NO302031B1 - Rekombinant gen omfattende en nukleotidsekvens som koder for et flagellinfusjonsprotein, genmodifisert mikroorganisme omfattende det rekombinante genet og fremgangsmåte for ekspresjon av det - Google Patents

Description

Rekombinant DNA-teknologi medfører innsetting av spesifikke DNA-sekvenser i en DNA-bærer (vektor) slik at det dannes et rekombinant DNA-molekyl som er istand til replikasjon i en verts-celle. Generelt er den innsatte DNA-sekvens fremmed for den mottakende DNA-bæreren, dvs. at den innsatte DNA-sekvensen og DNA-vektorer er avledet fra organismer som ikke utveksler genetisk informasjon i naturen, eller den innsatte DNA-sekvens kan helt eller delvis være syntetisk fremstilt. Flere generelle metoder er blitt utviklet som muliggjør konstruksjon av rekombinante DNA-molekyler.

Uansett metode som anvendes for konstruksjon må det rekombinante DNA-molekylet være forlikelig med vertscellen, dvs. være istand til autonom replikasjon i vertscellen eller stabilt integrert i ett eller flere av vertscellens kromosomer eller plasmider. Det rekombinante DNA-molekylet bør også fortrinnsvis ha en markørfunksjon som tillater seleksjon av det eller de ønskete rekombinante DNA-molekylene. Dessuten, dersom alle de riktige replikasjons-, transkripsjons- og translasjonssignalene er korrekt ordnet på den rekombinante vektoren, vil det fremmede genet bli korrekt uttrykt i f.eks. de transformerte bakteriecellene, når det gjelder bakterielle ekspresjonsplasmider, eller i tillatte celle-linjer eller verter som er infisert med en rekombinant virus eller som bærer et rekombinant plasmid som har den riktige replikasjons-opprinnelsen.

Forskjellige genetiske signaler og prosesseringshendelser kontrollerer nivået av genekspresjon såsom DNA-transkripsjon og translasjon av budbringer-RNA (mRNA). Transkripsjon av DNA er avhengig av tilstedeværelse av en promotor, som er en DNA-sekvens som styrer bindingen av RNA-polymerase og derved befordrer mRNA-syntesen. DNA-sekvensene i eukaryote promotorer atskiller seg fra DNA-sekvensene i prokaryote promotorer. Dessuten kan eukaryote promotorer og medfølgende genetiske signaler ikke gjenkjennes i eller kan ikke fungere i et prokaryote system, og dessuten blir prokaryote promotorer ikke gjenkjent og fungerer ikke i eukaryote celler.

På liknende måte avhenger translasjonen av mRNA i prokaryoter av tilstedeværelse av de riktige prokaryote signaler, som atskiller seg fra eukaryote signaler. Effektiv translasjon av mRNA i prokaryoter krever et ribosombindende sete som kalles Shine-Dalgarno (S/D)-sekvensen (Shine, J. og Dalgarno, L., 1975, Nature 254:34-38) på mRNA. Denne sekvensen er en kort nukleotidsekvens av mRNA som er lokalisert foran startkodonet, vanligvis AUG, som koder for det aminoterminale (formyl-) metionin i proteinet. S/D-sekvensene er komplementære til 3'-halen av 16S rRNA (ribosomal RNA), og befordrer sannsynligvis binding av mRNA til ribosomer ved dupleksering med rRNA for å tillatte riktig posisjonering av ribosomet (Shine, J. og Dalgarno, L., 1975, Nature 254:34-38) .

En heldig gjennomført ekspresjon av et klonet gen krever tilstrekkelig transkripsjon av DNA, translasjon av mRNA og i noen tilfeller modifikasjon av proteinet etter translasjonen. Ekspresjonsvektorer er blitt anvendt til å uttrykke gener under kontroll av en aktiv promotor i en egnet vert, og til å øke proteinproduksj onen.

Utviklingen av vaksiner for å forhindre virale, bakterielle, sopp- eller parasitt-sykdommer er i fokus for en betydelig forskningsinnsats.

Tradisjonelle måter for fremstilling av vaksiner omfatter anvendelse av inaktiverte eller svekkete patogener. En egnet inaktivering av den patogene mikroorganismen gjør den harmløs som biologisk virkemiddel, men ødelegger ikke dens immunogenisitet. Injeksjon av disse "avlivete" partikler i en vert vil derfor fremkalle en immunrespons som er istand til å forhindre en frem-tidig infeksjon med en levende mikroorganisme. Et betydelig problem ved anvendelse av avlivete vaksiner (anvendelse av inaktivert patogen) er imidlertid at man ikke lykkes i å inaktivere alle partiklene av mikroorganismen. Selv når dette lykkes, siden avlivete patogener ikke formerer seg i verten, eller av andre ukjente grunner, er den oppnådde immunitet ofte ufullstendig, kortlivet og krever flere immuniseringer. Endelig kan inaktiveringsprosessen forandre mikroorganismens antigener, og gjøre dem mindre effektive som immunogener.

Svekkelse refererer til fremstillingen av stammer av patogene mikroorganismer som i alt vesentlig har mistet sine sykdomsfremkallende evner. En måte å oppnå dette på er å under-kaste mikroorganismen uvanlige vekstbetingelser og/eller hyppig passasje i cellekultur. Deretter blir det utvalgt mutanter som har mistet virulens men som allikevel er istand til å frembringe immunrespons. Svekkete patogener er ofte gode immunogener ettersom de i virkeligheten replikerer i vertscellen og frembringer lang-varig immunitet. Man støter imidlertid på flere problemer ved anvendelse av levende vaksiner, de mest bekymringsfulle er utilstrekkelig svekkelse og risiko for at vaksinen igjen blir virulent.

Et alternativ til metodene ovenfor er anvendelse av underenhetsvaksiner. Dette medfører immunisering bare med de kompo-nentene som inneholder det relevante immunologiske materialet. Vaksiner blir ofte formulert og inokulert med forskjellige hjelpemidler. Hjelpemidlene bidrar til å oppnå en mere varig og høyere grad av immunitet ved anvendelse av mindre mengder antigen eller færre doser enn om immunogenet ble administrert alene. Mekanismen for hjelpemiddelvirkningen er kompleks og ikke fullstendig forstått. Den kan imidlertid medføre stimulering av cytokin-produksjonen, fagocytose og andre aktiviteter i det retikuloendoteliale system samt forsinket avgivelse og nedbrytning av antigenet. Eksempler på hjelpemidler omfatter Freunds hjelpemiddel (fullstendig eller ufullstendig), Adjuvans 65 (som inneholder jordnøttoljer, mannidmonooleat og aluminiummonostearat), den pluroniske polyol L-121, Avridin og mineralgeler såsom aluminiumhydroksyd, aluminiumfosfat osv. Freunds hjelpemiddel blir ikke lenger anvendt i vaksinepreparater for mennesker, fordi det inneholder ikke-metaboliserbar mineralolje og er et potensielt karsinogen.

Det er blitt vist at levende, svekket Salmonella er istand til å stimulere en beskyttende immunrespons mot utfordring med den homologe, virulente stammen (Germanier, R. og Furer, E., 1975, J. Invect Dis. 181:533; Germanier, R., 1984, i Bacterial Vaccines, Academic Press; New York, s. 137-165; Levine, M.M., et al., 1983, Microbiol. Rev. 47:510; Wahdan, M.H., et al., 1982, J. Invect. Dis. 145:292; Hoiseth, S.K. og Stocker, B.A.D., 1981, Nature, 291:238; Stocker, B.A.D., et al., 1982, Dev. Biol. Std. 53:47; Lindberg, A.A. og Robertsson, J.A., 1983, Infect. Immun. 41:751; Robertsson, J.A., et al., 1983, Infect. Immun. 41:742; Smith, B.P., et al., 1984, Am.J.Vet.Res. 45:2231; Smith, B.P. et al.,

Am. J. Vet. Res. 45:59; Moser, I. et al., 1980, Med. Micribiol. Imm., 168:119). Dessuten har flere forskere anvendt svekket Salmonella som har plasmider som koder for fremmede antigener for å avgi disse fremmede antigener til immunsystemet (Formal, S.B., et al., 1981, Infect. Immun. 34:746; US-patent nr. 4 632 830 til Formal et al.; elements, J.D. et al., 1986, Invect. Immun. 53:685; Maskell, D.J. et al., 1987, Microb. Path. 2:211; Brown, A. et al., 1987, J. Infect. Dis. 155:86; Dougan G. et al., 1987, Parasite Immun. 9:151).

Den repeterende immunodominante epitopen assosiert med cirkumsporozoittproteinet i Plasmodium-arter blir betraktet som mål for beskyttende humorale (og mulige cellebefordrete) responser mot malariasporozoitter (Miller, L.H. et al., 1986, Science 234:1349;) det er beskrevet monoklonale antistoffer som gjenkjenner disse molekyler og er istand til passivt å beskytte naturlige mottakende dyr. To vaksiner basert på disse repeterende epitopene er blitt testet på mennesker og er blitt vist å indusere en beskyttende immunrespons hos noen individer (Ballou, W.R. et al., 1987, Lancet i:1277; Herrington, D., et al., 1987, Nature 328:257).

Koleratoksin er prototypen på en familie av bakterieenterotoksiner som befordrer diaresykdom og er beslektet i struktur, funksjon og immunogenisitet. Andre medlemmer av denne familien omfatter det varmelabile toksinet av E_;_ coli isolert fra mennesker (Yamamoto, T. og Yokota, T., 1983, J. Bacteriology 155:728) og fra griser (Leong, J., et al., 1985, Infect. Immun. 48:73) og toksiner fra Salmonella typhimurium (Finkelstein, R.A., et al., 1983, FEMS Microbiology Letters 17:239) og fra Campylobacter ieiuni (Walker, R.I., et al., 1986, Microbiology Rev. 50:81). Felles for alle disse toksiner er en A-underenhet som befordrer binding av holotoksinet til målcellen. B-underenheten er i seg selv ikke-toksisk, og immunisering med dette molekylet induserer dannelse av toksinnøytraliserende antistoffer.

Vaksiner basert på dannelse av toksinnøytraliserende antistoffresponser ved immunisering med de ikke-toksiske bindende underenhetene i bakterielle eksotoksiner (koleratoksin, varmelabilt toksin fra coli) er blitt foreslått (Jacob, C.O., et al., 1983, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 80:7611; Jacob, CO. et al., 1984, EMBO J. 3:2889).

Hepatitt B-virionet er en 42 nm omhyllet struktur som inneholder et lite DNA-genom. Omhyllingsproteinene blir kodet av S-genet (preS, preS2og S), én av de fire åpne leserammene i HBV-genomet (Tiollais, P. et al., 1985, Nature 317:489). Disse polypeptidene inneholder hepatitt B overflateantigenet (HBsAg). HBsAg-partikler avledet fra humant plasma eller liknende HBsAg-partikler fremstilt ved rekombinant DNA-metoder (hvorav noen mangler preS-epitoper) er blitt vist å fremkalle beskyttende immunrespons, og de rensete partiklene representerer aktuelle vaksiner for HBV (Krugman, S., 1982, J. Am. Med. Assoc. 247:2012).

Flageller er organeller som er involvert i bevegelse av bakterieceller. Syntesen av strukturelle proteiner og den virkelige funksjon av sammensatte flageller er en kompleks prosess som involverer samvirke mellom mange gener og genprodukter (over-sikt av Iino, T., 1977, Ann. Rev. Genet. 11:161). Mer enn 35 gener er blitt definert som spiller en rolle i flagellærfunksjonen i E. coli, og genprodukter for minst 17 av disse er blitt identifisert. Den aktuelle flagellære organellen er sammensatt av tre hovedstrukturelementer, og spenner fra cellecytoplasma via celle-membraner og kulminerer i et stort ekstracellulært domene. Filamentet er sammensatt av et enkelt underenhetsprotein, flagellin, og er den viktigste strukturelle komponenten i organellen, idet den utgjør mer enn 95% av den samlete masse. De strukturelle genene for flagellin er blitt betegnet Hl og H2 i Salmonella (Iino, T., 1969, Bacteriol. Rev. 33:454-475), H i Bacillus subtilis (Joys, T.M. og Frankel, R.W., 1967, J.Bacteriol, 94:32-37) og Pseudomonas aeru<g>inosa (Iino, T., 1969, Ann. Rep. Nati. Inst. Genet. Jpn. 20:94), og hag i E. coli (Armstrong, J.B. og Adler, J., 1969, J. Bacteriol. 97:156-161). Basallegemet er den mest komplekse delen av organellen, og tjener både til å forankre organellen til cellen og som en del av det motorliknende apparatet som roterer filamentet. Endelig tjener kroken til å feste filamentet til basallegemet.

Rotasjonen av filamentet er ansvarlig for den flagella-befordrete bevegelsen. Hvert filament består av flere tusen kopier av flagellinunderenheten, hvilket fører til en heliks-struktur som typisk er 5-10^m i lengde (for de fleste E^. coli og Salmonella-arter; MacNab, P., 1987, i Eschericia coli and Salmonella typhimurium, Neidhardt, F.C., utg. American Society for Microbiology, Washington, DC. s. 70-83). Det er blitt observert at mutasjoner i flagellinstrukturgenet frembringer forandringer i effektiviteten av filamentdannelse, filamentform, følsomhet for flagellotropisk fag og/eller den antigene spesifisitet av flagellene (Yamaguchi, S. og Iino, T., 1969, J. Gen. Microbiol. 55:59-74; Iino, T., et al., 1974, J. Gen. Microbiol. 81:37-45; Horiguchi, T., et al., 1975, J. Gen. Microbiol. 91:139-149). Filamenter blir satt sammen ekstracellulært ved sekvensiell addisjon av flagellinmonomerer til den distale enden av det voksende filamentet, og forlengelseshastigheten avtar omvendt med lengden av filamentet inntil veksten stanser, slik at filament-lengden reguleres.

Flagellene finnes først og fremst, om ikke utelukkende, på overflaten av stavformete og spiralformete bakterier, omfattende medlemmer av slektene Escherichia, Salmonella, Proteus, Pseudomonas, Bacillus, Campylobacter, Vibrio, Treponema, Legionella, Clostridia, Caulobacter, og andre. Selv om de utfører den samme funksjonen er disse flagellene polymorfe i molekylvekt iiansett slekt, i området fra 28 til 66 kd. Det observeres en høy grad av antigenpolymorfisme selv innenfor en enkelt slekt, såsom Salmonella, og denne kan anvendes til å identifisere individuelle serotyper innenfor en enkelt art (Edwards, P.R. og Ewing, W.H., 1972, Identification of Enterobacteriaceae, 3. utg., Burgess Publishing Co., Minneapolis, MN). Strukturanalyse av flere bakterieflageller har åpenbart en felles arkitektur blant filamenter isolert fra forskjellige bakterier (Wei, L.N. og Joys, T.M., 1985, J. Mol. Bio. 186:791; DeLange, R.J., et al., 1976, J. Biol. Chem. 251:705: Gill, P.R. og Agabian, J. Biol. Chem. 258:7395). Mest slående er en høy grad av proteinsekvenshomologi ved amino-og karboksyendene av disse molekylene, og tilstede-værelse av en polymorf sentral region som er ansvarlig for det antigene mangfold blant forskjellige flageller.

Vertsimmunrespons på antigener på bakterieoverflaten er blitt vel dokumenter (Horowitz, S.A. et al., 1987, Infect.Immun. 55:1314; Naito, Y. et al., 1987, Infect. Immun. 55:832; Zhang, Y.X. et al., 1987, J. Immunol. 138:575; Nordgard, M.V., 1986, Infect. Immun. 54:500; Nagy, L.K., 1985, Vet. Ree. 117:408; Levine, M.M., et al., 1984, Infect. Immun. 44:409; Zak, K. et al., 1984, J. Infect. Dis. 149:166). Det er blitt vist at flageller, og spesielt flagellære filamenter, er potente immunogener under betingelser for naturlig infeksjon og kunstig immunisering, og i noen tilfeller er det blitt vist at responsen på antigene determinanter som er tilstede på flageller, må være beskyttende (Young, R.J. et al., 1979, Infect. Immun. 25:220; Eubanks, H.L., Jr., 1976, Infect. Immun. 15:533; Smith, H.L. Jr., 1974, App. Micro. 27:375; Dwyer, J.M. og Mackay, I.R., 1972, Int. Arch. AllergyAppl. Imm. 43:434; Ebersole, J.L. og Molinari, J.A., 1976, Infect. Immun. 13:53; Ebersole, J.L. et al., 1975, Infect. Immun. 12:353; Stevenson, J.R. og Stronger, K.A., 1980, Am. J. Vet. Res. 41:650; Tamura, Y. et al., 1984, Micro. Imm. 28:1325). Kuwajima (1988, J. Bact. 170:485) har beskrevet fremstilling av E_^coli-mutanter med forandret flagella antigenisitet ved innføring av delesjoner i den sentrale regionen av flagellinets hag-gen.

US-patent 4 702 911 beskriver anvendelse av rensete under-enheter av bakteriell pili, hårliknende organeller festet til den ytre bakterieoverflaten, i vaksinepreparater.

Internasjonal PCT-publikasjon nr. WO 87/02385, publisert

23. april 1987, beskriver ekspresjonen av en proinsulinsekvens og en betalaktamasesekvens som fusjonsproteiner med hag-genet i B. subtilis flagellin.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører rekombinante gener omfattende en nukleotidsekvens som koder for et flagellin fusjonsprotein. Slike proteiner omfatter en epitop innkodet av et funksjonelt flagellin strukturgen og minst én epitop av en heterolog organisme, hvilken epitop er immunogen ved innføring av fusjonsproteinet i en virveldyrvert. Disse epitopene blir gjenkjent av B-celle- og/eller T-celle-epitoper. Epitopen fra en heterolog organisme innsettes i en region som er ikke-essensiell for funksjonen av det kodete flagellinet og som ikke ødelegger dets funksjon, såsom den hypervariable regionen i flagellinstrukturgenet. I en spesielt foretrukket utførelse blir epitopen av en heterolog organisme innsatt mellom de naturlige EcoRV-setene og Salmonella Hl-d-genet. De rekombinante flagellinproteinene blir eksportert til celleoverflaten, hvor de samler seg i funksjonelle flageller som inneholder den heterologe epitopen. I andre utførelser kan de rekombinante flagellinfusjonsproteinene fremkalle en cellulær-, en mukosal- eller en humoral respons.

De rekombinante flagellingenene og proteinene kan formuleres for anvendelse som vaksiner for beskyttelse mot infeksjon av den heterologe organismen. De kan også gi beskyttelse mot tilstander eller forstyrrelser forårsaket av et antigen av den heterogene organismen. Ekspresjon som et rekombinant flagellinfusjonsprotein, ifølge den foreliggende oppfinnelse, tilveiebringer en fremgangsmåte for å presentere en hvilken som helst ønsket epitop i immunogen form, for å stimulere immunresponser innbefattende humorale, mukosale og/eller cellemediert immunresponser.. I en spesiell utførelse kan de rekombinante flagellingenene ifølge oppfinnelsen uttrykkes ved svekkete angrepsbakterier i levende orale vaksinepreparater.I en annen spesiell utførelse kan de rekombinante flagellinfusjonsproteinene formuleres for anvendelse i underenhet svaks iner.

I spesielle utførelser av oppfinnelse detaljert i eksempel-delen, blir epitoper av malarialcirkumsporozoittantigener, B-underenheten av koleratoksin, overflate- og preoverflateantigener av hepatitt B, VP7-polypeptid av rotavirus, innkapslingsglykoprotein av HIV, og M-protein av Streptococcus uttrykt på rekombinante flagellin fusjonsproteiner som samler seg i funksjonelle flageller, og som fremkaller immunresponsDrettet mot den heterologe epitopen i virveldyrverten.

Definisi oner

bp = basepar

CRM197 = molekyl av mutant difteritoksin

CS = cirkumsporozoitt

CT-B = underenhet av koleratoksin B

CTP3 = et peptid som representerer aminosyrerest nr.

50 til 64 i B-underenheten av koleratoksin

(Jacob, C.O., et al., 1984, Proe. Nati. Acad.

Sei. USA, 81:7893)

DPAPPNAN = peptidet

(asp-pro-ala-pro-pro-asn-ala-asn) som representerer den immunodominante konsensusrepeterende epitopen av Plasmodium berqhei

cirkumsporozoittprotein

DTT = ditiotreitol

ELISA = enzyme-linked immunosorben assay

HBsAg = overflateantigenet av hepatitt B

HIV = humant immunodeficienc-virus

kd = kilodalton

KLH = keyhole limpet hemocyanin

Mab = monoklonalt antistoff

NANP = peptidet (asn-ala-asn-pro) som representerer den immunodominante repiterende epitopen av

Plasmodium falciparum cirkumsporozoittprotein PAGE = polyakrylamidgelelektroforese

PBS = fosfatbuffret saltløsning

RSV = respiratorisk syncytialt virus

VP7 = et betydelig polypeptid av rotavirus i det ytre skall

Fig. 1. Skjematisk fremstilling av plasmidene pLS402, pPX1651 og pLS408, som koder for Hl-d flagellinstrukturgenet. Plasmidet pLS4 02 ble isolert fra et genombibliotek av Salmonella muenchen DNA konstruert i pBR322 (Wei, L.N. og Joys, T.M., 1985, J. Mol. Biol. 186:791) . Den kodende regionen for Hl-d flagellingenet (det mørke området) er tilstede i et 3,8 kb EcoRI-genomfragment, og inneholder to EcoRV-restriksjonssteder. Et ytterligere EcoRV-sted er tilstede på vektoren. De to subklonene, plasmidene pPX1651 og pLS408, ble konstruert ved først å sette inn genomfragmentet på 3,8 kb fra pLS4 02 i EcoRI-stedet i henholdsvis pUC18 og pUC19, hvilket førte til henholdsvis konstruksjonene pPX1650 og pLS405. EcoRV-fragmentet på 51 bp ble deretter deletert fra hvert av disse plasmidene, hvilket førte til plasmidene pPX1651 og pLS408, som begge nå hadde et unikt EcoRV-restriksionssted tilgjengelig for innsetting av oligonukleotider som spesifiserer en fremmed epitop.

Fig. 2A. Skjematisk fremstilling av Hl-d flagellinproteinet. Den hypervariable regionen IV er betegnet ved skraverincf. Posisjonene for EcoRV-restriksjonsstedene i den tilsvarende gensekvensen er vist. Fig. 2B. Nukleotid- og avledet aminosyresekvens for Hl-d flagellingenet (fra: Wei, L.N. og Joys, T.M., 1985, J. Mol. Biol. 186:791). EcoRV-restriksjonsstedene er understreket. Fig. 3A. Nukleotid- og utledet aminosyresekvens for syntetiske oligonukleotider som koder for tre fullstendige og to halve kopier av P^. falciparum circumsporozoitt immunodominant repiterende epitop (NANP). Fig. 3B. Nukleotid- og utledet aminosyresekvens for syntetiske oligonukleotider som koder for to kopier av P^.berqhei circumsporozoitt immunodominant konsensusrepeterende epitop

(DPAPPNAN) .

Fig. 4A. Skjematisk fremstilling av koleratoksin B under-enhetproteinet som illustrerer posisjonen for CTP3-epitopen. Fig. 4B. Nukleotid- og utledet aminosyresekvenser for syntetiske oligonukleotider som koder for CTP3-epitopen av koleratoksin B underenheten. Anilerte oligonukleotider ble behandlet med Klenow-enzym for å frembringe jevne haler før ligeringen til plasmidvektoren, som beskrevet i eksempel 1. Fig. 5. Skjematisk fremstilling av de rekombinante flagellinfusjonsproteinene, konstruert som beskrevet i eksempel 1. Skraverte områder fremstiller de heterologe sekvensene, fra CS-proteinene av P. f alciparum eller P^.berqhei, eller B-underenheten av koleratoksin (CT-B), som vist. Fig. 6. Western blot-analyse av rekombinante flagelliner uttrykt i svekket Salmonella. Celleekstrakter ble underkastet elektroforese og overført til nitrocellulosefiltre som beskrevet i eksempel 1. De antistoffprobene som ble anvendt til å påvise rekombinante flagellinmolekyler var: Del A: kanin anti-Hl-d antiserum; del B: anti-P^berghei circumsporozoitt Mab 3,28; del C: anti-P^. falciparum circumsporozoitt Mab 4D9; del D: kanin anti-koleratoksin aminosyrerestene 50-64 (CTP3-peptid) peptidserum. Plasmidkonstruksjoner og vertsstammer er angitt over hvert spor. Fig. 7. Påvisning av antistoff mot malaria circumsporozoitt (CS-epitop) i mus immunisert med rekombinante flagellinproteiner. Musene ble immunisert og boosted med delvis rensete Hl-d flageller av villtypen (innkodet av plasmidet pPX1650) eller rekombinante flageller inneholdende to kopier av £_;_ ber<g>hei CS immunodominant repetisjon (innkodet av plasmidet pPX1661). Seriefortynninger av sera oppnådd fra disse dyrene ved uke 0, 4 og 6 etter primær immunisering ble analysert med ELISA for binding til syntetiske peptider bestående av to kopier av P^. ber<g>hei CS-repetisjon koplet til keyhole limpet hemocyanin (KLH). De gitte data er gjennomsnittsverdier beregnet ut i fra fem enkeltdyr pr. gruppe, a: plasmid pPC1650 ved uke 0; b: plasmid pPX1650 ved uke 4; c: plasmid pPX1650 ved uke 6; d: plasmid pPX1661 ved uke 0; e: plasmid pPX1661 ved uke 4; f: plasmid pPX1661 ved uke 6. Fig. 8. Påvisning av antistoff mot malaria circumsporozoitt (CS) epitop hos mus immunisert med levende svekkete Salmonella som uttrykker rekombinante flagellin fusjonsproteiner. Musene ble immunisert og boosted som beskrevet i eksempel 1. Seriefortynninger av serum oppnådd fra disse dyrene ved uke 0, 4 og 6 etter primær-immunisering ble analysert ved ELISA for binding til syntetiske peptider bestående av to kopier av P. berghei CS-repetisjon koblet til KLH. De gitte data er gjennomsnittsverdier beregnet ut i fra fem enkeltdyr pr. gruppe, unntatt for gruppe 6, hvor bare ett dyr ble tilbake pr. gruppe, a: plasmid pPX1650 ved uke 0; b: plasmid pPX1650 ved uke 4; c: plasmid pPX1650 ved uke 6; d: plasmid pPX1662 ved uke 0; e: plasmid pPX1662 ved uke 4; f: plasmid pPX1662 ved uke 6. Fig. 9 viser et histogram av antistoffresponser hos 5 mus immunisert med SL5929, formalinavlivet, Salmonella dublin-vaksine som uttrykker CTP3-epitopen av koleratoksin B underenhet. Fig. 10 viser aminosyre- og syntetiske oligonukleotidsekvenser for HBsAg (ayw) S 122-137 og preS2120-145, og kart over flagellingenet. Det sorte området representerer den hypervariable regionen. H er Hindi 11; R er EcoRV; P er Pst I og K er Kp.nl. Fig. 11 viser karakteristika for klonete plasmid pLS405 rekombinanter. Fig. 12 viser antistoffresponser kos kaniner immunisert intramuskulært med levende S. dublin SL5928 transformert med S16 eller pS21. Fig. 13 viser antistoffresponser hos mus immunisert oralt med levende SL5928 som uttrykker en HBsAg-epitop. Alle "X" representerer titeren av antistoff fra en enkelt mus. Fig. 14 viser data som fås når SJL-mus ble primet med rekombinante flageller, villtype-flageller eller CRM197-protein, og lymfeknuteceller ble restimulert in vitro med renset syntetisk peptid som koder for aminosyrene 366-383 i CRM197-proteinet. Fig. 15 viser data som fås ved priming av lymfeknuteceller som i fig. 14 som ble stimulert med renset CRM197-protein.

Den foreliggende oppfinnelse vedrører rekombinante flagellin-strukturgener som er uttrykt som rekombinante flagellin fusjonsproteiner. Slike rekombinante gener omfatter en nukleotidsekvens som koder for et flagellinfusjonsprotein, hvilket protein omfatter en første epitop kodet for av et Salmonella- eller Shigella-flagellinstrukturgen og minst én epitop av en heterolog'organisme, hvor epitopen av den heterologe organismen ikke er innsatt i flagellinet i et område som er essensielt for funksjonen til det kodete flagellin, hvori flagellinfusjonsproteinet er istand til å settes sammen til en funksjonell flagell og flagellindelen av proteinet beholder sin antigenisitet. I en foretrukket utførelse kan epitopen av en heterolog organisme innsettes i den hypervariable region av flagellinstrukturgenet, f.eks. mellom de naturlige EcoRV-stedene i Salmonella Hl-d-genet.

I en annen foretrukket utførelse av oppfinnelsen karakteri-seres den heterologe epitopen av å være immunogen etter innføring av fusjonsproteinet i en virveldyrvert, hvori den immunogene epitop frembringer en immunreaksjon som er T-celle, B-celle eller cellulær av natur eller kombinasjoner derav.

Ekspresjon som et rekombinant flagellinfusjonsprotein, ifølge den foreliggende oppfinnelse, tilveiebringer en fremgangsmåte for å presentere en hvilken som helst ønsket epitop i immunogen form, for å stimulere immunrespons omfattende humoral, mukosal og/eller cellemediert immunrespons. I en spesiell utførelse kan de rekombinante flagellingenene ifølge oppfinnelsen uttrykkes av svekkete inntrengerbakterier i et levende vaksinepreparat. I en annen spesiell utførelse kan de rekombinante flagellinfusjonsproteinene formuleres for anvendelse i underenhetsvaksiner.

I spesielle utførelser ifølge oppfinnelsen detaljert i eksempelavsnittene nedenfor, blir epitoper av malaria circum-sporozoittantigener, B-underenheten av koleratoksin, overflate-

og preoverflateantigener av hepatitt B, VP7 polypeptidantigener av rotavirus, innkapslingsglykoprotein for HIV, og M-protein i Streptococcus<py>o<q>enes, uttrykt på rekombinante flagellin fusjonsproteiner, som samler seg i funksjonelle flageller, og som fremkaller immunrespons rettet mot den heterologe epitop i en virveldyrvert.

Fremgangsmåten for ekspresjon av rekombinant flagellin-fus j onsprotein ifølge oppfinnelsen kan deles i følgende generelle trinn: a) konstruksjon av et rekombinant gen som omfatter en nukleotidsekvens som koder for et Salmonella eller Shiqella flagellin fusjonsprotein omfattende en første epitop av et flagellin-strukturgen og minst én epitop av en heterolog organisme, hvor epitopen av den heterologe organismen ikke er innsatt i flagellinet i et område som er essensielt for funksjonen av det kodete flagellin, og hvor flagellindelen av proteinet beholder sin antigenisitet; b) innsetting av det rekombinante gen i en tilsvarende ekspresj onsvektor;

c) innsetting av vektoren i en tilsvarende vert; og

d) bakterieverten som inneholder vektoren får anledning til å reprodusere under betingelser som induserer ekspresjon av det

rekombinante gen.

Anti-soppvaksiner kan anvendes for å forhindre mykose, disse omfatter, men er ikke begrenset til soppene oppført i tabell I.

(Braude et al., (1986), Infectious Diseases and Medical Microbiology; Feigin et al., (1987), Textbook of pediatric Infectious Diseases 35; Mandell et al., (1985), Principles and Practice of Infectious Diseases, seksjon F). Andre anvendelser for vaksiner omfatter fremkalling av antihormonrespons for slike formål som forbedret kontrasepsjon, forbedret omdanning av næringsmidler og hormonubalanse. Ytterligere anvendelser omfatter anticancer-terapi og profylakse, antiallergiterapi og fremstilling av immun-profylaktiske og immunterapeutiske midler.

Isolasjon av flagellingenet

Hvilket som helst flagellin strukturgen kan anvendes for konstruksjon av et rekombinant gen som koder for et flagellin-fus jonsprotein som inneholder en heterolog epitop. Slikei flagellingener omfatter, men er ikke begrenset til Hl- og H2-genene i Salmonella, H i Bacillus subtilis og Pseudomonas aeruainosa.og hag i E^. coli.

Flere av flagellingenene er blitt klonet og sekvensert

(se f.eks. Kuwajima, G., et al., 1975, J. Bact. 168:1479; Wei, L.M. og Joys, T.M., 1985, J. Mol. Biol. 186:791-803; og Gill, P.R. ogAgabian N., 1983, J. Biol. Chem. 258:7395-7401; inkorporert heri ved referanse).

Dersom det klonete flagellingenet ikke er lett tilgjengelig, kan det klones ved standard fremgangsmåter kjent i teknologien (se f.eks. Maniatis, T. et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbor, NewYork), med en hvilken som helst flagellert bakteriecelle som potensielt tjener som nukleinsyrekilde for den molekylære kloningen. Slike bakterier omfatter, men er ikke begrenset til Escherichia, Salmonella, Proteus, Pseudomonas, Bacillus„ Campvlobacter, Vibrio, Treponema, Le<g>ionella, Clostridia og Caulobacter.

Nukleotidsekvensanalyse av det klonete genet kan utføres ved forskjellige fremgangsmåter kjent i teknologien, f.eks. fremgangsmåten ifølge Maxam og Gilberg (1980, Meth. Enzymol. 65:499-560), dideoksymetoden til Sanger (Sanger, F. et al., 1977, Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 74:5463), eller anvendelse av en automatisert DNA-sekvensator (f.eks. Applied Biosystems, Foster City, CA).

Isolasjon av sekvenser som koder for immunogene epitoper for ekspresjon som rekombinante flagelliner

En hvilken som helst DNA-sekvens som koder for en epitop av en heterolog organisme, som når den uttrykkes som et flagellin-fus j onsprotein frembringer beskyttende immunitet mot en slik organisme eller mot en tilstand eller forstyrrelse forårsaket av et antigen, kan isoleres for anvendelse i vaksinepreparater. I en foretrukket utførelse er en slik organisme en patogen mikroorganisme. F.eks. kan en slik heterolog epitop finnes på bakterier, parasitter, virus eller sopp som er de kausative virkemidler for sykdommer eller forstyrrelser. I tillegg kan anvendes epitoper av allergener og cancerceller. Slike bakterier, parasitter, virus eller sopp omfatter, men er ikke begrenset til de som er oppført i tabell I.

I en annen utførelse kan en epitop av et antigen av en nematode uttrykkes som fusjonsprotein for å beskytte mot forstyrrelser forårsaket av slike ormer.

Potensielt anvendbare antigener for vaksinepreparater kan identifiseres ved forskjellige kriterier, såsom antigenets med-virkning til nøytralisering av et patogens infektivitet (Norrby, E. , 1985, Summary, i Vaccines 85, Lerner, R.A., R.M. Chanock og

F. Brown (utg.), Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, s. 388-389), type- eller gruppespesifisitet, gjenkjenning av pasientens antisera eller immunceller, og/eller demonstrasjon av beskyttende virkning av antisera eller immunceller som er spesifikke for antigenet. Dessuten bør antigenets innkodete epitop fortrinnsvis ha liten eller ingen grad av antigenvariasjon i tid eller blant forskjellige isolater av det samme patogen.

I en foretrukket utførelse koder den heterologe sekvensen for en immunpotent dominantepitop av et patogen. Molekyler som er haptener (dvs. antigene, men ikke immunogene) kan dessuten også uttrykkes som rekombinant flagellin, siden flagellinet kan fungere som bæremolekyl ved overføring av immunogenisitet til haptenet. Rekombinante flagelliner som inneholder epitoper som er reaktive med antistoff selv om de ikke er istand til å frembringe immunrespons, har likevel potensiell anvendelse ved immunanalyse.

Peptider eller proteiner som er kjent for å inneholde anti-gendeterminanter kan innføres i rekombinante flagelliner. Dersom spesielle antigener er ukjent, bør det utføres identifikasjon og karakterisering av immunreaktive sekvenser. En måte å oppnå dette på er ved anvendelse av monoklonale antistoffer som dannes på overflaten eller andre molekyler av et patogen. De peptidsekvensene som er istand til å bli gjenkjent av antistoffene defineres som epitoper. Alternativt kan små syntetiske peptider konjugert med bæremolekyler bli testet for dannelse av monoklonale antistoffer som binder seg til de stedene som svarer til peptidet på det intakte molekylet (se f.eks. Wilson, I.A. et al., 1984, Cell 37:767). Andre fremgangsmåter som er kjent i teknologien og som kan anvendes for identifikasjon og karakterisering av antigen-determinanter, er også innenfor rammen av denne oppfinnelse.

I en spesiell utførelse kan en hvilken som helst DNA-sekvens som koder for en Plasmodium-epitop som når den uttrykkes som et flagellin fusjonsprotein, er immunogen i en virveldyrvert, isoleres for anvendelse ifølge den foreliggende oppfinnelse. De arter avPlasmodium som kan tjene som DNA-kilde, omfatter, men er ikke begrenset til de humane malariaparasittene P_j_ f alciparum.

P. malaria, P. ovale, P^. vivax, og de animalske malariaparasittene P. ber<g>hei, P. yoelli, P. knowlesi og P_j.cvnomolcri. Antigenene eller fragmentene derav som kan uttrykkes som flagellinfusjonsproteiner, er antigener som blir uttrykt ved malariaparasitten på hvilket som helst av de forskjellige trinn i dens livssyklus, såsom sporozoitt-, exoerytrocytt- (utvikling i parenkymale leverceller), det aseksuelle, erytrocytt-, eller seksuelle (f.eks. gameter, zygoter, ookineter) trinnet. I en spesiell utførelse er den heterologe epitop som skal uttrykkes en epitop av circumsporozoitt (CS)-proteinet av en Plasmodium-art (se eksempel 1). Analoge CS-proteiner er blitt identifisert på overflaten av sporozoitter av alle testete arter av Plasmodium. Circumsporozoittproteinantigener uttrykt i svekkete Salmonella spp. kan anvendes som levende vaksiner rettet mot sporozoitter, den angripende form av malaria-parasitter som overføres av hunnmyggen av Anopheles. En hvilken som helst epitop av en region av CS-proteinet som er viktig ved induksjon av beskyttende humoral eller cellebefordret immunrespons, kan anvendes i vaksinepreparatene ifølge den foreliggende oppfinnelse. (Se f.eks. Dame, J.B., et al., 1984, Science 225:593; Arnot, D.D., et al., 1985, Science 230:815; Weber et al., 1987, Exp. Parasitol. 63:295; Enea, V., et al., 1984, Science 225:628; Enea, V., et al., 1984, Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 81:7520; Godson, G.N. et al., 1983, Nature 305:29; og McCutchan, T.F.,

et al., 1985, Science 230:1381, hvilke referanser er inkorporert

ved referanse heri). I en utførelse kan f.eks. peptidet asn-ala-asn-pro, som representerer den P_j_ falciparum CS-immunodominante repeterende epitopen, uttrykkes ved de rekombinante bakteriene ifølge oppfinnelsen. I en annen utførelse kan man uttrykke peptidet asp-pro-ala-pro-pro-asn-ala-asn, som representerer den immun-domonant repeterende epitopen av ber<g>hei CS-proteinet.

I en annen spesiell utførelse kan man uttrykke Th2R-epitopen (Good, M.F., et al., 1987, Science 235:1059) av P^falciparum CS-proteinet som et rekombinant flagellinprotein i vaksinepreparatene ifølge den foreliggende oppfinnelse.

I ytterligere en annen utførelse omfatter den heterologe epitopen som skal uttrykkes som et rekombinant flagellinfusjonsprotein, et peptid av B-underenheten av koleratoksin. Egnete peptider er beskrevet av Jacob et al. Som beskrevet av Jacob et al.

(1983, Proe. Nati. Acad. Sei. USA 80:7611) har man syntetisert peptider tilsvarende flere regioner av B-underenheten av koleratoksin, og koblet dem til en immunogen bærer i en anstrengelse for å definere epitoper som induserer nøytraliserende antistoffer. Når disse konjugatene ble anvendt til produsere antistoffer i kaniner, ble det vist at ett av disse som koder for aminosyrene 50-64 (peptidet CTP3), induserer antistoffer som gjenkjente det naturlige toksin og nøytraliserte de biokjemiske (adenylatcyklaseaktivering) og biologiske (fluidsekresjon i innvollene) virkningene av det intakte holotoksin (Jacob CO. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 81:7893) .

Andre epitoper som kan uttrykkes som flagellinfusjonsproteiner omfatter, men er ikke begrenset til følgende: epitoper av G-proteinet av respiratorisk syncytialvirus (RSV) (Collins et al., 1984, Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 81:7683); nøytraliserende epitoper på poliovirus I VP1 (Emini, E., et al., 1983, Nature 304:699); nøytraliserende epitoper på innkapslingsglykoproteiner i HIV I (Putney, S.D., et al., 1986, Science 234:1392-1395); epitoper som er tilstede på hepatitt B-overflateantigen (Itoh, Y., et al., 1986, Nature 3 08:19; Neurath, A.R., et al., 1986, Vaccine 4:34); epitoper av difteritoksin (Audibert, F., et al., 1981, Nature 289:543); streptococcus 24M epitop (Beachey, E.H., 1985, Adv. Exp. Med. Biol. 185:193); og epitoper på gonokokksalpilin (Rothbard, J.B. og Schoolnik, G.K. , 1985, Adv. Exp. Med. Biol. 185:247).

Flagellinfusjonsproteinene i vaksinepreparater kan også omfatte en epitop av en heterolog organisme som, når fusjonsproteinet introduseres i en virveldyrvert, induserer en immunrespons som beskytter mot en tilstand eller forstyrrelse forårsaket av et antigen som inneholder epitopen. I en slik utførelse kan anvendes f.eks. flagellinfusjonsproteiner som koder for en epitop av slangegift, biegift, et hormon, spermier (for befruktnings-hindring), et allergiinduserende antigen eller et hvilket som helst annet antigen på hvilket det ønskes en immunrespons. I en spesiell utførelse kan det uttrykkes en epitop av et antigen av fettcelle-membraner som et rekombinant flagellinprotein for formulering av en vaksine for å redusere fettinnholdet hos dyr som anvendes som matvarekilde. I en annen utførelse kan det uttrykkes et tumor-spesifikt antigen som et rekombinant flagellinfusjonsprotein for induksjon av en beskyttende immunrespons-mot cancer. I ytterligere en annen utførelse kan det også uttrykkes en epitop av et bakterieenterotoksin som et flagellinfusjonsprotein. Nukleotidet og de avledete aminosyresekvensene for flere bakterieenterotoksiner er blitt bestemt (Mekalanos, J.J. et al., 1983 Nature 306:551; Leong, J. et al., 1985, Infect. Immun. 48:73).

I en annen utførelse ifølge oppfinnelsen kan det innføres DNA-sekvenser som koder for store regioner av proteiner som inneholder flere B-celleepitoper (dvs. epitoper som er istand til å indusere en humoral immunrespons) og T-celleepitoper (dvs. epitoper som er istand til å indusere en cellemediert immunrespons) i flagellingenet for ekspresjon som flagellinfusjonsproteiner.

Ved å tilveiebringe naturlige T-hjelpecelleepitoper samt antistoff-induserende epitoper, kan man således prime mottakerne for boosting ved kontakt med en patogen heterolog organisme.

Gensekvensene som koder for den heterologe epitopen som skal uttrykkes som rekombinant flagellin ifølge den foreliggende oppfinnelse, kan isoleres ved teknikker som er kjent i teknologien, omfattende, men ikke begrenset til rensing av mikroorganismen for genomisk DNA, ved cDNA-syntese av mikroorganismen fra RNA, ved rekombinant DNA-metoder (Maniatis, T. et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York), eller ved kjemisk syntese.

Konstruksjon av rekombinante flagellingener

Ved konstruksjon av et rekombinant flagellingen ifølge den foreliggende oppfinnelse får sekvenser av et flagellingen innsatt sekvenser i seg eller blir erstattet med sekvens(er) som koder for én eller flere epitoper av en heterolog organisme.

Først bør man identifisere domenene i det flagellingenet som det ønskes å få innsatt sekvenser i eller som blir erstattet med de heterologe sekvensene. De flagellinsekvensene som er nødvendige og tilstrekkelige for transport av flagellinproteinet til den distale enden av flagellen (eller av kroken for initiering av et nytt flagellært filament) er de som ønskes bevart. Denne bevaringen fører til et rekombinant flagellinmolekyl som beholder evnen til å uttrykkes på cellens overflate, som flagellært filament, og befordrer således isolering og rensing av disse rekombinante molekylene for anvendelse som komponenter i en underenhetsvaksine, eller befordrer deres presentasjon for immunsystemet i en utførelse med levende vaksine.

Strukturanalyse av flere bakterieflageller har åpenbart en felles arkitektur blant filamenter isolert fra forskjellige bakterier (Wei, L.N. og Joys, T.M., 1985, J. Mol. Biol. 186:791-803; DeLange, R.J., et al., 1976, J. Biol. Chem. 251:705; Gill, P.R. og Agabian, N., 1983, J. Biol. Chem. 258:7395). Mest slående er en høy grad av proteinsekvenshomologi i amino- og karboksy-termini på disse filamentene (som antyder at disse regionene er nødvendige for strukturell integritet og/eller funksjon) og tilstedeværelse av en polymorf sentral region som er ansvarlig for den antigene mangfoldighet blant forskjellige flageller (id.; se også Iino T., 1977, Ann. Rev. Genet. 11:161-182 og referanser i denne). Strukturelle begrensninger på denne hypervariable sentrale regionen er ubetydelig, da det er blitt identifisert isolater som atskiller seg både i antallet aminosyrerester såvel som primær-sekvens.

I en foretrukket utførelse blir en DNA-sekvens som koder for en heterolog epitop, innsatt i, eller erstatter, den sentrale hypervariable regionen i flagellinmonomeren. Denne utførelse tillater konstruksjon av rekombinante flagellinmonomerer som kan beholde evnen til å danne intakte flageller. Evnen til å samle seg til flageller ville, når det gjelder et levende vaksinepreparat, resultere i fremstilling av en høy konsentrasjon av den heterologe epitopen, som finnes på hver flagellinmonomer, for in vivo-vertens immunsystem. Fremstilling som en organisert polymer struktur ville gi en mye sterkere antigenstimulus enn det samme materialet som monomer. Ved ekspresjon av en bakterie ville tilstedeværelse av flageller på den ytre bakterieoverflaten også tillate en mer effektiv fremstilling av den heterologe epitopen. Dessuten ville en sammenstilling til intakte flageller lette rensingen av de rekombinante flagellinmolekylene, siden forskjellige fremgangsmåter for slik rensing er kjent i teknologien og kunne anvendes. I en mest foretrukket utførelse frembringer de rekombinante flagellinmolekylene uttrykt ved en ikke-motil moderstamme av bakterier funksjonelle flageller som gir bevegelige bakterier som således mer effektivt kan presentere den heterologe epitopen for vertens immunsystem, enn en ikke-motil stamme, i kraft av den fremmede epitopens tilstedeværelse på bakterienes ytre overflate, og muligens den

relativt større angrepsevne som skyldes deres bevegelighet.

Som beskrevet i eksempelavsnittene nedenfor har vi vært istand til å innføre DNA som koder for epitoper av heterologe organismer i den sentrale hypervariable regionen av flagellingenet av Salmonella muenchen uten alvorlig å påvirke flagellær eksternalisering og sammenstilling.

Mange strategier som er kjent i teknologien kan anvendes ved konstruksjon av det rekombinante flagellingenet. F.eks. kan de relevante sekvensene av flagellingenet og av det heterologe genet spaltes ved teknikker som er kjent i teknologien, på egnete steder med restriksjonsendonuklease(r), isoleres og ligeres. Dersom kohesive termini blir dannet ved restriksjonsendonukleasespalting, behøves kanskje ingen ytterligere modifikasjon av DNA før ligeringen. Dersom imidlertid kohesive termini i DNA ikke er tilgjengelige for dannelse ved restriksjonsendonukleasespalting, eller andre steder forskjellige fra de som er tilgjengelige blir foretrukket, kan en hvilken som helst av forskjellige teknikker som er kjent i teknologien, anvendes til å gjennomføre ligering av den heterologe DNA på de ønskete stedene. F.eks. kan spalting med et restriksjonsenzym etterfølges av modifisering for å danne butte ender ved å spalte tilbake eller fylle inn enkelttrådete DNA-termini før ligering. Alternativt kan de spaltete endene av flagellingenet eller den heterologe DNA "tygges tilbake" ved anvendelse av en nuklease såsom en nuklease Bal 31, eksonuklease III, lambda eksonuklease, mung bean nuklease eller T4 DNA polymerase eksonukleaseaktivitet for å nevnte bare noen få, for å fjerne deler av sekvensen. En oligonukleotidsekvens (en linker) som koder for ett eller flere restriksjonssteder, kan innsettes i en region av flagellingenet ved ligering til DNA-termini. Den påfølgende ligering av en heterolog gensekvens i klonings-restriksjonsstedet, slik at begge sekvensene er i den riktige translasjonsleserammen uavbrutt av translasjonsstoppesignaler, vil resultere i en konstruksjon som styrer fremstillingen av et flagellinfusjonsprotein. En linker kan også anvendes til å generere egnete restriksjonssteder i den heterologe gensekvensen. Dessuten kan flagellin eller heterologe gensekvenser muteres in vitro eller in vivo for å danne nye endonukleaserestriksjonssteder eller ødelegge allerede eksisterende slike, for å lette in vitro ligeringsprosedyrene. En hvilken som helst teknikk for mutagenese som er kjent i teknologien kan anvendes, innbefattet, men ikke begrenset til in vitro seterettet mutagenese (Hutchinson, C, et al., 1978, J. Biol. Chem. 253:6551), anvendelse av TAB™ linkere (Pharmacia) etc.

Den spesielle strategi for konstruksjon av genfusjoner vil avhenge av den spesielle flagellinsekvensen som skal erstattes eller foretas innskudd i, såvel som det heterologe genet som skal innsettes.

Det rekombinante flagellingenet bør konstrueres i eller overføres til en vektor som er istand til replikering og ekspresjon i en bakterievert. I en foretrukket utførelse kan det rekombinante flagellingenet også innsettes i bakteriens kromosom-DNA. En måte hvorpå dette kan gjennomføres er ved rekombinasjonsutveksling med et plasmidbåret rekombinant flagellingen. I en alternativ utførelse kan det rekombinante flagellingenet innsettes i en kloningsvektor som kan foreligge episomalt, f.eks. et plasmid eller en bakteriofag, som deretter blir anvendt til å transformere eller infektere egnete bakterieceller hos verten, hvor den rekombinante DNA blir replikert og uttrykt.

Transformeringen av bakterieverter med DNA-molekyler som inkorporerer det rekombinante flagellingenet muliggjør dannelse av multippelkopier av flagellinsekvensen. Mange forskjellige vektor-systemer kan anvendes for ekspresjon i bakterieverten, omfattende, men ikke begrenset til plasmider såsom pUC-plasmider og derivater, pBR322-plasmider og derivater, bakteriofager såsom lambda og dens derivat, og kosmider. I en spesiell utførelse vil plasmidklonings-vektorer som kan anvendes, omfatte derivater av replikoner av typen ColEl (for ytterligere informasjon se Oka et al., 1979, Mol. Gen. Genet. 172:151-159). ColEl-plasmidene beholdes stabilt i E^coli og Salmonella typhimurium-stammer som monomere molekyler med et kopiantall på ca. 15-20 kopier pr. celle.

Forskjellige regulerende ekspresjonselementer kan anvendes, som er et hvilket som helst av flere egnete transkripsjons- og translasjonselementer som er aktive i bakterier. Promotorer som kan anvendes for å styre ekspresjonen av den rekombinante flagellinsekvensen, omfatter f.eks., men er ikke begrenset til laktose-operon-promotoren i E^. coli, hybrid trp-lac UV-5-promotoren (tac)

(DeBoer, H., et al., 1982, i Promoter Structure and Function, Rodriguez, R.L og Champerlain, M.J., utg., Praeger Publishing, New York), de venstredreide (PL) og høyredreide (PR) promotorene for bakteriofag lambda, bakteriofag T7-promotoren, trp-operon-promotoren, lpp-promotoren, E. coli lipoproteingenpromotoren; Nakamura, K. og Inouye, I., 1979, Cell 18:1109-1117), osv. Andre promotorer fremstilt ved rekombinant DNA eller synteseteknikker kan også anvendes til å sørge for transkripsjon av de innsatte sekvensene. Alternativt kan den naturlige flagellinpromotoren anvendes.

Spesielle initieringssignaler er også nødvendig for effektiv translasjon av innsatte proteinkodende sekvenser. Disse signaler omfatter ATG initieringskodonet og nabosekvenser. I tilfeller hvor de naturlige flagellingensekvensene som koder for sitt eget initieringskodon og nabosekvenser blir innsatt i de egnete ekspre-sjonsvektorene, kan det være at intet ytterligere translasjons-kontrollsignal er nødvendig. I tilfeller hvor de naturlige flagellintranslasjonssignalene ikke er tilstede, må det imidlertid fremskaffes eksogene translasjonskontrollsignaler, omfattende ATG initieringskodonet. Initieringskodonet må dessuten være i fase med leserammen for de proteinkodende sekvensene for å sikre translasjon av hele innskuddet. Disse eksogene translasjonskontrollsignalene og initieringskodonene kan være av mange forskjellige opprinnelser, både naturlige og syntetiske.

Fremgangsmåter for konstruksjon av de egnete ekspresjons-vektorene kan omfatte in vitro rekombinant DNA og syntetiske teknikker og in vivo rekombinanter (genetisk rekombinasjon).

For oversikter angående maksimering av genekspresjon, se Roberts og Lauer, 1979, Meth. Enzymol. 68:473; og Reznikoff, W. og Gold, M., 1986, Maximizing Gene Expression, Plenum Press, New York.

US-patent 4 237 224 til Cohen og Boyer beskriver fremstilling av rekombinante plasmider ved anvendelse av spaltningsfremgangs-måter med restriksjonsenzymer og sammenbinding med DNA-ligase ved kjente ligeringsmetoder. Disse rekombinante plasmidene blir deretter innført ved hjelp av transformering eller elektroporasjon, og replikert i éncellete kulturer omfattende prokaryote organismer og eukaryot celler dyrket i vevskultur.

En annen fremgangsmåte for innføring av rekombinante DNA-molekyler i éncellete organismer er beskrevet av Collins og Hohn i US-patent 4 304 863. Denne fremgangsmåten anvender et embal-lerings/transduksjonssystem med bakteriofag vektorer (kosmider).

Ekspresjon i bakterieverter

Ekspresjonsvektoren omfattende den rekombinante flagellinsekvensen bør deretter overføres til en bakterievertcelle hvor den kan replikere og bli uttrykt. Dette kan gjennomføres ved hvilken som helst av flere metoder som er kjent i teknologien, omfattende, men ikke begrenset til, transformering (f.eks av isolert plasmid-DNA til den svekkete bakterieverten), fagtransduksjon (Schmeiger, 1972, Mol. Gen. Genetics 119:75), konjugert mellom arten av bakterievert, elektroporasjon etc.

I en spesiell utførelse kan hvilke som helst svekkete bakterieverter som uttrykker det rekombinante flagellinet, formuleres som levende vaksiner. Slike bakterier omfatter, men er ikke begrenset til svekkete angrepsstammer og svekkete arter av Campylobacter, Shi<q>ella eller Escherichia.

Ekspresjon i svekkete angrepsbakterier

I en foretrukket utførelse ifølge den foreliggende oppfinnelse blir ekspresjonsvektoren omfattende den rekombinante flagellinsekvensen overført til en svekket angrepsbakterie, hvor den blir uttrykt og således frembringer en bakteriestamme som egner seg for anvendelse som levende vaksine.

Hvilken som helst av forskjellige svekkete angrepsbakterier kan anvendes som bærer for å uttrykke det rekombinante flagellinet slik at dets heterologe epitop blir fremstilt effektivt for vertens immunsystem, i vaksinepreparatene. Vaksinebakteriene beholder sine angrepsegenskaper, men mister i betydelig grad sine virulens-egenskaper, hvilket tillater dem å formere seg i verten i begrenset utstrekning, men ikke tilstrekkelig til å forårsake signifikant sykdom eller forstyrrelser. Eksempler på angrepsbakterier som i svekket form kan anvendes i vaksinepreparatene omfatter, men er ikke begrenset til Salmonella spp., angripende L. coli (EIEC), og Shiqella spp. I en foretrukket utførelse anvendes angrepsbakterier som finnes i lymfoidvev, såsom milten (f.eks. Salmonella spp). Slike bakterier kan invadere epitelvev i tarmene og/eller Peyers lapper, spre seg gjennom det retikuloendoteliale system, og få adgang til mesenterisk lymfoidvev, leveren, og milten, hvor de formerer seg eller i det minste overlever for en tid, og induserer humoral og cellemediert immunitet.

Svekkete angrepsbakterier kan oppnås ved flere fremgangsmåter, omfattende men ikke begrenset til kjemisk mutagenese, genetisk insersjon, delesjon (Miller, J., 1972, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) eller rekombinasjon ved anvendelse av rekombinant DNA-metodologi (Maniatis, T. et al., 1982, Molecular Cloning,

A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York), laboratorieseleksjon av naturlige mutasjoner, osv. Fremgangsmåter for å oppnå svekkete Salmonella-stammer som er ikke-reverterende ikke-virulente auxotrofe mutanter som egner seg for anvendelse som levende vaksiner, er beskrevet i US-patentene 4 735 801, utstedt 5. april 1988 og parallell US-patentsøknad serie nr. 798 052 inngitt 14, november 1985, av Stocker, som er inkorporert ved referanse heri i sin helhet. En pålitelig metode til å oppnå svekking av Salmonella er beskrevet (Hoiseth, S.K., og Stocker, B.A.D., 1981, Nature 291:238; Stocker, B.A.D., et al., 1982, Develop. Biol. Standard 53:47; og US-patent 4550 081) og kan anvendes i en spesiell utførelse ifølge oppfinnelsen.

Svekkete Salmonella som kan anvendes i de levende vaksinepreparater, omfatter men er ikke begrenset til de artene som er oppført i tabell II.

I spesielle utførelser kan det anvendes Salmonella-bakterier som er blitt svekket ved kromosomal delesjon av gen(er) for bio-syntese av aromatisk forbindelse ( aro) eller mutasjon i<g>alE-genet, eller som er cya"'crp~vir plasmid, osv. Aro-mutanter som kan anvendes omfatter, men er ikke begrenset til S_^_ typhi - stammene 543Ty og 541Ty, for anvendelse i vaksiner for mennesker, og S. tv<p>himurium SL3261 og SL1479, og S^_ enteriditis serotype dublin SL1438 (også kalt S^dublin) for anvendelse på dyr (se US-patent 4 550 081 for beskrivelse av S^tvphimurium- st ammen SL1479 og S. dublin-stammen SL1438). S^. typhi-stammer, såsom 543Ty og 541Ty er avirulente i mennesker på grunn av svekkelse ved delesjon som påvirker genene aroA og/eller<p>urA (Levine, M.M., et al., 1987,

J. Clin. Invest. 79:888). Mutanter av S^ dublin, såsom SL1438, og av typhimurium, såsom SL3261, kan anvendes ved utvikling av dyremodellsystemer, siden disse artene er istand til å forårsake dyresykdommer tilsvarende tyfoidfeber. gallE-mutanter som kan anvendes omfatter, men er ikke begrenset til Salmonella t<y>phi-stammene Ty21a (Germanier, 1984, Bacteria Vaccines, Academic Press, NY s. 137-165) Salmonella typhimurium G30D, osv.

I en foretrukket utførelse kan en plasmid ekspresjonsvektor som inneholder et rekombinant flagellingen, isoleres og karak-teriseres i E^. coli, før overføring til en svekket Salmonella-stamme, f.eks. ved fagtransduksjon (Schmeiger, 1972, Mol. Gen. Genetics. 119:75), på grunn av de høye transformasjonsfrekvensene for EL. coli K12 i forhold til transformasjonsfrekvensene for Salmonella, såsom S_;_ typhimurium.

Bestemmelse av immunpotens for den eller de heterologe epitopen(e) uttrykt som rekombinant flagellin

Immunpotensen for den heterologe epitopen uttrykt som rekombinant flagellin i levende vaksinepreparat, kan bestemmes ved overvåking av immunresponsen hos forsøksdyr etter immunisering med bakterier som uttrykker det rekombinante flagellinet. I et under-enhetsvaksinepreparat kan forsøksdyrenes immunrespons overvåkes, etter immunisering med det isolerte rekombinante flagellinmolekylet, som flagellære filamenter eller monomer, som kan formuleres med et egnet hjelpemiddel for å øke immunologisk respons. Egnete hjelpemidler omfatter, men er ikke begrenset til, mineralgeler, f.eks. aluminiumhydroksyd, overflateaktive stoffer såsom lysolecitin, pluroniske polyoler, polyanioner, peptider, oljeemulsjoner og potensielt anvendbare humane hjelpemidler, såsom BCG (Bacille Calmette-Guerin) og Corynebacterium parvum. Forsøksdyr kan omfatte mus, marsvin, kaniner, kyllinger, sjimpanser og andre primater, og eventuelt menneskelige individer. Metoder for inn-føring av immunogenet kan omfatte orale, intradermale, intramuskulære, intraperitoneale, intravenøse, subkutane, intranasale eller andre standardmåter for immunisering.

Immunresponsen for forsøksindividene kan analyseres ved forskjellige metoder såsom: (a) reaktiviteten for det resulterende immunserum på det naturlige antigen eller et fragment derav som inneholder den heterologe epitopen, eller på den isolerte naturlig forekommende heterologe organismen, analysert ved kjente teknikker, f.eks. enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), immunoblot, radioimmunoutfellinger osv, (b) reaktiviteten av lymfocytter isolert fra det immuniserte individ på det naturlige antigen eller fragment derav, eller den heterologe organismen, undersøkt ved kjente teknikker, f.eks. blastogenresponsanalyser, cytotoksisitets-analyser, hypersensitivitet av forsinket type osv., (c) evnen hos immunserum til å nøytralisere infektiviteten av organismen in vitro eller den biologiske aktiviteten av det naturlige antigen, og (d) beskyttelse mot sykdom og/eller demping av infeksjonsymptomer hos immuniserte dyr.

Formulering av vaksine

De rekombinante flagellinene som omfatter en epitop av en heterolog organisme kan formuleres for vaksineanvendeIse. Slike vaksinepreparater kan omfatte levende vaksiner eller underenhets-vaksinepreparater. Vaksinepreparatene blir anvendt på både dyr og mennesker.

Levende bakterie som vaksiner

Formålet med denne utførelse er å formulere en vaksine, hvori immunogenet er en svekket angrepsbakteriestamme som uttrykker et rekombinant flagellin omfattende en epitop av en heterolog organisme for å fremkalle en immun (humoral og/eller cellemediert) respons på den heterologe epitopen som vil beskytte mot infeksjoner av organismen eller tilstander eller forstyrrelser forårsaket av et antigen av organismen. Bakteriene i vaksinen omfatter stammer som er sykdomsfremkallende for verten som skal vaksineres. I en foretrukket utførelse er slike stammer svekkete angrepsbakterier såsom Salmonella-arter. Andre egnete arter kan omfatte, men er ikke begrenset til, Shicrella og JL. coli. I en mest foretrukket utførelse blir de rekombinante flagellingenene uttrykt av vertsbakteriene som flagellinmonomerer som samler seg til funksjonelle flageller, og tillater den heterologe epitopen på de rekombinante molekylene å bli fremstilt i stort antall kopier for vertens immunsystem.

Det levende vaksinepreparatet kan være énverdig eller fler-verdig. Flerverdige vaksiner kan fremstilles ut i fra en enkelt eller få rekombinante bakterier som uttrykker én eller flere heterologe epitoper, som kan være av forskjellige organismer. En enkelt bakterie kan uttrykke flere enn én epitop av det samme eller forskjellige antigener. De forskjellige epitopene kan uttrykkes i det samme rekombinante flagellinproteinet, på separate rekombinante flagellinmolekyler innkodet av de samme eller forskjellige ekspresjonsvektorer, eller i forskjellige bakterier.

Mange fremgangsmåter kan anvendes for innføring av levende vaksinepreparater, disse omfatter, men er ikke begrenset til orale, intradermale, intramuskulære, intraperitoneale, intravenøse, subkutane, transkutane og intranasale måter, omfattende den naturlige måten med infeksjon av den ville typen av moderbakteriestammen. I en utførelse, hvori et oralt vaksinepreparat er for dyrebruk, kan vaksinering av husdyr gjennomføres ved å anvende det levende vaksinepreparat som tilsetning til for eller i drikkevann.

I spesielle utførelser kan svekket Salmonella som uttrykker et rekombinant flagellin omfattende epitoper av et malariacircum-sporozoittprotein, B-underenheten av koleratoksin, overflate- og preoverflateantigener av hepatitt B, VP7 polypeptid av rotavirus, omhyllingsglykoprotein i HIV, og M-protein av Streptococcus formuleres som vaksiner.

En foretrukket utførelse er anvendelse av et avirulent ikke-patogent oralt vektoravgivelsessystem for Salmonella. Anvendelse av dette systemet kan ikke bare utelukke noen av de potensielle side-virkningene som henger sammen med anvendelsen av andre avgivelses-bærere såsom vacciniavirus og adenovirus, men kan også sørge for passende oral administrasjon av vaksiner. Dessuten kan det ventes at oral vaksinering vil indusere mykosal såvel som systemisk immunrespons, og derved øke vaksinens immunogene potensial.

Underenhetsvaksiner

Det heterologe peptidet uttrykt som et rekombinant flagellin fusjonsprotein, kan anvendes som immunogen i underenhetsvaksine-preparater, som kan være flerverdige. Det flerverdige vaksinepreparatet kan omfatte rekombinante flageller eller en rekombinant flagellinmonomer inneholdende mer enn én heterolog epitop, hvilken epitop kan være av forskjellige organismer, eller flere flagellinmolekyler som alle koder for en forskjellig heterolog epitop, osv.

Det rekombinante flagellingenproduktet kan være renset for det formål å fremstille vaksinepreparat fra et hvilket som helst vektor/vertssystem som uttrykker det heterologe proteinet, slik som transduserte eller transformerte bakterier. F.eks. blir flagellære bakteriefilamenter lett fjernet fra den intakte bakterien ved mekaniske midler som ikke på annen måte ødelegger cellen, og således tillater dem å bli lett renset uten innføring av kraftige denatureringsmidler. Standard fremgangsmåter kjent i teknologien kan anvendes for rensing av rekombinant flagellin, enten som monomerer eller som (sammensatte) flageller (se f.eks. Gill, P.R., og Ababian, N. , 1983, J. Biol. Chem. 258:7395-7401; Weissborn, A., et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:2066-2074; Gill, P.R. og Agabian, N., 1982, J. Bacteriol. 150:925-933; Lagenaur, C, og Agabian, N., 1976, J. Bacteriol. 128:435-444; Fukuda, A., et al., 1978, FEBS Lett. 95:70-75; Stevenson, J.R., og Stonger, K.A., 1980, Am. J. Vet. Res. 41 (4) :650-653) .

Dessuten kan isolert flage11aprøver solubiliseres (f.eks. ved dissosiasjon ved eksponering enten til pH 3 eller til pH 11 ved lav ionestyrke; DeLange, R.J., et al., 1976, J. Biol. Chem. 251(3):705-711) til flagellinunderenheter og deretter reassosieres til flageller ved kjente prosedyrer (f.eks. Weissborn, A., et al., 1982, J. Biol. Chem. 257:2066-2074) for å: (a) assistere ved rensing av de rekombinante flagellinene ved å fjerne uønskete forurensninger; og/eller (b) fremstille et immunogen for flerverdige vaksinepreparater ved assosiasjon av rekombinante flagellinmonomerer som koder for forskjellige heterologe epitoper.

Det eller de rensete protein(ene) bør justeres til egnet konsentrasjon, formuleres med eventuelle egnete vaksinehjelpemidler og emballeres for anvendelse. Egnete hjelpemidler omfatter, men er ikke begrenset til: mineralgeler, f.eks. aluminiumhydroksyd; overflateaktive stoffer som lysolecitin, pluroniske polyoler; polyanioner; peptider; oljeemulsjoner; og potensielt anvendbare humane hjelpemidler såsom BCG (Bacille Calmette-Guerin) og Cornebacterium parvum. Immunogenet kan også innføres i liposomer eller konjugeres med polysakkarider og/eller andre polymerer for anvendelse i vaksinepreparater.

I tilfeller hvor det rekombinante flagellingenproduktet er et hapten, dvs. et molekyl som er antigent ved at det kan reagere selektivt med beslektete antistoffer, men ikke immunogent ved at det ikke kan fremkalle immunrespons, kan haptenet være kovalent bundet til en bærer eller et immunogent molekyl; f.eks. vil et stort protein såsom serumalbumin gi immunogenisitet til det haptenet som er koblet til det. Haptenbæreren kan formuleres for anvendelse som vaksine.

Mange fremgangsmåter kan anvendes for innføring av vaksinepreparatene beskrevet ovenfor; disse omfatter, men er ikke begrenset til, orale, intradermale, intramuskulære, intraperitoneale, intravenøse, subkutane og intranasale måter.

Anvendelser av antistoffer rettet mot rekombinant flagellin

Antistoffene dannet mot heterologe organismer ved immunisering med det rekombinante flagellinet har også potensielle anvendelser ved diagnostiske immunundersøkelser, passiv immunterapi og dannelse av anti-idiotypiske antistoffer.

De dannete antistoffer kan isoleres ved standard teknikker kjent i teknologien (f.eks. immunaffinitetskromatografi, sentrifugering, utfelling osv.) og anvendt i diagnostiske immun-undersøkelser for å påvise tilstedeværelsen av virus, bakterier eller parasitter av medisinsk eller veterinærmedisinsk viktighet i humant eller dyrevev, blod, serum osv. Antistoffene kan også anvendes til å overvåke behandling og/eller sykdomsforløp. Et hvilket som helst immunundersøkelsessystem som er kjent i teknologien, såsom dem som er oppført heri, kan anvendes for dette formålet, omfattende, men ikke begrenset til konkurrerende og ikke-konkurrerende analysesystemer som anvender teknikker såsom radio-immunanalyser, ELISA (enzyme linked immunosorbent assays),"sandwich"-immunanalyser, presipitinreaksjoner, geldiffusjonspresipitinreaksjoner, immundiffusjonsanalyser, agglutineringsanalyser, komplementfikseringsanalyser, immunradiometriske analyser, fluorescensimmunanalyser, protein A-immunanalyser og immunelektroforeseanalyser, for å nevne bare noen få.

Vaksinepreparatene kan også anvendes til fremstilling av antistoffer for anvendelse i passiv immunterapi, hvor kortsiktig beskyttelse av en vert oppnås ved administrasjon av forutdannet antistoff rettet mot en heterolog organisme.

Antistoffene som dannes av vaksinepreparatene ifølge den foreliggende oppfinnelse kan også anvendes ved fremstilling av anti-idiotypisk antistoff. Det anti-idiotypiske antistoff kan deretter i sin tur anvendes til immunisering for å fremstille en subpopulasjon av antistoffer som binder det opprinnelige antigenet fra den patogene mikroorganismen (Jerne, N.K., 1974, Ann. Immunol.

(Paris) 125c:373; Jerne, N.K., et al., 1982, EMBO 1:234).

Immunanalyser

De rekombinante flagellingenproduktene, eller fragmenter derav, som uttrykker én eller flere fremmede epitoper, kan anvendes som antigener ved immunanalyse for påvisning av antistoffer for epitopen(e). Det heterologe proteinet, eller fragmenter derav, kan også anvendes for påvisning av den samme eller beslektete epitop(er) ved konkurransemålinger. De rekombinante flagellin-produktene, eller den eller de fremmede epitopen(e) som uttrykkes av dem, kan anvendes i et hvilket som helst immunundersøkelses-system som er kjent på dette området, omfattende, men ikke begrenset til, konkurrerende og ikke-konkurrerende analysesystemer som anvender teknikker såsom radioimmunanalyse, ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), "sandwich"-immunanalyse, presipitinreaksjoner, geldiffusjonspresipitinreaksjoner, immundiffusjonsanalyser, agglutineringsanalyser, komplementfikseringsanalyser, immunradiometriske analyser, fluorescensimmunanalyser, protein A-immunanalyser og immunelektroforeseanalyser, for å nevne bare noen få.

Eksempel 1

Konstruksjon av flagellin minus vaksinestammer

De to levende-vaksinestammene som anvendes som verter for flagellin-spesifiserende plasmider er SL5927 og SL5928. Begge disse ble oppnådd fra en aromatisk-avhengig S_i_ dublin moderstamme som var villtype i forhold til flagellæregenskaper, dvs. bevegelig og med enkelt-flagellingenet, Hl-g,p, som bestemmer fase-1 flagellær-antigenet, g,p, karakteristisk for monofasearten S^. dublin.

SL5927 ble oppnådd fra SL1437, en aromatisk-avhengig-levende vaksinestamme hvis konstruksjon er beskrevet i US-patenter 4735801 og 4550081, hvis beskrivelser er inkorporert heri ved referanse.

SL5928 ble oppnådd fra en annen aromatisk-avhengig-levende vaksinestamme av dublin SL5631, hvis konstruksjon er beskrevet nedenfor.

Hver bevegelig stamme ble anvendt som mottaker i transduksjonen, med SL566 9, som er en S_;_ tvphimurium-stamme, med transposon TnlO innsatt i gen Hl-i, for dets fase-1 flagellær antigen, i. Seleksjon ble gjort for kloner som var resistente mot tetracyklin, på grunn av utbytting av gen Hl-g,p hos mottakeren med gen Hl-i::TnlO fra donoren. En tetracyklin-bestandig klon, funnet ikke-bevegelig (på grunn av erstatning av villtype flagellingenet med genet inaktivert av transposonet) og fri for fagen P22 HT105/1 anvendt for å gjennomføre transduksjonen ble beholdt, SL5927 fra krysningen med SL1438 som mottaker og SL5928 fra krysningen med SL5631 som mottaker.

LS5631 er et stabilt aromatisk-avhengig derivat av en virulent S_;_ dublin-stamme, SVA47. Det ble oppnådd ved to trinn transduksjon, ved fremgangsmåten anvendt for å konstruere aroA (delesjon) stammer av S_;_ typhi (Edwards, M.F., 1985, Ph.D. Thesis, Standford University, California).

Ekspresjon av heterologe epitoper som rekombinante flaggelin fusj onsproteiner

Konstruksjon og ekspresjon av rekombinante flagellingener som koder for fremmede epitoper som er viktige ved induksjon og ekspresjon av beskyttende immunresponser er beskrevet. De heterologe parasittiske- og bakterielle epitopene som ble uttrykt som rekombinant flagellin, var av malaria CS-proteinet, og av B-underenheten av koleratoksin. De rekombinante flagellinmolekylene ble innført i og uttrykt av svekkete Salmonella-stammer, som kan anvendes i levende vaksinepreparater.

Materialer og metoder

Plasmider og bakteriestammer

De anvendte bakteriestammene var Salmone11a-stammene SL143 8 (ATCC adgangsnr. 39184) og SL5927 (ATCC adgangsnr. 67944), og E. coli-stammen CL447. Plasmidet pLS402 inneholder et 3,8 kb EcoRI-fragment av genomisk DNA som koder for det fullstendige Hl-d flagellin-strukturgenet fra S^. muenchen innsatt i EcoRI-setet i plasmidet pBR322 (Wei, L.N. og Joys, T.M., 1985, J. Mol. Biol. 186:791) . Plasmid pUC18, pUC19 og E^ coli-stammen JM103 ble levert fra Bethesda Research Laboratories (BRL; Bethesda, MD).

Betingelser for restriksjonsenzymspalting

Restriksjonsendonukleasene BamHI, Clal, EcoRI og EcoRV ble innkjøpt fra Bethesda Research Laboratories (BRL, Bethesda, MD). Spaltingen ble utført ved oppslemming av DNA i den passende restriksjonsbufferen, tilseting av 2-3 enheter enzym pr. mikrogram DNA, og inkubering ved 37°C over natten.

Den anvendte restriksjonsbuffer for BamHI-spaltin<g>ene besto av 10 mmM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2, og 100 mM NaCl.

Den anvendte restriksjonsbuffer for EcoRI og Clal-spaltin<g>ene besto av 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2og 50 mM NaCl.

Den anvendte restriksjonsbuffer for EcoRV-spaltingene besto av 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl2og 150 mM NaCl.

Dannelse av jevne ender i DNA-fragmentene

For å danne butte ender for ligering ble DNA-termini med 5'-overheng utfylt ved virkningen av det store fragmentet av DNA-polymerase I (Klenow-fragment). For utfylling med Klenow-fragment ble 1-25 fig DNA behandlet med 1 enhet/jxg DNA av Klenow-enzym (BRL) i et 50/il reaksjonsvolum i buffer som inneholdt 66 mM Tris-HCl, pH 7,5, 6,6 mM MgCl2, 1 mM ditriotreitol (DDT) og 20 nM av alle fire deoksynukleotidtrifosfåtene (dATP, dCTP, dGTP og TTP) i 30 minutter ved romtemperatur.

Gelrensing av DNA-fragmenter

Etter restriksjonsenzymspaltingene ble DNA-fragmenter av varierende størrelse separert ved polyakrylamidgelelektroforese ved anvendelse av TBE-buffer (0,089 M Tris, 0,089 M borsyre, 0,002 EDTA, pH 7,5) ved 15 volt/cm. Akrylamidgeler ble støpt ved fortynning av en stokkløsning av akrylamid:bisakrylamid (40:1,1) til enten 6% eller 8% med TBE-buffer avhengig av størrelsen av DNA-fragmentet som skulle isoleres. Etter vertikal elektroforese ble båndene visualisert med etidiumbromidfluorescens, og det riktige båndet ble skåret ut og plassert i dialyseslange som inneholdt en 1:10-fortynning av TBE-buffer. Denne ble plassert i et kammer som inneholdt den samme bufferen og elektroeluert ved 100 milliamp. i 2 timer. Det elektroeluerte DNA-fragmentet ble gjenvunnet ved å fjerne væskeinnholdet fra posen og utfelling av DNA med to volumer kald etanol i nærvær av 3 00 mM natriumacetat.

Syntese og rensing av oligonukleotider

Oligonukleotider ble syntetisert i 0,2/xm skala på en DNA syntesizer modell 380B fra Applied Biosystems Inc. ved anvendelse av beta-cyanoetylfosforamiditt-kjemi (Sinha, N.D., et al., 1984, Nucl. Acids. REs. 12:4539-4544).

Oligonukleotider ble renset ved elektroforese i en 0,4 mm tykk 8% polyakrylamidgel i TBE-buffer (0,01 M Tris-borat, pH 8,2, 1 mM EDTA), kjørt ved ca. 1600 volt med en konstant effekt på 75W. Båndene av oligonukleotid ble visualisert ved negativ skyggelegging over en PEI (polyetylenimin) tynnsjiktkromatografiplate under ultrafiolett lys, og båndet med produktet ble skåret ut i sin fulle lengde fra gelen. Det syntetiske oligonukleotidet ble eluert i 0,3

M natriumacetat pH 5,5 og ble utfelt ved tilsetning av to volumer 100% etanol, avkjølt til -20°C, og sentrifugert ved 14 000 g. Pelletene ble tørket under vakuum og løst i TE-buffer (10 mM Tris-HCl , pH 7,4, 1 mM EDTA).

Fosfatgrupper ble innført ved 5'-terminus på de syntetiske oligonukleotidene ved anvendelse av T4 polynukleotidkinase (New England Biolabs, Beverly, MA). Ett mikrogram mengder av renset oligonukleotid ble løst i 25 /il kinasebuffer bestående av 70 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl2, 5 mM DTT, med 1 mM adenosin-trifosfat (ATP). Denne løsningen ble inkubert med 20 enheter T4 polynukleotidkinase i 3 0 minutter ved 37°C.

Anilering av komplementære tråder ble oppnådd ved blanding av de kinaserte trådene og oppvarming til 60°C i 1 time og avkjøling til romtemperatur.

DNA-ligering

Alle ligeringer ble gjennomført ved anvendelse av T4 DNA ligase innkjøpt fra BRL (Bethesda, MD). Vektor-DNA og det korrekt behandlete isolerte restriksjonsfragmentet, eller syntetiske oligonukleotider, ble slemmet opp igjen i 30/il ligasebuffer (66 mM Tris-HCl, pH 7,5, 6,6 mM MgCl2, 10 mM DTT og 1 mM ATP), og 2 Weiss- enheter T4 DNA ligaseenzym ble tilsatt. Ligeringsreaksjonen fikk foregå i 18-24 timer ved 4°C. Normalt ble 50-100 ng av vektor DNA ligert til ca. et 10 gangers molart overskudd av innsatt DNA.

Transformering av plasmid DNA

Plasmidkonstruksjoner som skriver seg fra ligering av syntetiske oligonukleotider i plasmidene pPX1651 eller pLS408 ble innsatt i vanlige laboratoriestammer av Escherichia coli ved transformeringsteknikk (for detaljer se Maniatis et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York). Plasmidkonstruksjoner ble isolert ogkarakterisertførst i EL. coli, før overføring til Salmonella spp. på grunn av de høye transformeringsfrekvensene for E. coli K-12 i forhold til frekvensene for SL. typhimurium. Plasmider ble overført i S_;_ typhimurium LT-2 LB5010, en stamme som er restriksjonsnegativ (men modifikasjonseffektiv) for de tre restriksjonssystemene i Salmonella typhimurium, og også inneholde en mutasjon i galE som fører til høyere transformeringsfrekvenser (for en beskrivelse av restriksjonssystemene i Salmonella typhimurium, se Bullas et al., 1980, J. Bacteriol. 141:275).

Plasmider ble deretter innsatt i svekkete Salmonella ved transduksjonsteknikker. LB5010 inneholdende det ønskete plasmid ble dyrket i Luria-substrat (LB) til en tetthet på 3 x IO<8>celler/ml, på hvilket punkt D-galaktose (til en sluttkonsentrasjon på 1%) ble tilsatt til dyrkningsmediet for å indusere syntese av "glatt" lipopolysakkarid (LPS). Etter 1,5 timers vekst i nærvær av D-galaktose, ble bakteriofagen P22 HT 105/1 int tilsatt til kulturen til en flerhet av infeksjon av én. Etter adsorpsjon av fagen, ble cellene immobilisert i LB inneholdende 0,7% agar. Fag ble høstet og anvendt til å transdusere plasmider i eventuelle svekkete Salmonella som inneholdt LPS egnet som reseptor for den transduserende fagen P22.

Restriksjonsenzymanalyse av DNA

Rekombinant plasmid DNA ble analysert ved spalting av DNA med egnete restriksjonsendonukleaser, og elektroforese gjennom 1% agarosegel kjørt i TBE-buffer inneholdende 5/xg/ml etidiumbromid. Båndene ble påvist ved etidiumbromidfluorescens.

Polyakrylamidgelelektroforese

For å analyse rekombinante flagellinproteiner ved natriumdodecylsulfat (SDS)-polyakrylamidgelelektroforese (PAGE), ble sentrifugert 500 pil av en overnatten-kultur av bakterier som inneholdt et rekombinant plasmid, og pelleten ble slemmet opp igjen i 200/il av proteinkjøreblanding (0,125 M Tris-HCl, pH 6,8, 2,5% SDS, 5% 2-merkaptoetanol, 10% glycerol, 0,005% bromfenolblått) og oppvarmet til 100°C i 10 minutter. 20 iil av hver prøve ble underkastet elektroforese under betingelser beskrevet av Laemmli (Laemmli, U.K., 1979, Nature 227:680) gjennom en stablegel med 4% akrylamid og en separasjonsgel med 10% akrylamid.

Western blot-analyse

Etter SDS-PAGE av proteinprøvene ble elektroforiserte proteiner overført til nitrocellulosefolier (Schleicher og Schuell, Keene, NH) ved fremgangsmåten til Towbin et al., (Towbin, H., et al., 1979, Proe. Nati. Acad. Sei. USA. 76:4350). Etter overføringen ble filtrene blokkert ved inkubering i fosfatbuffret saltløsning (PBS) med 0,5% Tween 20 i 15 minutter ved romtemperatur. Primære antistoffer ble fortynnet til en passende konsentrasjon i PBS med 0,1% Twenn 20 (PBS Tween) og tilsatt til filterne. Inkuberingene var ved romtemperatur i en periode på minst 1 time og så lenge som over natten. Filterne ble deretter vasket i flere bytter (changes) av PBS-Tween, og pepperrot peroksydasekonjugert SL. aureus protein A (Kirkegaard og Perry, MD) , ved en konsentrasjon på 1/xg/ml ble tilsatt, etterfulgt av inkubering i 1 time ved romtemperatur. Filterne ble deretter vasket flere ganger i PBS Tween, og signalet ble fremkalt med PBS inneholdende 0,01% hydrogenperoksyd, 0,06% 4-klor-l-naftol (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) ved romtempratur inntil et egnet signal ble påvist. Denne reaksjonen ble stoppet ved å vaske filteret flere ganger med destillert vann.

Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for anticircumsporozoitt proteinantistoffer fra serum

For å måle serumantistoffer ble 96 brønners polystyrenplater (NUNC) belagt med 5 ug/ ml av DPAPPNANDPAPPNAN (KLH), et syntetisk peptid som representerer to repeterende enheter av Plasmodium ber<g>hei CS-protein koblet til KLH ved glutaraldehyd-tverrbinding. Hver brønn fikk 0,1 ml antigen i 0,1 M karbonat/hydrogenkarbonat-buffer (pH 9,6). Platene ble inkubert ved 37°C i fuktig inkubator i 18 timer, før de ble vasket 3 ganger med PBS inneholdende 0,05% Tween 20 (PBS-T) og blokkert med 0,1% gelatin i PBS i 60 minutter ved romtemperatur. Platene ble vasket 3 ganger med PBS-T, og seriefortynninger for sera ble tilsatt og inkubert i 90 minutter ved romtemperatur. Anti-P^.berghei CS Mab 3,28 ble anvendt som positiv kontroll ved analysene. Platene ble vasket som tidligere, og for-optimaliserte konsentrasjoner av alkalisk fosfatasekonjugert geit anti-mus immunoglobulin (ved en serumfortynning på 1:5000) ble tilsatt til passende brønner og inkubert i 60 minutter ved romtemperatur. Platene ble vasket igjen, og 100/il substratløsning (p-nitrofenylfosfat ved 1 mg/ml i dietanolaminbuffer, pH 9,6) ble tilsatt til hver brønn. Signalene ble fremkalt i 60 minutter ved romtemperatur og lest i en Bio-Tek automatisk ELISA-leser ved anvendelse av dobbelte bølgelengder ved 410 nm og 690 nm, med blindprøve på luft.

Delvis rensing av rekombinant flagella

Over natten-kulturer av S_;_ dublin SL1438 som inneholdt rekombinante plasmider ble anvendt til å inokulere 150 mm petri-skåler inneholdende 1,5% (w/v) Difco agar i LB-medium supplementert med 100/ig/ml ampicillin, og platene ble inkubert i 48 timer ved 37°C. Disse platene ble deretter oversvømmet med avionisert vann, og bakteriene ble forsiktig fjernet fra overflaten ved skraping. Denne suspensjonen ble blandet ved høy hastighet i en vanlig kjøkkenmaskin, og bakterieavfall ble fjernet ved sentrifugering ved 10.00 opm i en Sorvall SS34-rotor i 30 minutter. Flagella tilstede i supernatanten ble konsentrert ved ultrasentrifugering ved 50.000 opm i en Beckmann 70 lTi-rotor i en time. Disse preparatene av flagella ble anslått til å være ca. 90% rene ved Coomassie-blått proteinfarging av SDS-PAGE-gelene, og proteinkonsentrasjonene ble anslått ved sammenlikning med kjente mengder av standardproteiner kjørt på de samme gelene.

Immunisering av forsøksdyr

Hunnmus C57BL/6, ca. 6 uker gamle (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME) ble immunisert subkutant med ca. 25/ig av delvis rensete preparater for flagella emulgert i fullstendig Freunds adjuvans. Fire uker senere ble musene boosted subkutant med 25/xg av det samme preparatet av flagella emulgert i ufullstendig Freunds adjuvant. Alle dyrene ble avblødd fra halevenen før primær-immuniseringen, rett før boostingen, og 2 uker etter boostingen.

For immunisering med levende, svekkete Salmonella, ble dyrket kulturer av dublin SL1438 som hadde rekombinante plasmider, i LB-medium supplementert med 100 xxg/ml ampicillin til midt-log-fasen, høstet ved sentrifugering, vasket med PBS, og slemmet opp igjen til en konsentrasjon på 1 x IO<8>celler pr. ml. 0,1 ml av denne suspensjonen ble administrert intraperitonealt til 6 uker gamle C57BL/6 mus (Jackson Laboratories, Bar Harbor, ME). Fire uker senere ble dyrene boosted med 1 x IO<8>celler fremstilt og administrert på samme måten. Dyrene ble avblødd som beskrevet ovenfor.

Bestemmelse av bakteriemotilitet

S. dublin SL5927 er en ikke-flagellat (og således ikke-bevegelig) bakteriestamme på grunn av transduksjonsutveksling av dets eneste flagellingen med Hl-i::TnlO. Konstruksjonen av SL5927 er beskrevet ovenfor i avsnittet med tittelen "Konstruksjon av flagellin minus vaksinestammer".

Over natten-kulturer av S_s_ dublin SL5927 som inneholdt rekombinante plasmider ble anvendt til inokulering av plater av motilitetsagar (LB pluss 100/xg/ml ampicillin med 0,3% w/v Difco agar) ved hjelp av en inokuleringsnål. Platene ble inkubert over natten ved romtemperatur og i 6 timer ved 37°C. Diameteren av sonen med bakteriespredning ble deretter målt, som indikator for bakteriemotilitet.

RESULTATER

Konstruksjon av rekombinante flagellingener

Plasmid pLS4 02 inneholder et 3,8 kb EcoRI-fragment av genomisk DNA som innbefatter det fullstendige Hl-d (Hl antigen d) flagellin strukturgenet (Wei, L.N. og Joys, T.M., 1985,, J. Mol. Biol. 186:791-803) (fig. 2A, 2B) fra S. muenchen (American Type Culture Collection aksesjonsnr. 8388) innsatt i EcoRI-setet i plasmid pBR322 (fig. 1; Wei, L.N. og Joys, T.M, 1985, J. Mol. Biol. 186:791). Undersøkelsen av den publiserte basesekvensen i de kodende regionen for dette genet (fig. 2B) åpenbarte to EcoRV-restriksjonssteder atskilt med 48 bp i posisjonene 619 og 667. Ved sammenlikning med sekvenser avledet fra andre Hl-gener ble det vist at regionen i genet som inneholder disse to restriksjonsstedene er høyst variabel i både primær aminosyresekvens og i antallet rester. Vi sluttet derfor at denne regionen i genet kan være unnværlig for sammenstilling og funksjon av flagella, og ville derfor være en egnet lokalisering for innsetting av DNA som koder for fremmede epitoper. For å anvende denne strategi var det nødvendig å subklone Hl-d-genet på et plasmid bærer som ikke hadde noen EcoRV-restriksjonsseter. Derfor ble det 3,8 kb EcoRI-fra<g>mentet av pLS402 isolert og subklonet i EcoRI-stedet for pUC18 og pUC19, hvilket førte til konstruksjon av henholdsvis plasmidene pPX1650 og pLS4 05. Disse sistnevnte vektorene kunne så anvendes til utveksling av det autentiske Hl-d-DNA mellom nukleotidnummerne 619 og 667 (fig. 2B) med syntetisk eller klonet DNA som koder for en fremmed epitop. For ytterligere å gjøre det lettere å screene rekombinante plasmider ble 48 bp-fragmentet mellom EcoRV-stedene i hvert plasmid deletert ved spalting av pPX1650 og pPLS 405 med EcoRV og religering av hvert av de spaltete plasmidene. Transformantene ble deretter screenet for tapet av 48 bp-fragmentet; pPX1651 og pLS408 ble således oppnådd (fig. 1). Disse plasmidene beholdt bare et enkelt EcoRV-sete for innsetting av fremmede epitoper. I tillegg var det umulig å atskille, etter størrelse, en vektor med et innskudd av et 4 8 bp-stykke av fremmed DNA fra en vektor som ganske enkelt hadde religert med seg selv.

For å teste evnen hos fremmede epitoper til å bli uttrykt som genetiske fusjoner med flagellin, ble laget flere genetiske konstruksjoner, som beskrevet nedenfor.

Konstruksjon av et rekombinant flagellingen som koder for en epitop av en malariaparasitt som flagellin fusjonsprotein.

Rekombinante flagellingener ble konstruert som kodet for epitoper av malariaparasitt (slekten Plasmodium) circumsporozoitt-proteiner som flagellin fusjonsproteiner.

Til å begynne med ble to komplementære 4 8 resters oligonukleotider syntetisert, som koder for fire kopier av den P. falciparum circumsporozoittprotein fire-aminosyrerepeterende sekvensen (fig. 3A). Sekvensene i disse nukleinsyrefragmentene ble slik at når de ble anilert, ble det dannet komplementært 3 base-overheng som tillot oligonukleotidene å ligere med seg selv utelukkende på en hode til hale-måte, og således sikre innsetting av flere oligonukleotider, alle med samme orientering. Etter at fragmentene var anilert, ble de buttendet ved behandling med stort fragment av DNA-polymerase (Klenow-enzym) og ligert med pPX1651 som tidligere var blitt spaltet med EcoRV. Etter transformering av E. coli-stammen JM103, ble ampicillin-resistente kolonier screenet for tilstedeværelse av rekombinante plasmider ved restriksjonssted-analyse av plasmid DNA. To rekombinanter ble identifisert, pPX1653 inneholder en enkelt kopi av det innsatte oligonukleotidet, og pPX1652 inneholder tre innsatte oligonukleotider. Ved DNA-sekvensanalyse ble de tre oligonukleotidfragmentene som er tilstede i pPX1652, som ble ifyllt ved behandling med Klenow-fragmentet av DNA-polymerase I før ligering med pPX1651, innsatt med den samme orientering. Denne fremgangsmåten førte til innsetting av en ytterligere asparaginrest mellom de 16 aminosyreblokkene som oligonukleotidet koder for. Western blotting av celle-ekstrakter ved anvendelse av monoklonale antistoffer som er spesifikke for den P. falciparum-repeterende regionen, viste at disse klonene uttrykte immunreaktive proteiner med passende molekylvekt for rekombinant flagellin.

En liknende strategi ble anvendt for å danne rekombinante flagellinmolekyler som uttrykker den repeterte åtte aminosyresekvensen i E\_ ber<g>hei CS-proteinet (fig. 3B). I dette sett med eksperimenter ble oligonukleotider ligert sammen før behandling med Klenow-enzym for å sikre innsetting av tilstøtende olicfo-nukleotider, alle med samme orientering og uten intervenerende DNA-sekvenser. Det ble oppnådd kloner som inneholder 1, 2 eller 3 kopier av det spesielle oligonukleotidet, og de fikk navnene henholdvsis pPX1661, pPX1662 og pPX1663. Bakterier som har disse klonene ble funnet å uttrykke immunreaktive proteiner med egnet molekylvekt, når de ble screenet ved Western-analyse ved anvendelse av et EL. berghei CS-spesifikt monoklonalt antistoff.

Konstruksjon av et rekombinant flagellingen som koder for en epitop av koleratoksin B underenhet som flaggelin fusjonsprotein

En liknende strategi ble anvendt for ekspresjon, som flagellinfusjonsprotein, av en epitop av et eksotoksin av den patogene bakterien Vibrio cholerae. For konstruksjon av denne rekombinant ble syntetisert komplementære oligonukleotider (fig. 4B) som koder for epitopen representert ved CTP3-peptidet (fig. 4A) i koleral toksin B underenheten (Jacob, C.O., et al., 1983, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 80:7611). Den aminosyresekvens som de syntetiske oligonukleotidene koder for, var som følger:

og representerer restnummerne 50-64 (fig. 4B) i B-underenheten.

De komplementære oligonukleotidene ble anilert og buttendet ved behandling med Klenow-enzym. Disse fragmentene ble deretter innsatt i EcoRV-stedet i pLS408 og transformert til EL. coli CL477. Et plasmid som inneholder et enkelt innskudd ble identifisert ved restriksjonsanalyse og ble kalt pLS411. pLS411 ble bekreftet ved DNA-sekvensering av innskuddet og ved Western blot-analyse til å inneholde innskuddet i den ønskete orientering, siden det uttrykte et molekyl med den passende molekylvekt, som ble gjenkjent av både anti-Hl-d antiserum og monoklonale- og kanin polyklonale antisera fremstilt til CPT3-peptidet.

Ekspresjon av rekombinante flagellin fusjonsproteiner

For å uttrykke disse rekombinante flagellinmolekylene i en svekket bakteriestamme for anvendelse som levende vaksiner, ble alle konstruksjonene beskrevet ovenfor (fig. 5) innført i svekkete stammer av £L_ dublin (SL1438 og SL5927) ved fagtransduksjon (Schmeiger, 1972, Mol. Gen. Genetics 119:75). Fremgangsmåten anvendt til å svekke disse stammene er beskrevet av Stocker og medarbeidere (Hoiseth, S.K. og Stocker, B.A.D., 1981, Nature 291:238; Stocker, B.A.D., et al., 1982, Dev. Biol. Std. 53:47; US-patent nr. 4 550 081). Spesielt ble det innført delesjoner i genet aroA, som førte til pleiotropisk behov for fenylalanin, tryptofan, tyrosin, folinsyreforløperen p-aminobenzosyre og enterokelin-forløperen, dihydroksybenzosyre. p-aminobenzosyre er fraværende fra dyrevev, og medlemmer av Enterobacteriaceae er ikke istand til å assimilere folinsyre fra dyrevev, hvilket fører til deres svekkelse i en dyrisk eller human vert. Western blot-analyse ble gjennomført på ekstrakter fra hver av disse stammene, og syntesen av rekombinante flagelliner ble demonstrert ved anvendelse av begge antistoffene rettet mot flagellinepitoper (fig. 6) som viste at disse stammene kunne være verdifulle som levende vaksiner til å indusere immunrespons mot de fremmede epitopene innsatt i flagellinmolekylene.

Immungullmerking av rekombinant flagellin

Eksponering av den fremmede epitopen på overflaten av flagella ble påvist ved gullimmunmerking av flagellene av formalin-fikserte bakterier, med MAb TE33 som det første antistoffet. Stammen SL5676 som har enten plasmidet pLS411 som har det fullstendige CTP3-innskuddet eller plasmidet pLS408, med in vitro-delesjonen, men ikke innskuddet, ble merket ved behandling med MAb TE33 og gullkonjugert geite-antistoff mot mus IgG (Janssen) for elektronmikroskopisk visualisering (30.000 ganger). Visualiseringen av merkingen viste at CTP3-epitopen var tilstede på bakterienes overflate.

Rekombinante flagellin fusjonsproteiner er istand til å samle seg til funksjonelle flagella

Evnen hos de rekombinante flagellinproteinene til å polymeri-sere seg til intakte flageller og til derfor å være tilstede på den ytre overflaten av bakteriene, ble demonstrert ved deres gjenvin-ning av motiliteten i en normalt ikke-motil (fordi den er flagellin negativ) vert (tabell III).

SL5927 er et ikke-motilt derivat av SL1438 konstruert ved å avbryte kromosomkopien av strukturgenet som koder for Hl-antigenet (flagellin) ved innsetting av et transponerbart element (TnlO); denne stammen, i likhet med andre S_;_ dublin, har intet H2 allel. SL5927 er konstruert som beskrevet ovenfor i avsnittet med tittelen "Konstruksjon av flagellin minus vaksinestammer". Innføring av hvilket som helst av de rekombinante flagellinplasmidene gjenopp-retter i det minste delvis motilitet for denne stammen (tabell III), hvilket viser at disse rekombinante flagellinene kan polyme-risere til funksjonelle flageller, og at de fremmede epitopene derfor er tilstede på cellens ytre overflate.

Immunogenisitet av de heterologe epitopene på rekombinante flagellinfusjonsproteiner

For å demonstrere evnen hos rekombinante flagelliner til å avgi fremmede epitoper til vertens immunsystem, ble C57BL/6 mus immunisert med delvis rensete flageller isolert fra SL. dublin SL143 8 som i hvert flagellinmolekyl uttrykker to kopier av den P. berghei CS-immundominante repetisjon (innkodet av plasmidet pPX1661) eller villtype Hl-d-flagella (innkodet av plasmidet pPX1650) . Musene ble injisert subkutant med ca. 25 fig flagellinprotein emulgert i fullstendig Freunds adjuvans ved uke 0, og boosted med 25 fj. g av det samme preparatet subkutant i ufullstendig Freunds adjuvans 4 uker senere. Dyrene ble avblødd før den første og den andre immuniseringen og igjen to uker etter boosteren. Sera ble analysert med ELISA for antistoffer spesifikke for syntetiske peptider som koder for to kopier av P_^_ ber<g>hei CS-repetisjonen (DPAPPNAN). Anti-EL. ber<g>hei antistoffer (fig. 7) var såvidt over bakgrunnen 4 uker etter den primære immuniseringen, og nivået økte dramatisk etter booster-immuniseringen, mens nivået av disse antistoffene i dyr immunisert med kontroll villtype flagella (kodet for av plasmidet pPX1650) ikke var signifikant forskjellige fra på forhånd avblødde verdier (fig. 7, uke 0).

Immunisering av C57BL/6 mus med levende S_;_ dublin SL143 8 som uttrykker rekombinante flageller som bærer P^ber<g>hei CS-epitopen (kodet for av plasmidet pPX1662) induserte også et signifikant nivå av serum antistoffer mot denne epitopen, i forhold til kontrolldyr immunisert med den samme bakteriestammen som uttrykker villtype Hl-d-flageller (kodet for av plasmidet pPX1650) (fig. 8), hvilket illustrerer evnen hos levende svekkete bakterier til å avgi en fremmed epitop som flagellinfusjonsprotein uttrykt på disse organismers overflate.

For testing av immunogenisiteten erstattet vi fase-1 flagellingenet, Hl-g,p i aromatisk-avhengig levende vaksine S. dublin stamme SL1438 (elements, J. et al., 1987, Infect. Immunol. 53:685; Dougan, G. et al., 1987, Parasite Immunol. 9:151; og Poirier, T.P. et al., 1988, J. Exp. Med. 68:25) med et flagellinallel inaktivert med et transposon, Hl-i::TnlO; ettersom S. dublin er énfaset, ble den resulterende stammen, SL5928, ikke- motil, men ble motil når den ble transformert med plasmider som inneholdt enten villtypen, delesjonen eller den kimere formen av Hl-d, akkurat som observert for den flagellin negative S. tvphimurium-verten SL5676. De pUC-deriverte plasmidene er stabile i den anvendte levende vaksinestammen, som vist ved ampicillin-resistensen for alle av mer enn 100 kolonier fra en bakterie-suspensjon etter to passeringer i substrat uten ampicillin, og ved ampicillin-resistensen for alle koloniene gjenvunnet fra muselever ved autopsi. Vi immuniserte S57BL/6 mus med tre intraperitoneale injeksjoner på 5xl0<6>bakterier, enten formalinavlivet eller levende, med 7 døgns intervaller. En uke etter den siste injeksjonen ble musene avblødd, og deres sera ble testet ved ELISA (enzyme-linked immunosorbent assay) for reaktivitet med CTP3-peptid eller fullstendig koleratoksin (fig. 9). Vi påviste antistoff mot den innsatte epitopen i alle sera; alle sera reagerte like sterkt med koleratoksin som med CTP3-peptidet.

Fig. 9 viser antistoffresponsen for fem mus immunisert med SL592 9, en Salmonella dublin levende vaksinestamme som uttrykker de kimere flagellinene; □, før immuniseringen, I etter immuniseringen med SL5929. Reaktivitet av musesera med komplett naturlig koleratoksin ble målt ved fastfase-ELISA (Jacob, CO. et al., Proe. Nati. Acad. Sei. USA 80:7611 (1983)), med peroksydasekonjugert geiteanti-stoff mot mus IgG (TAGO). Musene ble injisert intraperitonealt tre ganger, med ukentlige intervaller, med 5xlO<s>formalinavlivete bakterier; sera ble oppsamlet 7 døgn etter den siste injeksjonen. Stavene representerer gjennomsnittsverdien av optisk tetthet for sera fra fem mus (SE større enn 15% for alle fortynningene).

Diskusjon

Vi demonstrerer ekspresjonen av epitoper som er kritisk for induksjon av beskyttende immunrespons mot patogene organismer, som fusjonsproteiner med flagellin, proteinet i flagellære bakteriefilamenter. Flere rekombinante flage1lingener ble konstruert som kodet for epitoper som normalt ble uttrykt ved en protosoisk parasitt, eller ved en bakterie. Den immundominante repeterende epitopen i circumsporozoitt (SC) proteinet i EL. falciparum og den analoge epitopen assosiert med IVj. ber<g>hei ble innsatt i en region av Hl-d-genet i Salmonella muenchen. Et oligonukleotid som koder for en beskyttende epitop som er tilstede på den bindende underenheten av koleratoksin (CT-B) ble også innsatt i et Hl-d flagellingen. Det ble vist at alle disse rekombinante konstruksjonene uttrykker molekyler som migrerte gjennom SDS-PAGE-geler med mobiliteter i overensstemmelse med deres forventete molekylvekter. Dessuten ble disse molekylene gjenkjent på Western blot av antisera spesifikke for Hl-d flagellinmolekylet samt av reagenser som gjenkjenner de heterologe epitopene på det naturlige proteinet.

Disse hybride proteinene beholder sin evne til å bli uttrykt på.overflaten av rekombinante bakterier, og gjør det således lettere å isolere og rense disse molekylene for anvendelse som komponenter i en underenhetsvaksine. Dessuten ble disse molekylene ikke bare uttrykt ved E_;_ coli som inneholder de rekombinante plasmidene, men ble også introdusert i flere svekkete Salmonella-stammer som kan være nyttige som levende vaksiner. Ekspresjon av rekombinante flagellinmolekyler i svekkete, angripende bakterier, kan tillate dannelse av levende vaksiner mot essensielt et hvilket som helst patogen for hvilket kritiske, immunogene epitoper kan identifiseres.

Eksempel 2

Ekspresjon av epitoper av hepatitt B overflateantigen som rekombinante flagellin fusjonsproteiner

I denne studien satte vi inn to spesifikke HBV S gensekvenser som koder for henholdsvis aminosyresekvensene S 122-13 7 og preS2120-145 i Salmonella flagellingenet Hl-d, og det ble vist at HBsAg-epitoper ble uttrykt ved en flagellin-negativ svekket S^dublin-stamme transformert av de rekombinante plasmidene. Immunisering av dyr med levende bakterier førte til både anti-HBs og anti-flagellinrespons.

Syntetiske oligonukleotider, syntetiske peptider og rekombinant DNA-metoder

Enkelttrådete oligonukleotider med spesifikk sekvens ble syntetisert og renset ved polyakrylamidgelelektroforese. Syntetiske peptider S 122-137 og preS2120-145 med sekvenser tilsvarende de anvendte syntetiske oligonukleotidene, ble syntetisert ved fast- fasemetoden til Erickson, B.W. og Merrifield, R.B., (1976) i The Proteins, utg. H. Neurath og R.L. Hill (Academic Press, New York) vol. 2, s. 255, og renset ved gelfiltrering på Sephadex LH-20. Renheten av peptidene ble undersøkt ved analytisk reversfase HPLC og aminosyreanalyse. Kloningsteknikkene var som beskrevet av Maniatis, T. et al., 1982, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor. Bakterielysater ble fremstilt fra 1,0 ml av over natten-kulturer ved sentrifugering av bakteriene og resuspendering av disse i 0,1ml prøvebuffer inneholdende 2% SDS (Sigma), 2% B-merkaptoetanol (Sigma), og PMSF (fenylmetansulfonylfluorid), TLCK (N-tosyl-L-lysinklormetylketon), TPCK (N-tosyl-L-fenylalaninklormetylketon) , leupeptin, pepstatin (proteaseinhibitorer, Boehringer Mannheim) ved konsentrasjonen angitt av produsentene.

Antisera

Et polyklonalt kanin anti-Hl-d ( Salmonella fase-1 flagellært antigen) serum, mottatt fra Dr. P.H. Makela, National Public Health Insitute, Helsinki, Finland, ble anvendt som anti-flagellin-serum. Polyklonalt geite anti-HBs (fremstilt mot naturlig HBsAg renset for humant plasma) ble innkjøpt fra Daco company. Antisera mot peptidene S 122-137 og preS2120-145 ble fremstilt ved immunisering av marsvin med de respektive syntetiske peptidene konjugert med tyroglobulin. Optimale fortynninger av disse antisera etablert ved titrering, ble anvendt til å påvise ekspresjon av de respektive HBsAg-epitopene i bakterielysater ved immunblotting.

Immunisering

Bakteriekloner for immunisering ble dyrket over natten ved 37°C i Luria-substrat inneholdende 50 mg/ml ampicillin. Cellene ble vasket to ganger og slemmet opp igjen i fosfatbuffret salt-oppløsning (PBS). To hvite kaniner fra New Zealand ble immunisert med hver bakterieklon ved intramuskulær injeksjon av 1 ml av en oppslemming inneholdende ca. IO<9>levende bakterier på dagene 0, 7, 14, 21 og 28; og blodprøver ble tatt på dagene 0, 28, 56 og 84.

Tre marsvin og ti mus (BlO.BR-mus for preS2120-145 kloner og BALB/cj-mus for S 122-137 kloner), de kjente responderstammene for de to peptidene (F. Chiasari, personlig meddelelse og Milich, D.R. et al., 1986, J. Exp. Med. 164:532) ble immunisert med hver klon ved å plassere ca. IO<9>levende bakterier i 1 ml suspensjon i munnen på hvert marsvin eller ca. 5xl0<8>levende bakterier i 0,05 ml i munnen på hver mus på dagene 0, 7, 14 og 2 8; og blodprøver ble oppsamlet på dagene 0, 28, 56 og 84.

Sera ble analysert for spesifikke antistoffer ved ELISA (Gooderham, K., (1984) i Methods in Molecular Biology, utg. Walker, J.M., Hummang Press, Clifton, JN, vol. 1: Proteins, s. 165) med alkalisk fosfatasekonjugert anti-kanin, anti-mus eller anti-marsvin antisera innkjøpt fra Boehringer-Mannheim. Antistofftiteren refererer til den høyeste fortynningen av testserum hvorved forholdet mellom A405 fra testserum og A405 fra preimmunt serum var over 2,0.

Konstruksjon av rekombinante plasmider

To syntetiske oligonukleotider som begge koder for en HBsAg (undertype ayw) aminosyresekvens som synes å inneholde en beskyttende eller delvis beskyttende epitop, ble anvendt i denne studie (S 122-137 og preS2120-145). De øvre linjene i fig. 10 representerer nukleotidsekvensene for de korresponderende syntetiske oligonukleotidene som ble utformet for innsetting i ramme på EcoRV-stedene i flagellingenet (fig. 10). De valgte kodonene var de mest hyppig anvendte i Salmonella flagellingenet Hl-d (Wei, L.N. og Joys, T.M., 1985, J. Mol. Biol. 186:791). Restriksjonssteder for Kpnl og BamHI (for henholdsvis de S 122-147 og preS2120-145-kodende sekvensene) ble medtatt for å tillate identifikasjon av rekombinanter ved restriksjonsanalyse. Et halvt sete for EcoRV ble satt på 3 x-enden av preS2oligonukleotidet for å lette ligeringen med oligonukleotider fra andre HBV-epitoper. To stoppkodoner (understreket) ble plassert i den komplementære tråden for preS2-oligonukleotidet for lett utvelgelse av kloner med innskudd i den ønskete orientering. Flagellingenet var tilstede i plasmidet pLS405 bestående av et 3,8 kb S^muenchen genomfragment som inneholdt den 1,5 kb flagellinkodende sekvensen klonet inn i EcoRI-setet i plasmidet pUC19 (se eksempel 1). Den sentrale hypervariable regionen i flagellingenet av villtypen inneholder to innrammete EcoRV-steder med 48 basepar (bp) imellom (fig. 10). Delesjon av dette EcoRV-fra<g>mentet i pLS405, for å frembringe plasmidet pLS408, reduserer men eliminerer ikke flagelleringen av bakteriene (se eksempel 1). Overlappende komplementære enkelttrådete syntetiske oligonukleotider ble hybridisert, fosforylert, reparert med Klenow-fragmentet fra EL. coli DNA-polymerase for å lage dobbelt-trådete DNA-fragmenter med butte ender, deretter ligert i EcoRV-setet på pLS4 0 8 med T4DNA-ligase, og ligerings-reaksjonsblandingen ble anvendt til å transformere CL447, en variant av den flagellin-negative stammen Ej. coli C600 hag"-

Kloner med rekombinante plasmider ble identifisert ved koloni-hybridisering ved anvendelse av de respektive syntetiske oligonukleotidene merket med<32>P som gensøker og ved restriksjons-spalting. Antallet, orienteringen, leserammen og nøyaktigheten av innskuddene ble bestemt ved dideoksynukleotidsekvensering (Sanger, F., et al., 1977, Proe. Nati. Acad. Sei. USA, 74:5463), ved anvendelse av en 15 nukleotid syntetisk primer tilsvarende en flagellingensekvens ca. 3 0 bp nedstrøms fra EcoRV-setet. Flere rekombinante plasmider med 1-3 kopier av de respektive syntetiske oligonukleotidsekvensene i forskjellige orienteringer ble isolert og ytterligerekarakterisert.

Karakterisering av rekombinante kloner

Rekombinante plasmider som skal analyseres ytterligere ble anvendt til å transformere S^typhimurium LB5000 (en restriksjonsnegativ, modifikasjonsdyktig og ikke-flagellert stamme med mutasjon flaA66) kompetente celler, og deretter overført til en flagellin-negativ levende vaksine-stamme av S^dublin SL5928 ved transduksjon ved anvendelse av fag P22 HT105/1 int i hvert tilfelle med seleksjon for ampicillin-resistens. SL592 er en aromatisk-avhengig stamme avledet fra S. dublin SL1438 (Smith, B.P., et al., 1984, Amer. J. Veterin. Sei. 45:2231); den er ikke-motil fordi den er en-faset med sitt enkelt-flagellingen inaktivert ved innsetting av transposonet TnlO.

Antigener uttrykt i både EL_ coli C600 hag""variantstammen og SL592 8 ble undersøkt ved immunblotting ved anvendelse av enten kanin anti-Hl-d (anvendt som antiflagellin), eller geite anti-HBsAg eller anti-syntetisk preS212 0-145 peptid antisera. Bakterielysater av E_j. coli C6 00 hag""varianten transformert med rekombinante plasmider som inneholder sekvenser som koder for S 122-137 (S16e og S20e), sekvensen preS2121-145 (ps8e) eller sekvensen for preS2120-145 (pS21e) , og £L_ dublin SL5928 som inneholder de samme plasmidene (henholdsvis S16s, S20s og pS8s, pS21s) og kontroller bestående av lysater av den ikke-transformerte EL. coli C60 0 hag""stammen og

S. dublin SL5928, iL_ dublin SL5985 som er SL5928 transformert med bare moderplasmidet pLS4 05 med delesjon av EcoRV-fragmentet og HBsAg fra pasientserum, ble oppvarmet til 100°C i 3 minutter før ifylling. Proteinene ble separert ved natriumdodecylsulfat-12,5% polyakrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) (Laemmli, U.K., 1979, Nature, 227:680). Proteinene ble overført til nitrocellulose-filtre som ble immunfarget med enten kanin anti-flagellin Hl-d antiserum vist som anti-F eller geit anti-HBsAg eller kanin anti-syntetisk peptid preS2120-145. Inkubering med et egnet andre antistoff konjugert med enten alkalisk fosfatase eller peroksydase ble etterfulgt av omsetning med NBT-BCIP (for alkalisk fosfatase) eller DAB-H202(for peroksydase).

Som ventet ble intet flagellin antigen påvist i EL. coli C600 hag""varianten eller i SL. dublin SL5928, i mangel av et intakt flagellingen. To elektroforetiske komponenter som reagerer som flagellin antigen ble påvist i klon S20, og basis for dette kompleksmønsteret er ikke klart.

Geit anti-HBs fremstilt mot HBsAG (ayw) renset for humant plasma, reagerte med de hybride flagellinproteinene i kloneneS16 og S2 0 (med sekvensen som koder for S 122-137) og klonene pS8 og pS21 (med sekvensen som koder for henholdsvis preS2121-145 og preS2120-145) som viser at hybridproteiner i disse klonene inneholdt epitoper som ble gjenkjent av dette anti-HBs-holdige serum.

Kanin anti-peptid preS2120-145 reagerte med hybrid flagellinproteinene i klonene pS8 og pS21 med preS2-sekvensen, og ikke med proteinene i noen av klonene med S-sekvensen.

Sammenstilling av rekombinant flagellinbærende HBsAg-epitoper ble undersøkt ved elektronmikroskopi av bakterier som uttrykker det hybride flagellin. I den motile klonen ble det på de fleste bakterier sett flageller med morfologi som ikke lar seg skille fra morfologien til flageller av den ville typen. I de tre ikke-motile (vurdert etter evnen til spredning på halvfast agar), men flagellin-positive klonene S16, pS8 og pS21, ble det observert svært få flageller (data ikke vist).

Fig. 11 oppsummerer egenskapene hos 7 rekombinante plasmider som er blitt analysert. De sorte (for S-sekvensene) eller skraverte (for preS2-sekvensene) pilene representerer orienteringen og antallet av syntetiske oligonukleotidsekvenser innsatt mellom EcoRV-stedene på flagellingenet når det gjelder orienteringen av flagellingenet (representert ved de stiplete pilene) i pLS405. Bakteriemotilitet ble testet ved anvendelse av halvfast agar. Kaniner ble immunisert med S^ dublin SL5928 transformert med individuelle plasmider, og antistoffresponsene ble målt ved ELISA ved anvendelse av hvert syntetisk peptid som antigenbelegg. "nd" betyr "ikke utført". Som ventet var det bare plasmider med S- eller preS2-kodende sekvenser i den samme orienteringen som flagellingenet (S16, S20, pS8 og pS21) som førte til ekspresjon av hybride flagellinproteiner med påvisbare S- eller preS2-determinanter. Blant det lille antallet plasmider som ble undersøkt, var det tre av de fire med et innskudd i en orientering motsatt orienteringen av flagellingenet (S20, S6 og S27) som var motile; lysater av bakterier som inneholdt det fjerde, pS2, ville ikke binde anti-d-antistoff, som ventet siden preS2-oligonukleotidet i revers orientering omfatter to terminasjonskodoner (fig. 10). De med ett eller flere innskudd i samme orientering og ingen innskudd i motsatt orientering (S16, pS8 og pS21) spredte seg ikke i halvfast medium, selv om spredte flageller ble påvist ved elektronmikroskopi, og både flagellin- og HBsAg-epitoper ble påvist ved immunblotting.

Immunogenisitet av bakterier som uttrykker hybride proteiner

Immunogenisiteten av HBsAg-epitoper i de hybride flagellinproteinene ble først testet ved intramuskulær immunisering av kaniner med levende S_j_ dublin SL5928 som uttrykker hybrid flagellin (fig. 12). Fig. 12 viser antistoff-responser hos kaniner immunisert intramuskulært med levende S^dublin SL592 8 transformert med S16 eller pS21. Anti-flagellin indikerer antistoff påvist ved ELISA med det naturlige flagellinproteinet renset for SL5928 transformert med plasmidet som inneholder den ville typen av flagellingenet, antipeptid representerer antistoffer påvist ved ELISA med de syntetiske peptidene S 122-137 og preS2120-145 (for dyr immunisert med SL5928 som bærer henholdsvis S16 og pS21, og anti-HBs representerer antistoff påvist ved ELISA med HBsAg fremstilt i CHO-celler.

Høy titer (over IO<4>) av anti-flagellin antistoffer ble fremkalt i de to dyrene som fikk SL5928 transformert med plasmidet S16 (med sekvens som koder for S 122-13 7) og i de to som fikk SL5928 transformert med plasmidet pS21 (med sekvens som koder for preS2120-145). ELISA-titrene for anti-peptid antistoffer (anti-S 122-137 eller anti-preS2120-145 i de respektive kaniner immunisert med SL5928 som bærer det korresponderende plasmidet) varierte mellomIO<3>og 2xl0<4>. Disse antisera reagerte med rekombinant HBsAg (undertype ayw og som inneholder preS2-sekvens) produsert i kinesisk hamster ovarieceller (CHO) (vennligst fremskaffet av Dr. P. Toillais fra Institut Pasteur) (Michel, M.K. et al., 1985, Biotechnology 3:561) med topptitre på ca. 6400 i to av fire kaniner. Immunsera fra disse kaninene reagerte også kraftig med naturlig HBsAg renset fra HBV-infiserte sjimpanser påvist ved Abbott Laboratory<x>s Ausab-analyse (data ikke vist). Kaniner immunisert med SL5928 transformert med henholdsvis plasmidene S20 og pS8 ga en liknende respons (data ikke vist) som dyrene immunisert med SL5928 inneholdende S16 og pS21. I to kaniner immunisert med SL592 8 inneholdende moderplasmidet pLS4 05 uten innskudd av HBV-sekvenser, ble som ventet påvist høyt innhold av anti-flagellin antistoff, og intet anti-S- eller anti-preS2-peptid eller anti-HBsAg-antistoffer ble påvist. Ingen av dyrene inokulert med denne svekkete S_j_ dublin-mut ant en (SL592 8) viste tegn på septisk sjokk eller annen sykdom. Disse resultatene viser at de hybride flagellene uttrykt ved S_;_ dublin SL592 8 som bærer det rekombinante plasmidet, inneholder HBsAg-epitoper som er immunogene, og at antistoff fremkalt av dem reagerer med avledet plasma eller rekombinant HBsAg.

De syntetiske peptidene S122-137 og preS2120-145 blokkerte spesielt bindingen av HBsAg fremstilt i CHO-celler ved antistoffer i de immune sera, men ikke de pre-immune sera (data ikke vist) fra kaniner immunisert med SL5928-kloner som uttrykker henholdsvis S-eller preS2-epitopene, hvilket bekrefter at anti-HBs i disse dyrene var rettet mot epitoper innkodet av sekvensene som ble innført i flagellingenet.

For å bestemme hvorvidt anti-HBs-responser ville bli resultatet av oral administrasjon av levende svekket S. dublin SL5928 som uttrykker hybride flageller, ble det utført eksperimenter i kanin, mus og marsvin. Fig. 13 viser anti-peptid- og anti-HBs-titre hos mus etter oral vaksinasjon med SL5928 transformert med hver av de rekombinante plasmidene S16, S20, pS8 og pS21 og med det uforandrete flagellingenet pLS405. Signifikante titre av det respektive antipeptidet og anti-HBs ble påvist i alle dyrene, selv om titrene var lavere enn de som ble observert etter intramuskulær immunisering av kaniner. Oral administrasjon av pLS405-transformerte bakterier SL5928 førte til intet påvisbart HBs eller antipeptid antistoff som ventet. Titrene for antipeptid og anti-HBs i kaniner og marsvin (data ikke vist) liknet på (80-640) dem hos mus (fig. 13) etter oral administrasjon av levende S^dublin SL5928. Ingen diaré eller annen sykdomsmanifestasjon observert i noe som helst dyr som ble gitt S_^dublin SL5928 oralt. Disse eksperimentene viser at immunrespons på HBsAg-epitoper blir fremkalt ved oral vaksinasjon med levende SL. dublin SL5928 som uttrykker hybride flageller.

Diskusj oner

I dette eksempelet har vi vist at nukleotidsekvenser som koder for antigene regioner i HBsAg polypeptider kan innsettes i den hypervariable regionen i Salmonella flagellingen, og at disse genene i en svekket Salmone11a-mut ant kan bli uttrykt. Noen resulterende hybride flagellinproteiner kan sammensettes til funksjonelle flageller som testet ved evnen til å spre seg i halvfast medium; andre hybride flagelliner ble ikke samlet til filamenter, unntatt kanskje i en liten minoritet av bakterier. De hybride flagellene inneholder både flagellin og HBsAg-epitoper påvist ved immunblotting. HGsAg-epitopene ble påvist med antisera fremstilt mot spesielle syntetiske peptider og mot serumavledet HBsAg. Det synes klart at antallet og orienteringen av HBsAg-sekvenser innsatt i flagellingenet, påvirket proteinets evne til å samle seg til funksjonelle flageller. Det er interessant at en HBsAg-sekvens innsatt i den samme (og ikke i den motsatte) orienteringen som flagellingenet, reduserte bevegeligheten av bakteriene, og derved antydet at den spesielle virale omhyllings- proteinsekvensen (S122-137) som erstattet en naturlig flagellin-sekvens av samme størrelse, signifikant forandret konformasjonen av det hybride flagellinet. Utveksling av flagellindelesjonen på 16 aminosyrer med et innskudd på 27 aminosyrer (preS212 0-145) forhindret dessuten ikke ekspresjonen av flagellin, men påvirket dets funksjon. I begge ble påvist HBsAg-epitoper gjenkjent av antisera mot naturlig HBsAg, i det hybride flagellinproteinet. Disse sekvensene som fremstilt av levende bakterier var immunogene, og fremkalte antistoff som gjenkjente naturlig HBsAg. Flagellin representerer således et bakterieprotein, hvori virale antigener kan fremstilles i en form som er immunogen i levende stammer av Salmonella.

Eksempel 3

Konstruksjon av rekombinant flagellin som uttrykker en epitop av rotavirus VP7

Bakgrunn

Det viktigste polypeptidet, VP7, i det ytre skallet, er et glykoprotein med en tilsynelatende molekylvekt på 38.000 (38,2 K)

i sin ureduserte form og 41.900 (41,9 K) i sin reduserte form. Det er blitt vist at det er det viktigste antigenet som er ansvarlig for å indusere nøytraliserende antistoffer til virus. Dette glykoproteinet er også ansvarlig for å feste virus til cellene.

Forskjellige serotyper av rotavirus forekommer, og defineres ved den nøytraliserende aktiviteten som stimuleres av VP7. Til dato er det blitt identifisert syv serotyper; fire av disse (serotypene 1-4) finnes hos mennesker, og fem (serotypene 3-7) finnes hos dyr. Viktigheten av disse serotypeforskjellene er uklar, fordi nylige studier viste at både hos mennesker og dyr kan det forekomme kryssbeskyttelse blant stammer som hører til forskjellige serotyper. Denne kryssbeskytteisen kan forekomme fordi det er vanlige antigen-determinanter av VP7 som er uavhengig av serotype. Alternativt kan de spesifikke aminosyresekvensene i VP7 (epitoper) som er ansvar-lige for serotypespesifisitet, indusere noen kryssreaktivt antistoff som er ansvarlig for kryssbeskyttelse.

Med en molekylvekt på 38,2/41,9 K er VP7 sammensatt av ca. 325 aminosyrer. Sekvensen av aminosyrene som omfatter VP7 i flere forskjellige rotavirusisolater er blitt bestemt, og indikerer at graden av aminosyrehomologi ligger i området fra 75 til 86%. Sammenlikning av sekvensene i disse VP7 åpenbarer flere regioner hvor aminosyresekvensen varierer.

Epitopkartlegging av VP7 ved anvendelse av nøytraliserende monoklonale antistoffer lokaliserte et nøytraliserings-absorpsjons-domene for en peptidkomponent med en tilsynelatende molekylvekt på 14.000 (14 K). Etter rensing stimulerte dette 14 K-peptidet dannelse av nøytraliserende antistoffer hos mus. Dessuten ble det observert at sekundærstrukturen for dette peptidet var nødvendig for bibehold av antigenisitet. Aminosyresekvensen for Nebraska kalvediarevirus (NCDV bovint rotavirus), som utviser høy nuklein-syrehomologi med det bovine rotavirus C4 86 og er av samme serotype, ble anvendt for å kartlegge polypeptidfragmentet på 14 K i den regionen som omfatter aminosyrene 165-295. Et hydrofilisitets-diagram av det tilsvarende NCDV glykoproteinet identifiserte flere hydrofile regioner i dette området.

En slik region tilsvarte aminosyrerestene 275-295 på VP7 i bovint rotavirus. Det tilsvarende peptidet ble syntetisert ved fastfase peptidsyntese-metoden til Merrifield. Den spesifikke aminosyresekvensen for peptidet var som følger: Pro-Thr-Thr-Ala-Gln-Thr-Glu-Arg-Met-Met-Arg-Ile-Asn-Trp-Lys-Trp-Trp-Gln-Val.

Renheten av dette peptidet ble bestemt ved anvendelse av tynnsjiktkromatografi og reversfase-høytrykksvæskekromatografi. Hurtig-atombombardement-massespektrometri ble anvendt til å bekrefte molekylvekten.

Reaktivitet og spesifisitet for det syntetiske peptidet ble bestemt ved flere metoder. 1) ELISA med anti-VP7 monospesifikt serum, som indikerte peptidets spesifisitet for VP7. 2) ELISA med monoklonale antistoffer spesifikke for det nøytraliserende glykoproteinet (VP7) og som hadde evne til å blokkere virusbinding, som indikerte peptidets spesifisitet for en spesiell region eller epitop i VP7. 3) Adsorpsjonsblokkeringsanalyse som indikerte at peptidet 275-295 blokkerte virusbinding in vitro til celler fra afrikansk grønn apekatt (MA-104).

Påvisning av epitop i flagellinkonstruksjon

For å konstruere hybrid flagellingen som koder for epitopen av rotavirus VP7 (AA 275-292) ble syntetiske oligonukleotider som representerer aminosyrene 275-292 i rotavirus VP7 med følgende sekvens innsatt i flagellinekspresjonsvektoren pPX1651 (se eksempel 1) :

Etter transformasjon ble rekombinantene screenet, for innsetting av epitopen ved restriksjonsenzymkartlegging, Western blotting og nukleotidsekvensering. Det resulterende rekombinante plasmidet, pROTA92-19, ble innført i Salmonella dublin SL5927, og rekombinante flageller fremstilt som beskrevet tidligere.

Flagellin konkurranse-eksperiment

Evnen til flagellin og flagellin med rotavirus 275-292-epitopen (bestemt ut fra VP7 bovint rotavirus-sekvensen som beskrevet ovenfor) til å konkurrere med infektiøst rotavirus for MA-104 cellereseptorer ble bestemt. Virusbeholdningen anvendt for konkurransestudien var bovint rotavirus stammen C486 som ble aktivert med 50 fig trypsin pr. ml. En passende fortynning av denne beholdningen ble anvendt i konkurranseeksperimentet, slik at slutt-antallet av plakkdannende enheter var 30-50. Utgangskonsentrasjonen av beholdningen av flagellinpreparat, anvendt som kontroll, var 3,55 mg/ml, mens lagerpreparatet av flagellin som inneholdt 275-292-epitopen hadde en konsentrasjon på 2,0 mg/ml. Passende fortynninger av disse preparatene ble laget, slik at sluttkonsentrasjonen av flagellin var 1,25 fig, 25 fig, 50 fig eller 100 fig pr. lxlO<5>celler.

Konkurransen ble utført ved å blande passende mengder av rotavirusbeholdning med det egnete flagellinpreparatet. Blandingene ble adsorbert på enkeltsjikt av MA-104-celler i 1 time ved 37°C. Etter adsorpsjon ble celle-enkeltsjiktene vasket tre ganger med Eagles minimale essensielle medium (MEM) og oversjiktet med 1% agaroseperler fortynnet i MEM. Cellene ble inkubert i 3 døgn ved 37°C og deretter farget for påvisning av plakker med 1% krystall-fiolett fortynnet i 80% metanol.

Hver analyse ble utført i triplikat og flagellinets eller flagellin som inneholdt 275-292-epitop-preparatene ble også anvendt alene på én-cellesjikt i de indikerte konsentrasjoner for å kontrollere for eventuell skadelig virkning av selve peptidene på enkeltcellesj iktene.

Eksempel 4

Induksjon av cellulær immunrespons med hybride flageller som uttrykker epitoper av CRM197

Avgivelse av visse immunogene epitoper kan føre til induksjo av spesielle cellulære immunresponser såsom celleformering, opp-bygging av cytokiner og spesifikk lyse av målceller som uttrykker disse epitopene. For å demonstrere evnen hos rekombinante flagellei til å indusere cellulær immunrespons ble anvendt en forutsagt og eksperimentelt begreftet T-celle-epitop som modell for disse eksperimentene. Epitopen som ble valgt er sammensatt av aminosyrene 366-383 i CRM197-proteinet (et mutant difteritoksin-molekyl). Deretter ble det vist at lymfeknuteceller fra SJL-mus som på forhånd var blitt primet med CRM197-protein ga respons in vitro vec innføring av tritiert tymidin (blastogenese) når de ble stimulert med renset syntetisk peptid som representerte aminosyrene 366-383 i CRM197-proteinet (se US-serienr. 07/150 688, inngitt 1. februar1989, hvis beskrivelse er inkorporert heri ved referanse).

Følgende oligonukleotider ble syntetisert som koder for CRM197 aminosyrene 3 66-3 83:

Disse oligonukleotidene ble subklonet i flagellinekspresjons plasmidet pPX1647. Dette plasmidet er en modifikasjon av den originale vektoren pPX1651, hvor det enkelte BamHI-restriksjons-stedet er blitt ødelagt ved kutting, dannelse av fluktende-ender ved behandling med Klenow-enzym, og religering, og hvori følgende oligonukleotid ble innsatt på det unike EcoRV-setet:

De understrekete kodonene representerer tre separate restriksjonssteder, henholdsvis EcoRV. Clal og BamHI. Denne innsettingen resulterer i innføring av tre unike restriksjonsenzym-gjenkjenningssteder som letter påfølgende innsetting av sekvenser som koder for fremmede epitoper. Plasmidet pPX1647 ble spaltet med EcoRV og BamHI, og religert i nærvær av en overskuddsmengde av oligonukleotidfragmentene som koder for CRM197-epitopen. Etter transformering ble rekombinantene isolert ogkarakterisert vedrestriksjonsenzymkartlegging, Western blotting og nukleotidsekvensering. Det resulterende rekombinante plasmidet, pCRM7F, ble innført i Salmonella dublin SL5927, og rekombinante flageller fremstilt som beskrevet i eksempel 1.

Immunisering

50/xg av det rensete rekombinante flagellinpreparatet ble emulgert i et like stort volum av fullstendig Freunds hjelpemiddel, og administrert til SJL-mus s.c. ved haleroten. Som kontroller ble andre grupper av SJL-mus immunisert på liknende måte med ikke-rekombinante flageller (1650) og renset CRM197-protein, som beskrevet i US-patentsøknad serienr. 07/150 688 inngitt 1. februar 1989 .

T-celle-aktivering

Formering av murine T-celler

Inguinale og periaortiske lymfeknuter ble aseptisk høstet fra mus som på forhånd var immunisert med en optimal dose av antigen emulgert (1:1, vol:vol) i fullstendig Freunds hjelpemiddel. En en-cellet oppslemming ble fremstilt i RPMI inneholdende 10% føtalt bovinserum. Etter en enkelt vasking ble cellene slemmet opp igjen i RPMI uten serum og tellet ved trypanblått-eksklusjon med fase-kontrastmikroskop. Celletallet ble justert til en konsentrasjon på3x10<6>celler/ml i RPMI som inneholdt 2% normalt museserum. Forskjellige konsentrasjoner av antigener, mitogener eller andre kontrollmaterialer ble fremstilt i RPMI uten serum, og alikvotert (0,1 ml) i triplikat i 96 brønners, flatbunnete vevskultur-behandlete plater. Et bredt område av doser ble rutinemessig anvendt for alle antigener. Til disse platene ble tilsatt 0,1 ml cellesuspensjon. Den oppnådde sluttkonsentrasjonen av celler var således 3xl0<5>celler/brønn i medier som inneholdt 1% museserum. Etter tilsetting av cellene ble kulturene plassert i fuktig 5% C02-inkubator ved 37°C. Etter 3 døgns inkubering ble kulturene pulset i 18 timer med 1/xCi/brønn med [3H] -thymidin og høstet for telling ved væske-scintillasjon. Tymidin-inkorporeringen blir uttrykt som gjennomsnittet av replikate eksperimentalverdier minus gjennom-snittet av replikate ikke-stimulerte (bakgrunns)-verdier.

Resultater

Fig. 14 viser data som fremkommer når lymfeknuteceller fra SJL-mus ble primet med rekombinante flageller. SJL-mus ble immunisert med 50 fig renset CRM197-protein a, rekombinante flageller som koder for CRM197 366-383 epitopen ♦, eller renset villtype (1650) flageller ■ i fullstendig Freunds hjelpemiddel SC ved haleroten. 7 døgn etter priming ble lymfeknutene fjernet, og én-cellesuspensjoner oppnådd. 3xl0<5>lymfeknuteceller (LNC) ble inkubert med 5 gangers seriefortynninger av renset syntetisk peptid som koder for aminosyrene 366-383 i CRM197-proteinet. Cellene ble dyrket i RPMI 1640 inneholdende 1% normalt museserum i 37°C i 3 døgn, pulset med 1,0 tiCi pr. brønn med tritiert thymidin i 16 timer, og høstet for væskescintillasjonstelling. Data er gitt som stimulasjonsindeks (SI) versus konsentrasjonen av stimulerende antigen, hvor SI = cpm målt i brønner i nærvær av stimulerende antigen, dividert med CPM i brønnene i fravær av eventuelt stimulerende antigen. Hvert datapunkt representerer gjennomsnittet og standardavvik for triplikate kulturer. Fig. 15 viser data når de samme lymfeknutecellene ble stimulert med renset CRM197-protein. SJL-mus ble immunisert med 50 \ Lg renset CRM197-protein a, rekombinante flageller som koder for CRM197 366-383 epitopen ♦, eller renset villtype (1650) flageller ■ i fullstendig Freunds hjelpemiddel s.c. ved haleroten; under betingelser som beskrevet for data oppnådd i fig. 14.

Eksempel 5

De følgende tabellene V og VI sammenfatter resultatene oppnådd fra motilitetsstudier, Western blot-analyse og immunise-ringsstudier ved anvendelse av rekombinante flagellinfusjonsproteiner i forskjellige verter. Fremgangsmåtene for hver av testene sammenfattet nedenfor er beskrevet i tidligere eksempler.

Deponering av mikroorganismer

Følgende bakteriestammer som bærer de oppførte plasmidene, er blitt deponert 4. mai 1988 hos The American Type Culture Collection (ATCC), Rockville, MD, og er blitt gitt de viste tilgj engelighetsnummer:

Den foreliggende oppfinnelse skal ikke begrenses i omfang av de deponerte mikroorganismene, da de deponerte utførelsene er ment å være enkeltillustrasjoner av et trekk ifølge oppfinnelsen, og eventuelle mikroorganismer som er funksjonelt ekvivalente, er innenfor rammen av oppfinnelsen. Forskjellige modifikasjoner av oppfinnelsen i tillegg til dem som er vist og beskrevet heri, vil være åpenbare for fagfolk på dette området ut i fra den foregående beskrivelse og vedlagte tegninger. Slike modifikasjoner er ment å falle innenfor rammen av de vedlagte kravene.

Det skal også forstås at alle baseparstørrelser som er gitt for nukleotider er omtrentlige og blir anvendt for beskrivelses-formål, og figurer som skjematisk beskriver DNA-sekvenser, er ikke nødvendigvis tegnet i skala.

Claims (16)

1. Rekombinant gen omfattende en nukleotidsekvens,karakterisert vedat den koder for et flagellinfusjonsprotein, hvilket protein omfatter en første epitop kodet for av et Salmonella- eller Shi<g>ella-flagellinstrukturgen og minst én epitop av en heterolog organisme, hvor epitopen av den heterologe organismen ikke er innsatt i flagellinet i et område som er essensielt for funksjonen til det kodete flagellin, hvori flagellinfusjonsproteinet er istand til å settes sammen til en funksjonell flagell og flagellindelen av proteinet beholder sin antigenisitet.

2. Rekombinant gen ifølge krav 1, karakterisert vedat flagellinstrukturgenet er fra Salmonella Hl, Hl-d eller H2-gen.

3. Rekombinant gen ifølge krav 1, karakterisert vedat den heterologe epitop er immunogen etter innføring av fusjonsproteinet i en virveldyrvert, hvori den immunogene epitop frembringer en immunreaksjon som er T-celle, B-celle eller cellulær av natur eller kombinasjoner derav.

4. Rekombinant gen ifølge krav 1, karakterisert vedat den heterologe organisme er en parasitt, bakterie, virus eller sopp.

5. Rekombinant gen ifølge krav 4, karakterisert vedat epitopen av en heterolog organisme er fra et circumsporozoitt antigenprotein, et Streptococcus M protein, koleratoksin B underenhet, Hepatitt B over-flateantigen eller Hepatitt B preoverflateangigen, HIV kapsel-protein eller Rotavirus VP7 protein.

6. Rekombinant gen ifølge krav 3, karakterisert vedat epitopen er en T-celle epitop, B-celle epitop eller kombinasjon derav.

7. Rekombinant gen ifølge krav 6, karakterisert vedat T-celle epitopen stammer fra difteri CRM197 toksin 366-383.

8. Rekombinant gen ifølge krav 1, karakterisert vedat den heterologe DNA-sekvens er innsatt i det hypervariable området av flagellin-strukturgenet.

9. Rekombinant gen ifølge krav 1, karakterisert vedat flagellinstrukturgenet er fra Salmonella Hl, Hl-d eller H2-genet.

10. Rekombinant gen ifølge krav 9, karakterisert vedat den heterologe DNA-sekvens sitter mellom de naturlige EcoRV seter av Salmonella Hl-d genet.

11. Rekombinant gen ifølge krav 1, karakterisert vedat den heterologe DNA-sekvens koder for en epitop av en organisme som er patogen for virveldyr.

12. Rekombinant nukleinsyrevektor, karakterisert vedat den inneholder det rekombinante gen i krav 1.

13. Rekombinant vektor ifølge krav 12,karakterisert vedat det inneholder et plasmid valgt fra gruppen bestående av pPX1653, pPX1662, pLS411, og pROTA92-19, deponert hos ATCC under deponerings-numrene 67688, 67687, 67686 og 67945 henholdsvis.

14. Genmodifisert mikroorganisme, karakterisert vedat den omfatter det rekombinante gen i krav 1.

15. Genmodifisert mikroorganisme ifølge krav 14,karakterisert vedat mikroorganismen er en svekket og invasiv bakterie valgt fra Salmonella, Shi<g>ella og Escherichia coli.

16. Fremgangsmåte for ekspresjon av et rekombinant flagellins-fusjonsprotein, som er i stand til å settes sammen til en funksjonell flagell,karakterisert ved: a) konstruksjon av et rekombinant gen som omfatter en nukleotidsekvens som koder for et Salmonella eller Shigella flagellin fusjonsprotein omfattende en første epitop av et flagellin-strukturgen og minst én epitop av en heterolog organisme, hvor epitopen av den heterologe organismen ikke er innsatt i flagellinet i et område som er essensielt for funksjonen av det kodete flagellin, og hvor flagellindelen av proteinet beholder sin antigenisitet; b) innsetting av det rekombinante gen i en tilsvarende ekspresj onsvektor; c) innsetting av vektoren i en tilsvarende vert; og d) bakterieverten som inneholder vektoren får anledning til å reprodusere under betingelser som induserer ekspresjon av det rekombinante gen.