CN102905724A - 分枝杆菌抗原组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明提供一种抗原组合物，所述抗原组合物包含：(a)第一分枝杆菌抗原多肽或第一分枝杆菌多核苷酸；和(b)第二分枝杆菌抗原多肽或第二分枝杆菌多核苷酸；其中：(i)所述第一分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：1或7的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；(ii)所述第一分枝杆菌多核苷酸包含编码所述第一分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列；(iii)所述第二分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；和(iv)所述第二分枝杆菌多核苷酸包含编码所述第二分枝杆菌多肽的多核苷酸序列。

Description

分枝杆菌抗原组合物
本发明涉及分枝杆菌多核苷酸和多肽，涉及其片段或变体，涉及其抑制剂，涉及与其结合的抗体，涉及载体和微生物载体，涉及治疗性组合物如针对分枝杆菌感染的疫苗，并且涉及用于检测分枝杆菌感染的存在的组合物和方法。
微生物如沙门氏菌属(Salmonella)、耶尔森氏菌属(Yersinia)、志贺氏菌属(Shigella)、弯曲杆菌属(Campylobacter)、衣原体属(Chlamydia)和分枝杆菌属(Mycobacteria)的物种能够形成胞内感染。这些感染可能是绝对胞内的，或可能包含胞内成分和胞外成分二者。通常，这些微生物不能在体内例如在血流中自由循环，并且因此通常对药物治疗方案没有响应。
多药耐药性微生物的发展加剧了与治疗胞内感染相关的困难。由于突变随时间积累以及后续的突变基因向其他生物体的水平和垂直的转移，整个种类的抗生素已经失去活性。由于类似的原因，已不能证明疫苗治疗是对胞内微生物有效的。
结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)(MTB)和紧密相关的物种组成一小组已知为结核分枝杆菌复合体(Mycobacterium tuberculosiscomplex，MTC)的分枝杆菌。该组包括五种不同的物种：结核分枝杆菌(M.tuberculosis)，田鼠分枝杆菌(M.microti)，牛分枝杆菌(M.bovis)，M.caneti和非洲分枝杆菌(M.africanum)。
其他分枝杆菌在人类和动物中也是致病性的，例如，鸟分枝杆菌副结核亚种(M.avium subsp.paratuberculosis)，其在反刍动物中引起约尼病(Johne′s disease)，牛分枝杆菌，其在牛中引起结核病(tuberculosis)，鸟分枝杆菌和胞内分枝杆菌(M.intracellulare)，其在免疫受损的患者(例如，AIDS患者、和骨髓移植患者)中引起结核病，以及麻风分枝杆菌(M.leprae)，其在人类中引起麻风病(leprosy)。另一种重要的分枝杆菌物种是母牛分枝杆菌(M.vaccae)。
作为结核病感染(TB)的发病原因，结核分枝杆菌(M.tuberculosis)在世界范围内是细菌感染疾病引起的死亡的主要原因----潜在的感染影响多至世界人口的三分之一。世界卫生组织(WHO)估计每年全世界发生近九百万例TB新病例，近两百万例死亡。2005年，最大数量的TB新病例发生在东南亚(占全球发病病例的34％)，估计在撒哈拉以南非洲地区(sub-Saharan Africa)的发病率为每100,000人口近350例。然而，TB感染不限于发展中国家：自二十世纪八十年代末期以来，英国观察到结核病的复现，并且目前每年有超过8000例新病例----比率为每100,000人口14.0例。这些新病例中有大约40％发生在伦敦地区，在伦敦地区感染率为每100,000人口44.8例。
最佳的患者管理需要尽可能早地开始药物治疗并且分离感染的个体。不进行治疗的话，每名患有活动期TB病的个体平均每年传染10-15人。TB感染通常可以通过6个月疗程的抗生素进行治疗；然而，患者对长期药物治疗的依从性是变化的，有的患者经常在他们的症状停止时就停止治疗。不能完成治疗可能促进多药耐药性分枝杆菌的发展。
术语“潜伏期”与“持久性”同义，并且描述一种低代谢活性的可逆状态，在这种状态中，分枝杆菌细胞可以以有限的细胞分裂或没有细胞分裂存活延长的时间期间。在潜伏期(即，潜伏的感染)期间，与分枝杆菌感染相关的临床症状没有变得明显。
然而，环境刺激---例如，营养可用性和/或局部溶解的氧浓度的增加，可以诱导潜伏分枝杆菌的再激活。在活动性感染过程中，分枝杆菌(例如，结核分枝杆菌)表现出高代谢活性并且快速复制，导致带有相关临床症状的活动性分枝杆菌感染的发展。
体外研究已经表明分枝杆菌如结核分枝杆菌能够适应并且在营养贫瘠和氧气贫瘠的条件下存活，并且可以在一定范围的营养可用性和氧张力下生长。在体外适应碳饥饿和/或低溶解氧张力促进向可能与体内潜伏类似的非复制持续状态的转换。
怀疑分枝杆菌的胞内存活和繁殖是分枝杆菌疾病进展的主要支持因素。存在大量潜伏感染分枝杆菌的无症状的个体是控制分枝杆菌感染的主要问题，尤其是控制结核分枝杆菌感染的主要问题。另外，通过皮肤检测来检测潜伏分枝杆菌感染的常规方法可能受到BCG疫苗接种和暴露于环境分枝杆菌的损害。
针对结核分枝杆菌的疫苗预防的有效性已经广泛变化。目前的结核分枝杆菌疫苗，BCG，是牛分枝杆菌的减毒毒株。其针对儿童中严重的TB并发症是有效的，但是其效力在成年人中、特别是在种族之间有很大不同。BCG疫苗接种已经用来预防结核性脑膜炎(tuberculous meningitis)，并且帮助防止结核分枝杆菌向肺外部位的扩散，但是不能预防感染。BCG的有限功效和TB的全球流行性已经引起产生新的更有效的疫苗的国际性的尝试。
WO 03/004520(以本申请人的名义，通过引用结合于此)描述了不同亚组的分枝杆菌基因的鉴定，这些基因的表达在分枝杆菌潜伏期过程中被诱导或上调。具体地，与不是营养-不足(nutrient-starving)并且支持所述分枝杆菌的指数生长的培养条件相比较，在营养-不足培养条件下，在分枝杆菌培养过程中，这一确定的亚组的分枝杆菌基因的表达被诱导或上调。
WO 03/035681(以本申请人的名义，通过引用结合于此)描述了不同亚组的分枝杆菌基因的鉴定，这些基因的表达在分枝杆菌潜伏期过程中被下调。具体地，与不是营养-不足并且支持所述分枝杆菌的指数生长的培养条件相比较，在营养-不足培养条件下，这一确定的亚组的分枝杆菌基因的表达被下调。
WO 03/000721(以本申请人的名义，通过引用结合于此)描述了不同亚组的分枝杆菌基因的鉴定，与在37℃测量至少40％空气饱和的溶解氧张力相比较，这些基因的表达在由低溶解氧张力(在37℃测量至多10％空气饱和)限定的生长条件下连续培养分枝杆菌的过程中被诱导或上调。
考虑到分枝杆菌感染的日益增加的威胁和全球流行性，需要新的策略来更有效的预防、治疗和诊断分枝杆菌感染。
本发明提供一种抗原组合物，所述抗原组合物包含第一分枝杆菌抗原和第二分枝杆菌抗原；
其中所述第一分枝杆菌抗原包含：
(i)与选自SEQ ID NOs：1，3，5，7和56的潜伏期-调节多肽的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；或
(ii)编码(i)所述的多肽序列的多核苷酸序列；或与选自SEQ ID NOs：2，4，6，8和57的潜伏期-调节多核苷酸的核酸序列具有至少70％的核苷酸序列同一性的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段；
并且其中所述第二分枝杆菌抗原不同于所述第一分枝杆菌抗原。
当用于本文时，术语“分枝杆菌的”或“分枝杆菌”包括下述物种：草分枝杆菌(M.phlei)，耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)，非洲分枝杆菌(M.africanum)，M.caneti，偶发分枝杆菌(M.fortuitum)，瘰疬分枝杆菌(M.marinum)，溃疡分枝杆菌(M.ulcerans)，结核分枝杆菌(M.tuberculosis)，牛分枝杆菌(M.bovis)，田鼠分枝杆菌(M.microti)，鸟分枝杆菌(M.avium)，副结核分枝杆菌(M.paratuberculosis)，麻风分枝杆菌(M.leprae)，鼠麻风分枝杆菌(M.lepraemurium)，胞内分枝杆菌(M.intracellulare)，瘰疬分枝杆菌(M.scrofulaceum)，蟾分枝杆菌(M.xenopi)，日内瓦分枝杆菌(M.genavense)，堪萨斯分枝杆菌(M.kansasii)，猿分枝杆菌(M.simiae)，斯氏分枝杆菌(M.szulgai)，嗜血分枝杆菌(M.haemophilum)，亚洲分枝杆菌(M.asiaticum)，玛尔摩分枝杆菌(M.malmoense)，母牛分枝杆菌(M.vaccae)，M.caneti和石氏分枝杆菌(M.shimoidei)。其中特别感兴趣的是MTC的成员，如结核分枝杆菌。
术语抗原意指可以被免疫系统识别和/或刺激免疫应答的任意物质。例如，抗原可以刺激细胞介导的免疫应答和/或可以刺激抗体的产生。
在一个实施方案中，本发明的分枝杆菌抗原提供涉及免疫细胞如T细胞(CD4+和/或CD8+T细胞)的针对感染的细胞介导的应答和/或用Th1-型细胞因子如IFN-γ应答的能力。在一个实施方案中，分枝杆菌抗原诱导IFN-γ-分泌细胞(例如，主要是CD4+T细胞)。在这一点上，最近的研究表明免疫细胞应答(例如，特别是在肺黏膜中的T细胞免疫应答)对于针对肺分枝杆菌疾病的保护可能是关键的。
在一个实施方案中，本发明的分枝杆菌抗原提供针对分枝杆菌(如结核分枝杆菌)攻击的保护(如长期的保护)。
例如，本发明的分枝杆菌抗原可以诱导“记忆T细胞”，其可以长期(例如，数十年)持续刺激保护性免疫。记忆免疫应答已经归因于长期存在的(long-lived)抗原特异性T淋巴细胞的再激活，所述T淋巴细胞直接由分化的效应T细胞产生并且以静息状态继续存在。记忆T细胞是异质的；已经鉴定了至少两个亚组，它们具有不同的迁移能力和效应子功能。第一亚组的记忆T细胞称为‘效应子记忆T细胞’(TEM)，因为它们与在初次应答中产生的效应T细胞相似，在初次应答中，它们缺少用于迁移到发炎组织中的淋巴结归巢受体(lymph node-homing receptors)。当再遇到抗原时，TEM迅速产生IFN-γ或IL-4，或释放预先存储的穿孔蛋白。第二亚组的记忆T细胞(称为‘中心记忆细胞(central memory cells)’(TCM))表达L-选择蛋白和CCR7，并且缺少即时效应子功能。TCM具有低激活阈值并且当在次级淋巴器官中被再次刺激时增殖并且分化成效应子。
在一个实施方案中，分枝杆菌抗原提供针对分枝杆菌(例如结核分枝杆菌)感染的中和抗体应答。
在一个实施方案中，本发明的抗原组合物中的每种抗原独立的诱导有效的免疫应答(例如，细胞介导的免疫应答或抗体应答)。因此，按照这一实施方案，在向受试者施用所述抗原组合物后，在所述受试者中诱导针对所述抗原组合物中的每种抗原的免疫应答。
在这一点上，本发明人已经鉴定了(在一个实施方案中)与关于已知的多价疫苗组合物可能预见到的竞争效应相比较，本发明的抗原组合物有利地避免“抗原竞争”，或与低水平的“抗原竞争”相关。
“抗原竞争”是这样的一种现象，即，通过这种现象，针对一种抗原的免疫应答抑制针对第二种不相关的抗原的免疫应答(参见，Eidinger，D.等，J Exp Med，1968.128(5)：第1183-1200页)。例如，响应一种抗原的免疫细胞(例如，T细胞)可能积极地干扰响应另一种抗原的其他免疫细胞(例如，T细胞)(参见，Kerbel，R.S.和Eidinger，D.，Nat New Biol，1971.232(27)：第26-28页)。
WO 00/47227描述了(在实施例2中)用编码单独的分枝杆菌抗原85A的DNA免疫豚鼠(组A)；或用编码分枝杆菌抗原85A和分枝杆菌抗原MPT32二者的DNA免疫豚鼠(组B)。在用结核分枝杆菌攻击后，通过确定肺和脾中的分枝杆菌负荷评估疫苗功效。图11A和11B举例说明抗原85A和MPT32的组合(组B)没有单独的抗原85A(组A)对结核分枝杆菌有效。
因此，已知将有效的疫苗候选物汇集成多价疫苗抑制或甚至竞争性消除疫苗的功效。由于抗原竞争的普遍性，所以认为获得高于其最有效成分的提高的功效的多价疫苗是有益的。
因此，令人惊讶的是，本发明的抗原组合物组合单独能够引发免疫应答的抗原并且与针对每种单独的抗原的免疫应答相比较产生提高的/增强的免疫应答。
在一个实施方案中，分枝杆菌抗原包含多肽序列。分枝杆菌抗原可以是多肽。备选地，或另外，分枝杆菌抗原包含多核苷酸序列。例如，分枝杆菌抗原可以是多核苷酸，如DNA或RNA。
第一分枝杆菌抗原包含：
(i)与选自SEQ ID NOs：1，3，5，7和56的潜伏期-调节多肽的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；或
(ii)编码(i)所述的多肽序列的多核苷酸序列；或与选自SEQ ID NOs：2，4，6，8和57的潜伏期-调节多核苷酸的核酸序列具有至少70％的核苷酸序列同一性的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段。
在一个实施方案中，第一分枝杆菌抗原包含：
(i)与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；或
(ii)编码(i)所述的多肽序列的多核苷酸序列；或与SEQ ID NO：2的核酸序列具有至少70％的核苷酸序列同一性的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段。
由SEQ ID NOs：1，3，5，7和56所示的特定亚组的分枝杆菌多肽是‘潜伏期-调节多肽’。由SEQ ID NOs：2，4，6，8和57所示的特定亚组的分枝杆菌多核苷酸是‘潜伏期-调节多核苷酸’。
在一个实施方案中，‘潜伏期-调节多肽’由‘潜伏期-调节多核苷酸’编码。例如，潜伏期-调节多肽SEQ ID NO：1由潜伏期-调节多核苷酸SEQID NO：2编码；SEQ ID NO：3由SEQ ID NO：4编码；SEQ ID NO：5由SEQ ID NO：6编码；SEQ ID NO：7由SEQ ID NO：8编码；并且SEQ ID NO：56由SEQ ID NO：57编码。
潜伏期-调节多肽或多核苷酸的表达或活性响应分枝杆菌的潜伏期进行调节----例如，响应在诱导或维持分枝杆菌潜伏期的培养条件下的分枝杆菌(例如，结核分枝杆菌)的培养物进行调节。
在一个实施方案中，响应分枝杆菌潜伏期的条件“调节”潜伏期-调节多肽或多核苷酸的表达或活性意指响应潜伏期诱导或上调所述表达或活性。因此，潜伏期-调节多肽或多核苷酸可以是‘潜伏期-诱导的’或‘潜伏期-上调的’多肽或多核苷酸。
例如，与非潜伏期条件相比较，在潜伏期条件下，潜伏期-上调的多肽或多核苷酸的表达或活性可以上调至少1.5-倍、2-倍、5-倍、10-倍、20-倍或50-倍。
在分枝杆菌的天然环境中，在潜伏期过程中，在体内可以诱导或上调潜伏期-诱导和潜伏期-上调的多肽和多核苷酸的表达或活性。因此，潜伏期-诱导的或潜伏期-上调的分枝杆菌多肽和多核苷酸代表用于预防疾病的建立、扩散和再激活的良好的疫苗候选物和良好的治疗靶标和/或产生用于潜伏性感染的良好的诊断工具。
在一个实施方案中，响应分枝杆菌潜伏期的条件“调节”潜伏期-调节多肽的表达或活性意指响应潜伏期抑制或下调所述表达或活性。因此，在一个实施方案中，潜伏期-调节多肽或多核苷酸是‘潜伏期-抑制的’或‘潜伏期-下调的’多肽或多核苷酸。
与非潜伏期条件相比较，潜伏期-下调的多肽或多核苷酸的表达或活性可以下调至少1.5-倍、2-倍、5-倍、10-倍、20-倍或50-倍。引用“下调”包括“阻断”，意指基本上没有可检测到的多肽或多核苷酸的活性和/或表达。
在活动性分枝杆菌感染过程中，或在分枝杆菌由潜伏状态再激活的过程中/之后，在体内可以诱导或下调潜伏期-抑制的或潜伏期-下调的多肽和多核苷酸的表达或活性。潜伏期-抑制的和潜伏期-下调的分枝杆菌多肽和多核苷酸可能在疾病的活动期过程中发展针对复制的杆菌的有效免疫应答中起早期作用，并且因此代表用于预防疾病的建立、扩散和再激活的良好的疫苗候选物和良好的治疗靶标。
与不是营养不足的培养条件相比较，在营养-不足的培养条件下可以调节(如诱导、上调、抑制或下调)潜伏期-调节多肽或多核苷酸的表达或活性。在营养不足的培养条件下，初始能源(primary energy source)(例如碳)的浓度不足以支持分枝杆菌的指数生长，结果分枝杆菌在代谢上受到胁迫并且进入潜伏状态。
与不是限氧的培养条件相比较，在限氧(低溶解氧张力)条件下，可以备选地(或另外地)调节(如诱导、上调、抑制或下调)潜伏期-调节多肽或多核苷酸的表达或活性。
在一个实施方案中，第一分枝杆菌抗原包含与选自SEQ ID NOs：1，3，5，7和56的潜伏期-调节多肽的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性(如至少75，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，99或100％的氨基酸序列同一性)的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段。
在一个实施方案中，第一分枝杆菌抗原由与选自SEQ ID NOs：1，3，5，7和56的潜伏期-调节多肽的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性(如至少75，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，99或100％的氨基酸序列同一性)的多肽序列组成，或由具有其至少7个连续氨基酸的其片段组成。
因此，在一个实施方案中，第一分枝杆菌抗原是如上文定义的‘第一分枝杆菌多肽’(或片段)。
在一个实施方案中，所述第一分枝杆菌抗原多肽包含(或由下述组成)与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段。
SEQ ID NOs：1，3，5，7和56在下表1中定义：
表1
SEQ ID NO： 多肽名称
1 Rv0111
3 Rv1806
5 Rv0198
7 Rv3812
56 Rv1807
因此，在本申请的上下文中，“Rv0111多肽抗原”包含SEQ ID NO：1(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)或由SEQ ID NO：1(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)组成；“Rv1806多肽抗原”包含SEQ ID NO：3(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)或由SEQ IDNO：3(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)组成；“Rv0198多肽抗原”包含SEQ ID NO：5(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)或由SEQ ID NO：5(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)组成；“Rv3812多肽抗原”包含SEQ ID NO：7(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)或由SEQ ID NO：7(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)组成；并且，“RV1807多肽抗原”包含SEQ ID NO：56(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)或由SEQ ID NO：56(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)组成。
在一个实施方案中，氨基酸序列同一性存在于长度为至少7个连续的氨基酸残基(例如，长度为至少10，15，25，50，75，100，150，200，250，300，350，400，450，500，550，600或650个连续的氨基酸残基)的多肽序列的区域。
用于确定氨基酸序列同一性的常规方法在本说明书下文中更详细地讨论。
在第一分枝杆菌抗原的情形中，多肽的片段包含(或由下述组成)所述多肽的至少7个连续的氨基酸残基(例如，所述多肽的至少10，15，25，50，75，100，125，150，175，200，225，250，275，300，325，350，375，400，425，450，475，500，525，550，575，600，625，650或675个连续的氨基酸残基)。
在一个实施方案中，多肽的片段具有的序列长度是全长多肽的序列长度的至少5％，10％，25％，50％，60％，70％，80％，或90％。
多肽的片段可以包含所述多肽的至少一个表位。
在一个实施方案中，在第一分枝杆菌抗原的情形中，多肽的片段包含(或由下述组成)所述多肽的截短形式。例如，多肽的片段可以具有N-端截短(与所述多肽比较)，或多肽的片段可以具有C-端截短(与所述多肽比较)。
在一个实施方案中，在第一分枝杆菌抗原的情形中，多肽的片段包含(或由下述组成)所述多肽的成熟形式。例如，多肽可以包含信号序列(即，分泌/靶向序列)(例如，在N-端)，并且多肽的片段可以缺少这一信号序列。在一个实施方案中，片段可以通过从所述多肽切割信号序列而形成。
在一个实施方案中，多肽SEQ ID NO：1的片段是SEQ ID NO：1的N-端截短形式。在一个实施方案中，与SEQ ID NO：1的氨基酸序列相比较，多肽SEQ ID NO：1的片段具有至少50，100，150，200，250，300，或350个氨基酸残基的N-端截短。在一个实施方案中，SEQ ID NO：1的片段至少包含SEQ ID NO：1的C-端50，100，150，200，250或300个氨基酸的序列。
在一个实施方案中，多肽SEQ ID NO：7的片段是SEQ ID NO：7的N-端截短形式。在一个实施方案中，SEQ ID NO：7的片段是成熟的多肽序列，其与SEQ ID NO：7的序列的不同在于去除了N-端信号序列。在一个实施方案中，与SEQ ID NO：7的氨基酸序列相比较，多肽SEQ ID NO：7的片段具有至少5，10，15，20，25，30，35或40个氨基酸残基的N-端截短。在一个实施方案中，SEQ ID NO：7的片段至少包含SEQ ID NO：7的C-端50，100，150，200，250，300，350，400或450个氨基酸的序列。
在一个实施方案中，第一分枝杆菌抗原包含与选自SEQ ID NOs：1，3，5，7和56的潜伏期-调节多肽具有共同的抗原交叉反应性和/或基本上相同的体内生物活性的多肽或其片段。
当用于此处时，‘共同的抗原交叉反应性’意指第一分枝杆菌多肽或片段与选自SEQ ID NOs：1，3，5，7和56的潜伏期-调节多肽共有共同的诱导先前暴露于分枝杆菌感染的抗原成分的免疫细胞如T-淋巴细胞(例如，CD4+，CD8+，效应T细胞或记忆T细胞如TEM或TCM)的“回忆应答”的能力。
在最近的10年间已经建立了用于测量和定量免疫细胞应答(例如，T细胞应答)的新的免疫学测定法。例如，干扰素-γ(IFN-γ)ELISPOT测定法可用作免疫学读取，原因在于抗原-特异性免疫细胞如T细胞的IFN-γ分泌与针对结核分枝杆菌的保护良好相关。此外，ELISPOT测定法是一种定量分泌IFN-γ的抗原-特异性免疫细胞如T细胞的数目的非常可重现和灵敏的方法。
备选地，或另外，‘共同的抗原交叉反应性’意指能够结合第一分枝杆菌多肽或片段的抗体也能够结合潜伏期-调节多肽。
在一个实施方案中，第一分枝杆菌抗原包含编码如上述定义的第一分枝杆菌多肽的多核苷酸序列，或由编码如上述定义的第一分枝杆菌多肽的多核苷酸序列组成。
因此，在一个实施方案中，第一分枝杆菌抗原包含(或由下述组成)编码这样的多肽的多核苷酸序列，所述多肽包含(或由下述组成)与选自SEQ ID NOs：1，3，5，7和56的潜伏期-调节多肽的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性(如至少75，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，99或100％的氨基酸序列同一性)的氨基酸序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段(例如，如上述定义)。
在一个实施方案中，第一分枝杆菌抗原包含与选自SEQ ID NOs：2，4，6，8和57的潜伏期-调节多核苷酸的核酸序列具有至少70％的核苷酸序列同一性(如至少75，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，99或100％的核苷酸序列同一性)的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段。
在一个实施方案中，第一分枝杆菌抗原由下述组成：与选自SEQ IDNOs：2，4，6，8和57的潜伏期-调节多核苷酸的核酸序列具有至少70％的核苷酸序列同一性(如至少75，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，99或100％的核苷酸序列同一性)的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段。
因此，在一个实施方案中，第一分枝杆菌抗原是如上述定义的‘第一分枝杆菌多核苷酸’(或片段)。
在一个实施方案中，所述第一分枝杆菌多核苷酸包含(或由下述组成)如上述定义的编码本发明的第一分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列。在一个实施方案中，所述第一分枝杆菌多核苷酸包含(或由下述组成)与SEQID NO：2的核酸序列具有至少70％的核苷酸序列同一性的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段。
SEQ ID NOs：2，4，6，8和57在下表2中定义：
表2
SEQ ID NO： 多核苷酸名称
2 Rv0111
4 Rv1806
6 Rv0198
8 Rv3812
57 Rv1807
因此，在本申请的上下文中，“Rv0111多核苷酸抗原”包含SEQ IDNO：2(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)或由SEQ ID NO：2(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)组成；“Rv1806多核苷酸抗原”包含SEQ ID NO：4(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)或由SEQ ID NO：4(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)组成；“Rv0198多核苷酸抗原”包含SEQ ID NO：6(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)或由SEQ ID NO：6(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)组成；“Rv3812多核苷酸抗原”包含SEQ ID NO：8(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)或由SEQ ID NO：8(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)组成；并且“Rv1807多核苷酸抗原”包含SEQ ID NO：57(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)或由SEQ IDNO：57(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)组成。
在一个实施方案中，核苷酸序列同一性存在于长度为至少21个连续的核苷酸残基(例如，长度为至少25，50，75，100，150，200，250，300，350，400，450，500，550，600，650，700，750，800，850，900或1000个连续的核苷酸残基)的多核苷酸序列的区域。
用于确定核苷酸序列同一性的常规方法在本说明书下文中更详细地讨论。
在第一分枝杆菌抗原的情形中，所述多核苷酸的片段包含(或由下述组成)所述多核苷酸的至少21个连续的核苷酸残基(例如，所述多核苷酸的至少25，50，75，100，125，150，200，250，300，350，400，450，500，550，600，650，700，750，800，850，900，950，1000，1050，1100，1150，1200，1250，1300，1350，1400，1450，1500，1550，1600，1650，1700，1750，1800，1850，1900，1950或2000个连续的核苷酸残基)。
在一个实施方案中，多核苷酸片段的序列长度是所述多核苷酸的序列长度的至少5％，10％，25％，50％，60％，70％，80％，或90％。
在一个实施方案中，在第一分枝杆菌抗原的情形中，多核苷酸的片段包含(或由下述组成)所述多核苷酸的截短形式。在一个实施方案中，与全长多核苷酸序列相比较，多核苷酸的片段在5’端和/或3’端截短。在一个实施方案中，多核苷酸的片段编码所述多肽的截短形式。例如，多核苷酸的片段可以编码在N-端截短的多肽和/或C-端截短的多肽(与由全长多核苷酸编码的多肽相比较)。
在一个实施方案中，在第一分枝杆菌抗原的情形中，多核苷酸的片段编码包含(或由下述组成)成熟多肽的多肽。例如，全长多肽包含信号序列(即，分泌/靶向序列)(例如，在N-端)，并且多核苷酸片段编码缺少该信号序列的成熟多肽。
在一个实施方案中，多核苷酸SEQ ID NO：2的片段是SEQ ID NO：2的5’截短形式。在一个实施方案中，与SEQ ID NO：2的核苷酸序列相比较，多核苷酸SEQ ID NO：2的片段具有至少100，200，300，400，500，600，700，800，900或1000个核苷酸残基的5’截短。在一个实施方案中，多核苷酸SEQ ID NO：2的片段编码SEQ ID NO：1的N-端截短形式。在一个实施方案中，多核苷酸SEQ ID NO：2的片段编码与SEQ ID NO：1的氨基酸序列相比较具有至少50，100，150，200，250，300，或350个氨基酸残基的N-端截短的多肽。在一个实施方案中，与SEQ ID NO：2的核苷酸序列相比较，SEQ ID NO：2的片段包含3’端100，200，300，400，500，600，700，800或900个核苷酸残基。在一个实施方案中，多核苷酸SEQ ID NO：2的片段编码至少包含SEQ ID NO：1的C端50，100，150，200，250或300个氨基酸序列的多肽。
在一个实施方案中，多核苷酸SEQ ID NO：8的片段是SEQ ID NO：8的5’截短形式。在一个实施方案中，与SEQ ID NO：8的核苷酸序列相比较，多核苷酸SEQ ID NO：8的片段具有至少25，50，75，100或125个核苷酸残基的5’截短。在一个实施方案中，多核苷酸SEQ ID NO：8的片段编码SEQ ID NO：7的N-端截短形式。在一个实施方案中，多核苷酸SEQID NO：8的片段编码成熟多肽序列，所述成熟多肽序列与SEQ ID NO：7的序列不同在于去除了N-端信号序列。在一个实施方案中，多核苷酸SEQ ID NO：8的片段编码与SEQ ID NO：7的氨基酸序列相比较具有至少5，10，15，20，25，30，35或40个氨基酸残基的N-端截短的多肽。在一个实施方案中，与SEQ ID NO：8的核苷酸序列相比较，SEQ ID NO：8的片段包含3’端150，300，450，600，750，900，1050，1200或1350个核苷酸残基。在一个实施方案中，SEQ ID NO：8的片段编码至少包含SEQ ID NO：7的C端50，100，150，200，250，300，350，400或450个氨基酸序列的多肽。
在一个实施方案中，所述第一分枝杆菌多核苷酸，或其片段，编码与选自SEQ ID NOs：1，3，5，7和56的潜伏期-调节多肽具有共同的抗原交叉反应性和/或基本上相同的体内生物活性的多肽。
例如，所述第一分枝杆菌抗原可以包含(或由下述组成)编码能够引发针对分枝杆菌感染的保护性免疫细胞应答(例如，T细胞应答)的多肽序列的多核苷酸序列。
例如，由第一分枝杆菌多核苷酸或其片段表达的多肽与潜伏期-调节多肽共有共同的诱导先前暴露于分枝杆菌感染的抗原成分的免疫细胞如T-淋巴细胞(例如，CD4+，CD8+，效应T细胞或记忆T细胞如TEM或TCM)的“回忆应答”的能力。在这一点上，抗原-特异性免疫细胞如T细胞的IFN-γ分泌与针对结核分枝杆菌的保护良好相关。因此，干扰素-γ(IFN-γ)ELISPOT测定法可用作免疫学读取，并且能够可重现的且灵敏的定量分泌IFN-γ的抗原-特异性免疫细胞如T细胞。
备选地，或另外，能够结合由第一分枝杆菌多核苷酸或其片段编码的多肽的抗体也能够结合潜伏期-调节多肽。
本发明的抗原组合物除第一分枝杆菌抗原外包含至少第二分枝杆菌抗原。
在一个实施方案中，第二分枝杆菌抗原能够引发针对分枝杆菌感染的保护性免疫应答(例如，T细胞应答)。
在一个实施方案中，第二分枝杆菌抗原包含(例如，由下述组成)多肽序列。在一个实施方案中，第二分枝杆菌抗原包含(例如，由下述组成)多核苷酸序列，如DNA或RNA序列。
在一个实施方案中，第二分枝杆菌抗原包含(例如，由下述组成)分枝杆菌糖脂，如分枝杆菌磺基糖脂。
在一个实施方案中，第二分枝杆菌抗原包含(例如，由下述组成)分枝杆菌碳水化合物抗原，如分枝杆菌糖或多糖。任选地，糖可以连接到(例如，化学缀合到)载体(例如，多肽)上，从而增强免疫原性。
第二分枝杆菌抗原与第一分枝杆菌抗原不同。
在一个实施方案中，第二分枝杆菌抗原与第一分枝杆菌抗原之间的‘不同’由针对所述第一和第二分枝杆菌抗原的免疫应答的特异性限定。例如，在一个实施方案中，第二和第二抗原的每一个诱导基本上对所述抗原特异性的免疫应答。
第二分枝杆菌抗原与第一分枝杆菌抗原之间的‘不同’可以关于在所述第一和第二分枝杆菌抗原之间基本上缺少(例如，不存在)共同的抗原交叉反应性而限定。
第二分枝杆菌抗原与第一分枝杆菌抗原之间的‘不同’可以备选地(或另外)定义为在所述第一和第二分枝杆菌抗原之间基本上缺少(例如，不存在)共同的体内生物活性。
例如，在一个实施方案中，第一和第二分枝杆菌抗原可以表现出(基本上)不共同的抗原交叉反应性。在一个实施方案中，第一和第二分枝杆菌抗原可以表现出(基本上)不共同的体内生物活性。例如，第一和第二分枝杆菌抗原诱导不同的免疫应答和/或具有不同的体内生物活性。
在一个实施方案中，第一和第二分枝杆菌抗原包含多肽(如本文定义)，第二分枝杆菌抗原具有与第一分枝杆菌抗原基本上不共同的抗原交叉反应性和/或具有与第一分枝杆菌抗原基本上不同的体内生物活性。
在一个实施方案中，第一和第二分枝杆菌抗原包含多核苷酸(如本文定义)，第二分枝杆菌抗原编码具有与由第一分枝杆菌抗原编码的多肽基本上不共同的抗原交叉反应性的多肽。
在一个实施方案中，第一和第二分枝杆菌抗原包含多核苷酸(如本文定义)，第二分枝杆菌抗原具有与第一分枝杆菌抗原基本上不同的体内生物活性和/或编码具有与由第一分枝杆菌抗原编码的多肽基本上不同的体内生物活性的多肽。
在一个实施方案中，第一分枝杆菌抗原包含多肽并且第二分枝杆菌抗原包含多核苷酸(如本文定义)，并且由此编码的第二分枝杆菌抗原或多肽具有与第一分枝杆菌抗原基本上不共同的抗原交叉反应性和/或具有与第一分枝杆菌抗原基本上不同的体内生物活性。
在一个实施方案中，第一分枝杆菌抗原包含多核苷酸并且第二分枝杆菌抗原包含多肽(如本文定义)，并且第二分枝杆菌抗原具有与由此编码的第一分枝杆菌抗原或多肽基本上不共同的抗原交叉反应性，和/或具有与由此编码的第一分枝杆菌抗原或多肽基本上不同的体内生物活性。
例如，在一个实施方案中，第一和第二分枝杆菌抗原(或由此编码的多肽)不共有共同的诱导先前暴露于分枝杆菌感染的抗原成分的免疫细胞如T-淋巴细胞(例如，CD4+，CD8+，效应T细胞或记忆T细胞如TEM或TCM)的“回忆应答”的能力。
换言之，在一个实施方案中，第一和第二分枝杆菌抗原(或由此编码的多肽)是‘不同的’，原因在于它们在不同的免疫细胞(例如，不同的T细胞)中诱导回忆应答。
在一个实施方案中，第一和第二分枝杆菌抗原由在不同培养条件和/或感染状态下的分枝杆菌表达。本申请人已经鉴定了包含代表不同的分枝杆菌感染状态的本发明的第一和第二抗原的抗原组合物有利地引发针对分枝杆菌感染的不同阶段的免疫应答，由此针对分枝杆菌疾病的多个阶段进行保护。这是特别有利的，因为分枝杆菌感染以不同的急性期、潜伏期的和再激活期发生。
因此，在一个实施方案中，第一分枝杆菌抗原的表达或活性在分枝杆菌潜伏性条件下被上调，而第二分枝杆菌抗原的表达或活性在活动性分枝杆菌感染过程中或由潜伏状态再激活时被上调(和/或在分枝杆菌潜伏条件性下被下调)。
在备选的实施方案中，第一分枝杆菌抗原的表达或活性在分枝杆菌潜伏性条件下被下调，而第二分枝杆菌抗原的表达或活性在活动性分枝杆菌感染过程中或由潜伏状态再激活时被下调(和/或在分枝杆菌潜伏条件性下被上调)。
第二分枝杆菌抗原可以包含多肽序列。例如，第二分枝杆菌抗原可以包含多肽或由多肽组成。
在一个实施方案中，第二分枝杆菌多肽包含(或由下述组成)抗原分枝杆菌多肽-即，能够引发针对分枝杆菌感染的保护性T细胞应答的分枝杆菌多肽。
因此，在一个实施方案中，第二分枝杆菌抗原是‘第二分枝杆菌多肽’(或片段)。
在一个实施方案中，第二分枝杆菌抗原包含选自与上述关于第一分枝杆菌抗原讨论的相同组的多肽的多肽(只要第二分枝杆菌多肽与第一分枝杆菌多肽不同即可，如上述所讨论的)。
因此，在一个实施方案中，第二分枝杆菌抗原包含(或由下述组成)与选自SEQ ID NOs：1，3，5，7和56的潜伏期-调节多肽的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性(诸如至少75，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，99或100％的氨基酸序列同一性)的多肽序列，或其具有其至少7个连续的氨基酸(诸如其至少10，15，25，50，75，100，125，150，175，200，225，250，275，300，325，350，375，400，425，450，475，500，525，550，575，600，625，650或675个连续的氨基酸残基)的片段。
在一个实施方案中，第二分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或其具有其至少7个连续的氨基酸残基的片段。
在一个实施方案中，上述关于第一分枝杆菌多肽所讨论的限制同等适用于第二分枝杆菌多肽的这一实施方案。
在一个实施方案中，第二分枝杆菌抗原包含不是选自与上述关于第一分枝杆菌抗原讨论的相同组的多肽的多肽。
例如，在一个实施方案中，第二分枝杆菌抗原包含与选自SEQ ID NOs：9-20和34-44的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性(诸如至少75，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，99或100％的氨基酸序列同一性)的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段。
在一个实施方案中，第二分枝杆菌抗原由下述组成：与选自SEQ IDNOs：9-20和34-44的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性(诸如至少75，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，99或100％的氨基酸序列同一性)的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段。
SEQ ID NOs：9-20和34-44显示在下表3中：
表3
SEQ ID NO： 多肽名称：
9 Ag85A/Rv3804c
10 Ag85B/Rv1886c
11 ESAT-6/Rv3875
12 TB10.4/Rv0288
13 Rv0125
14 PPE18/Rv1196
15 P27/Rv1411c
16 Hsp65/Rv0440
17 HBHA/Rv0475
18 Rv2659c
19 Rv2660c
20 HspX/Rv2031c
34 RPFA/Rv0867c
35 RPFB/Rv1009
36 RPFC/Rv1884c
37 RPFD/Rv2389c
38 RPFE/Rv2450c
39 Rv1733
40 Rv2029c
41 Rv2032
42 Rv2626c
43 Rv2627c
44 Rv2628
本申请由SEQ ID NO：9所示的多肽“Ag85A”(登记号CAA17868和BX842584)是蛋白家族(“Ag85复合物”)的一员，该蛋白家族还包括Ag85B(本申请的SEQ ID NO：10)和Ag85C。该蛋白家族由结核分枝杆菌，BCG，和多种其他分枝杆菌物种分泌。Ag85A在所有分枝杆菌物种之间是高度保守的并且在动物和人类研究中是免疫显著性的(immunodominant)。
由SEQ ID NOs：20和39-44所示的多肽包含在DosR调节子(还称为DevR调节子)中，所述调节子包括由Rv2623-2631和Rv3126-3134所示的多肽。这些多肽的表达通过DosR(DevR)调节。
由SEQ ID NOs：34-38所示的多肽是多肽RPF家族的成员(分别为RPFA，RPFB，RPFC，RPFD和RPFE)。
在一个实施方案中，氨基酸序列同一性存在于长度为至少7个连续的氨基酸残基(例如，长度为至少10，15，25，50，75，100，125，150，175，200，225，250，275，300，325，350，375，400，425，450，475，500或525个连续的氨基酸残基)的多肽序列的区域。
用于确定氨基酸序列同一性的常规方法在本说明书下文中更详细地讨论。
在一个实施方案中，在第二分枝杆菌抗原的情形中，所述多肽的片段包含所述多肽序列的至少7个连续的氨基酸残基。在一个实施方案中，所述片段包含(或由下述组成)所述多肽序列的至少10，15，25，50，75，100，125，150，175，200，225，250，275，300，325，350，375，400，425，450，475，500或525个连续的氨基酸残基。
在一个实施方案中，多肽的片段是所述分枝杆菌多肽长度的至少5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，或90％。
多肽的片段可以包含所述多肽的至少一个表位。
在一个实施方案中，在第二分枝杆菌抗原的情形中，多肽的片段包含(或由下述组成)所述多肽的截短形式。例如，多肽的片段可以具有N-端截短(与所述多肽比较)，或多肽的片段可以具有C-端截短(与所述多肽比较)。
在一个实施方案中，在第二分枝杆菌抗原的情形中，多肽的片段包含(或由下述组成)所述多肽的成熟形式。例如，多肽可以包含信号序列(即，分泌/靶向序列)(例如，在N-端)，并且多肽的片段可以缺少这一信号序列。在一个实施方案中，片段可以通过从所述多肽切割信号序列而形成。
在一个实施方案中，多肽SEQ ID NO：9的片段是SEQ ID NO：9的N-端截短形式。在一个实施方案中，SEQ ID NO：9的片段是成熟的多肽序列，其与SEQ ID NO：9的序列的不同在于去除了N-端信号序列。在一个实施方案中，与SEQ ID NO：9的氨基酸序列相比较，多肽SEQ ID NO：9的片段具有至少10，20，30或40个氨基酸残基的N-端截短。在一个实施方案中，SEQ ID NO：9的片段包含至少SEQ ID NO：9的C-端50，100，150，200或250个氨基酸序列。
在一个实施方案中，第二分枝杆菌多肽或其片段与选自SEQ ID NOs：9-20和34-44的多肽具有共同的抗原交叉反应性和/或基本上相同的体内生物活性。
在一个实施方案中，‘共同的抗原交叉反应性’意指第二分枝杆菌多肽或片段与选自SEQ ID NOs：9-20和34-44的多肽共有共同的诱导先前暴露于分枝杆菌感染的抗原成分的免疫细胞如T-淋巴细胞的“回忆应答”的能力。例如，干扰素-γ(IFN-γ)ELISPOT测定法可用作免疫学读取，原因在于抗原-特异性免疫细胞如T细胞的IFN-γ分泌与针对结核分枝杆菌的保护良好相关。此外，ELISPOT测定法是一种定量分泌IFN-γ的抗原-特异性免疫细胞如T细胞的数目的非常可重现和灵敏的方法。
备选地，或另外，‘共同的抗原交叉反应性’意指能够结合第二分枝杆菌多肽或片段的抗体也能够结合选自SEQ ID NOs：9-20和34-44的多肽。
第二分枝杆菌抗原可以包含多核苷酸序列。例如，第二分枝杆菌抗原可以包含多核苷酸或由多核苷酸组成。
在一个实施方案中，第二分枝杆菌多核苷酸包含(或由下述组成)抗原分枝杆菌多核苷酸-即，能够引发针对分枝杆菌感染的保护性免疫细胞应答(例如，T细胞应答)的多核苷酸。在一个实施方案中，第二分枝杆菌多核苷酸编码抗原分枝杆菌多肽-即，能够引发针对分枝杆菌感染的保护性免疫细胞应答(例如，T细胞应答)的分枝杆菌多肽。
因此，在一个实施方案中，第二分枝杆菌抗原是如上述定义的‘第二分枝杆菌多核苷酸’(或片段)。
在一个实施方案中，第二分枝杆菌抗原包含选自与上述关于第一分枝杆菌抗原讨论的相同组的多核苷酸的多核苷酸(只要第二分枝杆菌多核苷酸与第一分枝杆菌多核苷酸不同即可)。
因此，在一个实施方案中，第二分枝杆菌抗原包含(或由下述组成)编码选自与上述关于第一分枝杆菌抗原讨论的相同组的多肽的多核苷酸序列(只要第二分枝杆菌多核苷酸不同于第一分枝杆菌多核苷酸，并且由第二分枝杆菌多核苷酸编码的多肽不同于由第一分枝杆菌多核苷酸编码的多肽即可)。
因此，所述第二分枝杆菌多核苷酸包含编码如上文定义的本发明的第二分枝杆菌多肽的多核苷酸序列。
在一个实施方案中，所述编码的第二分枝杆菌多肽包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段。
在一个实施方案中，第二分枝杆菌抗原包含(或由下述组成)与选自SEQ ID NOs：2，4，6，8和57的潜伏期-调节的多核苷酸的核酸序列具有至少70％的核苷酸序列同一性(诸如至少75，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，99或100％的核苷酸序列同一性)的多核苷酸序列，或其具有其至少21个连续的核苷酸(诸如其至少25，50，75，100，125，150，200，250，300，350，400，450，500，550，600，650，700，750，800，850，900，950，1000，1050，1100，1150，1200，1250，1300，1350，1400，1450，1500，1550，1600，1650，1700，1750，1800，1850，1900，1950或2000个连续的氨基酸残基)的片段。
在一个实施方案中，第二分枝杆菌多肽包含(或由下述组成)与SEQID NO：6的核酸序列具有至少70％的核苷酸序列同一性的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段。
在一个实施方案中，上述关于第一分枝杆菌多肽所讨论的限制同等适用于第二分枝杆菌多肽的这一实施方案。
在一个实施方案中，第二分枝杆菌抗原包含不是选自与上述关于第一分枝杆菌抗原讨论的相同组的多核苷酸的多核苷酸。
在一个实施方案中，第二分枝杆菌抗原包含编码不是选自上述关于第一分枝杆菌抗原讨论的相同组的多肽的多肽的多核苷酸。
在一个实施方案中，第二分枝杆菌抗原包含编码如上文定义的第二分枝杆菌多肽的多核苷酸序列。
因此，在一个实施方案中，第二分枝杆菌抗原包含(或由下述组成)多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列编码这样的多肽，所述多肽包含(或由下述组成)与选自SEQ ID NOs：9-20和34-44的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性(如至少75，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，99或100％的氨基酸序列同一性)的氨基酸序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段。
在一个实施方案中，第二分枝杆菌抗原包含(或由下述组成)与选自SEQ ID NOs：21-32和45-55的核酸序列具有至少70％的核苷酸序列同一性(诸如至少75，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，99或100％的核苷酸序列同一性)的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段。
SEQ ID NOs：21-32和45-55显示在下表4中：
表4
SEQ ID NO： 多核苷酸名称：
21 Ag85A/Rv3804c
22 Ag85B/Rv1886c
23 ESAT-6/Rv3875
24 TB10.4/Rv0288
25 Rv0125
26 PPE18/Rv1196
27 P27/Rv1411c
28 Hsp65/Rv0440
29 HBHA/Rv0475
30 Rv2659c
31 Rv2660c
32 HspX/Rv2031c
45 RPFA/Rv0867c
46 RPFB/Rv1009
47 RPFC/Rv1884c
48 RPFD/Rv2389c
49 RPFE/Rv2450c
50 Rv1733
51 Rv2029c
52 Rv2032
53 Rv2626c
54 Rv2627c
55 Rv2628
本申请由SEQ ID NO：21所示的多核苷酸“Ag85A”(登记号CAA17868和BX842584)是基因家族(“Ag85复合物”)的一员，所述基因家族还包括Ag85B(本申请的SEQ ID NO：22)和Ag85C。该家族的基因编码由结核分枝杆菌，BCG，和多种其他分枝杆菌物种分泌的蛋白。Ag85A在所有分枝杆菌物种之间是高度保守的并且在动物和人类研究中是免疫显著性的。
由SEQ ID NOs：32和50-55所示的多核苷酸包含在DosR调节子(还称为DevR调节子)中，所述调节子包括由Rv2623-2631和Rv3126-3134所示的多核苷酸。这些多核苷酸的表达通过DosR(DevR)调节。
由SEQ ID NOs：45-49所示的多核苷酸是多核苷酸RPF家族的成员(分别为RPFA，RPFB，RPFC，RPFD和RPFE)。
在一个实施方案中，核苷酸序列同一性存在于长度为至少21个连续的核苷酸残基(例如，长度为至少25，50，75，100，125，150，200，250，300，350，400，450，500，550，600，650，700，750，800，850，900，950，1000，1050，1100，1150，1200，1250，1300，1350，1400，1450，1500，1550或1600个连续的核苷酸残基)的多核苷酸序列的区域。
用于确定核苷酸序列同一性的常规方法在本说明书下文中更详细地讨论。
在一个实施方案中，在第二分枝杆菌抗原的情形中，多核苷酸的片段包含所述多核苷酸序列的至少21个连续的核苷酸残基。在一个实施方案中，所述片段包含(或由下述组成)所述多核苷酸序列的至少25，50，75，100，125，150，200，250，300，350，400，450，500，550，600，650，700，750，800，850，900，950，1000，1050，1100，1150，1200，1250，1300，1350，1400，1450，1500，1550或1600个连续的核苷酸残基。
在一个实施方案中，所述多核苷酸的片段是所述多核苷酸长度的至少5％，10％，20％，30％，40％，50％，60％，70％，80％，或90％。
在一个实施方案中，在第二分枝杆菌抗原的情形中，多核苷酸的片段包含(或由下述组成)所述多核苷酸的截短形式。例如，与所述多核苷酸相比较，多核苷酸的片段可以具有5’截短和/或3’截短。在一个实施方案中，在第二分枝杆菌抗原的情形中，多核苷酸的片段编码与由全长多核苷酸编码的多肽相比较是截短的多肽。例如，所述多核苷酸片段可以编码与由全长多核苷酸编码的多肽相比较在N端被截短和/或在C端被截短的多肽。
在一个实施方案中，在第二分枝杆菌抗原的情形中，多核苷酸的片段编码成熟多肽。例如，所述多肽可以包含信号序列(即，分泌/靶向序列)(例如，在N-端)，并且所述多核苷酸片段可以编码缺少这一信号序列的多肽片段。
在一个实施方案中，多核苷酸SEQ ID NO：21的片段是SEQ ID NO：21的5’截短形式。在一个实施方案中，与SEQ ID NO：21的核苷酸序列相比较，多核苷酸SEQ ID NO：21的片段具有至少25，50，75，100或125个核苷酸残基的N-端截短。在一个实施方案中，多核苷酸SEQ ID NO：21的片段至少包含SEQ ID NO：21的C-端150，300，450，600，750或850个核苷酸残基。在一个实施方案中，多核苷酸SEQ ID NO：21的片段编码SEQ ID NO：9的N-端截短形式。在一个实施方案中，多核苷酸SEQ IDNO：21的片段编码成熟的多肽序列，所述成熟的多肽序列与SEQ ID NO：9的序列不同在于去除了N-端信号序列。在一个实施方案中，多核苷酸SEQ ID NO：21的片段编码SEQ ID NO：9的多肽片段，所述多肽片段与SEQ ID NO：9的氨基酸序列相比较具有至少10，20，30或40个氨基酸残基的N-端截短。在一个实施方案中，多核苷酸SEQ ID NO：21的片段编码SEQ ID NO：9的多肽片段，所述多肽片段至少包含SEQ ID NO：9的C-端50，100，150，200，250或275个氨基酸残基。
在一个实施方案中，由第二分枝杆菌多核苷酸或片段编码的多肽与选自SEQ ID NOs：9-20和34-44的多肽具有共同的抗原交叉反应性和/或基本上相同的体内生物活性。
例如，由第二分枝杆菌多核苷酸或片段编码的多肽与选自SEQ IDNOs：9-20和34-44的多肽共有共同的诱导先前暴露于分枝杆菌感染的抗原成分的免疫细胞如T-淋巴细胞的“回忆应答”的能力。例如，干扰素-γ(IFN-γ)ELISPOT测定法可用作免疫学读取，原因在于抗原-特异性免疫细胞如T细胞的IFN-γ分泌与针对结核分枝杆菌的保护良好相关。此外，ELISPOT测定法是一种定量分泌IFN-γ的抗原-特异性免疫细胞如T细胞的数目的非常可重现和灵敏的方法。
备选地，或另外，能够结合由第二分枝杆菌多核苷酸或片段编码的多肽的抗体也能够结合选自SEQ ID NOs：9-20和34-44的多肽。
在一个实施方案中，所述抗原组合物包含Rv0111抗原(抗原多肽或多核苷酸)和Rv0198抗原(抗原多肽或多核苷酸)二者。
在一个实施方案中，所述抗原组合物包含：
(i)第一分枝杆菌抗原多肽，其中所述第一分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；或
(ii)第一分枝杆菌多核苷酸，其中所述第一分枝杆菌多核苷酸包含编码所述第一分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列；
并且还包含：
(iii)第二分枝杆菌抗原多肽，其中所述第二分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；或
(iv)第二分枝杆菌多核苷酸，其中所述第二分枝杆菌多核苷酸包含编码所述第二分枝杆菌多肽的多核苷酸序列。
例如，Rv0111/Rv0198抗原组合物可以包含：
(i)第一分枝杆菌抗原多肽，其中所述第一分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；和
(ii)第二分枝杆菌抗原多肽，其中所述第二分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段。
备选地，Rv0111/Rv0198抗原组合物可以包含：
(i)第一分枝杆菌多核苷酸，其中所述第一分枝杆菌多核苷酸包含编码第一分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列，其中所述第一分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；和
(ii)第二分枝杆菌多核苷酸，其中所述第二分枝杆菌多核苷酸包含编码第二分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列，其中所述第二分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段。
备选地，Rv0111/Rv0198抗原组合物可以包含：
(i)第一分枝杆菌抗原多肽，其中所述第一分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；和
(ii)第二分枝杆菌多核苷酸，其中所述第二分枝杆菌多核苷酸包含编码第二分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列，其中所述第二分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段。
备选地，Rv0111/Rv0198抗原组合物可以包含：
(i)第一分枝杆菌多核苷酸，其中所述第一分枝杆菌多核苷酸包含编码第一分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列，其中所述第一分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；和
(ii)第二分枝杆菌抗原多肽，其中所述第二分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段。
按照这一实施方案，在本发明的Rv0111/Rv0198抗原组合物中，所述第一分枝杆菌多核苷酸可以包含(或由下述组成)与SEQ ID NO：2的核酸序列具有至少70％的核苷酸序列同一性的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段。
按照这一实施方案，在本发明的Rv0111/Rv0198抗原组合物中，所述第二分枝杆菌多核苷酸可以包含(或由下述组成)与SEQ ID NO：6的核酸序列具有至少70％的核苷酸序列同一性的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段。
在一个实施方案中，所述抗原组合物不包含Rv1806抗原和Rv1807抗原二者。
因此，在一个实施方案中，如果第一分枝杆菌抗原是Rv1806多肽抗原，则第二分枝杆菌抗原不是Rv1807多肽抗原。在一个实施方案中，如果第一分枝杆菌抗原是Rv1806多核苷酸抗原，则第二分枝杆菌抗原不是Rv1807多核苷酸抗原。在一个实施方案中，如果第一分枝杆菌抗原是Rv1806多肽抗原，则第二分枝杆菌抗原不是Rv1807多核苷酸抗原。在一个实施方案中，如果第一分枝杆菌抗原是Rv1806多核苷酸抗原，则第二分枝杆菌抗原不是Rv1807多肽抗原。
在一个实施方案中，如果第一分枝杆菌抗原是Rv1807多肽抗原，则第二分枝杆菌抗原不是Rv1806多肽抗原。在一个实施方案中，如果第一分枝杆菌抗原是Rv1807多核苷酸抗原，则第二分枝杆菌抗原不是Rv1806多核苷酸抗原。在一个实施方案中，如果第一分枝杆菌抗原是Rv1807多肽抗原，则第二分枝杆菌抗原不是Rv1806多核苷酸抗原。在一个实施方案中，如果第一分枝杆菌抗原是Rv1807多核苷酸抗原，则第二分枝杆菌抗原不是Rv1806多核苷酸抗原。
在一个实施方案中，如果第一分枝杆菌抗原包含：
(i)与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；
则第二分枝杆菌抗原不包含：
(ii)与SEQ ID NO：56的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段。
在一个实施方案中，如果第一分枝杆菌抗原包含：
(i)编码与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列、或具有其至少7个连续氨基酸的其片段的多核苷酸序列；或与SEQ ID NO：4的核酸序列具有至少70％的核苷酸序列同一性的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段；
则第二分枝杆菌抗原不包含：
(ii)编码与SEQ ID NO：56的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列、或具有其至少7个连续氨基酸的其片段的多核苷酸序列；或与SEQ ID NO：57的核酸序列具有至少70％的核苷酸序列同一性的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段。
在一个实施方案中，如果第一分枝杆菌抗原包含：
(i)与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；或
(ii)编码根据(i)所述的多肽序列的多核苷酸序列；或与SEQ ID NO：4的核酸序列具有至少70％的核苷酸序列同一性的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段；
则第二分枝杆菌抗原不包含：
(iii)与SEQ ID NO：56的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；或
(iv)编码根据(iii)所述的多肽序列的多核苷酸序列；或与SEQ ID NO：57的核酸序列具有至少70％的核苷酸序列同一性的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段。
在一个实施方案中，如果第一分枝杆菌抗原包含：
(i)与SEQ ID NO：56的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；
则第二分枝杆菌抗原不包含：
(ii)与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段。
在一个实施方案中，如果第一分枝杆菌抗原包含：
(i)编码与SEQ ID NO：56的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列、或具有其至少7个连续氨基酸的其片段的多核苷酸序列；或与SEQ ID NO：57的核酸序列具有至少70％的核苷酸序列同一性的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段；
则第二分枝杆菌抗原不包含：
(ii)编码与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列、或具有其至少7个连续氨基酸的其片段的多核苷酸序列；或与SEQ ID NO：4的核酸序列具有至少70％的核苷酸序列同一性的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段。
在一个实施方案中，如果第一分枝杆菌抗原包含：
(i)与SEQ ID NO：56的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；或
(ii)编码根据(i)所述的多肽序列的多核苷酸序列；或与SEQ ID NO：57的核酸序列具有至少70％的核苷酸序列同一性的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段；
则第二分枝杆菌抗原不包含：
(iii)与SEQ ID NO：3的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；或
(iv)编码根据(iii)所述的多肽序列的多核苷酸序列；或与SEQ ID NO：4的核酸序列具有至少70％的核苷酸序列同一性的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段。
在一个实施方案中，所述抗原组合物包含Rv3812抗原(抗原多肽或多核苷酸)和Rv0198抗原(抗原多肽或多核苷酸)二者。
在一个实施方案中，所述抗原组合物包含：
(i)第一分枝杆菌抗原多肽，其中所述第一分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：7的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；或
(ii)第一分枝杆菌多核苷酸，其中所述第一分枝杆菌多核苷酸包含编码所述第一分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列；
并且还包含：
(iii)第二分枝杆菌抗原多肽，其中所述第二分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；或
(iv)第二分枝杆菌多核苷酸，其中所述第二分枝杆菌多核苷酸包含编码所述第二分枝杆菌多肽的多核苷酸序列。
例如，Rv3812/Rv0198抗原组合物可以包含：
(i)第一分枝杆菌抗原多肽，其中所述第一分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：7的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；和
(ii)第二分枝杆菌抗原多肽，其中所述第二分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段。
备选地，Rv3812/Rv0198抗原组合物可以包含：
(i)第一分枝杆菌多核苷酸，其中所述第一分枝杆菌多核苷酸包含编码第一分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列，其中所述第一分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：7的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；和
(ii)第二分枝杆菌多核苷酸，其中所述第二分枝杆菌多核苷酸包含编码第二分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列，其中所述第二分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段。
备选地，Rv3812/Rv0198抗原组合物可以包含：
(i)第一分枝杆菌抗原多肽，其中所述第一分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：7的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；和
(ii)第二分枝杆菌多核苷酸，其中所述第二分枝杆菌多核苷酸包含编码第二分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列，其中所述第二分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段。
备选地，Rv3812/Rv0198抗原组合物可以包含：
(i)第一分枝杆菌多核苷酸，其中所述第一分枝杆菌多核苷酸包含编码第一分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列，其中所述第一分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：7的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；和
(ii)第二分枝杆菌抗原多肽，其中所述第二分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段。
除了上文讨论的第一和第二分枝杆菌抗原之外，本发明的抗原组合物还可以包含至少一种另外的分枝杆菌抗原，所述另外的分枝杆菌抗原不同于第一和/或第二分枝杆菌抗原。在一个实施方案中，所述至少一种另外的分枝杆菌抗原不同于第一分枝杆菌抗原和第二分枝杆菌抗原二者。
在一个实施方案中，本发明的抗原组合物还可以包含至少一种另外的分枝杆菌抗原多肽，所述另外的分枝杆菌抗原多肽不同于所述第一分枝杆菌抗原多肽和/或所述第二分枝杆菌抗原多肽。在一个实施方案中，本发明的抗原组合物进一步包含至少一种另外的分枝杆菌多核苷酸，所述另外的分枝杆菌多核苷酸不同于所述第一分枝杆菌多核苷酸和/或所述第二分枝杆菌多核苷酸。
在一个实施方案中，其中有多个另外的分枝杆菌抗原(例如，2个以上另外的分枝杆菌抗原，以及第一和第二分枝杆菌抗原)，所述另外的分枝杆菌抗原的每一个彼此不同。
在一个实施方案中，所述另外的分枝杆菌抗原与第一和第二分枝杆菌抗原之间的‘不同’由针对所述分枝杆菌抗原的免疫应答的特异性限定。例如，在一个实施方案中，第一、第二和另外的抗原中的每一个诱导基本上对所述抗原特异性的免疫应答。
第一、第二与另外的分枝杆菌抗原之间的‘不同’可以关于在所述分枝杆菌抗原之间基本上缺少(例如，不存在)共同的抗原交叉反应性而限定。
第一、第二与另外的分枝杆菌抗原之间的‘不同’可以备选地(或另外)定义为在所述分枝杆菌抗原之间基本上缺少(例如，不存在)共同的体内生物活性。
例如，在一个实施方案中，第一、第二与另外的分枝杆菌抗原(例如，第一、第二与另外的分枝杆菌抗原多肽，或第一、第二与另外的分枝杆菌抗原多核苷酸或由其编码的多肽)可以表现出(基本上)不共同的抗原交叉反应性。
在一个实施方案中，第一、第二与另外的分枝杆菌抗原(例如，第一、第二与另外的分枝杆菌抗原多肽，或第一、第二与另外的分枝杆菌抗原多核苷酸或由其编码的多肽)表现出(基本上)不共同的体内生物活性。
例如，第一、第二与另外的分枝杆菌抗原(例如，第一、第二与另外的分枝杆菌抗原多肽，或第一、第二与另外的分枝杆菌抗原多核苷酸或由其编码的多肽)可以分别诱导不同的免疫应答和/或分别具有不同的体内生物活性。
例如，在一个实施方案中，第一、第二与另外的分枝杆菌抗原(例如，第一、第二与另外的分枝杆菌抗原多肽，或第一、第二与另外的分枝杆菌抗原多核苷酸或由其编码的多肽)不共有共同的诱导先前暴露于分枝杆菌感染的抗原成分的免疫细胞如T-淋巴细胞(例如，CD4+，CD8+，效应T细胞或记忆T细胞如TEM或TCM)的“回忆应答”的能力。
换言之，在一个实施方案中，第一、第二和另外的分枝杆菌抗原是不同的，原因在于它们在不同的免疫细胞中(例如，不同的T细胞中)诱导回忆应答。
在一个实施方案中，与第一和/或第二分枝杆菌抗原相比较，所述一种或多种另外的分枝杆菌抗原在不同的培养条件和/或分枝杆菌感染状态下表达或被上调。在一个实施方案中，与第一和/或第二分枝杆菌抗原相比较，所述一种或多种另外的分枝杆菌抗原的活性在不同的培养条件和/或分枝杆菌感染状态下被上调。
在这一方面，本申请人已经鉴定了包含代表不同的分枝杆菌感染状态的本发明的第一和第二以及另外的分枝杆菌抗原的抗原组合物有利地引发针对分枝杆菌感染的不同阶段的免疫应答，由此针对分枝杆菌疾病的多个阶段进行保护。这是特别有利的，因为分枝杆菌感染以不同的急性期、潜伏期和再激活期发生。
因此，在一个实施方案中，第一分枝杆菌抗原的表达或活性在分枝杆菌潜伏性条件下被上调，而第二和/或另外的分枝杆菌抗原的表达或活性在活动性分枝杆菌感染过程中或由潜伏状态再激活时被上调(和/或在分枝杆菌潜伏条件性下被下调)。
在备选的实施方案中，第一分枝杆菌抗原的表达或活性在分枝杆菌潜伏性条件下被下调，而第二和/或另外的分枝杆菌抗原的表达或活性在活动性分枝杆菌感染过程中或由潜伏状态再激活时被下调(和/或在分枝杆菌潜伏条件性下被上调)。
在一个实施方案中，其中有多个另外的分枝杆菌抗原(例如，2个以上另外的分枝杆菌抗原，以及第一和第二分枝杆菌抗原)，每个另外的分枝杆菌抗原在不同的分枝杆菌感染阶段表达/上调，或者每个另外的分枝杆菌抗原的活性在不同的分枝杆菌感染阶段被上调。
在一个实施方案中，所述一种或多种另外的分枝杆菌抗原来自于不同于结核分枝杆菌的分枝杆菌。例如，所述一种或多种另外的分枝杆菌抗原可以来自于MTC的另一成员，诸如田鼠分枝杆菌，牛分枝杆菌，M.canetti或非洲分枝杆菌，或来自于非-MTC分枝杆菌，如鸟分枝杆菌-胞内分枝杆菌(M.avium-intracellulare)，堪萨斯分枝杆菌，瘰疬分枝杆菌(M.marinum)或溃疡分枝杆菌。
在一个实施方案中，除了上文讨论的第一和第二分枝杆菌抗原之外，所述抗原组合物包含至少1，2，3，4或5种另外的分枝杆菌抗原。在一个实施方案中，所述至少1，2，3，4或5种另外的分枝杆菌抗原中的每一种彼此不同并且不同于第一和第二分枝杆菌抗原。在一个实施方案中，所述抗原组合物包含多至约10种不同的分枝杆菌抗原(例如，包含上文讨论的第一和第二分枝杆菌抗原)。
在一个实施方案中，所述抗原组合物包含1种另外的分枝杆菌抗原，并且因此总共包含3种不同的分枝杆菌抗原(即，所述抗原组合物是三聚物)。在一个实施方案中，所述抗原组合物包含2种另外的分枝杆菌抗原，并且因此总共包含4种不同的分枝杆菌抗原(即，所述抗原组合物是四聚物)。在一个实施方案中，所述抗原组合物包含3种另外的分枝杆菌抗原，并且因此总共包含4种不同的分枝杆菌抗原(即，所述抗原组合物是五聚物)。在一个实施方案中，所述抗原组合物包含多至8种另外的分枝杆菌抗原，并且因此总共包含10种不同的分枝杆菌抗原(即，所述抗原组合物是十聚物)。
所述一种或多种另外的分枝杆菌抗原可以包含(或由下述组成)多肽序列。
在一个实施方案中，所述一种或多种另外的分枝杆菌抗原包含(或由下述组成)与选自SEQ ID NOs：1，3，5，7和56的潜伏期-调节多肽的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段，如上述关于第一分枝杆菌抗原所定义的那样(只要所述一种或多种另外的分枝杆菌抗原不同于第一分枝杆菌抗原)。
备选地，或另外，所述一种或多种另外的分枝杆菌抗原包含(或由下述组成)与选自SEQ ID NOs：9-20和34-44的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段，如上述关于第二分枝杆菌抗原所定义的那样(只要所述一种或多种另外的分枝杆菌抗原不同于第二分枝杆菌抗原)。
所述一种或多种另外的分枝杆菌抗原可以包含(或由下述组成)多核苷酸序列。
在一个实施方案中，所述一种或多种另外的分枝杆菌抗原包含(或由下述组成)编码如上文关于第一分枝杆菌抗原多肽所述的多肽序列的多核苷酸序列(只要所述一种或多种另外的分枝杆菌抗原不同于第一分枝杆菌抗原)。
在一个实施方案中，所述一种或多种另外的分枝杆菌抗原包含(或由下述组成)编码如上文关于第二分枝杆菌抗原多肽所述的多肽序列的多核苷酸序列(只要所述一种或多种另外的分枝杆菌抗原不同于第二分枝杆菌抗原)。
在一个实施方案中，所述一种或多种另外的分枝杆菌抗原包含(或由下述组成)与选自SEQ ID NOs：2，4，6，8和57的潜伏期-调节多核苷酸的核酸序列具有至少70％的核苷酸序列同一性的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段，如上文关于第一分枝杆菌抗原所述(只要所述一种或多种另外的分枝杆菌抗原不同于第一分枝杆菌抗原)。
备选地，或另外，所述一种或多种另外的分枝杆菌抗原包含(或由下述组成)与选自SEQ ID NOs：21-32和45-55的核酸序列具有至少70％的核苷酸序列同一性的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段，如上文关于第二分枝杆菌抗原所述那样(只要所述一种或多种另外的分枝杆菌抗原不同于第二分枝杆菌抗原)。
在一个实施方案中，所述抗原组合物包含：
(i)第一分枝杆菌抗原多肽，其中所述第一分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：1或7的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；或
(ii)第一分枝杆菌多核苷酸，其中所述第一分枝杆菌多核苷酸包含编码所述第一分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列；
并且还包含：
(iii)第二分枝杆菌抗原多肽，其中所述第二分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；或
(iv)第二分枝杆菌多核苷酸，其中所述第二分枝杆菌多核苷酸包含编码所述第二分枝杆菌多肽的多核苷酸序列；
并且还包含：
(v)至少一种另外的分枝杆菌抗原多肽，所述另外的分枝杆菌抗原多肽不同于所述第一分枝杆菌抗原多肽和/或所述第二分枝杆菌抗原多肽；或至少一种另外的分枝杆菌多核苷酸，所述另外的分枝杆菌多核苷酸不同于所述第一分枝杆菌多核苷酸和/或所述第二分枝杆菌多核苷酸。
在一个实施方案中，所述抗原组合物不包含Rv1806抗原和Rv1807抗原二者。
因此，在一个实施方案中，如果第一分枝杆菌抗原是Rv1806多肽抗原，则所述抗原组合物中的所述另外的分枝杆菌抗原不是Rv1807多肽抗原。在一个实施方案中，如果第一分枝杆菌抗原是Rv1806多核苷酸抗原，则所述抗原组合物中的所述另外的分枝杆菌抗原不是Rv1807多核苷酸抗原。在一个实施方案中，如果第一分枝杆菌抗原是Rv1806多肽抗原，则所述抗原组合物中的所述另外的分枝杆菌抗原不是Rv1807多核苷酸抗原。在一个实施方案中，如果第一分枝杆菌抗原是Rv1806多核苷酸抗原，则所述抗原组合物中的所述另外的分枝杆菌抗原不是Rv1807多肽抗原。
在一个实施方案中，如果第一分枝杆菌抗原是Rv1807多肽抗原，则所述抗原组合物中的所述另外的分枝杆菌抗原不是Rv1806多肽抗原。在一个实施方案中，如果第一分枝杆菌抗原是Rv1807多核苷酸抗原，则所述抗原组合物中的所述另外的分枝杆菌抗原不是Rv1806多核苷酸抗原。在一个实施方案中，如果第一分枝杆菌抗原是Rv1807多肽抗原，则所述抗原组合物中的所述另外的分枝杆菌抗原不是Rv1806多核苷酸抗原。在一个实施方案中，如果第一分枝杆菌抗原是Rv1807多核苷酸抗原，则所述抗原组合物中的所述另外的分枝杆菌抗原不是Rv1806多肽抗原。
在一个实施方案中，所述抗原组合物不包含Rv0111抗原、Rv0198抗原和Rv3812抗原。因此，如果所述抗原组合物包含Rv0111抗原和Rv0198抗原，则所述抗原组合物也不包含Rv3812抗原。
例如，如果第一分枝杆菌抗原多肽或第一分枝杆菌多肽包含Rv0111抗原并且如果第二分枝杆菌抗原多肽或第二分枝杆菌多核苷酸包含Rv0198抗原，则所述抗原组合物中的所述一种或多种另外的抗原多肽或多核苷酸不包含(或由下述组成)Rv3812抗原。备选地，如果第一分枝杆菌抗原多肽或第一分枝杆菌多肽包含Rv0198抗原并且如果第二分枝杆菌抗原多肽或第二分枝杆菌多核苷酸包含Rv0111抗原，则所述抗原组合物中的所述一种或多种另外的抗原多肽或多核苷酸不包含(或由下述组成)Rv3812抗原。
例如，在一个实施方案中，所述抗原组合物包含：
(i)第一分枝杆菌抗原多肽，其中所述第一分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；或
(ii)第一分枝杆菌多核苷酸，其中所述第一分枝杆菌多核苷酸包含编码所述第一分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列；
并且还包含：
(iii)第二分枝杆菌抗原多肽，其中所述第二分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；或
(iv)第二分枝杆菌多核苷酸，其中所述第二分枝杆菌多核苷酸包含编码所述第二分枝杆菌多肽的多核苷酸序列；
并且还进一步包含至少一种另外的分枝杆菌抗原多肽，所述另外的分枝杆菌抗原多肽不同于所述第一分枝杆菌抗原多肽和/或所述第二分枝杆菌抗原多肽；其中所述至少一种另外的分枝杆菌抗原多肽不是Rv3812多肽抗原。
如上文讨论的，“Rv3812多肽抗原”包含SEQ ID NO：7(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)或由SEQ ID NO：7(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)组成。因此，按照本发明的这一实施方案，所述至少一种另外的分枝杆菌抗原多肽可以包含下述或由下述组成：与SEQ ID NO：7的氨基酸序列具有小于50％的氨基酸序列同一性的多肽序列、或其具有其少于7个连续的氨基酸的片段。
在一个备选的实施方案中，所述抗原组合物包含：
(i)第一分枝杆菌抗原多肽，其中所述第一分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；或
(ii)第一分枝杆菌多核苷酸，其中所述第一分枝杆菌多核苷酸包含编码所述第一分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列；
并且还包含：
(iii)第二分枝杆菌抗原多肽，其中所述第二分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；或
(iv)第二分枝杆菌多核苷酸，其中所述第二分枝杆菌多核苷酸包含编码所述第二分枝杆菌多肽的多核苷酸序列；
并且还进一步包含至少一种另外的分枝杆菌多核苷酸，所述另外的分枝杆菌多核苷酸不同于所述第一分枝杆菌多核苷酸和/或所述第二分枝杆菌多核苷酸；其中所述至少一种另外的分枝杆菌多核苷酸不是Rv3812多核苷酸抗原。
如上文讨论的，“Rv3812多核苷酸抗原”包含SEQ ID NO：8(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)或由SEQ ID NO：8(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)组成。因此，按照本发明的这一实施方案，所述至少一种另外的分枝杆菌多核苷酸可以包含下述或由下述组成：与SEQ ID NO：8的核酸序列具有小于50％的核苷酸序列同一性的多核苷酸序列、或其具有其少于21个连续的核苷酸的片段。
在一个实施方案中，所述抗原组合物不包含SEQ ID NO：1(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)和SEQ ID NO：5(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)和SEQ ID NO：7(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)。
在一个实施方案中，所述抗原组合物不包含SEQ ID NO：2(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)和SEQ ID NO：6(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)和SEQ ID NO：8(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)。
在一个实施方案中，所述抗原组合物中的至少两种分枝杆菌抗原包含(或由下述组成)多肽序列，并且所述至少两种多肽序列连接在一起以形成融合蛋白。
例如，在一个实施方案中，第一分枝杆菌抗原和第二分枝杆菌抗原分别包含(或由下述组成)多肽序列，如上文定义，并且所述第一和第二多肽序列连接在一起以形成融合蛋白。
在一个实施方案中，所述融合蛋白是Rv0111-Rv0198融合蛋白，其中所述Rv0111-Rv0198融合蛋白包含下述或由下述组成(以从N-端到C-端的任意顺序)：
(i)第一分枝杆菌抗原多肽，其中所述第一分枝杆菌抗原多肽包含(或由下述组成)与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；和
(ii)第二分枝杆菌抗原多肽，其中所述第二分枝杆菌抗原多肽包含(或由下述组成)与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段。
在一个实施方案中，所述融合蛋白是Rv3812-Rv0198融合蛋白，其中所述Rv3812-Rv0198融合蛋白包含下述或由下述组成(以从N-端到C-端的任意顺序)：
(i)第一分枝杆菌抗原多肽，其中所述第一分枝杆菌抗原多肽包含(或下述组成)与SEQ ID NO：7的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；和
(ii)第二分枝杆菌抗原多肽，其中所述第二分枝杆菌抗原多肽包含(或下述组成)与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段。
在一个实施方案中，所述融合蛋白进一步包含至少一种另外的分枝杆菌抗原多肽序列，所述另外的分枝杆菌抗原多肽序列连接到所述第一和/或第二多肽序列上，其中所述另外的分枝杆菌抗原中的每一种彼此不同并且不同于第一和第二分枝杆菌抗原。例如，除了所述第一和第二分枝杆菌抗原之外，所述融合蛋白可以包含至少1，2，3，4或5种另外的分枝杆菌抗原，其中所述另外的分枝杆菌抗原中的每一种彼此不同并且不同于第一和第二分枝杆菌抗原。在一个实施方案中，所述融合蛋白可以包含多至约10种不同的分枝杆菌抗原(例如，包含第一和第二分枝杆菌抗原)。
在一个实施方案中，所述抗原组合物包含至少一种另外的分枝杆菌抗原(例如，至少1，2，3，4，5，6，7，8，9或10种另外的分枝杆菌抗原)，并且第一分枝杆菌抗原和所述至少一种另外的分枝杆菌抗原分别包含(或由下述组成)多肽序列，如上文定义，并且所述多肽序列连接在一起以形成融合蛋白。
在一个实施方案中，所述抗原组合物包含至少一种另外的分枝杆菌抗原(例如，至少1，2，3，4，5，6，7，8，9或10种另外的分枝杆菌抗原)，并且第二分枝杆菌抗原和所述至少一种另外的分枝杆菌抗原分别包含(或由下述组成)多肽序列，如上文定义，并且所述多肽序列连接在一起以形成融合蛋白。
备选地，在一个实施方案中，所述抗原组合物包含至少两种另外的分枝杆菌抗原(例如，至少2，3，4，5，6，7，8，9或10种另外的分枝杆菌抗原)，并且所述至少两种另外的分枝杆菌抗原分别包含(或由下述组成)多肽序列，如上文定义，并且所述多肽序列连接在一起以形成融合蛋白。
在一个实施方案中，所述抗原组合物不包含含有Rv1806抗原和Rv1807抗原二者的融合蛋白。因此，在一个实施方案中，所述抗原组合物不包含含有SEQ ID NO：3(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)和SEQ ID NO：56(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)二者的融合蛋白。
在一个实施方案中，所述抗原组合物不包含由Rv1806抗原和Rv1807抗原二者组成的融合蛋白。因此，在一个实施方案中，所述抗原组合物不包含由SEQ ID NO：3(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)和SEQID NO：56(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)二者组成的融合蛋白。
在一个实施方案中，如果所述抗原组合物包含Rv0111抗原和Rv1098抗原(例如，分别地，或以融合蛋白的形式)，则所述抗原组合物(或融合蛋白)也不包含Rv3821抗原。
因此，在一个实施方案中，所述抗原组合物不包含含有下述或由下述组成的融合蛋白：SEQ ID NO：1(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)和SEQ ID NO：5(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)和SEQ ID NO：7(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)。
融合蛋白中的多肽序列的顺序不重要。
用于制备融合蛋白的技术在本领域中是公知的。
在一个实施方案中，重组融合蛋白可以通过表达编码所述融合蛋白的重组多核苷酸序列而产生。例如，编码本发明的分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列可以位于表达载体中启动子下游的同一阅读框中，由此允许通过所述多核苷酸序列的转录并且翻译成一种蛋白产物。
在一个实施方案中，插入的‘接头’序列位于关于每种多肽抗原的多核苷酸序列之间，由于包含限制性位点而产生。通常，由这些接头序列编码的氨基酸对所得到的融合蛋白的免疫原性没有损害，并且甚至可以对免疫原性有益。备选地，本发明的融合蛋白可以通过表达不用插入核苷酸连接的多核苷酸序列而作为表位串(epitope string)产生。不存在插入的接头序列避免存在不必要的核酸和/或氨基酸物质。
备选地，本发明的融合蛋白可以通过化学缀合本发明的分枝杆菌抗原多肽而制备。例如，可以使用常规化学缀合技术将本发明的第一和/或第二和/或另外的分枝杆菌多肽彼此偶联。
在一个实施方案中，所述抗原组合物中的分枝杆菌抗原中的至少两种包含(或由下述组成)多核苷酸序列，并且所述至少两种多核苷酸序列连接在一起以形成多顺反子核酸序列。
例如，在一个实施方案中，第一分枝杆菌抗原和第二分枝杆菌抗原分别包含(或由下述组成)多核苷酸序列，如上文定义，并且所述第一和第二多核苷酸序列连接在一起以形成多顺反子核酸序列。
在一个实施方案中，所述多顺反子核酸序列包含或由下述组成(以从5’到3’端的任意顺序)：
(i)第一分枝杆菌多核苷酸，其中所述第一分枝杆菌多核苷酸包含(或由下述组成)编码第一分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列，其中所述第一分枝杆菌抗原多肽包含(或由下述组成)与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；和
(ii)第二分枝杆菌多核苷酸，其中所述第二分枝杆菌多核苷酸包含(或由下述组成)编码第二分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列，其中所述第二分枝杆菌抗原多肽包含(或由下述组成)与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段。
在一个实施方案中，所述第一分枝杆菌多核苷酸包含(或由下述组成)与SEQ ID NO：2的核酸序列具有至少70％的核苷酸序列同一性的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段。在一个实施方案中，所述第二分枝杆菌多核苷酸包含(或由下述组成)与SEQ ID NO：6的核酸序列具有至少70％的核苷酸序列同一性的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段。
在一个实施方案中，所述多顺反子核酸序列包含或由下述组成(以从5’到3’端的任意顺序)：
(i)第一分枝杆菌多核苷酸，其中所述第一分枝杆菌多核苷酸包含(或由下述组成)编码第一分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列，其中所述第一分枝杆菌抗原多肽包含(或由下述组成)与SEQ ID NO：7的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；和
(ii)第二分枝杆菌多核苷酸，其中所述第二分枝杆菌多核苷酸包含(或由下述组成)编码第二分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列，其中所述第二分枝杆菌抗原多肽包含(或由下述组成)与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段。
在一个实施方案中，所述第一分枝杆菌多核苷酸包含(或由下述组成)与SEQ ID NO：8的核酸序列具有至少70％的核苷酸序列同一性的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段。在一个实施方案中，所述第二分枝杆菌多核苷酸包含(或由下述组成)与SEQ ID NO：6的核酸序列具有至少70％的核苷酸序列同一性的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段。
在一个实施方案中，所述多顺反子序列还包含至少一种另外的分枝杆菌抗原多核苷酸序列，所述另外的分枝杆菌抗原多核苷酸序列与所述第一和第二多核苷酸序列连接。
备选地，在一个实施方案中，所述抗原组合物包含至少一种另外的分枝杆菌抗原，并且所述第一分枝杆菌抗原和至少一种另外的分枝杆菌抗原分别包含(或由下述组成)多核苷酸序列，如上文定义，并且所述多核苷酸序列连接在一起以形成多顺反子核酸序列。
备选地，在一个实施方案中，所述抗原组合物包含至少一种另外的分枝杆菌抗原，并且所述第二分枝杆菌抗原和至少一种另外的分枝杆菌抗原分别包含(或由下述组成)多核苷酸序列，如上文定义，并且所述多核苷酸序列连接在一起以形成多顺反子核酸序列。
备选地，在一个实施方案中，所述抗原组合物包含至少两种另外的分枝杆菌抗原，并且所述至少两种另外的分枝杆菌抗原分别包含(或由下述组成)多核苷酸序列，如上文定义，并且所述多核苷酸序列连接在一起以形成多顺反子核酸序列。
在一个实施方案中，所述多顺反子序列不包含Rv1806抗原和Rv1807抗原二者。在一个实施方案中，所述多顺反子序列不是由Rv1806抗原和Rv1807抗原组成。
因此，在一个实施方案中，所述多顺反子序列不包含SEQ ID NO：3(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)和SEQ ID NO：56(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)二者。在一个实施方案中，所述抗原组合物不是由SEQ ID NO：3(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)和SEQ ID NO：56(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)二者组成。
在一个实施方案中，如果所述抗原组合物包含Rv0111抗原和Rv0198抗原(例如，以包含Rv0111多核苷酸和Rv0198多核苷酸或由Rv0111多核苷酸和Rv0198多核苷酸组成的多顺反子序列的形式)，则所述抗原组合物(或多顺反子序列)还不包含Rv3812抗原。因此，在一个实施方案中，如果所述抗原组合物包含含有SEQ ID NO：2(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)和SEQ ID NO：6(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)或由SEQ ID NO：2(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)和SEQ ID NO：6(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)组成的多顺反子序列，则所述抗原组合物还不包含SEQ ID NO：8(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)。
在一个实施方案中，所述多顺反子序列不包含Rv0111抗原、Rv0198抗原和Rv3812抗原或不由Rv0111抗原、Rv0198抗原和Rv3812抗原组成。因此，在一个实施方案中，所述多顺反子序列不包含下述或不由下述组成：SEQ ID NO：2(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)和SEQ ID NO：6(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)和SEQ ID NO：8(或如本文定义的其序列‘变体’或‘片段’)。
在所述多顺反子序列中多核苷酸序列从5’到3’的顺序不重要。
用于制备多顺反子核酸序列的技术在本领域中是公知的，并且典型地包括制备在同一阅读框中包含多个个体多核苷酸序列的重组分子。
在一个实施方案中，本发明的所述多顺反子核酸序列在载体中符合阅读框地位于启动子的下游(例如，如下文讨论的表达载体或病毒载体)，由此允许通过所述多核苷酸序列的转录并且任选地翻译成一种‘融合蛋白’产物。
因此，在一个实施方案中，所述多顺反子核酸序列编码如上文讨论的融合蛋白。备选地，在一个实施方案中，所述多顺反子核酸序列编码分开的分枝杆菌抗原多肽序列，如上文所讨论的那样。
在一个实施方案中，所述多顺反子核酸序列可操作地连接到编码标签多肽的核酸序列上，以使所编码的标签在翻译时与所编码的抗原多肽共价连接。
所述标签可以促进抗原多肽表达的检测或表达所述抗原的克隆的检测，和/或可以导致抗原功效的增加。适当的标签多肽包括PK标签、FLAG标签、MYC标签、聚组氨酸标签或任意可检测的标签(例如，可以通过抗体如单克隆抗体检测的标签)。标签的其他实例对于本领域技术人员是清楚的。PK标签可以具有序列Pro-Asn-Pro-Leu-Gly-Leu-Asp(SEQ ID NO：33)。
编码标签多肽的核酸序列可以位于这样的位置，即，翻译后，所述标签位于所表达的抗原多肽的C-端(即，以这样的顺序：抗原多肽-标签)。备选地，编码标签多肽的核酸序列可以位于这样的位置，即，翻译后，所述标签位于所表达的抗原多肽的N-端(即，以这样的顺序：标签-抗原多肽)。备选地，编码标签多肽的核酸序列可以位于这样的位置，即，翻译后，所述标签位于所表达的抗原多肽的中间，或者在编码的融合蛋白的所表达的抗原多肽之间。
编码接头序列的核苷酸可以插入在编码一种或多种抗原多肽的多顺反子核酸序列和编码标签多肽的核酸序列之间。在一个实施方案中，接头序列编码氨基酸序列Gly-Ser-Ile。
在一个实施方案中，所编码的接头序列位于所表达的抗原多肽和标签多肽之间(即，以这样的顺序：抗原多肽-接头-标签，或标签-接头-抗原多肽)。在一个实施方案中，编码标签多肽的核酸序列和编码接头序列的核苷酸的位置是这样的，即，翻译后，所述接头序列(例如Gly-Ser-Ile)位于所表达的抗原多肽的C-端，并且所述标签位于所表达的接头序列的C-端(即，以这样的顺序：抗原多肽-接头-标签)。
插入的‘接头’序列(例如，编码Gly-Ser-Ile)可以备选地(或另外地)位于所述多顺反子序列的分枝杆菌多核苷酸序列之间，由于包含限制性位点而产生(例如，以这样的形式：分枝杆菌多核苷酸-接头-分枝杆菌多核苷酸)。然而，为了避免存在不必要的核酸和/或氨基酸物质，多核苷酸序列可以不用插入核苷酸而连接。
在一个实施方案中，所述多顺反子核酸序列可操作地与前导序列连接。例如，所述前导序列可以融合在所述多顺反子序列的N-端(即，以这样的形式：前导-多顺反子序列)或所述多顺反子序列的C-端(即，以这样的形式：多顺反子序列-前导)。
前导序列可以影响初级DNA转录物到mRNA的加工，和/或可以影响mRNA的稳定性或翻译效率。在一个实施方案中，前导序列确保所编码的多肽抗原被导向宿主细胞的分泌机制(secretory machinery)。在一个实施方案中，前导序列增强抗原的表达和/或免疫原性。增强的表达可以通过常规测定法确定，诸如使用抗体(例如，单克隆抗体)来检测所产生的蛋白的量。增强的免疫原性可以使用常规测定法确定，常规测定法诸如培养的或离体ELISPOT测定法。在一个实施方案中，当与所表达的没有前导序列的抗原多肽相比较时，存在前导序列使分枝杆菌抗原多肽的表达和/或免疫原性增强2倍、3倍或更多倍。
一个适当的前导序列的实例是t-PA(组织纤溶酶原激活物)。
因此，在一个实施方案中，编码所述分枝杆菌抗原多肽的多顺反子核酸序列可操作性地与前导序列和标签序列连接。例如，前导序列可以融合在所述多顺反子序列的N-端，并且标签序列可以融合在所述多顺反子序列的C-端(即，以这样的形式：前导-多顺反子序列-标签)。在一个实施方案中，接头序列(例如Gly-Ser-Ile)位于所述多顺反子序列与编码标签的核苷酸序列之间(即，以这样的形式：前导-多顺反子序列-接头-标签)。
在一个实施方案中，前导序列是t-PA前导序列和/或标签序列是PK标签序列(即，以这样的形式：t-PA前导-多顺反子序列-PK标签)。在一个实施方案中，接头序列(例如Gly-Ser-Ile)位于所述多顺反子序列与编码标签的核苷酸序列之间(即，以这样的形式：t-PA前导-多顺反子序列-接头-PK标签)。
在一个实施方案中，插入的前导序列位于所述多顺反子序列的一个或多个分枝杆菌多核苷酸序列之间(即，以这样的形式：分枝杆菌多核苷酸-前导-分枝杆菌多核苷酸)。
在一个实施方案中，编码所述分枝杆菌抗原多肽的多顺反子核酸序列可操作性地与N-端前导序列、中间前导序列和标签序列连接(即，以这样的形式：前导-第一分枝杆菌多核苷酸-前导-第二分枝杆菌多核苷酸-标签)。在一个实施方案中，接头序列(例如Gly-Ser-Ile)位于所述多顺反子序列与编码标签的核酸序列之间(即，以这样的形式：前导-第一分枝杆菌多核苷酸-前导-第二分枝杆菌多核苷酸-接头-标签)。
在一个实施方案中，前导序列是t-PA前导序列和/或标签序列是PK标签序列(即，以这样的形式：t-PA前导-第一分枝杆菌多核苷酸-t-PA前导-第二分枝杆菌多核苷酸-PK标签)。
在一个实施方案中，接头序列(例如Gly-Ser-Ile)位于所述多顺反子序列与编码标签的核酸序列之间(即，以这样的形式：t-PA前导-第一分枝杆菌多核苷酸-t-PA前导-第二分枝杆菌多核苷酸-接头-PK标签)。
在一个实施方案中，所述多顺反子核酸序列还包含多聚腺苷酸化信号，如牛生长激素(BGH)多聚腺苷酸化信号。
在一个实施方案中，所述抗原组合物包含一种或多种细胞，其中所述细胞包含所述分枝杆菌抗原中的至少一种。
在一个实施方案中，所述一种或多种细胞包含第一分枝杆菌抗原，如上文定义。在一个实施方案中，所述第一分枝杆菌抗原包含如上文定义的多肽序列，诸如如上文定义的Rv0111或Rv3812多肽序列。在一个实施方案中，所述第一分枝杆菌抗原包含如上文定义的多核苷酸序列，诸如如上文定义的Rv0111或Rv3812多核苷酸序列。
在一个实施方案中，所述一种或多种细胞包含第二分枝杆菌抗原，如上文定义。在一个实施方案中，所述第二分枝杆菌抗原包含如上文定义的多肽序列，诸如如上文定义的Rv0198多肽序列。在一个实施方案中，所述第二分枝杆菌抗原包含如上提出的多核苷酸序列，诸如如上文定义的Rv0198多核苷酸序列。
在一个实施方案中，所述一种或多种细胞包含一种或多种所述另外的分枝杆菌抗原，如上文定义。在一个实施方案中，一种或多种所述另外的分枝杆菌抗原包含如上文定义的多肽序列。在一个实施方案中，一种或多种所述另外的分枝杆菌抗原包含如上提出的多核苷酸序列。
在一个实施方案中，上述关于包含第一和第二分枝杆菌抗原的抗原组合物所讨论的限制同等适用于包含一种或多种细胞的抗原组合物，其中所述细胞包含所述分枝杆菌抗原中的至少一种。
在一个实施方案中，所述至少一种分枝杆菌抗原(例如多肽)至少部分暴露在细胞的表面上。
在一个备选实施方案中，细胞在体内降解，以使至少部分的分枝杆菌抗原(例如多肽)暴露于宿主的免疫系统。在一个备选实施方案中，细胞将所述分枝杆菌抗原(例如多肽)至少部分释放(例如，分泌或输出)到细胞外部，以使其暴露于宿主的免疫系统。
在一个实施方案中，所述抗原组合物包含个体细胞，其中所述细胞包含所述分枝杆菌抗原中的至少两种。
例如，在一个实施方案中，所述抗原组合物包含个体细胞，其中所述细胞包含所述第一分枝杆菌抗原和所述第二分枝杆菌抗原二者。在一个实施方案中，所述个体细胞包含如本文定义的Rv0111多肽或多核苷酸抗原或者包含Rv3812多肽或多核苷酸抗原，并且还包含如本文定义的Rv0198多肽或多核苷酸抗原。在一个实施方案中，所述个体细胞还包含所述另外的分枝杆菌抗原中的一种或多种。
在一个实施方案中，所述抗原组合物包含个体细胞，其中所述细胞包含所述第一分枝杆菌抗原和所述一种或多种另外的分枝杆菌抗原。在一个实施方案中，所述抗原组合物包含个体细胞，其中所述细胞包含所述第二分枝杆菌抗原和所述一种更多另外的分枝杆菌抗原。在一个实施方案中，所述抗原组合物包含个体细胞，其中所述细胞包含所述至少两种所述另外的分枝杆菌抗原。
在一个备选实施方案中，所述抗原组合物包含至少第一和第二细胞，其中所述第一细胞包含所述第一分枝杆菌抗原(如上文定义)，并且其中所述第二细胞包含所述第二分枝杆菌抗原(如上文定义)。在这一实施方案中，第一和第二分枝杆菌抗原不存在于相同的细胞中；相反，第一和第二分枝杆菌抗原存在于不同的细胞中。
在一个实施方案中，所述抗原组合物还包含至少第三细胞，其中所述细胞包含如上述定义的另外的分枝杆菌抗原。
在一个实施方案中，如果所述抗原组合物包含如本文定义的Rv0111多肽或多核苷酸抗原，和如本文定义的Rv0198多肽或多核苷酸抗原(例如，在相同或不同的细胞中)，则所述抗原组合物(或所述细胞)还不包含如本文定义的Rv3812多肽或多核苷酸抗原。
在一个实施方案中，所述至少一种细胞是减毒的微生物载体。减毒的载体是一种在动物受试者中、典型地在哺乳动物受试者如人、牛、猪或马受试者中不能引起显著致病效果的细胞(如细菌细胞)。
减毒的微生物载体的适当的实例包括减毒的沙门氏菌(salmonella)、减毒的结核分枝杆菌(M.tuberculosis)或减毒的牛分枝杆菌(M.bovis)(例如，BCG菌株)。
在一个实施方案中，所述抗原组合物包含一种或多种载体，其中所述载体包含所述分枝杆菌抗原中的至少一种。
在一个实施方案中，所述一种或多种载体包含如上文定义的第一分枝杆菌抗原。在一个实施方案中，所述第一分枝杆菌抗原包含如上文定义的多肽序列，诸如如本文定义的Rv0111多肽抗原或Rv3812多肽抗原。在一个实施方案中，所述第一分枝杆菌抗原包含如上提出的多核苷酸序列，诸如如本文定义的Rv0111多核苷酸抗原或Rv3812多核苷酸抗原。
在一个实施方案中，所述一种或多种载体包含如上文定义的第二分枝杆菌抗原。在一个实施方案中，所述第二分枝杆菌抗原包含如上文定义的多肽序列，诸如如本文定义的Rv0198多肽抗原。在一个实施方案中，所述第二分枝杆菌抗原包含如上提出的多核苷酸序列，诸如如本文定义的Rv0198多核苷酸抗原。
在一个实施方案中，所述载体包含所述第一分枝杆菌抗原和所述第二分枝杆菌抗原。例如，所述载体可以包含如本文定义的第一分枝杆菌多核苷酸和如本文定义的第二分枝杆菌多核苷酸。
在一个实施方案中，所述载体包含：
(i)第一分枝杆菌多核苷酸，其中所述第一分枝杆菌多核苷酸包含(或由下述组成)编码第一分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列，其中所述第一分枝杆菌抗原多肽包含(或由下述组成)与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；和
(ii)第二分枝杆菌多核苷酸，其中所述第二分枝杆菌多核苷酸包含(或由下述组成)编码第二分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列，其中所述第二分枝杆菌抗原多肽包含(或由下述组成)与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段。
在一个实施方案中，所述第一分枝杆菌多核苷酸包含(或由下述组成)与SEQ ID NO：2的核酸序列具有至少70％的核苷酸序列同一性的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段。在一个实施方案中，所述第二分枝杆菌多核苷酸包含(或由下述组成)与SEQ ID NO：6的核酸序列具有至少70％的核苷酸序列同一性的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段。
在一个实施方案中，所述载体包含下述或由下述组成：
(i)第一分枝杆菌多核苷酸，其中所述第一分枝杆菌多核苷酸包含(或由下述组成)编码第一分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列，其中所述第一分枝杆菌抗原多肽包含(或由下述组成)与SEQ ID NO：7的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；和
(ii)第二分枝杆菌多核苷酸，其中所述第二分枝杆菌多核苷酸包含(或由下述组成)编码第二分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列，其中所述第二分枝杆菌抗原多肽包含(或由下述组成)与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段。
在一个实施方案中，所述第一分枝杆菌多核苷酸包含(或由下述组成)与SEQ ID NO：8的核酸序列具有至少70％的核苷酸序列同一性的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段。在一个实施方案中，所述第二分枝杆菌多核苷酸包含(或由下述组成)与SEQ ID NO：6的核酸序列具有至少70％的核苷酸序列同一性的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段。
在一个实施方案中，所述一种或多种载体包含如上文定义的所述另外的分枝杆菌抗原中的一种或多种。在一个实施方案中，所述另外的分枝杆菌抗原中的一种或多种包含如上文定义的多肽序列。在一个实施方案中，所述另外的分枝杆菌抗原中的一种或多种包含如上提出的多核苷酸序列。
在一个实施方案中，如果所述抗原组合物包含如本文定义的Rv0111多肽或多核苷酸抗原，和如本文定义的Rv0198多肽或多核苷酸抗原(例如，在相同或不同的载体中)，则所述抗原组合物(或所述载体)还不包含如本文定义的Rv3812多肽或多核苷酸抗原。
在一个实施方案中，上述关于包含第一和第二分枝杆菌抗原的抗原组合物所讨论的限制同等适用于包含一种或多种载体的抗原组合物，其中所述载体包含所述分枝杆菌抗原中的至少一种。
载体的实例包括DNA载体和RNA载体。术语‘载体’包括表达载体(其可以用于制备本发明的分枝杆菌抗原)和病毒载体(其可以用于复制和/或递送本发明的分枝杆菌抗原)。
载体任选地包括适当的控制序列，如启动子和/或终止子。用于这样的载体的表达控制序列是本领域技术人员已知的，并且可以取决于宿主细胞进行选择。常规载体成分的进一步讨论提供在说明书下文中。
在一个实施方案中，所述载体包含一种或多种编码所述一种或多种分枝杆菌抗原的多核苷酸序列。所述多核苷酸序列可以可操作性地连接到编码标签多肽的核酸序列上，以使在翻译时，所编码的标签与所述抗原共价连接。所述标签可以促进抗原表达的检测，或表达所述抗原的克隆的检测，和/或可以导致抗原功效的增加。
适当的标签多肽包括PK标签、FLAG标签、MYC标签、聚组氨酸标签或任意可检测的标签(例如，可以通过抗体如单克隆抗体检测的标签)。其他标签实例对于本领域技术人员将是清楚的。PK标签可以具有序列Pro-Asn-Pro-Leu-Gly-Leu-Asp(SEQ ID NO：33)。
编码所述标签多肽的核酸序列可以位于这样的位置，以使在翻译后，所述标签位于所表达的抗原的C-端。备选地，编码所述标签多肽的核酸序列可以位于这样的位置，以使在翻译后，所述标签位于所表达的抗原的N-端。备选地，编码所述标签多肽的核酸序列可以位于这样的位置，以使在翻译后，所述标签位于所表达的抗原的中间。
编码接头序列的核苷酸可以插入在编码所表达的抗原的多核苷酸和编码标签多肽的核酸序列之间。在一个实施方案中，所编码的接头序列位于所表达的抗原多肽和标签多肽之间。在一个实施方案中，接头序列编码氨基酸序列Gly-Ser-Ile。
在一个实施方案中，编码标签多肽的核酸序列和编码接头序列的核苷酸位于这样的位置，以使在翻译后，所述接头序列(例如，Gly-Ser-Ile)位于所表达的抗原的C-端，并且所述标签位于所表达的接头序列的C-端。
在一个实施方案中，所述载体包含一种或多种编码一种或多种分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列可操作性地连接在前导序列上。前导序列可以影响初级转录物到mRNA的加工，和/或可以影响mRNA的稳定性或翻译效率。在一个实施方案中，前导序列确保所编码的多肽抗原被导向宿主细胞的分泌机制。在一个实施方案中，前导序列增强抗原的表达和/或免疫原性。增强的免疫原性可以使用常规测定法确定，常规测定法诸如培养的或离体ELISPOT测定法。增强的表达可以通过常规测定法确定，诸如使用抗体(例如，单克隆抗体)来检测所产生的蛋白的量。在一个实施方案中，当与所表达的没有前导序列的抗原相比较时，存在前导序列使分枝杆菌抗原的表达和/或免疫原性增强2倍、3倍或更多倍。
一个适当的前导序列的实例是t-PA(组织纤溶酶原激活物)。
在一个实施方案中，所述载体包含融合在t-PA前导序列上的编码所述分枝杆菌抗原的C-端截短的多核苷酸。在一个实施方案中，所述载体包含融合在t-PA前导序列和PK标签序列上的编码所述分枝杆菌抗原的C-端截短的多核苷酸。例如，所述前导序列可以融合在编码所述抗原的多核苷酸的N-端，并且所述标签序列可以融合在编码所述抗原的多核苷酸的C-端。在一个实施方案中，接头序列(例如Gly-Ser-Ile)位于编码所述抗原的多核苷酸与编码所述标签的核酸序列之间。
在一个实施方案中，所述抗原组合物包含个体载体，其中所述载体包含所述第一分枝杆菌抗原和所述第二分枝杆菌抗原二者。在一个实施方案中，所述个体载体还包含所述另外的分枝杆菌抗原中的一种或多种。
在一个实施方案中，所述抗原组合物包含个体载体，其中所述载体包含所述第一分枝杆菌抗原和所述一种或多种另外的分枝杆菌抗原。在一个实施方案中，所述抗原组合物包含个体载体，其中所述载体包含所述第二分枝杆菌抗原和所述一种更多另外的分枝杆菌抗原。在一个实施方案中，所述抗原组合物包含个体载体，其中所述细胞包含所述一种或多种另外的分枝杆菌抗原。
在一个备选实施方案中，所述抗原组合物包含至少第一和第二载体，其中所述第一载体包含所述第一分枝杆菌抗原(如上文定义)和其中所述第二载体包含所述第二分枝杆菌抗原(如上文定义)。在这一实施方案中，第一和第二分枝杆菌抗原不存在于相同的载体中；相反，第一和第二分枝杆菌抗原存在于不同的载体中。
在一个实施方案中，所述抗原组合物还包含至少第三载体，其中所述第三载体包含(一种或多种)如上文定义的另外的分枝杆菌抗原。
在一个实施方案中，所述载体(或所述载体中的至少一种)是病毒载体。
病毒载体通常是不复制或复制-受损的载体，这意味着病毒载体在正常细胞(例如，正常的人细胞中)不能以任何显著的程度复制，如通过常规方法测量的----例如，通过测量DNA合成和/或病毒滴度。不复制或复制-受损的载体可以天然(即，其从自然中按原样分离)或人工地(例如，通过体外杂交或通过基因操作)变成这样。通常存在至少一种复制-受损的病毒载体可以在其中生长的细胞类型----例如，修饰的痘苗Ankara(MVA)可以在CEF细胞中生长。
典型地，所述病毒载体不能在动物受试者中、典型地在哺乳动物受试者如人、牛、猪或马病患中引起显著的感染。
可用于这种情形的病毒载体的实例包括减毒的痘苗病毒载体，如修饰的痘苗Ankara(MVA)和NYVAC，或来源于其的毒株。
其他适当的病毒载体包括痘病毒(poxvirus)载体，如鸟痘病毒(avipox)载体，例如，减毒的鸡痘(fowlpox)载体(例如，FP9)或金丝雀痘(canarypox)载体(例如，ALVAC和来源于其的毒株)。可用于本发明的备选的病毒载体包括腺病毒载体(例如，非人腺病毒载体)、甲病毒属(alphavirus)载体、黄病毒属(flavivirus)载体、疱疹病毒载体、流感病毒载体和反转录病毒载体。
在一个实施方案中，所述载体(或所述载体中的至少一种)是表达载体。
表达载体是包含一种或多种编码一种或多种目的多肽的多核苷酸序列的核酸分子(线性的或环形的)，所述编码一种或多种目的多肽的多核苷酸序列可操作性地与其表达所需要的另外的调节元件连接。
在这一方面，表达载体通常包括启动子和终止子序列，和任选地一种或多种增强子序列，多聚腺苷酸化信号等。表达载体还可以包括适当的翻译调节元件，其包括核糖体结合位点，和翻译起始和终止序列。用在本发明的表达载体中的转录和翻译调节元件在用于表达的宿主细胞中是有功能的，并且可以包括与分枝杆菌基因天然相关的那些。
适当的启动子、终止子、选择标记和其他元件的选择是在本领域普通技术人员水平之内的常规设计内容。
诸如trp、lac和噬菌体启动子、tRNA启动子和糖酵解酶启动子的启动子可以用在原核宿主中。可用的酵母启动子包括关于下述的启动子区域：金属硫蛋白、3-磷酸甘油激酶或其他糖酵解酶诸如烯醇化酶或甘油醛-3-磷酸脱氢酶、负责麦芽糖和半乳糖利用的酶以及其他。适当的非天然哺乳动物启动子可以包括来自SV40的早期和晚期启动子，或来源于鼠莫洛尼白血病病毒(murine moloney leukemia virus)、小鼠乳腺瘤病毒、鸟肉瘤病毒、腺病毒II、牛乳头状瘤病毒或多瘤病毒的启动子。在一个实施方案中，所述表达载体包含CMV启动子。
通常，“可操作性地连接”意指被连接的核酸序列是连续的并且这样排列，以使它们关于意欲的目的协同行使功能----例如，以启动子起始转录并且通过编码多核苷酸片段进行到终止子。在必须连接两个蛋白编码区的情形中，多核苷酸编码序列应该是连续的并且在阅读框中。
在一个实施方案中，本发明提供包含如上文定义的本发明的抗原组合物的宿主细胞。因此，所述宿主细胞包含本发明的第一分枝杆菌抗原和第二分枝杆菌抗原，其中所述分枝杆菌抗原可以包含如上文讨论的多肽和/或多核苷酸序列。
因此，在一个实施方案中，宿主细胞包含含有第一分枝杆菌抗原和第二分枝杆菌抗原的抗原组合物；其中所述第一分枝杆菌抗原包含：
(i)与选自SEQ ID NOs：1，3，5，7和56的潜伏期-调节多肽的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；或
(ii)编码(i)所述的多肽序列的多核苷酸序列；或与选自SEQ ID NOs：2，4，6，8和57的潜伏期-调节多核苷酸的核酸序列具有至少70％的核苷酸序列同一性的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段；
并且其中所述第二分枝杆菌抗原不同于所述第一分枝杆菌抗原。
在一个实施方案中，所述宿主细胞包含下述：
(i)第一分枝杆菌抗原多肽，其中所述第一分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：1或7的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；或
(ii)第一分枝杆菌多核苷酸，其中所述第一分枝杆菌多核苷酸包含编码所述第一分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列；
并且还包含：
(iii)第二分枝杆菌抗原多肽，其中所述第二分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；或
(iv)第二分枝杆菌多核苷酸，其中所述第二分枝杆菌多核苷酸包含编码所述第二分枝杆菌多肽的多核苷酸序列。
可以通过用标准的分子生物学方法(例如，Sambrook等人，1989，Molecular Cloning a Laboratory Manual(分子克隆实验室手册)，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York；通过引用结合于此)在相容的原核或真核宿主细胞中表达在载体或其他表达媒介(expression vehicles)中的本发明的多核苷酸序列而制备本发明的抗原组合物、多核苷酸或多肽。
尽管可以使用其他原核生物，如枯草芽孢杆菌(B.subtilis)或假单胞菌属(Pseudomonas)，但是最常用的原核宿主是大肠杆菌(E.coli)菌株。哺乳动物或其他原核宿主细胞，如酵母菌、丝状真菌、植物、昆虫、两栖动物或鸟类物种的那些也可以用于本发明。培养的哺乳动物细胞的增殖本身是总所周知的。常用的哺乳动物细胞系的实例是VERO和HeLa细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，和WI38，BHK和COS细胞系，尽管其他细胞系可以是适当的，例如，适当地提供更高的表达。
当用于本文时，“重组宿主细胞”、“宿主细胞”、“细胞”、“细胞系”、“细胞培养物”和表示作为单细胞实体培养的微生物或高等真核细胞系的其他这样的术语是指可以或已经用作重组载体或其他转移DNA的接纳体，并且包括已经转化的原始细胞的后代。应该理解，由于天然的、意外的或有意的突变，单个母体细胞的后代可以不必在形态或基因组或总DNA互补物(complement)方面与原始母体完全相同。
目的多核苷酸序列可以在体外转录，并且所得到的RNA被引入到宿主细胞中(例如，通过注射)，或者多核苷酸序列可以通过取决于细胞宿主类型而不同的方法被直接引入到宿主细胞中，所述方法包括电穿孔；利用氯化钙、氯化铷、磷酸钙、DEAE-葡聚糖或其他物质的转染；微粒轰击；脂质转染(lipofection)；感染(其中所述载体是感染试剂，如反转录病毒基因组)。“转化”是指将外源多核苷酸插入到宿主细胞中，与用于插入的方法无关，例如，直接摄入、转导、f-交配或电穿孔。
载体可以自主复制，或可以通过插入到宿主细胞的基因组中进行复制，在这种情形中，所述载体包含插入序列。
表达和克隆载体可以包含选择标记，即为编码用所述载体转化的宿主细胞存活或生长必需的蛋白的基因。所述基因确保仅表达插入物的那些宿主细胞生长。常规的选择基因编码下述蛋白：(a)赋予针对抗生素或其他毒性物质的抗性的蛋白，所述抗生素或其他毒性物质例如氨苄青霉素、新霉素、甲氨蝶呤等；(b)补充营养缺陷的蛋白；或(c)供应不能从复合培养基中获得的关键营养素的蛋白，例如，编码用于杆菌属(Bacilli)的D-丙氨酸消旋酶的基因。适当的选择标记的选择将取决于宿主细胞。
转化的宿主细胞可以按照已知方法培养，并且所表达的多肽可以用常规流程回收和分离(例如，从培养基中)。
在一个方面中，本发明提供用于制备包含(至少)如上文定义的第一分枝杆菌抗原和第二分枝杆菌抗原的抗原组合物的方法；所述方法包括下述：
(a)表达如上文定义的编码所述至少第一和第二分枝杆菌抗原的多核苷酸序列；或
(b)培养如上文定义的宿主细胞，由此所述细胞产生所述至少第一和第二分枝杆菌抗原；
并且回收所表达的抗原。
在一个实施方案中，上述关于包含第一和第二分枝杆菌抗原的抗原组合物所讨论的限制同等适用于上述用于制备包含至少第一和第二分枝杆菌抗原的抗原组合物的方法。
本发明还涉及结合如上文定义的第一分枝杆菌抗原(例如多肽)和如上文定义的第二分枝杆菌抗原(例如多肽)的抗体。
因此，在一个实施方案中，本发明提供包含第一抗体和第二抗体的免疫原性组合物，其中所述第一抗体结合第一分枝杆菌抗原，并且所述第二抗体结合第二分枝杆菌抗原；
其中所述第一分枝杆菌抗原包含：
(i)与选自SEQ ID NOs：1，3，5，7和56的潜伏期-调节多肽的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；或
(ii)编码(i)所述的多肽序列的多核苷酸序列；或与选自SEQ ID NOs：2，4，6，8和57的潜伏期-调节多核苷酸的核酸序列具有至少70％的核苷酸序列同一性的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段；
并且其中所述第二分枝杆菌抗原不同于所述第一分枝杆菌抗原。
在一个实施方案中，所述第一分枝杆菌抗原包含本发明的抗原多肽或由本发明的抗原多肽组成，诸如如本文定义的Rv0111多肽抗原或Rv3812多肽抗原。
在一个实施方案中，所述第二分枝杆菌抗原包含本发明的抗原多肽或由本发明的抗原多肽组成，诸如如本文定义的Rv0198多肽抗原。
在一个实施方案中，所述免疫原性组合物包含第一抗体和第二抗体，其中所述第一抗体结合第一分枝杆菌抗原多肽，并且所述第二抗体结合第二分枝杆菌抗原多肽；
其中所述第一分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；并且
其中所述第二分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段。
在一个实施方案中，所述免疫原性组合物包含第一抗体和第二抗体，其中所述第一抗体结合第一分枝杆菌抗原多肽，并且所述第二抗体结合第二分枝杆菌抗原多肽；
其中所述第一分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：7的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；并且
其中所述第二分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段。
任选地，所述免疫原性组合物还包含至少第三抗体(例如至少3，4，5，6，7，8种另外的抗体)，其中所述第三抗体结合与第一和第二分枝杆菌抗原不同的第三分枝杆菌抗原。
在一个实施方案中，如果所述免疫原性组合物包含(i)结合如本文定义的Rv0111抗原(例如，包括下述或由下述组成：与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段)的抗体；和(ii)结合如本文定义的Rv0198抗原(例如，包括下述或由下述组成：与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段)的抗体；则所述组合物不包含结合如本文定义的Rv3812抗原(例如，包括下述或由下述组成：与SEQ ID NO：7的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段)的抗体。
在一个实施方案中，上述关于包含至少第一和第二分枝杆菌抗原的抗原组合物所讨论的限制同等适用于上述抗原组合物的至少第一和第二抗体所结合的分枝杆菌抗原。
术语‘抗体’包括包含抗原结合片段或抗原-结合结构域的任何多肽。实例包括，但不限于，多克隆、单克隆、特异性、单特异性、多特异性、非特异性、人源化的、人的、单链、嵌合的、合成的、重组的、杂化的、突变的、嫁接的、和体外产生的抗体。
除非前面有词语“完整的”，术语“抗体”包括抗体片段，如Fab，F(ab′)2，Fv，scFv，Fd，dAb，和其他保留抗原结合功能的抗体片段。
在一个实施方案中，抗体属于IgG、IgM或IgA同种型家族。对IgA同种型的引用包括该抗体的分泌形式(即sIgA)。sIgA的分泌成分(SC)可以在体外或体内添加。在后一种情形中，可以利用母体天然SC标记机制的应用。
在一个实施方案中，所述抗体特异性结合所讨论的分枝杆菌抗原。“特异性结合”意欲指在生理条件下在两种以上的分子中形成相对稳定的复合物。特异性结合特征在于高亲和力和低至中等的能力，如与通常具有低亲和力和中等至高等的能力的非特异性结合区分。典型地，当缔合常数KA高于106M 1时，认为抗体与抗原之间的结合是特异性的。如果必要，可以通过改变结合条件而在基本上不影响特异性结合的情况下减少非特异性结合。
技术人员可以用常规技术最优化适当的结合条件，如抗体浓度、溶液的离子强度、温度、允许结合的时间、阻断剂(例如，血清白蛋白、乳酪蛋白)的浓度等。
在一个实施方案中，所述第一和第二抗体已经分别针对如本文所述的本发明的第一和第二分枝杆菌抗原产生。在一个实施方案中，所述第一和第二抗体已经分别针对如本文所述的本发明的第一和第二分枝杆菌抗原多肽产生。
在一个实施方案中，本发明提供由已经用本发明的抗原组合物免疫的动物分离的抗血清。当用于本文时，术语‘抗血清’是指血清中针对特定抗原具有可检测的结合(例如，通过ELISA或流式细胞术检测)的抗体。
用于制备免疫血清的方法在本领域中是已知的。例如，可以将本发明的第一和第二抗体(以及任选的另外的抗体)，或本发明的免疫原性组合物施用给动物(如哺乳动物----例如，马或人)，直到产生针对第一和第二分枝杆菌抗原的抗体应答(例如，中和抗体应答)。
通过杂交瘤制备单克隆抗体的通用方法包括，例如，通过细胞融合制备永生的产生抗体的细胞系，或可以使用其他技术，如用癌基因DNA直接转化B淋巴细胞，或用埃-巴病毒(Epstein-Barr virus)转染。
针对本文公开的抗原片段(例如，多肽片段)产生的抗体可以具有识别它们所衍生的全长抗原(例如，全长多肽)的特性。在这一方面，多肽片段携带可通过常规免疫测定法检测的抗原决定簇。本发明的全长抗原与其片段共有一种或多种抗原决定簇，因此针对抗原片段产生的抗体也可以结合相对应的本发明的全长抗原。
在一个实施方案中，抗体以分离的形式提供。
抗体可以用可检测的或功能性标记进行标记。这些标记包括放射性标记(例如，131I或99Tc)、酶标记(例如，辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶)、和其他化学结构部分(例如，生物素)。
当在暴露于分枝杆菌如结核分枝杆菌之前或之后立即施用给哺乳动物如人时，上述抗体可以提供提高的存活。因此，本发明的第一和第二抗体(和任选地另外的抗体)(或本发明的免疫原性的包含抗体的组合物)可以用作被动免疫血清来防止分枝杆菌感染，或者治疗暴露于分枝杆菌(如结核分枝杆菌)的患者。
在一个实施方案中，抗体与本发明的分枝杆菌抗原的结合可以起始表达所述抗原的分枝杆菌的包被。分枝杆菌的包被优选地导致其调理作用(opsonization)，这导致细菌被破坏。抗体的调理作用可以通过防止或调节受体-介导的进入和在巨噬细胞中的复制而影响吞噬细胞和非吞噬细胞中的分枝杆菌的细胞进入和扩散。
不被任何理论束缚，可能的是，在分枝杆菌感染巨噬细胞后，巨噬细胞被杀死，并且杆菌被释放。认为分枝杆菌在这一阶段是最容易受抗体攻击的。因此，可能的是，本发明的抗体在巨噬细胞死亡之后作用于释放的杆菌，由此发挥感染后的作用。
可能的是，通过增强本发明的抗体对分枝杆菌属杆菌上的抗原的可及性来促进本发明的被动保护方面(即，抗体递送)。还可能的是，抗体结合可能通过其寡聚结构的空间位阻或破坏来阻断巨噬细胞感染。因此，作用在从杀死的、感染的巨噬细胞释放的分枝杆菌属杆菌上的抗体可以妨碍对新巨噬细胞的再感染的扩散。这一假说包括在抗体与在感染后早期作用的细胞毒性T细胞(例如NK T细胞)之间的协同作用，但是可能后来还包括CD8和CD4细胞毒性T细胞。
在另一个实施方案中，本发明的包含抗体(例如单克隆抗体)的组合物可以用于产生抗-独特型抗体(anti-idiotype antibodies)。抗-独特型抗体是携带针对其的保护是携带感染性分枝杆菌试剂的抗原的“内部图像”的免疫球蛋白。这些抗-独特型抗体还可以用于治疗、接种和/或诊断分枝杆菌感染。
本发明的第一和第二分枝杆菌抗原刺激针对分枝杆菌如结核分枝杆菌的免疫应答。
在下文讨论的治疗应用和方法的情形中，‘受试者’是将受益于针对分枝杆菌如结核分枝杆菌的免疫应答的刺激的任何动物受试者。典型的动物受试者是哺乳动物，例如，人，牛，猪，绵羊、山羊，马，鸦(corvine)，犬或猫科受试者。在一个实施方案中，所述受试者是人、牛、猪或马。
按照本发明的一个方面，提供第一分枝杆菌抗原和第二分枝杆菌抗原用于制备用于在受试者如哺乳动物受试者(例如，人、牛、猪或马受试者)中刺激免疫应答的药物的应用；其中所述第一分枝杆菌抗原包含：
(i)与选自SEQ ID NOs：1，3，5，7和56的潜伏期-调节多肽的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；或
(ii)编码(i)所述的多肽序列的多核苷酸序列；与选自SEQ ID NOs：2，4，6，8和57的潜伏期-调节多核苷酸的核酸序列具有至少70％的核苷酸序列同一性的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段；
并且其中所述第二分枝杆菌抗原不同于所述第一分枝杆菌抗原。
本发明还提供用于在受试者如哺乳动物受试者(例如，人、牛、猪或马受试者)中刺激免疫应答的第一分枝杆菌抗原和第二分枝杆菌抗原；其中所述第一分枝杆菌抗原包含：
(i)与选自SEQ ID NOs：1，3，5，7和56的潜伏期-调节多肽的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；或
(ii)编码(i)所述的多肽序列的多核苷酸序列；或与选自SEQ ID NOs：2，4，6，8和57的潜伏期-调节多核苷酸的核酸序列具有至少70％的核苷酸序列同一性的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段；
并且其中所述第二分枝杆菌抗原不同于所述第一分枝杆菌抗原。
在一个实施方案中，所述第二分枝杆菌抗原包含下述或由下述组成：分枝杆菌抗原多肽或多核苷酸序列，如(i)或(ii)中定义的分枝杆菌抗原多肽或多核苷酸序列(其中所述第二分枝杆菌抗原不同于所述第一分枝杆菌抗原)。
在一个实施方案中，本发明提供：(a)第一分枝杆菌抗原多肽或第一分枝杆菌多核苷酸，和(b)第二分枝杆菌抗原多肽或第二分枝杆菌多核苷酸，其用于在受试者中刺激免疫应答；其中
(i)所述第一分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；
(ii)所述第一分枝杆菌多核苷酸序列包含编码所述第一分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列；
(iii)所述第二分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；并且
(iv)所述第二分枝杆菌多核苷酸序列包含编码所述第二分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列。
在一个实施方案中，所述第一分枝杆菌多核苷酸包含与SEQ ID NO：2的核酸序列具有至少70％的核苷酸序列同一性的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段。在一个实施方案中，所述第二分枝杆菌多核苷酸包含与SEQ ID NO：6的核酸序列具有至少70％的核苷酸序列同一性的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段。
在一个实施方案中，本发明提供：(a)第一分枝杆菌抗原多肽或第一分枝杆菌多核苷酸，和(b)第二分枝杆菌抗原多肽或第二分枝杆菌多核苷酸，其用于在受试者中刺激免疫应答；其中
(i)所述第一分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：7的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；
(ii)所述第一分枝杆菌多核苷酸序列包含编码所述第一分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列；
(iii)所述第二分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；和
(iv)所述第二分枝杆菌多核苷酸序列包含编码所述第二分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列。
在一个实施方案中，所述第一分枝杆菌多核苷酸包含与SEQ ID NO：8的核酸序列具有至少70％的核苷酸序列同一性的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段。在一个实施方案中，所述第二分枝杆菌多核苷酸包含与SEQ ID NO：6的核酸序列具有至少70％的核苷酸序列同一性的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段。
在一个实施方案中，免疫刺激通过在体内存活测定法中的保护性作用来测量。在一个实施方案中，免疫刺激通过针对疫苗中的抗原特异性的免疫细胞如T淋巴细胞中增加的频率----即，免疫细胞应答(例如，T细胞免疫应答)来测量。在一个实施方案中，免疫刺激是记忆T细胞免疫应答，如中心记忆T细胞应答(例如CCR7+应答)。在一个实施方案中，免疫刺激通过针对疫苗中的抗原特异性的抗体滴度的增加来测量。
在一个实施方案中，所述药物还包含一种或多种如本文所述的另外的分枝杆菌抗原。在一个实施方案中，一种或多种如本文所述的另外的分枝杆菌抗原还与所述第一和第二分枝杆菌抗原一起应用。在一个实施方案中，如果所述第一分枝杆菌抗原包含或由Rv0111抗原(如本文定义)组成，并且如果所述第二分枝杆菌抗原包含或由Rv1098抗原(如本文定义)组成，则所述一种或多种另外的分枝杆菌抗原不包含或不由Rv3812抗原(如本文定义)组成。
在这种治疗性应用的一个实施方案中，所述第一和第二(以及任选的一种或多种另外的分枝杆菌抗原)以本文所述的抗原组合物的形式提供。在一个实施方案中，所述第一、第二和/或任选的另外的分枝杆菌抗原中的一种或多种可以包含在本文所述的一种或多种载体或细胞中。
在这种治疗性应用的一个实施方案中，本文关于所述第一和/或第二分枝杆菌抗原(以及任选的另外的分枝杆菌抗原)所述的任何限制同等适用于其治疗性应用。
在这种治疗性应用的一个实施方案中，所述第一和/或第二分枝杆菌抗原(以及任选的一种或多种另外的分枝杆菌抗原)基本上同时、或顺次施用给受试者。同时或顺次施用方案在下文更详细地讨论。
本发明还提供第一分枝杆菌抗原和第二分枝杆菌抗原用于制备用于治疗或预防受试者如哺乳动物受试者(例如，人、牛、猪或马受试者)中的分枝杆菌感染(如结核分枝杆菌感染)的药用的应用，其中所述第一分枝杆菌抗原包含：
(i)与选自SEQ ID NOs：1，3，5，7和56的潜伏期-调节多肽的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；或
(ii)编码根据(i)所述的多肽序列的多核苷酸序列；或与选自SEQ IDNOs：2，4，6，8和57的潜伏期-调节多核苷酸的核酸序列具有至少70％的核苷酸序列同一性的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段；
并且其中所述第二分枝杆菌抗原不同于所述第一分枝杆菌抗原。
本发明还提供用于治疗或预防受试者如哺乳动物受试者(例如，人、牛、猪或马受试者)中的分枝杆菌感染(如结核分枝杆菌感染)的第一分枝杆菌抗原和第二分枝杆菌抗原；其中所述第一分枝杆菌抗原包含：
(i)与选自SEQ ID NOs：1，3，5，7和56的潜伏期-调节多肽的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；或
(ii)编码(i)所述的多肽序列的多核苷酸序列；或与选自SEQ ID NOs：2，4，6，8和57的潜伏期-调节多核苷酸的核酸序列具有至少70％的核苷酸序列同一性的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段；
并且其中所述第二分枝杆菌抗原不同于所述第一分枝杆菌抗原。
在一个实施方案中，所述第二分枝杆菌抗原包含下述或由下述组成：分枝杆菌抗原多肽或多核苷酸序列，如(i)或(ii)中定义的分枝杆菌抗原多肽或多核苷酸序列(其中所述第二分枝杆菌抗原不同于所述第一分枝杆菌抗原)。
在一个实施方案中，本发明提供：(a)第一分枝杆菌抗原多肽或第一分枝杆菌多核苷酸，和(b)第二分枝杆菌抗原多肽或第二分枝杆菌多核苷酸，其用于治疗或预防受试者中的分枝杆菌感染(例如结核分枝杆菌感染)其中：
(i)所述第一分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：1或7的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；
(ii)所述第一分枝杆菌多核苷酸序列包含编码所述第一分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列；
(iii)所述第二分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；并且
(iv)所述第二分枝杆菌多核苷酸序列包含编码所述第二分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列。
在一个实施方案中，所述第一分枝杆菌多核苷酸包含与SEQ ID NO：2或8的核酸序列具有至少70％的核苷酸序列同一性的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段。在一个实施方案中，所述第二分枝杆菌多核苷酸包含与SEQ ID NO：6的核酸序列具有至少70％的核苷酸序列同一性的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段。
例如，所述应用或药物可以保护受试者不被分枝杆菌如结核分枝杆菌感染。例如，所述应用或药物可以用于治疗受试者中的TB，典型地哺乳动物受试者如人、牛、猪或马受试者。
在一个实施方案中，所述应用或药物可以保护受试者抗分枝杆菌如结核分枝杆菌的早期感染。术语‘早期感染’是指感染后的开始期，在该时期内，分枝杆菌在肺中增殖，已经克服了宿主受试者的先天性抵御(非特异性免疫系统)。在早期感染过程中，分枝杆菌增殖刺激被感染的受试者中增加的免疫应答。受试者的免疫系统尝试控制细菌的生长，以使其可能被减缓，被限制在肉芽肿(granuloma)内，然后以持续的低水平消退。向其他器官如脾的传播可以在该时期发生。在人中发生早期感染的时期没有明确的定义；然而，在诸如豚鼠的实验模型中，这一时期为约3-4周。
因此，早期感染不同于潜伏期感染。在潜伏期感染过程中，由于存在持续成功的免疫应答，分枝杆菌的水平以低水平保持在肉芽肿内，在其中分枝杆菌可能表现出‘休眠’(另外已知为‘无复制性持续’)。
在一个实施方案中，所述药物还包含一种或多种如本文所述的另外的分枝杆菌抗原。在一个实施方案中，一种或多种如本文所述的另外的分枝杆菌抗原还与所述第一和第二分枝杆菌抗原一起使用。在一个实施方案中，如果所述第一分枝杆菌抗原包含或由下述组成：Rv0111抗原(如本文定义)，并且如果所述第二分枝杆菌抗原包含或由下述组成：Rv1098抗原(如本文定义)，则所述一种或多种另外的分枝杆菌抗原不包含或不由下述组成：Rv3812抗原(如本文定义)。
在这种治疗性应用的一个实施方案中，所述第一和第二(以及任选的一种或多种另外的分枝杆菌抗原)以本文所述的抗原组合物的形式提供。在一个实施方案中，所述第一、第二和/或任选地另外的分枝杆菌抗原中的一种或多种可以包含在如本文所述的一种或多种载体或细胞中。
在这种治疗性应用的一个实施方案中，本文关于所述第一和/或第二分枝杆菌抗原(和/或任选的另外的分枝杆菌抗原)所述的任何限制同等适用于其治疗性应用。
在这种治疗性应用的一个实施方案中，所述第一和第二分枝杆菌抗原(和任选的一种或多种另外的分枝杆菌抗原)基本上同时、或顺次施用给受试者。同时或顺次施用方案在下文更详细地讨论。
一个相关的方面包括用于在受试者中刺激免疫应答的方法，所述方法包括给受试者如哺乳动物(例如，人、牛、猪或马受试者)施用有效量的第一分枝杆菌抗原和第二分枝杆菌抗原；
其中所述第一分枝杆菌抗原包含：
(i)与选自SEQ ID NOs：1，3，5，7和56的潜伏期-调节多肽的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；或
(ii)编码根据(i)所述的多肽序列的多核苷酸序列；或与选自SEQ IDNOs：2，4，6，8和57的潜伏期-调节多核苷酸的核酸序列具有至少70％的核苷酸序列同一性的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段；
并且其中所述第二分枝杆菌抗原不同于所述第一分枝杆菌抗原。
在一个实施方案中，所述第二分枝杆菌抗原包含下述或由下述组成：分枝杆菌抗原多肽或多核苷酸序列，如(i)或(ii)中定义的分枝杆菌抗原多肽或多核苷酸序列(其中所述第二分枝杆菌抗原不同于所述第一分枝杆菌抗原)。
在一个实施方案中，本发明提供用于在受试者中刺激免疫应答的方法，所述方法包括给所述受试者施用下述：(a)第一分枝杆菌抗原多肽或第一分枝杆菌多核苷酸，和(b)第二分枝杆菌抗原多肽或第二分枝杆菌多核苷酸；其中：
(i)所述第一分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：1或7的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；
(ii)所述第一分枝杆菌多核苷酸包含编码所述第一分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列；
(iii)所述第二分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；并且
(iv)所述第二分枝杆菌多核苷酸包含编码所述第二分枝杆菌多肽的多核苷酸序列。
在一个实施方案中，免疫刺激通过在体内存活测定法中的保护性作用来测量。在一个实施方案中，免疫刺激通过针对疫苗中的抗原特异性的免疫细胞如T淋巴细胞中增加的频率----即，免疫细胞应答(例如，T细胞免疫应答)来测量。在一个实施方案中，免疫刺激是记忆T细胞免疫应答，如中心记忆T细胞应答(例如CCR7+应答)。在一个实施方案中，免疫刺激通过针对疫苗中的抗原特异性的抗体滴度的增加来测量。
在一个实施方案中，所述方法还包括施用一种或多种本文所述的另外的分枝杆菌抗原。在一个实施方案中，如果所述第一分枝杆菌抗原包含或由Rv0111抗原(如本文定义)组成，并且如果所述第二分枝杆菌抗原包含或由Rv1098抗原(如本文定义)组成，则所述一种或多种另外的分枝杆菌抗原不包含或不由Rv3812抗原(如本文定义)组成。
在这种治疗方法的一个实施方案中，所述第一和第二(以及任选的一种或多种另外的分枝杆菌抗原)以本文所述的抗原组合物的形式提供。在一个实施方案中，所述第一、第二和/或任选的另外的分枝杆菌抗原中的一种或多种可以包含在本文所述的一种或多种载体或细胞中。
在这种治疗方法的一个实施方案中，本文关于所述第一和/或第二分枝杆菌抗原(和/或任选的另外的分枝杆菌抗原)所述的任何限制同等适用于其治疗性应用。
在一个实施方案中，所述方法包括基本上同时、或顺次给受试者施用所述第一和第二分枝杆菌抗原。同时和顺次施用方案在下文更详细地讨论。
在一个相关的方面中，提供一种治疗或预防分枝杆菌感染(例如，结核分枝杆菌感染)的方法，所述方法包括给受试者如哺乳动物(例如，人、牛、猪或马受试者)施用有效量的第一分枝杆菌抗原和第二分枝杆菌抗原；
其中所述第一分枝杆菌抗原包含：
(i)与选自SEQ ID NOs：1，3，5，7和56的潜伏期-调节多肽的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；或
(ii)编码根据(i)所述的多肽序列的多核苷酸序列；或与选自SEQ IDNOs：2，4，6，8和57的潜伏期-调节多核苷酸的核酸序列具有至少70％的核苷酸序列同一性的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段；
并且其中所述第二分枝杆菌抗原不同于所述第一分枝杆菌抗原。
在一个实施方案中，所述第二分枝杆菌抗原包含下述或由下述组成：分枝杆菌抗原多肽或多核苷酸序列，如(i)或(ii)中定义的分枝杆菌抗原多肽或多核苷酸序列(其中所述第二分枝杆菌抗原不同于所述第一分枝杆菌抗原)。
在一个实施方案中，本发明提供一种治疗或预防受试者中的分枝杆菌感染(例如，结核分枝杆菌感染)的方法；所述方法包括给所述受试者施用下述：(a)第一分枝杆菌抗原多肽或第一分枝杆菌多核苷酸，和(b)第二分枝杆菌抗原多肽或第二分枝杆菌多核苷酸；其中：
(i)所述第一分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：1或7的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；
(ii)所述第一分枝杆菌多核苷酸包含编码所述第一分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列；
(iii)所述第二分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；并且
(iv)所述第二分枝杆菌多核苷酸包含编码所述第二分枝杆菌多肽的多核苷酸序列。
例如，所述方法可以保护受试者不被分枝杆菌如结核分枝杆菌感染。例如，所述方法可以治疗受试者中的TB。在一个实施方案中，所述方法可以保护受试者抗分枝杆菌如结核分枝杆菌的早期感染。早期分枝杆菌感染如上文定义。
在一个实施方案中，所述方法还包括施用一种或多种如本文所述的另外的分枝杆菌抗原。在一个实施方案中，如果所述第一分枝杆菌抗原包含或由Rv0111抗原(如本文定义)组成，并且如果所述第二分枝杆菌抗原包含或由Rv1098抗原(如本文定义)组成，则所述一种或多种另外的分枝杆菌抗原不包括或不由Rv3812抗原(如本文定义)组成。
在这种治疗方法的一个实施方案中，所述第一和第二(以及任选的一种或多种另外的分枝杆菌抗原)以本文所述的抗原组合物的形式提供。在一个实施方案中，所述第一、第二和/或任选地另外的分枝杆菌抗原中的一种或多种可以包含在如本文所述的一种或多种载体或细胞中。
在这种治疗方法的一个实施方案中，本文关于所述第一和/或第二分枝杆菌抗原(和/或任选的另外的分枝杆菌抗原)所述的任何限制同等适用于其治疗性应用。
在一个实施方案中，所述方法包括向所述受试者基本上同时、或顺次施用所述第一和第二分枝杆菌抗原。同时和顺次施用方案在下文更详细地讨论。
本发明的第一和第二抗体还可用于刺激针对分枝杆菌如结核分枝杆菌的免疫应答。
因此，本发明还提供涉及第一抗体和第二抗体的治疗性应用和方法，其中所述第一抗体结合第一分枝杆菌抗原，并且所述第二抗体结合第二分枝杆菌抗原；
其中所述第一分枝杆菌抗原包含：
(i)与选自SEQ ID NOs：1，3，5，7和56的潜伏期-调节多肽的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；或
(ii)编码根据(i)所述的多肽序列的多核苷酸序列；或与选自SEQ IDNOs：2，4，6，8和57的潜伏期-调节多核苷酸的核酸序列具有至少70％的核苷酸序列同一性的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段；
并且其中所述第二分枝杆菌抗原不同于所述第一分枝杆菌抗原。
在一个实施方案中，所述第一分枝杆菌抗原包含下述或由下述组成：如(i)中定义的分枝杆菌抗原多肽序列。在一个实施方案中，所述第二分枝杆菌抗原包含下述或由下述组成：分枝杆菌抗原多肽序列，诸如如(i)中定义的分枝杆菌抗原多肽序列(其中所述第二分枝杆菌抗原不同于所述第一分枝杆菌抗原)。
在一个实施方案中，所述第一抗体和第二抗体以如本文所述的免疫原性的包含抗体的组合物的形式、或制剂形式提供。
例如，本发明提供本发明的第一和第二抗体(例如，以本发明的免疫原性的包含抗体的组合物的形式)用于制备用于在受试者(典型地为哺乳动物----例如，人、牛、猪或马受试者)中刺激免疫应答的药物的应用；或用于制备用于治疗或预防受试者(诸如哺乳动物----例如，人、牛、猪或马受试者)中的分枝杆菌感染(例如TB)或怀疑的感染的药物的应用。
本发明还提供本发明的第一和第二抗体(例如，以本发明的免疫原性的包含抗体的组合物的形式)，其用于在受试者(典型地为哺乳动物----例如，人、牛、猪或马受试者)中刺激免疫应答；或用于制备治疗或预防受试者(诸如哺乳动物----例如，人、牛、猪或马受试者)中的分枝杆菌感染(例如TB)或怀疑的感染的药物的应用。
在一个实施方案中，本发明提供第一抗体和第二抗体，其用于在受试者中刺激免疫应答；
其中所述第一抗体结合第一分枝杆菌抗原多肽，其中所述第一分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：1或7的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；并且
其中所述第二抗体结合第二分枝杆菌抗原多肽，其中所述第二分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段。
本发明还提供用于在受试者(诸如哺乳动物----例如，人、牛、猪或马受试者)中刺激免疫应答或用于治疗或预防受试者(诸如哺乳动物----例如，人、牛、猪或马受试者)中的分枝杆菌感染(例如结核分枝杆菌感染，TB)的方法，所述方法包括给所述受试者(感染前或感染后)施用本发明的第一和第二抗体(以及任选地另外的抗体)(例如，以本发明的免疫原性的包含抗体的组合物的形式)。
在一个实施方案中，本发明提供在受试者中刺激免疫应答的方法，所述方法包括给所述受试者施用下述：
(a)第一抗体，其中所述第一抗体结合第一分枝杆菌抗原多肽；其中所述第一分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：1或7的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；并且
(b)第二抗体，其中所述第二抗体结合第二分枝杆菌抗原多肽；其中所述第二分枝杆菌抗原包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段。
在所述应用和方法的一个实施方案中，所述第一抗体和第二抗体以本文所述的免疫原性的包含抗体的组合物或制剂的形式提供。
在一个实施方案中，所述应用或方法还包括施用如本文所述的结合一种或多种另外的分枝杆菌抗原的一种或多种另外的抗体。在一个实施方案中，如果所述第一抗体结合包含或由Rv0111抗原(如本文定义)组成的第一分枝杆菌抗原，并且如果所述第二抗体结合包含或由Rv1098抗原(如本文定义)组成的第二分枝杆菌抗原，则所述一种或多种另外的抗体不结合包含或由Rv3812抗原(如本文定义)组成的分枝杆菌抗原。
在一个实施方案中，本文关于所述第一和/或第二抗体(和/或所述抗体所结合的抗原)所述的任何限制同等适用于其治疗方法和应用。
所述方法或应用可以用于同时或顺次施用所述第一和第二抗体(和/或任选地另外的抗体)。在一个实施方案中，第一和第二分枝杆菌抗体用于基本上同时或顺次施用给受试者。同时和顺次施用方案在下文更详细地讨论。
在一个实施方案中，所述应用或方法可以保护受试者抗分枝杆菌如结核分枝杆菌的早期感染。早期分枝杆菌感染如上文定义。
在一个相关的方面中，如本文定义的本发明的第一和第二(以及任选的另外的)分枝杆菌抗原、抗原组合物、抗体、免疫原性组合物或药物可以用于一定范围的分枝杆菌疾病的治疗(包括预防性治疗)，所述分枝杆菌疾病不限于结核病(TB)，麻风病(leprosy)，鸟分枝杆菌感染，牛分枝杆菌感染，副结核分枝杆菌感染，溃疡分枝杆菌感染(例如布路里溃疡(Buruli ulcer))，或其他非结核分枝杆菌感染。
本发明的第一和第二(以及任选的另外的)分枝杆菌抗原、抗原组合物、抗体、免疫原性组合物或药物可以用于诱导一定范围的免疫应答，并且因此可以用于治疗一定范围的疾病的方法。
在一个实施方案中，本发明的第一和第二(以及任选的另外的)分枝杆菌抗原、抗原组合物或药物可用于治疗或预防其中涉及分枝杆菌的一定范围的非-分枝杆菌疾病。例如，可以受益于本发明的药物的疾病包括炎性疾病，如自身免疫疾病，癌症(例如，膀胱癌)，炎性肠病，局限性肠炎(Crohn’s Disease)，约尼病，麻风病(Hansen’s Disease)，骨髓炎(osteomyelitis)，淋巴结炎(lymphadenitis)，天花(smallpox)或猴痘(monkeypox)。
当用于本文时，术语“治疗”(“treatment”或“treating”)包括治疗性或防止性/预防性措施，并且包括分枝杆菌感染的感染后治疗和改善。
当用于本文时，术语“预防”包括防止分枝杆菌感染的起始和/或减少分枝杆菌感染的严重性或强度。
在一个实施方案中，本发明的抗原组合物或药物包含代表不同的分枝杆菌感染状态(例如，潜伏期、再激活或活动性感染)的分枝杆菌抗原。在一个实施方案中，本发明的抗原组合物或药物包含至少一种在潜伏期过程中表达的分枝杆菌抗原和至少一种在潜伏期过程中下调的分枝杆菌抗原。
因此，这种抗原的混合物可用于预防和/或治疗多个分枝杆菌感染，原因在于所述抗原在受试者中激发针对不同疾病阶段(例如，分枝杆菌疾病的早期，潜伏期，再激活或急性期)的反应。
当用于本文时，术语“疫苗功效”描述疫苗保护受试者(典型地为哺乳动物受试者，例如，人、牛、猪或马受试者)免受分枝杆菌如结核分枝杆菌的攻击的能力。例如，“疫苗功效”可以指疫苗预防分枝杆菌感染的起始和/或减小分枝杆菌感染的严重性/强度的功效。
治疗性/预防性组合物或药物可以施用给已经具有分枝杆菌感染、与分枝杆菌感染相关的状况或症状的受试者(典型地为哺乳动物受试者，例如，人、牛、猪或马受试者)，从而治疗或预防所述分枝杆菌感染。在一个实施方案中，所述受试者怀疑已经接触了分枝杆菌，或已经知道接触了分枝杆菌，但是还没有表现出暴露的症状。在一个实施方案中，所述受试者具有早期感染。
当施用给已经具有分枝杆菌感染或疾病、或正表现出与分枝杆菌感染相关的症状的受试者(例如，哺乳动物，如人、牛、猪或马受试者)时，所述治疗性组合物/药物可以治愈、延缓、降低受试者的严重性或改善一种或多种症状，和/或使受试者的存活延长超过在不存在所述治疗时预测的存活。
备选地，治疗性/预防性组合物或药物可以施用给最终可能获得分枝杆菌感染的受试者(例如，哺乳动物如人、牛、猪、或马受试者)，从而预防、治愈、延缓、降低所述分枝杆菌感染的严重性或改善其一种或多种症状，或使受试者的存活延长超过在不存在所述治疗时预测的存活。
在一个实施方案中，所述受试者先前暴露于分枝杆菌。例如，所述受试者可能在过去具有过分枝杆菌感染(但是任选地目前没有感染分枝杆菌)。所述受试者可以潜伏地感染分枝杆菌。备选地，或另外，所述受试者已经在过去针对分枝杆菌感染进行过接种(例如，所述受试者先前接收过BCG接种)。
本发明的治疗和预防性治疗适用于各种不同年龄的不同受试者。在人类的情形中，所述治疗适用于儿童(例如，婴儿、5岁以下的儿童、较大的儿童或青少年)和成人。在其他动物受试者的情形中(例如，哺乳动物，诸如牛、猪或马受试者)，所述治疗适用于不成熟的受试者(例如，小牛、小猪、驹)和成熟的/成体受试者。本发明的治疗和预防性治疗适用于免疫损害或免疫抑制的受试者(例如，患有HIV或AIDS的人类受试者，或患有相当的免疫缺陷性疾病的其他动物病患)，已经进行了器官移植、骨髓移植的受试者，或具有遗传免疫缺陷的受试者。
本发明提供了治疗性制剂、药物和预防性制剂(例如，疫苗)，其包含药用载体，如上文定义的本发明的第一分枝杆菌抗原，如上文定义的本发明的第二分枝杆菌抗原(以及任选地，如上文所述的一种或多种本发明的另外的分枝杆菌抗原)。
在一个实施方案中，本发明提供一种治疗性或预防性的制剂(例如，疫苗)，所述制剂包含药用载体和：
(a)第一分枝杆菌抗原，其中所述第一分枝杆菌抗原包含：
(i)与选自SEQ ID NOs：1，3，5，7和56的潜伏期-调节多肽的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；或
(ii)编码(i)所述的多肽序列的多核苷酸序列，或与选自SEQ IDNOs：2，4，6，8和57的潜伏期-调节多核苷酸的核酸序列具有至少70％的核苷酸序列同一性的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段；
以及
(b)第二分枝杆菌抗原，其中所述第二分枝杆菌抗原不同于所述第一分枝杆菌抗原；
其中所述制剂用于所述第一和第二分枝杆菌抗原的同时施用或顺次施用。
在一个实施方案中，所述第二分枝杆菌抗原包含下述或由下述组成：分枝杆菌抗原多肽或多核苷酸序列，诸如(i)或(ii)中定义的分枝杆菌抗原多肽或多核苷酸序列(其中所述第二分枝杆菌抗原不同于所述第一分枝杆菌抗原)。
在一个实施方案中，所述治疗性或预防性制剂(例如疫苗)包含：(a)药用载体；(b)第一分枝杆菌抗原多肽或第一分枝杆菌多核苷酸；和(c)第二分枝杆菌抗原多肽或第二分枝杆菌多核苷酸；其中：
(i)所述第一分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：1或7的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；
(ii)所述第一分枝杆菌多核苷酸包含编码所述第一分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列；
(iii)所述第二分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；并且
(iv)所述第二分枝杆菌多核苷酸包含编码所述第二分枝杆菌多肽的多核苷酸序列；
其中所述制剂用于同时或顺次施用所述第一分枝杆菌抗原多肽或多核苷酸和所述第二分枝杆菌抗原多肽或多核苷酸。
在一个实施方案中，所述第一分枝杆菌多核苷酸包含与SEQ ID NO：2或8的核酸序列具有至少70％的核苷酸序列同一性多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段。在一个实施方案中，所述第二分枝杆菌多核苷酸包含与SEQ ID NO：6的核酸序列具有至少70％的核苷酸序列同一性的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段。
在一个实施方案中，本发明的所述治疗性制剂、药物或预防性制剂(例如疫苗)包含如上文定义的本发明的抗原组合物。
在一个实施方案中，所述治疗性制剂、药物或预防性制剂(例如疫苗)包含如上文定义的包含一种或多种载体或细胞的抗原组合物，其中所述载体或细胞包含所述分枝杆菌抗原中的至少一种。
在所述治疗性制剂、药物或预防性制剂(例如疫苗)的一个实施方案中，本文关于所述第一和/或第二(或另外的)分枝杆菌抗原所述的任何限制同等适用于所述治疗性制剂、药物或预防性制剂(例如疫苗)。
在一个实施方案中，本发明的疫苗是包含如上文所述的一种或多种载体的“载体化疫苗”。
在一个实施方案中，本发明的所述治疗性制剂、药物或预防性制剂(例如疫苗)用于同时施用所述第一和第二(和/或任选地另外的)分枝杆菌抗原。在一个备选实施方案中，本发明的所述治疗性制剂、药物或预防性制剂(例如疫苗)用于顺次施用所述第一和第二(和/或任选地另外的)分枝杆菌抗原。同时和顺次施用方案在下文更详细地讨论。
本发明还提供治疗剂制剂、药物或预防性制剂(例如疫苗)，其包含药用载体，第一抗体，其中所述第一抗体结合如上文定义的本发明的第一分枝杆菌抗原；和第二抗体，其中所述第二抗体结合如上文定义的本发明的第二分枝杆菌抗原(以及任选地如上文所述的一种或多种本发明的另外的抗体)。
在一个实施方案中，本发明提供一种治疗性或预防性制剂(例如疫苗)，所述制剂包含药用载体和：
(a)第一抗体，其中所述第一抗体结合第一分枝杆菌抗原；其中所述第一分枝杆菌抗原包含：
(i)与选自SEQ ID NOs：1，3，5，7和56的潜伏期-调节多肽的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；或
(ii)编码(i)所述的多肽序列的多核苷酸序列，或与选自SEQ IDNOs：2，4，6，8和57的潜伏期-调节多核苷酸的核酸序列具有至少70％的核苷酸序列同一性的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段；
以及
(b)第二抗体，其中所述第二抗体结合不同于所述第一分枝杆菌抗原的第二分枝杆菌抗原；
其中所述制剂用于同时或顺次施用所述第一和第二抗体。
在一个实施方案中，所述第一抗体结合包含如(i)中定义的分枝杆菌抗原多肽序列的第一分枝杆菌抗原。在一个实施方案中，所述第二抗体结合包含如(i)中定义的分枝杆菌抗原多肽序列的第二分枝杆菌抗原(其中所述第二分枝杆菌抗原多肽不同于所述第一分枝杆菌抗原多肽)。
在一个实施方案中，本发明提供一种治疗性或预防性制剂(例如疫苗)，所述制剂包含药用载体和：
(a)第一抗体，其中所述第一抗体结合第一分枝杆菌抗原多肽；其中所述第一分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：1或7的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；和
(b)第二抗体，其中所述第二抗体结合第二分枝杆菌抗原多肽；其中所述第二分枝杆菌抗原包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；
其中所述制剂用于同时或顺次施用所述第一和第二抗体。
在一个实施方案中，本发明的所述治疗性制剂、药物或预防性制剂(例如疫苗)包含如上文定义的本发明的免疫原性的包含抗体的组合物。
在所述治疗性制剂、药物或预防性制剂(例如疫苗)的一个实施方案中，本发明关于所述第一和/或第二(或另外的)抗体(或其所结合的分枝杆菌抗原)所述的任何限制同等适用于所述治疗性制剂、药物或预防性制剂(例如疫苗)。
在一个实施方案中，本发明的所述治疗性制剂、药物或预防性制剂(例如疫苗)用于同时施用所述第一和第二(和/或任选地另外的)抗体。在一个备选实施方案中，本发明的所述治疗性制剂、药物或预防性制剂(例如疫苗)用于顺次施用所述第一和第二(和/或任选地另外的)抗体。同时和顺次施用方案在下文更详细地讨论。
本发明的所述治疗性制剂、药物和预防性制剂(例如疫苗)包含药用载体，和任选地盐、赋形剂、稀释剂和/或佐剂中的一种或多种。
在一个实施方案中，本发明的治疗性制剂、药物或预防性制剂(例如疫苗)可以包含一种或多种免疫调节剂，所述免疫调节剂选自，例如，免疫球蛋白、抗生素、白介素(例如IL-2，IL-12)、和/或细胞因子(例如IFNγ)。
在一个实施方案中，本发明的治疗性制剂、药物或预防性制剂(例如疫苗)可以包含一种或多种抗微生物化合物，诸如常规的抗结核药(例如，利福平(rifampicin)，异烟肼(isoniazid)，乙胺丁醇(ethambutol)或pyrizinamide)。
因此，在一个方面中，本发明提供一种用于制备治疗性或预防性制剂(例如疫苗)的方法，所述方法包括将药用载体与下述组合：如上文定义的本发明的第一分枝杆菌抗原；和如上文定义的本发明的第二分枝杆菌抗原(以及任选地如上文定义的一种或多种另外的分枝杆菌抗原)。
因此，在一个实施方案中，本发明提供一种用于制备治疗性或预防性制剂(例如疫苗)的方法，所述方法包括将药用载体与下述组合：
(a)第一分枝杆菌抗原，其中所述第一分枝杆菌抗原包含：
(i)与选自SEQ ID NOs：1，3，5，7和56的潜伏期-调节多肽的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；或
(ii)编码(i)所述的多肽序列的多核苷酸序列，或与选自SEQ IDNOs：2，4，6，8和57的潜伏期-调节多核苷酸的核酸序列具有至少70％的核苷酸序列同一性的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段；
以及
(b)第二分枝杆菌抗原，其中所述第二分枝杆菌抗原不同于所述第一分枝杆菌抗原。
在一个实施方案中，所述第二分枝杆菌抗原包含下述或由下述组成：分枝杆菌抗原多肽或多核苷酸序列，诸如如(i)或(ii)中定义的分枝杆菌抗原多肽或多核苷酸序列(其中所述第二分枝杆菌抗原不同于所述第一分枝杆菌抗原)。
在一个实施方案中，本发明提供一种制备治疗性或预防性制剂(例如疫苗)的方法，所述方法包括：
将药用载体与下述组合：
(i)第一分枝杆菌抗原多肽，其中所述第一分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：1或7的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；或
(ii)第一分枝杆菌多核苷酸，其中所述第一分枝杆菌多核苷酸包含编码所述第一分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列；
并且与下述组合：
(iii)第二分枝杆菌抗原多肽，其中所述第二分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；或
(iv)第二分枝杆菌多核苷酸，其中所述第二分枝杆菌多核苷酸包含编码所述第二分枝杆菌多肽的多核苷酸序列。
在一个实施方案中，所述分枝杆菌抗原以如上文定义的本发明的抗原组合物的形式存在。
在所述方法的一个实施方案中，本文关于所述第一和/或第二(或另外的)分枝杆菌抗原所述的任何限制同等适用于所述方法。
在一个实施方案中，所述方法还包括将所述药用载体和分枝杆菌抗原(或抗原组合物)与盐、赋形剂、稀释剂、佐剂、免疫调节剂和/或抗微生物化合物中的一种或多种组合。
本发明还提供用于制备治疗性制剂或预防性制剂(例如疫苗)的方法，所述方法包括将药用载体与下述组合：第一抗体，其中所述第一抗体结合如上文定义的本发明的第一分枝杆菌抗原；和第二抗体，其中所述第二抗体结合如上文定义的本发明的第二分枝杆菌抗原(以及任选地如上文定义的一种或多种本发明的另外的分枝杆菌抗体)。
因此，在一个实施方案中，本发明提供一种用于制备治疗性或预防性制剂(例如疫苗)的方法，所述方法包括将药用载体与下述组合：
(a)第一抗体，其中所述第一抗体结合第一分枝杆菌抗原；其中所述第一分枝杆菌抗原包含：
(i)与选自SEQ ID NOs：1，3，5，7和56的潜伏期-调节多肽的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；或
(ii)编码(i)所述的多肽序列的多核苷酸序列，或与选自SEQ IDNOs：2，4，6，8和57的潜伏期-调节多核苷酸的核酸序列具有至少70％的核苷酸序列同一性的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段；
以及
(b)第二抗体，其中所述第二抗体结合不同于所述第一分枝杆菌抗原的第二分枝杆菌抗原。
在一个实施方案中，所述第一抗体结合包含如(i)中定义的分枝杆菌抗原多肽序列的第一分枝杆菌抗原。在一个实施方案中，所述第二抗体结合包含如(i)中定义的分枝杆菌抗原多肽序列的第二分枝杆菌抗原(其中所述第二分枝杆菌抗原多肽不同于所述第一分枝杆菌抗原多肽)。
在一个实施方案中，本发明提供一种用于制备治疗性或预防性制剂(例如疫苗)的方法，所述方法包括将药用载体与第一抗体和第二抗体组合；
其中所述第一抗体结合第一分枝杆菌抗原多肽，其中所述第一分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：1或7的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；并且
其中所述第二抗体结合第二分枝杆菌抗原多肽，其中所述第二分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段。
在一个实施方案中，所述第一和第二抗体以如上文定义的本发明的免疫原性组合物的形式存在。
在所述方法的一个实施方案中，本文关于所述第一和/或第二(或另外的)抗体(或其所结合的分枝杆菌抗原)所述的任何限制同等适用于所述方法。
在一个实施方案中，所述方法还包含将所述药用载体和抗体(或免疫原性组合物)与盐、赋形剂、稀释剂、佐剂、免疫调节剂和/或抗微生物化合物中的一种或多种组合。
如使用的，此处，“疫苗”是一种在施用到动物受试者如哺乳动物(例如，人、牛、猪、绵羊、山羊、马、鸦、犬或猫科受试者)中时刺激针对分枝杆菌感染的保护性免疫应答的制剂。免疫应答可以是体液和/或细胞介导的免疫应答(例如，T细胞应答)。例如，本发明的疫苗可以用于保护动物免受本发明的分枝杆菌的影响(例如结核分枝杆菌感染)，诸如早期感染。
本发明的第一和第二分枝杆菌抗原(例如多肽)的表位的免疫原性可以通过将其在哺乳动物或酵母系统中与颗粒-形成蛋白诸如例如与乙型肝炎表面抗原相缔合的颗粒-形成蛋白融合或组装制备而得以提高。在一个实施方案中，所述疫苗包含至少一种已用化学改性剂(如甲醛)处理过的分枝杆菌多肽，从而提供提高功效的疫苗。
本发明的多肽(包括抗体)和/或多核苷酸可以配制成中性或盐形式的疫苗。药用盐包括与无机酸诸如例如盐酸或磷酸或与有机酸如乙酸、草酸、酒石酸、马来酸等形成的酸加成盐。与游离的羧基基团形成的盐也可以来源于无机碱，诸如，例如，氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化铵、氢氧化钙或氢氧化铁，以及有机碱，如异丙胺、三甲胺、2-乙基氨基乙醇、组氨酸、普鲁卡因等。
治疗性制剂、药物和预防性制剂(例如疫苗)的施用通常通过常规途径进行，例如，静脉内、皮下、腹膜内或黏膜途径。施用可以通过肠胃外注射进行，例如，皮下或肌内注射。包含中和抗体的制剂可以特别适用于静脉内、肌内、真皮内或皮下施用。
因此，本发明的治疗性制剂、药物和预防性制剂(例如疫苗)典型地制备为注射剂，作为液体溶液或混悬液。备选地，可以制备成在注射前适于溶解在液体中或混悬在液体中的固体形式。所述制剂还可以被乳化，或所述肽被包封在脂质体或微胶囊中。
活性免疫原成分通常与药用且与活性成分相容的赋形剂混合。适当的赋形剂为，例如，水，盐水，葡萄糖，甘油，乙醇等以及它们的组合。另外，如果需要，疫苗可以包含少量的辅助物质，如湿润剂或乳化剂、pH缓冲剂和/或增强疫苗的效力的佐剂。
一般地，载体是药用载体。药用载体的非限制性实例包括水、盐水、和磷酸缓冲液。然而，在一些实施方案中，组合物以冻干形式存在，在这种情形中，其可以包含稳定剂如BSA。在一些实施方案中，可以理想地用防腐剂如乙基汞硫代水杨酸钠或叠氮化钠配制所述组合物，从而便于长期存储。
可以作为有效的佐剂的实例包括但不限于：完全弗氏佐剂(CFA)、不完全弗氏佐剂(IVA)、皂苷、纯化的皂苷提取物如Quil A、皂苷的衍生物如QS-21、基于皂苷的脂质颗粒如ISCOM/ISCOMATIX、大肠杆菌不耐热毒素(LT)突变体如LTK63和/或LTK72、氢氧化铝、N-乙酰基-胞壁酰基-L-苏氨酰-D-异谷氨酰胺(thr-MDP)、N-乙酰基-正-胞壁酰基-L-丙氨酰-D-异谷氨酰胺(CGP 11637，称为正-MDP)，N-乙酰基胞壁酰基-L-丙氨酰-D-异谷氨酰基-L-丙氨酸-2-(1′-2′-二棕榈酰-sn-甘油-3-羟基磷酰氧)-乙胺(CGP19835A，称为MTP-PE)、和RIBI，其包含在2％角鲨烯/吐温80乳液中的三种提取自细菌的成分，即单磷酸类脂A、海藻糖二霉菌酸酯和细胞壁骨架(MPL+TDM+CWS)。
缓冲剂的实例包括，但不限于，琥珀酸钠(pH 6.5)和磷酸缓冲液(PBS；pH 6.5和7.5)。
适用于其他施用方式的另外的制剂包括栓剂，并且在一些情形中，口服制剂或适于作为气雾剂分布的制剂。对于栓剂，传统的结合剂和载体可以包括，例如，聚亚烷基二醇或三甘油酯；这样的栓剂可以由包含在0.5％至10％、优选1％-2％范围内的活性成分的混合物形成。
口服制剂包括这样正常应用的赋形剂，如例如，药用级别的甘露醇、乳糖、淀粉、硬脂酸镁、糖精钠、纤维素、碳酸镁等。这些组合物采用溶液、混悬液、片剂、药丸、胶囊、缓释制剂或粉末的形式。
在分枝杆菌呼吸道感染(例如结核分枝杆菌感染)的情形中，可以通过口服或鼻内给药(i.n.)实现所述治疗性/预防性组合物或药物向肺部感染部位的有效传递。这些递送模式对应于递送结核分枝杆菌感染的途径。在基于抗体的组合物的情形中，这些递送模式确保抗体存在于感染部位以在细菌变成细胞内的之前并且还在当其在细胞之间扩散的时期过程中与细菌战斗。
用于鼻内给药的制剂可以以鼻滴剂或鼻喷雾剂的形式存在。鼻内制剂可以包含近似直径在100-5000μm、如500-4000μm、1000-3000μm或100-1000μm范围内的小滴。备选地，关于体积，小滴可以在约0.001-100μl、如0.1-50μl或1.0-25μl、或如0.001-1μl的范围内。
备选地，所述治疗性/预防性制剂或药物可以是气雾剂制剂。气雾剂制剂可以采用粉末、混悬液或溶液的形式。气雾剂颗粒的尺寸与气雾剂的递送能力相关。颗粒越小可以比较大的颗粒进一步沿呼吸道传送到肺泡。在一个实施方案中，气雾剂颗粒具有促使沿着支气管、细支气管和肺泡的完整长度递送的直径分布。备选地，可以选择颗粒尺寸分布，以靶向呼吸道的特定部分，例如，肺泡。在药物的气雾剂递送的情形中，颗粒可以具有0.1-50μm、优选1-25μm、更优选1-5μm的大致范围内的直径。
气雾剂颗粒可以使用喷雾器递送(例如，通过嘴)或鼻喷雾递送。气雾剂制剂可以任选地包含推进剂和/或表面活性剂。
可能的是，在鼻内递送分枝杆菌抗原或抗体后，通过黏膜分泌物的反向流动而促进其到肺部的通道，尽管认为呼吸道中的黏液纤毛作用是将黏液中的颗粒带出肺部。在肺灌洗液中相对长期的保存期，从胆汁的快速清除并且缺少一些抗体向唾液的传输表明黏膜部位-特异性机制的作用。
通过控制小滴/颗粒的尺寸在本发明限定的范围内，可以避免(或减少至最低)向肺泡的非故意的抗原递送，并且因此避免肺泡相关的病理问题，如肺的炎症和纤维化瘢痕。
鼻内接种连接在鼻和支气管相关的黏膜组织中的T和B细胞介导的效应机制，支气管相关的黏膜组织不同于其他黏膜相关的淋巴组织。通过鼻内给药途径激发的保护性机制可以包括：激活具有优先的肺部归巢的T淋巴细胞；共刺激分子(例如B7.2)的上调；和/或激活巨噬细胞或分泌型IgA抗体。
抗原的鼻递送可以促进激发黏膜抗体应答，其得到T细胞应答向辅助抗体生产的Th2表型转化的促进。黏膜应答特征在于增加的IgA生产，并且Th2应答特征在于增加的IL-4生产。
鼻内递送本发明的分枝杆菌抗原允许使所述抗原靶向呼吸系统的黏膜下层B细胞。这些B细胞在哺乳动物中是主要的局部IgA生产细胞，并且鼻内递送促使这些细胞针对分枝杆菌抗原的IgA生产的快速增加。
在一个实施方案中，本发明的治疗性/预防性制剂或药物刺激黏膜和/或Th2免疫应答。在另一个实施方案中，刺激IgA抗体生产，并且IgA抗体结合所述分枝杆菌抗原。
在一个实施方案中，本发明的第一和第二(以及任选的另外的)分枝杆菌抗原或抗体用于同时施用。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法/应用包括同时施用第一和第二(以及任选的另外的)分枝杆菌抗原。在一个实施方案中，本发明的方法/应用包括同时施用第一和第二(以及任选的另外的)分枝杆菌抗体。
同时施用意指在(基本上)相同的时刻进行施用。例如，在一个实施方案中，第一和第二(以及任选的另外的)分枝杆菌抗原彼此在5分钟内，诸如彼此在4，3，2或1分钟内，例如彼此在30秒内施用给受试者。
在‘同时施用’的一个实施方案中，本发明的至少两种成分(即，抗原或抗体)组合成一种组合物(例如，如本文定义的本发明的单一抗原组合物或免疫原性组合物)。将该组合物施用给受试者(诸如哺乳动物----例如，人、牛、猪、绵羊、山羊、马、鸦、犬或猫科受试者)，由此向所述受试者同时提供两种成分。
在‘同时施用’的一个备选的实施方案中，本发明的至少两种成分(即，抗原或抗体)彼此分开提供，但是在(基本上)相同的时刻施用给受试者(诸如哺乳动物----例如，人、牛、猪、绵羊、山羊、马、鸦、犬或猫科受试者)。所述分开的组合物的同时/平行施用将两种成分在(基本上)相同的时间提供给所述受试者。例如，本发明的治疗性或预防性制剂(例如疫苗)可以包含在第一组合物中的第一分枝杆菌抗原或抗体和在第二组合物中的第二分枝杆菌抗原或抗体。
在一个实施方案中，本发明的第一和第二(以及任选的另外的)分枝杆菌抗原或抗体用于在(基本上)相同的部位同时施用。因此，在一个实施方案中，本发明的方法/应用包括在(基本上)相同的部位同时施用第一和第二(以及任选的另外的)分枝杆菌抗原。在一个实施方案中，本发明的方法/应用包括在(基本上)相同的部位同时施用第一和第二(以及任选的另外的)分枝杆菌抗体。
在这一方面，认为在受试者身体的不同部位施用常规多价疫苗的每种不同的抗原成分时有利的，从而刺激不同的淋巴结。还认为在不同部位施用常规多价疫苗的不同的抗原成分有利地减少或避免不需要的抗原竞争。
在一个实施方案中，本发明有利地避免将不同的抗原成分施用在受试者身体的不同部位/位置的需求。在这一方面，在一个实施方案中，与关于已知的多价疫苗组合物已经预测到的竞争效应相比较，本发明的第一和第二(以及任选的另外的)抗原(基本上)彼此不互相竞争，或者与相对低水平的抗原竞争相关。
如果将本发明的至少两种成分(即抗原或抗体)组合成单一组合物(例如，如本文定义的本发明的单一抗原组合物或免疫原性组合物)，则明显的是本发明的所有成分在相同部位施用给受试者。
在一个实施方案中，如果本发明的第一和第二(以及任选的另外的)分枝杆菌抗原或抗体彼此分开提供，用于在(基本上)相同的时刻同时、平行施用给受试者，则所述分开的组合物在受试者上/中的相同的(或基本上相同的)部位施用。
在一个实施方案中，在受试者上/中(基本上)相同的部位施用意指本发明的每种分枝杆菌抗原或抗体施用的位点在本发明的其他分枝杆菌抗原或抗体所施用的位点附近或紧挨着。备选地，在受试者上/中的(基本上)相同的部位的施用意指本发明的每种分枝杆菌抗原或抗体所施用的部位准确地在本发明的其他分枝杆菌抗原或抗体所施用的部位处。
例如，本发明的第一和第二(以及任选的另外的)分枝杆菌抗原或抗体可以用于施用到受试者的相同的静脉、动脉或肌肉，或通过受试者的同一鼻孔施用；或施用到受试者的同一肢体(例如，手臂)上(例如，施用到受试者的同一上臂)；或本发明的第一和第二(以及任选的另外的)分枝杆菌抗原或抗体可以全部用于口服或舌下施用。在一个实施方案中，本发明的第一和第二(以及任选的另外的)分枝杆菌抗原或抗体可以全部用于在相同的淋巴结处或紧邻相同的淋巴结施用。
备选地，本发明的分枝杆菌抗原或抗体用于顺次(即，一种接一种地)施用给受试者(例如，哺乳动物，如人、牛、猪、绵羊、山羊、马、鸦、犬或猫科受试者)。在这一实施方案中，本发明的至少两种成分(即，抗原或抗体)彼此分开提供，并且顺次施用给受试者。
例如，本发明的治疗性或预防性制剂(例如疫苗)可以包含在第一组合物中的第一分枝杆菌抗原或抗体和在第二组合物中的第二分枝杆菌抗原或抗体。所述第一和第二组合物的顺次施用将两种成分一种接一种地施用给受试者。
因此，在一个实施方案中，本发明的方法包括施用第一分枝杆菌抗原，然后施用第二分枝杆菌抗原。备选地，可以施用第二分枝杆菌抗原，然后施用第一分枝杆菌抗原。任意另外的分枝杆菌抗原可以与第一和/或第二分枝杆菌抗原一起施用。备选地，任意另外的分枝杆菌抗原可以在第一和/或第二分枝杆菌抗原之前或之后施用。
在一个实施方案中，本发明的方法包括施用第一分枝杆菌抗体，然后施用第二分枝杆菌抗体。备选地，可以施用第二分枝杆菌抗体，然后施用第一分枝杆菌抗体。任意另外的分枝杆菌抗体可以与第一和/或第二分枝杆菌抗体一起施用。备选地，任意另外的分枝杆菌抗体可以在第一和/或第二分枝杆菌抗体之前或之后施用。
在一个实施方案中，每种顺次施用的抗原/抗体一种接另一种立即进行。在一个实施方案中，在一次或多次施用之间(例如，在每一次之间)存在时间间隔或停顿。顺次施用之间的时间间隔或停顿可以是至少5，10，15，或30分钟，或可以是至少1，2，5，12，18或24小时，或可以是至少1，2，或5天，或可以是至少1或2周。
在一个实施方案中，本发明的第一和第二(以及任选的另外的)分枝杆菌抗原或抗体用于在(基本上)相同的部位顺次施用。因此，在一个实施方案中，本发明的方法/应用包括在(基本上)相同的部位顺次施用所述第一和第二(以及任选的另外的)分枝杆菌抗原。在一个实施方案中，本发明的方法/应用包括在(基本上)相同的部位顺次施用所述第一和第二(以及任选的另外的)分枝杆菌抗体。
在一个实施方案中，在受试者上/中的(基本上)相同的部位的施用意指本发明的每种分枝杆菌抗原或抗体施用的位点在本发明的其他分枝杆菌抗原或抗体所施用的位点附近或紧挨着。备选地，在受试者上/中的(基本上)相同的部位的施用意指本发明的每种分枝杆菌抗原或抗体所施用的部位准确地在本发明的其他分枝杆菌抗原或抗体所施用的部位处。
例如，本发明的第一和第二(以及任选的另外的)分枝杆菌抗原或抗体可以用于施用到受试者的相同的静脉、动脉或肌肉，或通过受试者的同一鼻孔施用；或施用到受试者的同一肢体(例如，手臂)上(例如，施用到受试者的同一上臂)；或本发明的第一和第二(以及任选的另外的)分枝杆菌抗原或抗体可以全部用于口服或舌下施用。。在一个实施方案中，本发明的第一和第二(以及任选的另外的)分枝杆菌抗原或抗体可以全部用于在相同的淋巴结处或紧邻相同的淋巴结施用。
本发明的治疗性制剂、药物或预防性制剂(例如疫苗)可以以单次给药时间表给药(即，全部剂量基本上一次给药)。备选地，本发明的治疗性制剂、药物或预防性制剂(例如疫苗)可以以多次给药时间表给药。
多次给药时间表是这样安排的：其中初始治疗(例如，接种)疗程可以用1-6个分开的给药，然后以维持和或加强免疫应答所需要的后续时间间隔给药其他的剂量，例如(对于人受试者)，在1-4个月进行第二次给药，并且如果需要，再过1-4个月后接着进行给药。
剂量方案至少部分由个体的需要确定，并且取决于执业者(例如，医生或兽医)的判断。
在一个实施方案中，本发明的疫苗可以作为‘致敏-加强’接种方案的一部分施用。
致敏-加强接种方案包括：致敏-即，使受试者暴露于一种或多种抗原或疫苗；并且随后：加强-即，使受试者暴露于一种或多种抗原或疫苗。‘加强’抗原/疫苗典型地不同于‘致敏’抗原/疫苗(已知为“异源性”致敏-加强)。在这一方面，已经表明，与用相同疫苗进行同源性加强相比较，异源性致敏-加强免疫策略在受试者中诱导更高水平的免疫细胞应答(例如，效应T细胞应答)。例如，用常规疫苗如BCG重复接种似乎不能进一步加强针对TB的保护。然而，将BCG结合在异源性致敏-加强方案中可以保留BCG的保护性作用。
因此，在一个实施方案中，本发明提供一种针对分枝杆菌感染接种的方法，所述方法包括通过施用异源性常规疫苗(例如BCG疫苗)使受试者的免疫系统‘致敏’，然后通过施用本发明的疫苗而使所述受试者的免疫系统‘加强’。在一个实施方案中，本发明提供一种针对分枝杆菌感染接种的方法，所述方法包括给之前已经暴露于异源性常规疫苗如BCG的受试者施用本发明的疫苗。
备选地，受试者的免疫系统可以通过施用本发明的疫苗而被‘致敏’，然后通过施用异源性常规疫苗(例如BCG疫苗)而被‘加强’。因此，在一个实施方案中，将疫苗施用给受试者，随后该受试者暴露于异源性常规疫苗，如BCG。
‘致敏’步骤可以在任何年龄的受试者上进行-在哺乳动物受试者的情形中(例如，人、牛、猪、绵羊、山羊、马、鹿、犬或猫科受试者)，用BCG致敏常规在刚出生时进行，或者在婴儿期、青春期或成人期进行。‘加强’步骤可以在‘致敏’步骤后的任意时间进行。在哺乳动物受试者的情形中(例如，人、牛、猪、绵羊、山羊、马、鹿、犬或猫科受试者)，加强步骤可以在致敏步骤后至少约1，2，3，4，5，6，7，8，9或10周进行，或在致敏步骤后至少约3，6，8或12个月进行，或在加强步骤后至少约2，5，10，15，20，25，30，35，或40年以上进行。在一个实施方案中，对于人受试者，致敏步骤在婴儿期进行，加强步骤在青春期进行。
在一个实施方案中，本发明的治疗性制剂、药物或预防性制剂(例如疫苗)可以与选自例如免疫球蛋白、抗生素、白介素(例如IL-2，IL-12)，和/或细胞因子(例如IFNγ)的一种或多种免疫调节剂联合(同时或顺次)施用给受试者，如哺乳动物(例如，人、牛、猪、绵羊、山羊、马、鸦、犬或猫科受试者)。
在一个实施方案中，本发明的治疗性制剂、药物或预防性制剂(例如疫苗)可以与一种或多种抗微生物化合物如常规的抗结核药(例如利福平，异烟肼，乙胺丁醇或pyrizinamide)联合(同时或顺次)施用给受试者，如哺乳动物(例如，人、牛、猪、绵羊、山羊、马、鸦、犬或猫科受试者)。
所述治疗性制剂、药物或预防性制剂(例如疫苗)可以包含5％至95％的活性成分，如至少10％或25％的活性成分，或至少40％的活性成分或至少50，55，60，70或75％的活性成分。
所述治疗性制剂、药物或预防性制剂(例如疫苗)以与剂量制剂相容的方式施用，并且以将是预防性和/或治疗性有效的量施用。
在这一方面，当用于本文时，“有效量”是足以实现所需要的生物结果的剂量或量。当用于本文时，“治疗有效量”是当单次或多次剂量施用给受试者(诸如哺乳动物-例如，人、牛、猪、绵羊、山羊、马、鸦、犬或猫科受试者)时，有效用于治疗、预防、治愈、延缓、减轻病症或复发病症的严重性，改善病症或复发病症的至少一种症状，或使受试者的存活延长超过在不存在所述治疗时预期的存活。
因此，要施用的活性成分的量，通常在5微克至250微克抗原/剂量的范围内(或者，如果口服递送或以病毒载体的形式，则更高)，取决于待治疗的受试者，受试者的免疫系统产生保护性免疫应答的能力，和所需要的保护的程度。需要施用的活性成分的精确量可以取决于执业者的判断，并且可能是对每名受试者特定的。
根据本发明的另一个方面，如本文所述的本发明的第一和第二分枝杆菌抗原(以及任选地另外的分枝杆菌抗原)可用于免疫测定法中检测测试样品中针对所述第一和第二分枝杆菌抗原的抗体的存在。在一个实施方案中，所述第一和第二分枝杆菌抗原(以及任选地另外的抗原)以如本文所述的抗原组合物的形式使用。
根据本发明的另一个方面，如本文所述的本发明的第一和第二抗体(以及任选地另外的抗体)可用于免疫测定法来检测测试样品中所述第一和第二分枝杆菌抗原的存在。在一个实施方案中，所述第一和第二抗体(以及任选地另外的抗体)以本文所述的免疫原性的包含抗体的组合物的形式使用。
测试样品可以是生物样品，如临床样品或环境样品。当用于本文时，‘临床样品’是指从个体分离的组织或流体样品，包括但不限于，例如，血浆，血清，脊髓液，淋巴液，皮肤外部切片，呼吸道，肠，和泌尿生殖道，泪水，唾液，乳汁，血液细胞，肿瘤，器官，以及还有体外细胞培养成分的样品(包括但不限于由于细胞在细胞培养基中生长导致的条件培养基，推定感染的细胞、重组细胞和细胞成分)。
在下文讨论的诊断方法的情形中，‘受试者’是将受益于分枝杆菌感染如结核分枝杆菌感染的检测的任意动物受试者。典型的动物受试者是哺乳动物，例如，人、牛、猪、绵羊、山羊、马、鸦、犬或猫科受试者。在一个实施方案中，所述受试者是人、牛、猪或马。
免疫测定法的设计是进行大量的变化，并且本领域已知多种格式。例如，流程可以基于竞争、直接反应或夹心型测定法。例如，流程还可以使用固体支持物，或可以使用免疫沉淀。大部分测定法包括使用标记的抗体或多肽；所述标记可以是，例如，酶，荧光，化学发光，放射性或染料分子。包括信号放大的测定法也是已知的；例如，利用生物素和抗生物素蛋白的测定法、或酶标记和介导的免疫测定法，如ELISA测定法。
在本发明的一个方面中，本发明的第一和第二分枝杆菌抗原(或抗原组合物)可用于检测在患者中先前暴露于分枝杆菌感染的抗原成分的T-淋巴细胞的存在。
因此，在一个实施方案中，本发明提供一种诊断分枝杆菌感染如早期分枝杆菌感染的体外方法，所述方法包括将来自受试者(例如，哺乳动物，如人、牛、猪、或马受试者)的包含免疫细胞如T-淋巴细胞的测试样品与下述一起温育(‘攻击’)：如本文定义的本发明的第一分枝杆菌抗原和本发明的第二分枝杆菌抗原；或如本文定义的本发明的抗原组合物；并且检测所述免疫细胞(例如T-淋巴细胞)的激活。所述免疫细胞的激活指示所述受试者中的分枝杆菌感染。
在所述体外方法的一个实施方案中，所述第一分枝杆菌抗原选自：(i)第一分枝杆菌抗原多肽，所述第一分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：1或7的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；或(ii)第一分枝杆菌多核苷酸序列，所述第一分枝杆菌多核苷酸序列包含编码所述第一分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列。在所述体外方法的一个实施方案中，所述第二分枝杆菌抗原选自：(iii)第二分枝杆菌抗原多肽，所述第二分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；或(iv)第二分枝杆菌多核苷酸序列，所述第二分枝杆菌多核苷酸序列包含编码所述第二分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列。
先前已经暴露于第一和第二分枝杆菌抗原之一或二者的免疫细胞，如T-淋巴细胞，在后续被相同的抗原攻击时将被‘激活’。因此，所述免疫细胞(例如T-淋巴细胞)的激活指示受试者中的分枝杆菌感染，并且提供了一种鉴定阳性的分枝杆菌感染诊断的方式。相反，先前没有暴露于特定抗原的免疫细胞(例如T-淋巴细胞)不会实现相同的激活。
免疫细胞(例如T-淋巴细胞)的上述‘激活’有时称为‘回忆应答’并且可以进行测量，例如，通过确定来自激活的免疫细胞(例如T-淋巴细胞)的干扰素(例如IFN-γ)的释放进行测量。
因此，可以通过检测免疫细胞(例如T-淋巴细胞)响应本发明的第一和第二分枝杆菌抗原(或抗原组合物)的攻击的激活-例如，通过在所述攻击后确定的时间期间后检测由免疫细胞(例如T-淋巴细胞)的最低浓度的干扰素的释放而检测-可以确定患者中存在分枝杆菌感染。
上述免疫细胞(例如T-淋巴细胞)诊断测定法可以进一步包括一种抗原呈递细胞(APC)，所述抗原呈递细胞表达由正被研究的患者所表达的至少一种主要组织相容性复合物(MHC)II类分子。APC可以固有地提供在生物样品中，或可以从外部添加。在一个实施方案中，所述T-淋巴细胞是CD4T-淋巴细胞。
用于诊断分枝杆菌感染的备选的免疫测定法依赖于对针对本发明的第一和第二分枝杆菌抗原(例如多肽)的抗体的检测。所述测定法可以包括用本发明的所述第一和第二抗原(或抗原组合物)温育怀疑含有所述抗体的测试样品(例如生物样品)的步骤。
因此，本发明还提供一种诊断分枝杆菌感染如早期分枝杆菌感染的体外方法，所述方法包括将来自受试者(例如哺乳动物，如人、牛、猪、或马受试者)的测试样品与下述一起温育：如本文定义的本发明的第一分枝杆菌抗原和第二分枝杆菌抗原；或如本文定义的本发明的抗原组合物；其中所述温育在允许所述第一和第二分枝杆菌抗原与样品中的抗体结合从而形成抗原-抗体复合物的条件下进行；并且然后检测所述复合物的形成。抗原-抗体复合物的存在指示所述受试者中的分枝杆菌感染。
在所述体外方法的一个实施方案中，所述第一分枝杆菌抗原选自：(i)第一分枝杆菌抗原多肽，所述第一分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：1或7的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；或(ii)第一分枝杆菌多核苷酸序列，所述第一分枝杆菌多核苷酸序列包含编码所述第一分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列；并且所述第二分枝杆菌抗原选自：(iii)第二分枝杆菌抗原多肽，所述第二分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；和(iv)第二分枝杆菌多核苷酸序列，所述第二分枝杆菌多核苷酸序列包含编码所述第二分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列。
抗原-抗体复合物(或者，在竞争性测定法的情形中，竞争抗体的量)可以通过多种已知技术中的任一种根据形式进行检测。例如，复合物中未标记的抗体可以用与标记(例如，酶标记)复合的抗-异种Ig的缀合物进行检测。
免疫测定法可以是标准的或竞争类型的。
在一个实施方案中，第一和第二分枝杆菌抗原结合在一种或多种固体支持物上，以在温育后促进样品与抗原的分离。可以使用的固体支持物的实例是硝基纤维素(例如，以膜或微量滴定孔的形式)，聚氯乙烯(例如，以片或微量滴定孔形式)，聚苯乙烯胶乳(例如，以珠或微量滴定板形式)，聚偏氟乙烯(polyvinylidine fluoride)(已知为Immulon)，重氮化纸，尼龙膜，活化珠和蛋白质A珠。例如，可以使用Dynatech Immulon微量滴定板或60mm直径的聚苯乙烯珠(Precision Plastic Ball)。包含第一和第二分枝杆菌抗原的固体支持物典型地在将其与测试样品分离后且在检测所结合的抗体之前进行洗涤。
本发明还包括用于检测测试样品(例如生物样品)中本发明的第一和第二分枝杆菌抗原(例如多肽)的存在的免疫测定法。在这样的方法中，怀疑含有所述分枝杆菌抗原的测试样品可以用针对第一和第二分枝杆菌抗原的抗体进行温育。
因此，本发明提供一种诊断分枝杆菌感染如早期分枝杆菌感染的体外方法，所述方法包括将来自受试者(例如哺乳动物，如人、牛、猪、或马受试者)的测试样品与下述一起温育：如本文定义的本发明的第一抗体和第二抗体；或如本文定义的本发明的免疫原性组合物；其中所述温育在允许所述第一和第二抗体与所述样品中的抗原结合从而形成抗原-抗体复合物的条件下进行；然后检测所述复合物的形成，其中抗原-抗体复合物的存在指示所述受试者中的分枝杆菌感染。
在所述体外方法的一个实施方案中，所述第一抗体结合第一分枝杆菌抗原多肽，其中所述第一分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：1或7的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；并且所述第二抗体结合第二分枝杆菌抗原多肽，其中所述第二分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段。
在检测之前处理生物样品可能是合乎需要的，从而释放推定的细菌成分。可以应用各种格式。例如，可以应用“夹心测定法”，其中将与固体支持物结合的抗体与测试样品一起温育；洗涤；用针对第一和第二抗原的第二、标记的抗体温育，并且再次洗涤支持物。通过测定第二抗体是否结合在支持物上检测第一和第二分枝杆菌抗原。在竞争性格式中，测试样品通常与抗体一起温育，并且也温育标记的、竞争抗原，顺次或同时进行。
在一个方面中，本发明提供一种免疫测定试剂盒，所述试剂盒包含本发明的抗原组合物，或针对所述第一和第二分枝杆菌抗原的抗体。所述免疫测定试剂盒还可以包含缓冲剂。
术语“多肽”在整个说明书中于术语“寡肽”、“肽”和“蛋白”同义。这些术语可互换使用，并且不是指特定长度的产物。这些术语包括翻译后修饰，如糖基化、乙酰化和磷酸化。
在一个实施方案中，本发明的分离的多肽基本上不含与其共同产生的其他蛋白以及其他污染物。例如，分离的多肽基本上不含来源于细胞、细菌、或其所来源的组织来源的物质或其他蛋白。
当用于本文时，“纯化的”分子基本上脱离其原始环境，并且足够纯以用在药物组合物中。当用于本文时，基本上纯的多肽是指至少约50％(w/w)纯的多肽；或至少约60％，70％，80％，85％，90％或95％(w/w)纯的多肽；或至少约95％，96％，97％，98％，99％，或100％(w/w)纯的多肽。
本发明的多肽可以从分枝杆菌纯化，或可以从表达这些多肽的其他细胞类型(例如，因为其转化了编码这些肽的重组核酸)纯化。例如，所表达的多肽可以通过疏水相互作用层析、离子交换层析和陶瓷羟磷灰石层析的组合进行纯化。可以使用蛋白质纯化领域公知的其他层析技术。多肽的纯度或一致性可以通过例如蛋白质样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳然后当染色凝胶时显现单一多肽条带或用HPLC显示。
本发明的多肽应该通常是可溶的或主要是可溶的(例如，至少约70％，75％，80％，85％，90％，95％，97％，98％，或甚至99％可溶)。
本发明包括与基于本申请中鉴定的参照SEQ ID NOs中的任一种的多肽(包括其片段)基本上同源的多肽。术语“序列同一性”和“序列同源性”在本说明书中认为是同义的。
例如，目的多肽可以包括与参照多肽的氨基酸序列具有至少70，75，80，82，84，86，88，90，92，94，96，98，99或100％的氨基酸序列同一性的氨基酸序列。
存在多种已建立的可用于比对两种氨基酸序列的算法。
典型地，一个序列作为参照序列，测试序列可以与其进行比较。序列比较算法基于所指定的程序参数计算测试序列相对于参照序列的百分比序列同一性。例如，可以通过计算机执行的算法(例如，GAP，BESTFIT，FASTA或TFASTA)、或BLAST和BLAST 2.0算法进行用于比较的氨基酸序列的比对。
下文所示的BLOSUM62表示来源于约2,000次蛋白质序列片段的局部多重比对的氨基酸置换矩阵，其代表多于500组相关蛋白的高度保守区(Henikoff & Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)89：10915-10919，1992；通过引用结合于此)。氨基酸以标准的一字母密码表示。百分比同一性计算为：
Figure BDA00002442179300941
BLOSUM62表
Figure BDA00002442179300942
Figure BDA00002442179300951
在同源性比较中，同一性可以在长度为至少7个氨基酸残基的序列区域存在(例如，长度为至少10，20，30，40，50，75，100，150，200，250，300，350，400，450，500，550，600或650个氨基酸残基-例如，多至参照序列的完整长度)。
基本上同源的多肽具有一个或多种氨基酸置换、缺失、或添加。在多个实施方案中，这些变化较少是天然的，例如，仅涉及保守氨基酸置换。保守置换是通过用下组内的一种氨基酸替换另一种氨基酸而得到的那些置换：碱性的：精氨酸，赖氨酸，组氨酸；酸性的：谷氨酸，天冬氨酸；极性的：谷氨酰胺，天冬酰胺；疏水性的：亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸；芳香的：苯丙氨酸，色氨酸，酪氨酸；小的：甘氨酸，丙氨酸，丝氨酸，苏氨酸，甲硫氨酸。基本上同源的多肽还包括包含不显著影响多肽的折叠或活性的其他置换的那些多肽；小的缺失，典型地为1至约30个氨基酸(如1-10或1-5个氨基酸)的缺失；以及小的氨基-或羧基-端延伸，如氨基端甲硫氨酸残基，至多约20-25个残基的小的接头肽，或亲和标签。
本发明的多肽还可以包含非天然存在的氨基酸残基。在这一方面，除了20种标准氨基酸之外，非标准氨基酸(如4-羟基脯氨酸，6-N-甲基赖氨酸，2-氨基异丁酸，异缬氨酸和α-甲基丝氨酸)可以置换本发明的分枝杆菌多肽中的氨基酸残基。有限数量的非保守氨基酸、不是由遗传密码编码的氨基酸、和非天然氨基酸可以置换分枝杆菌多肽氨基酸残基。非天然存在的氨基酸包括，但不限于，反式-3-甲基脯氨酸，2，4-甲醇基-脯氨酸，顺式-4-羟基脯氨酸，反式-4-羟基-脯氨酸，N-甲基甘氨酸，别-苏氨酸，甲基-苏氨酸，羟基-乙基半胱氨酸，羟基乙基同型-半胱氨酸，硝基-谷氨酰胺，同型谷氨酰胺，哌可酸，叔-亮氨酸，正缬氨酸，2-氮杂苯丙氨酸，3-氮杂苯基-丙氨酸，4-氮杂苯基-丙氨酸，和4-氟苯丙氨酸。
本领域已知一些用于将非天然存在的氨基酸残基结合到多肽中的方法。例如，可以应用体外系统，其中使用化学氨酰化的抑制剂tRNAs抑制无义突变。用于合成氨基酸和将tRNA氨酰化的方法在本领域中是已知的。包含无义突变的质粒的转录和翻译可以在包含大肠杆菌S30提取物和商购的酶和其他试剂的无细胞系统中进行。例如，可以通过层析纯化肽。在第二种方法中，通过显微注射突变的mRNA和化学氨酰化的抑制剂tRNAs而在爪蟾卵母细胞中进行翻译。在第三种方法中，将大肠杆菌细胞在不存在要被替换的天然氨基酸(例如，苯丙氨酸)且存在所需要的非天然存在的氨基酸(例如，2-氮杂苯丙氨酸，3-氮杂苯丙氨酸，4-氮杂苯丙氨酸，或4-氟苯丙氨酸)的条件下培养。所述非天然存在的氨基酸结合到多肽中替代其天然对应体。天然存在的氨基酸残基可以通过体外化学修饰转化为非天然存在的种类。化学修饰可以与定点诱变组合，从而进一步扩大置换的范围。
必需氨基酸，诸如本发明的多肽中的那些，可以按照本领域已知的步骤诸如定点诱变或丙氨酸-扫描诱变进行鉴定。生物相互作用的位点也可以通过结构的物理分析确定，如通过诸如核磁共振、结晶学、电子衍射或光亲和标记的技术联合推定的接触位点氨基酸的突变来确定。必需氨基酸的性质也可以通过分析与目的多肽的相关家族成员的同源性推导。
可以使用已知的诱变和筛选方法进行并检测多种氨基酸置换。已知这样的方法：将多肽中的两个以上的位置同时随机化，选择功能多肽，然后测序所诱变的多肽，以确定在每个位置的允许的置换的光谱。可以应用的其他方法包括噬菌体展示。
可以进行核酸分子的常规检测分析，以获得编码本发明的多肽的核酸分子的功能片段。作为示例，可以将DNA分子用Bal31核酸酶消化以得到一系列巢式缺失。然后，将这些DNA片段插入到表达载体正确的阅读框中，并且将表达的多肽分离并测试所需要的活性。外切核酸酶的替代方案是使用寡核苷酸-定向诱变来引入缺失，或使用终止密码子来指定产生需要的片段。备选地，特定的多核苷酸片段可以用聚合酶链式反应合成。
与参照多肽的序列相比较，本发明的多肽的突变体可以包含氨基酸(例如，非天然氨基酸)的一种或多种类似物，或置换的接头。在另一个实施方案中，目的多肽可以是参照多肽的模拟物，该模拟物再现所述参照多肽的至少一个表位。
本发明公开的多核苷酸和多肽序列的突变体可以通过DNA改组产生。简言之，通过母本DNA的随机片段化的体外同源重组然后类似地使用PCR导致随机引入的点突变而产生突变的DNAs。该技术可以用母本DNAs家族进行改进，以向该过程中引入另外的可变性。选择或筛选所需要的活性，然后另外的诱变和测定的重复通过选择所需要的突变同时选择有害的变化而提供快速的序列“进化”。
上文公开的诱变方法可以与高通量筛选方法组合，以检测克隆的突变多肽的活性。编码本发明的多肽或其片段的诱变的核酸分子可以从宿主细胞回收，并且应用现代化设备快速测序。这些方法允许快速确定目的多肽中个体氨基酸残基的重要性，并且可以应用于结构未知的多肽。
目的多肽的“片段”包含来自于所述多肽的序列的一系列连续的氨基酸残基。例如，目的多肽的“片段”可以包含(或由下述组成)来自所述多肽的序列的至少7个连续的氨基酸残基(例如，所述多肽的至少10，15，25，50，75，100，125，150，175，200，225，250，275，300，325，350，375，400，425，450，475，500，525，550，575，600，625，650或675个连续的氨基酸残基)。片段可以包括目的多肽的至少一个表位。
目的多肽或片段可以具有参照多肽的活性位点。
目的多肽，或其片段，可以具有与参照肽共同的抗原交叉反应性和/或基本上相同的体内生物活性。例如，多肽、或多肽片段、以及参照多肽共有共同的诱导先前暴露于分枝杆菌感染的抗原成分的免疫细胞如T-淋巴细胞(例如CD4+，CD8+，效应T细胞或记忆T细胞如TEM或TCM)的“回忆应答”的能力。
在过去的10年间已经建立了用于测量和定量免疫细胞应答(例如，T细胞应答)的新的免疫测定法。例如，干扰素-γ(IFN-γ)ELISPOT测定法可用作免疫学读取，原因在于抗原-特异性T细胞的IFN-γ分泌与针对结核分枝杆菌的保护良好相关。此外，ELISPOT测定法是一种定量分泌IFN-γ的抗原-特异性免疫细胞(例如T细胞)的数目的非常可重现和灵敏的方法。
备选地，或另外，能够结合目的多肽或片段的抗体也能够结合参照肽。
当用于本文时，术语“核酸序列”和“多核苷酸”可互换使用，并且不暗示任何长度限制。当用于本文时，术语“核酸”和“核苷酸”可互换使用。术语“核酸序列”和“多核苷酸”包括DNA(包括cDNA)和RNA序列。
本发明的多核苷酸序列包括已经从其天然存在的环境中分开的核酸序列，重组或克隆的DNA分离物，和化学合成的类似物或通过异源系统生物合成的类似物。
本发明的多核苷酸可以通过本领域已知的任何方式制备。例如，大量的所述多核苷酸可以通过在适当的宿主细胞中复制产生。编码所需要的片段的天然或合成的DNA片段将结合到重组核酸构建体中，典型地为DNA构建体，其能够引入到原核或真核细胞中并且在其中复制。通常，所述DNA构建体适于在单核宿主如酵母或细菌中自主复制，但是也可以意欲引入并且整合到培养的昆虫、哺乳动物、植物或其他真核细胞系的基因组中。
本发明的多核苷酸也可以通过化学合成产生，例如，通过磷酰胺法或三酯法产生，并且可以在商购自动化寡核苷酸合成仪上进行。可以通过合成互补链并且在适当条件下使所述链退火或者通过用DNA聚合酶与适当的引物序列添加互补链而由化学合成的单链产物得到双链片段。
术语“重组体”用在本文中指基因组、cDNA、半合成的、或合成来源的多核苷酸，利用其来源或操作，其：(1)不与其天然缔合的多核苷酸的全部或部分缔合；或(2)与除了与其天然连接的多核苷酸之外的多核苷酸连接；和(3)不是天然存在的。这种人工组合通常通过常规化学合成技术、或通过分离的核酸片段的人工操作-例如，通过常规遗传改造技术实现。
当应用于核酸序列时，在本发明的情形中，术语“分离的”表示多核苷酸序列已经与其天然遗传环境分开，并且因此不含其它外源的或不需要的编码序列(但是可以包含天然存在的5′和3′不翻译区，如启动子和终止子)，并且以适于用在遗传改造的蛋白生产系统中的形式存在。所述分离的分子是与其天然环境分离的分子。
用于分离核酸序列的方法在本领域中是已知的。
编码本发明的多肽的核酸序列可以通过常规克隆技术如PCR获得，或可以用核酸合成机器合成。制备全长多核苷酸的一种替代方式是合成特定组的重叠寡核苷酸(例如，40至100个核苷酸)，如在Glick & Pasternak，Molecular Biotechnology，Principles&Applications of Recombinant DNA(重组DNA的分子生物技术、原理和应用)，(1994)中所述。可以添加包含正确起始和终止转录和翻译的信号的其他序列。
考虑到遗传密码的简并性，在本发明的多核苷酸之间大量的序列变异是可能的。对于给定的氨基酸，包括所有可能的密码子的简并密码显示如下：
Figure BDA00002442179300991
本领域普通技术人员应该理解，为确定简并密码子引入一些错读，其代表编码每种氨基酸的所有可能的密码子。例如，简并序列所包括的一些多核苷酸可以编码变体氨基酸序列，但是本领域技术人员通过参考本发明的氨基酸序列可以容易地鉴定这样的变体序列。
“变体”核酸序列与参照核酸序列(或其片段)具有基本的同源性或基本的相似性。如果，当与另一种核酸(或其互补链)最佳比对(带有适当的核苷酸插入或缺失)时，在至少约70％，75％，80％，82，84，86，88，90，92，94，96，98或99％的核苷酸碱基存在核苷酸序列同一性，则核酸序列或其片段与参照序列“基本上同源”(或“基本上相同”)。同源性确定如前文关于多肽所述那样进行。
备选地，如果“变体”和参照序列能够在严格(例如，高度严格)杂交条件下杂交，则“变体”核酸序列与参照序列基本上同源(或基本上相同)。核酸序列杂交除了碱基组成、互补链长度和杂交核酸之间的核苷酸碱基错配数目之外，还受诸如盐浓度(例如NaCl)、温度、或有机溶剂的条件的影响，这是本领域技术人员容易理解的。优选应用严格的温度条件，并且通常包括高于30℃的温度，典型地高于37℃且优选高于45℃的温度。严格的盐条件通常小于1000mM，典型地小于500mM，并且优选地小于200mM。pH典型地为7.0-8.3。参数组合比任意单个参数要重要得多。
本领域的普通技术人员理解，不同的物种表现出“偏好的密码子应用”。当用于本文时，术语“偏好的密码子应用”是指在特定物种的细胞中最经常使用的密码子，由此偏好编码每种氨基酸的可能的密码子中的一个或几个代表。例如，氨基酸苏氨酸(Thr)可以由ACA，ACC，ACG，或ACT编码，但是在哺乳动物宿主细胞中，ACC是最常用的密码子；在其他物种中，可能偏好不同的Thr密码子。可以通过本领域已知的多种方法将特定宿主细胞所偏好的密码子引入到本发明的多核苷酸中。例如，将偏好的密码子序列引入到重组DNA中可以通过使在特定细胞类型或物种中的蛋白翻译更有效而增加蛋白的产生。
因此，在本发明的一个实施方案中，核酸序列关于在宿主细胞中表达进行密码子优化。
目的多核苷酸的“片段”包含一系列来自于所述全长多核苷酸的序列的连续的氨基酸残基。例如，目的多核苷酸的“片段”可以包含(或由下述组成)来自所述多肽序列的至少21个连续的核酸残基(例如，所述多核苷酸的至少25，50，75，100，150，200，250，300，350，400，450，500，550，600，650，700，750，800850，900，950或1000个连续的核酸残基)。片段可以包括至少一个抗原决定簇和/或可以编码对应的目的多肽的至少一个抗原表位。
目的多核苷酸，或其变体或片段，可以编码与参照肽具有共同的抗原交叉反应性和/或基本上相同的体内生物活性的多肽。
例如，由多核苷酸(或片段或变体)编码的多肽，和参照多核苷酸可以共有共同的诱导先前暴露于分枝杆菌感染的抗原成分的免疫细胞如T-淋巴细胞(例如，CD4+，CD8+，效应T细胞或记忆T细胞如TEM或TCM)的“回忆应答”的能力。
在过去的10年间已经建立了用于测量和定量免疫细胞应答(例如，T细胞应答)的新的免疫测定法。例如，干扰素-γ(IFN-γ)ELISPOT测定法可用作免疫学读取，原因在于抗原-特异性T细胞的IFN-γ分泌与针对结核分枝杆菌的保护良好相关。此外，ELISPOT测定法是一种定量分泌IFN-γ的抗原-特异性免疫细胞(例如T细胞)的数目的非常可重现和灵敏的方法。
备选地，或另外，能够结合由目的多核苷酸编码的多肽的抗体或片段或变体也能够结合由参照多核苷酸编码的多肽。
SEQ ID NOs要点：
SEQ ID NO：1潜伏期-调节肽Rv0111
SEQ ID NO：2潜伏期-调节基因Rv0111(编码SEQ ID NO：1)
SEQ ID NO：3潜伏期-调节肽Rv1806
SEQ ID NO：4潜伏期-调节基因Rv1806(encodes SEQ NO：3)
SEQ ID NO：5潜伏期-调节肽Rv0198
SEQ ID NO：6潜伏期-调节基因Rv1098(encodes SEQ ID NO：5)
SEQ ID NO：7潜伏期-调节肽Rv3812
SEQ ID NO：8潜伏期-调节基因Rv3812(encodes SEQ ID NO：7)
SEQ ID NO：9分枝杆菌肽Ag85A/Rv3804c
SEQ ID NO：10分枝杆菌肽Ag85B/Rv1886c
SEQ ID NO：11分枝杆菌肽ESAT6/Rv3875
SEQ ID NO：12分枝杆菌肽TB10.4/Rv0288
SEQ ID NO：13分枝杆菌肽Rv0125
SEQ ID NO：14分枝杆菌肽PPE18/Rv1196
SEQ ID NO：15分枝杆菌肽P27/Rv1411c
SEQ ID NO：16分枝杆菌肽HSP65/Rv0440
SEQ ID NO：17分枝杆菌肽HBHA/Rv0475
SEQ ID NO：18分枝杆菌肽Rv2659c
SEQ ID NO：19分枝杆菌肽Rv2660c
SEQ ID NO：20分枝杆菌肽HspX/Rv2031c
SEQ ID NO：21编码肽Ag85A的分枝杆菌多核苷酸
SEQ ID NO：22编码肽Ag85B的分枝杆菌多核苷酸
SEQ ID NO：23编码肽ESAT6的分枝杆菌多核苷酸
SEQ ID NO：24编码肽TB10.4的分枝杆菌多核苷酸
SEQ ID NO：25编码肽Rv0125的分枝杆菌多核苷酸
SEQ ID NO：26编码肽Rv1196的分枝杆菌多核苷酸
SEQ ID NO：27编码肽Rv1411的分枝杆菌多核苷酸
SEQ ID NO：28编码肽HSP65的分枝杆菌多核苷酸
SEQ ID NO：29编码肽HBHA的分枝杆菌多核苷酸
SEQ ID NO：30编码肽Rv2659c的分枝杆菌多核苷酸
SEQ ID NO：31编码肽Rv2660c的分枝杆菌多核苷酸
SEQ ID NO：32编码肽HspX/Rv2031c的分枝杆菌多核苷酸
SEQ ID NO：33PK标签序列
SEQ ID NO：34分枝杆菌肽RPFA/Rv0867c
SEQ ID NO：35分枝杆菌肽RPFB/Rv1009
SEQ ID NO：36分枝杆菌肽RPFC/Rv1884c
SEQ ID NO：37分枝杆菌肽RPFD/Rv2389c
SEQ ID NO：38分枝杆菌肽RPFE/Rv2450c
SEQ ID NO：39分枝杆菌肽Rv1733c
SEQ ID NO：40分枝杆菌肽Rv2029c
SEQ ID NO：41分枝杆菌肽Rv2032
SEQ ID NO：42分枝杆菌肽Rv2626c
SEQ ID NO：43分枝杆菌肽Rv2627c
SEQ ID NO：44分枝杆菌肽Rv2628
SEQ ID NO：45编码肽RPFA/Rv0867c的分枝杆菌多核苷酸
SEQ ID NO：46编码肽RPFB/Rv1009的分枝杆菌多核苷酸
SEQ ID NO：47编码肽RPFC/Rv1884c的分枝杆菌多核苷酸
SEQ ID NO：48编码肽RPFD/Rv2389c的分枝杆菌多核苷酸
SEQ ID NO：49编码肽RPFE/Rv2450c的分枝杆菌多核苷酸
SEQ ID NO：50编码肽Rv1733c的分枝杆菌多核苷酸
SEQ ID NO：51编码肽Rv2029c的分枝杆菌多核苷酸
SEQ ID NO：52编码肽Rv2032的分枝杆菌多核苷酸
SEQ ID NO：53编码肽Rv2626c的分枝杆菌多核苷酸
SEQ ID NO：54编码肽Rv2627c的分枝杆菌多核苷酸
SEQ ID NO：55编码肽Rv2628的分枝杆菌多核苷酸
SEQ ID NO：56潜伏期-调节肽Rv1807
SEQ ID NO：57潜伏期-调节基因Rv1807(编码SEQ ID NO：56)
SEQ ID NO：1
Val Pro Ala Arg Ser Val Pro Arg Pro Arg Trp Val Ala Pro Val Arg
Arg Val Gly Arg Leu Ala Val Trp Asp Arg Pro Glu Arg Arg Ser Gly
Ile Pro Ala Leu Asp Gly Leu Arg Ala Ile Ala Val Ala Leu Val Leu
Ala Ser His Gly Gly Ile Pro Gly Met Gly Gly Gly Phe Ile Gly Val
Asp Ala Phe Phe Val Leu Ser Gly Phe Leu Ile Thr Ser Leu Leu Leu
Asp Glu Leu Gly Arg Thr Gly Arg Ile Asp Leu Ser Gly Phe Trp Ile
Arg Arg Ala Arg Arg Leu Leu Pro Ala Leu Val Leu Met Val Leu Thr
Val Ser Ala Ala Arg Ala Leu Phe Pro Asp Gln Ala Leu Thr Gly Leu
Arg Ser Asp Ala Ile Ala Ala Phe Leu Trp Thr Ala Asn Trp Arg Phe
Val Ala Gln Asn Thr Asp Tyr Phe Thr Gln Gly Ala Pro Pro Ser Pro
Leu Gln His Thr Trp Ser Leu Gly Val Glu Glu Gln Tyr Tyr Val Val
Trp Pro Leu Leu Leu Ile Gly Ala Thr Leu Leu Leu Ala Ala Arg Ala
Arg Arg Arg Cys Arg Arg Ala Thr Val Gly Gly Val Arg Phe Ala Ala
Phe Leu Ile Ala Ser Leu Gly Thr Met Ala Ser Ala Thr Ala Ala Val
Ala Phe Thr Ser Ala Ala Thr Arg Asp Arg Ile Tyr Phe Gly Thr Asp
Thr Arg Ala Gln Ala Leu Leu Ile Gly Ser Ala Ala Ala Ala Leu Leu
Val Arg Asp Trp Pro Ser Leu Asn Arg Gly Trp Cys Leu Ile Arg Thr
Arg Trp Gly Arg Arg Ile Ala Arg Leu Leu Pro Phe Val Gly Leu Ala
Gly Leu Ala Val Thr Thr His Val Ala Thr Gly Ser Val Gly Glu Phe
Arg His Gly Leu Leu Ile Val Val Ala Gly Ala Ala Val Ile Val Val
Ala Ser Val Ala Met Glu Gln Arg Gly Ala Val Ala Arg Ile Leu Ala
Trp Arg Pro Leu Val Trp Leu Gly Thr Ile Ser Tyr Gly Val Tyr Leu
Trp His Trp Pro Ile Phe Leu Ala Leu Asn Gly Gln Arg Thr Gly Trp
Ser Gly Pro Ala Leu Phe Ala Ala Arg Cys Ala Ala Thr Val Val Leu
Ala Gly Ala Ser Trp Trp Leu Ile Glu Gln Pro Ile Arg Arg Trp Arg
Pro Ala Arg Val Pro Leu Leu Pro Leu Ala Ala Ala Thr Val Ala Ser
Ala Ala Ala Val Thr Met Leu Val Val Pro Val Gly Ala Gly Pro Gly
Leu Arg Glu Ile Gly Leu Pro Pro Gly Val Ser Ala Val Ala Ala Val
Ser Pro Ser Pro Pro Glu Ala Ser Gln Pro Ala Pro Gly Pro Arg Asp
Pro Asn Arg Pro Phe Thr Val Ser Val Phe Gly Asp Ser Ile Gly Trp
Thr Leu Met His Tyr Leu Pro Pro Thr Pro Gly Phe Arg Phe Ile Asp
His Thr Val Ile Gly Cys Ser Leu Val Arg Gly Thr Pro Tyr Arg Tyr
Ile Gly Gln Thr Leu Glu Gln Arg Ala Glu Cys Asp Gly Trp Pro Ala
Arg Trp Ser Ala Gln Val Asn Arg Asp Gln Pro Asp Val Ala Leu Leu
Ile Val Gly Arg Trp Glu Thr Val Asp Arg Val Asn Glu Gly Arg Trp
Thr His Ile Gly Asp Pro Thr Phe Asp Ala Tyr Leu Asn Ala Glu Leu
Gln Arg Ala Leu Ser Ile Val Gly Ser Thr Gly Val Arg Val Met Val
Thr Thr Val Pro Tyr Ser Arg Gly Gly Glu Lys Pro Asp Gly Arg Leu
Tyr Pro Glu Asp Gln Pro Glu Arg Val Asn Lys Trp Asn Ala Met Leu
His Asn Ala Ile Ser Gln His Ser Asn Val Gly Met Ile Asp Leu Asn
Lys Lys Leu Cys Pro Asp Gly Val Tyr Thr Ala Lys Val Asp Gly Ile
Lys Val Arg Ser Asp Gly Val His Leu Thr Gln Glu Gly Val Lys Trp
Leu Ile Pro Trp Leu Glu Asp Ser Val Arg Val Ala Ser
SEQ ID NO：2
gtgccggcac gttctgttcc ccggccccgt tgggtggccc cggtgcgccg ggtcggtcgg
ctggccgtat gggatcggcc ggagcggcgc agcggaattc cagcgttaga tggccttcgt
gcgatagcgg tcgcgctggt actcgccagc catggcggca tccccggtat gggcggcggg
ttcatcggcg tcgacgcctt cttcgtcttg agcggatttc tcatcacctc gctgctgctc
gacgagctgg ggcgcaccgg tcgtatcgat ctgagcgggt tctggattcg ccgtgcgcgg
cggctgctgc cggcgctggt gctgatggtt ctcaccgtga gcgccgcacg cgcactattt
cctgaccaag ctctcaccgg gctacggagc gatgcgatcg ccgcgttcct atggacggcg
aattggcggt ttgtggccca aaataccgat tacttcaccc agggcgctcc accctcgccc
ctacagcaca cctggtcgtt gggggtggag gagcagtatt acgttgtctg gccactgttg
ctgatcgggg cgacgctact gttggcggcc cgggcgaggc gccgttgcag acgggccacg
gtgggcgggg ttcggttcgc cgcgttcctg attgccagtc tcggcacgat ggcttccgcc
accgccgcgg tcgcatttac ctcggcggcc acccgcgacc ggatttactt cggcaccgat
acccgtgcgc aggcgttgct gatcggctcc gcggcagcgg ctctgctggt gcgggattgg
ccatcgctga accgcgggtg gtgcctgatc cggactcgct ggggacggcg gattgcccgt
ctgttgccgt tcgtcgggct ggctgggctg gcggtgacga ctcacgtcgc aacgggcagt
gtgggcgagt tccgccatgg tctgctgatc gtggtggcag gtgcggccgt catcgtggtt
gcctcggtag ccatggagca gcgcggagcg gtggcccgca tcctggcctg gcgaccgttg
gtgtggctgg gcaccatatc gtacggcgtc tatctgtggc actggccaat ctttctggcg
ctcaacggcc aacgtacggg ctggtcgggc ccggccctgt ttgccgctag gtgtgcagcc
acggtggtgc tggccggtgc gtcgtggtgg ctgatcgagc aacctattcg gcgctggcga
ccggcacggg ttccgctgtt gccgctggca gcggcgaccg ttgccagcgc tgccgccgtg
acgatgctcg ttgttccggt cggagccgga ccggggctac gcgagatcgg ccttccgccc
ggcgtttcgg cggtcgccgc ggtctcgccg tcgccgccgg aagcgagtca gcccgcgccc
gggccacgag atcccaaccg gccgttcacc gtttcggtat tcggtgattc gatcgggtgg
actttgatgc attacctgcc gccgactccc ggattccggt tcatcgacca caccgtcatc
ggctgcagcc tggtacgcgg cacaccgtat cggtacatcg gtcaaaccct ggagcagagg
gcggaatgcg acggctggcc ggccagatgg tcggcgcagg tcaaccggga ccaaccggac
gttgcgttgc tgatcgtcgg ccgctgggag acggtagacc gggtcaatga ggggcggtgg
acacatatcg gcgacccgac cttcgatgcg tacctcaacg ccgagctaca gcgagcgctc
agcatcgttg gatccaccgg ggttcgagtg atggtcacca ccgtgcccta cagccgcggc
ggcgaaaagc cggacggccg cttgtatccg gaggatcaac ccgagcgtgt gaacaaatgg
aacgccatgt tacataacgc cattagccaa cactcgaacg tcggaatgat cgacctcaac
aaaaagcttt gtccagacgg cgtttacacg gccaaggtcg acggcatcaa ggtccgcagt
gatggtgttc atctcaccca ggaaggcgtg aagtggctga taccgtggct tgaggattcg
gtgcgggtcg ccagt
SEQ ID NO：3
Met Ala Phe Val Leu Val Cys Pro Asp Ala Leu Ala Ile Ala Ala Gly
Gln Leu Arg His Val Gly Ser Val Ile Ala Ala Arg Asn Ala Val Ala
Ala Pro Ala Thr Ala Glu Leu Ala Pro Ala Ala Ala Asp Glu Val Ser
Ala Leu Thr Ala Thr Gln Phe Asn Phe His Ala Ala Met Tyr Gln Ala
Val Gly Ala Gln Ala Ile Ala Met Asn Glu Ala Phe Val Ala Met Leu
Gly Ala Ser Ala Asp Ser Tyr Ala Ala Thr Glu Ala Ala Asn Ile Ile
Ala Val Ser
SEQ ID NO：4
atggcgtttg ttcttgtctg tccagatgcg ctggccatcg cggccggtca gttgcgccat
gttggatcgg tgatagccgc gcggaatgcg gtcgcggcac cggcaactgc cgaattggcc
ccggcggccg ctgacgaagt atcagctttg actgcaacac aattcaactt ccatgccgcc
atgtaccaag cggtcggcgc ccaggcgatc gccatgaatg aggcgttcgt cgcgatgttg
ggcgccagcg cggattctta cgcggctacc gaagccgcca acatcattgc tgtgagc
SEQ ID NO：5
Val Thr Leu Ala Ile Pro Ser Gly Ile Asp Leu Ser His Ile Asp Ala
Asp Ala Arg Pro Gln Asp Asp Leu Phe Gly His Val Asn Gly Arg Trp
Leu Ala Glu His Glu Ile Pro Ala Asp Arg Ala Thr Asp Gly Ala Phe
Arg Ser Leu Phe Asp Arg Ala Glu Thr Gln Val Arg Asp Leu Ile Ile
Gln Ala Ser Gln Ala Gly Ala Ala Val Gly Thr Asp Ala Gln Arg Ile
Gly Asp Leu Tyr Ala Ser Phe Leu Asp Glu Glu Ala Val Glu Arg Ala
Gly Val Gln Pro Leu His Asp Glu Leu Ala Thr Ile Asp Ser Ala Ala
Asp Ala Thr Glu Leu Ala Ala Ala Leu Gly Thr Leu Gln Arg Ala Gly
Val Gly Gly Gly Ile Gly Val Tyr Val Asp Thr Asp Ser Lys Asp Ser
Thr Arg Tyr Leu Val His Phe Thr Gln Ser Gly Ile Gly Leu Pro Asp
Glu Ser Tyr Tyr Arg Asp Glu Gln His Ala Ala Val Leu Ala Ala Tyr
Pro Gly His Ile Ala Arg Met Phe Gly Leu Val Tyr Gly Gly Glu Ser
Arg Asp His Ala Lys Thr Ala Asp Arg Ile Val Ala Leu Glu Thr Lys
Leu Ala Asp Ala His Trp Asp Val Val Lys Arg Ar gAsp Ala Asp Leu
Gly Tyr Asn Leu Arg Thr Phe Ala Gln Leu Gln Thr Glu Gly Ala Gly
Phe Asp Trp Val Ser Trp Val Thr Ala Leu Gly Ser Ala Pro Asp Ala
Met Thr Glu Leu Val Val Arg Gln Pro Asp Tyr Leu Val Thr Phe Ala
Ser Leu Trp Ala Ser Val Asn Val Glu Asp Trp Lys Cys Trp Ala Arg
Trp Arg Leu Ile Arg Ala Arg Ala Pro Trp Leu Thr Arg Ala Leu Val
Ala Glu Asp Phe Glu Phe Tyr Gly Arg Thr Leu Thr Gly Ala Gln Gln
Leu Arg Asp Arg Trp Lys Arg Gly Val Ser Leu Val Glu Asn Leu Met
Gly Asp Ala Val Gly Lys Leu Tyr Val Gln Arg His Phe Pro Pro Asp
Ala Lys Ser Arg Ile Asp Thr Leu Val Asp Asn Leu Gln Glu Ala Tyr
Arg Ile Ser Ile Ser Glu Leu Asp Trp Met Thr Pro Gln Thr Arg Gln
Arg Ala Leu Ala Lys Leu Asn Lys Phe Thr Ala Lys Val Gly Tyr Pro
Ile Lys Trp Arg Asp Tyr Ser Lys Leu Ala Ile Asp Arg Asp Asp Leu
Tyr Gly Asn Val Gln Arg Gly Tyr Ala Val Asn His Asp Arg Glu Leu
Ala Lys Leu Phe Gly Pro Val Asp Arg Asp Glu Trp Phe Met Thr Pro
Gln Thr Val Asn Ala Tyr Tyr Asn Pro Gly Met Asn Glu Ile Val Phe
Pro Ala Ala Ile Leu Gln Pro Pro Phe Phe Asp Pro Gln Ala Asp Glu
Ala Ala Asn Tyr Gly Gly Ile Gly Ala Val Ile Gly His Glu Ile Gly
His Gly Phe Asp Asp Gln Gly Ala Lys Tyr Asp Gly Asp Gly Asn Leu
Val Asp Trp Trp Thr Asp Asp Asp Arg Thr Glu Phe Ala Ala Arg Thr
Lys Ala Leu Ile Glu Gln Tyr His Ala Tyr Thr Pro Arg Asp Leu Val
Asp His Pro Gly Pro Pro His Val Gln Gly Ala Phe Thr Ile Gly Glu
Asn Ile Gly Asp Leu Gly Gly Leu Ser Ile Ala Leu Leu Ala Tyr Gln
Leu Ser Leu Asn Gly Asn Pro Ala Pro Val Ile Asp Gly Leu Thr Gly
Met Gln Arg Val Phe Phe Gly Trp Ala Gln Ile Trp Arg Thr Lys Ser
Arg Ala Ala Glu Ala Ile Arg Arg Leu Ala Val Asp Pro His Ser Pro
Pro Glu Phe Arg Cys Asn Gly Val Val Arg Asn Val Asp Ala Phe Tyr
Gln Ala Phe Asp Val Thr Glu Asp Asp Ala Leu Phe Leu Asp Pro Gln
Arg Arg Val Arg Ile Trp Asn
SEQ ID NO：6
gtgacacttg ccatcccctc gggtatcgac ctgagccaca tcgacgctga tgcccgaccc
caagacgacc tgttcggcca cgttaacggc cgctggctgg ctgaacacga gataccagcg
gaccgagcga ccgacggcgc cttccgtagc ctgttcgacc gcgccgagac acaagtgcga
gacctgatca tccaggccag ccaagcaggt gctgcggtag gcaccgatgc gcagcgcatc
ggcgacctct acgccagctt cctcgacgag gaagccgtcg agcgcgcagg ggtgcaaccg
ctgcacgacg aattggccac gattgacagc gcggccgacg ccaccgaatt ggccgccgcc
cttggcactc tgcaacgtgc cggcgtgggc ggcggcatcg gagtctatgt cgataccgat
tccaaagact cgacccgtta cttggtgcat ttcacccaat ccggcatcgg attacccgac
gagtcctact accgtgacga gcaacacgcc gccgtgctag cggcctaccc ggggcacatc
gcccggatgt tcggcctggt gtacgggggc gagagccgtg accatgccaa aaccgcggac
cgcatcgtcg cgctggagac caaactcgcc gacgcgcatt gggatgtggt gaagcgccgc
gacgccgacc ttggctacaa cctgcgcacg tttgcccagc tgcagaccga aggggcgggt
ttcgactggg tcagctgggt gaccgcattg gggagcgctc cggacgccat gacggaactg
gttgtgcgcc aacctgatta cctcgtcacc tttgcctcgc tgtgggcgag cgttaacgtt
gaagactgga aatgctgggc gcgttggcgt ttgatccgcg cccgggcccc ctggctgacc
cgcgccctgg tcgccgagga cttcgaattc tacggccgca cgcttaccgg cgcacagcag
cttcgggacc gttggaagcg tggggtgtca ctggtggaga acctgatggg cgatgccgtc
ggaaagctct atgtacaacg ccatttcccg ccggatgcca agtcccgcat cgacaccctg
gtggacaacc tgcaggaggc gtatcggatc agcatcagcg agctggattg gatgacgccg
cagacccggc aacgcgcgct agcgaagctg aacaagttca ccgccaaagt cggctatccg
atcaagtggc gcgactactc gaagctggcg atcgaccgcg acgacctcta cggtaacgtc
cagcgcggct acgccgtcaa ccatgaccgc gagctagcca agcttttcgg cccggtcgac
cgcgacgagt ggttcatgac accacaaacc gtcaacgcct actacaaccc ggggatgaac
gaaatcgtct tccccgcagc gattttacag ccaccatttt tcgatccgca ggccgacgag
gccgccaact acggcgggat cggggcggtg atcgggcacg agatcgggca cggtttcgac
gatcagggcg ccaaatacga cggcgacggc aatctggtcg attggtggac cgacgacgat
cgcaccgagt tcgccgcccg caccaaagcg ttgatcgagc agtaccacgc ttacacgccg
cgcgatctcg tcgaccaccc cggcccgcct catgtgcaag gcgcgttcac cataggcgag
aacatcggcg acctgggcgg gctgtcgatc gccctgctgg cttaccagct ctcgctgaac
ggcaaccccg ctccggttat cgacgggctg accggcatgc aacgggtgtt cttcggctgg
gcacaaatat ggcgaaccaa atcgcgtgca gccgaagcaa tccgccggtt ggcggtcgat
ccgcactccc cgccggagtt ccggtgcaac ggtgtggttc gcaacgtgga cgctttttat
caggccttcg acgtcaccga ggatgacgcg ctgtttctgg acccgcagcg cagggtccgg
atctggaac
SEQ ID NO：7
Val Ser Phe Val Val Thr Val Pro Glu Ala Val Ala Ala Ala Ala Gly
Asp Leu Ala Ala Ile Gly Ser Thr Leu Arg Glu Ala Thr Ala Ala Ala
Ala Gly Pro Thr Thr Gly Leu Ala Ala Ala Ala Ala Asp Asp Val Ser
Ile Ala Val Ser Gln Leu Phe Gly Arg Tyr Gly Gln Glu Phe Gln Thr
Val Ser Asn Gln Leu Ala Ala Phe His Thr Glu Phe Val Arg Thr Leu
Asn Arg Gly Ala Ala Ala Tyr Leu Asn Thr Glu Ser Ala Asn Gly Gly
Gln Leu Phe Gly Gln Ile Glu Ala Gly Gln Arg Ala Val Ser Ala Ala
Ala Ala Ala Ala Pro Gly Gly Ala Tyr Gly Gln Leu Val Ala Asn Thr
Ala Thr Asn Leu Glu Ser Leu Tyr Gly Ala Trp Ser Ala Asn Pro Phe
Pro Phe Leu Arg Gln Ile Ile Ala Asn Gln Gln Val Tyr Trp Gln Gln
Ile Ala Ala Ala Leu Ala Asn Ala Val Gln Asn Phe Pro Ala Leu Val
Ala Asn Leu Pro Ala Ala Ile Asp Ala Ala Val Gln Gln Phe Leu Ala
Phe Asn Ala Ala Tyr Tyr Ile Gln Gln Ile Ile Ser Ser Gln Ile Gly
Phe Ala Gln Leu Phe Ala Thr Thr Val Gly Gln Gly Val Thr Ser Val
Ile Ala Gly Trp Pro Asn Leu Ala Ala Glu Leu Gln Leu Ala Phe Gln
Gln Leu Leu Val Gly Asp Tyr Asn Ala Ala Val Ala Asn Leu Gly Lys
Ala Met Thr Asn Leu Leu Val Thr Gly Phe Asp Thr Ser Asp Val Thr
Ile Gly Thr Met Gly Thr Thr Ile Ser Val Thr Ala Lys Pro Lys Leu
Leu Gly Pro Leu Gly Asp Leu Phe Thr Ile Met Thr Ile Pro Ala Gln
Glu Ala Gln Tyr Phe Thr Asn Leu Met Pro Pro Ser Ile Leu Arg Asp
Met Ser Gln Asn Phe Thr Asn Val Leu Thr Thr Leu Ser Asn Pro Asn
Ile Gln Ala Val Ala Ser Phe Asp Ile Ala Thr Thr Ala Gly Thr Leu
Ser Thr Phe Phe Gly Val Pro Leu Val Leu Thr Tyr Ala Thr Leu Gly
Ala Pro Phe Ala Ser Leu Asn Ala Ile Ala Thr Ser Ala Glu Thr Ile
Glu Gln Ala Leu Leu Ala Gly Asn Tyr Leu Gly Ala Val Gly Ala Leu
Ile Asp Ala Pro Ala His Ala Leu Asp Gly Phe Leu Asn Ser Ala Thr
Val Leu Asp Thr Pro Ile Leu Val Pro Thr Gly Leu Pro Ser Pro Leu
Pro Pro Thr Val Gly Ile Thr Leu His Leu Pro Phe Asp Gly Ile Leu
Val Pro Pro His Pro Val Thr Ala Thr Ile Ser Phe Pro Gly Ala Pro
Val Pro Ile Pro Gly Phe Pro Thr Thr Val Thr Val Phe Gly Thr Pro
Phe Met Gly Met Ala Pro Leu Leu Ile Asn Tyr Ile Pro Gln Gln Leu
Ala Leu Ala Ile Lys Pro Ala Ala
SEQ ID NO：8
gtgtcgttcg tggtcacagt gccggaggcc gtggcggctg cggcggggga tttggcggcc
atcggctcga cgcttcggga agcgaccgct gcggcggcgg gccccacgac cgggctggcg
gccgcggccg ccgacgacgt gtcgatcgct gtctcgcagc tgttcggcag gtacggccag
gaatttcaaa ccgtgagcaa ccaactggcc gcgtttcata ccgagttcgt acgcacgttg
aaccgcggcg cggcggcgta tctcaacacc gaaagcgcta acggcgggca gctgttcggt
cagatcgagg cgggacagcg cgccgtttcc gcggccgcgg ccgccgctcc gggcggcgca
tacggccaac tcgttgccaa cacggccacc aacctggaat ccctctacgg cgcatggtcg
gccaacccgt tcccattcct ccgccagatc atcgccaacc agcaggttta ctggcagcag
atcgccgcgg cgctcgccaa cgccgtccag aacttccccg ccctggtggc gaatttgcca
gcggccatcg acgcggccgt ccagcaattc ctggccttca acgcggcgta ctacatccaa
cagattatta gctcgcagat cggcttcgcc cagctattcg ccacgacggt cggtcagggg
gtcaccagcg tcattgccgg gtggcccaac cttgcggcgg agcttcagct agcgtttcaa
cagcttctgg tgggtgacta caacgccgcg gtggcgaacc tgggtaaggc catgacaaac
cttctggtca ccgggttcga caccagcgac gtgacgatcg gcacaatggg caccaccatt
agtgtcaccg cgaaacccaa gctgctgggc ccgctgggag atctgttcac catcatgacc
atcccggcac aagaggcgca gtacttcacc aacctgatgc ccccctccat cctgcgagac
atgtcgcaga acttcaccaa cgtgctcacg acgctctcca acccgaacat ccaggcggtc
gcttcgttcg atatcgcaac caccgccggg actttgagca ccttcttcgg ggtgccattg
gtgctcactt acgccacatt gggtgcgccg ttcgcgtcac tgaacgcgat tgcgacgagc
gcggaaacca tcgagcaggc cctgttggcc ggcaactacc taggggcggt gggtgcgctt
atcgacgccc cggcccacgc gttagacggc ttcctcaaca gcgcaaccgt gttggatacg
ccgatcctgg tgcccacggg gctcccgtcc cctctgcccc cgacggtcgg gatcacgctg
cacttgcctt tcgacgggat tctcgtgccg ccgcatcccg tcaccgcgac gatcagcttc
ccgggtgctc cggttcctat tcccggtttc ccaaccaccg taaccgtttt cggcacaccc
ttcatgggaa tggctccgct gctgatcaac tacattcccc aacagctcgc cctggcaatc
aaaccggcgg ct
SEQ ID NO：9
MQLVDRVRGAVTGMSRRLVVGAVGAALVSGLVGAVGGTATAGAFSRPGLPVEYLQVPSPS
MGRDIKVQFQSGGANSPALYLLDGLRAQDDFSGWDINTPAFEWYDQSGLSVVMPVGGQSS
FYSDWYQPACGKAGCQTYKWETFLTSELPGWLQANRHVKPTGSAVVGLSMAASSALTLAI
YHPQQFVYAGAMSGLLDPSQAMGPTLIGLAMGDAGGYKASDMWGPKEDPAWQRNDPLLNV
GKLIANNTRVWVYCGNGKPSDLGGNNLPAKFLEGFVRTSNIKFQDAYNAGGGHNGVFDFP
DSGTHSWEYWGAQLNAMKPDLQRALGATPNTGPAPQGA
SEQ ID NO：10
MTDVSRKIRAWGRRLMIGTAAAVVLPGLVGLAGGAATAGAFSRPGLPVEYLQVPSPSMGR
DIKVQFQSGGNNSPAVYLLDGLRAQDDYNGWDINTPAFEWYYQSGLSIVMPVGGQSSFYS
DWYSPACGKAGCQTYKWETFLTSELPQWLSANRAVKPTGSAAIGLSMAGSSAMILAAYHP
QQFIYAGSLSALLDPSQGMGPSLIGLAMGDAGGYKAADMWGPSSDPAWERNDPTQQIPKL
VANNTRLWVYCGNGTPNELGGANIPAEFLENFVRSSNLKFQDAYNAAGGHNAVFNFPPNG
THSWEYWGAQLNAMKGDLQSSLGAG
SEQ ID NO：11
MTEQQWNFAGIEAAASAIQGNVTSIHSLLDEGKQSLTKLAAAWGGSGSEAYQGVQQKWDA
TATELNNALQNLARTISEAGQAMASTEGNVTGMFA
SEQ ID NO：12
MSQIMYNYPAMLGHAGDMAGYAGTLQSLGAEIAVEQAALQSAWQGDTGITYQAWQAQWNQ
AMEDLVRAYHAMSSTHEANTMAMMARDTAEAAKWGG
SEQ ID NO：13
MSNSRRRSLRWSWLLSVLAAVGLGLATAPAQAAPPALSQDRFADFPALPLDPSAMVAQVG
PQVVNINTKLGYNNAVGAGTGIVIDPNGVVLTNNHVIAGATDINAFSVGSGQTYGVDVVG
YDRTQDVAVLQLRGAGGLPSAAIGGGVAVGEPVVAMGNSGGQGGTPRAVPGRVVALGQTV
QASDSLTGAEETLNGLIQFDAAIQPGDSGGPVVNGLGQVVGMNTAASDNFQLSQGGQGFA
IPIGQAMAIAGQIRSGGGSPTVHIGPTAFLGLGVVDNNGNGARVQRVVGSAPAASLGIST
GDVITAVDGAPINSATAMADALNGHHPGDVISVTWQTKSGGTRTGNVTLAEGPPA
SEQ ID NO：14
MVDFGALPPEINSARMYAGPGSASLVAAAQMWDSVASDLFSAASAFQSVVWGLTVGSWIG
SSAGLMVAAASPYVAWMSVTAGQAELTAAQVRVAAAAYETAYGLTVPPPVIAENRAELMI
LIATNLLGQNTPAIAVNEAEYGEMWAQDAAAMFGYAAATATATATLLPFEEAPEMTSAGG
LLEQAAAVEEASDTAAANQLMNNVPQALQQLAQPTQGTTPSSKLGGLWKTVSPHRSPISN
MVSMANNHMSMTNSGVSMTNTLSSMLKGFAPAAAAQAVQTAAQNGVRAMSSLGSSLGSSG
LGGGVAANLGRAASVGSLSVPQAWAAANQAVTPAARALPLTSLTSAAERGPGQMLGGLPV
GQMGARAGGGLSGVLRVPPRPYVMPHSPAAG
SEQ ID NO：15
MRTPRRHCRRIAVLAAVSIAATVVAGCSSGSKPSGGPLPDAKPLVEEATAQTKALKSAHM
VLTVNGKIPGLSLKTLSGDLTTNPTAATGNVKLTLGGSDIDADFVVFDGILYATLTPNQW
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SEQ ID NO：16
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SEQ ID NO：17
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SEQ ID NO：18
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SEQ ID NO：19
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SEQ ID NO：20
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SEQ ID NO：21
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atgggccgtgacatcaaggtccaattccaaagtggtggtgccaactcgcccgccctgtac
ctgctcgacggcctgcgcgcgcaggacgacttcagcggctgggacatcaacaccccggcg
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ttctactccgactggtaccagcccgcctgcggcaaggccggttgccagacttacaagtgg
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accggaagcgccgtcgtcggtctttcgatggctgcttcttcggcgctgacgctggcgatc
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gcgatgggtcccaccctgatcggcctggcgatgggtgacgctggcggctacaaggcctcc
gacatgtggggcccgaaggaggacccggcgtggcagcgcaacgacccgctgttgaacgtc
gggaagctgatcgccaacaacacccgcgtctgggtgtactgcggcaacggcaagccgtcg
gatctgggtggcaacaacctgccggccaagttcctcgagggcttcgtgcggaccagcaac
atcaagttccaagacgcctacaacgccggtggcggccacaacggcgtgttcgacttcccg
gacagcggtacgcacagctgggagtactggggcgcgcagctcaacgctatgaagcccgac
ctgcaacgggcactgggtgccacgcccaacaccgggcccgcgccccagggcgcctag
SEQ ID NO：22
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gcggctgtagtccttccgggcctggtggggcttgccggcggagcggcaaccgcgggcgcg
ttctcccggccggggctgccggtcgagtacctgcaggtgccgtcgccgtcgatgggccgc
gacatcaaggttcagttccagagcggtgggaacaactcacctgcggtttatctgctcgac
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tactaccagtcgggactgtcgatagtcatgccggtcggcgggcagtccagcttctacagc
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ggtccctcgagtgacccggcatgggagcgcaacgaccctacgcagcagatccccaagctg
gtcgcaaacaacacccggctatgggtttattgcgggaacggcaccccgaacgagttgggc
ggtgccaacatacccgccgagttcttggagaacttcgttcgtagcagcaacctgaagttc
caggatgcgtacaacgccgcgggcgggcacaacgccgtgttcaacttcccgcccaacggc
acgcacagctgggagtactggggcgctcagctcaacgccatgaagggtgacctgcagagt
tcgttaggcgccggctga
SEQ ID NO：23
atgacagagcagcagtggaatttcgcgggtatcgaggccgcggcaagcgcaatccaggga
aatgtcacgtccattcattccctccttgacgaggggaagcagtccctgaccaagctcgca
gcggcctggggcggtagcggttcggaggcgtaccagggtgtccagcaaaaatgggacgcc
acggctaccgagctgaacaacgcgctgcagaacctggcgcggacgatcagcgaagccggt
caggcaatggcttcgaccgaaggcaacgtcactgggatgttcgcatag
SEQ ID NO：24
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tatgccggcacgctgcagagcttgggtgccgagatcgccgtggagcaggccgcgttgcag
agtgcgtggcagggcgataccgggatcacgtatcaggcgtggcaggcacagtggaaccag
gccatggaagatttggtgcgggcctatcatgcgatgtccagcacccatgaagccaacacc
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SEQ ID NO：25
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SEQ ID NO：26
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SEQ ID NO：27
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SEQ ID NO：28
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gtcgtcaacaagatccgcggcaccttcaagtcggtggcggtcaaggctcccggcttcggc
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aaggtggcgctggaggccccgctgaagcagatcgccttcaactccgggctggagccgggc
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SEQ ID NO：29
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caggaagatctgcccgagcagctcaccgagctgcgtgagaagttcaccgccgaggagctg
cgtaaggccgccgagggctacctcgaggccgcgactagccggtacaacgagctggtcgag
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aagaaggctgctccggccaagaaggccgctccggccaagaaggccgctccggccaagaag
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SEQ ID NO：30
gtgacgcaaaccggcaagcgtcagagacgcaaattcggtcgcatccgacagttcaactcc
ggccgctggcaagccagctacaccggccccgacggccgcgtgtacatcgcccccaaaacc
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ctgctggacaaccacatcctggccaccttcgctgacaccgacctacgcgacatcaccccg
gccgccgtgcgccgctggtacgccaccaccgccgtgggcacaccgaccatgcgggcacac
tcctacagcttgctgcgcgcaatcatgcagaccgccttggccgacgacctgatcgactcc
aacccctgccgcatctcaggcgcgtccaccgcccgccgcgtccacaagatcaggcccgcc
accctcgacgagctggaaaccatcaccaaagccatgcccgacccctaccaggcgttcgtg
ctgatggcggcatggctggccatgcgctacggcgagctgaccgaattacgccgcaaagac
atcgacctgcacggcgaggttgcgcgggtgcggcgggctgtcgttcgggtgggcgaaggc
ttcaaggtgacgacaccgaaaagcgatgcgggagtgcgcgacataagtatcccgccacat
ctgatacccgccatcgaagaccaccttcacaaacacgtcaaccccggccgggagtccctg
ctgttcccatcggtcaacgaccccaaccgtcacctagcaccctcggcgctgtaccgcatg
ttctacaaggcccgaaaagccgccggccgaccagacttacgggtgcacgaccttcgacac
tccggcgccgtgttggctgcatccaccggcgccacactggccgaactgatgcagcggcta
ggacacagcacagccggcgccgcactccgctaccagcacgccgccaagggccgggaccgc
gaaatcgccgcactgttaagcaaactggccgagaaccaggagatgtga
SEQ ID NO：31
gtgatagcgggcgtcgaccaggcgcttgcagcaacaggccaggctagccagcgggcggca
ggcgcatctggtggggtcaccgtcggtgtcggcgtgggcacggaacagaggaacctttcg
gtggttgcaccgagtcagttcacatttagttcacgcagcccagattttgtggatgaaacc
gcaggtcaatcgtggtgcgcgatactgggattgaaccagtttcactag
SEQ ID NO：32
atggccaccacccttcccgttcagcgccacccgcggtccctcttccccgagttttctgag
ctgttcgcggccttcccgtcattcgccggactccggcccaccttcgacacccggttgatg
cggctggaagacgagatgaaagaggggcgctacgaggtacgcgcggagcttcccggggtc
gaccccgacaaggacgtcgacattatggtccgcgatggtcagctgaccatcaaggccgag
cgcaccgagcagaaggacttcgacggtcgctcggaattcgcgtacggttccttcgttcgc
acggtgtcgctgccggtaggtgctgacgaggacgacattaaggccacctacgacaagggc
attcttactgtgtcggtggcggtttcggaagggaagccaaccgaaaagcacattcagatc
cggtccaccaactga
SEQ ID NO：33
Pro Asn Pro Leu Gly Leu Asp
SEQ ID NO：34
MSGRHRKPTTSNVSVAKIAFTGAVLGGGGIAMAAQATAATDGEWDQVARCESGGNWSINT
GNGYLGGLQFTQSTWAAHGGGEFAPSAQLASREQQIAVGERVLATQGRGAWPVCGRGLSN
ATPREVLPASAAMDAPLDAAAVNGEPAPLAPPPADPAPPVELAANDLPAPLGEPLPAAPA
DPAPPADLAPPAPADVAPPVELAVNDLPAPLGEPLPAAPADPAPPADLAPPAPADLAPPA
PADLAPPAPADLAPPVELAVNDLPAPLGEPLPAAPAELAPPADLAPASADLAPPAPADLA
PPAPAELAPPAPADLAPPAAVNEQTAPGDQPATAPGGPVGLATDLELPEPDPQPADAPPP
GDVTEAPAETPQVSNIAYTKKLWQAIRAQDVCGNDALDSLAQPYVIG
SEQ ID NO：35
MLRLVVGALLLVLAFAGGYAVAACKTVTLTVDGTAMRVTTMKSRVIDIVEENGFSVDDRD
DLYPAAGVQVHDADTIVLRRSRPLQISLDGHDAKQVWTTASTVDEALAQLAMTDTAPAAA
SRASRVPLSGMALPVVSAKTVQLNDGGLVRTVHLPAPNVAGLLSAAGVPLLQSDHVVPAA
TAPIVEGMQIQVTRNRIKKVTERLPLPPNARRVEDPEMNMSREVVEDPGVPGTQDVTFAV
AEVNGVETGRLPVANVVVTPAHEAVVRVGTKPGTEVPPVIDGSIWDAIAGCEAGGNWAIN
TGNGYYGGVQFDQGTWEANGGLRYAPRADLATREEQIAVAEVTRLRQGWGAWPVCAARAG
AR
SEQ ID NO：36
VHPLPADHGRSRCNRHPISPLSLIGNASATSGDMSSMTRIAKPLIKSAMAAGLVTASMSL
STAVAHAGPSPNWDAVAQCESGGNWAANTGNGKYGGLQFKPATWAAFGGVGNPAAASREQ
QIAVANRVLAEQGLDAWPTCGAASGLPIALWSKPAQGIKQIINEIIWAGIQASIPR
SEQ ID NO：37
MTPGLLTTAGAGRPRDRCARIVCTVFIETAVVATMFVALLGLSTISSKADDIDWDAIAQC
ESGGNWAANTGNGLYGGLQISQATWDSNGGVGSPAAASPQQQIEVADNIMKTQGPGAWPK
CSSCSQGDAPLGSLTHILTFLAAETGGCSGSRDD
SEQ ID NO：38
LKNARTTLIAAAIAGTLVTTSPAGIANADDAGLDPNAAAGPDAVGFDPNLPPAPDAAPVD
TPPAPEDAGFDPNLPPPLAPDFLSPPAEEAPPVPVAYSVNWDAIAQCESGGNWSINTGNG
YYGGLRFTAGTWRANGGSGSAANASREEQIRVAENVLRSQGIRAWPVCGRRG
SEQ ID NO：39
MIATTRDREGATMITFRLRLPCRTILRVFSRNPLVRGTDRLEAVVMLLAVTVSLLTIPFA
AAAGTAVQDSRSHVYAHQAQTRHPATATVIDHEGVIDSNTTATSAPPRTKITVPARWVVN
GIERSGEVNAKPGTKSGDRVGIWVDSAGQLVDEPAPPARAIADAALAALGLWLSVAAVAG
ALLALTRAILIRVRNASWQHDIDSLFCTQR
SEQ ID NO：40
MTEPAAWDEGKPRIITLTMNPALDITTSVDVVRPTEKMRCGAPRYDPGGGGINVARIVHV
LGGCSTALFPAGGSTGSLLMALLGDAGVPFRVIPIAASTRESFTVNESRTAKQYRFVLPG
PSLTVAEQEQCLDELRGAAASAAFVVASGSLPPGVAADYYQRVADICRRSSTPLILDTSG
GGLQHISSGVFLLKASVRELRECVGSELLTEPEQLAAAHELIDRGRAEVVVVSLGSQGAL
LATRHASHRFSSIPMTAVSGVGAGDAMVAAITVGLSRGWSLIKSVRLGNAAGAAMLLTPG
TAACNRDDVERFFELAAEPTEVGQDQYVWHPIVNPEASP
SEQ ID NO：41
MPDTMVTTDVIKSAVQLACRAPSLHNSQPWRWIAEDHTVALFLDKDRVLYATDHSGREAL
LGCGAVLDHFRVAMAAAGTTANVERFPNPNDPLHLASIDFSPADFVTEGHRLRADAILLR
RTDRLPFAEPPDWDLVESQLRTTVTADTVRIDVIADDMRPELAAASKLTESLRLYDSSYH
AELFWWTGAFETSEGIPHSSLVSAAESDRVTFGRDFPVVANTDRRPEFGHDRSKVLVLST
YDNERASLLRCGEMLSAVLLDATMAGLATCTLTHITELHASRDLVAALIGQPATPQALVR
VGLAPEMEEPPPATPRRPIDEVFHVRAKDHR
SEQ ID NO：42
MTTARDIMNAGVTCVGEHETLTAAAQYMREHDIGALPICGDDDRLHGMLTDRDIVIKGLA
AGLDPNTATAGELARDSIYYVDANASIQEMLNVMEEHQVRRVPVISEHRLVGIVTEADIA
RHLPEHAIVQFVKAICSPMALAS
SEQ ID NO：43
MASSASDGTHERSAFRLSPPVLSGAMGPFMHTGLYVAQSWRDYLGQQPDKLPIARPTIAL
AAQAFRDEIVLLGLKARRPVSNHRVFERISQEVAAGLEFYGNRRWLEKPSGFFAQPPPLT
EVAVRKVKDRRRSFYRIFFDSGFTPHPGEPGSQRWLSYTANNREYALLLRHPEPRPWLVC
VHGTEMGRAPLDLAVFRAWKLHDELGLNIVMPVLPMHGPRGQGLPKGAVFPGEDVLDDVH
GTAQAVWDIRRLLSWIRSQEEESLIGLNGLSLGGYIASLVASLEEGLACAILGVPVADLI
ELLGRHCGLRHKDPRRHTVKMAEPIGRMISPLSLTPLVPMPGRFIYAGIADRLVHPREQV
TRLWEHWGKPEIVWYPGGHTGFFQSRPVRRFVQAALEQSGLLDAPRTQRDRSA
SEQ ID NO：44
MSTQRPRHSGIRAVGPYAWAGRCGRIGRWGVHQEAMMNLAIWHPRKVQSATIYQVTDRSH
DGRTARVPGDEITSTVSGWLSELGTQSPLADELARAVRIGDWPAAYAIGEHLSVEIAVAV
SEQ ID NO：45
atgagtggacgccaccgtaagcccaccacatccaacgtcagcgtcgccaagatcgccttt
accggcgcagtactcggtggcggcggcatcgccatggccgctcaggcgaccgcggccacc
gacggggaatgggatcaggtggcccgctgcgagtcgggcggcaactggtcgatcaacacc
ggcaacggttacctcggtggcttgcagttcactcaaagcacctgggccgcacatggtggc
ggcgagttcgccccgtcggctcagctggccagccgggagcagcagattgccgtcggtgag
cgggtgctggccacccagggtcgcggcgcctggccggtgtgcggccgcgggttatcgaac
gcaacaccccgcgaagtgcttcccgcttcggcagcgatggacgctccgttggacgcggcc
gcggtcaacggcgaaccagcaccgctggccccgccgcccgccgacccggcgccacccgtg
gaacttgccgctaacgacctgcccgcaccgctgggtgaacccctcccggcagctcccgcc
gacccggcaccacccgccgacctggcaccacccgcgcccgccgacgtcgcgccacccgtg
gaacttgccgtaaacgacctgcccgcaccgctgggtgaacccctcccggcagctcccgcc
gacccggcaccacccgccgacctggcaccacccgcgcccgccgacctggcgccacccgcg
cccgccgacctggcgccacccgcgcccgccgacctggcaccacccgtggaacttgccgta
aacgacctgcccgcgccgctgggtgaacccctcccggcagctcccgccgaactggcgcca
cccgccgatctggcacccgcgtccgccgacctggcgccacccgcgcccgccgacctggcg
ccacccgcgcccgccgaactggcgccacccgcgcccgccgacctggcaccacccgctgcg
gtgaacgagcaaaccgcgccgggcgatcagcccgccacagctccaggcggcccggttggc
cttgccaccgatttggaactccccgagcccgacccccaaccagctgacgcaccgccgccc
ggcgacgtcaccgaggcgcccgccgaaacgccccaagtctcgaacatcgcctatacgaag
aagctgtggcaggcgattcgggcccaggacgtctgcggcaacgatgcgctggactcgctc
gcacagccgtacgtcatcggctga
SEQ ID NO：46
atgttgcgcctggtagtcggtgcgctgctgctggtgttggcgttcgccggtggctatgcg
gtcgccgcatgcaaaacggtgacgttgaccgtcgacggaaccgcgatgcgggtgaccacg
atgaaatcgcgggtgatcgacatcgtcgaagagaacgggttctcagtcgacgaccgcgac
gacctgtatcccgcggccggcgtgcaggtccatgacgccgacaccatcgtgctgcggcgt
agccgtccgctgcagatctcgctggatggtcacgacgctaagcaggtgtggacgaccgcg
tcgacggtggacgaggcgctggcccaactcgcgatgaccgacacggcgccggccgcggct
tctcgcgccagccgcgtcccgctgtccgggatggcgctaccggtcgtcagcgccaagacg
gtgcagctcaacgacggcgggttggtgcgcacggtgcacttgccggcccccaatgtcgcg
gggctgctgagtgcggccggcgtgccgctgttgcaaagcgaccacgtggtgcccgccgcg
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通过下述实施例，本发明将更清楚，实施例目的仅是示意本发明而决不是限制。
实施例
实施例1-包含本发明的多肽的亚单位疫苗
为了制备包含多肽的亚单位疫苗，首先需要获得制备所述疫苗的多肽供应品。这可以通过从TB培养物纯化目的蛋白或通过克隆目的基因并且产生重组蛋白而实现。
通过PCR扩增关于目的基因的克隆序列，在N端和C端插入限制性位点，以允许符合阅读框地克隆到蛋白表达载体如pET-15b中。基因插入在可诱导的启动子如lacZ之后。然后将载体转化到培养生长的大肠杆菌中。过度表达并且纯化重组蛋白。
一种常见的纯化方法是生产带有N-端纯化标签-例如His-标签的重组蛋白。然后可以基于His-标签对Ni-NTA柱上的金属离子的亲和性纯化所述蛋白，之后切割所述His-标签。然后，将纯化的蛋白在适当的佐剂中施用给动物。
当组合使用至少2种分枝杆菌抗原时，第一和第二分枝杆菌抗原可以作为分开的多肽表达并且通过用佐剂混合并且在单一部位接种而组合使用。备选地，第一和第二分枝杆菌抗原可以作为融合蛋白表达，与佐剂混合并且用于在单一部位接种。
实施例2-使用BCG作为微生物载体
通过PCR扩增目的多核苷酸序列。纯化扩增的产物并且克隆到质粒(pMV306)中，其在用于分枝杆菌噬菌体L5的附着位点(attB)位点特异性整合到分枝杆菌基因组中。
通过电穿孔用该质粒转化BCG，其包括用高压电脉冲破坏细胞包膜，导致DNA的摄入。质粒在attB位点整合到BCG染色体中，产生稳定的重组体。选择重组体并且通过PCR或Southern印迹检验以确保已经整合所述基因。然后用重组菌株进行蛋白质研究。
目的多核苷酸序列可以包含如本文定义的单一分枝杆菌抗原、第一和第二分枝杆菌抗原、或其片段。
实施例3-表达分枝杆菌基因的病毒载体(例如减毒的痘苗病毒)
Figure BDA00002442179301251
这种类型的方法的一种最佳实例是使用修饰的痘苗病毒Ankara(MVA)。允许外源基因或靶基因重组到MVA基因组中的方法在本领域中是公知的[1，2]。
靶基因的插入通过具有与上述这些特征相似的特征的转运DNA介导。转运DNA可以以质粒的形式存在，所述质粒可以在对于常规克隆方法最优化的细菌菌株中增殖。靶基因被引入到启动子(如mH5、p7.5或其他)下游的盒中。靶基因可以包含本发明的多核苷酸中的一种或多种和/或其片段。靶基因还可以包含辅助辅因子，如B7-1或IL-12，如本领域中充分描述的[3]。靶基因可以位于优化的Kozak序列-例如GCCACCATGG的下游并且符合阅读框。靶基因还可以位于前导序列-例如tPA的下游并且符合阅读框。靶基因可以位于符合阅读框的标签-例如V5、HIS或另一种标签的上游。盒向MVA基因组中的转移由本领域公知的同源侧翼区-例如DelI-VI介导。
1.Earl PL等人.Current Protocols in Protein Science，(2001)“Generation ofrecombinant vaccinia viruses(重组痘苗病毒的产生)”。
2.Earl PL等人.Current Protocols in Protein Science，(2001)“Preparation ofcell cultures and vaccine virus stocks(细胞培养物和疫苗病毒储液的制备)”。
3.Carroll MW等人.Journal of the National Cancer Institute，(1998)“Construction and characterization of a triple-recombinant vaccine virusencoding B7-1，Interleukin 12and a model tumor antigen(编码B7-1、白介素12和模式肿瘤抗原的三联-重组疫苗病毒的构建和表征)”。
实施例4-携带分枝杆菌多核苷酸的质粒DNA疫苗
通过PCR扩增目的多核苷酸序列，纯化并且插入到为疫苗开发研发的专用载体中，如pVAX1。这些载体包含启动子序列(例如，CMV或SV40启动子)，其引导所引入的多核苷酸(编码候选抗原)在真核细胞中的强表达；和多聚腺苷酸化信号(例如，SV40或牛生长激素)，以稳定mRNA转录物。
将所述载体转化到大肠杆菌中，并且用所述质粒编码的标记如卡那霉素抗性选择转化体。然后从转化的菌落回收所述质粒，并且测序以检验目的多核苷酸存在并且正确编码而没有PCR产生的突变。
然后，在大肠杆菌中产生大量的质粒，并且用商购试剂盒(例如QiagenEndofree-plasmid preparation)回收并纯化所述质粒。然后，将疫苗在存在或不存在佐剂的条件下施用给动物(例如，通过肌内注射)。
分开编码第一分枝杆菌抗原或第二分枝杆菌抗原的质粒DNA可以混合并且在单一施用部位接种。可以构建表达第一和第二分枝杆菌抗原二者(以及任选地第三分枝杆菌抗原)的单一质粒。
实施例5-携带多个分枝杆菌多核苷酸的质粒DNA疫苗
可以如实施例4所述制备分开编码第三和/或其他(例如，第四和第五)分枝杆菌抗原的其他质粒DNA。编码第三和/或其他分枝杆菌抗原的分开的质粒可以与编码第一和第二分枝杆菌抗原的质粒DNA(例如，如在实施例4中制备)同时或顺次在单一施用部位接种。
备选地，可以如实施例4所述构建表达第三和一种或多种其他(例如第四和第五)分枝杆菌抗原的单一质粒。所述单一质粒可以与分开编码第一和第二分枝杆菌抗原或来自单一质粒的质粒DNA同时或顺次在单一施用部位接种。备选地，可以如实施例4所述构建表达第一、第二和第三(以及，任选地，一种或多种其他-例如，第四和第五)分枝杆菌抗原的单一质粒。
实施例6-制备DNA表达载体
DNA疫苗由克隆到细菌质粒中的目的核酸序列组成。质粒载体pVAX1常用于制备DNA疫苗。所述载体设计成促进在大肠杆菌中的高拷贝数复制和在大部分哺乳动物细胞中目的肽的高水平瞬时表达(详细请见关于pVAX1的制备流程(产品目录编号V260-20www.invitrogen.com))。
所述载体包含下述元件：
Figure BDA00002442179301271
人巨细胞病毒即时-早期(CMV)启动子，其用于在多种哺乳动物细胞中高水平表达
Figure BDA00002442179301272
T7启动子/引发位点，其允许以有义方向体外转录并且通过该插入物测序
Figure BDA00002442179301273
牛生长激素(BGH)多聚腺苷酸化信号，其用于mRNA的有效的转录终止和多聚腺苷酸化
Figure BDA00002442179301274
卡那霉素抗性基因，其用于在大肠杆菌中选择
Figure BDA00002442179301275
多克隆位点
Figure BDA00002442179301276
pUC起点，其用于在大肠杆菌中高拷贝数复制和生长
BGH反向引发位点，其允许通过该插入物测序
可以通过本领域已知的标准重组技术，例如Sambrook等人.(1989)，来制备载体。制备疫苗的关键阶段如下：
Figure BDA00002442179301282
将目的多核苷酸通过多克隆位点中的一个连接到pVAX1中
Figure BDA00002442179301283
然后，将连接的混合物转化到感受态大肠杆菌菌株(例如TOP10)中，并且使用包含50μg/ml卡那霉素的LB平板来选择转化体。
Figure BDA00002442179301284
选择克隆并且可以测序来验证目的基因的存在和方向。
Figure BDA00002442179301285
一旦证实存在所述基因，所述载体可以用来转染哺乳动物细胞系，从而检验蛋白表达。转染方法在本领域中是已知的并且包括，例如，电穿孔、磷酸钙和脂质转染。
Figure BDA00002442179301286
一旦证实多肽表达，可以由适当的细胞宿主例如大肠杆菌产生并纯化大量的所述载体。
pVAX1不整合到宿主染色体中。所有的非必需序列都被去除，以最小化整合的可能性。当构建特定的载体时，可以包含前导序列，以在真核细胞中表达时引导所编码的蛋白的分泌。
可以使用的载体的一个实例包括V1Jns.tPA和pCMV4。
可以使用整合到宿主基因组中的表达载体，然而，使用不整合的载体更常用并且更优选。整合将导致产生引起其他问题的遗传修饰的宿主。
实施例7-制备包含多个抗原的DNA表达载体
DNA疫苗由克隆到细菌质粒中的目的核酸序列组成。质粒载体pVAX1常用于制备DNA疫苗。所述载体设计成促进在大肠杆菌中的高拷贝数复制和在大部分哺乳动物细胞中目的肽的高水平瞬时表达(详细请见关于pVAX1的制备流程(产品目录编号V260-20www.invitrogen.com))。
所述载体包含下述元件：
Figure BDA00002442179301287
人巨细胞病毒即时-早期(CMV)启动子，其用于在多种哺乳动物细胞中高水平表达
T7启动子/引发位点，其允许以有义方向体外转录并且通过该插入物测序
Figure BDA00002442179301292
牛生长激素(BGH)多聚腺苷酸化信号，其用于mRNA的有效的转录终止和多聚腺苷酸化
Figure BDA00002442179301293
卡那霉素抗性基因，其用于在大肠杆菌中选择
Figure BDA00002442179301294
多克隆位点
Figure BDA00002442179301295
pUC起点，其用于在大肠杆菌中高拷贝数复制和生长
Figure BDA00002442179301296
BGH反向引发位点，其允许通过该插入物测序
可以通过本领域已知的标准重组技术，例如Sambrook等人.(1989)，
Figure BDA00002442179301297
克隆(Invitrogen，UK)来制备载体。制备疫苗的关键阶段如下：
Figure BDA00002442179301298
将目的多核苷酸通过多克隆位点中的一个连接到pVAX1中或通过
Figure BDA00002442179301299
克隆引入
Figure BDA000024421793012910
多于一种抗原的多核苷酸可以作为重组融合体表达
Figure BDA000024421793012911
转化感受态大肠杆菌菌株(例如TOP10)，并且使用包含50μg/ml卡那霉素的LB平板来选择转化体。
选择克隆并且可以测序来验证目的基因的存在和方向。
Figure BDA000024421793012913
一旦证实存在所述基因，所述载体可以用来转染哺乳动物细胞系，从而检验蛋白表达。转染方法在本领域中是已知的并且包括，例如，电穿孔、磷酸钙和脂质转染。
Figure BDA000024421793012914
一旦证实多肽表达，可以由适当的细胞宿主例如大肠杆菌产生并纯化大量的所述载体。
pVAX1不整合到宿主染色体中。所有的非必需序列都被去除，以最小化整合的可能性。当构建特定的载体时，可以包含前导序列，以在真核细胞中表达时引导所编码的蛋白的分泌。
可以使用的载体的一个实例包括V1Jns.tPA和pCMV4。
可以使用整合到宿主基因组中的表达载体，然而，使用不整合的载体更常用并且更优选。整合将导致产生引起其他问题的遗传修饰的宿主。
可以这样构建表达多个分枝杆菌抗原的单一质粒。例如，所述单一质粒可以编码第一和第二分枝杆菌抗原二者。所述单一质粒可以另外编码一种或多种其他分枝杆菌抗原，诸如第三分枝杆菌抗原(以及任选地，一种或多种其他的-例如第四和第五)分枝杆菌抗原。
实施例8-RNA疫苗
RNA可以被直接引入到宿主中。因此，载体构建体可以用于在体外产生RNA，然后将纯化的RNA注射到宿主中。然后，RNA在宿主细胞中作为翻译模板。在这一实施例中，整合通常不发生。
替代的选择是使用感染试剂，诸如携带与目的基因相对应的RNA的反转录基因组。在这一实施例中，将发生整合到宿主基因组中。
另一种选择是使用RNA复制子疫苗，其可以来源于病毒载体，如Sindbis病毒或西门利克森林病毒(Semliki Forest virus)。这些疫苗是自我复制的且自我限制，并且可以作为RNA或DNA施用，然后其在体内转录成RNA复制子。所述载体最终引起所转染的细胞裂解，由此减少关于整合到宿主基因组中的担忧。
实施例9-基于评估免疫细胞应答的诊断测定法
对于基于评估免疫细胞应答(例如T细胞应答)的诊断测定法，获得来自患者的血液样品将是足够的。可以用密度梯度如Ficoll梯度从血液中分离单核的细胞(单核细胞，T和B淋巴细胞)。
单核细胞和B-淋巴细胞二者都能够呈递抗原，尽管不如专门的抗原呈递细胞(APCs)如树突细胞有效。后者常位于淋巴组织中。
最简单的方法是将抗原添加到分离的单核细胞中，并且温育一周，然后评估增殖的量。如果个体先前通过感染已经暴露于所述抗原，那么对所述抗原特异性的免疫细胞克隆(例如T-细胞克隆)在所述样品中应该是更普遍的，并且应该应答。
如果需要控制T细胞与APCs的比例，还可以分离不同的细胞群体。
这种类型的测定法的另一种变化是测量应答淋巴细胞的细胞因子的产生作为应答的测量。ELISPOT测定法是这种测定法的一种适当的实例。
实施例10-检测潜伏期分枝杆菌
可以通过检测血液样品中的抗原-特异性抗体、或通过检测免疫细胞如T-细胞来检测潜伏期分枝杆菌-相关的抗原的存在。
将96孔板用细胞因子(例如，干扰素-，IL-2)-特异性抗体包被。然后从患者的全血分离外周血单核细胞，并且应用到孔中。
添加抗原，以刺激可能存在的特定的免疫细胞(例如T细胞)，并且将平板温育24小时。所述抗原刺激所述免疫细胞(例如T细胞)产生结合特定的抗体的细胞因子。
洗涤平板，留下存在抗原-特异性免疫细胞(例如T细胞)的印迹。然后，添加与适当的检测系统偶联的第二抗体，例如酶，并且在添加适当的底物后，计数点的数目。点的数目，每个对应于单一抗原-特异性免疫细胞(例如T细胞)，与原始加入的细胞总数相关。
上述测定法也可以用来区分TB-感染的个体与BCG-接种的个体。
实施例11-多种抗原的抗原活性
将小鼠用至少第一和第二分枝杆菌抗原免疫。递送系统包括(但不限于)DNA疫苗、重组MVA、辅助的蛋白。递送途径包括(但不限于)皮下、真皮内、肌内施用。免疫方案可以包括异源致敏-加强-例如，用DNA疫苗‘致敏’，然后用MVA疫苗‘加强’。免疫方案可以包括多个剂量。
接种后(例如，约2周后)，从接种的动物取出脾细胞，并且用代表一种或多种免疫抗原的多肽刺激。通过抗原-特异性诱导的细胞因子(例如IFN-y)释放可以测量免疫应答，并且是针对靶抗原免疫的证据。
当动物已用包含第一和第二分枝杆菌抗原的疫苗免疫时，在共同施用时，针对同一样品中的第一和第二分枝杆菌抗原的抗原回忆应答表明两种抗原的免疫原性。免疫原性对于保护性功效是首要的。
按照这一实施例产生的数据示例在图1-6中。
图1A和B图示针对单独的和组合的抗原Ag85A和Rv1807的脾细胞应答(图1A＝肌内；图1B＝真皮内)。
图2图示针对单独的和组合的抗原Ag85A和Rv0111的脾细胞应答。
图3图示针对单独的和组合的抗原Ag85A和Rv0198的脾细胞应答。
图4图示针对单独的和组合的抗原Ag85A和Rv1807的脾细胞应答(图1B中的IM数据的重复)。
图5图示针对单独的和组合的抗原Ag85A和Rv1806的脾细胞应答。
图6图示针对单独的和组合的抗原Rv1806、Rv1807、Rv0198和Rv0111的脾细胞应答。
实施例12-在实验模型中证实疫苗功效
疫苗候选物在豚鼠中的功效可以基于在气雾剂攻击后4周减少肺和/或脾中的结核分枝杆菌的细菌负荷进行评估。
第一和第二分枝杆菌抗原作为在Th1-诱导佐剂如DDA/MPL中的亚单位DNA疫苗或蛋白、或通过表达载体如重组病毒或BCG(见实施例1-4)递送。第一和第二分枝杆菌抗原以设计为使免疫系统致敏的方式递送，其包括上述全部。通过接种DNA、多肽或病毒载体或(较不常用)重组BCG对初始致敏进行至少一次‘加强’。6-8只豚鼠的组免疫两次或三次，每次免疫之间休息2-3周。在最后一次接种后，在攻击之前，豚鼠休息6周。
一组阳性对照动物皮下接种5x104个BCG Danish(1331)的菌落形成单位(CFU)，一组阴性对照动物给予盐水。
最后一次接种后六周，将结核分枝杆菌的细小颗粒气雾剂(平均直径2μm；在Collison喷雾器中产生)用包含的Henderson装置直接递送到动物的吻部。将在恒化器中在限定条件下培养的攻击菌株结核分枝杆菌H37Rv(NCTC 7416)的混悬液稀释至1x 106CFU/ml，以得到约10CFU/肺的估计保持的、吸入的剂量。
在气雾剂攻击后四周，将动物人道地杀死，并且取出肺进行CFU确定。
将匀浆的样品连续稀释，并且涂布在Middlebrook 7H11选择琼脂上，确定对于每个治疗组的平均CFU。根据与盐水对照组相比较的肺或脾中的细菌计数的减少评估疫苗功效。将测试疫苗的平均log10CFU与阴性对照比较，并且用适当的检验法如Mann-Whitney统计分析各组之间的差别。
第一和第二分枝杆菌抗原的任意组合给出存活的结核分枝杆菌数目的减少，其统计学显著性地(p＝＜0.05)低于假接种(盐水)对照，这表明所述抗原在共同施用时的保护性功效。
在豚鼠中的保护性功效指示组合疫苗保护人和动物免受致病性分枝杆菌感染的能力。
实施例13-在实验模型中证实疫苗功效
疫苗候选物在豚鼠中的功效可以基于在气雾剂攻击后4周减少脾中的结核分枝杆菌的细菌负荷进行评估。
第一和第二分枝杆菌抗原作为在Th1-诱导佐剂如DDA/MPL中的亚单位DNA疫苗或蛋白、或通过表达载体如重组病毒或BCG(见实施例1-4)递送。第一和第二分枝杆菌抗原以设计为使免疫系统致敏的方式递送，其包括上述全部。通过接种DNA、多肽或病毒载体或(较不常用)重组BCG对初始致敏进行至少一次‘加强’。6-8只豚鼠的组免疫两次或三次，每次免疫之间休息2-3周。在最后一次接种后，在攻击之前，豚鼠休息6周。
一组阳性对照动物皮下接种5x104个BCG Danish(1331)的菌落形成单位(CFU)，一组阴性对照动物给予盐水或保持不接种。
最后一次接种后六周，将结核分枝杆菌的细小颗粒气雾剂(平均直径2μm；在Collison喷雾器中产生)用包含的Henderson装置直接递送到动物的吻部。将在恒化器中在限定条件下培养的攻击菌株结核分枝杆菌H37Rv(NCTC 7416)的混悬液稀释至1x106CFU/ml，以得到约10CFU/肺的估计保持的、吸入的剂量。
在气雾剂攻击后四周，将动物人道地杀死，并且取出脾进行CFU确定。
将匀浆的样品连续稀释，并且涂布在Middlebrook 7H11选择琼脂上，确定对于每个治疗组的平均CFU。根据与盐水或未接种的对照组相比较的脾中的细菌计数的减少评估疫苗功效。将测试疫苗的平均log10CFU与阴性对照比较，并且用适当的检验法如Mann-Whitney统计分析各组之间的差别。
第一和第二分枝杆菌抗原的任意组合给出存活的结核分枝杆菌数目的减少，其统计学显著性地(p＝＜0.05)低于未接种的对照，这表明所述抗原在共同施用时的保护性功效。
在豚鼠中的保护性功效指示组合疫苗保护人和动物免受致病性分枝杆菌感染的能力。
按照本实施例产生的数据显示在图7中。图7显示响应每种单独的抗原Rv0111，Rv0198c，Rv3812，Rv1806和Rv180和响应组合抗原Rv0111与Rv0198c的细菌负荷的减少。
实施例14-多个抗原的抗原活性
将小鼠用至少第一和第二分枝杆菌抗原感染。递送系统包括(但不限于)DNA疫苗、重组MVA或辅助的蛋白。递送途径包括(但不限于)皮下、真皮内或肌内施用。免疫方案可以包括异源致敏-加强-例如，用DNA疫苗‘致敏’，然后用MVA疫苗‘加强’，和/或可以包括多个剂量。
接种后(例如，约2周后)，从接种的动物取出血清，并且筛查抗体的存在。通过检测对免疫抗原特异性的抗体(例如，如通过ELISA检测的)可测量免疫应答。
当动物已用包含第一和第二分枝杆菌抗原的疫苗免疫时，在共同施用时，同一样品中针对第一和第二分枝杆菌抗原的抗体的存在表明两种抗原的免疫原性。免疫原性对于保护功效是首要的。
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Claims (30)

1.抗原组合物，所述抗原组合物包含：
(i)第一分枝杆菌抗原多肽，其中所述第一分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；或
(ii)第一分枝杆菌多核苷酸，其中所述第一分枝杆菌多核苷酸包含编码所述第一分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列；
并且还包含：
(iii)第二分枝杆菌抗原多肽，其中所述第二分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；或
(iv)第二分枝杆菌多核苷酸，其中所述第二分枝杆菌多核苷酸包含编码所述第二分枝杆菌多肽的多核苷酸序列。
2.根据权利要求1所述的抗原组合物，其中所述第一分枝杆菌多核苷酸包含与SEQ ID NO：2的核酸序列具有至少70％的核苷酸序列同一性的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段。
3.根据权利要求1或2所述的抗原组合物，其中所述第二分枝杆菌多核苷酸包含与SEQ ID NO：6的核酸序列具有至少70％的核苷酸序列同一性的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的抗原组合物，所述抗原组合物还包含至少一种另外的分枝杆菌抗原多肽，所述另外的分枝杆菌抗原多肽不同于所述第一分枝杆菌抗原多肽和/或所述第二分枝杆菌抗原多肽；或还包含至少一种另外的分枝杆菌多核苷酸，所述另外的分枝杆菌多核苷酸不同于所述第一分枝杆菌多核苷酸和/或所述第二分枝杆菌多核苷酸。
5.根据权利要求4所述的抗原组合物，其中所述至少一种另外的分枝杆菌抗原多肽包含与选自SEQ ID NOs：3，7，9-20，34-44或56的任一种的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段。
6.根据权利要求4所述的抗原组合物，其中所述至少一种另外的分枝杆菌多核苷酸包含编码如权利要求5定义的多肽序列的多核苷酸序列；诸如与选自SEQ ID NOs：4，8，21-32，45-55或57的核酸序列具有至少70％的核苷酸序列同一性的多核苷酸序列，或具有其至少21个连续的核苷酸的其片段。
7.根据前述权利要求任一项所述的抗原组合物，其中所述抗原组合物包含至少一种载体；其中所述载体包含至少一种所述分枝杆菌多核苷酸。
8.根据权利要求7所述的抗原组合物，其中所述载体包含所述第一分枝杆菌多核苷酸和所述第二分枝杆菌多核苷酸。
9.根据权利要求7或8所述的抗原组合物，其中所述载体是表达载体，或病毒载体，如减毒的痘苗病毒(vaccinia virus)载体或腺病毒载体。
10.根据前述权利要求任一项所述的抗原组合物，其中所述抗原组合物包含至少一种细胞，并且其中所述细胞包含所述分枝杆菌抗原多肽和/或分枝杆菌多核苷酸中的至少一种；如其中所述细胞是减毒的微生物载体，如减毒的沙门氏菌(salmonella)、减毒的牛分枝杆菌(M.bovis)(例如，BCG菌株)或减毒的结核分枝杆菌(M.tuberculosis)。
11.免疫原性组合物，所述免疫原性组合物包含第一抗体和第二抗体，其中所述第一抗体结合第一分枝杆菌抗原多肽，并且所述第二抗体结合第二分枝杆菌抗原多肽；
其中所述第一分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；
并且其中所述第二分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段。
12.用于制备治疗性或预防性制剂(例如，疫苗)的方法，所述方法包括组合药用载体与：
(i)第一分枝杆菌抗原多肽，其中所述第一分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；或
(ii)第一分枝杆菌多核苷酸，其中所述第一分枝杆菌多核苷酸包含编码所述第一分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列；
并且与(iii)或(iv)组合：
(iii)第二分枝杆菌抗原多肽，其中所述第二分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；或
(iv)第二分枝杆菌多核苷酸，其中所述第二分枝杆菌多核苷酸包含编码所述第二分枝杆菌多肽的多核苷酸序列。
13.根据权利要求12所述的方法，所述方法包括将所述药用载体与权利要求1-10中任一项所述的抗原组合物组合。
14.用于制备治疗性或预防性制剂(例如，疫苗)的方法，所述方法包括将药用载体与第一抗体和第二抗体组合；
其中所述第一抗体结合第一分枝杆菌抗原多肽，其中所述第一分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；并且
其中所述第二抗体结合第二分枝杆菌抗原多肽，其中所述第二分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段。
15.根据权利要求14所述的方法，所述方法包括将所述药用载体与根据权利要求11所述的免疫原性组合物组合。
16.治疗性或预防性制剂(例如，疫苗)，所述制剂包含药用载体和：
(i)第一分枝杆菌抗原多肽，其中所述第一分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；或
(ii)第一分枝杆菌多核苷酸，其中所述第一分枝杆菌多核苷酸包含编码所述第一分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列；
以及：
(iii)第二分枝杆菌抗原多肽，其中所述第二分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；或
(iv)第二分枝杆菌多核苷酸，其中所述第二分枝杆菌多核苷酸包含编码所述第二分枝杆菌多肽的多核苷酸序列；
其中所述制剂用于所述第一分枝杆菌抗原多肽或多核苷酸和所述第二分枝杆菌抗原多肽或多核苷酸的同时施用或顺次施用。
17.根据权利要求16所述的制剂，所述制剂包含根据权利要求1-10中任一项所述的抗原组合物。
18.治疗性或预防性制剂(例如，疫苗)，所述制剂包含药用载体和：
(a)第一抗体，其中所述第一抗体结合第一分枝杆菌抗原多肽；其中所述第一分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；和
(b)第二抗体，其中所述第二抗体结合第二分枝杆菌抗原多肽；其中所述第二分枝杆菌抗原包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；
其中所述制剂用于所述第一和第二抗体的同时施用或顺次施用。
19.根据权利要求18所述的制剂，所述制剂包含权利要求11所述的免疫原性组合物。
20.第一分枝杆菌抗原多肽或第一分枝杆菌多核苷酸，与第二分枝杆菌抗原多肽或第二分枝杆菌多核苷酸，其用于在受试者中刺激免疫应答；其中
(i)所述第一分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；
(ii)所述第一分枝杆菌多核苷酸序列包含编码所述第一分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列；
(iii)所述第二分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；并且
(iv)所述第二分枝杆菌多核苷酸序列包含编码所述第二分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列。
21.根据权利要求20所述应用的第一分枝杆菌抗原多肽或多核苷酸与第二分枝杆菌抗原多肽或多核苷酸，其中所述第一分枝杆菌抗原多肽或多核苷酸与所述第二第一分枝杆菌抗原多肽或多核苷酸用于基本上同时或顺次施用给受试者。
22.根据权利要求20或21所述应用的第一分枝杆菌抗原多肽或多核苷酸与第二分枝杆菌抗原多肽或多核苷酸，其中所述第一和第二分枝杆菌抗原多肽或多核苷酸以权利要求16或17所述的制剂的形式存在。
23.第一抗体和第二抗体，所述第一抗体和第二抗体用于在受试者中刺激免疫应答；
其中所述第一抗体结合第一分枝杆菌抗原多肽，其中所述第一分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；并且
其中所述第二抗体结合第二分枝杆菌抗原多肽，其中所述第二分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段。
24.根据权利要求23所述应用的第一抗体和第二抗体，其中所述第一和第二抗体用于基本上同时或顺次施用给受试者。
25.根据权利要求23或24所述应用的第一抗体和第二抗体，其中所述第一和第二抗体以权利要求18或19所述的制剂的形式存在。
26.根据权利要求20-22中任一项所述应用的第一分枝杆菌抗原多肽或多核苷酸和第二分枝杆菌抗原多肽或多核苷酸，或根据权利要求23-25中任一项所述应用的第一抗体和第二抗体，其中所述应用是用于治疗或预防所述受试者中的分枝杆菌感染(例如，TB)；如其中所述分枝杆菌感染是早期感染。
27.诊断分枝杆菌感染如早期分枝杆菌感染的体外方法，所述方法包括将来自受试者的包含免疫细胞如T-淋巴细胞的测试样品与下述一起温育：
(a)权利要求1-10中任一项所述的抗原组合物；或
(b)第一分枝杆菌抗原多肽或第一分枝杆菌多核苷酸，和第二分枝杆菌抗原多肽或第二分枝杆菌多核苷酸；其中
(i)所述第一分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；
(ii)所述第一分枝杆菌多核苷酸序列包含编码所述第一分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列；
(iii)所述第二分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；并且
(iv)所述第二分枝杆菌多核苷酸序列包含编码所述第二分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列；
并且检测所述免疫细胞的激活，其中所述免疫细胞的激活指示所述受试者中的分枝杆菌感染。
28.诊断分枝杆菌感染如早期分枝杆菌感染的体外方法，所述方法包括将来自受试者的测试样品与下述一起温育：
(a)权利要求1-10中任一项所述的抗原组合物；或
(b)第一分枝杆菌抗原多肽或第一分枝杆菌多核苷酸，和第二分枝杆菌抗原多肽或第二分枝杆菌多核苷酸；其中
(i)所述第一分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；
(ii)所述第一分枝杆菌多核苷酸序列包含编码所述第一分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列；
(iii)所述第二分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：5的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；并且
(iv)所述第二分枝杆菌多核苷酸序列包含编码所述第二分枝杆菌抗原多肽的多核苷酸序列；
其中所述温育在允许所述第一和第二分枝杆菌抗原与所述样品中的抗体结合从而形成抗原-抗体复合物的条件下进行；然后检测所述复合物的形成，其中抗原-抗体复合物的存在指示所述受试者中的分枝杆菌感染。
29.诊断分枝杆菌感染如早期分枝杆菌感染的体外方法，所述方法包括将来自受试者的测试样品与下述一起温育：
(a)权利要求11中所述的免疫原性组合物；或
(b)第一抗体和第二抗体，其中所述第一抗体结合第一分枝杆菌抗原多肽，并且所述第二抗体结合第二分枝杆菌抗原多肽；
其中所述第一分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ ID NO：1的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；并且其中所述第二分枝杆菌抗原多肽包含与SEQ IDNO：5的氨基酸序列具有至少70％的氨基酸序列同一性的多肽序列，或具有其至少7个连续氨基酸的其片段；
其中所述温育在允许所述第一和第二抗体与所述样品中的抗原结合从而形成抗原-抗体复合物的条件下进行；然后检测所述复合物的形成，其中抗原-抗体复合物的存在指示所述受试者中的分枝杆菌感染。
30.如前述和/或如附图和/或实施例中所示的抗原组合物、免疫原性组合物、细胞、方法或应用。
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