FI104638B - Menetelmä flagelliinifuusioproteiinin, sitä koodaavan geenin ja mikro-organismin valmistamiseksi - Google Patents

Menetelmä flagelliinifuusioproteiinin, sitä koodaavan geenin ja mikro-organismin valmistamiseksi Download PDF

Info

Publication number
FI104638B
FI104638B FI905441A FI905441A FI104638B FI 104638 B FI104638 B FI 104638B FI 905441 A FI905441 A FI 905441A FI 905441 A FI905441 A FI 905441A FI 104638 B FI104638 B FI 104638B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
flagellin
epitope
recombinant
gene
protein
Prior art date
Application number
FI905441A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI905441A0 (fi
Inventor
William Robert Marjarian
Salete Maria Cardozo Newton
Bruce Arnold Dunbar Stocker
Original Assignee
Univ Leland Stanford Junior
American Cyanamid Co
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Univ Leland Stanford Junior, American Cyanamid Co filed Critical Univ Leland Stanford Junior
Publication of FI905441A0 publication Critical patent/FI905441A0/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI104638B publication Critical patent/FI104638B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
    • C07K14/445—Plasmodium
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/735—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a domain for self-assembly, e.g. a viral coat protein (includes phage display)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2730/00—Reverse transcribing DNA viruses
    • C12N2730/00011—Details
    • C12N2730/10011—Hepadnaviridae
    • C12N2730/10111—Orthohepadnavirus, e.g. hepatitis B virus
    • C12N2730/10122—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Description

1 104638
Menetelmä flagelliinifuusioproteiinin, sitä koodaavan geenin ja mikro-organismin valmistamiseksi
Esillä oleva keksintö kohdistuu menetelmään fuu-: 5 sioproteiinin ilmentämiseksi ja valmistamiseksi, joka pro teiini käsittää ensimmäisen epitoopin, jota koodaa Salmonellan tai Shigellan flagelliinin rakennegeeni ja ainakin yhden heterologisen organismin epitoopin, joka organismi on muu kuin se organismi, josta ensimmäinen epitooppi on 10 peräisin ja joka epitooppi ei oleellisesti ole sama kuin flagelliinigeenin koodaama epitooppi ja jonka flagel-liiniosan oleellinen antigeenisuus säilyy. Keksintö koskee myös menetelmää fuusioproteeinia koodaavan yhdistelmägee-nin ja sitä sisältävän nukleiinihappokloonin valmistami-15 seksi sekä menetelmää mainitun geenin sisältävän mikro-organismin valmistamiseksi.
Keksinnön tausta
Yhdistelmä-DNA-tekniikka ja geenien ilmentäminen
Yhdistelmä-DNA-tekniikkaan kuuluu spesifisten DNA-20 jaksojen liittäminen DNA-kantajaan (vektoriin) sellaisen yhdistelmä-DNA-molekyylin muodostamiseksi, joka kykenee lisääntymään isäntäsolussa. Liitetty DNA-jakso on yleensä vastaanottavan DNA-kantajan suhteen vierasta DNA:ta, ts. liitetty DNA-jakso ja DNA-vektori ovat peräisin organis-y 25 meistä, jotka eivät luonnossa vaihda keskenään geneettistä informaatiota, tai liitetty DNA-jakso voi olla kokonaan tai osittain synteettisesti valmistettua. On kehitetty useita yleisiä menetelmiä, joiden avulla yhdistelmä-DNA-molekyylien konstruointi voidaan suorittaa.
30 Huolimatta siitä, mitä konstruointimenetelmää käy- ’ tetään, täytyy yhdistelmä-DNA-molekyylien olla yhteen- sopivia isäntäsolun kanssa, ts. kykeneviä lisääntymään ’ itsenäisesti isäntäsolussa tai liittyneitä pysyvästi isän täsolun yhteen tai useampaan kromosomiin tai plasmidiin. 35 Yhdistelmä-DNA-molekyylillä tulisi olla edullisesti mark- t 2 104638 keritoiminto, jonka avulla haluttu(tut) yhdistelmä-DNA-molekyyli(t) voidaan selektoida. Jos lisäksi yhdistelmä-vektorissa kaikki asianmukaiset replikaatio-, transkriptio- ja translaatiosignaalit ovat järjestyneet oikein, 5 vieras geeni ilmenee tarkoituksenmukaisella tavalla esim. transformoiduissa bakteerisoluissa bakteeriperäisten il-mentämisplasmidien ollessa kyseessä tai permissiivisissä solulinjoissa tai isäntäsoluissa, jotka on infektoitu yh-distelmäviruksella tai joissa on asianmukaisen replikaa-10 tioalkukohdan omaava yhdistelmäplasmidi.
Erilaiset geneettiset signaalit ja prosessointi-tapahtumat ohjaavat geenien ilmentymisen kuten DNA:n transkription ja lähetti-RNA:n (mRNA:n) translaation tasoja. DNA:n transkriptio riippuu siitä, että saatavilla on 15 promoottori, joka on RNA-polymeraasin sitoutumista ohjaava ja siten mRNA:n synteesiä edistävä DNA-jakso. Eu-karyoottien promoottorien DNÄ-jaksot eroavat prokaryoot-tien vastaavista jaksoista. Eukaryoottien promoottorit ja niihin liittyvät geneettiset signaalit saattavat lisäksi 2 0 jäädä tunnistamattomiksi tai toimintakyvyttömiksi prokary- oottisessa systeemissä ja prokaryoottien promoottorit jäävät tämän lisäksi tunnistamatta ja toimintakyvyttömiksi eukaryoottisoluissa.
Samoin mRNA:n translaatio prokaryooteissa riippuu - Γ 25 asianmukaisten prokaryoottien signaalien läsnäolosta ja nämä signaalit eroavat eukaryoottien signaaleista. mRNA:n tehokas translaatio prokaryooteissa vaatii mRNA.-ssa olevan ribosomien sitoutumiskohdan, jota kutsutaan Shine-Dalgarno (S/D) -jaksoksi [Shine, J. ja Dalgarno, L., (1975) Nature 30 254, 34 - 38] . Tämä jakso on mRNA:n lyhyt nukleotidi jakso, joka sijaitsee ennen aloituskodonia, joka on tavallisesti AUG ja joka koodaa tämän proteiinin aminoterminaalisessa päässä olevaa (formyyli)metioniinia. S/D-jaksot ovat komplementaarisia 16S rRNA:n (ribosomaalisen RNA:n) 3'-pään i 35 suhteen ja ne luultavasti edistävät mRNA:n sitoutumista 4 a 3 104638 ribosomeihin liittymällä dupleksiksi rRNAm kanssa siten, että ribosomi asettuu oikein [Shine, J. ja Dalgarno, L., (1975) Nature 254, 34 - 38].
Kloonatun geenin ilmenemisen onnistuminen vaatii 5 riittävää DNA:n transkriptiota, mRNA:n translaatiota ja joissakin tapauksissa proteiinin translaation jälkeistä modifiointia. Ilmentämisvektoreita on käytetty geenien ilmentämiseen aktiivisen promoottorin ohjaamina sopivassa isännässä ja niitä on käytetty proteiinien tuoton kohotta-10 miseen.
Rokotteet:
Rokotteiden kehittäminen virusten, bakteerien, sienten tai loisten aiheuttamien tautien ehkäisy muodostaa kohteen, johon on suunnattu suuri tutkimuspanos.
15 Tavanomaisiin rokotteiden valmistustapoihin kuuluu inaktivoitujen tai heikennettyjen patogeenien käyttö. Patogeenisten mikro-organismien sopiva inaktivointi tekee nämä organismit haitattomiksi biologisiksi agensseiksi mutta ei tuhoa niiden immunogeenisyyttä. Näiden "tapettu-20 jen" partikkelien antaminen ruiskeena isäntään aiheuttaa sitten immuunivasteen, joka kykenee estämään tulevaisuudessa tapahtuvan infektion elävällä mikro-organismilla. Suurena huolenaiheena tapettuja rokotteita käytettäessä (inaktivoitua patogeeniä käyttäen) on kuitenkin se, että 1' 25 kaikkia mikro-organismeja ei onnistuta inaktivoimaan. Vie läpä silloinkin, kun tässä onnistutaan, saavutettu immuniteetti on usein epätäydellistä, lyhytikäistä ja siihen tarvitaan useita immunisointeja sen vuoksi, että tapetut patogeenit eivät lisäänny isännässään tai että tähän on 30 muita tuntemattomia syitä. Inaktivointitapahtuma voi li- säksi muuntaa mikro-organismin antigeenejä, minkä johdosta näiden immunogeeninen tehokkuus heikentyy.
Heikentäminen tarkoittaa sitä, että patogeenisistä mikro-organismeista tuotetaan kantoja, joista kyky sai-35 rauden aiheuttamiseen on olennaisesti hävinnyt. Yksi keino 104638 4 tämän aikaansaamiseksi on altistaa mikro-organismi epätavallisille kasvuolosuhteille ja/tai viljellä sitä usein soluviljelmässä. Tämän jälkeen selektoidaan mutantteja, joista virulenssi on hävinnyt mutta jotka kykenevät kui-5 tenkin aiheuttamaan immuunivasteen. Heikennetyt patogeenit ovat usein hyviä immunogeeneja, koska ne replikoituvat isäntäsolussa ja aiheuttavat pitkään kestävän immuuniteetin. Elävien rokotteiden käyttöön liittyy useita ongelmia, joista eniten huolta aiheuttavat ongelmat ovat riittämätön 10 heikentäminen ja riski virulenssin palautumisesta.
Vaihtoehtona näille menetelmille on alayksikköro-kotteiden käyttö. Tämä käsittää immunisoinnin käyttäen vain niitä komponentteja, jotka sisältävät immunogeenista materiaalia.
15 Rokotteet formuloidaan ja niillä suoritetaan rokot taminen usein eri lisäaineita käyttämällä. Lisäaineiden avulla on mahdollista saada kestävämpi ja korkeammanastei-nen immuniteetti käyttäen pienempiä antigeenimääriä tai harvemmin annettuja annoksia verrattuna siihen, että im-20 munogeeni annettaisiin yksin. Lisäaineiden vaikutusmekanismi on monimutkainen eikä sitä tunneta täysin. Siihen voi kuitenkin liittyä sytokiinien tuotanto, fagosytoosi ja muita retikuloendoteelisysteemin aktiivisuuksia sekä antigeenin viivästynyt vapautuminen ja hajottaminen. Esimerk-·* 25 keihin lisäaineista kuuluvat Freundin adjuvantti (täydel linen tai epätäydellinen), Adjuvant 65 (sisältää maapähkinäöljyä, mannidimono-oleaattia ja aluminiummonostearaat-tia, pluroninen polyoli L-121, Avridiini ja mineraaligee-lit, kuten aluminiumhydroksidi, aluminiumfosfaatti jne. 30 Freundin adjuvanttia ei enää käytetä ihmisille tarkoite-tuissa rokoteformulaatioissa, koska se sisältää metaboloi-tumatonta mineraaliöljyä ja se on mahdollinen karsinogeeni .
Elävän, heikennetyn Salmonellan on osoitettu ky-35 kenevän stimuloimaan suojaavaa immuunivastetta homologi- 3 i 5 104638 sella virulentilla kannalla tehtyä altistusta vastaan. [Germanier, R. ja Furer, E., (1975) J. Infect Dis. 181, 533, Germanier, R., (1984) teoksessa Bacterial Vaccines,
Academic Press, New York, sivut 137 - 155, Levine, M.M., 7 5 et ai., (1983) Microbiol. Rev. 47, 510, Wahdan, M. H., et ai., (1982) J. Infect. Dis. 145, 292, Hoiseth, S. K. ja Stocker, B.A.D., (1981) Nature 291, 238, Stocker, B.A.D., et ai. (1982) Dev. Biol. Std. 53, 47, Lindberg, A. A. ja Robertsson, J. A., (1983) Infect. Immun. 41, 751, Roberts-10 son, J. A., et ai., (1983) Infect. Immun. 41, 742, Smith, B. P., et ai., (1984) Am. J. Vet. Res. 45, 2231, Smith, B.
P., et ai., (1984) Am. J. Vet. Res, 45, 59, Moser, I., et ai., (1980) Med. Microbiol. Imm. 168, 119]. Useat tutkijat ovat lisäksi käyttäneet vieraita antigeenejä koodaavia I
15 plasmideja sisältäviä heikennettyjä Salmonella-bakteereja näiden vieraiden antigeenien viemiseksi immuunijärjestelmään [Formal, S. B., et ai., (1981) Infect. Immun. 34, 746, US-patenttijulkaisu nro 4 632 830, Formal et ai.,
Clements, J. D., et ai., (1986) Infect. Immun. 5, 685, 20 Maskell, D. J., et ai., (1987) Microb. Path. 2, 211,
Brown, A., et ai., (1987) J. Infect. Dis. 155, 86, Dougan, G., et ai., (1987) Parasite Immun. 9, 151].
Plasmodium-lajin sirkumsporotsoiittiproteiiniin liittyvän toistuvan immunodominantin epitoopin ajatellaan ** 25 olevan malariasporotsoiitteja vastaan syntyvien suojaavien humoraalisten (ja mahdollisesti soluvälitteisten) vasteiden kohde [Miller, L.H. et ai., (1986) Science 234, 1349], on kuvattu monoklonaalisia vasta-aineita, jotka tunnistavat näitä molekyyleja ja kykenevät suojaamaan naiiveja 30 resipienttieläimiä. Kahta näihin toistuviin epitooppeihin ' perustuvaa rokotetta on testattu ihmisissä ja niiden on osoitettu aiheuttavan suojaavan immuunivasteen joissakin yksilöissä. [Ballou, W. R., et ai., (1987) Lancet i, 1277, Herrington, D., et ai., (1987) Nature 328, 257], 6 104638
Koleratoksiini on prototyyppi bakteerien enterotok-siinien ryhmästä, joka välittää ripulitauteja ja jotka ovat rakenteeltaan, toiminnaltaan ja immunogeenisyydeltään toistensa kaltaisia. Muihin tämän ryhmän jäseniin kuuluvat 5 E. colin lämpöherkkä toksiini, joka on eristetty ihmisistä [Yamamoto, T. ja Yokota, T., (1983) J. Bacteriology 155, 728] ja sioista [Leong, J., et ai., (1985) Infect. Immun. 48, 73] , ja Salmonella typhimuriumista [Finkelstein, R. A., et ai., (1983) FEMS Microbiology Letters 17, 239] ja 10 Campylobacter jejunista peräisin olevat toksiinit [Walker, R. I., et ai., (1986) Microbiology Rev. 50, 81]. Yhteistä kaikille näille toksiineille on A-alayksikkö, joka välittää ADP-ribosyylitransferaasiaktiivisuutta, jonka tuloksena on adenylaattisyklaasin aktivaatio ja joka lopulta joh-15 taa kohteena olevan solun kuolemaan. Kaikki nämä toksiinit sisältävät lisäksi immunologisesti dominantin B-alayksi-kön, jonka välityksellä holotoksiini sitoutuu kohdesoluun-sa. Pelkkä B-alayksikkö ei ole toksinen ja immunisointi tällä molekyylillä aiheuttaa toksiinia neutraloivien vas-20 ta-aineiden muodostumisen.
On ehdotettu, että voitaisiin valmistaa rokotteita, jotka perustuvat toksiinia neutraloiviin vasta-ainevastei-siin immunisoimalla bakteerien eksotoksiinien (koleratoksiini, E. colin lämpöherkkä toksiini) ei-toksisilla sitou-25 tumisalayksiköillä [Jacob, C. 0., et ai., (1983) Proc.
Natl. Acad. Sei. U.S.A. 80, 7611, Jacob, C. 0., et ai., (1984) EMBO J. 3, 2889] .
Hepatiitti-B-virioni on 42 nm:n vaipallinen rakenne, joka sisältää pienen DNA-genomin. Vaippaproteiineja 30 koodaavat S-geeni (esi-S, esi-S2 ja S) , yksi HBV:n genomin .* neljästä avoimesta lukukehyksestä [Tiollais, P. et ai., • · (1985) Nature 317, 489]. Näihin polypeptideihin sisältyy hepatiitti-B-pinta-antigeeni (HBsAg). HBsAg-partikkelien, jotka on saatu ihmisen plasmasta, tai samanlaisten partik- 35 kelien, jotka on tuotettu yhdistelmä-DNA-menetelmillä 3 ’ 104638 (joista joiltakin puuttuvat esi-S-epitoopit), on osoitettu aiheuttavan suojaavan immuunivasteen ja puhdistetut partikkelit edustavat nykyisiä HBVttä vastaan käytettäviä rokotteita. [Krugman, S., (1982) J. Am. Med. Assoc. 247, 7 5 2012].
Flagelliini
Flagellat ovat organelleja, jotka liittyvät bakteerisolujen liikkumiseen. Rakenneproteiinien synteesi ja kokoonpantujen flagellojen varsinainen toiminta on moni-10 mutkainen tapahtumasarja, joka käsittää useiden geenien ja geenituotteiden vuorovaikutuksia [katsaus esitetty julkaisussa lino, T., (1977) Ann. Rev. Genet. 11, 161]. On määritetty yli kolmekymmentäviisi geeniä, jotka osallistuvat flagellaan liittyviin toimintoihin E. colissa ja on 15 tunnistettu geenituotteet, jotka vastaavat ainakin seitsemästoista näistä geeneistä. Varsinainen flagellaorganelli koostuu kolmesta pääasiallisesta rakenteellisesta elementistä ja se ulottuu sytoplasmasta solukalvojen läpi ja päättyy suureen solunulkoiseen osaan. Filamentti muodostuu 20 yhdestä alayksikköproteiinista, flagelliinista ja se on tämän organellin pääasiallisin rakenneyksikkö, joka muodostaa yli 95 % kokonaismassasta. Flagelliinin rakenne-geenejä nimitetään Hl:ksi ja H2:ksi Salmonellassa [lino, T., (1969) Bacteriol. Rev. 33, 454 - 475], H:ksi Bacillus 25 subtiliksessa [Joys, T. M. ja Frankel, R. W. , (1967) J.
Bacteriol. 94, 32 - 37] ja Pseudomonas aeruginosassa [lino, T., (1969) Ann. Rep. Natl. Inst. Genet. Jpn. 20, 94] ja hag-.ksi E. colissa [Armstrong, J. B. ja Adler, J., (1969) J. Bacteriol. 97, 156 - 161]. Tyvikappale on tämän 30 organellin monimutkaisin osa ja se toimii sekä organellin
V
!t ankkuroinnissa soluun ja osana moottorin kaltaista laitet ta, joka pyörittää filamenttia. Koukun osuutena on filament in kiinnittäminen tyvikappaleeseen.
Filamentin pyöriminen synnyttää flagellan välityk-35 sellä tapahtuvan solujen liikkeen. Kukin filamentti koos- 8 104638 tuu useista tuhansista kappaleista flagelliinialayksiköi-tä, jotka muodostavat tyypillisesti 5-10 μτη:η pituisen kierteisen rakenteen [useimpien E. coli ja Salmonella -kantojen ollessa kyseessä ks. MacNab, P., (1987) teokses-5 sa Escherichia coli and Salmonella typhimurium, Neidhardt, F.C., toim. American Society for Microbiology, Washington, DC, sivut 70 - 83] . Flagelliinin rakennegeenissä olevien mutaatioiden on havaittu aiheuttavan muutoksia filamentin muodostumisen tehokkuuteen, filamentin muotoon, herkkyy-10 teen flagelloihin hakeutuvia faageja vastaan ja/tai fla-gellan antigeenispesifisyyteen [Yamaguchi, S. ja lino, T., (1969) J. Gen. Microbiol. 55, 59 - 74, lino, T., et ai., (1974) J. Gen. Microbiol. 81, 37 - 45, Horiguchi, T., et ai., (1975) J. Gen. Microbiol. 91, 139 - 149]. Filament-15 tien kokoaminen tapahtuu solun ulkopuolella lisäämällä flagelliinimonomeerejä toinen toisensa perään kasvavaan filamenttiin ja pidentymisen nopeus on kääntäen verrannollinen filamentin pituuteen sen kasvun pysähtymiseen asti ja tämä säätelee siten filamentin pituutta.
20 Flagellat esiintyvät etupäässä sauvan- ja spiraa- linmuotoisten bakteerien pinnalla ja tällaisiin bakteereihin kuuluu jäseniä bakteerisuvuista Escherichia, Salmonella, Proteus, Pseudomonas, Bacillus, Campylobacter, Vibrio, Treponema, Legionella, Clostridia, Caulobacter ja eräistä 25 muista suvuista, vaikkakaan tämä ominaisuus ei rajoitu yksinomaan tämän tyyppisiin bakteereihin. Siitä huolimatta että nämä flagellat toimivat samoin, ne ovat eri suvuissa molekyylipainoltaan monimuotoisia alueella 28 - 66 kDa. Jopa yhdessä suvussa kuten Salmonellassa tavataan kor-30 keanasteista antigeenipolymorfiaa ja tämä on käyttökelpoinen keino yksittäisten seroptyyppien tunnistamiseen yhden • « lajin sisällä [Edwards, P. R. ja Ewing, W. H., (1972)
Identification of Enterobacteriaceae, 3. painos., Burgess Publishing Co., Minneapolis, MN]. Useiden bakteerien fla-35 gellojen rakenteellisessa analyysissa on paljastunut se 9 104638 seikka, että eri bakteereista eristetyille filamenteille on yhteistä niiden rakentuminen samalla tavalla [Wei, L.-N. ja Joys, T. M., (1985) J. Mol. Bio. 186, 791, DeLan- ge, R. J., et ai., (1976) J. Biol. Chem. 251, 705, Gill, 5 P. R. ja Agabian, J., Biol. Chem. 258, 7395] . Huomattavin-ta on se, että näiden molekyylien amino- ja karboksiterminaalisissa päissä on korkeanasteista proteiinisekvenssin homologiaa ja että niiden keskiosassa esiintyy polymorfi-nen alue, josta eri flagelloissa esiintyvä antigeenien 10 monimuotoisuus on peräisin.
Bakteerien pinnalla olevien antigeenien synnyttämät vasteet isännissä ovat perusteellisesti dokumentoituja [Horowitz, S. A. et ai., (1987) Infect. Immun. 55, 1314,
Naito, Y., et ai., (1987) Infect. Immun. 55, 832, Zhang, 15 Y. X., et ai., (1987) J. Immunol. 138, 575, Norgard, M.
V., (1986) Infect. Immun. 54, 500, Nagy, L. K., (1985)
Vet. Rec. 117, 408, Levine, M. M., et ai., (1984) Infect.
Immun. 44, 409, Zak, K., et ai., (1984) J. infect. Dis.
149, 166]. Flagellojen ja erityisesti flagellan filament-20 tien on osoitettu olevan vahvoja immunogeenejä luonnollisissa infektio-olosuhteissa ja keinotekoisissa immuni-sointiolosuhteissa ja joissakin tapauksissa flagellassa esiintyvien antigeenisten determinanttien on osoitettu olevan suojaavia [Young, R. J., et ai., (1979) Infect. Im-25 mun. 25, 220, Eubanks, E. R. , et ai., (1976) Infect. Immun. 15, 533, Smith, H. L., Jr., (1974) App. Micro. 2, 375, Dwyer, J. M. ja Mackay, I. R., (1972) Int. Arch. Al lergy Appi. Imm. 43, 434, Ebersole, J. L. ja Molinari, J.
A., (1976) Infect. Immun. 13, 53, Ebersole, J. L., et ai., 30 (1975) Infect. Immun. 12, 353, Stevenson, J. R. ja Stronger, K. A., (1980) Am. J. Vet. Res. 41, 650, Tamura, Y., et ai., (1984) Micro. Imm. 28, 1325. Kuwajima (1988) J.
Bact. 170, 485] on kuvannut hag-flagelliinigeenin keskusalueelle aiheutettujen deleetioiden avulla muodostettuja ^ 10 104638 E. coli -bakteerin mutantteja, joilla flagellan antigeeni-syys on muuntunut.
US-patenttijulkaisu nro 4 702 911 kuvaa bakteerien pilusten, bakteerien ulkopintaan kiinnittyneiden organel-5 lien, puhdistettujen alayksiköiden käytön rokoteformulaa- tioissa.
Kansainvälinen PCT-patenttijulkaisu WO 87/02 385, julkaistu 23. huhtikuuta 1987, kuvaa proinsuliinijakson ja beta-laktamaasijakson ilmentymisen fuusioproteiineina B. 10 subtiliksen hag-flagelliinigeenin kanssa.
Keksinnön yhteenveto
Esillä oleva keksintö koskee menetelmiä flagel-liinifuusioproteiinin valmistamiseksi ja ilmentämiseksi, joille menetelmille on tunnusomaista se, mitä patenttivaa-15 timuksissa 17 ja 21 esitetään. Keksintö koskee edelleen menetelmiä f lagelliinifuusioproteiinia koodaavan yhdistel-mägeenin ja sitä sisältävän nukleiinihappokloonin valmistamiseksi, joille menetelmille on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksissa 1 ja 13 esitetään. Keksinnön mu-20 kaiselle menetelmälle mainitun geenin sisältävän mikro-organismin valmistamiseksi on tunnusomaista se, mitä patenttivaatimuksessa 15 esitetään.
Tämän keksinnön mukaisesti valmistetaan yhdistelmä-geenejä ja niiden koodaamia proteiineja, jotka ovat fla-25 gelliinin yhdistelmäfuusioproteiineja. Nämä proteiinit käsittävät epitoopin, joka on toiminnallisen flagelliinin rakennegeenin koodaama ja ainakin yhden heterologisen organismin epitoopin, joka epitooppi on immunogeeninen silloin, kun fuusioproteiini viedään isäntänä olevaan selkä-30 rankaisyksilöön. Nämä epitoopit ovat B-solu- ja/tai T-so-. luepitooppien tunnistamia. Heterologisen organismin epi tooppi voidaan liittää sellaiselle alueelle, joka ei ole välttämätön sen koodaaman flagelliinin toiminnalle ja joka ei hävitä tämän toimivuutta, kuten flagelliinin rakenne-35 geenin suurta vaihtelua sisältävälle alueelle. Erityisen 104638 edullisessa sovellutusmuodossa heterologisen organismin epitooppi liitetään Salmonellan Hl-d-geenin luonnostaan sisältämien EcoRV-kohtien väliin. Tämän keksinnön mukaisesti valmistetut yhdistelmäflagelliiniproteiinit kul-• 5 jetetaan solun pinnalle, jossa, edullisen sovellutusmuodon ollessa kyseessä, niistä rakentuu heterologisen epitoopin sisältävä toiminnallinen flagella. Muissa sovellutusmuo-doissa flagelliinin yhdistelmäfuusioproteiinit voivat synnyttää solu-, limakalvo- tai humoraalisen vasteen.
10 Yhdistelmäflagelliinigeenejä ja -proteiineja voi daan formuloida käytettäväksi rokotteina, jotka torjuvat heterologisen organismin aiheuttaman infektion. Ne voivat myös antaa suojaa sellaista sairaustilaa tai tautia vastaan, joka on heterologisen organismin antigeenin aiheut-15 tama. Flagelliinin yhdistelmäfuusioproteiinina tapahtuva ilmentäminen tarjoaa käyttöön menetelmän minkä tahansa halutun epitoopin esittämiseksi immunologiselle järjestelmälle immunogeenisessä muodossa ja menetelmän immuunivasteiden stimuloimiseksi, mukaanlukien humoraalisten, lima-20 kalvoihin liittyvien ja/tai soluvälitteisten immuunivasteiden stimuloimisen. Erityisessä sovellutusmuodossa voivat heikennetyt elimistöön tunkeutumiskykyiset bakteerit ilmentää yhdistelmäflagelliinigeenejä elävissä suun kautta annettavissa rokoteformulaatioissa. Toisessa sovellutus-25 muodossa flagelliinin yhdistelmäfuusioproteiineja voidaan formuloida käytettäviksi alayksikkörokotteina.
Erityisissä tämän keksinnön mukaisissa sovellutus-muodoissa, jotka esitetään yksityiskohtaisesti esimerkkien yhteydessä, ilmennetään malarian sirkumsporotsoiittianti-30 geenien, koleratoksiinin B-alayksikön, hepatiitti-B:n pinta-antigeenin ja pinta-antigeenin esimuodon, rotaviruksen VP7-polypeptidin, HIV:n vaippaglykoproteiinin ja Strepto-coccuksen M-proteiinin epitooppeja flagelliinin yhdistel-mäfuusioproteiineissa, joista rakentuu toiminnallisia fla-35 gelloja ja jotka aiheuttavat heterologista epitooppia vas- •.. .
12 104638 taan kohdistuvan immuunivasteen isäntänä olevassa selkä-rankaisyksilössä.
Määritelmät bp = emäspari 5 CRM197 = mutantti difteriatoksiinimolekyyli CS = sirkumsporotsoiitti CT-B = koleratoksiinin B-alayksikkö CTP3 = peptide, joka edustaa koleratoksiinin B-alayksi- kön aminohapporyhmiä 50 - 64 [Jacob, C. 0., et ai., 10 (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 81, 7893] DPAPP- NAN = peptidi (asp-pro-ala-pro-pro-asn-ala-asn), joka edustaa Plasmodium berghein sirkumsporotsoiittipro-teiinin immunodominanttia toistuvaa konsensusepi-15 tooppia DTT = ditiotreitoli ELISA = entsyymivälitteinen immunosorbenttimääritys HBsAg = Hepatiitti-B:n pinta-antigeeni HIV = Ihmisen immuunipuutostautivirus 20 kDa = kilodaltonia KLH = reikäkotilon hemosyaniini
Mab = monoklonaalinen vasta-aine NANP = Peptidi (asn-ala-asn-pro), joka edustaa Plasmo dium falciparumin sirkumsporotsoiittiproteiinin im-25 munodominanttia toistuvaa konsensusepitooppia PAGE = polyakryyliamidigeelielektroforeesi PBS = fosfaatilla puskuroitu fysiologinen suolaliuos RSV = respiratory syncytial -virus VP7 = rotaviruksen ulkokuoren pääasiallisin polypeptidi 30 .. Kuvioiden selitykset
Kuvio 1. Kaavio plasmideista pLS402, pPX1651 ja pLS408, jotka koodaavat flagelliinin rakenne geeniä Hl-d. Plasmidi pLS402 eristettiin Salmonella muenchenin DNA:n 35 genomikirjastosta, joka oli konstruoitu pBR322:een [Wei, 13 104638 L.-N. ja Joys, T. M., (1985) J. Mol. Biol. 186, 791]. Hl-d flagelliinigeeniä koodaava alue (tummennettu alue) esiintyy 3,8 ke:n EcoRI genomifragmentissa ja se sisältää kaksi EcoRV-restriktiokohtaa. Tämän lisäksi vektorissa esiintyy * 5 vielä yksi EcoRV-kohta. Kaksi jatkokloonia, plasmidit pPX- 1651 ja pLS408, konstruoitiin liittämällä ensin pLS402:n 3,8 ke:n genomifragmentti pUC18:n ja pUC19:n EcoRI-kohtiin, tässä järjestyksessä mainittuna, ja tulokseksi saatiin konstruktiot pPX1650 ja pLS405, tässä järjestyksessä 10 mainittuna. Tämän jälkeen deletoitiin kummastakin näistä plasmidista 51 ep:n EcoRV-fragmentti ja tästä oli tuloksena plasmidit pPX1651 ja pLS408, joilla kummallakin oli nyt ainutkertainen EcoRV-restriktiokohta käytettäväksi vierasta epitooppia määräävien oligonukleotidien liittämiseen.
15 Kuvio 2A. Kaavio Hl-d-flagelliiniproteiinista.
Suurta vaihtelua sisältävä alue IV on merkitty ristivii-voituksella. Kuvassa on osoitettu EcoRV-restriktiokohtien sijainti geenijaksoissa.
Kuvio 2B. Hl-d flagelliinigeenin nukleotidijakso 20 ja siitä johdettu aminohappojakso [julkaisusta Wei, L. N. ja Joys, T. M., (1985) J. Mol. Biol. 186, 791]. EcoRV-res- triktiokohdat on alleviivattu.
Kuvio 3A. Kolmea täyttä ja kahta puolikaskappalet-ta P. falciparumin sirkumsporotsoiitin immunodominanttia 25 toistuvaa epitooppia (NAND) koodaavien synteettisten oligonukleotidien nukleotidijakso ja siitä johdettu aminohappo jakso .
Kuvio 3B. Kahta P. berghein sirkumsporotsoiitin immunodominanttia toistuvaa konsensusepitooppia (DPAPPNAN) 30 koodaavien synteettisten oligonukleotidien nukleotidijakso .. ja siitä johdettu aminohappojakso.
Kuvio 4A. Kaavio koleratoksiinin B-alayksikköpro-teiinista ja CTP3-epitoopin sijainnista siinä.
Kuvio 4B. Koleratoksiinin B-alayksikköä koodaavien 35 synteettisten oligonukleotidien nukleotidijakso ja siitä 14 104638 johdettu aminohappojakso. Toisiinsa pituussuunnassa liittyneet oligonukleotidit käsiteltiin Klenow-entsyymilla tasaisten päiden muodostamiseksi ennen niiden liittämistä plasmidivektoriin kuviossa 1 esitetyllä tavalla.
5 Kuvio 5. Kaavio flagelliinin yhdistelmäfuusiopro- teiineista, jotka on konstruoitu esimerkissä 1 esitetyn kuvauksen mukaisesti. Ristikkäisviivoitetut alueet edustavat P. falciparumin tai P. berghein CS-proteiinien tai koleratoksiinin B-alayksikön (CT-B) heterologisia jaksoja 10 kuvassa esitettyjen merkintöjen mukaisesti.
Kuvio 6. Heikennetyssä Salmonellassa ilmennettyjen yhdistelmätlagelliinien Western -blottausanalyysi. Solu-uutteille suoritettiin elektroforeesi ja siirto nitrosel-luloosasuodattimille esimerkissä 1 esitetyn tavan mukai-15 sesti. Yhdistelmätlagelliinimolekyylien havaitsemiseen käytetyt vasta-ainekoettimet olivat: Osa A: Hl-d:tä vastaan valmistettu kaniinin antiseerumi, Osa B: P. berghein sirkumsporotsoiittia vastaan valmistettu Mab 3.28, Osa C: P. falciparumin sirkumsporotsoiittia vastaan valmistettu 20 Mab 4D9, Osa D: koleratoksiinin aminohapporyhmistä 50§64 muodostuvaa peptidiä (CTP3-peptidiä) vastaan valmistettu seerumi. Plasmidien konstruktiot ja isäntäkannat on merkitty kunkin kanavan yläpuolelle.
Kuvio 7. Malariasirkumsporotsoiitti (CS) -epitoop-.. 25 pia vastaan suunnatun vasta-aineen havaitseminen yhdistel- mäflagelliiniproteineilla immunisoiduissa hiirissä. Hiiret immunisoitiin ja niille annettiin tehosterokotukset käyttäen osittain puhdistettuja villityyppisiä flagelloja (plasmidin pPX1650 koodaamia) tai yhdistelmätlagelloja, 30 jotka sisälsivät kaksi kappaletta P. berghein immunodo-.. minanttia CS-toistumaa (plasmidin pPX1661 koodaamia).
Näistä eläimistä viikoilla 0, 4 ja 6 primaari-immunisoinnin jälkeen saaduista seerumeista valmistetuista sarjalai-mennoksista määritettiin ELISA:11a niiden kyky sitoutua 35 synteettisiin peptideihin, jotka koostuivat kahdesta kap- _ · | i •« 15 104638 paleesta P. berghein CS-toistumajaksoa, jotka oli kytketty reikäkotilon hemosyaniiniin (KHL). Esitetyt koetulokset ovat keskiarvoja, jotka on laskettu viiden eläinyksilön muodostamasta ryhmästä, a: plasmidi pPX1650 viikolla 0, b: • 5 plasmidi pPX1650 viikolla 4, c: plasmidi pPX1650 viikolla 6, d: plasmidi pPX1661 viikolla 0, e: plasmidi pPX1650 viikolla 4, f: plasmidi pPX1661 viikolla 6.
Kuvio 8. Malariasirkumsporotsoiitti (CS) -epitoop-pia vastaan suunnatun vasta-aineen havaitseminen flagel-10 liinin yhdistelmäfuusioproteiineja ilmentävällä elävällä heikennetyllä Salmonellalla immunisoiduissa hiirissä. Hiiret immunisoitiin ja niille annettiin tehosterokotukset esimerkissä 1 esitetyn tavan mukaisesti. Näistä eläimistä viikoilla 0, 4 ja 6 primaari-immunisoinnin jälkeen saa-15 duista seerumeista valmistetuista sarjalaimennoksista mää ritettiin ELISA:11a niiden kyky sitoutua synteettisiin peptideihin, jotka koostuivat kahdesta kappaleesta P. berghein CS-toistumajaksoa, jotka oli kytketty KHL:ään. Esitetyt koetulokset ovat keskiarvoja, jotka on laskettu 20 viiden eläinyksilön muodostamasta ryhmästä paitsi viikon 6 ollessa kyseessä, jolloin ryhmää kohti jäi vain yksi eläin, a: plasmidi pPX1650 viikolla 0, b: plasmidi pPX1650 viikolla 4, c*. plasmidi pPX1650 viikolla 6, d: plasmidi pPX1661 viikolla 0, e: plasmidi pPX1650 viikolla 4, f: 25 plasmidi pPX1661 viikolla 6.
Kuvio 9 esittää vasta-ainevasteet viidestä hiirestä, jotka oli immunisoitu SL5929:llä, koleratoksiinin B-alayksikön CTP3-epitooppia ilmentävällä, formaliinilla tapetulla Salmonella dublin -rokotteella.
30 Kuvio 10 esittää HBsAg (ayw):n S-alueen 122 - 137 ja esi-S2-alueen 120-145 aminohappo- ja synteettiset oli-gonukleotidijaksot ja flagelliinigeenin kartan. Tummennettu alue edustaa suurta vaihtelua sisältävää aluetta. H on Hindlll, R on EcoRV P on PstI ja K on Koni.
16 104638
Kuvio 11 esittää kloonatut plasmidin pLS405 rekom-binantit.
Kuvio 12 esittää vasta-ainevasteet kaneissa, jotka on immunisoitu lihaksensisäisesti elävällä S. dublin 5 SL5928:11a, joka on transformoitu S16:lla tai pS21:lla.
Kuvio 13 esittää vasta-ainevasteet hiirissä, jotka on immunisoitu suun kautta elävällä 5L5928:lla, joka ilmentää HBsAg-epitooppia. Kukin "X" edustaa yksittäisen hiiren vasta-ainetiitteriä.
10 Kuvio 14 esittää koetulokset, jotka on saatu, kun SJL-hiiret esikäsiteltiin yhdistelmäflagelloilla, villi-tyypin flagelloilla tai CRM197-proteiinilla ja imurauhas-solut stimuloitiin uudelleen in vitro synteettisellä peptidillä, joka koodaa CRM197-proteiinin aminohappoja 366 -15 383.
Kuvio 15 esittää koetulokset, jotka on saatu käyttäen kuviossa 14 esitetyllä tavalla esikäsiteltyjä imurau-hassoluja, jotka stimuloitiin puhdistetulla CRM197-pro-teiinilla.
20 Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus Tämä keksintö liittyy flagelliinin yhdistelmäraken-negeeneihin, jotka ilmentyvät flagelliinin yhdistelmä-fuusioproteiineina. Nämä yhdistelmägeenit käsittävät jakson, joka koodaa flagelliinin rakennegeenin määräämää epi-25 tooppia ja jakson, joka koodaa heterologisen organismin epitooppia, joka epitooppi on immunogeeninen vietäessä fuusioproteiini selkärankaisisäntään. Heterologisen organismin epitooppi voidaan liittää alueelle, joka koodaa flagelliinia mutta ei ole välttämätön tämän toiminnalle. 30 Tämän liittymäjakson ei kuitenkaan tule tehdä flagellaa .. toimintakyvyttömäksi. Edullisessa sovellutusmuodossa hete rologisen organismin epitooppi voidaan liittää flagelliinin rakennegeenin suurta vaihtelua sisältävälle alueelle (esim. Salmonellan Hl-d-geenin luontaisten EcoRV-kohtien 35 väliin).
Ί 17 104638 Tämä keksintö liittyy myös näiden geenien koodaamiin fuusioproteiineihin ja näiden geenien ja proteiinien * käyttöön rokoteformulaatioissa, suojaamaan heterologisten organismien infektioita vastaan tai suojaamaan organismin : 5 antigeenin aiheuttamia sairaustiloja tai tauteja vastaan.
Tämän keksinnön mukaisesti tapahtuva ilmentäminen flagel-liinin yhdistelmäfuusioproteiinina tarjoaa menetelmän minkä tahansa epitoopin esittämisen immunologiselle järjestelmälle immunogeenisessä muodossa immuunivasteiden stimu-10 loimiseksi (joihin kuuluvat humoraalinen, limakalvojen ja /tai soluvälitteinen immuunivaste). Erityisessä sovellu-tusmuodossa voivat elävän rokotteen muodossa olevat heikennetyt elimistöön tunkeutumiskykyiset bakteerit ilmentää tämän keksinnön mukaisesti valmistettuja yhdistelmätlagel-15 liinigeenejä. Toisessa erityisessä sovellutusmuodossa voidaan flagelliinin yhdistelmäfuusioproteiineja formuloida käytettäväksi alayksikkörokotteina.
Esimerkeissä yksityiskohtaisesti kuvatuissa tämän keksinnön mukaisissa erityisissä sovellutusmuodoissa il-20 mennetään malarian sirkumsporotsoiittiantigeenien, kolera- toksiinin B-alayksikön, hepatiitti-B:n pinta-antigeenin ja pinta-antigeenin esimuodon, rotaviruksen VP7-polypepti-diantigeenien, HIV:n vaippaglykoproteiinin ja Streptococcus pyogeneksen M-proteiinin epitooppeja flagelliinin yh-»·< 25 distelmäfuusioproteiineissa, joista rakentuu toiminnalli sia flagelloja ja jotka aiheuttavat heterologista epi-tooppia vastaan kohdistuvan immuunivasteen isäntänä olevassa selkärankaisyksilössä.
Tässä kuvattu menetelmä voidaan yksinomaan kuvaa-30 mistarkoituksissa jakaa seuraaviin yleisiin vaiheisiin: a. flagelliinigeenin eristäminen b. immunogeenisia epitooppeja koodaavien jaksojen eristäminen yhdistelmätlagelliineina tapahtuvaa ilmentämistä varten 35 c. yhdistelmäflagelliinigeenien konstruktio • · 104638 18 d. ilmentäminen bakteeri-isännissä e. yhdistelmäflagelliin(e)ina ilmennetyn(ty-jen) heterologis(te)n epitoopin(pien) immunologisen tehon määrittäminen 5 f. rokotteen formulaatio Tässä kuvataan lisäksi immuunivasteen aiheutta-mismenetelmä (johon kuuluvat humoraalinen, limakalvojen ja/tai soluvälitteinen immuunivaste) antamalla selkäran-kaisisännälle fysiologisesti hyväksyttävässä kantaja-ai-10 neessa olevaa bakteeria, joka on transfektoitu siten, että se ilmentää mainittua flagelliinin yhdistelmäfuusioprote-iinia. Bakteeri on edullisesti elävä ja infektiokykyinen mutta ei voi aiheuttaa merkittävää tautia selkäran-kaisisännässä. Vaihtoehtoisesti voidaan isäntään antaa 15 pelkkää flagellan yhdistelmäfuusioproteiinia immuunivasteen aiheuttamiseksi.
Sienten vastaisia aineita voidaan käyttää sienisai-rauksien ehkäisyyn ja näihin kuuluvat taulukossa 1 esitetyt sienet, esitettyihin kuitenkaan rajoittumatta. [Braude 20 et ai., (1986), Infectious Diseases and Medical Microbiology, Feigin et ai., (1987), Textbook of Pediatric Infectious Diseases 35, Mandell et al., (1985), Principles and Practice of Infectious Diseases, Osa F.] . Muihin rokotteiden käyttösovellutuksiin kuuluvat sellaisten hormoneja 25 vastaan suunnattujen vasteiden aiheuttaminen kuten raskauden ehkäisyn tehostaminen, elimistön tarvitsemien ravintoaineiden muuntokyvyn parantaminen ja hormonitasapainohäiriöt . Muihin käyttömuotoihin kuuluvat syövän hoito ja sen ennakolta ehkäisy, allergiaa vastaan suunnattu hoito ja 30 immunologisia sairauksia ennakolta ehkäisevien ja immuno->· terapeuttisten aineiden tuotanto.
Flagelliinigeenin eristys
Heterologisen epitoopin sisältävää flagelliinin fuusioproteiinia koodaavan yhdistelmägeenin konstruoimi-35 seksi voidaan käyttää mitä tahansa flagelliinin rakenne- 19 104638 geeniä. Näihin flagelliinigeeneihin kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, Salmonellan Hl- ja H2-geenit, Bacillus subtiliksen ja Pseudomonas aeruginosan H- ja E. colin hag-geeni.
5 Useat flagelliinigeenit on kloonattu ja sekvenssoi- tu [ks. esim. Kuwajima, G., et ai. (1986) J. Bact. 168, 1-479, Wei, L.-N. ja Joys, T. M., (1985) J. Mol Biol. 186, 791-803 ja Gill, P. R. ja Agabian, N., (1983) J. Biol. Chem. 258, 7395 - 7401, jotka on liitetty tähän viit-10 tauksella].
Jos kloonattu flagelliinigeeni ei ole saatavissa valmiina, se voidaan kloonata tunnetuilla vakiomenetelmil-lä [ks. esim. Maniatis, T., et ai., (1982) Molecular Clo-ninq, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 15 Cold Spring Harbor, New York], käyttäen mitä tahansa fla-gellan sisältävää bakteerisolua, joka muodostaa molekulaa-riseen kloonaukseen tarvittavan potentiaalisen nukleiini-happolähteen. Näihin bakteereihin kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, Escherichia, Salmonella, Pro-20 teus, Pseudomonas, Bacillus, Campylobacter, Vibrio, Tre ponema, Legionella, Clostridia ja Caulobacter. Kloonatun geenin nukleotidijakson analyysi voidaan suorittaa useilla tunnetuilla menetelmillä esim.[Maxamin ja Gilbertin (1980) Meth. Enzymol. 65, 499 - 560] menetelmällä, Sangerin di-·.! 25 deoksimenetelmällä [Sanger, F., et ai., (1977) Proc. Natl.
Acad. Sei. U.S.A. 74, 5463] tai automaattista DNA-sek- venointilaitetta käyttäen (esim. Applied Biosystems, Foster City, CA).
Immunogeenisia epitooppeja koodaavien jaksojen 30 eristys niiden ilmentämiseksi yhdistelmäflagel- liineina
Mikä tahansa DNA-jakso, joka koodaa heterologisen organismin epitooppia, joka flagelliinifuusioproteiinina ilmennettynä tuottaa suojaavan immuniteetin tätä organis-35 mia vastaan tai antigeenin aiheuttamaa sairaustilaa tai • · 20 104638 tautia vastaan, voidaan eristää tässä kuvatuissa rokote-formulaatioissa käytettäväksi. Edullisessa sovellutusmuo-dossa tämä organismi on patogeeninen mikro-organismi. Tämä heterologinen epitooppi voi esimerkiksi esiintyä baktee-5 reissä, loisissa, viruksissa tai sienissä, jotka ovat taudinaiheuttajia. Lisäksi voidaan käyttää allergeenien ja syöpäsolujen epitooppeja. Näihin bakteereihin, loisiin, viruksiin tai sieniin kuuluvat taulukossa 1 luetellut organismit, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta.
10
Taulukko 1
Heterologiset organismit, joista DNA voidaan eristää fla-gelliinifuusioproteiinien konstruoimiseksi 15
Loiset:
Plasmodium spp.
Eimeria spp.
Schistosoma spp.
20 Trypanosoma spp.
Babesia spp.
Leishmania spp.
Cryptosporidia spp.
Toxoplasma spp.
25 Pneumocystis spp.
Bakteerit:
Vibrio cholerae Streptococcus pyogenes Neisseria menigitidis 30 Neisseria gonorrhoeae
Corynebacteria diphtheriae Clostridium tetani Branhamella catarrhalis Bordetella pertussis 35 Haemophilus spp. (esim. influenzae) Ί • « 2i 104638
Chlamydia spp.
Enterotoksigeeninen Escherichia coli Virukset
Ihmisen immuunipuutostautivirus, tyyppi I 5 Ihmisen immuunipuutostautivirus, tyyppi II
Apinan immuunipuutostautivirus
Ihmisen T-lymfosyyttivirus, tyyppi I, II ja III Respiratory syncytial -virus Hepatiitti-A -virus 10 Hepatiitti-B -virus
Hepatiitti-C -virus Ei-A, ei-B-hepatiitti -virus Herpes simplex -virus, tyyppi I Herpes simplex -virus, tyyppi II 15 Sytomegalovirus
Influenssavirus Parainfluenssavirus Poliovirus Rotavirus 20 Coronavirus
Vihurirokkkovirus
Tuhkarokkovirus
Sikotautivirus
Vesirokkovirus • ϊ 25 Epstein Barr -virus
Adnovirus Papilloomavirus Kelt akuumev i ru s Sienet 30 Candida spp. (varsinkin albicans) · Cryptococcus spp. (varsinkin neoformans)
Blastomyces spp. (dermatitidis)
Histoplasma spp. (varsinkin capsulatum)
Coccidroides spp. (varsinkin immitis) 35 Paracoccidroides spp. (varsinkin brasiliensis)
Aspergillus spp.
• · 22 1 0 4 6 3 8
Toisessa sovellutusmuodossa voidaan nematodin antigeenin epitooppi ilmentää fuusioproteiinina antamaan suojaa näiden matojen aiheuttamia tauteja vastaan.
Potentiaalisesti käyttökelpoiset antigeenit rokote-5 formulaatoita varten voidaan tunnistaa useilla eri arviointiperusteilla, kuten antigeenin liittyminen patogeenin infektiokyvyn neutralointiin [Norrby, E., (1985) Yhteenveto teoksessa Vaccines 85, Lerner, R. A., R.M. Chanock ja F. Brown (toim.), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold 10 Spring Harbor, New York, pp. 388 - 389], sen tyyppi- tai ryhmäspesifisyys, potilaan antiseerumin tai immuunijärjestelmän solujen kyky tunnistaa kyseinen antigeeni ja/tai antigeeniä vastaan spesifisten antiseerumien tai immuuni-järjestelmän solujen suojäävien vaikutusten osoittaminen. 15 Lisäksi antigeenin koodaamassa epitoopissa tulisi lisäksi saman patogeenin eri isolaatioissa esiintyä edullisesti vähäistä ajan mittaan ilmenevää antigeenivaihtelua tai tämän tulisi puuttua täysin.
Edullisessa sovellutusmuodossa heterologinen jakso 20 koodaa patogeenin immunogeenisesti tehokasta määräävää epitooppia. Lisäksi molekyylit, jotka ovat hapteeneja (ts. antigeenisiä mutta eivät immunogeenisia) voidaan myös ilmentää yhdistelmätlagelliinina, koska flagelliini voi toimia kantajamolekyylinä, jonka läsnäolo tekee hapteenin 25 immunogeeniseksi. Yhdistelmätlagelliineilla, jotka sisäl tävät vasta-aineen kanssa reaktiokykyisiä epitooppeja mutta jotka eivät kykene aiheuttamaan immuunivasteita, on kuitenkin potentiaalista käyttöä immuunimäärityksissä.
Peptidit tai proteiinit, joiden tiedetään sisältä-30 vän antigeenisiä determinantteja, voidaan liittää yhdis-.· telmäflagelliineihin. Jos jotkin tietyt antigeenit ovat tuntemattomia, on suoritettava immunologisesti reagoivien jaksojen tunnistus ja luonnehtiminen. Yksi tapa tämän suorittamiseksi on käyttää monoklonaalisia vasta-aineita, 35 jotka on muodostettu patogeenin pinta- tai muita molekyy- ! * 23 1 0 4 6 3 8 lejä vastaan. Peptidijaksoja, joita vasta-aineet kykenevät tunnistamaan, kutsutaan epitoopeiksi. Vaihtoehtoisesti voidaan kantajamolekyyleihin liitetyistä pienistä peptideistä testata niiden kyky aikaansaada sellaisten mono-5 klonaalisten vasta-aineiden muodostuminen, jotka sitoutuvat peptidiä vastaaviin kohtiin täysimittaisessa proteiinissa [ks. esim. Wilson, I.A., et ai., (1984), Cell 37, 767] . Tämän keksinnön piiriin kuuluvat myös muut tällä alalla tunnetut keinot, joita voidaan käyttää antigeenis-10 ten determinanttien tunnistamiseen ja luonnehtimiseen.
Yhdessä erityisessä sovellutusmuodossa voidaan tämän keksinnön mukaista käyttöä varten eristää mikä tahansa DNA-jakso, joka koodaa Plasmodiumin epitooppia, joka fla-gelliinin fuusioproteiinina ilmentyessään on immunogeeni-15 nen selkärankaisisännässä. DNA-lähteiksi soveltuviin Plasmodium- lajeihin kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, ihmisen malariaparasiitit P. falciparum, P. mala-riae, P. ovale, P. vivax ja eläinten malariaparasiitit P. berghei, p. yoelii, P. knowlesi ja P. cynomolgi. Anti-20 geenit tai niiden fragmentit, joita voidaan ilmentää fla-gelliinin fuusioproteiineina, ovat antigeenejä, joita ma-lariaparasiitti ilmentää missä tahansa elinkiertonsa vaiheessa, kuten sporotsoiittivaiheessa, eksoerytsosyyttivai-heessa (kehittyminen maksan parenkyymisoluissa) , aseksuaa-·· 25 lisessa erytrosyyttivaiheessa tai seksuaalisissa vaiheissa (ts. gameetti-, tsygootti- tai ookineettisessä vaiheessa). Yhdessä erityisessä sovellutusmuodossa ilmennettävä hete-rologinen epitooppi on Plasmodium-lajin sirkumsporotsoiit-ti (CS) -proteiini (ks. esim. 1) . Analogisia CS-proteiine-30 ja on tunnistettu kaikkien testattujen Plasmodium-lajien ' sporotsoiittien pinnoilla. Heikennetyissä Salmonella-la jeissa ilmennettyjä sirkumsporotsoiittiproteiiniantigeene-jä voidaan käyttää elävinä rokotteina, jotka on suunnattu sporotsoiitteja vastaan, jotka ovat naaraspuolisen Anophe-35 les-moskiiton välityksellä siirtyvän malariaparasiitin “ 104638 elimistöön tunkeutuva muoto. Mitä tahansa sellaisella CS-proteiinin alueella olevaa epitooppia, joka on tärkeä suo-jaavan humoraalisen tai soluvälitteisen immuunivasteen induktiossa, voidaan käyttää tässä esitetyissä rokotefor-5 mulaatioissa. [Ks. esim. Dame, J.B., et ai., (1984) Science 225, 593, Arnot, D.D., et ai., (1985) Science 230, 815, Weber et ai., (1987) Exp. Parasitol. 63, 295, Enea, V., et ai., (1984) Science 225, 628, Enea, V., et ai., (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 81, 7520, Godson, G.N. et 10 ai., (1983) Nature 305, 29 ja McCutchan, T.F., et ai., (1985) Science 230, 1381, jotka viitteet on liitetty tähän hakemukseen viittauksella]. Tämän keksinnön mukaisesti valmistetut yhdistelmäbakteerit voivat esimerkiksi yhdessä sovellutusmuodossa ilmentää peptidiä asn-ala-asn-pro, joka 15 edustaa P. falciparumin immunodominanttia toistuvaa CS- epitooppia. Toisessa sovellutusmuodossa voidaan ilmentää peptidiä asp-pro-ala-pro-pro-asn-ala-asn, joka edustaa P. berghein CS-proteiinin immunodominanttia toistuvaa epitooppia. Vielä yhdessä erityisessä sovellutusmuodossa voi-20 daan ilmentää P. falciparumin CS-proteiinin Th2R-epi-tooppia [Good, M.F., et ai., (1987) Science 235, 1059] flagelliinin yhdistelmäproteiinina rokoteformulaatoissa. Vielä yhdessä sovellutusmuodossa flagelliinin yhdistelmä-fuusioproteiinina ilmennettävä heterologinen epitooppi 25 käsittää koleratoksiinin B-alayksikön peptidin. Julkaisussa Jacob et ai. kuvataan sopivia peptidejä. Kuten julkaisussa [Jacob et ai., (1983) Proc. Natl. Acad. Sei.
U.S.A. 80, 7611] kuvataan, on syntetisoituja peptidejä, jotka vastaavat koleratoksiinin B-alayksikön useita aluei-30 ta ja nämä on liitetty immunogeeniseen kantaja-aineeseen yritettäessä määrittää ne epitoopit, jotka aiheuttavat neutraloivien vasta-aineiden syntymisen. Kun näitä konju-gaatteja käytettiin synnyttämään vasta-aineita kaniineissa, osoitettiin niistä yhden, aminohappoja 50 - 64 vastaa-35 van (peptidin CTP3) aiheuttavan sellaisten vasta-aineiden i
J
25 1 0 4 6 3 8 muodostumisen, jotka tunnistivat natiivin toksiinin ja neutraloivat kokonaisen toksiinin sekä biokemiallisen (adenylaattisyklaasin aktivaatio) ja biologisen (nesteen eristys suolesta) vaikutuksen. [Jacob, C.O. et ai., (1984) • 5 Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 81, 7893] .
Muihin epitooppeihin, joita voidaan ilmentää fla-gelliinin fuusioproteiineina, kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, seuraavat epitoopit: respiratory ! syncytial viruksen (RSV) G-proteiinin epitoopit [Collins 10 et ai., (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 81, 7683], poliovirus I:n VPl:ssä olevat neutraloivat epitoopit [Emi-ni, E., et ai., (1983) Nature 304, 699], HIV I:n vaipan glykoproteiineissa olevat neutraloivat epitoopit [Putney, S.D., et ai., (1986) Science 234, 1392 - 1395], Hepa- 15 tiitti-B:n pinta-antigeenissa olevat epitoopit [Itoh, Y., et ai., (1986) Nature 308, 19, Neurath., A.R., et ai., (1986) Vaccine 4, 34], difteriatoksiinin epitoopit [Audibert, F., et ai., (1981) Nature 289, 543], strepto-coccuksen 24M-epitooppi [Beachey, E.H., (1985) Adv. Exp.
20 Med. Biol. 185, 193], ja gonokokkien piliinissä olevat epitoopit [Rothbard, J.B. ja Schoolnik, G.K., (1985) Adv.
Exp. Med. Biol. 185, 247] .
Tässä kuvatuissa rokoteformulaatioissa käytettävät flagelliinin fuusioproteiinit voivat myös käsittää hetero-·· ' 25 logisen organismin epitoopin, joka sitten kun fuusiopro- teiini on viety selkärankaisisäntään, aiheuttaa immuunivasteen, joka antaa suojan epitooppia sisältävän antigeenin aiheuttamaa sairaustilaa tai tautia vastaan. Esimerkiksi tässä tämän keksinnön mukaisessa sovellutusmuo-30 dossa voidaan käyttää flagelliinin fuusioproteiineja, jot- ka koodaavat käärmeen myrkyn, mehiläisen myrkyn, hormonin, sperman, (ehkäisyä varten), allergiaa aiheuttavan antigeenin tai minkä tahansa muun antigeenin epitooppia, jota vastaan immuunivasteen halutaan syntyvän. Yhdessä erityi-35 sessä sovellutusmuodossa voidaan ilmentää rasvasolujen * • 26 1 0 4 6 3 8 kalvossa olevan antigeenin epitooppia flagelliinin yhdis-telmäproteiinina sellaisen rokotteen formuloimiseksi, joka vähentää ravintona käytettävien eläinten rasvapitoisuutta. Toisessa sovellutusmuodossa voidaan flagelliinin yhdistel-5 mäfuusioproteiinina ilmentää tuumorispesifistä antigeeniä suojaavan immuunivasteen synnyttämiseksi syöpää vastaan. Vielä yhdessä sovellutusmuodossa voidaan bakteerin entero-toksiinin epitooppia myös ilmentää flagelliinifuusioprote-iinina. Useiden bakteerien enterotoksiinien nukleotidijak-10 sot ja niistä johdetut aminohappojaksot on määritetty [Me-kalanos, J.J., et ai., (1983 Nature 306, 551, Leong, J. , et ai., (1985) Infect. Immun. 48, 73].
Toisessa tämän keksinnön mukaisessa sovellutusmuodossa useita B-solujen epitooppeja sisältäviä laajoja pro-15 teiinialueita koodaavia DNA-jaksoja (ts. kiertävien vasta-aineiden välittämän immuunivasteen induktioon kykeneviä epitooppeja) voidaan liittää flagelliinigeeniin ilmennettäväksi flagelliinin fuusioproteiineina. Luontaisia T-aut-tajasoluepitooppeja sekä vasta-aineita synnyttäviä epi-20 tooppeja käyttämällä voidaan siten suorittaa esikäsittely, josta seuraa immuunivasteen nopea kohoaminen potilaan joutuessa kosketuksiin patogeenisen heterologisen organismin kanssa.
Tämän keksinnön mukaisesti valmistettuna yhdistel-25 mäflagelliinina ilmennettävää heterologista epitooppia koodaavat geenijaksot voidaan eristää tunnetuilla menetelmillä ja näihin kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, puhdistus mikro-organismin genomin DNA:sta, mikro-organismin RNA:sta tapahtuva cDNA:n systeesi, yhdistel-30 mä-DNA-menetelmät (Maniatis, T., et ai., (1982) Molecular Cloninq, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laborato-ry, Cold Spring Harbor, New York) tai kemiallinen synteesi .
27 1 0 4 6 3 8
Yhdistelmäflagelliinigeenien synteesi Tämän keksinnön mukaisesti valmistetun yhdistelmä-flagelliinigeenin konstruktiossa flagelliinigeenin jaksoissa on niihin lisättyjä jaksoja tai sen jaksoja korvaa-5 vat heterologisen organismin epitooppia(eja) koodaa(vat) jakso(t) .
Tulisi ensin tunnistaa ne flagelliinigeenin alueet, joihin heterologiset jaksot lisätään tai joita nämä korvaavat. Halutaan säilyttää ne flagelliinijaksot, joita 10 tarvitaan ja jotka ovat riittävät flagelliiniproteiinin kuljettamiseksi flagellan ääripäähän (tai koukkuun uuden flagellafilamentin aloittamiseksi). Säilytettäessä nämä osat saadaan yhdistelmäflagelliinimolekyyli, jolla on säilynyt kyky ilmentyä solun pinnalla flagellafilamenttina, 15 mikä helpottaa muiden yhdistelmämolekyylien eristystä ja puhdistusta, kun niitä tarvitaan alayksikkörokotteiden komponenteiksi tai kun niitä elävässä rokotesovellutusmuo-dossa tarvitaan helpottamaan immuunijärjestelmälle tapahtuvaa esittämistä.
20 Useiden bakteerien flagellojen rakenteellisessa analyysissa on paljastunut se seikka, että eri bakteereista eristetyille filamenteille on yhteistä niiden rakentuminen samalla tavalla [Wei, L.-N. ja Joys, T. M., (1985) J. Mol. Bio. 186, 791, DeLange, R. J., et ai., (1976) J.
*· 25 Biol. Chem. 251, 705, Gill, P. R. ja Agabian, J. , Biol.
Chem. 258, 7395] . Huomattavinta on se, että näiden molekyylien amino- ja karboksiterminaalisiss.a päissä on korkeanasteista proteiinisekvenssin homologiaa (mikä viittaa siihen, että näitä alueita tarvitaan rakenteen koossapysy-30 miseksi ja/tai flagellan toiminnassa) ja että niiden kes- :* kiosassa esiintyy polymorfinen alue, josta eri flagellois- • .
sa esiintyvä antigeenien monimuotoisuus on peräisin [id. ks. myös lino, T. (1977) Ann. Rev. Genet. 11, 161 - 182 ja siinä siteeratut viitteet]. Tämän suurta vaihtelua sisäl-35 tävän keskusosan rakenteelliset rajoitukset ovat vähäisiä, « 28 104638 sillä on eristetty isolaatioita, jotka eroavat sekä amino-happoryhmien lukumäärän että primaarirakenteen suhteen.
Yhdessä edullisessa sovellutusmuodossa heterologis-ta epitooppia koodaava DNA-jakso liitetään tai sillä kor-5 vataan flagelliinimonomeerin keskeinen suurta vaihtelua sisältävä jakso. Tämä sovellutusmuoto sallii sellaisten yhdistelmätlagelliinimonomeerien konstruktion, joissa kyky kokonaisten flagellojen muodostukseen voi olla säilynyt. Kyvystä rakentua flagelloiksi seuraa elävän rokoteformu-10 laation ollessa kyseessä se, että heterologinen, kussakin flagelliinimonomeerissä esiintyvä epitooppi esitetään in vivo-isännän immuunijärjestelmälle suurena pitoisuutena. Esittäminen organisoituna polymeerirakenteena tuottaa mahdollisesti vahvemman antigeenistimulaation kuin sama mate-15 riaali monomeerina. Bakteerissa suoritettavassa ilmentämisessä bakteerien ulkopinnalla olevien flagellojen esiintyminen mahdollistaa heterologisen epitoopin esittämisen tehokkaalla tavalla. Lisäksi kokonaisen flagellan muotoon tapahtuva koostaminen helpottaa yhdistelmäflagelliinimole-20 kyylien puhdistusta, koska tunnetaan useita tällaisia puhdistusmenetelmiä ja näitä menetelmiä voidaan käyttää. Edullisimmassa sovellutusmuodossa bakteerin liikkumattoman parentaalikannan ilmentämät yhdistelmäflagelliinimolekyy-lit tuottavat toiminnallisia flagelloja, joista saadaan 25 liikkuvia bakteereja, jotka siten voivat esittää heterolo gisen epitoopin isännän immuunijärjestelmälle tehokkaammin kuin liikkumaton kanta sen johdosta, että vieras epitooppi esiintyy bakteerien ulkopinnalla ja mahdollisesti sen johdosta, että niiden liikkuvuus tekee ne paremmin elimistöön 30 tunkeutuviksi.
Kuten esimerkit sisältävässä osassa kuvataan, olem-
• I
me kyenneet liittämään Salmonella muenchenin flagelliini-geenin keskiosan suurta vaihtelua sisältävään alueeseen DNA:ta, joka koodaa heterologisten organismien epitooppe- l I ..
i · 104638 29 ja, ilman, että flagellan ulkopuolisten osien muodostuminen ja kokoonpano on pahasti häiriytynyt.
Yhdistelmäflagelliinigeenin konstruoimiseksi voidaan käyttää useita tunnettuja strategioita. Flagelliini- • 5 geenin ja heterologisen geenin asianmukaiset jaksot voi daan pilkkoa tällä alalla tunnetuilla menetelmillä sopivista kohdista restriktioendonukleaas(e)illa, eristää ja liittää ligaasin avulla yhteen. Jos restriktioendonukleaa-silla suoritettu pilkkominen muodostaa kohesiiviset päät, 10 ei tarvita DNA:n muunlaista modifiointia ennen ligaatiota. Jos restriktioendonukleaasilla suoritetusta pilkkomisesta ei kuitenkaan ole muodostettavissa kohesiivisia päitä tai muut kohdat kuin saatavilla olevat kohdat ovat edullisempia, voidaan käyttää mitä tahansa monista tällä alalla 15 tunnetuista menetelmistä heterologisen DNA:n ligaation suorittamiseksi haluttuihin kohtiin. Esimerkiksi restrik-tioentsyymillä suoritetun pilkkomisen jälkeen voidaan tehdä modifikaatio tasaisten päiden muodostamiseksi pilkkomalla yksinauhaiset DNA-päät takaisin päin tai täyttämällä 20 ne ennen ligaatiota. Vaihtoehtoisesti voidaan flagelliinigeenin tai heterologisen DNA:n pilkkomisen tuloksena olevat päät "pureskella pois" jakson osien poistamiseksi käyttäen nukleaasia kuten Bal 31 -nukleaasia, eksonukleaa-si-III:a, lambda-eksonukleaasia, mungpavun nukleaasia tai ·· 25 T4-DNA-polymeraasin eksomukleaasiaktiivisuutta, joitakin esimerkkejä mainitaksemme. Oligonukleotidijakso (kytkijä-jakso) , joka koodaa yhtä tai useampaa restriktiokohtaa, voidaan liittää flagelliinigeenin alueeseen liittämällä tämä ligaasin avulla DNA:n päihin. Tämän jälkeen suoritet-30 tava heterologisen geenijakson liittäminen kloonausrest- • riktiokohtaan siten, että molemmat jaksot ovat oikeassa •.
lukukehyksessä, joka ei keskeydy translaation lopetussig-naaleihin, antaa tulokseksi konstruktion, joka ohjaa fla-gelliinin fuusioproteiinin tuottoa. Kytkijäjaksoa voidaan 35 myös käyttää sopivien restriktiokohtien muodostamiseen 30 1 0 4 6 3 8 heterologiseen geenijaksoon. Lisäksi voidaan flagelliini-jakso tai heterologiset geenijaksot mutatoida in vitro tai in vivo uusien restriktioendonukleaasikohtien muodostamiseksi tai olemassaolevien kohtien hävittämiseksi in vit-5 ro -ligaatiomenetelmien käytön helpottamiseksi. Voidaan käyttää mitä tahansa tällä alalla tunnettua mutageneesi-menetelmää mukaanlukien in vitro kohdemutageneesi [Hutchinson, C., et ai., (1978) J. Biol. Chem. 253, 6551],
Tab™-kytkijäjaksojen (Pharmacia) käyttö jne.
10 Tietty nimenomainen strategia geenifuusion konstru oimiseksi riippuu käytetystä nimenomaisesta flagelliini-jaksosta, joka korvataan tai johon liitos suoritetaan, sekä liitettävästä heterologisesta geenistä.
Yhdistelmätlagelliinigeeni tulisi konstruoida vek-15 torissa tai siirtää sellaiseen vektoriin, joka kykenee replikoitumaan ja ilmentymään bakteeri-isännässä. Edullisessa sovellutusmuodossa voidaan yhdistelmätlagelliinigee-ni myös liittää bakteerin kromosomaaliseen DNA:hän. Yksi tapa, jolla tämä voidaan tehdä, on rekombinaation avulla 20 tapahtuva tekijöiden vaihto plasmidissa olevan flagellii-nigeenin kanssa. Vaihtoehtoisessa sovellutusmuodossa yh-distelmäflagelliinigeeni voidaan liittää kloonausvekto-riin, joka voi esiintyä episomaalisessa muodossa, ts. plasmidiin tai bakteriofaagiin, jota sitten käytetään ·· 25 transformoimaan tai infektoimaan isäntäsolut, joissa yh- distelmä-DNA replikoituu ja ilmentyy.
Isäntinä olevien bakteerien transformaatiolla DNA-molekyyleilla, joissa yhdistelmätlagelliinigeeni on liittyneenä, on flagelliinijaksosta mahdollista saada syn- 30 tymään useita kappaleita. Useita eri vektorisysteemejä .* voidaan käyttää bakteerina olevasta isännästä tapahtuvaan • .
ilmentämiseen ja näihin kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, plasmidit, kuten pUC-plasmidit ja niiden johdannaiset, pBR322-plasmidi ja sen johdannaiset, bakte-35 riofaagi, kuten lambda ja sen johdannaiset ja kosmidit.
H · • i 3i 104638
Erityisessä sovellutusmuodossa kuuluvat ColEl-tyyppiset replikonit plasmidikloonausvektoreihin, joita voidaan käyttää [ks. lisätietoja tästä julkaisusta Oka et ai., (1979) Mol. Gen. Genet. 172, 151 - 159]. ColEl-plasmidit 5 lisääntyvät pysyvästi E. coli- ja Salmonella typhimurium -kannoissa monomeerisinä molekyyleinä, joiden kopioiden lukumäärä on noin 15 - 20 kappaletta solua kohti.
Voidaan käyttää useita eri sääteleviä ilmentymise-lementtejä, jotka ovat mitkä tahansa bakteereissa aktiivi-10 sista lukuisista sopivista transkriptio- ja translaatio-elementeistä. Esimerkiksi promoottoreihin, joita voidaan käyttää ohjaamaan yhdistelmäflagelliinijakson ilmentämistä, kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, E. colin laktoosioperonin promoottori, hybridi trp-lac 15 UV-5-promoottori (tae) [DeBoer, H., et ai., (1982) teoksessa Promoter Structure and Function, Rodriguez, R.L. ja Chamberlain, M.J., toim., Praeger Publishing, New York], vasemmalle (PL) ja oikealle (PR) orientoituneet bakterio-faagi lambdan promoottorit, T7-bakteriofaagin promoottori, 20 trp-operonin promomoottori, lpp-promoottori [E. colin li-poproteiinigeenin promoottori, Nakamura, K. ja Inouye, I., (1979) Cell 18, 1109 - 1117] jne. Voidaan myös käyttää muita promoottoreita, jotka on tuotettu yhdistelmä-DNA-tai synteettisillä menetelmillä liitettyjen jaksojen 25 transkription aikaansaamiseksi. Vaihtoehtoisesti voidaan käyttää luontaista flagelliinipromoottoria.
Tarvitaan myös erityisiä aloitussignaaleja liitettyjen proteiinia koodaavien jaksojen tehokasta translaatiota varten. Näihin signaaleihin kuuluvat ATG-aloitusko-30 doni ja tämän vieressä olevat jaksot. Niissä tapauksissa, joissa oman aloituskodoninsa ja sen viereiset jaksot sisältäviä natiiveja flagelliinigeenin jaksoja liitetään sopiviin ilmentämisvektoreihin, ei ehkä tarvita muita translaatiota ohjaavia signaaleja. Niissä tapauksissa, 35 joissa natiiveja flagelliinin translaatiosignaaleja ei • < 32 1 0 4 6 3 8 esiinny, täytyy tuoda saataville ulkopuolisia translaatiota ohjaavia signaaleja, ATG-kodoni mukaanluettuna. Aloituskodonin tulee olla lisäksi oikeassa vaiheessa proteiinia koodaavan jakson lukukehyksessä, jotta koko liite-5 tyn jakson translaatio varmistuisi. Nämä ulkopuoliset translaatiota ohjaavat signaalit ja aloituskodonit voivat olla peräisin useista eri lähteistä, jotka voivat olla sekä luontaisia että synteettisiä.
Sopivien ilmentämisvektoreiden konstruoint imene tel-10 miin voi kuulua in vitro -yhdistelmä-DNA- ja synteettiset menetelmät ja in vivo-rekombiantit (geneettinen rekombinaatio) .
Katsaukset geenien ilmentämisen maksimoimisesta ovat löydettävissä julkaisuista Roberts ja Lauer, (1979) 15 Meth. Enzymol. 68, 473 ja Reznikoff, W. ja Gold, M., (1986) Maximizing Gene Expression, Plenum Press, New York.
Cohenille ja Boyerille myönnetty US-patentti nro 4 237 224 kuvaa yhdistelmäplasmidien tuoton käyttäen menetelmiä, joissa pilkkominen suoritetaan restriktioentsyy-20 meillä ja liittäminen DNA-ligaasilla tunnettuja ligaatio-menetelmiä käyttäen. Nämä yhdistelmäplasmidit viedään sitten transformaation tai elektroporaation avulla yksisoluisiin viljelmiin, joihin kuuluvat prokaryoottiset organismit ja kudosviljelmässä kasvatetut eukaryoottisolut, ja 25 niiden annetaan replikoitua näissä soluissa.
Toisen menetelmän yhdistelmä-DNA-molekyylien viemiseksi yksisoluisiin organismeihin ovat kuvanneet Collins ja Hohn US-patenttijulkaisussa nro 4 304 863. Tässä menetelmässä käytetään hyödyksi bakteriofaagivektorien (kosmi-30 dien) pakkaus/transduktiosysteemiä.
;* Ilmentäminen isäntänä olevassa bakteerissa
Ilmentämisvektori, joka käsittää yhdistelmäflagel-liinijakson, tulee sitten siirtää isäntäsoluna olevaan bakteeriin, jossa se voi replikoitua ja ilmentyä. Tämä 35 voidaan suorittaa useilla tunnetuilla menetelmillä, mai- i • i 33 104638 nittuihin kuitenkaan rajoittumatta, mukaanlukien transformaation (ts. eristetyn plasmidi-DNA:n transformaation heikennettyyn isäntänä olevaan bakteeriin), faagitransduktion [Schmeiger, (1972) Mol. Gen. Genetics 119, 75], isäntäso-5 luina olevien bakteerien välisen konjugaation, elektropo-raation jne.
Erityisessä sovellutusmuodossa voidaan mitkä tahansa isäntinä olevat heikennetyt bakteerit, jotka ilmentävät yhdistelmäflagelliinia, formuloida eläviksi rokotteiksi. 10 Näihin bakteereihin kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, heikennetyt elimistöön tunkeutumiskykyiset kannat ja heikennetyt Campylobacter-, Shigella- tai Esche-richia-laj it.
Ilmentäminen heikennetyissä elimistöön tunkeutumis-15 kykyisissä bakteereissa Tämän keksinnön mukaisessa edullisessa sovellutus-muodossa siirretään ilmentämisvektori, joka käsittää yhdistelmäf lagelliinijakson, heikennettyyn elimistöön tun-keutumiskykyiseen bakteeriin, jossa se ilmentyy ja tuottaa 20 siten bakteerikannan, joka soveltuu käytettäväksi elävänä rokotteena.
Valmistettavissa rokoteformulaatioissa voidaan käyttää mitä tahansa useista eri heikennetyistä elimistöön tunkeutumiskykyisistä bakteereista kantajana, joka ilmen-’** 25 tää yhdistelmäf lagelliinia niin, että sen heterologinen epitooppi tulee esitetyksi tehokkaasti isännän immuunijärjestelmälle. Rokotebakteereilla säilyvät niiden invaasio-ominaisuudet mutta suuri osa niiden virulentti-sista ominaisuuksista häviää, jolloin tämän seurauksena ne 30 voivat lisääntyä isännässä rajoitetusti, mutta eivät riittävästi aiheuttaakseen merkittävää tautia tai sairautta.
•«
Esimerkkeihin elimistöön tunkeutumiskykyisistä bakteereista, joita voidaan käyttää rokoteformulaatioissa, kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, Salmonella spp., 35 elimistöön tunkeutumiskykyinen E. coli (EIEC) ja Shigella 9 · 34 104638 spp. Edullisessa sovellutusmuodossa käytetään elimistöön tunkeutumiskykyisiä bakteereja, jotka esiintyvät lymfaku-doksissa kuten pernassa (ts. Salmonella spp.). Nämä bakteerit voivat tunkeutua suoliepiteelikudokseen ja/tai 5 Peyerin mukaan nimitettyihin ohutsuolen imusolmukkeisiin, levitä retikuloendoteelijärjestelmään ja päästä suoli-liepeen lymfakudokseen, maksaan ja pernaan, jossa ne lisääntyvät tai jonne ne jäävät elinkykyisiksi joksikin aikaa ja aiheuttavat kiertäviin vasta-aineisiin perustuvan 10 ja soluvälitteisen immuniteetin.
Heikennetyt elimistöön tunkeutumiskykyiset bakteerit voidaan saada useilla menetelmillä, joihin kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, kemiallinen muta-geneesi, geneettinen insertio ja deleetio [Miller, J., 15 (1972) Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Har bor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York] tai rekombinaatio yhdistelmä-DNA-menetelmiä käyttäen [Maniatis, T., et ai., (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New 20 York], luonnollisten mutaatioiden selektio laboratorio- olosuhteissa jne. Menetelmiä sellaisten heikennettyjen Salmonella-kantojen aikaansaamiseksi, jotka ovat revertoi-tumattomia ei-virulenttisia auksotrofisiä mutantteja ja jotka soveltuvat elävinä rokotteina käytettäviksi, kuvaa 25 Stocker US-patenttijulkaisussa 4 735 801 ja 4 837 151, jotka liitetään tähän kokonaisuudessaan viittauksella. Luotettava menetelmä Salmonellan heikentämisen aikaansaamiseksi on kuvattu [Hoiseth, S.K. ja Stocker, B.A.D., (1981) Nature 291, 238, Stocker B.A.D., et ai., (1982) 30 Develop. Biol. Standard 53, 47 ja US-patenttijulkaisu nro 4 550 081] ja tätä voidaan käyttää tämän keksinnön mukai- * € sessa tietyssä sovellutusmuodossa.
Heikennettyihin Salmonella-kantoihin, joita voidaan käyttää elävissä rokoteformulaatioissa, kuuluvat, luetel ψ • < 104638 35 tuihin kuitenkaan rajoittumatta, taulukossa 2 luetellut laj it.
Taulukko 2 5
Salmonella-lajit, joita heikennetyssä muodossa voidaan käyttää tämän keksinnön mukaisissa rokoteformulaatioissa1 S. typhi 10 S. typhimurium S. paratyphi A S. paratyphi B S. enteritidis (esim. serotyyppi dublin) 15
Erityisissä sovellutusmuodoissa voidaan käyttää Salmonella-bakteereita, jotka on heikennetty deletoimalla kromosomaalinen(set) geeni(t) aromaattisten yhdisteiden biosynteesiä varten (aro), tai mutaatiolla galE-geenissä 20 tai jotka ovat cya', crp', vir-plasmidi1 jne. Aro-mutanttei-hin, joita voidaan käyttää, kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, S. typhi -kannat 543Ty ja 541Ty käytettäväksi ihmisille tarkoitetuissa rokotteissa ja S. typhimurium SL3261 ja SL1479 ja S. enteriditis serotyyppi 25 dublin SL1438, (jota nimitetään myös S. dubliniksi) käytettäväksi eläimissä (ks. US-patentttijulkaisu nro 4 550 081, jossa kuvataan S. typhimurium -kanta SL1479 ja S. dublin -kanta SL1438). S. typhi -kannat kuten 543Ty ja 541Ty ovat ei-virulenttisia ihmisissä, joka johtuu niiden 30 heikentämisestä deleetiolla, jotka vaikuttavat aroA-ja/tai purA-geeneihin [Levine, M.M., et ai., (1987) J.
• < •» Täydellinen kuvaus Salmonellan serotyypeistä on esitetty julkaisussa Edwards ja Ewing, (1986) Classification of the 35 Enterobacteriaceae, 4. painos, Elsevier, N.Y.
104638 36
Clin. Invest. 79, 888]. S. dublinin rautantteja kuten SL1438 ja S. typhimuriumin mutantteja kuten SL3261 voidaan käyttää eläinmallisysteemien kehittämisessä, koska nämä lajit kykenevät aiheuttamaan lavantautia vastaavia eläin-5 ten tauteja. galE-mutantteihin, joita voidaan käyttää, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, kuuluvat Salmonella typhi -kannat Ty21a [Germanier, (1984) Bacterial Vaccines, Academic Press, NY sivut 137 - 165] , Salmonella typhimu-rium G30D jne.
10 Edullisessa sovellutusmuodossa voidaan yhdistelmä- flagelliinigeenin sisältävä plasmidi-ilmentämisvektori eristää ja luonnehtia E. colissa ennen sen siirtämistä heikennettyyn Salmonella-kantaan esim. faagitransduktiolla [Schmeiger, (1972) Mol. Gen. Genetics 119, 75], koska E. 15 coli K12 -kannassa on suhteellisesti korkeammat transfor-maatiofrekvenssit kuin Salmonella -kannoissa kuten S. typhimuriumissa.
Yhdistelmäf lagelliinina ilmennetyn (ty jen) heterolo-gis(t)en epitoopin(pien) immunologisen tehokkuuden 20 määrittäminen
Elävän rokoteformulaation muodossa olevan yhdistelmäf lagelliinina ilmennetyn heterologisen epitoopin immunologinen tehokkuus voidaan määrittää seuraamalla koe-eläin-ten immuunivastetta yhdistelmäflagelliinia ilmentävillä 25 bakteereilla suoritetun immunisoinnin jälkeen. Alayksikkö-rokoteformulaation tapauksessa koe-eläinten immuunivastetta voidaan seurata sellaisen immunisoinnin jälkeen, joka on suoritettu eristetyllä yhdistelmäflagelliinimolekyylil-lä, joka on flagelliinifilamenttien tai monomeerin muodos-30 sa ja joka voidaan formuloida sopivien lisäaineiden kanssa immuunivasteen tehostamiseksi. Sopiviin lisäaineisiin kuu- • · luvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, mineraali-geelit, esim. aluminiumhydroksidi, pinta-aktiiviset aineet kuten lysolesitiini, pluroniset polyolit, polyanionit, 35 peptidit, öljyemulsiot ja potentiaalisesti käyttökelpoiset 104638 37 ihmisen adjuvantit, kuten BCG (Bacille Calmette-Guerin) ja Corynebacterium parvum. Koe-eläimiin voivat kuulua hiiret, marsut, kaniinit, kananpojat, simpanssit ja muut kädelliset ja lopulta koehenkilöinä olevat ihmiset. Immunogeenin 5 antomenetelmiin voivat kuulua antaminen suun kautta, ihon sisäisesti, lihaksensisäisesti, vatsaontelonsisäisesti, ihonalaisesti, nenänsisäisesti tai mitä tahansa muuta tavallista immunisoinnin suoritustietä käyttäen.
Kokeen kohteena olevien yksilöiden immuunivaste 10 voidaan analysoida useista eri lähtökohdista käsin, kuten (a) tuloksena olevan immuuniseerumin reaktiivisuudesta heterologisen epitoopin sisältävää natiivia antigeeniä tai sen fragmenttia vastaan tai eristettyä luonnossa esiintyvää heterologista organismia vastaan määritettynä tunne-15 tuilla menetelmillä, esim. entsyymivälitteisellä im-munosorbenttimäärityksellä (ELISA), immunobloteilla, ra-dioimmuunisaostumilla jne., (b) immunisoiduista yksilöistä eristettyjen lymfosyyttien reaktiivisuudesta natiivia antigeeniä tai sen fragmenttia tai heterologista organismia 20 vastaan määritettynä tunnetuilla menetelmillä, esim. blas-togeenisen vasteen määrityksillä, sytotoksisuusmäärityk-sillä, viivästyneen yliherkkyyden määrityksillä jne. (c) immuuniseerumin kyvystä neutraloida in vitro -olosuhteissa organismin infektiokykyä tai natiivin antigeenin biologis-.. 25 ta aktiivisuutta ja (d) suojauksesta sairautta vastaan ja/tai infektion oireiden lieventymisestä immunisoiduissa eläimissä.
Rokotteen formulaatio
Heterologisen organismin epitoopin käsittävät yh-30 distelmäflagelliinit formuloidaan rokotekäyttöä varten. Nämä rokoteformulaatiot voivat käsittää eläviä rokotteita tai alayksikkörokoteformulaatioita. Rokoteformulaatioilla on käyttöä sekä ihmisissä että eläimissä.
38 1 0 4 6 3 8
Elävät bakteerit rokotteina Tässä käsiteltävän sovellutusmuodon tarkoitus on formuloida rokote, jossa immunogeeni on heikennetty elimistöön tunkeutumiskykyinen bakteerikanta, joka ilmentää 5 yhdistelmätlagelliinia, joka käsittää heterologisen or ganismin epitoopin, jotta se muodostaisi sellaisen immuunivasteen (kiertäviin vasta-aineisiin perustuvan ja/tai soluvälitteisen vasteen) heterologista epitooppia vastaan, joka antaa suojaa organismin aiheuttamia infektioita vas-10 taan tai organismin antigeenin aiheuttamia sairaustiloja tai tauteja vastaan. Rokotteen bakteerit käsittävät kantoja, joilla on kyky infektoida rokotettava isäntä. Edullisessa sovellutusmuodossa nämä kannat ovat heikennettyjä elimistöön tunkeutumiskykyisiä bakteereja kuten Salmonel-15 la-lajeja. Muihin sopiviin lajeihin voivat kuulua, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, Shigella ja E. coli. Edullisimmassa sovellutusmuodossa isäntäbakteerit ilmentävät yhdistelmätlagelliinigeenejä flagelliinimonomeereinä, joista rakentuu toiminnallinen flagella, joka sallii yh-20 distelmämolekyyleissä olevan heterologisen epitoopin tulevan esitetyksi suurina kappalemäärinä isännän immuunijärjestelmälle.
Elävä rokoteformulaatio voi olla yksi- tai moniva-lenttinen. Monivalenttiset rokotteet voivat olla valmis-25 tettuja yhdestä tai muutamasta yhdistelmäbakteerista, joka (jotka) ilmentää(tavat) yhtä tai useampaa heterologista epitooppia, jotka voivat olla peräisin eri organismeista. Yksi bakteeri voi ilmentää useampaa kuin yhtä saman tai eri antigeenin epitooppia. Eri epitoopit voivat ilmentyä 30 samassa yhdistelmäflagelliiniproteiinissa, saman tai eri ilmentämisvektorin koodaamissa erillisissä yhdistelmäfla- s gelliinimolekyyleissa tai eri bakteereissa.
Elävien rokoteformulaatioiden antamiseen voidaan käyttää monia menetelmiä; näihin kuuluvat, mainittuihin 35 kuitenkaan rajoittumatta, antaminen suun kautta, ihon- • t 104638 39 sisäisesti, lihaksensisäisesti, vatsaontelonsisäisesti, suonensisäisesti, ihon läpi ja nenänsisäisesti parentaali- • sen villityyppisen bakteerikannan luonnollinen infektiotie mukaanluettuna. Sovellutusmuodossa, jossa suun kautta an- 5 nettava rokoteformulaatio on tarkoitettu käytettäväksi eläimille, karjan rokottaminen voidaan suorittaa käyttämällä elävää rokoteformulaatiota karjanrehun tai juomaveden lisäaineena.
Erityisissä sovellutusmuodossa voidaan rokotteiksi 10 formuloida heikennettyjä Salmonella-bakteereja, jotka ilmentävät malarian sirkumsporotsoiittiproteiinin, kolera-toksiinin B-alayksikön, hepatiitti-B:n pinnan ja pinnan esiasteantigeenien, rotaviruksen VP7 :n polypeptidin, HIV:n vaippaglykoproteiinin ja Streptococcuksen M-proteiinin 15 epitooppeja käsittävää yhdistelmäflagelliinia.
Edullinen sovellutusmuoto on avirulentin ei-pato-geenisen Salmonellan suun kautta otettava vektorin an-tosysteemi. Tätä systeemiä käytettäessä ei ainoastaan vältytä joidenkin muiden antamisessa käytettyjen kantajien 20 kuten vacciciaviruksen ja adenoviruksen käyttöön liitty viltä sivuvaikutuksilta vaan voidaan myös tarjota käyttöön kätevä rokotteiden antotapa suun kautta. Lisäksi on odotettavissa, että suun kautta suoritettava rokotus aiheuttaa limakalvojen sekä systeemisen immunivasteen, joten .. 25 tämä lisää rokotteen immunogeenista kapasiteettia.
Alayksikkörokotteet
Flagelliinin yhdistelmäfuusioproteiinina ilmennettyä heterologista peptidiä voidaan käyttää immunogeenina alayksikkörokoteformulaatioissa, jotka voivat olla multi-30 valenttisia. Multivalenttinen rokoteformulaatio voi käsit- • t· tää yhdistelmäflagelloja tai yhdistelmätlagelliinimonomee- rejä, jotka sisältävät useamman kuin yhden heterologisen epitoopin, joka epitooppi voi olla eri organismien epi-tooppi, tai useita flagelliinimolekyyleja, joista kukin 35 koodaa erilaista heterologista epitooppia jne.
40 104658
Yhdistelmätlagelliinigeenin tuote voidaan rokote-formulaatiotarkoituksiin puhdistaa mistä tahansa heterolo-gista proteiinia ilmentävästä vektori/isäntäsysteemistä, kuten transduktoiduista tai transformoiduista bakteereis-5 ta. Bakteerien flagellan filamentit voidaan esimerkiksi poistaa helposti kokonaisesta bakteerista mekaanisin keinoin, jotka eivät vaurioita solua muulla tavalla ja joiden avulla nämä voidaan helposti puhdistaa tarvitsematta ottaa käyttöön voimakkaasti vaikuttavia denaturoivia aineita. 10 Yhdistelmäflagelliinin puhdistamiseen joko monomeereinä tai (valmiiksi rakentuneina) flagelloina voidaan käyttää tällä alalla tunnettuja vakiomenetelmiä [ks. Gill, P.R. ja Agablan, N., (1983) J. Biol. Chem. 258, 7395 - 7401,
Weissborn, A., et ai., (1982) J. Biol. Chem. 257, 2066 -15 2074, Gill, P.R. ja Agabian, N., (1982) J. Bacteriol. 15,
925 - 933, Lagenaur, C. ja Agabian, N., (1970) J. Bacteriol. 128, 435 - 444, Fukuda, A., et ai., (1978) FEBS
Lett. 95, 70 - 75, Stevenson, J.R. ja Stonger, K. A., (1980) Am. J. Vet. Res. 41(4), 650 - 653].
20 Eristetyt flagellanäytteet voidaan lisäksi solubi- lisoida (esim. dissosioimalla altistamalla ne pH 3:een tai pH ll:een alhaisessa ioniväkevyydessä, [DeLange, R.J., et ai., (1976) J. Biol. Chem. 251(3), 705 - 711) flagelliini-alayksiköiksi ja assosioida ne takaisin flagellaksi tunne- 25 tuilla menetelmillä [esim. Weissborn, A., et ai., (1982) J. Biol. Chem. 257, 2066 - 2074], jotta (a) tästä olisi apua yhdistelmäflagelliinien puhdistukseen haitallisten epäpuhtauksien poistamiseksi ja/tai (b) voitaisiin tuottaa multivalenttisessa rokoteformulaatiossa käytettäväksi tar-30 koitettua immunogeeniä assosioimalla erilaisia heterolo-.· gisia epitooppeja koodaavia yhdistelmäflagelliinimonomee- re jä.
Puhdistetut proteiinit tulee säätää sopivan vakeel vyisiksi, formuloida minkä tahansa sopivan rokotelisäai- j 35 neen kanssa ja pakata käyttöä varten. Sopiviin lisäainei- -a ΐ . - 104638 41 siin kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, mi-neraaligeelit, esim. aluminiumhydroksidi, pinta-aktiiviset ’ aineet kuten lysolesitiini, pluroniset polyolit, polyanio- nit, peptidit, öljyemulsiot ja potentiaalisesti käyttökel-* 5 poiset ihmisen adjuvantit, kuten BCG (Bacille Calmette-
Guerin) ja Corynebacterium parvum. Immunogeeni voidaan myös viedä liposomien sisään tai liittää polysakkarideihin ja/tai muihin polymeereihin rokoteformulaatioissa käytettäväksi .
10 Tapauksissa, joissa yhdistelmäflagelliinin geeni- tuote on hapteeni, ts. molekyyli, joka on antigeeninen siinä suhteessa, että se voi reagoida valikoivasti- synnyt-tämiensä vasta-aineiden kanssa, mutta ei ole immunogeeni-nen siinä suhteessa, että se ei voi aiheuttaa immuunivas-15 tetta, hapteeni voidaan sitoa kovalenttisesti kantaja-aineeseen tai immunogeeniseen molekyyliin, esimerkiksi suuri proteiini kuten seerumin albumiini tekee siihen kytketyn kapteenin immunogeeniseksi. Hapteeni-kantaja-aineyhdistel-mä voidaan formuloida käytettäväksi rokotteena.
20 Rokoteformulaatioiden antamiseen voidaan käyttää useita menetelmiä ja näihin kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, antaminen suun kautta, ihonsisäisesti, lihaksensisäisesti, vatsaontelonsisäisesti, suonensisäisesti, ihonalaisesti ja nenänsisäisesti.
25 Yhdistelmäflagelliinia vastaan suunnattujen vasta- aineiden käyttötavat Tämän keksinnön mukaisesti valmistetulla yhdistelmäf lagelliinilla suoritetussa immunisoinnissa muodostuneilla vasta-aineilla heterologisia organismeja vastaan on 30 myös mahdollisia käyttötapoja diagnostisissa immuunimääri-tyksissä, passiivisessa immuuniterapiassa ja anti-idio-tyyppisten vasta-aineiden muodostamisessa.
Muodostuneet vasta-aineet voidaan eristää tunnetuilla vakiomenetelmillä (esim. immuuniaffiniteettikroma-35 tografialla, sentrifugoinnilla, saostamisella jne.) ja 104638 42 käyttää diagnostisissa immuunimäärityksissä havaitsemaan lääketieteellisesti tai eläinlääketieteellisesti tärkeiden virusten, bakteerien tai loisien esiintyminen ihmisen tai eläimen kudoksissa, veressä, seerumissa jne. Vasta-aineita 5 voidaan myös käyttää hoidon ja/tai sairauden edistymisen seuraamiseen. Tähän tarkoitukseen voidaan käyttää mitä tahansa tunnettua immuunimäärityssysteemiä kuten jotakin seuraavaan luetteloon kuuluvaa systeemiä, joihin kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, radioimmuunimääri-10 tykset, ELISA (entsyymivälitteiset immuunimääritykset), kerrosimmuunimääritykset, presipitiinireaktiot, geelidif-fuusiopresipitiinireaktiot, immunodiffuusiomääritykset, agglutinaatiomääritykset, komplementin sitomismääritykset, immunoradiometriset määritykset, fluoresenssi-immuunimää-15 ritykset, proteiini-A -immuunimääritykset ja immunoelekt-roforeesimääritykset joitakin määrityksiä mainitaksemme.
Tässä kuvattuja rokoteformulaatioita voidaan myös käyttää sellaisten vasta-aineiden tuottamiseen, jotka on tarkoitettu käytettäväksi passiivisessa immuuniterapiassa, 20 jossa isännän lyhytaikainen suojaus saadaan aikaan antamalla heterologista organismia vastaan ennakolta muodostettua vasta-ainetta.
Tässä kuvattujen rokoteformulaatioiden muodostamia vasta-aineita voidaan myös käyttää anti-idiotyyppisen vas-25 ta-aineen tuottamiseen. Anti-idiotyyppistä vasta-ainetta voidaan puolestaan käyttää immunisointiin, jotta voitaisiin tuottaa vasta-aineiden alapopulaatio, joka sitoo läh-tömuotona käytettyä patogeenisen mikro-organismin antigeeniä [Jerne, N.K., (1974) Ann. Immunol. (Paris) 125c, 373, 30 Jerne, N.K., et ai., (1982) EMBO 234].
·· Immuunimääritykset
Vierasta(aita) epitooppia(eja) ilmentäviä tämän keksinnön mukaisia yhdistelmätlagelliinigeenituotteita tai näiden fragmentteja voidaan käyttää antigeeneinä immuuni-35 määrityksissä epitooppia(eja) vastaan suunnattujen vasta- m
iS
i 43 1 0 4 6 3 8 aineiden määrittämiseksi. Heterologista proteiinia tai sen fragmentteja voidaan myös käyttää saman(ojen) tai tätä läheisesti muistuttavan(ien) epitoopin(pien) havaitsemiseen kompetitiomäärityksissä. Yhdistelmäflagelliinituot-• 5 teitä tai niiden ilmentämää(iä) vierasta(aita) epitoop- pia(eja) voidaan käyttää missä tahansa tunnetussa immuuni-määrityssysteemissä, joihin kuuluvat, mainittuihin kuitenkaan rajoittumatta, kompetitiiviset ja ei-kompetitiiviset määrityssysteemit, joissa käytetään menetelmiä kuten ra-10 dioimmuunimääritykset, ELISA (entsyymivälitteiset immuuni -määritykset), kerrosimmuunimääritykset, presipitiinireak-tiot, geelidiffuusiopresipitiinireaktiot, immunodiffuusio-määritykset, agglutinaatiomääritykset, komplementin sito-mismääritykset, immunoradiometriset määritykset, fluore-15 senssi-immuunimääritykset, proteiini-A-immuunimääritykset ja immunoelektroforeesimääritykset, joitakin määrityksiä mainitaksemme.
Esimerkki 1
Flagelliini-miinus -rokotekannan konstruktio 20 Flagelliinia määrävien plasmidien isäntinä käytetyt kaksi elävää rokotekantaa ovat SL5927 ja SL5928. Kumpikin näistä saatiin aromaattisista aminohapoista riippuvasta S. dublin -lähtökannasta, joka oli villityyppinen flagellan ominaisuuksien suhteen, ts. liikkuva ja siinä oli yksi ... 25 flagelliinigeeni, Hl-g,p, joka määrää faasin 1 flagella- antigeeniä g,p, joka on yksifaasisen lajin, S. dublinin, luonteenomainen piirre.
SL5527 saatiin kannasta SL1437, joka on aromaattisista aminohapoista riippuva elävä rokotekanta, jonka 30 konstruktio on kuvattu US-patenttijulkaisuissa numerot ·· 4 735 801 ja 4 550 081, joista opittavat asiat liitetään tähän hakemukseen viittauksella.
SL5928 saatiin toisesta aromaattisista aminohapoista riippuvasta elävästä S. dublinin rokotekannasta, 35 SL5631, jonka konstruktio on kuvattu jäljempänä.
« 104638 44
Kumpaakin liikkumiskykyistä kantaa käytettiin vastaanottajan transduktiossa, johon käytettiin SL5609-kan-taa, joka on Hl-i-geeniin liitetyn transposonin TnlO sisältävä S. typhimurium -kanta, merkintä Hl-i merkitsee 5 faasin 1 flagella-antigeenia i. Selektio tehtiin kloonien suhteen, jotka olivat resistenttejä tetrasykliiniä vastaan, koska resipientin Hl-g,p-geeni oli korvattu donorin Hl-i::TnlO-geenillä. Risteytyksestä, jossa vastaanottajana oli SL1438, säilytettiin tetrasykliiniä vastaan resistent-10 ti klooni SL5927 ja risteytyksestä, jossa vastaanottajana oli SL5631, säilytettiin samanlainen klooni SL5928 molempien kloonien havaittiin olevan liikkumattomia (koska vil-lityypin flagelliinigeeni oli korvattu transposonin inak-tivoimalla geenillä) ja puhtaita faagista P22 HT105/1, 15 jota käytettiin transduktion suorittamiseen.
SL5631 on pysyvä aromaattisista aminohapoista riippuva virulentin S. dublin -kannan SVA47 johdannainen. Se saatiin kaksivaiheisella transduktiolla menetelmällä, jota käytettiin S. typhin aroA- (deleetio) -kantojen konstruoi-20 miseksi [Edwards, M.F. (1985) Ph.D. Thesis, Stanford University, California].
Heterologisten epitooppien ilmentäminen flagellii- nin yhdistelmäfuusioproteiineina
Kuvataan sellaisten yhdistelmätlagelliinigeenien 25 konstruktio ja ilmentäminen, jotka koodaavat suojaavien immuunivasteiden induktiolle ja ilmenemiselle tärkeitä vieraita epitooppeja. Yhdistelmätlagelliinina ilmennetyt heterologiset loisten ja bakteerien epitoopit olivat malarian CS-proteiinin ja koleratoksiinin B-alayksikön epi-30 tooppeja. Yhdistelmätlagelliinimolekyylit vietiin heiken-.· nettyihin Salmonella-kantoihin, joita voidaan käyttää elä vissä rokoteformulaatioissa, ja ne ilmennettiin niissä.
1 104638 45
Materiaalit ja menetelmät Plasmidit ja bakteerikannat Käytetyt bakteeri kannat olivat Salmonella-kannat SL1438 (ATCC hakunumero 39184) ja SL5927 (ATCC hakunumero 5 67944) ja E. coli -kanta CL447. Plasmidi pLS402 sisältää genomin DNA:n 3,8 ke:n EcoRI-fragmentin, joka koodaa S. muenchenistä saatavaa flagelliinin täydellistä Hl-d-raken-negeeniä, joka on liitetty plasmidin pBR322 EcoRI-kohtaan (Wei, L.-N. ja Joys, T.M., (1985) J. Mol. Biol. 186, 791). 10 Plasmidit pUC18, pUC19 ja E. coli-kanta JM103 saatiin yhtiöstä Bethesda Research Laboratories (BRL, Bethesda, MD).
Restriktioentsyymeillä suoritetun pilkkomisen olosuhteet
Restriktioendonukleaasit BamHI, Clal, EcoRI ja 15 EcoRV hankittiin yhtiöstä Bethesda Research Laboratories (BRL, Bethesda, MD). Pilkkomiset suoritettiin suspendoi-malla DNA sopivaan restriktiopuskuriin, lisäämällä 2-3 yksikköä entsyymiä yhtä mikrogrammaa DNA:ta kohti ja inku-boimalla 37°C:ssa yön yli. BamHI:llä suoritetussa pilkko-20 misessa käytetty restriktiopuskuri käsitti seoksen, jossa oli 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2 ja 100 mM NaCl.
EcoRI:llä ja Clal:llä suoritetussa pilkkomisessa käytetty restriktiopuskuri käsitti seoksen, jossa oli 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2 ja 50 mM NaCl.
·· 25 EcoRV:llä suoritetussa pilkkomisessa käytetty restriktiopuskuri käsitti seoksen, jossa oli 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2 ja 150 mM NaCl.
Tasaisten päiden muodostaminen DNA-fragmentteihin Ligaatiossa tarvittavien tasaisten päiden muodosta-30 miseksi täytettiin DNA-molekyylien päät, joissa oli vapai-.· ta 5'-puoleisia nauhan osia, antamalla DNA-polymeraasi I:n suuren fragmentin (Klenow-fragmentti) vaikuttaa niihin. Klenow-fragmentilla suoritettavaa täyttöä varten käsiteltiin 1-25 mikrogrammaa DNA:ta 1 yksiköllä Klenow-entsyymiä 35 (BRL) yhtä DNA-mikrogrammaa kohti 50 mikrolitran reak- • 46 104638 tiotilavuudessa puskurissa, jonka koostumus oli 66 mM Tris-HCl, pH 7,5, 6,6 mM MgCl2, 1 mM ditiotreitoli (DTT) ja 20 nanomolaarinen pitoisuus kaikkia neljää deoksinukleo-tiditrifosfaattia (dATP, dCTP, dGTP ja TTP), 30 minuutin 5 ajan huoneenlämmössä.
DNA-fragmenttien puhdistus geelissä Restriktioentsyymeillä suoritetun pilkkomisen jälkeen erotettiin erisuuruiset DNA-fragmentit polyakryyli-amidigeelielektroforeesilla käyttäen TBE-puskuria (0,089 M 10 Tris, 0,089 M boorihappo, 0,002 M EDTA, pH 7,5) ja jännitettä, joka oli 15 volttia/cm. Akryyliamidigeelit valettiin laimentamalla akryyliamidi : bis-akryyliamidikanta-liuos (40 : 1,1) joko 6 %:ksi tai 8 %:ksi TBE-puskuri11a riippuen eristettävän DNA-fragmentin koosta. Vyöhykkeet 15 tehtiin havaittaviksi pystysuuntaisen elektroforeesin jäl keen käyttäen hyväksi etidiumbromidin fluoresenssia ja asianmukaiset vyöhykkeet leikattiin irti ja asetettiin dialyysiletkuun, joka sisälsi TBE-puskuria laimennettuna suhteessa 1 : 10. Tämä asetettiin samaa puskuria sisältä-20 vään kammioon ja se elektroeluoitiin 100 milliampeerin virralla 2 tuntia. Elektroeluoitu DNA-fragmentti otettiin talteen poistamalla letkun nestemäinen sisältö ja saos-tamalla DNA 2 tilavuudella kylmää etanolia 300-millimolaa-risen natriumasetaatin läsnäollessa.
.. 25 Oligonukleotidien synteesi ja puhdistus
Oligonukleotidit syntetisoitiin 0,2 mikromoolin mittakaavassa käyttäen Applied Biosystems Inc -yhtiön mallin 380B DNA-syntetisaattoria beetasyaanietyylifosfori-amidiittikemiaa käyttäen [Sinha, N.D., et ai., (1984) 30 Nucl. Acids. Res. 12, 4539 - 4544].
,· Oligonukleotidit puhdistettiin elektroforeesilla
0,4 mm paksussa 8-%:sessa polyakryyliamidigeelissä TBE puskuriliuoksessa (0,01 M Tris-boraatti, pH 8,2, 1 mM
! j EDTA), jossa suoritetussa ajossa käytettiin noin 1600 vol- j 35 tin jännitettä 75 watin jatkuvalla teholla. Oligonukleoti- 47 104638 divyöhykkeet tehtiin havaittaviksi negatiivisella varjostuksella PEI (polyetyleeni-imiini) levykromatografialevyn päällä ultraviolettivalossa ja täysimittaista tuotetta vastaava vyöhyke irrotettiin geelistä. Synteettinen oligo-5 nukleotidi eluoitiin 0,3 M natriumasetaatissa, pH 5,5, ja se saostettiin lisäämällä kaksi tilavuusosaa 100-%:sta etanolia, jäähdytettiin -20 °C:seen ja sentrifugoitiin 14 000 x g:n kiihtyvyydellä. Sentrifugoinnista saadut napit kuivattiin tyhjiössä ja liuotettiin TE-puskuriliuok-10 seen (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM EDTA).
Fosfaattiryhmät liitettiin synteettisten oligo-nukleotidien 5'-puoleisiin päihin käyttäen T4-polynukleo-tidikinaasia (New England Biolabs, Beverly, MA) . Yhden mikrogramman suuruiset määrät puhdistettua oligonukleo-15 tidia liuotettiin 25 mikrolitraan kinaasipuskuriliuosta, jonka koostumus oli 70 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl2, 5 mM DTT ja jossa oli 1 mM adenosiinitrifosfaattia (ATP). Tämä liuos ja siihen lisätyt 20 yksikköä T4-polynukleo-tidikinaasia inkuboitiin 30 minuuttia 37 °C:ssa.
20 Komplementaaristen nauhojen liittäminen toisiinsa suoritettiin sekoittamalla kinaasilla käsitellyt nauhat ja kuumentamalla 60 °C-.n lämpötilassa 1 tunnin ajan ja jäähdyttämällä huoneenlämpöön.
DNA:n ligaatio ·« 25 Kaikki ligaatiot suoritettiin käyttäen T4-DNA-li- gaasia, joka oli hankittu yhtiöstä BRL (Bethesda, MD) . Vektori-DNA ja asianmukaisella tavalla käsitelty eristetty restriktiofragmentti tai synteettiset oligonukleotidit suspendoitiin uudelleen 30 mikrolitraan ligaasipuskuri-3 0 liuosta (66 mM Tris-HCl, pH 7,5, 6,6 mM MgCl2, 10 mM DTT ja ‘ .· 1 mM ATP) ja näihin lisättiin 2 Weiss-yksikköä T4-DNA-li- t gaasientsyymiä. Ligaatioreaktion annettiin edetä 18 - 24 tuntia 4 °C:ssa. Tavallisesti 50 - 100 ng vektorin DNA:ta liitettiin noin 10-kertaiseen molaariseen ylimäärään lii-35 tettävää DNA:ta.
104638 48
Plasmidi-DNA:n transformaatio
Plasmidikonstruktiot, jotka saatiin synteettisten oligonukleotidien ligaatiosta plastnideihin pPX1651 tai pLS408, vietiin yleisesti käytettyihin Escherichia coli 5 -laboratoriokantoihin transformaatiomenetelmillä [yksi tyiskohdat on esitetty teoksessa Maniatis et ai., (1982) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York]. Plasmidikonstruktiot eristettiin ja ne luonnehdittiin ensin E.
10 colissa ennenkuin ne siirrettiin Salmonella-lajeihin, kos ka E. coli K12 -kannassa transformatiofrekvenssit ovat korkeammat kuin S. typhimurium -kannassa. Plasmidit siirrettiin S. typhimurium LT-2 LB5010 -kantaan, joka on rest-riktionegatiivinen kanta (mutta modifikaatiokykyinen) Sal-15 monella typhimuriumin kolmen restriktiosysteemin suhteen ja joka myös sisältää mutaation galE.-ssä, josta on seu rauksena korkeampi transformaatiofrekvenssi (Salmonella typhimuriumin restriktiosysteemit on kuvattu julkaisussa Bullas et ai., (1980, J. Bacteriol. 141, 275).
20 Plasmidit vietiin sitten Salmonellaan transduktio- menetelmiä käyttäen. Halutun plasmidin sisältävä LB5010-kanta kasvatettiin Luria-lihaliemessä (LB) solu-tiheyteen, joka oli 3 x 108 solua/ml, jolloin kasvatus-liuokseen lisättiin D-galaktoosia (loppupitoisuus 1 %) 25 "sileän" lipopolysakkaridi (LPS) -synteesin indusoimisek-si. Sen jälkeen, kun kasvua D-galaktoosin läsnäollessa oli jatkunut 1,5 tuntia, viljelmään lisättiin bakteriofaagi P22 HT 105/1 int käyttäen infektiomultiplisiteettiä yksi. Faagin adsorption jälkeen solut immobilisoitiin LB:ssä, 30 joka sisälsi 0,7 % agaria. Faagit otettiin talteen ja niitä käytettiin plasmidien transduktioon mihin tahansa heikennettyyn Salmonella-kantaan, joka sisälsi asianmukaisen transduktoivan P22-faagin LPS-reseptorin.
• · -1¾ j ] 49 104638 DNA:n restriktioentsyymianalyysi
Yhdistelmäplasmidien DNA analysoitiin pilkkomalla DNA tarkoitukseen sopivilla restriktioendonukleaseilla ja elektroforeesilla l-%:sissa agaroosigeeleissä, joissa käy-5 tettiin TBE-puskuriliuosta, joka sisälsi 5 μg/ml etidium-bromidia. Vyöhykkeet havaittiin etidiumbromidin fluoresenssin perusteella.
Polyakryyliamidigeelielektroforeesi
Yhdistelmäflagelliiniproteiinien analysoimiseksi 10 natriumdodekyylisulfaatti (SDS) -polyakryyliamidigeeli-elektroforeesilla (PAGE) sentrifugoitiin 500 mikrolitraa yhdistelmäplasmideja sisältävää yön yli kasvatettua bak-teeriviljelmää, ja solunappi suspendoitiin uudelleen 200 mikrolitraan proteiiniajoseosta (0,125 M Tris-HCl, pH 6,8, 15 2,5 % SDS, 5 % 2-merkaptoetanoli, 10 % glyseroli, 0,005 bromifenolisineä) ja kuumennettiin 100°C:een 10 minuutiksi .
Elektroforeesi suoritettiin käyttäen 20 mikrolitraa kutakin näytettä olosuhteissa, jotka on kuvannut Laemmli 20 [Laemmli, U.K., (1979) Nature 227, 680], pinoamisgeelin ollessa 4-%:nen akryyliamidi ja erotusgeelin ollessa 10-%:nen akryyliamidi.
Western-blottausanalyysi
Proteiininäytteiden SDS-PAGE:n jälkeen elektro-·· 25 foreesilla erotetut proteiinit siirrettiin nitrosel- luloosalevyille (Schleicher and Schuell, Keene, NH) käyttäen Towbinin et ai. menetelmää, [Towbin, H., et ai., (1979) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 76, 4350]. Siirron jälkeen suodattimet käsiteltiin niiden blokkaamiseksi in-30 kuboimalla fosfaatilla puskuroidussa fysiologisessa suola-.· liuoksessa (PBS) , johon oli lisätty 0,5 % Tween 20, 15 minuutin ajan huoneenlämmössä. Primaariset vasta-aineet laimennettiin sopivaan pitoisuuteen PBS:ssä, jossa oli 0,1 % Tween 20 (PBS-Tween) ja ne lisättiin suodattimille. 35 Inkuboinnit suoritettiin huoneenlämmössä ainakin yhden 50 1 0 4 6 3 8 tunnin ajan ja korkeintaan yön yli. Suodattimet pestiin sitten PAS-Tween-liuoksessa suorittaen liuoksen vaihto useaan kertaan, jonka jälkeen lisättiin piparjuuriperoksi-daasilla konjugoitua S. aureuksen proteiini-A:ta (Kirke-5 gaard and Perry, MD), pitoisuuteen 1 μg millilitraa kohti ja tämän jälkeen inkuboitiin tunnin ajan huoneenlämmössä. Suodattimet pestiin sitten useita kertoja PAS-Tween-liuoksessa ja signaali kehitettiin PAS:llä, joka sisälsi 0,01 % vetyperoksidia ja 0,06 % 4-kloori-l-nafto-10 lia (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) huoneenlämmössä kunnes havaittiin sopivan kokoinen signaali. Tämä reaktio pysäytettiin pesemällä suodatin useita kertoja tislatulla vedellä.
Seerumin sirkumsporotsoiittiproteiinia vastaan IS muodostuneiden vasta-aineiden entsyymivälitteinen immunosorbenttimääritys
Seerumin vasta-aineiden määrittämiseksi päällystettiin 96-kuoppaiset polystyreenilevyt (NUNC) käyttäen peptidiä DPAPPNANDPAPPNAN(KLH), joka on synteettinen peptidi, 20 joka edustaa kahta Plasmodium berghein CS-proteiinin kahta toistuvaa yksikköä ja joka on kytketty KLH:hon glutaarial-dehydi-ristisidoksilla, pitoisuudessa 5 μg/ml. Kuhunkin kuoppaan lisättiin 0,1 ml antigeeniä, joka oli valmistettu 0,1-molaariseen karbonaatti/bikarbonaattipuskuriliuokseen ··· 25 (pH 9,6). Levyt inkuboitiin 37 °C:ssa kosteutetussa inku- baattorissa 18 tunnin ajan ennenkuin ne pestiin 3 kertaa PAS:lla, joka sisälsi 0,05 % Tween 20 (PAS-T) ja blokat-tiin 0,1-%:sella PBS:ään valmistetulla gelatiinilla 60 minuutin ajan huoneenlämmössä. Levyt pestiin 3 kertaa 30 PAS-T:llä ja niihin lisättiin seerumien sarjalaimennuksia .· ja inkuboitiin 90 minuutin ajan huoneenlämmössä. Määrityk sissä käytettiin positiivisena kontrollina P. berghein CS:ää vastaan valmistettua Mab 3.28:ta. Levyt pestiin kuten edellä ja ennakolta optimoituja pitoisuuksia alkali-35 sella fosfataasilla konjugoitua vuohen hiirtä vastaan vai- • « ;« S1 104638 lisättiin asianomaisiin kuoppiin ja inkuboitiin 60 minuutin ajan huoneenlämmössä. Levyt pestiin uudelleen ja 100 mikrolitraa substraattiliuosta (p-nitrofenyylifosfaatti, jota oli 1 mg/ml dietanoliamiinipuskuriliuoksessa, jonka 5 pH oli 9,6) lisättiin kuhunkin kuoppaan. Signaalit kehitettiin 60 minuutin ajan huoneenlämmössä ja luettiin automaattisessa Bio-Tek -ELISA-lukijassa käyttäen kahta aallonpituutta 410 nm and 690 nm ilmaa vastaan mitaten.
Yhdistelmäflagellojen osittainen puhdistus 10 Yön yli kasvatettuja yhdistelmäplasmideja sisältä viä S. dublin SL1438 -viljelmiä ympättiin 150 mm:n petri-maljoille, jotka sisälsivät 1,5 paino-%:sta Difco-agaria LB-kasvatusliuoksessa, johon oli lisätty 100 μg/ml am-pisilliiniä, ja maljoja inkuboitiin 48 tuntia 37 °C:ssa. 15 Näille maljoille kaadettiin deionisoitua vettä ja bakteerit poistettiin pinnalta varovasti kaapien. Tälle suspensiolle suoritettiin tehosekoitus suurella nopeudella tavallisessa tehosekoittajassa ja bakteerien jätteet poistettiin sentrifugoimalla 10 000 kierroksen minuuttinopeu-20 della Sorvali SS34 -roottorissa 30 minuutin ajan. Super-natantissa olevat flagellat väkevöitiin ultrasentrifugoi-malla 50 000 kierroksen minuuttinopeudella Beckman 70.1ΤΪ -roottorissa yhden tunnin ajan. Näiden flagellapreparaat-tien arvioitiin olevan noin 90-%:sesti puhtaita SDS-PAGE-·· 25 geelien Coomassiesinellä tehdyn proteiinivärjäyksen perus teella ja proteiinipitoisuudet arvioitiin vertaamalla tutkittavia näytteitä tunnettuihin määriin samoissa geeleissä ajettuja standardiproteiineja.
Koe-eläinten immunisointi 30 Naaraspuoliset C57BL/6-hiiret, jotka olivat noin 6 ' Λ viikon ikäisiä, (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) immunisoitiin ihonalaisesti noin 25 mikrogrammalla täydelliseen Freundin adjuvanttiin emulsifioituja osittain puhdistettuja flagellapreparaatteja. Neljän viikon kuluttua 35 hiirille annettiin tehosteannos, joka sisälsi 25 mikro-grammaa samaa flagellapreparaattia, joka oli emulsifioitu
• I
52 104638 epätäydelliseen Freundin adjuvanttiin. Kaikista eläimistä otettiin verta häntälaskimosta ennen primaarista immunisointia, juuri ennen tehosteen antoa ja kaksi viikkoa tehosteannoksen antamisen jälkeen.
5 Elävällä ja heikennetyllä Salmonella-kannalla suo ritettavaa immunisointia varten yhdistelmäplasmideja sisältäviä S. dublin SL1438 -viljelmiä kasvatettiin LB ravintoliuoksessa, jota oli täydennetty 100 /ig/ml:lla am-pisilliiniä, logaritmisen vaiheen puoliväliin, otettiin 10 talteen sentrifugoimalla, pestiin PBSrllä ja suspendoitiin uudelleen pitoisuuteen 1 x 108 solua yhtä ml:aa kohti. 0,1 ml tätä suspensiota annettiin vatsaontelonsisäisesti 6 viikon ikäisiin C57BL/6-hiiriin (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) . Neljän viikon kuluttua eläimille annettiin 15 tehoste, jossa oli 1 x 10B solua ja joka valmistettiin ja annettiin samalla tavalla. Eläimistä otettiin verta edellä kuvatulla tavalla.
Bakteerien liikkuvuuden määritys S. dublin SL5927 on flagellaton (ja siten liikkuma-20 ton) bakteerikanta ja tämä johtuu siitä, että sen ainoa flagelliinigeeni on transduktion avulla korvattu
Hl-i::TnlO:llä. SL5927-kannan konstruktio on kuvattu edellä kappaleessa, jonka otsikko on "Flagelliini-miinus rokotekantojen konstruktio".
25 Yön yli kasvatettuja yhdistelmäplasmideja sisäl täviä S. dublin SL5927 -viljelmiä ympättiin liikkumiskyvyn osoittaville agarmaljoille (LB plus 100 μg/ml ampisillii-nia ja 0,3 paino-% Difco-agaria) ymppäyssauvaa käyttäen. Maljoja inkuboitiin yön yli huoneenlämmössä ja 6 tuntia 30 37°C:ssa. Tämän jälkeen mitattiin bakteerien leviämis- ;; alueen läpimitta osoitukseksi bakteerien liikkumiskyvystä.
Tulokset
Yhdistelmäflagelliinigeenien konstruktio ! j Plasmidi pLS402 sisältää genomin DNA:ta olevan 3,8 35 ke:n EcoRI-fragmentin, joka sisältää täydellisen Hl-d
A
i (Hl-antigeeni d) -flagelliinin rakennegeenin [Wei, L.-N ja · 53 104638
Joys, T.M., (1985) J. Mol. Biol. 186, 701 - 803] (kuviot 2A ja 2B) , joka on saatu S. muenchenista (American Type Culture Collection hakunro 8 388) ja joka on liitetty plasmidin pBR322 EcoRI-kohtaan [kuvio 1, Wei, L.-N. ja r 5 Joys, T.M., (1985) J. Mol. Biol. 186, 791]. Tämän geenin koodaavaa aluetta vastaavan julkaistun emässekvenssin (kuva 2B) tarkastelu paljasti kaksi asemissa 619 ja 667 olevaa EcoRV-kohtaa, jotka olivat 48 ep:n päässä toisistaan. Vertaamalla muista Hl-geeneistä peräisin oleviin 10 jaksoihin osoitettiin nämä kaksi restriktiokohtaa sisältävän geenin alueen olevan erittäin vaihteleva sekä primaarisen aminohapposekvenssin suhteen että ryhmien lukumäärän suhteen. Teimme siten sen johtopäätöksen, että kyseessä-oleva geenialue voi olla merkityksetön flagellan kokoon-15 panon ja toiminnan suhteen ja olisi siten sopiva kohta vieraita epitooppeja koodaavan DNA:n liittämiseksi. Tämän strategian hyödyntämiseksi oli tarpeen jatkokloonata Hl-d-geeni plasmidikantajaan, jolla ei ollut yhtään EcoRV-restriktiokohtaa. Tämän vuoksi pLS402:n 3,8 ke:n 20 EcoRI-fragmentti eristettiin ja jatkokloonattiin pUC18:n ja pUC19:n EcoRI-kohtiin ja tuloksena olivat plasmidi-konstruktiot pPX650 ja pLS405, tässä järjestyksessä mainittuna. Näitä viimeksimainittuja vektoreita voitiin sitten käyttää vaihtamaan nukleotidinumeroiden 619 ja 667 25 (kuva 2B) välinen autenttinen Hl-d-DNA synteettiseen tai kloonattuun DNA:hän, joka koodaa vierasta epitooppia. Jotta yhdistelmäplasmidien seulonta kävisi vielä helpommaksi poistettiin kummassakin plasmidissa oleva EcoRV-kohtien välinen 48 ep:n fragmentti pilkkomalla pPX1650 ja pLS405 30 EcoRV:llä ja liittämällä kumpikin pilkottu plasmidi takai-' '· sin yhteen. Tämän jälkeen seulottiin esiin transformantit, joilta 48 ep:n fragmentti oli poistunut, ja näin saatiin pPX1651 ja pLS408 (kuva 1) . Näissä plasmideissa säilyi vain yksi EcoRV-kohta vieraiden epitooppien liittämistä 35 varten. Nyt oli lisäksi mahdollista erottaa koon perusteella vektori, jossa oli 48 ep:n kappale vierasta DNA:ta, • t “ 104638 vektorista, joka oli yksinkertaisesti liittynyt takaisin itseensä.
Jotta voitaisiin testata vieraiden epitooppien kykyä ilmentyä geneettisinä fuusioina flagelliinin kanssa, 5 tehtiin useita geneettisiä konstruktioita jäljempänä kuvatuilla tavoilla.
Sellaisen yhdistelmäflagelliinigeenin konstruktio, joka koodaa xnalarialoisen epitooppia flagelliini-fuusioproteiinina 10 Konstruoitiin yhdistelmäflagelliinigeenit, jotka koodasivat malarialoisen (Plasmodium-suku) sirkumsporo-tsoiittiproteinien epitooppeja flagelliinifuusio proteiineina.
Aluksi syntetisoitiin kaksi komplementaarista 48 15 ryhmää sisältävää oligonukleotidia, jotka koodasivat neljää kappaletta P. falciparumin sirkumsporotsoiittiprote-iinin neljän aminohapon toistumajaksoa (kuvio 3A). Näiden nukleiinihappofragmenttien sekvenssit olivat sellaisia, että kun ne olivat liittyneinä toisiinsa niin syntyi 20 komplementaariset kolmen emäksen mittaiset vapaat päät, joiden avulla nämä oligonukleotidit saattoivat liittyä itseensä ainoastaan alkukohdan ja loppukohdan välisellä liitoksella, joka varmistaa sen, että jokainen useista oligonukleotideistä liittyy samalla tavoin orientoitu-25 neena. Kun fragmentit oli annettu asettua yhteen, niihin muodostettiin tasatut päät käsittelemällä DNA-polymeraasin suurella fragmentilla (Klenow-entsyymillä) ja ne liitettiin plasmidiin pPX1651, joka oli pilkottu ennakolta EcoRV:llä. E. coli -kantaan JM103 tehdyn transformaation 30 jälkeen ampisilliiniresistenttejä pesäkkeitä seulottiin '· yhdistelmäplasmidien esiintymisen suhteen käyttäen plasmi- dien DNA:n restriktiokohtien analyysia. Tunnistettiin kaksi rekombinanttia, josta pPX1653 sisältää liitetyn oli-gonukleotidin yhtenä kappaleena, ja pPX1652 sisältää kolme 35 liitettyä oligonukleotidia. DNA-jakson analyysin perus-Ί teella pPX1652:ssa esiintyvät kolme oligonukleotidifrag- ti
Hi 55 1 0 4 6 3 8 menttia, jotka oli täytetty DNA polymeraasi I:n Klenow fragmentilla ennen ligaatiota pPX1651:n kanssa, olivat liittyneet samalla tavalla orientoituneina. Tästä menetelmästä oli tuloksena ylimääräisen asparagiiniryhmän 5 liittyminen oligonukleotidin koodaamien 16 aminohaposta koostuvien ryhmien väliin. Solu-uutteiden Western-blot-taus, jossa käytettiin P. falciparumin toistumajaksoalueen suhteen spesifisiä monoklonaalisia vasta-aineita, osoitti sen, että nämä kloonit ilmensivät immunoreaktiivisiä pro-10 teiineja, joilla oli yhdistelmätlagelliinille ominainen molekyylimassa.
Samanlaista strategiaa käytettiin muodostettaessa yhdistelmätlagelliinimolekyylejä, jotka ilmensivät P. berghein CS-proteiinin toistuvaa kahdeksan aminohapon jak-15 soa (kuva 3B). Näissä kokeissa oligonukleotidit liitettiin yhteen ennen niiden käsittelyä Klenow-entsyymillä, jotta voitiin varmistaa se, että kaikki vierekkäiset oligonukleotidit liittyvät samalla tavoin orientoituneina ja ilman väliin tulevia DNA-jaksoja. Saatiin klooneja, jotka sisäl-20 sivät yhden, kaksi tai kolme kappaletta spesifistä oli- gonukleotidia ja näille annettiin merkinnät pPX1661, pPX1662 ja pPX1663, tässä järjestyksessä mainittuna. Näitä klooneja sisältävien bakteerien havaittiin ilmentävän im-munoreaktiivisia proteiineja, joilla oli oikeaa luokkaa 25 oleva molekyylimassa määritettynä seulontakokeella • ·
Western-analyysia käyttäen, joka suoritettiin P. berghein CS-spesifisyyden omaavalla monoklonaalisella vasta-aineella .
Sellaisen yhdistelmäflagelliinigeenin konstruktio, 3 0 joka koodaa koleratoksiinin B-alayksikön epitooppia ·· f lagelliinifuusioproteiinina
Samanlaista strategiaa käytettiin patogeenisen Vibrio cholerae -bakteerin eksotoksiinin epitoopin suhteen. Tämän yhdistelmämolekyylin konstruoimiseksi syntetisoitiin 35 komplementaariset oligonukleotidit (kuvio 4B), jotka koodasivat koleratoksiinin B-alayksikön [Jacob, C.O., et ai., • · 56 1 0 4 6 38 (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 80, 7611] CTP3-pep- tidin edustamaa epitooppia (kuvio 4A). Synteettisten oli-gonukleotidien koodaama aminohappojakso oli seuraava: 5 (N)Val-Glu-Val-Pro-Gln-Ser-Gly-His-Ile-Asp-Ser-
Gln-Lys-Lys-Ala(C) ja se edustaa B-alayksikön ryhmiä 50 - 64 (kuvio 4B) .
Komplementaariset oligonukleotidit liitettiin toisiinsa ja 10 niiden päät tasoitettiin käsittelemällä Klenow-entsyymillä. Nämä fragmentit liitettiin sitten pLS408:n EcoRV-koh-' taan ja transformoitiin E. coli CL477 -kantaan. Plasmidi, joka sisälsi yhden liittyneen jakson tunnistettiin restriktioanalyysia käyttäen ja siitä käytettiin merkintää 15 pLS411. Liittyneen DNA-jakson sekvenssin määrityksellä ja
Western-blottausanalyysilla vahvistettiin se, että pLS411:n sisältämä liittynyt jakso oli oikein orientoitunut, koska se ilmensi sopivan molekyylimassan omaavaa molekyyliä, joka oli sekä Hl-d:tä vastaan valmistetun anti-20 seerumin että CTP3-peptidiä vastaan valmistetun monoklo-naalisen ja kaniinin polyklonaalisen antiseerumin tunnistama .
Flagelliinin yhdistelmäfuusioproteiinien ilmentäminen 25 Jotta nämä yhdistelmäflagelliinimolekyylit olisi voitu ilmentää heikennetyssä bakteerikannassa elävinä rokotteina käytettäviksi, vietiin kaikki edellä kuvatut konstruktiot (kuvio 5) heikennettyihin S. dublin -kantoihin (SL1438 ja SL5927) käyttäen faagitransduktiota [Schmeiger, 30 (1972) Mol. Gen. Genetics 119, 75]. Stocker ja hänen työ- toverinsa ovat kuvanneet näiden kantojen heikentämiseen käytetyn menetelmän [Hoiseth, S.K. ja Stocker, B.A.D., (1981) Nature 291, 238, Stocker, B.A.D., et ai., (1982)
Dev. Biol. Std. 53, 47, US-patentti julkaisu nro 35 4 550 081] . Yksityiskohtaisesti esitettynä, aiheutettiin
M
57 104638 deleetioita aroA-geeniin, josta oli tuloksena pleiotroop-piset vaatimukset fenyylialaniinin, tryptofaanin, tyrosii-' nin, folihapon esiasteen, p-aminobentsoehapon, ja entero- keliinin esiasteen, dihydroksibentsoehapon suhteen, p-ami-5 nobentsoehappo ei esiinny eläinkudoksissa ja Enterobakte-riaceae-ryhmän jäsenet eivät kykene assimiloimaan folihap-poa eläinkudoksista, josta on seurauksena niiden heikentyminen eläin- tai ihmisisännässä. Kummastakin näistä kannoista valmistetuille uutteille suoritettiin Western-blot-10 tausanalyysi ja yhdistelmätlagelliinien osoitettiin syntetisoituvan käyttäen flagelliiniepitooppeja vastaan suunnattuja molempia vasta-aineita (kuvio 6) , joka viittasi siihen, että nämä kannat voivat olla arvokkaita elävinä rokotteina, jotka aiheuttavat immuunivasteita sellaisia 15 vieraita epitooppeja vastaan, jotka on liitetty flagellii-nimolekyyleihin.
Yhdistelmäflagelliinin leimaus immunologisella kul-taleimalla
Vieraan epitoopin esiintyminen flagellan pinnalla 20 havaittiin leimaamalla formaliinilla kiinnitettyjen bakteerien flagellat immunologisella kultaleimalla käyttäen MAb TE33:a ensimmäisenä vasta-aineena. Kanta SL5076, joka sisältää joko plasmidin pLS411, jolla on täydellinen CTP3-liittymäjakso tai plasmidin pLS408, jolla on vitro 25 -deleetio mutta ei liittymäjaksoa, leimattiin käsittelemällä MAb TE33:lla ja kullalla konjugoidulla vuohen vasta-aineella hiiren IgG:tä vastaan (Janssen) elektronimikroskooppista visualisointia (x 30,000) varten. Leiman visualisointi viittasi siihen, että CTP3-epitooppi esiintyi 30 bakteerien pinnalla.
;; Flagelliinin yhdistelmäfuusioproteiinit kykenevät rakentumaan toimintakykyisiksi flagelloiksi
Yhdistelmäflagelliiniproteiinien kyky polymerisoi-tua ehjiksi flagelloiksi ja esiintyä bakteerien ulkopin-35 nalla osoitettiin sillä, että ne palauttivat liikkumis- ·· 58 104638 kyvyn normaalisti liikkumattomille (flagelliininegatiivi-suuden aiheuttaman liikkumattomuuden vuoksi) isännille (taulukko 3).
5 Taulukko 3
Liikkumiskyky S. dublin SL5927 -kannassa1
Heterologinen Leviämisalueen 10 Plasmidi antigeeni2 läpimitta (mm)3 pPX16501 - 20 pPX16511 - 22 pPX16521 P. falciparumin CS-proteiini 13,5 pPX16531 P. falciparumin CS-proteiini 18 15 pPX16611 P. berghein CS-proteiini 21 pPX16621 P. berghein CS-proteiini 13,5 pPX16631 P. berghein CD-proteiini 12 pLS411 koleratoksiinin B-alayksikkö 4,5 pUC18 - 0 20 1 (liikkumiskyvytön) S. dublin SL5927 = S. dublin SL1438 Hl-i::Tnl0 2 Natiivi antigeeni, jonka osa ilmentyy yhdistelmä-flagelliinifuusioproteiinina, jota koodaa vasemman- 25 puoleinen plasmidi 3 Yön yli kasvatettuja viljelmiä pisteltiin sellaisten 60 mm:n petrimaljojen keskiosaan, jotka sisälsivät 0,3-%:sta agaria LB-kasvatusliuoksessa, jota oli täydennetty ampisilliinilla, jonka pitoisuus 30 oli 100 μ$/χη1. Maljoja inkuboitiin 16 tuntia huo- ;; neenlämmössä ja 6 tuntia 37 °C:ssa. Tämän jälkeen mitattiin bakteerien leviämisvyöhykkeen läpimitta, joka ilmoitettiin millimetreinä.
* Koodaa ainakin osaa flagelliinin Hl-d-geenistä.
35 id · l 104638 59 SL5927 on SL1438-kannan liikkumiskyvyton johdannainen, joka on konstruoitu aiheuttamalla keskeytys kromosomissa ' olevaan Hl-antigeenia (flagelliinia) koodaavaan rakenne- geeniin liittämällä siihen transpositioelementti (TnlO), 5 tällä kannalla, samoin kuin muilla S. dublin -kannoilla ei ole H2-alleelia. SL5927 on konstruoitu "Flagelliini miinus -rokotekantojen konstruktio" -otsikoidussa kappaleessa esitetyllä tavalla. Minkä tahansa yhdistelmätlagelliini-plasmidin tuominen palauttaa ainakin osittaisen liikkumis-10 kyvyn tähän kantaan (taulukko 3) , joka viittaa siihen, että nämä yhdistelmätlagelliinit voivat polymeroitua toimintakykyisiksi flagelloiksi ja että vieraat epitoopit esiintyvät solun ulkopinnalla.
Flagelliinin yhdistelmäfuusioproteiineissa olevien 15 heterologisten epitooppien ixnmunogeenisyys
Jotta olisi voitu osoittaa yhdistelmätlagelliinien kyky saattaa epitoopit isännän immuunijärjestelmän yhteyteen, immunisoitiin C57BL/6-hiiret osittain puhdistetuilla flagelloilla, jotka oli eristetty S. dublin SL1438 -kan-20 nasta, joka ilmentää kaikissa flagelliinimolekyyleissään kahta kappaletta P. berghein immunodominanttia S-toistuma-jaksoa (plasmidin pPX1661 koodaama) tai villityppistä Hl-d-flagellaa (plasmidin pPX1650 koodaama). Hiiriin injektoitiin ihonalaisesti noin 25 mikrogrammaa flagelliini-25 proteiinia, joka oli emulsifioitu täydelliseen Freundin adjuvanttiin viikolla 0 ja tehosteannos annettiin käyttämällä 25 mikrogrammaa samaa valmistetta ihonalaisesti epätäydellisessä Freundin adjuvantissa 4 viikkoa myöhemmin. Eläimistä otettiin verta ennen ensimmäistä ja toista immu-30 nisointia taas kaksi viikkoa tehosteannoksen jälkeen. See-l rumeista määritettiin ELISA:11a vasta-aineet, jotka olivat spesifisiä sellaisia synteettisiä peptidejä vastaan, jotka koodaavat kahta kappaletta P. berghein CS-toistumajaksoa (DPAPPNAN). P. bergheitä vastaan muodostuneet vasta-aineet 35 (kuvio 7) olivat hieman yli taustan 4 viikkoa primaari-im- ·· 104638 60 munisoinnin jälkeen ja tasot lisääntyivät dramaattisesti tehosteimmunisoinnin jälkeen, kun taas näiden vasta-aineiden tasot eläimissä, jotka oli immunisoitu kontrollina olevilla villityyppisillä flagelloilla (plasmidin pPX1650 5 koodaamia) eivät eronneet merkittävästi ennen veren ottoa saaduista arvoista (kuvio 7, viikko 0).
C57BL/5-hiirien immunisointi elävällä S. dublin SL1438 -kannalla, joka ilmentää P. berghein CS-epitooppia (plasmidin pPX1662 koodaama) yhdistelmäflagellaa, aiheutti 10 myös merkittävät seerumin vasta-aineiden tasot tätä epi-tooppia vastaan verrattuna kontrollieläimiin, jotka oli immunisoitu samalla bakteerikannalla, joka ilmentää villi-tyyppistä Hl-d-flagellaa (plasmidin pPX1650 koodaama) (kuva 8) , mikä kuvaa elävien heikennettyjen bakteerien kykyä 15 tuottaa vierasta epitooppia näiden organismien pinnalla ilmentyvänä flagelliinifuusioproteiinina
Immunogeenisyyttä mittaavia testejä varten korvasimme aromaattisista yhdisteistä riippuvan elävän S. dublin -rokotekannan SL1438 [Clements, J. et ai., (1987) In-20 feet. Immunol. 53, 685, Dougan, G. et ai., (1987) Parasite Immunol. 9, 151 ja Poirier, T.P. et ai., (1988) J. Exp.
Med. 68, 25] faasin 1 Hl-g,p-flagelliinigeenin transposo-nin Hl-i::Tnl0 inaktivoimalla flagelliinialleelilla, koska S. dublin on yksifaasinen, saatu SL5928-kanta oli liikku-25 maton mutta tuli liikkuvaksi, kun siihen transformoitiin plasmideja, jotka sisälsivät joko villityyppisen, delee-tion sisältävän tai kimeerisen Hl-d-muodon, mikä oli yhdenmukainen flagelliininegatiivisesta S. typhimurium -isännästä SL5676 tehtyjen havaintojen kanssa. pUC.-stä 30 johdetut plasmidit ovat pysyviä käytetyssä elävässä roko-" tekannassa, jota osoittaa kaikkien ampisilliinia sisältä mättömässä lihaliemessä suoritetun jatkokasvatuksen jälkeen saadusta bakteerisuspensiosta tutkittujen yli sadan pesäkkeen ampisilliiniresistenttisyys ja kaikkien avatun ! 35 hiiren maksasta talteen saatujen pesäkkeiden ampisilliini- 1 · 104638 61 resistenttisyys. Immunisoimme C57BL/6-hiiriä kolmella 7 päivän välein suoritetulla vatsaontelonsisäisellä ruiskeella, jotka käsittivät 5xl06 bakteeria, jotka olivat joko formaliinilla tapettuja tai eläviä. Viikko viimeisen ruis-5 keen jälkeen hiiristä otettiin verta ja niiden seerumit testattiin entsyymivälitteisellä immunosorbenttimäärityk-sellä (ELISA) CTP3-peptidireaktiivisuuden tai kokonaisen koleratoksiinin suhteen (kuva 9) . Havaitsimme liitettyä epitooppia vastaan suunnattuja vasta-aineita kaikissa see-10 rumeissa, kaikki seerumit reagoivat koleratoksiinin kanssa yhtä vahvasti kuin mitä tapahtui CTP3-peptidin kyseessä ollessa.
Kuviosta 9 näkyy, että vasta-ainevaste viidessä hiiressä, jotka immunisoitiin SL5929-kannalla, joka on 15 Salmonella dublinin elävä rokotekanta, joka ilmentää ki-meerisiä flagelliinigeenejä (□) ennen immunisointia, (H), SL5929:llä suoritetun immunisoinnin jälkeen. Hiirten seerumien reaktiivisyys kokonaisen natiivin koleratoksiinin suhteen mitattiin kiinteän faasin ELISA:lla [Jacob, C.O. 20 et ai., (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 80, 7611] käyttäen peroksidaasilla konjugoitua, hiiren IgG:tä vastaan valmistettua vuohen vasta-ainetta (TAGO). Hiirille annettiin vatsaontelonsisäisiä ruiskeita kolme kertaa viikon väliajoin käyttäen 5 x 10s formaliinilla tapettua baktee-25 ria, seerumit otettiin talteen 7 päivää viimeisen ruiskeen jälkeen. Pylväät edustavat optisen tiheyden keskiarvoa viidestä hiirestä saaduissa seerumeissa (SE on suurempi kuin 15 % kaikissa laimennoksissa).
Tarkastelu 30 Olemme osoittaneet, että epitoopit, jotka ovat rat- * • kaisevia patogeenisiä organismeja vastaan suunnattujen • .
suojäävien immuunivasteiden induktiolle, ilmentyvät fuu-sioproteiineina flagelliinin kanssa, joka on bakteerien flagellan filamenttien proteiini. Konstruoitiin useita 35 yhdistelmäflagelliinigeenejä, jotka koodasivat epitoop- • · 62 104638 peja, jotka ilmentyvät tavallisesti alkueläinloisessa tai bakteerissa. P. falciparumin sirkumsporotsoiitti (CS) -proteiinin immunodominantti toistuva epitooppi ja analoginen P. bergheihin liittyvä epitooppi liitettiin Salmo-5 neliä muenchenin Hl-d-geenialueeseen. Oligonukleotidi, joka koodaa koleratoksiinin sitoutumisalayksikön (CT-B) suojaavaa epitooppia liitettiin myös Hl-d-flagelliinigee-niin. Kaikkien näiden yhdistelmäkonstruktioiden osoitettiin ilmentävän molekyylejä, jotka liikkuivat SDS-PAGE-10 geeleissä liikkuvuuksilla, jotka olivat yhdenmukaisia odotettujen molekyylimassojensa suhteen. Hl-d-flagelliini-molekyylille spesifiset antiseerumit sekä reagenssit, jotka tunnistavat natiivissa proteiinissa olevia heterologi-sia epitooppeja, tunnistivat lisäksi nämä molekyylit 15 Western-bloteissa.
Nämä hybridiproteiinit säilyttävät kykynsä ilmentyä yhdistelmäbakteerien pinnalla, joka helpottaa näiden molekyylien eristystä ja puhdistusta alayksikkörokotteissa tapahtuvaa käyttöä varten. Lisäksi nämä molekyylit eivät 20 ainoastaan ilmentyneet yhdistelmäplasmideja sisältävissä E. coli -kannoissa vaan ne myös vietiin useisiin heikennettyihin Salmonella -kantoihin, jotka voivat olla käyttökelpoisia elävinä rokotteina. Yhdistelmätlagelliinimole-kyylien ilmentäminen heikennetyissä, elimistöön tunkeutu-25 miskykyisissä bakteereissa voi tehdä mahdolliseksi elävien rokotteiden formulaation olennaisesti mitä tahansa sellaista patogeeniä vastaan, josta voidaan tunnistaa ratkaisevalla tavalla vaikuttavia immunogeenisiä epitooppeja.
Esimerkki 2 30 Hepatiitti-B-pinta-antigeenin epitooppien ilmentä minen flagelliinin yhdistelmäfuusioproteiineina • 4 Tässä tutkimuksessa sijoitimme kaksi spesifistä HBV:n S-geenijaksoa, jotka koodaavat aminohappojaksoj a S 122-137 ja esi-S2 122-145, tässä järjestyksessä mainittu-35 na, Salmonellan flagelliinigeeniin Hl-d ja osoitettiin, - ·· 104638 63 että yhdistelmäplasmideilla transformoitu flagelliininega-tiivinen heikennetty S. dublin -kanta ilmensi HBsAg-epi-tooppeja. Eläinten immunisoinnista elävillä bakteereilla oli tuloksena sekä HB:tä että flagelliinia vastaan suun-5 nattujen vasteiden muodostuminen.
Synteettiset oligonukleotidit, synteettiset peptidit ja yhdistelmä-DNA-menetelmät
Syntetisoitiin spesifisen sekvenssin omaavia yk-sinauhaisia oligonukleotidejä ja nämä puhdistettiin poly-10 akryyliamidigeelielektroforeesilla. Synteettiset peptidit S 122-137 ja esi-S2 120-145, joiden jaksot vastasivat käytettyjä synteettisiä oligonukleotidejä, syntetisoitiin kiinteän faasin menetelmällä, jonka ovat kuvanneet Erickson, B.W. ja Merrifield, R.B., (1976) teoksessa The 15 Proteins, eds. H. Neurath ja R.L. Hill (Academic Press, New York) Osa 2, sivu 255, ja ne puhdistettiin geelisuoda-tuksella Sephadex LH-20-pylväässä. Peptidien puhtaus tarkastettiin analyyttisellä käänteisfaasi-HPLC:llä ja amino-happoanalyysilla. Kloonausmenetelmät olivat teoksessa Ma-20 niatis, T., et ai., (1982) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, kuvattujen menetelmien mukaisia. Bakteerilysaatit valmistettiin yön yli kasvatetuista 1,0 ml:n suuruisista viljelmistä sentrifugoimalla bakteerit ja suspendoimalla ne uu-25 delleen 0,1 ml:aan näytepuskuriliuosta, jonka koostumus oli 2 % SDS (Sigma) , 2 % β-merkaptoetanoli (Sigma) , ja PMSF (fenyylimetaanisulfonyylifluoridi), TLCK (N-tosyyli-L-lysiinikloorimetyyliketoni), TPCK (N-tosyyli-L-fenyyli-alaniini kloorimetyyliketoni), leupeptiini, pepstatiini 30 (proteaasi-inhibiittoreita, Boehringer Mannheim) ja käyte- m » tyt pitoisuudet olivat valmistajien suosittelemia.
Antiseerumit
Flagelliinia vastaan suunnattuna seerumina käytettiin polyklonaalista, Hl-d:tä (Salmonellan faasi-l-flagel-35 la-antigeenia) vastaan valmistettua kaniinin seerumia, • * 64 104638 joka oli saatu Dr. P.H. Makelalta, National Public Health Institute, Helsinki, Suomi. Polyklonaaliset HB:tä vastaan valmistetut vuohen seerumit (valmistettu ihmisen plasmasta puhdistettua natiivia HBsAg:ta vastaan) hankittiin Dako-5 yhtiöstä. Antiseerumi peptidejä S 122 - 137 ja esi-S2 120 -145 vastaan valmistettiin immunisoimalla marsuja näitä vastaavilla synteettisillä peptideillä, jotka oli liitetty tyroglobuliiniin. Näiden antiseerumien titraamalla selvitettyjä optimilaimennoksia käytettiin vastaavien HBsAgio epitooppien bakteerilysaateista määritetyn ilmentymisen havaitsemiseen immunoblottauksella.
Immunisointi
Immunisointiin käytettävät bakteerikloonit kasvatettiin yön yli 37 °C:ssa Luria-lihaliemessä, joka sisälsi 15 50 μg/ml ampisilliiniä. Solut pestiin kahdesti ja ne sus- pendoitiin uudelleen fosfaatilla puskuroituun fysiologiseen suolaliuokseen (PBS). Kaksi Uuden Seelannin valkeaa kaniinia immunisoitiin kummallakin bakteerikloonilla käyttäen lihaksensisäistä 1 ml:n ruisketta, jossa oli 109 elä-20 vää bakteeria, päivinä 0, 7, 14, 21 ja 28, ja verinäytteet otettiin päivinä 0, 28, 56, ja 84.
Kolme marsua ja kymmenen hiirtä (BIO.BR-hiiriä esi-S2 120-145 -kloonien ollessa kyseessä ja BALB/cj-hiiriä S 122-137 -kloonien ollessa kyseessä) , jotka olivat tun-25 nettuja näitä kahta peptidiä vastaan reagoivia kantoja [F. Chiasari, henkilökohtainen tiedonanto, ja Milich, D.R. et ai., (1986) J. Exp. Med. 164, 532] immunisoitiin kullakin kloonilla antamalla 1 ml:ssa suspensiota, jossa oli noin 109 elävää bakteeria, kunkin marsun suuhun tai 0,05 ml:n 30 erä noin 5 x 10® elävää bakteeria kunkin hiiren suuhun päi-’· vinä 0, 7, 14 ja 28, ja verinäytteet kerättiin talteen päivinä 0, 28, 56 ja 84.
Seerumeista määritettiin spesifiset vasta-aineet ELISA:11a [Gooderham, K., (1984) teoksessa Methods in Mo- 35 lecular Biology, Walker, J.M., (toim.) Hummang Press, » 3 i 65 104638
Clifton, NJ, osa 1: Proteins, sivulta 165 eteenp.] käyttäen alkalisella fosfataasilla konjugoitua kaniinia, hiirtä tai marsua vastaan valmistettua antiseerumia, joka oli hankittu yhtiöstä Boehringer-Mannheim. Vasta-ainetiitteri 5 tarkoittaa korkeinta testattavan seerumin laimennosta, jolla testattavan seerumin A405:n ja ennen immunisointia saadun serumin A405:n suhde oli yli 2,0.
Yhdistelmäplasmidien konstruktio Tässä tutkimuksessa käytettiin kahta synteettistä 10 oligonukleotidiä, jotka kummatkin koodaavat HBsAgm (alatyyppi ayw) aminohappojaksoa, joka näyttää sisältävän suo-jaavan tai osittain suojaavan epitoopin (S 122 - 137 ja esi-S2 120 - 145) . Kuviossa 10 esitetyt ylemmät viivat edustavat vastaavien synteettisten oligonukleotidien nuk-15 leotidijaksoja, jotka oli suunniteltu lukukehyksen säilyttävään flagelliinigeenin EcoRV-kohtiin suoritettavaan liittämiseen (kuva 10) . Valitut kodonit olivat Salmonellan Hl-d-flagelliinigeenissä [Wei, L.-N. ja Joys, T.M., (1985) J. Mol. Biol. 186, 791] useimmin esiintyvät kodonit. Kpnl-20 ja BamHl-restriktiokohdat (epitooppeja S 122 - 147 ja esi-S2 120 - 145 koodaavien jaksojen ollessa kyseessä, tässä järjestyksessä mainittuna) otettiin mukaan sen vuoksi, että rekombinantit voidaan tunnistaa niiden avulla rest-riktioanalyysiä käyttäen. EcoRV:tä vastaavan kohdan puoli-25 kas muodostettiin esi-S2-oligonukleotidin 3'-puoleiseen päähän helpottamaan muita HBV:n epitooppeja vastaavien oligonukleotidien liittämistä. Lopetuskodonit (alleviivattuja) asetettiin esi-S2-oligonukleotidin komplementaariseen nauhaan sellaisten kloonien selektion helpottamiseksi, 30 joissa liittyneet jaksot olivat halutussa orientaatiossa. Flagelliinigeeni oli plasmidissa pLS405, joka koostuu 3,8 ke:n S. muenchenin genomin fragmentista, joka sisältää plasmidin pUC19 EcoRI-kohtaan kloonatun 1,5 ke:n mittaisen flagelliinia koodaavan jakson (ks. esimerkki 1) . Villi-35 tyyppisen flagelliinigeeni keskiosassa oleva suurta vaih- 104638 66 telua sisältävä alue sisältää kaksi oikeassa lukukehyksessä ja 48 emäsparin etäisyydellä toisistaan olevaa EcoRV-kohtaa (kuvio 10) . Tämän EcoRV-fragmentin deleetio pLS405:stä plasmidin pLS408 tuottamiseksi vähentää mutta 5 ei poista bakteerien flagellanmuodostuskykyä (ks. esimerkki 1) . Toistensa suhteen limittäiset komplementaariset yk-sinauhaiset synteettiset oligonukleotidit hybridisoitiin, fosforyloitiin, korjattiin E. colin DNA polymeraasin Kle-now-fragmentilla päistään tasoitettujen kaksinauhaisten 10 DNA-fragmenttien valmistamiseksi, liitettiin sitten pLS408.*n EcoRV-kohtaan T4-DNA-ligaasilla ja ligaatioreak-tioseosta käytettiin kannan CL447, joka on flagelliini-ne-gatiivisen E. coli C600-kannan variantti, transformoimi-seen. Yhdistelmäplasmideja sisältävät kloonit tunnistet-15 tiin pesäkehybridisoinnilla käyttäen vastaavia synteettistä oligonukleotidejä, jotka oli leimattu käyttäen koettimena 32P:tä, ja suorittamalla pilkkominen restriktioentsyy-meillä. Liitettyjen jaksojen lukumäärä, orientaatio, luku-kehys ja emäsjärjestyksen säilyminen määritettiin dideok-20 synukleotidisekvenssoinnilla [Sanger, F., et ai., (1977)
Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 74, 5463], käyttäen synteettistä 15-nukleotidistä aluketta, joka vastaa noin 30 ep EcoRV-kohdasta myötäsuuntaan olevaa flagelliinigeenin jaksoa. Eristettiin useita yhdistelmäplasmideja, joissa oli 1 ·· 25 - 3 kappaletta asianomaista synteettistä oligonukleotidi- jaksoa eri orientaatioissa ja jotka luonnehdittiin tarkemmin .
Yhdistelmäkloonien luonnehtiminen S. typhimurium LB5000 -kannan (restriktionegatiivi-30 nen, modifikaatiokykyinen ja flagellaton kanta, jolla on .· mutaatio flaA66) kompetentit solut transformoitiin tarkem min analysoitavilla yhdistelmäplasmideilla ja siirrettiin sitten flagelliininegatiiviseen elävään S. dublin SL5928 -rokotekantaan transduktiolla käyttäen P22-faagia HT105/1 35 int ja suorittaen selektion kussakin tapauksessa ampisil- ] • 67 104638 liiniresistenttiyden suhteen. SL5928 on aromaattisista yhdisteistä riippuva kanta, joka on johdettu S. dublin SL1438-kannasta [Smith, B.P., et ai., (1984) Amer. J. Ve-terin. Sei. 45, 2231], se on liikkumaton, koska se on yk-5 sifaasinen ja sen yksi flagelliinigeeni on TnlO-transpo-soni-insertion inaktivoima.
Sekä E. coli C600 hag* -varianttikannan että SL5928-kannan ilmentämät antigeenit tutkittiin immunoblot-tauksella käyttäen joko Hl-d:tä vastaan valmistettua ka-10 niinin antiseerumia (käytettiin flagelliinia vastaan), tai HBsAg:ta vastaan valmistettua tai synteettistä esi-S2 120-145 peptidiä vastaan valmistettua vuohen antiseerumia. Bakteerilysaatit, jotka oli valmistettu E. coli C600 hag' -varianttikannasta, joka oli transformoitu yhdistelmä-15 plasmideilla, jotka sisälsivät epitooppia S 122-137 (S16e ja S20e) koodaavat jaksot, esi-S2 121-145 (ps8e) -jakson tai esi-S2 120-145 (pS21e) -epitooppia vastaavan jakson, ja S. dublin SL5928 -kannasta, joka sisälsi samat plasmidit (S16s, S20s, ja pS8s ja pS21s, tässä järjestyksessä mai-20 nittuna) ja kontrolleista, jotka koostuivat transformoi-mattoman E. coli C600 hag' -kannan ja S. dublin SL5928 -kannan lysaateista, S. dublin SL5985 -kanta on SL5928 -kanta, joka on transformoitu parentaalisella pLS405-plas-midilla, jolla on EcoRV-fragmentin deeletio, ja potilas-·· 25 seerumista saatu HBsAg kuumennettiin 100 °C:seen kolmeksi minuutiksi ennen näytteiden viemistä ajoon. Proteiinit erotettiin natriumdodekyylisulfaatti-12,5 % -polyakryyli-amidigeelielektroforeesilla (SDS-PAGE) [Laemmli, U.K., (1970) Nature 227, 680]. Proteiinit siirrettiin nitrosel-30 luloosasuodattimille, joille suoritettiin immunologinen ' .' värjäys joko Hl-d-flagelliinia vastaan valmistetulla ka niinin antiseerumilla, jota merkittiin anti-F:llä tai HBsAg:ta vastaan valmistetulla vuohen tai synteettistä peptidiä esiS2 120 - 145 vastaan valmistetulla kaniinin an-35 tiseerumilla. Sopivan joko alkalisella fosfataasilla tai • · 104638 68 peroksidaasilla konjugoidun toisen vasta-aineen kanssa suoritetun inkuboinnin jälkeen suoritettiin reaktio NBT-BCIP:llä (alkalisen fosfataasin ollessa kyseessä) tai DAB-H202 (peroksidaasin ollessa kyseessä).
5 Kuten odotettiin, flagelliiniantigeenia ei havaittu E. coli 600 hag" -variantissa tai S. dublin SL5928 -kannassa, jolta puuttui ehjänä säilynyt flagelliinigeeni. Kaksi elektroforeettista komponenttia, jotka reagoivat flagel-liiniantigeenin tavoin, havaittiin kloonissa S20 mutta 10 tämän tulokseksi saadun monimutkaisen muodostelman syntytapa ei ole selvillä.
Vuohen HB-antiseerumit, jotka oli valmistettu ihmisen plasmasta puhdistettua HBsAG:ta (ayw) vastaan, reagoivat kloonien S16 ja S20 (joissa on S 122 - 137-jaksoa koo-15 daava jakso) ja kloonien pS8 ja pS2l (joissa on esi-S2 121 - 145 ja esi-S2 120 - 145 -jaksoja koodaavat jaksot, tässä järjestyksessä mainittuna) tuottamien hybridiflagelliinip-roteiinien kanssa, joka viittaa siihen, että näiden kloonien hybridiproteiinit sisälsivät epitooppeja, jotka nämä 20 HB:ta vastaa suunnattuja vasta-aineita sisältävä seerumi kykeni tunnistamaan.
Esi-S2 120 - 145 -peptidiä vastaan valmistettu kaniinin antiseerumi reagoi pS8- ja pS2l-kloonien hybridi-flagelliiniproteiinien kanssa, esi-S2 jakson kanssa mutta ·· ' 25 ei yhdenkään S jakson sisältävien kloonien proteiinien kanssa.
HBsAg-epitooppeja sisältävien yhdistelmätlagellii-nin kokoonpanoa tutkittiin elektronimikroskooppisesti käyttäen hybridiflagelliinia ilmentäviä bakteereja. Liik-30 kumiskykyisessä kloonissa havaittiin useimmissa baktee-.· reissä flagelloja, joita ei voitu morfologisesti erottaa villityyppisistä flagelloista. Kolmessa liikkumiskyvyttö-mässä (puolikiinteällä agarilla havaittavan leviämiskyvyn perusteella arvioituna) mutta flagelliinin suhteen posi- i 69 104638 tiivisessa kloonissa SI6, pS8, ja pS2l havaittiin vain muutama flagella (koetuloksia ei esitetty).
Kuvio 11 esittää yhteenvedon analysoitujen seitsemän yhdistelmäplasmidin ominaisuuksista. Yhtenäiset 5 (S-jaksot) tai viivoitetut (esi-S2-jaksot) nuolet edustavat flagelliinigeenin EcoRV-kohtien väliin sijoitettujen synteettisten oligonukleotidijaksojen orientaatiota ja lukumäärää suhteessa pLS405:n flagelliinigeenin orientaatioon (pilkutetut nuolet). Bakteerien liikkuvuus testattiin 10 käyttäen puolikiinteää agaria. Kaniinit immunisoitiin yksittäisillä plasmideilla transformoiduilla S. dublin SL5928 -kannoilla ja vasta-ainevasteet mitattiin ELISA:11a, jossa kutakin synteettistä peptidiä käytettiin antigeenillä suoritettavaan päällystämiseen, "et" tarkoit-15 taa "ei tehty". Kuten oli odotettua, ainoastaan plasmi-deissa, joiden S:ää tai esi-S2:ta koodaavat jaksot olivat samassa orientaatiossa kuin flagelliinigeeni (S16, S20, pS8, ja pS2l) saatiin aikaan sellaisten hybridiflagellii-niproteiinien ilmentyminen, joissa oli havaittavia S- tai 20 esi-S2-determinantteja. Tutkitussa pienessä määrässä plas- mideja kolme neljästä flagelliinigeenin orientaation suhteen vastakkaisen jaksoliittymän omaavasta (S20, S6 ja S27) plasmidista olivat liikkumiskykyisiä, lysaatit bakteereista, joissa oli neljäs plasmidi, pS2, eivät sitoneet ·* 25 d:tä vastaan valmistettua vasta-ainetta, mikä oli odotet tua, koska päinvastaisessa orientaatiossa oleva esi-S2-oli-gonukleotidi sisältää kaksi terminaatiokodonia (kuvio 10). Ne, joissa oli yksi tai useampia samassa orientaatiossa olevia jaksoliittymiä eikä jaksoliittymiä päinvastaisessa 30 orientaatiossa (S16, pS8 ja pS21), eivät kyenneet leviä-mään puolikiinteällä ravintoalustalla, vaikkakin joitakin « - harvoja flagelloja havaittiin elektronimikroskooppisessa tutkimuksessa ja sekä flagelliini- että HBsAg-epitooppeja havaittiin immunoblottauksessa.
35 104638 70
Hybridiproteiineja ilmentävien bakteerien immuno- geenisyys
Hybridiflagelliiniproteiineissa olevien HBsAg-epi-tooppien immunogeenisyys testattiin ensin suorittamalla 5 kaniinien lihaksensisäinen immunisointi hybridiflagellii-nia ilmentävällä elävällä S. dublin SL5928 -kannalla (kuvio 12) . Kuvio 12 esittää vasta-ainevasteet kaniineissa, jotka oli immunisoitu lihaksensisäisesti S16:lla tai pS21:llä transformoidulla elävällä S. dublin SL5928 -kan-10 nalla. Anti-flagelliini tarkoittaa vasta-ainetta, joka havaitaan ELISA:11a käyttäen natiivia flagelliiniproteii-nia, joka on puhdistettu villityyppisen flagelliinigeenin sisältävällä plasmidilla transformoidusta SL5928-kannasta, anti-peptidi tarkoittaa vasta-aineita, jotka havaitaan 15 ELISA:11a käyttäen synteettisiä peptidejä S 122-137 ja esi-S2 120 - 145 (sellaisten eläinten kyseessä ollessa, jotka oli immunisoitu S16:n ja pS21:n sisältävällä SL5928-kannalla, tässä järjestyksessä mainittuna, ja an-ti-HBs edustaa vasta-ainetta, joka havaitaan ELISA:11a 20 käyttäen CHO- solujen muokkaamaa HBsAg:ta.
Korkeita vasta-ainetiittereitä (yli 104) syntyi kahdessa eläimessä, joille annettiin S16-plasmidilla (jossa oli S 122-137-aluetta koodaava jakso) transformoitua SL5928-kantaa ja kahdessa sellaisessa, joille annettiin ·· ' 25 plasmidilla pS21 (jossa oli jakso, joka koodaa esi-S2 120 - 145 -aluetta) transformoitua SL5928-kantaa. Peptidiä vastaan suunnattujen vasta-aineiden (jotka olivat vastaavan plasmidin sisältävällä SL5928-kannalla immunisoiduissa kaniineissa valmistettujen S 122 - 137 -aluetta tai esi-S2 30 120 - 145 -aluetta vastaan valmistettuja vasta-aineita) .* ELISA tiitterit vaihtelivat alueella 103-2 x 104. Nämä an- tiseerumit reagoivat kiinanhamsterin munasarja (CHO)solujen (saatu Dr. P. Tiollaisilta Pasteur-instituutista) [Michel, M.K., et ai., (1985) Biotechnology 3, 561] tuot-35 tamien yhdistelmä-HBsAg-molekyylien (jotka olivat m 7l 104638 ayw-alatyyppiä ja sisälsivät esi-S2-jakson) kanssa ja korkeimmat tiitterit kahdella neljästä kaniinista olivat noin 6400. Näistä kaniineista saatu immuuniseerumi reagoi myös voimakkaasti natiivin HBsAg:n kanssa, joka oli puhdistettu 5 HBVrllä infektoiduista simpansseista, havaittuna Abbott Laboratoryn Ausab-määrityksellä (koetuloksia ei esitetty) . Kaniinit, jotka oli immunisoitu S20- ja pS8-plasmideilla transformoidulla SL5928-kannalla, tässä järjestyksessä mainittuna, antoivat samanlaisen vasteen (tuloksia ei esi-10 tetty) kuin eläimet, jotka oli immunisoitu S16:n ja pS21:n sisältävällä SL5928-kannalla. Kahdessa kaniinissa, jotka oli immunisoitu parentaalisen pLS405-plasmidin, jossa ei ollut HBV-jaksoliittymiä, sisältävällä SL5928-kannalla, havaittiin odotetusti korkeita flagelliinia vastaan suun-15 nattujen vasta-aineiden tasoja eikä lainkaan vasta-aineita, jotka olisivat olleet suunnattuja S- tai esi-S2 -peptidiä tai HBsAgrta vastaan. Yhdessäkään tällä heikennetyllä S. dublinin mutanttikannalla (SL5928) rokotetuista eläimistä ei ilmennyt septistä sokkia tai muuta sairautta.
20 Nämä tulokset viittaavat siihen, että yhdistelmäplasmidin sisältävän S. dublin SL5928 -kannan ilmentämät hybridifla-gellat sisältävät HBsAg epitooppeja, jotka ovat im-munogeenisia ja että niiden aiheuttama vasta-aine reagoi sellaisen plasman kanssa, joka on saatu yhdistel-*' 25 mä-HBsAg: sta.
Synteettiset peptidit S122 - 137 ja esi-S2 120 - 145 estivät spesifisesti immuuniseerumissa olevien vasta-aineiden sitoutumisen CHO-solujen tuottamaan HBsAg:hen, mutta vastaavaa ei havaittu ennen immunisointia saadussa see-30 rumissa (koetuloksia ei esitetty), kaniineissa, jotka oli immunisoitu S- tai esi-S2-epitooppeja ilmentävillä • .
SL5928-klooneilla, tässä järjestyksessä mainittuna, vahvistaen siten sen, että HB:tä vastaan suunnatut vasta-aineet näissä eläimissä olivat suunnattuja flagelliinigee-35 niin tuotujen jaksojen koodaamia epitooppeja vastaan.
104638 72
Sen määrittämiseksi, voiko HB:tä vastaan suunnattuja vasteita syntyä siitä, että hybridiflagelloja ilmentävää, elävää ja heikennettyä S. dublin SL5928 -kantaa annetaan suun kautta, suoritettiin kokeita kaniineilla, hii-5 rillä ja marsuilla. Kuvio 13 esittää peptidejä ja HB-mole-kyylejä vastaan muodostuneet tiitterit hiirissä, joille rokotteena suun kautta annettiin kullekin yhdistelmäplas-mideilla S16, S20, pS8 ja pS21 ja muuntamattomalla flagel-liinigeenillä pLS405 transformoitua SL5928-kantaa. Vastaa-10 via peptidejä ja HB-molekyylejä vastaan muodostuneiden vasta-aineiden merkittäviä tiittereitä havaittiin kaikissa eläimissä, vaikkakin tiitterit olivat alhaisempia kuin kaniinien lihaksensisäisen immunisoinnin jälkeen havaitut tiitterit. Kuten oli odotettua, pLS405:llä transformoitu-15 jen SL5928-bakteerien antaminen suun kautta ei johtanut havaittavien HB:ta tai peptidejä vastaan suunnattujen vasta-aineiden muodostumiseen. Peptidejä ja HB-molekyyleja vastaan suunnattujen vasta-aineiden tiitterit kaniineissa ja marsuissa (tuloksia ei esitetty) olivat samanlaisia (80 20 - 640) kuin vastaavat tiitterit hiirissä (kuvio 13) elävän S. dublin SL5928 -kannan suun kautta tapahtuneen antamisen jälkeen. Yhdessäkään eläimessä, jolle annettiin S. dublin SL5928 -kantaa suun kautta ei havaittu ripulia eikä muita merkkejä taudista. Nämä kokeet viittaavat siihen, että 25 suun kautta annettu rokotus elävällä hybridiflagelloja ilmentävällä S. dublin SL5928 -kannalla aiheuttaa immuunivasteita HBsAg-epitooppeja vastaan.
Tarkastelu Tässä esimerkissä olemme osoittaneet, että 30 HBsAg-polypeptidien antigeenisiä alueita koodaavat nukleotidi jaksot voidaan liittää Salmonellan flagelliinigeenin • · runsaasti vaihtelua sisältävään alueeseen ja nämä geenit voidaan ilmentää heikennetyssä Salmonella -mutantissa. Joistakin tuloksena olevista hybridiflagelliinipro-35 telineistä voi muodostua toiminnallinen flagella puoli- ” * · i 73 104638 kiinteällä ravintoalustalla ilmenevän leviämiskyvyn perusteella testattuna, toisista hybriditlagelliineista ei muodostunut filamentteja paitsi ehkä pienessä vähemmistössä bakteereja. Hybriditlagellat sisältävät sekä flagelliini-5 että HBsAg-epitooppeja immunoblottauksella havaittuna. HBsAg-epitoopit havaittiin antiseerumilla, joka oli valmistettu spesifisiä synteettisiä peptidejä vastaan ja seerumista peräisin olevaa HBsAg:ta vastaan. Flagelliinigee-niin liitettyjen HBsAg-jaksojen lukumäärä ja orientaatio 10 vaikutti proteiinin kykyyn rakentua toiminnallisiksi fla-gelloiksi. Mielenkiintoinen havainto oli se, että HBsAg jakso, joka oli liitetty flagelliinigeenin suhteen samassa orientaatiossa vähensi bakteerien liikkuvuutta (jota ei havaittu päinvastaiseen suuntaan tehdyssä liitoksessa), jo-15 ka viittaa siihen, että samankokoisen luonnollisen flagel-liinijakson korvaava spesifinen viruksen vaippaproteiini-jakso (S 122 - 137), muutti merkittävästi hybriditlagel-liinin konformaatiota. Lisäksi 16 aminohappoa sisältävän flagelliinideleetion korvaaminen 27 aminohappoa sisältä-20 väliä jaksoliitoksella (esi-S2 120 - 145) ei estänyt fla-gelliinin ilmentymistä vaan vaikutti sen toimintaan. Kummassakin näissä tapauksista hybriditlagelliiniproteiinissa havaittiin HBsAg-epitooppeja, jotka natiivia HBsAg:ta vastaan valmistettu antiseerumi tunnisti. Nämä jaksot olivat ·· 25 elävien bakteerien esittäminä immunogeenisiä ja aiheutti vat vasta-aineen, joka tunnisti natiivin HBsAg:n. Flagel-liini edustaa siten bakteeriproteiinia, jossa virusten antigeenejä voidaan esittää muodossa, joka on immunogeeni-nen elävissä Salmonella-kannoissa ollessaan.
30 Esimerkki 3
Rotaviruksen VP7:n epitooppia ilmentävän yhdistel- • < mäflagelliinin konstruktio
Tausta Pääasiallisin ulkokuoren polypeptidi, VP7, on gly-35 koproteiini, jonka näennäinen molekyylimassa on 38 000 • * 104638 74 (38,2 kDa) pelkistämättömässä muodossaan ja 41 900 (41,9 kDa) pelkistetyssä muodossaan. Sen on osoitettu olevan pääasiallisin antigeeni, joka toimii neutraloivien vasta-aineiden muodostumisessa virusta vastaan. Tämä glykoprote-5 iini toimii myös viruksen liittymisessä soluihin.
Rotaviruksesta esiintyy eri serotyyppejä ja ne määräytyvät VP7:n stimuloiman neutraloivan aktiivisuuden mukaan. Tähän päivämäärään mennessä on tunnistettu seitsemän serotyyppiä, neljä näistä (serotyyppit 1-4) esiintyy 10 ihmisissä ja viisi (serotyypit 3-7) esiintyvät eläimissä. Näiden serotyyppierojen merkitys on epäselvä, koska viimeaikaiset tutkimukset sekä ihmisissä että eläimissä ovat osoittaneet, että eri serotyyppeihin kuuluvien kantojen välillä voi esiintyä ristiin menevää suojausta. Tämä 15 ristiinsuojaus voi syntyä siitä syystä, että VP7:ssä on yhteisiä antigeenideterminantteja, jotka ovat serotyypistä riippumattomia. Toisena vaihtoehtona on se, että VP7:ssä (epitoopeissa) olevat spesifiset aminohappojaksot, joiden vaikutuksesta serotyyppispesifisyys muodostuu, voivat ai-20 heuttaa sellaisen jossain määrin ristireagoivan vasta-aineen syntymisen, joka aiheuttaa ristiin menevän suojauksen.
Molekyylimassan 38,2/41,9 kDA perusteella VP7 koostuu noin 325 aminohaposta. Useiden eri rotavirusisolaati-25 oiden käsittämien VP7-molekyylien aminohappojaksot on määritetty ja ne viittaavat siihen, että aminohappojen homo-logia-aste vaihtelee välillä 75 - 86 %. VP7-molekyylien jaksojen vertailu paljastaa useita aminohappojakson vaihtelua sisältäviä alueita.
30 Neutraloivia monoklonaalisia vasta-aineita käyttäen :* tehdyllä VP7:n epitooppikartoituksella voitiin paikantaa neutraloiva absorptioon osallistuva alue molekyylin osana olevaan peptidiin, jonka näennäinen molekyylimassa oli i 14 000 (14 kDa). Tämä 14 kDa:n suuruinen peptidi stimuloi 3 5 puhdistettuna neutraloivien vasta-aineiden muodostumista i \ \ · i 104638 75 hiirissä. Lisäksi havaittiin, että tällä peptidillä oleva sekundaarinen rakenne oli tarpeellinen antigeenisyyden ’ ylläpitämiseksi. Nebraskan vasikoiden ripuliviruksen (NCDV, naudan rotavirus) aminohappojaksoa, jolla on korkea 5 nukleiinihappohomologia naudan C486-rotaviruksen suhteen ja jonka serotyyppi on sama, käytettiin 14 kDa:n suuruisen polypeptidifragmentin kartoittamiseen alueelle, joka kattoi aminohapot 165 - 295. Vastaavasta NCDV-glykoproteiinin hydrofiilisyyskuvaajasta oli tunnistettavissa useita tällä 10 alueella olevia hydrofiilisiä alueita.
Yksi tällainen alue vastasi naudan rotaviruksen VP7:n aminohapporyhmiä 275 - 295. Tätä vastaava peptidi syntetisoitiin Merrifieldin kiinteän faasin peptidisyntee-simenetelmällä. Tämän peptidin spesifinen aminohappojakso 15 oli seuraava:
Pro-Thr-Thr-Ala-Pro-Gln-Thr-Glu-Arg-Met-Met-Arg-Ile--Asn-Trp-Lys-Lys-Trp-Trp-Gln-Val.
20 Tämän peptidin puhtaus määritettiin levykromatogra- fiaa ja korkeasuorituskykyistä käänteisfaasinestekromato-grafiaa käyttäen. Nopea-atomimassaspektrometriaa käytettiin molekyylimassan varmistamiseen.
Synteettisen peptidin reaktiivisyys spesifisyys ” 25 määritettiin useilla menetelmillä.
1) ELISA, jossa käytettiin VP7:ää vastaan valmistettua monospesifistä seerumia, joka osoittaa peptidin spesifisyyden VP7:n suhteen, 2) ELISA, jossa käytettiin monoklonaalisia vasta-ai- 30 neita, jotka ovat spesifisiä neutraloivan glykopro- - teiinin (VP7) suhteen ja joilla on kyky estää vi- • · ruksen kiinnittyminen, mikä osoittaa peptidin spe-’ sifisyyden tiettyä spesifistä VP7:n epitoopin aluetta vastaan.
m •« 104638 76 3) Adsorptionestymismääritys, joka osoittaa, että pep tidi 275-295 esti viruksen kiinnittymisen in vitro afrikkalaisiin viherapinasoluihin (MA-104). Flagelliinikonstruktiossa olevan epitoopin havait-5 seminen
Rotaviruksen VP7:n epitooppia (AA 275-292) koodaa-van hybridiflagelliinigeenin konstruoimiseksi liitettiin flagelliini-ilmentämisvektoriin pPX1651 (ks. esimerkki 1) synteettiset oligonukleotidit, jotka edustavat rotaviruk-10 sen VP7:n aminohappoja 275 - 292 ja joilla on seuraava sekvenssi, : 275
APQTER MMR 5'-GCT CCT CAG ACT GAA CGT ATG ATG CGT 15 31 -CGA GGA GTC TGA CTT GCA TAC TAC GCA
292 I NWKKWWQV ATC AAC TGG AAA AAA TGG TGG CAG GTT-3' TAG TTG ACC TTT TTT ACC ACC GTC CAA-5' 20
Transformaation jälkeen rekombinantit seulottiin epitooppijaksoliittymän suhteen restriktioentsyymikartoi-tuksella, Western-blottauksella ja nukleotidisekvenssoin-nila. Saatu yhdistelmäplasmidi pROTA92-19, vietiin Salmo-25 neliä dublin SL5927 -kantaan ja yhdistelmäflagellat valmistettiin aiemmin kuvatulla tavalla. Flagelliinikompetitiokoe Määritettiin flagelliinin ja flagelliinin, jossa oli rotaviruksen 275 - 292 -epitooppi (määritetty naudan 30 VP7-rotaviruksen sekvenssistä edellä kuvatulla tavalla), “ kyky kilpailla infektiokykyisen rotaviruksen kanssa solu- • · jen MA-104-reseptoreista. Kompetitiotutkimukseen käytetty viruskanta oli naudan rotaviruskanta C486, joka aktivoitiin 50 μg:lla trypsiiniä yhtä millilitraa kohti. Kompeti- 35 tiokokeessa käytettiin tämän kannan sopivaa laimennusta ” • · 77 1 0 4 6 3 8 siten, että plakkeja muodostavien yksiköiden määrä oli 30 - 50. Kontrollina käytetyn flagelliinin varastopreparaatin lähtöpitoisuus oli 3,55 mg/ml, kun taas 275 - 292 -epitoo-pin sisältävän flagelliinin varastopreparaatin pitoisuus 5 oli 2,0 mg/ml. Näistä preparaateista valmistettiin sopivat laimennokset siten, että lopulliset flagelliinipitoisuudet olivat 1,25 μg, 25 μg, 50 μg, tai 100 μg 1 x 105 solua kohti .
Kompetitio suoritettiin sekoittamalla sopivia mää-10 riä rotavirus -varastopreparaattia sopivaan määrään fla-gelliinipreparaattia. Seokset adsorboitiin MA-104-solujen yksisolukerroksiin 1 tunnin ajan 37 °C:ssa. Adsorption jälkeen yksisolukerrokset pestiin kolme kertaa Eaglen minimaalisella välttämättömällä ravintoliuoksella (MEM) ja 15 niiden päälle lisättiin l-%:sia agaroosirakeita, jotka oli laimennettu MEM:ään. Soluja inkuboitiin 3 päivää 37 °C:ssa ja ne värjättiin sitten plakkien osoittamiseksi l-%:sella kristallivioletilla, joka oli laimennettu 80-%:seen meta-noliin.
20 Kukin määritys suoritettiin kolmena rinnakkaisko- keena käyttäen myös yksisolukerroksiin lisättyjä preparaatteja, jotka sisälsivät osoitetuissa pitoisuuksissa yksinomaan flagelliinia tai flagelliinia, joka sisälsi 275 292-epitoopin, jotta oltaisiin voitu kontrolloida ··· 25 pelkkien peptidien mitkä tahansa yksisolukerroksiin koh distuvat haitalliset vaikutukset.
«t • i • « 7a 104638 78
Taulukko 4
Flagelliinipreparaatin ja viruksen välisen kilpailun aiheuttama plakkien prosentuaalinen väheneminen 5
Preparaatti Flagelliinimäärä ^g) Vähenemä (%)a
Flagelliini 1,25 0 25.0 0 50.0 0 10 100 0
Flagelliini, 1,25 50 joka sisälsi 25,0 85 275-292 -jak- 50,0 99 15 son 100 100 a Plakkeja muodostavien yksiköiden määrä määritystä kohti oli noin 40. Kukin määritys suoritettiin kolmena rinnak-kaismäärityksenä ja lopullinen vähenemisprosentti lasket-20 tiin näiden keskiarvosta.
Esimerkki 4
Solutason immuunivasteiden induktio CRM197-epitoop-peja ilmentävillä hybridiflagelloilla
Tiettyjen immunogeenisten epitooppien antaminen *' 25 soluille voi johtaa sellaisten spesifisten solutasoisten immuunivasteiden induktioon kuten solujen lisääntyminen, sytokiinien muodostuminen ja näitä epitooppeja ilmentävien kohdesolujen spesifinen hajoaminen. Jotta oltaisiin voitu osoittaa yhdistelmätlagellojen kyky aiheuttaa solutasoisia 30 immuunivasteita, näissä kokeissa käytettiin mallina ennus- ;* tettua ja kokeellisesti vahvistettua T-soluepitooppia.
Valittu epitooppi käsittää CRM197-proteiinin (mutatoitunut difteriatoksiinimolekyyli) aminohapot 366 - 383. Sitten osoitettiin, että aiemmin CRM197-proteiinilla esikäsitel-35 lyistä SJL-hiiristä saadut imusolmukesolut reagoivat in z ·» 104638 79 vitro ottamalla sisäänsä tritioitua tymidiiniä (blasto-geneesi), kun niitä stimuloitiin puhdistetulla synteettisellä peptidillä, joka edusti CRM197-proteiini aminohappoja 366 - 383 (ks. US-patenttihakemusjulkaisu, jonka sarja-5 numero on 07/150 688 ja joka on jätetty 1. helmikuuta 1989, jossa esitetty materiaali liitetään tähän viittauksella) .
Syntetisoitiin seuraavat oligonukleotidit, jotka koodaavat CRM17:n aminohappoja 366 - 383: 10 366 NLFQVVHNSYNR 5'-AAC CTG TTC CAG GTT GTT CAC AAC TCT TAT AAC CGT 3'-TTG GAC AAG GTC CAA CAA GTG TTG AGA ATA TTG GCA 15 383 P A Y S P G (S) CCG GCT TAT TCT CCG G -3' GGC CGA ATA AGA GGC CCT AG-5' 20 Nämä oligonukleotidit jatkokloonattiin flagellii- ni-ilmentämisplasmidiin pPX1647. Tämä plasmidi on alkuperäisen vektorin pPX1651 muunnos, jossa yksi ainoana esiintyvä BamHI-restriktiokohta on hävitetty katkaisemalla, muodostamalla tasoitetut päät käsittelemällä Klenow-25 entsyymillä ja liittämällä uudelleen yhteen ja jonka yhteen ainoaan EcoRV-kohtaan liitettiin seuraava oligonuk-leotidi D L L D G S 30 5'-GAT ATC ATC GAT GGA TCC-3' r 3 ' -CTA TAG TAG CTA CCT AGG-5 1
Alleviivatut kodonit edustavat kolmea yksittäistä restriktiokohtaa, EcoRV, Clal ja BamHI, tässä järjestyk-35 sessä mainittuna. Tämän jaksoliittymän tuloksena on sei- 9
I
so 104638 laisten kolmen ainoana kappaleena esiintyvän restriktio-entsyymin tunnistuskohdan liittäminen, jotka helpottavat myöhemmin suoritettavaa vieraita epitooppeja koodaavien jaksojen liittämistä. Plasmidi pPX1647 pilkottiin 5 EcoRV:llä ja BamHI:llä ja liitettiin uudelleen yhteen CRM197-epitooppia koodaavien oligonukleotidifragmenttien ylimäärän läsnäollessa. Rekombinantit eristettiin transformaation jälkeen ja ne luonnehdittiin restriktioentsyy-mikartoituksella, Western-blottauksella ja nukleotidisek-10 venssoinnilla. Saatu yhdistelmä plasmidi, pCRM7F, vietiin Salmonella dublin SL5927-kantaan, ja yhdistelmätlagellat valmistettiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla.
Immunisointi 50 μg puhdistettua yhdistelmätlagelliinipreparaat-15 tia tehtiin emulsioksi yhtä suureen tilavuuteen täydellistä Freundin adjuvanttia ja tämä annettiin SJL-hiiriin ihonalaisesti hännän tyveen. Kontrolleiksi immunisoitiin toisia SJL-hiirten ryhmiä samalla tavalla käyttäen flagel-loja, joista yhdistelmät puuttuivat (1650) ja puhdistettua 20 CRM197-proteiinia kuten on kuvattu US-patenttihakemusjulkaisussa, joka on jätetty 1. helmikuuta 1989 sarjanumerolla 07/150 688.
T-solujen aktivaatio
Hiiren T-solujen lisääntyminen 25 Nivus- ja aorttaa ympäröivät imusolmukkeet kerät tiin aseptisesti talteen hiiristä, jotka oli immunisoitu edeltäkäsin optimaalisella annoksella täydelliseen Freundin adjuvanttiin emulsioksi (1 : 1 -tilavuussuhteessa) tehtyä antigeeniä. Valmistettiin yksisoluinen suspensio 30 RPMI:hin, joka sisälsi 10-%:sta naudan sikiön seerumia. i' Yhden pesun jälkeen solut suspendoitiin uudelleen RPMI:hin, jossa ei ollut seerumia ja ne laskettiin trypaa-nisinieliminaatiota käyttäen faasikontrastimikroskoopissa. Solumäärä säädettiin pitoisuuteen 3 x 106 solua/ml 35 RPMI:ssä, joka sisälsi 2 % normaalia hiiren seerumia. Vai- _ · “1
• I
104638 81 niistettiin useita pitoisuuksia antigeenejä, mitogeenejä tai muita kontrollimateriaaleja RPMI:hin, jossa ei ollut seerumia ja näistä otettiin erät (0,1 ml) kolmena rinnak-kaisnäytteenä 96-kuoppaisiin tasapohjaisiin kudosviljelyä 5 varten käsiteltyihin levyihin. Kaikkien antigeenien suhteen käytettiin rutiininomaisesti hyvin kattavaa annos-aluetta. Näihin levyihin lisättiin 0,1 ml solususpensiota. Lopullinen solupitoisuus oli siten 3 x 105 liuoksessa, joka sisälsi 1 % hiiren seerumia. Solujen lisäyksen jälkeen 10 viljelmät asetettiin inkubaattoriin, jossa ylläpidettiin kosteutettua 5-%:sta C02-atmosfääriä ja 37 °C:n lämpötilaa. Kolmen päivän pituisen inkubaation jälkeen viljelmille annettiin 18 tunnin pituinen pulssi (3H)-tymidiiniä, jota annettiin 1 /zCi/kuoppa, ja otettiin talteen nestetuikelas-15 kennalla suoritettavaa laskemista varten. Tymidiinin kertyminen soluihin on ilmoitettu keskiarvona toistetuista testattavista arvoista, joista on vähennetty toistettujen stimuloimattomien (tausta) arvojen keskiarvot.
Tulokset 20 Kuviosta 14 nähdään koetulokset, jotka saatiin sil loin, kun imusolmukesolut SJL-hiiristä oli esikäsitelty yhdistelmäflagelloilla. SJL-hiiret immunisoitiin 50 μg:lla puhdistettua CRM197-proteiinia (Δ)> yhdistelmäflagelloilla, jotka koodasivat CRM197:n 366-383-epitooppia (♦), tai 25 puhdistettuja villityyppisiä (1650) flagelloja (1), jotka • · · oli tehty täydelliseen Freundin adjuvanttiin ja annettu ihonalaisesti hännän tyveen. Seitsemän päivää esikäsittelyn jälkeen imusolmukkeet poistettiin ja niistä valmistettiin yksisoluiset suspensiot. 3 x 105 imusolmukesolua (LNC) 30 inkuboitiin puhdistetusta CRM197-proteiinin aminohappoja 366 - 383 koodaavasta synteettisestä peptidistä valmistettujen viisinkertaisten sarjalaimennosten kanssa. Soluja viljeltiin RPMI 1640-kasvatusliuoksessa, joka sisälsi l-%:sta normaalia hiiren seerumia, 37 °C:ssa kolme päivää, 35 niille annettiin pulssi tritioitua tymidiiniä, jonka suu- • 104638 82 ruus oli 1,0 μ(2ΐ kuoppaa kohti, 16 tunnin pituisen ajan ja ne otettiin talteen nestetuikelaskentaa varten. Koetulokset on esitetty stimulaatioindeksinä (S) versus stimuloivan antigeenin pitoisuus, jossa S = cpm, joka on mitattu 5 kuopista, joissa oli stimuloivaa antigeeniä jaettuna niistä kuopista saadulla cpm:llä, joissa ei ollut lainkaan stimuloivaa antigeeniä. Kukin tulokseksi saatu piste edustaa kolmesta rinnakkaisviljelmästä saatua keskiarvoa ja keskihajontaa.
10 Kuvio 15 esittää koetulokset, kun samoja imusolmu- kesoluja stimuloitiin puhdistetulla CRM197-proteiinilla. SJL-hiiret immunisoitiin 50 μg:lla puhdistettua CRM197-proteiinia (δ) , yhdistelmätlagelloilla, jotka koodaavat CRM197:n 366 - 383-epitooppia (♦), tai puhdistettuja vil-15 lityyppisiä (1650) flagelloja (I) , jotka oli valmistettu täydelliseen Freundin adjuvanttiin, ihonalaisesti hännän tyveen olosuhteissa, jotka on kuvattu kuviossa 14 esitettyjen koetulosten ollessa kyseessä.
Esimerkki 5 20 Taulukoissa 5 ja 6 on esitetty yhteenveto tuloksis ta, jotka saatiin liikkuvuuskykytutkimuksista, Western-blottausanalyysista ja immunisointitutkimuksista, joissa käytettiin flagelliinin yhdistelmäfuusioproteiineja useissa eri isännissä. Menetelmät, joita käytettiin näissä yh-25 teenvetona esitetyissä kokeissa, on kuvattu edellisissä esimerkeissä.
t < * ( Ϊ
• I
., 104638 O «5 0) ίΠ3 »rt ;Π3 =Π5 :ίΰ :fö
4-1 Η ι—I >—I ι—) JS
Ο ι—I (“Η ι ι-Η γΗ _ι ^ 3J ή ·Η !>i'G !>ι S- rN -h S- 0 o dl IDJ»! J) Μ £ Μ >ί Φ £
Cm r*' m S * φ ΰ J o W rl ΦΛ + + + + + + + I + s I.
fj 4J 3 m λ Λ rt Λν W »rt Ό · ' ' · Il + I I I , «d£.HC + + C + Η Ή -Η ft 0J J3 •Η 4-1 Μ ö φ ο Η ·Η Η Ή ί Η Λ ^coococo cn ^ η m H ^i^rocNCNrororo^Gl '' φ ·η ϊσισ^σιΐΛ Lj & Ό imininm ιηΐΛ λ,» Γ id-H_2JJJJJJin3 j Η E^MMMMMMJ™ m
«h m Π w J
m ^ « £ Q :<e Dj Ö > I rs \J :<Ö »rt !(Ö 00 VO GO rl VO 00 m 00 00 00 m
rt +1 iJ JJrOMNIC CN VX> (M CM CN
H H G G ro VO CO CN voro ^ CO CO CO ~ g »rt »rt »rt h in in ro in w vom in in in X, m n ro »144J4I JJ in j J J J j fS-H H H M M M M MM J £ M M M ^
W M J
O -H
(d O +J in H
•rl O l 4J M H CN ^ 3.
w in >1 rt J vo r~ cn L
Λ WH 1« ft (N (N VO L.
0 J ι ro \ O 0 tN $ •P O u
H G
•H -H
H T! O -HÖH — σ> oo m E G h h Lj cn ιι cn JL’
M ro Φ n* n o* S n H o< LJ
rt m£w VOM Il rn OOtn (N M CN m n »H G J H J oji MJ MJ M j a g ft w ft cnq, aa aa ft- n, :rt M w O ^
H CN
> Λ ΐ" H S3
:rt 1 (C 4-> O' ro I >,-H
:rt >1 »rt ro H C" ι l ^ tlfl M »rt 4-> E il o» hi Oh h h o in ft id-h :rt G »rt rG CO VO I CN ι h CN CN CN 0 G 4-> §=rt ί> >*1 ai CN CN CNrOCN Hin H in H 4J G a »rt >ί G E-ι o CN H CQ CN H H CQ M O» M θ' M 10 ΦΦ , S 4-) I U in CQ H I I H I I I ftH CQ ftH pq ft"-- « ft
·, rt I *r4 -H I I
: -n -H 4J 4-> -G -G
φ G 4-1 Ή 4-> -G 4J 4-1 4-1 -H
a »rt -H 4J G -G g -rt 4-1 4-1 G
. ft G l G »O *H Ή ·Η ·Η -H *H -H l *H
0 Φ rt Ή l Ή ·Η ·Η ·Η -H *Η -H CC Ή 0 Ο^ΗΐβΛί4-1φ4-)φ 4-1 M 4-1 M 4-1 M G ft Φ P GrtraiH-H rt 4-) rt 4J rti rti rti "ft4-i H Λί rG AJ rt CO ftO ftO ft-G ft-G ft-G > -H o ft h o o ι ^ φ G φ g Φω φω φ ro h cc g H <^4JCQ>iffiMft KMft W Φ K Φ K Φ K > ft ’ in o in o in o m H H CN cn ro ro 84 104638 »III ..
rt 4-) -Η ο ΓΟ g o o g h G 3 co -H cn , P 4J O £ v -h « a * β X «D -H O rt ,§ ,§ X + E H -H =(0 § „8, 7 1 d to ns 03 . .
(-! 2 (q 1-1 P 2 c3 S3 <d ^ w p § ® g £ o * 3 ra£ β 'π« Λ 0)5 P jj ^ ~ 3 -¾ s“ S| S Si JJ “ U* S g'rH m
+*3 3 -H 9 G D CO
•H 3 _, !* rt § -P G w
•ö C -Η π 2 O <U H
•H H ^ m G ^ '—
g JJ ^ + «g λ; ” -H -H
W =rt [y CD >, d g rt ί ^ 3 3* g *s .& ΰ * 5 ^ _ .3 -3 s eS g >.g p ra -h tj C ^ 3 ε ^ ή !<β ω n H Λ te cn -H Π ,„J O Q, .
Λ H >, [g r- hJ JS -h ^ ϊ
Jj <D -H r< m G 1-1 TS L. ^ 5¾ id ö> τ5 .¾ P E Dj JJ ™ .u 3 •n <d -H g co ή ,_, Jj ^ Ρ ^ 2
ν-'ΗΕ'Ξ ,G ^ ο 1 rt E-· <C G
Crag a rt ^ £j ,υ O O U & m ns S O o
+) rH ^ ^ O M H .H
n :(ti di sfö/»^1—I <! H - - 8>ι« . ω 5 w3i-i nm m 2 :id «e »te 00 co ,m ra S ö O U 11 3 -p jj jj n .'2 a) .h 0 , r ^ ' H H G G os rain <U rrt " »< E-ι CN En < 3 :id «e =rt m -Λ 2 · m 9 O O ω < H m O O U vo ra w ra ra P 'C «rt >, £ ra co O U c- o U m £ -H m h co ra fr ra j? ° Λ! .* _ m M no .5 sr ra ^ rt rt C E-1 H <C m
o -h _j o’-η ra .ra *'—»ί—1 M s E-· co U O
G o jj CO nm'H » u !, 1 O U E-ι C
•HmijJcoc^ g .2 9 m .> C , _ „ h w pq >, rt P r» ra p cd cu^iij OO E-· C (v^
,Κ JH rt p, (N O|rtr-I PTJ M Eh < 04 O U
O I IHN. O .3rarH »Ή C H U O
P m 15 m O «rt :G P fl) •H G W ^ P · 4-> > Dj E-i C E-i C Λ •H -H , '2 > G G -h =Π5 rt O O U P C H 2
H Ti ^"GrtrtrtrartJDj OU UU G
^ O -H O σ> 5rH4-iTi>W .2 CO n E D ro ^ ra ^ ‘H ’H 10 :nJ = C E"1 H C n ’· m ma) ^ °!jrtoOrt=rt>i ω < h 04OU r2 « rt E m i^p-H cou Et! OU UO ω •n 1—1 g P ^ - ra y -ri p m ft c Dj ^crtrt-H-Hi^C OU Ε-<<ί Τ' :id ΐΝΕΡ«·Η0ιηβ noo PCEn ^ •H 1 fn^CXt^Hd) UO OU ® >J3P P'gjj.HODi^ ^ ud irt4-> Sm m p 3,0 E rtM= E-*<C E-< <d T, :ld >^:rt MW (ΰι-ΐεεΡίΝ 04OU 04 o u
M =rt-UE OW <0 M O -H _, ho UO UO
:(d P=rtG ι4λ; id r
§.rt>>jE-i(2 rt G^rtHrnHC < H _J
rt >1 Sh >0 m Ed G'HmnftraP<h W^H
SP' CP nEraOJ-HVOCJit' OU OU rt ’ rt ^cutiphDj
. -n s Hr-Hrt-H4->i>Oj> Il H< P
a) -HPOOirtCDmrtH -- OOU 0)^ «rt 1 mG coEpSph-GH! mm OU <0
ft G O -H >iCN
0 rt p ra -h -h Ti
0 Dj Dj G Dj rt rt I
+> G rt ϋ DjP fi •ΗΛί^υΚο Gr' ftMGOSD H rt C"
w C COUPDj rt ,D U Ό !^(N
*· m o m o m o H M CN CN ΓΟ 104638 85 % i i [Ö-H OOOO 4-) mmr'irt H H 1-1 H « 0
1/1 m (N cn \ <n cn \ ro cn ^ m cn in in cn in 4J
Η Φ (1) \\ \ O \ O \ \ O \ \ O \ NNN w m LT)tn (N Η Π CN H m CN Η Γ0 CN H CO CN m O HLT) (Ö
+ -H
G
nS , tö (C rC td 4-> nJ 4-> 3 e,, ra 1 ra „< m cö ra <ura 0 m 3 5 mm™ ns m ns rarara raranj curate cura g fi 2 Orim to 0 “ room raora mom m 0 m Mm g 1-1 h y ran ® ra m m uh u mn m hh b mo -h
M D * ^ 0 cu 0 ocuo Olio 000 000 o M
E V. ο M \ M \ r—I M\M r—l\r-1 3 \ r-I 3 0 (4 'OO <U · ® 0-0 0-0 0-0 Λ< · 0 Λί\ »(« m.^3 ft 24 2 \ o \ \ o \ \o\ \ e \ \ · =te »J πζ · · I III ·· *· «· « Q, ϋ 2 -H m r1 ε o<0 ε ft ο g ft ο ε α o g μ ο ε· =nj RP' \ ffl· ·\ \ ^ \ · \ •-H 4-)
5mm M N< ft M <1< ft M (2, -H («) ft -H\ 4J
ft $ X * \ X \ X \ \ X \ \ X \ \ X \ \ ro =t0
mm 2 ^ U1 \ ^ in\N< IT) \ ^ Π \ Π CO X R
10 ”2° oo X^-C X“ X X® X X® X X® X X® 0 oom 2 9 ^ 9 \3\ \3\ \5\ \ 9 \ \o Λ OVhVhCL/ π π λ n Oi m nm λ rn σ» σ\ τ*ι στ oo rn στ ® π
Sc XX o X o o X o o X o o χ o o X ο οχ , 5 LO LO I—I LT) rH Η ΙΛ rl rHl/)rH γ-ί L0 Ι—I rl LO rI rH LO ^ ί τ Ο « *J O (X O Ρ4 Ο Ο £ Β . m m w \ ^ £ m cq cq m cq c 3 s ä s ä ä ä .3 ΙΟ lO M CQ -H CQ M CQ -H CQ -H ffl PQ -H ffl Lj w c a c c ccl]
C rH H -rl -H 3 -H M 3 -H -rl c -H -H 3 -H -H -H -H M
h ffl m -h (h m -h in m -h u m -h in m -ri -h r r -hr m :tö r» t" d -h r d -h r d -h r d -h R d d -h -h d -h rH in ID (ö -rl aj m -rl Π5 tö -rl tö Π} -rl <Ö -H (C -rl -rl (Tj -rl L] w UU XfflS XKS XÄS XHS -HXfflffl Xffl 7? 0 u i.) S g ffl ? • - ή .ra -.te cd co d co oo co oo 2® oo ^
4J CN 04 -H CSI CN (Tr CN CN
d'Oc^CTr-ricTT στ cn στ dor στ p :a5^inLn®Ln in in in -·ιη in d
Oi M ffl ffl 4J ffl ffl ffl ffl m ffl ffl ro M-Hcncnocn m w co cn cn -t
m r -h S
^ o, ft ä U -H >1 (TS ffl m 0 -a m m S 2 0 -Hi—ι h h d N* oo n στ >,στ στ d
λ; gtrSHH-rlH CN H CN 4->Γ0 m P
o mi ^ ft^f ^ m ^j< υ m nspQcncnicn cn cn m men en m ·· "Hi—I ffl ffl PQ ffl ffl ffl ffl Pffl ·· 4-> * Qc ft 1 ft ft ft ft Cjft ft jj d m -n o
•η -h a; 4-> o S
O ft 0 -I.) U I ΰ m oh-> -η η ο S-h ^ -rlO<e Ή lo CN 4-)-4-)^5¾^ do^n -ί-) h cn a,&O0-rid 3 o i) on nuo ι 0 0 R d-ud g -H H ft Λ ft öl -H O CO R Rft dOrm g di O E-* E-· 0 m CN cn 4-) 4-) 00 m wxuUKcn w cn ft cncns ** inoinomoin H H cn cn ro n 86 1 0 4 6 3 8
Mikro-organismien talletus
Seuraavat bakteerikannat, jotka sisältävät luetellut plasmidit, on talletettu 4. toukokuuta 1988 talletus-laitokseen American Type Culture Collection (ATCC), Rock-5 ville, MD, ja niille on annettu esitetyt talletusnumerot
Bakteerikanta Plasmidit Talletusnumero
Salmonella dublin pPX1650: koodaa 10 SL1438 täysimittaista 67685 S. muenchenin flagelliinin Hl-d-rakennegeeniä
Salmonella dublin pPX1653: koodaa 4 15 SL1438 kappaletta 4:n amino- 67688 hapon mittaista Plasmodium falciparumin sirkumsporotsoiitti- ! proteiinijakson toistuma- 20 jaksoa Hl-d-flagelliinin yhdistelmäfuusioproteiinina Salmonella dublin pPX1662: koodaa 4 SL1438 kappaletta 9:n amino- 67687 hapon mittaista ' 25 Plasmodium berghein i · c sirkumsporotsoiitti-proteiinijakson toistuma-jaksoa, joka liittyy Hl-d-flagelliiniin 30 Salmonella dublin pLS411: koodaa kolera-'* SL1438 toksiinin B-alayksikön 67686 -CTP3-peptidiä Hl-d-flagelliiniin liittyvänä yhdistelmäfuusioproteiinina 35 ! i 104638 87
Bakteerikanta Plasmidit Hakunumero
Salmonella dublin ilman plasmidia (rokote- SL5927 kanta, jossa on Salmonella 67944 dublin SL5927 -kannan 5 Hl-lokukseen liitetty TnlO- transposoni)
Salmonella dublin pROTA92-l9: koodaa rota- SL5927 viruksen VP7:n aminohappoja 67945 i 275-292 yhdistelmäfuusio-10 proteiinina Hl-d- flagelliinin kanssa
Tarkoituksena ei ole se, että talletetut mikro-organismit rajoittaisivat tämän keksinnön suojapiiriä, koska 15 talletettujen sovellutusesimerkkien tarkoituksena on toimia yksittäisinä kuvaavina esimerkkeinä yhdestä tämän keksinnön puolesta ja mitkä tahansa mikro-organismit, jotka ovat toiminnallisesti samanarvoisia, kuuluvat tämän keksinnön suojapiirin. Edelläolevan kuvauksen ja oheistettu-20 jen piirrosten perusteella alan ammattimies kykenee itse asiassa havaitsemaan useita tämän keksinnön mukaisia muunnelmia tässä jo esitettyjen ja kuvattujen muotojen lisäksi. Näiden muunnosten on tarkoitus kuulua liitteenä olevien patenttivaatimusten suojapiiriin. On myös selvää, että 25 nukleotideille annetut emäsparikoot ovat vain likimääräisiä ja niitä käytetään vain kuvaamistarkoituksessa ja kuvia, jotka esittävät kaavioita DNA-jaksoista, ei välttämättä ole piirretty oikeassa mittakaavassa.
«
• I
m i

Claims (21)

104638 88
1. Menetelmä yhdistelmägeenin valmistamiseksi, joka käsittää f lagelliinifuusioproteiinia koodaavan nukleotidi- 5 jakson, joka proteiini käsittää ensimmäisen epitoopin, jota koodaa Salmonellan tai Shigellan flagelliinin raken-negeeni, ja ainakin yhden heterologisen organismin epitoopin, joka organismi on muu kuin se organismi, josta ensimmäinen epitooppi on peräisin ja joka epitooppi ei oleelli- 10 sesti ole sama kuin flagelliinigeenin koodaama epitooppi, ja joka flagelliinifuusioproteiini kykenee rakentumaan toiminnalliseksi flagellaksi, ja jonka proteiinin flagel-liiniosan oleellinen antigeenisuus säilyy, tunnet-t u siitä, että 15 a) eristetään flagelliinigeenin sekvenssejä b) eristetään sekvenssejä, jotka koodaavat heterologisen organismin epitooppia tai epitooppeja, ja c) konstruoidaan mainittu yhdistelmägeeni sisällyttämällä heterologisen organismin epitooppia tai epi- 20 tooppeja koodaava(t) sekvenssi(t) flagelliinigeenin sek- vensseihin tai ne korvataan heterologisen organismin epitooppia tai epitooppeja koodaavilla sekvensseillä.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että flagelliinirakennegeeni on 25 peräisin Salmonellan Hl-, H-ld- tai H2-geenistä.
3. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että heterologinen epitooppi on immunogeeninen, kun fuusioproteiini tuodaan selkärankais-isäntään ja että immunogeeninen epitooppi aiheuttaa im- 30 muunivasteen, joka on T-solu-, B-solu- tai luonteeltaan I solutasoinen vaste tai näiden yhdistelmät.
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että heterologinen organismi on loinen, bakteeri, virus tai sieni.
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että heterologisen organismin epi- % 104638 89 tooppi on sirkumsporotsoiittiproteiiniantigeenin, Strepto-coccuksen M-proteiinin, koleratoksiinin B-alayksikön, he-• patiitti-B:n pinta-antigeenin tai hepatiitti-B:n pinta- antigeenin esiastemuodon, HIV:n vaippaproteiinin tai rota-5 viruksen VP7-proteiinin epitooppi.
6. Patenttivaatimuksen 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että epitooppi on T-solu -epitooppi, B-solu - epitooppi tai näiden yhdistelmä.
7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen menetelmä, 10 tunnettu siitä, että T-solun epitooppi on peräisin difteriä-CRM197-toksiini 366-383:sta.
8. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan yhdistelmägeeni, joka käsittää Salmonellan flagelliinin rakennegeenin, jos- 15 sa heterologinen DNA-jakso on liitetty flagelliinin ra- kennegeeniin alueelle, joka ei ole sen koodaaman flagelliinin toiminnalle välttämätön.
9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että heterologinen DNA-jakso on 20 liitetty flagelliinin rakennegeenin runsasta vaihtelua sisältävään alueeseen.
10. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että flagelliinin rakennegeeni on peräisin Salmonellan Hl-, Hl-d tai H2-geenistä.
11. Patenttivaatimuksen 10 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että heterologinen DNA-jakso on liitetty Salmonellan Hl-d-geenin luonnollisten EcoRV-koh-tien väliin.
12. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, 30 tunnettu siitä, että heterologinen DNA-jakso koo- ; daa organismin epitooppia, joka organismi on patogeeninen selkärankaisille.
13. Menetelmä yhdistelmänukleiinihappokloonin valmistamiseksi, joka sisältää patenttivaatimuksen 1 mukaisen 35 yhdistelmägeenin, tunnettu siitä, että patentti- 90 104638 vaatimuksen 1 mukainen yhdistelmägeeni viedään vektoriin ja eristetään klooni, joka sisältää mainitun yhdistelmä-geenin.
14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, 5 tunnettu siitä, että valmistetaan yhdistelmänuk- leiinihappoklooni, joka sisältää plasmidin, joka on pPX1653, pPX1662, pLS411 tai pROTA92-19 siinä muodossa kuin ne on talletettu ATCC:hen varustettuna hakunumeroilla 67688, 67687, 67686 ja 67945, tässä järjestyksessä mainit-10 tuna.
15. Menetelmä yhdistelmämikro-organismin valmistamiseksi, joka käsittää patenttivaatimuksen 1 mukaisen yh-distelmägeenin, tunnettu siitä, että mikro-organismiin viedään sopiva vektori, joka sisältää patentti- 15 vaatimuksen 1 mukaisen yhdistelmägeenin.
16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mikro-organismi on heikennetty bakteeri, jolla on kyky tunkeutua elimistöön ja se on Salmonella, Shigella tai Escherichia coli.
17. Menetelmä flagelliinifuusioproteiinin val mistamiseksi, joka käsittää ensimmäisen epitoopin, jota koodaa Salmonellan tai Shigellan flagelliinin rakennegeeni ja ainakin yhden heterologisen organismin epitoopin, joka organismi on muu kuin se organismi, josta ensimmäinen epi-25 tooppi on peräisin ja joka epitooppi ei oleellisesti ole sama kuin flagelliinigeenin koodaama epitooppi ja jonka flagelliiniosan oleellinen antigeenisuus säilyy, tunnettu siitä että a) jonkin patenttivaatimuksista 1-12 mukainen 30 geeni liitetään sopivaan ilmentämisvektoriin, » l b) vektori sijoitetaan sopivaan isäntäsoluun ja saatetaan ilmentymään siinä, ja c) ilmennetty flagelliinifuusioproteiini otetaan talteen. • . 35 91 104638
18. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan fuusioproteiini, jonka heterologisen organismin epitooppi on immunogeeni-nen, kun proteiini tuodaan selkärankaisisäntään, jossa im- 5 munogeeninen epitooppi aiheuttaa immuunivasteen, joka on T-solu-, B-solu- tai luonteeltaan solutasoinen vaste.
19. Patenttivaatimuksen 17 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan fuusioproteiini, joka käsittää Salmonellan flagelliiniproteiinin, joka si- 10 sältää siihen liitetyn heterologisen aminohappojakson lii tettynä flagelliiniproteiiniin alueelle, joka ei ole fla-gelliiniproteiinin toiminnalle välttämätön.
20. Patenttivaatimuksen 19 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että valmistetaan fuusioproteiini, 15 jonka heterologinen aminohappojakso on epitooppi, joka on immunogeeninen, kun proteiini tuodaan selkärankaisisäntään, jossa immunogeeninen epitooppi aiheuttaa B-solu-, T-solu- tai solutasoisen vasteen tai näiden yhdistelmän.
21. Menetelmä flagelliinin yhdistelmäfuusiopro- 20 teiinin ilmentämiseksi, tunnettu siitä, että a) konstruoidaan yhdistelmägeeni, joka käsittää nukleotidijakson, joka koodaa Salmonellan flagelliinifuu-sioproteiinia, joka käsittää ensimmäisen epitoopin, jota koodaa flagelliinin rakennegeeni ja ainakin yhden hetero-" 25 logisen organismin epitoopin, joka organismi on muu kuin se organismi, josta ensimmäinen epitooppi on peräisin ja joka epitooppi ei oleellisesti ole sama kuin flagel-liinigeenin koodaama epitooppi, ja jonka proteiinin fla-gelliiniosan oleellinen antigeenisuus säilyy, 30 b) liitetään yhdistelmägeeni sopivaan ilmentämis- vektoriin, * »« c) sijoitetaan vektori sopivaan isäntään ja d) annetaan vektoria sisältävän bakteeri-isännän lisääntyä olosuhteissa, jotka aiheuttavat yhdistelmägeenin 35 ilmentymisen. 92 104638
FI905441A 1988-05-05 1990-11-02 Menetelmä flagelliinifuusioproteiinin, sitä koodaavan geenin ja mikro-organismin valmistamiseksi FI104638B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US19057088A 1988-05-05 1988-05-05
US19057088 1988-05-05
PCT/US1989/001932 WO1989010967A1 (en) 1988-05-05 1989-05-05 Recombinant flagellin vaccines
US8901932 1989-05-05

Publications (2)

Publication Number Publication Date
FI905441A0 FI905441A0 (fi) 1990-11-02
FI104638B true FI104638B (fi) 2000-03-15

Family

ID=22701885

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI905441A FI104638B (fi) 1988-05-05 1990-11-02 Menetelmä flagelliinifuusioproteiinin, sitä koodaavan geenin ja mikro-organismin valmistamiseksi

Country Status (10)

Country Link
EP (1) EP0419513B1 (fi)
JP (1) JP2793673B2 (fi)
AT (1) ATE121782T1 (fi)
AU (1) AU637049B2 (fi)
CA (1) CA1340817C (fi)
DE (1) DE68922394T2 (fi)
DK (1) DK263390A (fi)
FI (1) FI104638B (fi)
NO (1) NO302031B1 (fi)
WO (1) WO1989010967A1 (fi)

Families Citing this family (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5712088A (en) * 1987-11-18 1998-01-27 Chiron Corporation Methods for detecting Hepatitis C virus using polynucleotides specific for same
US5698390A (en) * 1987-11-18 1997-12-16 Chiron Corporation Hepatitis C immunoassays
US6171782B1 (en) 1987-11-18 2001-01-09 Chiron Corporation Antibody compositions to HCV and uses thereof
US6861212B1 (en) 1987-11-18 2005-03-01 Chiron Corporation NANBV diagnostics and vaccines
US5714596A (en) * 1987-11-18 1998-02-03 Chiron Corporation NANBV diagnostics: polynucleotides useful for screening for hepatitis C virus
AU640118B2 (en) * 1988-12-19 1993-08-19 De Staat Der Nederlanden Vertegenwoordigd Door De Minister Van Welzijn, Volksgezonheid En Cultuur Meningococcal class 1 outer-membrane protein vaccine
US7118757B1 (en) 1988-12-19 2006-10-10 Wyeth Holdings Corporation Meningococcal class 1 outer-membrane protein vaccine
US6027729A (en) * 1989-04-20 2000-02-22 Chiron Corporation NANBV Diagnostics and vaccines
ATE155169T1 (de) * 1990-10-01 1997-07-15 Mini Agriculture & Fisheries Polynukleotidsequenz von salmonella
IE913455A1 (en) * 1990-10-01 1992-04-08 Mini Agriculture & Fisheries Method of testing for salmonella
GB9101550D0 (en) * 1991-01-24 1991-03-06 Mastico Robert A Antigen-presenting chimaeric protein
IL101639A0 (en) * 1992-04-17 1992-12-30 Yeda Res & Dev Recombinant influenza vaccines
PT1112747E (pt) * 1999-12-28 2004-10-29 Akzo Nobel Nv Vacina de salmonella que nao induz anticorpos contra flagelina ou flagelos
WO2004055045A1 (ja) * 2002-12-16 2004-07-01 Caf Laboratories Inc. サルモネラ抗原処方物、それを使用した抗体検査キット及びサブユニットワクチン
WO2005107381A2 (en) 2004-05-07 2005-11-17 Hans-Gustaf Ljunggren Use of flagellin as an adjuvant for vaccine
CN101128480A (zh) * 2004-12-02 2008-02-20 Csir公司 含有缺损的鞭毛蛋白基因的革兰氏阳性菌细胞、基于鞭毛蛋白的融合蛋白以及从液体中除去金属离子的用途
JP5094407B2 (ja) 2004-12-16 2012-12-12 ウェイク・フォレスト・ユニヴァーシティ・ヘルス・サイエンシズ Ｙｅｒｓｉｎｉａｐｅｓｔｉｓの免疫療法におけるフラジェリンの使用
WO2006078657A2 (en) 2005-01-19 2006-07-27 Vaxinnate Corporation Compositions comprising pathogen-associated molecular patterns and antigens and their use to stimulate an immune response
CN106237316A (zh) 2006-03-07 2016-12-21 法克斯因内特公司 包含血细胞凝集素的组合物、制造其的方法与使用其的方法
AU2009236585B2 (en) 2008-04-18 2013-03-07 Vaxinnate Corporation Deletion mutants of flagellin and methods of use
US8932598B2 (en) 2012-08-28 2015-01-13 Vaxinnate Corporation Fusion proteins and methods of use
CN102816246B (zh) * 2012-09-04 2014-07-23 成都蓉生药业有限责任公司 一种人巨细胞病毒免疫原融合蛋白及其制备方法和用途
WO2016046357A1 (en) 2014-09-26 2016-03-31 Bavarian Nordic A/S Methods and compositions for intra-nasal immunization with recombinant mva encoding flagellin
WO2016081619A1 (en) * 2014-11-18 2016-05-26 The Trustees Of Columbia University In The City Of New York Detection of analytes using live cells
CN104402974B (zh) * 2014-12-10 2017-11-14 重庆医科大学 一种具有粘膜免疫佐剂活性的多肽及其在制备粘膜免疫佐剂中的用途
US10849938B2 (en) 2017-09-13 2020-12-01 ZBiotics Company Gene expression system for probiotic microorganisms

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4735801A (en) * 1982-09-07 1988-04-05 Board Of Trustees Of Leland Stanford Jr. University Novel non-reverting salmonella live vaccines
WO1987002385A1 (en) * 1985-10-11 1987-04-23 Genetics Institute, Inc. Method for producing heterologous proteins
ES2060580T3 (es) * 1986-03-11 1994-12-01 Shionogi & Co Adn que tiene una secuencia adn codificante de la proteina flagelina y vector que la contiene.
CA1331355C (en) * 1986-04-21 1994-08-09 Bioenterprises Pty. Ltd Immunopotentation

Also Published As

Publication number Publication date
JP2793673B2 (ja) 1998-09-03
AU637049B2 (en) 1993-05-20
JPH04502402A (ja) 1992-05-07
WO1989010967A1 (en) 1989-11-16
NO904806L (no) 1991-01-03
EP0419513A1 (en) 1991-04-03
DK263390A (da) 1991-01-04
CA1340817C (en) 1999-11-09
DE68922394D1 (de) 1995-06-01
DK263390D0 (da) 1990-11-02
AU3697989A (en) 1989-11-29
FI905441A0 (fi) 1990-11-02
NO302031B1 (no) 1998-01-12
DE68922394T2 (de) 1995-10-05
NO904806D0 (no) 1990-11-05
EP0419513B1 (en) 1995-04-26
ATE121782T1 (de) 1995-05-15

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI104638B (fi) Menetelmä flagelliinifuusioproteiinin, sitä koodaavan geenin ja mikro-organismin valmistamiseksi
US6130082A (en) Recombinant flagellin vaccines
JP5566684B2 (ja) Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対する、組換え毒素Ａ／毒素Ｂワクチン
US5112749A (en) Vaccines for the malaria circumsporozoite protein
EP0672116B1 (en) Deletion mutants as vaccines for cholera
EP0863211A1 (en) Expression of recombinant fusion proteins in attenuated bacteria
JP6329544B2 (ja) 新規生弱毒化赤痢菌属（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）ワクチン
EP2532363B1 (en) Use of flagellins from the genus marinobacter as vaccination adjuvants
LeClerc et al. Induction of virus-neutralizing antibodies by bacteria expressing the C3 poliovirus epitope in the periplasm. The route of immunization influences the isotypic distribution and the biologic activity of the antipoliovirus antibodies.
JP4573773B2 (ja) マラリア・ワクチン
EP0395706B1 (en) Production of gonorrheal pi proteins and vaccines
Schmidt et al. Synthetic peptides corresponding to protective epitopes of Escherichia coli digalactoside-binding pilin prevent infection in a murine pyelonephritis model.
Liew New aspects of vaccine development.
US5874088A (en) Deletion mutants of cholera vaccines expressing heterologous antigens
Alves et al. DNA immunisation against the CFA/I fimbriae of enterotoxigenic Escherichia coli (ETEC)
Alves et al. Epitope specificity of antibodies raised against enterotoxigenic Escherichia coli CFA/I fimbriae in mice immunized with naked DNA
Wu et al. Construction and immunogenicity in mice of attenuated Salmonella typhi expressing Plasmodium falciparum merozoite surface protein 1 (MSP-1) fused to tetanus toxin fragment C
Lo-Man et al. Control by H-2 genes of the Th1 response induced against a foreign antigen expressed by attenuated Salmonella typhimurium
US20020142008A1 (en) Immunogenic pili presenting foreign peptides, their production and use
US6348332B1 (en) DNA molecule encoding gonorrhoeal hybrid PIA/PIB protein
Liew Biotechnology of vaccine development
AU617402B2 (en) Vaccines for malaria
JPS63503197A (ja) マラリアに対する保護免疫を与えるポリペプチド類
WO1994006911A2 (en) Mycoplasma pulmonis antigens and methods and compositions for use in cloning and vaccination
Pozza Development of a recombinant pertussis toxin operon: expression and characterisation in Escherichia coli and Salmonella typhimurium aroA

Legal Events

Date Code Title Description
GB Transfer or assigment of application

Owner name: AMERICAN CYANAMID COMPANY

FG Patent granted

Owner name: THE BOARD OF TRUSTEES OF THE LELAND STANFORD JUNIO

Owner name: AMERICAN CYANAMID COMPANY

MA Patent expired