DE68922394T2

DE68922394T2 - Rekombinante vakzine von flagellin.

Info

Publication number: DE68922394T2
Application number: DE68922394T
Authority: DE
Inventors: William Marjarian; Salete Newton; Bruce Stocker
Original assignee: Praxis Biologics Inc; Leland Stanford Junior University
Current assignee: Wyeth Holdings LLC
Priority date: 1988-05-05
Filing date: 1989-05-05
Publication date: 1995-10-05
Anticipated expiration: 2009-05-06
Also published as: AU637049B2; NO904806D0; DK263390A; DK263390D0; FI104638B; NO302031B1; DE68922394D1; JPH04502402A; ATE121782T1; EP0419513A1; EP0419513B1; FI905441A0; CA1340817C; NO904806L; AU3697989A; JP2793673B2; WO1989010967A1

Description

Hintergrund der Erfindung

Rekombinante DNA-Technologie und Genexpression

Die rekombinante DNA-Technologie schließt das Einführen spezifischer DNA-Sequenzen in einen DNA-Vektor zur Bildung eines rekombinanten DNA-Moleküls ein, das zur Replikation in einer Wirtszelle in der Lage ist. Im allgemeinen ist die eingeführte DNA-Sequenz für den empfangenden DNA-Vektor fremd, d.h., die eingeführte DNA-Sequenz und der DNA-Vektor sind aus Organismen abgeleitet, die in der Natur keine genetische Information austauschen, oder die eingeführte DNA-Sequenz kann vollständig oder teilweise synthetisch hergestellt sein. Es wurden allgemeine Verfahren entwickelt, die die Konstruktion rekombinanter DNA-Moleküle ermöglichen.
Ungeachtet des für die Konstruktion benutzten Verfahrens muß das rekombinante DNA- Molekül mit der Wirtszelle verträglich, d.h., fähig der autonomen Replikation in der Wirtszelle oder stabil in ein oder mehrere der Chromosomen oder Plasmide der Wirtszelle integrierbar sein. Das rekombinante DNA-Molekül sollte vorzugsweise auch eine Marker-Funktion haben, die die Auswahl des (der) erwünschten rekombinanten DNA-Moleküls (Moleküle) gestattet. Sind alle korrekten Replikations-, Transcriptions- und Translations-Signale richtig auf dem rekombinanten Vektor angeordnet, dann wird das Fremdgen richtig in zum Beispiel den transformierten Bakterienzellen im Falle von Bakterien-Expressionsplasmiden oder in permissiven Zellinien oder Wirten exprimiert, die mit einem rekombinanten Virus infiziert sind oder ein rekombinantes Plasmid tragen, das den geeigneten Replikationsursprung aufweist.
Unterschiedliche genetische Signale und Verarbeitungsschritte kontrollieren Niveaus der Genexpression, wie DNA-Transcription und Messenger-RNA (mRNA)-Translation. Die Transcription von DNA hängt von der Anwesenheit eines Promotors ab, der eine DNA-Sequenz ist, die das Binden von RNA-Polymerase dirigiert und dadurch die mRNA-Synthese fördert. Die DNA- Sequenzen eukaryotischer Promotoren unterscheiden sich von denen von prokaryotischen Promotoren. Weiter können eukaryotische Promotoren und begleitende genetische Signale in prokaryotischen Systemen nicht erkannt werden, oder sie funktionieren nicht darin, und weiter werden prokaryotische Promotoren in eukaryotischen Zellen nicht erkannt, und sie funktionieren nicht darin.
In ähnlicher Weise hängt die Translation von mRNA in Prokaryoten von der Anwesenheit der richtigen prokaryotischen Signale ab, die sich von denen der Eukaryoten unterscheiden. Die wirksame Translation von mRNA in Prokaryoten erfordert eine Ribosom-Bindestelle, die als Shine-Dalgarno (S/D)-Sequenz (J. Shine und L. Dalgarno, Nature, 254, 34-38, 1975) bezeichnet wird, auf der mRNA. Diese Sequenz ist eine kurze Nucleotid-Sequenz von mRNA, die vor dem Startkodon, üblicherweise AUG, angeordnet ist, das für das Amino-Endgruppe aufweisende (Formyl)methionin des Proteins codiert. Die S/D-Sequenzen sind komplementär zum 3'-Ende der 16S rRNA (ribosomale RNA), und sie fördern wahrscheinlich das Binden von mRNA an Ribosomen durch Paaren mit der rRNA, um das richtige Anordnen des Ribosoms zu gestatten (J. Shine und L. Dalgarno, Nature, 254:34-38, 1975).
Die erfolgreiche Expression eines klonierten Gens erfordert genügend Transcription der DNA, Translation der mRNA und, in einigen Fällen, die nach der Translation ausgeführte Modifikation des Proteins. Expressionsvektoren wurden eingesetzt, um Gene unter der Kontrolle eines aktiven Promotors in einem geeigneten Wirt zu exprimieren und die Proteinproduktion zu erhöhen.

Vaccine

Die Entwicklung von Vaccinen für die Verhinderung viraler, bakterieller, fungaler oder parasitärer Erkrankungen steht im Brennpunkt von großen Forschungsanstrengungen.
Traditionelle Wege zum Herstellen von Vaccinen schließen den Einsatz inaktivierter oder geschwächter Pathogene ein. Eine geeignete Inaktivierung des pathogenen Mikroorganismus macht ihn harmlos als ein biologisches Mittel, zerstört aber nicht seine Immunogenität. Das Injizieren dieser "getöteten" Teilchen in einen Wirt bewirkt eine Immunreaktion, die eine zukünftige Infektion mit einem lebenden Mikroorganismus verhindert. Eine Hauptsorge beim Einsatz getöteter Vaccine (unter Anwendung inaktivierten Pathogens) ist jedoch, daß nicht alle Mikroorganismus-Teilchen inaktiviert sein könnten. Selbst wenn dies geschehen ist, ist die erworbene Immunität, da sich die getöteten Pathogene nicht in ihrem Wirt vermehren oder aus anderen unbekannten Gründen, häufig unvollständig, kurzlebig und erfordert mehrfache Immunisierung. Schließlich kann das Inaktivierungsverfahren die Antigene des Mikroorganismus ändern, was sie weniger wirksam als Immunogene macht.
Die Schwächung bezieht sich auf die Herstellung von Stämmen pathogener Mikroorganlsmen, die ihre Krankheit erzeugende Fähigkeit im wesentlichen verloren haben. Ein Weg hierzu besteht darin, den Mikroorganismus ungewöhnlichen Wachstumsbedingungen und/oder einem häufigen Durchgang in der Zellkultur zu unterwerfen. Es werden dann Mutanten ausgewählt, die ihre Virulenz verloren haben aber noch fähig sind, eine Immunreaktion herauszufordern. Geschwächte Pathogene ergeben häufig gute Immunogene, da sie sich tatsächlich in der Wirtszelle vermehren und eine lange andauernde Immunität hervorrufen. Es werden jedoch beim Einsatz lebender Vaccine mehrere Probleme angetroffen, wobei das Problematischste die ungenügende Schwächung und das Risiko der Rückkehr der Virulenz sind. Eine Alternative zu den obigen Verfahren ist der Einsatz von Untereinheit-Vaccinen. Dies schließt die Immunisierung mit nur solchen Komponenten ein, die das relevante, immunologische Material enthalten.
Vaccine werden häufig mit verschiedenen Adjuvatien formuliert und inokuliert. Die Adjuvantien unterstützen ein dauerhafteres und höheres Niveau der Immunität unter Einsatz geringerer Mengen von Antigen oder einer geringeren Anzahl von Dosierungen, als wenn das Immunogen allein verabreicht würde. Der Mechanismus der Wirkung des Adjuvans ist komplex, und er wird nicht vollständig verstanden. Er kann jedoch die Stimulierung der Cytokin-Produktion, Phagozytose und andere Aktivitäten des retikuloendothelialen Systems sowie eine verzögerte Freigabe und einen Abbau des Antigens stimulieren. Beispiele von Adjuvantien schiießen Freund's Adjuvans (vollständiges oder unvollständiges), Adjuvans 65 (enthaltend Erdnußol, Mannidmonooleat und Aluminiummonostearat), das Polyol L-121 von Pluronic, Avridin und Mineralgele, wie Aluminiumhydroxid, Aluminiumphosphat, usw., ein. Freund's Adjuvans wird in Vaccin-Formulierungen für Menschen nicht länger benutzt, weil es nicht-metabolisierbares Mineralöl enthält und ein potentielles Carcinogen ist.
Es wurde gezeigt, daß lebende, geschwächte Salmonelle in der Lage sind, eine schützende Immunreaktion gegen Angriff durch den homologen, virulenten Stamm zu stimulierene (R. Germanier und E. Furer, J. Infect Dis., 181, 533, 1975; R. Germanier in Bacterial Vaccines, Academic Press, New York, Seiten 137-165, 1984; M.M. Levine et al., Microbiol. Rev., 47, 510, 1983; M.H. Wahdan et al., J. Infect. Dis., 145, 292, 1982; S.K. Hoiseth und B.A.D. Stocker, Nature, 291, 38, 1981; B.A.D. Stocker et al., Dev. Biol. Std., 53, 47, 1982; A.A. Lindberg und J.A. Robertsson, Infect. Immun., 41, 751, 1983; J.A. Robertsson et al., Infect. Immun., 41, 742, 1983; B.P. Smith et al., Am. J. Vet. Res., 45, 2231, 1984; B.P. Smith et al., Am. J. Vet. Res., 45, 59, 1984; I. Moser et al., Med. Microbiol., Imm., 168, 119, 1980). Zusätzlich haben verschiedene Forscher geschwächte Salmonella benutzt, die Plasmide beherbergen, die für Fremdantigene codieren, um diese Fremdantigene an das Immunsystem abzugeben (S.B. Formal et al., Infect. Immun., 34, 746, 1981; US-PS 4,632,830 von Formal et al.; J.D. Clements et al., Infect. Immun., 53, 685, 1986; D.J. Maskell et al., Microb. Path., 2 211, 1987; A. Brown et al., J. Infect. Dis., 155, 86, 1987; G. Dougan et al., Parasit Immun., 9, 151, 1987).
Das wiederkehrende, immundominante Epitop, das mit dem Circumsporozoit-Protein von Plasmodium verbunden ist, wird als Ziel bzw. Target der schützenden humoralen (und möglicherweise zellvermittelten) Reaktionen gegen Malaria-Sporozoiten angesehen (L.H. Miller et al., Science, 234, 1349, 1986); es wurden monoklonale Antikörper beschrieben, die diese Moleküle erkennen und in der Lage sind, natürliche Empfängertiere passiv zu schützen. Zwei Vaccine, die auf diesen wiederkehrenden Epitopen beruhen, wurden in Menschen getestet, und es wurde gezeigt, daß sie eine schützende Immunreaktion in einigen Personen induzieren (W.R. Ballou et al., Lancet, i, 1277, 1987; D. Herrington et al., Nature, 328, 257, 1987).
Choleratoxin ist der Prototyp einer Familie bakterieller Enterotoxine, die Diarrhö verursachen und in Struktur, Funktion und Immunogenität verwandt sind. Andere Mitglieder dieser Familie schiießen das hitzelabile Toxin von E. coli ein, das aus Menschen (T. Yamamoto und T. Yokota, J. Bacteriology, 155, 728, 1983) und aus Schweinen isoliert wird (J. Leong et al., Infect. Immun., 48, 73, 1985) sowie Toxine aus Salmonella tvphimurium (R.R. Finkelstein et al., FEMS Microbiology Letters, 17, 239, 1983) sowie aus Campylobacter jejuni (R.I. Walker et al., Microbiology Rev., 50, 81, 1986). All diesen Toxinen ist eine A-Untereinheit gemeinsam, die ADP-Ribosyltransferase-Aktivitat vermittelt, die in der Aktivierung von Adenylat-Cyclase resultiert und schließlich zum Tode der Zielzelle führt. Zusatzlich enthalten alle diese Toxine eine immunologisch dominante B-Untereinheit die das Verbinden des Holotoxins mit der Zielzelle vermittelt. Die B Untereinheit selbst ist nicht toxisch, und die Immunisierung mit diesem Molekül induziert die Bildung Toxin-neutralisierender Antikörper.
Vaccine auf der Grundlage der Bildung von Toxin-neutralisierenden Antikörper-Reaktionen durch Immunisierung mit den nicht toxischen Untereinheiten von bakteriellen Exotoxinen (Cholera-toxin, hitzelabiles Toxin von E coli) wurden vorgeschlagen (C.O. Jakob et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80:7611, 1983; C.O. Jakob et al., EMBO J., 3:2889, 1984).
Das Hepatitis B-Virion ist eine von einem Mantel umgebene 42nm Struktur, die ein kleines DNA-Genom enthält. Die Mantelproteine werden durch das S-Gen (preS, preS&sub2; und S) codiert, einen der vier offenen Leserahmen des HBV-Genoms (P. Tiollais et al., Nature., 317:489, 1985). Diese Polypeptide enthalten das Oberflächenantigen der Hepatitis B (HBsAg). HBsAg- Teilchen, die aus menschlichem Plasma oder ahnlichen HBsAg-Teilchen gewonnen sind, hergestellt durch rekombinante DNA-Verfahren (von denen es einigen an preS-Epitopen mangelt) verursachen eine schützende Immunreaktion, und die gereinigten Teilchen stellen derzeitige Vaccine für HBV dar (S. Krugman, J. Am. Med. Assoc., 241:2012, 1982).

Flaggelin

Geißeln sind Organellen für die Bewegung von Bakterienzellen. Die Synthese von Strukturproteinen und die tatsächliche Funktion der zusammengesetzten Geißeln ist ein komplexer Prozeß, der die Wechselwirkungen vieler Gene und Genprodukte einschließt (Übersicht von T. lino, Ann. Rev. Genet., 11:161, 1977). Es wurden mehr als 35 Gene definiert, die eine Rolle bei der Geißelfunktion in E coli spielen, und es wurden Genprodukte für mindestens siebzehn von diesen identifiziert. Die tatsächliche Geißel-Organelle ist aus drei strukturellen Hauptelementen zusammengesetzt und spannt sich vom Zellcytoplasma über die Zellmembranen und kulminiert in einer großen, extrazellularen Domäne. Das Filament ist aus einem einzelnen Untereinheit-Protein, Flaggelin, zusammengesetzt und ist die strukturelle Hauptkomponente der Organelle, die mehr als 95% der Gesamtmasse aufweist. Die Strukturgene für Flaggelin wurden H1 und H2 in Salmonella (T. Iino, Bacteriol. Rev., 33:454-475, 1969), H in Bacillus subtilis (T.M. Joys und R.W. Frankel, J. Bacteriol., 94:32-37, 1967) und Pseudomonas aeruginosa (T. Iino, Ann. Rep., Natl. Inst. Genet. Jpn., 20:94, 1969) und hag in E coli (J.B. Armstrong und J. Adler, J. Bacteriol., 97:156-161, 1969) bezeichnet. Der Basalkörper ist der komplexeste Teil der Organelle, und er dient sowohl zum Verankern der Organelle an der Zelle als auch als Teil der motorartigen Vorrichtung, die das Filament dreht. Schließlich dient der Haken zum Befestigen des Filaments am Basalkörper.
Die Rotation des Filaments bzw. des fadenförmigen Zellfortsatzes ist für die durch die Geißel vermittelte Bewegung verantwortlich. Jedes Filament besteht aus mehreren tausend Kopien der Flaggelin-Untereinheit, die in einer spiralförmigen Struktur resultieren, die typischerweise eine Länge von 5-10 u aufweist (für die meisten E coli und Salmonella-Arten; P. MacNab, in Escherichia coli und Salmonella typhimurium, F.C. Neidhardt, Herausgeber, American Society for Microbiology, Washington, DC, Seiten 70-83). Es wurde beobachtet, daß Mutationen im Flaggelin-Strukturgen Änderungen in der Wirksamkeit der Filament-Bildung, Filament- Gestalt, Sensibilität gegenüber der flaggelotropen Phage und/oder der antigenen Spezifizität der Geißel erzeugen (S. Yamaguchi und T. Iino, J. Gen. Microbiol., 55.59-74, 1969, T. Iino et al., J. Gen. Microbiol., 81.37-45, 1974, T. Horiguchi et al., J. Gen. Microbiol., 91.139-149, 1975). Die Filaments werden durch sequenzielle Addition von Flaggelin-Monomeren am distalen Ende des wachsenden Filaments außerhalb der Zelle zusammengesetzt, und die Verlängerungsrate nimmt umgekehrt mit der Länge des Filarments ab, bis das Wachstum aufhört, wodurch die Filamentlänge reguliert wird.
Geißeln finden sich in erster Linie, obwohl nicht ausschließlich, auf der Oberfläche stabund spiral-förmiger Bakterien, einschließlich solcher der Gattungen Escherichia, Salmonella, Proteus, Pseudomonas, Bacillus, Campylobacter, Vibrio, Treponema, Legionella, Clostridia, Caulobacter und anderer. Diese Geißeln, obwohl sie die gleiche Funktion ausüben, sind über diese Gattungen hinsichtlich des Molekulargewichtes im Bereich von 28-66 kd polymorph. Einen hohe Grad des antigenen Polymorphismus sieht man selbst in einer einzelnen Gattung, wie Salmonella, und er ist brauchbar zum Identifizieren einzelner Serotypen innerhalb einer einzigen Art (P.R. Edwards und W.H. Ewing, Identification of Enterobacteriaceae, 3. Auflage, Burgess Publishing Co., Mineapolis, MN, 1972). Strukturanalysen der verschiedenen Bakterien- Geißeln haben eine gemeinsame Architektur bei den von verschiedenen Bakterien isolierten Filaments gezeigt (L.-N. Wei und T.M. Joys, J. Mol. Bio., 186:791, 1985; R.J. DeLange et al., J. Biol. Chem., 251:705, 1976; P.R. Gill und Agabian, J. Biol. Chem., 258:7395). Am überraschendsten ist ein hoher Grad der Homologie der Proteinsequenz an den Amino- und Carboxy-Enden dieser Moleküle sowie die Anwesenheit eines polymorphen Mittelabschnittes, der für die antigene Verschiedenheit zwischen den verschiedenen Geißeln verantwortlich ist.
Immunreaktionen eines Wirtes auf Antigene auf der Oberfläche von Bakterien wurden gut dokumentiert (S.A. Horowitz et al., Infect. Immun., 55:1314, 1987; Y. Naito et al., Infect. Immun., 55:832, 1987; Y.X. Zhang et al., J. Immunol., 138:575, 1987; M.V. Norgard, Infect. Immun., 54:500, 1986; L.K. Nagy, Vet. Rec., 117:408, 1985; M.M. Levine et al., Infect. Immun., 44:409, 1984; K. Zak et al., J. Infect. Dis., 149:166, 1984). Geißeln und besonders Geißel-Filaments wurden als potente Immunogene unter Bedingungen der natürlichen Infektion und der künstlichen Immunisierung gezeigt, und in einigen Fällen haben sich die Reaktionen auf antigene Determinanten, die auf Geißeln vorhanden waren, als schützend erwiesen (R.J. Young et al., Infect. Immun., 25:220, 1979; E.R. Eubanks et al., Infect. Immun., 15:533, 1976; H.L. Smith, Jr., App. Micro., 27:375, 1974; J.M. Dwyer und I.R. Mackay, Int. Arch. Allergy Appl. Imm., 43:434, 1972; J.L. Ebersole und J.A. Molinari, Infect. Immun., 13:53, 1976; J.L. Ebersole et al., Infect. Immun., 12:353, 1975; J.R. Stevenson und K.A. Stronger, Am. J. Vet. Res., 41:650, 1980; Y. Tamura et al., Micro. Imm., 28.1325, 1984). Kuwajima (J. Bact., 170:485, 1988) hat die Produktion von Mutanten von E coli mit geänderter Antigemtät der Geißel durch die Einfuhrung von Deletionen in den Mittelbereich des Flaggelin-hag-Gens beschrieben.
Die US PS 4,702,911 offenbart die Verwendung gereinigter Untereinheiten von Bakterienhaaren, haarartigen Organellen, die an der außeren Bakterienoberfläche befestigt sind, in Vaccin-Formulierungen.
Die internationale PCT-Veröffentlichung Nr. WO 87/02385, veröffentlicht am 23. April 1987, offenbart die Expression einer Proinsulin-Frequenz und einer β-Lactamase-Frequenz als Fusionsproteine mit dem Flaggelin-hag-Gen von B. Subtilis.
Die vorliegende Erfindung ist auf rekombinante Gene und ihre codierten Proteine gerichtet, die rekombinante Flaggelin-Fusionsproteine sind. Solche Proteine umfassen ein Epitop, das durch ein funktionales Flaggelin-Strukturgen codiert wird, derart, daß der Flaggelinteil des Proteins eine beträchtliche Antigenität beibehält und mindestens ein Epitop eines heterologen Organismus, wobei das Epitop kein Epitop eines Flaggelingens ist, beim Einführen des Fusionsproteins in einen Wirbeltier-Wirt immunogen ist. Diese Epitope werden durch B-Zellen- und/oder T- Zellen-Epitope erkannt. Das Epitop eines heterologen Organismus kann in einen Bereich eingeführt werden, der für die Funktion des codierten Flaggelins nicht wesentlich ist, dessen Funktion jedoch nicht zerstört, wie den hypervariablen Bereich des Flaggelin-Strukturgens. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird das Epitop eines heterologen Organismus zwischen den natürlichen EcoRV-Stelien des H1-d-Gens von Salmonella eingeführt. Die rekombinanten Flaggelinproteine der Erfindung werden zur Zelloberfläche exportiert, wo sie sich, in einer bevorzugten Ausführungsform, zu funktionellen Geißeln zusammensetzen, die das heterologe Epitop enthalten. In anderen Ausführungsformen können die rekombinanten Flaggelin-Fusionsproteine der Erfindung eine zellulare, eine Schleimhaut- oder eine humorale Reaktion provozieren.
Die rekombinanten Flaggelingene und -proteine können zum Einsatz als Vaccine zum Schutz gegen Infektion durch den heterologen Organismus formuliert werden. Sie können auch Schutz gegen Zustände oder Störungen bieten, die durch ein Antigen des heterologen Organismus verursacht werden. Die Expression als ein rekombinantes Flaggelin-Fusionsprotein gemäß der vorliegenden Erfindung schafft ein Verfahren zum Herstellen irgendeines erwünschten Epitops in einer immunogenen Form, um Immunreationen zu stimulieren, einschließlich humoraler, Schleimhaut- und/oder zellvermittelter Immunreaktionen. In einer spezifischen Ausführungsform können die rekombinanten Flaggelingene der vorliegenden Erfindung durch abgeschwächte Invasionsbakterien in lebenden, oralen Vaccin-Formulierungen exprimiert werden. In einer anderen spezifischen Ausführungsform können die rekombinanten Flaggelin-Fusionsproteine zur Verwendung in Untereinheit-Vaccinen formuliert werden.
In spezifischen Ausführungsformen der Erfindung, die detailliert im Beispielabschnitt angegeben sind, werden Epitope von circumsporozoiden Antigenen der Malaria, der B-Untereinheit des Choleratoxins, Oberflächen- und Voroberflächen-Antigene von Hepatitis B, das VP7- Polypeptid des Rotavirus, Hüllenglykoprotein von HIV und M-Protein von Streptococcus auf rekombinanten Flaggelin-Fusionsproteinen exprimiert, die sich zu funktionellen Geißeln zusammensetzen und eine Immunreaktion provozieren, die sich gegen das heterologe Epitop in einem Wirbeltier-Wirt richtet.

Definitionen

bp = Basenpaare
CRM197 = mutiertes Diphtherietoxin-Molekül
CS = Circumsporozoit
CT-B = B-Untereinheit von Choleratoxin
CTP3 = ein Peptid, das die Aminosäurerest-Nummern 50 bis 64 der B-Untereinheit von Choleratoxin repräsentiert (C.O. Jakob et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:7893, 1984)
DPAPPNAN = Peptid (asp-pro-ala-pro-pro-asn-ala-asn), das das immundominante, wiederkehrende Konsensus-Epitop des Circumsporozoit-Proteins von Plasmodium berghei repräsentiert
DTT = Dithiothreit
ELISA = "heterogener" Enzym-Immunoassay (enzyme-linked immunosorbent assay)
HBsAg = Oberflächenantigen von Hepatitis B
HW = menschliche Immuninsuffizienz verursachendes Virus
kd - Kilodalton
KLH = Hämocyanin einer Nacktschnecke (keyhole limpet) der Gattung Fissurella
Mab = monoklonaler Antikörper
NANP = Peptid (asn-ala-asn-pro), das das immundominante, wiederkehrende Epitop des Circumsporoit-Proteins von Plasmodium falciparum repräsentiert
PAGE - Polyacrylamid-Gelelektrophorese
PBS = Phosphat-gepufferte Salzlösung
RSV = mehrkerniger Atmungsvirus (respiratory syncytial virus)
VP7 = ein Hauptpolypeptid der Außenhülle von Rotavirus

Beschreibung der Figuren

Figur 1. Diagrammartige Darstellung der Plasmide pLS4O2, pPX1651 und pLS408, die für das Flaggelin-Strukturgen H1-g codieren. Plasmid pLS402 wurde aus einer Genbank von Salmonella muenchen DNA isoliert, die in pBR23 konstruiert war (L.-N. Wei und T.M. Joys, J. Mol. Biol., 186:791, 1985). Der für das Flaggelingen H1-d codierende Bereich (geschwärzte Fläche) ist in einem 3,8 kb EcoRI Genomfragment vorhanden und enthält zwei EcoRV-Restriktionsstellen. Eine zusätzliche EcoRV-Stelle ist auf dem Vektor vorhanden. Die beiden Subklone, die Plasmide pPX1651 und pLS408, wurden konstruiert, indem man zuerst das 3,8 kb Genomfragment von pLS402 in die EcoRI-Stelle von pUC18 bzw. pUC19 einführte, was die Konstruktionen pPX1650 bzw. pLS405 ergab. Das 51bp EcoRV-Fragment wurde dann aus jedem dieser Plasmide entfernt, was zu den Plasmiden pPX1651 und pLS4O8 führte, die nun jeweils eine einzigartige EcoRV-Restriktionsstelle für die Einführung von Oligonucleotiden aufwiesen, die ein Fremdepitop spezifizieren.
Figur 2A. Schematische Darstellung des Flaggelinproteins H1-d. Die hypervariable Region IV ist durch Schraffieren hervorgehoben. Die Stellen der EcoRV-Resfriktionsstellen in der entsprechenden Gensequenz sind angegeben.
Figur 2B. Nucleotid- und abgeleitete Aminosäure-Sequenz des Flaggelingens H1-d (aus: L.-N. Wei und T.M. Joys, J. Mol. Biol., 186:791, 1985). Die EcoRV Restriktionsstellen sind unter strichen.
Figur 3A. Nucleotid- und abgeleitete Aminosäure-Sequenz von synthetischen Oligonucleotiden, die für drei vollständige und zwei halbe Kopien des immundominanten, wiederkehrenden bzw- Repeat-Epitops des Circumsprorozoitproteins von P. falciparum codieren (NANP).
Figur 3B. Nucleotid- und abgeleitete Aminosäure-Sequenz von synthetischen Oligonucleotiden, die für zwei Kopien des immundominanten Konsensus-Repeatepitops des Circumsporozoitproteins von P. berghei codieren (DPAPPNAN).
Figur 4A. Schematische Darstellung des Proteins der B-Untereinheit des Choleratoxins, die die Stelle des CTP3-Epitops darstellt.
Figur 4B. Nucleotid- und abgeleitete Aminosäure-Sequenzen synthetischer Oligonucleotide, die für das CTP3-Epitop der B-Untereinheit des Choleratoxins codieren. Wärmebehandelte (annealed) Oligonucleotide wurden mit Klenow-Enzym behandelt, um vor der Ligation in den Plasmidvektor glatte Enden zu erzeugen, wie in Beispiel 1 beschrieben.
Figur 5. Schematische Darstellung der rekombinanten Flaggelin-Fusionsproteine, die, wie in Beispiel 1 beschrieben, konstruiert sind. Die schraffierten Flächen stellen die heterologen Sequenzen von den CS-Proteinen von P. falciparum oder P. berghei oder die B-Untereinheit des Choleratoxins (CT-B) dar, wie angegeben.
Figur 6. Western Blot-Analyse rekombinanter Flaggeline, die in abgeschwächter Salmonella exprimiert sind. Zellextrakte wurden einer Elektrophorese unterworfen und auf Nitrozellulose-Filter übertragen, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die zum Nachweisen rekombinanter Flaggelin-Moleküle eingesetzten Antikörper-Sonden waren: Teil A: Kaninchen-anti-H1-d-Antiserum; Teil B: Anti-P. berghei-Circumsporozoit Mab 3,28; Teil C: Anti-P. falciparum-Circumsporozoit Mab 4D9; Teil D: Kaninchen-anti-Choleratoxin-Aminosäurereste 50-64 (CTP3 Peptid) Peptidserum. Die Plasmid-Konstruktionen und Wirtsstämme sind oberhalb jeder Spur angegeben.
Figur 7. Nachweis des Antikörpers zum Malaria-Circumsporozoit (CS)-Epitop in Mäusen, die mit rekombinanten Flaggelin-Proteinen immunisiert sind. Die Mäuse wurden immunisiert und mit partiell gereinigter Wild-Typ H1-d-Flagella (codiert durch Plasmid pPX1650) oder rekombinanter Flagella, enthaltend zwei Kopien des immundominaten CS-Repeats von P. berghei (codiert durch Plasmid pPX1661) unterstützt. Reihenverdünnungen von Seren, erhalten 0, 4 und 6 Wochen nach der primären Immunisierung aus diesen Tieren, wurden mittels ELISA auf Binden mit synthetischen Peptiden untersucht, bestehend aus zwei Kopien des CS-Repeats von P. berghei, gekoppelt an ein Hämocyanin der Nacktschnecke der Gattung Fissurella (KLH). Die angegebenen Daten sind Mittelwerte, errechnet von fünf einzelnen Tieren pro Gruppe. a: Plasmid pPX1650 bei Woche 0; b: Plasmid pPX1650 bei Woche 4; c: Plasmid pPX1650 bei Woche 6; d: Plasmid pPX1661 bei Woche 0; e: Plasmid pPX1661 bei Woche 4; f: Plasmid pPX1661 bei Woche 6.
Figur 8. Nachweis des Antikörpers auf das Malaria-Circumsporozoit (CS)-Epitop in Mäusen, die mit lebender, abgeschwächter Salmonella immunisiert waren, die rekombinante Flagge lin Fusionsproteine exprimiert. Die Mause wurden immunisiert und unterstützt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Reihenverdünnungen von Seren, die aus diesen Tieren bei den Wochen 2, 4 und 6 nach der primären Immunisierung erhalten wurden, wurden mittels ELISA hinsichtlich des Bindens an synthetische Peptide untersucht, bestehend aus zwei Kopien von CS-Repeat von P. berghei, gekoppelt an KLH. Die gezeigten Daten sind Mittelwerte, errechnet von fünf einzelnen Tieren pro Gruppe, ausgenommen für Woche 6, wo nur ein Tier pro Gruppe übrigblieb. a: Plasmid pPX1650 bei Woche 0; b: Plasmid pPX1650 bei Woche 4; c: Plasmid pPX1650 bei Woche 6; d: Plasmid pPX1662 bei Woche 0; e: Plasmid pPX1662 bei Woche 4; f: Plasmid pPX1662 bei Woche 6.
Figur 9 zeigt ein Histogramm von Antiköper-Reaktionen von fünf Mäusen, die mit SL5929, einem Vaccin aus mit Formalin getöteten Salmonella dublin, immunisiert wurden, das das CT3-Epitop der B-Untereinheit von Choleratoxin exprimiert.
Figur 10 zeigt Aminosäure- und synthetische Oligonnucleotid-Sequenzen von HBsAg (ayw) S 122-137 und preS&sub2; 120-145 sowie eine Karte des Flagellingens. Der geschwärzte Bereich repräsentiert die hypervariable Region. H ist HindIII, R ist EcoRV, P ist PstI und K ist KpnI.
Figur 11 zeigt die Eigenschaften von geklonten Rekombinanten von Plasmid pLS405.
Figur 12 zeigt Antikörper-Reaktionen von intramuskulär mit lebendem S. dublin-SL5928, das mit S16 oder pS21 transformiert ist, immunisierten Kaninchen.
Figur 13 zeigt Antikörper-Reaktionen in Mäusen, die oral mit lebendem SL5928 immunisiert sind, das ein HBsAg-Epitop exprimiert. Jedes "X" repräsentiert den Antikörper-Titer einer einzelnen Maus.
Figur 14 zeigt Daten, die mit SJL-Mäusen erzeugt wurden, die mit Primer aus rekombinanter Flagella, natürlicher Flagella oder CRM197-Protein versehen waren und Lymphknotenzellen in vitro mit gereinigtem, synthetischem Peptid restimuliert wurden, das für Aminosäuren 366-388 des CRM97-Proteins codiert.
Figur 15 zeigt Daten, die wie in Figur 14 mit mit Primer versehenen Lymphknotenzellen erzeugt wurden, die mit gereinigtem CRM197-Protein stimuliert wurden.

Detaillierte Beschreibung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf rekombinante Flagellin-Strukturgene, die als rekombinante Flagellin-Fusionsproteine exprimiert werden. Solche rekombinanten Gene umfassen eine Sequenz, die für ein Epitop codiert, das durch ein Flagellin-Strukturgen spezifiziert wird sowie eine Sequenz, die für ein Epitop eines heterologen Organismus codiert, das bei Einführung des Fusionsproteins in einen Wirbeltier-Wirt immunogen ist. Das Epitop eines heterologen Organismus kann in eine Region eingeführt werden, die für die Funktion des codierten Flagellins nicht wesentlich ist. Eine solche Einfügung sollte jedoch nicht die Geißelfunktion zerstören. In einer bevorzugten Ausführungsform kann das Epitop eines heterologen Organismus in die hypervariable Region des Flagellin-Strukturgens (zum Beispiel zwischen den natürlichen EcoRV-Stellen des H1-d-Gens von Salmonella) eingeführt werden.
Die Erfindung bezieht sich auch auf durch solche Gene codierte Fusions-Flagelline sowie die Verwendungen dieser Gene und Proteine in Vaccin-Formulierungen zum Schutz gegen Infektion durch den heterologen Organismus oder zum Schutz gegen Zustände und Störungen, die durch ein Antigen des Organismus verursacht werden. Die Expression als ein rekombinantes Flagellin-Fusionsprotein gemäß der vorliegenden Erfindung schafft ein Verfahren zum Präsentieren irgendeines erwünschten Epitops in einer immunogenen Form, um Immunreaktionen (einschließlich humoraler, Schleimhaut- und/oder zellvermittelter Immunreaktionen) zu stimulieren. In einer spezifischen Ausführungsform können die rekombinanten Flagellingene der Erfindung durch abgeschwächte Invasionsbakterien in einer lebenden Vaccin-Formulierung exprimiert werden. In einer anderen spezifischen Ausführungsform können die rekombinanten Flagellin-Fusionsproteine zur Verwendung in Untereinheit-Vaccinen formuliert werden.
In spezifischen Ausführungsformen der Erfindung, die in den weiter unten folgenden Beispielen detailliert beschrieben sind, werden Epitope von Circumsporozoit-Antigenen der Malaria, die B-Untereinheit von Choleratoxin, Oberflächen- und Preoberflächen-Antigene von Hepatitis B, VP7-Polypeptid-Antigene von Rotavirus, Hüllen-Glykoprotein von HIV und M-Protein von Streptococcus pyogenes auf rekombinanten Flagellin-Fusionsproteinen exprimiert, die sich zu funktionellen Geißeln zusammensetzen, und die in einem Wirbeltier-Wirt eine gegen das heterologe Epitop gerichtete Immunreaktion produzieren.
Das Verfahren der Erfindung kann für die Zwecke der Beschreibung in die folgenden allgemeinen Stufen unterteilt werden:
a. Isolation des Flagellingens;
b. Isolation von Sequenzen, die für immunogene Epitope zur Expression als rekombinante Flagelline codieren;
c. Konstruktion rekombinanter Flagellingene;
d. Expression in Bakterien-Wirten
e. Bestimmung der Immunpotenz des(der) heterologen Epitops(e), das bzw. die als ein rekombinantes Flagellin exprimiert ist bzw. sind und
f. Formulierung eines Vaccins.
Die Erfindung betrifft weiter ein Verfahren zum Erzielen einer Immunreaktion (einschließlich humoraler, Schleimhaut- und/oder zellvermittelter Immunreaktionen) durch Verabreichen eines einer Transfektion unterworfenen Bakteriums, das ein rekombinantes Flagellin-Fusionsprotein dieser Erfindung exprimiert, in einem physiologisch akzeptablen Träger, an einen Wirbeltier-Wirt. Vorzugsweise lebt das Bakterium und ist infektiös, kann jedoch keine signifikante Erkrankung im Wirbeltier-Wirt verursachen. Alternativ kann das rekombinante Flagellin-Fusionsprotein selbst dem Wirt verabreicht werden, um eine Immunreaktion herauszufordern.
Zur Verhinderung von Mykosen können Pilze, die die in Tabelle I aufgeführten Fungi bzw. Pilze einschließen, auf diese aber nicht beschränkt sind, bekämpfende Vaccine benutzt werden (Braude et al., Infectious Diseases and Medical Microbiology, (1986); Feigin et al., Textbook od Pediatric Infectious Diseases 35, (1987); Mandell et al., Principles and Practice of Infectious Diseases, Section F, (1985)). Andere Verwendungen für Vaccine schließen das Verursachen von Antihormon-Reaktionen für solche Zwecke ein, wie Kontrazeption, Nahrungsmittelumwandlung und Hormon-Ungleichgewicht. Weitere Verwendungen schließen Antikrebs-Therapie und -Prophylaxe, Antiallergie-Therapie und die Herstellung immunprophylaktischer und immuntherapeutischer Mittel ein.

Isolation des Flagellingens

Für die Konstruktion eines rekombinanten Gens, das für ein Flagellin-Fusionsprotein codiert, das ein heterologes Epitop enthält, kann irgendein Flagellin-Strukturgen benutzt werden. Solche Flagellingene schließen die H1- und H2-Gene von Salmonella, H von Bacillus subtilis und Pseudomonas aeroginosa sowie hag von E coli ein, sind auf diese jedoch nicht beschränkt.
Mehrere der Flagellingene wurden geklont und sequenziert (siehe zum Beispiel G. Kuwajima et al., J. Bact. , 168:1479, 1986; L.-N. Wei und T.M. Joys, J. Mol. Biol., 186:791-803, 1985 und P.R. Gill und N. Agabian, J. Biol. Chem., 258:7395-7401, 1983, die durch Bezugnahme hier aufgenommen werden).
Ist das geklonte Flagellingen nicht leicht erhältlich, dann kann es nach im Stande der Technik bekannten Standardverfahren geklont werden (siehe zum Beispiel T. Maniatis et al., Molecular Cloning. A Laboratorv Manual, Cold Spring Habor Laboratory, Cold Spring Habor, New York, 1982), wobei irgendeine mit Geißeln versehene Bakterienzelle potentiell als die Nucleinsäurequelle für das molekulare Klonen dient. Solche Bakterien schließen ein Escherichia, Salonella, Proteus, Pseudomonas, Bacillus, Campylobacter, Vibrio, Treponema, Legionella, Clostridia und Caulobacter, doch sind sie auf diese nicht beschränkt.
Die Nucleotidsequenz-Analyse des geklonten Gens kann auch nach verschiedenen Verfahren ausgeführt werden, die im Stande der Technik bekannt sind, zum Beispiel dem Verfahren von Maxam und Gilbert (Med. Enzymol., 65:499-560, 1980), dem Dideoxyverfahren von Sanger (F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74:5463, 1977) oder unter Einsatz einer Vorrichtung zum automatischen Herstellen von DNA-Sequenzen (zum Beispiel Applied Biosystems, Foster City, CA).

Isolation von Seauenzen, die für immunogene Epitope zur Expression als rekombinante Flagelline codieren

Irgendeine DNA-Sequenz, die für ein Epitop eines heterologen Organismus codiert, das, wenn es als ein Flagellin-Fusionsprotein exprimiert wird, eine schützende Immunität gegen solche Organismen oder gegen einen Zustand oder eine Störung erzeugt, die durch ein Antigen erzeugt wird, kann zum Einsatz in den Vaccin-Formulierungen der vorliegenden Erfindung isoliert werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist ein solcher Organismus ein pathogener Mikroorganismus. So kann zum Beispiel ein solches heterologes Epitop auf Bakterien, Parasiten, Viren oder Fungi gefunden werden, die die Verursacher von Krankheiten oder Störungen sind. Zusätzlich können Epitope von Allergenen und Krebszellen benutzt werden. Solche Bakterien, Parasiten, Viren oder Fungi schließen die in Tabelle I aufgeführten ein, sind auf diese jedoch nicht beschränkt. TABELLE I HETEROLOGE ORGANISMEN, AUS DENEN DNA ZUR KONSTRUKTION VON GENEN ISOLIERT WERDEN KANN, DIE FÜR FLAGELLIN-FUSIONSPROTEINE CODIEREN PARASITEN: Plasmodium spp. Eimeria spp. Schistosoma spp. Trypanosoma spp. Babesia spp. Leishmania spp. Cryptosporidia spp. Toxoplasma spp. Pneumocystis spp. BAKTERIEN: Vibrio cholerae Streptococcus pyogenes Neisseria menigitidis Neisseria gonorrhoeae Corynebacteria diphtheriae Clostrydium tetani Branhamella catarrhalis Bordetella pertussis Haemophilus spp. (z.B. infiuenzae) Chlamydia spp. Enterotoxigenes Escherichia coli VIREN: Menschlicher Immuninsuffiziens-Virus, Typ I Menschlicher Immuninsuffiziens-Virus, Typ II Simian Immuninsuffiziens-Virus Menschlicher T-Lymphozyten-Virus, Typ I, II und III Mehrkerniger Atmungsvirus Hepatitis A-Virus Hepatitis B-Virus Hepatitis C-Virus Non-A-, Non-B-Hepatitis-Virus Herpes-simplex-Virus, Typ I Herpes-simplex-Virus, Typ II Zytomegalie-Virus Influenzavirus VIREN (Fortsetzung): Parainfluenza-Virus Poliovirus Rotavirus Coronavirus Rubella-Virus Masernvirus Mumps-Virus Varizellen Epstein-Barr-Virus Adenovirus Papilloma-Virus Gelbfieber-Virus FUNGI: Candida spp. (speziell albicans) Cryptococcus spp. (speziell neoformans) Blastomyces spp. (dermatitidis) Histoplasma spp. (speziell capsulatum) Coccidroides spp. (speziell immitis) Paracoccidroides spp. (speziell brasiliensis) Aspergillus spp.
In einer anderen Ausführungsform kann ein Epitop eines Antigens eines Nematoden als ein Fusionsprotein exprimiert werden, um gegen durch solche Würmer verursachte Störungen zu schützen.
Potentiell brauchbare Antigene für Vaccin-Formulierungen können durch verschiedene Kriterien identifiziert werden, wie Einbeziehung des Antigens in die Neutralisation der Anstekkungsfähigkeit eines Pathogens (E. Norrby, 1985, Summary in Vaccines 85, R.A. Lerner, R.M. Chanock und F. Braun (Herausgeber), Cold Spring Habor Laboratory, Cold Spring Habor, New York, Seiten 388-389), Art- oder Gruppen-Spezifität, Erkennung durch die Antiseren oder Immunzellen des Patienten und/oder die Demonstration schützender Wirkungen von Antiseren oder Immunzellen, die für das Antigen spezifisch sind. Zusätzlich sollte das codierte Epitop des Antigens vorzugsweise eine geringe oder keine antigene Variation mit der Zeit oder zwischen verschiedenen Isolaten des gleichen Pathogens zeigen.
In einer bevorzugten Ausführungsform codiert die heterologe Sequenz für ein immundominantes Epitop eines Pathogens. Zusätzlich können auch Moleküle, die Haptene (d.h. antigen aber nicht immunogen) sind, als rekombinantes Flagellin exprimiert werden, da das Flagellin als ein Tragermolekül beim Übertragen der Immunogenität auf das Hapten wirken kann. Rekombinante Flagelline, die Epitope enthalten, die mit Antikörper reagieren, obwohl sie nicht in der Lage sind Immunreaktionen hervorzurufen, haben potentielle Verwendung in Immunoassays.
Peptide oder Proteine, von denen bekannt ist, daß sie antigene Determinanten enthalten, können in rekombinante Flagelline eingebaut werden. Sind spezifische Antigene unbekannt, dann sollte die Identifikation und Charakterisierung von immunreaktiven Sequenzen ausgeführt werden. Ein Weg, dies auszuführen, besteht in der Verwendung von monoklonalen Antikörpern, die auf die Oberfläche oder andere Moleküle eines Pathogens hin erzeugt werden. Die Peptidsequenzen, die durch die Antikörper erkannt werden können, sind als Epitope bezeichnet. Alternativ können kleine synthetische Peptide, die zu Trägermolekülen konjugiert sind, zur Erzeugung monoklonaler Antikörper getestet werden, die sich mit den Stellen verbinden, die dem Peptid auf dem intakten Molekül entsprechen (siehe zum Beispiel I.A. Wilson et al., Cell, 37:767, 1984). Andere im Stande der Technik bekannte Verfahren, die zur Identifikation und Charakterisierung antigener Determinanten benutzt werden können, liegen auch im Rahmen der Erfindung.
In einer spezifischen Ausführungsform kann irgendeine DNA-Sequenz, die für ein Plasmodium-Epitop codiert, das, wenn es als Flagellin-Fusionsprotein exprimiert wird, in einem Wirbeltier-Wirt immunogen ist, zur Verwendung gemäß der vorliegenden Erfindung isoliert werden. Die Arten von Plasmodium, die als DNA-Quellen dienen können, schließen die menschlichen Malaria-Parasiten P. falciparum, P. malariae, P. ovale, P. vivax und die tierischen Malaria-Parasiten P.berghei, P. voelii P. knowlesi und P. cynomolgi ein, sind jedoch auf diese nicht beschränkt. Die Antigene oder Fragmente davon, die als Flagellin-Fusionsproteine exprimiert werden können, sind Antigene, die vom Malaria-Parasit in irgendeinem der verschiedenen Stadien seines Lebenszyklus exprimiert werden können, wie dem Sporozoit-, Exoerythrozyt- (Entwicklung in Leberparenchymzellen), asexuellen Erythrozyt- oder sexuellen (zum Beispiel Gameten, Zygoten, Ookineten) Stadien. In einer besonderen Ausführungsform ist das zu exprimierende, heterologe Epitop ein Epitop des Circumsporozoit(CS)-Proteins einer Art von Plasmodium (siehe Beispiel 1). Analoge CS-Proteine wurden auf den Oberflächen von Sporozoiten aller getesteten Arten von Plasmodium identifiziert. Circumsporozoitprotein-Antigene, die in abgeschwächten Salmonella spp. exprimiert sind, können als lebende Vaccine gegen Sporozoiten, die invasive Form von Malaria-Parasiten, eingesetzt werden, die durch das weibliche Anopheles- Moskito übertragen wird. Irgendein Epitop einer Region des CS-Proteins, das für die Induktion schützender, humoraler oder zellvermittelter Immunreaktion wichtig ist, kann in den Vaccin- Formulierungen der vorliegenden Erfindung benutzt werden (siehe zum Beispiel J.B. Dame et al., Science, 225, 593, 1984; D.D. Arnot et al., Science, 230, 815, 1985; Weber et al., Exp. Parasitol., 63, 295, 1987; V. Enea et al., Science, 225, 628, 1984; V. Enea et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, 7520, 1984; G.N. Godson et al., Nature, 305, 29, 1983 und T.F. McCutchan et al., Science, 230, 1381, 1985, die durch Bezugnahme hier aufgenommen werden). In einer Ausführungsform kann zum Beispiel das Peptid asn-ala-asn-pro-, das das immundominante CS-Repeatepitop von P. falciparum repräsentiert, durch die rekombinanten Bakterien der Erfindung exprimiert werden. In einer anderen Ausführungsform kann das Peptid asp-pro-ala-pro-pro-asn- ala-asn, das das immundominate Repeatepitop des CS-Proteins von P. berghei repräsentiert, exprimiert werden.
In einer anderen spezifischen Ausführungsform kann das Th2R-Epitop (M.F. Good et al., Science, 235, 1059, 1987) des CS-Proteins von P. falciparum als ein rekombinantes Flagellin-Protein in den Vaccin-Formulierungen der vorliegenden Erfindung exprimiert werden.
In noch einer anderen Ausführungsform umfaßt das als ein rekombinantes Flagellin-Fusionsprotein zu exprimierende heterologe Epitop ein Peptid der B-Untereinheit des Choleratoxins. Geeignete Peptide sind von Jacob et al. beschrieben. Wie durch Jacob et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80, 7611, 1983) beschrieben, wurden Peptide, die verschiedenen Regionen der B-Untereinheit von Choleratoxin entsprechen, synthetisiert und mit einem immunogenen Träger gekoppelt, um Epitope zu definieren, die neutalisierende Antikörper induzieren. Wurden diese Konjugate zur Vermehrung von Antikörpern in Kaninchen benutzt, dann induzierte eines davon, das für Aminosäuren 50-64 (Peptid CTP3) codiert, Antikörper, die das natürliche Toxin erkannten und die die biochemischen (Adenylat-Cyclase-Aktivierung) und biologischen (intestinale Flüssigkeitssekretion) Wirkungen des intakten Holotoxins neutralisierten (C.O. Jacob et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, 7893, 1984).
Andere Epitope, die als Flagellin-Fusionsproteine exprimiert werden können, schließen die folgenden ein: Epitope des G-Proteins des mehrkernigen Atmungsvirus (RSV) (Collins et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81, 7683, 1984); neutralisierende Epitope auf Poliovirus I VP1 (E. Emini et al., Nature, 304, 699, 1983); neutralisierende Epitope auf Hüllen-Glykoproteinen von HIV I (S.D. Putney et al., Science, 254, 1392-1395, 1986); auf dem Oberflächenantigen von Hepatitis B vorhandene Epitope (Y. Itoh et al., Nature, 308, 19, 1986; A.R. Neurath et al., Vaccine, 4, 34, 1986); Epitope von Diphtherietoxin (F. Audibert et al., Nature, 289, 543, 1981); Streptococcus 24M-Epitop (E.H. Beachey, Adv. Exp. Med. Biol., 185, 193, 1985) und Epitope auf Gonococcenhaaren (J.B. Rothbard und G.K. Schoolnik, Adv. Exn. Med. Biol., 185, 247, 1985).
Die Flagellin-Fusionsproteine in den Vaccin-Formulierungen der Erfindung können auch ein Epitop eines heterologen Organismus umfassen, der, wenn das Fusionsprotein in einen Wirbeltier-Wirt eingeführt wird, eine Immunreaktion induziert, die gegen einen Zustand oder eine Störung schützt, die durch ein das Epitop enthaltendes Antigen verursacht wird. In dieser Ausführungsform der Erfindung können zum Beispiel Flagellin-Fusionsproteine, die für ein Epitop von Schlangengift, Bienengift, ein Hormon, Sperma (zur Kontrazeption), ein Allergie induzierendes Antigen oder irgendein anderes Antigen codiert, auf das eine Immunreaktion erwünscht ist, eingesetzt werden. In einer besonderen Ausführungsform kann ein Epitop eines Antigens von Fettzellen Membranen als ein rekombinantes Flagellin Protein zur Formulierung eines Vaccins exprimiert werden, um den Fettgehalt in Tieren zu vermindern, die als Nahrungsmittelquellen benutzt werden. In einer anderen Ausführungsform kann ein tumorspezfisches Antigen als ein rekombinantes Flagellin Fusionsprotein exprimiert werden, um eine schützende Immunreaktion gegen Krebs zu induzieren. In noch einer anderen Ausführungsform kann auch ein Epitop eines bakteriellen Enterotoxins als ein Flagellin-Fusionsprotein exprimiert werden. Die Nucleotid und abgeleiteten Aminosaure Sequenzen fur verschiedene bakterielle Enterotoxine wurden bestimmt (J.J. Mekalanos et al., Nature, 306, 551, 1983; J. Leong et al., Infect. Immun., 48, 73, 1985).
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung können DNA-Sequenzen, die für große Regionen von Proteinen codieren, die mehrere B-Zellen-Epitöpe (d.h. Epitope, die zur Induzierung einer humoralen Immunreaktion in der Lage sind) und T-Zellen-Epitope (d.h. Epitope, die zum Induzieren einer zellvermittelten Immunreaktion in der Lage sind) enthalten, in das Flagellin-Gen zur Expression als Flagellin-Fusionsproteine eingeführt werden. Durch Schaffen natürlicher T-Helferzellen-Epitope sowie von Antikörper induzierenden Epitopen kann man so durch Kontakt mit einem pathogenen, heterologen Organismus Empfänger zum Unterstützen mit Primer versehen.
Die Gensequenzen, die für das heterologe Epitop codieren, das gemäß der vorliegenden Erfindung als rekombinantes Flagellin zu exprimieren ist, können nach im Stande der Technik bekannten Techniken isoliert werden, die die Reinigung aus Genom-DNA des Mikroorganismus, cDNA-Synthese aus RNA des Mikroorganismus, rekombinante DNA-Verfahren (T. Maniatis et al., Molecular Cloning. A Laoratory Manuel, Cold Spring Habor Laboratory, Cold Spring Habor, New York, 1982) oder chemische Synthese einschließen, doch sind sie darauf nicht beschränkt.

Konstruktion rekombinanter Flagellin-Gene

Bei der Konstruktion eines rekombinanten Flagellin-Gens der vorliegenden Erfindung werden in Sequenzen eines Flagellin-Gens Sequenzen eingeführt, die für ein Epitop(e) eines heterologen Organismus codieren, oder sie werden durch eine solche Sequenz(en) ersetzt.
Als erstes sollten die Domänen des Flagellin-Gens, von denen erwünscht ist, daß in diese Domänen Sequenzen eingeführt werden oder in denen solche durch heterologe Sequenzen ersetzt werden, identifiziert werden. Solche Flagellin-Sequenzen, die für den Transport des Flagellin-Proteins zum distalen Ende der Geißel (oder zu dem Haken zur Initiierung eines neuen Geißel-Filaments) notwendig und genügend sind, sollten beibehalten werden. Diese Beibehaltung bzw. Konservierung führt zu einem rekombinanten Flagellin-Molekül, das die Fähigkeit zum exprimiert werden auf der Oberfläche der Zelle als Geißel-Filament beibehält, was die Isolation und Reinigung dieser rekombinanten Moleküle zum Einsatz als Komponenten eines Untereinheit-Vaccins oder ihre Präsentation gegenüber dem Immunsystem in einer Ausführungsform von Lebendvaccin erleichtert.
Strukturanalysen verschiedener bakterieller Geißeln haben eine gemeinsame Architektur bei aus verschiedenen Bakterien isolierten Filaments gezeigt (L.-N. Wei und T.M. Joys, J. Mol. Biol., 186, 791-803, 1985; R.J. DeLange et al., J. Biol. Chem., 251, 705, 1976; P.R. Gill und N. Agabian, J. Biol. Chem., 258, 7395, 1983). Noch überraschender ist ein hoher Grad der Proteinsequenz-Homologie an den Amino- und Carboxyenden dieser Filaments (was nahelegt, daß diese Regionen für die strukturelle Intergrität und/oder Funktion erforderlich sind) sowie die Anwesenheit einer polymorphen Mittelregion, die für die antigenen Unterschiede zwischen verschiedenen Geißeln verantwortlich ist (wie vorstehend angegeben; siehe auch T. Iino, Ann. Rev. Genet., 11, 161-182, 1977, sowie die darin zitierten Druckschriften). Strukturelle Einschränkungen auf dieser hypervariablen Mittelregion sind unaulfällig, da Isolate identifiziert wurden, die sich sowohl hinsichtlich der Anzahl der Aminosäurereste als auch der Primärsequenz unterscheiden.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine DNA-Sequenz, die für ein heterologes Epitop codiert, in die hypervariable Mittelregion des Flagellin-Monomers eingeführt oder ersetzt diese. Diese Ausführungsform gestattet die Konstruktion von rekombinanten Flagellin-Monomeren, die die Fähigkeit zur Bildung intakter Geißeln beibehalten können. Die Fähigkeit zum Zusammensetzen zu Geißeln würde, im Kontext einer lebenden Vaccin-Formulierung, zur Präsentation einer hohen Konzentration des heterologen Epitops, das auf jedem Flagellin-Monomer existiert, gegnüber dem Immunsystem des in vivo-Wirtes führen. Die Präsentation einer organisierten polymeren Struktur würde eine sehr viel stärkere antigene Anregung vermitteln als das gleiche Material als Monomer. Auch würde, nach der Expression durch ein Bakterium, die Anwesenheit von Geißeln auf der äußeren Oberfläche der Bakterien eine wirksamere Präsentation des heterologen Epitops gestatten. Weiter würde das Zusammensetzen zu intakten Geißeln die Reinigung der rekombinanten Flagellin-Moleküle erleichtern, da verschiedene Verfahren für eine solche Reinigung im Stande der Technik bekannt sind und benutzt werden können. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform erzeugen die rekombinanten Flagellin-Moleküle, die durch einen nicht beweglichen Elternstamm der Bakterien exprimiert werden, funktionelle Geißeln, die bewegliche Bakterien ergeben, die aufgrund der Anwesenheit des Fremdepitops auf der äußeren Oberfläche der Bakterien und möglicherweise der relativ größeren Invasivität aufgrund ihrer Beweglichkeit wirksamer das heterologe Epitop dem Wirts-Immunsystem gegenüber präsentieren können als ein nicht beweglicher Stamm.
Wie in den weiter unten aufgeführten Beispielen beschrieben, waren wir in der Lage, DNA-codierende Epitope heterologer Organismen in die hypervariable Mittelregion der Flagellin-Gene von Salmonella muenchen einzuführen, ohne die Verkörperung und das Zusammensetzen der Geißeln zu beeinträchtigen.
Es können viele im Stande der Technik bekannte Strategien bei der Konstruktion der rekombinanten Flagellin-Gene benutzt werden. So können die relevanten Sequenzen des Flagellin-Gens und des heterologen Gens nach im Stande der Technik bekannten Verfahren an geeigneten Stellen mit Restriktionsendonuclease(n) gespalten, isoliert und verknüpft werden. Werden durch die Verdauung mit Restriktionsendonuclease kohäsive Enden erzeugt, dann mag eine weitere Modifikation der DNA vor der Ligation nicht erforderlich sein. Sind jedoch durch die Restriktionsendonuclease-Verdauung kohäsive Enden der DNA für die Generation nicht verfügbar oder sind andere Stellen als die verfügbaren bevorzugt, dann kann irgendeines der zahlreichen, im Stande der Technik bekannten Verfahren benutzt werden, um die Ligation der heterologen DNA an den erwünschten Stellen zu bewerkstelligen. So kann zum Beispiel auf die Spaltung mit einen Restriktionsenzym eine Modifikation folgen, um glatte Enden durch Rückverdauen oder Auffüllen einsträngiger DNA-Enden vor der Ligation zu schaffen. Alternativ können die gespaltenen Enden des Flagellin-Gens oder der heterologen DNA unter Einsatz einer Nuclease, wie Nuclease Bal 31, Exonuclease III, Lambda-Exonuclease, Mung-Bean-Nuclease oder T4 DNA Polymerase-Exonuclease abgeschnitten ("chewed back") werden, um nur wenige zu nennen, um Abschnitte der Sequenz zu entfernen. Eine Oligonucleotid-Sequenz (ein Linker), die für ein oder mehrere Restriktionsstellen codiert, kann durch Ligation mit DNA-Enden in eine Region des Flagellin-Gens eingeführt werden. Die nachfolgende Ligation einer heterologen Gensequenz in die klonierende Restriktionsstelle, so daß beide Sequenzen sich im richtigen Translations-Leserahmen befinden, der nicht durch Translations-Stoppsignale unterbrochen ist, führt zu einem Konstrukt, das die Produktion eines Flagellin-Fusionsproteins dirigiert. Ein Linker kann auch benutzt werden, um geeignete Restriktionsstellen in der heterologen Gensequenz zu erzeugen. Zusätzlich können Flagellin- oder heterologe Gensequenzen la vitro oder in vivo mutiert werden, um neue Restriktionsendonuclease-Stellen zu bilden oder vorbestehende zu zerstören, in vitro ausgeführte Ligationsverfahren zu erleichtern. Es kann irgendein im Stande der Technik bekanntes Verfahren zur Mutagenese benutzt werden, einschließlich der durch in vitro-Stelie dirigierten Mutagenese (C. Hutchinson et al., J. Biol. Chem., 253, 6551, 1978), des Einsatzes von TABTM-Linkern (Pharmacia), usw., doch sind sie auf diese nicht beschränkt.
Die spezielle Strategie zum Konstruieren von Genfusionen hängt von der speziellen zu ersetzenden Flagellin-Sequenz oder der einzuführenden Sequenz sowie dem einzuführenden heterologen Gen ab.
Das rekombinante Flagellin-Gen sollte in einen Vektor eingebaut oder übertragen werden, der zur Replikation und Expression in einem Bakterienwirt in der Lage ist. In einer bevorzugten Ausführungsform kann das rekombinante Flagellin-Gen auch in die Chromosomen-DNA des Bakteriums eingeführt werden. Ein Weg, auf dem dies bewerkstelligt werden kann, ist der durch Rekombinationsaustausch mit einem aus einem Plasmid stammenden, rekombinanten Flagellin-Gen. In einer anderen Ausführungsform kann das rekombinante Flagellin-Gen in einen Klonierungsvektor eingeführt werden, der episomal existiert, d.h. ein Plasmid oder eine Bakteriophage, der dann zum Transformieren oder Infizieren geeigneter Bakterien-Wirtszellen benutzt wird, wo die rekombinante DNA repliziert und exprimiert wird.
Die Transformation von Bakterienwirten mit den DNA-Molekülen, die das rekombinante Flagellin-Gen enthalten, gestattet die Erzeugung einer Vielzahl von Kopien der Flagellin-Sequenz. Eine Vielfalt von Vektorsystemen kann zur Expression innerhalb des Bakterienwirtes benutzt werden, einschließlich Plasmiden, wie pUC-Plasmiden und Derivaten, pBR322-Plasmid und Derivaten, Bakteriophagen, wie Lambda und seinen Derivaten und Cosmiden, doch sind sie auf diese nicht beschränkt. In einer spezifischen Ausführungsform schließen Plasmid-Monierungsvektoren, die eingesetzt werden können, Derivate von ColE1-Typ Replikonen (für zusätzliche Information siehe Oka et al., Mol. Gen. Genet., 172, 151-159, 1979) ein. Die ColE1-Plasmide werden in E. coli- und Salmonella typhimurium-Stammen als monomere Moleküle mit einer Kopienanzahl von etwa 15-20 Kopien pro Zelle beibehalten.
Es können verschiedene regulierende Expressionselemente benutzt werden, die irgendeine Anzahl geeigneter Transcriptions- und Translations-Elemente sind, die in Bakterien aktiv sind. So schließen zum Beispiel Promotoren, die zum Dirigieren der Expression der rekombinanten Flagellin-Sequenz benutzt werden können, den Lactose-Operon-Promotor von E. coli, den Hybrid trp-lac UV-5 Promotor (tac) (H. DeBoer et al. in Promotor Structure and Function, 1982, R.L. Rodriguez und M.J. Chamberlain, Herausgeber, Praeger Publishing, New York), die linken (PL) und rechten (PR) Promotoren des Bakteriophagen Lambda, den Promotor des Baktereophagen T7, den trp-Operon-Promotor, den lpp-Promotor (den E. coli-Lipoprotein-Genpromotör, K. Nakamura und I. Inouye, Cell, 18, 1109-1117, 1979) usw. ein, doch sind sie auf diese nicht beschränkt. Andere durch rekombinante DNA oder synthetische Techniken erzeugte Promotoren können für die Transcription der eingeführten Sequenzen auch benutzt werden. Alternativ kann der natürliche Flagellin-Promotor benutzt werden.
Für die effiziente Translation von eingeführten, für Protein codierenden Sequenzen sind auch spezifische Initiationssignale erforderlich. Diese Signale schiießen das ATG-Initiationscodon und benachbarte Sequenzen ein. In Fällen, bei denen die natürlichen Flagellingen-Sequenzen für ihr eigenes Initiationscodon codieren und benachbarte Sequenzen in die geeigneten Expressionsvektoren eingeführt werden, brauchen zusätzliche Translations-Kontrollsignale nicht erforderlich zu sein. In Fällen jedoch, bei denen die natürlichen Flagellin-Translationssignale nicht vorhanden sind, müssen exogene Translations-Kontrollsignale, die das ATG-Initiationscodon einschließen, geschaffen werden. Das Initiationscodon muß weiter in Phase mit dem Leserahmen der für Protein codierenden Sequenzen vorhanden sein, um die Translation des gesamten Einsatzes sicherzustellen. Diese exogenen Translations-Kontrollsignale und Initiationscodons können von einer Vielfalt von Ursprüngen stammen, die sowohl natürlich als auch synthetisch sind.
Verfahren zum Konstruieren der geeigneten Expressionsvektoren können in vitro ausgeführte, rekombinante DNA- und synthetische Techniken sowie in vivo-Rekombinanten (genetische Rekombination) sein.
Hinsichtlich Übersichten bezüglich der Maximierung der Genexpression siehe Roberts und Lauer, Meth. Enzymol., 68, 473, 1979 und W. Reznikoff und M. Gold, Maximizing Gene Expression, Plenum Press, New York, 1986.
Die US-PS 4,237,224 von Cohen und Boyer beschreibt die Produktion von rekombinanten Plasmiden unter Anwendung von Verfahren zum Spalten mit Restriktionsenzymen und Verbinden mit DNA-Ligase nach bekannten Ligationsverfahren. Diese rekombinanten Plasmide werden dann mittels Transformation oder Elektroporation eingeführt und in einzelligen Kulturen, einschließlich prokariotischen Organismen und eukariotischen Zellen, die in Gewebekultur gezüchtet werden, repliziert.
Ein anderes Verfahren zum Einführen rekombinanter DNA-Moleküle in einzellige Organismen ist von Collins und Hohn in der US-PS 4,304,863 beschrieben. Dieses Verfahren benutzt ein Packungs/Transduktions-System mit Bakteriophagen-Vektoren (Cosmiden).

Expression in Bakterienwirten

Der Expressionsvektor, der die rekombinante Flagellin-Sequenz umfaßt, sollte dann in eine Bakterien-Wirtszelle transferiert werden, wo er replizieren und exprimiert werden kann.
Dies kann mit irgendeinem der im Stande der Technik bekannten zahlreichen Verfahren ausgeführt werden, die Transformation (zum Beispiel von isolierter Plasmid-DNA in den geschwächten Bakterienwirt), Phagentransduktion (Schmeiger, Mol. Gen. Genetics, 119, 75, 1972) konjugiert zwischen Bakterien-Wirtsarten, Elektroporation usw. erfolgen, ist auf diese jedoch nicht beschränkt.
In einer spezifischen Ausführungsform können irgendwelche geschwächten Bakterienwirte, die das rekombinante Flagellin exprimieren, als Lebendvaccine formuliert werden. Solche Bakterien schließen abgeschwächte, invasive Stämme und abgeschächte Campylobacter-, Shigella- oder Escherichia-Arten ein, sind auf diese jedoch nicht beschränkt.

Expression in abgeschwächten. invasiven Bakterien

In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird der die rekombinante Flagellin-Sequenz umfassende Expressionsvektor in abgeschwächte Invasionsbakterien transferiert, wo er exprimiert wird und somit einen Bakterienstamm produziert, der zum Einsatz als ein Lebendvaccin geeignet ist.
Es können in den Vaccin-Formulierungen der vorliegenden Erfindung irgendwelche der verschiedenen, abgeschwächten Invasionsbakterien als ein Träger benutzt werden, um das rekombinante Flagellin zu exprimieren, so daß sein heterologes Epitop wirksam dem Immunsystem des Wirtes präsentiert wird. Die Vaccin-Bakterien behalten ihre invasiven Eigenschaften, verlieren jedoch einen goßen Teil ihrer Virulenzeigenschaften, was es gestattet, sie zu einem beschränkten Ausmaß im Wirt zu vermehren, nicht jedoch genug, um eine signifikante Erkrankung oder Störung zu verursachen. Beispiele von Invasionsbakterien, die in abgeschwächten Formen in den Vaccin-Formulierungen der Erfindung eingesetzt werden können, schließen Salmonella spp., invasives E. coli (EIEC) und Shigella spp. ein, sind auf diese jedoch nicht beschränkt. In einer bevorzugten Ausführungsform werden Invasionsbakterien, die sich in lymphartigen Geweben aufhalten, wie der Milz (zum Beispiel Salonella spp.), benutzt. Solche Bakterien können in Darm-Epithelgewebe und/oder Peyer's Haufen eindringen, sich durch das reticuloendotheliale System verteilen und Zugang zu mesenterialem, lymphartigem Gewebe, Leber und Milz gewinnen, wo sie sich vermehren oder zumindest für eine Zeit überleben und humorale und zellvermittelte Immunität induzieren.
Abgeschwächte, invasive Bakterien können nach zahlreichen Verfahren erhalten werden, die chemische Mutagenese, genetische Einführung, Deletion (J. Miller, Experiments in Molecular Genetics, Cold Spring Habor Laboratory, Cold Spring Habor, New York, 1972) oder Rekombination unter Anwendung der Methoden für rekombinante DNA (T. Maniatis et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manuel, Cold Spring Habor Laboratory, Cold Spring Habor, New York, 1982), Laboratoriums-Auswahl natürlicher Mutationen usw. einschließen, auf diese aber nicht beschränkt sind. Verfahren zum Erhalten abgeschwächter Salmonella-Stämme, die nicht umkehrende, nicht virulente, auxotrophe Mutanten, geeignet zum Einsatz als Lebendvaccine sind, sind in der US-PS 4,735,801 vom 5. April 1988 und der anhängigen US-Patentanmeldung Serial Nr. 798,052, eingereicht am 14. November 1985, durch Stocker beschrieben, die in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme hier aufgenommen werden. Ein zuverlässiges Verfahren, um eine Abschwächung von Salmonella zu erzielen, wurde beschrieben (S.K. Hoiseth und B.A.D. Stocker, Nature, 291, 238, 1981; B.A.D. Stocker et al., Develop, Biol, Standard, 53, 47, 1982 und der US- PS4,550,081), und es kann in einer besonderen Ausführungsform der Erfindung benutzt werden.
Abgeschwächte Salmonella, die in Lebendvaccin-Formulierungen der Erfindung benutzt werden können, schließen solche Arten ein, die in Tabelle II aufgeführt sind, doch sind sie auf diese nicht beschränkt. TABELLE II SALMONELLA-ARTEN. DIE IN ABGESCHWÄCHTEN FORMEN IN DEN VACCIN-FORMULIERUNGEN DER VORLIEGENDEN ERFINDUNG* EINGESETZT WERDEN KÖNNEN S. typhi S. typhimurium S. paratyphi A S. paratyphi B S. enteritides (zum Beispiel den Serotyp dublin)
* Hinsichtlich einer vollständigen Beschreibung von Salmonella Serotypen siehe Edwards und Ewing, Classification of the Enterobacteriaceae, 4. Auflage, Elsevier, N.Y., 1986
In spezifischen Ausführungsformen können Salmonella-Bakterien, die durch Chromosomen-Deletion von Gen(en) für die Biosynthese aromatischer Verbindungen (aro oder Mutation in galE-Gen abgeschwächt sind oder die cya&supmin;-, crp&supmin;vir-Plasmid&supmin; usw. sind, benutzt werden. Aro- Mutanten, die benutzt werden können, schiießen S. typhi-Stämme 543Ty und 541Ty zum Einsatz in Vaccinen für Menschen und S. typhimuriam SL3261 und SL1479 und S. enteritidis Serotyp dublin SL1438 (auch als S. dublin bezeichnet) zum Einsatz in Tieren ein, sind auf diese jedoch nicht beschränkt (siehe US-PS 4,550,081 hinsichtlich einer Beschreibung des S. typhimurium-Stammes SL1479 und des S. dublin-Stammes SL1438). S. typhi-Stämme, wie 543Ty und 541Ty, sind in Menschen avirulent aufgrund der Abschwächung durch Deletion affizierender Gene aroA und/oder purA (M.M. Levine et al., J. Clin. Invest., 79, 888, 1987). Mutanten von $. dublin, wie SL1438 und von S. typhimurium, wie SL3261, können bei der Entwicklung von Tiermodell-Systemen eingesetzt werden, da diese Arten zur Verursachung von Tierkrankheiten in der Lage sind, die typhoidem Fieber äquivalent sind. ga1E-Mutanten, die benutzt werden können, schließen Salmonelle typhi-Stämme Ty21a (Germanier, Bacteria Vaccines, Academic Press, NY, Seiten 137-165, 1984), Salmonella typhimurium G30D, usw. ein, sind auf diese jedoch nicht beschränkt.
In einer bevorzugten Ausführungsform kann ein Plasmid-Expressionsvektor, der ein rekombinantes Flagellin-Gen enthält, isoliert und, wegen der hohen Transformations-Frequenzen von E. coli K12 relativ zu denen von Salmonella, wie S. typhimunium, in E. coli charakterisiert werden, bevor der Transfer zu einem abgeschwächten Salmonella-Stamm stattfindet, zum Beispiel durch Phagen-Transduktion (Schmeiger, Mol. Gen. Genetics, 119, 75, 1972),.

Bestimmung der Immunpotenz des(der) heterologen Epitope(s). (das) die als rekombinantes Flagellin exprimiert sind

Die Immunpotenz des als ein rekombinantes Flagellin exprimierten, heterologen Epitops in einer Lebendvaccin-Formulierung kann durch Überwachen der Immunreaktion von Testtieren nach einer Immunisierung mit Bakterien, die das rekombinante Flagellin exprimieren, bestimmt werden. In einer Untereinheit-Vaccinformulierung kann die Immunreaktion von Testtieren nach der Immunisierung mit dem isolierten rekombinanten Flagellin-Molekül, wie Geißel- Filamenten oder -Monomer, das mit einem geeigneten Adjuvans zur Förderung der immunologischen Reaktion formuliert werden kann, überwacht werden. Geeignete Adjuvantien schließen Mineralgele, zum Beispiel Aluminiumhydroxid, oberflächenaktive Substanzen, wie Lysolecithin, Polyole von Pluronic, Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen und potentiell brauchbare menschliche Adjuvantien, wie BCG (Bacille Calmette Guerin) und Corynebacterium payrum ein, sind auf diese jedoch nicht beschränkt. Testtiere können Mäuse, Meerschweinchen, Kaninchen, Hühner, Schimpansen und andere Primaten und schließlich Menschen einschließen. Verfahren zum Einführen des Immunogens können orale, intradermale, intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse, subcutane, intranasale oder andere Standardrouten der Immunisierung einschließen.
Die Immunreaktion der Testsubjekte kann auf verschiedene Weise analysiert werden, wie: (a) die Reaktivität des resultierenden Immunserums auf das natürliche Antigen oder ein das heterologe Epitop enthaltende Fragment davon, oder die isolierten, natürlich vorkommenden, heterologen Organismen, wie nach bekannten Techniken untersucht, zum Beispiel enzymgekoppelter Immunsorptionsmittel-Assay (ELISA), Immunoblots, Radioimmun-Ausfällungen usw., (b) die Reaktivität von aus dem immunisierten Subjekt isolierten Lymphozyten gegenüber dem nativen Antigen oder dessen Fragment oder dem heterologen Organismus, wie durch bekannte Techniken bestimmt, zum Beispiel Assays auf die blastogene Reaktion, Zytotoxizitäts-Assays, verzögerte Hypersensibilität, usw., (c) die Fähigkeit des Immunserums, die Infektionsfähigkeit des Organismus ja vitro oder die biologische Aktivität des nativen Antigens zu neutralisieren und (d) Schutz vor Erkrankung und/oder Abschwächung von Infektionssymptomen in immunisierten Tieren.

Formulierung eines Vaccins

In dieser Ausführungsform der Erfindung werden die ein Epitop eines heterologen Organismus umfassenden rekombinanten Flagelline zum Vaccineinsatz formuliert. Solche Vaccin- Formulierungen können Lebendvaccin- oder Untereinheit-Vaccinformulierungen umfassen. Die Vaccin-Formulierungen der Erfindung sind sowohl in Tieren als auch Menschen von Nutzen.

Lebende Bakterien als Vaccine

Der Zweck dieser Ausführungsform der Erfindung ist es, ein Vaccin zu formulieren, bei dem das Immunogen ein abgeschwächter, invasiver Bakterienstamm ist, der ein rekombinantes Flagellin exprimiert, das ein Epitop eines heterologen Organismus umfaßt, um eine Immun (humorale und/oder zellvermittelte)-Reaktion auf das heterologe Epitep auszulösen, die gegen Infektionen durch den Organismus oder gegen durch ein Antigen des Organismus verursachte Zustände oder Störungen schützt. Die Bakterien des Vaccins umfassen Stämme, die für den mit Vaccin zu versehenden Wirt infektiös sind. In einer bevorzugten Ausführungsform sind solche Stämme abgeschwächte Invasionsbakterien, wie Salmonella-Arten. andere geeignete Arten können Shigella und E. coli einschließen, sind auf diese jedoch nicht beschränkt. In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform werden die rekombinanten Flagellin-Gene durch die Wirtsbakterien als Flagellin-Monomere exprimiert, die sich zu funktionierenden Flagella bzw. Geißeln zusammensetzen und es dem heterologen Epitop auf den rekombinanten Molekülen gestatten, gegenüber dem Immunsystem des Wirtes in einer großen Anzahl von Kopien präsentiert zu werden.
Die Lebendvaccin-Formulierungen können einwertig oder mehrwertig sein. Mehrwertige Vaccine können aus einzelnen oder wenigen rekombinanten Bakterien zubereitet werden, die ein oder mehrere heterologe Epitope, die von verschiedenen Organismen stammen können, exprimieren. Ein einzelnes Bakterium kann mehr als ein Epitop des gleichen oder verschiedener Antigene exprimieren. Die verschiedenen Epitope können innerhalb des gleichen rekombinanten Flagellin-Proteins auf separaten, rekombinanten Flagellin-Molekülen exprimiert werden, die durch die gleichen oder verschiedene Expressionsvektoren oder in verschiedenen Bakterien codiert werden.
Es können viele Verfahren benutzt werden, um die Lebendvaccin-Formulierungen der Erfindung einzuführen, die die orale, intradermale, intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse, subcutane, transcutane und intranasale Route, einschließlich der natürlichen Infektionsroute der Wildtyp-Elternbakterien-Stämme einschließen, sind auf diese jedoch nicht beschränkt. In einer Ausführungsform, betreffend eine orale Vaccin-Formulierung für Tiergebrauch, kann die Immunisierung eines Tierbestandes durch Einsatz der Lebendvaccin-Formulierung als ein Zusatz zum Futter oder im Trinkwasser erfolgen.
In spezifischen Ausführungsformen können abgeschwächte Salmonella als Vaccine formuliert werden, die ein rekombinantes Flagellin exprimieren, das ein Epitop eines Malaria- Circumsporozoit-Proteins, die B-Untereinheit von Choleratoxin, Oberflächen- und Preoberflächen-Antigene von Hepatitis B, VP7-Polypeptid von Rotavirus, Hüllenglykoprotein von HIV und M-Protein von Streptococcus umfaßt.
Eine bevorzugte Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist der Einsatz eines avirulenten, nicht pathogenen, einen Vektor liefernden, oralen Salmonella-Systems. Der Einsatz dieses Systems kann nicht nur einige der potentiellen Nebenwirkungen ausschließen, die mit dem Einsatz anderer Verabreichungsträger verbunden sind, wie Vaccinvirus und Adenovirus, sondern sie sorgen auch dafür, daß eine bequeme, orale Verabreichung der Vaccine eine Schleimhaut- sowie eine systemische Immunreaktion induziert, was das immumogene Potential des Vaccins erhöht.

Untereinheit-Vaccine

Das als ein rekombinantes Flagellin-Fusionsprotein exprimierte, heterologe Peptid kann als ein Immunogen in Untereinheit-Vaccin-Formulierungen benutzt werden, die mehrwertig sein können. Die mehrwertige Vaccin-Formulierung kann rekombinante Flagella oder ein rekombinantes Flagellin-Monomer umfassen, das mehr als ein heterologes Epitop enthält, wobei dieses Epitop aus verschiedenen Organismen oder verschiedenen Flagellin-Molekülen stammen kann, die jeweils für ein anderes heterologes Epitop codieren, usw.
Das Produkt des rekombinanten Flagellin-Gens kann für Zwecke der Vaccin-Formulierung aus irgendwelchen Vektor/Wirts-Systemen gereinigt werden, die das heterologe Protein expimieren, wie transduzierte oder transformierte Bakterien. So werden zum Beispiel Geißel-Filaments von Bakterien durch mechanische Mittel leicht vom intakten Bakterium entfernt, die die Zelle nicht in anderer Weise beschädigen, was deren leichte Reinigung ohne Einführung harscher, denaturierender Mittel gestattet. Im Stande der Technik bekannte Standardverfahren können für die Reinigung des rekombinanten Flagellins, entweder als Monomere oder als (zusammengesetzte) Geißeln benutzt werden (siehe zum Beispiel P.R. Gill und N. Agabian, sL Biol. Chem., 258, 7395-7401, 1983; A. Weisborn et al., J. Biol. Chem., 257, 2066-2074, 1982; P.R. Gill und N. Agabian, J. Bacteriol., 150, 925-933, 1982; C. Lagenaur und N. Agabian, J. Bacteriol., 128, 435-444, 1976; A. Fukuda et al., FEBSLett., 95, 70-75, 1978; J.R. Stevenson und K.A. Stonger, Am. J. Vet. Res., 41(4), 650-653, 1980).
Weiter können isolierte Flagella-Proben zu Flagellin-Untereinheiten solubilisiert (zum Beispiel durch Dissoziation durch Aussetzen gegenüber pH 3 oder pH 11 bei geringer Ionenstärke; R.J. DeLange et al., J. Biol. Chem., 291(3), 705-711, 1976) und dann nach bekannten Verfahren wieder zu Flagella vereinlgt werden (zum Beispiel A. Weissborn et al., J. Biol. Chem., 257, 2066-2074, 1982), um: (a) die Reinigung der rekombinanten Flagelline durch Entfernen unerwunschter Verunreinigungen zu unterstützen und/oder (b) ein Immunogen für eine mehrwertige Vaccin-Formulierung durch Vereinigen rekombinanter Flagellin-Monomerer, die für verschiedene heterologe Epitope codieren, zu produzieren.
Das(die) gereinigte(n) Protein(e) sollte(n) auf eine geeignete Konzentration eingestellt, mit irgendwelchen geeigneten Vaccin-Adjuvantien formuliert und zum Einsatz verpackt werden. Geeignete Adjuvantien schiießen zum Beispiel Mineralgele, wie Aluminiumhydroxid, oberflächenaktive Substanzen, wie Lysolezithin, Polyole von Pluronic, Polyanionen, Peptide, Ölemulsionen und potentiell brauchbare menschliche Adjuvantien, wie BCG (Bacille Calmette-Guerin) und Cornebacterium paryum ein, sind auf diese jedoch nicht beschränkt. Das Immunogen kann auch in Liposome eingebaut oder mit Polysacchariden und/oder anderen Polymeren zum Einsatz in einer Vaccin-Formulierung konjugiert werden.
In Fällen, bei denen das rekombinante Flagellin-Produkt ein Hapten ist, d.h. ein Molekül, das antigen ist, da es selektiv mit erkannten Antikörpern reagiert, aber nicht immunogen ist, da es keine Immunreaktion auslosen kann, kann das Hapten kovalent an einen Trager oder ein immunogenes Molekül gebunden werden, zum Beispiel ein großes Protein, wie Serumalbumin, das dem damit gekoppelten Hapten Immunogenität verleiht. Der Hapten-Träger kann dann zum Einsatz als ein Vaccin formuliert werden.
Es können viele Verfahren zum Einführen der obigen Vaccin-Formulierungen benutzt werden, die orale, intradermale, intramuskuläre, intraperitoneale, intravenöse, subcutane und intranasale Routen einschließen, auf diese jedoch nicht beschränkt sind.

Verwendungen von Antikörpern, die gegen rekombinantes Flagellin gerichtet sind

Die gegen heterologe Organismen durch Immunisierung mit dem rekombinanten Flagellin der vorliegenden Erfindung erzeugten Antikörper haben auch potentielle Verwendungen in diagnostischen Immunoassays, in der passiven Immuntherapie und zur Erzeugung antiidiotypischer Antikörper.
Die erzeugten Antikörper können nach im Stande der Technik bekannten Standardtechniken isoliert werden (zum Beispiel Immunoaffinitäts-Chromatographie, Zentrifugieren, Ausfällung usw.), und sie können in diagnostischen Immunoassays eingesetzt werden, um die Anwesenheit von Viren, Bakterien oder Parasiten von medizinischer oder veterinär-medizinischer Bedeutung in menschlichen oder Tier-Geweben, -Blut, -Serum usw. nachzuweisen. Die Antikörper können auch zum Überwachen des Behandlungs- und/oder Erkrankungs-Fortschrittes benutzt werden. Es kann irgendein im Stande der Technik bekanntes Immunoassay-System, wie die hier aufgeführten, für diesen Zweck benutzt werden, einschließlich im Wettbewerb stehender und nicht im Wettbewerb stehender Assay-Systeme, unter Anwendung von Techniken, wie Radio-Immunoassays, ELISA (enzymgekoppelte Immunosorptionsmittel-Assays), "Sandwich"-Immunoassays, Ausfällungsreaktionen, Geldiffusions-Ausfällungsreaktionen, Immunodiffusionsassays, Agglutinierungsassays, Komplement-Fixierungs-Assays, immuno-radiometrische Assays, Fluoreszens-Immunoassays, Protein A-Immunoassays und Immunelektrophorese-Assays, um nur wenige zu nennen, jedoch sind sie auf diese nicht beschränkt.
Die Vaccin-Formulierungen der vorliegenden Erfindung können auch benutzt werden, um Antikörper zum Einsatz in der passiven Immunotherapie herzustellen, bei der ein kurzzeitiger Schutz eines Wirtes durch die Verabreichung eines vorgebildeten Antikörpers erzielt wird, der gegen einen heterologen Organismus gerichtet ist.
Die durch die Vaccin-Formulierungen der vorliegenden Erfindung erzeugten Antikörper können auch bei der Herstellung von antiidiotypischem Antikörpern eingesetzt werden. Der antiidiotypische Antikörper kann dann seinerseits zum Immunisieren benutzt werden, um eine Unterpopulation von Antikörpern zu erzeugen, die das ursprüngliche Antigen des pathogenen Mikroorganismus bindet (N.K. Jerne, Ann. Immunol. (Paris), 125c, 373, 1974; N.K. Jerne et al., EMBO, 1, 234, 1982).

Immunoassays

Die Produkte des rekombinanten Flagellin-Gens der vorliegenden Erfindung oder deren Fragment, die Fremdepitop(e) exprimieren, können als Antigene in Immunoassays von Antikörpern für das (die) Epitop(e) eingesetzt werden. Das heterologe Protein oder dessen Fragmente kann bzw. können ebenfalls zum Nachweisen des gleichen oder verwandten Epitop(e) durch Wettbewerbsassays eingesetzt werden. Die rekombinanten Flagellin-Produkte oder das durch diese exprimierte Fremdepitop(e) kann in irgendein im Stande der Technik bekanntes Immunoassay-System eingesetzt werden, einschließlich in im Wettbewerb stehenden oder nicht im Wettbewerb stehenden Assay-Systemen, die Techniken benutzen, wie Radio-Immunoassays, ELISA (enzymgekoppelter, Immunosorptionsmittel-Assay), "Sandwich"-Immunoassay, Ausfällungsreaktionen, Geldiffusions-Ausfällungsreaktionen, Immunodiffusions-Assays, Agglutinierungs-Assays, Komplement-Fixierungs-Assays, Immunoradiometrische Assays, Fluoreszens-Immunoassays, Protein A-Immunoassays und Immunoelektrophorese-Assays, um nur wenige zu nennen, jedoch sind sie auf diese nicht beschränkt.

Beispiel 1

Konstruktion von Flaggelin-Minus-Vaccin-Stämmen

Die beiden Lebendvaccin-Stämme, die als Wirte von Flagellin spezifizierenden Plasmiden benutzt wurden, waren SL5927 und SL5928. Jeder wurde erhalten von einem von Aromaten abhängigen S. dublin-Elternstamm, der hinsichtlich der Geißelcharakteristika Wildtyp war, der beweglich und mit dem einzelnen Flagellin-Gen, H1-g.p, versehen war, das das Flagellar-Antigen der Phase-1, g,p, bestimmt, das charakteristisch für die Monophasenarten ist, S. dublin.
SL5927 wurde von SL1437 erhalten, einem von Aromaten abhängigen, lebenden Vaccinstamm, dessen Konstruktion in den US-PSn 4,735,801 und 4,550,081 beschrieben ist, deren Lehren durch Bezugnahme hier aufgenommen werden.
SL5928 wurde von einem anderen, von Aromaten abhängigen Lebendvaccin-Stamm von dublin, SL5631, erhalten, dessen Konstruktion unten beschrieben ist.
Jeder bewegliche Stamm wurde als ein Empfänger in der Transduktion benutzt, wobei SL5669, der ein S. typhimurium-Stamm ist, mit dem in das Gen H1-i eingeführten Transposon Tn10 für sein Flagellar-Antigen der Phase-1, i, versehen war. Die Selektion wurde hinsichtlich Klonen vorgenommen, die wegen der Ersetzung des Gens H1-g.p des Empfängers durch das Gen H1-i::Tn10 des Donors resistent gegenüber Tetracyclin sind. Ein gegenüber Tetracyclin resistentes Klon, das (wegen der Ersetzung des Wildtyp-Flagellin-Gens durch das durch das Transposon inaktivierte Gen) nicht beweglich und frei vom Phagen, P22HT105/1, das zum Ausführen der Transduktion benutzt wurde, war, wurde erhalten, SL5927, von der Kreuzung mit SL1438 als Empfänger und SL5928 von der mit SL5631 als Empfänger.
SL5631 ist ein stabiles, von Aromaten abhängiges Derivat eines virulenten S. dublin- Stammes, SVA47. Er wurde erhalten durch zwei Stufen der Transduktion nach dem zum Konstruieren von aroA (Deletion)-Stämmen von S. typhi (M. F. Edwards, Promotionsthesen, Stanford, University, California, 1985) benutzten Verfahren.

Expression heterologer Epitope als rekombinate Flagellin-Fusionsproteine

Die Konstruktion und Expression von rekombinanten Flagellin Genen, die fur Fremdepi tope codieren, die bei der Einfuhrung und Expression von schützenden Immunreaktionen wichtig sind, wird beschrieben. Die heterologen, parasitaren und Bakterien-Epitope, die als rekombinantes Flagellin exprimiert wurden, waren vom Malaria CS Protein und der B Untereinheit des Choleratoxins. Die rekombinanten Flagellin-Moleküle wurden in abgeschwächte Salmonella- Stämme eingeführt und durch diese exprimiert, die in Lebendvaccin-Formulierungen benutzt werden können.

Materialien und Verfahren

Plasmide und Bakterienstämme

Die benutzten Bakterienstämme waren Salmonella-Stämme SL1438 (ATCC Zugangsnummer 39184) und SL5927 (ATCC Zugangsnummer 67944) und der E. coli-Stamm CL447. Das Plasmid pLS402 enthält ein 3,8 kb EcoRI-Fragment der Genom-DNA von S. muenchen, das für das vollständige Flageliin-Strukturgen H1-d codiert, eingeführt in die EcoRI-Stelk des Plasmids pBR322 (L.-N. Wei und T.N. Joys, J. Mol. Biol., 186, 791, 1985). Plasmid pUC18, pUC19 und der E. coli-Stamm JM103 wurden von den Bethesda Research Laboratories (BRL, Bethesda, MD) erhalten.

Bedingungen für die Verdauung durch Restriktionsenzym

Restriktionsendonucleasen BamHI, ClaI, EcoRI und EcoRV wurden von den Bethesda Research Laboratories (BRL, Bethesda, MD) gekauft. Die Verdauungen wurden ausgeführt durch Suspendieren von DNA im geeigneten Restriktionspuffer, Hinzugeben von 2-3 Einheiten des Enzyms pro ug der DNA und Inkubieren bei 37ºC über Nacht.
Restriktionspuffer, der für BamHI-Verdauungen benutzt wurde, bestand aus 10 mM Tris-HCl (pH 7,5), 10 mM MgCl&sub2; und 100 mM NaCl.
Restriktionspuffer, der für EcoRI und ClaI-Verdauungen benutzt wurde, bestand aus 10 mM Tris-HCl(pH 7,5), 10 mM MgCl&sub2; und 50 mM NaCl.
Restriktionspuffer, der für EcoRV-Verdauungen benutzt wurde, bestand aus bestand aus 10 mM Tris-HCl(pH 7,5), 10 mM MgCl&sub2; und 150 mM NaCl.

Schaffung von glatten Enden in DNA-Fragmenten

Um glatte Enden für die Ligation zu schaffen, wurden DNA-Enden mit 5'-Überhängen durch die Einwirkung von dem großen Fragment der DNA-Polymerase I (Klenow-Fragment) aufgefüllt. Zum Auffüllen mit Klenow-Fragment wurden 1-25 ug DNA mit 1 Einheit pro ug des Klenow-Enzyms (BRL) in einem Reaktionsvolumen von 50 ul für 30 Minuten bei Raumtemperatur in Puffer behandelt, enthaltend 66 mM Tris-HCl, pH 7,5; 6,6 mM MgCl&sub2;, 1 mM Dithiothreit (DTT) und 20 nM aller vier Desoxynucleotid-Triphosphate (dATP, dCTP, dGTP und TTP). Gelreinigung von DNA-Fragmenten Nach den Verdauungen mit Restriktionsenzym wurden DNA-Fragmente variierender Größen durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese unter Einsatz von TBE-Puffer (0,089 M Tris, 0,089 M Borsäure, 0,002 M EDTA, pH 7,5) bei 15 V/cm getrennt. Die Acrylamid-Gele wurden durch Verdunnen einer Vorratslösung von Acrylamid/Bisacrylamid (40/1,1) auf entweder 6% oder 8% mit TBE Puffer, in Abhängigkeit von der Große des zu isolierenden DNA-Fragments, gegossen. Nach der vertikalen Elektrophorese wurden Banden mit Ethidiumbromid-Fluoreszens sichtbar gemacht, und das geeignete Band wurde herausgeschnitten und in Dialyserohr, enthaltend eine 1:10-Verdünnung von TBE-Puffer, angeordnet. Dieses Rohr wurde in einer den gleichen Puffer enthaltenden Kammer angeordnet und bei 100 mA 2 Stunden lang einer Elektroelution unterworfen. Das durch Elektroelution erhaltene DNA-Fragment wurde gewonnen durch Entfernen des Flüssigkeitsgehaltes aus dem Beutel und Ausfällen der DNA mit dem zweifachen Volumen von kaltem Ethanol in Gegenwart von 300 mM Natriumacetat.

Synthese und Reinigung von Oligonucleotiden

Auf einer Vorrichtung zum Synthetisieren von DNA Modell 380B der Applied Biosystems Inc. wurden, unter Anwendung der β-Cyanethyl-Phosphoramidit-Chemie, Oligonucleotide im 0,2 Mikromol-Maßstab synthetisiert (N.D. Sinha et al., Nucl. Acids. Res., 12, 4539-4544, 1984).
Die Oligonucleotide wurden durch Elektrophorese in einem 0,4 mm dicken 8%-tigen Polyacrylamidgel in TBE-Puffer (0,01 M Tris-Borat, pH 8,2, 1 mM EDTA) bei etwa 1600 V mit einer konstanten Leistung von 75 Watt gereinigt. Die Oligonucleotid-Banden wurden sichtbar gemacht durch negatives Schattieren übe einer Dünnschicht-Chromatographieplatte von PEI (Polyethylenimin) unter UV-Licht, und das Produktband wurde in voller Länge aus dem Gel herausgeschnitten. Das synthetische Oligonucleotid wurde in 0,3 M Natriumacetat, pH 5,5, eluiert, und es wurde durch Zugabe des doppelten Volumens von 100%-igem Alkohol ausgefällt, auf -20ºC abgekühlt und bei 14.000 g zentrifugiert. Die Pellets wurden unter Vakuum getrocknet und in TE-Puffer (10 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 mM EDTA) gelöst.
Am 5'-Ende der synthetischen Oligonucleotide wurden unter Einsatz von T4 Polynucleotid-Kinase (New England Biolabs, Beverly, MA) Phosphatgruppen eingeführt. Mengen von 1 pg des gereinigten Oligonucleotids wurden in 25 ul von Kinase-Puffer, bestehend aus 70 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl&sub2;, 5 mM DTT mit 1 mM Adenosin-Triphosphat (ATP) gelöst. Diese Lösung wurde mit 20 Einheiten von T4 Polynucleotid-Kinase 30 Minuten bei 37ºC inkubiert.
Die Wärmebehandlung (annealing) komplementärer Stränge wurde erzielt durch Vermischen der mit Kinase behandelten Stränge und Erhitzen auf 60ºC für 1 Stunde und Abkühlen bei Raumtemperatur.

DNA-Ligation

Alle Ligationen wurden unter Einsatz von T4 DNA-Ligase, die vom BRL (Bethesda, MD) käuflich erworben war, ausgeführt. Vektor-DNA und das geeignet behandelte, isolierte Restriktionsfragment oder synthetische Oligonucleotide wurden wieder in 30 ul von Ligase-Puffer (66 mM Tris-HCI, pH 7,5, 6,6 mM MgCl&sub2;, 10 mM DTT und 1 mM ATP) suspendiert, und es wurden 2 Weiss-Einheiten von T4 DNA-Ligaseenzym hinzugegeben. Die Ligationsreaktion ließ man 18- 24 Stunden bei 4ºC ablaufen. Normalerweise wurden 50-100 ng der Vektor-DNA mit etwa einem 10-fachen molaren Überschuß von Einfügungs-DNA verknüpft.

Transformation von Plasmid-DNA

Plasmid-Konstruktionen, die sich aus der Ligation synthetischer Oligonucleotide in Plasmide pPX1651 oder pLS408 ergaben, wurden durch Transformations-Techniken in übliche Laboratoriums Stämme von Escherichia coli eingefuhrt (hinsichtlich Einzelheiten siehe Maniatis et al., Molecular Cloning. A Laboratory Manual, Cold Spring Habor Laboratory, Cold Spring Habor, New York, 1982). Plasmid-Konstruktionen wurden isoliert und wegen der hohen Transformations-Frequenzen von E. coli K-12 mit Bezug auf solche von S. typhimurium. erst in E. coli charakterisiert, bevor eine Übertragung auf Salmonella spp. stattfand. Plasmide wurden für die drei Restriktionssysteme von Salmonella typhimurium in S. typhimurium LT-2 LB5010, einen Stamm, der restriktions-negativ (aber modifikations-tüchtig) ist, transferiert, und er enthält auch eine Mutation in galE, die in höheren Transformations-Frequenzen resultiert (hinsichtlich einer Beschreibung der Restriktionssysteme von Salmonella tynphiurium siehe Bullas et al., J. Bacteriol., 141, 275, 1980).
Die Plasmide wurden dann durch Transduktions-Techniken in abgeschwächte Salmonella eingeführt. LB5010, der das erwünschte Plasmid enthielt, wurde in Luria-Brühe (LB) bis zu einer Dichte von 3 x 108 Zellen/ml gezüchtet, woraufhin D-Galactose (bis zu einer Endkonzentration von 1%) zum Züchtungsmedium hinzugegeben wurde, um die Synthese von "glattem" Lipopolysaccharid (LPS) zu induzieren. Nach 1,5 Stunden des Wachstums in Gegenwart von D- Galactose wurde der Bakteriophage P22 HT 105/1 int zu der Kultur bis zu einem mehrfachen der Infektion von einem hinzugegeben. Nach der Adsorption der Phage wurden Zellen in LB, enthaltend 0,7% Agar, immobilisiert. Die Phagen wurden geerntet und zur Transduktion von Plasmiden in abgeschwächte Salmonella, enthalten LPS, geeignet als ein Rezeptor für die transduzierende Phage P22, benutzt.

Restriktionsenzym-Analyse von DNA

Rekombinante Plasmid-DNA wurde durch Verdauung von DNA mit geeigneten Restriktionsendonucleasen und durch Elektrophorese durch 1%-ige Agarosegele in TBE-Puffer, enthaltend 5 ug/ml Ethidiumbromid, analysiert. Die Banden wurden durch Ethidiumbromid-Fluoreszens nachgewiesen.

Polyacrylamid-Gelelektrophorese

Um rekombinante Flagellin-Proteine durch Natriumdodecylsulfat (SDS)-Polyacrylaid- Gelelektrophorese (PAGE) zu analysieren, wurden 500 ul einer über Nacht ausgeführten Kultur von Bakterien, enthaltend ein rekombinantes Plasmid, zentrifugiert, und das Pellet in 200 ul von Protein-Laufmischung (0,125 M Tris-HCl, pH 6,8, 2,5% SDS, 5% 2-Mercaptoethanol, 10% Glycerin, 0,005% Bromphenol-Blau) wieder suspendiert und 10 Minuten auf 100ºC erhitzt. 20 ul jeder Probe wurden unter Bedingungen der Elektrophorese durch eine Sammelgelschicht von 4% Acrylamid und ein Trenngel von 10% Acrylamid unterworfen, die von Laemmli beschrieben sind (U.K. Laemmli, Nature, 227, 680, 1979).

Western-Blot-Analyse

Nach der SDS-PAGE von Proteinproben wurden nach dem Verfahren von Towbin et al. durch Elektrophorese gewonnene Proteine auf Nitrocellulose-Blätter übertragen (Schleicher und Schuell, Keene, NH) (H. Towbin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 76, 4350, 1979). Nach der Übertragung wurden Filter durch Inkubation in Phosphat-gepufferter Salzlauge (PBS) mit 0,5% Tween 20 15 Minuten bei Raumtemperatur blockiert. Primäre Antikörper wurden in PBS mit 0,1% Tween 20 (PBS Tween) zu einer geeigneten Kozentration verdünnt und zu den Filtern hinzugegeben. Inkubationen wurden bei Raumtemperatur für eine Dauer von mindestens 1 Stunde und bis über Nacht ausgeführt. Die Filter wurden dann in mehreren Variationen von PBS- Tween gewaschen, und es wurde mit Meerrettich-Peroxidase konjugiertes Protein A von S. aureus (Kirkegaard und Perry, MD) in einer Konzentration von 1 ug/ml hinzugegeben, gefolgt von einer Inkubation für 1 Stunde bei Raumtemperatur. Die Filter wurden mehrere Male in PBS- Tween gewaschen und das Signal mit PBS, enthaltend 0,01% Wasserstoffperoxid, 0,06% 4-Chlor- 1-naphthol (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) bei Raumtemperatur entwickelt, bis ein geeignetes Signal nachgewiesen wurde. Diese Reaktion wurde durch mehrmaliges Waschen des Filters mit destilliertem Wasser beendet.

Enzym-gekoppelter Immunosorptionsmittel-Assay auf Antikörper gegen Circumsporozoit-Protein im Serum

Um Serum-Antikörper zu messen, wurden 96 Bohrungen aufweisende Polystyrolplatten (NUNC) mit 5 ug/ml von DPAPPNANDPAPPNAN (KLH), einem synthetischen Peptid, das zwei Repeat-Einheiten des CS-Proteins von Plasmodium berghei, gekoppelt durch Glutaraldehydvernetzen mit KLH repräsentiert, überzogen. Jede Bohrung erhielt 0,1 ml Antigen in 0,1 M Carbonat/Bicarbonat-Puffer (pH 9,6). Die Platten wurden bei 37ºC in einem Feuchtigkeit enthaltenden Inkubator 18 Stunden inkubiert, bevor sie dreimal mit PBS, enthaltend 0,05% Tween 20 (PBS-T) gewaschen und mit 0,1% Gelatine in PBS für 60 Minuten bei Raumtemperatur blockiert wurden. Die Platten wurden dreimal mit PBS-T gewaschen, und es wurden Reihenverdünnungen für Seren hinzugegeben und 90 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Als eine positive Kontrolle bei den Assays wurde Anti-P. berghei CS Mab 3,28 benutzt. Die Platten wurden wie zuvor gewaschen, und es wurden voroptimierte Konzentrationen von mit alkalischer Phosphatase konjugiertem Ziegen Antimäuse-Immunglobulin (bei einer Serumverdünnung von 1:5.000) zu geeigneten Bohrungen hinzugegeben und 60 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. Die Platten wurden wiederum gewaschen, und es wurden 100 ul einer Substratlösung (p-Nitrophenylphosphat bei 1 mg/ml in Diethanolamin-Puffer, pH 9,6) zu jeder Bohrung hinzugegeben. Die Signale wurden 60 Minuten bei Raumtemperatur entwickelt und in einer automatischen ELISA-Lesevorrichtung von Bio-Tek mittels Doppel-Wellenlängen bei 410 nm und 690 nm abgelesen, wobei die Vorrichtung bei Luft keinen Wert ergibt.

Teilreinigung rekombinanter Flagella

Aus über Nacht ausgeführten Kulturen von S. dublin SL1438 gewonnene rekombinante Plasmide wurden zum Inokulieren von 150 mm Petrischalen, enthaltend 1,5% (Gew./Vol.) Difco- Agar in LB-Medium, ergänzt mit 100 ug/ml Ampicillin, benutzt, und die Platten wurden 48 Stunden bei 37ºC inkubiert. Diese Platten wurden dann mit entionisiertem Wasser gespült, und die Bakterien sanft durch Abkratzen von der Oberfläche entfernt. Diese Suspension wurde bei hoher Geschwindigkeit in einem Standard-Nahrungsmittelmischer gemischt, und die Bakterientrümmer wurden durch Zentrifugieren bei 10.000 U/min in einem Sorvall SS34 Rotor für 30 Minuten entfernt. Im Überstehenden vorhandene Flagella wurden durch Ultrazentrifugieren bei 50.000 U/min in einem Beckman 70.1Ti Rotor für 1 Stunde konzentriert. Diese Flagella-Zubereitungen wurden aufgrund einer Protein-Färbung von SDS-PAGE-Gelen mit Coomassie-Blau für etwa 90% rein geschätzt, und die Protein-Konzentrationen wurden durch Vergleich mit bekannten Mengen von Standard-Proteinen auf den gleichen Gelen geschätzt.

Immunisierung von Experimental-Tieren

Weibliche C57BL/6-Mäuse, die etwa 6 Wochen alt waren (Jackson Laboratories, Bar Habor, ME) wurden subcutan mit etwa 25 ug teilgereinlgten Zubereitungen für Flagella, emulgiert in Freunds komplettem Adjuvans, immunisiert. 4 Wochen später erfolgte eine subcutane Auffrischung mit 25 ug der gleichen Flagella-Zubereitung, emulgiert in Freunds inkompletten Adjuvans. Alle Tiere ließ man vor der primären Immunisierung, unmittelbar vor dem Auffrischen und 2 Wochen nach dem Auffrischen aus der Schwanzvene bluten.
Zur Immunisierung mit lebender, abgeschwächter Salmonella wurden Kulturen von dublin SL1438, die rekombinante Plasmide ergaben, in LB-Medium, das mit 100 ug/ml Ampicillin ergänzt war, bis zur Mitte der Aufzeichnungsphase (mid-log phase) gezüchtet, durch Zentrifugieren gewonnen, mit PBS gewaschen und bis zu einer Konzentration von 1 x 10&sup8; Zellen/ml wieder suspendiert. 0,1 ml dieser Suspension wurde intraperitoneal 6 Wochen alten C57BL/6- Mäusen (Jackson Laboratories, Bar Habor, ME) verabreicht. 4 Wochen später wurden die Tiere nochmals mit 1 x 10&sup8; Zellen geimpft, die in der gleichen Weise zubereitet und verabreicht wurden. Die Tiere ließ man, wie oben beschrieben, bluten.

Assay auf bakterielle Beweglichkeit

S. dublin SL5927 ist ein geißelloser (und somit unbeweglicher) Bakterienstamm aufgrund der Ersetzung seines einzigen Flagellin-Gens durch H1-i::Tn10 durch Transduktion. Die Konstruktion von SL5927 ist oben in dem Abschnitt "Konstruktion von Flagellin-Minus-Vaccin- Stämmen" beschrieben.
Über Nacht hergestellte Kulturen von rekombinante Plasmide ergebendem S. dublin SL5927 wurden zum Inokulieren von Platten von Beweglichkeitsagar (LB plus 100 ug/ml Ampicillin mit 0,3% Gew./Vol. Difco-Agar), unter Verwendung einer Inokulationsnadel, benutzt. Die Platten wurden über Nacht bei Raumtemperatur und 6 Stunden bei 37ºC inkubiert. Der Durchmesser der Zone der Bakterienausbreitung wurde gemessen als ein Indikator der Bakterienbeweglichkeit.

ERGEBNISSE

Konstruktion rekombinanter Flagellin-Gene

Plasmid pLS402 enthält ein 3,8 kb EcoRI-Fragment der Genom-DNA, die das vollständige Flagellin-Strukturgen H1-d (H1 Antigen d) (L.-N. Wei und T.M. Joys, J. Mol. Biol., 186, 791- 803, 1985) (Figuren 2A, 2B) von S. muenchen einschiießt (American Type Culture Collection, Zugangsnummer 8388, das in die EcoRI-Stelle des Plasmids pBR322 eingeführt ist (Figur 1; L.- N. Wei und T.N. Joys, J. Mol. Biol., 186, 791, 1985). Die Untersuchung der veröffentlichten Basensequenz der codierenden Region für dieses Gen (Figur 2B) zeigte zwei EcoRV-Restriktionsstellen, die durch 48 bp bei den Positionen 619 und 667 voneinander getrennt sind. Durch Vergleich mit Sequenzen, die aus anderen H1-Genen gewonnen wurden, wurde gezeigt, daß die diese beiden Restriktionsstellen enthaltende Region des Gens, sowohl hinsichtlich der primären Aininosäure-Sequenz als auch hinsichtlich der Anzahl von Resten, sehr variabel war. Wir zogen daher den Schiüß, daß diese Region des Gens für den Zusammenbau und die Funktion der Geißel entbehrlich und somit eine geeignete Stelle für die Einführung von DNA-codierenden Fremd- Epitopen wäre. Um diese Strategie zu nutzen, war es erforderlich, das H1-d-Gen auf einen Plasmid-Träger zu subklonieren, der keine EcoRV-Restriktionsstellen aufwies. Es wurde daher das 3,8 kb EcoRI-Fragment von pLS402 isoliert und in die EcoRI-Stelle von pUC18 und von pUC19 subkloniert, was zur Konstruktion der Plasmide pPX1650 bzw. pLS405 führte. Diese letztgenannten Vektoren konnten dann zum Austausch der autentischen H1-d-DNA zwischen den Nucleotid-Nummern 619 und 667 (Figur 2B) gegen synthetische oder klonierte DNA benutzt werden, die für ein Fremd-Epitop codiert. Um das Screenen rekombinanter Plasmide weiter zu erleichtern, wurde das 48 bp-Fragment zwischen den EcoRV-Stellen in jedem Plasmid durch Verdauen von pPX1650 und pLS405 mit EcoRV und Neuverknüpfen jedes der verdauten Plasmide entfernt. Die Transformanden wurden dann hinsichtlich des Verlustes des 48 bp-Fragments gescreent, auf welche Weise pPX1651 und pLS408 erhalten wurden (Figur 1). Diese Plasmide behielten nur eine einzige EcoRV-Stelle für die Einführung von Fremd-Epitopen. Außerdem war es nun möglich, durch die Größe einen Vektor mit einer Einführung eines 48 bp- Stückes aus Fremd-DNA von einem Vektor, der nur wieder mit sich selbst verknüpft worden war, zu unterscheiden.
Um die Fähigkeit von Fremd-Epitopen, als genetische Fusionen mit Flagellin exprimiert zu werden, zu testen, wurden verschiedene genetische Konstruktionen hergestellt, wie unten beschrieben.

Konstruktion eines rekombinanten Flagellin-Gens, das für ein Epitop eines Malariaparasiten als ein Flagellin-Fusionsprotein codiert

Es wurden rekombinante Flagellin-Gene konstruiert, die für Epitope von Circumsporozoit-Proteinen von Malariaparasit (Gattung Plasmodium) als Flagellin-Fusionsproteine codierten.
Anfänglich wurde zwei komplementäre 48-Rest-Oligonucleotide synthetisiert, die für vier Kopien der 4-Aminosäure-Repeatsequenz des Circumsporozoit-Proteins von P. falciparum codieren (Figur 3A). Die Sequenzen dieser Nucleinsäure-Fragmente waren derart, daß bei der Wärmebehandlung komplementäre Dreibasen-Überhänge erzeugt wurden, die das Verknüpfen der Oligonucleotide mit sich selbst nur in einer Kopf-Schwanz-Weise gestatteten, was die Einführung multipler Oligonucleotide, alle in der gleichen Orientierung, sicherstellte. Nachdem die Fragmente wärmebehandelt waren, wurden sie durch Behandlung mit dem großen Fragment von DNA-Polymerase (Klenow-Enzym) behandelt und mit pPX1651 verknüpft, das vorher mit EcoRV verdaut worden war. Nach der Transformation des E. coli-Stammes JM103 wurden Ampicillin-resistente Kolonien auf die Anwesenheit rekombinanter Plasmide durch Restriktionsstellen-Analyse von Plasmid-DNA gescreent. Zwei Rekombinante wurden identifiziert: pPX1653 enthält eine einzige Kopie des eingeführten Oligonucleotids und pPX1652 enthält drei eingeführte Nucleotide. Gemäß DNA-Sequenzanalyse waren die drei Oligonucleotid-Fragmente, die in pPX1652 vorhanden waren, die durch Behandlung mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I vor der Ligation mit pPX1651 aufgefüllt wurden, in der gleichen Orientierung eingeführt. Dieses Verfahren führte zur Einführung eines zusätzlichen Asparaginrestes zwischen den 16- Aminosäure-Blöcken, für die das Oligonucleotid codiert. Das Westernblotting von Zellextrakten unter Einsatz von monoklonalen Antikörpern, die für die Repeatregion des P. falciparum spezifisch waren, zeigte, daß die drei Klone immunreaktive Proteine eines geeigneten Molekulargewichtes für rekombinantes Flagellin exprimierten.
Es wurde eine ähnliche Strategie benutzt, um rekombinante Flagellin-Moleküle zu schaffen, die die wiederholte 8-Aminosäure-Sequenz des CS-Proteins von P. berghei (Figur 3B) exprimieren. In diesem Satz von Experimenten wurden Oligonucleotide vor der Behandlung mit Klenow-Enzym verknüpft, um die Einführung benachbarter Oligonucleotide, alle in der gleichen Orientierung und ohne dazwischenliegende DNA-Sequenzen, sicherzustellen. Es wurden Klone erhalten, die ein, zwei oder drei Kopien des spezifischen Oligonucleotids enthielten, und diese wurden mit pPX1661, pPX1662 bzw. pPX1663 bezeichnet. Bakterien, die diese Klone enthielten, exprimierten immunreaktive Proteine des geeigneten Molekulargewichtes, wenn sie unter Einsatz eines auf das CS von P. berghei spezifischen monoklonalen Antikörpers mittels Western- Analyse gescreent wurden.

Konstruktion eines rekombinanten Flagellin-Gens, das für ein Epitop der B-Untereinheit von Choleratoxin als ein Flagellin-Fusionsprotein codiert.

Eine ähnliche Strategie wurde für die Expression eines Epitops eines Exotöxins des pathogenen Bakteriums Vibrio cholerae als ein Flagellin-Fusionsprotein benutzt. Für die Konstruktion dieser Rekombinante wurden komplementäre Oligonucleotide (Figur 4B) synthetisiert, die für das durch das CTP3-Peptid (Figur 4A) repräsentierte Epitop der B-Untereinheit des Choleratoxins codieren (C.O. Jacob et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80, 7611, 1983). Die durch die synthetischen Oligonucleotide codierte Aminosäure-Sequenz war folgende:
(N)Val-Glu-Val-Pro-Gln-Ser-Gly-His-Ile-Asp-Ser-Gln-Lys-Lys-Ala(C)
und sie repräsentiert die Reste Nummer 50-64 (Figur 4B) der B-Untereinheit. Die komplementären Oligonucleotide wurden wärmebehandelt und durch Behandlung mit Klenow-Enzym mit glatten Enden versehen. Diese Fragmente wurden dann in die EcoRV-Stelle von pLS408 eingeführt und in E. coli CL477 transformiert. Ein einen einzigen Einsatz enthaltendes Plasmid wurde durch Restriktions-Analyse identifiziert und als pLS411 bezeichnet. pLS411 wurde durch DNA-Sequenzieren des Einsatzes bestätigt, und durch Westernblot-Analyse wurde festgestellt, daß es den Einsatz in der erwünschten Orientierung enthält, da es ein Molekül des geeigneten Molekulargewichtes exprimierte, das sowohl von Anti-H1-d-Antiserum als auch monoklonalen und polyklonalen Kaninchen-Antiseren erkannt wurde, die auf das CTP3-Peptid gebildet wurden.

Expression rekombinanter Flagellin-Fusionsproteine

Um diese rekombinanten Flagellin-Moleküle in einem abgeschwächten Bakterienstamm zum Einsatz als Lebendvaccine zu exprimieren, wurden alle oben beschriebenen Konstruktionen (Figur 5) in abgeschwächte Stämme von S. dublin (SL1438 und SL5927) durch Phagen-Transduktion eingeführt (Schmeiger, Mol. Gen. Genetics, 119, 75,1972). Das zum Abschwächen dieser Stämme benutzte Verfahren wurde von Stocker und seinen Mitarbeitern beschrieben (S.K. Hoiseth und B.A.D. Stocker, Nature, 291, 238, 1981; B.A.D. Stocker et al., Dev. Biol. Std., 53, 47, 1982; US-PS 4,550,081). Spezifisch wurden in das Gen aroA Deletionen eingeführt, die zu einem vermehrten Bedarf an Phenylalanin, Tryptophan, Tyrosin und dem Folsäure-Vorläufer p-Aminobenzoesäure und dem Enterochelin-Vorläufer Dihydroxybenzoesäure führte. p-Aminobenzoesäure ist in tierischen Geweben nicht vorhanden, und Mitglieder der Enterobakteriaceae sind nicht in der Lage Folsäure aus tierischen Gewebe zu assimilieren, was zu ihrer Abschwächung innerhalb eines tierischen oder menschlichen Wirtes führt. An Extrakten jedes dieser Stämme wurde eine Western-Blot-Analyse ausgeführt, und die Synthese rekombinanter Flagelline wurde unter Einsatz beider gegen Flagellin-Epitope gerichteter Antikörper (Figur 6) gezeigt, was erkennen läßt, daß diese Stämme wertvoll als Lebendvaccine sein könnten, um Immunreaktionen gegen die Fremd-Epitope auszulösen, die in die Flagellin-Moleküle eingeführt sind.

Immunogold-Markierung von rekombinantem Flagellin

Die Exponierung des Fremd-Epitops an der Oberfläche der Flagella wurde durch Gold- Immunmarkierung der Flagella von mit Formalin fixierten Bakterien mit MAb TE33, als dem ersten Antikörper, nachgewiesen. Der Stamm SL5676, der entweder Plasmid pLS411, das den kompletten CTP3-Einsatz aufweist oder Plasmid pLS408 enthält, wobei die in vitro-Deletion, aber nicht der Einsatz, durch Behandlung mit MAb TE33 und Gold-konjugiertem Ziegen-Antikörper gegen Mäuse IgG (Janssen) für die Sichtbarmachung mit dem Elektronenmikroskop (30.000-fache Vergrößerung) marklert wurde. Die Sichtbarmachung der Markierung zeigte, daß das CTP3-Epitop auf der Oberfläche der Bakterien vorhanden war.

Rekombinante Flagellin-Fusionsproteine sind in der Lage, sich zu funktionierenden Flagella zusammenzusetzen

Die Fähigkeit der rekombinanten Flagellin-Proteine zu intakten Flagella bzw. Geißeln zu polymerisieren und daher auf der äußéren Oberfläche der Bakterien vorhanden zu sein, wurde durch die Restauration der Beweglichkeit in einem normalerweise nicht beweglichen (weil Flagellin-negativen) Wirt demonstriert (Tabelle III). TABELLE III BEWEGLICHKEIT IN S. DUBLIN SL5927¹ Plasmid Heterologes Antigen² Durchmesser der Ausbreitung (mm)³ CS-Protein von P. falciparum CS-Protein von P. berghei B-Untereinheit von Choleratoxin
1 (nicht bewegliches) S. dublin SL5927 = dublin SL1438 H1- i;;Tn10
2 Das native Antigen, von dem ein Teil als ein rekombinantes Flagellin-Fusionsprotein exprimiert wird, für das das Plasmid in der linken Spalte codiert.
3 Über Nacht ausgeführte Kulturen wurden in das Zentrum von 60 mm Petrischalen gestochen, enthaltend 0,3% Agar in LB-Medium, das mit 100 ug/ml Ampicillin ergänzt war. Die Platten wurden 16 Stunden bei Raumtemperatur und 6 Stunden bei 37ºC inkubiert. Der Durchmesser der Zone der Bakterienausbreitung in mm wurde gemessen.
* codiert für mindestens einen Teil des Flagellin-Gens H1-d.
SL5927 ist ein nichtbewegliches Derivat von SL1438, konstruiert durch Unterbrechen der Chromosomenkopie des Strukturgens, das für das H1-Antigen (Flagellin) codiert, durch Einführung eines transposierbaren Elementes (Tn10); dieser Stamm hat, wie andere von S. dublin, kein H2-Allel. SL5927 wurde, wie oben in dem Abschnitt "Konstruktion von Flagellin-Minus-Vaccin-Stämmen" konstruiert. Die Einführung eines der rekombinanten Flagellin-Plasmide restauriert mindestens die Teilbeweglichkeit dieses Stammes (Tabelle III), was anzeigt, daß sich diese rekombinanten Flagelline zu funktionierenden Flagella polymerisieren können, und daß die Fremd-Epitope daher auf der äußeren Oberfläche der Zelle vorhanden sind.

Immunogenität der heterologen Epitope auf rekombinanten Flagellin-Fusionsproteinen

Um die Fähigkeit von rekombinanten Flagellinen, Fremd-Epitope dem Immunsystem des Wirtes zu liefern, zu demonstrieren, wurden C57BL/6-Mäuse mit teilgereinigten Flagella, isoliert aus S. dublin SL1438, das in jedem Flagellin-Molekül zwei Kopien des immundominanten Repeat-CS von P. berghei exprimiert (codiert durch Plasmid pPX1661) oder Wildtyp H1-d Flagella (codiert durch Plasmid pPX1650), immunisiert. Den Mäusen wurden subcutan 25 ug von Flagellin-Protein, emulgiert in Freund's kompletten Adjuvans, in der Woche 0 injiziert, und 4 Wochen später wurde die Impfung mit 25 ug der gleichen Zubereitung in Freunds inklompetten Adjuvans subcutan aufgefrischt. Man ließ die Tiere vor der ersten und zweiten Immunisierung und 2 Wochen nach der Auffrischung bluten. Die Seren wurden mittels ELISA auf Antikörper untersucht, die spezifisch sind für synthetische Peptide, die für zwei Kopien des CS-Repeat von P. berghei codieren (DPAPPNAN). Anti-P berghei Antikörper (Figur 7) waren 4 Wochen nach der primären Immunisierung etwas über dem Hintergrund, und die Niveaus erhöhten sich sehr stark nach der Auffrischungs-Immunisierung, während die Niveaus dieser Antikörper in Tieren, die zur Kontrolle mit Wildtyp-Flagella immunisiert waren (codiert durch Plasmid pPX1650), sich von den Werten vor dem Bluten (Figur 7, Woche 0) nicht merklich unterschieden.
Die Immunisierung von C57BL/6-Mäusen mit lebendem S. dublin SL1438, der rekombinante Flagella exprimiert, die das CS-Epitop von P. berghei tragen (codiert durch Plasmid pPX1662) führte auch merkliche Niveaus der Serum-Antikörper auf dieses Epitop relativ zu Kontrolltieren ein, die mit dem gleichen Bakterienstamm immunisiert waren, der Wildtyp-Flagella H1-d exprimierte (codiert durch Plasmid pPX1650) (Figur 8), was die Fähigkeit lebender, abgeschwächter Bakterien veranschaulicht, ein Fremd-Epitop als ein Flagellin-Fusionsprotein zu liefern, das auf der Oberfläche dieser Organismen exprimiert wird.
Hinsichtlich Tests der Immunogenität ersetzten wir das Phase-1 Flagellin-Gen, H1-g,p, des von Aromaten abhängigen Lebendvaccin-Stammes S. dublin SL1438 (J. Clements et al., Infect. Immunol., 53, 685, 1987; G. Dougan et al., Parasite Immunol., 9, 151, 1987 und T.P. Poirier et al., J. Ex-. Med., 68, 25, 1988) durch ein durch ein Transposon inaktiviertes Flagellin-Allel, H1-i::Tn10; da S. dublin einphasig ist, war der resultierende Stamm SL5928 nicht beweglich, doch wurde er nach der Transformation mit Plasmiden, die entweder den Wildtyp, die Deletion oder die chimäre Form von H1-d enthielten beweglich, wie für den Flagellin-negativen S. typhimurium-Wirt SL5676 beobachtet. Die von pUC abgeleiteten Plasmide sind in dem benutzten Lebendvaccin-Stamm stabil, wie durch die Ampicillin-Resistenz aller von mehr als 100 Kolonien aus einer Bakteriensuspension nach zwei Durchgängen in der Brühe ohne Ampicillin und die Ampicillin-Resistenz aller Kolonien, die bei der Autopsie aus Mäuselebern gewonnen wurden, gezeigt. Wir immunisierten C57BL/6-Mäuse mit drei intraperitonealen Injektionen von 5 x 10&sup6; Bakterien, die entweder durch Formalin abgetötet oder lebend waren, in Intervallen von 7 Tagen. Eine Woche nach der letzten Injektion ließ man die Mäuse bluten, und ihre Seren wurden durch Enzym-gekoppelten Immunisorptionsmittel-Assay (ELISA) auf Reaktivität mit CTP3- Peptid oder das ganze Choleratoxin (Figur 9) getestet. Es wurde in allen Seren Antikörper zum eingeführten Epitop gefunden; alle Seren reagierten so stark mit Choleratoxin, wie mit dem CTP3-Peptid.
Figur 9 zeigt die Antikörper-Reaktion von fünf mit SL5929, einem Lebendvaccin S. dublin-Stamm, der die chimären Flagellin-Gene exprimiert, immunisierten Mäusen, vor der Immunisierung, nach der Immunisierung mit SL5929. Die Reaktivität des Mäuseserums mit dem ganzen nativen Choleratoxin wurde durch Festkörperphasen-ELISA mit Peroxidase konjugiertem Ziegenantikörper zum Mäuse IgG (TAGO) gemessen (C.O. Jacob et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 80, 7611, 1983). Den Mäusen wurde dreimal in wöchentlichen Intervallen intraperitoneal 5 x 10&sup6; mit Formalin abgetötete Bakterien injiziert, die Seren wurde 7 Tage nach der letzten Injektion gesammelt. Die Balken repräsentieren die mittlere optische Dichte für Seren von fünf Mäusen (SE größer als 15% für alle Verdünnungen).

Diskussion

Wir zeigen die Expression von Epitopen, die kritisch für die Einführung schützender Immunreaktionen auf pathogene Organismen sind, als Fusionsproteine mit Flagellin, dem Protein der Bakterien-Geißelfilaments. Es wurden verschiedene rekombinante Flagellin-Gene konstruiert, die für Epitope codierten, die normalerweise durch einen Protozoen-Parasiten oder durch ein Bakterium exprimiert werden. Das immundominante Repeat-Epitop des Circumsporozoit (CS)-Proteins von P. falciparum und das mit P. berghei verbundene analoge Epitop wurden in eine Region des H1-d-Gens von Salmonella muenchen eingeführt. Ein Oligonucleotid, das für ein schützendes Epitop codiert, das auf der bindenden Untereinheit von Choleratoxin (CT-B) vorhanden ist, wurde auch in ein H1-d-Flagellin-Gen eingeführt. All diese rekombinanten Konstruktionen exprimieren Moleküle, die durch SDS-PAGE-Gele mit Beweglichkeiten wanderten, die mit ihren erwarteten Molekulargewichten übereinstimmten. Zusätzlich wurden diese Moleküle auf Western-Blots durch Antisera erkannt, die für das Flagellin-Molekül H1-d spezifisch sind sowie durch Reagenzien, die die heterologen Epitope auf dem nativen Protein erkennen.
Diese Hybrid-Proteine behalten ihre Fähigkeit, auf der Oberfläche rekombinanter Bakterien exprimiert zu werden, bei, was die Isolation und Reinigung dieser Moleküle zum Einsatz als Komponenten eines Untereinheit-Vaccins erleichtert. Zusätzlich wurden diese Moleküle nicht nur durch E. coli exprimiert, das die rekombinanten Plasmide enthielt, sondern sie wurden auch in mehrere abgeschwächte Salmonella-Stämme eingeführt, die als Lebendvaccine brauchbar sein können. Die Expression der rekombinanten Flagellin-Moleküle in abgeschwächten Invasionsbakterien kann die Bildung von Lebendvaccinen gegen im wesentlichen jedes Pathogen gestatten, für das kritische immunogene Epitope identifiziert werden können.

BEISPIEL 2

Expression von Epitopen des Oberflächenantigens von Hepatitis B als rekombinante Flagellin-Fusionsproteine

Bei dieser Untersuchung führten wir zwei spezifische HBV S-Gensequenzen, die für Aminosäuresequenzen S122-137 bzw. preS&sub2; 120-145 codieren, in das Flagellin-Gen H1-d von Salmonella ein, und es wurden HBsAg-Epitope durch einen Flagellin-negativen abgeschwächten S. dublin-Stamm exprimiert, der durch die rekombinanten Plasmide transformiert war. Die Immunisierung von Tieren mit lebenden Bakterien führte sowohl zu Anti-HBs- als auch Anti-Flagellin-Reaktionen.

Synthetische Oligonucleotide, synthetische Peptide und rekombinante DNA-Methoden

Einsträngige Oligonucleotide mit spezifischer Sequenz wurden synthetisiert und durch Polyacrylamid-Gelelektrophorese gereinigt. Synthetische Peptide S 122-137 und preS&sub2; 120-145 mit Sequenzen, die den eingesetzten synthetischen Oligonucleotiden entsprachen, wurden nach dem Festkörperphasen-Verfahren von B.W. Erickson und R.B. Merrifield in The Proteins, Herausgeber K. Neurath und R.L. Hill (Academic Press, New York) Band 2, Seiten 255, (1976) synthetisiert und durch Gelfiltration auf Sephadex LH-20 gereinigt. Die Reinheit der Peptide wurde durch analytische Umkehrphasen-HPLC und Aminosäure-Analyse überprüft. Die Klonierungstechniken waren, wie durch T. Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manuel, Cold Spring Habor Laboratory, Cold Spring Habor, 1982, beschrieben. Es wurden Bakterien-Lysate aus 1,0 ml über Nacht durchgeführten Kulturen durch Zentrifugieren der Bakterien und erneutes Suspendieren derselben in 0,1 ml Probenpuffer, enthaltend 2% SDS (Sigma), 2% B- Mercaptoethanol (Sigma) und PMSF (Phenylmethansulfonylfluorid), TLCK (N-Tosyl-L-lysinchlormethylketon), TPCK (N-Tosyl-L-phenylalanin-chlormethylketon), Leupeptin, Pepstatin (Protease-Inhibitoren, Boehringer Mannheim) in den durch die Hersteller vorgeschlagenen Konzentrationen zubereitet.

Antiseren

Ein polyklonales Kaninchen-anti-H1-d (Salmonella-Phase-1-Flagellarantigen) Serum, erhalten von Dr. P.H. Makela, National Public Health Institute, Helsinki, Finnland, wurde als ein Anti-Flagellin-Serum eingesetzt. Polyklonales Ziegen-anti-HBs (gebildet gegen natives HBsAg, gereinigt aus menschlichem Plasma) wurde von der Dako Company käuflich erworben. Die Antiseren gegen die Peptide S 122-137 und preS&sub2; 120-145 wurden durch Immunisierung von Meerschweinchen mit dem entsprechenden, synthetischen Peptid, konjugiert mit Thyroglobulin, gebildet. Optimale Verdünnungen dieser Antiseren, die durch Titration gebildet wurden, wurden zum Nachweisen der Expression der entsprechenden HBsAg-Epitope in Bakterien-Lysaten durch Immunoblotting benutzt.

Immunisierung

Bakterien-Klone zur Immunisierung wurden über Nacht bei 37ºC in Luria-Brühe gezüchtet, enthaltend 50 mg/ml Ampicillin. Die Zellen wurden zweimal gewaschen und wieder in Phosphat-gepufferter Salzlösung (PBS) suspendiert. Zwei weiße Neuseeland-Kaninchen wurden an den Tagen, 0, 7, 14, 21 und 28 mit jedem Bakterien-Klon durch intramuskuläre Injektion von 1 ml einer Suspension immunisiert, die etwa 109 lebende Bakterien enthielt, und es wurden Blutproben an den Tagen 0, 28, 56 und 84 genommen.
Drei Meerschweinchen und 10 Mäuse (B10.BR-Mäuse für preS&sub2; 120-145-Klone und BALB/cj-Mäuse für S 122-137-Klone), die bekannten reagierenden Stämme für die beiden Peptide (F. Chiasari, persönliche Mitteilung und D.R. Milich et al., J. Ex-. Med., 164, 532, 1986), wurden mit jedem Klon immunisiert, indem man an den Tagen 0, 7, 14 und 28 etwa 10&sup9; lebende Bakterien in 1 ml Suspension in die Schnauze jedes Meerschweinchens einbrachte oder etwa 5 x 10&sup8; lebende Bakterien in 0,05 ml in die Schnauze jeder Maus einbrachte und Blutproben an den Tagen 0, 28, 56 und 84 entnahm.
Die Seren wurden mittels ELISA (K. Gooderham in Methods in Molecular Biology, Herausgeber J .M. Walker, Hummang Press, Clifton, NJ, Band 1: Proteins, Seite 165) mit mit alkalischer Phosphatase konjugierten Anti Kaninchen , Anti-Mäuse- oder Anti-Meerscheinchen-Antiseren, die von Boeringer Mannheim käuflich erworben wurden, auf spezifische Antikörper untersucht. Der Antikörper-Titer bezieht sich auf die höchste Verdünnung des Testserums, bei dem das Verhältnis von A405 des Testserums und A405 des Vorimmun-Serums oberhalb von 2,0 lag.

Konstruktion rekombinanter Plasmide

In dieser Untersuchung wurden zwei synthetische Oligonucleotide, die jeweils für eine HBsAg- (Subtyp ayw) Aminosäuresequenz codierten, die ein schützendes oder teilweise schützendes Epitop zu enthalten schien, benutzt (S 122-137 und preS2 120-145). Die oberen Linien in Figur 10 repräsentieren die Nucleotid-Sequenzen der entsprechenden, synthetischen Oligonucleotide, die für die rahmengemaße Einführung in EcoRV-Stelien des Flagellin-Gens (Figur 10) geschaffen wurden. Die ausgewählten Codons waren die am häufigsten im Flagellin-Gen H1-d von Salmonella benutzten (L.-N. Wei und T.M. Joys, J. Mol. Biol., 186, 791, 1985). Restriktionsstellen für -KpnI und BamHi (für die Codierungssequenzen S 122-137 bzw. preS2 120-145) wurden eingeschlossen, um die Identifikation von Rekombinanten durch Restriktions-Analyse zu gestatten. Eine Halbstelle für EcoRV wurde an das 3'-Ende des preS2-Oligonucleotids gesetzt, um die Ligation mit Oligonucleotiden für andere HBV-Epitope zu erleichtern. Zwei Stoppcodons (unterstrichen) wurden zur leichten Auswahl von Klonen mit Einführungen in der erwünschten Orientierung in dem Komplementärstrang für das preS2-Oligonucleotid angeordnet. Das Flagellin-Gen war im Plasmid pLS405 enthalten, das aus einem 3,8 kb Genom-Fragment von S. muenchen bestand, das die 1,5 Kb Flagellin-codierende Sequenz enthielt, die in die EcoRI-Stelie von Plasmid pUC19 geklont war (siehe Beispiel 1). Die zentrale hypervariable Region des Wildtyp- Flagellin-Gens enthält zwei im Rahmen befindliche EcoRV-Stellen, die 48 Basenpaare (bp) auseinanderliegen (Figur 10). Die Deletion dieses LQRV-Fragments in pLS405 zur Herstellung des Plasmids pLS408 vermindert die Geißelbildung der Bakterien, beseitigt sie aber nicht (siehe Beispiel 1). Überlappende komplementäre, einsträngige, synthetische Oligonucleotide wurden hybridisiert, phosphoryliert, mit Klenow-Fragment der E. coli DNA-Polymerase repariert, um doppelsträngige DNA-Fragmente mit glatten Enden herzuspellen, dann mit T4 DNA-Ligase in die EcoRV-Stelie von pLS408 ligiert und die Ligations-Reaktionsmischung wurde benutzt, um CL447, einen Varianten des Flagellin-negativen Stammes E. coli C600 hag&supmin; zu transformieren. Klone mit rekombinanten Plasmiden wurden durch Kolonie-Hybridisierung unter Einsatz des mit ³²P marklerten, entsprechenden synthetischen Oligonucleotids als Sonde und durch Restriktions-Verdauung identifiziert. Die Anzahl, Orientierung, der Leserahmen und die Genauigkeit der Einfügungen wurde durch Didesoxynucleotid-Sequenzierung bestimmt (F. Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 74, 5463, 1977), wozu ein synthetischer 15 Nucleotid-Primer, entsprechend einer Flagellin-Gen-Sequenz etwa 30 bp stromabwärts der EcoRV-Stelle, benutzt wurde. Mehrere rekombinante Plasmide mit 1 bis 3 Kopien der entsprechenden synthetischen Oligonucleotid-Sequenz in verschiedenen Orientierungen wurden isoliert und weiter charakterisiert.

Charakterisierung rekombinanter Klone

Rekombinante Plasmide wurden zur weiteren Analyse zum Transformieren von kompetenten Zellen von S. typhimurium LB5000 (einem restriktions-negativen, modifikations-tüchtigen Stamm ohne Geißeln mit einer Mutation flaA66) benutzt und dann durch Transduktion unter Verwendung der Phage P22 HT105/1 int, in jedem Falle mit Auswahl für Ampicillin-Resistenz, in einen Flagellin-negativen Lebendvaccin-Stamm von dublin SL5928 transferiert. SL5928 ist ein von dublin SL1438 (B.P. Smith et al., Amer. J. Veterin. Sci., 45, 2231, 1984) abgleiteter, von Aromaten abhängiger Stamm, der nicht beweglich ist, weil er monophasisch ist, wobei sein einziges Flagellin-Gen durch Einführung des Transposons Tn10 inaktiviert wurde.
Antigene, die sowohl in dem hag&supmin;-Variantenstamm C600 von E. coli als auch in SL5928 exprimiert wurden, wurden durch Immunoblotting untersucht, wobei entweder Kanlnchen-anti- H1-d- (als Anti-Flagellin eingesetzt) oder Ziegen-anti-HBsAg- oder Anti-synthetische preS&sub2; 120- 145 Peptid-Antiseren eingesetzt wurden. Bakterien-Lysate der E. coli C600 hag&supmin;-Variante, die mit rekombinanten Plasmiden transformiert war, die Sequenzen enthielten, die für S 122-137 (S16e und S20e), die Sequenz für preS&sub2; 121-145 (ps8e) oder die Sequenz für preS&sub2; 120-145 (pS2le) codierten sowie von S. dublin SL5928, enthaltend die gleichen Plasmide (S16s, S20s bzw. pS8s, pS21s) und Kontrollen, bestehend aus Lysaten des nicht transformierten E. coli C600 hag&supmin;-Stammes und S. dublin SL5928, S. dublin SL5985, der SL5928, transformiert nur mit dem Eltern-Plasmid pLS405 unter Deletion des EcoRV-Fragmentes und von HBsAg aus einem Patientenserum, wurden drei Minuten auf 100ºC vor dem Beladen erhitzt. Die Proteine wurden durch Natriumdodecylsulfat-12,5% Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) getrennt (U.K. Laemmli, Nature, 221 680, 1970). Die Proteine wurden auf Nitrocellulose-Filter übertragen, die mit entweder Kaninchen-anti-Flagellin H1-d-Antiserum, als Anti-F bezeichnet, oder mit Ziegen-anti-HBsAg oder Kaninchen-anti-synthetisches Peptid-preS&sub2; 120-145 immunogefärbt waren. Der Inkubation mit einem geeigneten zweiten Antikörper, konjugiert mit entweder alkalischer Phosphatase oder Peroxidase, folgte eine Umsetzung mit NBT-BCIP (für alkalische Phosphatase) oder DAB-H&sub2;O&sub2; (für Peroxidase).
Wie erwartet, wurde in der E. coli 600 hag&supmin;-Variante oder in S. dublin SL5928 die kein intaktes Flagellin Gen aufwiesen, kein Flagellin Antigen nachgewiesen. Es wurden zwei elek trophoretische Komponenten, die als Flagellin-Antigen reagierten, im Klon S20 nachgewiesen, und die Grundlage dieses Komplexmusters ist nicht klar.
Gegen HBsAg (ayw) gebildete Ziegen anti HBs, gereinigt aus menschlichem Plasma, reagierten mit den Hybrid-Flagellin-Proteinen der Klone S16 und S20 (mit der fur S122-137 codierenden Sequenz) und der Klone pS8 und pS21 (mit der fur preS&sub2; 121-145 bzw. preS&sub2; 120-145 codierenden Sequenz), was zeigt, daß Hybrid Proteine dieser Klone Epitope enthielten, die durch dieses Anti-HBs enthaltende Serum erkannt wurden.
Kaninchen anti Peptid preS&sub2; 120-145 reagierte mit den Hybrid Flagellin Proteinen der Klone pS8 und pS21 mit der preS&sub2;-Sequenz und nicht mit den Proteinen irgendeines der Klone mit der S-Sequenz.
Das Zusammensetzen rekombinanten Flagellins, das HBsAg-Epitope trug, wurde durch Elektronenmikroskopie von Bakterien untersucht, die das Hybrid-Flagellin exprimierten. Im beweglichen Klon wurden Flagella mit einer Morphologie auf den meisten Bakterien gesehen, die von der der Wildtyp-Flagella nicht zu unterscheiden war. In den drei nicht beweglichen (beurteilt durch die Fähigkeit, sich auf halbfestem Agar auszubreiten), aber Flagellin-positiven Klonen S16, pS8 und pS21 wurden sehr wenige Flagella beobachtet (die Daten sind nicht gezeigt).
Figur 11 faßt die Eigenschaften von sieben rekombinanten Plasmiden zusammen, die untersucht wurden. Die durchgezogenen (für S-Sequenzen) oder schraffierten (für preS&sub2;-Sequenzen) Pfeile repräsentieren die Orientierung und Anzahl der synthetischen Nucleotid-Sequenzen, die zwischen den EcoRV-Stellen des Flagellin-Gens mit Bezug auf die Orientierung des Flagellin-Gens (repräsentiert durch die getüpfelten Pfeile) für pLS405 eingeführt wurden. Die Bakterien-Beweglichkeit wurde unter Verwendung von halbfestem Agar getestet. Kaninchen wurden mit S. dublin SL5928 immunisiert, der mit einzelnen Plasmiden transformiert war, und die Antikörper-Reaktionen wurden durch ELISA gemessen, wobei man jedes synthetische Peptid als Überzugs-Antigen einsetzte. "nd" bedeutet "nicht ausgeführt". Wie erwartet, führten nur Plasmide mit S- oder preS&sub2;-codierenden Sequenzen in der gleichen Orientierung wie beim Flagellin- Gen (S16, S20, pS8 und pS21) zur Expression von Hybrid-Flagellin-Proteinen mit nachweisbaren S- oder preS&sub2;-Determinanten. Von der geringen Anzahl untersuchter Plasmide waren drei der vier mit einem Einsatz in einer Orientierung entgegengesetzt zu der des Flagellin-Gens (S20, S6 und S27) beweglich; Lysate von Bakterien, die das vierte, pS2, trugen, banden, wie erwartet, keinen Anti-d-Antikörper, da das preS&sub2;-Oligonucleotid in umgekehrter Orientierung zwei Terminationscodons (Figur 10) einschließt. Solche mit einem oder mehreren Einsätzen in der gleichen Orientierung und keinem Einsatz in der entgegengesetzten Orientierung (S16, pS8 und pS21) breiteten sich in halbfestem Medium nicht aus, obwohl notdürftige Flagella bzw. Geißeln durch Elektronenmikroskopie nachgewiesen wurden, und sowohl Flagellin- als auch HBsAg-Epitope durch Immunoblotting nachgewiesen wurden.

Immunogenität von Bakterien. die Hybrid-Proteine exprimieren

Die Immunogenität von HBsAg-Epitopen in den Hybrid-Flagellin-Proteinen wurde zuerst durch intramuskuläre Immunisierung von Kaninchen mit lebendem S. dublin SL5928 getestet, der Hybrid-Flagellin (Figur 12) exprimierte. Figur 12 zeigt Antikörper-Reaktionen von Kaninchen, die intramuskulär mit lebendem S. dublin SL5928 immunisiert waren, der mit S16 oder pS21 transformiert war. Anti-Flagellin zeigt Antikörper, nachgewiesen durch ELISA, mit dem nativen Flagellin-Protein, gereinigt aus SL5928, transformiert mit dem das Wildtyp-Flagellin- Gen enthaltenden Plasmid; Anti-Peptid repräsentiert Antikörper, nachgewiesen durch ELISA, mit synthetischen Peptiden S 122-137 und preS&sub2; 120-145 (für Tiere, immunisiert mit SL5928, die S16 bzw. pS21 trugen) und Anti-HBs repräsentiert Antikörper, nachgewiesen durch ELISA, mit HBsAg, das in CHO-Zellen produziert wurde.
Es wurden hohe Titer (oberhalb 10&sup4;) von Anti-Flagellin-Antikörpern in den beiden Tieren gebildet, die SL5928, transformiert mit Plasmid S16 (mit der für S 122-137 codierenden Sequenz) erhielten, sowie in den beiden Tieren, die SL5928, transformiert mit Plasmid pS21 (mit der für preS&sub2; 120-145 codierenden Sequenz) erhielten. Die ELISA-Titer der Anti-Peptid-Antikörper (Anti-S 122-137 oder Anti-preS&sub2; 120-145 in den jeweiligen Kaninchen, immunisiert mit SL5928, das das entsprechende Plasmid trug) variierten zwischen 10³ und 2 x 10&sup4;. Diese Antiseren reagierten mit rekombinantem HBsAg (Subtyp ayw und enthaltend die preS&sub2;-Sequenz), erzeugt in Ovar-Zellen von chinesischen Hamstern (CHO) (die freundlicherweise durch Dr. P. Toiliais vom Institut Pasteur zur Verfügung gestellt wurden) (M.K. Michel et al., Biotechnology, 3, 561, 1985), wobei Spitzentiter von etwa 6.400 in zweien von vier Kaninchen erhalten wurden. Die Immunseren aus diesen Kaninchen reagierten auch stark mit nativem HBsAg, gereinigt aus mit HBv infizierten Schimpansen, nachgewiesen durch den Abbott Laboratory's Ausab-Assay (Daten nicht gezeigt). Kaninchen, immunisiert mit SL5928, transformiert mit den Plasmiden S20 bzw. pS8, sprachen in ähnlicher Weise an (Daten nicht gezeigt) wie die Tiere, die mit SL5928, enthaltend S16 und pS21, immunisiert waren. In zwei Kaninchen, immunisiert mit SL5928, enthaltend das parentale Plasmid pLS405 ohne Einführung von HBV-Sequenzen, wurden, wie erwartet, hohe Niveaus von Anti-Flagellin-Antikörpern nachgewiesen, und es wurden keine Anti-S- oder Anti-preS&sub2;-Peptid- oder Anti-HBsAg-Antikörper nachgewiesen. Keines der Tiere, das mit dieser abgeschwächten S. dublin-Mutante (SL5928) inokuliert wurde, zeigte Zeichen eines septischen Schocks oder anderer Krankheit. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Hybrid-Flagella, die durch S. dublin SL5928, der das rekombinante Plasmid trägt, das HBsAg-Epitope enthält, exprimiert werden, immunogen sind, und daß durch sie ausgelöste Antikörper mit gewonnenem Plasma oder rekombinanter HBsAg reagieren.
Synthetische Peptide S 122-137 und preS&sub2; 120-145 blockierten spezifisch das Binden von HBsAg, das durch Antikörper in den Immunseren in CHO-Zellen, aber nicht den Preimmun-Seren (Daten nicht gezeigt) von Kaninchen erzeugt wurde, die mit SL5928-Klonen immunisiert waren, die die S- oder preS&sub2;-Epitope exprimierten, was bestätigt, daß die Anti-HBs in diesen Tieren auf Epitope gerichtet waren, für die die in das Flagellin-Gen eingeführten Sequenzen codierten.
Um zu bestimmen, ob sich Anti-HBs-Reaktionen aus der oralen Verabreichung von lebendem, abgeschwächtem S. dublin SL5928 ergeben würden, der Hybrid-Flagella exprimierte, wurden Versuche in Kaninchen, Mäusen und Meerschweinchen ausgeführt. Figur 13 zeigt Anti- Peptid- und Anti-HBs-Titer in Mäusen nach der oralen Immunisierung mit SL5928, transformiert mit jedem der rekombinanten Plasmide S16, S20, pS8 und pS21 und mit ungeändertem Flagellin-Gen pLS405. Signifikante Titer des entsprechenden Anti-Peptids und Anti-HBs wurden in allen Tieren nachgewiesen, obwohl die Titer geringer waren als solche, die nach der intramuskulären Immunisierung von Kaninchen beobachtet wurden. Die orale Verabreichung von mit pLS405 transformierten Bakterien SL5928 führte, wie erwartet, nicht zu nachweisbarem Anti-HBs- oder Anti-Peptid-Antikörper. Die Titer von Anti-Peptid und Anti-HBs in Kaninchen und Meerschweinchen (Daten nicht gezeigt) waren ähnlich (80-640) solchen in Mäusen (Figur 13) nach oraler Verabreichung von lebendem S. dublin SL5928. Es wurden keine Diarrhoe oder andere Krankheitserscheinungen in irgendeinem Tier beobachtet, dem S. dublin SL5928 oral verabreicht worden war. Diese Ergebnisse zeigen, daß Immunreaktionen auf HBsAg-Epitope durch orale Immunisierung mit lebendem S. dublin SL5928, der Hybrid-Flagella exprimiert, ausgelöst wurden.

Diskussion

In diesem Beispiel wurde gezeigt, daß Nucleotid-Sequenzen, die für antigene Regionen von HBsAg-Polypeptiden codieren, in die hypervariable Region des Flagellin-Gens von Salmonella eingeführt werden können, und daß diese Gene in einem abgeschwächten Salmonella- Mutanten exprimiert werden können. Einige resultierende Hybrid-Flagellin-Proteine können zu funktionierenden Flagella zusammengesetzt werden, wie durch die Fähigkeit zur Ausbreitung in halbfestem Medium getestet; andere Hybrid-Flagelline wurden nicht zu Filaments zusammengesetzt, ausgenommen vielleicht in einer geringen Minorität von Bakterien. Die Hybrid-Flagella enthalten sowohl Flagellin- als auch HBsAg-Epitope, wie durch Immunoblotting nachgewiesen. Die HBsAg-Epitope wurden mit Antiseren nachgewiesen, die gegen spezifische, synthetische Peptide und gegen aus Serum stammendes HBsAg gebildet wurden. Die Anzahl und Orientierung der HBsAg-Sequenzen, die in das Flagellin-Gen eingeführt wurden, beeinflußten die Fähigkeit des Proteins, zu funktionierenden Flagella zusammengesetzt zu werden. Interessanterweise verringerte eine HBsAg-Sequenz, die in der (und nicht in der entgegengesetzten) Orientierung wie beim Flagellin-Gen eingeführt wurde, die Bakterien-Beweglichkeit, was vermuten läßt, daß die spezifische virale Hüllenprotein-Sequenz (S 122-137), die eine natürlichen Flagellin-Sequenz der gleichen Größe ersetzte, die Konformation des Hybrid-Flagellins merklich änderte. Das Ersetzen der 16 Aminosäuren-Flagellin-Deletion durch einen 27 Aminosäuren-Einsatz (preS&sub2; 120-145) verhinderte die Expression von Flagellin nicht, beeinflußte aber seine Funktion. In beiden wurden HBsAg-Epitope, die durch Antiseren auf natives HBsAg erkannt wurden, im Hybrid-Flagellin nachgewiesen. Diese Sequenzen, wie sie durch lebende Bakterien präsentiert werden, waren immunogen und lösten Antikörper aus, die natives HBsAg erkannten. Flagellin repräsentiert somit ein Bakterien-Protein, in dem virale Antigene in einer Form präsentiert werden können, die in lebenden Stämmen von Salmonella immunogen ist.

BEISPIEL 3

Konstruktion von rekombinantem Flagellin, das ein Epitop des Rotavirus VB7 exprimiert

Hintergrund

Das hauptsächiche Außenhüllen-Polypeptid, VP7, ist ein Glykoprotein mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 38.000 (38,2 K) in seiner nichtreduzierten Form und 41.900 (41,9 K) in seiner reduzierten Form. Es wurde gezeigt, daß es das Hauptantigen ist, das verantwortlich ist für das Induzieren neutralisierender Antikörper für den Virus. Dieses Glykoprotein ist auch für die Virus-Befestigung an Zellen verantwortlich.
Es kommen andere Serotypen von Rotavirus vor, und sie sind durch die neutralisierende Aktivität definiert, die durch VP7 stimuliert wird. Bis jetzt wurden sieben Serotypen identifiziert; vier davon (Serotypen 1-4) wurden in Menschen gefunden und fünf (Serotypen 3-7) wurden in Tieren gefunden. Die Bedeutung dieser serotypischen Unterschiede ist unklar, weil kürzliche Untersuchungen zeigten, daß sowohl in Tieren als auch Menschen ein Überkreuz-Schutz zwischen zu verschiedenen Serotypen gehörenden Stämmen vorkommen kann. Dieser Überkreuz-Schutz kann eintreten, weil es gemeinsame antigene Determinanten von VP7 gibt, die vom Serotyp unabhängig sind. Alternativ können die spezifischen Aminosäure-Sequenzen innerhalb von VP7 (Epitope), die für die Serotyp-Spezifität verantwortlich sind, überkreuz reaktionsfähige Antikörper induzieren, die für den Überkreuz-Schutz verantwortlich sind.
Bei einem Molekulargewicht von 38,2/41,9 K besteht VP7 aus etwa 325 Aminosäuren. Die Sequenz von Aminosäuren, die VP7 verschiedener, unterschiedlicher Rotavirus-Isolate umfaßt, wurde bestimmt, und sie zeigt, daß der Grad der Aminosäure-Homologie im Bereich von 75-86% liegt. Ein Vergleich der Sequenzen der VP7 zeigt verschiedene Regionen, in denen die Aminosäure-Sequenz variiert.
Die Epitop-Kartierung von VP7 unter Verwendung von neutralisierenden, monoklonalen Antikörpern lokalisierte eine neutralisierende Absorptionsdomäne auf ein Komponenten-Peptid mit einem scheinbaren Molekulargewicht von 14.000 (14 K). Gereinigt, stimuliert dieses 14 K- Peptid die Bildung neutralisierender Antikörper in Mäusen. Zusätzlich wurde beobachtet, daß die sekundäre Struktur dieses Peptids erforderlich war, um die Antigenität beizubehalten. Die Aminosäure-Sequenz des Nebraska Kalb-Diarrhoe-Virus (NCDV-Rinder-Rotavirus), der eine hohe Nucleinsäure-Homologie mit dem C486-Rinder-Rotavirus aufweist und vom gleichen Serotyp ist, wurde zum Kartieren des 14 K Polypeptid-Fragments bis zu der Region benutzt, die die Aminosäuren 165-295 überspannt. Ein Diagramm der Hydrophilität des entsprechenden NCDV- Glykoproteins zeigte mehrere hydrophile Regionen innerhalb dieses Bereiches.
Eine solche Region entsprach den Aminosäure-Resten 275-295 auf VP7 von Rinder-Rotavirus. Das entsprechende Peptid wurde durch das Festkörperphasen-Peptid-Syntheseverfahren von Merrifield synthetisiert. Die spezifische Aminosäure-Sequenz des Peptids war folgende:
Pro-Thr-Thr-Ala-Pro-Gln-Thr-Glu-Arg-Met-Met-Arg-Ile-Asn-Trp-Lys-Lys-Trp-Trp-Gln-Val.
Die Reinheit dieses Peptids wurde mittels Dünnschicht-Chromatographie und Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie hoher Leistungsfähigkeit geschätzt. Die Massenspektrometrie mit raschem Atom-Bombardement wurde benutzt, um das Molekulargewicht zu bestätigen.
Die Reaktivität und Spezifität des synthetischen Peptids wurde nach mehreren Verfahren bestimmt.
1) ELISA mit monospezifischem Anti-VP7-Serum, das eine Peptidspezifität für VP7 zeigt.
2) ELISA mit monoklonalen Antikörpern, die spezifisch für das neutralisierende Glykoprotein (VP7) sind und die Fähigkeit hatten, die Virus-Befestigung zu blockleren, was eine Spezifität des Peptids für eine spezifische Region oder ein spezifisches Epitop von VP7 zeigt.
3) Adsorptions-Blockierungsassay, der zeigt, daß das Peptid 275-295 die Virus-Befestigung in vitro an Zellen (MA 104) afrikanischer grüner Meerkatzen blockierte.

Nachweis des EpitopS in der Flagellin-Konstruktion

Um Hybrid-Flagellin-Gen zu konstruieren, das für das Epitop des Rotavirus VP7 (AA 275-292) codiert, wurden synthetische Oligonucleotide, die Aminosäuren 275-290 des Rotavirus VP7 mit der folgenden Sequenz repräsentieren, in den Flagellin-Expressionsvektor pPX1651 (siehe Beispiel 1) eingeführt:
Nach der Transformation wurden Rekombinanten auf Einführung des Epitops durch Restriktionsenzym-Kartierung, Westernblotting und Nucleotid-Sequenzieren gescreent. Das resultierende rekombinante Plasmid, pROTA92-19, wurde in Salmonella dublin SL5927 engeführt und rekombinante Flagella, wie bereits beschrieben, hergestellt.

Flagellin-Wettbewerbs-Experiment

Die Fähigkeit von Flagellin und Flagellin mit dem Epitop 275-292 des Rotavirus (aus der VP7-Rinder-Rotavirus-Sequenz bestimmt, wie oben beschrieben), mit infektiösem Rotavirus für die Rezeptoren der MA-104-Zelle in Wettbewerb zu treten, wurde bestimmt. Der Virusvorrat, der für diese Wettbewerbsuntersuchung benutzt wurde, war der Rinder-Rotavirus-Stamm C486, der mit 50 ug Trypsin/ml aktiviert war. Eine geeignete Verdünnung dieses Vorrates wurde bei dem Wettbewerbs-Experiment derart eingesetzt, daß die Endzahl der Plaque bildenden Einheiten 30- 50 betrug. Die anfängliche Konzentration der Flagellin-Vorratszubereitung, die als Kontrolle benutzt wurde, betrug 3,55 mg/ml, während die Vorratszubereitung von Flagellin, die das Epitop 275-292 enthielt, eine Konzentration von 2,0 mg/ml aufwies. Geeignete Verdünnungen dieser Zubereitungen wurden hergestellt, so daß die Endkonzentration des Flagellins 1,25 ug, 25 ug, 50 ug oder 100 ug auf 1 x 10&sup5; Zellen betrug.
Der Wettbewerb wurde ausgeführt durch Vermischen geeigneter Mengen des Rotavirus-Vorrates mit der geeigneten Flagellin-Zubereitung. Die Mischungen wurden 1 Stunde bei 37ºC an Monoschichten von MA-104-Zellen adsorbiert. Nach der Adsorption wurden die Zellen-Monoschichten dreimal mit Eagle's wesentlichem Minimalmedium (MEM) gewaschen und mit 1% Agaroseperlen, verdünnt in MEM, abgedeckt. Die Zellen wurden drei Tage bei 37ºC inkubiert und dann zum Nachweis von Plaquen mit 1% Kristallviolett, verdünnt in 80%-tigem Methanol, gefärbt.
Jeder Assay wurde dreifach ausgeführt, und die Flagellin- oder Flagellin-Zubereitungen, enthaltend das Epitop 275-292, wurden ebenfalls allein auf Zellen-Monoschichten bei den angegebenen Konzentrationen eingesetzt, um eine Kontrolle auf irgendeine nachteilige Wirkung der Peptide selbst auf die Zellen-Monoschichten zu haben. TABELLE IV Prozentuale Plaquen-Verminderung aufgrund des Wettbewerbs von Flagellin-Zubereitung mit Virus Zubereitung Menge von Flagellin (ug) % Verminderung a Flagellin enthaltend a Die Anzahl der Plaque-bildenden Einheiten pro Assay betrug etwa 40. Jeder Assay wurde dreifach ausgeführt, und der Mittelwert von diesen wurde zum Errechnen der endgültigen prozentualen Verminderung benutzt.

BEISPIEL 4

Induktion zellularer Immunreaktionen mit Hybrid-Flagella, die Epitope von CRM197 exprimieren

Die Verabreichung gewisser immunogener Epitope kann zur Induktion spezifischer zellularer Immunreaktionen, wie Zell-Proliferation, Freisetzung von Zytokinen und spezifische Lysis von Zielzellen, die solche Epitope exprimieren, führen. Um die Kapazität rekombinanter Flagella, zellulare Immunreaktionen zu induzieren, zu demonstrieren, wurde ein vorhergesagtes und experimentell bestätigtes T-Zellen-Epitop als ein Modell für diese Experimente benutzt. Das ausgewählte Epitop war aus Aminosäuren 366-383 des CRM197-Proteins (eines mutanten Diphtherietoxin-Moleküls) zusammengesetzt. Danach zeigten Lymphknotenzellen von SJL-Mäusen, die vorher mit CRM197-Protein mit Primer versehen worden waren, in vitro eine Reaktion durch Einbeziehung von tritiertem Thymidin (Blastogenese), wenn sie mit gereinigtem, synthetischem Peptid, das die Aminosäuren 366-383 des CRM197-Proteins repräsentiert, stimuliert wurden (siehe US-Patentanmeldung Serial Nr. 07/150,688, eingereicht am 1. Februar 1989, deren Lehren durch Bezugnahme hier aufgenommen werden).
Es wurden die folgenden Oligonucleotide synthetisiert, die für die CRM197-Aminosäuren 366-383 codieren:
Diese Oligonucleotide wurden in das Flagellin-Expressionsplasmid pPX1647 subkloniert. Dieses Plasmid ist eine Modifikation des ursprünglichen Vektors pPX1651, bei dem die einzige Bam HI-Restriktionsstelle durch Schneiden, Erzeugen von glatten Enden durch Behandlung mit Klenow-Enzym und erneutes Legieren zerstört wurde, und in das das folgenden Oligonucleotid an der einzigen EcoRV-Stelle eingeführt wurde:
Die unterstrichenen Codons repräsentieren drei separate Restriktionsstellen, EcoRV, ClaI und BamHI. Diese Insertion führt zur Einführung der drei einzigen Restriktionsenzym-Erkennungsstellen, die die nachfolgende Einführung von Sequenzen erleichtert, die für Fremd- Epitope codieren. Das Plasmid pPX1647 wurde mit EcoRV und BamHI verdaut und in Gegenwart einer Überschußmenge der Oligonucleotid-Fragmente, die für das CRM197-Epitop codieren, wieder verknüpft. Nach der Transformation wurden Rekombinante isoliert und durch Restriktionsenzym-Kartierung, Westernblotting und Nucleotid-Sequenzieren charakterisiert. Das resultierende rekombinante Plasmid, pTRM7F, wurde in Salmonella dublin SL5927 eingeführt und rekombinante Flagella, wie in Beispiel 1 beschrieben, hergestellt.

Immunisierung

50 ug der gereinigten Zubereitung des rekombinanten Flagellins wurde in einem gleichen Volumen von Freund's komplettem Adjuvans emulgiert und SJL-Mäusen subcutan an der Schwanzbasis verabreicht. Als Kontrollen wurden andere Gruppen von SJL-Mäusen in einer ähnlichen Weise mit nicht-rekombinanter Flagella (1650) und gereinlgtem CRM197-Protein immunlsiert, wie in der am 1. Februar 1989 eingereichten US-Patenanmeldung Serial Nr. 07/150,688 beschrieben.

T-Zellen-Aktivierung

Murin-T-Zellen Proliferation

Lymphknoten der Leisten und um die Aorta herum wurden aseptisch Mäusen entnommen, die vorher mit einer optimalen Dosis Antigen, emulgiert in Freund's komplettem Adjuvans (1:1, Vol:Vol) immunisiert waren. Es wurde eine einzige Zellsuspension in RPMI zubereitet, das 10% fötales Rinderserum enthielt. Nach einem einzigen Waschen wurden die Zellen erneut in RPMI ohne Serum suspendiert und durch Trypanblau-Ausschluß mit einem Phasenkontrast- Mikroskop gezählt. Die Zellenanzahl wurde auf eine Konzentration von 3 x 10&sup6; Zellen/ml in RPMI, enthaltend 2% normales Mäuseserum, eingestellt. Es wurden verschiedene Konzentrationen von Antigenen, Mitogenen oder anderen Kontrollmaterialien in RPMI ohne Serum zubereitet und dreifach in gleichen Teilen (0,1 ml) in 96 Bohrungen aufweisende, behandelte Flachboden-Gewebekultur-Platten gegeben. Es wurde routinemäßig ein weiter Bereich von Dosierungen für alle Antigene benutzt. Zu diesen Platten wurde 0,1 ml Zellsuspension hinzugegeben. Die End-Zellkonzentration war 3 x 10&sup5; Zellen/Bohrung in 1% Mäuseserum enthaltenden Medien. Nach der Zugabe der Zellen wurden die Kulturen in einem angefeuchteten, 5% CO&sub2; enthaltenden Inkubator bei 37ºC angeordnet. Nach 3 Tagen der Inkubation wurden die Kulturen 18 Stunden mit 1 uCi/Bohrung von [³H]-Thymidin impulsmäßig behandelt und zum Zählen durch Flüssigkeits-Scintillation gewonnen. Der Thymidin-Einbau wird ausgedrückt als das Mittel der wiederholten Experimentalwerte minus dem Mittel der wiederholten, nicht-stimulierten (Hintergrund) Werte.

Ergebnisse

Figur 14 zeigt Daten, die erhalten wurden, wenn Lymphknoten-Zellen von SJL-Mäusen mit rekombinanter Flagella als Primer versehen wurden. Die SJL-Mäuse wurden mit 50 ug gereinigtem CRM197-Protein (A), rekombinanter Flagella, die für das CRM197 366-383-Epitop ( ) codiert oder gereinigter Wildtyp (1650)-Flagella (I) in Freund's komplettem Adjuvans subcutan an der Schwanzbasis immunisiert. Sieben Tage nach dem Einbau des Primers wurden Lymphknoten entfernt und Einzelzellen-Suspensionen erhalten. 3 x 10&sup5; Lymphknoten-Zellen (LNC) wurden mit fünffachen Reihenverdünnungen von gereinigtem, synthetischem Peptid inkubiert, das für die Aminosäuren 366-383 des CRM197-Proteis codiert. Die Zellen wurden in RPMI 1640, enthaltend 1% normales Mäuseserum, bei 37ºC drei Tage gezüchtet, mit 1,0 uCi/Bohrung von tritiertem Thymidin 16 Stunden Impuls-behandelt und zum Zählen mittels Flüssigkeits-Scintillation gewonnen. Die Daten sind als Stimulationsindex (SI) in Abhängigkeit von der Konzentration des stimulierenden Antigens angegeben, wobei SI=cpm, gemessen in Bohrungen in Gegenwart von stimulierendem Antigen, dividiert durch cpm in Bohrungen ohne ein stimulierendes Antigen ist. Jeder Datenpunkt repräsentiert das Mittel und die Standardabweichung dreifacher Kulturen.
Figur 15 zeigt Daten, wenn die gleichen Lymphknoten-Zellen mit gereinigtem CRM197- Protein stimuliert wurden. SJL-Mäuse wurden mit 50 ug des gereinigtem CRM197-Proteins (Δ), rekombinanter Flagella, die für das CRM197 366-383-Epitop codiert ( ) oder gereinigter Wildtyp (1650)-Flagella ( ) in Freund's komplettem Adjuvans subcutan an der Schwanzbasis immunisiert unter den Bedingungen, wie sie im Zusammenhang mit den Daten der Figur 14 beschrieben wurden.

BEISPIEL 5

Die folgenden Tabellen V und VI fassen die Ergebnisse zusammen, die bei Motilitäts-Untersuchungen, Western-Blot-Analyse und Immunisierungs-Untersuchungen, unter Einsatz rekombinanter Flagellin-Fusionsproteine in verschiedenen Wirten, erhalten wurden. Die Verfahren für jeden der unten zusammengefaßten Tests sind in den vorhergehenden Beispielen beschrieben. TABELLE V Flagellin-Plasmide mit Epitop-spezifizierenden Einsätzen Ursprung AA-Reste spezifiziert Plasmid-Nummer Lysat von LB5000/pLS Wirt-Plasmid-Kombinationen Wirt a Kombination Motilität Western-Blot Vaccin-Versuch B-Unter einheit von Choleratoxin S-Protein von Hepatitis B preS von Hepatitis B HIV-Hüllen-Protein Strepptococcus Typ 5 M-Protein pS145¹= (stop)-120' Kennedy d-Petid nein ja
a SL1438 und SL3261 sind S. dublin bzw. S. typhimurium, beide aroA, aber beweglich, so daß die Fähigkeit des Plasmids, die Produktion von Flagella zu verursachen, darin nicht getestet werden konnte.
b Für diese Kombinationen wurde gezeigt, daß der Anti-Peptid-Antikörper immobilisiert.
c¹ 137¹-122¹ gibt die Aminosäuren an den Stellen 122-137 an, die durch eine DNA-Sequenz für Aminosäuren 122-137, die umgekehrt eingeführt wurde, spezifiziert sind.
d Sequenz des HIV gp160 "Kennedy"-Peptids:
Kennedy et al., Science, 231, 1556-59, 1986.
Ratner et al., Nature (London), 313, 277-284, 1985. TABELLE VI Immunisierungsversuche Epitop Plasmid Wirt Tier Dosis/Anzahl der Dosen Verabreichung/lebend, abgetötet ELISA +/Nr. getestet B-Untereinheit von Choleratoxin Oberflächenprotein von Hepatitis B M-Protein von Streptococcus Typ 5 Streptoc. M- Protein Kaninchen Mäuse BALB.cj Meerschweinchen Mäuse BIO. BR Mäuse BALB.c lebend HCHO-abgetötet getötet a Die orale Dosis kann zu gering sein, um eine Immunreaktion auszulösen.

Hinterlegung der Mikroorganismen

Die folgenden Bakterienstämme, die die aufgeführten Plasmide tragen, wurden am 4. Mai 1988 bei der Amirican Type Culture Coliection (ATCC), Rockville, MD hinterlegt, und sie erhielten die angegebenen Zugangsnummern: Bakterien-Stamm Plasmide Zugangs-Nr. Salmonella dublin SL1438 pPX1650, codiert für das vollständige Flagellin-Strukturgen H1-d von S. muenchen pPX1653: codiert für 4 Kopien der 4 Aminosäure-Repeatsequenz der Sequenz des Circumsporozoit-Proteins von Plasmodium fälciparum als ein rekombinantes Fusionsprotein mit H1-d-Flagellin Salmonella dublin SL1438 pPX1662: codiert für 4 Kopien der 9 Aminosäure-Repeatsequenz des Circumsporozoit-Proteins von Plasmodium berghei mit H1-d-Flagellin pLS411: codiert für das CTP3-Peptid der B-Untereinheit von Choleratoxin, als ein rekombinantes Fusionsprotein mit H1-d-Flagellin Salmonella dublin SL5927 kein Plasmid (Vaccinstamm mit in die H1-Stelle von Salmonella dublin SL5927 eingeführtem Tn10-Transposon) pROTA92-19: codiert für Aminosäuren 275-292 des Rotavirus VP7 als ein rekombinantes Fusionsprotein mit H1-d-Flagellin
Die vorliegende Erfindung ist hinsichtlich des Umfanges nicht auf die hinterlegten Mikroorganismen beschränkt, da die hinterlegten Ausführungsformen einzelne Veranschaulichungen eines Aspektes der vorliegenden Erfindung sein sollen und alle Mikroorganismen, die funktionell äquivalent sind, in den Rahmen der Erfindung fallen. Tatsächlich stehen dem Fachmann aufgrund der vorstehenden Beschreibung und der beigefügten Zeichnung verschiedene Modifikationen der Erfindung, zusätzlich zu den hier gezeigten und beschriebenen, zur Verfügung.
Es sollte auch klar sein, daß alle Basenpaar-Größen, die für Nucleotide angegeben wurden, etwaige Werte sind, und diese für die Zwecke der Beschreibung benutzt wurden, und daß Figuren, die diagrammartig DNA-Sequenzen abbilden, nicht notwendigerweise maßstabgerecht gezeichnet sind.

Claims

1. Rekombinantes Gen, umfassend eine Nucleotid-Sequenz, die für ein Flagellin-Fusionsprotein codiert, wobei das Protein ein erstes Epitop eines strukturellen Flagellin- Gens von Salmonella oder Shigella und mindestens ein Epitop eines heterologen Organismus umfaßt, der ein anderer Organismus ist als der Organismus, aus dem das erste Epitop stammt, wobei das genannte Epitop einem Epitop eines Flagellin-Gens nicht sehr identisch ist, das Flagellin- Fusionsprotein in der Lage ist, sich zu einer funktionierenden Geißel zusammenzusetzen und der Flagellin-Abschnitt des Proteins eine beträchtliche Antigenität beibehält.

2. Rekombinantes Gen nach Anspruch 1, bei dem das strukturelle Flagellin-Gen vom Salmonella-H1-, -H1-d- oder -H2-Gen stammt.

3. Rekombinantes Gen nach Anspruch 1 oder 2, bei dem das heterologe Epitop nach Einführung des Fusionsproteins in einen Wirbeltier-Wirt immunogen ist, wobei das immunogene Epitop eine Immunreaktion auslöst, die ihrer Natur nach T-Zelle, P-Zelle oder zellular ist oder aus Kombinationen davon besteht.

4. Rekombinantes Gen nach einem vorhergehenden Anspruch, bei dem der heterologe Organismus ein Parasit, Bakterium, Virus oder Pilz ist.

5. Rekombinantes Gen nach Anspruch 4, bei dem das Epitop ein heterologer Organismus ist, der eines Circumsporozoiten-Proteinantigens, eine Streptococcus-M-Proteins, einer Choleratoxin B-Untereinheit, des Hepatitis B Oberflächenantigens oder Hepatitis B Voroberflächenantigens, des HIV-Hüllenproteins oder des Rotavirus VP7-Proteins ist.

6. Rekombinantes Gen nach Anspruch 5, worin das Epitop ein T-Zellen-Epitop, B-Zellen-Epitop oder eine Kombination davon ist.

7. Rekombinantes Gen nach Anspruch 6, worin das T-Zellen-Epitop von Diphtherie CRM197-Toxin 366-383 abgeleitet ist.

8. Rekombinantes Gen, umfassend ein strukturelles Salmonella-Flagellin-Gen mit einer heterologen DNA-Sequenz, die DNA eines anderen Organismus ist, als desjenigen, von dem das Flagellin-Gen abgeleitet ist, wobei die heterologe DNA-Sequenz nicht sehr identisch einer Flagellin-Gen- Sequenz ist, die in einem Bereich, der für die Funktion des codierten Flagellins nicht wesentlich ist, in das strukturelle Flagellin-Gen eingeführt ist, wobei der Flagellin-Teil des codierten Proteins eine beträchtliche Antigenität beibehält.

9. Rekoinbinantes Gen nach Anspruch 8, worin die heterologe DNA-Sequenz in die hypervariable Region des strukturellen Flagellin-Gens eingeführt ist.

10. Rekombinantes Gen nach Anspruch 8 oder 9, bei dem das strukturelle Flagellin-Gen vom Salmonella-HA-, -HI-d- oder -H2-Gen stammt.

11. Rekombinantes Gen nach Anspruch 10, worin die heterologe DNA-Sequenz zwischen den natürlichen EcoRV-Stellen des Salmonella-H1-d-Gens eingeführt ist.

12. Rekombinantes Gen nach einem der Ansprüche 8 bis 11, worin die heterologe DNA-Sequenz für ein Epitop eines Organismus codiert, der für Wirbeltiere pathogen ist.

13. Rekombinantes Nucleinsäure-Klon, enthaltend ein rekombinantes Gen, wie es in einem vorhergehenden Anspruch definiert ist.

14. Rekombinantes Klon nach Anspruch 13, enthaltend Plasmid, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus pPX1653, pPX1662, pLS411 und pROTA92-19, wie beim ATCC hinterlegt und mit den Zugangsnummern 67688, 67687, 67686 bzw. 67945 versehen.

15. Rekombinanter Mikroorganismus, umfassend ein rekombinantes Gen, wie in einem vorhergehenden Anspruch definiert.

16. Rekombinanter Mikroorganismus nach Anspruch 15, worin der Mikroorganismus ein geschwächtes und invasives Bakterium ist, ausgewählt aus Salmonella, Shigella und Escherichia coli.

17. Rekombinantes Protein, umfassend ein erstes Epitop eines Salmonella- oder Shigella-Flagellinmoleküls und mindestens ein Epitop eines heterologen Organismus, der ein anderer Organismus ist als der, von dem das erste Epitop abgeleitet ist, wobei das genannte Epitop einem Epitop eines Flagellin-Gens nicht sehr identisch ist, und wobei der Flagellin-Teil des Proteins eine beträchtliche Antigenität beibehält.

18. Rekombinantes Protein nach Anspruch 17, worin das Epitop des heterologen Organismus nach Einführung des Proteins in einen Wirbeltier-Wirt immunogen ist, wobei das immunogene Epitop eine Immunreaktion auslöst, die ihrer Natur nach T-Zelle, B-Zelle oder zellular ist.

19. Rekombinantes Protein, umfassend ein Salmonella- Flagellin-Protein mit einer heterologen Aminosäure-Sequenz, die eine Sequenz eines anderen Organismus ist als dem, von dem das Flagellin-Protein abgeleitet ist, wobei die heterologe Aminosäure-Sequenz einer Flagellin-Aminosäure-Sequenz nicht sehr identisch ist, die in einer Region in das Flagellin-Protein eingeführt ist, die für die Funktion des Flagellin-Proteins nicht wesentlich ist, wobei der Flagellin-Teil des Proteins eine beträchtliche Antigenität beibehält.

20. Rekombinantes Protein nach Anspruch 19, worin die heterologe Aminosäure-Sequenz ein Epitop eines Organismus ist, der nach Einführung des Proteins in einen Wirbeltier-Wirt immunogen ist, wobei das immunogene Epitop eine B-Zellen-, T-Zellen- oder zellulare Reaktion oder eine Kombination davon auslöst.

21. Verfahren zum Exprimieren eines rekombinanten Flagellin-Fusionsproteins, umfassend:

a) Konstruieren eines rekombinanten Gens, das eine Nucleotid-Sequenz umfaßt, die für ein Salmonella-Flagellin-Fusionsprotein codiert, das ein erstes Epitop eines strukturellen Flagellin-Gens und mindestens ein Epitop eines heterologen Organismus umfaßt, der ein anderer Organismus ist als derjenige, von dem das erste Epitop abgeleitet ist, wobei der Flagellin-Teil des Proteins eine beträchtliche Antigenität beibehält;

b) Einführen des rekombinanten Gens in einen geeigneten Expressionsvektor;

c) Einführen des Vektors in einen geeigneten Wirt und

d) Reproduzieren lassen des den Vektor enthaltenen bakteriellen Wirtes unter Bedingungen, die die Expression des rekombinanten Gens induzieren.

22. Untereinheit-Vaccin-Formulierung, bei der das Immunogen eine wirksame Dosis des Proteins von Anspruch 17, vermischt mit einem physiologisch akzeptablen Träger, umfaßt.

23. Untereinheit-Vaccin-Formulierung, bei der das Immunogen eine wirksame Dosis des Proteins nach Anspruch 19, vermischt mit einem physiologisch akzeptablen Träger, umfaßt.

24. Zur Expression eines rekombinanten Salmonella-Flagellin-Fusions-Proteins auf seiner Oberfläche transformiertes Bakterium zum Einsatz beim Auslösen einer Immunreaktion, in einem physiologisch akzeptablen Träger, wobei das rekombinante Flagellin-Fusions-Protein ein erstes Epitop eines strukturellen Flagellin-Gens und mindestens ein Epitop eines heterologen Organismus umfaßt, der ein anderer Organismus ist als derjenige, von dem das erste Epitop abgeleitet ist, wobei das genannte Epitop einem Epitop eines Flagellin-Gens nicht sehr identisch ist, wobei der Flagellin-Teil des Proteins eine beträchtliche Antigenität beibehält und das Epitop des heterologen Organismus nach Einführung des Fusionsproteins in den Wirbeltier-Wirt immunogen ist.

25. Bakterium nach Anspruch 24 zum Einsatz beim Auslösen einer Immunreaktion, wobei das Bakterium lebt und infektiös ist, aber keine merkliche-Erkrankung im zu impfenden Wirt verursachen kann.

26. Bakterium nach Anspruch 24 zum Einsatz beim Auslösen einer Immunreaktion, worin das strukturelle Flagellin-Gen vom Salmonella-H1- oder -H2-Gen stammt.

27. Bakterium nach Anspruch 24 zum Auslösen einer Immunreaktion, worin das Bakterium Salmonella, Shigella oder Escherichia coli ist.

28. Salmonella-Flagellin-Fusionsprotein in einem physiologisch akzeptablen Träger zum Einsatz beim Auslösen einer Immunreaktion, wobei das Protein eine heterologe Aminosäure-Sequenz aufweist, die eine Aminosäure-Sequenz eines anderen Organismus ist als desjenigen, von dem das Flagellin-Protein abgeleitet ist, wobei die genannte Aminosäure-Sequenz einer Aminosäure-Sequenz von Flagellin nicht identisch ist, die in einem Bereich des Proteins eingeführt ist, der für die Funktion des Flagellin-Proteins nicht wesentlich ist, die jedoch eine beträchtliche Antigenität des Flagellin-Teiles des Proteins beibehält.