CN106103471A - 异源寡聚分枝杆菌抗原的融合 - Google Patents

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Abstract

本发明一般涉及包含或编码至少两个异源寡聚分枝杆菌抗原并且优选包含所述两个异源寡聚分枝杆菌抗原的融合多肽的新免疫原性组合，其中所述分枝杆菌抗原选自分枝杆菌属物种的Esx、PE和PPE抗原，特别是结核病复合群的分枝杆菌如结核分枝杆菌(Mtb)。本发明还涉及包含或编码所述免疫原性组合的载体、宿主细胞和组合物以及表达和制备它的方法。本发明还涉及利用所述免疫原性组合、融合多肽、载体、宿主细胞、组合物特别用于诱导或刺激免疫应答的方法，目的是提供针对分枝杆菌感染或者由分枝杆菌感染引起或与分枝杆菌感染相关的任何疾病的保护性应答。

Description

异源寡聚分枝杆菌抗原的融合
发明领域
本发明一般涉及包含或编码至少两个异源寡聚分枝杆菌抗原的新免疫原性组合或者编码这类异源寡聚分枝杆菌抗原的核酸分子，其中所述分枝杆菌抗原选自分枝杆菌属物种的Esx、PE和PPE抗原，特别是结核病复合群的分枝杆菌如结核分枝杆菌(Mtb)。在一优选实施方案中，所述免疫原性组合是包含至少两个异源寡聚分枝杆菌抗原的融合多肽形式。本发明还涉及包含或编码所述免疫原性组合的载体、宿主细胞和组合物以及表达和制备它的方法。本发明还涉及利用所述免疫原性组合、融合多肽、载体、宿主细胞、组合物特别用于诱导或刺激免疫应答的方法，目的是提供针对分枝杆菌感染或者由分枝杆菌感染引起或与分枝杆菌感染相关的任何疾病的保护性应答。
发明背景
据估计三分之一的世界人口感染结核分枝杆菌(Mtb)(即超过二十亿个体)，并且每年有九百万-一千万新病例和两百万人死亡，结核病(TB)是全球性和世界性健康问题。一般来说，人际传播通过患有肺TB(活性疾病)的人产生的飞沫发生。在那些感染的人中(估计30％的暴露个体)，仅5–10％会在暴露后2年内发展活性TB疾病(称作原发性TB)。但是，大多数感染个体发展潜伏性感染(LTBI)，其可以持续几十年而没有疾病的临床表现或症状。LTBI代表平衡状态，其中感染个体能够控制感染但不能彻底根除细菌。重新激活(远程感染之后的活性TB)可以在稍后的阶段发生，特别是在老年人或免疫功能低下的个体中，如在HIV感染和用TNF抑制剂治疗的情况下。TB重新激活的风险估计为10％/一生，并且免疫受损将风险增加至10％/年。
TB的病原体结核分枝杆菌(Mtb)具有4 411 529个碱基对(bp)的圆形基因组，其在1998年完全测序(Cole et al.,1998,Nature 393:537-44。Mtb编码约4000个基因；但是尚未阐明在Mtb生命周期中的功能和作用以及大多数这些基因的发病机理。
来自密切相关的分枝杆菌的基因组序列分析和比较研究已允许鉴定许多分泌蛋白，包括Esx和PE/PPE基因家族的成员。
虽然对PE/PPE家族的各种成员没有结构或精确功能是已知的，但是已表明它们中的一些可能在感染分枝杆菌的免疫逃避、毒力和宿主特异性中起作用。基因组分析显示经常发现PE和PPE基因在Mtb基因组中是相邻的，并且是功能连接的(Riley et al.,2008,PLoS Comput Biol,4:e1000174)。因此认为这样的PE/PPE蛋白对(例如Rv2431c/Rv2430、Rv3477/Rv3478等)互相相互作用以形成异源二聚体，这可能是这些蛋白的功能形式。
如PE和PPE基因家族，大多数Esx基因表达为协同调节的串联对。结核分枝杆菌(M.tuberculosis)基因组包含23个EsX基因(命名为Esx A-W)，其编码可能与Mtb毒力相关的蛋白。生物物理研究显示Esx对的基因产物在功能性异源二聚体中互相相互作用。为了说明目的，TB9.8(Rv0287)/TB10.4(Rv0288)复合物的结构分析显示来自TB9.8的19个氨基酸残基和来自TB10.4的21个氨基酸残基参与分子间接触(Ilghari et al.,2011,J.Biol.Chem.,286:29993-30002)。
以前在大肠杆菌(E.coli)中单独过量表达结核分枝杆菌的Mtb EsxA(ESAT6)和EsxB(CFP 10)蛋白的尝试受到技术难题的阻碍，所述技术难题导致低收率的蛋白。几个研究倾向于表明相关蛋白对的一起表达会促进适当折叠和二聚化，允许制备高收率的重组蛋白，这简化参与Mtb毒力的这些蛋白家族的结构和生物化学研究(Strong et al.,2006,Proc.Natl.Acad.Sci,103:8060-5；Mehra et al.,2013,PLoS,9:e1003734)。但是，没有表明这类二聚体保留免疫原性活性。
Mtb引起的每年一百万人死亡是特别引人注目的考虑，疫苗(Bacille-Calmette-Guérin(BCG))和抗生素存在并广泛使用。但是，虽然BCG看来在新生儿和幼儿中有效防止疾病，但是其不保护成年人且不能在潜伏性感染的人中防止Mtb重新激活。在另一方面，用各种抗生素组合治疗活性TB看来有效，但是需要强烈的患者依从性，在几个月中每天给药不同药物。此外，耐药性Mtb菌株(例如“多重耐药性”(MDR)、“广泛耐药性”(XDR)和“完全耐药性”(TDR)菌株)出现的速度惊人，大部分是因为这种漫长且昂贵的药物方案治疗的不适当遵守。
有几条证据表明细胞免疫系统的刺激在控制TB疾病中起作用(Rook et al.,2007,J Infect Dis,196:191-8)。CD4T淋巴细胞控制病原体和防止疾病发展的核心作用是公认的。例如，具有低CD4+T细胞计数的HIV/AIDS患者对TB疾病的发展更易感，而提高CD4+T细胞的抗病毒治疗减少TB疾病的发展。但是，CD4T细胞不单独操作，并且受到CD8T细胞和其他T细胞子集的支持。
因此有效TB疫苗的开发在这种令人担忧的背景下是优先的，并且过去十年中研究了两种主要方法：BCG的替换和BCG强化。
BCG替换候选物的目的在于提高BCG效力和安全性，并且主要是基于活减毒细菌如遗传修饰的BCG或Mtb菌株，将其工程化以表达BCG中不存在的新抗原集合或者过量表达BCG表达但可能水平不足的Mtb抗原或者缺失毒力基因和它们的调节物(例如WO2009/064825；WO2012031752)。
BCG强化的目的在于诱导细胞和/或体液免疫应答，并且一般依赖于设计用于提供各种TB抗原的重组疫苗，作为一般与有效的Th1激活佐剂混合的蛋白组合物或通过病毒表达载体(参见Andersen,2007,Nature,5:484；Ottenhoff and Kaufman,2012,PLoS 8(5):e1002607；Cayabyab et al.,2012,Frontiers in Cellular and InfectionMicrobiology 2:1-16；和Brennan et al.,2012,Int J Tuberc.Lung Dis.16(12):1566-1573)。
这些疫苗候选物中的一些已在临床前和临床研究中产生结果，证实诱导稳健的针对Mtb的细胞介导的免疫应答或者提供针对TB相关肺部病变的保护的能力。例如，表达Ag85A、TB10.4、TB9.8和Acr2(AdTBF)的腺病毒载体提高BCG的效果，减少免疫接种的山羊肺中的病变体积和细菌负荷(Perez de Val et al.,2013,PLoS,8:e81317)。但是，这些研究强调了各种因素对T细胞应答和保护效力的影响，如抗原剂量(例如Aagaard et al.,2009,PLoS One,4:1-8)和给药途径(Goonetilleke et al.,2003,J.Immunol.,171:1602-9)。
还已描述了使用包含各种TB抗原的融合多肽。例如，由融合至TB10.4的Ag85B组成的融合蛋白Hyvac 4(H4)(Aagaard et al.,2009,PLoS One,4:1-8)在临床开发中。GSK的由插入丝氨酸蛋白酶Rv0125中间的Rv1196组成的M72融合蛋白在与不同合成佐剂给药时在安全性和免疫原性方面表现出良好的临床特征谱(Von Eschen et al.,2009,Hum Vaccine,5:475-82)。还可以引用所谓的“ID”融合蛋白(WO2008/124647)如由Rv1813、Rv3620和Rv2608组成的ID83以及包括融合至3个ID83抗原的Rv3619的ID93以及Rv0198抗原与Rv3812或Rv0111的融合物(参见WO2011/144951)。在另一方面，WO2014/009438描述了包括感染的自然过程的所有阶段的许多分枝杆菌抗原代表的大融合物。
尽管所有这些和其他努力，结核病远未被控制，并且仍然需要可选疫苗候选物用于诊断、预防和治疗结核病，特别是在流行地区。
本发明通过提供免疫原性组合满足这个和其他需要，所述免疫原性组合至少包含优选融合的异源寡聚分枝杆菌抗原，其选自Esx、PE和PPE抗原。这类异源寡聚体(例如异源二聚体)中包括的分枝杆菌抗原对的组合/融合提供出乎意料的特性，如与单独的抗原相比，抗原折叠和融合抗原溶解性提高，这可以增加疫苗候选物的遗传稳定性，减少在宿主细胞或生物体中制备时潜在的细胞毒性和/或提高抗分枝杆菌免疫原性应答(无论体液和/或细胞)的质量和/或范围。此外，本发明的免疫原性组合可以用额外的分枝杆菌抗原针对分枝杆菌感染的自然过程的不同阶段。本发明特别可用于免疫疗法的背景，独立或作为BCG强化用于分枝杆菌感染领域的预防或治疗目的，例如预防Mtb感染和/或预防原发性TB和/或预防潜伏性感染的个体中的重新激活。其还可以与标准(例如抗生素-疗法)或目前开发的任何其他新治疗(例如小直接或间接抑制剂分子；抗体或免疫疗法等)联用。本发明还有助于兽医领域，例如减少或消除动物中分枝杆菌感染和/或活性疾病的风险，特别是在牛和山羊饲养中。
通过提供如权利要求中定义的实施方案来解决这个技术问题。
本发明的其他和进一步的方面、特征和优点从本发明的目前优选的实施方案的以下描述会显而易见。为了公开的目的给出这些实施方案。
发明详述
本发明涉及一种免疫原性组合，所述免疫原性组合包含或编码至少两个异源寡聚分枝杆菌抗原，优选其融合多肽，其选自Esx、PE和PPE抗原，或者编码所述组合/融合的核酸分子。
定义
如本文整个申请中所用，除非上下文另有指示，术语“一(a)”和“一(an)”在它们表示“至少一”、“至少第一”、“一或更多”或“许多”参考化合物或步骤的意义上使用。
无论在本文中哪里使用，术语“和/或”包括“和”、“或”以及“所述术语连接的元素的所有或任何其他组合”。
如本文所用，术语“约”或“大约”表示在给定值或范围的10％内，优选8％内，并且更优选5％内。
术语“氨基酸”、“残基”和“氨基酸残基”是同义词，并且涵盖天然氨基酸以及氨基酸类似物(例如非天然、合成和修饰的氨基酸，包括D或L旋光异构体)。
如本文所用，当用来定义产物、组合物和方法时，术语“包含(comprising)”(以及包含的任何形式，如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)、“具有(having)”(以及具有的任何形式，如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括(including)”(以及包括的任何形式，如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“含有(containing)”(以及含有的任何形式，如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是开放性的，并且不排除额外的未列举的元素或方法步骤。因此，当氨基酸序列可能是多肽的最终氨基酸序列的部分时，多肽“包含”氨基酸序列。这样的多肽可以具有多达几百个额外的氨基酸残基(例如如本文所述的接头和靶向肽)。“基本上由……组成”表示排除具有任何实质意义的其他组分或步骤。因此，基本上由所列举的组分组成的组合物不排除痕量污染物和药学可接受的载体。当这样的氨基酸序列最终仅与几个额外的氨基酸残基存在时，多肽“基本上由氨基酸序列组成”。“由……组成”表示排除超过痕量元素的其他组分或步骤。例如，当多肽除了所列举的氨基酸序列不含任何氨基酸时，多肽“由氨基酸序列组成”。
如本文所用，术语“多肽”指通过共价肽键键合的至少8个或更多个氨基酸的氨基酸残基聚合物。多肽可以是线性或支化的，并且可以包含天然存在和/或氨基酸类似物。该术语还涵盖已天然或通过干预修饰的氨基酸聚合物；例如，二硫键形成、糖基化、脂质化、乙酰化、磷酸化或者任何其他操作或修饰，如与标记组分缀合或添加功能肽如标签(his、myc、Flag等)靶向肽(信号肽、跨膜结构域等)，以及本领域已知的其他修饰。应当理解术语“多肽”涵盖蛋白(通常用于包含50或更多个氨基酸残基的多肽)、寡肽、和肽(通常用于包含少于50个氨基酸残基的多肽)。因此每个多肽可以特征在于特定氨基酸并且由特定核酸序列编码。
如本文所用，术语“组合”指各种组分的任何可能的排列。这样的排列包括分枝杆菌抗原的混合物(例如单独抗原的混合物和/或抗原的融合物)或核酸分子的混合物(例如由一个或多个载体携带)以及多肽和核酸分子的混合物。本发明涵盖包含等摩尔浓度的每种组分的组合以及具有非常不同的浓度的组合。应当理解每种分枝杆菌组分的最佳浓度可以由本领域技术人员确定。
术语“免疫原性”指在已引入定性为免疫原性的组分的个体中诱导或刺激可测量的细胞和/或体液免疫应答的能力。例如，本发明的组合是免疫原性的，因为其能够在个体中诱导或刺激免疫应答，其可以是先天的和/或特异性的(即针对所述免疫原性组合中包含或表达的至少一个分枝杆菌抗原/表位)，体液和/或细胞(例如产生抗体和/或细胞因子和/或激活细胞毒性T细胞、B细胞、T淋巴细胞、抗原呈递细胞、辅助性T细胞、树突细胞、NK细胞等)，并且通常导致给药个体中的保护性应答。如本文所述，在本领域中各种直接或间接生物学测定可用来在体内(动物或人)或体外(例如在生物样品中)评价组分的免疫原性性质。例如，特定抗原刺激细胞介导的免疫应答的能力可以通过许多测定确定，如通过淋巴细胞增殖(lymphoproliferation)(淋巴细胞激活)测定、CTL细胞毒性细胞测定或者通过测定敏化个体中抗原特异性的T淋巴细胞。
如本文所用，术语“融合”或“融合多肽”指两个或更多个多肽的单一多肽链中的共价连接，并且通过遗传方式进行，即通过框内融合编码每个所述多肽的核酸分子。通过“框内融合”，其表示融合的编码序列的表达导致单一多肽，在每个融合的多肽之间没有任何翻译终止子。融合可以是直接的(即其间没有任何额外的氨基酸残基)或间接的(例如通过融合多肽之间的接头)，并且可以发生在多肽的N或C端或者内部。接头的存在可以促进融合多肽的正确折叠和/或功能。接头还可以包括切割位点，其目的是在宿主细胞或生物体中翻译期间(例如2a肽)或之后(例如蛋白酶位点)切割融合多肽。本发明不受采用的接头序列的形式、大小或数量的限制。为了说明的目的，典型的接头长为3-30个氨基酸，并且由氨基酸残基如甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、丙氨酸和/或脯氨酸的重复组成。接头还可以是来自原核生物体(例如分枝杆菌如Mtb)的肽序列，其特别柔软或已存在于一些抗原的N-端部分(如信号肽)。
如本文所用，术语“分枝杆菌抗原”指存在于(例如由分枝杆菌属物种基因组编码)或获得自分枝杆菌属物种的多肽。在本发明的上下文中，这个术语涵盖天然分枝杆菌多肽以及如下文所述的其片段和修饰形式(即变体)。优选地，用于本发明的分枝杆菌抗原在引入个体时是免疫原性的(能够被抗体或T细胞受体结合)。通常，其包含一个或多个B和/或T表位，特别是CTL或TH表位或者两者，参与在主要组织相容性复合物(MHC)的背景中被特定抗体或T-细胞受体。鉴定这类表位的方法是本领域公知的。例如，可以通过实施生物学测定(例如利用合成的重叠寡肽文库的IFNg测定)或可用的预测程序鉴定T细胞表位。
“天然”分枝杆菌抗原可以发现、分离、获得自自然中的分枝杆菌来源。这类来源包括采集自感染或已暴露于分枝杆菌的个体的生物样品(例如血液、血浆、血清、唾液、痰、组织切片、活检标本等)，培养细胞以及在保存机构(例如ATCC或TB机构)、文库或文献描述中可获得的重组材料(例如分枝杆菌分离株、分枝杆菌基因组、基因组片段、基因组RNA或cDNA以及本领域已知的包括这类元素的任何质粒或载体)。
分枝杆菌抗原的“片段”是包含分枝杆菌抗原的至少8个连续氨基酸的多肽，更优选至少15个连续氨基酸，更优选至少约20个连续氨基酸，甚至更优选至少约25个连续氨基酸，甚至更优选至少约30个连续氨基酸，甚至更优选至少约40个连续氨基酸。这样的片段可以特征在于保留如分枝杆菌抗原刺激免疫应答的能力。合适的片段可以是包含抗体、T-细胞受体或HLA分子识别的一个或多个肽基序的免疫原性结构域(通常具有8-30个氨基酸残基)。
“修饰”、“变体”或“突变”分枝杆菌抗原通常在一个或多个位置中不同于本文具体公开的多肽或天然多肽。可以设想任何修饰，包括一个或多个氨基酸残基的取代、插入、添加和/或缺失，非天然重排以及这些可能性的任何组合。氨基酸取代可以是保守的或不是。当考虑几个修饰时，它们可以涉及连续残基和/或非连续残基。这样的修饰可以有利于所得的变体多肽的合成、加工、稳定性、功能和/或溶解性和/或有利于其免疫原性。可以通过本领域技术人员已知的许多方式产生修饰，如位点定向诱变(例如利用Amersham,Les Ullis,France的SculptorTM体外诱变系统)、PCR诱变、DNA改组和通过合成技术(例如导致编码期望的多肽变体的合成核酸分子)。
如本文所用，术语“异源寡聚”指两个组分形成复合物的能力。关联可以是特异性的(需要在结合位点处两个配对物的氨基酸残基之间的结构互补性以及一种或多种类型的静电力、氢键、疏水作用力和/或范德华力以维持结合)或非特异性的(通过一种或多少类型的上述力相互作用但是缺少结构互补性)。许多Esx、PE或PPE基因家族的分枝杆菌抗原倾向于在自然背景(例如分枝杆菌感染)下关联并形成复合物(异源寡聚物)，如1:1复合物(异源二聚体)或者两个配对物之间的任何其他类型的关联(例如三聚体、四聚体等)。这样的异源寡聚体的形成可以通过圆二色性或蛋白印迹或标记技术容易地证实。或者，其还可以通过常规结构技术如X-射线晶体学、NMR或SHG确定。
如本文所用，术语“分枝杆菌属”、“分枝杆菌属物种”和“分枝杆菌”可交换地用来指属于分枝杆菌科的放线菌属的任何成员。该术语涵盖实验室菌株以及临床分离株。
“分枝杆菌感染”指个体暴露于分枝杆菌属物种然后个体或个体的组织被细菌定殖。定殖可以引起严重疾病(例如结核病、麻风病、Bureli溃疡等，取决于分枝杆菌)，或者可以导致无不良表现(无症状或潜伏性感染)。
如本文所用，术语“治疗(treating)”(和治疗的任何形式如“治疗(treatment)”、“治疗(treat)”)涵盖预防(例如防止个体有感染分枝杆菌的风险)和/或治疗(例如诊断为感染分枝杆菌的个体)。治疗需要向个体外部或内部给药活性剂(例如本文所述免疫原性组合、融合多肽、核酸分子、载体和/或组合物)，最终与常规治疗方式相关，特别是目前用于治疗活性分枝杆菌疾病(例如TB)的治疗方式。
术语“个体”一般指会受益于诱导或刺激针对分枝杆菌属物种的免疫应答的脊椎动物，特别是选自家养动物、农场动物、运动动物和灵长类的哺乳动物。优选地，所述个体是已诊断为或有风险感染分枝杆菌特别是Mtb的人，因此怀疑患有或有风险患有由分枝杆菌感染引起或与分枝杆菌感染相关的疾病或疾病状况(例如活性或潜伏性结核病)。
当用来描述本文公开的多肽、核酸分子、载体时，术语“分离”表示这样的多肽、核酸分子、载体等是从其自然环境取出的(即分离自其天然相关的至少一种其他组分)。为了说明的目的，分离的多肽涵盖通常在工程化以表达它的重组细胞内制备的重组多肽，因为所述多肽的天然环境的至少一种组分不会存在。然而，通常分离的多肽通过至少一个纯化步骤来制备。
术语“获得自”、“来源于(originating)”或“来源于(originate)”用来鉴定组分(例如多肽、核酸分子、载体等)的来源，但是并不表示限制制备组分的方法，其可以例如通过化学合成或重组方式。
分枝杆菌属物种
如上文定义的，分枝杆菌抗原(如本发明的免疫原性组合包含或编码的异源寡聚分枝杆菌抗原以及任选存在的一种或多种额外的分枝杆菌抗原)可以独立地获得自目前鉴定的分枝杆菌属(M.)物种的任何成员。
本领域描述了许多用于本发明的上下文的分枝杆菌。示例性分枝杆菌属物种包括但不限于草分枝杆菌(M.phlei)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)、非洲分枝杆菌(M.africanum)、卡氏分枝杆菌(M.canetti)、偶发分枝杆菌(M.fortuitum)、海洋分枝杆菌(M.marinum)、溃疡分枝杆菌(M.ulcerans)、结核分枝杆菌(Mtb)、副结核分枝杆菌(M.paratuberculosis)、牛分枝杆菌(M.bovis)、田鼠分枝杆菌(M.microti)、隐藏分枝杆菌(M.celatum)、鸟分枝杆菌(M.avium)、麻风分枝杆菌(M.leprae)、鼠麻风分枝杆菌(M.lepraemurium)、胞内分枝杆菌(M.intracellulare)、瘰疬分枝杆菌(M.scrofulaceum)、蟾分枝杆菌(M.xenopi)、日内瓦分枝杆菌(M.genavense)、堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)、猿分枝杆菌(M.simiae)、斯塞格分枝杆菌(M.szulgai)、嗜血分枝杆菌(M.haemophilum)、亚洲分枝杆菌(M.asiaticum)、玛尔摩分枝杆菌(M.malmoense)、牝牛分枝杆菌(M.vaccae)、羊分枝杆菌(M.caprae)、M.pinnipedii和石氏分枝杆菌(M.shimoidei)。
在一优选实施方案中，本发明中使用的分枝杆菌抗原获得自结核病复合群的分枝杆菌属物种，其包括传统认为引起疾病结核病的那些物种，以及在免疫受损的个体(例如HIV感染的患者)中引起结核病和肺疾病的分枝杆菌属环境和机会物种。本文使用的结核病复合群的示例性物种包括但不限于结核分枝杆菌(Mtb)、牛分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、非洲分枝杆菌、卡氏分枝杆菌、羊分枝杆菌(M.caprae)和田鼠分枝杆菌。一优选实施方案涉及Mtb，包括Mtb实验室菌株如H37Rv和H37Ra以及临床分离株如KZN4207、T85、CDC1551(在美国分离)、F11(在南非分离)、C、K85(在荷兰分离)、CPHL-A以及MDR或XDR分离株如TN5904、Haarlem、KZN1435、Bejing和KZN605。分枝杆菌抗原来源的其他优选物种为牛分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG和羊分枝杆菌(M.caprae)，特别是用于兽医用途。但是，人们的确会期望在氨基酸和核苷酸水平分枝杆菌属物种之间存在的高百分比同源性给出交叉反应性。因此，本发明的免疫原性组合可能可用于治疗Mtb-(人用)、牛分枝杆菌-和羊分枝杆菌(M.caprae)-(兽医用)感染的个体。
免疫原性组合
在一实施方案中，本发明的免疫原性组合包含或编码的异源寡聚分枝杆菌配对物选自Esx、PE和PPE分枝杆菌抗原。这样的分枝杆菌基因产物的组是本领域公知的，并且可以由技术人员从现有技术中可获得的数据库容易地鉴定。
为了说明的目的，结核分枝杆菌基因组包含23个Esx基因(命名为Esx A-W)，其编码可能与Mtb毒力相关的蛋白。Esx基因产物通常特征在于约100个氨基酸残基的大小和中心WXG基序的存在。生物物理学研究表明Esx对的基因产物在异源二聚体中相互所有，所述异源二聚体可能是这些蛋白的功能形式。这类异源二聚体的代表性实例包括但不限于例如EsxA(ESAT6)和EsxB(CFP-10)；EsxG(TB9.8或Rv0287)和EsxH(TB10.4或Rv0288)；EsxR(Rv3019c)和EsxS(Rv3020c)；EsxO(Rv2346c)和EsxP(Rv2347c)以及EsxV和EsxW。
结核分枝杆菌的PE和PPE多基因家族家族包含基因组的约10％的编码潜力，并且认为有约168个成员(综述参见例如Deng and Xie,J Cell Bioch,2013,113:1087-1095)。这个家族成员的特征在于保守的N-端和可变的C-端。这些大基因家族编码的蛋白的功能仍是未知的，虽然已提出它们参与抗原变化和疾病发病机理。PE/PPE异源二聚体的代表性实例包括但不限于例如Rv3478和Rv3477。
合适的EsX、PE和PPE家族的分枝杆菌抗原的氨基酸序列以及编码核苷酸序列在专业数据库和文献中可容易地获得。例如，Mtb序列可以在Cole et al.(1998,Nature 393:537)中或者在网站如Wellcome Trust Sanger Institute、lnstitut Pasteur等维护的那些网站(例如TB数据库(@tbdb.org)和tuberculist(@tuberculist.epfl.ch))找到。但是，本发明并不限于这些示例性分枝杆菌属物种。事实上核苷酸和氨基酸序列可以在不同分离株和菌株之间变化，并且这种天然遗传变化以及非天然修饰如本文描述的那些包括在本发明的范围内。当修饰时，在全长多肽或其片段中(例如至少40个氨基酸残基)，异源寡聚配对物优选表现出与它们的代表性天然EsX、PE和PPE抗原的氨基酸序列至少70％且优选至少80％(例如80％、85％、90％、92％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％)的相同性百分比。术语“相同性”指两个多肽或核酸序列之间氨基酸对氨基酸或核苷酸对核苷酸对应。两个序列之间的相同性百分比是所述序列享有的相同位置数量的函数，考虑需要引入用于最佳比对的缺口数量和每个缺口的长度。在本领域中各种计算机程序和数学算法可用于确定氨基酸序列之间的相同性百分比，例如在NCBI可获得的Blast程序或Atlas of ProteinSequence and Structure中的ALIGN(Dayhoffed,1981,Suppl.,3:482-9)。确定核苷酸序列之间的相同性的程序也可在专业数据库中获得(例如Genbank、the Wisconsin SequenceAnalysis Package、BESTFIT、FASTA和GAP程序)。
在本发明的上下文中，修饰异源寡聚配对物之一或两者可以是值得的。合适的修饰的代表性实例包括但不限于(a)缺失内部高度疏水区，和/或(b)缺失N-端信号肽(如果需要用异源信号肽代替)，和/或(c)缺失可能负面干扰溶解性、稳定性、免疫原性和重组表达的展开区域，和/或(d)缺失或突变催化结构域以废除分枝杆菌抗原和/或异源寡聚体的至少一种生物学活性，和/或(e)缺失或突变一个或多个氨基酸残基以减少或废除其与靶细胞蛋白(例如哺乳动物细胞蛋白，其在Mtb感染的背景中能够特异性地结合至分枝杆菌抗原的异源寡聚体，其在Mtb感染的背景中允许细菌减少、损害或修改所述靶细胞蛋白的天然功能或活性并且因此有助于Mtb感染或与Mtb感染相关的疾病的发展)的相互作用，因此避免细胞活性或细胞功能的损害。
在一优选方面，异源寡聚分枝杆菌抗原选自ESAT-6(Rv3875)、CFP10(Rv3874)、PPE60(Rv3478)、PE31(Rv3477)、TB10.4(Rv0288)和TB9.8(Rv0287)。
在另一优选方面，将这类异源寡聚分枝杆菌抗原融合以形成融合多肽。本发明的免疫延续组合包含或编码的融合物的代表性但非限制性实例包括(a)EsxA(也称作ESAT-6或Rv3875)与EsxB(也称作CFP10或Rv3874)的融合物；(b)EsxG(也称作TB10.4或Rv0288)与EsxH(也称作TB9.8或Rv0287)的融合物以及(c)PE分枝杆菌抗原Rv3478与其异源寡聚配对物PPE分枝杆菌抗原Rv3477的融合物。在本发明的上下文中，免疫原性组合可以包含两个或更多个异源寡聚配对物的融合物(例如CFP10与ESAT-6的融合物以及TB10.4与TB9.8的融合物)。
本发明涵盖两个方向的融合物，在融合物的N端或C端具有异源寡聚配对物之一。融合物可以是直接的，或者在异源寡聚配对物之间具有接头。优选融合物包括在N-端的CFP10和在C-端的ESAT-6。另一优选融合物包括在N-端的TB10.4和在C-端的TB9.8。
可取的是，本发明的免疫原性组合物包含或编码的融合物不包括分枝杆菌抗原的任何其他免疫原性片段(虽然其可以包括另一分枝杆菌抗原的非免疫原性片段，例如用作接头或靶向肽，等等如本文所述)。
本发明的一特别优选的免疫原性组合包含或编码融合多肽，所述融合多肽包含与SEQ ID NO:1中示出的氨基酸序列或者其任何变体或片段具有至少70％相同性的氨基酸序列。更具体地，SEQ ID NO:1提供由CFP10和ESAT6组成的融合物，其中异源寡聚配对物通过用作接头的对应于Mtb蛋白Rv1827的149-162部分的14个氨基酸肽分开。
本发明的另一特别优选的免疫原性组合包含或编码融合多肽，所述融合多肽包含与SEQ ID NO:2中示出的氨基酸序列或者其任何变体或片段具有至少70％相同性的氨基酸序列。更具体地，SEQ ID NO:2提供由TB10.4和Rv0287组成的融合物，其中异源寡聚配对物通过用作接头的对应于Mtb蛋白Rv1827的149-161部分的13个氨基酸肽分开。
本发明的另一特别优选的免疫原性组合包含或编码包含与SEQ ID NO:1中示出的氨基酸序列或者其任何变体或片段具有至少70％相同性的氨基酸序列的融合物以及包含与SEQ ID NO:2中示出的氨基酸序列或者其任何变体或片段具有至少70％相同性的氨基酸序列的融合物。
关于异源寡聚分枝杆菌配对物(例如其融合物)，本发明的免疫原性组合可以进一步包含或编码一个或多个额外的分枝杆菌抗原。所述额外的分枝杆菌抗原优选选自活性、复苏和潜伏阶段的抗原。所述额外的分枝杆菌抗原可以以单独多肽的形式或者以一个或多个融合多肽的形式(例如额外的融合多肽)或者以单独抗原和融合物的形式包含于免疫原性组合中或由免疫原性组合表达。
有利地，包含于本发明的免疫原性组合中或由本发明的免疫原性组合编码的异源寡聚配对物以及最终的一个或多个额外的分枝杆菌抗原独立地获得自选自结核分枝杆菌(Mtb)、牛分枝杆菌、牛分枝杆菌BCG、非洲分枝杆菌、卡氏分枝杆菌、羊分枝杆菌(M.caprae)和田鼠分枝杆菌的结核病复合群的分枝杆菌属物种。
合适地，本发明的免疫原性组合进一步包含或编码至少两个额外的分枝杆菌抗原。如本文所用，“至少两个”是包含于2-30范围内的数字(即2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30)。优选地，本发明的免疫原性组合包含2-10个额外的分枝杆菌抗原或相应的核酸分子，特别优选2-6个。
可取的是，“一个或多个额外的分枝杆菌抗原”互相不同，并且不同于(融合的)异源寡聚配对物。在本发明的上下文中，每个额外的分枝杆菌抗原可以独立地为天然分枝杆菌抗原(例如全长抗原)或其修饰形式(片段或变体)，只要其保留免疫原性特性(例如诱导细胞介导的免疫应答CD4+和/或CD8+和/或抗体应答的能力)。
在一优选实施方案中，一个或多个额外的分枝杆菌抗原独立地选自活性、复苏和潜伏阶段的抗原。
“活性阶段的抗原”通常是主要在分枝杆菌在体内活性生长和复制时表达的一组蛋白。用于本发明的许多活性分枝杆菌抗原描述于文献中(例如Bertholet et al.,2008,J.Immunol.181:7948-57；Bertholet and al.,2010,Sci Transl Med 2:53ra74)。活性阶段的分枝杆菌抗原的代表性实例包括但不限于Ag85A(Rv3804)、Ag85B(Rv1886)、Rv3619、Rv3620和PPE蛋白Rv2608。
“复苏阶段的抗原”指主要表达于或参与休眠和/或持续状态以及活性生长和复制(分枝杆菌感染的活性状态)之间的转变的任何抗原。用于本发明的复苏抗原描述于文献中(例如Yeremeev et al.,2003,Infection and Immunity71:4789-94；Kana et al.,2008,Mol Microbiol 67:672-84；和Commandeur et al.,2011,Clin Vaccine Immunol.18:676-83)。复苏阶段的分枝杆菌抗原的代表性实例包括但不限于RpfA、RpfB、RpfC、RpfD和RpfE。
“潜伏阶段的抗原”主要在分枝杆菌感染的休眠(或持续)阶段表达，所述休眠(或持续)阶段是其中分枝杆菌可以长期坚持的低代谢活性的可逆状态。用于本发明的许多潜伏性分枝杆菌抗原描述于文献中。示例性Mtb潜伏性抗原是介导细菌对低氧应答的DosR调节子编码的那些抗原以及在营养耗尽时上调的饥饿抗原(Singh et al.,2013,Vaccine,2013.11.065；WO03/000721；WO03/004520；WO03/035681；WO2004/006952和WO2006/104389)。潜伏阶段的分枝杆菌抗原的代表性实例包括但不限于Rv0081、Rv0111、Rv0198、Rv0569、Rv1733c、Rv1735、Rv1737、Rv1806、Rv1807、Rv1813、Rv2005c、Rv2029c、Rv2032、Rv2626、Rv2627、Rv2628、Rv2660c、Rv3407和Rv3812。
合适地，本发明的免疫原性组合是“多阶段的(multiphasic)”，包含或编码来自至少两个感染阶段(例如活性和复苏、活性和潜伏或者复苏和潜伏阶段)的分枝杆菌抗原，特别是Mtb抗原。一特别适当的组合包含或编码来自3个感染阶段的Mtb抗原，具有至少一个来自活性感染阶段的抗原、至少一个来自潜伏性感染阶段的抗原和至少一个来自复苏感染阶段的抗原。
有利地，本发明的免疫原性组合包含或编码的一个或多个额外的分枝杆菌抗原选自Ag85A(Rv3804)、Ag85B(Rv1886)、Rv3619、Rv3620、RpfB、RpfD、Rv0081、Rv0111、Rv0198、Rv0569、Rv1733c、Rv1735、Rv1737、Rv1806、Rv1807、Rv1813、Rv2005c、Rv2029c、Rv2032、Rv2626、Rv2627、Rv2628、Rv2660c、Rv3407和Rv3812。优选地，所述额外的分枝杆菌抗原选自Ag85B(Rv1886)、RpfB、RpfD、Rv1813、Rv2626和Rv3407。如异源寡聚分枝杆菌抗原，用于本发明的免疫原性组合的一个或多个额外的分枝杆菌抗原可以相对于相应的天然分枝杆菌抗原进行修饰。用于本文的合适的分枝杆菌抗原的代表性实例包括但不限于通过缺失N-端信号肽(从第一个残基至约位置31)来相对于天然对应物进行修饰的如SEQ ID NO:3所示的Rv1813抗原(Rv1813*)；通过缺失N-端信号肽(从第一个残基至约位置32)来相对应天然对应物进行修饰的如SEQ ID NO:4所示的Ag85B(Ag85B**)。
在一更优选的实施方案中，免疫原性组合包含或编码异源寡聚分枝杆菌配对物CFP10和ESAT6的融合物，并且进一步包含或编码额外的分枝杆菌抗原Rv2626和Ag85B。另一优选的免疫原性组合包含或编码异源寡聚配对物CFP10和ESAT-6的融合物以及异源寡聚配对物TB10.4和TB9.8的融合物，并且进一步包含或编码额外的分枝杆菌抗原Rv2626、Ag85B、RpfB、RpfD、Rv3407和Rv1813。另一优选的免疫原性组合包含或编码异源寡聚配对物CFP10和ESAT-6，并且进一步包含或编码额外的分枝杆菌抗原Rv2626、Ag85B、RpfB和RpfD。另一优选的免疫原性组合包含或编码异源寡聚配对物Rv0287和TB10.4以及Rv3478和Rv3477，并且进一步包含或编码额外的分枝杆菌抗原Rv3407。
在另一实施方案中，本发明涵盖免疫原性组合包含或编码的分枝杆菌抗原的任何排列。在这方面，额外的分枝杆菌抗原可以以单独多肽的形式(例如重组产生的Mtb抗原的混合物)或者一个或多个融合多肽的形式(至少两个额外的分枝杆菌抗原的共价连接)或者单独抗原和融合物的形式存在或表达。换句话说，这类额外的分枝杆菌抗原可以独立地(在单独的调节元件下)表达或者作为至少两个抗原的融合物(例如通过编码核酸分子的共价连接)表达。此外，编码核酸分子可以由一个或多个载体携带。在这方面，人们可以使用相同类型的载体(例如两个MVA)或不同类型的载体(例如质粒DNA和MVA)来表达本文所述的各种分枝杆菌抗原或融合物。
融合多肽
在一优选实施方案中，本发明的免疫原性组合以两个的融合物的形式包含或编码额外的分枝杆菌抗原。
额外的分枝杆菌抗原的示例性融合多肽包含Rv2626和Ag85B；RpfB和RpfD；以及Rv3407和Rv1813(或者它们的任何变体或片段)。如异源寡聚配对物的融合物，在本发明的上下文中，任何排列都是可能的。为了说明的目的，包含Rv3407和Rv1813的融合物可以在N-端(Rv3407/1813)、内部或C-端(Rv1813/Rv3407)具有Rv3407。
异源寡聚分枝杆菌配对物和/或额外的分枝杆菌抗原的融合多肽还可以包含一个或多个其他组分，其可以源自分枝杆菌属物种(例如额外的分枝杆菌抗原)或者是异源的(即来自不同于分枝杆菌的来源)。其可以是免疫原性的，但是优选其不是。这类额外的组分的实例包括但不限于接头、切割位点、标签肽、靶向肽、跨膜结构域、寡聚结构域。根据分枝杆菌抗原，当与没有这类肽表达的抗原或融合物相比时，这类肽的存在可以有益于增强所得的抗原或融合物的表达、折叠和/或免疫原性。增强的表达可以通过常规技术如蛋白印迹确定。增强的折叠可以通过常规技术如大小排阻色谱(以区分可溶性与聚集的蛋白)确定。增强的免疫原性可以利用常规测定如ELISpot测定确定。
例如，在本文所述的融合多肽(异源寡聚配对物和/或额外的分枝杆菌抗原的融合物)中包含的上游和下游多肽之间插入切割位点可以是有利的。用于本发明的合适的切割位点包括但不限于具有自我切割活性的口蹄疫病毒2A肽(F2A；SEQ ID NO:5)、Thoseaasigna病毒2A肽(T2A；SEQ ID NO:6)和马鼻炎(Equine rhinitis)A病毒肽(E2A；SEQ IDNO:7)。这类肽2A介导在它们自己的C-端的共翻译切割，并且提出操纵核糖体跳过特定肽键的合成-产生肽骨架的不连续-(Luke,2012.Innovations in Biotechnology,Dr.EddyC.Agbo(Ed.),ISBN:978-953-51-0096-6,In Tech,Available from:http:// www.intechopen.com/books/innovation-in-biotechnology/translating-2a-research- into-practice)。因此预期所得的融合蛋白产生上游分枝杆菌抗原，其融合至包含接头的切割位点和下游分枝杆菌抗原。
可选地或此外，本文使用的任何分枝杆菌抗原或其融合物可以包含靶向肽如信号和/或跨膜肽。这类靶向肽是本领域公知的(参见例如WO99/03885)。简单地说，信号肽(SS)一般存在于出现在膜或分泌的多肽的N-端，并且启动它们进入内质网(ER)。它们包含15或更多个基本上疏水的氨基酸，然后通过特异性的位于ER的内肽酶去除以给出成熟多肽。跨膜肽(TM)通常是在性质上是高度疏水的，并且用来将多肽锚定在细胞膜上。可以用于本发明的上下文的跨膜和/或信号肽的选择是广泛的。它们可以获得自任何膜锚定和/或分泌的多肽(例如细胞或病毒多肽)如免疫球蛋白、组织纤溶酶原激活物(tPA)、胰岛素、狂犬病毒糖蛋白、HIV病毒包膜糖蛋白或麻疹病毒F蛋白的那些多肽或者可以是合成的。插入信号肽的优选位点是起始翻译的密码子的N-端下游，而跨膜肽的优选位点是C-端，例如紧接终止密码子上游。
可选地或此外，用于本文的任何分枝杆菌抗原或其融合物可以包含标签肽以便促进其分离或检测或者促进表达这样的抗原或融合物的宿主细胞的鉴定。各种标签肽可以用于本发明的上下文，包括但不限于PK标签、FLAG标签、MYC标签、多组氨酸标签(通常一段5-10个组氨酸残基)。标签肽可以通过免疫检测测定利用如所附实施例中描述的抗标签抗体进行检测。标签肽可以独立地位于分枝杆菌抗原或融合物的N-端(标签-多肽)或者可选地位于其C-端(多肽-标签)或者可选地位于其内部或者当采用几个标签时位于任何这些位置。
用于本发明的额外的分枝杆菌抗原的示例性融合物包括但不限于包含氨基酸序列或可选地基本上由氨基酸序列组成或可选地由氨基酸序列组成的多肽，所述氨基酸序列与SEQ ID NO:8-12中示出的任何氨基酸序列表现出至少70％相同性，有利地至少80％相同性，可取的是至少90％相同性，优选至少95％相同性，更优选98％相同性并且甚至更优选100％相同性。更特别地，SEQ ID NO:8代表RpfB和RpfD复苏抗原的融合物，其包含通过缺失信号肽(从第一个残基至大约位置29中的残基，并且通过缺失催化结构域，因此保留从大约位置30-位置283的RfpB)来相对于天然对应物进行修饰的RpfB，融合至RpfD抗原的所谓的LD(溶菌酶结构域)，具有旨在废除相关酶促活性的突变(例如E292K、T315A和Q347A)。SEQID NO:9和SEQ ID NO:10描述了有(SEQ ID NO:9:Rv2626/2A/Ag85B**)或无(SEQ ID NO:10:Rv2626/Ag85B**)T2A切割位点的Rv2626与Ag85B**的融合物。SEQ ID NO:11描述了融合物Rv3407/E2A/Rv1813*，而SEQ ID NO:12描述了没有E2A切割位点的融合多肽Rv3407/Rv1813*。
通常，可以利用标准技术制备本发明的免疫原性组合。例如，分枝杆菌抗原可以纯化自例如细菌培养物或者利用本领域可用的任何表达系统在宿主细胞中重组表达或者可以在以本文所述方式将编码核酸分子克隆入合适的表达载体时向个体提供。
此外，本发明的免疫原性组合可以进一步包含能够增强免疫原性特性的一个或多个免疫激活剂肽/多肽。人们可以引用例如钙网蛋白(Cheng et al.,2001,J.Clin.Invest.108:669)、Mtb热休克蛋白70(HSP70)(Chen et al.,2000,Cancer Res.60:1035)、泛素(Rodriguez et al.,1997,J.Virol.71:8497)、和T辅助表位如Pan-Dr肽(Sidney et al.,1994,Immunity 1:751)、pstS1GCG表位(Vordermeier et al.,1992,Eur.J.Immunol.22:2631)、破伤风类毒素肽P2TT(Panina-Bordignon et al.,1989,Eur.J.Immunol.19:2237)、P30TT(Demotz et al.,1993,Eur.J.Immunol.23:425)、血凝素表位(Rothbard et al.,1989,Int.Immunol.1:479)和C4bp寡聚结构域(Spencer et al.,2012,PLos One7:e33555)。这类免疫激活剂肽/多肽可以独立地存在或表达或者包括于异源寡聚配对物和/或额外的分枝杆菌抗原的融合物中。
核酸分子和核酸组合
本发明还提供包含于本发明的免疫原性组合中的核酸分子组合以及编码所述分枝杆菌异源寡聚配对物和/或额外的分枝杆菌抗原的融合物的分离的核酸分子。
在本发明的上下文内，术语“核酸”、“核酸分子”、“多核苷酸”和“核苷酸”可交换使用，并且定义任何长度的多脱氧核糖核苷酸(DNA)(例如，cDNA、基因组DNA、质粒、载体、病毒基因组、分离的DNA、探针、引物和它们的任何混合物)或多核糖核苷酸(RNA)(例如，mRNA、反义RNA)或混合的多核糖-多脱氧核糖核苷酸的聚合物。它们涵盖单链或双链的、线性或环状的、天然或合成的核酸。
如之前定义的，本发明的核酸分子可以是天然核酸(例如分离自分枝杆菌的基因组或基因组片段)或者可以被人修饰以包括一个或多个核苷酸的取代、缺失、添加和/或插入。本发明涵盖旨在提高所编码的多肽和融合物的克隆和/或表达及其折叠、稳定性和/或免疫原性的任何修饰。当考虑几个修饰时，它们可以涉及连续和/或非连续的核苷酸残基。本发明考虑的修饰涵盖不改变所编码的分枝杆菌抗原和融合多肽的氨基酸序列的沉默修饰，以及翻译为所编码的多肽的修饰。优选相对于未修饰的多肽，修饰不减少所得多肽的免疫原性潜力。修饰的代表性实例包括但不限于引入适当的限制性位点，序列变性(例如以便减少本发明的上下文或可能有利于遗传不稳定性的宿主细胞中使用的核酸分子之间的序列同源性)和/或优化核苷酸序列(例如以便优化在给定宿主细胞中的翻译)和/或抑制可能的负面元素(预期其负面影响表达水平)。
例如，可能值得优化密码子使用以确保在特定的宿主细胞或个体中高水平表达所编码的基因产物。的确已观察到，当超过一个密码子可用于编码给定氨基酸时，生物体的密码子使用模式是高度非随机的，并且密码子的使用率在不同宿主之间可能显著不同。因为本发明中使用的核苷酸序列大多数是细菌来源的，对于在宿主细胞如高等真核细胞中高效表达，它们可能具有不适当的密码子使用模式。通常，通过用比较常用的编码相同氨基酸的一个或多个密码子替换对应于所关注的宿主细胞中不常用的密码子的一个或多个“天然”(分枝杆菌)密码子来进行密码子优化。不必替换对应于不常用的密码子的所有天然密码子，因为即使用部分替换仍可以实现增加的表达。此外，可以对严格遵守优化的密码子使用做出一些偏差以适应将限制性位点引入所得的核酸分子。
本发明的一特别优选的实施方案涉及编码SEQ ID NO:1、2和8-12中示出的任何融合多肽的核酸分子，特别优选包含(可选地基本上由以下组成或可选地由以下组成)与SEQID NO:13-19中示出的任何核苷酸序列或者其任何变体和片段表现出至少80％相同性，有利地至少85％相同性，优选至少90％相同性，更优选至少95％相同性，并且甚至更优选100％相同性的核苷酸序列的核酸分子。
本发明的核酸分子可以利用本领域可使用的序列数据以及本文提供的序列信息产生。例如，它们可以利用本领域公知的常规技术分离，例如通过PCR分离和/或通过常规分子生物学从特定物种的分枝杆菌基因组或其基因组片段、cDNA和基因组文库或者已知包含它的任何现有技术载体克隆。或者，本发明的核酸分子还可以在自动化过程中通过化学合成产生(例如组装自重叠合成的寡核苷酸)。
本发明的另一实施方案涉及本发明的核酸分子的片段，例如限制性内切核酸酶和PCR产生的片段。这类片段可以用作探针、引物或编码相关免疫原性部分的片段。
载体
本发明还涉及包含本发明的一个或多个核酸分子(编码所述异源寡聚分枝杆菌抗原的融合物和/或所述额外的分枝杆菌抗原的融合多肽)的载体以及包含这类载体的组合物。
如本文所用，术语“载体”指媒介物，优选核酸分子或病毒颗粒，其包含允许在宿主细胞或个体内递送、增殖和/或表达本文所述的任何核酸分子所必需的元件。这个术语涵盖用于维持的载体(克隆载体)或者用于在各种宿主细胞或个体中表达的载体(表达载体)，染色体外载体(例如多拷贝质粒)或整合载体(例如设计为整合入宿主细胞基因组并且在宿主细胞复制时产生额外拷贝的核酸分子)以及穿梭载体(例如在原核和/或真核宿主中发挥功能)和转移载体(例如用于在病毒基因组中转移核酸分子)。为了本发明的目的，载体可以是天然存在的遗传来源的、合成的或人工的，或者天然和人工遗传元件的一些组合。
在本发明的上下文中，术语“载体”必须广泛理解为包括质粒和病毒载体。在本发明的上下文中适合的载体包括但不限于用于在原核宿主细胞如细菌(例如大肠杆菌、BCG或李斯特菌(Listeria))中表达的噬菌体、质粒或粘粒载体；用于在酵母(例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、粟酒裂殖酵母(Schizosaccharomyces pombe)、毕赤酵母(Pichia pastoris))中表达的载体；用于在昆虫细胞系统(例如Sf 9细胞)中表达的杆状病毒载体；以及用于在高等真核细胞或个体中表达的质粒和病毒载体。通常，这类载体可商业获得(例如在Invitrogen、Stratagene、Amersham Biosciences、Promega等)或获得自保存机构如美国典型培养物保藏中心(ATCC,Rockville,Md.)或者是描述它们的序列、组织和制备方法的许多出版物的主题，允许技术人员应用它们。本发明还涵盖与脂质或聚合物络合以形成颗粒结构如脂质体、脂质复合物(lipoplex)或纳米颗粒的载体(例如质粒DNA)。
如本文所用，“质粒载体”指可复制的DNA构建体。通常质粒载体包含可选择的标记基因，其允许在相应的选择药物的存在下选择或反选携带质粒载体的宿主细胞。各种阳性和阴性的可选择的标记基因是本领域已知的。通过说明的方式，抗生素抗性基因可以用作阳性的可选择的标记基因，其允许在相应的抗生素的存在下选择宿主细胞。合适的质粒载体的代表性实例包括但不限于pREP4、pCEP4(Invitrogen)、pCI(Promega)、pVAX(Invitrogen)和pGWiz(Gene Therapy System Inc)。
如本文所用，术语“病毒载体”指包括至少一个病毒基因组的元件并且可以包装入病毒颗粒或包装为病毒颗粒的核酸载体。术语“病毒”、“病毒粒子”“病毒颗粒”和“病毒载体颗粒”可交换地用来指在根据允许产生病毒颗粒的合适条件将核酸载体转导入适当的细胞或细胞系时形成的病毒颗粒。在本发明的上下文中，术语“病毒载体”必须广泛理解为包括核酸载体(例如DNA病毒载体)及其产生的病毒颗粒。术语“感染性”指病毒载体感染并进入宿主细胞或个体的能力。病毒载体可以是可复制的或可选择性复制的(例如工程化以在特定宿主细胞中更好地复制或选择性地复制)，或者可以是遗传缺陷的，以便是复制缺陷的或复制受损的。
合适的病毒载体的代表性实例产生自各种不同的病毒(例如逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关(AAV)、痘病毒、疱疹病毒、麻疹病毒、泡沫病毒、甲病毒、水疱性口炎病毒等)。如上文所述，术语“病毒载体”涵盖载体DNA、基因组DNA及其产生的病毒颗粒，特别是感染性病毒颗粒。
在一实施方案中，本发明中采用的病毒载体是复制缺陷或复制受损的，这表示其不可以在给药的正常细胞(例如正常人细胞)或个体中复制至任何显著程度(复制功能的受损或缺陷可以通过常规方式评价-例如通过测量非允许细胞中的DNA合成和/或病毒滴度)。这类复制缺陷或受损的载体通常需要提出或补充缺失/受损的功能的增殖、允许细胞系。
可用于本发明的上下文的病毒载体的实例包括腺病毒载体，其具有许多很好记录的优点用于免疫接种、免疫疗法、基因转移或用于重组产生(对于综述，参见“Adenoviralvectors for gene therapy”,2002,Ed D.Curiel and J.Douglas,Academic Press)。本发明的腺病毒载体可以源自各种人或动物来源(例如犬、羊、猿猴腺病毒等)。可以采用任何血清型，特别优选人腺病毒，并且特别优选亚属C如Ad2、Ad5、Ad6和亚属B如Ad11、Ad34和Ad35。使用动物Ad也可以是有利的，特别优选黑猩猩Ad，如黑猩猩Ad3和Ad63。所引用的腺病毒可获得自ATCC或者已是描述它们的序列、组织或制备方法的许多出版物的主题，允许技术人员应用它们(参见例如US 6,136,594；US 6,133,028；WO00/50573；WO00/70071；WO2004/083418；WO2004/097016和WO2005/071093)。
优选的复制缺陷型腺病毒载体是具有从大约位置459延伸至3328或从大约位置459延伸至3510的E1缺失的E1-缺陷型(参考GeneBank公开的登录号M 73260的Ad5序列)。通过缺失腺病毒基因组的额外部分可以进一步提高克隆能力(如WO94/28152和Lusky etal.,1998,J.Virol 72:2022所述的全部或部分的非必要的E3区(例如从大约位置27867至30743缺失)或其他必要的E2和/或E4区)。
可以将本发明的核酸分子独立地插入腺病毒基因组的任何位置，特别优选替换E1和/或E3区的插入。相对于所讨论的区域的天然翻译方向，它们可以位于正义或反义方向。
在本发明的上下文中特别适合的病毒载体的其他实例包括痘病毒如禽痘载体(例如FP9)、金丝雀痘载体(例如ALVAC)和痘苗病毒载体，优选后者。合适的痘苗病毒包括但不限于哥本哈根毒株、惠氏毒株、NYVAC(US 5,494,807)和修饰的安卡拉(MVA)毒株(Antoineet al.,1998,Virol.244:365；WO02/42480)。用于构建和制备重组痘病毒的一般条件是本领域公知的(参见例如WO2010/130753；WO03/008533；US 6,998,252；US 5,972,597和US 6,440,422)。优选将本发明的核酸分子插入痘病毒基因组内的非必需基因座。胸苷激酶基因特别适合插入哥本哈根痘苗载体，并且缺失II或III用于插入MVA载体(WO97/02355)。
在本发明的上下文中适合的其他病毒载体是可以获得自副粘病毒科的麻疹病毒属，特别优选麻疹病毒。各种减毒毒株在本领域中是可获得的(Brandler et al,2008,CIMID,31:271；Singh et al.,1999,J.virol.73(6):4823)，例如且不限于，Edmonston A和B毒株(Griffin et al.,2001,Field’s in Virology,1401-1441)、Schwarz毒株(SchwarzA,1962,Am J Dis Child,103:216)、S-191或C-47毒株(Zhang et al.,2009,J MedVirol.81(8):1477)。在P和M基因之间或者H和L基因之间插入是特别合适的。
用于本发明的合适的载体还包括细菌细胞，其可以是野生型或突变的(例如无毒的)。这类细菌细胞的公知的实例包括但不限于无毒的分枝杆菌(例如牛分枝杆菌BCG)、乳杆菌(例如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis))、李斯特菌(例如单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes))以及其他微生物如沙门氏菌和假单胞菌。一优选实施方案涉及BCG载体，已经以允许BCG载体表达这类元件的方式将编码如上文定义的一个或多个分枝杆菌抗原或融合多肽的核酸分子并入其基因组。
在一实施方案中，本发明的免疫原性组合中包含的核酸分子由单一载体携带。或者它们可以由两个或更多个载体携带，所述载体可以同时或顺序向个体给药。
按照本发明，本发明的载体中包含的核酸分子为适合在宿主细胞或个体中表达的形式，这表示将本文示出的核酸分子可操作地连接至适当的调节序列。如本文所用，术语“调节元件”或“调节序列”指允许、有助于或调节核酸分子在给定宿主细胞或个体中的表达的任何元件，包括核酸或其衍生物(即mRNA)的复制、重复、转录、剪切、翻译、稳定性和/或转运。本领域技术人员会理解调节序列的选择可以取决于这类因素如载体自身、宿主细胞或个体、期望的表达水平等。“可操作地连接”表示这样排列连接的元件，从而它们为了它们的预期目的一致发挥功能。例如，如果启动子影响从转录起始至终止子转录，导致在允许的宿主细胞中表达核酸分子中存在的编码序列，则将启动子可操作地连接至核酸分子。
特别地，将本发明的免疫原性组合中包含的核苷酸分子置于启动子的转录控制下，所述启动子适合确保在哺乳动物细胞中表达所编码的多肽和/或融合物以及最终表达额外的分枝杆菌抗原。在本发明的上下文中，启动子可以在许多类型的宿主细胞中组成型指导可操作地连接的核酸分子的表达，或者是某些宿主细胞特异性的(例如肺特异性调节序列)，或者对特定事件或外源因素应答调节(例如通过温度、营养添加物、激素等)，或者根据病毒周期的阶段(例如晚期或早期)。人们还可以使用在制备步骤中对特定事件或外源因素应答而受到抑制的启动子，以便优化载体制备并避免所表达的多肽的潜在毒性。
适合在哺乳动物细胞中组成型表达的启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)立即早期启动子(US 5,168,062)、RSV启动子、腺病毒主要晚期启动子、磷酸甘油激酶(PGK)启动子、单纯疱疹病毒(HSV)-1的胸苷激酶(TK)启动子和T7聚合酶启动子。启动子如trp、lac、噬菌体启动子、tRNA启动子和糖酵解酶启动子可以用于原核宿主。可用的酵母启动子包括金属硫蛋白、3-磷酸甘油酸激酶或者其他糖酵解酶如烯醇化酶或甘油醛-3-磷酸脱氢酶、负责麦芽糖和半乳糖利用的酶的启动子区。痘苗病毒启动子特别适合在痘病毒载体中表达。代表性实例包括但不限于痘苗7.5K、H5R、B2R、A35R、11K7.5(Erbs et al.,2008,Cancer GeneTher.15:18)、TK、p28、p11和K1L启动子，以及合成启动子如Chakrabarti et al.(1997,Biotechniques 23:1094-7；Hammond et al.,1997,J.Virol Methods 66:135-8；andKumar and Boyle,1990,Virology 179:151-8)中描述的那些合成启动子，以及早期/完全嵌合启动子(例如pSE/L)。适合麻疹介导的表达的启动子包括但不限于指导麻疹转录单元表达的任何启动子(Brandler and Tangy,2008,CIMID 31:271)。
本领域技术人员会理解控制本发明的核酸分子表达的调节元件可以进一步包含额外的元件用于转录的正确起始、调节和/或终止(例如polyA转录终止序列)，mRNA转运(例如核定位信号序列)，加工(例如剪切信号)，以及稳定性(例如内含子以及非编码的5'和3'序列)，在宿主细胞或个体中翻译(例如起始Met、三方前导序列、IRES核糖体结合位点、Shine-Dalgarno序列等)以及纯化步骤(例如如本文所述的标签)。
本发明的特别优选的实施方案涉及选自以下的载体(或其病毒颗粒)：
(i)一种载体，其包含：编码包含异源寡聚配对物ESAT-6和CFP10的融合物的核酸分子、编码Ag85B的核酸分子和编码Rv2626的核酸分子；
(ii)一种载体，其包含：编码包含异源寡聚配对物ESAT-6和CFP10的融合物的核酸分子；编码包含异源寡聚配对物TB10.4和TB9.8的融合物的核酸分子，编码包含额外的分枝杆菌抗原Rv2626和Ag85B的融合多肽的核酸分子；编码包含额外的分枝杆菌抗原RpfB和RpfD的融合多肽的核酸分子；以及编码包含额外的分枝杆菌抗原Rv3407和Rv1813的融合多肽的核酸分子(如所附实施例中MVATG18598说明的)；以及
(iii)一种载体，其包含编码异源寡聚配对物ESAT-6和CFP10的核酸分子，以及额外的分枝杆菌抗原Ag85B、Rv2626、RpfB和RpfD的核酸分子的组合(如所附实施例中MVATG18597说明的)。
更优选地，上述载体为MVA载体。
根据一优选实施方案，本发明的载体为感染性病毒颗粒形式。通常，通过包括以下步骤的方法制备这类病毒颗粒：(i)将本发明的病毒载体引入生产细胞，(ii)在允许产生所述感染性病毒颗粒的合适条件下培养所述生产细胞，(iii)从所述生产细胞的培养物回收产生的病毒颗粒，以及(iv)任选地纯化所述回收的病毒颗粒。
当病毒载体是复制缺陷或复制受损的时，通常在允许生产细胞中或者通过使用反式提供缺失/受损功能的辅助病毒制备颗粒。例如，用于补充E1缺失的腺病毒载体的合适的生产细胞包括293细胞(Graham et al.,1997,J.Gen.Virol.36:59-72)以及HER-96和PER-C6细胞(例如Fallaux et al.,1998,Human Gene Ther.9:1909-17；WO97/00326)或这些细胞系的任何衍生物。禽细胞特别适合用于繁殖痘病毒载体，包括但不限于制备自获得自受精卵的鸡胚的原代鸡胚成纤维细胞(CEF)，以及鸭细胞系(例如WO03/076601、WO2009/004016、WO2010/130756和WO2012/001075所述)。
感染性病毒颗粒可以回收自培养物上清和/或在裂解之后回收自生产细胞。它们可以根据标准技术(色谱、超速离心等)进一步纯化。
本发明还涵盖已修饰以允许优先靶向特定宿主细胞的载体或病毒颗粒。靶向载体的特征性特性是在它们的表面存在能够识别并结合细胞和表面暴露的组分如细胞特异性标记(例如分枝杆菌感染的细胞)、组织特异性标记(例如肺特异性标记)等的配体。
合适的配体的实例包括针对分枝杆菌抗原结构域的抗体或其片段。可以通过将配体遗传插入病毒表面上存在的多肽(例如腺病毒纤维、五邻体、pIX或痘苗p14基因产物)来进行靶向。
宿主细胞和制备方法
在另一方面，本发明还涉及包含本发明的免疫原性组合、融合多肽、核酸分子或载体(例如病毒颗粒)的宿主细胞以及包含这样的宿主细胞的组合物。
如本文所用，术语“宿主细胞”应当没有任何限制地广泛理解为关于组织、器官或分离细胞中的特定组织。这类细胞可以是独特类型的细胞或一组不同类型的细胞如培养的细胞系、原代细胞和增殖细胞。本发明涵盖原核宿主细胞，低等真核宿主细胞如酵母，其他真核宿主细胞如昆虫细胞、植物和哺乳动物(例如人或非人)细胞以及能够产生本发明的载体的生成细胞(例如293、HER96、PERC.6细胞、CEF、鸭细胞系等)。这个术语还包括可以是或已经是本文所述载体的受体的细胞以及这类细胞的子代。
根据本发明的一特定实施方案，可以将宿主细胞进一步包裹。细胞包裹技术是本领域已知的。
本发明的另一方面是一种重组制备免疫原性组合包含或编码的分枝杆菌抗原(例如异源寡聚配对物和/或额外的分枝杆菌抗原的融合物)的方法，采用本发明的载体(或感染性病毒颗粒)和/或宿主细胞。通常，所述方法包括以下步骤：(i)将载体引入合适的宿主细胞以产生转染或感染的宿主细胞，(ii)在适合宿主细胞生长的条件下体外培养所述转染或感染的宿主细胞，(iii)回收细胞培养物，以及(iv)任选地，纯化回收自细胞培养物的分枝杆菌抗原。
期望本领域技术人员非常了解本领域可用于表达多肽的许多表达系统以及将载体引入宿主细胞的方法。这类方法包括但不限于显微注射、CaPO4介导的转染、DEAE-葡聚糖介导的转染、电穿孔、脂质体转染/脂质体融合、基因枪、转导、病毒感染以及通过各种方式直接给药入宿主生物体。所述方法还可以与促进将核酸引入宿主细胞的常规转染试剂联用，如聚阳离子聚合物(例如壳聚糖、聚甲基丙烯酸酯、PEI等)和阳离子脂质(例如DC-Chol/DOPE、transfectam、lipofectin等)。
可以在常规发酵生物反应器、烧瓶和培养皿中培养宿主细胞。培养可以在适合给定宿主细胞的温度、pH和氧含量下进行。这里不会尝试详细描述本领域可用于这类目的的各种原核和真核表达系统。
在一优选实施方案中，所述方法采用大肠杆菌宿主细胞，特别是在其基因组中携带D13原噬菌体以允许通过乳糖或乳糖类似物(例如IPTG：异丙基b-D-1-硫代吡喃半乳糖苷)可诱导表达T7聚合酶的大肠杆菌菌株。这类菌株对于各种制造商(例如Lucigen、Merck等)是可获得的。质粒引入之后，可以将转化的大肠杆菌细胞在约18℃至约39℃之间包含的温度(特别优选约30℃或约37℃)下于适合载体选择标记(例如抗生素的存在)和宿主菌株(例如在诱导剂如IPTG的存在下)的常规培养基中培养6-48小时的时间(特别优选约8-约24h)。回收细胞培养物，并且可以将其裂解(例如用去污剂化学裂解、超声处理等)。细胞裂解物的离心之后，可以收集上清和沉淀用于进一步分析(例如通过SDS PAGE)以评价表达水平以及所表达的物质的溶解性(例如可溶性物质可以在细胞裂解物上清中找到，而不溶性物质可以被困在包涵体中)。
分枝杆菌抗原和/或其融合物可以回收自培养物上清和/或宿主细胞(例如在细胞裂解时)。回收的物质可以任选地通过公知的纯化方法进行纯化，包括硫酸铵沉淀、酸提取、凝胶电泳；过滤和色谱方法(例如反相、大小排阻、离子交换、亲和、疏水相互作用、羟基磷灰石、高效液相色谱等)。使用的条件和技术取决于诸如净电荷、分子量、疏水性、亲水性的因素，并且对于本领域技术人员是显而易见的。此外，纯化水平取决于预期用途。例如，可以通过Bradford测定(Biorad)评价蛋白浓度，通过诸如便携式测试系统(Charles RiverLaboratories)的技术可以评价内毒素水平，并且可以利用MALDI(基质辅助的激光解吸/电离)或电喷雾方法测量纯化的多肽的质量。
组合物
在另一方面，本发明提供一种组合物，其包含至少一种本文描述的免疫原性组合、融合多肽、核酸分子、载体(例如感染性病毒颗粒)或宿主细胞(在本文中也称作“活性剂”)或者它们的任何组合(例如不同多肽或载体/病毒颗粒的组合)。优选地，所述组合物是一种药物组合物，其进一步包含治疗有效量的活性剂，一种或多种药学可接受的媒介物。
如本文所用，“药学可接受的媒介物”意图包括与在个体特别是人中给药相容的任何和所有载体、溶剂、稀释剂、赋形剂、佐剂、分散介质、包衣、抗细菌和抗真菌剂以及吸收延迟剂等。
如本文所用，“治疗有效量”对于预期用途足够的剂量。当考虑预防用途时，这个术语表示足以防止或延迟分枝杆菌感染(例如Mtb感染)的发生和/或建立的剂量。对于“治疗”用途，向已感染分枝杆菌属物种的个体给药所述组合物，目的是治疗活性疾病或预防在潜伏性感染的个体中重新激活，最终与一种或多种常规治疗方法组合。特别地，治疗有效量的本发明的组合物可以是在给药个体中引起免疫系统的诱导或刺激(例如导致先天和/或特定应答的发展)所必需的量。
待治疗的个体可以是新生儿、婴儿、年轻人或成人。在用本文所述活性剂治疗之前，所述个体可以以前已用Bacillus Calmette-Guérin(BCG)免疫或者以前已治疗分枝杆菌感染。其可能或没有共感染另一病原生物体(例如人免疫缺陷病毒HIV)。
特别地，待治疗的个体感染了毒性分枝杆菌属物种(例如Mtb)，其可以是耐药(例如MDR、XDR或TDR)菌株。感染性分枝杆菌可以是与本发明中使用的活性剂包含或编码的抗原所来源的任何分枝杆菌相同的菌株或分离株，或者其可以来自不同菌株或分离株。
将本发明的组合物适当缓冲以便适合在生理或略微碱性pH(例如约pH 7-约pH 9)下用于人或动物用途。合适的缓冲液包括但不限于磷酸盐缓冲液(例如PBS)、碳酸氢盐缓冲液和/或Tris缓冲液。
本发明的组合物可以进一步包含适合用于人或动物用途的稀释剂。其优选是等渗的、低渗的或弱高渗的，并且具有相对低的离子强度。代表性实例包括无菌水，生理盐水(例如氯化钠)，林格氏液，葡萄糖、海藻糖或蔗糖溶液，汉克斯溶液以及其他水性生理平衡盐溶液(参见例如最新版本的Remington:The Science and Practice of Pharmacy,A.Gennaro,Lippincott,Williams&Wilkins)。
额外的药学可接受的赋形剂可以用于提供可取的药学或药效学特性，包括例如修改或保持pH、渗透压、粘度、澄清度、颜色、无菌度、稳定性、制剂的溶解速率，修改或保持释放或吸收入人或动物生物体，促进穿越血液屏障运输或渗透入特定器官(例如肺)中。
此外，本发明的组合物可以包含适合在人中全身或粘膜施用的一种或多种佐剂。优选地，所述佐剂能够刺激对本发明的组合物的免疫，特别是T细胞介导的免疫，例如通过toll样受体(TLR)，如TLR-7、TLR-8和TLR-9。可用的佐剂的代表性实例包括但不限于明矾，矿物油乳剂如弗氏完全和不完全(IFA)，脂多糖或其衍生物(Ribi et al.,1986,Immunology and Immunopharmacology of Bacterial Endotoxins,Plenum Publ.Corp.,NY,p407-419)，皂草苷如QS21(WO 98/56415)，咪唑并-喹啉化合物如咪喹莫德(WO2007/147529)，胞嘧啶磷酸鸟苷寡脱氧核苷酸如CpG和阳离子肽如IC-31(Kritsch et al.,2005,J.Chromatogr Anal.Technol Biomed Life Sci 822:263)或者它们的任何衍生物。
本发明的组合物中包括的药学可接受的媒介物还必须允许在冷冻(例如-70℃、-20℃)、冷藏(例如4℃)、环境温度下制备和长期储存(即至少一个月，优选至少一年)的条件下保持其稳定性。这类“长期”制剂是本领域已知的(例如WO98/02522；WO03/053463)。人们可以引用(a)1M蔗糖、150mM NaCl、1mM MgCl2、54mg/l吐温80、10mM Tris pH 8.5，(b)10mg/ml甘露醇、1mg/ml HAS、20mM Tris、pH 7.2和150mM NaCl以及(c)生理盐水，其特别适合本发明的组合物。
本发明的组合物可以为各种形式，例如固体、液体或冷冻。固体(例如干粉或冻干)组合物可以通过包括真空干燥和冷冻干燥的方法获得。在一具体实施方案，配制本发明的组合物用于以喷雾干燥(参见例如WO2010/135495)或液滴形式(特别优选具有100-5000μm的平均直径的液滴)在呼吸道中递送(例如通过吸入、鼻内或肺内途径)。
本发明的免疫原性组合、融合多肽、核酸分子、载体、宿主细胞或组合物适合各种给药模式。在本发明的上下文中任何常规给药途径均可应用，包括全身、局部或粘膜途径。
全身给药包括例如皮下、皮内、肌肉内、静脉内、腹腔内、血管内、动脉内注射以及划痕。注射可以用常规注射器和针头进行，或者本领域可用的其他适当的装置(例如电穿孔)。粘膜给药包括但不限于口服/消化、鼻内、气管内、肺内、阴道内或直肠内途径。在呼吸道中给药可以通过液滴、喷雾或干粉组合物的喷雾或雾化利用适当的分配器进行。局部给药还可以利用透皮方式(例如贴剂等)进行。在本发明的上下文中特别优选肌肉内、皮内和皮下途径以及鼻内、气管内和肺内给药。
可以将适当的剂量改成各种参数的函数，特别是所述组合物中包含的活性剂，给药模式；个体的年龄、健康和体重；症状的性质和程度；目前治疗的种类；治疗频率；和/或预防或治疗的需要。确定治疗的适当剂量所必需的计算的进一步细化由从业人员鉴于相关环境常规进行。
对于一般指导，包含病毒载体的组合物的合适剂量变化从约104至约1013vp(病毒颗粒)、iu(感染单位)或pfu(空斑形成单位)，取决于使用的载体和定量技术。可用于评价样品中存在的vp、iu和pfu的量的技术在本领域中是常规的。例如，通常通过测量A260吸光度或HPLC确定腺病毒颗粒(vp)的数量，通过定量DBP免疫荧光确定iu滴度，并且通过计数感染允许细胞之后空斑的数量确定pfu。优选地，按照FDA指导，vp/iu比例低于100。优选剂量包含约105-约1012vp的腺病毒载体(例如约5x108、约109、约5x109、约1010、约5x1010vp或约1011vp)。对于基于痘苗(例如MVA)的组合物优选约5x105-约109pfu的剂量，特别优选约5x106、约107、约5x107、约108或约5x108pfu。对于基于麻疹的组合物，优选约5x104-约107pfu的剂量，特别优选约105、5x105、106或5x106pfu。基于质粒载体的组合物可以以10μg-20mg的剂量给药，有利地100μg-2mg。蛋白组合物可以以10μg-20mg的剂量给药，特别优选对于所述组合物中包含的每种分枝杆菌抗原约0.1mg-约2mg/kg体重。
给药可以以单一剂量或者一定时间间隔之后的重复剂量进行。重复给药(2、3、4、5、6、7、8、9、10等)可以互相分开适当时间，并且通过相同途径或通过不同给药途径在相同部位或在不同部位进行。此外，每次给药可以使用相同活性剂或不同活性剂。为了说明的目的，互相分开约一周(例如3-10天)的2或3次皮下给药特别适合基于MVA的组合物，而一次或两次肌肉内给药特别适合基于Ad、麻疹和质粒的组合物。还可以通过休息时间之后重复的给药的顺序周期(例如每周给药的周期)进行。第一系列的给药之后可以是一次或多次“召回”给药(例如4个月-几年之后)，以便召回引发的抗分枝杆菌免疫应答。
在一具体实施方案中，给药可以根据引发强化方式进行，其包括一种或多种引发组合物以及一种或多种强化组合物的顺序给药。通常，引发和强化组合物使用不同活性剂，所述活性剂包含或编码至少一种共同的分枝杆菌抗原、免疫原性组合或表位。引发和强化组合物可以通过相同途径或通过不同给药途径在相同部位或在可选部位给药。例如，基于多肽的组合物可以通过粘膜途径给药，而基于载体的组合物优选例如通过皮下或肌肉内途径注射。为了说明的目的，人们可以考虑用活减毒细菌(如BCG)引发宿主的应答，并且用至少一种本文描述的“活性剂”(例如本发明的免疫原性组合、融合多肽、核酸分子、载体(例如感染性病毒颗粒)或宿主细胞或者它们的任何组合)强化。
预防和治疗用途
本发明的免疫原性组合、融合物、核酸分子、载体、宿主细胞或组合物优选用于预防或治疗分枝杆菌感染或者由其引起或与其相关的任何疾病和病理状况。这样的用途旨在诱导或刺激针对分枝杆菌抗原/表位的保护性免疫应答。
在一实施方案中，本发明的免疫原性组合、融合物、核酸分子、载体、宿主细胞或组合物用于在有此需要的个体中预防感染或延迟感染分枝杆菌的风险的方法，特别是已密切接触已发展活性疾病的感染个体并且因此有发展分枝杆菌感染的风险的个体(例如通过吸入患有TB的个体咳出的湿润液滴中的杆菌传播)。
在另一实施方案中，本发明的免疫原性组合、融合物、核酸分子、载体、宿主细胞或组合物用于治疗感染分枝杆菌属物种特别是Mtb的个体中的活性疾病，所述方法包括以下步骤，向患有发展的活性疾病的感染个体给药治疗有效量的本文描述的免疫原性组合、融合物、核酸分子、载体、宿主细胞或组合物，以便诱导针对感染性分枝杆菌属物种的免疫应答，从而延迟或减少发展活性疾病的风险。
“活性疾病”指具有表现严重的疾病症状的分枝杆菌感染。例如，在人个体中，TB的特征在于一般临床表现(如体重减轻、虚弱、发热、盗汗)，临床表现和/或症状(如在肺TB的情况下咳嗽、咯血、胸部疼痛)，和/或在某些情况下根据感染部位的肺外表现(如淋巴结、骨形式、脑膜炎、urologenital形式)。
在另一实施方案中，本发明的免疫原性组合、融合物、核酸分子、载体、宿主细胞或组合物用于预防或治疗潜伏性感染分枝杆菌属物种特别是结核分枝杆菌的个体中的重新激活，所述方法包括以下步骤，向所述潜伏性感染的个体给药治疗有效量的本文描述的免疫原性组合、融合物、核酸分子、载体、宿主细胞或组合物，以便诱导针对感染性分枝杆菌属物种的免疫应答，从而防止或延迟重新激活。
“潜伏性感染的个体”理解为已感染毒性分枝杆菌属物种(例如Mtb)但是未表现出明显的疾病症状或临床表现的个体。通常，潜伏性感染的个体在其体内保留分枝杆菌，不是临床上生病的，但是保留随后发展为临床疾病(重新激活)的风险，特别是在免疫抑制的背景下(例如共感染另一病原体如HIV或在免疫抑制治疗如TNFa抑制剂下)。如果通过允许诊断Mtb感染的任何测试(例如结核菌素测试、PPD反应性的Mantoux测试和/或IFNg释放测定)进行测试，预期Mtb潜伏性感染的个体会是阳性的。
术语“重新激活”指在测试分枝杆菌感染阳性但未表现出明显的疾病症状的个体中后来表现分枝杆菌相关疾病的疾病症状。例如重新激活可以发生在可能具有或没有以前表现的活性疾病症状的感染个体中，或者已充分治疗以将感染带入潜伏状态的感染个体中。例如，将Mtb感染的个体以前用BCG免疫或者以前治疗Mtb感染(例如用一种或多种“前线”化疗药物)。
在一具体实施方案中，本发明的免疫原性组合、融合物、核酸分子、载体、宿主细胞或组合物用作BCG强化剂以增加BCG免疫接种在免疫接种的个体中的效力。
与化疗的关联
本发明的免疫原性组合、融合物、核酸分子、载体、宿主细胞或组合物可以与一种或多种常规疗法联用，例如有效针对分枝杆菌感染(例如Mtb感染)的一种或多种化疗药物。
化疗通常由治疗医生利用目前的实践确定。这类化疗药物的实例包括但不限于如本领域描述的抗生素以及小直接和间接抑制剂分子、抗体和免疫疗法。通常，目前用来治疗不耐药的Mtb感染的“前线”抗生素化疗包括异烟肼、利福霉素(即，利福平、利福喷汀和利福布汀)、乙胺丁醇、链霉素、吡嗪酰胺和氟喹诺酮类。用来治疗已证实对一种或多种“一线”疗法耐药的Mtb感染的“二线”化疗包括氧氟沙星、环丙沙星、乙硫异烟胺、对氨水杨酸、环丝氨酸、阿卡米星、卡那霉素和卷曲霉素。所述一种或多种化疗剂一般在适当的时间中给药，例如，一个月或几个月(例如1、2、3、4、5、6、9或12个月)或更长。在6-12个月的时间中每日给药剂量200-600mg(例如300或400mg)是适当的。
在一实施方案中，本发明的免疫原性组合、融合物、核酸分子、载体、宿主细胞或组合物用于减少针对分枝杆菌(例如Mtb)感染的化疗的时间过程。通常，给药本文所述活性剂会允许增强化疗的效力，(例如减少临床表现的持续时间和/或严重程度，提高痰转化率等)，减少化疗的长度和/或采用的化疗药物的数量，特别是在感染性分枝杆菌耐药时。
按照本发明，本发明的免疫原性组合、融合物、核酸分子、载体、宿主细胞或组合物可以在给药一种或多种化疗药物之前、同时或之后给药。在一实施方案中，在开始给药化疗之后至少2周给药本文描述的活性剂。
在一优选实施方案中，本发明的免疫原性组合、融合物、核酸分子、载体、宿主细胞和/或组合物用于在给药个体中诱导或增强免疫应答。因此，本发明还涵盖一种在个体中给药本发明的免疫原性组合、融合物、核酸分子、载体、宿主细胞和/或组合物时诱导或刺激针对分枝杆菌抗原的免疫应答的方法。
诱导或刺激的免疫应答可以是特异性的(即针对分枝杆菌表位/抗原)和/或非特异性的(先天的)，体液的和/或细胞的。在本发明的上下文中，免疫应答优选是针对分枝杆菌抗原/表位的CD4+或CD8+介导的T细胞应答。
本文描述的活性剂诱导或刺激免疫应答的能力可以在体外或体内利用本领域中标准的各种直接或间接测定进行评价。
例如，非特异性免疫的诱导可以通过测量NK/NKT-细胞(例如激活的代表性和水平)，以及IFN相关的细胞因子和/或趋化因子产生级联，TLR的激活和先天免疫的其他标记(例如Riano et al.,2012,Tuberculosis 92:148-59)来进行。
刺激体液应答的能力可以通过增加对本文所述免疫原性组合和融合物包含或编码的至少一种抗原特异性的抗体滴度来确定。示例性技术包括但不限于抗体结合、结合竞争以及ELISA和蛋白印迹。
细胞免疫的评价可以例如通过对本文所述免疫原性组合和融合物包含或编码的至少一种分枝杆菌抗原特异性的免疫细胞如T淋巴细胞的频率增加来估算。人们还可以在放射性标记时监测细胞增殖(例如通过[3H]胸苷掺入测定的T细胞增殖测定)。检测免疫应答的另一灵敏方法是ELISpot，其中确定IFNg-产生细胞的频率。还可以在敏化个体中或通过免疫适当动物模型来评价抗体特异性T淋巴细胞的细胞毒性能力。还可以通过利用常规生物测定(例如通过多参数流式细胞术(ICS)、通过利用多元技术或ELISA的细胞因子谱分析等)定量激活的T细胞产生的相关Th1和/或Th2细胞因子的释放来进行。PCR技术也可以用来确定编码相关细胞因子的mRNA的存在。技术人员会理解这类相关细胞因子量的显著增加或减少可以用来评价本文描述的一种或多种活性剂的免疫原性活性。
这类免疫学读出是本文所述活性剂提供的针对分枝杆菌感染的保护性免疫应答的可接受的相关性。“保护性应答”具有其通常的含义，与未治疗的个体中的应答相比，治疗向治疗的个体提供益处；例如诱导或刺激免疫应答，保护免于患有分枝杆菌感染，或者增加对活性疾病的抗性或防止潜伏性分枝杆菌感染的重新激活或甚至在活性疾病发展之后治愈。
这样的保护性免疫应答还可以在适当的实验动物如小鼠、大鼠或豚鼠中体内评价(参见Ashwin et al.,2008,Am J Resp,39:503-8；Acosta et al.,2011,Malays J Med,18:5-12)，例如通过测量与感染相同的分枝杆菌毒性菌株但以前未免疫的对照组实验动物中的分枝杆菌cfu相比，分离自以前用本文描述的一种或多种活性剂免疫之后接受用分枝杆菌属物种(例如Mtb)的毒性菌株攻击感染的动物的脾、肺或其他组织匀浆的分枝杆菌集落形成单位(cfu)的减少。治疗和未治疗组之间的比较还可以在动物存活上评价(治疗组中增加的存活与保护性免疫应答相关)。
本发明的免疫原性组合、融合物、核酸分子、载体、宿主细胞或组合物提供的保护性应答还可以在根据本文所述方式于人个体中给药时估算，超过基线状态或超过如果未治疗的预期状态。保护性应答可以通过医生或其他熟练的医护人员通常使用的任何相关临床测量证实，例如：
-给定人口如中国人口或给定国家中的流动人口中疾病发病率和/或流行程度和/或频率的减少(例如在已接受本文所述活性剂的组中较低比例的已诊断为分枝杆菌感染或有发展分枝杆菌感染的风险或患有与分枝杆菌感染相关的疾病的新个体)；
-在治疗个体组中较高百分比的痰转化率；
-在治疗个体组中较高百分比的治愈活性疾病；
-与感染个体密切接触之后分枝杆菌传播程度减少(例如感染的风险或发展活性疾病的风险减少或延迟和/或在潜伏性感染的个体中重新激活的风险减少或延迟)；
-疾病状态的改善(例如靶组织或生物样品中细菌cfu减少；疾病症状或它们的严重程度(例如靶器官中病变的数量和/或严重程度)减少或者稳定(不恶化)的疾病状态)；以及
-治疗个体对同期治疗的应答提高(常规化疗药物的需要、数量、持续时间和/或剂量减少)。
在本发明的上下文中，保护性应答可以是短暂的(停止给药后几周)或持续的(几个月或几年)。因为从个体至另一个体可能变化很大的临床状态的自然过程，不需要在治疗的每个个体中观察免疫应答，而是在显著数量的个体中观察免疫应答(例如两组之间统计显著的差异可以通过本领域已知的任何统计检验确定，如Tukey参数检验、Kruskal-Wallis检验、根据Mann和Whitney的U检验、学生t-检验、Wilcoxon检验等)。
这类测量可以在给药本文所述活性剂之前(基线)和在治疗期间的各种时间点和停止治疗之后至少几(例如12)周进行。
对于一般指导，可以通过各种方式检测分枝杆菌感染和相关疾病。例如，Mtb感染还可以通过现在临床使用的许多方法定向，如Mantoux结核菌素皮肤测试(TST)、Quantiferon测试以及体外检测对HBHA的应答(肝素结合血凝素；Hougardy et al.,2007；PLos One 2(10):e926)或者在体外用ESAT6、CFP10和TB7.7刺激之后检测IP10(Ruhwald etal.,2008；Microbes Infect 9:806-12)。发展活性疾病的个体可以根据目前的实践诊断。为了说明的目的，TB诊断是基于通过显微镜术、培养技术、聚合酶链反应(PCR)及其各种衍生物检测临床样本中的致病细菌。还可以实施DNA指纹方法和间隔区寡核苷酸分型。分枝杆菌培养是鉴定结核分枝杆菌复合群的分离株和药物敏感性测试的黄金标准方法。还可以实施X射线技术和临床观察以支持活性肺和/或肺外疾病的发现。在另一方面，已开发许多血清学测定用于诊断Mtb感染，利用各种抗原检测循环抗体，包括补体结合试验、血球凝集试验、放射免疫测定和酶联免疫吸附测定(ELISA)。
本发明还涉及一种检测和/或定量生物样品(例如采自感染或怀疑感染分枝杆菌的个体的血浆、血清等)中针对分枝杆菌的抗体的方法，所述方法包括以下步骤：使所述生物样品与包含本发明的任何免疫原性组合、融合物、核酸分子、载体、感染性病毒颗粒、宿主细胞的试剂在允许抗体与任何上述试剂包含或编码的分枝杆菌抗原/表位之间形成复合物的条件下接触，以及通过任何适当的方式检测和/或定量所述复合物的形成。检测特异性抗体的存在是分枝杆菌感染(例如Mtb)的指示。
本领域的技术人员会容易地确定本发明的方法中使用的试剂的量。抗原/抗体复合物的检测和/或定量方式是常规的，并且是本领域技术人员公知的。通过说明的方式，人们可以提到印迹，ELISA，所谓的夹心技术，竞争技术，和PCR技术，特别是所谓的“实时”技术。可以通过偶联(即物理连接)至可检测的物质促进上述试剂的使用。可检测的物质的实例包括各种酶(例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙酰胆碱酯酶)、辅基(例如链霉抗生物素蛋白/生物素或抗生物素蛋白/生物素)、荧光物质(例如伞形酮、荧光素或荧光素衍生物)、发光物质、生物发光物质(例如萤光素酶、萤光素或水母发光蛋白)和放射性物质(例如125I、131I、35S或3H)。
本发明还涉及用于诊断分枝杆菌(例如Mtb)感染的试剂盒，对于抗原测定，其包含本发明的抗体，而对于抗体测定，其包含本发明的免疫原性组合、融合物、核酸分子、载体、宿主细胞、组合物。
所有上文引用的专利、出版物和数据库的公开均特别地整体援引加入本文，与每个这样的单独专利、出版物或事项特别且单独指明援引加入本文相同。
附图说明
图1 说明用(a)空MVATGN33.1或者(b)MVATG18379(Rv2029-Rv2626-Rv1733-Rv0111+RpfB-Dhyb-Ag85B-TB10.4-ESAT6+Rv0569-Rv1813-Rv3407-Rv3478-Rv1807)或MVATG18598(Rv2626-2a-Ag85B+CFP10-ESAT6+TB10.4-Rv0287+RpfB-Dhyb+Rv1813-2a-Rv3407)免疫C57BL/6小鼠之后诱导的细胞免疫应答。用特异性肽池(P)离体刺激之后在最后的MVA注射之后一周通过IFNγ ELISpot测定评价IFNγ产生细胞。每个单色条形代表单独小鼠的应答(6只小鼠/组)，而阴影的条形代表每组的中值。表示了实验界限(虚线)。利用Mann-Whitney检验进行统计分析。*，p<0.05。
图2 说明用(a)空MVATGN33.1或者(b)MVATG18377(Rv2029-Rv2626-Rv1733-Rv0111+RpfB-Dhyb-Ag85B-TB10.4-ESAT6+Rv0569-Rv1813-Rv3407-Rv3478-Rv1807)或MVATG18597(ESAT6+CFP10+Rv2626+Ag85B+RpfB-Dhyb)或MVATG18633(ESAT6+Rv1813+Rv2626+Ag85B+RpfB-Dhyb)免疫C57BL/6小鼠之后诱导的细胞免疫应答。用特异性肽池(P)离体刺激之后在最后的MVA注射之后一周通过IFNγ ELISpot测定评价IFNγ产生细胞。每个单色条形代表单独小鼠的应答(5只小鼠/组)，而阴影的条形代表每组的中值。表示了实验界限(虚线)。利用Mann-Whitney检验进行统计分析。*，p<0.05；**，p<0.01。
实施例
材料和方法
痘苗启动子以及编码不同Mtb抗原和融合物的合成基因由Geneart(Regensburg,Germany)合成。将序列优化用于人密码子使用，并且在ATG起始密码子之前添加Kozak序列(ACC)。此外排除一些基序：对在痘病毒载体中表达有害的TTTTTNT、GGGGG、CCCCC以及可以对在一些其他载体中表达有害的AAAGGG、AAAAGG、GGGAAA、GGGGAA(和互补序列TTCCCC、TTTCCC、CCTTTT、CCCCTT)。
异源寡聚Mtb抗原的MVATG18598表达融合物的构建
MVATG18598包含5个表达盒，每个编码2个Mtb抗原的融合物(如表1中说明的)。第一个融合物Rv2626/2a/Ag85B**(SEQ ID NO:9)由位置1-143的Rv2626序列、位置144-146的GSG接头、位置147-164的自我切割肽T2A序列和位置165-457的修饰的Ag85B序列(通过从第一个残基至大约位置32部分缺失N-端信号肽来相对于天然对应物修饰的Ag85B**)组成。将编码Rv2626/2a/Ag85B**的核苷酸序列(SEQ ID NO:16)置于pB2R启动子(SEQ ID NO:20)的控制下。第二个融合物(SEQ ID NO:1)是两个异源二聚配对物CFP10和ESAT6的融合物。其由位置1-100的CFP10、位置101-114的14个氨基酸接头(对应于Mtb蛋白Rv1827的氨基酸149-162)和位置115-208的ESAT6组成。将编码CFP10/ESAT6的核苷酸序列(SEQ ID NO:13)置于pH5R启动子(SEQ ID NO:21)的控制下。第三个融合物(SEQ ID NO:2)是两个异源二聚配对物TB10.4和Rv0287的融合物。其由位置1-96的TB10.4、位置97-109的13个氨基酸接头(对应于Mtb蛋白Rv1827的氨基酸149-161)和位置110-205的Rv0287组成。将编码TB10.4/Rv0287的核苷酸序列(SEQ ID NO:14)置于pSE/L启动子(SEQ ID NO:22)的控制下。第四个融合物是SEQ ID NO:8中描述的RPFB-Dhyb融合物。其是通过缺失信号肽(从第一个残基至大约位置29中的残基)并通过缺失催化结构域，因此保留大约位置30-位置283的RfpB的相对于天然对应物修饰的RpfB抗原以及具有旨在废除相关酶促活性的3个突变(E292K、T315A和Q347A)的RpfD抗原的催化结构域之间的融合物。将编码RPFB-Dhyb的核苷酸序列(SEQ IDNO:15)置于p7.5K启动子(SEQ ID NO:23)的控制下。最后一个融合物Rv3407/2a/Rv1813*(SEQ ID NO:11)由位置1-99的Rv3407、位置100-102的GSG接头、位置103-122的自我切割肽E2A和位置123-235的修饰的Rv1813(Rv1813*，通过从第一个残基至大约位置31部分缺失N-端信号肽来相对于天然对应物修饰)组成。将编码Rv3407/2a/Rv1813*的核苷酸序列(SEQID NO:18)置于pA35R启动子(SEQ ID NO:24)的控制下。
通过合适的限制性位点分开的分别对应于前3个表达盒和后2个表达盒的两个DNA片段是通过合成方式产生的。通过NotI和XhoI对第一个片段以及通过XhoI和PacI对第二个片段限制之后，将两个片段克隆入通过NotI和XhoI限制的pTG18593以给出pTG18598。
MVA转移质粒pTG18593设计为允许通过MVA基因组的缺失III中的同源重组插入待转移的核苷酸序列。其源自质粒pUC18，将MVA缺失III周围的两侧序列(BRG3和BRD3)克隆入质粒pUC18(Sutter and Moss,1992,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10847)。
通过在感染MVA并通过核转染(nucleofection)用pTG18598转染(根据AmaxaNucleofector技术)的原代鸡胚成纤维细胞(CEF)中同源重组来进行MVATG18598的产生。通过PCR证实不存在亲本MVA污染。
共表达Mtb异源寡聚配对物的MVA载体的构建
MVATG18597的构建
MVATG18597包含5个表达盒，每个编码一个Mtb抗原(表1)。将编码ESAT6的核苷酸序列(SEQ ID NO:25)置于pB2R启动子(SEQ ID NO:20)的控制下。将编码CFP10的核苷酸序列(SEQ ID NO:26)置于pH5R启动子(SEQ ID NO:21)的控制下。将编码Rv2626的核苷酸序列(SEQ ID NO:27)置于pSE/L启动子(SEQ ID NO:22)的控制下。将编码修饰的Ag85B(Ag85B*，通过从第一个残基至位置39缺失N-端信号肽来相对于天然对应物修饰)的核苷酸序列(SEQID NO:28)置于p7.5K启动子的控制下(SEQ ID NO:23)。最后一个抗原是包含Mtb抗原RpfB和RpfD的融合多肽(例如SEQ ID NO:8的所谓的RPFB-Dhyb说明的)。将编码RPFB-Dhyb的核苷酸序列(SEQ ID NO:15)置于pA35R启动子(SEQ ID NO:24)的控制下。
对应于通过合适的限制性位点分开并且周围有约30bp的与痘苗转移质粒同源的序列的5个表达盒的DNA片段是通过合成方式产生的。通过SnaB1和FspI限制之后，通过融合克隆(融合HD克隆试剂盒，Clontech)将片段插入通过NotI和PacI消化的痘苗转移质粒pTG18593，导致pTG18597。
在CEF中通过如上文所述的同源重组进行MVATG18597病毒的产生。
MVATG18604的构建
MVATG18604包含5个表达盒，每个编码单独的Mtb抗原(表1)。将编码Rv0287的核苷酸序列(SEQ ID NO:29)置于pB2R启动子(SEQ ID NO:20)的控制下。将编码TB10.4的核苷酸序列(SEQ ID NO:30)置于pH5R启动子(SEQ ID NO:21)的控制下。将编码Rv3407的核苷酸序列(SEQ ID NO:31)置于pSE/L启动子(SEQ ID NO:22)的控制下。将编码Rv3478的核苷酸序列(SEQ ID NO:32)置于p7.5K启动子(SEQ ID NO:22)的控制下，并且将Rv3477的核苷酸序列(SEQ ID NO:33)置于pA35R启动子(SEQ ID NO:24)的控制下。
对应于通过合适的限制性位点分开并且周围有约30bp的与痘苗转移质粒同源的序列的5个表达盒的DNA片段是通过合成方式产生的。通过SnaB1和FspI限制之后，通过融合克隆(融合HD克隆试剂盒，Clontech)将片段插入通过NotI和PacI消化的痘苗转移质粒pTG18593，导致pTG18604。
在CEF中通过如上文所述的同源重组进行MVATG18604病毒的产生。
针对Mtb抗原的抗体的制备
用两种不同抗原特异性的肽的混合物(Eurogentec；Seraing,Belgium)免疫兔之后制备针对各种Mtb抗原的抗体。运行表位B预测程序之后选择这类15或16个氨基酸残基的肽。在第0天用两种特异性肽免疫兔以及在第7、10和18进行3次加强之后产生针对Rv1807、RPFB-Dhyb*、Rv1813*和Rv3407的抗血清。在第一次肽注射之前和第21天采集血液样品。在第29天进行兔的最终放血。对于Rv3478，在第0、22、49和77天用两种特异性16聚体肽注射兔。在第一次肽注射之前以及第31和59天采集血液样品。在第87天进行兔的最终放血。
通过ELISA利用特异性肽并且通过蛋白印迹分析利用单独的Mtb基因表达质粒评价最终的血清。
对MVA介导的表达产物的蛋白印迹
用产生Mtb抗原融合物各种MVA以MOI 0.2感染4x106个CEF细胞，存在或不存在感染后30min添加至生长培养基的蛋白酶体抑制剂MG132。将MVATGN33.1空载体用作阴性对照。24小时之后，丢弃培养基，并且将细胞用300μL/皿的补充了β-巯基乙醇(5％v:v)的Tris-甘氨酸-SDS 2X缓冲液(ref:LC2676；Novex)裂解。然后将裂解物超声处理，并且在95℃下加热5min。将20微升的细胞裂解物在利用标准预制凝胶系统(Biorad)的预制4-15％标准凝胶上电泳。电泳之后，将蛋白转移至PVDF膜(TurboTM转移系统(#170-4155,Biorad))。用Mtb特异性抗体进行免疫检测(见上文)。利用ImmunStar WesternC试剂盒(Biorad,ref 170.5070)显示免疫-复合物。
如上文所述，免疫兔之后获得的血清(1/1000稀释)还用于Rpf-B-D、Rv1813*、Rv3407和Rv3478的免疫印迹检测。商业抗体分别用于检测ESAT6、Ag85B*、TB10.4和Rv2626，小鼠单克隆抗体HYB076-08(Santa-Cruz；#sc-57730，1/500稀释)用于ESAT6，兔多克隆抗血清NR-13800(BEI，1/5000稀释)用于Ag85B*，小鼠单克隆抗体26A11(Lifespan-Biosciences；#LS-C91052，1/1000稀释)用于Rv2626，而多克隆兔抗体ABIN361292(Antibodies–online，1/1000稀释)用于TB10.4。
溶解性分析
如上文所述将4x106个CEF/孔在6孔板中培养，并且通过MVA以0.2MOI感染，没有MG132。感染之后24小时，去除培养基，并且通过250μL的本地缓冲液(50mM Tris pH7,5；150mM NaCl；1％tritonX100；Roche的抗蛋白酶混合物)或补充了0.7M Beta-巯基乙醇的Novex缓冲液(Invitrogen)(Novex+BME)裂解细胞。
将细胞裂解物在室温下以16 000g旋转5min以去除细胞碎片和大蛋白聚集体。将沉淀重悬于具有250μL的Novex+BME缓冲液的原始体积中。对总细胞(Novex条件)以及沉淀和上清进行蛋白印迹以分别检测不溶性或可溶性级分中抗原的表达。阴性对照是用不携带任何转基因的MVA(N33)感染的细胞的裂解物。对照MVA允许鉴定免疫检测产生的任何非特异性背景。
如果主要在可溶性级分中检测到抗原或融合物，则将0.45-mL的裂解物在大小排阻色谱(SEC)上利用PBS中平衡的S200 10/30Superdex柱分级分离。从8-10mL(空隙体积)至23.6mL(柱的总体积)收集0.75mL级分。
通过蛋白印迹用特异性抗体或血清分析这些级分以确定每种抗原或融合物的洗脱谱。如果其在柱的空隙体积中洗脱，则认为融合物或抗原是聚集的。
小鼠模型中的免疫原性评价
MVA免疫方案
在C57BL/6小鼠中评价MVA TB候选物的免疫原性。将每种MVA载体在尾的底部皮下给药两次，具有4-周间隔，剂量为100μL的Tris-HCl缓冲且包含蔗糖的缓冲液中1x107pfu。在最后一次MVA注射之后7天通过ELISpot IFNγ测定评价细胞免疫应答。
肽文库
肽文库用来离体重新刺激来自免疫小鼠的脾细胞。更确切地说，合成覆盖上述构建体中包含的所有Mtb抗原的肽(11个氨基酸重叠的15聚体)(Proteogenix)。在DMSO中制备肽池，终浓度为1μmol/L。需要1-4个池以覆盖每个Mtb抗原的全长。
RpfB-Dhyb由4个池覆盖，前3个池24种肽，而第4个池19种肽。池1：覆盖RpfB残基30-127的22种肽；池2：覆盖RpfB残基117-215的22种肽；池3：覆盖RpfB残基205-284和RpfD残基53-71的22种肽；池4：覆盖RpfD残基61-153的21种肽。
Rv1813由覆盖Rv1813残基34-143的25种肽的1个池覆盖。
Rv3407由覆盖Rv3407残基1-99的22种肽的1个池覆盖。
Rv2626由17和16种肽的2个池覆盖。池1：覆盖Rv2626残基1-79的17种肽；池2：覆盖Rv2626残基69-143的16种肽。
Ag85B由23种肽的3个池覆盖。池1：覆盖Ag85B残基39-141的23种肽；池2：覆盖Ag85B残基131-233的23种肽；池3：覆盖Ag85B残基223-325的23种肽。
ESAT-6由覆盖ESAT-6残基1-95的21种肽的1个池覆盖。
CFP10由覆盖CFP10残基1-100的23种肽的1个池覆盖。
TB10.4由覆盖TB10.4残基1-96的21种肽的1个池覆盖。
Rv0287由覆盖Rv0287残基1-97的22种肽的1个池覆盖。
IFNγ ELISpot测定
收集来自免疫小鼠的脾细胞，并且将红细胞裂解(Sigma,R7757)。将2x105个细胞/孔一式三份在用抗小鼠IFNγ单克隆抗体(BD Biosciences；10μg/mL,551216)包被的Multiscreen平板(Millipore,MSHA S4510)中于补充了10％FCS(JRH,12003-100M)、80U/mL青霉素/80μg/mL链霉素(PAN,P06-07-100)、2mM L-谷氨酰胺(Gibco,25030)、1x非必要氨基酸(Gibco,11140)、10mM Hepes(Gibco,15630)、1mM丙酮酸钠(Gibco,31350)和50μMβ-巯基乙醇(Gibco,31350)的αMEM培养基(Gibco,22571)中并且在10单位/mL的重组小鼠IL2(Peprotech,212-12)的存在下培养40h，单独作为阴性对照，或者具有：
-终浓度1μmol/L的上述肽池
-5μg/ml的伴刀豆球蛋白A(Sigma,C5275)用于阳性对照。
-无关的肽
如以前描述的通过ELISpot(细胞因子特异性免疫酶联免疫斑点)测定定量产生IFNγ的T细胞(Himoudi et al.,2002,J.Virol.76:12735-46)。结果示出为对一式三份的孔获得的平均值。通过计算对应于用单独培养基观察的斑点的平均值+2标准差的阈值确定观察的应答的阳性的实验阈值(或界限)，对106个细胞报道。连接至CTL ELISpot读数器的技术界限还定义为50个斑点/106个细胞(在这个值以上读数器的CV(变异系数)系统上少于20％)。技术和实验界限之间的最高界限值在图上示出。仅认为界限以上的应答(每组小鼠的中值)是阳性的。通过利用Kruskal-Wallis检验，当获得显著差异时，然后通过Mann-Whitney检验进行ELISpot应答的统计分析。认为等于或低于0.05的P值是显著的。
结果
实施例1：异源二聚配对物的重组MVA表达融合物的产生。
将MVATG18598MVA工程化以表达异源二聚配对物ESAT6与CFP10以及TB10.4与Rv0287(也称作TB9.8)的两个融合物连同包括潜伏(Rv2626、Rv3407和Rv1813)、活性(Ag85B)和复苏(RPFB-Dhyb)Mtb抗原的额外的分枝杆菌抗原的三个融合物。在每个配对物之间添加13-14个氨基酸的柔性接头以有利于异源二聚体的折叠。在某些情况下，在融合物的两个元件之间添加编码自我切割的肽2A的序列以允许分别合成两个元件。在构建体种使用两种不同的肽2A：T2A(来自Thosea asigna病毒)和E2A(来自马鼻炎A病毒)。总的来说，MVATG18598包含通过5个不同启动子驱动的5个独立的表达盒(如表1种说明的)。
产生MVATG18597和MVATG18604作为对照，共表达(非融合构型)异源二聚配对物ESAT6和CFP10(MVATG18597)和TB10.4和Rv0287以及Rv3478和Rv3477(MVATG18604)连同其他额外的潜伏(Rv2626、Rv3407和Rv1813)、活性(Ag85B)和复苏(RPFB-Dhyb)Mtb抗原MVA。
更具体地，
·MVATG18598包含10个Mtb抗原的5个融合物，分别为pB2R启动子控制下的Rv2626/2a/Ag85B**，pH5R启动子控制下的CFP10/ESAT6，p7.5K启动子控制下的RPFB-Dhyb，pSE/L启动子控制下的TB10.4/TB9.8以及pA35R启动子控制下的Rv3407/2a/Rv1813*。
·MVATG18597包含pB2R启动子控制下的ESAT6，pH5R启动子控制下的CFP10，pSE/L启动子控制下的Rv2626，p7.5K启动子控制下的Ag85B*以及pA35R启动子控制下的RPFB-Dhyb。
·MVAT18604包含pB2R启动子控制下的Rv0287，pH5R启动子控制下的TB10.4，pSE/L启动子控制下的Rv3407，p7.5K启动子控制下的Rv3478以及pA35R启动子控制下的Rv3477。
表1
实施例2：MVA表达的Mtb抗原和融合物的蛋白印迹分析
在MG132的存在或不存在下用上文描述的各种MVA候选物感染(MOI0.2)CEF细胞，并且通过蛋白印迹在材料和方法中描述的条件下分析表达产物。用本文描述的各种Mtb抗原特异性的抗体进行免疫检测，除了CFP-10、Rv0287和Rv3477。具体地，将免疫兔之后获得的血清(参见材料和方法)用于检测Rv1807、RPFB-Dhyb*、Rv1813*、Rv3407和Rv3478，而商业抗体用于检测ESAT6、Ag85B*、TB10.4和Rv2626。
结果总结于表2中。用源自感染MVATG18598的细胞的细胞裂解物种的抗ESAT6和抗TB10.4抗体免疫检测之后检测到对应于异源二聚体CFP10/ESAT6和TB10.4/Rv0287的融合物的强条带。用融合物Rv2626/2a/Ag85B**的抗Rv2626和抗Ag85B*抗体；以及用融合物Rv3407/2a/Rv1813*的抗Rv3407和抗Rv1813抗体免疫检测之后检测到切割肽2A的条带结果。
在另一方面，当表达为单独抗原(MVATG18597和MVATG18604)时，用抗ESAT6抗体检测到微弱条带，而用抗TB10.4抗体未检测到表达，尽管在相同载体中存在它们各自的异源二聚配对物。但是，在两个构建体中，通过免疫检测用相应的抗体检测到额外的Mtb抗原。实际上，用抗Ag85B、抗RPFB-Dhyb、抗Rv2626、抗Rv3478和抗Rv3407血清/抗体免疫检测之后检测到对应于预期大小的条带。
表2
neg：在MG132不存在下最佳表达
pos：在MG132的存在下最佳表达
none：在两种条件下相同表达
na：不可应用
实施例3：MVA表达的Mtb抗原和融合物的溶解性分析
分析用MVATG18598、MVATG18597和MVATG18604(没有MG132)感染的CEF的抗原或融合物的溶解性。未分析CFP10、Rv0287和Rv3477。以16 000g离心5分钟允许细胞碎片和蛋白的大聚集体的沉积(包含不溶性级分的沉淀)。相比之下，折叠的蛋白和小聚集体保留在上清中(可溶性级分)。将沉淀重悬于与上清相同的体积中，并且将5-15μL的上清和重悬沉淀上样至SDS-PAGE。因此，“沉淀”(P)和“上清“S”中检测的信号强度直接可比。表3总结了上文提到的3种MVA表达的每种抗原或融合物的结果。
表3：细胞裂解物离心之后抗原或融合物的溶解性
MVATG18604 MVATG18597 MVATG18598
Ag85B na 100 100
Rv2626 na 100 100
ESAT6 na 100(弱信号) 100
TB10-4 NED na 100
RPFB-D na NED 100
Rv3407 100 na NED
Rv1813 na na NED
Rv3478 50 na na
Na：不可应用
NED：未检测到表达
100％：仅在可溶性级分中检测到抗原
>50％：主要在可溶性级分中检测到抗原
50％：在可溶性和不溶性级分中检测到的抗原具有相同强度
<50％：主要在不溶性级分中检测到抗原
0：仅在不溶性级分中检测到抗原
对于一些主要在可溶性级分中表达的抗原，进行可溶性级分的SEC以评价抗原或融合物的聚集状态。对于球状蛋白，使用的柱(即Superdex 20010/30)具有10-600kDa的分级分离范围。具有质量<600kDa的任何球状单体蛋白会在柱的空隙体积之后洗脱。因此，认为空隙体积之后洗脱的任何融合物或抗原是不聚集的。结果在表4中说明。
表4：不聚集的抗原级分
Na：不可应用
ND：未进行
100％：仅在不同于空隙体积的级分中检测到抗原(不聚集)
50％：在空隙体积(聚集)和不同于空隙体积的级分(不聚集)中检测到抗原
溶解性结果总结
-在MVATG18597和MVATG18598感染的CEF中在预期大小(未融合)检测到Ag85B，并且为可溶性蛋白。在MVATG18598感染的CEF中，还检测到对应于Ag85B未切割的融合物大小的微弱条带。这些条带太弱而不能通过SEC分析。SEC分析证实上文提到的两种病毒表达的Ag85B是折叠蛋白。
-在MVATG18597和MVATG18598感染的CEF中在预期大小(未融合)检测到Rv2626，并且为可溶性和折叠蛋白。
-当未融合表达时(MVATG18597)几乎未检测到ESAT6，而当融合至CFP10时(MVATG18598)检测良好。有趣的是，仅MVATG18598编码的CFP10-ESAT6融合物是完全可溶性和折叠的。
-当未融合表达时(MVATG18604)未检测到TB10-4，而当融合至Rv0287时(MVATG18598)检测良好。有趣的是，仅MVATG18598编码的TB10-4-Rv0287融合物是完全可溶性和折叠的。
-当通过MVATG18598表达时RPFB-Dhyb检测为单体蛋白。MVATG18598表达的RPFB-Dhyb是可溶性的，并且SEC分析证实RPFB-Dhyb蛋白是部分聚集的。
-在MVATG18598感染的CEF中在MG132不存在下不可以检测到Rv3407。Rv3407在MVATG18604感染的CEF中表达为完全可溶性蛋白。未对可溶性级分进行分析SEC。
-Rv3478由MVATG18604编码为未融合的蛋白。仅在不溶性级分或者可溶性和可溶性级分中检测到Rv3478。
-
总的来说，如用ESAT6和TB10.4说明的，分枝杆菌抗原与其天然异源二聚配对物的融合物允许提高所得基因产物的表达和溶解性。
实施例4：表达Mtb抗原的MVA候选疫苗的免疫原性的评价
4.1在C57BL/6小鼠中评价表达Mtb抗原的MVATG18598候选疫苗的免疫原性
将C57BL/6小鼠用表达3个蛋白融合物《Rv2029-Rv2626-Rv1733-Rv0111+RpfB-Dhyb-Ag85B-TB10.4-ESAT6+Rv0569-Rv1813-Rv3407-Rv3478-Rv1807》的MVATG18379(WO2014/009438中描述)或表达5个不同蛋白融合物《Rv2626-2a-Ag85B+CFP10-ESAT6+TB10.4-Rv0287+RpfB-Dhyb+Rv1813-2a-Rv3407》的MVATG18598以4-周间隔免疫两次。在最后一次注射之后一周用本文所述肽池刺激之后通过IFNγ ELISpot测定评价特异性细胞免疫应答。还用空MVA载体(MVATGN33.1)免疫小鼠作为阴性对照。
如图1b中说明的，MVATG18379和MVATG18598均在C57BL/6小鼠中诱导Ag85B(池3)、ESAT6和TB10.4特异性的IFNγ阳性应答，范围为113-1548个斑点/106个细胞。此外，与不表达CFP10的MVATG18379(119个斑点/106个细胞)相比，表达ESAT6配对物CFP10的MVATG18598的ESAT6特异性应答显著较强(387个斑点/106个细胞)。当用MVATG18598注射小鼠时，与用MVATG18379免疫接种的组相比，Ag85B特异性应答也显著较高(分别为1548和928个斑点/106个细胞)。在用MVATG18379或MVATG18598免疫接种的组之间TB10.4特异性应答相似。仅在用MVATG18379免疫接种的小鼠中检测到RpfB-Dhyb特异性应答。无论在C57BL/6小鼠中注射任何疫苗，未诱导Rv2626、Rv1813或Rv3407特异性的信号。如预期的，在用空MVATGN33.1病毒免疫接种的小鼠中未检测到IFNγ应答(图1a)。
4.2在C57BL/6小鼠中评价表达Mtb抗原的MVATG18597和MVATG18633候选疫苗的免疫原性
将C57BL/6小鼠用表达3个蛋白融合物《Rv2029-Rv2626-Rv1733-Rv0111+RpfB-Dhyb-Ag85B-TB10.4-ESAT6+Rv0569-Rv1813-Rv3407-Rv3478-Rv1807》的MVATG18377(WO2014/009438中描述)、表达5个单独的Mtb抗原《Ag85B+ESAT6+CFP10+Rv2626+RpfB-Dhyb》的MVATG18597或者编码如下的除CFP10以外相同的单独的Mtb抗原：《Ag85B+ESAT6+Rv1813+Rv2626+RpfB-Dhyb》的MVATG18633以4-周间隔免疫两次。在最后一次注射之后一周用本文描述的具有共享的Mtb抗原的肽池刺激之后通过IFNγ ELISpot测定评价特异性细胞免疫应答。还用空MVA载体(MVATGN33.1)免疫小鼠作为阴性对照。
如图2b中说明的，3种MVA-TB疫苗均在C57BL/6小鼠中诱导Ag85B(池3)、ESAT6和RpfB-Dhyb特异性的IFNγ阳性应答，范围为85-2113个斑点/106个细胞。此外，与不表达CFP10蛋白的MVATG18377和MVATG18633(分别为85和102个斑点/106个细胞)相比，表达ESAT6配对物CFP10蛋白的MVATG18597的ESAT6特异性应答显著较强(375个斑点/106个细胞)。与用MVATG18377免疫接种的组(52-468个斑点/106个细胞)相比，当用MVATG18597或MVATG18633注射小鼠时Ag85B特异性的应答(池1和3)也显著较高(262-2113个斑点/106个细胞)。仅在用MVATG18377免疫接种的小鼠中检测到Rv1813特异性应答。无论在C57BL/6小鼠中注射任何疫苗，均未诱导CFP10或Rv2626特异性的信号。如预期的，在用空MVATGN33.1病毒免疫接种的小鼠中未检测到IFNγ应答(图2a)。

Claims (33)

1.一种免疫原性组合，其包含或编码至少两个异源寡聚分枝杆菌抗原，并且优选包含所述两个异源寡聚分枝杆菌抗原的融合多肽，其中所述异源寡聚分枝杆菌抗原选自Esx、PE和PPE抗原。
2.权利要求1的免疫原性组合，其中所述异源寡聚分枝杆菌抗原选自ESAT-6(Rv3875)、CFP10(Rv3874)、PPE60(Rv3478)、PE31(Rv3477)、TB10.4(Rv0288)和TB9.8(Rv0287)。
3.权利要求2的免疫原性组合，其包含或编码异源寡聚分枝杆菌抗原ESAT6(Rv3875)与CFP10(Rv3874)的融合物，并且优选包含与SEQ ID NO:1示出的氨基酸序列具有至少70％相同性的氨基酸序列的融合物。
4.权利要求2或3的免疫原性组合，其包含或编码异源寡聚分枝杆菌抗原TB10.4(Rv0288)与TB9.8(Rv0287)的融合物，并且优选包含与SEQ ID NO:2示出的氨基酸序列具有至少70％相同性的氨基酸序列的融合物。
5.权利要求1-4中任一项的免疫原性组合，其中所述免疫原性组合进一步包含或编码一种或多种额外的分枝杆菌抗原。
6.权利要求5的免疫原性组合，其中所述额外的分枝杆菌抗原选自活性、复苏和潜伏阶段的抗原。
7.权利要求1-6中任一项的免疫原性组合，其中所述免疫原性组合包含或编码的所述异源寡聚分枝杆菌抗原以及所述一种或多种额外的分枝杆菌抗原独立地获得自选自结核分枝杆菌(Mtb)、牛分枝杆菌(M.bovis)、牛分枝杆菌BCG、非洲分枝杆菌(M.africanum)、卡氏分枝杆菌(M.canetti)、羊分枝杆菌(M.caprae)和田鼠分枝杆菌(M.microti)的结核病复合群的分枝杆菌属物种。
8.权利要求6或7的免疫原性组合，其中所述一种或多种额外的分枝杆菌抗原选自Ag85B(Rv1886)、RpfB、RpfD、Rv1813、Rv2626和Rv3407以及包含SEQ ID NO:3或4示出的氨基酸序列的多肽。
9.权利要求8的免疫原性组合，其包含或编码异源寡聚分枝杆菌抗原CFP10和ESAT6的融合物，并且进一步包含或表达额外的分枝杆菌抗原Rv2626和Ag85B。
10.权利要求8的免疫原性组合，其包含或编码异源寡聚分枝杆菌抗原CFP10和ESAT6的融合物以及异源寡聚分枝杆菌抗原TB10.4和TB9.8的融合物，并且进一步包含或表达额外的分枝杆菌抗原Rv2626、Ag85B、RpfB、RpfD、Rv3407和Rv1813。
11.权利要求1-10中任一项的免疫原性组合，其中所述额外的分枝杆菌抗原以单独的多肽的形式或两个的融合物的形式包含于所述免疫原性组合中或由所述免疫原性组合编码。
12.权利要求11的免疫原性组合，其中所述额外的分枝杆菌抗原的融合多肽包含(i)Rv2626和Ag85B或者(ii)RpfB和RpfD或者(ii)Rv3407和Rv1813。
13.权利要求11或12的免疫原性组合，其中所述额外的分枝杆菌抗原的融合多肽包含一种或多种肽以确保所述分枝杆菌抗原的适当折叠，如插入所述融合多肽的上游和下游多肽之间的蛋白酶切割位点。
14.权利要求12或13的免疫原性组合，其中所述额外的分枝杆菌抗原的融合多肽包含与SEQ ID NO:8至SEQ ID NO:12中示出的任何氨基酸序列表现出至少70％相同性的氨基酸序列。
15.一种核酸分子，其编码权利要求1-14中任一项的免疫原性组合包含或编码的所述异源寡聚分枝杆菌抗原的组合或融合物和/或所述额外的分枝杆菌抗原的融合多肽。
16.权利要求15的核酸分子，其与SEQ ID NO:13-19中任一个示出的任何核苷酸序列表现出至少80％相同性。
17.一种载体，其包含权利要求15或16的一种或多种核酸分子或者权利要求1-14中任一项的免疫原性组合中包含的核酸分子。
18.权利要求17的载体，其中所述载体为质粒或者选自逆转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒(AAV)、痘病毒、疱疹病毒、麻疹病毒、泡沫病毒、甲病毒、水疱性口炎病毒的病毒载体。
19.权利要求18的载体，其中所述载体是选自禽痘病毒载体、金丝雀痘病毒载体和痘苗病毒载体的痘病毒载体，并且优选选自哥本哈根、惠氏、NYVAC和修饰的安卡拉(MVA)毒株的痘苗病毒载体。
20.权利要求17-19中任一项的载体，其选自：
(i)一种载体，其包含：编码包含异源寡聚分枝杆菌抗原ESAT-6和CFP10的融合物的核酸分子、编码Ag85B的核酸分子和编码Rv2626的核酸分子；以及
(ii)一种载体，其包含：编码包含异源寡聚分枝杆菌抗原ESAT-6和CFP10的融合物的核酸分子；编码包含异源寡聚分枝杆菌抗原TB10.4和TB9.8的融合物的核酸分子，编码包含额外的分枝杆菌抗原Rv2626和Ag85B的融合多肽的核酸分子；编码包含额外的分枝杆菌抗原RpfB和RpfD的融合多肽的核酸分子；以及编码包含额外的分枝杆菌抗原Rv3407和Rv1813的融合多肽的核酸分子。
21.权利要求17-20中任一项的载体，其中所述核酸分子被置于适合确保在哺乳动物细胞中表达编码的融合物和额外的分枝杆菌抗原的启动子的转录控制下，特别是在优选选自p7.5K、pH5R、pB2R、pSE/L和pA35R启动子的痘苗启动子的转录控制下。
22.一种宿主细胞，其包含权利要求1-14中任一项的免疫原性组合，权利要求15或16的核酸分子或者权利要求17-21中任一项的载体。
23.一种重组制备权利要求1-14中任一项的免疫原性组合包含或编码的分枝杆菌抗原的方法，所述方法包括以下步骤：(i)将载体引入宿主细胞以产生转染或感染的宿主细胞，(ii)在适合宿主细胞生长的条件下体外培养所述转染或感染的宿主细胞，(iii)回收细胞培养物，以及(iv)任选地，从细胞培养物纯化所述分枝杆菌抗原。
24.一种组合物，其包含权利要求1-14中任一项的免疫原性组合、权利要求15或16的核酸分子、权利要求17-21中任一项的载体或权利要求22的宿主细胞中的至少一种或者它们的任何组合。
25.权利要求24的组合物，其进一步包含药学可接受的媒介物。
26.权利要求1-14中任一项的免疫原性组合、权利要求15或16的核酸分子、权利要求17-21中任一项的载体、权利要求22的宿主细胞或者权利要求24或25的组合物在预防或治疗分枝杆菌感染或者由这样的分枝杆菌感染引起或与这样的分枝杆菌感染相关的任何疾病和病理状况中的用途。
27.权利要求26的免疫原性组合、融合多肽、核酸分子、载体、宿主细胞或组合物，用于在有此需要的个体中预防感染或延迟感染分枝杆菌的风险，特别是已与发展活性疾病的感染个体密切接触的个体。
28.权利要求26或27的免疫原性组合、融合多肽、核酸分子、载体、宿主细胞或组合物，用于治疗感染分枝杆菌属物种，特别是结核分枝杆菌的个体中的活性疾病。
29.权利要求26或27的免疫原性组合、融合多肽、核酸分子、载体、宿主细胞或组合物，用于预防或治疗潜伏感染分枝杆菌属物种，特别是结核分枝杆菌的个体中的重新激活。
30.权利要求26-29中任一项的免疫原性组合、融合多肽、核酸分子、载体、宿主细胞或组合物，用作BCG强化剂。
31.权利要求26-30中任一项的免疫原性组合、融合多肽、核酸分子、载体、宿主细胞或组合物，与有效针对分枝杆菌感染的一种或多种化疗药物，特别是一种或多种抗生素化疗联用。
32.权利要求26-32中任一项的免疫原性组合、融合多肽、核酸分子、载体、宿主细胞或组合物，用于在给药个体中诱导或增强免疫应答。
33.权利要求32的免疫原性组合、融合多肽、核酸分子、载体、宿主细胞或组合物，其中所述诱导或刺激的免疫应答是CD4+和/或CD8+介导的针对分枝杆菌抗原/表位的T细胞应答。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110590957A (zh) * 2019-09-11 2019-12-20 中国人民解放军总医院第八医学中心 一种融合蛋白及其在抗结核分枝杆菌的免疫保护中的应用
CN111269297A (zh) * 2020-01-23 2020-06-12 郑州伊美诺生物技术有限公司 一种结核分枝杆菌刺激抗原的制备方法
CN116063418A (zh) * 2022-12-08 2023-05-05 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 结核分枝杆菌抗原组合物epdpa015及其制备方法与应用
CN116162141A (zh) * 2022-11-30 2023-05-26 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 一种结核分枝杆菌抗原epcra013及其应用

Families Citing this family (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20150058152A (ko) * 2012-07-10 2015-05-28 트랜스진 에스아이 마이코박테리아 항원 백신
WO2016131945A1 (en) 2015-02-20 2016-08-25 Transgene Sa Combination product with autophagy modulator
CN105601747B (zh) * 2015-10-21 2019-05-28 中山大学 一种结核杆菌融合蛋白及其在诱导外周血单个核细胞产生细胞因子的应用
CN105218680B (zh) * 2015-10-21 2019-06-25 中山大学 一种用于诱导外周血单个核细胞产生细胞因子的结核分支杆菌融合蛋白
CA3023022A1 (en) 2016-05-04 2017-11-09 Transgene Sa Combination therapy with cpg tlr9 ligand
CN109310748A (zh) * 2016-05-21 2019-02-05 传染病研究所 用于治疗继发性结核和非结核分枝杆菌感染的组合物和方法
CA3028827A1 (en) 2016-06-22 2017-12-28 Aeras Recombinant cytomegalovirus vectors as vaccines for tuberculosis
US20190328869A1 (en) 2016-10-10 2019-10-31 Transgene Sa Immunotherapeutic product and mdsc modulator combination therapy
US11638749B2 (en) 2017-10-17 2023-05-02 International Aids Vaccine Initiative, Inc. Tuberculosis antigen cassettes
KR102004902B1 (ko) * 2017-12-26 2019-07-29 연세대학교 산학협력단 융합 단백질을 포함하는 결핵 예방용 조성물
CN110684116B (zh) * 2019-08-23 2022-04-26 成都可恩生物科技有限公司 一种结核分枝杆菌eec融合蛋白、制备方法及其应用
RU2724896C1 (ru) * 2019-11-14 2020-06-26 федеральное государственное бюджетное учреждение "Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи" Министерства здравоохранения Российской Федерации Полиантигенная вакцина для профилактики и вспомогательного лечения туберкулеза
WO2024028445A1 (en) * 2022-08-03 2024-02-08 BioNTech SE Rna for preventing or treating tuberculosis
WO2024027910A1 (en) * 2022-08-03 2024-02-08 BioNTech SE Rna for preventing or treating tuberculosis

Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005061534A2 (en) * 2003-12-23 2005-07-07 Statens Serum Institut Improved tuberculosis vaccines
CN101538578A (zh) * 2009-03-02 2009-09-23 华中农业大学 三基因融合的重组牛结核特异性抗原蛋白及制备方法
WO2010034974A3 (en) * 2008-09-24 2010-08-12 Adjuvantix Limited Tuberculosis vaccines targeted to cd40
CN101900727A (zh) * 2010-06-01 2010-12-01 华中农业大学 一种应用Rv3872新型融合蛋白制备的牛结核抗体鉴别检测试纸条
WO2011141451A1 (en) * 2010-05-10 2011-11-17 Isis Innovation Limited Dna based multivalent vaccine against mycobacterium tuberculosis, encoding ag85a, tb9.8, tb10.4 and acr2 antigens.
WO2012057904A1 (en) * 2010-10-27 2012-05-03 Infectious Disease Research Institute Mycobacterium tuberculosis antigens and combinations thereof having high seroreactivity
CN102692509A (zh) * 2012-05-11 2012-09-26 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 重组蛋白混合物介导的牛结核病诊断方法及其试剂
WO2012129227A1 (en) * 2011-03-22 2012-09-27 Baylor Research Institute Dendritic cells (dcs) targeting for tuberculosis (tb) vaccine
CN102836425A (zh) * 2005-06-23 2012-12-26 国家血清研究中心 包含潜伏感染阶段期间所表达的抗原的结核疫苗
CN102905724A (zh) * 2010-05-21 2013-01-30 健康保护局 分枝杆菌抗原组合物
CN103204945A (zh) * 2013-05-03 2013-07-17 扬州大学 一种用于牛结核病诊断的真核表达cfp10-esat-6融合蛋白
CN103333251A (zh) * 2013-04-11 2013-10-02 广西壮族自治区动物疫病预防控制中心 基于重组融合抗原蛋白的γ-干扰素夹心ELISA检测方法
WO2014009438A2 (en) * 2012-07-10 2014-01-16 Transgene Sa Mycobacterial antigen vaccine
WO2014009433A1 (en) * 2012-07-10 2014-01-16 Transgene Sa Mycobacterium resuscitation promoting factor for use as adjuvant
WO2014063704A2 (en) * 2012-10-23 2014-05-01 Statens Serum Institut M. tuberculosis vaccines

Family Cites Families (48)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4603112A (en) 1981-12-24 1986-07-29 Health Research, Incorporated Modified vaccinia virus
US7045313B1 (en) 1982-11-30 2006-05-16 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Recombinant vaccinia virus containing a chimeric gene having foreign DNA flanked by vaccinia regulatory DNA
US5168062A (en) 1985-01-30 1992-12-01 University Of Iowa Research Foundation Transfer vectors and microorganisms containing human cytomegalovirus immediate-early promoter-regulatory DNA sequence
EP0575491B1 (en) 1991-03-07 2003-08-13 Virogenetics Corporation Genetically engineered vaccine strain
US6013638A (en) 1991-10-02 2000-01-11 The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services Adenovirus comprising deletions on the E1A, E1B and E3 regions for transfer of genes to the lung
US6133028A (en) 1993-05-28 2000-10-17 Transgene S.A. Defective adenoviruses and corresponding complementation lines
FR2705686B1 (fr) 1993-05-28 1995-08-18 Transgene Sa Nouveaux adénovirus défectifs et lignées de complémentation correspondantes.
SI0833934T2 (sl) 1995-06-15 2013-04-30 Crucell Holland B.V. Pakirni sistemi za humani rekombinantni adenovirus za uporabo v genski terapiji
UA68327C2 (en) 1995-07-04 2004-08-16 Gsf Forschungszentrum Fur Unwe A recombinant mva virus, an isolated eukaryotic cell, infected with recombinant mva virus, a method for production in vitro of polypeptides with use of said cell, a method for production in vitro of virus parts (variants), vaccine containing the recombinant mva virus, a method for immunization of animals
FR2751343B1 (fr) 1996-07-16 1998-12-18 Transgene Sa Procede de conservation de virus recombinants infectieux, suspension aqueuse virale et utilisation comme medicament
EP0988053A1 (en) 1997-06-11 2000-03-29 Aquila Biopharmaceuticals, Inc. Purified saponins as oral adjuvants
FR2766091A1 (fr) 1997-07-18 1999-01-22 Transgene Sa Composition antitumorale a base de polypeptide immunogene de localisation cellulaire modifiee
US6328978B1 (en) * 1997-12-23 2001-12-11 Genesis Research & Development Corp. Ltd. Methods for the treatment of immunologically-mediated skin disorders
NZ505834A (en) * 1997-12-23 2002-12-20 Genesis Res & Dev Corp Ltd Compositions containing polypeptides isolated from mycobacterium vaccae and methods for their use
EP1155120B1 (fr) 1999-02-22 2006-07-05 Transgene S.A. Procede d'obtention d'une preparation virale purifiee
ATE519854T1 (de) 1999-05-17 2011-08-15 Crucell Holland Bv Rekombinantes adenovirus auf basis von serotyp 48 (ad48).
NZ524661A (en) 2000-11-23 2005-03-24 Bavarian Nordic As Modified vaccinia ankara virus variant
CA2451026C (en) 2001-06-22 2013-12-10 Health Protection Agency Mycobacterial antigens expressed under low oxygen tension
CA2453173C (en) 2001-07-04 2013-12-10 Health Protection Agency Mycobacterial antigens expressed during latency
UA82466C2 (uk) 2001-07-18 2008-04-25 Бавариан Нордика А/С Спосіб посилення ампліфікації хордопоксвірусу
GB0125535D0 (en) 2001-10-24 2001-12-12 Microbiological Res Authority Mycobacterial genes down-regulated during latency
NZ533302A (en) 2001-12-10 2005-11-25 Bavarian Nordic As Poxvirus containing formulations and process for preparing stable, poxvirus containing compositions containing a disaaccharide and a pharmaceutically acceptable polymer i.e. dextran or polyvinylpyrrolidon (PVP)
FR2836924B1 (fr) 2002-03-08 2005-01-14 Vivalis Lignees de cellules aviaires utiles pour la production de substances d'interet
WO2004006952A2 (en) 2002-07-13 2004-01-22 Statens Serum Institut Therapeutic tuberculosis vaccines
WO2004083418A1 (en) 2003-03-17 2004-09-30 Merck & Co., Inc. Adenovirus serotype 24 vectors, nucleic acids and virus produced thereby
EP1611237A1 (en) 2003-03-28 2006-01-04 Merck & Co., Inc. Adenovirus serotype 34 vectors, nucleic acids and virus produced thereby
CA2553541C (en) 2004-01-23 2015-04-21 Istituto Di Ricerche Di Biologia Molecolare P. Angeletti S.P.A. Chimpanzee adenovirus vaccine carriers
EP1766096B1 (en) * 2004-05-25 2013-01-02 Oregon Health and Science University Hiv vaccination usingand hcmv-based vaccine vectors
US20060024332A1 (en) 2004-08-02 2006-02-02 Waters Wade R Recombinant ESAT-6:CFP-10 fusion protein useful for specific diagnosis of tuberculosis
WO2006026404A2 (en) * 2004-08-26 2006-03-09 Sequella, Inc. Assay for detecting tuberculosis in nonhuman primates
KR20070108518A (ko) * 2005-01-05 2007-11-12 아이시스 이노베이션 리미티드 마이코박테리움에 대한 면역성을 제공하기 위한 조성물들
EP1868640A1 (en) 2005-03-31 2007-12-26 Leiden University Medical Center Methods and means for diagnostics, prevention and treatment of mycobacterium infections and tuberculosis disease
JP2009528545A (ja) * 2006-03-02 2009-08-06 ザ ユーエービー リサーチ ファウンデーション マイコバクテリウム属の疾患検出、処置、および薬物開発
BRPI0713711A2 (pt) 2006-06-20 2012-10-30 Transgene Sa vacina viral recombinante, kit para vacinação, e, método para usar pelo menos um composto
WO2008124647A2 (en) * 2007-04-04 2008-10-16 Infectious Disease Research Institute Immunogenic compositions comprising mycobacterium tuberculosis polypeptides and fusions thereof
CN101790384B (zh) 2007-06-29 2013-12-11 国立血清研究所 单分枝酰基甘油(mmg)作为佐剂的应用
ES2618490T3 (es) 2007-07-03 2017-06-21 Transgene Sa Estirpes celulares aviares inmortalizadas
US8357531B2 (en) 2007-07-03 2013-01-22 Transgene S.A. Immortalized avian cell lines
CN101376891B (zh) * 2007-08-27 2012-05-23 上海生物制品研究所有限责任公司 新型结核病疫苗的制备及其应用
US7935354B2 (en) 2007-11-13 2011-05-03 Aeras Global Tb Vaccine Foundation Generation of new BCG vaccine strains protecting against the establishment of latent Mycobacterium tuberculosis infection and reactivation from the latent or persistent state
AU2009294850B2 (en) 2008-09-22 2015-07-02 Oregon Health & Science University Methods for detecting a Mycobacterium tuberculosis infection
WO2010121618A1 (en) * 2009-04-24 2010-10-28 Statens Serum Institut A tuberculosis tb vaccine to prevent reactivation
CA2760465A1 (en) 2009-05-12 2010-11-18 Transgene Sa Method for orthopoxvirus production and purification
TR201802619T4 (tr) 2009-05-20 2018-03-21 Aeras Kararlı, sprey ile kurutulmuş, immunojen, viral bileşimler.
WO2012031752A2 (en) 2010-09-07 2012-03-15 Institut Pasteur Korea Tuberculosis mutants
CN102719438B (zh) 2012-07-12 2013-10-30 章晓联 一种能特异结合结核菌抗原的核酸适配子及其应用
US10266574B2 (en) 2013-06-25 2019-04-23 International Aids Vaccine Initiative, Inc. Tuberculosis compositions and methods of using the same
CN103386128B (zh) 2013-07-02 2017-02-08 中国食品药品检定研究院 一种含联合佐剂的结核亚单位疫苗

Patent Citations (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2005061534A2 (en) * 2003-12-23 2005-07-07 Statens Serum Institut Improved tuberculosis vaccines
CN102836425A (zh) * 2005-06-23 2012-12-26 国家血清研究中心 包含潜伏感染阶段期间所表达的抗原的结核疫苗
WO2010034974A3 (en) * 2008-09-24 2010-08-12 Adjuvantix Limited Tuberculosis vaccines targeted to cd40
CN101538578A (zh) * 2009-03-02 2009-09-23 华中农业大学 三基因融合的重组牛结核特异性抗原蛋白及制备方法
WO2011141451A1 (en) * 2010-05-10 2011-11-17 Isis Innovation Limited Dna based multivalent vaccine against mycobacterium tuberculosis, encoding ag85a, tb9.8, tb10.4 and acr2 antigens.
CN102905724A (zh) * 2010-05-21 2013-01-30 健康保护局 分枝杆菌抗原组合物
CN101900727A (zh) * 2010-06-01 2010-12-01 华中农业大学 一种应用Rv3872新型融合蛋白制备的牛结核抗体鉴别检测试纸条
WO2012057904A1 (en) * 2010-10-27 2012-05-03 Infectious Disease Research Institute Mycobacterium tuberculosis antigens and combinations thereof having high seroreactivity
WO2012129227A1 (en) * 2011-03-22 2012-09-27 Baylor Research Institute Dendritic cells (dcs) targeting for tuberculosis (tb) vaccine
CN102692509A (zh) * 2012-05-11 2012-09-26 中国农业科学院北京畜牧兽医研究所 重组蛋白混合物介导的牛结核病诊断方法及其试剂
WO2014009438A2 (en) * 2012-07-10 2014-01-16 Transgene Sa Mycobacterial antigen vaccine
WO2014009433A1 (en) * 2012-07-10 2014-01-16 Transgene Sa Mycobacterium resuscitation promoting factor for use as adjuvant
WO2014063704A2 (en) * 2012-10-23 2014-05-01 Statens Serum Institut M. tuberculosis vaccines
CN103333251A (zh) * 2013-04-11 2013-10-02 广西壮族自治区动物疫病预防控制中心 基于重组融合抗原蛋白的γ-干扰素夹心ELISA检测方法
CN103204945A (zh) * 2013-05-03 2013-07-17 扬州大学 一种用于牛结核病诊断的真核表达cfp10-esat-6融合蛋白

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FAN ZHANG等: "Multiple antigen-presenting system (MAPS) to induce comprehensive B- and T-cell immunity", 《PNAS》 *
W. R. WATERS等: "Use of Recombinant ESAT-6:CFP-10 Fusion Protein for Differentiation of Infections of Cattle by Mycobacterium bovis and by M. avium subsp. avium and M. avium subsp. paratuberculosis", 《CLINICAL AND DIAGNOSTIC LABORATORY IMMUNOLOGY》 *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110590957A (zh) * 2019-09-11 2019-12-20 中国人民解放军总医院第八医学中心 一种融合蛋白及其在抗结核分枝杆菌的免疫保护中的应用
CN110590957B (zh) * 2019-09-11 2021-06-01 中国人民解放军总医院第八医学中心 一种融合蛋白及其在抗结核分枝杆菌的免疫保护中的应用
CN111269297A (zh) * 2020-01-23 2020-06-12 郑州伊美诺生物技术有限公司 一种结核分枝杆菌刺激抗原的制备方法
CN111269297B (zh) * 2020-01-23 2021-11-30 郑州伊美诺生物技术有限公司 一种结核分枝杆菌刺激抗原的制备方法
CN116162141A (zh) * 2022-11-30 2023-05-26 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 一种结核分枝杆菌抗原epcra013及其应用
CN116162141B (zh) * 2022-11-30 2024-04-12 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 一种结核分枝杆菌抗原epcra013及其应用
CN116063418A (zh) * 2022-12-08 2023-05-05 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 结核分枝杆菌抗原组合物epdpa015及其制备方法与应用
CN116063418B (zh) * 2022-12-08 2024-04-12 中国疾病预防控制中心传染病预防控制所 结核分枝杆菌抗原组合物epdpa015及其制备方法与应用

Also Published As

Publication number Publication date
CA2936131A1 (en) 2015-07-16
US10765731B2 (en) 2020-09-08
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TWI638829B (zh) 分枝桿菌抗原疫苗
JP4764445B2 (ja) 結核の免疫治療および診断のための化合物およびそれらの使用方法
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