピー、ストレプトコッカス・エスピーピー、またはボルデテラ・ペルッシスのごときボルデテラ・エスピーピーである請求の範囲第７４項による方法。
７６．病原性細菌が線毛形成細菌である請求の範囲第７５項による方法。
７７．病原性細菌が、泌尿器病原性もしくは腸内病原性菌株の、エシエリヒア・コリ、ネイセリア・ゴノルホエ、ネイセリア・メニンギデイテイス、ネイセリア・キヤタルハリス、モラキセラ・ボビスもしくは他のモラキセラ・エスピーピー、またはボルデテラ・ペルツシスである請求の範囲第７６項による方法。
７８．宿主からの組織の試料を受容体−特異性ポリペプチドで処理し、未結合の受容体−特異性ポリペプチドを除去し、結合した受容体−特異性ポリペプチドを測定することからなる、ヒトのごとき宿主哺乳類における受容体密度もしくは分布を測定する方法。
７９．受容体−特異性ポリペプチドがアドヒシンポリベプチドである請求の範囲第７８項による方法。
８０．アドヒシンポリベプチドが、泌尿器病原性菌株のエシエリヒア・コリのアドヒシンポリペプチドである請求の範囲第７９項による方法。
８１．特定の病原性細菌の感染が防止されるよう細胞表面にアドヒシンポリペプチドを分布させるために、１以上のアドヒシンポリペプチドでヒトもしくは他の哺乳類を処理することからなり、使用されるアドヒシンポリペプチドが、病原性細菌によって生成されたアドヒシンの結合する受容体と結合するアドヒシンポリペプチドである、ヒトもしくは他の哺乳類が病原性のアドヒシン結合性微生物に感染する可能性を防止もしくは減少させる方法。