PT92511A - Processo de preparacao de um hospedeiro transformado e de proteinas de fusao da subunidade b de toxina labil ao calor - Google Patents
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Description
7036α N? hizhb
MEMÓRIA DESCRITIVA 0 presente invento refere-se ao processo de preparação de proteínas de fusão da subunídade B de toxina lãbil ao calor e ãs suas utilizações.
As estirpes toxigénicas da Eschertchia co 1 i (ETEC) estão entre as causas maís importantes de doenças e de mortalidade infantil, no mundo em desenvolvimento. Qualquer vacina capaz de reduzir os 650 milhões de casos estimados (incluindo cerca de 800 000 mortes) por ano, contribuirá claramente de uma forma significativa para os cuidados de saúde globais. 0 desenvolvimento destas vacinas tem de ter em conta o requisito de imunizar contra as ETEC de serotipos diferentes que produzem uma variedade de an-tigénios adesivos e uma, ou ambas, de duas enterotoxinas altamente potentes. Será também necessário avaliar a via e a facilidade de administração da vacina, bem como o seu armazenamento, estabilidade e custo. A requerente conseguiu preparar com sucesso, uma série de proteínas de fusão onde diferentes porções do gene da en-terotoxina estável ao calor ($T) estão fundidas no terminal 3' do gene codificando a subunídade B da enterotoxina lãbil ao calor (LTB). Estes híbridos recombinantes LTB-ST possuem todas as propriedades relevantes para serem imunogénios de mucosa eficazes. Exprimiu-se também outra proteína híbrida onde um epítopo está fundido com o terminal carboxilo da LTB. As proteínas de fusão, compreendendo um antigénio ou epítopo fundido com o terminal carboxilo da LTB, representam deste modo uma nova forma de apresentar eficazmente o antigénio ou epítopo ao imuno-si s tema.
Deste modo, o presente invento refere-se a uma proteína de fusão que compreende a subunídade B da toxina lãbil ao calor de E. co1i (LTB) com um antigénio ou epítopo de um patogênío responsável por uma doença humana ou veterinária, fundida com o terminal carboxilo da LTB.
As proteínas de fusão dobram-se correctamente e reúnem 70360 N? ^72^6.
•-9 - 3 -se formando complexos pantaméricos estiveis. A LTB natural reu-ne-se formando oligõmeros de holotoxina com a subunidade A acti-vadora da adenί1 atoeíc1 ase numa proporção molar de B:A de 5:1· As proteínas de fusão têm uma afinidade elevada para ligação ao gan-gliõsido -GM1, uma forte Imuno-reactívidade em relação ã neutralização do anticorpo antí-LT e do anticorpo em relação ao antigé-nio ou epítopo fundido com a LTB, e a capacidade de induzir boas respostas de anticorpo em relação ã LTB e ao antigénio ou epítopos fundi dos.
As proteínas de fusão utilizam a LTB como transportador para um epítopo ou antigénio. No gene da LTB tem de ficar retida informação estrutural suficiente para favorecer a formação de uma proteína quimérica que se ligue ao gangliõsído GM1 e apresente todos os epítopos da LTB. Tipicamente, a sequência de aminoicidos da LTB é pois mantida até ao aminoãcido 102 (G1u). A LTB pode ser, por exemplo, a LTB humana (hLTB) ou a LTB porcina (pLTB).
Pode utilizar-se uma sequência ligante entre o terminal carboxilo da LTB e o antigénio ou epítopo fundido com a LTB. A sequência pode ter até 10 resíduos aminoãcido,. por exemplo, 2 ou 3 resíduos. Deste modo, uma sequência ligante adequada é -Lys-Leu-ou - Lys -Leu-G 1 y- . A sequência na junção entre a LTB e o antigénio ou epítopo fundido compreende, preferivelmente, -Lys-Leu-G1y-Pro-G1n-. A presença desta sequência de junção é particularmente benéfica em assegurar que a porção LTB da proteína de fusão e o antigénio ou epítopos fundidos se dobram ambos correctamente e são, consequentemente, apresentados de um modo adequado ao imuno-sistema de um humano ou animal ao qual podem ser administrados. Adiciona1 mente, a sequência de junção é também particu 1 armente benéfica devido a permitir que a proteína de fusão se auto-reúna em pentâmeros estáveis. A sequência de junção é constituída quando se junta o antigénio ou epítopo fundido com a LTB. A sequência de junção pode compreender um ou mais resíduos aminoãcido do terminal carboxilo da LTB e/ou um ou maís resíduos aminoãcido do terminal amino
7036ο N? 47246. do antigénío ou epítopo fundido·. Tipicamente, a sequência de junção situa-se imedíatamente apôs a sequência de aminoácidos do LTB. Os dois ou três resíduos finais do terminal amíno do antigé-nio ou epítopo fundido podem fazer parte da sequência de junção.
Qualquer sequência de resíduos aminolcido com activida-de biológica pode ser fundida com o terminal carboxilo da LTB. Qualquer antigénío ou epítopo de um patogénio responsável por uma doença humana ou veterinária pode ser apresentado pela proteína de fusão. 0 antigénío ou epítopo pode ser qualquer um que é capaz de induzir a formação de anticorpos neutralizantes ou não neutra-lizantes. Pode utilizar-se um determinante antigenico previsto. 0 epítopo pode ter ate 20 resíduos aminoâcido de comprimento.
Assim, funde-se uma sequência de amínoãcidos estranha com a LTB. Esta pode, deste modo, compreender um determinante an-tigénico capaz de induzir a formação de anticorpos neutra1izantes em relação a um organismo patogénico. 0 epítopo pode ser derivado de um vírus, bactéria, fungo, levedura ou parasita. Mais especialmente, o epítopo pode ser derivado de um tipo do vírus da imunodeficiência humana (HIV), tal como o HIV-1 ou HIV-2, do vírus da hepatite A ou B, do rindvírus humano, tal como o tipo 2 ou o tipo 14, do vírus herpes simplex, do poliovírus do tipo 2 ou 3, do víYus da febre aftosa, do vírus da gripe, do vírus coxsackie, do antigénío de superfície celular CD4, da Chlamydia trachomatis, RSV, HPV, p.e. HPV16, e da enterotoxina estável ao calor de E.co-1i (ST). A LTB pode, deste modo, ser fundida com uma porção imu-nogénica da ST. Pode fundir-se a LTB com as regiões central e de toxina, ou apenas com a região de toxina. Por exemplo, pode ligar--se a LTB a uma porção da ST começando no aminoâcido da ST numero 19 (Pro) ou no aminoâcido da ST número 49 (Gly). Ambas as proteínas híbridas, larga e curta, resultantes incluem todos os dezanove resíduos aminoâcido do terminal carboxilo da ST que contêm os seis resíduos Cys necessários para a configuração da ST nativa.
As proteínas- de fusão são preparadas por metodologia - 5 -
- 5 - f'L 70360 N? h7.2½ de ADN recombInante. Maís partícu1 armente, uma proteína de fusão é preparada por um processo que compreende a cultura de um hospedeiro que foi transformado com um vector capaz de exprimir a proteína de fusão nesse hospedeiro, sob condições tais que a proteína de fusão possa ser expressa. Pode depois isolar-se a proteína de fusão, tipicamente, numa forma biologicamente pura.
Deste modo, a preparação da proteína de fusão depende da obtenção de uma sequência de ADN codificando a proteína de fusão. A sequência de ADN pode estar guarnecida no seu terminal 51> com uma sequência codificando um líder para a proteína de fusão» de modo a que a proteína de fusão seja exportada do citoplasma da célula hospedeira no qual se exprime. Pode utilizar-se qualquer sequência líder apropriada. Tipicamente porém, o ADN codificando a sequência líder da LTB natural é fornecido imediatamente a montante do gene da LTB. Por "gene da LTB" entende-se a sequência de ADN codificando a LTB madura sem a sua sequência líder.
Assim, é preparada uma sequência de ADN codificando a proteína de fusão desejada. Prepara-se um vector de expressão que incorpora a sequência de ADN e que e capaz de exprimir a proteína de fusão quando transfectado num hospedeiro adequado. Para a sequência de ADN são fornecidos os elementos de controlo da transcrição e da tradução apropriados, em particular, um promotor para a sequência de ADN e um sítio de terminação da transcrição. A sequência de ADN está localizada no vector entre os sinais de início e paragem da tradução. A sequência de ADN é fornecida na estrutura correcta, de modo a permitir que a expressão da proteína de fusão ocorra num hospedeiro compatível com o vector.
Usa-se o vector de expressão para transformar um hospedeiro. Cultivam-se as células contendo o vector de expressão de forma a permitir que se verifique a expressão da proteína de fusão. A proteína de fusão pode-se auto-reunir em oligõmeros. Pode utilizar-se qualquer sistema de hospedeiro-vector apropriado. 0 hospedeiro pode ser um hospedeiro procariótico ou eucartõtico. 0 vector pode ser um vector plasmídeo. Nesse caso, pode usar-se um hospedeiro bacteriano ou de levedura, por exemplo, um bacilo Gram- 7Q36Q N? klZkk ã~ C - //. // . y t '.-«"l
--:n" - 6 -negativo tal como E. colL ou uma espécie V i fa r í o, ou S♦Cerev i s i ae. AIternativamente, o vector pode ser um vecto r virai. Este pode ser usado para transfectar células de uma linha de células de mamífero, tal como as células de ovário de criceto chinês (CHO), de modo a provocar a expressão.
Um vector de expressão de proteínas de fusão pode ser preparado: a) fornecendo um vector de expressão LTB; e b) ligando o gene codificando um antigénío ou epítopo desejado ao terminal 3' do gene LTB.
Pode obter-se um vector capaz de exprimir a LTB por clo-naçio do gene da LTB (Dal las, fnfect. Immun. hQ_, 647~652, 1983) num vector sob o controlo, de elementos reguladores da transcrição e da tradução apropriados. Se a proteína de fusão tem uma sequen-c i a ilgante entre/LTB e o antigénío ou epítopo, podem sintetizar-se oligonuc1eõtidos correspondentes à sequência ligante e podem ajustar-se ao terminal 3' da gene da LTB ou ao terminal 5' do gene codificando o antigénío ou epítopo.
Um vector preferido para uso na obtenção de um vector de expressão da proteína de fusão ê um vector que codifica a LTB com uma extensão carboxi-terminal. A sequência de codificação para a extensão é seleccionada de modo a que tenha um sítio de restrição. Se se desejar a fusão com a LTB pode inserir-se neste sítio um gene codificando um antigénío ou epítopo. A sequência de codificação até ao sítio de restrição é também seleccionada de modo a codificar os resíduos aminoãcido correctos para toda ou para parte de uma sequência ligadora desejada.
Deste modo, o presente invento refere-se a um vector de expressão que codifica a LTB com uma extensão carboxi-termlna 1 onde a sequência de codificação da extensão tem um sítio de restrição inserido. 0 presente invento refere-se também a um processo para a preparação de uma proteína de fusão compreendendo a LTB e um an-tigênío ou epítopo de um patogénio responsável por uma doença hu- 70360 Ν° ^72½. / ?· <r '
<ãv - 7 mana ou veterinária fundida no terminal carboxilo da LTB, processo este que compreende (li a Inserção de uma sequência de ADN codificando o antígénio ou epítopo. num tal vector no referido sftio de restrição; e (Γ Γ) cultura de um hospedeiro compreendendo o vec tor resultante sob condições tais que a proteína de fusão seja expressa. 0 sítio de restrição pode ser fornecido em qualquer cadeia de leitura. Podem estar presentes mais do que um sítio. A ex tensão carboxi-termina 1 pode ter qualquer comprimento, por exempl 5 a 10 resíduos amínoicido e, especia 1mente, 8 resíduos aminoaci-do. As extensões preferidas, as suas sequências de codificação e a localização de um sítio de restrição para adiael (_) são as se- gu i ntes:
Ly s Leu Gly Pro Gin Al a Gly Asp Sfeífe* AAG CTG GGT CCG CAG GCC GGC GAC TAG Lys Leu Gly Pro Gin Gly Arg Hís *** AAG CTG GGT CCG CAG GGC CGG CAC TAG Lys Leu Gly Pro Gin P ro Ala Asp *** AAG CTG GGT CCG CAG CCG GCT GAC TAG *** representa um codão de paragem. Estes vectores de expressão podem ser preparados sintetizando os oligonucleõtidos correspondentes â extensão desejada e ajustando estes ao terminal 3' do ge ne LTB. 0 gene LTB alargado resultante ê fornecido num vector de expressão com os elementos de controlo de transcrição e de tradução adequados.
Pode isolar-se a proteína de fusão expressa, Quando se exprime uma proteína de fusão com uma sequência líder, a proteína terá sido exportada do citoplasma da célula onde se realiza a sua expressão. Uma proteína de fusão com uma sequência líder de LTB natural, por exemplo, pode deste modo ser isolada e purificada a partir do periplasma de E. co11. A proteína de fusão purificada matou as estirpes toxi-génicas de E. Coi i onde a proteína de fusão tinha sido expressa e
7036 α Ν° 4724.6-podem usar-se, como v a cimas, as. vacinas vivas atenuadas, capazes de exprimirem a proteína de fusão. 0 presente invento refere-se pois, consequentemente, também a uma vacina onde o princípio activo é seleccio-nado de entre: í) uma proteína de fusão que compreende a LTB com um antigénio ou epítopo, de um patogénio responsável por uma doença humana ou animal, fundido com o terminal carboxMo da LTB; ii) uma estirpe toxigéníea de E. coli onde se exprimiu a referida proteína de fusão e que foi morta; e iii) uma vacina viva atenuada capaz de exprimir a referida proteína de fusão.
Tipicamente as vacinas compreendem também um transportador ou diluente fisio 1oglcamente aceitável. Podem utilizar-se formulações, transportadores e diluentes convencionais. Uma vacina viva atenuada adequada pode ser um microrganismo atenuado com uma mutação não reversível em cada um de dois genes discretos no seu percurso de bío-síntese de aromáticos. Na EP-A0322237 descrevem-se estes microrganismos. 0 microrganismo é tipicamente uma bactéria patogênica, por exemplo do género Salmonel1 a tal como a S . typh i, a S. typhimurium, a S. dub1i n ou a S. cho1 eras i us.
As mutações não reversíveis podem ocorrer em qualquer um dos genes aroA, aroC, aroD e aroE. Preferivelmente, uma das mutações não reversíveis situa-se no gene a roA. Um microrganismo atenuado adequado pode compreender uma "cassette11 de expressão codificando uma proteína de fusão de modo a que a proteína de fusão possa ser expressa pelo microrganismo. Para a expressão fiável através de geração do microrganismo, uma "cassette" de expressão deverá ser estavelmente herdada na ausência da selecção por antibióticos.
Uma vacina pode ser administrada por qualquer via conveniente. A esco 1 ha entre a adopção de uma via oral ou de uma via pa-renteral, tal como a administração subcutânea, intravenosa ou intramuscular, da dose e da frequência da vacinação depende do propósito da vacinação, de se estar a tratar um humano ou um animal, 7 ¢13 6 Ο Ν° kjlh&. -·;>Γ ' c;-·" - a e do estado clínico do humano ou do animal ao qual se vai adminis· trar a vacina.
Tipicamente, contudo, a proteína de fusão é administrada numa quantidade de 1 — 1 Q 0 0 ug por dose, ma i s. preferivelmente de 10 - 100 ag por dose, quer pela via oral quer pela via parenteral q
Para a S. typhi atenuada, por outro lado, uma dosagem de 10 a 11 10 organismos S. typhi, por dose e geralmente conveniente para um paciente adulto humano de 70 Kg, tipicamente, pela via oral.
Os Exemplos seguintes servem para ilustrar a invenção. Nos desenhos: a região interior central do gene Sta2 e \ljII]]IHÍl\ representa a região carbo-xi-terminal do gene Sta2; a Figura 2 mostra a imuno-reactividade das proteínas híbridas expressas pela estirpe Gé de E. co1í K-12 compreendendo o pTRH5 ou o pTRHó, onde o eixo y representa o título de toxina em logaritmo, m o anticorpo monoc 1 ona.l. contra .q .Sta2 e j///j\ representa o anticorpo monoclonal.contra a LTB; e a Figura 1 mostra a estrutura do pTRH5, pTRHó, pTRH13 e pTRHl4, onde -representa o gene da LTB, [ a Figura 3 mostra os resultados de uma análise para a ligação de anticorpos anti-(proteína híbrida) em relação a determinantes ST, onde no eixo y se representa a absorvância a 45Q nm; I representa revestimento: antigénio híbrido, anticorpo sonda: soro de coelho de pré-imunização; ffj/j representa revestimento: LTB, anticorpo sonda: soro de coelho imunizado, e F~3 apresenta revestimento: antigénio híbrido, anticorpo sonda: soro de coelho de pré-imunização. EXEMPLO 1 A construção das proteínas híbridas LTB-ST recorabinantes foi conseguida por fusão do gene codificando a subunidade B da en-terotoxina lãbil ao calor (LT) com duas porções diferentes do gene codificando a enterotòxina estável ao calor (ST). Isto permi- - 10 * &
7Q36Q Ν° 47246. £ ítu a introdução de sequências 1igantes no gene ST e o uso de um gene LTB modificado, os quais jã foram ambos anteriormente descritos (Sanchez et a 1, Gene 64, 265-275, 1986; Sanchez et al, FEBS Letters, 208, 194-198, 1988; Sandkvist et aj, J. Bacteriol, 169, 4570-4578, 1987). 0 gene Sta2 foí isolado na forma de um fragmento AvalI/BamH 1 ou Driel/BamH1 a partir do pSLM4 (Moseley e_t a 1 , Infect. Immun. 3_9, 1 167-1 174, 1983). Os terminais AvaXI ou Ddel foram ajustados com os o 1igonuc1eõtidos A ou B (Sanchez et al, 1988), produzindo-se assim um terminal complementar para o ADN cortado com EcoRI, A: AATTCGCCCGG pJSó: Avall-EcoR1
GCGGGCCCAG
Sma I B: AATTCGCCCGGGTCC pJS7: Ddel-EcoR1
GCGGGCCCAGGAGT
Sma [ e introduzindo-se um sítio Smal em cada extensão. Os fragmentos foram depois ligados ao vector pl)C18 que tinha sido cortado com EcoRI e com BamH1, produzindo-se assim o pJS6 e o pJS7. A construção do pMMl38 envolveu o isolamento do gene LTB a partir do pWD6l5 (Da lias, Infect. Immun. 40., 647-652, 1983) na forma de um fragmento EcoR1/ΗindllI e a sua ligação subsequente ao pMMB66EH (Furste et a_l , Gene 4_8, 1 19-131 , 1986) para produzir o pMMB68. 0 sftio Spei incorporando o codão de paragem do gene hLTB foi mutado num sítio Hindi 11 como é descrito por Sandkvist et _aj, obtendo-se o plasmfdeo pMMB138.
Os plasmídeos pJS6 e pJS7 foram digeridos com EcoRI e com Smal. 0 plasmídeo pMMB138 foi cortado com Hindi II, isolou-se o fragmento grande de ADN e preencheram-se os terminais salientes com ADN-pol imerase T4 (0 ,1 U/ytíl) e com 100 nM de dATP, dCTP, dGTP 11 - 7 Ο 3.6 ο. . N? 472.46. ____— e dTTP. Após precipitar o fragmento de ADN, este foi adicionalmente cortado com EcoRl e isolou-se o fragmento mais pequeno, codificando o hLTB. Misturou-se este com o digerido de pJS6 e pJS7 com EcoRi/Smal, com uma proporção fragmento: vector de 1:10 (p/p) , aqueceu-se até 70°C durante 2 minutos e depois deixou-se a incubar ã temperatura ambiente. Apôs a adição de ATP (1 mM), BSA (29 ^.g/ml), DTT (4 mM) e ADN-lígase T4 (1,4 u/μ]), incubou-se a mistura a 4°C, de um dia para o outro, para ligar o ADN (a concentração final de ADN foi de 63 ng/u.1).
Transformaram-se células competentes de E. co1i K-12 estirpe G6 (Hardy et , Proc. Natl . Acad. Scí. 85., 71Q9"7113j 1988) com as misturas de ligação. Cu 111varam-se os transformantes que produziram material que se.ligava a cavidades, de microtítulo revestidas com GM.1 e que era reconhecido por anticorpos monoclonais contra hLTB e STa2, isolou-se o ADN plasmTdeo e verificou-se o padrão de restrição em relação ao previsto. 0 plasmTdeo pTRH5 foi obtido a partir de uma fusão do gene codificando a hLTB e do pJS7; o pTRHô resultou de uma fusão similar com.o pJS6 (Figura 1). As sequências de junção previstas das proteínas híbridas resultantes foram as seguintes: +402
pMM B138 GluLysLeuAlaProGlnLysArgTrpSTOP +402 +19 pTRH5 GluLysLeuGlyProGlnAspAla.♦ . +102 +49 pTRHô GluLysLeuGlyProGluSerMet.,, 0 numero 102 representa o número do aminoãcido da hLTB.
Os resíduos aminolcido da ST estão sublinhados e é indicado o número do primeiro. Para a proteína híbrida obtida a partir do pTRH5> estavam presentes tanto a região interior centra1 como a região carboxi-termina 1 da ST. Na proteína recombínante expressa pelo plasmídeo pTRH6 apenas estava fundida com o hLTB a região de toxina da ST. As E. co1I CC118 compreendendo os plasmídeos pMMB138, pTRH5 ou pTRHô foram depositadas em 6 de Dezembro de 1989 na "Na- 70360 N? 47246 /9 /5 .^ 1 - ,v____' ;.___ \ - 12 - tional Collection of industrial and Marina Bactéria11, Aberdeen, GB com os números de registo NC ΓΜΒ 4023-1» NCIMB 40232 e NCIMB 40233, respectivamente.
As proteínas de fusão foram obtidas a partir das frac-ções periplãsmicas da E. colí K-12, estirpe G6 compreendendo os plasmfdeos pTRH5 ou pTRHô. Isolaram-se as fracções perip1ãsmicas por tratamento com 1ísozima-ácido etί1enodiaminõtetra-acétíco (EDTA) e depois analisaram-se por electroforese de dodeci1su1fato de sódio (SDS)-gel de pol i ac r ί 1 ami-da (PAGE) . A posição de migração das proteínas recombinantes correspondeu aos pesos moleculares das proteínas quiméricas contendo os diferentes comprimentos da STa2 fundida com a LTB. EXEMPLO 2
Introduziram-se os genes híbridos construídos no Exemplo 1, que codificam a proteína de fusão hLTB-ST num vector de expressão controlada derivado do RSF1 010 (Sandkvist e_t_a_l_, 1 987) ·
Rec1onaram-se os genes híbridos no vector, compatível com um grande número de hospedeiros, pMMBóó (Furste et aj, 1936). Este pôs a transcrição sob o controlo do promotor tac e permitiu que a síntese fosse regulada e que as proteínas fossem produzidas em enorme quantidade pela adição de i sop rop i 1 -jB-D-1 i oga 1 actop i ranos i do (IPTG). Os plasmídeos resultantes eram o pTRH13 e o pTRHl4 que produziram as proteínas de fusão também produzidas pelo pTRH5 e pTRHó respectivamente (Figura 1).
Mais pormenorizadamente, digeriu-se o pTRH5 com endonu-cleases de restrição EcoRl e Hindi II, e Íso1ou~se um fragmento de 0,65 kb. Simi 1armente, o pTRH6 foi clivado com EcoRl e Hindi II, e obteve-se um fragmento de 0,56 kb. Tratou-se o pMMB66 com EcoRl e Hind III, misturou-se com o fragmento isolado do pTRH5 ou do pTRHó e ligou-se o ADN com ADN-ligase T4 obtendo-se o pTRH13 (inserção do pTRH5) e o pTRHl4 (inserção do pTRHó). Se 1eccionaram-se os transformantes compreendendo os novos plasmídeos com base na sua capacidade em produzir, em resposta ã adição de 1 mM de IPTG, proteínas de fusão que se ligavam a placas de mícrotítulo revesti- 70360Ν° 47246 / tr
- 13 das com GM1 e que eram reconhecidas pelos anticorpos monoclonais contra a LTB e a ST» A expressão das proteínas híbridas em E. co1j K-12, estirpe G6 compreendendo o pTRH13 e o pTRHl4 resultou na síntese de dois polipéptidos com pesos moleculares correspondentes ãs proteínas híbridas intactas esperadas. As amostras periplãsmicas de E. coli pTRH13 e pTRHl4 foram precipitadas com sulfato de amónio (saturadas a 25_40&) , e dialísadas contra fosfato de sódio 1 mM, pH 7,2. Recolheram-se os agregados sedimentáveis, gerados durante a dialise, por centrifugação e redíssolveram-se em fosfato de sódio 100 mM, pH 7,2, e depois, analisaram-se por SDS-PAGE. A análise por SDS-PAGE mostrou que as proteínas híbridas LTB-ST retinham uma propriedade importante da LTB. Permaneceram como pentâmeros estáveis, discretos quando não aquecidas antes da análise por SDS-PAGE. Contudo, dissociaram-se em monõmeros após ebulição. Este facto indicou que a ligação da ST ã LTB não interferiu com um aspecto estrutural crítico da LTB que lhe empresta estabilidade e resistência ã proteõlise. EXEMPLO 3
Reconhecimento dos híbridos LTB-STa2 por anticorpos an-ti-LT e anti-ST
Avaliou-se a imuno-reactividade dos híbridos LTB-STa2 num ensaio de i muno-sorvente ... ligado a enzima baseada no GM1 (GM1 - ELISA) usando anticorpos monoclonais neutra 1izantes contra a LTB e a ST nativas para detectar o antigénío ligado. 0 ensaio é dependente da capacidade dos híbridos em se ligarem ao GMl-gan-gliõsido, e como tal, um resultado positivo constitui evidência inequívoca de que os híbridos mantiveram a propriedade de ligação a receptor característ I ca da LTB. Os resultados são apresentados na Figura 2. Na Figura 2 pode observar-se que tanto os híbridos longos com os híbridos curtos foram fortemente detectados por anticorpos neutra1izantes antí-LT e anti-ST. Deste modo, concluiu--se que os híbridos exibiram vários aspectos estruturais importan - 14 -
- 14 - ML 7 Q 3 6 Q N°. 4724b tes, incluindo a 1Lgaçao a receptor GB1 e um forte reconhecimento por anticorpos antί-toxína, que e provável que possam desempenhar um papel vital na utilização como imunogénios eficazes. EXEMPLO 4
Propriedades toxico1ógícas
Testaram-se os híbridos LTB-ST purificados para avaliar a sua toxicidade de ST em ensaios com ratinhos não adultos. Verificou-se que o híbrido mais curto, codificado pelo pTRHl4, era tóxico. Contudo, a construção mais comprida e mais estável, codificada pelo pTRH13, tinha de facto uma toxicidade muito baixa. Não se observou qualquer toxicidade detectável quando se injectaram 4 g, intragastrícamente, em ratinhos não adultos, para os quais a sensibilidade do ensaio para a ST nativa era de 1-2 ng/ratinho. Este facto indicou que o híbrido LTB-ST mais comprido estava atenuado em pelo menos 2000-4000 vezes^ainda que, na base estritamente molar, se tenha estimado que cada porção ST no híbrido tivesse ficado com uma toxicidade inferior, pelo menos 500 vezes menor, quando comparada com a do ST nativo. EXEMPLO 5
Imunogenjcidade dos híbridos LTB-STa2
Por imunização de coelhos com preparações parcialmente purificadas dos híbridos, longo e curto, obtiveram-se elevados títulos de respostas de anticorpos ao LTB e respostas significativas ao ST, Os coelhos foram ínmunizados com cada proteína híbrida utilizando um regime simples de três injecções com Adjuvante Completo de Freunds para a injecção principal e com Adjuvante Incompleto de Freunds para os reforços. Os soros de coelho imunizados com qualquer dos dois híbridos induziram fortes respostas de anticorpos anti-LTB com títulos superiores a 40 00Q. 0 facto de os híbridos terem induzido respostas de anticorpos em relação ã porção ST foi demonstrado por duas aproximações experimentais. 1) Usou-se um ELtSA de inibição onde se revestiram pia-
7036α N? 47246 cas de microtítulo cora ura híbrido de subunídade B da toxina da cólera (CT)/ST, conjugado quimicamente. Verificou-se que os anti--soros policlonais dirigidos contra a CTB não tinham qualquer efeito na ligação de um anticorpo monoclonal de ratinho anti-ST. Contudo, por contraste, o soro obtido a partir de coelhos imunizados com os híbridos recombinantes exibiram um efeito inibidor forte na ligação do anticorpo monoclonal de ratinho. Este facto sugere a presença de anticorpos anti-ST competidores no sistema imunolõ-gico do coelho. 2) Desenvolveu-se um ELTSA dírecto para discriminar os anticorpos antí-LTB dos anti-ST nos soros de coelho imunizados com híbridos recombinantes. Revestiram-se primeiro as placas de microtítulo quer com híbridos recombinantes, quer com LTB purificada e depois bloquearam-se todos os epítopos da subunídade B pela adição de um título elevado de soros de ratinho policlonais an-tí-LTB (RJ11). Seguiu-se depois a adição dos soros de coelhos. A ligação da IgG de coelho foi quantificada com um anticorpo conjugado com peroxídase de rábano (HRO). Os resultados são apresentados na Figura 3·
Nas cavidades revestidas com LTB, o soro de coelhos bloqueou eficazmente a ligação subsequente dos anticorpos anti-LTB de coelho do imuno-soro híbrido. Apesar deste efeito bloqueante, os anticorpos nos soros de coelhos imunizados com LTB-STa2 ligaram-se fortemente às cavidades revestidas com os híbridos recombi-nantes. Isto sugere fortemente que os soros dos coelhos imunizados contêm anticorpos dirigidos contra o determinante ST.
Investigou-se, adiciona1 mente, a significância biológica destes resultados, usando o ensaio do ratinho não adulto do Exemplo 4 para testar se estas respostas anti-ST podem ou não neutralizar a toxina ST nativa. As observações iniciais sugerem que os soros de coelhos imunizados com o híbrido LTB-ST mais comprido (produto de gene pTRH13) são capazes de neutralizar a ST. 0 ensaio envolveu a pré-incubação da ST nativa (40 ng/ml) com séries de diluição de soro (p.e. 1/10, 1/60} seguindo-se a injecção intragãs-trica nos ratinhos não adultos. Em ambas as diluições o imuno-so- - 16 7 0-3.6 0 · Ν° 472½ ro inibiu completamente a toxicidade ST.
Conclusões anteriores, de outros investigadores têm sugerido que os anticorpos neutra 1izantes da ST são apenas induzidos por conjugados ST-transportador que são tóxicos ST. Em face das constatações do presente invento, anteriormente descritas, a requerente considera que o híbrido LTB-ST mais comprido do presente invento exibe uma promessa considerável como antigénio toxóide LTB-ST, que deverá induzir anticorpos protectores contra ETEC produzindo ST. EXEMPLO 6 17 17 f/j] /'v»**-C, 7 0.3 6 Q N? mikL··
As cadeias duplas de olίgonucleõtldos t, II e 111, foram usadas para gerar os vectores. pTRHIOQ, pTRHlQ! e pTRH1Q2, res-pectivamente. Apresentam-se a seguir as juntas de fusão no terminal 3‘ do gene codificando a subunidade B da enterotoxína libil ao calor de Es-cher i ch i a co 1 i, os aminoãcidos codificados pelas inserções de o 1ígonuc1eõtido e os sítios das endonuc1eases de restrição. Cada vector contém um único sítio Nael, em uma das cadeias de leitura de três codões, para inserção de fragmentos de ADN ou de o 1igonuc1eõtídos sintéticos adicionais. Todos os passos de clonação foram realizados usando procedimentos convencionais. Analisaram-se a ligação e a orientação correctas dos fragmentos, estabelecendo o mapa detalhado de enzimas de restrição. + 102
G1uLysLeuGlyProGlnAlaGlyAsp *** pTRHlOO GAAAAGCTGGGTCCGCAGGCCGGCGACTAGTGGATCCTCTAGAAGCTT
Nael Spel BamHI Xbal Hindi II + 1 02
G1uLysLeuG1yProGInG1yArgHis *** pTRH101 GAAAAGCTGGGTCCGCAGGGCCGGCACTAGTGGATCCTCTAGAAGCTT
Nael Spel BamHI Xbal Hindi I I + 102
G1uLysLeuG1yProG1nProAIaAsp *** pTRH102 GAAAAGCTGGGTCCGCAGCCGGCTGACTAGTGGATCCTCTAGAAGCTT
Nael Spel BamHI Xbal Hindi II 0 número +102 sobre a sequência de aminoãcidos prevista corresponde ao resíduo aminolctdo 102 na subunidade B madura (Le-ong et al, Infect. immun. h8, 73“7, 1985). 7 CL3 6. Q. N? 47246,
- 18.
EXEMPLO 7
Produzlu-se uma proteína híbrida contendo a subunídade B fundida com epítopo repetitivo (NANP)^ do parasita da malária Piasmodtum falciparum,.inserindo uma sequência de o 1igonuc1eõti-do codificando 0 epítopo (NANP)^ no sítio Nael do piãsmídeo pTRH102.
Digeriu-se o plasmídeo pTRH102 com as endonuc1eases de restrição Nael e BamHi e purificou-se o fragmento maior. Trataram--se conjuntamente por aquecimento/arrefecimento duas sequêncías de oligonucleõtidos sintéticos (que a seguir se apresentam como A) codificando três repetições em tandem de aminoãcidos NANP, e digeriram-se com.BamHi. Lígaram-se o o 1igonuc1eótido de cadeia dupla digerido e o fragmento Naef/BamHi de pTRHl02 e transformaram-se em Escher i chia col i K12 estirpe Gó (Enequist, _ejt £_[> Eur. J.Bio-chem. 227-33, 1981).
Purificaram-se os plasmídeos recombinantes e confirmaram-se a sua ligação e orientação correctas estabelecendo o mapa detalhado de enzimas de restrição. Um dos plasmídeos correctos foi designado por pTRH17*4. Mostram-se a seguir a sequência de nucle-õtidos e os aminoãcidos previstos codificados no terminal 3' do gene (B). Por indução do produto de fusão obteve-se uma proteína com as propriedades seguintes: i) reconhecimento do receptor gangliosido GM1 ii) reunião formando oligomeros definidos iii) reacção por anticorpos monoclonais contra a subuni-dade LTB e contra o epítopo (NANP)^ usando ensaios de mancha Western e de imuno-sorvente ligado a enzima, GM1 iv) e exportada para o periplasma de Escherichia col?.
A 5' -TAACGCTAACCCGAATGCGAACCCAAACGCAAACCCGTGAGGA TCCGGGGGGAA-31 .3 ' -ATTGCGATTGGGCTTACGCTTGGGTTTGCGTTTGGGCACT CCTAGGCCCCCC-5‘ BAMH1 7(1360 N? A7246 Ífí
- 12 - + 1Q2
GluL.ysLeuGlyProGlnProAsnAlaAsnProAsnAlaAsnPro AsnAlaAsnP ro'***
B.pTRH17·^ GAAAAGCTGGGTCCGCAGCCTAACGCTAACCCGAATGCGAACCCAAA CGCAAACCCGTGAGGATC C 0 número +102 corresponde ao aminoãcido 102 na sequência madura da subuntdade B da enterotoxína lábil ao calor de Escheri-chia colI. Os nucleÓtidos sublinhados em pTRH17·^ são derivados do o 1igonuc1eótido sintético em A.
Claims (15)
- -20- -20- ‘V-y»*»<©V 70 360 Ν.47246 REIVINDICACÕES 1 - Processo de preparação de um hospedeiro transformado, no qual se exprime uma proteína de fusão, compreendendo a transformação do de um hospedeiro com um vector o qual compreende uma sequência de ADN codificando uma proteína de fusão e o que é capaz de, no hospedeiro transformado, exprimir a proteína de fusão, caracterizado por o hospedeiro ser transformado com o referido vector compreendendo a referida sequência de ADN que codifica uma proteína de fusão que compreende a subunidade B da tóxina lábil ao calor de E. coli (LTB) possuindo um antigénio ou epitopo de um patogéneo responsável por uma doença humana ou animal, fundindo com o terminal carboxilo da LTB.
- 2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se proporcionar uma sequência ligante entre o terminal carboxilo da LTB e o referido antigénio ou epitopo.
- 3 - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por a união de fusão compreender a sequência de aminoácidos -Lys-Leu-Gly-Pro-Gln.
- 4 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizado por a LTB ser fundida com o núcleo e regiões da toxina ou à região da toxina da toxina estável ao calor de E. coli (ST).
- 5 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizado por o vector ser um plasmídeo.
- 6 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizado por o hospedeiro ser uma estirpe de E. coli.
- 7 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizado por o hospedeiro transformado, resultante, ser uma vacina viva atenuada.
- 8 - Processo de preparação de uma proteína de fusão compreendendo a cultura, sob condições tais que a proteína de fusão é expressa, de um hospedeiro transformado com um vector, o qual compreende uma sequência de ADN codificando a proteína de fusão e que é capaz de, no hospedeiro transformado, exprimir a proteína de fusão, caracterizado por o referido hospedeiro que é cultivado comportar um vector referido que compreende uma -21- 70 360 Ν.47246 sequência de ADN referida codificando uma proteína de fusão compreendendo LTB possuindo um antigénio ou epitopo proveniente de um patogénio responsável por uma doença humana ou animal fundido com o terminal carboxilo da LTB.
- 9 - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por se proporcionar uma sequência ligante entre o terminal carboxilo da LTB e o referido antigénio ou epitopo.
- 10 - Processo de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado por a união de fusão compreender a sequência de aminoácidos -Lys-Leu-Gly-Pro-Gln-.
- 11 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, caracterizado por a LTB ser fundida com o núcleo e regiões da toxina ou à região da toxina da toxina estável ao calor de E. coli (ST).
- 12 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11, caracterizado por o vector ser um plasmídeo.
- 13 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 12, caracterizado por o hospedeiro ser de uma estirpe de E. coli.
- 14 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 13, caracterizado por o hospedeiro transformado resultante ser uma vacina viva atenuada.
- 15 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 14, caracterizado por compreender' (i) a inserção de uma sequência de ADN codificando o referido antigénio ou epitopo, num vector que codifica LTB, possuindo a LTB uma extensão do terminal carboxilo possuindo a sequência de codificação para extensão um sítio de restrição e sendo a sequência de ADN inserida no referido sítio de restrição; e (ii) a cultura de um hospedeiro contendo o vector resultante, sob condições tais que a proteína de fusão é expressa. Lisboa, -6.0U ΓΌ9 Por UNIVERSITY 0F LEICESTER
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FC3A | Refusal |
Effective date: 19960219 |