PT92511A - Processo de preparacao de um hospedeiro transformado e de proteinas de fusao da subunidade b de toxina labil ao calor - Google Patents
Processo de preparacao de um hospedeiro transformado e de proteinas de fusao da subunidade b de toxina labil ao calor Download PDFInfo
- Publication number
- PT92511A PT92511A PT92511A PT9251189A PT92511A PT 92511 A PT92511 A PT 92511A PT 92511 A PT92511 A PT 92511A PT 9251189 A PT9251189 A PT 9251189A PT 92511 A PT92511 A PT 92511A
- Authority
- PT
- Portugal
- Prior art keywords
- ltb
- fusion protein
- host
- vector
- toxin
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 21
- 239000003053 toxin Substances 0.000 title claims description 8
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 title claims description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 6
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title description 33
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title description 16
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 57
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 57
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 30
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 30
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 30
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 25
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 16
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 15
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 14
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 9
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 8
- 244000052769 pathogen Species 0.000 claims description 7
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 6
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 6
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 claims description 5
- 229940124590 live attenuated vaccine Drugs 0.000 claims description 5
- 229940023012 live-attenuated vaccine Drugs 0.000 claims description 5
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 3
- 101710182223 Toxin B Proteins 0.000 claims description 2
- 208000031295 Animal disease Diseases 0.000 claims 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 claims 1
- 101000764294 Homo sapiens Lymphotoxin-beta Proteins 0.000 description 57
- 102100026894 Lymphotoxin-beta Human genes 0.000 description 49
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 16
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 15
- 101150018411 LTB gene Proteins 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 10
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 8
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 7
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 7
- 102000055414 human LTB Human genes 0.000 description 7
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 7
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 6
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 6
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 6
- 101100366889 Caenorhabditis elegans sta-2 gene Proteins 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 5
- 241001646716 Escherichia coli K-12 Species 0.000 description 4
- 101001111984 Homo sapiens N-acylneuraminate-9-phosphatase Proteins 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 4
- 102100023906 N-acylneuraminate-9-phosphatase Human genes 0.000 description 4
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 4
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 4
- 239000000147 enterotoxin Substances 0.000 description 4
- 231100000655 enterotoxin Toxicity 0.000 description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 4
- KQPKMEYBZUPZGK-UHFFFAOYSA-N 4-[(4-azido-2-nitroanilino)methyl]-5-(hydroxymethyl)-2-methylpyridin-3-ol Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CNC=2C(=CC(=CC=2)N=[N+]=[N-])[N+]([O-])=O)=C1O KQPKMEYBZUPZGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 101710146739 Enterotoxin Proteins 0.000 description 3
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 3
- 241000293871 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhi Species 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- QPJBWNIQKHGLAU-IQZHVAEDSA-N ganglioside GM1 Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC[C@H](NC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC)[C@H](O)\C=C\CCCCCCCCCCCCC)O[C@H](CO)[C@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@]2(O[C@H]([C@H](NC(C)=O)[C@@H](O)C2)[C@H](O)[C@H](O)CO)C(O)=O)[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](CO)O1 QPJBWNIQKHGLAU-IQZHVAEDSA-N 0.000 description 3
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 3
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- 230000004044 response Effects 0.000 description 3
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 3
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 3
- 231100000033 toxigenic Toxicity 0.000 description 3
- 230000001551 toxigenic effect Effects 0.000 description 3
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 3
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 102000009016 Cholera Toxin Human genes 0.000 description 2
- 108010049048 Cholera Toxin Proteins 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 101710121697 Heat-stable enterotoxin Proteins 0.000 description 2
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- VMTYLUGCXIEDMV-QWRGUYRKSA-N Lys-Leu-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN VMTYLUGCXIEDMV-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N N-glycyl-L-proline Natural products NCC(=O)N1CCCC1C(O)=O KZNQNBZMBZJQJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- 241000293869 Salmonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium Species 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 101150037081 aroA gene Proteins 0.000 description 2
- 101150040872 aroE gene Proteins 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 2
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 2
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 2
- 210000001322 periplasm Anatomy 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 229940083575 sodium dodecyl sulfate Drugs 0.000 description 2
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 2
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 2
- 101100163490 Alkalihalobacillus halodurans (strain ATCC BAA-125 / DSM 18197 / FERM 7344 / JCM 9153 / C-125) aroA1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241001167018 Aroa Species 0.000 description 1
- 101100216993 Bacillus subtilis (strain 168) aroD gene Proteins 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 241000606153 Chlamydia trachomatis Species 0.000 description 1
- 241000709687 Coxsackievirus Species 0.000 description 1
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 1
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 244000115658 Dahlia pinnata Species 0.000 description 1
- 235000012040 Dahlia pinnata Nutrition 0.000 description 1
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 1
- 101100491986 Emericella nidulans (strain FGSC A4 / ATCC 38163 / CBS 112.46 / NRRL 194 / M139) aromA gene Proteins 0.000 description 1
- 208000007212 Foot-and-Mouth Disease Diseases 0.000 description 1
- 241000710198 Foot-and-mouth disease virus Species 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 101150111020 GLUL gene Proteins 0.000 description 1
- JLXVRFDTDUGQEE-YFKPBYRVSA-N Gly-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N JLXVRFDTDUGQEE-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- SCCPDJAQCXWPTF-VKHMYHEASA-N Gly-Asp Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CC(O)=O SCCPDJAQCXWPTF-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 208000031886 HIV Infections Diseases 0.000 description 1
- 241000709721 Hepatovirus A Species 0.000 description 1
- 241000713772 Human immunodeficiency virus 1 Species 0.000 description 1
- 241000713340 Human immunodeficiency virus 2 Species 0.000 description 1
- 241000341655 Human papillomavirus type 16 Species 0.000 description 1
- 241000709704 Human poliovirus 2 Species 0.000 description 1
- 241000709727 Human poliovirus 3 Species 0.000 description 1
- YFBBUHJJUXXZOF-UWVGGRQHSA-N Leu-Gly-Pro Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O YFBBUHJJUXXZOF-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- 241000701076 Macacine alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 102000029749 Microtubule Human genes 0.000 description 1
- 108091022875 Microtubule Proteins 0.000 description 1
- 101000764297 Mus musculus Lymphotoxin-alpha Proteins 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 101000822797 Naja naja Long neurotoxin 5 Proteins 0.000 description 1
- 101710160107 Outer membrane protein A Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 1
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 1
- 241000360012 Spilosoma dubia Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 description 1
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 description 1
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000001147 anti-toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 101150042732 aroC gene Proteins 0.000 description 1
- 101150102858 aroD gene Proteins 0.000 description 1
- 101150108612 aroQ gene Proteins 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 210000004970 cd4 cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 229940038705 chlamydia trachomatis Drugs 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 108010055409 ganglioside receptor Proteins 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000005182 global health Effects 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 208000005252 hepatitis A Diseases 0.000 description 1
- 229930186900 holotoxin Natural products 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 210000004688 microtubule Anatomy 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 230000003389 potentiating effect Effects 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000002110 toxicologic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000723 toxicological property Toxicity 0.000 description 1
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 1
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000010396 two-hybrid screening Methods 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/44—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from protozoa
- C07K14/445—Plasmodium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/24—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Enterobacteriaceae (F), e.g. Citrobacter, Serratia, Proteus, Providencia, Morganella, Yersinia
- C07K14/245—Escherichia (G)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/55—Fusion polypeptide containing a fusion with a toxin, e.g. diphteria toxin
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
Description
7036α N? hizhb
MEMÓRIA DESCRITIVA 0 presente invento refere-se ao processo de preparação de proteínas de fusão da subunídade B de toxina lãbil ao calor e ãs suas utilizações.
As estirpes toxigénicas da Eschertchia co 1 i (ETEC) estão entre as causas maís importantes de doenças e de mortalidade infantil, no mundo em desenvolvimento. Qualquer vacina capaz de reduzir os 650 milhões de casos estimados (incluindo cerca de 800 000 mortes) por ano, contribuirá claramente de uma forma significativa para os cuidados de saúde globais. 0 desenvolvimento destas vacinas tem de ter em conta o requisito de imunizar contra as ETEC de serotipos diferentes que produzem uma variedade de an-tigénios adesivos e uma, ou ambas, de duas enterotoxinas altamente potentes. Será também necessário avaliar a via e a facilidade de administração da vacina, bem como o seu armazenamento, estabilidade e custo. A requerente conseguiu preparar com sucesso, uma série de proteínas de fusão onde diferentes porções do gene da en-terotoxina estável ao calor ($T) estão fundidas no terminal 3' do gene codificando a subunídade B da enterotoxina lãbil ao calor (LTB). Estes híbridos recombinantes LTB-ST possuem todas as propriedades relevantes para serem imunogénios de mucosa eficazes. Exprimiu-se também outra proteína híbrida onde um epítopo está fundido com o terminal carboxilo da LTB. As proteínas de fusão, compreendendo um antigénio ou epítopo fundido com o terminal carboxilo da LTB, representam deste modo uma nova forma de apresentar eficazmente o antigénio ou epítopo ao imuno-si s tema.
Deste modo, o presente invento refere-se a uma proteína de fusão que compreende a subunídade B da toxina lãbil ao calor de E. co1i (LTB) com um antigénio ou epítopo de um patogênío responsável por uma doença humana ou veterinária, fundida com o terminal carboxilo da LTB.
As proteínas de fusão dobram-se correctamente e reúnem 70360 N? ^72^6.
•-9 - 3 -se formando complexos pantaméricos estiveis. A LTB natural reu-ne-se formando oligõmeros de holotoxina com a subunidade A acti-vadora da adenί1 atoeíc1 ase numa proporção molar de B:A de 5:1· As proteínas de fusão têm uma afinidade elevada para ligação ao gan-gliõsido -GM1, uma forte Imuno-reactívidade em relação ã neutralização do anticorpo antí-LT e do anticorpo em relação ao antigé-nio ou epítopo fundido com a LTB, e a capacidade de induzir boas respostas de anticorpo em relação ã LTB e ao antigénio ou epítopos fundi dos.
As proteínas de fusão utilizam a LTB como transportador para um epítopo ou antigénio. No gene da LTB tem de ficar retida informação estrutural suficiente para favorecer a formação de uma proteína quimérica que se ligue ao gangliõsído GM1 e apresente todos os epítopos da LTB. Tipicamente, a sequência de aminoicidos da LTB é pois mantida até ao aminoãcido 102 (G1u). A LTB pode ser, por exemplo, a LTB humana (hLTB) ou a LTB porcina (pLTB).
Pode utilizar-se uma sequência ligante entre o terminal carboxilo da LTB e o antigénio ou epítopo fundido com a LTB. A sequência pode ter até 10 resíduos aminoãcido,. por exemplo, 2 ou 3 resíduos. Deste modo, uma sequência ligante adequada é -Lys-Leu-ou - Lys -Leu-G 1 y- . A sequência na junção entre a LTB e o antigénio ou epítopo fundido compreende, preferivelmente, -Lys-Leu-G1y-Pro-G1n-. A presença desta sequência de junção é particularmente benéfica em assegurar que a porção LTB da proteína de fusão e o antigénio ou epítopos fundidos se dobram ambos correctamente e são, consequentemente, apresentados de um modo adequado ao imuno-sistema de um humano ou animal ao qual podem ser administrados. Adiciona1 mente, a sequência de junção é também particu 1 armente benéfica devido a permitir que a proteína de fusão se auto-reúna em pentâmeros estáveis. A sequência de junção é constituída quando se junta o antigénio ou epítopo fundido com a LTB. A sequência de junção pode compreender um ou mais resíduos aminoãcido do terminal carboxilo da LTB e/ou um ou maís resíduos aminoãcido do terminal amino
7036ο N? 47246. do antigénío ou epítopo fundido·. Tipicamente, a sequência de junção situa-se imedíatamente apôs a sequência de aminoácidos do LTB. Os dois ou três resíduos finais do terminal amíno do antigé-nio ou epítopo fundido podem fazer parte da sequência de junção.
Qualquer sequência de resíduos aminolcido com activida-de biológica pode ser fundida com o terminal carboxilo da LTB. Qualquer antigénío ou epítopo de um patogénio responsável por uma doença humana ou veterinária pode ser apresentado pela proteína de fusão. 0 antigénío ou epítopo pode ser qualquer um que é capaz de induzir a formação de anticorpos neutralizantes ou não neutra-lizantes. Pode utilizar-se um determinante antigenico previsto. 0 epítopo pode ter ate 20 resíduos aminoâcido de comprimento.
Assim, funde-se uma sequência de amínoãcidos estranha com a LTB. Esta pode, deste modo, compreender um determinante an-tigénico capaz de induzir a formação de anticorpos neutra1izantes em relação a um organismo patogénico. 0 epítopo pode ser derivado de um vírus, bactéria, fungo, levedura ou parasita. Mais especialmente, o epítopo pode ser derivado de um tipo do vírus da imunodeficiência humana (HIV), tal como o HIV-1 ou HIV-2, do vírus da hepatite A ou B, do rindvírus humano, tal como o tipo 2 ou o tipo 14, do vírus herpes simplex, do poliovírus do tipo 2 ou 3, do víYus da febre aftosa, do vírus da gripe, do vírus coxsackie, do antigénío de superfície celular CD4, da Chlamydia trachomatis, RSV, HPV, p.e. HPV16, e da enterotoxina estável ao calor de E.co-1i (ST). A LTB pode, deste modo, ser fundida com uma porção imu-nogénica da ST. Pode fundir-se a LTB com as regiões central e de toxina, ou apenas com a região de toxina. Por exemplo, pode ligar--se a LTB a uma porção da ST começando no aminoâcido da ST numero 19 (Pro) ou no aminoâcido da ST número 49 (Gly). Ambas as proteínas híbridas, larga e curta, resultantes incluem todos os dezanove resíduos aminoâcido do terminal carboxilo da ST que contêm os seis resíduos Cys necessários para a configuração da ST nativa.
As proteínas- de fusão são preparadas por metodologia - 5 -
- 5 - f'L 70360 N? h7.2½ de ADN recombInante. Maís partícu1 armente, uma proteína de fusão é preparada por um processo que compreende a cultura de um hospedeiro que foi transformado com um vector capaz de exprimir a proteína de fusão nesse hospedeiro, sob condições tais que a proteína de fusão possa ser expressa. Pode depois isolar-se a proteína de fusão, tipicamente, numa forma biologicamente pura.
Deste modo, a preparação da proteína de fusão depende da obtenção de uma sequência de ADN codificando a proteína de fusão. A sequência de ADN pode estar guarnecida no seu terminal 51> com uma sequência codificando um líder para a proteína de fusão» de modo a que a proteína de fusão seja exportada do citoplasma da célula hospedeira no qual se exprime. Pode utilizar-se qualquer sequência líder apropriada. Tipicamente porém, o ADN codificando a sequência líder da LTB natural é fornecido imediatamente a montante do gene da LTB. Por "gene da LTB" entende-se a sequência de ADN codificando a LTB madura sem a sua sequência líder.
Assim, é preparada uma sequência de ADN codificando a proteína de fusão desejada. Prepara-se um vector de expressão que incorpora a sequência de ADN e que e capaz de exprimir a proteína de fusão quando transfectado num hospedeiro adequado. Para a sequência de ADN são fornecidos os elementos de controlo da transcrição e da tradução apropriados, em particular, um promotor para a sequência de ADN e um sítio de terminação da transcrição. A sequência de ADN está localizada no vector entre os sinais de início e paragem da tradução. A sequência de ADN é fornecida na estrutura correcta, de modo a permitir que a expressão da proteína de fusão ocorra num hospedeiro compatível com o vector.
Usa-se o vector de expressão para transformar um hospedeiro. Cultivam-se as células contendo o vector de expressão de forma a permitir que se verifique a expressão da proteína de fusão. A proteína de fusão pode-se auto-reunir em oligõmeros. Pode utilizar-se qualquer sistema de hospedeiro-vector apropriado. 0 hospedeiro pode ser um hospedeiro procariótico ou eucartõtico. 0 vector pode ser um vector plasmídeo. Nesse caso, pode usar-se um hospedeiro bacteriano ou de levedura, por exemplo, um bacilo Gram- 7Q36Q N? klZkk ã~ C - //. // . y t '.-«"l
--:n" - 6 -negativo tal como E. colL ou uma espécie V i fa r í o, ou S♦Cerev i s i ae. AIternativamente, o vector pode ser um vecto r virai. Este pode ser usado para transfectar células de uma linha de células de mamífero, tal como as células de ovário de criceto chinês (CHO), de modo a provocar a expressão.
Um vector de expressão de proteínas de fusão pode ser preparado: a) fornecendo um vector de expressão LTB; e b) ligando o gene codificando um antigénío ou epítopo desejado ao terminal 3' do gene LTB.
Pode obter-se um vector capaz de exprimir a LTB por clo-naçio do gene da LTB (Dal las, fnfect. Immun. hQ_, 647~652, 1983) num vector sob o controlo, de elementos reguladores da transcrição e da tradução apropriados. Se a proteína de fusão tem uma sequen-c i a ilgante entre/LTB e o antigénío ou epítopo, podem sintetizar-se oligonuc1eõtidos correspondentes à sequência ligante e podem ajustar-se ao terminal 3' da gene da LTB ou ao terminal 5' do gene codificando o antigénío ou epítopo.
Um vector preferido para uso na obtenção de um vector de expressão da proteína de fusão ê um vector que codifica a LTB com uma extensão carboxi-terminal. A sequência de codificação para a extensão é seleccionada de modo a que tenha um sítio de restrição. Se se desejar a fusão com a LTB pode inserir-se neste sítio um gene codificando um antigénío ou epítopo. A sequência de codificação até ao sítio de restrição é também seleccionada de modo a codificar os resíduos aminoãcido correctos para toda ou para parte de uma sequência ligadora desejada.
Deste modo, o presente invento refere-se a um vector de expressão que codifica a LTB com uma extensão carboxi-termlna 1 onde a sequência de codificação da extensão tem um sítio de restrição inserido. 0 presente invento refere-se também a um processo para a preparação de uma proteína de fusão compreendendo a LTB e um an-tigênío ou epítopo de um patogénio responsável por uma doença hu- 70360 Ν° ^72½. / ?· <r '
<ãv - 7 mana ou veterinária fundida no terminal carboxilo da LTB, processo este que compreende (li a Inserção de uma sequência de ADN codificando o antígénio ou epítopo. num tal vector no referido sftio de restrição; e (Γ Γ) cultura de um hospedeiro compreendendo o vec tor resultante sob condições tais que a proteína de fusão seja expressa. 0 sítio de restrição pode ser fornecido em qualquer cadeia de leitura. Podem estar presentes mais do que um sítio. A ex tensão carboxi-termina 1 pode ter qualquer comprimento, por exempl 5 a 10 resíduos amínoicido e, especia 1mente, 8 resíduos aminoaci-do. As extensões preferidas, as suas sequências de codificação e a localização de um sítio de restrição para adiael (_) são as se- gu i ntes:
Ly s Leu Gly Pro Gin Al a Gly Asp Sfeífe* AAG CTG GGT CCG CAG GCC GGC GAC TAG Lys Leu Gly Pro Gin Gly Arg Hís *** AAG CTG GGT CCG CAG GGC CGG CAC TAG Lys Leu Gly Pro Gin P ro Ala Asp *** AAG CTG GGT CCG CAG CCG GCT GAC TAG *** representa um codão de paragem. Estes vectores de expressão podem ser preparados sintetizando os oligonucleõtidos correspondentes â extensão desejada e ajustando estes ao terminal 3' do ge ne LTB. 0 gene LTB alargado resultante ê fornecido num vector de expressão com os elementos de controlo de transcrição e de tradução adequados.
Pode isolar-se a proteína de fusão expressa, Quando se exprime uma proteína de fusão com uma sequência líder, a proteína terá sido exportada do citoplasma da célula onde se realiza a sua expressão. Uma proteína de fusão com uma sequência líder de LTB natural, por exemplo, pode deste modo ser isolada e purificada a partir do periplasma de E. co11. A proteína de fusão purificada matou as estirpes toxi-génicas de E. Coi i onde a proteína de fusão tinha sido expressa e
7036 α Ν° 4724.6-podem usar-se, como v a cimas, as. vacinas vivas atenuadas, capazes de exprimirem a proteína de fusão. 0 presente invento refere-se pois, consequentemente, também a uma vacina onde o princípio activo é seleccio-nado de entre: í) uma proteína de fusão que compreende a LTB com um antigénio ou epítopo, de um patogénio responsável por uma doença humana ou animal, fundido com o terminal carboxMo da LTB; ii) uma estirpe toxigéníea de E. coli onde se exprimiu a referida proteína de fusão e que foi morta; e iii) uma vacina viva atenuada capaz de exprimir a referida proteína de fusão.
Tipicamente as vacinas compreendem também um transportador ou diluente fisio 1oglcamente aceitável. Podem utilizar-se formulações, transportadores e diluentes convencionais. Uma vacina viva atenuada adequada pode ser um microrganismo atenuado com uma mutação não reversível em cada um de dois genes discretos no seu percurso de bío-síntese de aromáticos. Na EP-A0322237 descrevem-se estes microrganismos. 0 microrganismo é tipicamente uma bactéria patogênica, por exemplo do género Salmonel1 a tal como a S . typh i, a S. typhimurium, a S. dub1i n ou a S. cho1 eras i us.
As mutações não reversíveis podem ocorrer em qualquer um dos genes aroA, aroC, aroD e aroE. Preferivelmente, uma das mutações não reversíveis situa-se no gene a roA. Um microrganismo atenuado adequado pode compreender uma "cassette11 de expressão codificando uma proteína de fusão de modo a que a proteína de fusão possa ser expressa pelo microrganismo. Para a expressão fiável através de geração do microrganismo, uma "cassette" de expressão deverá ser estavelmente herdada na ausência da selecção por antibióticos.
Uma vacina pode ser administrada por qualquer via conveniente. A esco 1 ha entre a adopção de uma via oral ou de uma via pa-renteral, tal como a administração subcutânea, intravenosa ou intramuscular, da dose e da frequência da vacinação depende do propósito da vacinação, de se estar a tratar um humano ou um animal, 7 ¢13 6 Ο Ν° kjlh&. -·;>Γ ' c;-·" - a e do estado clínico do humano ou do animal ao qual se vai adminis· trar a vacina.
Tipicamente, contudo, a proteína de fusão é administrada numa quantidade de 1 — 1 Q 0 0 ug por dose, ma i s. preferivelmente de 10 - 100 ag por dose, quer pela via oral quer pela via parenteral q
Para a S. typhi atenuada, por outro lado, uma dosagem de 10 a 11 10 organismos S. typhi, por dose e geralmente conveniente para um paciente adulto humano de 70 Kg, tipicamente, pela via oral.
Os Exemplos seguintes servem para ilustrar a invenção. Nos desenhos: a região interior central do gene Sta2 e \ljII]]IHÍl\ representa a região carbo-xi-terminal do gene Sta2; a Figura 2 mostra a imuno-reactividade das proteínas híbridas expressas pela estirpe Gé de E. co1í K-12 compreendendo o pTRH5 ou o pTRHó, onde o eixo y representa o título de toxina em logaritmo, m o anticorpo monoc 1 ona.l. contra .q .Sta2 e j///j\ representa o anticorpo monoclonal.contra a LTB; e a Figura 1 mostra a estrutura do pTRH5, pTRHó, pTRH13 e pTRHl4, onde -representa o gene da LTB, [ a Figura 3 mostra os resultados de uma análise para a ligação de anticorpos anti-(proteína híbrida) em relação a determinantes ST, onde no eixo y se representa a absorvância a 45Q nm; I representa revestimento: antigénio híbrido, anticorpo sonda: soro de coelho de pré-imunização; ffj/j representa revestimento: LTB, anticorpo sonda: soro de coelho imunizado, e F~3 apresenta revestimento: antigénio híbrido, anticorpo sonda: soro de coelho de pré-imunização. EXEMPLO 1 A construção das proteínas híbridas LTB-ST recorabinantes foi conseguida por fusão do gene codificando a subunidade B da en-terotoxina lãbil ao calor (LT) com duas porções diferentes do gene codificando a enterotòxina estável ao calor (ST). Isto permi- - 10 * &
7Q36Q Ν° 47246. £ ítu a introdução de sequências 1igantes no gene ST e o uso de um gene LTB modificado, os quais jã foram ambos anteriormente descritos (Sanchez et a 1, Gene 64, 265-275, 1986; Sanchez et al, FEBS Letters, 208, 194-198, 1988; Sandkvist et aj, J. Bacteriol, 169, 4570-4578, 1987). 0 gene Sta2 foí isolado na forma de um fragmento AvalI/BamH 1 ou Driel/BamH1 a partir do pSLM4 (Moseley e_t a 1 , Infect. Immun. 3_9, 1 167-1 174, 1983). Os terminais AvaXI ou Ddel foram ajustados com os o 1igonuc1eõtidos A ou B (Sanchez et al, 1988), produzindo-se assim um terminal complementar para o ADN cortado com EcoRI, A: AATTCGCCCGG pJSó: Avall-EcoR1
GCGGGCCCAG
Sma I B: AATTCGCCCGGGTCC pJS7: Ddel-EcoR1
GCGGGCCCAGGAGT
Sma [ e introduzindo-se um sítio Smal em cada extensão. Os fragmentos foram depois ligados ao vector pl)C18 que tinha sido cortado com EcoRI e com BamH1, produzindo-se assim o pJS6 e o pJS7. A construção do pMMl38 envolveu o isolamento do gene LTB a partir do pWD6l5 (Da lias, Infect. Immun. 40., 647-652, 1983) na forma de um fragmento EcoR1/ΗindllI e a sua ligação subsequente ao pMMB66EH (Furste et a_l , Gene 4_8, 1 19-131 , 1986) para produzir o pMMB68. 0 sftio Spei incorporando o codão de paragem do gene hLTB foi mutado num sítio Hindi 11 como é descrito por Sandkvist et _aj, obtendo-se o plasmfdeo pMMB138.
Os plasmídeos pJS6 e pJS7 foram digeridos com EcoRI e com Smal. 0 plasmídeo pMMB138 foi cortado com Hindi II, isolou-se o fragmento grande de ADN e preencheram-se os terminais salientes com ADN-pol imerase T4 (0 ,1 U/ytíl) e com 100 nM de dATP, dCTP, dGTP 11 - 7 Ο 3.6 ο. . N? 472.46. ____— e dTTP. Após precipitar o fragmento de ADN, este foi adicionalmente cortado com EcoRl e isolou-se o fragmento mais pequeno, codificando o hLTB. Misturou-se este com o digerido de pJS6 e pJS7 com EcoRi/Smal, com uma proporção fragmento: vector de 1:10 (p/p) , aqueceu-se até 70°C durante 2 minutos e depois deixou-se a incubar ã temperatura ambiente. Apôs a adição de ATP (1 mM), BSA (29 ^.g/ml), DTT (4 mM) e ADN-lígase T4 (1,4 u/μ]), incubou-se a mistura a 4°C, de um dia para o outro, para ligar o ADN (a concentração final de ADN foi de 63 ng/u.1).
Transformaram-se células competentes de E. co1i K-12 estirpe G6 (Hardy et , Proc. Natl . Acad. Scí. 85., 71Q9"7113j 1988) com as misturas de ligação. Cu 111varam-se os transformantes que produziram material que se.ligava a cavidades, de microtítulo revestidas com GM.1 e que era reconhecido por anticorpos monoclonais contra hLTB e STa2, isolou-se o ADN plasmTdeo e verificou-se o padrão de restrição em relação ao previsto. 0 plasmTdeo pTRH5 foi obtido a partir de uma fusão do gene codificando a hLTB e do pJS7; o pTRHô resultou de uma fusão similar com.o pJS6 (Figura 1). As sequências de junção previstas das proteínas híbridas resultantes foram as seguintes: +402
pMM B138 GluLysLeuAlaProGlnLysArgTrpSTOP +402 +19 pTRH5 GluLysLeuGlyProGlnAspAla.♦ . +102 +49 pTRHô GluLysLeuGlyProGluSerMet.,, 0 numero 102 representa o número do aminoãcido da hLTB.
Os resíduos aminolcido da ST estão sublinhados e é indicado o número do primeiro. Para a proteína híbrida obtida a partir do pTRH5> estavam presentes tanto a região interior centra1 como a região carboxi-termina 1 da ST. Na proteína recombínante expressa pelo plasmídeo pTRH6 apenas estava fundida com o hLTB a região de toxina da ST. As E. co1I CC118 compreendendo os plasmídeos pMMB138, pTRH5 ou pTRHô foram depositadas em 6 de Dezembro de 1989 na "Na- 70360 N? 47246 /9 /5 .^ 1 - ,v____' ;.___ \ - 12 - tional Collection of industrial and Marina Bactéria11, Aberdeen, GB com os números de registo NC ΓΜΒ 4023-1» NCIMB 40232 e NCIMB 40233, respectivamente.
As proteínas de fusão foram obtidas a partir das frac-ções periplãsmicas da E. colí K-12, estirpe G6 compreendendo os plasmfdeos pTRH5 ou pTRHô. Isolaram-se as fracções perip1ãsmicas por tratamento com 1ísozima-ácido etί1enodiaminõtetra-acétíco (EDTA) e depois analisaram-se por electroforese de dodeci1su1fato de sódio (SDS)-gel de pol i ac r ί 1 ami-da (PAGE) . A posição de migração das proteínas recombinantes correspondeu aos pesos moleculares das proteínas quiméricas contendo os diferentes comprimentos da STa2 fundida com a LTB. EXEMPLO 2
Introduziram-se os genes híbridos construídos no Exemplo 1, que codificam a proteína de fusão hLTB-ST num vector de expressão controlada derivado do RSF1 010 (Sandkvist e_t_a_l_, 1 987) ·
Rec1onaram-se os genes híbridos no vector, compatível com um grande número de hospedeiros, pMMBóó (Furste et aj, 1936). Este pôs a transcrição sob o controlo do promotor tac e permitiu que a síntese fosse regulada e que as proteínas fossem produzidas em enorme quantidade pela adição de i sop rop i 1 -jB-D-1 i oga 1 actop i ranos i do (IPTG). Os plasmídeos resultantes eram o pTRH13 e o pTRHl4 que produziram as proteínas de fusão também produzidas pelo pTRH5 e pTRHó respectivamente (Figura 1).
Mais pormenorizadamente, digeriu-se o pTRH5 com endonu-cleases de restrição EcoRl e Hindi II, e Íso1ou~se um fragmento de 0,65 kb. Simi 1armente, o pTRH6 foi clivado com EcoRl e Hindi II, e obteve-se um fragmento de 0,56 kb. Tratou-se o pMMB66 com EcoRl e Hind III, misturou-se com o fragmento isolado do pTRH5 ou do pTRHó e ligou-se o ADN com ADN-ligase T4 obtendo-se o pTRH13 (inserção do pTRH5) e o pTRHl4 (inserção do pTRHó). Se 1eccionaram-se os transformantes compreendendo os novos plasmídeos com base na sua capacidade em produzir, em resposta ã adição de 1 mM de IPTG, proteínas de fusão que se ligavam a placas de mícrotítulo revesti- 70360Ν° 47246 / tr
- 13 das com GM1 e que eram reconhecidas pelos anticorpos monoclonais contra a LTB e a ST» A expressão das proteínas híbridas em E. co1j K-12, estirpe G6 compreendendo o pTRH13 e o pTRHl4 resultou na síntese de dois polipéptidos com pesos moleculares correspondentes ãs proteínas híbridas intactas esperadas. As amostras periplãsmicas de E. coli pTRH13 e pTRHl4 foram precipitadas com sulfato de amónio (saturadas a 25_40&) , e dialísadas contra fosfato de sódio 1 mM, pH 7,2. Recolheram-se os agregados sedimentáveis, gerados durante a dialise, por centrifugação e redíssolveram-se em fosfato de sódio 100 mM, pH 7,2, e depois, analisaram-se por SDS-PAGE. A análise por SDS-PAGE mostrou que as proteínas híbridas LTB-ST retinham uma propriedade importante da LTB. Permaneceram como pentâmeros estáveis, discretos quando não aquecidas antes da análise por SDS-PAGE. Contudo, dissociaram-se em monõmeros após ebulição. Este facto indicou que a ligação da ST ã LTB não interferiu com um aspecto estrutural crítico da LTB que lhe empresta estabilidade e resistência ã proteõlise. EXEMPLO 3
Reconhecimento dos híbridos LTB-STa2 por anticorpos an-ti-LT e anti-ST
Avaliou-se a imuno-reactividade dos híbridos LTB-STa2 num ensaio de i muno-sorvente ... ligado a enzima baseada no GM1 (GM1 - ELISA) usando anticorpos monoclonais neutra 1izantes contra a LTB e a ST nativas para detectar o antigénío ligado. 0 ensaio é dependente da capacidade dos híbridos em se ligarem ao GMl-gan-gliõsido, e como tal, um resultado positivo constitui evidência inequívoca de que os híbridos mantiveram a propriedade de ligação a receptor característ I ca da LTB. Os resultados são apresentados na Figura 2. Na Figura 2 pode observar-se que tanto os híbridos longos com os híbridos curtos foram fortemente detectados por anticorpos neutra1izantes antí-LT e anti-ST. Deste modo, concluiu--se que os híbridos exibiram vários aspectos estruturais importan - 14 -
- 14 - ML 7 Q 3 6 Q N°. 4724b tes, incluindo a 1Lgaçao a receptor GB1 e um forte reconhecimento por anticorpos antί-toxína, que e provável que possam desempenhar um papel vital na utilização como imunogénios eficazes. EXEMPLO 4
Propriedades toxico1ógícas
Testaram-se os híbridos LTB-ST purificados para avaliar a sua toxicidade de ST em ensaios com ratinhos não adultos. Verificou-se que o híbrido mais curto, codificado pelo pTRHl4, era tóxico. Contudo, a construção mais comprida e mais estável, codificada pelo pTRH13, tinha de facto uma toxicidade muito baixa. Não se observou qualquer toxicidade detectável quando se injectaram 4 g, intragastrícamente, em ratinhos não adultos, para os quais a sensibilidade do ensaio para a ST nativa era de 1-2 ng/ratinho. Este facto indicou que o híbrido LTB-ST mais comprido estava atenuado em pelo menos 2000-4000 vezes^ainda que, na base estritamente molar, se tenha estimado que cada porção ST no híbrido tivesse ficado com uma toxicidade inferior, pelo menos 500 vezes menor, quando comparada com a do ST nativo. EXEMPLO 5
Imunogenjcidade dos híbridos LTB-STa2
Por imunização de coelhos com preparações parcialmente purificadas dos híbridos, longo e curto, obtiveram-se elevados títulos de respostas de anticorpos ao LTB e respostas significativas ao ST, Os coelhos foram ínmunizados com cada proteína híbrida utilizando um regime simples de três injecções com Adjuvante Completo de Freunds para a injecção principal e com Adjuvante Incompleto de Freunds para os reforços. Os soros de coelho imunizados com qualquer dos dois híbridos induziram fortes respostas de anticorpos anti-LTB com títulos superiores a 40 00Q. 0 facto de os híbridos terem induzido respostas de anticorpos em relação ã porção ST foi demonstrado por duas aproximações experimentais. 1) Usou-se um ELtSA de inibição onde se revestiram pia-
7036α N? 47246 cas de microtítulo cora ura híbrido de subunídade B da toxina da cólera (CT)/ST, conjugado quimicamente. Verificou-se que os anti--soros policlonais dirigidos contra a CTB não tinham qualquer efeito na ligação de um anticorpo monoclonal de ratinho anti-ST. Contudo, por contraste, o soro obtido a partir de coelhos imunizados com os híbridos recombinantes exibiram um efeito inibidor forte na ligação do anticorpo monoclonal de ratinho. Este facto sugere a presença de anticorpos anti-ST competidores no sistema imunolõ-gico do coelho. 2) Desenvolveu-se um ELTSA dírecto para discriminar os anticorpos antí-LTB dos anti-ST nos soros de coelho imunizados com híbridos recombinantes. Revestiram-se primeiro as placas de microtítulo quer com híbridos recombinantes, quer com LTB purificada e depois bloquearam-se todos os epítopos da subunídade B pela adição de um título elevado de soros de ratinho policlonais an-tí-LTB (RJ11). Seguiu-se depois a adição dos soros de coelhos. A ligação da IgG de coelho foi quantificada com um anticorpo conjugado com peroxídase de rábano (HRO). Os resultados são apresentados na Figura 3·
Nas cavidades revestidas com LTB, o soro de coelhos bloqueou eficazmente a ligação subsequente dos anticorpos anti-LTB de coelho do imuno-soro híbrido. Apesar deste efeito bloqueante, os anticorpos nos soros de coelhos imunizados com LTB-STa2 ligaram-se fortemente às cavidades revestidas com os híbridos recombi-nantes. Isto sugere fortemente que os soros dos coelhos imunizados contêm anticorpos dirigidos contra o determinante ST.
Investigou-se, adiciona1 mente, a significância biológica destes resultados, usando o ensaio do ratinho não adulto do Exemplo 4 para testar se estas respostas anti-ST podem ou não neutralizar a toxina ST nativa. As observações iniciais sugerem que os soros de coelhos imunizados com o híbrido LTB-ST mais comprido (produto de gene pTRH13) são capazes de neutralizar a ST. 0 ensaio envolveu a pré-incubação da ST nativa (40 ng/ml) com séries de diluição de soro (p.e. 1/10, 1/60} seguindo-se a injecção intragãs-trica nos ratinhos não adultos. Em ambas as diluições o imuno-so- - 16 7 0-3.6 0 · Ν° 472½ ro inibiu completamente a toxicidade ST.
Conclusões anteriores, de outros investigadores têm sugerido que os anticorpos neutra 1izantes da ST são apenas induzidos por conjugados ST-transportador que são tóxicos ST. Em face das constatações do presente invento, anteriormente descritas, a requerente considera que o híbrido LTB-ST mais comprido do presente invento exibe uma promessa considerável como antigénio toxóide LTB-ST, que deverá induzir anticorpos protectores contra ETEC produzindo ST. EXEMPLO 6 17 17 f/j] /'v»**-C, 7 0.3 6 Q N? mikL··
As cadeias duplas de olίgonucleõtldos t, II e 111, foram usadas para gerar os vectores. pTRHIOQ, pTRHlQ! e pTRH1Q2, res-pectivamente. Apresentam-se a seguir as juntas de fusão no terminal 3‘ do gene codificando a subunidade B da enterotoxína libil ao calor de Es-cher i ch i a co 1 i, os aminoãcidos codificados pelas inserções de o 1ígonuc1eõtido e os sítios das endonuc1eases de restrição. Cada vector contém um único sítio Nael, em uma das cadeias de leitura de três codões, para inserção de fragmentos de ADN ou de o 1igonuc1eõtídos sintéticos adicionais. Todos os passos de clonação foram realizados usando procedimentos convencionais. Analisaram-se a ligação e a orientação correctas dos fragmentos, estabelecendo o mapa detalhado de enzimas de restrição. + 102
G1uLysLeuGlyProGlnAlaGlyAsp *** pTRHlOO GAAAAGCTGGGTCCGCAGGCCGGCGACTAGTGGATCCTCTAGAAGCTT
Nael Spel BamHI Xbal Hindi II + 1 02
G1uLysLeuG1yProGInG1yArgHis *** pTRH101 GAAAAGCTGGGTCCGCAGGGCCGGCACTAGTGGATCCTCTAGAAGCTT
Nael Spel BamHI Xbal Hindi I I + 102
G1uLysLeuG1yProG1nProAIaAsp *** pTRH102 GAAAAGCTGGGTCCGCAGCCGGCTGACTAGTGGATCCTCTAGAAGCTT
Nael Spel BamHI Xbal Hindi II 0 número +102 sobre a sequência de aminoãcidos prevista corresponde ao resíduo aminolctdo 102 na subunidade B madura (Le-ong et al, Infect. immun. h8, 73“7, 1985). 7 CL3 6. Q. N? 47246,
- 18.
EXEMPLO 7
Produzlu-se uma proteína híbrida contendo a subunídade B fundida com epítopo repetitivo (NANP)^ do parasita da malária Piasmodtum falciparum,.inserindo uma sequência de o 1igonuc1eõti-do codificando 0 epítopo (NANP)^ no sítio Nael do piãsmídeo pTRH102.
Digeriu-se o plasmídeo pTRH102 com as endonuc1eases de restrição Nael e BamHi e purificou-se o fragmento maior. Trataram--se conjuntamente por aquecimento/arrefecimento duas sequêncías de oligonucleõtidos sintéticos (que a seguir se apresentam como A) codificando três repetições em tandem de aminoãcidos NANP, e digeriram-se com.BamHi. Lígaram-se o o 1igonuc1eótido de cadeia dupla digerido e o fragmento Naef/BamHi de pTRHl02 e transformaram-se em Escher i chia col i K12 estirpe Gó (Enequist, _ejt £_[> Eur. J.Bio-chem. 227-33, 1981).
Purificaram-se os plasmídeos recombinantes e confirmaram-se a sua ligação e orientação correctas estabelecendo o mapa detalhado de enzimas de restrição. Um dos plasmídeos correctos foi designado por pTRH17*4. Mostram-se a seguir a sequência de nucle-õtidos e os aminoãcidos previstos codificados no terminal 3' do gene (B). Por indução do produto de fusão obteve-se uma proteína com as propriedades seguintes: i) reconhecimento do receptor gangliosido GM1 ii) reunião formando oligomeros definidos iii) reacção por anticorpos monoclonais contra a subuni-dade LTB e contra o epítopo (NANP)^ usando ensaios de mancha Western e de imuno-sorvente ligado a enzima, GM1 iv) e exportada para o periplasma de Escherichia col?.
A 5' -TAACGCTAACCCGAATGCGAACCCAAACGCAAACCCGTGAGGA TCCGGGGGGAA-31 .3 ' -ATTGCGATTGGGCTTACGCTTGGGTTTGCGTTTGGGCACT CCTAGGCCCCCC-5‘ BAMH1 7(1360 N? A7246 Ífí
- 12 - + 1Q2
GluL.ysLeuGlyProGlnProAsnAlaAsnProAsnAlaAsnPro AsnAlaAsnP ro'***
B.pTRH17·^ GAAAAGCTGGGTCCGCAGCCTAACGCTAACCCGAATGCGAACCCAAA CGCAAACCCGTGAGGATC C 0 número +102 corresponde ao aminoãcido 102 na sequência madura da subuntdade B da enterotoxína lábil ao calor de Escheri-chia colI. Os nucleÓtidos sublinhados em pTRH17·^ são derivados do o 1igonuc1eótido sintético em A.
Claims (15)
- -20- -20- ‘V-y»*»<©V 70 360 Ν.47246 REIVINDICACÕES 1 - Processo de preparação de um hospedeiro transformado, no qual se exprime uma proteína de fusão, compreendendo a transformação do de um hospedeiro com um vector o qual compreende uma sequência de ADN codificando uma proteína de fusão e o que é capaz de, no hospedeiro transformado, exprimir a proteína de fusão, caracterizado por o hospedeiro ser transformado com o referido vector compreendendo a referida sequência de ADN que codifica uma proteína de fusão que compreende a subunidade B da tóxina lábil ao calor de E. coli (LTB) possuindo um antigénio ou epitopo de um patogéneo responsável por uma doença humana ou animal, fundindo com o terminal carboxilo da LTB.
- 2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por se proporcionar uma sequência ligante entre o terminal carboxilo da LTB e o referido antigénio ou epitopo.
- 3 - Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado por a união de fusão compreender a sequência de aminoácidos -Lys-Leu-Gly-Pro-Gln.
- 4 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizado por a LTB ser fundida com o núcleo e regiões da toxina ou à região da toxina da toxina estável ao calor de E. coli (ST).
- 5 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizado por o vector ser um plasmídeo.
- 6 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizado por o hospedeiro ser uma estirpe de E. coli.
- 7 - Processo de acordo com qualquer das reivindicações precedentes, caracterizado por o hospedeiro transformado, resultante, ser uma vacina viva atenuada.
- 8 - Processo de preparação de uma proteína de fusão compreendendo a cultura, sob condições tais que a proteína de fusão é expressa, de um hospedeiro transformado com um vector, o qual compreende uma sequência de ADN codificando a proteína de fusão e que é capaz de, no hospedeiro transformado, exprimir a proteína de fusão, caracterizado por o referido hospedeiro que é cultivado comportar um vector referido que compreende uma -21- 70 360 Ν.47246 sequência de ADN referida codificando uma proteína de fusão compreendendo LTB possuindo um antigénio ou epitopo proveniente de um patogénio responsável por uma doença humana ou animal fundido com o terminal carboxilo da LTB.
- 9 - Processo de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por se proporcionar uma sequência ligante entre o terminal carboxilo da LTB e o referido antigénio ou epitopo.
- 10 - Processo de acordo com a reivindicação 8 ou 9, caracterizado por a união de fusão compreender a sequência de aminoácidos -Lys-Leu-Gly-Pro-Gln-.
- 11 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 10, caracterizado por a LTB ser fundida com o núcleo e regiões da toxina ou à região da toxina da toxina estável ao calor de E. coli (ST).
- 12 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 11, caracterizado por o vector ser um plasmídeo.
- 13 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 12, caracterizado por o hospedeiro ser de uma estirpe de E. coli.
- 14 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 13, caracterizado por o hospedeiro transformado resultante ser uma vacina viva atenuada.
- 15 - Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 14, caracterizado por compreender' (i) a inserção de uma sequência de ADN codificando o referido antigénio ou epitopo, num vector que codifica LTB, possuindo a LTB uma extensão do terminal carboxilo possuindo a sequência de codificação para extensão um sítio de restrição e sendo a sequência de ADN inserida no referido sítio de restrição; e (ii) a cultura de um hospedeiro contendo o vector resultante, sob condições tais que a proteína de fusão é expressa. Lisboa, -6.0U ΓΌ9 Por UNIVERSITY 0F LEICESTER
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB888828523A GB8828523D0 (en) | 1988-12-07 | 1988-12-07 | St-lt recombinant antigen vaccines |
| GB898913991A GB8913991D0 (en) | 1989-06-17 | 1989-06-17 | Recombinant hybrid proteins |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PT92511A true PT92511A (pt) | 1990-06-29 |
Family
ID=26294708
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PT92511A PT92511A (pt) | 1988-12-07 | 1989-12-06 | Processo de preparacao de um hospedeiro transformado e de proteinas de fusao da subunidade b de toxina labil ao calor |
Country Status (7)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0372928A3 (pt) |
| AU (1) | AU4754490A (pt) |
| CA (1) | CA2004738A1 (pt) |
| IL (1) | IL92578A0 (pt) |
| MY (1) | MY105080A (pt) |
| PT (1) | PT92511A (pt) |
| WO (1) | WO1990006366A1 (pt) |
Families Citing this family (14)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE99331T1 (de) * | 1989-09-08 | 1994-01-15 | Takeda Chemical Industries Ltd | Fusionsproteine und herstellung davon. |
| US5241053A (en) * | 1990-09-05 | 1993-08-31 | Takeda Chemical Industries, Ltd. | Fused proteins comprising glycoprotein gD of HSV-1 and LTB |
| GB9112553D0 (en) * | 1991-06-11 | 1991-07-31 | Wellcome Found | Fusion proteins |
| GB9326174D0 (en) * | 1993-12-22 | 1994-02-23 | Biocine Sclavo | Mucosal adjuvant |
| JPH10509325A (ja) * | 1994-11-17 | 1998-09-14 | マキシム ファーマシューティカルズ，インコーポレイテッド | 粘膜免疫を刺激する免疫原 |
| EP0840796A2 (en) * | 1995-07-26 | 1998-05-13 | Maxim Pharmaceuticals | Mucosal delivery of polynucleotides |
| US5993820A (en) * | 1996-11-12 | 1999-11-30 | Michigan State University | Chimeric LTB vaccines |
| EP0919243A1 (en) * | 1997-11-25 | 1999-06-02 | Duphar International Research B.V | Vaccine containing B subunits of heat-labile enterotoxin (LTB) of Escherichia coli as an adjuvant |
| KR20010043441A (ko) | 1998-05-08 | 2001-05-25 | 더 유니버시티 오브 브리스톨 | 백신용 면역조절제 |
| WO1999058145A2 (en) * | 1998-05-08 | 1999-11-18 | University Of Bristol | Immunomodulators for vaccines |
| AU2003261492B2 (en) * | 1998-05-08 | 2006-09-07 | Trident Pharmaceuticals, Inc. | Vaccine |
| GB0030067D0 (en) * | 2000-12-11 | 2001-01-24 | Univ Bristol | Therapeutic agent |
| US20090017056A1 (en) * | 2004-06-15 | 2009-01-15 | Iomai Corporation | Skin immunization using lt-sta fusion proteins |
| WO2008043760A1 (en) | 2006-10-12 | 2008-04-17 | Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P. Angeletti Spa | Telomerase reverse transcriptase fusion protein, nucleotides encoding it, and uses thereof |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| IL78775A (en) * | 1985-05-15 | 1992-06-21 | Biotech Australia Pty Ltd | Oral vaccines |
| US5112749A (en) * | 1987-10-02 | 1992-05-12 | Praxis Biologics, Inc. | Vaccines for the malaria circumsporozoite protein |
-
1989
- 1989-12-06 WO PCT/GB1989/001462 patent/WO1990006366A1/en unknown
- 1989-12-06 IL IL92578A patent/IL92578A0/xx unknown
- 1989-12-06 PT PT92511A patent/PT92511A/pt not_active Application Discontinuation
- 1989-12-06 AU AU47544/90A patent/AU4754490A/en not_active Abandoned
- 1989-12-06 EP EP89312713A patent/EP0372928A3/en not_active Withdrawn
- 1989-12-06 CA CA002004738A patent/CA2004738A1/en not_active Abandoned
- 1989-12-07 MY MYPI89001723A patent/MY105080A/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP0372928A2 (en) | 1990-06-13 |
| IL92578A0 (en) | 1990-08-31 |
| WO1990006366A1 (en) | 1990-06-14 |
| EP0372928A3 (en) | 1990-06-27 |
| MY105080A (en) | 1994-07-30 |
| CA2004738A1 (en) | 1990-06-07 |
| AU4754490A (en) | 1990-06-26 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5589384A (en) | Fusion proteins | |
| JP5566684B2 (ja) | Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍｄｉｆｆｉｃｉｌｅに対する、組換え毒素Ａ／毒素Ｂワクチン | |
| Choi et al. | Functional mapping of protective domains and epitopes in the rotavirus VP6 protein | |
| Clements | Construction of a nontoxic fusion peptide for immunization against Escherichia coli strains that produce heat-labile and heat-stable enterotoxins | |
| Pizza et al. | A genetically detoxified derivative of heat-labile Escherichia coli enterotoxin induces neutralizing antibodies against the A subunit. | |
| DE68921895T2 (de) | Meningococcales klasse i-aussenmembranprotein-vakzin. | |
| AU784345B2 (en) | Hepatitis B core antigen fusion proteins | |
| Lebens et al. | Large-scale production of Vibrio cholerae toxin B subunit for use in oral vaccines | |
| FI104638B (fi) | Menetelmä flagelliinifuusioproteiinin, sitä koodaavan geenin ja mikro-organismin valmistamiseksi | |
| EP0267204B1 (en) | Immunopotentiation | |
| PT92511A (pt) | Processo de preparacao de um hospedeiro transformado e de proteinas de fusao da subunidade b de toxina labil ao calor | |
| Sanchez et al. | Recombinant cholera toxin B subunit and gene fusion proteins for oral vaccination | |
| Agterberg et al. | Outer membrane PhoE protein of Escherichia coli as a carrier for foreign antigenic determinants: immunogenicity of epitopes of foot-and-mouth disease virus | |
| Ljpscombe et al. | Intranasal immunization using the B subunit of the Escherichia coli heat‐labile toxin fused to an epitope of the Bordetella pertussis P. 69 antigen | |
| WO1986001228A1 (en) | Immunogenic conjugates of e. coli lt-b enterotoxin subunit and capsular polymers | |
| JPH08503602A (ja) | 弱毒化細菌における組換え融合タンパク質の発現 | |
| Dertzbaugh et al. | Reduction in oral immunogenicity of cholera toxin B subunit by N-terminal peptide addition | |
| LeClerc et al. | Induction of virus-neutralizing antibodies by bacteria expressing the C3 poliovirus epitope in the periplasm. The route of immunization influences the isotypic distribution and the biologic activity of the antipoliovirus antibodies. | |
| PL186847B1 (pl) | Konstrukcja DNA, wektor ekspresyjny, gospodarz, białko fuzyjne i sposób przygotowania bakterii | |
| JP4081140B2 (ja) | 非耐熱性エンテロトキシンとコレラトキシンｂサブユニットの雑種分子 | |
| Abraham et al. | Assembly of a chemically synthesized peptide of Escherichia coli type 1 fimbriae into fimbria-like antigenic structures | |
| O'Dowd et al. | Novel modifications to the C-terminus of LTB that facilitate site-directed chemical coupling of antigens and the development of LTB as a carrier for mucosal vaccines | |
| WO1989009064A1 (en) | Synthetic peptides from streptococcal m protein and vaccines prepared therefrom | |
| CA1245556A (en) | Synthetic vaccine against urinary tract infections | |
| PT100980B (pt) | Proteinas recombinantes de borrelia, seu processo de producao, vacina contra infeccao por borrelia e agente de imunodiagnostico para a sua deteccao |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FC3A | Refusal |
Effective date: 19960219 |