CN110590957A - 一种融合蛋白及其在抗结核分枝杆菌的免疫保护中的应用 - Google Patents

一种融合蛋白及其在抗结核分枝杆菌的免疫保护中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110590957A
CN110590957A CN201910858313.3A CN201910858313A CN110590957A CN 110590957 A CN110590957 A CN 110590957A CN 201910858313 A CN201910858313 A CN 201910858313A CN 110590957 A CN110590957 A CN 110590957A
Authority
CN
China
Prior art keywords
polypeptide
fusion protein
mycobacterium tuberculosis
bcg
seq
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201910858313.3A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110590957B (zh
Inventor
龚文平
吴雪琼
梁艳
王兰
王杰
薛勇
米洁
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
8th Medical Center of PLA General Hospital
Original Assignee
8th Medical Center of PLA General Hospital
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 8th Medical Center of PLA General Hospital filed Critical 8th Medical Center of PLA General Hospital
Priority to CN201910858313.3A priority Critical patent/CN110590957B/zh
Publication of CN110590957A publication Critical patent/CN110590957A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110590957B publication Critical patent/CN110590957B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/02—Bacterial antigens
    • A61K39/04—Mycobacterium, e.g. Mycobacterium tuberculosis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A61P31/06—Antibacterial agents for tuberculosis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/195—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria
    • C07K14/35—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from bacteria from Mycobacteriaceae (F)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/20—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand
    • C07K2319/21—Fusion polypeptide containing a tag with affinity for a non-protein ligand containing a His-tag
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/35—Fusion polypeptide containing a fusion for enhanced stability/folding during expression, e.g. fusions with chaperones or thioredoxin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Communicable Diseases (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)

Abstract

本发明公开了一种融合蛋白及其在抗结核分枝杆菌的免疫保护中的应用。融合蛋白含有SEQ ID NO：3所示的多肽甲、SEQ ID NO：4所示的多肽乙、SEQ ID NO：5所示的多肽丙、SEQ ID NO：6所示的多肽丁、SEQ ID NO：7所示的多肽戊和SEQ ID NO：8所示的多肽己。实验证明，BCG初免后用融合蛋白加强免疫能够诱导人源化C57BL/6小鼠肝脏和肺脏中结核分枝杆菌的菌落数显著降低，其免疫保护效率优于BCG单独免疫组；在野生型C57BL/6小鼠的肝脏和肺脏中结核分枝杆菌的菌落数无显著差异。由此可见，该融合蛋白可以抑制结核分枝杆菌在人源化动物体内的增殖；据此可以制备结核分枝杆菌疫苗。本发明具有重要的应用价值。

Description

一种融合蛋白及其在抗结核分枝杆菌的免疫保护中的应用
技术领域
本发明属于免疫学领域，具体涉及一种融合蛋白及其在抗结核分枝杆菌的免疫保护中的应用。
背景技术
疫苗接种是消除结核(Tuberculosis，TB)感染最好的手段，但目前仍缺乏有效的疫苗。最早的预防结核病的疫苗是BCG疫苗，但是大量研究表明，BCG虽然对儿童重症结核病(如粟粒型结核和结核性脑膜炎)具有预防作用，但其保护效应随着年龄增加而递减，且BCG对结核菌感染过的人群则基本无效。相对于BCG疫苗，亚单位疫苗由于只使用某些具有诱导机体产生保护性免疫应答的蛋白抗原而非全菌抗原，其免疫后副作用明显减轻，而且其制备也相对于传统疫苗更加的安全、高效。但是随着研究的深入，人们发现亚单位疫苗也存在不足之处，比如需多次接种、需要佐剂帮助、免疫保护效果有限等。
外源性物质进入机体后，通常会被机体的免疫系统识别并产生免疫应答以清除外来物或病原体。传统的亚单位疫苗正是将病原体全菌蛋白或某个/多个蛋白抗原接种，进而诱导机体产生特异性免疫应答来对抗病原体感染。但是，免疫细胞的表面受体通常仅能识别抗原肽分子上的某些特定氨基酸即表位(Epitope)或抗原决定簇(Antigenicdeterminant)。结核分枝杆菌是一种胞内寄生菌，抗胞内菌的保护性免疫主要依赖T细胞介导的特异性细胞免疫应答。T细胞表位疫苗不仅能够被体内更多的MHC分子识别并高效递呈，而且能弥补病原体某个优势表位变异而引起的免疫失效等问题。正是因为这些独特的优势，T细胞表位疫苗逐渐被越来越多的学者关注，成为疫苗研究领域里的热点之一。因此，设计并研究新型、高效的结核分枝杆菌T细胞表位疫苗对预防和治疗结核病具有至关重要的意义。
发明内容
本发明的目的是提供一种结核分枝杆菌疫苗。
本发明首先保护一种融合蛋白，可包括多肽甲、多肽乙、多肽丙、多肽丁、多肽戊和多肽己；
多肽甲的氨基酸序列可如SEQ ID NO：3所示；
多肽乙的氨基酸序列可如SEQ ID NO：4所示；
多肽丙的氨基酸序列可如SEQ ID NO：5所示；
多肽丁的氨基酸序列可如SEQ ID NO：6所示；
多肽戊的氨基酸序列可如SEQ ID NO：7所示；
多肽己的氨基酸序列可如SEQ ID NO：8所示。
所述融合蛋白具体可由所述多肽甲、所述多肽乙、所述多肽丙、所述多肽丁、所述多肽戊和所述多肽己组成。
上述任一所述融合蛋白的N端还可含有甲硫氨酸。
上述任一所述融合蛋白中，各个多肽之间还有连接肽。所述连接肽的氨基酸序列可为GGGGS或GGGS。
上述任一所述融合蛋白可为b1)-b6)中任一种：
b1)氨基酸序列如SEQ ID NO：2自N端起第162位至277位所示的融合蛋白1；
b2)将融合蛋白1中多肽甲和多肽乙的位置互换，得到的融合蛋白2；
b3)将融合蛋白1中多肽甲和多肽丙的位置互换，得到的融合蛋白3；
b4)将融合蛋白1中多肽甲和多肽丁的位置互换，得到的融合蛋白4；
b5)将融合蛋白1中多肽甲和多肽戊的位置互换，得到的融合蛋白5；
b6)将融合蛋白1中多肽甲和多肽己的位置互换，得到的融合蛋白6。
上述任一所述融合蛋白的N端和/或C端还可连接标签。
所述标签可为TrxA-tag标签。TrxA-tag标签的氨基酸序列可如SEQ ID NO：2自 N端起第1至161位所示。
所述标签可为His标签。His标签的氨基酸序列可如SEQ ID NO：2自N端起第 278至283位所示。
所述标签还可为Poly-Arg标签(氨基酸序列为RRRRR)、FLAG标签(氨基酸序列为DYKDDDDK)、c-myc标签(氨基酸序列为EQKLISEEDL)或Strep-tag II标签 (氨基酸序列为WSHPQFEK)。
上述任一所述融合蛋白具体可为氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示的融合蛋白MP3RT。
上述任一所述融合蛋白具体可为将融合蛋白MP3RT中多肽甲和多肽乙的位置互换，得到的融合蛋白甲。
上述任一所述融合蛋白具体可为将融合蛋白MP3RT中多肽甲和多肽丙的位置互换，得到的融合蛋白乙。
上述任一所述融合蛋白具体可为将融合蛋白MP3RT中多肽甲和多肽丁的位置互换，得到的融合蛋白丙。
上述任一所述融合蛋白具体可为将融合蛋白MP3RT中多肽甲和多肽戊的位置互换，得到的融合蛋白丁。
上述任一所述融合蛋白具体可为将融合蛋白MP3RT中多肽甲和多肽己的位置互换，得到的融合蛋白戊。
本发明还保护编码上述任一所述融合蛋白的核酸分子。
所述编码融合蛋白1的核酸分子可如SEQ ID NO：1自5末端起第490至837位所示。
所述编码融合蛋白MP3RT的核酸分子可如SEQ ID NO：1自5末端起第7至864 位所示。
本发明还保护所述多肽甲、所述多肽乙、所述多肽丙、所述多肽丁、所述多肽戊或所述多肽己。
本发明还保护d1)或d2)或d3)或d4)或d5)或d6)或d7)或d8)或d9)。
d1)上述任一所述融合蛋白或编码上述任一所述融合蛋白的核酸分子在制备结核分枝杆菌疫苗中的应用。
d2)上述任一所述融合蛋白或编码上述任一所述融合蛋白的核酸分子在抑制结核分枝杆菌增殖中的应用。
d3)上述任一所述融合蛋白或编码上述任一所述融合蛋白的核酸分子在制备用于预防和/或治疗结核病的产品中的应用。
d4)上述任一所述融合蛋白或编码上述任一所述融合蛋白的核酸分子联合卡介苗在制备结核分枝杆菌疫苗中的应用。
d5)上述任一所述融合蛋白或编码上述任一所述融合蛋白的核酸分子联合卡介苗在抑制结核分枝杆菌增殖中的应用。
d6)上述任一所述融合蛋白或编码上述任一所述融合蛋白的核酸分子联合卡介苗在制备用于预防和/或治疗结核病的产品中的应用。
d7)所述多肽甲、所述多肽乙、所述多肽丙、所述多肽丁、所述多肽戊和所述多肽己中的任五个、任四个、任三个、任两个或任一个在制备结核分枝杆菌疫苗中的应用。
d8)所述多肽甲、所述多肽乙、所述多肽丙、所述多肽丁、所述多肽戊和所述多肽己中的任五个、任四个、任三个、任两个或任一个在抑制结核分枝杆菌增殖中的应用。
d9)所述多肽甲、所述多肽乙、所述多肽丙、所述多肽丁、所述多肽戊和所述多肽己中的任五个、任四个、任三个、任两个或任一个在制备用于预防和/或治疗结核病的产品中的应用。
本发明还保护抗结核分枝杆菌制剂或“用于预防和/或治疗结核病的产品”，其可含有上述任一所述融合蛋白或编码上述任一所述融合蛋白的核酸分子。
所述抗结核分枝杆菌制剂或所述“用于预防和/或治疗结核病的产品”具体可由上述任一所述融合蛋白或编码上述任一所述融合蛋白的核酸分子组成。
所述抗结核分枝杆菌制剂或所述“用于预防和/或治疗结核病的产品”还可含有卡介苗。
所述抗结核分枝杆菌制剂或所述“用于预防和/或治疗结核病的产品”具体可由“上述任一所述融合蛋白或编码上述任一所述融合蛋白的核酸分子”和卡介苗组成。
所述产品具体可为结核分枝杆菌疫苗。
上述任一所述结核病具体可为肺结核。
上述任一所述结核病具体可为肝结核。
上述任一所述结核分枝杆菌疫苗具体可为人结核分枝杆菌疫苗。
上述任一所述抑制结核分枝杆菌增殖具体可为抑制结核分枝杆菌在人源化动物体内或人体内的增殖。
所述人源化动物具体可为人源化小鼠。所述人源化小鼠具体可为HLA-A11/DR1 转基因C57BL/6小鼠(曾扬.人MHC转基因小鼠模型建立及其应用基础研究.中国人民解放军军事医学科学院.2016)。
上述任一所述结核分枝杆菌具体可为结核分枝杆菌标准株H37Rv。结核分枝杆菌标准株H37Rv记载于如下文献中：Yan L，Xiaoyan Z，Li X，et al.Immunogenicity andTherapeutic Effects of pVAX1-rv1419 DNA from Mycobacterium tuberculosis[J].Current Gene Therapy，2016，16(4)：249-255.
在本发明的一个实施例中，将6-7周龄、体重为16-18g的人源化小鼠(即 HLA-A11/DR1转基因C57BL/6小鼠)随机分为MP3RT组、PBS组、BCG组和 BCG+MP3RT组，MP3RT组用融合蛋白MP3RT免疫，PBS组用PBS缓冲液免疫， BCG组用卡介苗免疫，BCG+MP3RT组用BCG初免后再用融合蛋白MP3RT加强免疫；之后，用结核分枝杆菌进行攻毒，统计小鼠肝脏和肺脏中结核分枝杆菌的数量。结果表明，人源化小鼠肝脏中，融合蛋白MP3RT的免疫保护性占BCG免疫保护性的比例为73.4％，卡介苗和融合蛋白MP3RT联合的免疫保护性占BCG免疫保护性的比例为 102.6％；人源化小鼠肺脏中，融合蛋白MP3RT的免疫保护性占BCG免疫保护性的比例为95.7％，卡介苗和融合蛋白MP3RT联合的免疫保护性占BCG免疫保护性的比例为103.9％。肺脏是结核分枝杆菌最主要的靶器官，因此可以认为融合蛋白MP3RT的免疫保护性可达到BCG免疫保护性的95.7％以上，卡介苗和融合蛋白MP3RT联合的免疫保护性可达到BCG免疫保护性的103.9％以上。由此可见，BCG初免后用本发明提供的融合蛋白加强免疫能够诱导人源化小鼠肝脏和肺脏中结核分枝杆菌的菌落数显著降低，其免疫保护效率优于BCG单独免疫组。
本发明提供的融合蛋白可以抑制结核分枝杆菌在人源化动物体内的增殖；据此可以制备结核分枝杆菌疫苗。本发明具有重要的应用价值。
附图说明
图1为四次独立ELISOPT实验筛选阳性表位肽的实验结果。
图2为融合蛋白MP3RT溶液的12％聚丙烯酰胺凝胶电泳结果。
图3为通过免疫小鼠肝脏和肺脏中结核分枝杆菌菌落数评价融合蛋白MP3RT的免疫保护效果。
图4为DNASTAR软件的Protean模块对融合蛋白MP3RT的预测结果。
图5为DNASTAR软件的Protean模块对融合蛋白甲的预测结果。
图6为DNASTAR软件的Protean模块对融合蛋白乙的预测结果。
图7为DNASTAR软件的Protean模块对融合蛋白丙的预测结果。
图8为DNASTAR软件的Protean模块对融合蛋白丁的预测结果。
图9为DNASTAR软件的Protean模块对融合蛋白戊的预测结果。
具体实施方式
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。
HLA-A11/DR1转基因C57BL/6小鼠记载于如下文献中：曾扬.人MHC转基因小鼠模型建立及其应用基础研究.中国人民解放军军事医学科学院.2016.在下文中， HLA-A11/DR1转基因C57BL/6小鼠称为人源化小鼠。
C57BL/6小鼠为北京维通利华实验动物技术有限公司的产品。在下文中，C57BL/6小鼠称为野生型小鼠。
CpG佐剂为生工生物工程(上海)股份有限公司的产品，产品目录号为ODN2395。罗氏培养基为珠海贝索生物技术有限公司的产品，产品目录号为BA7005C-2。载体 pET-32a(+)和大肠杆菌BL21均为Novagen公司的产品，产品目录号分别为69015和 69450。卡介苗为成都生物制品有限责任公司的产品。
下述实施例中结核分枝杆菌均为结核分枝杆菌标准株H37Rv，在符合生物安全操作规范的情况下，公众可从申请人处获得，仅可用于重复本发明实验使用。结核分枝杆菌标准株H37Rv记载于如下文献中：Yan L，Xiaoyan Z，Li X，et al.Immunogenicity andTherapeutic Effects of pVAX1-rv1419 DNA from Mycobacterium tuberculosis[J].Current Gene Therapy，2016，16(4)：249-255.在文献中，结核分枝杆菌标准株H37Rv的名称为Mycobacterium tuberculosis，H37Rv strain。
实施例1、人工合成结核分枝杆菌Th1表位肽
一、采用生物信息学预测结核分枝杆菌Th1优势表位
1、从NCBI数据库中获取结核分枝杆菌MPT51、MPT63、MPT64、MTB8.4、PPE18、PPE44、PPE68、RFPA、RFPB、RFPE和TB10.4等目标蛋白的氨基酸序列，然后利用IEDB MHC-Ⅱ数据库(网址为：http://tools.iedb.org/mhcii/)预测HLA-DRB1*01:01限制性表位。
2、分别使用IEDB recommended、Consensus method、Combinatorial library、NN-align (netMHCII-2.2)、SMM-align(netMHCII-1.1)、Sturniolo和NetMHCIIpan七种方法对步骤1预测的HLA-DRB1*01:01限制性表位进行预测，然后综合排序打分，综合排序中得分在10以下的表位即为Th1优势表位，得分越低代表亲和力越高。
Consensus method记载于如下文献中：Wang P，Sidney J，Kim Y，Sette A，LundO， Nielsen M，Peters B.2010.Peptide binding predictions for HLA DR，DP and DQmolecules.BMC Bioinformatics.11:568.Wang P，Sidney J，Dow C，MothéB，Sette A，Peters B.2008.A systematic assessment of MHC class II peptide bindingpredictions and evaluation of a consensus approach.PLoSComput Biol.4(4):e1000048.
Combinatorial library记载于如下文献中：Sidney J，Assarsson E，Moore C，Ngo S， Pinilla C，Sette A，Peters B.2008.Quantitative peptide binding motifsfor 19 human and mouse MHC class I molecules derived using positionalscanning combinatorial peptide libraries.Immunome Res 4:2.
NN-align(netMHCII-2.2)记载于如下文献中：Nielsen M，Lund O.2009.NN-align. An artificial neural network-based alignment algorithm for MHC classII peptide binding prediction.BMC Bioinformatics.10:296.
SMM-align(netMHCII-1.1)记载于如下文献中：Nielsen M，Lundegaard C，LundO.2007.Prediction of MHC class II binding affinity using SMM-align，a novelstabilization matrix alignment method.BMC Bioinformatics.8:238.
Sturniolo记载于如下文献中：Sturniolo T，Bono E，Ding J，Raddrizzani L，Tuereci O，Sahin U，Braxenthaler M，Gallazzi F，Protti MP，Sinigaglia F，HammerJ.1999.Generation of tissue-specific and promiscuous HLA ligand databasesusing DNA microarrays and virtual HLA class II matrices.Nat Biotechnol.17(6):555-561.
NetMHCIIpan记载于如下文献中：Andreatta M，Karosiene E，Rasmussen M，Stryhn A，Buus S，and Nielsen M.2015.Accurate pan-specific prediction ofpeptide-MHC class II binding affinity with improved binding core identification.Immunogenetics.67(11-12)： 641-50.
结核分枝杆菌Th1优势表位具体信息见表1。
表1
二、人工合成结核分枝杆菌Th1表位肽
各个结核分枝杆菌Th1表位肽均采用固相合成法体外合成，然后高压液相层析法进行纯化获得。
各个结核分枝杆菌Th1表位肽的氨基酸序列具体如表1中第5列所示。
实施例2、采用四次独立ELISOPT实验筛选阳性表位肽
一、第一次ELISPOT实验(重复2次)
A、表位肽刺激组
1、脾细胞悬液的制备
(1)将100μL灭活的结核分枝杆菌菌液(约5×106PFU)和100μL完全弗氏佐剂混匀，然后免疫C57BL/6小鼠。
共免疫10只。
(2)免疫后第15天处死小鼠，然后将小鼠置于75％(v/v)乙醇水溶液，10min 后取出，解剖取脾脏。
(3)取无菌培养皿，加入10mL 1640细胞培养液，然后将一个无菌的200目铜网置于无菌培养皿中，然后将脾脏置于铜网，用注射器推杆头部(无菌)轻轻挤压使得脾细胞分散开来。
(4)准备ELISOT板，用PBS缓冲液洗涤4次(200μL/孔)，然后用含10％(v/v) FBS的1640培养基按照200μL孔的量孵育至少30min，得到脾细胞悬液。
2、红细胞裂解
(1)取步骤1制备的脾细胞悬液，4℃、500g离心5min，弃上清。
(2)加入红细胞裂解液(加入量为20-30mL/脾脏)，轻轻吹打混匀，室温裂解4-5min。期间每隔1min轻轻摇晃一次。
(3)4℃、500g离心5min，弃上清。
如果发现红细胞裂解不完全，可以重复步骤(2)和步骤(3)。
(4)洗涤1-2次。每次洗涤的步骤为：加入适量无血清培养液重悬沉淀，4℃、 500g离心2-3min，收集沉淀。
洗涤时无血清培养液的用量通常应至少为沉淀体积的5倍。
3、计数及铺板
(1)用无血清1640细胞培养液重悬步骤2收集的沉淀(即细胞沉淀)，细胞计数，将细胞浓度调至3×106/mL。
(2)取ELISPOT板，按照100μL/孔铺板，使得每个孔中细胞个数为3×105个。
(3)按照10μL/孔的量加入结核分枝杆菌Th1表位肽，然后将ELISPOT板置于细胞培养箱，37℃、5％CO2孵育12-48h。
4、ELISpot检测小鼠IFN-γ反应点
(1)取完成步骤3的ELISPOT板，轻轻的移去ELISPOT板中的细胞，然后用 PBS缓冲液洗涤5次，200μL/孔。
(2)用含0.5％(v/v)FBS的PBS缓冲液将R4-6A2标记的单克隆抗体稀释至 1μg/mL，然后按照100μL/孔的量加入ELISPOT板，室温孵育2h。
(3)PBS缓冲液洗涤5次，200μL/孔。
(4)用含0.5％(v/v)FBS的PBS缓冲液将链亲和素-ALP按照1:1000稀释，然后按照100μL/孔的量加入ELISPOT板，室温孵育1h。
(5)PBS缓冲液洗涤5次，200μL/孔。
(6)用0.45μm过滤器过滤显色液，然后按照100μL/孔的量加入ELISPOT板，观察孔里斑点的变化。待斑点达到要求后，迅速用大量自来水冲洗，拍干水，避光使其自然干燥。读板，扫描，统计结果。
B、空白对照组
将上述步骤A、3中(3)替换为步骤(3A)，其它步骤均不变，作为空白对照组。步骤(3A)为：将ELISPOT板置于细胞培养箱，37℃、5％CO2孵育12-48h。
C、统计刺激指数(SI)
计算刺激指数(SI)。刺激指数＝表位肽刺激组的斑点数/空白对照组的斑点数。
当某表位肽的SI＞2时，则认为该表位肽为阳性表位肽。
其中一次的实验结果见图1中A。
二、第二次ELISPOT实验(重复2次)
A、表位肽刺激组
1、脾细胞悬液的制备
(1)取浓度为5mg/mL的灭活结核分枝杆菌溶液，400W超声20min，然后按照 200μL/只的剂量免疫人源化小鼠10只。
(2)免疫后第15天处死人源化小鼠，然后将人源化小鼠置于75％(v/v)乙醇水溶液，10min后取出，解剖取脾脏。
(3)取无菌培养皿，加入10mL 1640细胞培养液，然后将一个无菌的200目铜网置于无菌培养皿中，然后将脾脏置于铜网，用注射器推杆头部(无菌)轻轻挤压使得脾细胞分散开来。
(4)准备ELISOT板，用PBS缓冲液洗涤4次(200μL/孔)，然后用含10％(v/v) FBS的1640培养基按照200μL孔的量孵育至少30min，得到脾细胞悬液。
2、红细胞裂解
同步骤一A中2。
3、计数及铺板
同步骤一A中3。
4、ELISpot检测小鼠IFN-γ反应点
同步骤一A中4。
B、空白对照组
将上述步骤A、3中(3)替换为步骤(3A)，其它步骤均不变，作为空白对照组。步骤(3A)为：将ELISPOT板置于细胞培养箱，37℃、5％CO2孵育12-48h。
C、统计刺激指数(SI)
同步骤一中C。
其中一次的实验结果见图1中B。
三、第三次ELISPOT实验(重复3次)
A、表位肽刺激组
1、脾细胞悬液的制备
(1)取浓度为5mg/mL的灭活结核分枝杆菌溶液，400W超声20min，提取总蛋白；然后与等体积的弗氏完全佐剂混合，得到混合液；然后按照200μL/只的剂量免疫人源化小鼠10只。
(2)免疫后第15天处死人源化小鼠，然后将人源化小鼠置于75％(v/v)乙醇水溶液，10min后取出，解剖取脾脏。
(3)取无菌培养皿，加入10mL 1640细胞培养液，然后将一个无菌的200目铜网置于无菌培养皿中，然后将脾脏置于铜网，用注射器推杆头部(无菌)轻轻挤压使得脾细胞分散开来。
(4)准备ELISOT板，用PBS缓冲液洗涤4次(200μL/孔)，然后用含10％(v/v) FBS的1640培养基按照200μL孔的量孵育至少30min，得到脾细胞悬液。
2、红细胞裂解
同步骤一A中2。
3、计数及铺板
同步骤一A中3。
4、ELISpot检测小鼠IFN-γ反应点
同步骤一A中4。
B、空白对照组
将上述步骤A、3中(3)替换为步骤(3A)，其它步骤均不变，作为空白对照组。步骤(3A)为：将ELISPOT板置于细胞培养箱，37℃、5％CO2孵育12-48h。
C、统计刺激指数(SI)
同步骤一中C。
其中一次的实验结果见图1中C。
四、第四次ELISPOT实验(重复3次)
A、表位肽刺激组
1、脾细胞悬液的制备
(1)取浓度为5mg/mL的灭活结核分枝杆菌溶液，400W超声20min，提取总蛋白；然后与等体积的不弗氏完全佐剂混合，得到混合液；然后按照200μL/只的剂量免疫人源化小鼠10只。
(2)免疫后第15天处死人源化小鼠，然后将人源化小鼠置于75％(v/v)乙醇水溶液，10min后取出，解剖取脾脏。
(3)取无菌培养皿，加入10mL 1640细胞培养液，然后将一个无菌的200目铜网置于无菌培养皿中，然后将脾脏置于铜网，用注射器推杆头部(无菌)轻轻挤压使得脾细胞分散开来。
(4)准备ELISOT板，用PBS缓冲液洗涤4次(200μL/孔)，然后用含10％(v/v) FBS的1640培养基按照200μL孔的量孵育至少30min，得到脾细胞悬液。
2、红细胞裂解
同步骤一A中2。
3、计数及铺板
同步骤一A中3。
4、ELISpot检测小鼠IFN-γ反应点
同步骤一A中4。
B、空白对照组
将上述步骤A、3中(3)替换为步骤(3A)，其它步骤均不变，作为空白对照组。步骤(3A)为：将ELISPOT板置于细胞培养箱，37℃、5％CO2孵育12-48h。
C、统计刺激指数(SI)
同步骤一中C。
其中一次的实验结果见图1中D。
经过四次独立ELISOPT实验共10次重复，最终确定6个表位肽为阳性表位肽。这6个表位肽分别为Mtb8.469-83、PPE18115-129、PPE18149-163、PPE68138-152、RpfA377-391和TB10.421-35，其刺激指数和氨基酸序列等信息详见表2。
表2
实施例3、重组质粒pET-MP3RT的构建和融合蛋白MP3RT的表达
一、重组质粒pET-MP3RT的构建
1、人工合成SEQ ID NO：1所示的DNA分子。SEQ ID NO：1中，自5’末端起，第1至6位为限制性内切酶NcoI的识别位点，第7至489位为TrxA-tag标签的编码基因，第493至537位为Mtb8.469-83的编码基因，第553至597位为PPE18115-129的编码基因，第613至657位为PPE18149-163的编码基因，第673至717位为PPE68138-152的编码基因，第733至777位为RpfA377-391的编码基因，第793至837位为TB10.421-35的编码基因，第538至552位、第598至612位、第658至672位、第718至732位和第778至792位均为连接肽的编码基因，第838至855位为His标签的编码基因，第856至858位为终止密码子，第859至864位为限制性内切酶XhoI的编码基因。
SEQ ID NO：1中自5’末端起，将第7至858位所示的DNA分子命名为融合基因MP3RT。
2、用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切步骤1合成的DNA分子，回收约864bp 的酶切产物。
3、用限制性内切酶NcoI和XhoI双酶切载体pET-32a(+)，回收约855kb的载体骨架。
4、将酶切产物和载体骨架进行连接，得到重组质粒pET-MP3RT。
将重组质粒pET-MP3RT进行测序。根据测序结果，对重组质粒pET-MP3RT进行结构描述如下：将载体pET-32a(+)的限制性内切酶NcoI和XhoI之间的DNA小片段替换为SEQ IDNO：1中第7至858位所示的DNA分子，得到的重组质粒。
重组质粒pET-MP3RT表达SEQ ID NO：2所示的融合蛋白MP3RT。
SEQ ID NO：2中，自N末端起，第1至161位为TrxA-tag标签，第163至177 位为Mtb8.469-83，第183至197位为PPE18115-129，第203至217位为PPE18149-163，第 223至237位为PPE68138-152，第243至257位为RpfA377-391，第263至277位为TB10.421-35，第178至182位、第198至202位、第218至222位、第238至242位和第258至262 位均为连接肽，第278至283位为His标签。
二、重组大肠杆菌BL21/pET-MP3RT的获得
将重组质粒pET-MP3RT导入大肠杆菌BL21，得到重组大肠杆菌 BL21/pET-MP3RT。
三、融合蛋白MP3RT的表达
1、将重组大肠杆菌BL21/pET-MP3RT接种至含200mg/L氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃、200r/min培养过夜，得到培养菌液1。
2、完成步骤1后，将所述培养菌液1按照1％(v/v)的接种量接种至含200mg/L 氨苄青霉素的LB液体培养基，37℃、200r/min培养，得到OD600nm值为0.6的培养菌液2。
3、完成步骤2后，取所述培养菌液2，加入IPTG并使IPTG在体系中的浓度为 0.1mM，然后25℃、200r/min诱导表达8h，得到发酵液。
四、融合蛋白MP3RT的纯化
1、取100mL步骤三中3得到的发酵液，5000rpm离心10min，收集菌体沉淀。
2、取步骤1收集的菌体沉淀，加入30mL可溶性蛋白裂解缓冲液(含10mM咪唑、300mM NaCl和50mM NaH2PO4的水溶液；NaOH调节pH值至8.0)重悬，然后冰浴条件下超声(工作4.5sec，间隔9sec，共超声60min，功率为125W)，得到超声裂解物。
3、完成步骤2后，取所述超声裂解物，12000g离心20min，收集沉淀。
4、取步骤3收集的沉淀，加入10mL包涵体蛋白裂解液，并且充分吹打混匀，室温放置过夜。
5、完成步骤4后，将过夜混合物与2mL Ni-NTA(Qiagen公司产品，产品目录号为30230)混合，室温、200rpm振荡混匀4h(使融合蛋白MP3RT与Ni-NTA充分结合)，然后将混合物移入纯化柱内，用包涵体蛋白裂解缓冲液(含100mM NaH2PO4、 10mM Tris碱、0.05％(v/v)Tween 20和8M尿素的水溶液；NaOH调节pH值至8.0) 洗涤3次，每次10mL(流速控制为3mL/min)。
6、完成步骤5后，用包涵体蛋白洗脱缓冲液(含100mM NaH2PO4、10mM Tris 碱、0.05％(v/v)Tween 20和8M尿素的水溶液；NaOH调节pH值至4.5)洗脱5次，每次500μL(流速控制为3mL/min)，合并收集的洗脱液并测蛋白浓度，得到融合蛋白 MP3RT溶液。
五、融合蛋白MP3RT的鉴定
将步骤四得到的融合蛋白MP3RT溶液进行12％聚丙烯酰胺凝胶电泳。
电泳结果见图2(M为蛋白Marker，1为融合蛋白MP3RT溶液)。结果表明，融合蛋白MP3RT溶液，只显示一条约29.7kDa的条带，与预期完全符合。
实施例4、融合蛋白MP3RT的保护性评价
一、小鼠免疫
取6-7周龄、体重为16-18g的雌性人源化小鼠或雌性野生型小鼠，随机分为实验组(即MP3RT组)、阴性对照组(即PBS组)、阳性对照组(即BCG组)和加强组(即 BCG+MP3RT组)4组，每组6只或7只。各组进行如下处理：
实验组：适应性饲喂第28天，用200μL CpG佐剂中配制30μg融合蛋白MP3RT 皮下免疫1次，之后用200μL CpG佐剂中配制20μg融合蛋白MP3RT腹腔免疫2次，每次免疫间隔14天；
阴性对照组：适应性饲喂第28天，用200μL混合液(由30μg CpG佐剂冻干粉末和200μL PBS缓冲液混合而成)皮下免疫1次，之后用200μL混合液腹腔免疫2次，每次免疫间隔14天；
阳性对照组：适应性饲喂第28天，用200μL卡介苗(约1×105CFU)皮下免疫1 次，之后用200μL卡介苗腹腔免疫2次，每次免疫间隔14天；
加强组：适应性饲喂第28天，用200μL卡介苗(约1×105CFU)皮下免疫1次，之后用200μL CpG佐剂中配制20μg融合蛋白MP3RT腹腔免疫2次，每次免疫间隔 14天。
二、攻毒
完成步骤一后第14天，取人源化小鼠或野生型小鼠，每天尾静脉注射结核分枝杆菌进行攻毒，攻毒剂量为1.75×105CFU/只。
连续攻毒28天。
三、结核分枝杆菌菌落数检测
1、完成步骤二后，用拉颈断髓法处死小鼠，观察肺脏和肝脏大体病理，然后分别无菌摘取肺脏和肝脏。
2、取小鼠的肺脏或肝脏，加入适量生理盐水，用研磨仪研磨，得到研磨液。
3、完成步骤2后，取研磨液，加入4％(m/v)NaOH水溶液消化30min，摇匀，得到消化液。
4、完成步骤3后，取消化液，用生理盐水进行10、100、1000倍等比稀释，得到稀释液。将稀释液均匀涂布在罗氏培养基(每个稀释度3个平行)，37℃培养4周。
5、完成步骤4后，统计结核分枝杆菌的菌落数，并按组取平均值。
实验结果见表3、表4和图3(左上为人源化小鼠肝脏，右上为人源化小鼠肺脏，左下为野生型小鼠肝脏，右下为野生型小鼠肺脏)。
表3.人源化小鼠肝脏的统计结果
结核分枝杆菌菌落数(CFU)
MP3RT组 9495.467
PBS组 28351.060
BCG组 2659.802
BCG+MP3RT组 1983.280
表4.人源化小鼠肺脏的统计结果
结核分枝杆菌菌落数(CFU)
MP3RT组 7569.886
PBS组 87123.880
BCG组 3975.000
BCG+MP3RT组 825.000
结果如下：
人源化小鼠肝脏中，与PBS组相比，BCG组、MP3RT组和BCG+MP3RT组的结核分枝杆菌菌落数显著降低；
人源化小鼠肺脏中，与PBS组相比，BCG组和BCG+MP3RT组的结核分枝杆菌菌落数显著降低，MP3RT组的结核分枝杆菌菌落数也有一定程度的降低；与BCG组相比，BCG+MP3RT组的结核分枝杆菌菌落数也显著降低；由此可见，卡介苗和融合蛋白MP3RT联合免疫的保护效果比BCG单独免疫更佳；
野生型小鼠肝脏中，PBS组、BCG组、MP3RT组和BCG+MP3RT组的结核分枝杆菌菌落数无显著差异(P>0.05)；
野生型小鼠肺脏中，PBS组、BCG组、MP3RT组和BCG+MP3RT组的结核分枝杆菌菌落数无显著差异(P>0.05)；
与PBS组相比，MP3RT组可减少结核分枝杆菌在人源化小鼠肝脏和肺脏中数量的66.5％和91.3％，BCG+MP3RT组可减少结核分枝杆菌在人源化小鼠肝脏和肺脏中数量的93.0％和99.1％，BCG组可减少结核分枝杆菌在人源化小鼠肝脏和肺脏中数量的90.6％和95.4％。由此可见，人源化小鼠肝脏中，融合蛋白MP3RT的免疫保护性占 BCG免疫保护性的比例为73.4％(66.5％/90.6％)，卡介苗和融合蛋白MP3RT联合的免疫保护性占BCG免疫保护性的比例为102.6％(93.0％/90.6％)；人源化小鼠肺脏中，融合蛋白MP3RT的免疫保护性占BCG免疫保护性的比例为95.7％(91.3％/95.4％)，卡介苗和融合蛋白MP3RT联合的免疫保护性占BCG免疫保护性的比例为103.9％ (99.1％/95.4％)。肺脏是结核分枝杆菌最主要的靶器官，因此可以认为融合蛋白 MP3RT的免疫保护性可达到BCG免疫保护性的95.7％以上，卡介苗和融合蛋白 MP3RT联合的免疫保护性可达到BCG免疫保护性的103.9％以上。
由此可见，BCG初免后用融合蛋白MP3RT加强免疫能够诱导人源化C57BL/6小鼠肝脏和肺脏中结核分枝杆菌的菌落数显著降低，其免疫保护效率优于BCG单独免疫组。但是这种优势在野生型C57BL/6小鼠的肝脏和肺脏中均没有得到体现，进一步说明中国人群优势Th1表位疫苗分子具有很好的特异性。
实施例5、Mtb8.469-83、PPE18115-129、PPE18149-163、PPE68138-152、RpfA377-391和TB10.421-35六个表位肽排列顺序对融合蛋白的影响
为了解Mtb8.469-83、PPE18115-129、PPE18149-163、PPE68138-152、RpfA377-391和TB10.421-35六个表位肽排列顺序对融合蛋白的抗原性、疏水性、亲水性、α螺旋及β折叠等的影响，本发明的发明人采用DNASTAR软件的Protean模块分别对融合蛋白MP3RT中的六个表位肽顺序进行了预测。由于上述六个表位排列组合多达720种，在此仅选择将 Mtb8.469-83表位肽的位置依次后移，对得到的融合蛋白甲、融合蛋白乙、融合蛋白丙、融合蛋白丁和融合蛋白戊进行预测。
融合蛋白甲与融合蛋白MP3RT的氨基酸序列的区别在于：表位肽Mtb8.469-83与表位肽PPE18115-129位置互换。
融合蛋白乙与融合蛋白MP3RT的氨基酸序列的区别在于：表位肽Mtb8.469-83与表位肽PPE18149-163位置互换。
融合蛋白丙与融合蛋白MP3RT的氨基酸序列的区别在于：表位肽Mtb8.469-83与表位肽PPE68138-152位置互换。
融合蛋白丁与融合蛋白MP3RT的氨基酸序列的区别在于：表位肽Mtb8.469-83与表位肽RpfA377-391位置互换。
融合蛋白戊与融合蛋白MP3RT的氨基酸序列的区别在于：表位肽Mtb8.469-83与表位肽TB10.421-35位置互换。
融合蛋白MP3RT的预测结果见图4。
融合蛋白甲的预测结果见图5。
融合蛋白乙的预测结果见图6。
融合蛋白丙的预测结果见图7。
融合蛋白丁的预测结果见图8。
融合蛋白戊的预测结果见图9。
结果表明，Mtb8.469-83、PPE18115-129、PPE18149-163、PPE68138-152、RpfA377-391和TB10.421-35六个表位肽的排列顺序对总体抗原特性无明显影响，改变仅表现在位置的变化。以上数据提示，由Mtb8.469-83、PPE18115-129、PPE18149-163、PPE68138-152、RpfA377-391和TB10.421-35六个表位肽组成的融合蛋白在抑制结核分枝杆菌的增殖上具有类似的效果。
<110> 中国人民解放军总医院第八医学中心
<120> 一种融合蛋白及其在抗结核分枝杆菌的免疫保护中的应用
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210>1
<211>864
<212>DNA
<213>Artificial sequence
<400>1
ccatggatga gcgataaaat tattcacctg actgacgaca gttttgacac ggatgtactc 60
aaagcggacg gggcgatcct cgtcgatttc tgggcagagt ggtgcggtcc gtgcaaaatg 120
atcgccccga ttctggatga aatcgctgac gaatatcagg gcaaactgac cgttgcaaaa 180
ctgaacatcg atcaaaaccc tggcactgcg ccgaaatatg gcatccgtgg tatcccgact 240
ctgctgctgt tcaaaaacgg tgaagtggcg gcaaccaaag tgggtgcact gtctaaaggt 300
cagttgaaag agttcctcga cgctaacctg gccggttctg gttctggcca tatgcaccat 360
catcatcatc attcttctgg tctggtgcca cgcggttctg gtatgaaaga aaccgctgct 420
gctaaattcg aacgccagca catggacagc ccagatctgg gtaccgacga cgacgacaag 480
gccatggcta tgctgcgtaa cttcctggcg gcgccgccgc cgcagcgtgc ggcgatgggt 540
ggcggtggca gccgtgcgga gctgatgatc ctgattgcga ccaacctgct gggtcaaggt 600
ggcggtggca gcgcggcggc gatgtttggt tatgcggcgg cgaccgcgac cgcgaccggt 660
ggcggtggca gcgactattt tatccgtatg tggaaccaag cggcgctggc gatggagggt 720
ggcggtggca gcgcttacac caagaaactg tggcaggcga tccgtgcgca agatgtgggt 780
ggcggtggca gctatgcggg taccctgcaa agcctgggcg cggaaattgc ggttgagcac 840
caccaccacc accactgact cgag 864
<210>2
<211>283
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<400>2
Met Ser Asp Lys Ile Ile His Leu Thr Asp Asp Ser Phe Asp Thr Asp
1 5 10 15
Val Leu Lys Ala Asp Gly Ala Ile Leu Val Asp Phe Trp Ala Glu Trp
20 25 30
Cys Gly Pro Cys Lys Met Ile Ala Pro Ile Leu Asp Glu Ile Ala Asp
35 40 45
Glu Tyr Gln Gly Lys Leu Thr Val Ala Lys Leu Asn Ile Asp Gln Asn
50 55 60
Pro Gly Thr Ala Pro Lys Tyr Gly Ile Arg Gly Ile Pro Thr Leu Leu
65 70 75 80
Leu Phe Lys Asn Gly Glu Val Ala Ala Thr Lys Val Gly Ala Leu Ser
85 90 95
Lys Gly Gln Leu Lys Glu Phe Leu Asp Ala Asn Leu Ala Gly Ser Gly
100 105 110
Ser Gly His Met His His His His His His Ser Ser Gly Leu Val Pro
115 120 125
Arg Gly Ser Gly Met Lys Glu Thr Ala Ala Ala Lys Phe Glu Arg Gln
130 135 140
His Met Asp Ser Pro Asp Leu Gly Thr Asp Asp Asp Asp Lys Ala Met
145 150 155 160
Ala Met Leu Arg Asn Phe Leu Ala Ala Pro Pro Pro Gln Arg Ala Ala
165 170 175
Met Gly Gly Gly Gly Ser Arg Ala Glu Leu Met Ile Leu Ile Ala Thr
180 185 190
Asn Leu Leu Gly Gln Gly Gly Gly Gly Ser Ala Ala Ala Met Phe Gly
195 200 205
Tyr Ala Ala Ala Thr Ala Thr Ala Thr Gly Gly Gly Gly Ser Asp Tyr
210 215 220
Phe Ile Arg Met Trp Asn Gln Ala Ala Leu Ala Met Glu Gly Gly Gly
225 230 235 240
Gly Ser Ala Tyr Thr Lys Lys Leu Trp Gln Ala Ile Arg Ala Gln Asp
245 250 255
Val Gly Gly Gly Gly Ser Tyr Ala Gly Thr Leu Gln Ser Leu Gly Ala
260 265 270
Glu Ile Ala Val Glu His His His His His His
275 280
<210>3
<211>15
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<400>3
Leu Arg Asn Phe Leu Ala Ala Pro Pro Pro Gln Arg Ala Ala Met
1 5 10 15
<210>4
<211>15
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<400>4
Arg Ala Glu Leu Met Ile Leu Ile Ala Thr Asn Leu Leu Gly Gln
1 5 10 15
<210>5
<211>15
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<400>5
Ala Ala Ala Met Phe Gly Tyr Ala Ala Ala Thr Ala Thr Ala Thr
1 5 10 15
<210>6
<211>15
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<400>6
Asp Tyr Phe Ile Arg Met Trp Asn Gln Ala Ala Leu Ala Met Glu
1 5 10 15
<210>7
<211>15
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<400>7
Ala Tyr Thr Lys Lys Leu Trp Gln Ala Ile Arg Ala Gln Asp Val
1 5 10 15
<210>8
<211>15
<212>PRT
<213>Artificial sequence
<400>8
Tyr Ala Gly Thr Leu Gln Ser Leu Gly Ala Glu Ile Ala Val Glu
1 5 10 15

Claims (10)

1.一种融合蛋白，包括多肽甲、多肽乙、多肽丙、多肽丁、多肽戊和多肽己；
多肽甲的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；
多肽乙的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示；
多肽丙的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示；
多肽丁的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示；
多肽戊的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；
多肽己的氨基酸序列如SEQ ID NO：8所示。
2.如权利要求1所述融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白的N端还含有甲硫氨酸。
3.如权利要求1或2所述融合蛋白，其特征在于：各个多肽之间还有连接肽。
4.如权利要求1至3任一所述融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白为b1)-b6)中任一种：
b1)氨基酸序列如SEQ ID NO：2自N端起第162位至277位所示的融合蛋白1；
b2)将融合蛋白1中多肽甲和多肽乙的位置互换，得到的融合蛋白2；
b3)将融合蛋白1中多肽甲和多肽丙的位置互换，得到的融合蛋白3；
b4)将融合蛋白1中多肽甲和多肽丁的位置互换，得到的融合蛋白4；
b5)将融合蛋白1中多肽甲和多肽戊的位置互换，得到的融合蛋白5；
b6)将融合蛋白1中多肽甲和多肽己的位置互换，得到的融合蛋白6。
5.如权利要求1至4任一所述融合蛋白，其特征在于：所述融合蛋白的N端和/或C端还连接标签。
6.编码权利要求1至6任一所述融合蛋白的核酸分子。
7.权利要求1中所述多肽甲、所述多肽乙、所述多肽丙、所述多肽丁、所述多肽戊或所述多肽己。
8.d1)或d2)或d3)或d4)或d5)或d6)或d7)或d8)或d9)：
d1)“权利要求1至6任一所述融合蛋白”或权利要求7所述核酸分子在制备结核分枝杆菌疫苗中的应用；
d2)“权利要求1至6任一所述融合蛋白”或权利要求7所述核酸分子在抑制结核分枝杆菌增殖中的应用；
d3)“权利要求1至6任一所述融合蛋白”或权利要求7所述核酸分子在制备用于预防和/或治疗结核病的产品中的应用；
d4)“‘权利要求1至6任一所述融合蛋白’或权利要求7所述核酸分子”联合卡介苗在制备结核分枝杆菌疫苗中的应用；
d5)“‘权利要求1至6任一所述融合蛋白’或权利要求7所述核酸分子”联合卡介苗在抑制结核分枝杆菌增殖中的应用；
d6)“‘权利要求1至6任一所述融合蛋白’或权利要求7所述核酸分子”联合卡介苗在制备用于预防和/或治疗结核病的产品中的应用；
d7)权利要求1中所述多肽甲、所述多肽乙、所述多肽丙、所述多肽丁、所述多肽戊和所述多肽己中的任五个、任四个、任三个、任两个或任一个在制备结核分枝杆菌疫苗中的应用；
d8)权利要求1中所述多肽甲、所述多肽乙、所述多肽丙、所述多肽丁、所述多肽戊和所述多肽己中的任五个、任四个、任三个、任两个或任一个在抑制结核分枝杆菌增殖中的应用；
d9)权利要求1中所述多肽甲、所述多肽乙、所述多肽丙、所述多肽丁、所述多肽戊和所述多肽己中的任五个、任四个、任三个、任两个或任一个在制备用于预防和/或治疗结核病的产品中的应用。
9.抗结核分枝杆菌制剂或“用于预防和/或治疗结核病的产品”，其含有“权利要求1至6任一所述融合蛋白”或权利要求7所述核酸分子。
10.如权利要求9所述的抗结核分枝杆菌制剂或产品，其特征在于：所述抗结核分枝杆菌制剂或所述产品还含有卡介苗。
CN201910858313.3A 2019-09-11 2019-09-11 一种融合蛋白及其在抗结核分枝杆菌的免疫保护中的应用 Active CN110590957B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910858313.3A CN110590957B (zh) 2019-09-11 2019-09-11 一种融合蛋白及其在抗结核分枝杆菌的免疫保护中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910858313.3A CN110590957B (zh) 2019-09-11 2019-09-11 一种融合蛋白及其在抗结核分枝杆菌的免疫保护中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110590957A true CN110590957A (zh) 2019-12-20
CN110590957B CN110590957B (zh) 2021-06-01

Family

ID=68858756

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910858313.3A Active CN110590957B (zh) 2019-09-11 2019-09-11 一种融合蛋白及其在抗结核分枝杆菌的免疫保护中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110590957B (zh)

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100999550A (zh) * 2006-01-10 2007-07-18 解放军总医院第二附属医院 结核分枝杆菌融合蛋白及其应用
US20070184074A1 (en) * 2002-02-15 2007-08-09 Corixa Corporation Fusion proteins of Mycobacterium tuberculosis
CN102180974A (zh) * 2011-03-22 2011-09-14 兰州大学 一种结核杆菌融合蛋白及其制备方法和应用
CN104640564A (zh) * 2012-07-10 2015-05-20 特兰斯吉恩股份有限公司 分枝杆菌抗原疫苗
CN106103471A (zh) * 2014-01-09 2016-11-09 特兰斯吉恩股份有限公司 异源寡聚分枝杆菌抗原的融合

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070184074A1 (en) * 2002-02-15 2007-08-09 Corixa Corporation Fusion proteins of Mycobacterium tuberculosis
CN100999550A (zh) * 2006-01-10 2007-07-18 解放军总医院第二附属医院 结核分枝杆菌融合蛋白及其应用
CN102180974A (zh) * 2011-03-22 2011-09-14 兰州大学 一种结核杆菌融合蛋白及其制备方法和应用
CN104640564A (zh) * 2012-07-10 2015-05-20 特兰斯吉恩股份有限公司 分枝杆菌抗原疫苗
CN106103471A (zh) * 2014-01-09 2016-11-09 特兰斯吉恩股份有限公司 异源寡聚分枝杆菌抗原的融合

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘苏东: ""结核分枝杆菌免疫优势CTL和Th1表位的筛选与鉴定"", 《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科学辑》 *
周玉真等: ""结核分枝杆菌基因Rv2660c、Rv2460c、Rv3875、Rv3804c细胞表位融合蛋白的表达及其免疫原性评价"", 《四川大学学报(医学版)》 *
娄加陶等: ""重组结核分枝杆菌多表位肽的免疫原性研究"", 《临床军医杂志》 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN110590957B (zh) 2021-06-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110760006B (zh) 一种非洲猪瘟免疫系统靶向基因工程疫苗
CN111018996A (zh) 一种非洲猪瘟中和表位亚单位疫苗
CN101624422B (zh) 日本血吸虫重组多表位抗原及其表达、纯化方法与应用
JP7146926B2 (ja) Ｃｄ４ヘルパーｔ細胞エピトープの融合ペプチドおよびそのワクチン
CN106632694B (zh) 一种重组蛋白及药物组合物与应用
CN112679584A (zh) 一种猪瘟抗原表位肽及其用途
CN101451145B (zh) 基于t细胞表位的结核基因疫苗及其制备方法和应用
CN108273054B (zh) 猪口蹄疫病毒O型、A型Fc多肽双价疫苗及其制备方法和应用
CN101088559A (zh) 一种多表位结核基因疫苗及其制备方法
CN111548395A (zh) 一种口蹄疫病毒二价多表位重组病毒样颗粒及其应用
CN106350527A (zh) 一种可在大肠杆菌可溶性高表达的白喉毒素突变体
CN116970058B (zh) 针对tp53基因r249s突变的肿瘤新抗原多肽及其应用
CN102178950B (zh) 一种亚单位疫苗免疫佐剂及应用
CN101376887B (zh) 猪口蹄疫重组免疫复合肽的制备方法及应用
CN110590957B (zh) 一种融合蛋白及其在抗结核分枝杆菌的免疫保护中的应用
CN1830489A (zh) 基于胃泌素释放肽的肿瘤多肽疫苗
CN109575141A (zh) 一种cd4辅助性t细胞表位融合肽及其疫苗
CN110358741B (zh) 一种表达猪塞内卡病毒vp2基因的重组杆状病毒及其制备方法与应用
WO2013102492A1 (en) Synthetic genes encoding peptide fragments of natural myelin proteins for induction of oral tolerance, dna fragment comprising these genes, means of obtaining these peptides in a microbial (bacterial) system and their medical application
CN103360497A (zh) 一种新型抗肿瘤融合蛋白疫苗及其制备方法和应用
CN112646046B (zh) 用于预防铜绿假单胞菌感染的多表位融合蛋白及其编码基因、表达载体和应用
CN110590958B (zh) 一种串联多肽及其在抗结核分枝杆菌的免疫保护中的应用
CN114437235B (zh) 马链球菌马亚种8种蛋白的重组融合蛋白及其制备方法和应用
CN116003540A (zh) 一种结核分枝杆菌抗原组合物pfhp010的制备及其应用
CN101880328B (zh) 微小隐孢子虫Th多表位基因和融合蛋白及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant