PT86838B - Vector plasmideo compreendendo um replicao ligado a uma sequencia de adn e metodo de producao de proteinas utilizando esse vector plasmideo - Google Patents
Vector plasmideo compreendendo um replicao ligado a uma sequencia de adn e metodo de producao de proteinas utilizando esse vector plasmideo Download PDFInfo
- Publication number
- PT86838B PT86838B PT86838A PT8683888A PT86838B PT 86838 B PT86838 B PT 86838B PT 86838 A PT86838 A PT 86838A PT 8683888 A PT8683888 A PT 8683888A PT 86838 B PT86838 B PT 86838B
- Authority
- PT
- Portugal
- Prior art keywords
- protein
- amino acid
- sequence
- antigen
- epg
- Prior art date
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 217
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 192
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 title claims abstract description 56
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 54
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 49
- 230000010076 replication Effects 0.000 title claims description 29
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 title claims description 22
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims abstract description 80
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims abstract description 79
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims abstract description 40
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 claims abstract description 18
- 241000187479 Mycobacterium tuberculosis Species 0.000 claims abstract 4
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 96
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 90
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 85
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 55
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 46
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 34
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 33
- 201000008827 tuberculosis Diseases 0.000 claims description 32
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 30
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 29
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 claims description 24
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 claims description 24
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 claims description 24
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 23
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 23
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 21
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 19
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 18
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 18
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 claims description 17
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 17
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 claims description 16
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 claims description 16
- 238000013519 translation Methods 0.000 claims description 16
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 15
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 15
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 14
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 14
- 238000013518 transcription Methods 0.000 claims description 14
- 230000035897 transcription Effects 0.000 claims description 13
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 12
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 12
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 12
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 claims description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 11
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 claims description 10
- 206010015150 Erythema Diseases 0.000 claims description 9
- 241000186366 Mycobacterium bovis Species 0.000 claims description 9
- 231100000321 erythema Toxicity 0.000 claims description 9
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 9
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 9
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 claims description 9
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 claims description 7
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 claims description 5
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000007791 liquid phase Substances 0.000 claims description 5
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 claims description 4
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 claims description 4
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 claims description 4
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 claims description 2
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims 4
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims 4
- 101000852980 Homo sapiens Interleukin-23 subunit alpha Proteins 0.000 claims 2
- 102100036705 Interleukin-23 subunit alpha Human genes 0.000 claims 2
- 102100039028 Protein SPO16 homolog Human genes 0.000 claims 2
- 101150108548 SPO16 gene Proteins 0.000 claims 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims 1
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 claims 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 claims 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 claims 1
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 claims 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 claims 1
- 238000010517 secondary reaction Methods 0.000 claims 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 abstract description 2
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 155
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 31
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 26
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 26
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 20
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 17
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 13
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 13
- 239000000463 material Substances 0.000 description 13
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 12
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 10
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 10
- 241000894007 species Species 0.000 description 10
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 10
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 9
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 8
- 241000501348 Merope tuber Species 0.000 description 8
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 8
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 8
- 241000700198 Cavia Species 0.000 description 7
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 description 7
- 230000002788 anti-peptide Effects 0.000 description 7
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 7
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 6
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 6
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 6
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 6
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 6
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 5
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 description 5
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 239000006180 TBST buffer Substances 0.000 description 5
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 5
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 5
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 5
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 5
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 5
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 5
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 4
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 4
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N L-cystine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CSSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 4
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 4
- 241000186362 Mycobacterium leprae Species 0.000 description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 4
- 239000000562 conjugate Substances 0.000 description 4
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 4
- 238000002764 solid phase assay Methods 0.000 description 4
- 210000003046 sporozoite Anatomy 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 4
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 3
- 206010024229 Leprosy Diseases 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 3
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 3
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 3
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 description 3
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 3
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- QWXYZCJEXYQNEI-OSZHWHEXSA-N intermediate I Chemical compound COC(=O)[C@@]1(C=O)[C@H]2CC=[N+](C\C2=C\C)CCc2c1[nH]c1ccccc21 QWXYZCJEXYQNEI-OSZHWHEXSA-N 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 3
- 230000000644 propagated effect Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 2
- 108091029795 Intergenic region Proteins 0.000 description 2
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 2
- 102000016943 Muramidase Human genes 0.000 description 2
- 108010014251 Muramidase Proteins 0.000 description 2
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 2
- 238000002144 chemical decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 2
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 2
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 2
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 2
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 2
- 229960000274 lysozyme Drugs 0.000 description 2
- 239000004325 lysozyme Substances 0.000 description 2
- 235000010335 lysozyme Nutrition 0.000 description 2
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 125000001360 methionine group Chemical group N[C@@H](CCSC)C(=O)* 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 230000008520 organization Effects 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000012552 review Methods 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000005030 transcription termination Effects 0.000 description 2
- 229940108519 trasylol Drugs 0.000 description 2
- 229960001005 tuberculin Drugs 0.000 description 2
- 239000004474 valine Substances 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150008658 ASK7 gene Proteins 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N Ammonium bicarbonate Chemical compound [NH4+].OC([O-])=O ATRRKUHOCOJYRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000013 Ammonium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 108700003860 Bacterial Genes Proteins 0.000 description 1
- 241001235572 Balantioides coli Species 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108091028026 C-DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 101710169873 Capsid protein G8P Proteins 0.000 description 1
- 101710098119 Chaperonin GroEL 2 Proteins 0.000 description 1
- 241000207199 Citrus Species 0.000 description 1
- 235000019750 Crude protein Nutrition 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001340534 Eido Species 0.000 description 1
- 238000003072 Ellman's test Methods 0.000 description 1
- 244000148064 Enicostema verticillatum Species 0.000 description 1
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- 101100218337 Gibberella zeae (strain ATCC MYA-4620 / CBS 123657 / FGSC 9075 / NRRL 31084 / PH-1) aurL2 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 108020005350 Initiator Codon Proteins 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 1
- 101710125418 Major capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 101710156564 Major tail protein Gp23 Proteins 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010027259 Meningitis tuberculous Diseases 0.000 description 1
- LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N Methanethiol Chemical compound SC LSDPWZHWYPCBBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000237852 Mollusca Species 0.000 description 1
- 241000131430 Mycena Species 0.000 description 1
- 206010062207 Mycobacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 125000000729 N-terminal amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 1
- 241000223960 Plasmodium falciparum Species 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N Pyrimidine Chemical compound C1=CN=CN=C1 CZPWVGJYEJSRLH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091081062 Repeated sequence (DNA) Proteins 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000024932 T cell mediated immunity Effects 0.000 description 1
- 208000022971 Tuberculous meningitis Diseases 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 210000001132 alveolar macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001099 ammonium carbonate Substances 0.000 description 1
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 1
- 238000004166 bioassay Methods 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000337 buffer salt Substances 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 235000020971 citrus fruits Nutrition 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 238000005094 computer simulation Methods 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 210000003746 feather Anatomy 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 239000012847 fine chemical Substances 0.000 description 1
- 230000008571 general function Effects 0.000 description 1
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 description 1
- 238000011597 hartley guinea pig Methods 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005745 host immune response Effects 0.000 description 1
- 125000001165 hydrophobic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000036046 immunoreaction Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-YPZZEJLDSA-N iodine-125 Chemical compound [125I] ZCYVEMRRCGMTRW-YPZZEJLDSA-N 0.000 description 1
- 229940044173 iodine-125 Drugs 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 125000005647 linker group Chemical group 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 208000001223 meningeal tuberculosis Diseases 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000005497 microtitration Methods 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 208000027531 mycobacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 1
- 230000036281 parasite infection Effects 0.000 description 1
- 230000008506 pathogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000000863 peptide conjugate Substances 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- 230000004850 protein–protein interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 229920005604 random copolymer Polymers 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 239000013643 reference control Substances 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 208000037369 susceptibility to malaria Diseases 0.000 description 1
- -1 that is Proteins 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 125000002987 valine group Chemical group [H]N([H])C([H])(C(*)=O)C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
- C07K14/35—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Mycobacteriaceae (F)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
DESCRITIVA
425
SCKF 104.0-EPG:ll
CAMPO TÉCNICO
A presente· invenção refere-se a proteínas e a péptidos recombinante s, relacionados com micobactérias e em particular a proteínas de Nycobacteriun tubérculosis que são codificadas, assim por estruturas de leitura aberta adjacentes às cadeias de ADN complementar dc genoma e a vectores para propagar e expressar esses recombinantes, bem come a péptidos que correspondem, substancialmente, em sequência, a porções dessas proteínas.
TÉCNICA ANTERIOR
As micobactérias s rias gram-positivas, (fixas em ácidos), algumas das quais no homem e nos animais/“analisado em Infect. Dis., 5:765-780: e Chaparas, i crcbiclcgy, 9 :139-19//7. No homem, . muns provocadas por micobactérias são são um conjunto diversificado de bacte· que não desceram em presença de ácidos algumas das quais provocam doenças Blocm et al.,
M A·
x. j·· ;
as '“5 grave s (1933), Rev.
Ό2), CRC Reviews in Miduas doenças mais cotuberculose e a lepra que são o resultado de infecções motivadas por .fycobacteríuv tuberculosis e Nycobacteriam leprae respectivamente. Estas doenças atingem mais de 65 milhões de indivíduos, a nível mundial, e provocam para cima de 4 milhões de mortes anualmente, Blcom et al., (1983), Rev. Infect. Dis., 5í7ó5~78o.
A patogenia destas infecções micobacterianas está estritamente ligada à resposta imunitária ao hospedeiro à miccbactéria invasora/“Chaparas, (19-32), CRC 'f.eviews in íiicrobiclcgy, 9 : :139-197: Collins, (1982), Am. Rev. Respir. Dis., 125:42-49^ Dannenberg, (1982), Am. Rev. Respir. Dis., 125:25-29: e Grange, (1984), Adv. Tuherc. Res., 21:1-78 7« A N. tuberculosis não só infecta e cresce nas células do sistema imunitário do hospedeiro, em primeiro lugar no macrofagc alveolar, comc também é a resposta imunitário dc> hospedeiro que desempenha um papel chave na imunidade contra a infecção, a contenção da infecção no foco inicial da infecção, a progressão ou regressão da infecção
425
SCSF 104.0-EPG:ll e deterioração ou destruição do tecido no foco da infecção Chaparas, (1982), CRC Reviews In Microbiology, 9:139-197; Collins, (1982), Am. Rev. Respir. Pis., 125:42-49: Dannenberg, (I982), Am. Rev. Respir. Pis., 125:25-29; e Grange, (1984), Adv. Tuberc. Res., 21:1-78 7» Em adição, 0 método padrão de detecção de uma infecção por M. tubérculosis, o teste na pele, da tuberculina mede realmente a resposta imunitária celular dc hospedeiro à micobactéria Snider, (1982), Am. Rev. Respir. Pis., 125: 1C8-118_7. Os componentes micobacterianos que são importantes na indução da resposta imunitária não estão ainda bem definidos.
Tem-se feito vários estudos para tentar definir os antigénios micobacterianos por técnicas bioquímicas e imunolõgicas padrão incluindo a análise dos antigénios alvo de anticorpos de hibridoma monoclonais dirigidos contra micobactérias (Daniel et al., (197θ)? Microbiol. Rev. , 42:84-113; Engers et al.,(1985)? Infect. Immun, 48:603-605; Engers et al., (1986), Infect. Immun., ^1:718-720; Grange, (1984), Adv. Tuberc. Res., 21:1-78; Ivanyi et al., (1985), Monoclonal Antibodies Against Bactéria (A.J.L. e E.C. Macario, eds.) Academic Press, Inc. New York. pp. 59-90; e Stanfcrd (19θ3), The Biology of the Llycobacteria (Ratledge e Stanfcrd, eds.), Academic Press, London, vol. 2, pag. 85-127__7.
Um antigénio particular, uma proteína com 65 quilodaltons (K.D), está presente numa larga gama de espécies micobacterianas e tem-se estudado mais intensamente como um antigénio de M. leprae /“Emmrich et al., (1986), J. Exp. Med., 163:1024-1029; Gil lis et al., (19θ5), Infect. Immun., 49:371-377? Young et al., (19θ5)? Fature, 316:450-452: e Mehra et al., (1986) Proc. Natl. Acad. Sei USA, 83:7013-7017 7« Tem-se designado este antigénio como o antigénio 650 ou 0 antigénio de proteína-a da parede celular (CWP-a) visto que numa co-purificação aparece com paredes celulares, nalguns processos de isolamento/Gillis et al., (1985)? Infect, Immun., 49:371-377 7«
Nos ensaios da mancha de Western, os anticorpos monoclcnais dirigidos contra este antigénio, reagem com dois componentes principais num extracto de M. leprae migrando com tamanhos
425
SCRF 1C4.O-EPG:11 . .....j5r^· —4— aparentes de 55000 e 65000 daltons e reagem também, ocasionalmente, com componentes mais pequenos /“Engers et al., (19θ5), Infect. Immun., 48;603-605 β Gillis et al., (1905), Infect. Immun., 37:172-17δ_/. Não se sabe se estas espécies representam proteínas ou precursores e produtos discretos ou resultais da clivagem química ou enzimática durante o isolamento. Noutras espécies, tais como gordonae, detecta-se com os anticorpos mcncclonais apenas uma única espécie de cerca de 65000 daltons ^Gillis et al., (1965), Infect. Immun., 49^371-377 7» antigénio 65 KD é uma das principais proteínas imuno-reac tivas das micobactérias. Este antigénio contém epítopos que são únicos para uma dada espécie micobacteriana, bem como epítopos que são partilhados por várias espécies de micobactérias /“Engers et al., (19θ5), Infect. Immun., 48:603-605 © Gillis et al., (1985), Infect. Immun., 49:371-377,/.
Como se descreve a seguir, verificou-se agora que o antigêr.io purificado 65 KB pode induzir uma reacção de hipersensibilidade forte, do tipo de acção retardada, em mamíferos experimentalmente infectados com lá. tubérculo sis. Os anticorpos dirigidos contra esta proteína podem também ser detectados no soro de pacientes com tuberculose ou com lepra s as células-T reactivas com este antigénio podem ser isoladas a partir de pacientes com lepra ou tuberculose bem como a partir de pessoas vacinadas com a BCG /“Emmrich et al., (1986), J. Exp. Med., 163:1024-1029; Engers et al., (1986), Infect. Immun., 51? 718-720; Llustafa et al., (19θ6), Fature, 319s63-66; e Thole et al., (19θ5), Infect. Immun., $0:800-3b6 7» antigénio 65 KD parece ser sempre um imunogénio e antígénic principais de células-T e -B, importantes em seres humanos scb o ponto de vista médico.
Breve Sumário da Invenção
A presente invenção refere-se a sequências de ADN, a vecto res que contêm as sequências de ADN, a proteínas, a proteínas reccmbinantes, a peptidos, ao seu método de preparação e à sua utilização, que se referem a Nycobacterium tubérculo sis. Refe67 423
SCBF 1C4.0-NPGí11
-5re-se mais particularmente, às sequências de ADN, a vectores, a proteínas, a recombinantes e péptidos relacionados com duas pro teínas denominadas proteínas 340 (63 KD) e 317 que são codificadas por estruturas de leitura abertas adjacentes às cadeias de ADN complementar do genoma micobacteriano. Os péptidos correspondeu substancialmente a porções dessas proteínas.
Uma concretização da invenção contempla uma molécula de ADN isolada que consiste essencialmente numa sequência de nucleó tidos correspondendo da direita para a esquerda e na direcção da extremidade 3' para a extremidade 3* ? à sequência representada pela fórmula da figura 2 a partir de cerca da posição 3930 até cerca da posição 2390 e numa estrutura de leitura consistente couificando uma proteína com 317 resíduos de aminoácidos de Mycobaçterium tubérculo sis. De preferencia, essa sequência estende-se desde a posição 3948 até à posição 2398.
É também contemplado nesta invenção, um vector plasmídeo que compreende um replicão operacionalmente ligado a uma sequên cia de ADN estranho tal como a anterior e que 6 capaz de replicar essa sequência de ADN estranho num meio de replicação/expres são, particularmente quando o meio de replicação/expressão é um organismo unicelular, tal como uma bactéria como N. coli. 0 vector plasmídeo inclui tipicamente sinais cooificados em sequência para iniciação e terminação da transcrição que estão operacionalmente ligados à sequência de ADN estranho e são compatíveis com o meic/replicação/expressão para transcrever um produto codificado pela sequência de ADN estranho. Pode incluir ainda um codão de iniciação da tradução e um codão de terminação da tradução, cada um dos quais está operacionalmente ligado à extremidade 3' θ a extremidade 3‘} respectivamente, da sequên cia de ADN e são compatíveis com o meio de replicação/expressão para expressar um proauto de proteína codificado pela sequência de ADN estranho.
Mais. ainda,a extremidade 3' ha sequência de ADN estranho pode estar operacionalmente ligada numa estrutura de leitura traducional à extremidade 3’ de uma segunda sequência de ADN que codifica uma segunda proteína, ou fragmento, ou porção de proteína, tal como a molécula de beta-galactosidase. 0 produto
6? 425
SCRF 104.0-EPGsll de proteína expresso por esse vector é deste modo uma proteína de fusão que contém a segunda proteína, ou fragmento ou porção de proteína, no terminal amino e a proteína nomeada em primeiro lugar no terminal carboxilo da proteína de fusão; isto é, o fragmento ou porção da segunda proteína está no terminal amino da proteína designada em primeiro lugar.
E também contemplada uma cultura que compreende bactérias gue contêm um vector plasmídeo descrito previamente num meio
aminoácidos de M. tubérculosis.
A presente invenção contempla ainda um método para produzir uma proteína de 517 resíduos ue aminoácidos de M. tuberculosis. Esse método compreende os passes de cultivar um meio de replicação/expressão que contém um vector plasmídeo para replicar e expressar a sequência de ADN estranho contida nele. Esse vector contém uma sequência de ADN estranho que corresponde substancialmente à molécula de ALN mencionada previamente que codifica a sequência da proteína 517 de M. tubérculosis. 0 vector contém também sequências de nucleótidos ligadas operativamente regulando a replicação e a expressão da sequência de ADN estranho. A cultura é realizada sob condições apropriadas à expressão da proteína que é codificada pelo ADN estranho, A proteína expressa codificada por essa sequência de ADN estranho é depois disso recolhida. A cultura é tipicamente realizada utilizando organismos unicelulares como meio de replicação/expressão. Esses organismos unicelulares são tipicamente bactérias como se descreveu previamente.
É também contemplado um método para determinar previamente a exposição imunológica de um hospedeiro mamífero a Mycobacterium tubérculosis ou Mycobacterium bovis. Este método compreende os passes seguintes. Um ínóculo que consiste essencialmente na proteína 65 KD (540) purificada, codificada pela sequência de ADN da figura 2 é administrada por via intradérmica a um hospedeiro mamífero testado. Essa proteína é dissolvida ou dis persa num diluente fisiologicamente tolerável e está presente nesse diluente numa quantidade eficaz para induzir eritema e en duração anormal dos tecidos orgânicos num hospedeiro mamífero
42?
SCRF 104.0-EPG:ll
-7previamente imunizado com '1, tubérculo sis ou M. bovis. 0 mamífero é mantido durante um período de tempo de cerca de 24 a cer ca de 72 horas e depois disso 6 testado em relação à presença de eritema e enduração no local da administração intradérmica, no fim daquele período de tempo. Num aspecto deste método a proteína 6? KD purificada é obtida a partir de uma micobactéria tal como M. tubérculosis. Num outro aspecto deste método, a pro teína purificada © uma proteína 6? KD recombinante ou uma proteína de fusão recombinante que contém uma porção de uma molécu la de beta-galactosidase ligada por pêptido ao terminal amino da proteína 6? KD.
Ainda um outro aspecto da invenção contempla um inóculo que consiste essencialmente num antigénio da proteína 6? KD purificada (?40 resíduos aminoácidos) ou numa proteína de fusão que é codificada pela sequência da figura 2. Ess© antigénio de proteína é dissolvido ou disperso num diluente fisiologicamente tolerável e está presente no diluente numa quantidade que é eficaz para induzir eritema e enduração num hospedeiro mamífero previamente imunizado com M. tubérculo sis ou m. bovis. 0 antigénio, de proteína 6? KD, do inóculo pode ser uma das proteínas eficazes no método descrito imediatamente acima.
Ainda um outro aspecto da invenção é um pêptido que consiste essencialmente numa sequência de ? a cerca de 40 resíduos de amincácido, .pêptido que corresponde sutstaicialmente a uma sequência da proteína de >40 resíduos de aminoácidos ou da proteína de ?17 resíduos de aminoácidos codificada pela sequência da proteína de ADN da figura 2. De preferência,o pêptido contém de cerca de 10 a cerca de 20 resíduos aminoácidos.
Ainda um outro aspecto da presente invenção é um polímero que compreende uma pluralidade de unidades de repetição de pentapéptidos. Cada uma aessas unidades de repetição de pentapéptidos consiste essencialmente numa sequência, escrita da esquerda para a direita na direcção do terminal amino para o terminal carboxi, representada pela fórmula
N N N I G; ou
X G N Z G
425
SCRF 104.0-EPG:ll
-8sm que X é um resíduo aminoácido seleccionado de entre o grupo qu:· consiste em F, S, T, L, De I; e Z ê um resíduo aminoácido seleccionado de entre o grupo que consiste em Τ, I, L, S e V. Num outro aspecto desta invenção as unidades de repetição de pentape'ptiuos estão ligadas em conjunto por ligações pep tídicas em que num outro aspecto as unidades de repetição penta peptidicas estão ligadas em conjunto por resíduos de cisteína oxidados nos terminais dessas unidades de repetição.
Breve Descrição dos Desenhos
Nos desenhos que formam uma parte desta descrição:
A figura 1 é um mapa de restrição, esquemático, dos recombinante s que expressam o antigénio 65 KD de M. tubérculosis. A porção do genoma que contém a proteína 65 KD é representada por uma linha a cheio, grossas, no cimo da figura juntamente com as posições relativas (linhas pequenas, perpendiculares, tocando as linhas a cheio) dos locais de clivagem de endonuclease de restrição. As letras únicas aujacentes a essas linhas pequenas são indicativas de que endonuclease cliva o genoma no local indicado e são:
A = Saci, B = Bgl II, Κ = ΚρηΙ, X = Bam Hl, P = PstI, R = EcoRI, S = Sal I, V = Pvu II eX = Xhol.
Vinte dos recombinantes descritos aqui estão enumerados ao longo da margem do lado aireito da figura, oposta às representações, com linhas,esquemáticas da porção genómica respectiva, contida por cada recombinante. Os comprimentos e posições dessas porções genomicas em relação ao genoma da proteína 65 KD estão representados pelos comprimentos e posições relativos das linhas. Os tracejados nas extremiaades das primeiras seis linhas mais curtas inuicam que esses recombinantes continham pares de bases adicionais, mas as fontes e as sequências desses pares de bases adicionais são presentemente desconhecidos.
C ADN foi isolado a partir de concentrados de fagos dos recombinante s que expressam o antigénio 65 KD como descreveu Helms et al. (19θ5) DKA 4:39-49 θ construiu-se um mapa dos locais de clivagem da enzima de restrição.
425
SCRF 1O4.G~EPG:11
A figura 2 representa a sequência nucleotíaica da região que. contém o antigénio 65 KD de X tubérculo sis e os genes da proteína 517 ® é apresentada como quatro folhas identificadas por 2Λ, 2E, 20 e 2D. As sequências de resíduos de aminoácidos deduzidas das duas longas estruturas de leitura abertas (OKFs) capazes de codificar proteínas contendo 540 e 517 resíduos de aminoácidcs, respectivamente, são representadas utilizando o código de uma letra sobre(540) ou sob (51?) os tripletos apropriados. Os asteriscos acima ou abaixo das sequências respectivas indicam as posições aos coâãos de paragem (TGA, TAG ou TAA) nas sequências de ADN. Cada sequência está representada como começando com o primeiro resíduo de metionina (M) a montante e em fase, a partir do codão de paragem mais próximo.
A figura 3 ® uma representação esquemática das estruturas de leitura abertas encontradas na porção da sequência de ADN mi ccbacteriana que codifica o antigénio 65 KD. A linha a cheio, grossa, próxima do cimo da figura representa uma porção do gencma que inclui as proteínas 540 e 517· As linhas mais curtas, com setas na extremidade, abaixo da linha a cheio indicam as sequências de ADN que excedem em comprimento, 120 resíduos ami ncácidos. Os tripletos de iniciação, putativos, estão identificados nas linhas mais curtas pela letra M (AUG) ou pela letra V (GUG), na extremidade 5’ de cada estrutura de leitura aberta nas sequências relativamente mais curtas ilustradas abai xc da linha a cheio. As setas indicam a direcção da codificação.
A figura 4 é uma fotografia de uma análise da mancha de Western, dos produtos da estrutura de leitura aberta com 540 re síduos aminoácidos e contém dois painéis A e B. As células foram crescidas e induzidas (excepto para a faixa 2, painel A) e os extractos brutos foram preparados como se descreve na secção Materiais e Métodos, a seguir. Fora cada faixa, excepto a faixa 5, submeteram-se 200 microgramas (jug) de proteína a electrofcrese sobre 10/j de gel de Laemmli e transferiram-se para nitrocelulose. Para a faixa 5 carregaram-se 500 ug de proteína. Fizeram-se reagir as proteínas imobilizadas com os anticorpos IT-13 e visualizaram-se como se descreveu a seguir.
6? 425
SCRF 1C4.C-EPG; 11.
......
-10Para o painel A, as proteínas nas faixas foram: faixa 1, JM83; faixa 2, JM83 (pTB22) nãc, induzida: e faixa 3, JI’83 (p?E2^ induzida com IPTC-. Para o painel E as proteínas nas faixas foram: faixa 1, JX83 (pTE12); faixa 2, YIO89 (ASK116); faixa 3» YI089 (ÀRY314Ó); faixa 4, BN1T97 £21i CóOO contendo /\ gtll_7; e faixa 5, «Ε·’83 (ρΤΕ12).
EEFIRIÇOES
Sãc utilizadas as seguintes abreviaturas e símbolos.
| Pb | par-(es) de base |
| kpb | 1000 pb |
| KD | quiloaalton( s) |
| r | massa molecular relativa aparente |
| ADN | - ácido desoxirribonucleico |
| replicão | a unidade que controla actos individuais |
| de replicação; tem uma extremidade de ori- | |
| gem na qual se inicia a replicação e pode | |
| ter uma extremidade final na qual a replicação pára. |
guando utilizadas num contexto que descreve ou representa sequências nucleotídicas, as bases púricas ou pirimídicas que formam a sequência nucleotlúica sãc representadas como se segue:
À - descxiadenil
G - descxiguan.il
C - desoxicitosil
T - desoxitimidil
Ao descrever a sequência nucleotídica, cada tripleto de três letras, constituído pelas bases, identificadas acima, representa um trinucleótido de AEIT (um codão) que possui uma extremidade 5' no ladc- esquerdo e uma extremidade 3' no lado diiei tc da sequência superior da figura 2 e uma extremidade 5* no lado direito e uma extremidade 3' no lado esquerdo da sequência complementar inferior.
425
SCRF 104.0-EPG:ll
-11DESCRIÇÃC DETALHADA DA INVENÇÃO
I. Visão global
Nos estudos discutidos a seguir, refere-se c isolamento do gene que codifica o antigénio 65KD cie M. tubérculo sis e a determinação da sua sequência nucleotídica. A sequência contém uma estrutura de leitura aberta que codifica 540 resíciuos aminoácidos ou cerca de 60000 daltcns, u que corresponde ao antigénio 65 KE. Encontrou-se também. uma segunda estrutura de leitura aberta, comprida, que codifica uma proteína de 517 aminoácidos, no fragmento de ADN micobacteriano que contém o gene do antigénio 65 ND, adjacentemente àquele gene. Foi interessante notar que a região central da sequência de resíduos de aminoácidos, deduzida, da proteína com 517 aminoácidos contém várias repetições, perfeitas e imperfeitas, uispostas em tandem, de uma sequência de cinco resíduos de aminoácidos. Esta caracter!stica é reminiscente das características da sequência do antigénio das células-T, principal, da fase ae esporozoíto do parasita da malária em seres humanos. /~^assenzv;e^S 5 (19θ5), Cell,
42:401-403_J·
II. Resultados
A. Isolamento e Análise dos Recombinantes que Expressam o Antigénio 65 KD
Para isolar o gene que codifica o antigénio 65 KD, os anticorpos do hibridoma monoclonais, dirigidos contra este antigé nic, foram utilizados para analisar uma biblioteca de expressão de proteínas, construída com ADN micobacteriano. Escolheu-se uma biblioteca de expressão visto que não era conhecido a pricri se os genes de M, tubérculosis seriam expressos em E. coli. Tal biblioteca de ADN recombinante foi construída por Young et al., (1985), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82:25δ3-25θ7 e contém fragmentos de ADN genomicos de Z. tubérculo sis inseridos no local de expressão do vector lambda-gtll (Xgtll). Neste sistema as sequências de codificação inseridas podem ser expressas como uma proteína de fusão com beta-galactosidase. Os anticorpos do
425 7
SCRF 1O4.O-2PG:11
-12hibridoma monoclonais específicos do antigénio 65 KD utilizados nestes estudos foram produzidos nos laboratórios do Dr. T.II. Buchanon (Pacific Medicai Center, ITniversity of 7/ashinton, Seattle WA) e do Dr. J. Ivanyi (LÍRC Tubérculo sis Unit, Hammersmith Hospital. Lcndon) e foram obtidos no Steering Committee sobre Imu· nologia da Tuberculose da Organização Mundial de Saúde.
Come sonda de anticorpo, inicial, utilizou-se uma associação de três anticorpos monoclonais dirigidos contra o antigénio 65 KD (IT-13, IT-31 θ IT-33)· Detectaram-se trinta e oito sinais positivos numa análise com cerca de 8 x 10^ fagos recombinantes.
Os fagos correspondentes aos sinais positivos foram purificados duas vezes em placas e depois testados em relação à reactividade com os anticorpos individuais. Os resultados desta pu rificação e ensaie estão representados na Tabela 1 a seguir:
TABELA 1
Ί
Padrões de Reactividades de anticorpos
| Reactividade com anticorpos | |||
| Eúmero de Clones | IT-13 | IT-31 | IT-33 |
| 28 | 4* | + | 4. |
| 3 | + | + | - |
| «X | - | 4- | |
| 2 | - | + | - |
| rx | 4a |
Os clones recombinantes que expressam antigénios reactivos com os anticorpos monoclonais específicos do antigénio 65KD IT-13, IT-31 e IT-33, foram isolados comc se descreveu no texto. Para a análise inicial utilizou-se uma associação de três anticorpos que continha uma diluição de 1:1000 de cada anticorpo para analisar um total de cerca de 8 x 10^ fagos recombinantes a partir da biblioteca de M. tubérculo sis -lambda gtll. Para determinar quais os anticorpos monoclonais que reagiram com os 38 recombinantes purificados em placas, cerca de 100 uniciades de formação de placas (pfu), de cada fago recombinante, foram
6η 425
SCRF 1C4.O-EPG:11 ' L'
-l^U inoculadas em pequenas quantidades (spots) sobre uma camada de
E. coli Y1C90. Deixou-se o fago crescer e induziram-se para sh tetizar as proteínas estranhas, como se descreve aqui. Fizeram -se depois reagir os filtros com uma diluição de 1:1000 de um dos anticorpos de hibridoma monoclonal como se descreveu em Materiais e 'létcdcs.
Vinte e oito dos recombinantes produziram antigénios que reagiram com todos os três anticorpos, enquanto que dez recombinante s produziram antigénios que reagiram com um ou dois dos anticorpos. Especialmente os padrões de reactividade indicam que embora os três anticorpos reajam com o mesmo antigénio mico bacterianc, cada um reconhece ura epítopo diferente nesse antigé nio. Richard A. Young (Vhitenead Institute, m.I.T.) tem também analisado esta biblioteca de M. tuberculosis Agtll com ura destes anticorpos (IT-13) e detectcu 10 outros recombinantes/Young et al., (1985), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82:2?83-258.7. Estes recombinantes não foram testados em relação a reactividade com os citros anticorpos.
ADN foi isolado a partir de vinte dos recombinantes que expressam o antigénio 65 KD e deduziu-se um mapa de locais de clivagem das enzimas de restrição para esta região do genoma mi ccbacterianc (figura 1). Na maior parte dos recombinantes, a inserção do A.DU micobacteriano estava flanqueada pelos locais EcoRI como se esperava a partir do modo como a biblioteca foi construída.
No entanto, em 6 dos 20 recombinantes estudados, apenas um dos locais EcoRI, esperados, estava presente. Esta observação cria a possibilidade de uma fracção significativa do fago recom binante nesta biblioteca poder ter surgido a partir da inserção de um fragmento que contendo apenas um local EcoRI funcional no local de EcoRI de Agtll ou de alguns clones poderem ter sofridoura espécie de recombinação, rearr-anjo ou delecção, durante a propagação, que tenha removido um dos locais EcoRI.
mapa de restrição deduzido está de acordo com 0 mapa do gene para o antigénio 65 KD de M. bovis, publicado /“Thole et al., (1985)» Infect. Immun., 5θ:8ΐΌ-8θ6_7 excepto em relação à presença de dois locais Smal adicionais no gene de V. tubérculo67 425
SCRF 1G4.C-EPG:11
-14sis. C mapa não corre sponcie bem ao do gene do antigénio 65 KD de M. leprae /~Young et al., (1985), Fature, 316:450-452_7· Isto nãc era inesperado dado que, baseado em estudos de homologia de ΛΕΝ, a M. tubérculosis é pelo menos homóloga em 90$ a M, bovis e apenas homóloga em cerca de 36% a M. leprae, Athway et al., (19θ4), Int. J. Syst. Bacteriol., 34:371-375; Imaeda, (1985) Int. J. Syst. Bacteriol., 35:147-150·
Para determinar a sequência nucleotíd.ica desta região do genoma micobacteriano, vários fragmentos dos recombinantes de Agtll foram subclonados no vector plasmídeo pUG19· A maior par te da sequência desta região foi determinada a partir de um sub clcne (pTB7) do fragmente EcoRI de 1,4 quilo pares de base (kpb) do ASK7, e de um subclone (pTB9) do fragmente EcoRI 2,6 kpb do z\RY3143. A sequência através do local EcoRI na junção destes dois fragmentos foi determinada a partir de um fragmento isolado a partir de um subclone (pTEll) do fragmento Kpnl de 2,8 kpb dc /\SK119· Determinou-se a sequência da região 5' para o fragmento EcoRI de 2,6 kpb a partir de um subclone (pTB12) do fragmento Kpnl de 2,4 kpb doÀSKH9.
Em resumo, a sequência nucleotídica dos 43θ0 pares de bases do ADN micobacteriano foi determinada por uma combinação da ter minação da cadeia didesoxi de Sanger/“Sanger et al., (19θ0), J. Mol. Bicl., 143:161-178J7ccm técnicas de sequenciação da degradação química Maxam-Gilbert /“llaxam et al., (1976), Proc. Fatl. Acad. 3c.i. USA, 74:56o-5c4j7. A sequência está representada na figura 2.
Gomo se esperava para o ALF genómico de M. tubérculosis /“Wayne et al. , (1968), J. Bacteriol, 96:1916-1919_J7, a composição básica deste fragmento era, em cerca de 66%, G+C. 0 conteúdo elevado em G+C aumentou as hipóteses de sequenciação de artefactos devidos a compressões e tornou imperativo que as sequências fossem determinadas para ambas as cadeias, em todas as regiões.
B. Estruturas de Leitura Abertas
A sequência contém cinco estruturas ae leitura abertas (ORls) que começam com um tripleto ATG e contém mais do que 120
42?
SCRF 104.0-EPG:ll
aminoácidos. Duas destas excedem 200 aminoácidos, em comprimen to. Uma pode codificar 517 aminoácidos e a outra J40 aminoácidos.
Há mais três estruturas de leitura abertas adicionais com 140-190 resíduos de aminoácidos, em comprimento, que não contêm um tripleto ATG de início mas contêm um tripleto GTG. Não se sabe se um tripleto GTG pode funcionar nas micobactérias como um tripleto de início da tradução. As localizações destas 8 es truturas de leitura abertas estão representadas esquematicamente na figura 3· Nenhumas porções das sequências de aminoácidos deduzidas, de qualquer destas estruturas de leitura abertas apresentavam qualquer hcmologia significativa com sequências na Base de dados das sequências de Proteínas da Protein Identification Resource.
Deve ser notado que, embora uma estrutura de leitura aberta excedendo 100 aminoácidos, devesse ser considerada comc possuindo uma elevada probabilidade de ser expressa em proteína, na maior parte de bactérias, isto poder não ser verdadeiro para a micobactéria. Isto é, dado que o conteúdo em G+C, da inserção, é cerca de 66/ deveria ocorrer um tripleto de terminação da tradução (TAA, TAG ou TGA) numa média de uma vez em cada 41 aminoácidos, quando comparados com a cerca de urna vez em cada 21 aminoácidos num genoma com um conteúdo em G+C de 5θ/· Talvez, então, uma estrutura de leitura aberta com tantos aminoácidos como 150-200 pudesse ser devida à distribuição aleatória dos tripletos de terminação em vez de significar importância biológica possível. Como tal, descrevem-se aqui apenas as duas estruturas de leitura abertas muito longas que podiam codificar proteínas com 517 e 540 resíduos de aminoácidos, respectivamen te
tigénio 65 KD
Uma das estruturas de leitura aberta começa com um triple· to ATG nas posições 252-254 aa sequência de ADN e prolonga-se até um tripleto TGA nas posiçõ
Esta ORE codifica
425
SCRF 104.O-EPG:11 r'
- - TliiíC-·-16540 aminoácidos. Para determinar se esta estrutura de leitura aberta correspondia ao gene para o antigénio 65 KD, o fragmento BamHI-Kpnl de 1511 pb do pTB12 (resíuuos 438-1948 da sequência representada na figura 2), que contém a maior parte desta estrutura de leitura aberta, foi inserido em pUCly clivado com BamlII-Kpnl. Nesta construção denominada pTB22, a estrutura de leitura aberta é expressa utilizando os sinais de iniciação da tradução (translation) e da transcrição lacZ, presentes no vector pUC19 resultando na proaução de uma proteína de fusão que contém 15 resíduos de aminoácidos no terminal amino, codificada pe gene lacZ de pUC19, seguida por 478 aminoácidos da estrutura de leitura aberta micobacteriana.
ús extractos brutos foram preparados a partir de células que contêm este plasmídeo e foram testados em relação à reactividade com anticorpos específicos do antigénio 65 KD, por análise da mancha de Western. A reactividade com 0 anticorpo monoclonal IT-13 está representada no painel A da figura 4. Em resumo, cinco anticorpos monoclonais, diferentes, específicos para 0 antigénio 65 KD reagiram com uma espécie no extracto bruto, que migrou com uma massa molecular relativa aparente (lí ) de cerca de 55006 daltons (faixa 3)·
Não se verificou nenhuma reactividade em extractos de E.co- sem plasmídeo (faixa 1). Além do mais, a expressão desta proteína de fusão é inauzível com isopropil-beta-D-ticgalactopiranósido (IPTG) (comparar as faixas 2 e 3)· Em consequência, conclui-se que esta estrutura de leitura aberta, comprida, compreendendo os resíduos 252 a I87I, codifica o antigénio 65 KD de M. tubérculo sis. As frases proteína de 540 resíduos aminoácidos, proteína 540, proteína 65 KD e antigénio de proteína 65KD são utilizadas indiferentemente para a proteína 65 KD de M. tubérculosis.
Adicionalmente, a proteína 65 KD recombinante, purificada, foi utilizada nas análises de mancha de Western usando soro de pacientes humanos que se sabe estarem infectados com M. tubérculo sis. Em estudos preliminares, os anti-soros desses pacientes imunorreagiram com a proteína recombinante purificada.
Esses estudos ilustram a utilização da proteína natural ou tf 425
SCRF 1C'4.0-EPGí 11
-17recombinante como um antigénio, num método de ensaio de diagnóstico para a presença de anticorpos, para a proteína 65 KD que ocorrem naturalmente, nos pacientes infectados e deste modo, pa ra a detecção de uma infecção por Mycobacterium tubérculosis nes ses pacientes. Resultados semelhantes são obtidos num ensaio de fase sólida mais comum, como por exemplo os ensaios realizados numa placa de nicrotitulação onde a proteína 65 KD recombinante está fixada a uma matriz de fase sólida para formar um suporte de fase sólida, sendo o soro uo paciente a fonte de anticorpos a serem testados.
Os ensaios de fase sólida quer realizados numa placa de microtitulação, numa vareta de imersão ou como uma mancha de ãrestern necessitam todos de etapas similares e constituem variantes uns dos outros. Cada uma tem uma matriz de fase sólida (depósito da placa de microtitulação, superfície da vareta ou nitrocelulose) na qual a proteína natural purificada ou uma pro teína com 540 aminoácidos, recombinante, codificada pelo genoma de „Z. tubérculosis, como antigénio, é fixada, normalmente por adsorção para formar o suporte de fase solida. A amostra ensaia da tal como c soro ou o fluido cerebrospinal,quando se pretendem provas ce meningite tuberculosa do paciente,é misturada na forma líquida co:ra o suporte de fase sólida para formar uma mistura de fase sólida-líquida. Essa mistura é conservada sob as condições de ensaio biológicas usuais (por exemplo 0°C a cerca de 4o°C) durante um período de tempo suficiente para que quaisquer anticorpos presentes na amostra ensaiada imunorreajam com e se liguem ao antigénio do suporte da fase sólida. As fases sólidas e líquidas sãG separadas como por lavagem. A presença de anticorpos ligados ao suporte sólido é em seguida determinada como com um reagente marcado que reage com os anticorpos humanos ligados.
Um reagente marcado que reage com anticorpos humanos ligados presentes é misturado com a fase solida para formar uma segunda mistura de fase sólida-líquida. Esta segunda mistura de fase sólida-líquida é mantida durante um período de tempo suficiente para que o reagente marcado reaja com os anticorpos humanos ligados. A segunda mistura de fase sólida-líquida é se
425
SCRF 104.O-EPG:11 c'
-18parada como por lavagens e determina-se a quantidade de marcador presente. Uma quantidade de marcador presente acima de um valor de controlo de referência indica a presença de gnticorpos anti-proteína 65 KD e, em consequência, ue infecção por M. tubérculo sis.
reagente marcado que reage com os anticorpos humanos ligados é de preferência uma preparação marcada de anticorpos anti-humano xenogénicos tais como anticorpos de Ig anti-humana de cabra conjugada com fosfatase alcalina que estão disponíveis em Tago, Burlingame, CA. A presença da fosfatase alcalina ligada é, tipicamente, determinada por via espectrofotométrica medindo a hidrólise enzimática de uma molécula de substrato tal como fbs fato de j3-nitrofenilo a jD-nitrofenol. Outras enzimas tais como peroxidase de rábano e outros tipos de marcadores tais como elementos radioactivos, como o iodo 125, são também eficazes. A proteína A de S. aureus ligada a um marcador tal como -^5^ p0_ de também reagir com os anticorpos humanos ligados das fases sólidas separadas para detectar a sua presença.
método de ensaio ue diagnóstico anterior é tipicamente realizaao numa preparação clínica utilizando um conjunto .(Kit).O conjunto compreende pelo menos uma embalagem que contém um suporte de fase sólida que possui uma proteína 540 purificada, codificada pelo genoma de M. tubérculosis, isto é a partir da micobactéria, ou é uma proteína recombinante, como se descreveu, fixada como um antigénio, a uma matriz sólida tal como uma placa ou uma vareta plástica de micro titulação. Um ou mais reagen tes adicionais tais como o reagente marcado que reage com anticorpos humanos ligados a fase sólida, um substrato para o reagente marcado (quando se necessitar do marcador), sais tampão em solução ou na forma anidra e análogos, podem também estar presentes no conjunto, em embalagens separadas.
D. θ gene do antigénio 65 KD é expresso em E.coli
Devido a estudos prévios terem mostrado que a maior parte dos genes micobacterianos não eram expressos em E.coli utilizan do as sequências de sinal de tradução e transcrição micobacte67 425
SCRF 104.0-EPG: 11
-19rianas /“Clark-Curtis et al., (1985), J. Bacteriol., 161:1093“ -1102; e Thole et al., (1985), Infect. Immun., 800-806J7 utilizou-se uma biblioteca de expressão de proteína nos estudos de clonaçSo. Na biblioteca de M tubérculosis Agtll, as sequências de codificação micobacterianas inseridas deveriam ser expressas comc proteínas de fusão com beta.-galactosidase /~Young et al. , (1983) Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82:2583-2587J. Foi algo surpreendente descobrir que a estrutura de leitura aberta codificando o antigénio 65 KD não se prolongou até à extremidaae 5' da inserção de ADN micobacteriano em ASIÍ119. Isto sugeria que o antigénio 65 KD estava a ser expresso utilizando as sequências d© sinal de transcrição e tradução micobacterianas.
Com referência às sequências de sinal de consenso de E.coli descritas previamente, as sequências micobacterianas com. 180-230 pb a montante do presumível codãc iniciador ATG exibem concordância razoável com as sequências de consenso para as regiões -35 (3/3 de concordância com o TTG altamente conservado) e -10 (4/6 de concordância com TATAAT) dos promotores Ξ.coli f~Rosenberg et al., (1979), Ann. Rev. Genet., 13:319-353_7· Há também 5/5 de concordância com a sequência Shine-Dalgarno /Shine et al., (1974), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 71:1342-1346__7para um local de ligação ao ribossoma procariótico (GGA1G) com 13 pb a montante do tripleto iniciador, presumido, para a estrutura de leitura aberta do antigénio 65 O. Embora as localizações precisas das sequências reguladoras micobacterianas não tenham sido determinadas experimentalmente, os resultados dos dois estudos descritos a seguir sugerem que as sequências micobacterianas sejam na verdade funcionais em E.coli. 0 tamanho do material reactivo anti-65 KD produzido pelos recombinantes foi determinado num ensaio de mancha ae Western. Para isto, os lisados brutos de células expressando plasmídeos ou fagos recombinantes que tinham mostrado conter o gene do antigénio 65KD (/SK116,pTB12) completo, bem como os que tinham mostrado conter uma grande porção da estrutura de leitura aberta do antigénio 65 KD fundida com B-galactosidase (\RY3146; pTB22 que contém o ADN da proteína 540 desde a posição 438 até à posição 1948 da figura 2) foram preparados como se descreveu na secção Materiais
425
3CRF 104.0-EPGíll
e Métodos.
Os lisados foram submetidos a electroforese sobre 10% de geles de poliacrilamida-SDS Laemmli e as proteínas separadas foram transferidas por electroforese para nitrocelulose. As proteínas imobilizadas, desnaturadas por SDS, reagiram depois com anticorpos monoclonais, específicos para o antigénio 65 KD.
Os resultados, utilizando o anticorpo IT-13, estão representados na figura 4. Nas células que expressam recombinantes transportando a estrutura de leitura aberta fundida, os anticcr pcs monoclonais detectaram uma espécie fortemente reactiva migrando com um N de cerca de loOOUO Daltons, tendo também detectado, ocasionalmente, espécies mais pequenas (figura 4, Painel B, faixa 3)· Num outro recombinante da estrutura de leitura aberta, fundida, os anticorpos monoclonais detectaram uma única espécie reactiva migrando com um N de cerca de 55bí)C daltons
X (figura 4, Painel A, faixa 3). Nos· extractos das células que expressam recombinantes que continham o gene 65 KD completo os anticorpos monoclonais detectaram uma única espécie fortemente reactiva que migrou com um de cerca de 64000 daltons (figura 4, Painel E, faixa 1 e 2).
As espécies reactivas mais pequenas (cerca de 4ΟΟΟΟ-55θθθ daltons) foram observadas quando se carregaram quantidades gran des dos extractos (faixa 5) ou quando o inibidor de protease foi omitido do tampão de li se. Ocasionalmente observou-se também uma espécie menos reactiva a migrar com um M de cerca de 670OO daltons.
Dados os tamanhos dos materiais reactivos anti-65 KD, estes dados indicam que 0 antigénio 65 KD pode ser expresso utilizan do os sinais de iniciação de tradução micobacterianos presentes no gene 65 KD. Visto, também, que a contribuição do vector para os plasmíaeos recombinantes não contém quaisquer sequências conhecidas, que estejam devidamente localizadas e orientadas para promover a transcrição do ADN inserido, estes dados suge rem que os sinais de iniciação de funcionam em E.coli para permitir
Com vista a obter uma medida utilização dos sinais de iniciação de transcrição e ae tradução
6? 425
SCRF 104.O-EPG:11 .,l:· - n:h:
-21micobacterianos em B.coli, construíram-se dois plasmídeos que colocaram a expressão da beta-galactosidase emzimaticamente activa sob o controlo quer- das sequências de sinal micobacterianas quer das sequências de sinal do gene lac presentes no plasmídeo pUC19.
Em primeiro lugar, inseriu-se o fragmento BamHI de 3000 pb de pYC1871 que contém as sequências de codificação par-a os resíduos de aminoácidos 3-1021 /~Shapira et al., (1983), Gene, 25í 71-82^ no local BamHI do pTB12 (resíduos 437-442 da sequência apresentada na figura 2). 0 plasmídeo de 8,1 kpb (pTB27) resultante contém uma estrutura de leitura aberta que codifica uma proteína de fusão com 63 resíduos de aminoácidcs, derivada do gene do antigénio 65 KD, seguida por 1014 aminoácidos da beta-galactosidase e cujas expressões estão sob controlo cias sequências de sinal de tradução e transcrição presentes no ADN micobacteriano. Ccmo se esperava esta construção expressa uma proteína de cerca de 120 000 daltons que reagiu com anticorpos anti-beta-galactcsidase num ensaio da mancha de Testern.
Em segundo lugar, 0 fragmento BamHI de 3θθθ pb, de pHC1871, foi inserido no local BamHI no pcliligante de pTB9 que contém um fragmento de 2,4 kpb do gene do antigénio 65 KD inserido no local EcoRI do pUC19· θ plasmídeo de 8,1 kpb (ρΤΒ2δ) resultante contém uma estrutura de leitura aberta que codifica uma proteína de fusão com 15 resíduos de aminoácidos, derivada do gene lac2 do pUC19 e sequências de pcliligante seguidas de 1014 resíduos de aminoácidos da beta-galactosidase e cuja expressão es tá sob 0 controlo das sequências de sinal do gene lac presentes no pUC19.
Os extractos brutos de células que contem estes plasmídeos foram testados para a actividade de beta-galactosidase como se descreveu previamente. Em células que contêm pTB27, a activida de de beta-galactosidase ^cerca de 2800 unidades/micrograma Qug) proteír.a_y foi cerca de um quarto da (11000 unidades/jug de proteína) encontrada em células induzidas por IPTC-, contendo pTB2-S. Dado os desconhecimentos inerentes neste estudo (por exemplo, as actividades específicas e as estabilidades relativas das duas proteínas de fusão), não se pode fazer uma avalia67 42?
SCRF 104.0-EPGíll ção quantitativa precisa acerca das forças relativas das sequên cias de sinal micobacterianas e das sequências d© sinal do gene
encontradas nos dois extractos celulares. Contudo, os dados in dicam que estas sequências de sinal de tradução e transcriçãG micobacterianas são reconhecicas de modo eficiente em E.coli.
E· sequência do Antigénio 6? KD
Têm sido revelados vários aspectos interessantes desta estrutura de leitura aberta, longa, através d© uma análise da sequência auxiliada por computador. A composição base, total des ta estrutura de leitura aberta é de G+C. Contudo, o con teúdo em G+C varia consideravelmente com os codãos, o conteúdo em G+C das bases que ocupam os primeiros dois resíduos dos codãos é de ??/, enquanto que para as bases encontradas na terceira posição dos codãos é de 87%, pelo que se produz um desvio quando se utilizam codãos que possuem um G ou C na terceira posição.
Por exemplo, ?0 dos ?1 codãos da leucina (CTZ) possuem um G ou um C na terceira posição.
De maneira interessante, a ocorrência, essencialmente ao acaso, de qualquer das quatro bases nas primeiras duas posições de um codão mais a preferência por G ou C na terceira posição de um codão é una estratégia que permite a um organismo possuir um conteúdo elevado era G+C sem limitar o acesso aos aminoácidos cujos codãos contêm resíduos A ou T nas primeiras duas posições.
Embora a sequência de resíuucsde aminoácidos deduzida do antigénio 6? KD seja particularmente rica em resíduos alanina, glicina, leucina e valina, contendo a composição total de resíduos aminoáciGOS, ?2/ de resíduos hidrofóbicos e 48/ d© resíduos hidrofilicos.
A análise, feita com auxílio de computador·, do conteúdo alfa helicoidal /“Chou a1· > (1978), Adv. Enzym., 47;4?-148 7 e a hidrofobicidade 2~HoPP a^· > (1931), Proc. Hatl. Acad. Sei. USA, 78:3824-3828_J7 da sequência d© resíduos aminoácidos revelou numerosas regiões que podiam participar nas estruturas alfa
helicoidais e nenhumas regiões extensas de elevada hidrofobici
6? 425
3CRF 104.C-EPG:11 dade. Estes dados sugerem que o antigénio 65 KD não é uma proteína de membrana, integral, mas que a sua sequência se parece mais aprcpriadamente, com a de urna proteína solúvel.
Como se discutiu antes, o antigénio 65 KD parece ser um an tigénio e um imunogénio principal das células T no homem. Tem
-se sugerido que os epítopos de células T, imunodominantes, sejam extensões curtas de aminoácidos que podem formar hélices an· fifílicas onde um lado da hélice é hidrofóbico e o outro lado é hidrofílico Berzofsky, (1985), Science, 229:932-940. Baseado no modele do computador, identificaram-se sete extensões de aminoácidos dentro da sequência do antigénio 65 KD como podendo formar essas hélices anfifllicas.
A lista desses péptidos está representada na Tabela 2, a seguir.
Posições dos
| resíduos'' | i>equencxa |
| 11-28 | A R R G L E |
| 66-79 | Ξ K I G A E |
| 114-130 | G L F G I |
| 154-172 | Q S I G D L |
| 219-233 | L I V S 3 K |
| 394-408 | I S D A V R |
| 494-508 | V K V T R S |
| R | n | L | li | A & | L | Λ & | D | V | K | V | |
| T | V | K | V | A | K | K | |||||
| E | T7 x*. | * | V | E | K | V | T | E | T | -r | |
| I | A | E | k | D | K | V | G | M X. | T7» | G V | |
| V | 0 | T | V | K | D | 1 | L | P | |||
| T-T | Λ À* | K | «1® | A | V | TP -ÁJ | T? | G | |||
| A | T | r, | TT | A | A | /1 O | I | A |
^As posições dos resíduos são designadas utilizando uma letra da sequência de resíduos aminoácidos da proteína 65 KD repee sentada na figura 2 que representa o resíduo da metionina codificado pelo tripleto começando na posição 252, de pares bases, como o primeiro resíduo da proteína.
p
Estas sequências de aminoácidos são representadas da esquerda para a direita e na direcção do terminal amino para o terminal carboxilo, como é usual na técnica.
425
SCRF 104.0-EPGíll
-24F. Ensaio DCH com uma proteína recombinante 65 KD
Realizaram-se ensaios demonstrativos de hipersensibilidade cutânea retardada (DCH) utilizando proteínas recombinantes, ilustrativas, descritas aqui, como antigéniosde teste, após imunização com M. tubérculo sis, com N. bcvis ou com solução salina. Estes ensaios foram realizados seguindo c procedimento descrito em Minden et al., (1Ç86) Infec. Immun. 53:560-564.
Resumidamente, os hospedeiros mamíferos foram imunizados com uma quantidade suficiente de M.tubérculosis ou de M.bovis para induzir uma resposta imunológica ou com ura controlo (solução salina). Após manutenção dos animais durante um período ôe tempo suficiente para que a resposta imunológica inicial ao imunogénio cesse, activaram-se os animais com inóculos contendo a proteína 65 KD, uma proteína 65 KE recombinante ou uma proteína de fusão recombinante que continha a proteína 65 KD como antigénio de teste, dissolvida ou dispersa num diluente fisiclogicamente tolerável, ou com um controlo. Os antigénios de teste estavam presentes numa quantidade suficiente para induzir eritema e enduramento no local de administração a um mamífero previamente imunizado com M.tubérculosis ou M.bovis.
Os resultados deste estudo estão representados na Tabela 3, a seguir.
42?
SCRF 104.O-EPG:11
.....-'3· ~C-S~
TABELA <
Ensaios BCH com Antigénios recombinantes
| Antigénio desafio | Ns. Positivo/Ne. testado | |||
| de | de cobaias imunizadas com: | |||
| Tf Xci· tuberculosis | M. bovis | Solução salina | ||
| solução salina (0) | 0/5 | 0/5 | c/5 | |
| BM97J | (10) | 0/5 | 0/5 | 0/5 |
| F IO894 | (10) | 5/5 | 5/5 | 0/5 |
| ^10894 | (1) | 5/5 | 5/5 | 0/5 |
| pTB22^ | (10) | 5/5 | 5/5 | 0/5 |
| PTB22-5 | (D | 5/5 | 5/5 | 0/5 |
| BCG-SU | (1) | 5/5 | 5/5 | 0/5 |
| PPd7(5 T.u | .) | 5/5 | 5/5 | 0/5 |
| ^Comp | osições de | antigénio para | activação | foram injectadas |
| por via intradérmica | como se d | iseute em | Materiais e Méto- |
dos utilizando quantidades de 1 ou 10 jig/100 jil por injecção, como se indicou pelo número entre parêntesis após cada antigénio, excepto para o derivado de proteína purificada (PPd) que fci utilizado numa quantidade de 5 unidades de tuberculina (T.
o ^0 numero de cobaias que exibem respostas DCH positivas es tá no numerador enquanto que o número de cobaias testados está no denominador. 0 protocolo de imunização está descrito em Materiais e Métodos.
^221197 era um lisado bruto preparado a partir de E.coli infectado com o 4gtll. C lisado bruto foi parcialmente purificado por precipitação por sulfato de amónio como se descreve na secção Materiais e Métodos.
^1089 ora um lisado bruto preparado a partir de E.coli infectada com/\SE119 que expressou o antigénio 65 ICD. 0 lisado bruto foi parcialmente purificado por precipitação por sulfato
425
SCRF 104.0-EPG:ll
2ό· de amónio como se descreve na secção Materiais e Métodos.
5pTB22 era um lisado bruto preparado a partir de Ξ.coli contendo pTB22 que expressou o antigénio 65 KD como uma proteína ae fusão que continha uma porção da molécula da beta-galacto sidase e, próximo do terminal carboxilo, 88$ da proteína 65 KD. 0 lisado bruto foi parcialmente purificado por precipitação por sulfato de amónio como se descreve na secção Materiais e Métodos.
BGG-S era um extracto de K.tubérculo sis preparado como se descreve na secção Materiais e Ifétodos.
'PPd fcí obtido nos Connaught Laboratories, Ltd., V/illcwdale, Cntario, Canada.
Come se pode verificar a partir dos resultados anteriores, a proteína 65 KD codificada pela sequência de ADU da figura 2 pode ser utilizada em DCH como parte de um método para determinar se um hospedeiro mamífero, tal como cobaias, teve exposição imunológica prévia à M.tubérculosis, visto que os leucócitos T dos animais hospedeiros produziram eritema e enduramento nos locais de administração aos animais previamente imunizados com
M.tubérculosis e K. bovis e não produziram nenhumas reacções nos animais imunizados com solução salina. Esses resultados também mostram que as moléculas de proteína 65 KD recombinante são de modo análogo eficazes. As proteínas de fusão recombinan tes que contêm uma porção da molécula da beta-galactosidase ligada por péptido ao terminal amino da proteína 65 KD, são também eficazes, tal como o são as proteínas de fusão que contêm uma porção da molécula da beta-galactosidase e próximo do terminal carboxi pelo menos 85$ da proteína 65 KD, por exemplo, a proteína expressa por pTB22. A frase exposição imunológica prévia e as suas variantes gramaticais são utilizadas para significar que o hospedeiro mamífero tinha sido imunizado ou infectado por uma das micobactérias e que o maaíferc do hospedeiro correspondeu com uma resposta imunitária (resposta primária) aos imunegénios fornecidos pelas micobactérias e que essa resposta imunitária tinha cessado.
425
3CBF 104.0-EPG:ll ' . ®ϊβ á ' <*' -27- ·Λ
G. A Proteína de 517 Aminoácidos
1. A Estrutura de Leitura Aberta
A segunda estrutura de leitura aberta, longa, começa com um codão ATG nas posições 3948-3946 da figura 2 e estende-se até um tripleto TAA nas posições 2397-2395 na cadeia de ADF complementar para a cadeia de ADiT que codifica o antigénio 65 KD, tornando per consequência essas estruturas de leitura aberta adjacentes, no genoma. Esta estrutura de leitura aberta pode codificar uma proteína que contém uma sequência de 517 resíduos de aminoácidos sendo essa proteína referida aqui como a preteína de 517 aminoácidos ou proteína 517· A região de codificação de proteína 517 estende-se, deste modo, da. posição 3948 até à posição 239θ da figura 2.
Dado que as duas estruturas de leitura aberta estão localizadas de modo adjacente e a jusante umas uas outras nas cadeias complementares, pode-se esperar que a transcrição de um gene possa interferir com a transcrição do outro a menos que haja sinais de terminação de transcrição dentro da região intergénica. Fa verdade, há várias sequências curtas (por exemplo, 2134-2160) na região intergénica de 520 pares de bases que possuem aspectos reminiscentes dos sinais de terminação de transcrição das bactérias gram-negativas/“Rosenberg et al., (1979), Ann. ..Rev, Genet., 13:319-353 7» Isto é, as regiões que contêm repetições invertidas, ricas em G+C, curtas, capazes de formar estruturas em haste e em círculo seguidas por uma extensão de três, ou mais, resíduos T, a cerca de 20 bases do centro de simetria da díade. Estas repetições invertidas talvez possam funcionar como sinais de terminação de transcrição para permitir a expressão independente de cada um destes genes micobacterianos.
Para determinar se a estrutura de leitura aberta de 517 aminoácidos era expressa como proteína em E.coli, os extractcs de células que contêm um plasmídeo (pTEll) transportando a estrutura de leitura aberta completa foram sondadas com um anti-soro de coelho policlcnal estimulado de um extracto, submetido a ondas sonoras, da bactéria F.tubérculosis, num ensaio da man67 425
SCRF 1G4.O-EPG:11
-28cha de Uestern. Nestes recombinantes c produto proteico putativo da estrutura de leitura aberta de $17 amincácidos teria de ser expressa utilizando as sequências reguladoras nas. 0 anti-soro policlonal detectou mais de IvO extracto de células de M.tubérculo si s, tal como o
KD em extractos de células de B.coli transportando o plasmídeo apropriado (pTB12), mas nãc detectou quaisquer proteínas novas em extractos de células de E.coli que contêm plasmídeos transportando a estrutura de leitura aberta da proteína com pl? resíduos aminoácidos. Por este motivo, ou esta estrutura de leitura aberta não é expressa em B.coli, utilizando as sequências reguladoras micobacterianas ou o anti-soro particular utilizado nas imunomanchas não contém anticorpos dirigidos contra esta proteína.
Não é surpreendente que esta estrutura de leitura aberta não seja expressa em E.coli utilizando o recombinante discutido anteriormente, visto que estudos prévios sugerem que a maior parte dos genes bacterianos não são expressos em E.coli /~~Clark -Ourtiss et al., (19θ5), J· Bacteriol, 161:1093-1102; e Thole et al., (19θ5), Infect. Immun. 5o:8ΰο-8θ6 7. Esta estrutura de leitura aberta também não contém quaisquer correspondências impressivas em relação às sequências promotoras de consenso de E. coli nas 400 bases a montante do tripleto ATG embora apresente 3/5 de correspondência com a sequência de consenso Shine-Dalgar no para sítios de ligação ao ribossoma 12 bases a montante do tripleto iniciador ATG. Não obstante, dado o tamanho desta estrutura de leitura aberta e os seus aspectos estruturais únicos seguir), ela é ” tubérculosis e recombinante a seguir.
~ ' de M.tuber culo si s micobacteriaespécies num antigénio
J-j · ;Á (discutidos a proteína em X zando um vector se descreve muito provavelmente expressa como pode ser expressa em E.coli utiliconcebido para essa expressão,como
2« Aspectos estruturais oa proteína 517
A segunda estrutura de leitura aberta, longa, podia codificar 517 amincácidos ou uma proteína com cerca ãe 510C0 daltons (peso molecular calculado ~ 5^581). A sequência de resíduos
425
SCR? 104.O-3PG:11 y
resíduos 200 e 35θ θ mais particularmente nas posições 217 a
de aminoácidos.
Por exemplo, a sequência de 5 aminoácidos, asparagina-as-
desde a posição 227 até à 241.
Mas talvez o aspecto mais interessante se refira a uma se-
consenso desta repetição parece ser X-glicina-aspar-agina-Z-gli-
Para as quinze consenso, X é, a maior parte das vezes, fenilalanina, serina ou treonina (12/15) embora X possa ser também, isoleucina, leucina e ácido aspártico. Z 6 a maior parte das vezes isoleucina ou treonina (10/15) mas pode ser, também, algumas vezes serina, leucina ou valina. Outras sequências entre as posições 200 e 35θ exibem correspondências parciais com a sequência de consenso, (isto é, correspondência em 2 dos 3 resíduos do núcleo).
As sequências de cinco resíduos, anteriores, estão dispostas na direcção do terminal amino para o terminal carboxilo, com duas sequências XGIIZG confinantes (contíguas) que são contíguas às três sequências 1WIG que são elas próprias contíguas a oito sequências XGITZG contíguas. Segue-se uma falha de cerca de dezassete resíduos, que é, ela própria, seguida por três sequências de consenso XGNZG contíguas. Segue-se uma outra falha de cinco resíuuos que confina com outras duas sequências de
425
SOR? 1O4.C-3PG:11
......
-30consenso de cinco resíduos XGFZG contíguas. De um modo interes sante, ambas as falhas contêm sequências que possuem dois dos três resíduos do núcleo das sequências de consenso, bem como re síduos X e Z convenientemente espaçados.
Deve-se notar ainda que esta região contém uma repetição directa de uma sequência de 14 resíduos aminoácidos coia apenas uma discordância (resíduos 295-308 e 31-5-328). Essas sequências são apresentadas a seguir utilizando o código de uma letra:
295-308
315-328
FN3GSGITIGFGNSG
FNSGSGNIGIGH3G
Como se esperava, visto que as repetições de resíduos aminoácidos das sequências de consenso não são exactas, as sequências nucleotídicas nesta região não são repetições exactas. Esta observação sugere que os processos de recombinação tais como um cruzamento (crossing-over) desigual não podem, mais uma vez, desempenhar um papel na indução de alterações evolutivas, rápidas, nesta região como é muitas vezes observado para sequências nucleotídicas com elevado grau de repetições.
A parte restante desta sequência de proteína não apresenta quaisquer outros aspectos particularmente notáveis.
A natureza altamente repetitiva da proteína de 517 resíduos é reminiscente das estruturas repetidas encontradas nas proteínas de revestimento principais, da fase de esporozoito do parasita da malária/iTussenzv;eig et al., (1985), Cell, 42:401-403__7· Estes circum-esporozóitos, ou proteínas CS, são proteínas com 40-60 KD localizadas na membrana do esporozôito infeccioso e contêm um epítopo fortemente imunodominante que reage com a maior parte dos anticorpos anti-esporozéitos encontrados no anti-soro policlonal bem como todos os anticorpos monoclonais desenvolvidos contra a fase esporozoito. A região central destas proteínas contém 20-40 repetições em tandem, de uma sequência com 11-12 aminoácidos.
TTo Plasmodium falciparum, o epítopo imunodominante está contido entre três repetições consecutivas da sequência asparagina-alanina-asparagina-prolina (ΙΪΑ2ΓΡ; que está repetida 37 ve67 425
3CIU- 104.0-EPG:ll
-l· zes num isolado) e os anticorpos dirigidos contra esta repetição de 12 resíduos podem proporcionar protecção imunológica contra a infecção pelo parasita da malária. A sequência da repetição difere nas várias espécies deste parasita e c número de repetições pode variar entre isolados diferentes da mesma espécie. A semelhança da natureza repetida da proteína CS s a da proteína de Xtubérculosis, com 517 resíduos aminoácidos, dá origem à possibilidade interessante de que sequências repetidas na proteína de 517 resíduos pudessem desempenhar algum papel na resposta imunitária a micobactérias.
Embora a proteína 517 não fosse expressa utilizando a cons trução recombinante descrita atrás, esta proteína pode ser exum vector de expressão recombinante pressa em concebido
3.coli utilizando especificamente para a sua expressão. Tal vector de recombinante pode ser construído como se segue, utilibases da figura 2. Deve-se compreender que a sequência de ADN de interesse aqui é a representada na parte inferior das duas sequências de ADN apresentadas sendo essa sequência lida d.a direita para a esquerda e ção da extremidade 5’ para a extremidad de posição da sequência sejam e na direcçãc da extremidade sequência superior.
A sequência de ADN de cord expressão zando a numeração dos pares de
3', embora os lidos da esquerda para a 5’ para a extremidade 3 na direc números direita para clivada sequência de ADN de cordão duplo da figura 2 é con endonuclease PvuII para proporcionar um fragmento tende desde a posição 3511 até à posição 4019 (5θ9 pb) fragmento é ligado ao local 2mal do vector pUC19 para formar o intermediário I.
intermediário é introduzido em E.coli para propagar o vector η Λ.Γpoliligante pUC19).
era seguida, clivado Sall (no local de resultante é rejeido Intermediário I é conservado.
ADN propagado endonucleases jij-Ka fjn f. ní
ΟI ‘-rd.;
Uma outra amostra da. sequência de ADN da Figura 2 é clivada com as endonucleases Notl (posição 3603) e Sall (posição 2202) para proporcionar um fragmento Hotl-Sall que é ligado locais apropriados do ADN do intermediário I, que se conservou, para formar um segundo vector derivado de pUC19 denominado Intermediário II. Este vector contém a sequência de ΛΕΝ completa da proteína 517 e é ainda propagado em E.
ADN propagado do intermediário II com as endonucleases EcoRI e HindlII nos no gene da proteína 517 ® os
Este vector contém a sequência coli.
é recolhido e clivado seus locais r-espectives, no gene da proteína >17 e no poliligante de pUC19. 0 fragmento resultante EcoRI-HindlII que contém c ADN de proteína 517 é em seguida recolhido e ligado a esses locais respectivos no poliligante do vector plasmídeo pKK223-3 para formar o Intermediário III que contém a porção do terminal carboxilo do gene. 0 intermediário III e clonado em E. coli -3 e JM105 estão disponíveis na Pharmacia Fine t av< ay, χ <? · j
Uma outra amestra do ADN do Intermediário penas ccm EcoRI para excisar uma porção desse ADN posição no poliligante até 2769 na proteína >17 EcoRI resultante contendo 0 ADN Uue codifica amino da proteína
JXLO?.(pKK223
Chemicals, Pisca iívsis duas orientações para ligação do de expressão. Determinou-se a orientaconvencionais tais como por isolamento vectores e por preparação de mapas de Por- exemplo, um frapossui 0 fragmento de ADN pb, enpossui cerca de
II e clivada aa partir de uma . 0 fragmento a porção do terminal
517 é recolhido e é em seguida ligado ao único local EcoRI do Intermediário III par-a formar 0 vector de expressão que contém 0 gene completo da proteína 51?· Este vector é também cultivado em E. coli JX105, como meio de replicação/expressão.
Notou-se que são poss fragmento EcoRI no vector ção própria pelos métodos de vários clones contendo ' restrição do vector de ADN desses clones. gmente Kpnl-Hind III de um clone :;ue EcoRI, com a orientação adequada, contém quanto que um fragmento Kpnl-Hind III de um fragmente EcoRI orientado erradamente contém apenas 300 pb.
A expressão de uma proteína recombinante a partir de um veccerca de 2000 um clone que
dd
duzida é expressa como uma proteína em si mesma e não como um
snticorpos desenvolvidos para um ou mais dos péptidos relaciona
H. Recombinantes e vectores
A presente invenção contempla deste modo a proteína 540 re ccmbinante purificada e a proteína 517 recombinante bem como proteínas de fusão recombinantes que incluem também toda ou uma porção de outra molécula, tal como beta-galactosidase fundida ccm a extremidade amino dessas proteínas. Cada uma destas proteínas recombinantes é eficaz para induzir a produção de anticorpos que imunorreagem com essas moléculas respectivas, corne obtidas a partir da própria X tubérculosis, cu como de células infectadas com essa micobactéria. Os nétoâos de preparação des tes anticorpos são bem conhecidos na técnica e são semelhantes aos métodos utilizados para os péptidos desta invenção, como se descreve a seguir.
A proteína de 540 resíduos aminoácidos recombinante, purificada, cu as suas proteínas de fusão, quando presentes nuca quantidade eficaz num inóculo são também eficazes num ensaio DCH como se descreveu antes. Estas proteínas, são também eficazes em métodos e conjuntos de diagnóstico úteis para determinar a presença de infecçao per LT. tubérculo sis.
As sequências nucleótidas são também contempladas tal como o são os vectores plasmídeos não cremossómicos úteis na propagação destas sequências de ADH e na expressão dos produtos proteicos codificados por essas sequências.
Uma sequência nuclectiaa desta invenção consiste essencial mente numa das sequências anteriores. Deste modo, urna sequência
425
SCRF 104.0~FPG:ll
-34wZ Γ nucleótida da invenção exclui nucl°ótidos adicionais que afectam as características novas e básicas de uma sequência nucleótida que codifica a proteína 54C ou a proteína 517·
Uma sequência nucleótida da invenção pode incluir uma ou mais sequências prometeras transcricionais ligadas operacionalmente à sequência adjacente à sua extremidade 5'· Quando se deseja a tradução do ADN e a expressão da proteína, o ADN também inclui um codão de iniciação da tradução (ATC·) e uri codão de terminação da tradução (TAA ou TAG cu TGA), cada um dos quais está ligado operacicnalmente, de modo adjacente, à extremidade 5’ e 3’, respectivamente, da sequência, estando c codão de iniciação da tradução localizado entre a sequência promotora e a extremidade 5' ·
Uma sequência de ADN que codifica toda ou uma porção de outra molécula pode também ser incluída na molécula de ADN de tal forma que a molécula proteica traduzida (expressa) é uma proteína ae fusão que inclui una sequência de resíduos aminoácidos de toda ou de uma porção dessa outra molécula fundida (ligada por uma ligação peptídica) com as proteínas 540 e 517 expressas. Um polipéptido de fusão exemplar é a molécula da proteína de fusão descrita aqui que contém uma porção da molécula da beta-galactosidase fundida com o terminal amino da proteína de 540 resíduos aminoácidos.
Todas as sequências nucleótidas apresentadas na figura 2 podem estar presentes enquanto uma molécula de ADN enumerada permaneça replicável, quando se deseja apenas a replicação. Quando se deseja a replicação e a tradução (expressão da inolé-
quanto a molécula de ADN permanecer replicável e a molécula pro teica que contém a sequência de resíduos aminoácidos da proteína 540 e da proteína 517 expressa,exibir reactividade cruzada, imunc-lógica, com os anticorpos oesenvclvidos para um péptido apropriado descrito aqui. Numa prática mais preferida são apenas utilizados cs pares de bases necessários para expressão de uma protcína desejada.
E também contemplado um vector plasmídeo não crome-ssómico, para propagação e expressão de uma sequência nucleótida de ADN,
425
SCRF 104.0-EPG:ll
desejada, como se definiu aqui num meie replicação/expressão, per exemplo um organismo unicelular ou semelhante tal como
E.coli, 3. cerevisiae ou células de mamíferos, tais como células COS. Este vector compreende um replicão que é compatível com o meio/z^eplicação/expressão e contém nele a molécula de ΛΕΓ estranhe (por exemplo, toda ou uma porção da sequência apresentada na figura 2) para ser replicada de forma tal que o vector pode propagar a molécula de ADN.
Em adição, o vector plasmídeo não cromossómico inclui também os componentes de sequência que são utilizados para trans crição e tradução. Para este fim, u^ promotor transcrícional pode ser ligado operativamente à molécula de ADN presente de modo adjacente à sua extremidaoe 5’, come já se citou. 0 promotor transcrícional pode ser endógeno em relação ao vector ou exógeno em relação ao vector. Defere-se um promotor transcricional endógeno em relação ao vector tal como o promotor lac Z-operador utilizado nos vectores derivados de pUC19 ou o promotor trp-lac (tac) de pKK223-3· Um terminador traducicnal pode também ser ligado operativamente, de. modo adjacente, à extremidade 3' da molécula de ADN nalguns casos, embora a sequência nucleótida representada pela fórmula da figura 2 contenha essas numa molécusequências sequência sequências terminadoras.
É também necessário que um codão de iniciação (ATG·) adjacente à extremidade 5' da sequência que Inicia a tradução num meio de replicação/expressão esteja presente num vector utiliza do para expressão. Esse codãc pode estar pz*esente la de ADN definida em estrutura, como é o caso das apresentadas na figura 2 ou pode ser uma porção da nucleótida do vector plasmídeo percursora.
promotor de transcrição discutido antes, os e de terminação da tradução vector plasmídeo não cremossómicos molécula de Af'T da invenção. Para utilização molécula proteica o plasmídeo precursor inclui mente um local de ligação a ribossoma (sequência Shine-Delgardo) adjacente à extremidade 5’ da molécula de codãos de sãc frequente quando cominiciação da tradução mente partes do paradas com uma na expressão da também frequente
A.DTT estranho e localizado a montante do codão d© iniciação, com.c
425
SCRF 1C4.O-EPG:11
,.<r é bem conhecido. 0 promotor do vector tal como os promotores lac Z e tac utilizados aqui contêm, tipicamente, um local de li gação ao ribossoma.
Deste modo a sequência de nuclectidos do vector plasmídeo utilizado para expressão, exceptuando os nucleótidos necessários para a replicação e função geral do vector, inclui na estrutura e desde a extremidade 3‘ à extremidade 5' um local de ligação de ribossoma operacionalmente ligado de modo adjacente à extre midade 5’ de um promotor de transcrição; o promotor ligado operacionalmente à extremidade 5’ do codão de iniciação de tradução; o codãc ligado operacionalmente à extremidade 5’ de :
(a) uma sequência de uma porção de outra molécula que é expressa como uma proteína de fusão com a proteína desejada, ou (b) uma molécula de ADIT estranho desta invenção; quando (b) es tá presente, essa sequência está operacionalmente ligada à extremidade 5' de uma molécula de ADN desta invenção. Um vector de expressão que contém a molécula de ADN estranho aesta invenção (contudo ligado de modo adjacente à sua extremidade 5') con·
midade 3' do ADN estranho. Deve-se entender que todas as sequêr cias do ADN do vector devem ser compatíveis com o meio de replicação/ expressão utilizado para replicar ο ΛΖΗΤ e de preferência para expressar um produto codificado por uma molécula de ADN desta invenção.
Deve-se também entender que as sequências de sinal do vec tor útil, descritas anteriormente, podem ser proporcionadas a esse vector pelo ADN estranho ou por ura precursor para o vector final. Por exemplo, os codãos de iniciação e terminação de tra dação no vector de expressão para a proteína 517 são proporcionados pelo ADN estranho, enquanto que as sequências do promotor e do local de ligação ribossémico são proporcionadas pelo plasmídeo precursor.
Um vector da invenção é pelo menos capaz de replicar (pro preferência, o vec. de ADN mas é também genómica desse ADN é imunologicamente pagar) uma molécula de ADN da invenção. De tor é não sá capaz de replicar uma molécula capaz de expressar ou traduzir a informação numa molécula de proteína recombinante que ,
6? 425
SCRF 104.0-EPGíll υ ( semelhante à proteína 540 ou à proteína 517? isto é, induzirá anticorpos reactivos cruzadamente.
Um vector plasmídeo não cromcssómico desta invenção não necessita de estar limitado aos vectores úteis para replicação q tradução (expressão) em 3.coli como meio hospedeiro de replicação/expressão. Substancialmente, qualquer vector útil para replicar (propagar) e expressar uma sequência de ADN pode ser utilizado para replicar o ADN, por exemplo em células de mamíferos ou eucaríóticas.
Uma vasta gama desses vectores está comercialmente disponível assim como os meios hospedeiros de replicação apropriados. Exemplos d© vectores, plasmídeos e bacteriófagos e hospedeiros estão disponíveis na American Type Culture Collection of Rockville, ...D, e estão listados em Catalogue of Bactéria, Phages and rDNA Vectores, 16è. edição, 19θ5· Sm adição, os plasmídeos, cosmídecs e vectores de clonação estão disponíveis e listados em catálogos de Boehringer Mannheim Biochemicals of Indianapolis, IN; Bethesda Research Laboratories, Inc. of Gaethersberg, ND, e New England Biolabs, Inc. of Beverly, NA.
Péptido3
Um resi outro aspecto da presente invenção refere-se a um pepti do que consiste essencialmente numa sequência de resíduos aminoácidos que corresponde substancialmente a uma porção da sequência de proteína 540 ou 517. Tal péptido contém entre 5 a cerca de 40 resíduos aminoácidos e de preferência entre cerca de 10 e cerca de 2C resíduos aminoácidos que correspondem substancialmente em sequência a uma proteína escolhida de entre a proteína de 54C resíduos aminoácidos ou da proteína de 517 resíduos aminoácidos que são codificadas pela sequência de ADN representada na figura 2.
Um péptido útil contém de preferência, apenas, os resíduos aminoácidos que são idênticos ou homólogos a (substituições con servativas para) resíduos presentes numa sequência de qualquer das duas proteínas anteriores. Resíduos adicionais de essencialmente qualquer comprimento podem também estar presentes em
42;
SCRF 104. O-EPGí 11 qualquer um ou em ambos os terminais do pêptido. Contudo, quaisquer resíduos adicionais não devem interferir com a actividade do pêptido, como se discute a seguir, e por consequência diz-se que, um pêptido desta invenção consiste essencialmente” numa sequência enumerada. Em adição, se estão presentes resíduos adicionais e em conjunto com um pêptido anterior corressequência, a outras porções da mesa sequência do pêptido corresponde esresultante possui um peso molecular in>40 ou 517 que ocorrem naturalmente.
para induzir pondem sub st anc i almente, em ma proteína para a qual sencialmente, o pêptido ferior ao das proteínas
Um pêptido desta invenção é útil, inter alia, a produção de anticorpos num mamífero de laboratório como por exemplo um ratinho. Esses anticorpos induzidos imunorreagem com a proteína à qual corresponde substancialmente a sequência de pêptido quando essa proteína está numa forma desnaturada por SDS como numa análise por mancha11 de YJestern subsequente à anã lise SDS-PAGE.
Assim, os anticorpos anti-péptidos podem ser utilizados em ensaios em fase sólida para a detecção da presença de um antigénio isto é a proteína 540 ou Deste modo, a tigénio que é porte sólido.
anti-péptidos têm local de ligação) é misturada, se sólida anticorpos anti-proteínas de 65 KD. anti-péptidos é do antigénio de sos de mistura, Cs anticorpos completos e s x como moléculas paratópicas.
As moléculas paratópicas anti-péptidos podem elas próprias conter um marcador. Contudo, de preferência, utiliza-se um segundo reagente contendo um marcador que reage com as moléculas paratópicas ligadas tais como anticorpos completos antí-pépti. qetí a proteína 517 de -i. tubérculo sis . tal como''sputum”proporciona o ande fase sólida para formar o suaquosa que contérn os anticorpos idiotípicas (porções que conconservada e separada da fase descreveu anteriormente para a presença de A presença de anticorpos em seguida testada para determinar a presença Xtubérculosis na amostra, seguindo-se os passeparação e análise descritos anteriormente.
e as suas porções que contêm idictlpos 2ab e FCab’)^ são referidos eolectivamente amostra testada fixado à.matriz
Uma composição ou as suas porções λ como
-!Χ· tais como as porçÕ
Contudo
425 f
SCH? 1O4.O-SPS:11 . * ......
-39- ; dos. Os anticorpos de cabra anti-ratinho, conjugados com peroxidase, utilizados aqui são exemplos desses reagentes.
Um conjunto para ensaio em fase sólida que utiliza os anti corpos anti-péptidos é também contemplado para uso clínico do método descrito anteriormente. Aqui, o conjunto contém, pelo menos, uma matriz de fase sólida na qual pode ser fixado, numa embalagem o ensaio para o antigénio da amostra e numa segunda embalagem uma preparação de moléculas paratópicas anti-péptidos que imunorreagem com a proteína 54ú (65 KD) ou. com a proteína J17. Podem também ser incluídas embalagens adicionais de reagentes semelhantes no tipo e função aos anteriormente mencionados.
Para induzir moléculas paratópicas tais como anticorpos completos, liga-se tipicamente um péptido útil a uma molécula antigénica transportadora, tal como liemocianina de keyhole lim pet” (moluscos do género Fissurela) como um conjugado, o conjugado é em seguida disperso num diluente fisiologicamente tolerável tal como um inóculo e 0 inoculo é injectado no mamífero laboratorial utilizando procedimentos bem conhecidos. 0 animal inoculado é conservado e administram-se-lhe injecções de reforço como se desejar, até se atingir um título de anticorpos desejado para o péptido de indução. 0 soro de mamíferos contendo anticorpos é a seguir obtido, purificado como se desejar e é utilizado num ensaio de diagnóstico tal como o ensaio SDS-PAGE/ /mancha de Western para a detecção da presença de uma proteína substancialmente correspondente.
A palavra inóculo nas suas várias formas gramaticais é utilizada aqui para descrever uma composição contendo uma quantidade de conjugado de péptido, polímero de péptido (como se descreveu atrás), proteína de 6> KD ou proteína recombinante su ficiente para o fim em vista, dissolvidos ou dispersos num diluente aquoso, fisiologicamente tolerável. Exemplos de diluentes são bem conhecidos e incluem á6ua, soro fisiológico, soluçã) salina tamponada com fosfato, solução de Ringer, adjuvante incompleto de Freund e análogos.
Exemplos de procedimentos para a síntese química de um pép tido útil bem como para a preparação de um conjugado e utilizaΖ ,'Χ «·υ— ção do conjugado para originar anticorpos podem ser encontrados nas patentes Americanas He 4636463, Ue 4599231, Hs 4599230, N® 4545931 ? Re 4544500, sendo todas as suas revelações incorporadas aqui para referência.
Um péptido átil corresponde substancialmente, em sequência, a uma sequência da proteína 540 ou da proteína 517· A correspondência substancial das sequências dos péptidos pode ser determinada por várias maneiras.
Certamente, dois péptidos correspondem substancialmente i que partilhara quências. De substituições leucina por tâmico, serina por treonina, na por fenilalanina, outra.
Duas sequências uma ã outra quando os a outra.
possuem sequências idênticas outro assim como péptidos mas também contêm outras se sequências que diferem em s que i, um ac sequências idênticas, modo semelhante, duas ccnservativas tais como as substituições de isoleucina ou valina, de ácido aspártico por ácido glude asparagina por glutamina, de arginina por lisina, de de fenilalanina por triptofano e de tirosi correspondem também substancialmente uma. à podem também corresponder substancialmente us anticorpos desenvolvidos para uma imunorreagem com a outra. Por exemplo, os péptidos particulares descritos a seguir podem ser utilizados para desenvolver anticorpos que imunoreagem com a proteína (540) de 65 KD e, consequentemente, esses péptidos correspondem substancialmente, em sequên cia, à sequência da proteína de 65 KD.
Os resultados bioquímicos do imunoensaio e a analogia cora a interacção proteína-proteína conservada em estruturas cristalográficas de raios X resolvidas com sequências diferentes tais como nos contactos diméricos de enzimas oligoméricas indicam que a conservação do reconhecimento proteína-proteína não neces sita de una conservação estrita da sequência para que se verifique a analogia. Embora variações simples dos resíduos aminoáci dos possam afectar esse reconhecimento num grau elevado que depende da natureza da substituição, em termos gerais a analogia e por consequência a correspondência substancial de duas sequên cias de aminoácidos diferentes relativamente ao reconhecimento proteína-proteína (e antigénico e/ou imunogénico) pode ser ex41 pressa em eidos:
termos de sete parâmetros básicos de resíduos arninoã(D (2) (7) para estrutura secundária alterada para a estruturei secundária de cor<
para a estrutura secundária helicoidal, da sequência relevante hidrofobicidade;
ocorrência evolutiva de alterações nas sequências conhecidas;
tamanho da cadeia lateral: carga e polaridade; preferência preferência beta; e preferência
Para definir o grau de identida para o reconhecimento antigénico θ/gu imunogénico e por consequên cia a correspondência substancial de variantes de péptidos, po de-se utilizar também, uma matriz de consenso baseada nos sete critérios anteriores para determinar valores numéricos para cada um dos pares de resíduos aminoácidos nas sequências consideradas para correspondência substancial. Para os fins da presen te invenção, pode-se utilizar a matriz de consenso seguinte em que os resíduos aminoácidos individuais são designados por um código de uma letra para simplificar:
(continua) ί 67 425
SCRF 104.0-EPGíll
| A | R | N | D | C | Q | E | G | H | I | L | K | M | F | P | s | T | w | Y | V |
| A 7 | -5 | -1 | -2 | 0 | 0 | -1 | 2 | -1 | 0 | 1 | -2 | 2 | -1 | 0 | 0 | 0 -3 | -3 | 1 | |
| R -5 | 10 | 0 | -1 | -3 | 2 | -1 | -5 | 5 | -4 | -4 | 5 | -3 | -2 | -3 | 0 | 0 -1 | -1 | -4 | |
| N -1 | 0 | 6 | 3 | 1 | 3 | 0 | 1 | 3 | -2 | -2 | 2 | -1 | -3 | 1 | 4 | 2 -3 | 0 | -2 | |
| D -2 | -1 | 3 | 7 | -2 | 1 | 4 | 0 | 0 | -3 | -3 | 0 | -2 | -4 | 0 | 1 | 0 -5 | -2 | -3 | |
| C 0 | -3 | 1 | -2 | 7 | 1 | -2 | 1 | 0 | 0 | 0 | -2 | 0 | 0 | 0 | 3 | 4 -2 | 2 | 0 | |
| 0 0 | 2 | 3 | 1 | 1 | 6 | 2 | -1 | 4 | 0 | 0 | 2 | 0 | 0 | 0 | 1 | 3 -1 | 0 | 0 | |
| E -1 | -1 | 0 | 4 | -2 | 2 | 7 | -3 | 1 | -3 | -2 | 0 | -1 | -3 | -2 | 0 | 0 -5 | -3 | -3 | |
| G 2 | -5 | 1 | 0 | 1 | -1 | -3 | 6 | -2 | -3 | -3 | -2 | -2 | -5 | 2 | 3 | 1 -6 | -2 | -2 | |
| B -1 | 5 | 3 | 0 | 0 | 4 | 1 | -2 | 6 | -1 | 0 | 4 | 0 | 0 | 0 | 1 | 2 | 0 | 2 | -1 |
| I 0 | -4 | -2 | -3 | 0 | 0 | -3 | -3 | -1 | 5 | 4 | -3 | 2 | 2 | -2 | -2 | 0 | 0 | 0 | 4 |
| L 1 | -4 | -2 | -3 | 0 | 0 | -2 | -3 | 0 | 4 | 6 | -2 | 4 | 3 | -1 | -2 | 0 | 1 | 0 | 3 |
| K -2 | 5 | 2 | 0 | -2 | 2 | 0 | -2 | 4 | -3 | -2 | 6 | -1 | -3 | -1 | 0 | 0 -4 | -2 | -3 | |
| M 2 | -3 | -1 | -2 | 0 | 0 | -1 | -2 | 0 | 2 | 4 | —1 | 6 | 2 | 0 | -1 | 0 | 0 | -1 | 2 |
| F -1 | -2 | -3 | -4 | 0 | 0 | -3 | -5 | 0 | 2 | 3 | -3 | 2 | 7 | -2 | -3 | 0 | 4 | 3 | 2 |
| P 0 | -3 | 1 | 0 | 0 | 0 | -2 | 2 | 0 | -2 | -1 | -1 | 0 | -2 | 7 | 2 | 1 -4 | -1 | -1 | |
| S 0 | 0 | 4 | 1 | 3 | 1 | 0 | 3 | 1 | -2 | -2 | 0 | -1 | -3 | 2 | 5 | 3 -3 | 0 | -1 | |
| T 0 | 0 | 2 | 0 | 4 | 3 | 0 | 1 | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 1 | 3 | 6 -2 | 1 | 0 | |
| W -3 | -1 | -3 | -5 | -2 | -1 | -5 | -6 | 0 | 0 | 1 | -4 | 0 | 4 | -4 | -3 | -2 | 9 | 2 | 0 |
| Y -3 | -1 | 0 | -2 | 2 | 0 | -3 | -2 | 2 | 0 | 0 | -2 | -1 | 3 | -1 | 0 | 1 | 2 | 8 | 0 |
| V 1 | -4 | -2 | -3 | 0 | 0 | -3 | -2 | -1 | 4 | 3 | -3 | 2 | 2 | -1 | -1 | 0 | 0 | 0 | 5 |
A comparação de sequências utilizando a matriz ue consenso anterior envolve a determinação ae todos os alinhamentos possíveis e a subsequente contagem uesses alinhamentos pela matriz. Alinham-se depois auas sequências calculando-se a contagem máxima de combinações a partir da matriz de consenso. Pode-se determinar uma contagem de alinhamentos em unidades de desvio padrão tomando a diferença entre a contagem máxima de combinações e a contagem máxima média de combinações para permutação aleató ria das duas sequências e dividindc-a depois pelo desvio padrão da contagem aleatória.
Para os presentes fins, uma contagem em matrizes de consenso maior do que três desvios padrão (aproximadamente um valor médio de cerca de 3 por resíduo) mostra analogia significativa a um nível de confiança de mais do que 99,7% · Este é um critério restritivo visto que proporciona uma frequência de 0,005 pa67 425
SCRF lC4.0-EPGsll
I . 'JSi?*1*
-43_ ra touos os péptidos de cinco resíduos e 0,0014 para todos os péptidos de 13 resíduos que ocorrem em 2222 sequências ue prcteí nas conhecidas. De modo semelhante, uma contagem em matrizes de consenso maior do que dois desvios padrão (aproximadamente um valor médio de cerca de 2 por resíauos) mostra que a correspondência substancial é significativa a um nível de confiança superior a 95,4%.
Para determinar a correspondência substancial para os fins da presente invenção, a contagem de matrizes de consenso é calculada por verificação do valor aa matriz para cada um dos pares de resíduos aminoácidos alinhados sob consideração, e soman do, a seguir, os valores individuais para cada um desses pares. A soma obtida é depois comparada com o número de desvios padrão que significam 0 nível de confiança desejado. Se a soma obtida é maior do que c produto ao número seleccionado de desvios padrão vezes o número de pares ue resíduos aminoácidos sob consideração, então as sequências de resíduos aminoácidos que estão a ser comparadas correspondem substancialmente,ao nível de confiança indicado.
Por exemplo, para verificar a correspondência substancial das sequências ce resíduos aminoácidos
-Lys-Trp-Phe-Cys-Glye
-Arg-11e-Phe-C y s-Glya matriz de consenso proporciona gs seguintes valores
Valor
| -Lys- & -Arg- | ou | K & R | 5 |
| -Trp- < -Ile- | ou | W h I | 0 |
| -Phe- à -Phe- | ou | F X F | 7 |
| -Cys- & -Cys- | ou | C à C | 7 |
| -Gly- à -Gly- | ou | G & G | 8 |
| Total | 27 |
Para correspondência substancial ao nível de confiança de 99,7%, a contagem em matrizes de consenso tem de exceder o núme ro de pares de resíduos aminoácidos sob consideração vezes 3;
425
SCRF 104.O-EPG:11
-44isto é, 5 x 3 ou 15· Visto que 27 é maior do que 15, a correspondência substancial está na verdade presente para sequências superiores a 2 péptidos.
Para os propósitos da presente invenção a correspondência substancial entre péptidos dentro do âmbito da invenção está pre ferivelmente presente, pelo menos, a um nível de confiança de cerca de 95% e de preferencia, pelo menos, a um nível de confian ça, de cerca de 99%·
Uma sequência de ADN pooe corresponder substancialmente a outra sequência de ADN se ambas as sequências contiverem sequências de 15 bases que estão em fase e são idênticas, ou bases que não são idênticas mas codificam uma sequência idêntica de resíduos aminoácidos, ou codificam sequências de resíduos aminoácidos que correspondem substancialmente umas às outras. Des te modo , as sequências de resíduos aminoácidos que correspondem substancialmente umas às outras são codificadas por sequências de ADN que correspondem substancialmente umas às outras.
Em adição, para os péptidos específicos descritos na tabela 2, atrás, outros péptidos que correspondem em sequência a uma porção da sequência da proteína 540 são também úteis aqui. Uma lista desses péptidos é proporcionada na tabela 4, a seguir.
(segue Tabela 4)
425
SCRF 104.0-EPG:ll
Péptido
Número Resíduos-^·
-45TABELA 4
Pêptidos <*»
Sequência^__________________
1-15
MAKTIAYDEEARRGL
| 2 | 11-25 | A R |
| 3 | 21-35 | A L |
| 4 | 31-45 | G P |
| 5 | 41-55 | K K |
| 6 | 51-65 | D G |
| 7 | 61-75 | L E |
| 8 | 71-85 | E L |
| 9 | 81-95 | D D |
| 10 | 91-105 | A T |
| 11 | 101-115 | E G |
| 12 | 111-125 | N P |
| 13 | 121-135 | K A |
| 14 | 131-145 | L K |
RGLERGLNALADA ADAVKVTLGPKGR KGRNVVLEKKWGA WGAPTITNDGVSI VSIAKEIELEDPY DPYEKIGAELVKE VKEVAKKTDDVAG VAGDGTTTATVLA VLAQALVREGLRN LRNVAAGANPLGL LGLKRGIEKAVEK VEKVTETLLKGAK GAKEVETKEQIAA
EQIAATAAISAGDQS
425
3CBF 1O4.O-EPG:11
141-155
151-165
161-175
AGDQSIGDLIAEAMD
AEAMDKVGNEGVITV
171-185
181-195
191-205
201-215
211-225
219-233
GVITVEESNTFGLQL
FGLQLELTEGMRFDK
231-245
241-255
251-265
261-275
271-285
281-295
291-305
301-315
311-325
MRFDKGYISGYFVTD
YFVTDPERQEAVLED
AVLEDPYILLVSSKV LLVSSKVSTVKDLLP LLPLLEKVIGAGKPL
AGKPLLIIAEDVEGE
DVEGEALSTLVVNKI
VVNKIRGTFKSVAVK SVAVKAPGFGDRRKA DRRKAMLQDMAILTG AILTGGQVISEEVGL EEVGLTLENADLSLL DLSLLGKARKVVVTK
425
SCRF lu4.O-EPG:ll
| 321-335 | V V V T |
| 331-345 | V E G A |
| 341-355 | A G R V |
| 351-365 | I Ε N S |
| 361-375 | Ε K L Q |
| 371-385 | A G G V |
| 3 81-3 95 | A A T E |
| 391-405 | K H R I |
| 401-415 | A K A A |
| 411-425 | A G G G |
| 421-435 | A Ρ T L |
| 431-445 | G D Ε A |
| 441-455 | K V A L |
| 451-465 | I A F N |
| 461-475 | V V A E |
| 471-485 | A G H G |
| 481-495 | V Y E D |
KDETTIVEGAG
GDTDAIAGRVA AQIRQEIENSD DSDYDREKLQE ERLAKLAGGVA AVIKAGAATEV VELKERKHRIE EDAVRNAKAAV VEEGIVAGGGV VTLLQAAPTLD DELKLEGDEAT TGANIVKVALE EAPLKQIAFNS SGLEPGVVAEK KVRNLPAGHGL LNAQTGVYEDL LLAAGVADPVK
425
SCRF 104.0-EPGsll
| 50 | 491-505 | A D |
| 51 | 501-515 | L Q |
| 52 | 511-525 | F L |
| 53 | 521-535 | K P |
| 54 | 526-540 | K A |
| 1,2 Ver Notas 1 | e 2 d: |
PVKVTRSALQNAA NAAS IAGLFLTTE TTEAVVADKPEKE EKEKASVPGGGDM SVPGGGDMGGMDF
a. Tabela 2.
Os péptidos que correspondem substancialmente a porçóes da proteína 517 são de modo semelhante úteis e são definidos como possuindo correspondência substancial, similarmente à dos péptidos descritos atrás. Os péptidos que correspondem substancialmente a uma sequência da proteína 517 podem conter apenas cinco resíduos e são por consequência um pouco mais curtos do que os péptidos mais curtos descritos atrás.
Três péptidos (denominados 55, 56 e 57) e as suas variantes correspondem substancialmente a sequências, escritas da es querda para a direita na direcção do terminal amino para o terminal carboxi e utilizando um código de uma letra, e possuem as fórmulas
55) Ν N N I G,
56) X G Ν Z G, e
57) F NSG3GKIG F(I) G N S G em que X é um resíauo aminoácido seleccionado de entre o grupo que consiste em F, S, T, L, D e T; Z é um resíduo aminoácido seleccionado do grupo que consiste em T, I, L, 3 e V; e o resíauo entre parêntesis pode substituir o resíauo apresentado à sua esquerda na sequência. Deste modo, no péptiao 57, Fel são resíduos alternativos. De preferência, X é seleccionado de entre o grupo que consiste em F, 3 e T; e Z é seleccionado de entre o grupo que consiste em T e I.
425
SCRF 104.0-EPG:ll
.. ..-110
-49Utilizando a matriz de consenso descrita antes para calcular se os pentapéptidos variantes definidos atrás pela sequência de consenso XGMZG correspondem substancialmente uns aos outros, verifica-se que todas essas variantes correspondem substancialmente, pelG menos, a um nível de confiança de 99/· Isto pode ser prontamente verificado pela determinação das maiores diferenças provocadas pelas substituições, calculando depois as con tagens em matrizes de consenso resultantes e comparando esse va lor com 3 vezes o número de resíduos comparados, 5? (3 x 5 = 15) Deste modo, para o resíduo X, a substituição de um resíduo Asp (D) por um resíduo Ile (I) ou de um resíduo Phe (l·1) por um Ser (S) proporciona um valor de -3 a partir da matriz. De modo semelhante para Z, a substituição de Ser (S) por Ile (I) ou de Vai (V) por Ser (3) proporciona um valor de -2 a partir da matriz. Visto que dois resíduos Gly (G) e os resíduos Asn (1T) es tão presentes em qualquer das sequências de pentapéptidos de consenso comparadas anteriormente, a presença desses resíduos proporciona uma contagem de 22 (B-t-6+8-22). A subtracção de cin co /”(-3) + (-2)/7, para as substituições anteriores, de 22 pro porciona uma contagem total de 17 para os pentapéptidos comparados.
Visto que 17 θ maior do que 15, qualquer das substituições anteriores para a sequência de consenso proporciona pentapéptidos que correspondem substancialmente, pelo menos, a ura nível de confiança de 99%. Além do mais, visto que as substituições anteriores provocaram a maior diferença numérica na contagem total, qualquer outra das substituições descritas atrás de X e Z na sequência de consenso produz uma contagem total; isto é, quando X é Thr ou Leu eZ é Thr ou Leu, na sequência de consenso produz-se uma contagem total que é maior do que 17 e consequentemente, todos estes pentapéptidos correspondem também substancialmente uns aos outros, pelo menos, a um nível de confian ça de 99/.
Os péptidos 55 e 56 são tipicamente utilizados como uma entre várias unidades de repetição de um polímero que possui um peso molecular relativamente baixo: isto é, inferior a cerca de 10000 daltons em peso. 0 polímero, ou oligómero mais pequeno,
425
SCRF 1C4.O-EPG:11
----------50contém dois dos 5 resíduos de péptidos (pentapéptidos) ligados em conjunto através de uma ligação peptidica formada entre 0 resíduo do terminal carboxi de uma primeira unidade de repetição de pentapéptiao e o resíauo do terminal amino de uma segunda unidade de repetição de pentapéptido.
Por exemplo, o pépticio 57 anterior pode ser considerado como um polímero ou oligómero que possui duas uniaades de repetição de pentapéptido ligadas em conjunto por uma ligação peptí dica e contendo também quatro resíduos adicionais no terminal amino do oligómero.
Cálculos semelhantes podem também ser realizados para variantes dos outros péptidos descritos aqui como um meio para de terminar se um péptido com uma sequência diferente de uma das outras enumeradas especificamente corresponde substancialmente a um péptido enumerado especificamente ou a uma sua porção. Com 0 propósito das interacções epitopo-paratopo, as sequências que contêm pelo menos cinco resíauos são as sequências mais cur tas que deveriam ser comparadas, visto que, pelo menos, cinco ou seis resíduos parecem ser necessários para a interacção epitopo-paratopo. Veja-se, por exemplo, Elder et al. (1987) J.Virol. ol:8-15; Atassi (1975) Immunochemistry 12:423-438; e Eenjamini et al. (1969) Biochemistry 8:2242-2246.
De modo semelhante, a sequência na forma isolada HNNIGNNNIGITNITIG que está também presente nas posições de nucleótidos 3270 a 3226 da figura 2 pode considerar-se como um trímero polimérico ou oligomérico da sequência do péptido 55· De igual modo, uma for ma isolada da sequência a partir da posição de nucleótido 3210 à posição 3107 pode ser considerada como um polímero ou oligómero que contém oito pentapéptidos XGiTZG repetidos. Cada um dos polímeros ou oligomeros anteriores contém uma pluralidade de unidades de repetição de pentapéptidos ligadas em conjunto por ligações peptídicas.
As técnicas de síntese peptidica de fase sólida como são descritas nas Patentes Americanas citadas atrás cujas descrições estão incorporadas aqui para referência são tipicamente os meios mais úteis de preparação de oligomeros e polímeros contendo um
425
SCRF 104.0-EPG:ll
I total de até cerca de 40 resíduos totais (oito unidades de repe tição pentapeptídicas).
As técnicas de engenharia genética como são descritas aqui são particularmente úteis para preparar polímeros maiores que contêm mais cio que cerca de oito unidades de repetição pentapep tídicas. Por exemplo, uma molécula de ADN de cordão duplo que possui a sequência apresentada na figura 2 a partir da posição de nucleótido 2959 até à posição de nucleótido 33θ3 θ em fase com a sequência de resíduos aminoácidos ilustrados de proteína 517 pode ser excisada a partir da molécula maior apresentada na figura 2 ou sintetizada a partir de uerivados do ácido desoxirribonucleico apropriados utilizando técnicas conhecidas e em se guida ligados a um vector plasmídeo apropriado para expressar um polímero de péptiao que corresponde substancialmente em sequên cia ao polímero que contém as unidades de repetição pentapeptídicas representadas abaixo da sequência, nessas posições, na figura 2.
Os polímeros de peso molecular mais elevado isto é, com pe sos moleculares médios de cerca de 10000 a 1000000 ou mais, con tendo uma ou mais das unidades de repetição pentapeptídicas anteriores podem também ser preparados polimerizando oxidativamen te, um polipéptido que contém pentapéptidos e possui adicionalmente uma unidade de repetição pentapeptídica terminada por resíduos de cisteína (Cys;C) ou um polipéptido terminado por diCys. 0 polímero resultante contendo unidades de repetição pen tapeptídicas contém, deste modo, as suas unidades de repetição ligadas em conjunto por ligações de dissulfeto de cisteína oxidada (cistina).
Por exemplo, cada um dos pentapéptidos descritos atrás pode ser sintetizado para conter um resíuuo Cys adicional em cada um dos terminais arnino- e carboxi para proporcionar polipéptidos terminados diCys nas suas formas reduzidas. Após síntese, numa preparação laboratorial típica, dissolvem-se 10 miligramas do polipéptido diCys (contendo resíauos de cisteína numa forma não oxidada) em 250 mililitros (ml) de tampão de bicarbonato de amónio 0,1 molar (Iví). 0 polipéptido terminado por diCys dissolvido é depois oxidado ao ar por agitação suave da solução resul67 425
SCRF 1O4.O-EPG:11
-52tante durante um período de cerca de 18 horas ao ar, ou até que não se detecte mercaptano livre pelo teste de Ellman. /“Veja-se Ellman, Arch, Biochem. Biophys., 82:70-77 (1959). 1· polímero assim preparado contém urna pluralidade de unidades de repetição sintéticas de polipéptidos de copolímeros alea térios que são ligadas em conjunto por oxidação cios resíduos de cisteína (cistina). Esses polímeros contêm tipicamente as suas unioaaes ae repetição pclipeptíâicas ligaaas em conjunto ua for ma cabeça à caucia bem como cabeça a cabeça e cauda a cauda isto é o terminal amino das auas unidades de repetição polipeptídicas pode ser ligado em conjunto através de um resíauo de cistina simples assim como o pouem ciois terminais carboxilo vis to que os grupos de ligação em ambos os terminais polipeptídiccs são idênticos.
Certamente, a unidade de repetição pentapeptíaica pode, ela própria, estar contida sob a forma ae um oligómero contendo até cerca de oito unidades de repetição pentapeptídicas ou num péptido mais curto tal corno o péptido 5/ com .14 resíduos. Além disso, pode também ser polimerizado um polipéptido preparado por engenharia genética, tal como o preparado a partir de uma sequên cia de ADN de nucleotidos nas posições 2959 a 3303 que inclui codãos para Cys (TGT ou TGC) nas extremidades 5’ ©3'· peso molecular desse polímero pode ser controlado através da adição de reagentes ae terminação de cadeia. Exemplos de reagentes de terminação de caceia são a própria cisteína e um péptido tal como um pentapeptiao descrito atrás que inclui ainda um resíduo Cys simples, de preferência num terminal.
Os nomes completos para resíduos aminoácidos individuais são algumas vezes utilizados aqui como abreviaturas de três letras, bem conhecidas. As abreviaturas de uma letra (código) são também utilizadas. A tabela de correspondência a seguir, proporciona o nome completo bem como as abreviaturas de três le tras e de uma letra para cada resíduo aminoáciáo designado. (Veja-se, por exemplo, L.Stryer, Biochemistry, 2^ ed., W.H. Freeman and Company, San Francisco, (1981), página 16). Os resíduos aminoácidos utilizados aqui estão na forma natural, L, a menos que se estabeleça de outro modo.
425
SCRF 104.0-EPG:ll
Tabela de Correspondência
| Aminoácido | Abreviatura de três letras | Símbolo de uma letra |
| Alanina | Ala | A |
| Arginina | Arg | R |
| Asparagina | Asn | N |
| Acido aspártico | Asp | D |
| Asparagina ou ácido | aspártico Asx | B |
| Cisteína | Cys | C |
| Glutamina | Gin | Q |
| Acide glutâmico | Glu | E |
| Glicina | Gly | G |
| Histidina | His | H |
| Isoleucina | Ile | I |
| Leucina | Leu | L |
| Lisina | Lys | K |
| Metionina | Met | M |
| Fenilalanina | Phe | F |
| Prolina | Pro | P |
| Serina | Ser | □ |
| Treonir.a | Thr | T |
| Triptofano | Trp | w |
| Tirosina | Tyr | Y |
| Valina | Vai | V |
III. Materiais e Métodos
A. Bactérias, Fagos e Plasmídeos
As estirpes de E.coli utilizauas neste trabalho foram BNN97 /Young et al., (1983) Science, 222:778-782; ATCC 37194^7; JM83 /“Yanisch-Perron et al., (1985), Gene, 33:103-119; também ATCC 35607/7; JM101 /“Yanisch-Perron et al., (19θ5), Gene, 33:103-119; também ATCC 33876.7; YIO89 /Young et al., (1983), Science, 222:778-782; tamb'm ATCC 37196_7; e Y1090 /“Young et al.,
42?
SCRF 104.0-SPG:ll
-?4(1983), Science, 222:778-782; também ATCC 37197_7. Os plasmídeos pUC19 /Yanisch-Perron et al. , (198?), Gene, 33'· 103-119 7 e ρΜΟ1871 /“Shapira et al. , (1983), Gene, 25:71-82^7 foram adquiridos em pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, NJ. A biblio teca de ADN recombinante de fragmentos de ADN genómico de M.tubérculo sis no vector gtll foi construída por R. Young et al. (198?), Proc. Natl. Acad. Sei. USA 82:2?83-2?87, e tornada disponível através do Programa de Investigação de Imunologia da Tuberculose da Organização Mundial de Saúde. Os fagos recombinantes ÀRY3143 e /RY3146 foram generosamente proporcionados por R.A. Young /~Whitehead Institute, M.I.T.; Young et al., (198?), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 82:2?83-2?87__7· Os subclones das inserções de ADN micobacteriano nestes fagos recombinantes foran construídos nos vectores pUC19 ou M13mP9 /'Messing et al. ,(1982) Gene, 19:269-276; o M13mp9 foi incluído no catálogo ue Agosto de 1983 de Bethesda Research Laboratories, Inc.J7 utilizando técnicas de ADN recombinante padrão /“Kaniatis et al., (1982), Molecular Cloning - a laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, UY_7.
B. Anti-soros
Os anticorpos monoclonais específicos para, o antigénio de 6? KD foram obtidos no Immunology of Tuberculosas Scientific Working Group sob o auxílio de WHO/World Bank/UNDP Special Program for Vaccine Development. Estes anticorpos incluíam IT-13 /“WTB-78; Coates et al. , (1981), Dane et, 2:167-169^7; T. Buchanon, não publicado_7e IT-33 /MLIIH9; Gillis et al., (1982), Infect. Immun., 37:172-173_7. Os anticorpos anti-beta-galactosidase foram adquiridos em Cooperbiomedical, Malvern, PA. Os anti-soros policlonais de coelho dirigidos contra um sonicado (porção tratada por meio/Òndas de sons de elevadas frequências) da estirpe H37RV de II.tuberculosis foram induzidos como foi já descrito /“hinden et al., (1984), Infect. Immun., 46:?19-?20 7
C· Imuno-Análise de Biblioteca de Xgtll-M.tuberculosis
Os clones reactivos aos anticorpos monoclonais específicos
425
SCRF 104.O-EPG:11
.......«-í**
-55- r para o antigénio de 65 KD foram isolados essencialmente como descreveu Young et al /“Young et al., Proc. Datl. Acad. Sci.USA 82:2583-2587^7. Em resumo, para cada um dos pratos LB de 150mm 0,6 ml de uma cultura de células Y1090 preparada de fresco duran te a noite foram infectadas com 1-2x10·? unidades de formação de placas (pfu) da biblioteca. Após 3,5-4 horas de desenvolvimento a 42°C, as placas foram revestidas com um filtro de nitrocelulose seca que tinha sido saturado com isopropil-beta-D-tiogalactopiranósido 10 milimolar (mM) (IPTG; disponível de Sigma Chemical Co.). Os pratos foram incubados durante mais 3,5-4 horas a 37°C e depois removidos à temperatura ambiente sendo marcada a posição dos filtros.
Lavaram-se os filtros, rapidamente, em TBST (Tris-HCl 50mM pH=8, NaCl 150 mM, 0,05% de Tween 20 /“polioxietileno (20) monolaurato de sorbitancJ7 e depois incubaram-se em TBST mais 20% de soro de vitelo fetal. Após 30 minutos à temperatura ambiente, os filtros foram transferiaos para TBST mais anticorpo.
Para a análise inicial, a mistura de anticorpos continha uma diluição de 1:1000 da mistura IT-lj, IT-31 e IT-33· Os filtros foram incubados com a solução de anticorpo durante a noite a 4°C com agitação suave, lavados em TBST e feitos reagir com imunoglobulina de cabra anti-ratinho, biotinilada, com o reagente e com o agente de revelação Vectastain ABC (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Após se ter revelado a cor, os filtros foram lavados com várias mudanças de água e ar seco.
Cs fagos que correspondem aos sinais positivos foram purificados duas vezes em placa. Para determinar quais os anticorpos monoclonais que reagiram com que fagos recombinantes, inocularam-se cerca de 100 pfu de um caldo de fagos purificado numa pequena mancha sobre uma porção de Y1090 de E,coli num prato LB (caldo de Luria-Bertani). Deixaram-se os fagos crescer e induziram-se para sintetizar as proteínas estranhas como se descreveu atrás. Os filtros foram depois reagidos com uma diluição 1:1060 de um dos anticorpos monoclonais. Cs passos subsequentes foram os mesmos que os da análise inicial.
425
SCRF 104.0-EPG:ll
......... \ ..... 4'.....
-56D. Ensaios por Western Blot
As células que contêm fagos ou plasmídeos nas quais a expressão das sequências estranhas estava sob controlo das sequên cias reguladoras do gene lac de E.coli foram induzidas para sin tetizar as proteínas estranhas por incubação das células na pre sença de IPTG 2,5 πώΐ durante 2 horas. Os lisados brutos de células, que expressam recombinantes de ^gtll foram preparados como se descreve em Huynh et al; (1985), DNA Cloning Thechniques: :A Praticai; Gover, ed. IRL Press, Oxford, Vol. I, pag 49-7θ. Em resumo esses lisados foram preparados por recolha de células de culturas feitas durante a noite e por re-suspensão de células em tris 10 mlá pH=7,5, EDTA 10 mlí contendo 100 pg de lisozima/ml. Após 10 minutos à temperatura ambiente, adicionou-Se dodecil sulfato de sódio (SDS) até uma concentração final de 0,5%. Adicionou-se um inibidor de protease (Trasylol, Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN) a todos os lisados brutos ate uma concentração final compreendida entre 0,03% “ 0,3%.
As preparações de proteína brutas foram submetidas a electrofcrese sobre 10% em geles de Laemmli SDS-poliacrilamida /*~Lasn mli, (1970) Fature, 227:680-685 7 ® as proteínas separadas electroforeticamente transferidas para nitrocelulose /~Towbin et al., (1979), Proc. Natl. Acad. Sei USA, 76:4350-4354 7. As proteínas imobilizadas reagiram com uma diluição 1:1000 de anticorpo monoclonal IT-13 em TBST, durante a noite, a 4°C. Os filtros de nitrocelulose foram depois lavados, reagidos com imunoglobulina de cabra anti-ratinho conjugada com peroxidase e desenvolvidos como se descreveu anteriormente /“Niman et al., (1983), Proc. Natl. Acad. Sei.USA, 80:4949-4953^7.
E. SequenciaçS.0 de ácido nucleico
As sequências dos fragmentos de restrição marcados da extre midade 5' 6o ADN micobacteriano foram determinadas por uma modificação da técnica de degradação química parcial de Maxam e Gilbert /“Brow et al., (1985), Mol. Biol. Evol., 2:1-12; e Maxam et al., (1976), Proc. Natl.Acad. Sei. USA, 74:560-564_7. Para
425
SCRF 104.0-EPG:ll
os estudos úe sequenciação de M13/didesoxi os fragmentos Sau3AI das insersões de ADN micobacterianas foram subclonados no local BamHI de M13mp9. ϋ ADN do fago foi isolado a partir dos recombinantes M13 e submetido a reacções de sequenciação de terminação de cadeia didesoxi /“Biggin et al., (1983), rroc. Natl. Acad Sei. USA, 80:3963“3965j e Sanger et al., (1980), J. Mol. Biol., 143:161-I78 7. Os proQUtos das reacções de sequenciação foram submetidos a electroforese em acrilamida a 6^/ureia 711/geles de sequenciação de gradiente Ο,5~2,5χΤΒΕ /“Biggin, (19θ3), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 80:39Ó3-39ó5_7·
Os geles foram secos sob vácuo e expostos ao filme XRP-1 da Kodak. As sequências de nucleótidos foram determinadas independentemente para ambos os cordões do ADN micobacteriano.
As análises com o auxílio do computador das sequências de ácido nucleico e das sequências de proteínas deduzidas foram realizadas utilizando as bases de dados e os programas fornecidos por Nucleic Acid and Protein Identification Resources of the National Institutes of Health bem como os programas de Chow et al., (197θ) Aav. Enzym., 47:45-148 e Hopp e Woods /Hopp et ai·, (1981), Proc. Natl. Acad. Sei. USA, 78: 3θ24-3δ28_7.
F. Ensaios de beta-galactosidase
Fizeram-se crescer as células em caldo B ou em caldo B mais IPTG 2,5 ιώνΐ para uma densidade óptica de 6C0 nanómetros (ΟΟζθθ) de cerca de 0,3. Os lisados brutos foram preparados e testou-se a actividade da beta-galactosidase como uescreveu Miller (1972), Experiments ín Molecular Genetics, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.
G. Capacidade dos recombinantes para induzir DCH
1· Ensaios de DCH
Os estudos foram realizados para determinar se as proteínas recombinantes ou os derivados de proteínas purificados (PPd) (Ccn naught Laboratories, Ltd, Willowdale, Canada) poderiam induzir reacções DCH em porquinhos-da-India Hartley que tinham sido imu
425
SCRF 104.0-EPG:U
-58- ~ nizados com. sonicados M.tubérculosis e LI. bovis, ou com solução salina. Cs grupos dos porquinhos-da-índia foram injectados por via intramuscular três vezes por semana com sonicados, suspensos utilizando-se adjuvante de Freund incompleto (IFA) como diluente fisiologicamente tolerável. Cada injecção continha ip miligrama (mg) de proteína. Alguns animais receberam uma quarta injecção de forma que uma semana após a injecção final, todos os animais foram testados por via intradérmica (i.d.). Os antígenios do teste incluíram os extractos de recombinantes brutos e parcialmente purificados bem como solução salina e PPd como controlo. Os antigénios do teste foram utilizados a 1-10 jug diluídos em 100 pl de solução salina tamponada com fosfato a um valor de pH de 7,0 (PBS) contendo 0,0005$ de Tween 20 como diluente fisiologicamente tolerável. Os grupos ae porquinhos-da-índia não imunizados foram testados de modo semelhante. Todas as injecções i.d. foram administradas em áreas barbeadas nos flancos dos porquinhos-da-índia. As reacções foram verificadas ao fim de 24,48 e 72 horas e foram consiueradas positivas quando os diâmetros de eritema e as áreas induradas excederam 10 mm.
2. Preparação de lisados brutos
Fizeram-se crescer Ξ.coli contendo, um plasmídeo ou um fago lambda de interesse por incubação a 37°C, com arejamento, em caldo B para a última fase em que a absorvância a 600 nanómetxos (A&qq) escava entre aproximadamente 0,4 e 0,6. Adicionou-se de pois IPTG até uma concentração final de 10 mM e as bactérias foram ainda incubadas durante duas horas.
A cultura bacteriana foi depois arrefecida em gelo durante 10 minutos e as células foram colhidas por centrifugação a 6000 rpm durante 10 minutos. A pelota celular resultante foi lavada uma vez em TBS Tris (50 mM), pH 8, NaCl (150mi'I) por ressuspensão e re-centrifugação e foi em seguida ressuspensa (Sigma Chemical Co., St. Louis, M0) num volume de TBS com sacarose 0,5 molar equivalente a 1/10 do volume da cultura original. A lisozima foi adicionada à solução ressuspensa resultante até uma concentração final de 50 jig/ml e essa msitura foi incubada durn
425
SCRF 104.0-EPGíll
t. * ,
-59te 10 minutos a 37°C. As células foram colhidas por centrifugação e foram ressuspensas num volume igual de TBS. Em seguida, adicionaram-se ADNse, Trasylol e SDS (Sigma) à mistura resultante de tal modo que as concentrações finais fossem de 1 p.g/ml, 0,1 e 1/ respectivamente. Essa mistura foi ainda incubada à temperatura ambiente durante um período de tempo de 10 minutos com mistura periódica para se completar a lise da célula. 0 lisado bruto resultante foi armazenado a -20°C até à utilização.
3. Purificação Parcial da Proteína de 65 KD expressa
As proteínas que contêm antigénios de 65 KD foram parcialmente purificadas a partir de lisados brutos de E.coli expressando essa proteína por precipitação diferencial com sulfato de amónio. Para esse fim, um lisado bruto foi primeiro combinado com uma solução de sulfato de amónio saturado (SAS) para propor cionar uma concentração final de 36% da concentração do lisado original. A precipitação foi efectuada do iaodo conhecido na arte e a porção sobrenadante resultante foi retirada. A porção sobrenadante foi depois combinada com SAS para proporcionar uma concentração de 5θ/ da concentração do lisado original e efectuou-se novamente a precipitação. A pelota resultante foi retirada, ressuspensa em PBS e submetida a aiálise contra PBS. Este material submetido a diálise resultante é referido como parcialmente purificado.
4. Preparação de Extractos de Xtuberculosis
A estirpe H37B.V de Li.tubérculos!s foi obtida a partir da colecção de culturas ao National Jewish Hospital ® ao Research Center, Denver, CC, e feita crescer como descrito/“Minaen et aL, (1972) Science, 176:57~5θ e Líinden et al., (1972) Infect. Immun., 6:574-532^7.
As bactérias foram mortas por calor e quebradas por tratamento com ondas de som de elevada frequência até que, por exame microscópico, mais de 95/ das células foram rompidas. Estas bactérias rompidas foram depois submetidas a ultracentrifugação
425
SCRF 104.0-SPG:ll
-6oa 200000 x g durante um período de tempo de 2 horas e a porção sobrenadante foi separada. A porção sobrenadante assim obtida, é designada por BCG-S e as suas características antigénicas e biológicas foram descritas em Baker et al. , (1976) Infect. Immun., 14:83-87·
A presente invenção foi descrita com referência a formas de realização preferidas. Será evidente para os peritos da téc nica, que podem ser feitas modificações e/ou variações na matéria da descrição sem se afastarem do âmbito da invenção.
Claims (27)
- - R E I V IN D I C A Ç 8 E S le. - Vector plasmídeo compreendendo um replicão ligado operativamente a uma sequência de ADN estranho que corresponde substancialmente a uma molécula de ADN isolada a qual consiste essencialmente numa sequência nucleótida que, da direita para a esquerda e da extremidade 5’ para a extremidade 3', é representada pela fórmula5’ TCGAACGACGCGCGTCACCCGGTGCGGGGCTTCTTGCACTCGGCATACGCCAGTCCTAAC3’ AGCTTGCKCCCGCACTGGGCCACCCCCCGAAGAACGTGAGCCGTATCCGCTCACCATTC10 20 30 40 5060AATAACGTTCGCACTCCCCACCCGTGAGTCCTACGTCGGCACGGTCACGCCACGCCCGTC TTATTGCAACCGTGAGCGCTGCCCACTCACGATCCAGCCCTGCCACTCCGGTCCGGGCAG70 60 90 100 110120GTCGCAGCGACTGGCAGCGAGGACAACTTGAGCCGTCCGTCGCGGGCACTGCGCCCGGCCCAGCGTCGCTCACCGTCGCTCCTGTTGAACTCGGCAGGCAGCGCCCGTGACGCGGGCCGG130 140 150 160 170160AGCGTAAGTAGCGGGGTTGCCCTCACCCCGTGACCCCCGTTTCATCCCCCATCCCGAGCATCGCATTCATCGCCCCAACGGCAGTGGGCCACTGGGGGCAAAGTAGGCGCTAGGCCTCCT190 200 210 220 230240MAKTIAYDEEARRGLEATCACTTCGCAATGGCCAAGACAATTGCGTACGACGAAGAGGCCCGTCGCGGCCTCGAGC tagtgaagcgttaccggttctgttaacgcatgctgcttctccgggcagcgccggagctcg 250 260 270 2Θ0 290300RGLNALADAVKVTLGPKGRNGGCGCTTGAACGCCCTCGCCGATGCGGTAAAGGTCACATTGGGCCCCAAGGGCCGCAACGCCCCGAAC1TGCGGGAGCGGCTACGCCATTTCCACTGTAACCCGGGGTTCCCGGCGTTGC310 320 330 340 350360VV LEKKWGAPTTTNDGVSTA tcgtcctggaaaagaagtggggtgcccccaccatcaccaacgatggtgtgtccatcccca AGCAGGACCTTTTCTTCACCCCACGGGGGTGCTAGTGGTTGCTACCACACAGGTAGCGGT370 300 390 400 41042067 425SCRF 104.0-EPG:ll-62KEIELEDPYEXTGAELVKEVACCACATCGAGCTGCAGCATCCCTACGACAAGATCGGCGCCGAGCTGCTCAAAGAGGTAG TCCTCTAGCTCGACCTCCTAGGCATGCTCTTCTAGCCGCGGCTCGACCAGTTTCTCCATC430 440 450 460 470480AKKTDDVAGDGTTTATVLAQCCAAGAAGACCCATGACGTCGCCGGTGACGGCACCACGACGGCCACCGTCCTCCCCCAGG CGTTCTTCTGCCTACTGCAGCGGCCACTGCCGTGGTGCTGCCGGTGGCACGACCGGGTCC490 500 &10 520 530540 alvreglrnvaaganplglk cgttggttcgccaccgcctgcgcaacctcgccccccgcgccaacccgctccgtctcaaac gcaaccaagcgctcccggacgcgttgcagcgccggccgcggttgggcgagccagagtttg550 580 570 5Θ0 590800RGIEKAVEKVTETLLKGAKEGCCGCATCGAAAAGGCCGfGCAGAAGGTCACCGAGACCCTGCTCAAGGGCGCCAAGGAGG CGCCGTAGCTTTTCCGGCACCTCTTCCAGTGGCTCTGGGACGAGTTCCCGCGGTTCCTCC 610 620 630 640 650660VETKEQIAATAAISAGDQSI tccagaccaagcagcagattgcggccaccccagcgatttcggcgcgtcaccagtccatcg AGCTCTGGTTCCTCGTCTAACGCCGGTGGCGTCGCTAAAGCCGCCCACTGGTCAGGTAGC 670 6Θ0 690 700 710 720 gdliaeamdkvgnegvitveGTGACCTGATCGCCGACGCGATCGACAAGGTGGGCAACGAGGGCGTCATCACCGTCGAGG CACTGGACTAGCGGCTCCGCTACCTGTTCCACCCGTTGCTCCCGCAGTAGTGGCAGCTCC 730 740 750 760 770 700ESNTFGLQLELTEGMRFOKGAGTCCAACACCTTTGGGCTGCAGCTCGAGCTCACCGAGGGTATGCGGTTCGACAAGGGCT TCAGGTTGTGGAAACCCGACGTCGAGCTCGAGTGGCTCCCATACGCCAAGCTGTTCCCGA 790 000 Θ10 820 830 840YISCYFVTDPERQEAVLEDP ACATCTCGGGGTACTTCGTGACCGACCCCCAGCCTCAGGAGGCGGTCCTGCAGGACCCCT TGTAGAGCCCCATGAAGCACTCGCTGGGCCTCGCAGTCCrCCGCCAGGACCTCCTGGGCA 850 860 870 800 890 90067 425SCRF 104.0-EPG:11-63síf”YILLVSSKVSTVKDLLPLLEACATCCTCCTCGTCACCTCCAAGCTGTCCACTGTCAAGGATCTGCTCCCGCTGCTCCAGA TGTAGGACGACCAGTCGAGGTTCCACAGGTGACAGTTCCTAGACGACGGCGACGAGCTCT 910 920 930 940 950960 kvigackplliiaedveceaAGGTCATCGGAGCCGGTAACCCGCTGCTCATCATCCCCGAGGACCTCGAGGGCCAGGCGC tccagtagcctcgcccattcggcgacgactagtagcggctcctgcagctcccgctccgcg970 9Θ0 990 1000 10101020LSTLVVNKIRCTFKSVAVKATCTCCACCCTCGTCGTCAACAAGATCCGCCCCACCTTCAAGTCCGTGCCGGTCAAGGCTC ACAGGTGGGACCAGCACTTGTTCTAGGCGCCGTGGAAGTTCAGCCACCGCCAGTTCCGAG 1030 1040 1050 1060 10701080PGFGDRRKAMLQDMAILT CG ccggcikccccaccgccgcaaggcgatgctgcacgatatggccatktcacccgtcgtc ggccgaagccgctggcggcgtkcgctacgacgtcctataccggtaagagtcgccaccag 1090 1100 1110 1120 1130 H<0 qVlSEEVGlTlENADLSLlCACGTCATCAGCGAACACGTCGGCCTCACCCTGCACAACCCCCACCTGTCCCTCCTACCCA TCCACTAGTCGCTfCKCAGCCGGACTGCCACCTCTIGCGGCTGGACAGCGACCATCCGT 1150 1100 1170 11Θ0 1190 1200KARKVVVTKOETTIVEGAGDACGCCCCCAACCTCGTCGTCACCAAGCACCACACCACCATCCTCCAGGGCCCCCGTGACA KCCGGCGTTCCAGCACCAGTGGTKCTGCKTCGTGGTAGCAGCTCCCGCGGCCAC fgt 1210 1220 1230 1240 1250 1200TDAIACRVAqiWQETENSDS CCGACGCCATCCCCCGACGAGTCCCCCAGATCCCCCACGACATCCAGAACAGCGACTCCG GGCICCGGTAGCGGCCTGCTCACCGGGK TAGGCGGTCC TC TAGC TC 1TGTCGCTGAGGC 1270 1200 1290 1300 1310 1320OYDREKiqERLAKLACGVAV actaccaccgtgacaagctccaggagcggctggccaagctgccccgtcgtctcccgctca TGAlGCTGGCACTCTTCGACGTCCTCGCCGACCCGTTCGACCGGCCACCACAGCGCCACT 1330 1340 1350 1360 >370 130067 425SCRF 104.0-EPG:ll t, ι-64TKACAATEVELKERKMRÍEDTCAACCCCCGTGCCGCCACCCACGTCCAACTCAAGCAGCGCAACCACCCCAKCAGCATG AGTTCCGGCCACGGCGGTGGCKCAGCTTGAQTTCCTCGCGTTCGTGGCGrAGCrccrAC 1390 1400 1410 1420 1430 1440AVRNAKAAVEEGIVACCCVTCGGTKGCAATGCCAAGCCCCCCCTCCACCACCGCATCGTCCCCCCTGGGGGTGTCACCC GCCAAGCGTTACGGTTCCGCCGGCACCTCCTCCCGTAGCAGCGGCCACCCCCACACTGCG 1450 1460 1470 1460 1490 1500LLQAAPTLDELKI.ECDEATG tgttccaagccccccccaccctccaccagctcaagctcgaacgccaccagcccacccccc ACAACGTTCGCCGGGGCTGGGACCTGCTCGACTTCGAGCTTCCGCTGCTCCGCTCGCCCC 1610 1520 1530 1640 1550 1560 anivkvaieaplkqiafnsc ccaacatcctcaaggtggcgctgcacccccccctcaaccacatccccttcaactccggcc cgttgtagcactkcaccgcgacctccgggccgacttcgtctaccccaagttgagccccc 1570 1560 1590 1600 1010 1020LEPCVVAEKVRNLPACHCINTCGACCCGCGCGTCCTCCCCGACAACGTCCGCAACCTCCCCGCTCGCCACCGACTCAACG ACCfCCGCCCGCACCACCGGCTCTTCCACCCGTTGGACGGCCGACCGGTGCCIGACnGC 1630 1040 1050 1660 1670 1660IAQTGVYEDLLAACVADPVKV tTCACACCGGTGTCTACGAGGAKTCCTCCCTCCCCGCGTTCCTGACCCCCTCAACGTCAGAGTCTGGCCACAGATGCTCCTAGACGAGCGACGGCCGCAACCACTGGGCCAGTTCCACT1690 1700 1710 1720 1730 1740TRSALQMAASIACLFLTTEACCCCTTCGCCCCTCCACAATCCCCCCTCCATCCCCCCCCTCTTCCTCACCACCCACCCCC GGGCAAGCCGCGACGKTTACGCCGCAGGTAGCGCCCCGACAAGCACTGCTGCCTCCGGC 1750 1760 1770 1760 1790 180067 425SCRF 104.0-KPG:llVVADKPEKEKASVPGGGDMCTCCTTCCCCACAACCCCGAAAACGACAACGCTTCCCTTCCCGGTCCCCGCCACATCCGTC AGCAACGGCTGTTCGGCCTTTTCCTCTTCCGAAGGCAAGCGCCACCGCCGCTGTACCCAC 1010 1820 1830 1840 18501800G M 0 F ·GCATCCATTTCTGACCCCCCCCACAACTCCCACCCACCACCCCCGTCCCTTTCTCCCCCCCGTACCTAAAGACTGGGGCCGCTCTTCACCCTCGCTCCTCGGGCCAGGGAAACACCCCGG1870 1000 1890 1900 19101920CCGCKCTCTGGTTCCCAGCTACGCTACCGACAACACCACGCACTCGTCTACGCAACCTTCCCGAGGAGACCAAÇCCTCGATGCCATCCCTCTTGTGGTGCGTCACCACATCCGTTGGAA1930 1940 1950 1960 197019H0TGCCCCCTGTGCGCCAGTCGCCGGCCGCGTCTCCGTGCACCACCGCGCCCATCCCTACGAACCGGCGACACCCGCTCAGCCCCCGGCGCAGAGCCACGTCGTCGCGCGCCiacccatgcΓ1990 2000 2010 2020 20302040 caccgcagccggccgtctcctcatcggcgcctccgtcccacccctgggcacgcccctcca gtggcgkccccgccacagcagtagccccggacgcagcctgcggacccctcccgccagcf 2050 20G0 2070 2080 20902100CCATCAGCGAGTAGCCCCTAGCATCGGATCGCCGCCACAACAGGGTCACTTCGCTGCGCr GCTAGTCGCTCATCGGCGATCCTAGCCTACCGCCGGTGTTGTCCCACIGAAGCGACGCCA .2110 2120 2130 2140 21502160CGGCCAGGTTTTGCCGCGTACGACCCCCGATCAGCCCCACGTCGACCACTCCCCCGCGTC CCCGGTCCAAAACGGCGCATGCTGGGGGCTAGTCCCGCTGCAGCTCGTGACCGGCCCCAG 2170 2180 2190 2200 22102220CATCCCCGCCCTCCCGCAGTTCCCCCACCACCGCCTCCACTCCCACCCTCTCCACCCGATGTAGCCCCCGCAGCCCCTCAAGCGCGTCGTGCCCGAGCTGACGGTCGCACACGTGCGCTA
2230 2240 2250 2260 2270 2280 2290 2300 2310 2320 2330 2340 GCCCATCATCGACCGTGATCAGGTAAGCGAACGCGTAGTCCGCCAAGGCGGCCGCCAGCC CCGGTAGTAGCTGCCACTAGTCCATTCGCTTGCCCATCAGCCCGTTCCGCCGCCCGTCGG67 425SCRF 104.0-EPG:ll2350 2360 2370 2380 2390 2400CTTTCAGGTCTACCTTTfTGGCACCCACGCATTCCAGGATACCCCCCCGATCTGTTACTCCAAACTCCAGATGGAAAAACCGTGGCTGCCTAAGCTCCTATCCGCCGGCTACACAATGAG-662410 2420 2430 2440 2460 2460CCAACCCACCCCCTCCCCCATCCGCCGCCTCCCCTACGCGGATTCCCCGrCCCCCCTCGG CCTTGGCTGGCCGACGGGCTAGGCGCCCGACCGCATCCGCCTAAGCGCCAGCCCCGACCC SGVPQGIRPSAYASEROPSP • E2470 2480 2490 2600 25102520GTAGAAGrTCCACTTCGGGATCCCCCAGCCCCCCGTACTCCGCTCACGCACGGCCGTAfΓ CATCTTCAAGCTGAACCCCTACGCCCTCCGCCCCCATGAGCCGAGTGCGTGCCGCCAIAA YFNSKPIGSGPTSPERVATH2530 2540 2550 2560 26702580 ccgcaagccccactcgttgctgcccgagttgacgaagctccgctagctcgtgccagggct CGCG1TCGGGCTCACCAACGACGGCC1CAACTGCHCGAGCCCATCGACCACGGTCCCGA RLGSDNSGSNVFSPYSTGPS2590 2800 2810 2820 26302840 tctaaggcccccgtttgcgcccgagccagccccggcac tgccgctaccggggttccggt t agattccgggcccaaacccgggctcgctcggcgccgtgacggcgaicgccccaagcccaa rlgpnagsgaaasgsgpnpn2850 2860 2870 2680 28902700 gcctgagtccacgccgccaacaggagcactgccccgggcggccacgggcgtgttcgkag ccgackaggtccggcggttgtcctcgtgaccggccccgcccctgcccgcacaaccagtc GSDLGGVPASAPAAVPTNTL2710 2720 2730 2740 27502780GCCCCAGTTGACCACGTTCGCCACGCCGrGTTCGACACCGCCCGTTGATCCGACCGCCGA CGGGCTCAACTCCTGCAAGCGGTCCGGCACAACCTCTGGCGGGCAACTAGGCTCCCGCCT GSNLVNALGHQLGGTSGLAS2770 2780 2790 2800 2810?820CCCCACCATGCCCCAAÇtcaaacccgccgtgctcatgcccccggtgccgtagcccccgga CCGCTCC1ACGGGCTTGACTTTCGGCGGCACCAGTACCGCGGCCACCGCATCGGCCCCCT Al. JGSSLAATSMGCTAYGAS67 425SCRF 104.0-EPG:ll2830 2840 2850 2880 28702880 gctgaccaaggccccctccgacccacccgcgcttcctaacgcggcgttttccatccccgc CGACTGCTTCCGGCGGAGGCTCGGTCGGCGCGAAGGATKCCCCGCAAAACGTAGGGGCC svlaaesgaasclaanqmga2890 2900 2910 2920 29302940CTTCCACAAGCTCGTGTTGACGCTGCCTGCCCTGCCGAGGCCCCCGTIGATTGTCCCCGA CAAGGTCTrCGACCACAACTCCGACGGACCCGACGGCTCCCGGCGCAACTAACAGGGGCT mwfstnlsgasglganitgs2960 2900 2970 2980 29903000CGTCCCCATGCCCCTCTTCAGCGACCCCGAATTCCCGATCCCCATGT T1CCCCTGCCGGA CCAGGGCTACGGCGACAAGTCCCTCGGGCTTAAGGGCTACGGCTACAAAGGCGACCGCCT TGIGSNLSGSNGIGINGSGS3010 3020 3030 3040 3050 3060 CTTCAATAAGCCCACGTTGCCGGTCCCCGAGTTCCCGAACCCCATCTTGCCGCTACCCGA CAACTTATTCGGCTGCAACGGCCACCGGCTCAAGGGCTTCGGCTACAACGGCGATGGGCT nflgvngtgsngfgingsgs3070 3080 3090 3100 3110 3120 gttgaagccgccgaaacccatctcgtcatcacccgtgatccccaacccgatattcccgct caacttcggcggctttgggtacaccactagtggccactagggcttgggctataagggcga NFGGFGMQHDGTIGFG1NGS .----T 3130 3140 3150 3160 3170 3180ACCCGTGTTGCCGAACCCGATATTCCCGTCCCCCAGGTTGCCCAGGCCCAGGTTCCCGCT iGGCCACAACGGCTTCGGCTATAAGGGCAGCGGCTCCAACGGCTCCGGGTCCAACGGCGA GTnGFG1NGDGLNGLGLNGS3190 3200 3210 3220 3230 3240GCCCGTCTTGCCCCTGCCGATGTTCCCGGTCCCCGTGTTGCCGCTGCCGATGTTGTTGTT CGGCCACAACGGCGACGGCTACAACGGCCACGGCCACAACGGCGACGGCtacaacaacaa GTNGSGINGTGTNGSGINNN3250 3260 3270 3280 3290 3300CCCGATGTTGTTGTTGCCCATGTTGTTGTTGCCCATGTTGCCGCTCCCGGTGTTCCCGAA CGGCTAÇAACAACAACGGCTACAACAACAACGGCTACAACGGCGACCGCCACAACGGCTT G INNNG I NNNG I NGS GTNGF67 425SCRF 104.0-EPG:ll-683310 3320 3330 3340 33503300CCCCAGATTGATCTCCCCGTTCTTCCCGATGTCCATGCCCACCTTCCGCAACACCTGCTG CGGGTCTAACTAGACCGGCAAGAACGCCTACAGCTACCGCTCCAAGCCGTTCTGGACGAC GLNiqGNKGIDIGLNRLVqq3370 3300 3390 3400 34103420 ccacgccgccagttgtgcgaccgccccagacccatcgaagtcctaaccacccatcgccgc CGnCCGCGGTCAACACGCTCCCGGCGTCTCCGTAGCTTCACCATTGGTCGGTAGCGGCG WPALQAVAASADFHYGAMAA3430 3440 3460 3400 34703400CACCTCCAArCCCCACAnrCCTCCTATGCCGCCTCGACGTCCATCAGCGCCGGAGCGTT GTGCAGGnACCGGTGTAAACGAGCATACGCCGGAGCTGCAGGTACTCGCGGCCTCGCAA VDLAWMqeYAAEVDMLAPAN3490 3500 3510 3520 35303540CTCCCCAAACCACTTCGTAGCTCCCACCAGCTCCATCAGGCCACCATTGGCCCCTACCAC GACGGGTTTGGTCAAGCATCGACGGTCGTCGACGTAGTCCGGTCCTAACCGGCGATGGTG QG FWNTAALLqMLGRNAAVV3550 3560 3570 3560 35903600TGCCCGCTGCACCCTCGCCGCCAGCCCCGCCTCGAACGCGGTCCCTCTTGCCATCCCCTG acggccgacgtgccaccggccgtcgcgccggagcitgcgccagcgacaacggtaccggac APQVTAALAAEFATATAMAQ3810 3620 3830 3640 30503660 tccccccgcttcttccgcctgcgctcccgccgtcctgagccacgctacgtactccgttgc acgcccgcgaacaaggcggacgcgacggcggcacgactcggtcccatccatgacccaacg AAAqEAqAAATSLWALYqTA3670 3800 3890 3700 37103720 gacccccatcatccccgccgcccacccacccacccaggcgccactagtcagttccgatgt ctgccggtagtagcggcggcgcctgccigggkggtccgcggtgatcagtcaagcctaca vammaaaspglwagstlest3730 3740 3750 3760 37703760 cacggagccaagcgacgctattcacccgagcaattctkggccacctcgccccaccccgt CTGCCTCGGTTCGCTGCCATAACTGCGCKGTTAAGAAGCCGGTCGAGCCGGGTCCGCCA VSGLSAISALLEEALEGWAT67 425SCRF 104.0-KPG:ll-69..«..“•ÇÍMS.......3790 3000 3810 3820 38303840GCCCCCAGCAATTACCGGTCCCCACCCGGGACCCCCAAACATCACTGCCGAATTCATCTC CCCGCGTCGTTAATCGCCAGGGC1GGGCCCTGGCCCTTTGTAGTCACCGCTTAACTAGAG AAAILPGSGPGAFMLASN1E3850 3860 3870 3880 38903900 tggccgcaaccacccaaaatccccccttgtcagcccatccaacttaactgtcacccaccg ACCGCCGTTGGTGCGTTTTACGCCCGAACAGTCGGCTAGGTTCAATTCACAGTCGCTGCC PPLWAFHPSTLRDLKVTLSR3910 3920 3930 3940 39503960 ttcccctgCccctatccgcacttcaataccactcatctttcgcctcaktttcgagcgcc aacggcaccgccatagccgtgaacttatggtgagtagaaaccccagtacaaacctcgcgg QRPPIPVEICSMKPTM3970 3980 3990 4000 40104020CCTAGGAACCGCCACCTTACCTAGTCCCGGGTAGGGGCCGACTGGCGGCCGGGATGCAGC CGATCCTTGGCGGTCGAATGGATCAGGGCCCATCCCCGGCTGACCGCCGGCCCTACGTCG4030 4040 4050 4060 40704080TCACGCTCTGCCACCTGCCCCGTAATGKGCTCGTATGGCAACCACCGACGCCCCCGCCC ACTCCCAGACGGTGGACGGGGCATTACAGCGACCATACCGTTCGTGGCTGCGGCGCCGGG4090 4100 4110 4120 41304140AACAGTIGCTCGCCCACGCGTTCACCCGGTTGATCGAACATGTCGACGAACTCACCCACG 1K KAACGAGGCGCIGCGCAAGTGGGCCAACTAGCTrGTACAGCIGCTTGAGTGGCTGC4150 4160 4170 4180 41904200 ccctcaccgaccaactcgcctcctaccgcccgacccccagcgccaacagcattccctggcCGGAGTGGCTGGTTGACCGGACGATGGCGGGCTGGGGGTCGCGGTFGTCGrAACCCACCG4210 4220 4230 4240 4250 4260 tgctctggcacagccccccggtgcacgatatacaggtcgcccatgtggccggcctggaag ACr,AGACCr,TGTCC.CGGf.rcCACGICCTATArGTCCAGCGGGTACACCGGC€GCACC1TC4270 4280 4290 4300 4310 4320ACGTGTGGACCCCCGAÇGGTTGGGTGGACCCCTTTGGGTrACATCTGCCGCGCCACGACA ICCACACCTGGGCGCTGCCAACCCAÇCTGGCGAAACCCAATCTAGACGGCGCCGTGCTGT4330 4310 4350 4360 4370CCCGAIaTGGACACCGKCCGAGGATGTCGCGAACGTACGGCCACCCGCCGACCCAATTC 3 GGCCTA1ACC1GTGGCAGGGCTCCTACACCGCTTCCATGCCCGTGGGCGGCTGCCTTAAG 567 425SCRE1 104.0-EPGíll desde cerca da posição 3950 a-té cerca da posição 2390 e que numa estrutura de leitura consistente codifica uma proteína com. 517 resíauos de aminoácidos Mycobacterium tuberculosis ou desde cerca da posição 3948 até à posição 2398, caracterizado por ser capaz de replicar a sequência de ADI’ estranho num meio de replicação/expressão. - 2a. - Vector plasmídeo ae acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o meio de replicação/expressão ser um organismo celular.
- 3a. - Vector plasmídeo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por incluir também sinais codificados pela sequência para iniciação e finalização da transcrição que estão operativamente ligados à sequência de ADN estranho e são compatíveis com o meio de replicação/expressão para transcrever um produto codificado pela referida sequência de ADN estranho.
- 4a. - Vector plasmídeo ue acordo com a reivindicação 3, caracterizado por incluir ainda um codão de iniciação de tradução e um coaão de finalização da tradução ligados operativamente à extremidade 5 1 © á extremidade 31, respectivamente da referida sequência de ADN estranho sendo os referidos codões compatíveis com o meio de replicação/expressão para expressar um produto proteico codificado pela referida sequência de ADN.
- 5a. - Cultura bacteriana, caracterizada por compreender bactérias que contêm o vector plasmídeo de acordo com a reivindicação 4, num meio aquoso apropriado à expressão da proteína com 517 resíduos de aminoácidos da Mycobacterium tuberculosis.
- 6a. - Vector plasmídeo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por a extremidade 5’ da sequência de ADN estranho estar ligada operativamente, numa estrutura de leitura de tradução, à extremidade 3' de uma segunda sequência de ADN que codifica uma segunda proteína ou fragmento de proteína, sendo o produto proteico, expresso pelo referido vector, uma proteína de fusão que contém a segunda proteína, ou fragmento de proteína, no terminal amino e a proteína referida em primeiro lugar no terminal carboxilo.„a.y!67 425SCRE1 1O4.O-EPG:11'.'.a Ç
- 7a. - Método para produzir uma proteína com 51? resíduos de aminoácidos de My c ob act e r i um tubérculosis caracterizado porja) se cultivar um meio de replicação/expressão, contendo um vector plasmídeo, para replicar e expressar uma sequência de ADN estranho nele contido, contendo o referido vector uma sequên cia de ADN estranho que corresponde substancialmente à molécula de ADN representada pela fórmula de acordo com a reivindicação1 desde cerca da posição 3950 até cerca da posição 2398, o referido vector contendo ainda adicionalmente sequências de nucleótidos ligadas operativamente que regulam a replicação e a expres são da referida sequência de ADN estranho, sendo a cultura efec! tuada sob condições apropriadas à expressão da proteína codificada pela referida sequência de ADN estranho; eb) se recolher a proteína expressa que é codificada pela referiaa sequência de ADN.
- 8s. - wiétoqo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado per o meio de replicação/expressão ser uma cultura de organismos unicelulares.
- 9a. - Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado por os organismos unicelulares serem bactérias.
- 10a. - Método para a determinação, num hospedeiro mamífero de exposição imunológica prévia a Mycobacterium tuberculosis ou a Mycobacterium bovis caracterizado por:a) se administrar a um hospedeiro mamífero testado por via intradérmica um inóculo que consiste essencialmente na proteína com 54C resíuuos de aminoácidos purificada, codificada pela sequência de ADN com a fórmula apresentada na reivindicação 1 estando a proteína dissolvida ou dispersa num diluente tolerável fisiologicamente e presente no referido diluente numa quantidade eficaz para induzir eritema e enduramento num hospedeiro mamífero previamente imunizado com M. tuberculosis ou M. bovis;b) se conservar o referido mamífero durante um período de tempo compreendido entre cerca de 24 e cerca, de 72 horas; ec) se determinar no fim do período de tempo referido na alínea (b) a presença de eritema e enduramento no local da administração intradérmica.67 425SGRF 104.0-EPG:
- 11-72113, _ Método de acordo com a reivindicação 1G, caracterizado por a referida proteína purificada ser a proteína de 65 KD obtida a partir de uma myccbacterium.
- 12e. - Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por a proteína purificada ser uma proteína recombinante.
- 13®. - Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado por a proteína purificada ser uma proteína de fusão, recombinante, que contém uma porção de uma molécula de beta-galactosidase ligada ao terminal amino da proteína com 540 resíduos de aminoácidos.
- 14-. - Método para determinar a presença de uma infecção por M.tuberculosis, num paciente, caracterizado por:a) se proporcionar um suporte de fase sólida que compreende uma proteína com 540 resíauos de aminoácidos purificada, codificada pelo genoma de M. tuberculosis, como antigénio fixado sobre uma matriz de fase sóliua;b) se misturar uma amostra líquida recolhida de um paciente, com o referido suporte de fase sólida, para formar uma mistura de fase sóliua-líquida;c) se conservar a referida mistura durante um período de tempo suficiente para que os anticorpos da referida proteína com 540 resíduos de aminoáciaos, presente na amostra, se liguem ao antigénio do referido suporte sólido;d) se separar as fases sólida e líquida; ee) se determinar a presença de anticorpos ligados ao suporte de fase sólida.
- 15a. - Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado por o antigénio ser obtido a partir de células de M. tuberculosis.
- 16s. - Método de acordo com. a reivindicação 14, caracterizado por o antigénio ser uma proteína recombinante.
- 17®. - Método ce acordo com a reivindicação 16, caracterizado por a referida proteína recombinante ser uma proteína de fusão que inclui ainda uma porção da molécula da beta-galactosidase, ligada ao terminal amino do antigénio.67 425SCRP 104.0-EPG:ll-7318^, - Conjunto de diagnóstico caracterizado por compreender uma embalagem que contém um suporte sólido possuindo uma proteína com 540 resíduos de aminoâcidos codificada pelo genoma de M. tuberculosis, como antigénio fixado sobre uma matriz de fase sólida.
- 19§. - Conjunto de diagnóstico de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por incluir uma segunda embalagem que contém um reagente marcado que reage com anticorpos humanos ligados ao referido suporte sólido.
- 20&. - Conjunto de diagnóstico de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por o referido antigénio ser obtido a partir de células de M, tuberculosis.
- 21^. - Conjunto de diagnóstico de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por o referido antigénio ser uma proteína recombinante,
- 22^, - Processo de preparação de um inoculo caracterizado por se dissolver ou dispersar um antigénio num diluente fisioiogicamente aceitável, consistindo o referido antigénio essencialmente no antigénio com 540 resíduos aminoâcidos, purificado, codificado pela sequência apresentada na reivindicação 1, estando o referido antigénio presente no referido diluente numa quantidade eficaz para induzir eritema e enduramento num hos pedeiro mamífero previamente imunizado com M, tuberculosis ou M, bovis.
- 23&. - Processo de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por o referido antigénio de proteína ser o antigénio de proteína com 65KD de M. tuberculosis.
- 24^. - Processo de acordo com a reivindicação 22, caracterizado por o referido antigénio de proteína ser uma proteína recombinante.
- 25â. - Processo de acordo com a reivindicação 24, caracterizado por a referida proteína recombinante incluir ainda uma porção da molécula da beta-galactosidade ligada ao terminal amíno da referida proteína, com 540 resíduos aminoâcidos.67 425SORF 104.0-EPG:ll-74> ijviiigSMí
- 26§. - Processo de preparação de um péptido que consiste essencialmente numa sequência de 5 a 40 resíduos aminoácidos que corresponde substanelaImente a uma sequência da proteína de 540 resíduos aminoácidos ou da proteína de 577 resíduos aminoácidos codificada pela sequência de ADN apresentada na reivindicação 1, caracterizado por se efectuar uma síntese peptídica em fase sólida, em passos, que compreende:a) fazer reagir uma resina de suporte, polimérica, clorometilada com o grupo carboxi de um aminoácido protegido no seu grupo amino, para formar um aminoácido ligado à resina , bloquea do em amino;b) remover os reagentes não consumidos e os produtos de reacção secundários;o) remover o grupo protector de amino;d) repetir os passos a) a c) adicionando o aminoácido seguinte também protegido na sua função amino, as vezes necessárias até se preparar o péptido ligado à resina , desejado;e) clivar o pollpéptido da resina; ef) recuperar o pollpéptido,
- 27^, - Processo de acordo com a reivindicação 26, caracterizado por o péptido corresponder substancialmente à sequência da proteína de 540 resíduos aminoácidos representada por uma fórmula escrita da esquerda para a direita e na direcção do terminal amino para o terminal carboxi, seleccionada do grupo consistindo em:
A R R G L E R G L N A L A D A V K V; E K I G A E L V K E V A K K; G L K R G I E K A V E K V T E T L; Q S I G D L I A E A M D K V G N E G V L L V S S K V S T V K D L L P • t I E D A V R N A K A A V E E G « t V K V T R S A L Q N A A S I A J MAKTIAY.DEEARRGL;67 425SCRF 104O-EPG:11-75ARRGLERG ALADAVKV GPKGRNVV KKWGAPTI DGVSIAKE LEDPYEKI ELVKEVAK DDVAGDGT ATVLAQAL EGLRNVAA NPLGLKRG KAVEKVTE LKGAKEVE EQIAATAA AGDQSIGD AEAMDKVG GVITVEES FGLQLELT MRFDKGYI YFVTDPER AVLEDPYI LLPLLEKV AGKPLLII DVEGEALS VVNKIRGT SVAVKAPG DRRKAMLQ AILTGGQV EEVGLTLE DLSLLGKA VVVTKDET VEGAGDTD AGRVAQIR IEN-SDSDY EKLQERLALNALADA; T L G Ρ K G R; LEKKWGA; Τ N D G V S I; IELEDPY; GAELVKE; KTDDVAG; TTATVLA; V R E G L R N; G A N P L G L; I Ε Κ A V Ε K; TLLKGAK; TKEQIAA; I S A G D Q S; L I A Ε A M D; N E G V I Τ V; NTFGLQL; EGMRFDK; SGYFVTD; QEAVLED; LLVSSKV; IGAGKPL; AEDVEGE; TLVVNKI; FKSVAVK; FGDRRKA; D Μ A I L T G; I S Ε Ε V G L; NADLSLL; R Κ V V V Τ K; TIVEGAG; AIAGRVA; Q Ε I Ε N S D; D R Ε K L Q E; K L A G G V A;67 425SCRF 104.0-EPG:ll-76AGGVAVIK AATEVELK KHRIEDAV AKAAVEEG AGGGVTLL APTLDELK GDEATGAN KVALEAPL IAFNSGLE VVAEKVRN AGHGLNAQ VYEDLLAA ADPVKVTR LQNAAS IA FLTTEAVV KPEKEKAS KASVPGGGAGAATEV; ERKHRIE; RNAKAAV; IVAGGGV; Q A A P T L D; L E G D Ε A T; IVKVALE; KQIAFNS; PGVVAEK; L P A G H G L; T G V Y E D L; GVADPVK; S A L Q N A A; G L F L T T E; ADKPEKE; VPGGGDMje D M G G M D F. - 28§·, - Processo de acordo com a reivindicação 26, earacterizado por a referida sequência corresponder substancialmente à sequência da proteína de 517 resíduos aminoácidos, representada pela fórmula escrita da esquerda para a direita e na direcção do terminal amino para o terminal carboxi, seleccionada do grupo con sistindo em:X N N I G,X G Μ Z G, e F N S G S G N I G F (I) G N S G na qual X é um resíduo aminoácido seleccionado do grupo consistindo em F, S, T, L, D e I; Z é um resíduo aminoácido seleccionado do grupo consistindo em T, I, L, S e V; e o resíduo entre parêntesis pode substituir o resíduo mostrado à sua esquerda na sequência.67 425SGRF 104,0-EPG:ll-7729a, - Processo de preparação de um polímero, caracterizado por se eíectuar a polimerlzação de uma pluralidade de unidades de repetição pentapeptídlcas, consistindo essencialmente numa sequência escrita da esquerda para a direita e na direcção do terminal amino para o terminal carboxi, representada pela fórmulaΝ Ν Ν I G; ouX G N 2 G, na qual X é um resíduo aminoácldo seleccionado do grupo consistin do em F, S, T, L, D e I; 2 é um resíduo aminoácido seleccionado do grupo consistindo em Τ, I, L, S e V.305. - Processo de acordo com a reivindicação 29, caracterizado por as unidades de repetição pentapeptídicas estarem ligadas por ligações peptídicas.315, - Processo de acordo com a reivindicação 29, caracterizado por as unidades de repetição pentapeptídicas estarem ligadas por resíduos cisteína oxidados, presentes nos terminais das referidas unidades de repetição.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US07/019,529 US4952395A (en) | 1987-02-26 | 1987-02-26 | Mycobacterial recombinants and peptides |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PT86838A PT86838A (pt) | 1988-03-01 |
| PT86838B true PT86838B (pt) | 1992-05-29 |
Family
ID=21793686
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PT86838A PT86838B (pt) | 1987-02-26 | 1988-02-25 | Vector plasmideo compreendendo um replicao ligado a uma sequencia de adn e metodo de producao de proteinas utilizando esse vector plasmideo |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US4952395A (pt) |
| CA (1) | CA1340423C (pt) |
| ES (1) | ES2009238A6 (pt) |
| GR (1) | GR1000083B (pt) |
| NZ (1) | NZ223632A (pt) |
| PT (1) | PT86838B (pt) |
| WO (1) | WO1988006591A1 (pt) |
| ZA (1) | ZA881344B (pt) |
Families Citing this family (47)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NL8703107A (nl) * | 1987-12-22 | 1989-07-17 | Nederlanden Staat | Polypeptiden en derivaten daarvan, alsmede de toepassing daarvan in farmaceutische en diagnostische preparaten. |
| CA1338778C (en) * | 1988-06-15 | 1996-12-10 | Richard A. Young | Stress proteins and uses therefor |
| EP0370581A1 (en) * | 1988-11-25 | 1990-05-30 | Akzo N.V. | Anti-hCG antibodies |
| US5114844A (en) * | 1989-03-14 | 1992-05-19 | Yeda Research And Development Co., Ltd. | Diagnosis and treatment of insulin dependent diabetes mellitus |
| FR2645878B1 (fr) * | 1989-04-17 | 1994-02-25 | Institut Nal Sante Recherc Medic | Sequences nucleotidiques d'actinomycetales, applications a la synthese ou a la detection d'acides nucleiques, produits d'expression de ces sequences et application en tant que compositions immunogenes |
| SE9001105D0 (sv) * | 1990-03-27 | 1990-03-27 | Astra Ab | New methods foer diagnosis of tuberculosis |
| US5776693A (en) * | 1990-06-08 | 1998-07-07 | Institut Pasteur | Specific detection of the mycobacterium tuberculosis |
| GB9111291D0 (en) * | 1991-05-24 | 1991-07-17 | Medical Res Council | Diagnostic peptides |
| FR2694754B1 (fr) * | 1992-08-12 | 1994-09-16 | Bio Merieux | Fragments d'ADN de mycobactéries, amorces d'amplification, sondes d'hybridation, réactifs et procédé de détection de détection de mycobactéries. |
| DK0700445T3 (da) | 1993-06-04 | 2002-05-13 | Whitehead Biomedical Inst | Stressproteiner og anvendelser deraf |
| US5955077A (en) * | 1993-07-02 | 1999-09-21 | Statens Seruminstitut | Tuberculosis vaccine |
| US6991797B2 (en) * | 1993-07-02 | 2006-01-31 | Statens Serum Institut | M. tuberculosis antigens |
| US6752993B1 (en) | 1993-11-23 | 2004-06-22 | The Regents Of The University Of California | Abundant extracellular product vaccines and methods for their production and use |
| JPH09505588A (ja) | 1993-11-23 | 1997-06-03 | ザ リージェンツ オブ ザ ユニバーシティ オブ カリフォルニア | 多くの細胞外生成物及びそれらの製造法並びに使用 |
| US7300660B2 (en) * | 1993-11-23 | 2007-11-27 | The Regents Of The University Of California | Abundant extracellular products and methods for their production and use |
| ATE260295T1 (de) * | 1994-03-21 | 2004-03-15 | Univ Utrecht | Peptidfragmente von mikrobiellen stressproteinen und daraus hergestellte pharmazeutische zusammensetzungen für die behandlung und vorbeugung von entzündungserkrankungen |
| US5874405A (en) * | 1994-12-16 | 1999-02-23 | Birnbaum; Gary | Heat shock protein peptides that share sequences with cyclic nucleotide phosphodiesterase and methods for modulating autoimmune central nervous system disease |
| US6592877B1 (en) * | 1995-09-01 | 2003-07-15 | Corixa Corporation | Compounds and methods for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis |
| US6338852B1 (en) | 1995-09-01 | 2002-01-15 | Corixa Corporation | Compounds and methods for diagnosis of tuberculosis |
| US6290969B1 (en) * | 1995-09-01 | 2001-09-18 | Corixa Corporation | Compounds and methods for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis |
| US6458366B1 (en) * | 1995-09-01 | 2002-10-01 | Corixa Corporation | Compounds and methods for diagnosis of tuberculosis |
| US6013660A (en) * | 1996-10-02 | 2000-01-11 | The Regents Of The University Of California | Externally targeted prophylactic and chemotherapeutic method and agents |
| US7157089B1 (en) | 1996-11-26 | 2007-01-02 | Stressgen Biotechnologies Corporation | Immune responses using compositions containing stress proteins |
| US6982085B2 (en) * | 1997-04-02 | 2006-01-03 | Statens Serum Institut | TB diagnostic based on antigens from M. tuberculosis |
| US7037510B2 (en) | 1997-04-18 | 2006-05-02 | Statens Serum Institut | Hybrids of M. tuberculosis antigens |
| US6555653B2 (en) | 1997-05-20 | 2003-04-29 | Corixa Corporation | Compounds for diagnosis of tuberculosis and methods for their use |
| US6613881B1 (en) | 1997-05-20 | 2003-09-02 | Corixa Corporation | Compounds for immunotherapy and diagnosis of tuberculosis and methods of their use |
| CN100489105C (zh) | 1997-08-05 | 2009-05-20 | 恩温塔生物制药学公司 | 包含hpv抗原和应激蛋白或者其表达载体的组合物激发的抗hpv抗原免疫应答 |
| US20040013685A1 (en) * | 1997-11-10 | 2004-01-22 | Peter Andersen | Nucleic acid fragments and polypeptide fragments derived from M. tuberculosis |
| US6497880B1 (en) | 1998-12-08 | 2002-12-24 | Stressgen Biotechnologies Corporation | Heat shock genes and proteins from Neisseria meningitidis, Candida glabrata and Aspergillus fumigatus |
| US6465633B1 (en) | 1998-12-24 | 2002-10-15 | Corixa Corporation | Compositions and methods of their use in the treatment, prevention and diagnosis of tuberculosis |
| US8143386B2 (en) * | 1999-04-07 | 2012-03-27 | Corixa Corporation | Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis antigens and their uses |
| AU5926700A (en) | 1999-07-08 | 2001-01-30 | Stressgen Biotechnologies Corporation | Induction of a th1-like response in vitro |
| WO2001016174A2 (en) * | 1999-08-30 | 2001-03-08 | Rolf Kiessling | Induction of cytotoxic t lymphocyte response by hla class ia restricted epitopes of mycobacterial heat shock protein 65 |
| US7592304B2 (en) | 1999-10-01 | 2009-09-22 | Dmi Life Sciences, Inc. | Metal-binding compounds and uses therefor |
| US7632803B2 (en) * | 1999-10-01 | 2009-12-15 | Dmi Life Sciences, Inc. | Metal-binding compounds and uses therefor |
| WO2001024820A1 (en) * | 1999-10-07 | 2001-04-12 | Corixa Corporation | Fusion proteins of mycobacterium tuberculosis |
| AU1814101A (en) | 2000-01-14 | 2001-07-24 | Massachusetts Institute Of Technology | In vivo CTL elicitation by heat shock protein fusion proteins maps to a discrete ATP binding domain and is CD4+ cell-independent |
| AU2001241738A1 (en) * | 2000-02-25 | 2001-09-03 | Corixa Corporation | Compounds and methods for diagnosis and immunotherapy of tuberculosis |
| SI1542732T1 (sl) * | 2000-06-20 | 2010-01-29 | Corixa Corp Csc The United Sta | Fuzijski proteini Mycobacterium tuberculosis |
| IL153474A0 (en) | 2000-06-26 | 2003-07-06 | Stressgen Biotechnologies Corp | Human papilloma virus treatment |
| WO2002004018A2 (en) * | 2000-07-10 | 2002-01-17 | Colorado State University Research Foundation | Mid-life vaccine and methods for boosting anti-mycobacterial immunity |
| WO2002048175A2 (en) * | 2000-12-13 | 2002-06-20 | Argonex Pharmaceuticals | Mhc class i associated peptides for prevention and treatment of tuberculosis |
| MXPA03006971A (es) | 2001-02-05 | 2004-05-05 | Stressgen Biotechnologies Corp | Tratamiento del virus de hepatitis b. |
| US7026465B2 (en) * | 2002-02-15 | 2006-04-11 | Corixa Corporation | Fusion proteins of Mycobacterium tuberculosis |
| WO2004045539A2 (en) * | 2002-11-15 | 2004-06-03 | Regents Of The University Of California | Anti-microbial agents derived from methionine sulfoximine analogues |
| PL239045B1 (pl) * | 2018-01-09 | 2021-11-02 | Inst Immunologii I Terapii Doswiadczalnej Polskiej Akademii Nauk | Epitop specyficzny dla zakaźnych Streptococcus agalactiae oraz sposób wykrywania zakażenia pacjenta szczepem Streptococcus agalactiae |
Family Cites Families (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3853833A (en) * | 1971-04-27 | 1974-12-10 | Hormone Res Foundation | Synthetic human growth-promoting and lactogenic hormones and method of producing same |
| US4575484A (en) * | 1980-05-05 | 1986-03-11 | Montefiore Medical Center, Inc. | Binding assay for the detection of mycobacteria |
| US4489158A (en) * | 1980-05-05 | 1984-12-18 | Montefiore Hospital And Medical Center, Inc. | Binding assay for the detection of mycobacteria |
| US4431187A (en) * | 1982-06-25 | 1984-02-14 | Brunswick Corporation | Golf club shaft |
| US4703008A (en) * | 1983-12-13 | 1987-10-27 | Kiren-Amgen, Inc. | DNA sequences encoding erythropoietin |
| GB8404280D0 (en) * | 1984-02-17 | 1984-03-21 | Stanford J L | Biological preparations |
| US4689397A (en) * | 1985-08-12 | 1987-08-25 | Scripps Clinic And Research Foundation | Synthetic polypeptides for detecting mycobacterial infections |
| NL8701163A (nl) * | 1986-09-09 | 1988-04-05 | Nederlanden Staat | Gebruik van een peptide voor de bereiding van preparaten voor het verlichten, het behandelen en de diagnose van autoimmuunziekten, in het bijzonder arthritische toestanden, verbindingen die met dit peptide verwant zijn, alsmede farmaceutische en diagnostische preparaten en testkits. |
| AU1548388A (en) * | 1987-02-02 | 1988-08-24 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Mycobacterium tuberculosis genes and encoding protein antigens |
-
1987
- 1987-02-26 US US07/019,529 patent/US4952395A/en not_active Expired - Lifetime
-
1988
- 1988-02-24 NZ NZ223632A patent/NZ223632A/en unknown
- 1988-02-25 ZA ZA881344A patent/ZA881344B/xx unknown
- 1988-02-25 PT PT86838A patent/PT86838B/pt not_active IP Right Cessation
- 1988-02-25 WO PCT/US1988/000598 patent/WO1988006591A1/en active IP Right Grant
- 1988-02-25 GR GR880100104A patent/GR1000083B/el not_active IP Right Cessation
- 1988-02-25 CA CA000559844A patent/CA1340423C/en not_active Expired - Fee Related
- 1988-02-26 ES ES8800574A patent/ES2009238A6/es not_active Expired
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ZA881344B (en) | 1988-08-26 |
| NZ223632A (en) | 1991-03-26 |
| PT86838A (pt) | 1988-03-01 |
| ES2009238A6 (es) | 1989-09-16 |
| GR880100104A (en) | 1988-12-16 |
| CA1340423C (en) | 1999-03-09 |
| WO1988006591A1 (en) | 1988-09-07 |
| GR1000083B (el) | 1990-11-29 |
| US4952395A (en) | 1990-08-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| PT86838B (pt) | Vector plasmideo compreendendo um replicao ligado a uma sequencia de adn e metodo de producao de proteinas utilizando esse vector plasmideo | |
| US5478726A (en) | Mycobacterial recombinants and peptides | |
| Van De Water et al. | The autoepitope of the 74-kD mitochondrial autoantigen of primary biliary cirrhosis corresponds to the functional site of dihydrolipoamide acetyltransferase. | |
| ES2271449T3 (es) | Compuestos para inmunoterapia y diagnostico de la tuberculosis. | |
| KR870000702B1 (ko) | 합성 항원 펩티드의 제조방법 | |
| JPS62501355A (ja) | アドヒシン抗原類 | |
| Dallo et al. | Identification of P1 gene domain containing epitope (s) mediating Mycoplasma pneumoniae cytoadherence. | |
| JP2009067810A (ja) | 合成ペプチドとそれを含むワクチン | |
| EP0469045B1 (en) | SYNTHETIC $i(PSEUDOMONAS) $i(AERUGINOSA) PILIN PEPTIDE AND RELATED VACCINES AND DIAGNOSTICS | |
| US11684661B2 (en) | Multiepitope fusion antigens and vaccines and their use in treatment of enterotoxigenic diarrhea | |
| WO2022003119A1 (en) | Cross-reactive coronavirus vaccine | |
| CN103724413B (zh) | 旋毛虫副肌球蛋白b细胞抗原表位8a1及其应用 | |
| Meeker et al. | Analysis of human antibody epitopes on the 65-kilodalton protein of Mycobacterium leprae by using synthetic peptides | |
| US6861507B1 (en) | Screening of neisserial vaccine candidates and vaccines against pathogenic neisseria | |
| KR20100139096A (ko) | 조성물, 방법 및 키트 | |
| Ocampo et al. | Identifying Plasmodium falciparum cytoadherence‐linked asexual protein 3 (CLAG 3) sequences that specifically bind to C32 cells and erythrocytes | |
| JP2009029825A (ja) | 抗原 | |
| BRPI0308978B1 (pt) | Fragmentos de peptídeos, e, composições imunogênicas | |
| BRPI0604176B1 (pt) | Proteína de membrana sm29 do schistosoma mansoni, kit para teste imunoenzimático utilizando a proteína sm29 no diagnóstico da esquistossomose, vacina contendo a proteína sm29 especifica contra a esquistossomose e processo de obtenção da vacina | |
| BR112021000312A2 (pt) | Vacina, peptídeos, polipeptídeo, polinucleotídeo, vetor de vacina, método de tratamento ou prevenção da infecção por map ou da condição ou sintoma associado à infecção por map e kit | |
| CA2392895A1 (en) | Streptococcus pneumoniae antigens | |
| Arefpour Torabi et al. | Production and purification of polyclonal antibodies against diphtheria toxin | |
| JPH04501661A (ja) | マラリア抗原 | |
| ES2368572T3 (es) | Compuestos y métodos para inmunoterapia y diagnosis de tuberculosis. | |
| BR102019022933A2 (pt) | Sequências modificadas de dna, proteínas codificadas por estas sequências e seu uso como vacina e diagnóstico. |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| FG3A | Patent granted, date of granting |
Effective date: 19911115 |
|
| MM4A | Annulment/lapse due to non-payment of fees, searched and examined patent |
Free format text: MAXIMUM VALIDITY LIMIT REACHED Effective date: 20080225 |