BR112012029643A2 - composição de antígeno micobacteriano - Google Patents

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Abstract

COMPOSIÇÃO DE ANTÍGENO MICOBACTERIANO. A presente invenção refere-se a uma composição antigênica compreendendo (a) um primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano ou um primeiro polinucleotídeo microbacteriano; e (b) um segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano ou um segundo polinucleotídeo micobacteriano; em que: (i) o dito primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de mainoácido de SEQ ID NO: 1 ou 7, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma (ii) o dito primeiro polinucleotídeo micobacteriano compreende uma sequência de polinucleotídeos codificando o dito primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano; (iii) o dito segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de polipeptídeo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5. ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; e (iv) o dito segundo polinucleotídeo micobacteriano compreende uma sequência de polinucleotídeos codificando o dito segundo polipeptídeo microbacteriano.

Description

« Relatório Descritivo da Patente de lnvenção para "COMPOSl- ÇÃO DE ANTÍGENO MICOBACTERIANO". A presente invenção refere-se aos polinucleotideos e polipeptí- deos micobacterianos, aos seus fragmentos ou variantes, aos seus inibido- 5 res, aos anticorpos que se ligam aos mesmos, aos vetores e veiculos micro- bianos, às composições terapêuticas, tais como as vacinas contra as infec- ções micobacterianas, e às composições e aos métodos para detectar a presença de uma infecção micobacteriana. Os micro-organismos, tais como as espécies de Sa/mone//a, 10 Yersinia, Shige//a, Campy/obacteg Ch/amydia e Mycobacteria, são capazes
F .. de formar infecções intracelulares. Estas infecções podem ser exclusivamen- 'k m te intracelulares, ou podem conter componentes tanto intracelulares quanto extracelulares. Geralmente, estes micro-organismos não circulam livremente no corpo, por exemplo, na corrente sanguínea, e como tais são frequente- 15 mente não sensíveis aos regimes de tratamento de fármacos. As dificuldades associadas com o tratamento de infecção intra- celular foram exacerbadas pelo desenvolvimento de micro-organismos resis- tentes a múltiplos fármacos. Devido ao acúmulo de mutações ao longo do tempo e à transferência horizontal e vertical subsequente dos genes muta- 20 dos para outros organismos, classes inteiras de antibióticos foram tornadas inativas. Por razões similares, as terapias de vacinas não provaram ser efe- tivas contra micro-organismos intracelulares. A Mycobacterium tuberculosis (MTB) e as espécies intimamente relacionadas constituem um pequeno grupo de micobactérias conhecido 25 como o complexo de Mycobacterium tuberculosis (MTC). Este grupo com- preende cinco espécies distintas: M. tuberculosis, M. microtl: M. bovis, M. caneti, e M. africanum. Outras micobactérias são também patogênicas no homem e nos animais, por exemplo, M. avium subsp. paratubercu/osis, que causa a doen- 30 ça de johne nos ruminantes, M. bovis, que causa a tuberculose no gado, M. avium e M. intrace//ulare, que causam a tuberculose em pacientes imuno- comprometidos (por exemplo, pacientes com AIDS, e pacientes de trans-
plante da medula óssea) e M. leprae, que causa a lepra nos seres humanos. Outra espécie micobacteriana importante é a M. vaccae. Como o agente etiológico da infecção por tuberculose (TB), a Mycobacterium tubercu/osis (M. tubercu/osis) é a causa principal de morte por doença infecciosa bacteriana no mundo inteiro - infecção latente que afeta tanto quanto um terço da população do mundo. A Organização Mundial de Saúde (OMS) estima que quase nove milhões de novos casos de TB, e quase dois milhões de morte, ocorram globalmente a cada ano. O maior número de novos casos de TB em 2005 ocorreu no Sudeste da Ásia (34% dos casos incidentes globalmente), e a taxa de incidência estimada na regi- ão africana ao sul do deserto de Saara é quase 350 casos por população de
100.000. Entretanto, a infecção por TB não está limitada ao mundo em de- senvolvimento: o Reino Unido tem visto um ressurgimento da tuberculose desde os recentes anos 80 e existem atualmente mais de 8000 novos casos a cada ano - uma taxa de 14,0 por população de 100.000. Cerca de 40% destes novos casos ocorrem na região de Londres, em que a taxa de infec- ção é 44,8 por população de 100.000. O controle ótimo do paciente requer o início rápido da terapia com fármaco e o isolamento dos indivíduos infecciosos o quanto antes. Dei- xada não tratada, cada pessoa com doença de TB ativa infectará em média entre 10 e 15 pessoas a cada ano. A infecção por TB pode normalmente ser tratada por um curso de 6 meses de antibióticos; entretanto, a adesão do paciente ao tratamento com fármaco de longa duração é variada, com os pacientes frequentemente parando a terapia quando os seus sintomas ces- sam. O fracasso em completar o tratamento pode promover o desenvolvi- mento de micobactérias de resistência a múltiplos fármacos. O termo 'latência' é sinônimo com 'persistência', e descreve um estado reversível de baixa atividade metabólica em que as células micobac- terianas podem sobreviver por períodos prolongados com divisão celular limitada ou nenhuma divisão celular. Durante a Iatência (isto é, infecção la- tente), os sintomas clínicos associados com uma infecção micobacteriana não se tornam evidentes.
Entretanto, a reativação das micobactérias latentes pode ser in- duzida por estímulos ambientais - por exemplo, um aumento na disponibili- dade de nutrientes e/ou a concentração de oxigênio dissolvido local.
Durante a infecção ativa, as micobactérias (por exemplo, M. tubercu/osis) demons-
5 tram alta atividade metabólica e replicam-se rapidamente, resultando no de- senvolvimento de infecção micobacteriana ativa com os sintomas clínicos associados.
Os estudos in vitro demonstraram que as micobactérias, tais como a M. tuberculosis, são capazes de se adaptar a, e sobreviver sob, 10 condições esgotadas de nutrientes e oxigênio, e podem crescer sobre uma faixa de disponibilidades de nutrientes e tensões de oxigênio.
A adaptação à - privação de carbono e/ou a uma baixa tensão de oxigênio dissolvido in vitro desencadeia a transição para um estado persistente não replicador que po- de ser análogo à Iatência in vivo. 15 A sobrevivência e a multiplicação intracelulares das micobacté- rias são suspeitas de ser um fator apoiador principal para a progressão da doença micobacteriana.
A presença de um grande reseNatório de individuos assintomáticos infectados de modo latente com as micobactérias é um pro- blema principal para o controle das infecções micobacterianas, especialmen- 20 te as infecções por M. tubercu/osis.
Além disso, os métodos convencionais para a detecção de uma infecção micobacteriana latente por teste na pele podem ser comprometidos pela vacinação de BCG e por exposição a mico- bactérias ambientais.
A eficácia da prevenção por vacina contra M. tubercu/osis tem 25 variado amplamente.
A vacina atual contra M. tubercu/osis, a BCG, é uma cepa atenuada de M boviS.
Ela é efetiva contra as complicações graves de TB em crianças, porém varia muito na sua eficácia nos adultos, particular- mente através dos grupos étnicos.
A vacinação de BCG tem sido usada para impedir a meningite tuberculosa e auxilia a impedir a difusão da M. tubercu- 30 losis para locais extrapulmonares, porém não impede a infecção.
A eficácia limitada da BCG e o predomínio global de TB resultaram em um esforço in- ternacional para gerar novas vacinas mais efetivas.
O WO 03/004520 (no nome do presente Requerente, incorpora- do neste documento por referência) descreve a identificação de um subgru- po distinto de genes micobacterianos, cuja expressão é induzida ou suprar- regulada durante a latência micobacteriana. Especificamente, a expressão deste subgrupo definido de genes micobacterianos é induzida ou suprarre- gulada durante a cultura de micobactérias sob condições de cultura de pri- vação de nutrientes, em comparação com as condições de cultura que não são de privação de nutrientes e que suportam o crescimento exponencial da dita micobactéria. O WO 03/035681 (no nome do presente Requerente, incorpora- do neste documento por referência) descreve a identificação de um subgru- po distinto de genes micobacterianos, cuja expressão é infrarregulada duran- te a latência micobacteriana. Especificamente, a expressão deste subgrupo definido de genes micobacterianos é infrarregulada sob condições de cultura de privação de nutrientes, em comparação com as condições de cultura que não são de privação de nutrientes e que suportam o crescimento exponenci- al das ditas micobactérias. O WO 03/000721 (no nome do presente Requerente, incorpora- do neste documento por referência) descreve a identificação de um subgru- po distinto de genes micobacterianos, cuja expressão é induzida ou suprar- regulada durante a cultura contínua das micobactérias sob condições de crescimento definidas por uma baixa tensão de oxigênio dissolvido (até 10% de saturação do ar, medida a 37°C), em comparação com uma tensão de oxigênio dissolvido de pelo menos 40% de saturação do ar, medida a 37°C.
Em vista da ameaça crescente e do predomínio global de infec- ção micobacteriana, requerem-se novas estratégia para a prevenção, o tra- tamento, e a diagnose efetivos da infecção micobacteriana. A invenção proporciona uma composição antigênica que com- preende um primeiro antígeno micobacteriano e um segundo antígeno mico- bacteriano; em queem que o dito primeiro antígeno micobacteriano compre- ende:
(i) uma sequência de poIipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo regulado pela Iatência selecionado a partir de SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7 e 56, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos do mesmo; ou (ii) uma sequência de polinucleotÍdeos codificando uma se- quência de polipeptídeos de acordo com (i); ou uma sequência de poIinucle- otídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de nucleotídeos com a sequência de ácidos nucleicos de um polinucleotídeo regulado pela latência selecionado a partir de SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8 e 57, ou um seu fragmento tendo pelo menos 21 nucleotídeos consecutivos do mesmo; e em que o dito segundo antígeno micobacteriano é diferente do dito primeiro antígeno micobacteriano.
Conforme usado neste documento, o termo "micobacteriano" ou "micobactéria" inclui as espécies M. ph/ei, M. smegmatis, M. africanum, M. caneti, M. fortuitum, M. marinum, M. ulcerans, M. tubercu/os/s, M. bovis, M. microti, M. avium, M. pamtubercu/osis, M. leprae, M. lepraemurium, M. intra- cellu/are, M. scrofu/aceum, M. xenopi, M. genavense, M. kansasii, M. simiae, M. szu/gai, M. haemophi/um, M. asiaticum, M. malmoense, M. vaccae, M. canetG e M. shimoidei.
De interesse particular são os membros do MTC, tais como M. tuberculosis.
O termo antigeno significa qualquer substância que possa ser reconhecida pelo sistema imune e/ou que estimule uma resposta imune.
Por exemplo, um antígeno pode estimular uma resposta imune mediada por cé-
lula e/ou pode estimular a geração de anticorpos.
Em uma modalidade, um antígeno micobacteriano da invenção proporciona uma resposta mediada por célula à infecção que envolva células imunes, tais como as células T (células T CD4+ e/ou CD8+), e/ou a capaci- dade de respem quer com citocinas do tipo Thl, tais como lFNq'. Em uma modalidade, um antígeno micobacteriano induz as células secretoras de lFN"y (por exemplo, predominantemente as células T CD4+). Com relação a isto, os estudos recentes sugerem que as respostas das células imunes
(particularmente as respostas imunes das células T, por exemplo, na muco- sa do pulmão) podem ser críticas para a proteção contra doença micobacte- riana pulmonar. Em uma modalidade, um antígeno micobacteriano da invenção proporciona proteção (tal como proteção de longa duração) contra o desafio por micobactérias, tais como a M. tubercu/osis. A título de exemplo, um antígeno micobacteriano da invenção pode induzir as 'células T de memória', as quais podem continuar a estimular a imunidade protetora em longo prazo (por exemplo, por décadas). As res- lO postas imunes de memória têm sido atribuídas à reativação dos linfócitos T de antígenos específicos, de vida longa, que se originam diretamente das células T efetoras diferenciadas e persistem em um estado inativo. As célu- las T de memória são heterogêneas; pelo menos dois subgrupos foram iden- tificados, tendo capacidade migratória e função efetora diferentes. As células T de memória do primeiro subgrupo são conhecidas como 'células T efetoras de memória' (TEM) porque elas são parecidas com as células T efetoras ge- radas na resposta primária, pelo fato de que elas não têm os receptores gui- adores de linfonodos para a migração para os tecidos inflamados. Ao reen- contrarem-se com o antígeno, as TEM rapidamente produzem lFN-y ou ILA, ou liberam perforina pré-armazenada. As células T de memória do segundo subgrupo (conhecidas como 'células centrais de memória' (TCM)) expres- sam a L-selectina e a CCR7 e não têm função efetora imediata. As TCM têm um baixo Iimite de ativação e proliferam-se e diferenciam-se em efetoras quando reestimuladas em órgãos linfoides secundários.
Em uma modalidade, um antígeno micobacteriano proporciona uma resposta de anticorpo neutralizador à infecção micobacteriana (por e- xemplo, M. tuberculosis). Em uma modalidade, cada antigeno na composição antigênica da presente Ínvenção independentemente induz uma resposta imune efetiva (por exemplo, uma resposta imune mediada por célula ou resposta de anti- corpo). Desse modo, de acordo com esta modalidade, após a administração da composição antigênica a um paciente, uma resposta imune é induzida no paciente a cada antígeno na composição antigênica.
Com relação a isto, os presentes inventores identificaram que (em uma modalidade) a composição antigênica da presente invenção vanta- josamente evita a "competição antigênica", ou está associada com baixos
5 níveis cle "competição antigênica", em comparação com o efeito competitivo que poderia ter sido esperado em vista das composições de vacinas multiva- lentes conhecidas.
A "competição antigênica" é um fenômeno pelo qual uma res- posta imune a um antígeno suprime uma resposta imune a um segundo an-
lO tígeno não relacionado (ver Eidinger, D. e col., J Ex Med, 1968. 128(5): pá- . ginas 1183-1200). A título de exemplo, as células imunes (por exemplo, as células T) que respem quem a um antígeno podem ativamente interferir com outras células imunes (por exemplo, as células T) que respem quem a outro antígeno (ver Kerbel, R.S. e Eidinger, D., Nat New Biol, 1971 . 232(27): pá-
15 ginas 26-28). O WO 00/47227 descreve (no Exemplo 2) a imunização de por- quinhos-da-índia com DNA codificando o antígeno micobacteriano 85A sozi- nho (Grupo A): ou com DNA codificando tanto o antígeno micobacteriano 85A quanto o antlgeno micobacteriano MPT32 (Grupo B). Após o desafio
20 com M. tubercu/osis, a eficácia da vacina foi avaliada por determinação das ' cargas micobacterianas nos pulmões e baços.
As figuras 11A e 118 ilustram que a combinação de antígenos 85A e MPT32 (Grupo B) foi menos efetiva 4 contra M. tubercu/osis do que o antígeno 85A sozinho (Grupo A). Desse modo, sabe-se que a reunião de candidatos de vacinas
25 em uma vacina multivalente suprime ou até completamente anuia a eficácia da vacina, Tal é o predomínio da competição antigênica, que uma vacina multivalente que atinge eficácia aperfeiçoada acima de seu componente mais eficaz é considerada benéfica.
É, portanto, surpreendente que a composição antigênica da pre-
30 sente invenção combina antígenos que são individualmente capazes de pro- vocar uma resposta imune e, contudo, resulta em uma resposta imune aper- feiçoada / aumentada em comparação com a resposta imune a cada antíge-
no ind ividual. Em uma modalidade, um antígeno micobacteriano compreende uma sequência de polipeptídeos. Um antígeno micobacteriano pode ser um ' polipeptídeo. Alternativamente, ou além disso, um antígeno micobacteriano 5 compreende uma sequência de polinucleotídeos. Por exemplo, um antígeno micobacteriano pode ser um polinucleotÍdeo, tal como um DNA ou RNA. O primeiro antígeno micobacteriano compreende: (i) uma sequência de pohpeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos
M 10 de um polipeptídeo regulado pela latência selecionado a partir de SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7 e 56, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos - consecutivos do mesmo; ou (ii) uma sequência de poIinucleotideos codificando uma se- quência de polipeptideos de acordo com (i); ou uma sequência de polinucle- 15 otídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de nucleotídeos com a sequência de ácidos nucleicos de um poIinucleotídeo regulado pela latência selecionado a partir de SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8 e 57, ou um seu fragmento tendo pelo menos 21 nucleotldeos consecutivosdo mesmo. Em uma modalidade, o primeiro antígeno micobacteriano com- 20- preende: (i) uma sequência de poIipeptídeos tendo pelo menos 70°6 de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, ou um seu fragníento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; ou 25 (ii) uma sequência de polinucleotídeos codificando uma se- quência de poIipeptídeos de acordo com (i); ou uma sequência de polinucle- otídeos tendo pelo menos 70°6 de identidade da sequência de nucleotídeos com a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 2, ou um seu fragmen- to tendo pelo menos 21 nucleotídeos consecutivos da mesma.
30 O subgrupo específico de polipeptídeos micobacterianos repre- sentados por SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7 e 56 são os 'polipeptídeos regulados pela latência'. O subgrupo específico de polinucleotídeos micobacterianos representados por SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8 e 57 são os 'polinucleotídeos re- gulados pela latência'. Em uma modalidade, um 'polipeptídeo regulado pela latência' é codificado por um 'polinucleotídeo regulado pela latência'. A titulo de exem-
5 plo, a SEQ ID NO: 1 de polipeptídeo regulado pela latência é codificada pela SEQ ID NO: 2 de poHnucleotídeo regulado pela latência; a SEQ ID NO: 3 é codificada pela SEQ ID NO: 4: a SEQ ID NO: 5 é codificada pela SEQ ID NO: 6; a SEQ ID NO: 7 é codificada pela SEQ ID NO: 8; e a SEQ ID NO: 56 é codificada pela SEQ ID NO: 57. 10 A expressão ou a atividade de um polipeptídeo ou polinucleotí- . deo regulado pela latência é modulada em resposta à Iatência micobacteria- na - por exemplo, em resposta à cultura de micobactérias (por exemplo, M. tuberculosis) sob condições de cultura que induzam ou mantenham a latên-
cia micobacteriana. 15 Em uma modalidade, a "modulação" da expressão ou da ativi- dade do polipeptídeo ou do pohnucleotídeo regulado pela Iatência em res- posta a condições de latência micobacteriana significa que a expressão ou a atividade é induzida ou suprarregulada em resposta à latência.
Desse modo, o poIipeptídeo ou o polinucleotídeo regulado pela latência pode ser um poli-
20 peptídeo ou polinucleotideo 'induzido pela latência' ou 'suprarregulado pela Iatência'. Por exemplo, a expressão ou a atividade de um poIipeptídeo ou poIinucleotÍdeo suprarregulado pela latência pode ser suprarregulada em pelo menos 1,5 vez, 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes ou 50 vezes, sob
25 condições de latência em comparação com as condições de não latência.
A expressão ou a atividade de polipeptídeos e polinucleotídeos induzidos pela latência e suprarregulados pela latência pode ser induzida ou suprarregulada in vivo durante a latência no ambiente natural da micobacté- ria.
Como tal, os polipeptídeos e os poHnucleotídeos micobacterianos induzi-
30 dos pela latência ou suprarregulados pela latência representam bons candi- datos de vacinas e bons alvos terapêuticos para impedir o estabelecimento da difusão e da reativação de doença e/ou prepararam boas ferramentas diagnósticas para a infecção latente. Em uma modalidade, a "rnodulação" da expressão ou da ativi- dade de um polipeptídeo regulado pela latência em resposta às condições de latência micobacteriana significa que a expressão ou a atividade é repri- 5 mida ou infrarregulada em resposta à latência. Desse modo, em uma moda- Iidade, o polipeptídeo ou o pohnucleotídeo regulado pela latência é um poli- peptídeo ou polinucleotÍdeo 'reprimido pela latência' ou 'infrarregulado pela latência'. A expressão ou a atividade de um polipeptídeo ou polinucleotí-
M 1O deo infrarregulado pela latência pode ser infrarregulada em pelo menos 1,5 vez, 2 vezes, 5 vezes, 10 vezes, 20 vezes ou 50 vezes, sob condições de latência em comparação com as condições de não latência. A referência a "infrarregulado" inclui 'desativado', o que significa que não há substancial- mente nenhuma atividade e/ou expressão detectável do polipeptídeo ou do 15 poHnucleotídeo. A expressão ou a atividade de poIipeptideos e poHnucleotídeos reprimidos pela Iatência ou infrarregulados pela latência pode ser induzida ou infrarregulada in vivo durante a infecção micobacteriana ativa, ou duran- te/após a reativação das micobactérias a partir de um estado latente. Os po- 20 lipeptídeos e os polinucleotídeos micobacterianos reprimidos pela Iatência e infrarregulados pela latência podem desempenhar uma função inicial no de- senvolvimento de uma resposta imune efetiva contra a replicação de bacilos durante os estágios ativos da doença, e consequentemente. representam bons candidatos de vacinas e bons alvos terapêuticos para prevenir o esta- 25 belecimento, a difusão e a reativação da doença. A expressão ou a atividade de um polipeptídeo ou pohnucleoti- deo regulado pela latência pode ser modulada (tal como induzida, suprarre- gulada, reprimida ou infrarregulada) sob condições de cultura de privação de nutrientes, em comparação com as condições de cultura que não são de 30 privação de nutrientes. Sob as condições de cultura de privação de nutrien- tes, a concentração da fonte de energia primária (por exemplo, carbono) é insuficiente para suportar o crescimento exponencial das micobactérias, com o resultado que as micobactérias tornam-se metabolicamente estressadas e entram em um estado latente.
A expressão ou a atividade de um polipeptídeo ou polinucleoti- deo regulado pela latência pode alternativamente (ou adicionalmente) ser
5 modulada (por exemplo, induzida, suprarregulada, reprimida ou infrarregula- da) sob condições de limitação de oxigênio (baixa tensão de oxigênio dissol- vido), em comparação com as condições de cultura que não são limitadoras de oxigênio.
Em uma modalidade, o primeiro antígeno micobacteriano com-
lO preende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70°/o de identi- - dade da sequência de aminoácidos (tal como pelo menos 75, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, ,94, 96, 98, 99 ou 100% de identidade da sequência de aminoáci- dos) com a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo regulado pela la- tência selecionado a partir de SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7 e 56, ou um seu frag-
15 mento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos do mesmo.
Em uma modalidade, o primeiro antígeno micobacteriano consis- te em uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de aminoácidos (tal como pelo menos 75, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 99 ou 1OO°/o de identidade da sequência de aminoácidos)
20 com a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo regulado pela latência selecionado a partir de SEQ ÍD NOs: 1, 3, 5, 7 e 56, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos do mesmo.
Desse modo, em uma modalidade, o primeiro antígeno micobac- teriano é um 'primeiro polipeptídeo micobacteriano' (ou fragmento), como
25 definido acima.
Em uma modalidade, o dito primeiro polipeptídeo antigênico mi- cobacteriano compreende (ou consiste em) uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, ou um seu fragmento tendo
30 pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma.
As SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7 e 56 são definidas na Tabela 1, abai-
XO:
Tabela 1 SEQ ID NO: Nome do poIipeptídeo 1 RvO111 3 Rv1806 5 RVO198 7 RV3812 56 RV1807 Desse modo, no contexto do presente pedido, um "antígeno de polipeptídeo RvO111" compreende ou consiste em SEQ ID NO: 1 (ou uma 'variante' ou 'fragmento' da sequência da mesma, conforme definido neste 5 documento); um "antígeno de polipeptídeo RV1806" compreende ou consiste
W em SEQ ID NO: 3 (ou uma 'variante' ou 'fragmento' da sequência da mesma, conforme definido neste documento); um "antígeno de polipeptídeo RvO198" - compreende ou consiste em SEQ ID NO: 5 (ou uma 'variante' ou 'fragmento' da sequência da mesma, conforme definido neste documento); um "antígeno 10 de polipeptldeo Rv3812" compreende ou consiste em SEQ ID NO: 7 (ou uma 'variante' ou 'fragmento' da sequência da mesma, conforme definido neste documento); e um "antigeno de polipeptídeo RV1807" compreende ou consiste em SEQ ID NO: 56 (ou uma 'variante' ou 'fragmento' da sequência da mesma, conforme definido neste documento). 15 Em uma modalidade, a identidade da sequência de aminoácidos existe sobre uma região das sequências de polipeptídeos que é pelo menos 7 resíduos de aminoácidos consecutivos de comprimento (por exemplo, pelo menos 10, 15, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600 ou 650 resíduos de aminoácidos consecutivos de comprimento). 20 Os métodos convencionais para determinar a identidade da se- quência de aminoácidos são discutidos em mais detalhe posteriormente, no relatório descritivo. No contexto do primeiro antígeno micobacteriano, um fragmento de um polipeptídeo compreende (ou consiste em) pelo menos 7 resíduos de 25 aminoácidos consecutivos do dito polipeptídeo (por exemplo, pelo menos 10, 15, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650 ou 675 resíduos de ik7hF:yA aminoácidos consecutivos do dito polipeptídeo). Em uma modalidade, um fragmento de um polipeptídeo tem um comprimento da sequência que é pelo menos 5°6, 10%, 25%, 50%, 60%, 70%, 80°6, ou 90°6 daquele da sequência do polipeptídeo de tamanho natu- ral.
Um fragmento de um polipeptídeo pode incluir pelo menos um epítopo do polipeptídeo.
Em uma modalidade, no contexto do primeiro antígeno micobac- teriano, um fragmento de um poIipeptídeo compreende (ou consiste em) uma forma truncada do dito polipeptídeo.
Por exemplo, um fragmento de um polipeptídeo pode ter um truncamento N terminal (em comparação com o polipeptídeo), ou um fragmento de um polipeptídeo pode ter um truncamento C terminal (em comparação com o polipeptídeo). Em uma modalidade, no contexto do primeiro antígeno micobac- teriano, um fragmento de um polipeptídeo compreende (ou consiste em) uma forma madura do polipeptídeo.
Por exemplo, o polipeptideo pode com- preender uma sequência sinal (isto é, uma sequência de secreçãol alveja- mento) (por exemplo, na extremidade de N), e um fragmento do polipeptídeo pode não ter esta sequência sinal.
Em uma modalidade, o fragmento é for- mado por clivagem de uma sequência sinal a partir do poIipeptídeo.
Em uma modalidade, um fragmento de polipeptídeo SEQ ID NO: 1 é uma forma truncada de modo N terminal de SEQ ID NO: 1. Em uma mo- dalidade, um fragmento de polipeptídeo SEQ ID NO: 1 tem um trLIncamento N terminal de pelo menos 50, 100, 150, 200, 250, 300, ou 350 resíduos de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO; 1. Em uma modalidade, um fragmento de SEQ ID NO: 1 compreende pelo menos a sequência de 50, 100, 150, 200, 250 ou 300 aminoácidos de SEQ ID NO: 1 C terminal.
Em uma modalidade, um fragmento de polipeptídeo SEQ ID NO; 7 é uma forma truncada de modo N terminal de SEQ ID NO: 7. Em uma mo- dalidade, um fragmento de SEQ ID NO: 7 é uma sequência de polipeptídeos madura, a qual difere da sequência de SEQ ID NO: 7 por remoção de uma
W sequência sinal N terminal.
Em uma modalidade, um fragmento de polipeptí- deo SEQ ID NO: 7 tem um truncamento N terminal de pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 ou 40 resíduos de aminoácidos em comparação com a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7. Em uma modalidade, um frag- 5 mento de SEQ ID NO: 7 compreende pelo menos a sequência de 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 ou 450 aminoácidos de SEQ ID NO: 7 C termi- nal.
Em uma modalidade, o primeiro antígeno micobacteriano com- preende um polipeptídeo ou fragmento do mesmo que tem uma reatividade 10 cruzada antigênica comum e/ou uma atividade biológica in vivo substancial- . mente igual a um polipeptídeo regulado pela latência selecionado a partir de
- SEQIDNOs:1,3,5,7e56. Conforme usada neste documento, a 'reatividade cruzada anti- gênica comum' significa que o primeiro polipeptídeo micobacteriano, ou o 15 fragmento, e o polipeptídeo regulado pela latência selecionado a partir de SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7 e 56 compartilham uma capacidade comum de indu- zir uma "resposta de lembrança" de uma célula imune, tal como um linfócito T (por exemplo, CD4+, CD8+, célula T efetora ou célula T de memória, tal como uma TEM ou TCM), que tenha sido previamente exposta a um compo- 20 nente antigênico de uma infecção micobacteriana.
Novos ensaios imunológicos para medir e quantificar as respos- tas de células imunes (por exemplo, as respostas de células T) têm sido es- tabeiecidos durante os últimos 10 anos.
Por exemplo, o ensaio de interferon- gama (lFN-y) ELISPOT é útil como uma leitura imunológica, porque a secre- 25 ção de lFN-y a partir de células imunes específicas para antígenos, tais co- mo as células T, é um bom correlativo de proteção contra M. tubercu/osis.
Além disso, o ensaio ELISPOT é um método muito reproduzível e sensível de quantificar o número de células imunes específicas para antígenos que secretam lFN-j', tais como as células T. 30 Altemativamente, ou além disso, a 'reatividade cruzada antigêni- ca comum' significa que um anticorpo capaz de ligar-se ao primeiro polipep- tídeo micobacteriano, ou fragmento, também seria capaz de ligar-se ao poli-
* peptídeo regulado pela latência. Em uma modalidade, o primeiro antígeno micobacteriano com- preende, ou consiste em, uma sequência de polinucleotÍdeos que codifica um primeiro polipeptídeo micobacteriano, como definido acima.
5 Desse modo, em uma modalidade, o primeiro antigeno micobac- teriano compreende (ou consiste em) uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo que compreende (ou consiste em) uma se- quência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de aminoácidos (tal como pelo menos 75, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 10 98, 99 ou 1OO°/o da identidade da sequência de aminoácidos) com a sequên- cia de aminoácidos de um polipeptídeo regulado pela latência selecionado a partir de SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7 e 56, ou um seu fragmento tendo pelo me- nos 7 aminoácidos consecutivos do mesmo (por exemplo, confome definido acima). 15 Em uma modalidade, o primeiro antigeno micobacteriano com- preende uma sequência de poHnucleotídeos tendo pelo menos 7Õ°/o de iden- tidade da sequência de nucleotídeos (tal como pelo menos 75, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 99 ou 100% de identidade da sequência de nucle- otideos) com a sequência de ácidos nucleicos de um poIinucleotídeo regula- 20 do pela latência selecionado a partir de SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8 e 57, ou um seu fragmento tendo pelo menos 21 nucleotídeos consecutivos do mesmo. Em uma modalidade, o primeiro antígeno micobacteriano consis- te em uma sequência de pohnucleotídeos tendo pelo menos 70% de identi- dade da sequência de nucleotídeos (tal como pelo menos 75, 80, 82, 84, 8EÍ 25 88, 90, 92, 94, 96, 98, 99 ou 100% de identidade da sequência de nucleotí- deos) com a sequência de ácidos nucleicos de um polinucleotÍdeo regulado pela latência selecionado a partir de SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8 e 57, ou um seu fragmento tendo pelo menos 21 nucleotídeos consecutivos do mesmo. Desse modo, em uma modalidade, o primeiro antígeno micobac- 30 teriano é um 'primeiro polinucleotídeo micobacteriano' (ou fragmento), como definido acima. Em uma modalidade, o dito primeiro polinucleotÍdeo micobacte-
+ riano compreende (ou consiste em) uma sequência de pohnucleotídeos codi- ficando um primeiro polipeptldeo antigênico micobacteriano da invenção, como definido acima.
Em uma modalidade, o dito primeiro poHnucleotídeo micobacteriano compreende (ou consiste em) uma sequência de polinucleo-
5 tídeos tendo pelo menos 70°6 de identidade da sequência de nucleotídeos com a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 2, ou um seu fragmen- to tendo pelo menos 21 nucleotídeos consecutivos da mesma.
As SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8 e 57 são definidas na Tabela 2, abai-
XO: 10 Tabela 2 Nome do poIipeptídeo r RVO111 Rv1806 RVO198 RV3812 RV1807
Desse modo, no contexto do presente pedido, um "antígeno de polinucleotídeo RvO111" compreende ou consiste em SEQ ID NO: 2 (ou uma 'variante' ou 'fragmento' da sequência da mesma, conforme definido neste documento); um "antígeno de polinucleotídeo Rvl 806" compreende ou con-
15 siste em SEQ ID NO: 4 (ou uma 'variante' ou 'fragmento' da sequência da mesma, conforme defÍnido neste documento); um "antígeno de poHnucleotí- deo RvO198" compreende ou consiste em SEQ ID NO: 6 (ou uma 'variante' ou 'fragmento' da sequência da mesma, conforme definido neste documen- to); um "antígeno de pdinucleotídeo Rv3812" compreende ou consiste em
20 SEQ ID NO: 8 (ou uma 'variante' ou 'fragmento' da sequência da mesma, conforme definido neste documento); e um "antígeno de pohnucleotideo Rv1807" compreende ou consiste em SEQ ID NO: 57 (ou uma 'variante' ou 'fragmento' da sequência da mesma, conforme definido neste documento). Em uma modalidade, a identidade da sequência de nucleotídeos
25 existe sobre uma região das sequências de polinucleotÍdeos que é pelo me- nos 21 resíduos de nucleotídeos consecutivos de comprimento (por exem- pÍo, pelo menos 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500,
-
+
550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900 ou 1000 resíduos de nucleotideos consecutivos de comprimento). Os métodos convencionais para determinar a identidade da se- quência de nucleotídeos são discutidos em mais detalhe posteriormente, no 5 relatório descritivo.
No contexto do primeiro antígeno micobacteriano, um fragmento do dito poIinucleotídeo compreende (ou consiste em) pelo menos 21 resí- duos de nucleotídeos consecutivos do dito polinucleotÍdeo (por exemplo, pelo menos 25, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500,
0 10 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800,
- 1850, 1900, 1950 ou 2000 resíduos de nucleotídeos consecutivos do dito
- poIinucleotídeo). Em uma modalidade, o comprimento da sequência do fragmento 15 de polinucleotídeo é pelo menos 5°/j, 10°6, 25%, 50%, 60%, 70%, 80°/o, ou 90°6 daquele do poIinucleotídeo.
Em uma modalidade, no contexto do primeiro antígeno micobac- teriano, um fragmento de um polinucleotÍdeo compreende (ou consiste em) uma forma truncada do dito poIinucleotídeo.
Em uma modalidade, um frag- 20 mento de um polinucleotídeo está truncado na extremidade de 5' e/ou na extremidade de 3', em comparação com a sequência de polinucleotídeos de tamanho natural.
Em uma modalidade, um fragmento de um polinucleoh"deo codifica uma forma truncada do dito polipeptídeo.
Por exemplo, um fragmen- to de um polinucleotídeo pode codificar um polipeptídeo que está truncado 25 de modo N terminal e/ou um polipeptídeo truncado de modo C terminal (em comparação com o polipeptídeo codificado pelo poIinucleotideo de tamanho natural)- Em uma modalidade, no contexto do primeiro antígeno micobac- teriano, um fragmento de um polinucleoüdeo codifica um polipeptídeo que 30 compreende (ou consiste em) um polipeptídeo maduro.
Por exemplo, o poli- peptldeo de tamanho natural compreende uma sequência sinal (isto é, uma sequência de secreçãol alvejamento) (por exemplo, na extremidade de N), e
« 18/182 q b o fragmento do polinucleotídeo codifica um polipeptídeo maduro que não tem esta sequência sinal.
Em uma modalidade, um fragmento de poIinucleotídeo SEQ ID NO; 2 é uma forma truncada em 5' de SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade, 5 um fragmento de polinucleotídeo SEQ ID NO: 2 tem um truncamento em 5' de pelo menos 100, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900 ou 1000 resí- duos de nucleotídeos, em comparação com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade, um fragmento de polinucleotídeo SEQ ID NO: 2 codifica uma forma truncada de modo N terminal de SEQ ID NO: 1. 10 Em uma modalidade, um fragmento de polinucleotideo SEQ ID NO: 2 codifi- ca um poiipeptídeo tendo um truncamento N terminal de pelo menos 50,
- 100, 150, 200, 250, 300, ou 350 resíduos de aminoácidos em comparação com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade, um fragmento de SEQ ID NO: 2 compreende os 100, 200, 300, 400, 500, 15 600, 700, 800 ou 900 resíduos de nucleotídeos 3' terminais em comparação com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2. Em uma modalidade, q um fragmento de polinucleotÍdeo SEQ ID NO: 2 codifica um polipeptídeo compreendendo pelo menos a sequência de 50, 100, 150, 200, 250 ou 300 aminoácidos de SEQ ID NO: 1 C terminal. 20 Em uma modalidade, um fragmento de poIinucleotídeo SEQ ID NO: 8 é uma forma truncada em 5' de SEQ ID NO: 8. Em uma modalidade, um fragmento de poKnucleotídeo SEQ ID NO: 8 tem um truncamento em 5' de pelo menos 25, 50, 75, 100 ou 125 resíduos de nucleotldeos, em compa- ração com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 8. Em uma modali-
25 dade, um fragmento de polinucleotÍdeo SEQ ID NO: 8 codifica uma sequên- cia de polipeptídeos madura, a qual difere da sequência de SEQ ID NO: 7 jjor remoção de uma sequência sinal N terminal, Em uma modalidade, um fragmento de polinucleotídeo SEQ ID NO: 8 codifica um polipeptídeo que tem um truncamento N terminal de pelo menos 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35 ou
30 40 resíduos de aminoácidos, em comparação com a sequência de aminoá- cidos de SEQ ID NO: 7. Em uma modalidade, um fragmento de SEQ ID NO: 8 compreende os 150, 300, 450, 600, 750, 900, 1050, 1200 ou 1350 resí-
Q 19/182 3
B duos de nucleotídeos 3' terminais, em comparação com a sequência de nu- cleotídeos de SEQ ID NO: 8. Em uma modalidade, um fragmento de SEQ ID NO: 8 codifica um polipeptídeo que compreende pelo menos a sequência de 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400 ou 450 aminoácidos de SEQ ID NO: 7 5 C terminal. Em uma modalidade, o dito primeiro po|jnuc|eotÍdeo micobacte- riano, ou o seu fragmento, codifica um polipeptídeo que tem uma reatividade cruzada antigênica comum elou uma atividade biológica in vivo substancial- mente igual a um polipeptídeo regulado pela latência selecionado a partir de 10 SEQIDNOs:1,3,5,7e56. Por exemplo, o dito primeiro antígeno micobacteriano pode compreender (ou consistir em) uma sequência de "polinucleotídeos que codi- fica uma sequência de poIipeptídeos que é capaz de despertar uma resposta de célula imune protetora (por exemplo, resposta de células T) contra a in- 15 fecção micobacteriana. A tltulo de exemplo, o polipeptídeo codificado pelo primeiro poli- nucleotídeo micobacteriano ou o fragmento compartilha, com o polipeptídeo regulado pela latência, uma capacidade comum de induzir uma "resposta de lembrança" de uma célula imune, tal como um linfócito T (por exemplo, 20 CD4+, CD8+, célula T efetora ou célula T de memória, tal como TEM ou TCM), que tenha sido previamente exposta a um componente antigênico de uma infecção micobacteriana. Com relação a isto, a secreção de |FN-y a partir de células imunes específicas para antígenos, tais como as células T, é um bom correlativo de proteção contra M. tubemulosis. Consequentemen- 25 te, o ensaio de interferon-gama (lFN-y) ELISPOT é uma leitura imunológica útil, e capacita a quantificação reproduzível e sensível de células imunes específicas para antígenos que secretam lFN-y, tais como as células T. Ajternativamente, ou além disso, um anticorpo capaz de ligar-se a um polipeptídeo codificado pelo primeiro polinucleotídeo micobacteriano, 30 ou fragmento, também seria capaz de ligar-se ao polipeptídeo regulado pela latência. A composição antigênica da invenção compreende pelo menos
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I ¢t um segundo antígeno micobacteriano, além do primeiro antígeno micobacte- riano. Em uma modalidade, o segundo antígeno micobacteriano é ca- paz de despertar uma resposta imune protetora (por exemplo, uma resposta 5 de células T) contra a infecção micobacteriana. Em uma modalidade, o segundo antígeno micobacteriano com- preende (por exemplo, consiste em) uma sequência de polipeptídeos. Em uma modalidade, o segundo antígeno micobacteriano compreende (por e- xemplo, consiste em) uma sequência de polinucleotÍdeos, tal como uma se- lO quência de DNA ou RNA. Em uma modalidade, o segundo antígeno micobacteriano com- preende (por exemplo, consiste em) um glicolipídio micobacteriano, tal como um sulfoglicoHpÍdio micobacteriano. Em uma modalidade, o segundo antlgeno micobacteriano com- 15 preende (por exemplo, consiste em) um antlgeno de carboidrato micobacte- riano, tal como um sacarídeo ou polissacarídeo micobacteriano. Opcional- mente, o sacarídeo pode ser (igado (por exemplo, quimicamente conjugado) a um veículo (por exemplo, um polipeptídeo) para aumentar a imunogenici- dade. 20 O segundo antígeno micobacteriano é diferente do primeiro antl- geno micobacteriano. Em uma modalidade, a 'diferença' entre o segundo antígeno mi- cobacteriano e o primeiro antígeno micobacteriano é definida pela especifici- dade da resposta imune ao primeiro e ao segundo antígenos micobacteria- 25 nos. Por exemplo, em uma modalidade, cada um do primeiro e do segundo antígenos induz uma resposta imune que é substancialmente específica pa- ra aquele antígeno. A 'diferença' entre o segundo antígeno micobacteriano e o pri- meiro antígeno micobacteriano pode ser definida em termos de uma falta.
30 (por exemplo, uma ausência) substancial de reatividade cruzada antigênica comum entre o primeiro e o segundo antígenos micobacterianos. A 'diferença' entre o segundo antígeno micobacteriano e o pri-
meiro antígeno micobacteriano pode ser alternativamente (ou além disso) definida como uma falta (por exemplo, uma ausência) substancial de ativida- de biológica in vivo comum entre o primeiro e o segundo antígenos micobac- terianos. 5 Por exemplo, em uma modalidade, o primeiro e o segundo antí- genos micobacterianos podem não exibir (substancialmente) nenhuma reati- vidade cruzada antigênica comum.
Em uma modalidade, o primeiro e o se- gundo antígenos micobacterianos podem não exibir (substancialmente) ne- nhuma atividade biológica in vivo comum.
Por exemplo, o primeiro e o se-
. 10 gundo antígenos micobacterianos induzem diferentes respostas imunes e/ou têm diferentes atividades biológicas in vivo.
Em uma modalidade, o primeiro e o segundo antígenos mico- bacterianos compreendem polipeptídeos (como definidos neste documento), e o segundo antígeno micobacteriano não tem substancialmente nenhuma
15 reatividade cruzada antigênica comum com o primeiro antlgeno micobacteri- ano e/ou tem uma atividade biológica in vivo substancialmente diferente do primeiro antígeno micobacteriano.
Em uma modalidade, o primeiro e o segundo antígenos mico- bacterianos compreendem poIinucleotÍdeos (como definidos neste documen-
20 to), e o segundo antígeno micobacteriano codifica um polipeptídeo que não tem substancialmente nenhuma reatividade cruzada antigênica comum com o polipeptideo codificado pelo primeiro antígeno micobacteriano.
Em uma modalidade, o primeiro e o segundo antígenos mico- bacterianos compreendem poIinucleotídeos (como definidos neste documen-
25 to), e o segundo antígeno micobacteriano tem uma atividade biológica in vivo substancialmente diferente do primeiro antígeno micobacteriano e/ou codifi- ca um poÍipeptídeo que tem uma atividade biológica in vivo substancialmente diferente do polipeptídeo codificado pelo primeiro antigeno micobacteriano.
Em uma modalidade, o primeiro antígeno micobacteriano com-
30 preende um polipeptídeo e o segundo antígeno micobacteriano compreende um poIinucleotÍdeo (como definido neste documento), e o segundo antígeno micobacteriano ou o polipeptídeo codificado por ele não tem substancial-
mente nenhuma reatividade cruzada antigênica comum com o primeiro antí- geno micobacteriano e/ou tem uma atividade biológica in vivo substancial- mente diferente do primeiro antígeno micobacteriano.
Em uma modalidade, o primeiro antígeno micobacteriano com- preende um polinucleotídeo e o segundo antígeno micobacteriano compre- ende um polipeptídeo (como definido neste documento), e o segundo antí- geno micobacteriano não tem substancialmente nenhuma reatividade cruza- da antigênica comum com o primeiro antígeno micobacteriano ou o polipep- tídeo codificado por ele, e/ou tem uma atividade biológica in vivo substanci- lO almente diferente do primeiro antígeno micobacteriano ou do polipeptídeo codificado por ele.
A título de exemplo, em uma modalidade, o primeiro e o segun- do antígenos micobacterianos (ou os polipeptídeos codificados por eles) não compartilham uma capacidade comum de induzir uma "resposta de lem- brança" de uma célula imune, tal como um linfócito T (por exemplo, CD4+, CD8+, célula T efetora ou célula T de memória, tal como TEM ou TCM), que tenha sido previamente exposta a um componente antigênico de uma infec- ção micobacteriana.
Em outras palavras, em uma modalidade, o primeiro e o segun- do antígenos micobacterianos (ou os polipeptídeos codificados por eles) são 'diferentes' porque eles induzem respostas de lembranças em diferentes cé- lulas imunes (por exemplo, diferentes células T). Em uma modalidade, o primeiro e o segundo antígenos mico- bacterianos são expressos pelas micobactérias sob diferentes condições de cultura e/ou estados de infecção.
O presente Requerente identificou que uma composição antigênica compreendendo o primeiro e o segundo antíge- nos da invenção, que são representativos de diferentes estados de infecção micobacteriana, vantajosamente provoca uma resposta imune contra dife- rentes estágios de infecção micobacteriana e, desse modo, protege contra os múltiplos estágios da doença micobacteriana. lsto é particularmente van- tajoso porque a infecção por micobactérias ocorre em fases distintas agu- das, latentes e de reativação.
Desse modo, em uma modalidade, a expressão ou a atividade do primeiro antígeno micobacteriano é suprarregulada durante as condições de latência micobacteriana, ao passo que a expressão ou a atividade do se- gundo antígeno micobacteriano é suprarregulada durante a infecção mico- 5 bacteriana ativa ou com a reativação a partir de um estado latente (e/ou in- frarregulada durante as condições de latência micobacteriana). Em uma modalidade altemativa, a expressão ou a atividade do primeiro antígeno micobacteriano é infrarregulada durante as condições de latência micobacteriana, enquanto a expressão ou a atividade do segundo . 10 antígeno micobacteriano ativa ou com a reativaçãoéainfrarregulada durante partir de um estado a infecção Iatente (e/ou micobacteriana suprarregulada - durante as condições de latência micobacteriana). O segundo antígeno micobacteriano pode compreender uma se- quência de polipeptídeos. Por exemplo, o segundo antígeno micobacteriano 15 pode compreender ou consistir em um poIipeptideo. Em uma modalidade, o segundo polipeptldeo micobacteriano compreende (ou consiste em) um polipeptídeo micobacteriano antigênico - isto é, um polipeptídeo micobacteriano que é capaz de despertar uma res- posta de células T protetora contra a infecção micobacteriana.
20 Desse modo, em uma modalidade, o segundo antígeno mico- bacteriano é um 'segundo polipeptídeo micobacteriano' (ou fragmento). Em uma modalidade, o segundo antígeno micobacteriano com- preende um polipeptídeo que é selecionado a partir do mesmo grupo de po- lipeptídeos como discutidos acima em conexão com o primeiro antígeno mi- 25 cobacteriano (desde que o segundo polipeptídeo micobacteriano seja dife- rente do primeiro polipeptídeo micobacteriano, conforme discutido acima). Desse modo, em uma modalidade, o segundo antígeno mico- bacteriano compreende (ou consiste em) uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de aminoácidos (tal co- 30 mo pelo menos 75, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 99 ou 100°6 de i- dentidade da sequência de aminoácidos) com a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo regulado pela latência selecionado a partir de SEQ (D
NOS: 1, 3, 5, 7 e 56, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos do mesmo (tal como pelo menos 10, 15, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650 ou 675 residuos de aminoácidos consecutivos do mesmo). Em uma modalidade, o segundo polipeptídeo antigênico mico- bacteriano compreende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de ami- noácidos de SEQ ID NO: 5, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 ami-
lO noácidos consecutivos da mesma.
Em uma modalidade, as limitações discutidas acima em relação ao primeiro polipeptídeo micobacteriano se aplicam igualmente a esta moda- lidade do segundo polipeptídeo micobacteriano.
Em Llma modalidade, o segundo antígeno micobacteriano com-
preende um polipeptídeo que não é selecionado a partir do mesmo grupo de polipeptideos como discutidos acima em relação ao primeiro antígeno mico- bacteriano.
Por exemplo, em uma modalidade, o segundo antígeno mico- bacteriano compreende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos
70°/o de identidade da sequência de aminoácidos (tal como pelo menos 75, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 99 ou 100% de identidade da sequên- cia de aminoácidos) com uma sequência de aminoácidos selecionada a par- tir de SEQ ID NOs: 9-20 e 34-44, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma.
Em uma modalidade, o segundo antígeno micobacteriano con- siste em uma sequência de polipeptldeos tendo pelo menos 70°6 de identi- dade da sequência de aminoácidos (tal como pelo menos 75, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 99 ou 100% de identidade da sequência de aminoáci- dos) com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID
NOS: 9-20 e 34-44, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma.
As SEQ ID NOs: 9-20 e 34-44 são ilustradas na Tabela 3, abai-
XO: Tabela 3
SEQ ID NO: Nome do po|ipeptideo: 9 Ag85A/ Rv3804c 10 Ag858/ Rv1886c 11 ESAT-6/ Rv3875 12 TB10.4/ Rv0288 13 RvO125 14 PPE18/ Rv1196 15 P27l Rv1411c 16 Hsp65/ Rv0440
17 HBHN Rv0475 18 Rv2659c 19 Rv2660C 20 HspXl Rv2031c
34 RPFNRv0867C 35 RPFBI Rv1009 36 RPFCI Rv1884c
37 RPFDI Rv2389c
38 RPFEI Rv2450c 39 Rv1733 40 Rv2029c 41 Rv2032 42 Rv2626c 43 Rv2627c
44 Rv2628
O polipeptídeo "Ag85A" representado pela SEQ ID NO: 9 do presente pedido (Nos. de Acesso CAA17868 e BX842584) é um membro de uma família de proteínas ("o complexo de Ag85"), que também compreende o Ag858 (SEQ ID NO: 10 do presente pedido) e o Ag85C.
Esta família de proteínas é secretada por M. tubercu/osis, BCG, e muitas outras espécies de micobactérias.
O Ag85A está altamente conservado entre todas as espécies micobacterianas e é imunodominante nos estudos com animais e seres hu-
lO manos.
Os polipeptídeos representados pelas SEQ ID NOS: 20 e 39-44 estão compreendidos no regulon DOSR (também conhecido como o regulon DevR), que inclui os poIipeptídeos representados por Rv2623-2631 e Rv3126-3134. A expressão destes polipeptídeos é regulada por meio do
DOSR (DevR). Os polipeptídeos representados pelas SEQ ID NOS: 34-38 são membros da família RPF de poIipeptídeos (RPFA, RPFB, RPFC, RPFD e RPFE, respectivamente). Em uma modalidade, a identidade da sequência de aminoácidos existe sobre uma região das sequências de polipeptídeos que é pelo menos 5 7 resíduos de aminoácidos consecutivos de comprimento (por exemplo, pelo menos 10, 15, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 ou 525 reslduos de aminoácidos consecu- tivos de comprimento). Os métodos convencionais para deteminar a identidade da se-
. 10 quência de aminoácidos são discutidos em mais detalhe posteriormente, no relatório descritivo.
Em uma modalidade, no contexto do segundo antígeno micobac- teriano, um fragmento do dito polipeptídeo compreende pelo menos 7 resí- duos de aminoácidos consecutivos da dita sequência de poHpeptldeos.
Em 15 uma modalidade, o fragmento compreende (ou consiste em) pelo menos 10, 15, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500 ou 525 resíduos de aminoácidos consecutivos da dita sequêncla de polipeptídeos.
Em uma modalidade, um fragmento de um poIipeptídeo é pelo 20 menos 5°/0, 10%, 20°6, 30%, 40%, 50°6, 60°6, 70%, 8Õ°/o, ou 90°6 do com- primento do poiipeptídeo micobacteriano. ' Um fragmento de um polipeptídeo pode incluir pelo menos um epítopo do polipeptídeo.
Em uma modalidade, no contexto do segundo antlgeno micobac- 25 teriano, um fragmento de um polipeptídeo compreende (ou consiste em) uma forma truncada do dito polipeptídeo.
Por exemplo, um fragmento de um polipeptÍdeo pode ter um truncamento N terminal (em comparação com o polipeptídeo), ou um fragmento de um polipeptídeo pode ter um truncamento C terminal (em comparação com o poIipeptídeo). 30 Em uma modalidade, no contexto do segundo antígeno micobac- teriano, um fragmento de um poIipeptídeo compreende (ou consiste em) uma foma madura do polipeptídeo.
Por exemplo, o polipeptídeo pode com-
preender uma sequência sinal (isto é, uma sequência de secreçãol alveja- mento) (por exemplo, na extremidade de N), e um fragmento do polipeptídeo pode não ter esta sequência sinal.
Em uma modalidade, o fragmento é for- mado por clivagem de uma sequência sinal a partir do polipeptídeo.
Em uma modalidade, um fragmento de polipeptídeo SEQ ID NO: 9 é uma forma truncada de modo N terminal de SEQ ID NO: 9. Em uma mo- dalidade, um fragmento de SEQ ID NO: 9 é uma sequência de polipeptídeos madura, a qual difere da sequência de SEQ ID NO: 9 por remoção de uma sequência sinal N terminal.
Em uma modalidade, um fragmento de polipeptí- deo SEQ ID NO: 9 tem um truncamento N terminal de pelo menos 10, 20, 30 ou 40 resíduos de aminoácidos em comparação com a sequência de amino- ácidos de SEQ ID NO: 9. Em uma modalidade, um fragmento de SEQ ID NO: 9 compreende pelo menos a sequência de 50, 100, 150, 200 ou 250 aminoácidos de SEQ ID NO: 9 C terminal.
Em uma modalidade, o segundo polipeptídeo micobacteriano, ou o seu fragmento, tem uma reatividade cruzada antigênica comum e/ou uma atividade biológica in vivo substancialmente igual ao polipeptídeo seleciona- do a partirde SEQ ID NOs: 9-20 e 34-44. Em uma modalidade, a 'reatividade cruzada antigênica comum' significa que o segundo polipeptídeo micobacteriano, ou o fragmento, com- partilha uma capacidade comum, com o poíipeptídeo selecionado a partir de SEQ ID NOs: 9-20 e 34-44, de induzir uma "resposta de lembrança" de uma célula imune, tal como um linfócito T, que tenha sido previamente exposta a um componente antigênico de uma infecção rnicobacteriana.
Por exemplo, o ensaio de interferon-gama (lFN"y) ELISPOT é útil como uma leitura imunoló- gica, porque a secreção de lFN-y a partir de células imunes específicas para antígenos, tais como as células T, é um bom correlativo de proteção contra M. tubercu/osis.
Além disso, o ensaio ELISPOT é um método muito reprodu- zÍvel e sensível de quantificar o número de céluias imunes especlficas para antígenos que secretam lFN-y, tais como as células T.
Altemativamente, ou, além disso, a 'reatividade cruzada antigê- nica comum' significa que um anticorpo capaz de Iigar-se ao segundo poli-
peptideo micobacteriano, ou fragmento, também seria capaz de ligar-se ao polipeptídeo selecionado a partir de SEQ ID NOS: 9-20 e 34-44. O segundo antígeno micobacteriano pode compreender uma se- quência de pohnucleotídeos. Por exemplo, o segundo antígeno micobacteri- ano pode compreender ou consistir em um polinucleotídeo. Em uma modalidade, o segundo polinucleotÍdeo micobacteriano compreende (ou consiste em) um polinucleotÍdeo micobacteriano antigênico - isto é, um polinucleotídeo que é capaz de despertar uma resposta de célula imnue (por exemplo, resposta de célula T) protetora contra a infecção mico- lO bacteriana. Em uma modalidade, o segundo polinucleotídeo micobacteriano codifica um poIipeptídeo micobacteriano antigênico - isto é, um polipeptídeo micobacteriano que é capaz de despertar uma resposta de célula imune (por exemplo, resposta de célula T) protetora contra a infecção micobacteriana. Desse modo, em uma modalidade, o segundo antígeno mico- bacteriano é um 'segundo polinucleotídeo micobacteriano' (ou fragmento), conforme definido acima. Em uma modalidade, o segundo antígeno micobacteriano com- preende um polinucleotídeo que é selecionado a partir do mesmo grupo de poIinucleotídeos como discutidos acima em conexão com o primeiro antíge- no micobacteriano (desde que o segundo poIinucleotídeo micobacteriano seja diferente do primeiro polinucleotÍdeo micobacteriano). Desse modo, em uma modalidade, o segundo antígeno mico- bacteriano compreende (ou consiste em) uma sequência de polinucleotídeos que codifica um polipeptídeo selecionado a partir do mesmo grupo de poli- peptídeos como discutidos acima em conexão com o primeiro antígeno mi- cobacteriano (desde que o segundo poHnucleotídeo micobacteriano seja di- ferente do primeiro polinucleotídeo micobacteriano, e desde que o polipeptí- deo codificado pelo segundo polinucleotídeo micobacteriano seja diferente do polipeptídeo codificado pelo primeiro poHnucleotídeo micobacteriano).
Desse modo, o dito segundo polinucleotídeo micobacteriano compreende uma sequência de polinucleotídeos codificando um segundo polipeptídeo micobacteriano da invenção, conforme definido acima.
Em uma modalidade, o dito polipeptídeo micobacteriano codifi- cado compreende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoáci- dos de SEQ ID NO: 5, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoáci- dos consecutivos da mesma.
Em uma modaliclade, o segundo antígeno micobacteriano com- preende (ou consiste em) uma sequência de polinucleotídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de nucleotídeos (tal como pelo me- nos 75, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 99 ou 100% de iclentidade da sequência de nucleotídeos) com a sequência de ácidos nucleicos de um po- linucleotídeo regulado pela latência selecionado a partir de SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 e 57, ou um seu fragmento tendo pelo menos 21 nucleotídeos conse- cutivos do mesmo (tal como pelo menos 25, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350, 400,"450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1 100, 1 150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950 ou 2000 resíduos de aminoácidos consecutivos do mesmo). Em uma modalidade, o segundo polipeptídeo antigênico mico- bacteriano compreende (ou consiste em) uma sequência de polinucleotídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de nucleotídeos com a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 6, ou um seu fragmento ten- do pelo menos 21 nucleotídeos consecutivos da mesma.
Em uma modalidade, as limitações discutidas acima em relação ao primeiro poIipeptídeo micobacteriano se aplicam igualmente a esta moda- lidade do segundo polipeptídeo micobacteriano.
Em uma modalidade, o segundo antígeno micobacteriano com- preende um poIinucleotídeo que não é selecionado a partir do mesmo grupo de polinucleotÍdeos como discutidos acima em relação ao primeiro antígeno micobacteriano.
Em uma modalidade, o segundo antigeno micobacteriano com- preende "um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo não é selecionado a partir do mesmo grupo de polipeptídeos como discutidos acima em relação ao primeiro antígeno micobacteriano.
Em uma modalidade, o segundo antígeno micobacteriano com- preende uma sequência de polinucleotídeos que codifica um segundo poli- peptídeo micobacteriano como definido acima.
Desse modo, em uma modalidade, o segundo antígeno mico- bacteriano compreende (ou consiste em) uma sequência de polinucleoti- deos, em que a dita sequência de poIinucleotÍdeos codifica um polipeptídeo que compreende (ou consiste em) uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de aminoácidos (tal como pelo menos 75, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 99 ou 100% de identidade da sequência de aminoácidos) com uma sequência de aminoácidos selecio- nada a partir de SEQ ID NOS: 9-20 e 34-44, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 resíduos de aminoácidos consecutivos da mesma.
Em uma modalidade, o segundo antígeno micobacteriano com- preende (ou consiste em) uma sequência de polinucleotÍdeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de nucleotídeos (tal como pelo me- nos 75, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 99 ou 1O0°/o de identidade da sequência de nucleotídeos) com uma sequência de ácidos nucleicos sele- cionada a partir de SEQ ID NOs: 21-32 e 45-55, ou um seu fragmento tendo pelo menos 21 nucleotÍcleos consecutivos da mesma.
As SEQ ID NOs: 21-32 e 45-55 são ilustradas na Tabela 4, abai- XO:
Tabela 4 SEQ ID NO: Nome do poHnucleotídeo: 21 Ag85A/ Rv3804C 22 Ag858/ RV1886C 23 ESAT-6/ RV3875 24 TB10.4/ RV0288 25 RVO125 26 PPE18/RV1196 27 P27l RV1411C 28 Hsp65/ RV0440 29 HBHN RV0475 30 Rv2659c 31 Rv2660C 32 HspXl RV2031C 45 RPFA/RV0867C
46 RPFBI RV1009
47 RPFCI RV1884C
4ã RPFDI RV2389C 49 RPFEI RV2450C 50 RV1733 51 RV2029C 52 RV2032 53 Rv2626c 54 RV2627C
S RV2628
O polinucleotídeo "Ag85A" representado peia SEQ ID NO: 21 do -presente pedido (Nos. de Acesso CAA17868 e BX842584) é um membro de uma família de genes ("o complexo de Ag85°'), que também compreende o Ag858 (SEQ ID NO: 22 do presente pedido) e o Ag85C.
Esta família de ge-
- 5 nes codifica protelnas que são secretadas por M. tubercu/osis, BCG, e mui- tas outras espécies de micobactérias.
O Ag85A está altamente conservado entre todas as espécies micobacterianas e é imunodominante nos estudos com animais e seres humanos.
Os polinucleotídeos representados pelas SEQ ID NOS: 32 e 50- 10 55 estão compreendidos no regulon DOSR (também conhecido como o regu- lon DevR), que inclui os polinucleotídeos representados por Rv2623-2631 e RV3126-3134. A expressão destes polinucleotÍdeos é regulada por meio do DOsR (DevR). Os polinucleotÍdeos representados pelas SEQ ID NOs: 45-49 15 são membros da família RPF de polinucleotídeos (RPFA, RPFB, RPFC, RPFD e RPFE, respectivamente). Em uma modalidade, a identidade da sequência de nucleotídeos existe sobre uma região das sequências de pdinucleotídeos que é pelo me- nos 21 resíduos de nucleotídeos consecutivos de comprimento (por exem- 20 plo, pelo menos 25, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550 ou 1600 resíduos de nu- cleotídeos consecutivos de comprimento). Os métodos convencionais para determinar a identidade da se- 25 quência de nucleotídeos são discutidos em mais detalhe posterionnente, no relatório descritivo. Em uma modalidade, no contexto do segundo antigeno micobac- teriano, um fragmento de um poHnucleotídeo compreende pelo menos 21 resíduos de nucleotídeos consecutivos da dita sequência de poIinuc!eotí- 5 deos. Em uma modalidade, o fragmento compreende (ou consiste em) pelo menos 25, 50, 75, 100, 125, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550 ou 1600 resíduos de nucleotídeos con- secutivos da dita sequência de polinucleotídeos.
10 Em uma modalidade, um fragmento do dito polinucleotÍdeo é pe- - Io menos 5°/0, 10°6, 20°6, 30%, 40%, 50%, 60%, 7O°/j, 8Õ°/o, ou 90°6 do comprimento do polinucleotÍdeo. Em uma modalidade, no contexto do segundo antígeno micobac- teriano, um fragmento de um poIinucleotídeo compreende (ou consiste em) 15 uma forma truncada do dito polinucleotídeo. Por exemplo, um fragmento de um polinucleotídeo pode ter um truncamento em 5' e/ou um truncamento em 3' em comparação com o poHnucleotídeo. Em uma modalidade, no contexto do segundo antlgeno micobacteriano, um fragmento de um polinucleotídeo codifica um polipeptídeo que está truncado em comparação com a sequên- 20 cia de polipeptídeos codificada pelo poIinucleotídeo de tamanho natural. Por exemplo, o fragmento de polinucleotídeo pode codificar um polipeptídeo que está truncado de modo N terminal e/ou truncado de modo C terminal, em comparação com o polipeptídeo codificado pelo polinucleotÍdeo de tamanho natural. 25 Em uma modalidade, no contexto do segundo antígeno micobac- teriano, um fragmento de um polinucleotideo codifica um polipeptldeo madu- ro. Por exemplo, o polipeptídeo pode compreender uma sequência sinal (isto é, uma sequência de secreçãol alvejamento) (por exemplo, na extremidade de N), e o fragmento do poHnucleotídeo pode codificar um fragmento de po- 30 Íipeptídeo que não tem esta sequência sinal. Em uma modalidade, um fragmento de polinucleotídeo SEQ ID NO: 21 é uma forma truncada em 5' de SEQ ID NO: 21. Em uma modalida-
de, um fragmento de polinucleotídeo SEQ ID NO: 21 tem um truncamento N terminal de pelo menos 25, 50, 75, 100 ou 125 resíduos de nucleotldeos em comparação com a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 21. Em uma modalidade, um fragmento de polinucleotídeo SEQ ID NO: 21 compreende 5 pelo menos os 150, 300, 450, 600, 750 ou 850 resíduos de nucleotídeos de SEQ ID NO: 21 C terminal. Em uma modalidade, um fragmento de polinu- cleotídeo SEQ ID NO: 21 codifica uma forma truncada de modo N terminal de SEQ ID NO: 9. Em uma modalidade, um fragmento de poünucleotídeo SEQ ID NO: 21 codifica uma sequência de polipeptídeos madura, a qual di- . 10 fere da sequência de SEQ ID NO: 9 por remoção de uma sequência sinal N terminal. Em uma modalidade, um fragmento de polinucleotÍdeo SEQ ID NO: 21 codifica um fragmento de polipeptídeo de SEQ ID NO: 9 que tem um truncamento N terminal de pelo menos 10, 20, 30 ou 40 resíduos de amino- ácidos, em comparação com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.
15 Em uma modalidade, um fragmento de polinucleotídeo SEQ ID NO: 21 codi- fica um fragmento de poIipeptídeo de SEQ ID NO: 9 que compreende pelo menos os 50, 100, 150, 200, 250 ou 275 resíduos de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 C terminal. Em uma modalidade, um polipeptídeo codificado pelo segundo 20 polinucleotídeo micobacteriano, ou fragmento, tem uma reatividade cruzada antigênica comum e/ou uma atividade biológica in vivo substancialmente igual ao polipeptídeo selecionado a partir de SEQ ID NOS: 9-20 e 34-44. A título de exemplo, o polipeptídeo codificado pelo segundo poli- nucleotídeo micobacteriano, ou o fragmento, compartilha uma capacidade 25 comum, com o polipeptídeo selecionado a partir de SEQ ID NOS: 9-20 e 34- 44, de induzir uma "resposta de Iembrança" de uma célula imune, tal como um linfócito T, que tenha sido previamente exposta a um componente anti- gênico de uma infecção micobacteriana. Por exemplo, o ensaio de interfe- ron-gama (IFN-j') ELISPOT é útil como uma leitura imunológica, porque a 30 secreção de lFNq' a partir de células imunes específicas para antígenos, tais como as células T, é um bom correlativo de proteção contra M. tubercu/osis. Além disso, o ensaio ELISPOT é um método muito reproduzível e sensível de quantificar o número de células imunes específicas para antígenos que secretam lFN-y, tais como as células T.
Alternativamente, ou, além disso, um anticorpo capaz de ligar-se a um polipeptídeo codificaclo pelo segundo polinucleotídeo micobacteriano, ou fragmento, também seria capaz de ligar-se ao polipeptídeo selecionado a partir de SEQ ID NOs: 9-20 e 34-44. Em uma modalidade, a composição antigênica compreende tan- to um antígeno RvO111 (polipeptídeo ou polinucleotídeo antigênico) quanto um antígeno RvO198 (polipeptídeo ou polinucleotídeo antigênico). Em uma modalidade, a composição antigênica compreende: (i) um primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano, em que o dito primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de poiipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da se- quência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; ou (ii) um primeiro polinucleotÍdeo micobacteriano, em que o dito primeiro poHnucleotídeo micobacteriano compreende uma sequência de po- linucleotldeos codificando o dito primeiro polipeptídeo antigênico micobacte- riano; e adicionalmente compreende: (iii) um segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano, em que o dito segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da se- quência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; ou (iv) um segundo polinucleotídeo micobacteriano, em que o dito segundo polinucleotÍdeo micobacteriano compreende uma sequência de po- Hnucleotídeos codificando o dito segundo poiipeptídeo micobacteriano.
A título de exemplo, a composição antigênica de RvO111/RvO198 pode compreender:
(i) um primeiro polipeptideo antigênico micobacteriano, em que o dito primeiro poIipeptideo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da se- quência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; e (ii) um segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano, em que o dito segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da se- lO quência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, ou urn seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma.
Alternativamente, a composição antigênica de RVO111/RVO198 pode compreender: (i) um primeiro polinucleotídeo micobacteriano, em que o dito primeiro polinucleotÍdeo micobacteriano compreende uma sequência de po- Knucleotídeos codificando um primeiro polipeptídeo antigênico micobacteria- no, em que o dito primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano compre- ende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; e (ii) um segundo polinucleotídeo micobacteriano, em que o dito segundo polinucleotídeo micobacteriano compreende uma sequência de po- linucleotídeos codificando um segundo polipeptldeo antigênico micobacteri- ano, em que o dito segundo poIipeptídeo antigênico micobacteriano compre- ende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma.
Alternativamente, a composição antigênica de RvO111/RvO198 pode compreender:
(i) um primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano, em que o dito primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da se- quência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1,
ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; e (ii) um segundo polinucleotídeo micobacteriano, em que o dito segundo polinucleotídeo micobacteriano compreende uma sequência de po- linucleotideos codificando um segundo polipeptídeo antigênico micobacteri-
lO ano, em que o dito segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano compre- ende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70°6 de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma.
Alternativamente, a composição antigênica de RvO111/RvO198 pode compreender: (i) um primeiro polinucleotÍdeo micobacteriano, em que o dito primeiro polinucleotÍdeo micobacteriano compreende uma sequência de po- Hnucleotídeos codificando um primeiro polipeptídeo antigênico micobacteria-
no, em que o dito primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano compre- ende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; e (ii) um segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano, em que o dito segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da se- quência cle aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma.
De acordo com esta modalidade, na composição antigênica de RvO111/ RVO198 da invenção, o primeiro polinucleotídeo micobacteriano po-
de compreender (ou consistir em) uma sequência de polinucleotídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de nucleotídeos com a se- quência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 2, ou um seu fragmento tendo pelo menos 21 nucleotídeos consecutivos da mesma. 5 De acordo com esta modalidade, na composição antigênica de RVO111/ RvO198 da invenção, o segundo polinucleotídeo micobacteriano pode compreender (ou consistir em) uma sequência de polinucleotldeos ten- do pelo menos 70% de identidade da sequência de nucleotídeos com a se- quência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 6, ou um seu fragmento tendo
, 10 pelo menos 21 nucleotídeos consecutivos da mesma.
Em uma modalidade, a composição antigênica não compreende
- tanto um antígeno Rv1806 quanto um antlgeno Rv1807. Desse modo, em uma modalidade, se o primeiro antígeno mico- bacteriano for um antígeno de polipeptídeo RV1806, o segundo antígeno mi- 15 cobacteriano não é um antígeno de polipeptideo RV1807. Em uma modali- dade, se o primeiro antígeno micobacteriano for um antígeno de polinucleo- tÍdeo RV1806, o segundo antlgeno micobacteriano não é um antigeno de polinucleotÍdeo Rv1807. Em uma modalidade, se o primeiro antígeno mico- bacteriano for um antígeno de polipeptideo Rv1806, o segundo antígeno mi- 20 cobacteriano não é um antígeno de polinucleotídeo RV1807. Em uma moda- Iidade, se o primeiro antígeno micobacteriano for um antígeno de polinucleo- tídeo RV1806, o segundo antígeno micobacteriano não é um antígeno de polipeptídeo Rv1807. Em uma modalidade, se o primeiro antígeno micobacteriano for 25 um antígeno de polipeptídeo Rv1807, o segundo antígeno micobacteriano não é um antígeno de polipeptídeo RV1806. Em uma modalidade, se o pri- meiro antígeno micobacteriano for um antígeno de polinucleotÍdeo Rv1807, o segundo antígeno micobacteriano não é um antígeno de polinucleotídeo Rv1806. Em uma modalidade, se o primeiro antígeno micobacteriano for um 30 antígeno de poIipeptídeo Rv1807, o segundo antígeno micobacteriano não é um antígeno de polinucleotideo Rv1806. Em uma modalidade, se o primeiro antígeno micobacteriano for um antígeno de polinucleotídeo Rv1807, o se-
gundo antígeno micobacteriano não é um antígeno de polinucleotídeo
RV1806. Em uma modalidade, se o primeiro antlgeno micobacteriano compreender: 5 (i) uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70°6 de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; o segundo antígeno micobacteriano não compreende:
. 10 (ii) uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 7Õ°/o de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos
" de SEQ ID NO: 56, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma.
Em uma modalidade, se o primeiro antígeno micobacteriano
15 compreender: (i) uma sequência de polinudeotídeos codificando uma se- quência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; ou
20 uma sequência de pdinucleotídeos tendo pelo menos 70% de iclentidade da sequência de nucleotídeos com a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 4, ou um seu fragmento tendo pelo menos 21 nucleotídeos consecutivos da mesma: o segundo antígeno micobacteriano não compreende:
25 (ii) uma sequência de poKnucleotídeos codificando uma se- quência de polipeptídeos tendo pelo menos 70°6 de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; ou uma sequência de polinucleotídeos tendo pelo menos 70% de identidade da
30 sequência de nucleotídeos com a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 57, ou um seu fragmento tendo pelo menos 21 nucleotídeos consecuti-
vos da mesma.
Em uma modalidade, se o primeiro antígeno micobacteriano compreendet (i) uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70°6 de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; ou (ii) uma sequência de polinucleotídeos codificando uma se- quência de polipeptídeos de acordo com (i); ou uma sequência de polinucle- otídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de nucleotídeos com a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 4, ou um seu fragmen- to tendo pelo menos 21 nucleotídeos consecutivos da mesma; o segundo antígeno micobacteriano não compreende: (iii) uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; ou (iv) uma sequência de polinucleotídeos codificando uma se- quência de poiipeptldeos de acordo com (iii); ou uma sequência de poIinu- cleotídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de nucleotí-
deos com a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 57, ou um seu fragmento tendo pelo menos 21 nucleotídeos consecutivos da mesma.
Em uma modalidade, se o primeiro antígeno micobacteriano compreender: (i) uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, ou um seu fragmento tendo pelo menos' 7 aminoácidos consecutivos da mesma; o segundo antígeno micobacteriano não compreende: (ii) uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 7O°/j de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma.
Em uma modalidade, se o primeiro antígeno micobacteriano compreender: (i) uma sequência de poIinucleotÍdeos codificando uma se- quência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; ou uma sequência de polinucleotÍdeos tendo pelo menos 7Ó°/o de identidade da sequência de nucleotídeos com a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 57, ou um seu fragmento tendo pelo menos 21 nucleotídeos consecuti-
lO vos da mesma; o segundo antígeno micobacteriano não compreende: (ii) uma sequência de polinucleotídeos codificando uma se- quência de poiipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; ou uma sequência de polinucleotideos tendo pelo menos 70°6 de identidade da sequência de nucleotídeos com a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 4, ou um seu fragmento tendo pelo menos 21 nucleotldeos consecutivos da mesma.
Em uma modalidade, se o primeiro antlgeno micobacteriano compreender: (i) uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 56, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; ou (ii) uma sequência de polinucleotÍdeos codificando uma se- quência de poIipeptídeos de acordo com (i); ou uma sequência de polinucle- otídeos tendo pelo menos 70°6 de identidade da sequência de nucleotídeos com a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 57, ou um seu frag-
mento tendo pelo menos 21 nucleotídeos consecutivos da mesma; o segundo antigeno micobacteriano não compreende: (iii) uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; ou (iv) uma sequência de polinucleotÍdeos codificando uma se-
5 quência de polipeptídeos de acordo com (iii); ou uma sequência de poIinu- cleotídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de nucleoti- deos com a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 4, ou um seu fragmento tendo pelo menos 21 nucleotídeos consecutivos da mesma.
Em uma modatidade, a composição antigênica compreende tan-
6 lO to um antigeno Rv3812 (polipeptÍcleo ou polinucleotídeo antigênico) quanto um antigeno RvO198 (polipeptídeo ou polinucleotÍdeo antigênico). W Em uma modalidade, a composição antigênica compreende:
(i) um primeiro polipeptideo antigênico micobacteriano, em que o dito primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriàno compreende uma
15 sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da se- quência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; ou (ii) um primeiro polinucleotÍdeo micobacteriano, em que o dito 20 primeiro polinucleotideo micobacteriano compreende uma sequência de po- !inucleotídeos codificando o dito primeiro polipeptídeo antigênico micobacte-
riano; e adicionalmente compreende: (iii) um segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano, em
25 que o dito segundo polipeptldeo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da se- quência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; ou 30 (iv) um segundo polinucleotideo micobacteriano, em que o dito segundo poIinucleotÍdeo micobacteriano compreende uma sequência de po- linucleotídeos codificando o dito segundo polipeptídeo micobacteriano.
A título de exemplo, a composição antigênica de Rv3812/RVO198 pode compreender: (i) um primeiro polipeptideo antigênico micobacteriano, em que o dito primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano compreende uma 5 sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70°'6 de identidade da se- quência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; e (ii) um segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano, em
. 10 que o dito segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da se-
- quência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma. 15 Alternativamente, a composição antigênica de RV3812/RVO198 pode compreender: (i) um primeiro poHnucleotídeo micobacteriano, em que o dito primeiro polinucleotÍdeo rnicobacteriano compreende uma sequência de po- linucleotÍdeos codificando um primeiro poIipeptídeo antigênico micobacteria- 20 no, em que o dito primeiro polipeptideo antigênico micobacteriano compre- ende uma sequência de polipeptldeos tendo pelo menos 70°6 de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; e 25 (ii) um segundo poHnucleotídeo micobacteriano, em que o dito segundo polinucleotídeo micobacteriano compreende uma sequência de po- linucleotídeos codificando um segundo polipeptídeo antigênico micobacteri- ano, em que o dito segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano compre- ende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade 30 da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma.
Alternativamente, a composição antigênica de Rv3812/RVO198 pode compreender: (i) um primeiro poIipeptídeo antigênico micobacteriano, em que o dito primeiro polipeptideo antigênico micobacteriano compreende uma 5 sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70°6 de identidade da se- quência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; e (ii) um segundo polinucleotÍdeo micobacteriano, em que o dito
. 10 segundo polinucleotídeo micobacteriano compreende uma sequência de po- linucleotídeos codificando um segundo poIipeptídeo antigênico micobacteri-
- ano, em que o dito segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano compre- ende uma sequência de poIipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID 15 NO: 5, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma.
Alternativamente, a composição antigênica de Rv3812/RvO198 pode compreender: (i) um primeiro polinucleotídeo micobacteriano, em que o dito 20 primeiro polinucleotÍdeo micobacteriano compreende uma sequência de po- linucleotídeos codificando um primeiro polipeptideo antigênico micobacteria- no, em que o dito primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano compre- ende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID 25 NO: 7, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; e (ii) um segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano, em que o dito segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da se- 30 quência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma.
A composição antigênica da invenção pode adicionalmente compreender, além do primeiro e do segundo antígenos micobacterianos discutidos acima, pelo menos um antígeno micobacteriano adicional, o qual é diferente do primeiro e/ou do segundo antígenos micobacterianos. Em uma 5 modalidade, o pelo menos um antígeno micobacteriano adicional é diferente tanto do primeiro antlgeno micobacteriano quanto do segundo antígeno mi- co.bacteriano. Em uma modalidade, a composição antigênica da invenção adi- cionalmente compreende pelo menos um poIipeptídeo antigênico micobacte- . 10 riano adicional, o qual é diferente do dito primeiro poIipeptídeo antigênico micobacteriano e/ou do dito segundo polipeptídeo antigênico micobacteria- no. Em uma modalidade, a composição antigênica da invenção adicional- mente compreende pelo menos um polinucleoüdeo micobacteriano adicio- nal, o qual é diferente do dito primeiro polinucleotídeo micobacteriano e/ou 15 do dito segundo polinucleotÍdeo micobacteriano. Ern uma modalidade, em que houver múltiplos antigenos mico- bacterianos adicionais (por exemplo, 2 ou mais antígenos micobacterianos adicionais, bem como o primeiro e o segundo antígenos micobacterianos), cada um dos ditos antígenos micobacterianos adicionais é diferente um do ' 20 outro. Em uma modalidade, a 'diferença' entre O(S) antígeno(s) mico- bacteriano(s) adicional(is) e o primeiro e o segundo antígenos micobacteria- nos é definida pela especificidade da resposta imune aos antígenos mico- bacterianos. Por exemplo, em uma modalidade, cada um do primeiro, do 25 segundo antígenos e dos antígenos adicionais induz uma resposta imune que é substancialmente específica para aquele antígeno. A 'diferença' entre o primeiro, o segundo antígenos micobacteri- anos e os antígenos micobacterianos adicionais pode ser definida em termos de uma falta (por exemplo, uma ausência) substancial de reatividade cruza- 30 da antigênica comum entre os antígenos micobacterianos. A 'diferença' entre o primeiro, o segundo antígenos micobacteri- anos e os antígenos micobacterianos adicionais pode ser alternativamente
P
(ou além disso) definida como uma falta (por exemplo, uma ausência) subs- tancial de atividade biológica in vivo comum entre os antígenos micobacteri-
anos.
Por exemplo, em uma modalidade, o primeiro, o segundo antí- genos micobacterianos e os antígenos micobacterianos adicionais (por e- xemplo, o primeiro, o segundo polipeptídeos antigênicos micobacterianos e os polipeptídeos antigênicos micobacterianos adicionais, ou o primeiro, o segundo polinucleotídeos antigênicos micobacterianos e os poHnucleotídeos antigênicos micobacterianos adicionais ou o polipeptídeo codificado por eles) podem não exibir (substancialmente) nenhuma reatividade cruzada antigêni- ca comum.
Em uma modalidade, o primeiro, o segundo antígenos micobac- terianos e os antígenos micobacterianos adicionais (por exemplo, o primeiro, o segundo polipeptídeos antigênicos micobacterianos e os polipeptídeos an- tigênicos micobacterianos adicionais, ou o primeiro, o segundo polinucleotí- deos antigênicos micobacterianos e os polinucleotÍdeos antigênicos mico- bacterianos adicionais ou o polipeptideo codificado por eles) não exibem (substancialmente) nenhuma atividade biológica in vivo comum.
Por exemplo, o primeiro, o segundo antígenos micobacterianos e os antígenos micobacterianos adicionais (por exemplo, o primeiro, o segun- do polipeptídeos antigênicos micobacterianos e os polipeptídeos antigênicos micobacterianos adicionais, ou o primeiro, o segundo poKnucleotídeos anti- gênicos micobacterianos e os poHnucleotídeos antigênicos micobacterianos adicionais ou o polipeptídeo codificado por eles) podem, cada um, induzir diferentes respostas imunes e/ou, cada um, ter diferentes atividades biológi- cas in vivo.
A título de exemplo, em uma modalidade, o primeiro, o segundo antígenos micobacterianos e os antígenos micobacterianos adicionais (por exemplo, o primeiro, o segundo polipeptídeos antigênicos micobacterianos e os polipeptídeos antigênicos micobacterianos adicionais, ou o primeiro, o segundo polinucleotÍdeos antigênicos micobacterianos e os polinucleotÍdeos antigênicos micobacterianos adicionais ou o polipeptídeo codificado por eles)
não compartilham uma capacidade comum de induzir uma "resposta de lembrança" de uma célula imune, tal como um linfócito T (por exemplo, CD4+, CD8", célula T efetora ou célula T de memória, tal como uma TEM ou TCM), que tenha sido previamente exposta a um componente antigênico de 5 urna infecção micobacteriana. Em outras palavras, em uma modalidade, o primeiro, o segundo antígenos micobacterianos e os antígenos micobacterianos adicionais são 'diferentes' porque eles induzem respostas de lembranças em diferentes cé- lulas imunes (por exemplo, diferentes células T).
. 10 Em uma modalidade, os um ou mais antígenos micobacterianos adicionais são expressos ou suprarregulados sob condições de cultura e/ou - estados de infecção micobacteriana diferentes, em comparação com o pri- meiro e/ou o segundo antígenos micobacterianos. Em uma modalidade, a atividade dos um ou mais antígenos micobacterianos adicionais é suprarre- 15 gulada sob condições de cultura e/ou estados de infecção micobacteriana diferentes, em comparação com o primeiro e/ou o segundo antígenos mico- bacterianos. Com relação a isto, o presente Requerente identificou que uma composição antigênica compreendendo o primeiro e o segundo antígenos 20 micobacterianos e os antígenos micobacterianos adicionais da invenção, que são representativos dos diferentes estados de infecção micobacteriana, vantajosamente provoca uma resposta imune contra os diferentes estágios de infecção micobacteriana e, desse modo, protege contra os múltiplos es- tágios da doença micobacteriana. lsto é particularmente vantajoso porque a 25 infecção micobacteriana ocorre em fases agudas, latentes e de reativação distintas. Desse modo, em uma modalidade, a expressão ou a atividade do primeiro antígeno micobacteriano é suprarregulada durante as condições de Iatência micobacteriana, enquanto a expressão ou a atividade do segun- 30 do antígeno micobacteriano e/ou do antígeno micobacteriano adicional é suprarregulada durante a infecção micobacteriana ativa ou com a reativação a partir de um estado latente (e/ou infrarregulada durante as condições de latência micobacteriana). Em uma modalidade alternativa, a expressão ou a atividade do primeiro antígeno micobacteriano é infrarregulada durante as condições de latência micobacteriana, enquanto a expressão ou a atividade do segundo 5 antígeno micobacteriano e/ou do antígeno micobacteriano adicional é infrar- regulada durante a infecção micobacteriana ativa ou com a reativação a par- tir de um estado latente (e/ou suprarregulada durante as condições de latên- cia micobacteriana). Em uma modalidade, em que houver múltiplos antígenos mico-
. 10 bacterianos adicionais (por exemplo, 2 ou mais antígenos micobacterianos adicionais, bem como o primeiro e o segundo antígenos micobacterianos),
- cada antígeno micobacteriano adicional é expressol suprarregulado em dife- rentes estágios de infecção micobacteriana, ou a atividade de cada antígeno micobacteriano adicional é suprarregulada em diferentes estágios de infec- 15 . ção micobacteriana.
Em uma modalidade, os um ou mais antígenos micobacterianos adicionais são a partir de uma micobactéria diferente da M. tubercu/osis.
Por exemplo, os um ou mais antígenos micobacterianos adicionais podem ser a partir de outro membro do MTC, tal como M. microti, M. bov/s, M. canetti ou 20 M. afiicanum, ou uma micobactéria que não do MTC, tal como M. aviúm- intracel/u/are, M. kansasii, M. marinum ou M. ulcerans.
Em uma modalidade, a composição antigênica compreende pelo menos 1, 2, 3, 4 ou 5 antígenos micobacterianos adicionais, além do primei- ro e do segundo antígenos micobacterianos discutidos acima.
Em uma mo- 25 dalidade, cada um dos ditos pelo menos 1, 2, 3, 4 ou 5 antígenos micobacte- rianos adicionais é diferente um do outro e do primeiro e do segundo antíge- nos micobacterianos.
Em uma modalidade, a composição antigênica com- preende até cerca de 10 antígenos micobacterianos diferentes (por exemplo, incluindo o primeiro e o segundo antígenos micobacterianos discutidos aci- 30 ma). Em uma modalidade, a composição antigênica compreende 1 antígeno micobacteriano adicional e, desse modo, compreende um total de 3 antígenos micobacterianos diferentes (isto é, a composição antigênica é tri- mérica). Em uma modalidade, a composição antigênica compreende 2 antí- genos micobacterianos ad icionais e, desse modo, compreende um total de 4 antígenos micobacterianos diferentes (.e., a composição antigênica é tetra- 5 mérica). Em uma modalidade, a composição antigênica compreende 3 antí- genos micobacterianos adicionais e, desse modo, compreende um total de 4 antígenos micobacterianos diferentes (isto é, a composição antigênica é pentamérica). Em uma modalidade, a composição antigênica compreende até 8 antígenos micobacterianos adicionais e, desse modo, compreende até
. 10 um total de 10 antígenos micobacterianos diferentes (isto é, a composição antigênica é até decamérica). Os um ou mais antígenos micobacterianos adicionais podem compreender (ou consistir em) uma sequência de polipeptídeos.
Em uma modalidade, os um ou mais antígenos micobacterianos 15 adicionais compreendem (ou consistem em) uma sequência de polipeptí- deos tendo pelo menos 70°6 de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de um poIipeptideo regulado pela latência selecionado a partir de SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7 e 56, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos do mesmo, como definido 20 acima em relação ao primeiro antígeno micobacteriano (desde que os um ou mais antígenos micobacterianos adicionais sejam diferentes do primeiro an- tígeno mlcobacteriano). . Alternativamente, ou além disso, os um ou mais antígenos mico- bacterianos adicionais podem compreender (ou consistir em) uma sequência 25 de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de ami- noácidos com uma sequência de aminoácidos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 9-20 e 34-44, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoáci- dos consecutivos da mesma, como definido acima em relação ao segundo antígeno micobacteriano (desde que os um ou mais antígenos micobacteria- 30 nos adicionais sejam diferentes do segundo antígeno micobacteriano). Os um ou mais antígenos micobacterianos adi.cionais podem compreender (ou consistir em) uma sequência de poIinucleotídeos.
Em uma modalidade, os um ou mais antígenos micobacterianos adicionais compreendem (ou consistem em) uma sequência de poHnucleotí- deos que codifica uma sequência de polipeptídeos, como descrito acima em relação ao primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano (desde que os
5 um ou mais antígenos micobacterianos adicionais sejam diferentes do pri- meiro antígeno micobacteriano). Em uma modalidade, os um ou mais antígenos micobacterianos adicionais compreendem (ou consistem em) uma sequência de polinucleotí deos que codifica uma sequência de poIipeptídeos, como descrito acima em
. 10 relação ao segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano (desde que os um ou mais antígenos micobacterianos adicionais sejam diferentes do se- gundo antígeno micobacteriano). Em uma modalidade, os um ou mais antígenos micobacterianos adicionais compreendem (ou consistem em) uma sequência de polinucleotí-
15 deos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de nucleotídeos com a sequência de ácidos nucleicos de um polinucleotÍdeo regulado pela Iatência selecionado a partir de SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8 e 57, ou um seu fragmento tendo pelo menos 21 nucleotídeos consecutivos do mesmo, como descrito acima em relação ao primeiro antígeno micobacteriano (desde que
20 os um ou mais antígenos micobacterianos adicionais sejam diferentes do primeiro antígeno micobacteriano). Altemativamente, ou além disso, os um ou mais antígenos mico- bacterianos adicionais podem compreender (ou consistir em) uma sequência de polinucleotídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de
25 nucleotídeos com uma sequência de ácidos nucleicos selecionada a partir de SEQ ID NOs: 21-32 e 45-55, ou um seu fragmento tendo pelo menos 21 nucleotídeos consecutivos da mesma, como descrito acima em relação ao segundo antígeno micobacteriano (desde que os um ou mais antlgenos mi- cobacterianos adicionais sejam diferentes do segundo antígeno micobacteri-
30 ano). Em uma modalidade, a composição antigênica compreende: (i) um primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano, em que o dito primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da se- quência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou 7, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos 5 da mesma; ou (ii) um primeiro polinucleotideo micobacteriano, em que o dito primeiro polinucleotídeo micobacteriano compreende uma sequência de po- linucleotídeos codificando o dito primeiro polipeptídeo antigênico micobacte- riano;
. 10 e adicionalmente compreende: (iii) um segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano, em que o dito segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70°6 de identidade da se- quência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, 15 ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; ou (iv) um segundo poIinucleotídeo micobacteriano, em que o dito segundo poKnucleotídeo micobacteriano compreende uma sequência de po- linucleotídeos codificando o dito segundo polipeptídeo micobacteriano; 20 e adicionalmente compreende: (v) pelo menos um polipeptídeo antigênico micobacteriano adi- cional, o quai é diferente do dito primeiro polipeptídeo antigênico micobacte- riano e/ou do dito segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano; ou pelo menos um polinucleotídeo micobacteriano adicional, o qual é diferente do 25 dito primeiro polinucleotÍdeo micobacteriano e/ou do dito segundo polinu- cleotÍdeo micobacteriano.
Em uma modalidade, a composição antigênica não compreende tanto um antígeno Rv1806 quanto um antígeno Rv1807. Desse modo, em uma modalidade, se o primeiro antígeno mico- 30 bacteriano for um antlgeno de polipeptídeo Rv1806, o dito antígeno mico- bacteriano adicional na composição antigênica não é um antígeno de poli- peptídeo RV1807. Em uma modalidade, se o primeiro antigeno micobacteri-
ano for um antígeno de polinucleotídeo Rv1806, o d ito antígeno micobacteri- ano adicional na composição antigênica não é um antígeno de polinucleotÍ- deo RV1807. Em uma modalidade, se o primeiro antígeno micobacteriano for um antígeno de polipeptídeo Rv1806, o dito antígeno micobacteriano adicio- 5 nal na composição antigênica não é um antlgeno de polinucleotÍdeo RV1807. Em uma modalidade, se o primeiro antígeno micobacteriano for um antígeno de polinucleotÍdeo RV1806, o dito antigeno micobacteriano adicional na composição antigênica não é um antígeno de polipeptídeo Rv1807. Em uma modalidade, se o primeiro antlgeno micobacteriano for
. 10 um antígeno de polipeptídeo Rv1807, o dito antígeno micobacteriano adicio- nal na composição antigênica não é um antígeno de polipeptídeo Rv1806. Em uma modalidade, se o primeiro antígeno micobacteriano for um antígeno de poHnucleotídeo RV1807, o dito antígeno micobacteriano adicional na composição antigênica não é um antígeno de polinucleotÍdeo Rv1806. Em 15 uma modalidade, se o primeiro antígeno micobacteriano for um antígeno de polipeptídeo Rv1807, o dito antígeno micobacteriano adicional na composi- ção antigênica não é um antígeno de po1inucleotídeo Rv1806. Em uma mo- dalidade, se o primeiro antígeno micobacteriano for um antígeno de polinu- cleotídeo RV1807, o dito antígeno micobacteriano adicional na composição 20 antigênica não é um antígeno de polipeptídeo Rv1806. Em uma modalidade, a composição antigênica não compreende um antígeno RvO111, um antígeno RvO198 e um antígeno RV3812. Desse modo, se a composição antigênica compreender um antígeno RvO111 e um antígeno RvO198, a composição antigênica não compreende também um 25 antigeno Rv3812. A título de exemplo, se o primeiro polipeptídeo antigênico mico- bacteriano ou o primeiro polipeptídeo micobacteriano compreender um antí- geno RvO111 e se o segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano ou o segundo polinucleotÍdeo micobacteriano compreender um antigeno RvO198, 30 os um ou mais polipeptídeos ou polinucleotídeos antigênicos adicionais na . composição antigênica não compreendem (ou consistem em) um antígeno Rv3812. Alternativamente, se o primeiro polipeptídeo antigênico micobacte-
riano ou o primeiro polipeptídeo micobacteriano compreender um antígeno RVO198 e se o segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano ou o segun- do polinucleotÍdeo micobacteriano compreender um antígeno RVO111, os um ou mais polipeptídeos ou polinucleotídeos antigênicos adicionais na compo- '5 sição antigênica não compreendem (ou consistem em) um antígeno Rv3812. A título de exemplo, em uma modalidade, a composição antigê- nica compreende: (i) um primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano, em que o dito primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano compreende uma
. 10 sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70°6 de identidade da se- quência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, ou um seµ fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; ou (ii) um primeiro polinucleotídeo micobacteriano, em que o dito 15 primeiro poIinucleotídeo micobacteriano compreende uma sequência de po- linucleotídeos codificando o dito primeiro polipeptídeo antigênico micobacte-
riano; e adicionalmente compreende: (iii) um segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano, em 20 que o dito segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de poIipeptídeos tendo pelo menos 70°6 de identidade da se- quência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; ou 25 (iv) um segundo polinucleotídeo micobacteriano, em que o dito segundo polinucleotídeo micobacteriano compreende uma sequência de po- (inucleotídeos codificando o dito segundo polipeptídeo micobacteriano; e ainda adicionalmente compreende pelo menos um polipeptí- deo antigênico micobacteriano adicional, o qual é diferente do dito primeiro 30 polipeptídeo antigênico micobacteriano e/ou do dito segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano; em que o dito pelo menos um polipeptídeo anti- gênico micobacteriano adicional não é um antígeno de poIipeptídeo RV3812.
Conforme discutido aci.ma, um "antígeno de polipeptídeo Rv3812" compreende ou consiste na SEQ ID NO: 7 (ou uma 'variante' ou 'fragmento' da sequência da mesma, conforme definido neste documento). Desse modo, de acordo com esta modalidade da invenção, o pelo menos um polipeptideo antigênico micobacteriano adicional pode compreender ou consistir em uma sequência de polipeptídeos que tem menos do que 50°6 de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, ou um seu fragmento tendo menos do que 7 aminoácidos consecutivos da mesma.
Em uma modalidade alternativa, a composição antigênica com- preende: (i) um primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano, em que o dito primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de polipeptldeos tendo pelo menos 70% de identidade da se- quência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ÍD NO: 1, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; ou (ii) um primeiro polinucleotídeo micobacteriano, em que o dito primeiro polinucleotídeo micobacteriano compreende uma sequência de po- linucleotídeos codificando o dito primeiro polipeptídeo antigênico micobacte- riano: e adicionalmente compreende: (iii) um segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano, em que o dito segundo polipeptideo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 7Ô°/o de identidade da se- quência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; ou (iv) um segundo polinucleotídeo micobacteriano, em que o dito segundo pohnucleotídeo micobacteriano compreende uma sequência de po- linucleotídeos codificando o dito segundo polipeptídeo micobacteriano; e ainda adicionalmente compreende pelo menos um poÍinucleo-
tídeo micobacteriano adicional, o qual é diferente do dito primeiro polinucleo- tídeo micobacteriano e/ou do dito segundo polinucleotídeo micobacteriano; em que o dito pelo menos um polinucleotídeo micobacteriano adicional não é um antígeno de polinucleotídeo Rv3812. 5 Conforme discutido acima, um "antígeno de polinucleotldeo Rv3812" compreende ou consiste na SEQ ID NO: 8 (ou uma 'variante' ou 'fragmento' da sequência da mesma, confome definido neste documento). Desse modo, de acordo com esta modalidade da invenção, o pelo menos um polinucleotídeo micobacteriano adicional pode compreender ou consistir
. 10 em uma sequência de poiinucleotídeos que tem menos do que 5Ó°/o de iden- tidade da sequência de nucleotídeos com a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 8, ou um seu fragmento tendo menos do que 21 nucleotí- deos consecutivos da mesma.
Em uma modalidade, a composição antigênica não compreende 15 a SEQ ID NO: 1 (ou uma 'variante' ou 'fragmento' da sequência da mesma, conforme definido neste documento) e a SEQ ID NO: 5 (ou uma 'varianie' ou 'fragmento' da sequência da mesma, conforme definido neste documento) e a SEQ ID NO: 7 (ou uma 'variante' ou 'fragmento' da sequência da mesma, conforme definido neste documento). 20 Em uma modalidade, a composição antigênica não compreende a SEQ ID NO: 2 (ou uma 'variante' ou 'fragmento' da sequência da mesma, conforme definido neste clocumento) e a SEQ ID NO: 6 (ou uma 'variante' ou 'fragmento' da sequência da mesma, conforme definido neste documento) e a SEQ ID NO: 8 (ou uma 'variante' ou 'fragmento' da sequência da mesma, 25 conforme definido neste documento). Em uma modalidade, pelo menos dois dos antígenos micobacte- rianos na composição antigênica compreendem (ou consistem em) uma se- quência de poIipeptídeos, e as ditas pelo menos duas sequências de poli- peptídeos são unidas conjuntamente para formar uma proteína de fusão. 30 A título de exemplo, em uma modalidade, o primeiro antígeno micobacteriano e o segundo antígeno micobacteriano, cada um, compreen- dem (ou consistem em) uma sequência de polipeptídeos, como definido a-
cima, e as ditas primeira e segunda sequências de polipeptídeos são unidas conjuntamente para formar uma proteína de fusão.
Em uma modalidade, a dita proteína de fusão é uma proteína de fusão de RVO111-RVO198, em que a dita proteína de fusão de RVO111-
5 RvO198 compreende ou consiste em (em qualquer ordem a partir da extre- midadedeNatéadeC): (i) um primeiro polipeptldeo antigênico micobacteriano, em que o dito primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano compreende (ou consiste em) uma sequência de poIipeptídeos tendo pelo menos 70% de
. 10 identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; e (ii) um segundo polipeptídeo antigêníco micobacteriano, em que o dito segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano compreende (ou
15 consiste em) uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma.
Em uma modalidade, a dita proteína de fusão é uma proteína de
20 fusão de Rv3812-RvO198, em que a dita proteína de fusão de Rv3812- RVO198 compreende ou consiste em (em qualquer ordem a partir da extre- midadedeNatéadeC): (i) um primeiro polipeptÍdeo antigênico micobacteriano, em que o dito primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano compreende (ou
25 consiste em) uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; e (ii) um segundo poIipeptídeo antigênico micobacteriano, em 30 que o dito segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano compreende (ou consiste em) uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma.
Em uma modalidade, a dita proteína de fusão adicionalmente compreende pelo menos uma sequência de polipeptídeos antigênica mico-
5 bacteriana adicional, unida às ditas primeira e/ou segunda sequências de polipeptídeos, em que cada um dos ditos antígenos micobacterianos adicio- nais é diferente um do outro e do primeiro e do segundo antígenos micobac- terianos.
Por exemplo, a protelna de fusão pode compreender pelo menos 1, 2, 3, 4 ou 5 antígenos micobacterianos adicionais, além dos ditos primeiro e
, 10 segundo antígenos micobacterianos, em que cada um dos ditos antígeno micobacterianos adicionais é diferente um do outro e do primeiro e do se- gundo antígenos micobacterianos.
Em uma modalidade, a protelna de fusão pode compreender até cerca de 10 antígenos micobacterianos diferentes (por exemplo, incluindo o primeiro e o segundo antígenos micobacterianos)-
15 Em uma modalidade, a composição antigênica compreende pelo menos um antigeno micobacteriano adicional (por exemplo, pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 antígenos micobacterianos adicionais) e o primeiro antígeno micobacteriano e o dito pelo menos um antígeno micobacteriano adicional, cada um, compreendem (ou consistem em) uma sequência de
20 poIipeptídeos, como definido acima, e as ditas sequências de polipeptídeos são unidas conjuntamente para formar uma proteína de fusão.
Em uma modalidade, a composição antigênica compreende pelo menos um antígeno micobacteriano adicional (por exemplo, peio menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 antígenos micobacterianos adicionais) e o segundo
25 antígeno micobacteriano e o dito pelo menos um antígeno. micobacteriano adicional, cada um, compreendem (ou consistem em) uma sequência de polipeptídeos, como definido acima, e as ditas sequências de polipeptídeos são unidas conjuntamente para formar uma proteína de fusão.
Alternativamente, em uma modalidade, a composição antigênica
30 compreende pelo menos dois antígenos micobacterianos adicionais (por e- xemplo, pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 antígenos micobacterianos adicionais), e os ditos pelo menos dois antígenos micobacterianos adicio-
nais, cada um, compreendem (ou consistem em) uma sequência de polipep- tídeos, como definido acima, e as ditas sequências de polipeptídeos são u- nidas conjuntamente para formar uma proteína de fusão.
Em uma modalidade, a composição antigênica não compreende uma proteina de fusão que compreende tanto um antígeno Rv1806 quanto um antígeno Rv1807. Desse modo, em uma modalidade, a composição anti- gênica não compreende uma proteína de fusão que compreende tanto a SEQ ID NO: 3 (ou uma 'variante' ou 'fragmento' da sequência da mesma, conforme definido neste documento) quanto a SEQ ID NO: 56 (ou uma 'vari- lO ante' ou 'fragmento' da sequência da mesma, conforme definido neste do- cumento). Em uma modalidade, a composição antigênica não compreende uma proteína de fusão que consiste em um antígeno Rv1806 e um antígeno Rv1807. Desse modo, em uma modalidade, a composição antigênica não compreende uma proteína de fusão que consiste tanto na SEQ ID NO: 3 (ou uma 'variante' ou 'fragmento' da sequência da mesma, conforme definido neste documento) quanto na SEQ ID NO: 56 (ou uma 'variante' ou 'fragmen- to' da sequência da mesma, conforme definido neste documento). Em uma modalidade, se a composição antigênica compreender um antígeno RVO111 e um antígeno Rv1098 (por exemplo, separadamente, ou na forma de uma proteína de fusão), a composição antigênica (ou a pro- teína de fusão) não compreende também um antígeno Rv3821. Desse modo, em uma modalidade, a composição antigênica não compreende uma proteína de fusão compreendendo ou consistindo em: SEQ ID NO: 1 (ou uma 'variante' ou 'fragmento' da sequência da mesma, conforme definido neste documento) e SEQ ID NO: 5 (ou uma 'variante' ou 'fragmento' da sequência da mesma, conforme definido neste documento) e SEQ ID NO: 7 (ou uma 'variante' ou 'fragmento' da sequência da mesma, conforme definido neste documento). A ordem das sequências de polipeptídeos na proteína de fusão não é importante.
As práticas para preparar as proteínas de fusão são bastante conhecidas na técnica. Em uma modalidade, uma proteína de fusão recombinante pode ser gerada por expressão de uma sequência de polinucleotÍdeos recombi- nante que codifica a dita protelna de fusão. A titulo de exemplo, as sequên- 5 cias de pohnucleotídeos codificando os polipeptídeos antigênicos micobacte- rianos da invenção podem estar posicionadas no mesmo quadro de leitura a jusante de um promotor em um vetor de expressão, com isso permitindo a transcrição através das sequências de poHnucleotídeos e a tradução como um produto de proteína.
. 10 Em uma modalidade, as sequências 'ligadoras' intervenientes estão localizadas entre a sequência de poHnucleotídeo para cada antígeno " de polipeptídeo, originando-se da inclusão de sÍtios de restrição. Em geral, os aminoácidos codificados por estas sequências ligadoras não são prejudi- ciais para a imunogenicidade da proteína de fusão resultante, e podem 15 mesmo ser benéficos para a imunogenicidade. Alternativamente, uma prote- Ína de fusão da invenção pode ser produzida como uma cadeia de epltopo, por expressão das sequências de polinucleotÍdeos que estão ligadas sem nucleotídeos intervenientes. A ausência de sequência ligadora interveniente evita a presença de material de ácido nucleico e/ou aminoácido desnecessá- 20 rio. Alternativamente, uma proteína de fusão da invenção pode ser preparada conjugando-se quimicamente os polipeptídeos antigênicos mico- bacterianos da invenção. A tltulo de exemplo, o primeiro e/ou o segundo po- lipeptídeos micobacterianos e/ou os polipeptídeos micobacterianos adicio- 25 nais da invenção podem ser acoplados um ao outro usando técnicas de con- jugação química convencionais. Em uma modalidade, pelo menos dois dos antígenos micobacte- rianos na composição antigênica compreendem (ou consistem em) uma se- quência de poIinucleotÍdeos, e as ditas pelo menos duas sequências de poli- 30 nucleotídeos são unidas conjuntamente para formar uma sequência de áci- dos nucleicos policistrônica. A título de exemplo, em uma modalidade, o primeiro antígeno micobacteriano e o segundo antígeno micobacteriano, cada um, compreen- dem (ou consistem em) uma sequência de polinucleotídeos, como definido acima, e as ditas primeira e segunda sequências de polinucleotídeos são unidas conjuntamente para formar uma sequência de ácidos nucleicos poli- 5 cistrônica. Em uma modalidade, a dita sequência de ácidos nucleicos poli- cistrônica compreende ou consiste em (em qualquer ordem a partir da ex- tremidade de 5' até a de 3'): (i) um primeiro polinucleotídeo micobacteriano, em que o dito . 10 primeiro polinucleotídeo micobacteriano compreende (ou consiste em) uma sequência de poIinucleotídeos codificando um primeiro poIipeptídeo antigê- nico micobacteriano, em que o dito primeiro polipeptídeo antigênico mico- bacteriano compreende (ou consiste em) uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70°6 de identidade da sequência de aminoácidos com a 15 sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; e (ii) um segundo poHnucleotídeo micobacteriano, em que o dito segundo polinucleotídeo micobaderiano compreende (ou consiste em) uma sequência de polinucleotídeos codificando um segundo polipeptídeo antigê- 20 nico micobacteriano, em que o dito segundo polipeptídeo antigênico mico- bacteriano compreende (ou consiste em) uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma.
25 Em uma modalidade, o dito primeiro poIinucleotÍdeo micobacte- riano compreende (ou consiste em) uma sequência de poHnucleotídeos ten- do pelo menos 70% de identidade da sequência de nucleotídeos com a se- quência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 2, ou um seu fragmento tendo pelo menos 21 nucleotldeos consecutivos da mesma. Em uma modalidade, 30 o dito segundo polinucleotídeo micobacteriano compreende (ou consiste em) uma sequência de polinucleotÍdeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de nucleotídeos com a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID
NO: 6, ou um seu fragmento tendo pelo menos 21 nucleotídeos consecutivos da mesma.
Em uma modalidade, a dita sequência de ácidos nucleicos poli- cistrônica compreende ou consiste em (em qualquer ordem a partir da ex- 5 tremidade de 5' até a de 3'): (i) um primeiro polinucleotídeo micobacteriano, em que o dito primeiro polinucleotÍdeo micobacteriano compreende (ou consiste em) uma sequência de polinucleotideos codificando um primeiro polipeptídeo antigê- nico micobacteriano, em que o dito primeiro polipeptideo antigênico mico-
. 10 bacteriano compreende (ou consiste em) uma sequência de polipeptÍdeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de aminoácidos com a
" sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; e (ii) um segundo polinucleotídeo micobacteriano, em que o dito 15 segundo polinucleotídeo micobacteriano compreende (ou consiste em) uma " sequência de polinucleotideos coclificando um segundo polipeptídeo antigê- nico micobacteriano, em que o dito segundo polipeptídeo antigênico mico- bacteriano compreende (ou consiste em) uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70°6 de identidade da sequência de aminoácidos com a 20 sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma.
Em uma modaiidade, o dito primeiro polinucleotÍdeo micobacte- riano compreende (ou consiste em) uma sequência de polinucleotídeos ten- do pelo menos 70°6 de identidade da sequência de nucleotídeos com a se- 25 quência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 8, ou um seu fragmento tendo pelo menos 21 nucleotídeos consecutivos da mesma.
Em uma modalidade, o dito segundo polinucleotídeo micobacteriano compreende (ou consiste em) uma sequência de poHnucleotldeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de nucleotldeos com a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID 30 NO: 6, ou um seu fragmento tendo pelo menos 21 nucleotídeos consecutivos da mesma.
Em uma modalidade, a dita sequência policistrônica adicional-
mente compreende pelo menos uma sequência de polinucleotídeos antigê- nica micobacteriana adicional, unida às d itas primeira e segunda sequências de polinucleotídeos.
Alternativamente, em uma modalidade, a composição antigênica
5 compreende pelo menos um antígeno micobacteriano adicional, e o primeiro antígeno micobacteriano e pelo menos um antlgeno micobacteriano adicio- nal, cada um, compreendem (ou consistem em) uma sequência de polinu- cleotÍdeos, como definido acima, e as ditas sequências de polinucleotÍdeos são unidas conjuntamente para formar uma sequência de ácidos nucleicos
. 10 policistrônica.
Alternativamente, em uma modalidade, a composição antigênica
" compreende pelo menos um antígeno micobacteriano adicional, e o segundo antlgeno micobacteriano e pelo menos um antígeno micobacteriano adicio- nal, cada um, compreendem (ou consistem em) uma sequência de polinu- 15 cleotídeos, como definido acima, e as ditas sequências de polinucleotídeos são unidas conjuntamente para formar uma sequência de ácidos nucleicos policistrônica.
Alternativamente, em uma modalidade, a composição antigênica compreende pelo menos dois antígenos micobacterianos adicionais, e os 20 ditos pelo menos dois antígenos micobacterianos adicionais, cada um, com- preendem (ou consistem em) uma sequência de polinucleotídeos, como de- finido acima, e as ditas sequências de polinucleoüdeos são unidas conjun- tamente para formar uma sequência de ácidos nucleicos policistrônica.
Em uma modalidade, a sequência poIicistrônica não compreen- 25 de tanto um antígeno RV1806 quanto um antígeno Rv1807. Em uma modali- dade, a sequência poIicistrônica não consiste em um antígeno Rv1806 e um antígeno Rv1807. Desse modo, em uma modalidade, a sequência policistrônica não compreende tanto a SEQ ID NO: 3 (ou uma 'variante' ou 'fragmento' da
30 sequência da mesma, conforme definido neste documento) quanto a SEQ ID NO: 56 (ou uma 'variante' ou 'fragmento' da sequência da mesma, conforme definido neste documento). Em uma modalidade, a composição antigênica não consiste tanto na SEQ ID NO: 3 (ou uma 'variante' ou 'fragmento' da se- quência da mesma, conforme definido neste documento) quanto na SEQ ID NO: 56 (ou uma 'variante' ou 'fragmento' da sequência da mesma, conforme definido neste documento). 5 Em uma modalidade, se a composição antigênica compreender um antígeno RvO111 e um antígeno Rv1098 (por exemplo, na forma de uma sequência policistrônica. compreendendo ou consistindo em um polinucleotk deo RVO111 e um polinucleotídeo RvO198), a composição antigênica (ou a sequência policistrônica) não compreende também um antígeno RV3821.
. 10 Desse modo, em uma modalidade, se a composição antigênica compreen- der uma sequência policistrônica compreendendo ou consistindo em SEQ ID " NO: 2 (ou uma 'variante' ou 'fragmento' da sequência da mesma, conforme definido neste documento) e SEQ ID NO: 6 (ou uma 'variante' ou 'fragmento' da sequência da mesma, conforme definido neste documento), a composi- 15 ção antigênica também não compreende a SEQ ID NO: 8 (ou uma 'variante' ou 'fragmento' da sequência da mesma, conforme definido neste documen- to). Em uma modalidade, a sequência policistrônica não compreen- de ou consiste em um antígeno RvO111, um antígeno RvO198 e um antígeno 20 Rv3812. Desse modo, em uma modaiidade, a sequência policistrônica não compreende ou consiste na SEQ ID NO: 2 (ou uma 'variante' ou 'fragmento' da sequência da mesma, conforme definido neste documento) e na SEQ ID NO: 6 (ou uma 'variante' ou 'fragmento' cla seqLIência da mesma, conforme definido neste documento) e na SEQ ID NO: 8 (ou uma 'variante' ou 'frag- 25 mento' da sequência da mesma, conforme definido neste documento). A ordem das sequências de po|jnuc|eotÍdeos na sequência poli- cistrônica de 5' até 3' não é importante. As práticas para preparar as sequências de ácidos nucleicos po- Iicistrônicas são conhecidas na técnica e tipicamente envolvem a preparação 30 de uma molécula recombinante compreendendo as sequências de poIinu- cleotídeos individuais no mesmo quadro de leitura. Em uma modalidade, a sequência de ácidos nucleicos policistrô-
nica da invenção está posicionada a jusante de um promotor, em quadro, em um vetor (por exemplo, um vetor de expressão ou vetor viral, conforme dis- cutido abaixo), com isso permitindo a transcrição através das sequências de polinucleotídeos e a tradução ótima como um produto de 'proteina de fusão'.
5 Consequentemente, em uma modalidade, a sequência de ácidos nucleicos policistrônica codifica uma proteína de fusão, como discutido aci- ma. Alternativamente, em uma modalidade, a sequência de ácidos nucleicos policistrônica codifica sequências de polipeptídeos antigênicas micobacteria- nas separadas, conforme discutido acima.
. 10 Em uma modalidade, a sequência de ácidos nucleicos poIicistrô- nica está operavelmente ligada a uma sequência de ácidos nucleicos que codifica um polipeptídeo marca, de modo tal que a marca codificada seja covalentemente ligada ao(s) polipeptídeo(s) antigênico(s) codificado(s) com a tradução. 15 A marca pode facilitar a detecção da expressão do polipeptídeo antigênico, ou a detecção de clones que expressam o antígeno, e/ou pode resultar em aumentos na eficácia do antígeno. Os polipeptídeos marcas a- dequados incluem uma marca de PK, uma marca de FLAG, uma marca de MYC, uma marca de poli-histidina ou qualquer marca detectável (por exem- 20 plo, uma marca que possa ser detectada por um anticorpo, tal como um an- ticorpo monoclonal). Os outros exemplos de marcas estarão claros para as pessoas versadas na técnica. Uma marca de PK pode ter a sequência Pro-, Asn-Pro-Leu-Gly-Leu-Asp (SEQ ID NO: 33). A sequência de ácidos nucleicos que codifica o polipeptídeo 25 marca pode estar posicionada de modo tal que, após a tradução, a marca esteja Iocalizada na extremidade de C do polipeptídeo antigênico expresso (isto é, na ordem: polipeptídeo antigênico-marca). Alternativamente, a se- quência de ácidos nucleicos que codifica o poIipeptÍdeo marca pode estar posicionada de modo tal que, após a tradução, a marca esteja localizada na 30 extremidade de N do polipeptídeo antigênico expresso (isto é, na ordem: marca-polipeptídeo antigênico). Alternativamente, a sequência de ácidos nucleicos que codifica o polipeptídeo marca pode estar posicionada de modo tal que, após a tradução, a marca esteja localizada internamente no polipep- tídeo antigênico expresso, ou entre os polipeptídeos antigênicos expressos de uma proteína de fusão codificada.
Os nucleotídeos que codificam uma sequência ligadora podem
5 ser inseridos entre a sequência de ácidos nucleicos poIicistrônica que codifi- ca O(S) poiipeptídeo(s) antigênico(s) e a sequência de ácidos nucleicos que codifica o polipeptídeo marca.
Em uma modalidade, a sequência ligadora codifica a sequência de aminoácidos Gly-Ser-lle.
Em uma modalidade, a sequência ligadora codificada está Ioca-
. 10 lizada entre um polipeptídeo antigênico expresso e um polipeptídeo marca (isto é, na ordem: polipeptídeo antigênico-ligadora-marca, ou , marca- ligadora-polipeptideo antigênico). Em uma modalidade, a sequência de áci- dos nucleicos que codifica o polipeptídeo marca e os nucleotldeos que codi-
ficam a sequência ligadora estão posicionados de modo tal que, após a tra-
15 dução, a sequência ligadora (por exemplo, Gly-Ser-lle) esteja localizada na extremidade de C do poIipeptídeo antigênico expresso e a marca esteja Io- calizada na extremidade de C da sequência ligadora expressa (isto é, na ordem poIipeptídeo antigênico-ligadora-marca). As sequências 'ligadoras' interven ientes (por exemplo, codifican-
20 do Gly-Ser-lle) podem alternativamente (ou adicionalmente) estar localiza- das entre as sequências de polinucleotÍdeos micobacterianas da sequência ' policistrônica, originando-se da inclusão de sÍtios de restrição (por exemplo, na forma: polinucleotídeo micobacteriano-ligadora-polinucleotÍdeo micobac-
teriano). Entretanto, para evitar a presença de material de ácido nucleico
25 e/ou aminoácido desnecessário, as sequências de polinucleotldeos podem ser ligadas sem os nucleotldeos intervenientes.
Em uma modalidade, a sequência de ácidos nucleicos policistrô-
nica está operavelmente ligada a uma sequência líder.
Por exemplo, a se- quência líder pode estar fundida à extremidade de N da sequência policis-
30 trônica (isto é, na forma: líder-sequência policistrônica) ou à extremidade de C da sequência policistrônica (isto é, na forma: sequência policistrônica-
Kder).
Uma sequência Iíder pode afetar o processamento de um trans- crito de DNA primário no mRNA, e/ou pode afetar a estabilidade ou a efici- ência de tradução do mRNA.
Em uma modalidade, uma sequência líder as- segura que o antígeno de polipeptídeo codificado seja dirigido para o apare-
5 Iho secretório de uma célula hospedeira.
Em uma modalidade, uma sequên- cia líder aumenta a expressão e/ou a imunogenicidade do antígeno.
A ex- pressão aumentada pode ser determinada por um ensaio convencional, tal como utilizando um anticorpo (por exemplo, anticorpo monoclonal) para de- tectar a quantidade de proteína produzida.
A imunogenicidade aumentada
. 10 pode ser determinada usando um ensaio convencional, tal como um ensaio ELISPOT cultivado ou ex vivo.
Em uma modalidade, a presença de uma se-
" quência líder aumenta a expressão e/ou a imunogenícidade do polipeptídeo antigênico micobacteriano em 2 vezes, 3 vezes ou mais, quando comparado com o polipeptídeo antigênico expresso sem a sequência Iíder. 15 Um exemplo de uma sequência Iíder adequada é o t-PA (ativa- dor de pIasminogênio de tecido). Desse modo, em uma modalidade, a sequência de ácidos nucle- icos policistrônica cjue codifica os ditos polipeptídeos antigênicos micobacte- rianos está operavelmente ligada a uma sequência líder e uma sequência
20 marca.
Por exemplo, a sequência líder pode ser fundida à extremidade cle N da sequência policistrônica, e a sequência marca pode ser fundida à extre- midade de C da sequência poIicistrônica (isto é, na forma: líder-sequência policistrônica-marca). Em uma modalidade, uma sequência líder (por exem- plo, Gly-Ser-lle) está localizada entre a sequência policistrônica e a sequên-
25 cia de ácidos nucleicos codificando a marca (isto é, na forma líder-sequência poIicistrônica-ligadora-marca). Em uma modalidade, a sequência líder é uma sequência líder t- PA e/ou a sequência marca é uma sequência marca de PK (isto é, na forma: Iíder t-PA-sequência policistrônica-marca de PK). Em uma modalidade, uma 30 sequência líder (por exemplo, Gly-Ser-lle) está localizada entre a sequência policistrônica e a sequência de ácidos nucleicos codificando a marca (isto é, na forma líder t-PA-sequência policistrônica-ligadora-marca de PK).
Em uma modalidade, as sequências líderes intervenientes estão jocalizadas entre uma ou mais das sequências de polinucleotídeos micobac- terianas da sequência policistrônica (isto é, na forma: polinucleotídeo mico- bacteriano-lÍder-polinucleotÍdeo micobacteriano). 5 Em uma modalidade, a sequência de ácidos nucleicos policistrô- nica codificando os polipeptídeos antigênicos micobacterianos está opera- velmente ligada a uma sequência líder N terminal, uma sequência Ííder in- tema e uma sequência marca (isto é, na forma: líder-primeiro polinucleotídeo micobacterianojíder-segundo polinucleotÍdeo micobacteriano-marca). Em
. 10 uma modalidade, uma sequência líder (por exemplo, Gly-Ser-lle) está Iocali- zada entre a sequência policistrônica e a sequência de ácidos nucleicos co-
" d ificando a marca (isto é, na forma: líder - primeiro polinucleotÍdeo micobac- teriano - líder - segundo polinucleotídeo micobacteriano - ligadora - marca). Em uma modalidade, a sequência líder é uma sequência líder t- 15 PA e/ou a sequência marca é uma sequência marca de PK (isto é, na forma: líder t-PA-primeiro polinucleotideo micobacteriano-lider t-PA-segundo poli- nucleotÍdeo micobacteriano-marca de PK). Em uma modalidade, uma sequência líder (por exemplo, Gly- Ser-lle) está Iocalizada entre a sequência policistrônica e a sequência de
20 ácidos nucleicos codificando a marca (isto é, na forma líder t-PA - primeiro polinucleoüdeo micobacteriano - líder t-PA - segundo po|jnuc|eotÍdeo mico- bacteriano - ligadora - marca de PK). Em uma modalidade, a sequência de ácidos nucleicos policistrô- nica adicionalmente compreende um sinal de poIiadenilação, tal como um 25 sinal de poliadenilação do hormônio do crescimento bovino (BGH). Em uma modalidade, a composição antigênica compreende uma ou mais células, em que as ditas células compreendem pelo menos um dos antígenos micobacterianos.
Em uma modalidade, as ditas uma ou mais células compreen-
30 dem um primeiro antígeno micobacteriano, como definido acima.
Em uma modalidade, o dito primeiro antígeno micobacteriano compreende uma se- quência de polipeptídeos, como definida acima, tal como uma secjuência de polipeptídeos RvO111 ou RV3812, como definida acima.
Em uma modalida- de, o dito primeiro antígeno micobacteriano compreende uma sequência de polinucleotídeos, como definida acima, tal como uma sequência de poHnu- cleotídeos RvO111 ou Rv3812, como definida acima. 5 Em uma modalidade, as ditas uma ou mais células compreen- dem um segundo antigeno micobacteriano, como definido acima.
Em uma modalidade, o dito segundo antígeno micobacteriano compreende uma se- quência de poIipeptídeos, como definida acima, tal como uma sequência de polipeptídeos RvO198, como definida acima.
Em uma modalidade, o dito se-
. 10 gundo antígeno micobacteriano compreende uma sequência de polinucleotí- deos, como definida acima, tal como uma sequência de polinucleotídeos
" RvO198, como definida acima.
Em uma modalidade, as ditas uma ou mais células compreen- dem um ou mais dos ditos antígenos micobacterianos adicionais, como defi-
15 nidos acima.
Em uma modalidade, os um ou mais dos ditos antígenos mico- bacterianos adicionais compreendem uma sequência de polipeptídeos, como definida acima.
Em uma moclalidade, os um ou mais dos ditos antígenos mi- cobacterianos adicionais compreendem uma sequência de poIinucleotídeos, como definida acima. 20 Em uma modalidade, as limitações discutidas acima em relação a uma composição antigênica compreendendo o primeiro e o segundo antí- genos micobacterianos se aplicam igualmente a uma composição antigênica compreendendo uma ou mais células, em que as ditas células compreen- dem pelo menos um dos antígenos micobacterianos. 25 Em uma modalidade, o dito pelo menos um antígeno micobacte- riano (por exemplo, polipeptídeo) está pelo menos parcialmente exposto na superfíciè da(s) célula(s). Em uma modalidade alternativa, a célula torna-se degradada in vivo de modo que pelo menos parte do antígeno micobacteriano (por exem-
30 plo, polipeptideo) torne-se exposto ao sistema imune de um hospedeiro.
Em uma modalidade alternativa, a célula pelo menos parciaimente Iibera (por exemplo, secreta ou exporta) o antígeno micobacteriano (por exemplo, poli-
peptídeo) para o lado de fora da célula, de modo que ele esteja exposto ao sistema imune de um hospedeiro.
Em uma modalidade, a dita composição antigênica compreende uma céluta individual, em que a dita célula compreende pelo menos dois dos 5 ditos antígenos micobacterianos.
A título de exemplo, em uma modalidade, a dita composição an- tigênica compreende uma célula individual, em que a dita célula compreende tanto o dito primeiro antígeno micobacteriano quanto o dito segundo antíge- no micobacteriano.
Em uma modalidade, a dita célula individual compreende
- 10 um antígeno de polipeptídeo ou polinucleotídeo RvO111 ou um antígeno de polipeptideo ou polinucleotÍdeo Rv3812, como definido neste documento, e também compreende um antígeno de polipeptídeo ou polinucleotídeo RvO198, como definido neste documento.
Em uma modalidade, a dita célula individual adicionalmente compreende um ou mais dos ditos antígenos mi- 15 cobacterianos adicionais.
Em uma modalidade, a dita composição antigênica compreende uma célula individual, em que a dita célula compreende o dito primeiro antí- geno micobacteriano e os ditos um ou mais antígenos micobacterianos adi-
· cionais.
Em uma modalidade, a dita composição antigênica compreende 20 uma célula individual, em que a dita célula compreende o dito segundo antí- geno micobacteriano e os ditos um ou mais antígenos micobacterianos adi- cionais.
Em uma modalidade, a dita composição antigênica compreende uma célula individual, em que a dita célula compreende os ditos pelo menos dois dos ditos antígenos micobacterianos adicionais. 25 Em uma modalidade alternativa, a composição antigênica com- preende pelo menos uma primeira e uma segunda células, em queem que a dita primeira célula compreende o dito primeiro antígeno micobacteriano (como definido acima) e em que a dita segunda célula compreende o dito segundo antígeno mlcobacteriano (como definido acima). Nesta modalidade, 30 o primeiro e o segundo antígenos micobacterianos não estão presentes na mesma céluía; mais exatamente, o primeiro e o segundo antígenos micobac- terianos estão em células d iferentes.
Em uma modalidade, a dita composição antigênica adicional- mente compreende pelo menos uma terceira célula, em que a dita célula compreende um antígeno micobacteriano adicional, como definido acima.
Em uma modalidade, se a dita composição antigênica compre- 5 ender um antígeno de polipeptídeo ou polinucleotídeo RVO111, como defini- do neste documento, e um antígeno de poiipeptídeo ou polinucleotídeo RVO198, como definido neste documento (por exemplo, em células iguais ou diferentes), a dita composição antigênica (ou a dita célula) também não compreende um antígeno de polipeptídeo ou polinucleotídeo Rv3812, como
. 10 definido neste documento.
Em uma modalidade, a dita pelo rnenos uma célula é um veículo
" microbiano atenuado.
Um veículo atenuado é uma célula (tal como uma cé- lula bacteriana) que é incapaz de causar um efeito patológico significativo em um paciente animal, tipicamente um paciente mamífero, tal como um 15 paciente humano, bovino, suíno ou equino.
Os exemplos adequados de veículos microbianos atenuados in- cIuem a salmonela atenuada, a M. tuberculosis atenuada, ou a M. bovis ate- nuada (por exemplo, a cepa de BCG). Em uma modalidade, a composição antigênica compreende um 20 ou mais vetores, em que os ditos vetores compreendem pelo menos um dos antígenos micobacterianos.
Em uma modalidade, os ditos um ou mais vetores compreendem um primeiro antígeno micobacteriano, como definido acima.
Em uma moda- lidade, o dito primeiro antígeno micobacteriano compreende uma sequência 25 de polipeptídeos, como definida acima, tal como um antígeno de polipeptí- deo RVO111 ou um antígeno de polipeptídeo RV3812, como definido neste documento.
Em uma modalidade, o dito primeiro antígeno micobacteriano compreende uma sequência de polinucleotídeos, como definida acima, tal como um antígeno de polinucleotÍdeo RvO111 ou antígeno de poiinucleoti- 30 deo Rv3812, como definido neste documento.
Em uma modalidade, os ditos um ou mais vetores compreendem um segundo antígeno micobacteriano, como definido acima.
Em uma moda-
lidade, o dito segundo antígeno micobacteriano compreende uma sequência de polipeptídeos, como definida acima, tal como um antígeno de poIipeptí- deo RvO198, como definido neste documento.
Em uma modalidade, o dito segundo antígeno micobacteriano compreende uma sequência de polinucle-
5 otídeos, como definida acima, tal como um antígeno de polinucleotÍdeo RVO198, como definido neste documento.
Em uma modalidade, o dito vetor compreende o dito primeiro an- tígeno micobacteriano e o dito segundo antígeno micobacteriano.
A título de exemplo, o dito vetor pode compreender um primeiro polinucleotídeo mico-
- 10 bacteriano, como definido neste documento, e um segundo poIinucleotídeo micobacteriano, como definido neste documento. - Em uma modalidade, o dito vetor compreende: (i) um primeiro poHnucleotídeo micobacteriano, em que o dito primeiro polinucleotÍdeo micobacteriano compreende (ou consiste em) uma
15 sequência de polinucleotideos codificando um primeiro polipeptídeo antigê- nico micobacteriano, em que o dito primeiro polipeptídeo antigênico mico- bacteriano compreende (ou consiste em) uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70°6 de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, ou um seu fragmento tendo
20 pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; e (ii) um segundo polinucleotídeo micobacteriano, em que o dito segundo polinucleotídeo micobacteriano compreende (ou consiste em) uma sequência de polinucleotÍdeos codificando um segundo poIipeptídeo antigê- nico micobacteriano, em que o dito segundo polipeptídeo antigênico mico-
25 bacteriano compreende (ou consiste em) uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma.
Em uma modalidade, o dito primeiro poHnucleotídeo micobacte-
30 riano compreende (ou consiste em) uma sequência de polinucleotídeos ten- do pelo menos 70% de identidade da sequência de nucleotídeos com a se- quência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 2, ou um seu fragmento tendo pelo menos 21 nucleotídeos consecutivos da mesma.
Em uma modalidade, o dito segundo polinucleotídeo micobacteriano compreende (ou consiste em) uma sequência de polinucleotídeos tendo pelo menos 7Õ°/o de identidade da sequência de nucleotldeos com a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID
5 NO: 6, ou um seu fragmento tendo pelo menos 21 nucleotídeos consecutivos da mesma.
Em uma modalidade, o dito vetor compreende ou consiste em: (i) um primeiro polinucleotídeo micobacteriano, em que o dito primeiro polinucleotÍdeo micobacteriano compreende (ou consiste em) uma
- 10 sequência de polinucleotídeos codificando um primeiro polipeptídeo antigê- nico micobacteriano, em que o dito primeiro polipeptídeo antigênico mico- bacteriano compreende (ou consiste em) uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, ou um seu fragmento tendo 15 pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; e (ii) um segundo polinucleotídeo micobacteriano, em queem que o dito segundo polinucleotídeo micobacteriano compreende (ou consiste em) uma sequência de polinucleotídeos codificando um segundo polipeptí- deo antigênico micobacteriano, em que o dito segundo polipeptídeo antigê- 20 nico micobacteriano compreende (ou consiste em) uma sequência de poli- peptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de aminoáci- dos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, ou um seu fragmen- to tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma.
Em uma modalidade, o dito primeiro polinucleotídeo micobacte- 25 riano compreende (ou consiste em) uma sequência de polinucleotídeos ten- do pelo menos 70°6 de identidade da sequência de nucleotideos com a se- quência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 8, ou um seu fragmento tendo pelo menos 21 nucleotídeos consecutivos da mesma.
Em uma modalidade, o dito segundo polinucjeotídeo micobacteriano compreende (ou consiste em)
30 uma sequência de polinucleotÍdeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de nucleotldeos com a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 6, ou um seu fragmento tendo pelo menos 21 nucleotídeos consecutivos da mesma.
Em uma modalidade, os ditos um ou mais vetores compreendem um ou mais dos ditos antígenos micobacterianos adicionais, como definidos acima.
Em uma modalidade, um ou mais dos ditos antígenos micobacteria- 5 nos adicionais compreendem uma sequência de poIipeptídeos, como defini- da acima.
Em uma modalidade, um ou mais dos ditos antígenos micobacte- rianos adicionais compreendem uma sequência de polinucleotÍdeos, como definida acima.
Em uma modalidade, se a dita composição antigênica compre-
. 10 ender um antígeno de polipeptídeo ou polinuc1eotídeo RvO111, como defini- do neste documento, e um antígeno de poIipeptídeo ou polinucleotÍdeo RVO198, como definido neste documento (por exemplo, em vetores iguais ou diferentes), a dita composição antigênica (ou o dito vetor) também não com- preende um antígeno de polipeptídeo ou polinucleotídeo RV3812, como defi- 15 nido neste documento.
Em uma modalidade, as limitações discutidas acima em relação a uma composição antigênica compreendendo o primeiro e o segundo anti- genos micobacterianos se aplicam igualmente a uma composição antigênica compreendendo um ou mais vetores, em que os ditos vetores compreendem 20 pelo menos um dos antígenos micobacterianos.
Os exemplos de vetores incluem os vetores de DNA e os vetores de RNA.
O termo 'vetor' inclui os vetores de expressão (os quais podem ser úteis para a preparação dos antígenos micobacterianos da invenção), e os vetores virais (os quais podem ser úteis para a replicação e/ou a liberação 25 dos antígenos micobacterianos da invenção). Os vetores opcionalmente incluem sequências de controle apro- priadas, tais como um promotor e/ou terminador.
As sequências de controle da expressão para tais vetores são conhecidas para aqueles versados na técnica e podem ser selecionadas dependendo das células hospedeiras. 30 Uma discussão adicional dos componentes de vetores convencionais'é pro- porcionada posteriormente no relatório descritivo.
Em uma modalidade, o vetor compreende uma ou mais sequên-
cias de poKnucleotídeos codificando O(s) dito(s) antígeno(s) micobacteria- no(s). A dita sequência de polinucleotídeos pode ser operavelmente ligada a uma sequência de ácidos nucleicos codificando um polipeptídeo marca, de modo tal que a marca codificada seja covalentemente Iigada ao antígeno, 5 com a tradução.
A marca pode facilitar a detecção da expressão do antíge- no, ou de clones que expressam o antígeno, e/ou pode resultar em aumen- tos na eficácia do antígeno.
Os polipeptídeos marcas adequados incluem uma marca de PK, uma marca de FLAG, uma marca de MYC, uma marca de poli-histidina ou
. 10 qualquer marca detectável (por exemplo, uma marca que possa ser detecta- da por um anticorpo, tal como um anticorpo monoclonal). Os outros exem- " plos de marcas estarão claros para as pessoas versadas na técnica.
Uma marca de PK pode ter a sequência Pro-Asn-Pro-Leu-Gly-Leu-Asp (SEQ ID NO: 33). 15 A sequência de ácidos nucleicos que codifica o poIipeptídeo marca pode estar posicionada de modo tal que, após a tradução, a marca esteja iocalizada na extremidade de C do antígeno expresso.
Alternativa- mente, a sequência de ácidos nucleicos que codifica o polipeptídeo marca pode estar posicionada de modo tal que, após a tradução, a marca esteja 20 Iocalizada na extremidade de N do antígeno expresso.
Alternativamente, a sequência de ácidos nucleicos que codifica o polipeptldeo marca pode estar posicionada de modo tal que, após a tradução, a marca esteja localizada internamente no antigeno expresso.
Os nucleotídeos que codificam uma sequência ligadora podem 25 ser inseridos entre o polinucleotÍdeo que codifica o antígeno expresso e a sequência de ácidos nucleicos que codifica o pdipeptldeo marca.
Em uma modalidade, a sequência ligadora codificada está Iocalizada entre um poli- pepb'deo antígeno expresso e um polipeptideo marca.
Em uma modalidade, a sequência ligadora codifica a sequência de aminoácidos Gly-Ser-lle. 30 Em uma modalidade, a sequência de ácidos nucleicos que codi- fica o polipeptídeo marca e os nucleotídeos que codificam a sequência Iiga- dora estão posicionados de modo tal que, após a tradução, a sequência li-
gadora (por exemplo, Gly-Ser-lle) esteja localizada na extremidade de C do antígeno expresso e a marca esteja localizada na extremidade de C da se- quência ligadora expressa. Em uma modalidade, o vetor compreende uma ou mais sequên- 5 cias de poIinucleotídeos codificando o(s) polipeptídeo(s) antigênico(s) mico- bacteriano(s), em que a dita sequência de polinucleotídeos está operavel- mente ligada a uma sequência llder. Uma sequência líder pode afetar o pro- cessamento do transcrito primário no mRNA, e/ou pode afetar a estabiiidade ou a eficiência de tradução do mRNA. Em uma modalidade, uma sequência . 10 Iíder assegura que o antígeno de polipeptídeo codificado seja dirigido para o aparelho secretório de uma célula hospedeira. Em uma modalidade, uma sequência líder aumenta a expressão e/ou a imunogenicidade do antígeno.
W A imunogenicidade aumentada pode ser determinada usando um ensaio convencional, tal como um ensaio ELISPOT cultivado ou ex vivo. A expres- 15 são aumentada pode ser determinada por um ensaio convencional, tal como utilizando um anticorpo (por exemplo, anticorpo monoclonal) para detectar a quantidade de proteína produzida. Em uma modalidade, a presença de uma sequência líder aumenta a expressão e/ou a imunogenicidade do antígeno micobacteriano em 2 vezes, 3 vezes ou mais, quando comparado com o an- 20 tígeno expresso sem a sequência líder. Um exemplo de uma sequência líder adequada é o t-PA (ativa- dor de plasminogênio de tecido). Em uma modalidade, o vetor compreende um polinucleotÍdeo truncado de modo C terminal que codifica o dito antígeno micobacteriano 25 fundido a uma sequência líder t-PA. Em uma modalidade, o vetor compreen- de um poHnucleotídeo truncado de modo C terminal que codifica o dito antí- geno micobacteriano fundido a uma sequência líder t-PA e uma sequência marca de PK. Por exemplo, a sequência líder pode ser fundida à extremida- de de N do polinucleotídeo que codifica o antigeno e a sequência marca po- 30 de ser fundida à extremidade de C do poIinucleotídeo que codifica o antíge- no. Em uma modalidade, uma sequência ligadora (por exemplo, Gly-Ser-lle) está localizada entre o polinucieotídeo que codifica o antígeno e a sequência de ácidos nucleicos que codifica a marca. Em uma modalidade, a dita composição antigênica compreende um vetor individual, em que do dito vetor compreende tanto o dito primeiro antígeno micobacteriano quanto o dito segundo antígeno micobacteriano. 5 Em uma modalidade, o dito vetor ind ividual adicionalmente compreende um ou mais dos ditos antígenos micobacterianos adicionais. Em uma modalidade, a dita composição antigênica compreende um vetor individual, em que o dito vetor compreende o dito primeiro antígeno micobacteriano e os ditos um ou mais antígenos micobacterianos adicionais.
W 10 Em uma modalidade, a dita composição antigênica compreende um vetor individual, em que o dito vetor compreende o dito segundo antígeno mico- - bacteriano e os dito um ou mais antígenos micobacterianos adicionais. Em uma modalidade, a dita composição antigênica compreende um vetor indivi- dual, em que a dita célula compreende os ditos um ou mais antígenos mico- 15 bacterianos adicionais. Em uma modalidade alternativa, a composição antigênica com- preende pelo menos um primeiro e um segundo vetores, em que o dito pri- meiro vetor compreende o dito primeiro antígeno micobacteriano (como defi- nido acima) e em que o dito segundo vetor compreende o dito segundo antí- 20 geno micobacteriano (como definido acima). Nesta modalidade, o primeiro e o segundo antígenos micobacterianos não estão presentes no mesmo vetor; mais exatamente, o primeiro e o segundo antígenos micobacterianos estão em vetores diferentes. Em uma modalidade, a dita composição antigênica adicional- 25 mente compreende pelo menos um terceiro vetor, em que o dito terceiro ve- tor compreende um (um ou mais) antígeno(s) micobacteriano(s) adicional(is), como definido acima. Em uma modalidade, o vetor (ou pelo menos um dos ditos veto- res) é um vetor viral. 30 Os vetores virais são normalmente vetores que não se replicam ou de replicação diminuída, o que significa que o vetor viral não pode repli- car-se em qualquer proporção significativa nas células normais (por exem-
plo, as células humanas normais), como medido por meios convencionais - por exemplo, por meio da medição da sÍntese de DNA e/ou do título viral. Os vetores que não se replicam ou de replicação diminuída podem ter se torna- do assim naturalmente (isto é, eles foram isolados como tais da natureza) ou 5 artificialmente (por exemplo, por melhoramento genético in vitro ou por ma- nipulação genética). Haverá geralmente pelo menos um tipo de célula na qual o vetor viral de replicação diminuída pode ser desenvolvido - por exem- pIo, a vacínia Ancara modificada (MVA) pode ser desenvolvida em células CEF.
. 10 Tipicamente, o vetor viral é Íncapaz de causar uma infecção sig- nificativa em um paciente animal, tipicamente um paciente mamífero, tal co- mo um paciente humano, bovino, suíno ou equino. Os exemplos de vetores virais que são úteis neste contexto in- cluem os vetores de vÍrus da vacínia atenuado, tais como a vacínia Ancara 15 modificada (MVA) e NYVAC, ou as cepas derivadas do mesmos. Os outros vetores virais adequados incluem os vetores de poxví- rus, tais como os vetores de avipox, por exemplo, os vetores de epitelioma contagioso atenuado (por exemplo, FP9) ou os vetores de canarypox (por exemplo, ALVAC e as cepas derivadas do mesmo). Os vetores virais alter- 20 nativos, úteis na presente invenção, incluem os vetores de adenovírus (por exemplo, os vetores de adenovírus não humanos), os vetores de alfavírus, os vetores de flavivírus, os vetores virais do herpes, os vetores do vÍrus da influenza e os vetores retrovirais. Em uma modalidade, o vetor (ou pelo menos um dos ditos veto- 25 res) é um vetor de expressão. Os vetores de expressão são moléculas de ácidos nucleicos (li- neares ou circulares) que compreendem uma ou mais sequências de polinu- cleotídeos codificando (um) polipeptídeo(s) de interesse, operavelmente li- gadas a elementos reguladores adicionais requeridos para a sua expressão. 30 Com relação a isto, os vetores de expressão geralmente incluem sequências promotoras e terminadoras, e opcionalmente uma ou mais se- quências reforçadoras, sinais de poliadenilação, e similares. Os vetores de expressão podem também incluir elementos reguladores traducionais ade- quados, incluindo sÍtios de ligação ribossômicos, e sequências de iniciação e terminação da tradução. Os elementos reguladores transcricionais e tradu- cionais empregados nos vetores de expressão da invenção são funcionais 5 na célula hospedeira usada para a expressão, e podem incluir aqueles natu- ralmente associados com os genes micobacterianos. A seleção de promotores, terminadores, marcadores selecioná- veis e outros elementos adequados é uma questão de projeto de rotina den- tro do nível de habilidade comum na técnica.
. 10 Os promotores, tais como os promotores de trp, lac e fago, os promotores de tRNA e os promotores de enzima glicohtica podem ser usa- dos em hospedeiros procarióticos. Os promotores de leveduras úteis incluem as regiões cle promotores para a metalotioneína, 3-fosfoglicerato cinase ou outras enzimas glicolíticas, tais como enolase ou gliceraldeÍdo-3-fosfato de- 15 sidrogenase, enzimas responsáveis pela utilização de maltose e galactose, e outras. Os promotores mamíferos não nativoS apropriados podem incluir os promotores iniciais e finais de SV40 ou os promotores derivados de vÍrus da leucemia de moloney de camundongo, vÍrus do tumor mamário de camun- dongo, vÍrus do sarcoma aviário, adenovírus ll, vÍrus do papiloma bovino ou 20 polioma. Em uma modalidade, o vetor de expressão compreende um promo- tor de CMV. Geralmente, "operavelmente ligadas" significa que as sequên- cias de ácidos nucleicos que estão sendo ligadas são contíguas e estão dis- postas de modo que elas funcionem em harmonia para os seus propósitos 25 pretendidos - por exemplo, a transcrição inicia-se no promotor e prossegue através do segmento de polinucleotídeo codificador até o terminador. Em que necessário unir duas regiões codificadoras da proteina, as sequências codificadores de poIinucleotÍdeos devem ser contíguas e estar.no quadro de leitura. 30 Em uma modalidade, a invenção proporciona uma célula hospe- deira compreendendo uma composição antigênica da invenção, como defi- nida acima. A célula hospedeira, desse modo, compreende o primeiro antí-
geno m icobacteriano e o segundo antígeno micobacteriano da invenção, em que os ditos antígenos micobacterianos podem compreender as sequências de polipeptídeos e/ou polinucleotídeos, como discutido acima.
Consequentemente, em uma modalidade, uma célufa hospedei- 5 ra compreende uma composição antigênica compreendendo um primeiro antígeno micobacteriano e um segundo antígeno micobacteriano; em queem que o dito primeiro antígeno micobacteriano compreende: (i) uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos
- 10 de um polipeptídeo regulado pela latência selecionado a' partir de SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7 e 56, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos u consecutivos do mesmo; ou (ii) uma sequência de polinucleotídeos codificando uma se- · quência de polipeptídeos de acordo com (j); ou uma sequência de polinucle- 15 otídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de nucleotídeos com a sequência de ácidos nucleicos de um polinucleotÍdeo regulado pela latência selecionado a partir de SEQ ID NOS: ?, 4, 6, 8 e 57, ou um seu fragmento tendo pelo menos 21 nucleotldeos consecutivos do mesmo; e em queem que o dito segundo antígeno micobacteriano é dife- 20 rente do dito primeiro antígeno micobacteriano.
Em uma modalidade, a dita célula hospedeira compreende: Em uma modalidade, a composição antigênica compreende: (i) um primeiro poIipeptídeo antigênico micobacteriano, em que o dito primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano compreendé uma 25 sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da se- quência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou 7, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; ou (ii) um primeiro polinucleotídeo micobacteriano, em que o dito 30 primeiro poHnucleotídeo micobacteriano compreende uma sequência de po- linucleotídeos codificando o dito primeiro polipeptídeo antigênico micobacte- riano;
e também compreende: (iii) um segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano, em que o dito segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 7Ô°/o de identidade da se- 5 quência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; ou (iv) um segundo polinucleotídeo micobacteriano, em que o dito segundo polinucleotídeo micobacteriano compreende uma sequência de po-
- 10 linucleotídeos codificando o dito segundo poIipeptídeo micobacteriano.
As composições antigênicas, os polinucleotídeos ou os polipep- " tídeos da presente invenção podem ser preparados por expressão das se- quências de polinucleotldeos da invenção em vetores ou outros veículos de expressão, em células hospedeiras procarióticas ou eucarióticas compatí- 15 veis, usando métodos padrões de biologia molecular (por exemplo, Sambro- ok e COI. 1989, Molecular CIoning a Laboratory Manual, Segunda Edição, Cold Spring Harbor Laboratory Press, CoId Spring Harbor, Nova York; incor- porado nete documento por referência). Os hospedeiros procarióticos mais comumente usados são as 20 cepas de E. coli, embora outros procariotos, tais como o B. subti/is ou o Pseudomonas, possam ser usados.
As células hospedeiras mamíferas ou outras células hospedeiras eucarióticas, tais como aquelas de levedura, fun- gos filamentosos, planta, insetos, espécies anfíbias ou aviárias, podem tam- bém ser úteis na presente invenção.
A propagação de células mamíferas em 25 cultura é per se bastante conhecida.
Os exemplos de linhagens de células hospedeiras mamíferas comumente usadas são as células VERO e HeLa, as células do ovário de hamster chinês (CHO), e as linhagens de células Wl38, BHK e COS, embora outras linhagens de células possam ser apropri- adas, por exemplo, para proporcionar maior expressão. 30 Conforme usadas neste documento, as "células hospedeiras re- combinantes", as "células hospedeiras", as "células", as "linhagens de célu- las", as "culturas de células", e outros tais termos que signifiquem micro-
organismos ou Iinhagens de células eucarióticas superiores cultivadas como entidades unicelulares referem-se às células que podem ser, ou tenham si- do, usadas como receptoras para o vetor recombinante ou outro DNA de transferência, e incluem a progênie da célula original, a qual tenha sido 5 transformada.
Entende-se que a progênie de uma única célula parental pode não necessariamente ser completamente idêntica na morfologia ou no com- plemento de DNA genômico ou total à origem original, devido à mutação na- , tural, acidental ou deliberada.
As sequências de polinucleotÍdeos de interesse podem ser
· 10 transcritas in vitro e o RNA resultante introduzido na célula hospedeira (por exemplo, através de injeção), ou as sequências de polinucleotÍdeos podem r ser introduzidas diretamente nas células hospedeiras por métodos que vari- am, dependendo do tipo de hospedeiro celular, incluindo a eletroporação; a transfecção empregando cloreto de cálcio, cloreto de rubíd io, fosfato de cál- 15 cio, DEAE-dextrana, ou outras substâncias; o bombardeio de microprojéteis; a lipofecção; a infecção (em que o vetor é um agente infeccioso, tal como um genoma retroviral). A "transformação" refere-se à inserção de um polinu- cleotídeo exógeno em uma célula hospedeira, independente do método usa- do para a inserção, por exemplo, captação direta, transdução, f-mating ou 20 eletroporação.
Os vetores podem replicar-se autonomamente, ou podem repli- car-se por serem inseridos no genoma de uma céluia hospedeira, em cujo caso eles incluem uma sequêncla de inserção.
Os vetores de expressão e clonagem podem conter um marca- 2" dor selecionável, um gene que codifica uma proteína necessária para a so- brevivência ou o crescimento de uma célula hospedeira transformada com o vetor.
Este gene garante o crescimento de somente as células hospedeiras que expressam os insertos.
Os genes de seleção convencionais codificam proteínas que (a) conferem resistência a antibióticos ou outras substâncias 30 tóxicas, por exemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato, etc.; (b) comple- mentam deficiências auxotróficas; ou (C) fornecem nutrientes críticos não disponíveis dos meios complexos, por exemplo, o gene codificando a D-
alanina racemase para bacilos.
A escolha do marcador selecionável apropri- ado dependerá da célula hospedeira.
A célula hospedeira transformada pode ser cultivada de acordo com métodos conhecidos, e o polipeptídeo expresso pode ser recuperado e 5 isolado (por exemplo, do meio de cultura) usando protocolos convencionais.
Em um aspecto, a presente invenção proporciona um método para produzir uma composição antigênica compreendendo (pelo menos) um primeiro antígeno micobacteriano e um segundo antígeno micobacteriano, como definidos acima; o dito método compreendendo:
- 10 (a) expressar as sequências de polinucleotídeos como defini- das acima que codificam os ditos pelo menos primeiro e segundo antígenos " micobacterianos; ou (b) cultivar uma célula hospedeira como descrita acima, pelo que a dita célula produz os ditos pelo menos primeiro e segundo antígenos 15 micobacterianos; e recuperar os antígenos expressos.
Em uma modalidade, as Iimitações discutidas acima em relação a uma composição antigênica compreendendo o primeiro e o segundo antl- genos micobacterianos se aplicam igualmente ao método acima mencionado 20 para produzir uma composição antigênica compreendendo pelo menos o primeiro e o segundo antígenos micobacterianos.
A invenção também se refere aos anticorpos que ligam um pri- meiro antígeno micobacteriano (por exemplo, polipeptídeo), como definido acima, e um segundo antígeno micobacteriano (por exemplo, polipeptídeo), 25 como definido acima.
Desse modo, em uma modalidade, a invenção proporciona uma composição imunogênica compreendendo um primeiro anticorpo e um se- gundo anticorpo, em que o dito primeiro anticorpo liga um primeiro antigeno micobacteriano e o dito segundo anticorpo liga um segundo antígeno mico- 30 bacteriano; em que o dito primeiro antigeno micobacteriano compreende: (i) uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70%
de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoáci- dos de um polipeptídeo regulado pela latência selecionado a partir de SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7 e 56, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoáci- dos consecutivos do mesmo; ou 5 (ii) uma sequência de polinucleotídeos codificando uma se- quência de polipeptídeos de acordo com (i); ou uma sequência de polinucle- otídeos tendo pelo menos 70°6 de identidade da sequência de nucleotídeos com a sequência de ácidos nucleicos de um polinucleotÍdeo regulado pela latência selecionado a partir de SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8 e 57, ou um seu
· 10 fragmento tendo pelo menos 21 nucleotídeos consecutivos do mesmo;
. e em que o dito segundo antígeno micobaderiano é diferente do " dito primeiro antígeno micobacteriano.
Em uma modalidade, o dito primeiro antígeno micobacteriano compreende ou consiste em um polipeptldeo antigênico da invenção, tal co- 15 mo um antígeno de polipeptídeo RvO111 ou um antígeno de polipeptídeo RV3812, como definido neste documento.
Em uma modalidade, o dito segundo antígeno micobacteriano compreende ou consiste em um polipeptldeo antigênico da invenção, tal co- mo um antlgeno de polipeptídeo RvO198, como definido neste documento. 20 Em uma modalidade, a composição imunogênica compreende um primeiro anticorpo e um segundo anticorpo, em que o dito primeiro anti- corpo liga um primeiro polipeptideo antigênico micobacteriano e o dito se- gundo anticorpo liga um segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano; em que o dito primeiro poIipeptídeo antigênico micobacteriano 25 compreende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de i- dentidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; e em que o dito segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano 30 compreende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 7Ô°/o de i- dentidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma.
Em uma modalidade, a composição imunogênica compreende um primeiro anticorpo e um segundo anticorpo, em que o dito primeiro anti- corpo liga um primeiro polipeptideo antigênico micobacteriano e o dito se-
5 gundo anticorpo liga um segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano; em que o dito primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de polipeptldeos tendo pelo menos 70°6 de i- dentidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos
· 10 consecutivos da mesma; e em que o dito segundo polipeptldeo antigênico micobacteriano
" compreende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70°6 de j- dentidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ÍD NO: 5, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos
15 consecutivos da mesma.
Opcionalmente, a dita composíção imunogênica adicionalmente compreende pelo menos um terceiro anticorpo (por exemplo, pelo menos uns 3, 4, 5, 6, 7, 8 anticorpos adicionais), em que o dito terceiro anticorpo liga um terceiro antígeno micobacteriano que é diferente do primeiro e do
20 segundo antígenos micobacterianos.
Em uma modalidade, se a composição imunogênica compreen- der (i) um anticorpo que iiga um antígeno RvO111 como definido neste do- cumento (por exemplo, compreendendo ou consistindo em uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de ami-
25 noácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma); e (ii) um anticorpo que liga um antígeno RvO198 como definido neste documento (por exemplo, compreendendo ou consistindo em uma sequência de polipep- tídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de aminoácidos
30 com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma); a composição não compreende um anticorpo que liga um antígeno Rv3812 como definido neste documento (por exemplo, compreendendo ou consistindo em uma se- quência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma).
5 Em uma modalidade, as limitações discutidas acima em relação a uma composição antigênica compreendendo pelo menos o primeiro e o segundo antígenos micobacterianos se aplicam igualmente aos antígenos micobacterianos aos quais os pelo menos primeiro e segundo anticorpos da composição antigênica acima descrita ligam.
- 10 O termo 'anticorpo' inclui qualquer poIipeptídeo que compreenda um fragmento de ligação ao antígeno ou um domínio de ligação ao antígeno.
" Os exemplos incluem, porém não estão limitados aos anticorpos policlonais, monoclonais, especificos, monoespecificos, poliespecíficos, não específicos, humanizados, humanos, de uma única cadeia, quiméricos, sintéticos, re- 15 combinantes, hlbridos, mutados, enxertados, e gerados in vitro. A não ser que seguido pela palavra "intacto", o termo "anticorpo" inclui os fragmentos, tais como Fab, F(ab')2, Fv, SCFV, Fd, dAb, e outros fragmentos de anticorpos que conservem a função de ligação ao antígeno. Em uma modalidade, o anticorpo pertence às famílias dos isóti- 20 pos lgG, lgM ou lgA. A referência ao isótipo lgA inclui a forma secretória deste anticorpo (isto é, slgA). O componente secretório (SC) de slgA pode ser adicionado in vitro ou in vivo. Neste caso, pode ser empregado o uso de mecanismo de marcação do SC natural de um paciente. Em uma modalidade, o anticorpo especificamente liga o antíge- 25 no micobacteriano em questão. Pretende-se que a "ligação específica" signi- fique a formação de um complexo entre duas ou mais moléculas que é rela- tivamente estável sob as condições fisioiógicas. A ligação específica é ca- racterizada por uma alta afinidade e uma capacidade baixa a moderada, como distinguida da ligação não específica que normalmente tem uma baixa 30 afinidade, com uma capacidade moderada a alta. Tipicamente, a ligação en- tre um anticorpo e um antígeno é considerada ser específica 'quando a cons- tante de associação KA for maior do que 106 M 1. Se necessário, a ligação não específica pode ser reduzida, sem afetar substancialmente a ligação específica, por variação das condições de ligação.
As condições de Iigação apropriadas, tais como a concentração de anticorpo, a resistência iôn ica da solução, a temperatura, o tempo permi-
5 tido para a ligação, a concentração de um agente de bloqueio (por exemplo, a soro albumina, a caseína do leite), etc., podem ser otimizadas por uma pessoa versada usando técnicas de rotina.
Em uma modalidade, os ditos primeiro e segundo anticorpos fo- ram criados contra o primeiro e o segundo antlgenos micobacterianos da
- 10 invenção, conforme descrito neste documento, respectivamente.
Em uma modalidade, os ditos primeiro e segundo anticorpos foram criados contra o " primeiro e o segundo polipeptídeos antigênicos micobacterianos da inven- ção, conforme descrito neste documento, respectivamente.
Em uma modalidade, a invenção proporciona antissoros isolados
15 de animais que foram imunizados com uma composição antigênica da in- venção.
Conforme usado neste documento, o termo 'antissoros' refere-se aos anticorpos no soro que possuem ligação detectável, por exemplo, por ELISA ou citometria de fluxo, por um antígeno particular, Os métodos de preparar os soros imunes são conhecidos na
20 técnica.
Por exemplo, o primeiro e o segundo anticorpos (e os anticorpos adicionais opcionais) cla invenção, ou a composição imunogênica da inven- ção, podem ser administrados a um animal (ta| como um mamífero - por e- xemplo, um cavalo ou um ser humano) até que uma resposta do anticorpo (por exemplo, resposta do anticorpo neutralizador) seja gerada ao primeiro e
25 ao segundo antígenos micobacterianos.
A metodologia geral para preparar anticorpos monoclonais por hibridomas envolve, por exemplo, a preparação de linhagens de células pro- dutoras de anticorpos imortais por fusão da célula, ou outras técnicas, tais como a transformação direta de linfócitos B com DNA oncogênico, ou pode
30 ser empregada a transfecção com o vÍrus de Epstein-Barr.
Os anticorpos criados contra os fragmentos antigênicos divulga- dos neste documento (por exemplo, os fragmentos de polipeptídeos) podem ter a propriedade de reconhecer o antlgeno de tamanho natural (por exem- plo, o poIipeptídeo de tamanho natural) a partir do qual eles são derivados. Com relação a isto, os fragmentos de polipeptídeos contêm determinantes antigênicos que são detectáveis por imunoensaios convencionais. Um ou 5 mais determinantes antigênicos são compartilhados pelos antígenos de ta- manho natural da invenção e seus fragmentos, desse modo, os anticorpos criados contra um fragmento antigênico podem também Iigar os antígenos de tamanho natural correspondentes da invenção. Em uma modalidade, os anticorpos são proporcionados em uma - 10 forma isolada. Os anticorpos podem ser marcados com uma marca detectável " ou funcional. Estas marcas incluem as radiomarcas (por exemplo, 1311 ou 99Tc), as marcas enzimáticas (por exemplo, a peroxidase da raiz forte ou a fosfatase alcalina), e outras porções químicas (por exemplo, a biotina).
15 Os anticorpos acima descritos podem proporcionar sobrevivên- cia aperfeiçoada quando administrados a um mamífero, tal como um ser humano, antes da, ou Iogo após a, exposição às micobactérias, tais como a M. tuberculosis. Consequentemente, o primeiro e o segundo anticorpos (e os anticorpos adicionais opcionais) da invenção (ou a composição imunogênica, 20 contendo anticorpo da invenção) podem ser usados como um soro imune passivo para impedir a infecção micobacteriana, ou para tratar os pacientes expostos às micobactérias (tais como a M. tubemu/osis). Em uma modalidade, a ligação dos anticorpos aos antígenos mi- cobacterianos da invenção pode iniciar o revestimento de uma micobactéria 25 expressando o dito antígeno. O revestimento da micobactérias preferivel- mente resulta na sua opsonização, que resulta na bactéria sendo destruída. A opsonização por anticorpos pode influenciar a entrada celular e a difusão das micobactérias nas células fagocíticas e não fagocíticas por impedimento ou modulação da entrada mediada pelo receptor e da replicação em macró- 30 fagos. Sem estar ligado por qualquer teoria, é possÍvel que, após a in- fecção micobacteriana de um macrófago, o macrófago seja morto e os baci-
los sejam Iiberados.
É neste estágio que as micobactérias são consideradas estarem mais vulneráveis ao ataque do anticorpo.
Desse modo, é possÍvel que os anticorpos da presente invenção atuem sobre os bacilos Iiberados após a morte do macrófago e, com isso, exerçam um efeito pós-infecção. 5 É possÍvel que o aspecto de proteção passiva (isto é, liberação de anticorpos) da presente invenção seja facilitado por acessibilidade au- mentada dos anticorpos da presente invenção aos antígenos sobre os baci- los micobacterianos.
É também possÍvel que a ligação do anticorpo possa bloquear a infecção do macrófago por impedimento estérico ou rompimento
- 10 de sua estrutura oligomérica.
Desse modo, os anticorpos que atuam sobre os bacilos micobacterianos Iiberados dos macrófag.os infectados, mortos, " podem interferir com a propagação da reinfecção para os macrófagos vivos.
Esta hipótese envolve uma ação sinérgica entre os anticorpos e as células T citotóxicas, que atuam deste o inlcio após a infecção, por exemplo, as célu- 15 las T NK, porém poderia posteriormente envolver também as células T cito- tóxicas CD8 e CD4. Em outra modalidade, as composições compreendendo anticor- pos (por exemplo, anticorpos monoclonais) da invenção podem ser usadas para criar anticorpos anti-idiótipos.
Os anticorpos anti-idiótipos são imuno- 20 globulinas que carregam uma "imagem interna" do antigeno do agente mi- cobacteriano infeccioso contra a qual se deseja proteção.
Estes anticorpos anti-idiótipos podem também ser úteis para o tratamento, a vacinação e/ou a diagnose das infecções micobacterianas.
O primeiro e o segundo antígenos micobacterianos da invenção 25 estimulam uma resposta imune contra as micobactérias, tais como a M. tu- bercu/osis.
No contexto dos usos e métodos terapêuticos discutidos abaixo, um 'paciente' é qualquer paciente animal que se beneficiaria do estímulo de uma resposta imune contra as micobactérias, tais como a M. tubercu/osis. 30 Os pacientes animais típicos são os mamíferos, por exemplo, os pacientes humanos, bovinos, suínos, ovinos, caprinos, equmos, corvinos, caninos ou feiinos.
Em uma modalidade, o paciente é humano, bovino, suíno ou equino.
De acordo com um aspecto da presente invenção, proporciona- se o uso de um primeiro antigeno micobacteriano e um segundo antlgeno micobacteriano para a manufatura de um medicamento para estimular uma resposta imune em um paciente, tal como um paciente mamifero (por exem-
5 plo, um paciente humano, bovino, suíno ou equino); em que o dito primeiro antígeno micobacteriano compreende: (i) uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoáci- dos de um polipeptídeo regulado pela Iatência selecionado a partir de SEQ
- 10 ID NOs: 1, 3, 5, 7 e 56, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoáci- dos consecutivos do mesmo; ou .- (ii) uma sequência de polinucleotídeos codificando uma se- quência de poIipeptídeos de acordo com (i); ou uma sequência de pohnucle- otldeos tendo pelo menos 70°6 de identidade da sequência de nucleotideos f
15 com a sequência de ácidos nucleicos de um polinucleotídeo regulado pela latência selecionado a partir de SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 e 57, ou um seu fragmento tendo pelo menos 21 nucleotídeos consecutivos do mesmo; e em que o dito segundo antígeno micobacteriano é diferente do dito primei- ro antígeno micobacteriano. 20 A invenção também proporciona um primeiro antígeno micobac- teriano e um segundo antígeno tnicobacteriano para uso no estímulo de uma resposta imune em um paciente, tal como um paciente mamífero (por exem- plo, um paciente humano, bovino, suíno ou equino); em que o dito primeiro antígeno micobacteriano compreende: 25 (j) uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoáci- dos de um polipeptldeo regulado pela latência selecionado a partir de SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7 e 56, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoáci- dos consecutivos do mesmo; ou 30 (ii) uma sequência de polinucleotídeos codificando uma se- quência de polipeptídeos de acordo com (i); ou uma sequência de polinucle- otídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de nucleotídeos com a sequência de ácidos nucleicos de um polinucleotÍdeo regulado pela latência selecionado a partir de SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 e 57, ou um seu fragmento tendo pelo menos 21 nucleotídeos consecutivos do mesmo; e em que o dito segundo antígeno micobacteriano é diferente do dito primei- 5 ro antígeno micobacteriano.
Em uma modalidade, o dito segundo antígeno micobacteriano compreende ou consiste em uma sequência de polipeptídeos ou poIinucleo- tídeos antigênica micobacteriana, tal como uma sequência de polipeptídeos ou polinucleotÍdeos antigênica micobaderiana como definida em (i)- ou (ii)
. 10 (em que o dito segundo antígeno micobacteriano é diferente do dito primeiro antigeno micobacteriano)- . Em uma modalidade, a invenção proporciona (a) um primeiro po- lipeptídeo antigênico micobacteriano ou um primeiro polinucleotÍdeo mico- bacteriano, e (b) um segundo poIipeptídeo antigênico micobacteriano ou um 15 segundo polinucleotÍdeo micobacteriano, para uso no estímulo de uma res- posta imune em um paciente; em que (i) o dito primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de i- dentidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos 20 de SEQ ID NO: 1, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; (ii) a dita primeira sequência de polinucleotídeos micobacte- rianos compreende uma sequência de poIinucleotídeos codificando o dito primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano; 25 (iii) o dito segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de polipepticleos tendo pelo menos 70% de i- dentidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; e 30 (iv) a dita segunda sequência de poIinudeotídeos rnicobac- terianos compreende uma sequência de polinucleotÍdeos codificando o dito segundo polipeptideo antigênico micobacteriano.
Em uma modalidade, o dito primeiro polinucleotÍdeo micobacte- riano compreende uma sequência de polinucleotideos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de nucleotídeos com a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 2, ou um seu fragmento tendo pelo menos 21 nu- 5 cleotídeos consecutivos da mesma. Em uma modalidade, o dito segundo polinucleotídeo micobacteriano compreende uma sequência de polinucleotí- deos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de nucleotídeos com a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 6, ou um seu fragmen- to tendo pelo menos 21 nucleotídeos consecutivos da mesma.
. 10 Em uma modalidade, a invenção proporciona (a) um primeiro po- Íipeptídeo antigênico micobacteriano ou um primeiro polinucleotídeo mico- " bacteriano, e (b) um segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano ou um segundo polinucleotídeo micobacteriano, para uso no estímulo de uma res- posta imune em um paciente; em que 15 (i) o dito primeiro poIipeptídeo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de i- dentidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 7, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; 20 (ii) a dita primeira sequência de polinucleotideos micobacte- rianos compreende uma sequência de polinucleotídeos codificando o dito primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano; (iii) o dito segundo polipeptldeo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de i- 25 dentidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; e (iv) a dita segunda sequência de poIinucleotídeos micobac- ' terianos compreende uma sequência de polinucleotídeos codificando o dito 30 segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano. Em uma modaíidade, o dito primeiro poHnucleotídeo micobacte- riano compreende uma sequência de polinucleotídeos tendo pelo menos
70% de identidade da sequência de nucleotídeos com a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 8, ou um seu fragmento tendo pelo menos 21 nu- cIeotídeos consecutivos da mesma.
Em uma modalidade, o dito segundo polinucleotídeo micobacteriano compreende uma sequência de poIinucleotí- 5 deos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de nucleotideos com a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 6, ou um seu fragmen- to tendo pelo menos 21 nucleotídeos consecutivos da mesma.
Em uma modalidade, o estímulo imune é medido por um efeito protetor em um ensaio de sobrevivência in vivo.
Em uma modalidade, o es-
. 10 tímulo imune é medido por uma frequência aumentada em células imunes, tais como os linfócitos T específicos para o antígeno na vacina - isto é, uma 0 resposta de célula imune (por exemplo, resposta imune de células T). Em uma modalidade, o estímulo imune é uma resposta imune de células T de memória, tal como uma resposta de células T centrais de memória (por e- 15 xemplo, uma resposta de CCR7+). Em uma modalidade, o estímulo imune é medido por um aumento no título de anticorpo que é específico para o antí- geno na vacina.
Em uma modalidade, o dito medicamento adicionalmente com- preende um ou mais antígenos micobacterianos adicionais, como descritos 20 neste documento.
Em uma modalidade, os um ou mais antigenos micobac- terianos adicionais, como descritos neste documento, são também para uso com os ditos primeiro e segundo antígenos micobacterianos.
Em uma moda- lidade, se o dito primeiro antígeno micobacteriano compreender ou consistir em um antígeno RvO111 (como definido neste documento) e se o dito se- 25 gundo antígeno micobacteriano compreender ou consistir em um antígeno Rv1098 (como definido neste documento), os ditos um ou mais antlgenos micobacterianos adicionais não compreendem ou consistem em um antíge- no RV3812 (como definido neste documento). Em uma modalidade deste uso terapèutico, os ditos primeiro e 30 segundo (e o(S) antígeno(s) micobacteriano(s) adiciona1(is) opcional(is)) são proporcionados na forma de uma composição antigênica, como descrita nes- te documento.
Em uma modalidade, um ou mais dos ditos primeiro, segundo antigenos micobacterianos e/ou dos ditos antígenos micobacterianos adicio- nais opcionais podem estar compreendidos dentro de um ou mais vetores ou células, como descritos neste documento. Em uma modalidade deste uso terapêutico, quaisquer das limi- 5 tações descritas neste documento com relação aos ditos primeiro e/ou se- gundo antígenos micobacterianos (e antígenos micobacterianos adicionais opcionais) se aplicam igualmente aos seus usos terapêuticos. Em uma modalidade deste uso terapêutico, os ditos primeiro e segundo antígenos micobacterianos (e antígeno(s) micobacteriano(s) adicio- . 10 nal(is) opcional(is)) são para administração ao paciente substancialmente de modo simultâneo, ou sequencial. Os regimes de administração simultâneos " e sequenciais são discutidos em mais detalhe abaixo. A presente invenção também proporciona o uso de um primeiro antígeno micobacteriano e um segundo antígeno micobacteriano para a ma- 15 nufatura de um medicamento para o tratamento ou a prevenção de uma in- fecção micobacteriana (por exemplo, infecção por M. tubercu/osis) em um paciente, tal como um paciente mamífero (por exemplo, um paciente huma- no, bovino, suíno ou equino); em que o dito primeiro antígeno micobacteria- no compreende: 20 (i) uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70°6 de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoáci- dos de um polipeptídeo regulado pela latência selecionado a partir de SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7 e 56, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoáci- , dos consecutivos do mesmo; ou 25 (ii) uma sequência de polinucleotídeos codificando uma se- quência de polipeptídeos de acordo com (i); ou uma sequência de pohnucle- otídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de nucleotideos " com a sequência de ácidos nucleicos de um polinucleotídeo regulado pela " Iatência selecionado a partir de SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 e 57, ou um seu V.
30 fragmento tendo pelo menos 21 nucleotídeos consecutivos do mesmo; e em que o dito segundo antígeno micobacteriano é diferente do dito primei- ro antígeno micobacteriano.
> Vb
A invenção também proporciona um primeiro antígeno micobac- teriano e um segundo antígeno micobacteriano para uso no tratamento ou na prevenção de uma infecção micobacteriana (por exemplo, infecção por M. tubercu/osis) em um paciente, tal como um paciente mamífero (por exemplo, 5 um paciente humano, bovino, suíno ou equino); em que o dito primeiro anti- geno micobacteriano compreende: (i) uma sequência de polipeptldeos tendo pelo menos 7O°/, de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoáci- dos de um polipeptídeo regulado pela latência selecionado a partir de SEQ
. 10 ID NOs: 1, 3, 5, 7 e 56, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoáci- dos consecutivos do mesmo; ou " (ii) uma sequência de polinucleotídeos codificando uma se- quência de polipeptídeos de acordo com (i); ou uma sequência de polinucle- otídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de nucleotídeos 15 com a sequência de ácidos nucleicos de um polinucleotideo regulado pela Iatência selecionado a partir de SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8 e 57, ou um seu fragmento tendo pelo menos 21 nucleotídeos consecutivos do mesmo; e em que o ditç) segundo antígeno micobacteriano é diferente do dito primei- ro antígeno micobacteriano. 20 Em uma modalidade, o dito segundo antígeno micobacteriano compreende ou consiste em uma sequência de polipeptídeos ou polinucleo- tídeos antigênica micobacteriana, tal como uma sequência de poIipeptídeos ou polinucleotídeos antigênica micobacteriana como definida em (i) ou (ii) (em que o dito, segundo antígeno micobacteriano é diferente do dito primeiro 25 antígeno micobacteriano). Em uma modalidade, a invenção proporciona (a) um primeiro po- lipeptldeo antigênico micobacteriano ou um primeiro polinucleotídeo mico- ' . bacteriano, e (b) um segundo poIipeptídeo antigênico micobacteriano ou um segundo po|in|jc|eotÍdeo micobacteriano, para uso no tratamento ou na pre- . 30 venção de uma infecção micobacteriana (por exemplo, infecção por M. tu- bercu/osis) em um paciente; em que: (i) o dito primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70°6 de i- dentidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou 7, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoáci- dos consecutivos da mesma; 5 (ii) a dita primeira sequência de polinucleotídeos micobacte- rianos compreende uma sequência de polinucleotideos codificando o dito primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano; (iii) o dito segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de i-
, 10 dentidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos " consecutivos da mesma; e (iv) a dita segunda sequência de polinucleotÍdeos micobac- terianos compreende uma sequência de polinucleotídeos codificando o dito 15 segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano.
Em uma modalidade, o dito primeiro polinucleotkleo micobacte- riano compreende uma sequência de polinucleotídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de nucleotídeos com a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 2 ou 8, ou um seu fragmento tendo pelo menos 21 20 nucleotídeos consecutivos da mesma.
Em uma modalidade, o dito segundo polinucleotídeo micobacteriano compreende uma sequência de polinucleotÍ- deos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de nucleotídeos com a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 6, ou um seu fragmen- to tendo pelo menos 21 nucleotídeos consecutivos da mesma. 25 Por exemplo, o dito uso ou medicamento pode proteger o paci- ente contra a infecção com as micobactérias, tais como a M. tubercu/osis.
Por exemplo, o dito uso ou medicamento pode ser útil para tratar a TB em
" um paciente, tipicamente um paciente mamífero, tal como um paciente hu- mano, bovino, suino ou equino. * 30 Em uma modalidade, o dito uso ou medicamento pode proteger o paciente contra uma infecção no estágio inicial com as micobactérias, tais como a M. tuberculosis.
O termo 'infecção no estágio inicial' refere-se ao pe-
ríodo inicial após a infecção no qual as micobactérias proliferam-se no pul- mão, tendo superado as defesas naturais do paciente hospedeiro (o sistema imune não específico). Durante a infecção no estágio inicial, a proliferação micobacteriana estimula uma resposta imune crescente no paciente infecta- 5 do. O sistema imune do paciente tenta controlar o crescimento bacteriano de modo que ele possa ser diminuído, estar restrito a dentro de um granuloma, e então decline até um nível baixo constante. A disseminação para outros órgãos, tais como o baço, pode ocorrer durante este período. O período du- rante o qual ocorre a infecção no estágio inicial nos seres humanos não está m 10 cIaramente definido; entretanto, nos modelos experimentais, tais como o - porquinho-da-lndia, este período é aproximadamente 3-4 semanas.
W A infecção no estágio inicial é, desse modo, distinta da infecção fatente. Durante a infecção latente, devida à presença de uma resposta imu- ne bem sucedida, continuada, o nível de micobactérias é mantido em um 15 nível baixo dentro do granuloma, no qual as micobactérias podem exibir 'le- targia' (de outro modo conhecida como 'persistência de não replicat). Em uma modalidade, o dito medicamento adicionalmente com- preende um ou mais antlgenos micobacterianos adicionais, como descritos neste documento. Em uma modalidade, os um ou mais antígenos micobac- 20 terianos adicionais, como descritos neste documento, são também para uso com os ditos primeiro e segundo antígenos micobacterianos. Em uma moda- lidade, se o dito primeiro antígeno micobacteriano compreender ou consistir em um antígeno RvO111 (como definido neste documento) e se o dito se- gundo antígeno micobacteriano compreender ou consistir em um antigeno 25 RV1098 (como definido neste documento), os ditos um ou mais antígenos micobacterianos adicionais não compreendem ou consistem em um antige- no RV3812 (como definido neste documento).
P Em uma modalidade deste uso terapêutico, os ditos primeiro e segundo (e O(s) antígeno(s) micobacteriano(s) adicional(is) opcional(is)) são * 30 proporcionados na forma de uma composição antigênica, como descrita nes- te documento. Em uma modalidade, um ou mais dos ditos primeiro, segundo antígenos micobacterianos e/ou dos ditos antígenos micobacterianos adicio-
nais opcionais podem estar compreendidos dentro de um ou mais vetores ou células, como descritos neste documento.
Em uma modalidade deste uso terapêutico, quaisquer das limi- tações descritas neste documento com relação aos ditos primeiro e/ou se-
5 gundo antígenos micobacterianos (e/ou antlgenos micobacterianos adicio- nais opcionais) se aplicam igualmente aos seus usos terapêuticos.
Em uma modalidade deste uso terapêutico, os ditos primeiro e segundo antígenos micobacterianos (e antigeno(s) micobacteriano(s) adicio- nal(is) opcional(is)) são para administração ao paciente substancialmente de m 10 modo simultâneo, ou sequencial.
Os regimes de administração simultâneos : e sequenciais são discutidos em mais detalhe abaixo. " Um aspecto relacionado inclui um método para estimular uma resposta imune em um paciente, compreendendo administrar a um paciente, tal como um mamífero (por exemplo, um paciente humano, bovino, suíno ou 15 equino), uma quantidade efetiva de um primeiro antígeno micobacteriano e um segundo antígeno micobacteriano: em que o dito primeiro antígeno micobacteriano compreende: (i) uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% ' de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoáci-
20 dos de um polipeptídeo regulado pela latência selecionado a partir de SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7 e 56, Olj um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoáci- dos consecutivos do mesmo; ou (ii) uma sequência de polinucleotídeos codificando uma se- quência de polipeptídeos de acordo com (i); ou uma sequência de poiinucle-
25 otídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de nucleotídeos com a sequência de ácidos nucleicos de um poHnucleotídeo regulado pela latência selecionado a partir de SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 e 57, ou um seu " fragmento tendo pelo menos 21 nucleotídeos consecutivos do mesmo; e em que o dito segundo antígeno micobacteriano é diferente do dito primei- . 30 ro antígeno micobacteriano.
Em uma modaiidade, o dito segundo antígeno micobacteriano compreende ou consiste em uma sequência de polipeptídeos ou polinucleo-
tídeos antigênica micobacteriana, tal como uma sequência de polipeptídeos ou polinucleotÍdeos antigênica micobacteriana como definida em (i) ou (ii) (em que o dito segundo antígeno micobacteriano é diferente do dito primeiro antígeno micobacteriano). 5 Em uma modalidade, a invenção proporciona um método de es- timular uma resposta imune em um paciente, compreendendo administrar ao dito paciente: (a) um primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano ou um primeiro poHnucleotídeo micobacteriano, e (b) um segundo polipeptídeo anti- gênico micobacteriano ou um segundo polinucleotídeo micobacteriano; em 10 que: q ' %" (i) o dito primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano q - compreende uma sequência de poIipeptídeos tendo pelo menos 7Ó°/o de i- dentidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou 7, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoáci- 15 dos consecutivos da mesma; (ii) o dito primeiro polinucleotÍdeo micobacteriano compre- ende uma sequência de poHnucleotídeos codificando o dito primeiro polipep- tídeo antigênico micobacteriano; (iii) o dito segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano 20 compreende uma sequência de poIipeptldeos tendo pelo menos 70% de i- dentidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; e (iv) o dito segundo poIinucleotídeo micobacteriano compre- 25 ende uma sequência de polinucleotÍdeos codificando o dito segundo poIipep- tídeo micobacteriano.
Em uma modalidade, o estímulo imune é medido por um efeito protetor em um ensaio de sobrevivência in vivo.
Em uma modalidade, o es- tímulo imune é medido por uma frequência aumentada em células imunes, 30 tais como os linfócitos T específicos para o antigeno na vacina - isto é, uma resposta de célula imune (por exemplo, resposta imune de células T). Em uma modalidade, o estímulo imune é uma resposta imune de células T de memória, tal como uma resposta de células T centrais de memória (por e- xemplo, uma resposta de CCR7+). Em uma modalidade, o estímulo imune é medido por um aumento no título de anticorpo que é específico para o antí- geno na vacina. 5 Em uma modalidade, o dito método adicionalmente compreende administrar um ou mais antígenos micobacterianos adicionais, como descri- tos neste documento. Em uma modalidade, se o dito primeiro antígeno mi- cobacteriano compreender ou consistir em um antígeno RvO111 (como defi- nido neste documento) e se o dito segundo antlgeno micobacteriano com- lO preender ou consistir em um antígeno RV1098 (como definido neste docu- § mento), os ditos um ou mais antigenos micobacterianos adicionais não com- preendem ou consistem em um antígeno Rv3812 (como definido neste do- 0 cumento). Em uma modalidade deste método terapêutico, os ditos primeiro 15 e segundo (e O(s) antígeno(s) micobacteriano(s) adicional(is) opcional(is)) são proporcionados na forma de uma composição ou fomulação antigênica, como descrita neste documento. Em uma modalidade, um ou mais dos ditos primeiro, segundo antígenos micobacterianos e/ou dos ditos antígenos mi- cobacterianos adicionais opcionais podem estar compreendidos dentro de 20 um ou mais vetores ou células, como descritos neste documento. Em uma modalidade deste método terapêutico, quaisquer das limitações descritas neste documento com relação aos ditos primeiro e/ou segundo antlgenos micobacterianos (e/ou antígenos micobacterianos adi- cionais opcionais) se aplicam igualmente aos seus usos terapêuticos.
25 Em uma modalidade, o método compreende administrar os ditos primeiro e segundo antígenos micobacterianos ao paciente substanciaimen- te de modo simultâneo, ou sequencial. Os regimes de administração simul- tâneos e sequenciais são discutidos em mais detalhe abaixo. Em um aspecto relacionado, proporciona-se um método de tratar 30 ou prevenir uma infecção micobacteriana (por exemplo, uma infecção por M. tubercu/osis), compreendendo administrar a um paciente, tal como um ma- mífero (por exemplo, um paciente humano, bovino, suíno ou equino), uma quantidade efetiva de um primeiro antlgeno micobacteriano e um segundo antígeno micobacteriano; em que o dito primeiro antígeno micobacteriano compreende: (i) uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70°/õ 5 de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoáci- dos de um polipeptídeo regulado pela latência selecionado a partir de SEQ ID NOs: 1, 3, 5, 7 e 56, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoáci- dos consecutivos do mesmo; ou (ii) uma sequência de poHnucleotídeos codificando uma se- lO quência de polipeptideos de acordo com (j); ou uma sequência de polinucle- d otídeos tendo pelo menos 7O°/j de identidade da sequência de nucleotideos 0 com a sequência de ácidos nucleicos de um polinucleotídeo regulado pela latência selecionado a partir de SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8 e 57, ou um seu fragmento tendo pelo menos 21 nucleotídeos consecutivos do mesmo; 15 e em que o dito segundo antígeno micobacteriano é diferente do dito primei- ro antígeno micobaderiano. Em uma modalidade, o dito segundo antígeno micobacteriano compreende ou consiste em uma sequência de polipeptídeos ou polinucleo- tídeos antigênica micobacteriana, tal como uma sequência de polipeptídeos 20 ou po!inucleotídeos antigênica micobacteriana como definida em (i) ou (ii) (em que o dito segundo antígeno micobacteriano é diferente do dito primeiro antlgeno micobacteriano). Em uma modalidade, a invenção proporciona um método de tra- tar ou prevenir uma infecção micobacteriana (por exemplo, Ínfecção por M. 25 tubemu/osis) em um paciente; compreendendo administrar ao dito paciente: (a) um primeiro poIipeptideo antigênico micobacteriano ou um primeiro poli- nucleotídeo micobacteriano, e (b) um segundo polipeptídeo antigênico mico- " bacteriano ou um segundo poIinucleotídeo micobacteriano; em que: (i) o dito primeiro poIipeptídeo antigênico micobacteriano
Z 30 compreende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de i- dentidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou 7, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoáci-
dos consecutivos da mesma; (ii) o dito primeiro polinucleotídeo micobacteriano compre- ende uma sequência de polinucleotídeos codificando o dito primeiro poIipep- tídeo antigênico micobacteriano; 5 (iii) o dito segundo polipeptldeo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de poIipeptídeos tendo pelo menos 70% de i- dentidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; e 10 (iv) o dito segundo polinucleotídeo micobacteriano compre- ende uma sequência de poIinucleotídeos codificando o dito segundo polipep- tídeo micobacteriano.
D Por exemplo, o dito método pode proteger o paciente contra a in- fecção com as micobactérias, tais como a M. tubercu/osis. Por exemplo, o 15 dito método pode tratar a TB no paciente. Em uma modalidade, o dito méto- do pode proteger o paciente contra uma infecção no estágio inicial com as micobactérias, tais como a M. tubercu/osis. A infecção micobacteriana no estágio inicial é definida acima. Em uma modaiidade, o dito método adicionajmente compreende 20 administrar um ou mais antígenos micobacterianos adicionais, como descri- tos neste documento. Em uma modalidade, se o dito primeiro antígeno mi- cobacteriano compreender ou consistir em um antígeno RvO111 (como defi- nido neste documento) e se o dito segundo antígeno micobacteriano com- preender ou consistir em um antígeno Rv1098 (como definido neste docu- 25 mento), os ditos um ou mais antígenos micobacterianos adicionais não com- preendem ou consistem em um antígeno RV3812 (como definido neste do- cumento)- Em uma modalidade deste método terapêutico, os ditos primeiro e segundo (e O(S) antígeno(s) micobacteriano(s) adicional(is) opcional(is)) 30 são proporcionados na forma de uma composição antigênica, como descrita neste documento. Em uma modalidade, um ou mais dos ditos primeiro, se- gundo antígenos micobacterianos e/ou dos ditos antígenos micobacterianos adicionais opcionais podem estar compreendidos dentro de um ou mais ve- tores ou células, como descritos neste documento.
Em uma modalidade deste método terapêutico, quaisquer das limitações descritas neste documento com relação aos ditos primeiro e/ou
5 segundo antígenos micobacterianos (e/ou antígenos micobacterianos adi- cionais opcionais) se aplicam igualmente aos seus usos terapêuticos.
Em uma modalidade, o método compreende administrar os ditos primeiro e segundo antígenos micobacterianos ao paciente substancialmen- te de modo simultâneo, ou sequenciaL Os regimes de administração simul-
lO tâneos e sequenciais são discutidos em mais detalhe abaixo.
O primeiro e o segundo anticorpos da invenção são também ú- teis para estimular uma resposta imune contra as micobactérias, tais como a M. tubercu/osis.
Desse modo, a invenção também proporciona usos e métodos
15 terapêuticos que envolvem um primeiro anticorpo e um segundo anticorpo, em que o dito primeiro anticorpo liga um primeiro antígeno micobacteriano e o dito segundo anticorpo liga um segundo antígeno micobacteriano; em que o dito primeiro antígeno micobacteriano compreende: (i) uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% 20 de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoáci- dos de um polipeptídeo regulado pela Iatência selecionado a partir de SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7 e 56, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoáci- dos consecutivos do mesmo; ou (ii) uma sequência de polinucleotídeos codificando uma se- 25 quência de polipeptídeos de acordo com (i); ou uma sequência de poIinucle- otídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de nucleotídeos com a sequência de ácidos nucleicos de um polinucleotídeo regulado pela latência selecionado a partir de SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8 e 57, ou um seu fragmento tendo pelo menos 21 nucleotideos consecutivos do mesmo; 0
30 e em que o dito segundo antigeno micobacteriano é diferente do dito primeiro antígeno micobacteriano.
Em uma modalidade, o dito primeiro antígeno micobacteriano compreende ou consiste em uma sequência de polipeptídeos antigênica mi- cobacteriana, como definida em (i). Em uma modalidade, o dito segundo an- tígeno micobacteriano compreende ou consiste em uma sequência de poIi- peptídeos antigênica micobacteriana, tal como uma sequência de polipeptí- deos antigênica micobacteriana como definida em (i) (em que o dito segundo antígeno micobacteriano é diferente do dito primeiro antígeno micobacteria- no). Em uma modalidade, os ditos primeiro anticorpo e segundo anti- corpo são proporcionados na forma de uma composição que contém anti- lO corpo, imunogênica, ou uma formulação, conforme descrito neste documen- to.
A título de exemplo, a invenção proporciona o uso do primeiro e do segundo anticorpos da invenção (por exemplo, na forma de uma compo- sição que contém anticorpo, imunogênica, da invenção) para a manufatura de um medicamento para estimular uma resposta imune em um paciente (tipicamente um mamifero - por exemplo, um paciente humano, bovino, suí- no ou equino); ou para a manufatura de um medicamento para tratar ou pre- venir uma infecção micobacteriana (por exemplo, a TB), ou infecção suspei- ta, em um paciente (tal como um mamifero - por exemplo, um paciente hu- mano, bovino, suíno ou equino). A invenção também proporciona o primeiro e o segundo anticor- pos da invenção (por exemplo, na forma de uma composição que contém anticorpo, Ímunogênica, da invenção) para uso no estímulo de uma resposta imune em um paciente (tipicamente um mamífero - por exehiplo, um pacien- te humano, bovino, suíno ou equino); ou para a manufatura de um medica- mento para tratar ou prevenir uma infecção micobacteriana (por exemplo, a TB), ou infecção suspeita, em um paciente (tal como um mamífero - por e- xemplo, um paciente humano, bovino, suíno ou equino). Em uma modalidade, a invenção proporciona um primeiro anti- corpo e um segundo anticorpo para uso no estímulo de uma resposta imune em um paciente; em que o dito primeiro anticorpo liga um primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano, em que o dito primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou 7, ou um seu fragmento tendo pelo 5 menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; e em que o dito segundo anticorpo liga um segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano, em que o dito segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de poIipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência 10 de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 &.
aminoácidos consecutivos da mesma. A invenção também proporciona um método para estimular uma resposta imune em um paciente (tal como um mamífero - por exemplo, um paciente humano, bovino, suíno ou equino) ou para tratar ou prevenir uma 15 infecção micobacteriana (por exemplo, infecção por M. tubercu/osis, TB) em um paciente (tal como um mamífero - por exemplo, um paciente humano, bovino, suíno ou equino), compreendendo administrar ao dito paciente (pré- ou pós-infecção) o primeiro e o segundo anticorpos (e os anticorpos adicio- nais opcionais) da invenção (por exemplo, na forma de uma composição que 20 contém anticorpo, imunogênica, da invenção). Em uma modalidade, a invenção proporciona um método de es- timular uma resposta imune em um paciente, compreendendo administrar ao dito paciente: (a) um primeiro anticorpo, em que o dito primeiro anticorpo Iiga 25 um primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano; em que o dito primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de poli- peptldeos tendo pelo menos 70°/o de identidade da sequência de aminoáci- +· dos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou 7, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; e « 30 (b) um segundo anticorpo, em que o dito segundo anticorpo li- ga um segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano; em que o dito se- gundo antígeno micobacteriano compreende uma sequência de polipeptí-
í[0y : deos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma. Em uma modalidade dos ditos usos e métodos, os ditos primeiro 5 anticorpo e segundo anticorpo são proporcionados na forma de uma compo- sição ou formulação que contém anticorpo, imunogênica, como descrita nes- te documento. , Em uma modalidade, o dito uso ou método adicionalmente com- preende a administração de um ou mais anticorpos adicionais que ligam um 10 ou mais antígenos micobacterianos adicionais, como descritos neste docu- mento. Em uma modalidade, se o dito primeiro anticorpo ligar um primeiro antígeno micobacteriano que compreende ou consiste em um antígeno RvO111 (como definido neste documento) e se o dito segundo anticorpo ligar um segundo antígeno micobacteriano que compreende ou consiste em um 15 antígeno Rv1098 (como definido neste documento), os ditos um ou mais an- ticorpos adicionais não Iigam um antígeno micobacteriano que compreende ou consiste em um antígeno Rv3812 (como definido neste documento). Em uma modalidade, quaisquer das limitações descritas neste documento em relação aos ditos primeiro e/ou segundo anticorpos (e/ou os 20 antígenos aos quais os anticorpos ligam) se aplicam igualmente aos seus métodos e usos terapêuticos. O dito método ou uso pode ser para a administração simultânea ou sequencial dos ditos primeiro e segundo anticorpos (e/ou anticorpos adi- cionais opcionais). Em uma modalidade, o primeiro e o segundo anticorpos 25 micobacterianos são para a administração ao paciente substanciaimente de modo simultâneo, ou sequencial. Os regimes de administração simultâneos e sequenciais são discutidos em mais detalhe abaixo.
. Em uma modalidade, o dito uso ou método pode proteger o pa- ciente contra uma infecção no estágio inicial com as micobactérias, tais co- . 30 mo a M. tuberculosis. A infecção micobacteriana no estágio inicial é definida acima. Em um aspecto relacionado, o primeiro e o segundo antígenos micobacterianos (e os antígenos micobacterianos adicionais opcionais), a composição antigênica, os anticorpos, a composição imunogênica ou o me- dicamento da presente invenção, como definidos neste documento, pode ser útil em terapias (incluindo os tratamentos preventivos) para uma variedade 5 de doenças micobacterianas não limitaclas à tuberculose (TB), lepra, infec- ção por M. avium, infecção por M. bovis, infecção por M. pamtuberculosis, infecção por M. u/cerans (por exemplo, úlcera de Buruli), ou outra infecção micobacteriana que não a tuberculose. O primeiro e o segundo antígenos rnicobacterianos (e os antíge- lO nos micobacterianos adicionais opcionais), a composição antigênica, os an- - ticorpos, a composição imunogênica ou o medicamento da presente inven- ção pode ser útil para induzir uma variedade de respostas imunes e pode, portanto, ser útil em métodos para tratar uma variedade de doenças. Em uma modalidade, o primeiro e o segundo antigenos mico- 15 bacterianos (e os antígenos micobacterianos adicionais opcionais), a com- posição antigênica ou o medicamento da presente invenção é útil para o tra- tamento ou a prevenção de uma variedade de doenças não micobacterianas nas quais as micobactérias estão envolvidas. Por exemplo, as doenças que podem beneficiar-se do medicamento da invenção incluem as doenças in- 20 flamatórias, tais como a doença autoimune, o câncer (por exemplo, o câncer da bexiga), a doença inflamatória do intestino, a Doença de Crohn, a Doença de Johne, a Doença de Hansen, a osteomielite, a linfadenite, a variola ou o vÍrus da varíola do macaco. Conforme usado neste documento, o termo "tratamento" ou "tra- 25 tar" inclui as medidas terapêuticas ou preventivas/profiláticas, e inclui a tera- pia pós-infecção e a melhoria de uma infecção micobacteriana. Conforme usado neste documento, o termo "prevenir" inclui a · prevenção do inicio de uma infecção micobacteriana e/ou a redução da gra- vidade ou intensidade de uma infecção micobacteriana.
P 30 Em uma modalidade, a composição antigênica ou o medicamen- to da invenção compreende antígenos micobacterianos que representam diferentes estados de infecção micobacteriana (por exemplo, latência, reati-
vação ou infecção ativa). Em uma modalidade, a composição antigênica ou o medicamento da invenção compreende pelo menos um antigeno micobac- teriano que é expresso durante a latência e pelo menos um antígeno mico- bacteriano que é infrarregulado durante a Iatência.
Esta mistura de antígenos é, portanto, útil para prevenir e/ou pa- ra tratar os múltiplos estágios de infecção micobacteriana, porque os antíge- nos provocam respostas em um paciente contra os diferentes estágios da doença (por exemplo, as fases no estágio inicial, Iatentes, de reativação ou agudas da doença micobacteriana). Conforme usado neste documento, o termo "eficácia da vacina" descreve a capacidade de uma vacina de proteger um paciente (tipicamente um paciente mamífero, por exemplo, um paciente humano, bovino, suíno ou equino) do desafio com as micobactérias, tais como a M. tubercu/osis.
A títu- lo de exemplo, a "eficácia da vacina" pode referir-se à eficácia de uma vaci- na em prevenir o início de uma infecção micobacteriana e/ou reduzir a gravi- dade/intensidade de uma infecção micobacteriana.
Uma composição terapêutica/profilática ou medicamento pode ser administrado a um paciente (tipicamente um paciente mamífero, tal como um paciente humano, bovino, suíno ou equino) já tendo uma infecção mico- bacteriana, uma condição ou sintomas associados com uma infecção mico- bacteriana, para tratar ou prevenir a dita infecção micobacteriana.
Em uma modalidade, o paciente é suspeito de ter entrado em contato com as mico- bactérias, ou ter tido contato sabido com as micobactérias, porém ainda não está mostrando os sintomas da exposição.
Em uma modalidade, o paciente tem uma infecção no estágio inicial.
Quando administrados a um paciente (por exemplo, um mamífe- ro, tal como um paciente humano, bovino, suíno ou equino) que já tenha uma infecção ou doença micobacteriana, ou esteja mostrando sintomas as- sociados com uma infecção micobacteriana, a composição terapêutica/o medicamento podem curar, retardar, reduzir a gravidade de, ou melhorar um ou mais sintomas, e/ou prolongar a sobrevivência de um paciente mais do que esperada na ausência de tal tratamento.
Alternativamente, uma composição terapêutica/profilática ou medicamento pode ser administraclo a um paciente (por exemplo, um mamí- fero, tal como um paciente humano, bovino, suíno ou equino) que, em última análise, possa adquirir uma infecção micobacteriana, para impedir, curar, retardar, reduzir a gravidade de, ou melhorar um ou mais sintomas da dita infecção micobacteriana, Olj para prolongar a sobrevivência de um paciente mais do que esperada na ausência de tal tratamento.
Em uma modalidade, o paciente tinha sido anteriormente expos- to às micobactérias.
Por exemplo, o paciente pode ter tido uma infecção mi- lO cobacteriana no passado (porém não está opcionalmente no momento infec- tado com as micobactérias). O paciente pode ser infectado de modo latente com as micobactérias.
Alternativamente, ou além disso, o paciente pode ter sido vacinado contra a infecção micobacteriana no passado (por exemplo, o paciente recebeu previamente uma vacinação de BCG). Os tratamentos e as terapias preventivas da presente invenção são aplicáveis a uma variedade de diferentes pacientes de diferentes idades.
No contexto dos seres humanos, as terapias são aplicáveis às crianças (por exemplo, bebês, crianças menores de 5 anos de idade, crianças mais velhas ou adolescentes) e aos adultos.
No contexto de outros pacientes animais (por exemplo, os mamíferos, tais como os pacientes bovinos, suínos ou e- quinos), as terapias são aplicáveis aos pacientes imaturos (por exemplo, bezerros, leitões, potros) e aos pacientes madurosl adultos.
Os tratamentos e as terapias preventivas da presente invenção são aplicáveis aos pacientes que estejam imunocomprometidos ou imunossuprimidos (por exemplo, os pacientes humanos que tenham HlV ou AIDS, ou outros pacientes animais com doenças de imunodeficiência comparáveis), aos pacientes que tenham sofrido um transplante de órgão, transplante de medula óssea, ou que te- nham imunodeficiências genéticas.
A invenção proporciona formulações terapêuticas, medicamen- tos e formulações profiláticas (por exemplo, vacinas) que compreendem um veículo farmaceuticamente aceitável, um primeiro antígeno micobacteriano da invenção, como definido acima, e um segundo antígeno micobacteriano da invenção, como definido acima (e opcionalmente um ou mais antígenos micobacterianos adicionais da invenção, como descritos acima). Em uma modalidade, a invenção proporciona uma formulação terapêutica ou profilática (por exemplo, vacina), compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável e: (a) um primeiro antigeno micobacteriano, em que o dito primei- ro antígeno micobacteriano compreende: (i) uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70°'6 de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de um polipeptldeo regulado pela latência seiecionado a partir de SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7 e 56, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos do mesmo; ou (ii) uma sequência de polinucleotÍdeos codificando uma se- quência de poIipeptídeos de acordo com (i); ou uma sequência de polinucle- otídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de nucleotídeos com a sequência de ácidos nucleicos de um poIinucleotídeo regulado pela latência selecionado a partir de SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8 e 57, ou um seu fragmento tendo pelo menos 21 nucleotídeos consecutivos do mesmo;
e (b) um segundo antígeno micobacteriano, em que o dito se- gundo antlgeno micobacteriano é diferente do dito primeiro antlgeno mico- bacteriano; em que a dita formulação é para a administração simultânea ou sequencial dos ditos primeiro e segundo antígenos micobacterianos.
Em uma modalidade, o dito segundo antígeno micobacteriano compreende ou consiste em uma sequência de polipeptídeos ou polinucleo- tideos antigênica micobacteriana, tal como uma sequência de polipeptídeos ou polinucleotídeos antigênica micobacteriana como definida em (i) ou (ii) (em que o dito segundo antígeno micobacteriano é diferente do dito primeiro antígeno micobacteriano). Em uma modalidade, a dita formulação terapêutica ou profilática (por exemplo, vacina) compreende (a) um veículo farmaceuticamente acei-
tável; (b) um primeiro poIipeptídeo antigênico micobacteriano ou um primeiro polinucleotÍdeo micobacteriano; e (c) um segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano ou um segundo polinucleotÍdeo micobacteriano; em que: (i) o dito primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de i- dentidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou 7, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoáci- dos consecutivos da mesma; (ii) o dito primeiro polinucleotÍdeo micobacteriano compreende uma sequência de polinucleotÍdeos codificando o dito primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano; (iii) o dito segundo polipeptldeo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de i- dentidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; e (iv) o dito segundo polinucleotídeo micobacteriano compreende uma sequência de polinucleotideos codificando o dito segundo polipeptídeo micobacteriano. em que a dita formulação é para a administração simultânea ou sequencial do dito primeiro polipeptídeo ou polinucleotídeo antigênico mico- bacteriano e do dito segundo polipeptídeo ou polinucleotídeo antigênico mi- cobacteriano.
Em uma modalidade, o dito primeiro polinucleotÍdeo micobacte- riano compreende uma sequência de polinucleotídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de nucleotídeos com a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 2 ou 8, ou um seu fragmento tendo pelo menos 21 nucleotídeos consecutivos da mesma.
Em uma modalidade, o dito segundo polinucleotídeo micobacteriano compreende uma sequência de pdinucleotí- deos tendo pelo menos 70°6 de identidade da sequência de nucleotídeos com a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 6, ou um seu fragmen- to tendo pelo menos 21 nucleotídeos consecutivos da mesma.
Em uma modalidade, a dita formulação terapêutica, medicamen- to ou formulação profilática (por exemplo, vacina) da invenção compreende uma composição antigênica da invenção, como definida acima.
Em uma modalidade, a dita formulação terapêutica, medicamen- to ou formulação profilática (por exemplo, vacina) compreende uma compo- sição antigênica que compreende um ou mais vetores ou células, como des- critos acima, em que os ditos vetores ou células compreendem pelo menos um dos antígenos micobacterianos.
Em uma modalidade da dita formulação terapêutica, medica- lO mento ou formulação profilática (por exemplo, vacina), quaisquer das limita- ções descritas neste documento em relação aos ditos primeiro e/ou segundo antígenos micobacterianos (ou antígenos micobacterianos adicionais) se aplicarn igua'lmente à dita formulação terapêutica, medicamento ou formula- ção profilática (por exemplo, vacina). Em uma modalidade, uma vacina da invenção é uma "vacina de vetor" compreendendo um ou mais vetores, como descritos acima.
Em uma modalidade, as formulações terapêuticas, os medica- mentos ou as formulações profiláticas (por exemplo, as vacinas) da invenção são para a administração simultânea dos ditos primeiro e segundo antígenos micobacterianos (e/ou antígenos micobacterianos adicionais opcionais). Em uma modalidade alternativa, as formulações terapêuticas, os medicamentos ou as formulações profiláticas (por exemplo, vacinas) da invenção são para a administração sequencial dos ditos primeiro e segundo antígenos micobac- terianos (e/ou antlgenos micobacterianos adicionais opcionais). Os regimes de administração simultâneos e sequenciais são discutidos em mais detalhe abaixo.
A invenção também proporciona formulações terapêuticas, me- dicamentos e formulações profiláticas (por exemplo, vacinas) compreenden- do um veículo farmaceuticamente aceitável, um primeiro anticorpo, em que o dito primeiro anticorpo liga um primeiro antígeno micobacteriano da inven- ção, como definido acima; e um segundo anticorpo, em que o dito segundo anticorpo liga um segundo antígeno m icobacteriano da invenção, como defi-
nido acima (e opcionalmente um ou mais anticorpos adicionais da invenção, como descritos acima). Em uma modalidade, a invenção proporciona uma formulação terapêutica ou profilática (por exemplo, vacina), compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável e: (a) um primeiro anticorpo, em que o dito primeiro anticorpo liga um primeiro antígeno micobacteriano; em que o dito primeiro antígeno mico- bacteriano compreende: (i) uma sequência de polipeptldeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos . de um polipeptídeo regulado pela latência selecionado a partir de SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7 e 56, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos do mesmo; ou (ii) uma sequência de poIinucleotídeos codificando uma se- quência de polipeptídeos de acordo com (i); ou uma sequência de polinude- otídeos tendo pelo menos 70°6 de identidade da sequência de nucleotídeos com a sequência de ácidos nucleicos de um polinucleotÍdeo regulado pela latência selecionado a partir de SEQ ID NOS: 2, 4, 8 e 57, ou um seu frag- mento tendo pelo menos 21 nucleotídeos consecutivos do mesmo; e (b) um segundo anticorpo, em que o dito segundo anticorpo liga um segundo antígeno micobacteriano que é diferente do dito primeiro antígeno micobacteriano; em que a dita formulação é para a administração simultânea ou sequencial dos ditos primeiro e segundo anticorpos.
Em uma modalidade, o dito primeiro anticorpo liga um primeiro antígeno micobacteriano compreendendo uma sequência de polipeptídeos antigênica micobacteriana como definia em (i). Em uma modalidade, o dito segundo anticorpo liga um segundo antígeno micobacteriano compreenden- do uma sequência de polipeptídeos antigênica micobacteriana como definida em (i) (em que o dito segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano é difè- rente do dito primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano).
Em uma modalidade, a invenção proporciona uma formulação terapêutica ou profilática (por exemplo, vacina), compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável e: (a) um primeiro anticorpo, em que o dito primeiro anticorpo liga um primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano; em que o dito primeiro poIipeptídeo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de poIi- peptídeos tendo pelo menos 70°6 de identidade da sequência de aminoáci- dos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou 7, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; e
(b) um segundo anticorpo, em que o dito segundo anticorpo li- ga um segundo polipeptideo antigênico micobacteriano; em que o dito se- gundo antígeno micobacteriano compreende uma sequência de polipeptí- deos tendo pelo menos 7Õ°/o de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; em que a dita formulação é para a administração simultânea ou sequencial dos ditos primeiro e segundo anticorpos.
Em uma modalidade, a dita formulação terapêutica, medicamen- to ou formulação profilática (por exemplo, vacina) da invenção compreende uma composição que contém anticorpo, imunogênica.
Em uma modalidade da dita formulação terapêutica, medica- mento ou formulação profilática (por exemplo, vacina), quaisquer das lirnita- ções descritas neste documento com relação aos ditos primeiro e/ou segun- do anticorpos (ou anticorpos adicionais) (ou aos antígenos aos quais eles se
Íigam) se aplicam igualmente à dita formulação terapêutica, medicamento ou formulação profilática (por exemplo, vacina). Em uma modalidade, as formulações terapêuticas, os medica- mentos ou as formulações profiláticas (por exemplo, as vacinas) da invenção são para a administração simultânea dos ditos primeiro e segundo anticor-
pos (e/ou anticorpos adicionais). Em uma modalidade alternativa, as formu- lações terapêuticas, os medicamentos ou as formulações profiláticas (por exemplo, as vacinas) da invenção são para a administração sequencial dos ditos primeiro e segundo anticorpos (e/ou anticorpos adicionais). Os regimes de administração simultâneos e sequenciais são discutidos em mais detalhe abaixo.
As formulações terapêuticas, os medicamentos e as formulações profiláticas (por exemplo, as vacinas) da invenção compreendem um veículo farmaceuticamente aceitável, e opcionalmente um ou mais de um sal, exci- piente, diluente e/ou ad juvante.
Em uma modalidade, a formulação terapêutica, o medicamento ou a formulação profilática (por exemplo, a vacina) da invenção podem com-
lO preender um ou mais agentes imunorreguladores selecionados a partir de, por exemplo, imunoglobulinas, antibióticos, interleucinas (por exemplo, IL-2, IL-12), e/ou citocinas (por exemplo, lFNy). Em uma modalidade, a formulação terapêutica, o medicamento ou a formulação profilática (por exemplo, a vacina) da invenção pode com-
preender um ou mais compostos antimicrobianos, tais como os fármacos antituberculose convencionais (por exemplo, rifampicina, isoniazid, etambu- tol ou pirizinamida). Consequentemente, em um aspecto, a invenção proporciona um método para produzir uma formulação terapêutica ou profilática (por exem-
pIo, vacina), o método compreendendo combinar o veículo farmaceutica- mente aceitável com um primeiro antígeno micobacteriano da invenção, co- mo definido acima, e um segundo antígeno micobacteriano da invenção, como definido acima (e opcionalmente um ou mais antígenos micobacteria- nos adicionais, como definidos acima). Desse modo, em uma modalidade, a invenção proporciona um método para produzir uma formulação terapêutica ou profilática (por exem- plo, vacina), o método compreendendo combinar o veículo farmaceutica- mente aceitável com: (a) um primeiro antlgeno micobacteriano, em que o dito primei-
ro antígeno micobacteriano compreende: (i) uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 7Õ°/o de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de um poIipeptídeo regulado pela latência selecionado a partir de SEQ ID · NOS: 1, 3, 5, 7 e 56, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos do mesmo; ou (ii) uma sequência de polinucleotídeos codificando uma se- quência de polipeptídeos de acordo com (i) ou uma sequência de polinucleo- tídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de nucleotídeos com a sequência de ácidos nucleicos de um polinucleotÍdeo regulado pela latência selecionado a partir de SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8 e 57, ou um seu fragmento tendo pelo menos 21 nucleotídeos consecutivos do mesmo; e (b) um segundo antígeno micobacteriano, em que o dito se- gundo antígeno micobacteriano é diferente do dito primeiro antígeno mico- bacteriano.
Em uma modalidade, o dito segundo antígeno micobacteriano compreende ou consiste em uma sequência de polipeptídeos ou polinucleo- tídeos antigênica micobacteriana, tal como uma sequência de polipeptídeos ou polinucleotÍdeos antigênica micobacteriana como definida em (i) ou (ii) (em que o dito segundo antígeno micobacteriano é diferente do dito primeiro antígeno micobacteriano). Em uma modalidade, a invenção proporciona um método para produzir uma formulação terapêutica ou profilática (por exemplo, vacina), o método compreendendo: combinar um veículo farmaceuticamente aceitável com: (i) um primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano, em que o dito primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da se- quência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou 7, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma: ou . (ii) um primeiro polinucleotídeo micobacteriano, em que o dito primeiro polinucleotídeo micobacteriano compreende uma sequência de po- linucleotÍdeos codificando o dito primeiro polipeptídeo antigênico micobacte-
riano; e com: (iii) um segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano, em que o dito segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da se- quência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; ou (iv) um segundo poIinucleotÍdeo micobacteriano, em que o dito segundo polinucleotídeo micobacteriano compreende uma sequência de po- Hnucleotídeos codificando o dito segundo polipeptídeo micobacteriano.
Em uma modalidade, os ditos antígenos micobacterianos estão na forma de uma composição antigênica da invenção, como definida acima. . Em uma modalidade do dito método, quaisquer das limitações descritas neste documento em relação aos ditos primeiro e/ou segundo antí- genos micobacterianos (ou antígenos micobacterianos adicionais) se apli- cam igualmente ao d ito método.
Em uma modalidade, o método adicionalmente compreende combinar o dito veículo farmaceuticamente aceitável e os antígenos mico- bacterianos (ou a composição antigênica) com um ou mais de um sal, exci- piente, diluente, adjuvante, agente imunorregulador e/ou composto antimi- crobiano.
A invenção também proporciona um método para produzir uma formulação terapêutica ou profilática (por exemplo, vacina), o método com- preendendo combinar um veículo farmaceuticamente aceitável com um pri- meiro anticorpo, em que o dito primeiro,anticorpo liga um primeiro antígeno micobacteriano da invenção, como definido acima; e um segundo anticorpo, em que o dito segundo anticorpo liga um segundo antígeno micobacteriano da invenção, como definido acima (e opcionalmente um ou mais anticorpos micobacterianos adicionais da Ínvenção, como definidos acima). Desse modo, em uma modalidade, a invenção proporciona um método para produzir uma formulação terapêutica ou profilática (por exem-
plo, vacina), o método compreendendo combinar o veículo farmaceutica- mente aceitável com: (a) um primeiro anticorpo, em que o dito primeiro anticorpo liga um primeiro antígeno micobacteriano; em que o dito primeiro antígeno mico-
bacteriano compreende: (i) uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70°6 de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de um poIipeptídeo regulado pela latência selecionado a partir de SEQ ID NOS: 1, 3, 5, 7 e 56, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos do mesmo; ou (ii) uma sequência de poHnucleotídeos codificando uma se- quência de polipeptídeos de acordo com (i) ou uma sequência de polinucleo- tídeos tendo pelo menos 70°6 de identidade da sequência de nucleotídeos com a sequência de ácidos nucleicos de um polinucleotídeo regulado pela latência selecionado a partir de SEQ ID NOS: 2, 4, 6, 8 e 57, ou um seu fragmento tendo pelo menos 21 nucleotídeos consecutivos do mesmo;
e (b) um segundo anticorpo, em que o dito segundo anticorpo li- ga um segundo antígeno micobacteriano que é diferente do dito primeiro antígeno micobacteriano.
Em uma modalidade, o dito primeiro anticorpo liga um primeiro antlgeno micobacteriano compreendendo uma sequência de poIipeptídeos antigênica micobacteriana como definia em (i). Em uma modalidade, o dito segundo anticorpo liga um segundo antígeno micobacteriano compreenden- do uma sequência de polipeptídeos antigênica micobacteriana como definida em (j) (em que o dito segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano é dife- rente do dito primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano). Em uma modalidade, a invenção proporciona um método para produzir uma formulação terapêutica ou profilática (por exemplo, vacina), o método compreendendo combinar o veículo farmaceuticamente aceitável com um primeiro anticorpo e um segundo anticorpo; em que o dito primeiro anticorpo liga um primeiro polipeptideo antigênico micobacteriano; em que o dito primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 7Õ°/o de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou 7, ou um seu fragmento tendo pelo
5 menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; e em que o dito segundo anticorpo liga um segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano, em que o dito segundo polipeptldeo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência
10 de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 0 aminoácidos consecutivos da mesma.
Em uma modalidade, os ditos primeiro e segundo anticorpos es- - tão na forma de uma composição imunogênica da invenção, como definida acima. 15 Em uma modalidade do dito método, quaisquer das Iimitações descritas neste documento em relação aos ditos primeiro e/ou segundo anti- corpos (ou anticorpos adicionais) (ou aos antígenos micobacterianos aos quais eles se ligam) se aplicam igualmente ao dito método.
Em uma modalidade, o método adicionalmente compreende
20 combinar o dito veículo farmaceuticamente aceitável e os anticorpos (ou a composição imunogênica) com um ou mais de um sal, excipiente, diluente, adjuvante, agente imunorregulador e/ou composto antimicrobiano.
Conforme usada neste documento, uma "vacina" é uma fomula- ção que, quando administrada a um paciente animal, tal como um mamífero
25 (por exemplo, um paciente humano, bovino, suíno, ovino, caprino, equino, corvino, canino ou felino), estimula uma resposta imune protetora contra a infecção micobacteriana.
A resposta imune pode ser uma resposta imune humoral e/ou mediada por célula (por exemplo, uma resposta de células T). Uma vacina da invenção pode ser usada, por exemplo, para proteger um
30 animal dos efeitos da invenção micobacteriana (por exemplo, infecção por M, tuberculosis), tal como uma infecção no estágio inicial.
A imunogenicidade dos epítopos do primeiro e do segundo antí-
genos micobacterianos (por exemplo, polipeptídeos) da invenção podem ser aumentada preparando-os em sistemas de mamíferos ou Ieveduras fundidos com, ou unidos com, proteínas formadoras de partículas, tais como, por e- xemplo, aquela associada com o antígeno de superfície de hepatite B. Em 5 uma modalidade, a vacina compreende pelo menos um polipeptídeo mico- bacteriano que tenha sido tratado com um agente químico modificador (tal como o formaldeído) para dar uma vacina de eficácia aperfeiçoada. Os polipeptldeos (incluindo os anticorpos) e/ou os polinucleotí- deos da invenção podem ser formulados em uma vacina como formas neu- lO trais ou de sais. Os sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de
P adição de ácidos formados com ácidos inorgânicos, tais como, por exemplo, os ácidos clorídrico ou fosfórico, ou com ácidos orgânicos, tais como acético, 0 oxálico, tartárico, maleico, e similares. Os sais formados com os grupos car- boxila livres podem também ser derivados de bases inorgânicas, tais como, 15 por exemplo, os hidróxidos de sódio, potássio, amônio, cálcio, ou férricos, e tais bases orgânicas como a isopropilamina, a trimetilamina, o 2-etilamino etanol, a histidina, a procaína, e similares. A administração de formulações terapéuticas, medicamentos e formulações profiláticas (por exemplo, vacinas) é, em geral, por rotas con- 20 vencionais, por exemplo, rotas intravenosas, subcutâneas, intraperitoneais, ou mucosas. A administração pode ser por injeção parenteral, por exemplo, uma injeção subcutânea ou intramuscular. As formulações que compreen- dem anticorpos neutralizadores podem ser particularmente adequadas para a administração de modo intravenoso, intramuscular, intradérmico, ou subcu- 25 tâneo. Consequentemente, as formulações terapêuticas, os medica- mentos e as formulações profiláticas (por exemplo, as vacinas) da invenção são tipicamente preparados como injetáveis, ou como soluções líquidas ou como suspensões. As formas sólidas, adequadas para a solução em, ou a 30 sLlspensão em, Iíquido antes da injeção podem alternativamente ser prepa- radas. A preparação pode também ser emulsificada, ou o peptídeo encapsu- ' lado em lipossomos ou microcápsulas.
Os ingredientes imunogênicos ativos são frequentemente mistu- rados com excipientes, os quais são farmaceuticamente aceitáveis e compa- tíveis com o ingrediente ativo. Os excipientes adequados são, por exemplo, a água, a solução saiina, a dextrose, o glicerol, o etanol, ou similar, e as su- as combinações. Além disso, se desejado, a vacina pode conter quantidades pequenas de substâncias auxiliares, tais como agentes molhantes ou emul- sificantes, agentes de tamponamento do pH, e/ou adjuvantes, os quais au- mentam a eficácia da vacina. Geralmente, o velculo é um veículo farmaceuticamente aceitá- lO vel. Os exemplos não limitativos de velculos farmaceuticamente aceitáveis incluem a água, a soIução salina, e a solução salina tamponada com fosfato. Em algumas modalidades, entretanto, a composição está na forma Iiofiliza- da, em cujo caso ela pode incluir um estabilizante, tal como a BSA. Em al- gumas modalidades, pode ser desejável formular a composição com um conservante, tal como o tiomersal ou a azida sódica, para facilitar a armaze- nagem de longa duração. Os exemplos de adjuvantes que podem ser efetivos incluem, po- rém não estão limitados ao: adjuvante de Freund completo (CFA), adjuvante de Freund incompleto (IVA), Saponina, uma fração de extrato purificada de Saporina, tal como Quil A, um derivado de Saporina, tal como QS-21, parti- culas lipídicas baseadas em Saponina, tais como ISCOM/ISCOMATIX, mu- tantes de toxinas instáveis (LT) ao calor de E. CO//, tais como LTK63 e/ou LTK72, hidróxido de alumínio, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr- MDP), N-acetil-nor-muramil-L-alanikD-isoglutamina (CGP 11637, referido como nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alani!-D-isoglutaminikL-alanina-2-(1',2'- dipalmitoil-sn-g1icerok3-hidroxifosforil óxi)-etilamina (CGP 19835A, referida c'omo MTP-PE), e RIBI, que contém três componentes extraídos de bacté- rias, monofosforil lipídio A, trealose dimicolato e esqueleto da parede celular (MPL+TDM+CWS) em uma emulsão de 2 °/) de esqualenol Tween 80.
Os exemplos de agentes de tamponamento incluem, porém não estão limitados ao succinato de sódio (pH 6,5), e solução salina tamponada com fosfato (PBS; pH 6,5 e 7,5).
As formulações adicionais que são adequadas para outros mo- dos de administração incluem os supositórios e, em alguns casos, as formu- lações orais ou as formulações adequadas para a distribuição como aeros- sóis. Para os supositórios, os aglutinantes e os veículos tradicionais podem incluir, por exemplo, os polialquileno glicóis ou os triglicerídeos; tais suposi- tórios podem ser formados a partir de misturas contendo o Íngrediente ativo na faixa de 0,5% a 1O°/o, preferivelmente 1°/,-2°/,. As formulações orais incluem tais excipientes normalmente em- pregados como, -por exemplo, os graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio, e similares. Estas composições tomam a forma de soluções, sus- pensões, comprimidos, pÍlulas, cápsulas, formulações de liberação constan- te ou pós. No caso de uma infecção respiratória micobacteriana (por e- xemplo, uma infecção por M. tubercu/osis), a transmissão eficiente da com- posição terapêutica/profilática ou do medicamento para o local da infecção nos pulmões pode ser obtida por administração oral ou intranasal (i.n.). Es- tes modos de distribuição correspem quem à rota de distribuição de um uma infecção por M. tuberculosis. No caso das composições à base de anticor- pos, estes modos de distribuição asseguram que os anticorpos estejam pre- sentes no local da infecção para combater a bactéria antes dela tornar-se intracelular e também durante o período quando ela se espalha entre as cé- lulas. As formulações para a administração intranasal podem estar na forma de gotículas nasais ou um spray nasal. Uma formulação intranasal pode compreender gotículas tendo diâmetros aproximados na faixa de 100- 5000 µm, tal como 500-4000 µm, 1000-3000 µm ou 100-1000 µm. Alternati- vamente, em termos de volume, as gotículas podem estar na faixa de cerca de 0,001-100 µ1, tal como 0,1-50 µ1 ou 1,0-25 µ1, ou tal como 0,001-1 µ1.
Alternativamente, a formulação terapêutica/profilática ou o medi- camento pode ser uma formulação de aerossol. A formulação de aerossol pode tomar a forma de um pó, suspensão ou solução. O tamanho das partí-
culas de aerossol é relevante para a capacidade de distribuição de um ae- rossol.
As partículas menores podem deslocar-se mais longe, até a via aérea respiratória, na direção dos alvéolos, do que poderiam as partículas maiores.
Em uma modalidade, as partículas de aerossol têm uma distribuição do diâ- metro para facilitar a distribuição ao longo do comprimento inteiro dos brôn- quios, bronquíolos, e alvéolos.
Alternativamente, a d istribuição de tamanho de partícula pode ser selecionada para alvejar uma parte particular da via aérea respiratória, por exemplo, os alvéolos.
No caso da distribuição do me- dicamento por aerossol, as partículas podem ter diâmetros na faixa aproxi- lO mada de 0,1-50 µm, preferivelmente 1-25 µm, mais preferivelmente 1-5 µm.
As partículas de aerossol podem ser para a distribuição usando um nebulizador (por exemplo, por meio da boca) ou spray nasal.
Uma formu- lação de aerossol pode opcionalmente conter um propulsor e/ou um tensoa- tivo.
É possÍvel que, após a distribuição i.n. dos antigenos ou dos an- ticorpos micobacterianos, a sua passagem para os pulmões seja facilitada por um fluxo invertido de secreções mucosas, embora se acredite que a a- ção mucociliar no trato respiratório remova as partículas dentro do muco dos pulmões.
A persistência relativamente longa na lavagem do pulmão, a rápida depuração da bile e a ausência de transporte para a saliva de alguns anti- corpos sugerem a função dos mecanismos mucosos especificos para d lo- cal.
Pelo controle do tamanho das gotículasl partículas para aproxi- madamente a faixa definida da presente invenção, é possÍvel evitar (ou mi- nimizar) a distribuição de antígeno acidental para os alvéolos e, desse modo, evitar os problemas patológicos associados com os alvéolos, tais como a inflamação e as cicatrizes fibróticas dos pulmões.
A vacinação i.n. emprega os mecanismos efetores mediados tanto pelas células T quanto B nos tecidos mucosos nasais e associados aos brônquios, que diferem de outros tecidos Iinfoides associados às mucosas.
Os mecanismos protetores invocados pela rota de administração intranasal podem incluir: a ativação de linfócitos T com residência no pulmão preferen-
cial; a suprarregulação de moléculas coestimuladoras (por exemplo, B7.2); e/ou a ativação de macrófagos de anticorpos IgA secretórios.
A distribuição intranasal de antígenos pode facilitar a invocação de uma resposta mucosa de anticorpo, que é favorecida por uma alteração na resposta das células T para o fenótipo Th2, que auxilia a produção de anticorpos.
Uma resposta mucosa é caracterizada por produção aumentada de lgA, e uma resposta de Th2 é caraderizada por produção aumentada de IL-4. A distribuição intranasal de antígenos micobacterianos da inven- lO ção permite o alvejamento dos antígenos para as células B submucosas do sistema respiratório.
Estas células B são as células produtoras de lgA locais principais nos mamíferos e a distribuição intranasal facilita um aumento rápi- do na produção de lgA por estas células contra os antígenos micobacteria-
nos.
Em uma modalidade, a formulação terapêutica/profilática ou o medicamento da invenção estimula uma resposta imune mucosa e/ou de Th2. Em outra modalidade, a produção do anticorpo lgA é estimulada, e o anticorpo lgA se liga ao antígeno micobacteriano.
Em uma modalidade, o primeiro e o segundo antígenos ou anti- corpos micobacterianos (e os antígenos ou anticorpos micobacterianos adi- cionais opcionais) da invenção são para a administração simultânea.
Desse modo, em uma modalidade, os métodos/usos da inven- ção compreendem a administração simultânea dos primeiro e segundo antí- genos micobacterianos (e dos antígenos micobacterianos adicionais opcio- nais). Em uma modalidade, os métodos/usos da invenção compreendem a administração simultânea dos primeiro e segundo anticorpos micobacteria- nos (e dos anticorpos micobacterianos opcionais adicionais). A administração simultânea significa a administração (substanci- almente) ao mesmo tempo.
Por exemplo, em uma modalidade, o primeiro e o segundo antígenos micobacterianos (e os antígenos micobacterianos op- cionais adicionais) são administrados ao paciente dentro de 5 minutos um do outro, tal como dentro de 4, 3, 2 ou 1 minuto um do outro, por exemplo, den-
tro de 30 segundos um do outro.
Em uma modalidade da 'administração simultânea', os pelo me- nos dois componentes (isto é, os antígenos ou os anticorpos) da invenção são combinados em uma composição (por exemplo, uma única composição antigênica ou composição imunogênica da invenção, como definida neste documento). Esta composição é administrada ao paciente (tal como um mamífero - por exemplo, um paciente humano, bovino, suíno, ovino, caprino, equino, corvino, canino ou felino), corn isso propiciando ambos os compo- nentes para o paciente simultaneamente.
Em uma modalidade alternativa da 'administração simultânea', pelo menos dois dos componentes (isto é, os antígenos ou os anticorpos) da invenção são proporcionados separadamente um do outro, porém são admi- nistrados ao paciente (tal como um mamífero - por exemplo, um paciente humano, bovino, suíno, ovino, caprino, equino, corvino, canino ou felino)
(substancialmente) ao mesmo tempo.
A administração simultânea/paralela das ditas composições separadas propicia ambos os componentes para o paciente (substancialmente) ao mesmo tempo.
A título de exemplo, a formu- lação terapêutica ou profilática (por exemplo, vacina) da invenção pode compreender um primeiro antígeno ou anticorpo micobacteriano em uma primeira composição e o segundo antígeno ou anticorpo micobacteriano em uma segunda composição.
Em uma modalidade, o primeiro e o segundo antígenos ou anti- corpos micobacterianos (e os antígenos ou os anticorpos micobacterianos opcionais adicionais) da invenção são para a administração simultânea
(substancialmente) no mesmo local.
Desse modo, em uma modalidade, os métodos/usos da invenção compreendem a administração simultânea do primeiro e do segundo antígenos micobacterianos (e dos antígenos micobac- terianos opcionais adicionais) (substancialmente) no mesmo local.
Em uma modalidade, os métodos/usos da invenção compreendem a administração simultânea do primeiro e do segundo anticorpos micobacterianos (e dos an- ticorpos m icobacterianos opcionais adicionais) (substanciaimente) no mes- mo local.
Com relação a isto, considera-se vantajoso administrar cada componente antigênico diferente das vacinas multivalentes convencionais . em diferentes locais do corpo do paciente, para estimular diferentes linfono- dos. A administração de diferentes componentes antigênicos das vacinas multivalentes convencionais em diferentes locais é também considerada vantajosa para reduzir ou evitar a competição antigênica indesejável. Em uma modalidade, a presente invenção vantajosamente evita a necessidade de administrar cada componente antigênico diferente a dife- rentes locais/posições do corpo do paciente. Com relação a isto, em uma modalidade, o primeiro e o segundo antígenos (e os antígenos opcionais adicionais) da presente invenção (substancialmente) não competem um com o outro, ou estão associados com níveis relativamente baixos de competição antigênica, em comparação com o efeito competitivo que poderia ter sido esperado em vista das composições das vacinas multivalentes conhecidas.
Se os pelo menos dois componentes (isto é, antígenos ou anti- corpos) da invenção forem combinados em uma única composição (por e- xemplo, uma única composição antigênica ou composição imunogênica da invenção, como definida neste documento), é evidente que todos os compo- nentes da invenção são administrados ao paciente no mesmo Iocal. Em uma modalidade, se o primeiro e o segundo antígenos ou anticorpos micobacterianos (e os antígenos ou os anticorpos micobacteria- nos opcionais adicionais) da invenção forem proporcionados separadamente um do outro, para a administração paralela, simultânea, ao paciente (subs- tancialmente) ao mesmo tempo, as composições separadas são administra- das no mesmo (ou substancialmente no mesmo) Iocal sobre o/no paciente. Em uma modalidade, a administração (substancialmente) no mesmo local sobre o/no paciente significa que o local no qual cada antígeno ou anticorpo micobacteriano da invenção é administrado é na vizinhança do, ou está em proximidade estrita com o local no qual os outros antígenos ou anticorpos micobacterianos da invenção são administrados. Alternativamen- te, a administração (substancialmente) no mesmo local sobre o/no paciente significa que o local no qual o cada antígeno ou anticorpo micobacteriano da invenção é administrado está no local exato no qual os outros antígenos ou anticorpos micobaderianos da invenção são administrados. A título de exemplo, o primeiro e o segundo antígenos ou anti- corpos micobacterianos (e os antígenos ou os anticorpos micobacterianos opcionais adicionais) da invenção podem ser para a administração à mesma veia, artéria OLl músculo do paciente, ou por meio da mesma narina do paci- ente, ou ao mesmo membro (por exemplo, braço) do paciente (por exemplo, ao mesmo braço superior do paciente); ou o primeiro e o segundo antígenos ou anticorpos micobacterianos (e os antígenos ou os anticorpos micobacte- lO rianos opcionais adicionais) da invenção podem todos ser para a administra- ção oral ou sublingual. Em uma modalidade, o primeiro e o segundo antíge- nos ou anticorpos micobacterianos (e os antígenos ou os anticorpos mico- bacterianos opcionais adicionais) da invenção podem todos ser para a admi- nistração no, ou em proximidade estrita ao, mesmo linfonodo.
Alternativamente, os antígenos ou os anticorpos micobacteria- nos da invenção são para a administração ao paciente (por exemplo, um mamífero, tal como um paciente humano, bovino, suíno, ovino, caprino, e- quino, coMno, canino ou felino) sequencialmente (isto é, um após o outro). Nesta modalidade, pelo menos dois dos componentes (isto é, os antígenos ou os anticorpos) da invenção são proporcionados separadamente um do outro, e são administrados sequencialmente ao paciente. A título de exemplo, a formulação terapêutica ou profilática (por exemplo, a vacina) da invenção pode compreender um primeiro antígeno ou anticorpo micobacteriano em uma primeira composição e o segundo antíge- no ou anticorpo micobacteriano em uma segunda composição. A administra- ção sequencial das ditas primeira e segunda composições propicia ambos os componentes para o paciente, um após o outro. Desse modo, em uma modalidade, os métodos da invenção compreendem a administração do primeiro antígeno micobacteriano, e então a administração do segundo antígeno micobacteriano. Alternativamente, o segundo antígeno micobacteriano pode ser administrado e então o primeiro antígeno micobacteriano é administrado. Quaisquer antigenos micobacteria-
nos adicionais podem ser administrados juntamente com o primeiro e/ou o segundo antígenos micobacterianos.
Alternativamente, quaisquer antígenos micobacterianos adicionais podem ser administrados antes ou depois do primeiro elou do segundo antígenos micobacterianos.
Em uma modalidade, os métodos da invenção compreendem a administração do primeiro anticorpo micobacteriano, e então a administração do segundo anticorpo micobacteriano.
Alternativamente, o segundo anticor- po micobacteriano pode ser administrado e então o primeiro anticorpo mico- bacteriano é administrado.
Quaisquer anticorpos micobacterianos adicionais podem ser administrados juntamente com o primeiro e/ou o segundo anti- corpos micobacterianos.
Alternativamente, quaisquer anticorpos micobacte- rianos adicionais podem ser administrados antes ou depois do primeiro e/ou do segundo anticorpos micobacterianos.
Em uma modalidade, cada administração sequencial de antíge- no/anticorpo é feita imediatamente uma após a outra.
Em uma modalidade, há um intervalo de tempo ou pausa entre uma ou mais (por exemplo, entre cada uma) das administrações.
Um intervalo de tempo ou pausa entre as administrações sequenciais pode ser pelo menos 5, 10, 15, ou 30 minutos, ou pode ser pelo menos 1, 2, 5, 12, 18 ou 24 horas, ou pode ser pelo menos
1, 2, ou 5 dias, ou pode ser pelo menos 1 ou 2 semanas.
Em uma modalidade, o primeiro e o segundo antlgenos ou anti- corpos micobacterianos (e os antígenos ou os anticorpos micobacterianos opcionais adicionais) da invenção são para a administração sequencial (substancialmente) no mesmo local.
Desse modo, em uma modalidade, os métodos/usos da invenção compreendem a administração sequencial do . primeiro e do segundo antigenos micobacterianos (e dos antígenos micobac- terianos opcionais adicionais) (substancialmente) no mesmo local.
Em uma modalidade, os métodos/usos da invenção compreendem a administração sequencial do primeiro e do segundo anticorpos micobacterianos (e dos an-
ticorpos micobacterianos opcionais adicionais) (substancialmente) no mes- mo local.
Em uma modalidade, a administração (substancialmente) no mesmo local sobre o/no paciente significa que o local no qual cada antígeno ou anticorpo micobacteriano da invenção é administrado é na vizinhança do, ou está em proximidade estrita com o local no qual os outros antígenos ou anticorpos micobacterianos da invenção são administrados. Alternativamen- 5 te, a administração (substancialmente) no mesmo local sobre o/no paciente significa que o local no qual o cada antígeno ou anticorpo micobacteriano da invenção é administrado está no local exato no qual os outros antígenos ou anticorpos micobacterianos da invenção são administrados. A título de exemplo, o primeiro e o segundo antígenos ou anti- lO corpos micobacterianos (e os antígenos ou os anticorpos micobacterianos
B opcionais adicionais) da invenção podem ser para a administração à mesma veia, artéria ou músculo do paciente, ou por meio da mesma narina do paci- . ente: ou ao mesmo membro (por exemplo, braço) do paciente (por exemplo, ao mesmo braço superior do paciente); ou o primeiro e o segundo antígenos 15 ou anticorpos micobacterianos (e os antígenos ou os anticorpos micobacte- rianos opcionais adicionais) da invenção podem todos ser para a administra- ção oral ou sublingual. Em uma modalidade, o primeiro e o segundo antíge- nos ou anticorpos micobacterianos (e os antígenos ou os anticorpos mico- bacterianos opcionais adicionais) da invenção podem todos ser para a admi- 20 nistração no, ou em proximidade estrita ao, mesmo linfonodo. A formulação terapêutica, o medicamento ou a formulação profi- lática (por exemplo, uma vacina) da invenção pode ser dada em um progra- ma de uma única dose (isto é, a dose inteira é dada substancialmente uma vez). Alternativamente, a formulação terapêutica, o medicamento ou a for- 25 mulação profilática (por exemplo, uma vacina) da invenção pode ser dada em um programa de múltiplas doses. Um programa de múltiplas doses é um no qual um curso primá- rio de tratamento (por exemplo, vacinação) pode ser com 1-6 doses separa- das, seguidas por outras doses dadas em intervalos de tempo subsequen- 30 tes, requeridos para manter e ou reforçar a resposta imune, por exemplo (para os pacientes humanos), em 1-4 meses para uma segunda dose, e se necessário, (uma) dose(s) subsequente(s) após uns 1-4 meses mais.
O regime de dosagem será determinado, pelo menos em parte, pela necessidade do indivíduo e será dependente do julgamento do profis- sional (por exemplo, médico ou veterinário). Em uma modalidade, a vacina da presente invenção pode ser 5 administrada como parte de um regime de vacinação de 'início-reforço'. Os regimes de vacinação de início-reforço envolvem: a Pré- ativação - isto é, expor um paciente a um ou mais antigenos ou uma vacina; e subsequentemente: o Reforço - isto é, expor o paciente a um ou mais antí- genos ou uma vacina.
Os antígenosl a vacina 'de reforço' é tipicamente dife- lO rente dos antígenosl da vacina 'iniciadora' (conhecida como início-reforço " "heterólogo"). Com relação a isto, as estratégias de imunização por início- reforço heterólogo têm sido mostradas induzir níveis maiores de respostas de células imunes (por exemplo, respostas de células T efetoras) nos paci- entes, comparadas com o reforço homólogo com a mesma vacina.
Por e- 15 xemplo, a vacinação repetida com as vacinas convencionais, tais como a BCG, não parece aumentar mais a proteção contra a TB.
Entretanto, a in- corporação da BCG em um regime de início-reforço heterólogo pode manter os efeitos protetores da BCG.
Consequentemente, em uma modalidade, a invenção proporcio- 20 na um método de vacinação contra a infecção micobacteriana que compre- ende 'iniciar' o sistema imune de um paciente por administração de uma va- cina convencional heteróloga (por exemplo, a vacina BCG) e então 'reforçar' o sistema imune do paciente por administração da vacina da presente inven- ção.
Em uma modalidade, a invenção proporciona um método de vacinação 25 contra a infecção micobacteriana que compreende administrar a vacina da presente invenção a um paciente que tenha sido pré-exposto a uma vacina convencional heteróloga, tal como a BCG.
Altemativamente, o sistema imune de um paciente pode ser 'ini- ciado' por administração da vacina da presente invenção, e então 'reforçado' 30 por administração de uma vacina convencional heteróloga (por exemplo, a vacina BCG). Consequentemente, em uma modalidade, a vacina é adminis- trada a um paciente que é subsequentemente para ser exposto a uma vaci-
na convencional heteróloga, tal como a BCG.
A etapa de 'pré-ativação' pode ser realizada sobre o paciente em qualquer idade - no caso dos pacientes mamíferos (por exemplo, os pacien- tes humanos, bovinos, suínos, ovinos, caprinos, equinos, cervinos, caninos ou felinos), a pré-ativação com a BCG é convencionalmente realizada de modo neonatal, ou durante a infância, a adolescência ou a idade adulta.
A etapa de 'reforço' pode ser realizada em qualquer tempo após a etapa de 'pré-ativação'. No caso dos pacientes mamíferos (por exemplo, os pacientes humanos, bovinos, suínos, ovinos, caprinos, equinos, cervinos, caninos ou felinos), uma etapa de reforço pode ser realizada pelo menos aproximada- mente 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 semanas após a etapa de pré-ativação, ou pelo menos cerca de 3, 6, 8 ou 12 meses após a etapa de pré-ativação, ou pelo menos cerca de 2, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, ou 40 ou mais anos a- pós a etapa de reforço.
Em uma modalidade, para um paciente humano, a etapa de pré-ativação é realizada durante a infância e a etapa de reforço é realizada durante a adolescência, Em uma modalidade, a formulação terapêutica, o medicamento ou a formulação profilática (por exemplo, uma vacina) da invenção pode ser administrada a um paciente, tal como um mamífero (por exemplo, um paci-
ente humano, bovino, suíno, ovino, caprino, equino, corvino, canino ou feli- no), em conjunção com (simultânea ou sequencialmente) um ou mais agen- tes imunorreguladores selecionados a partir de, por exemplo, imunoglobuli- nas, antibióticos, interleucinas (por exemplo, IL-2, IL-12), e/ou citocinas (por exemplo, lFNy). Em uma modalidade, a formulação terapêutica, o medicamento ou a formulação profilática (por exemplo, uma vacina) da invenção pode ser administrada a um paciente, tal como um mamífero (por exemplo, um paci- ente humano, bovino, suíno, ovino, caprino, equino, corvino, canino ou feli- no), em conjunção com (simultânea ou sequencialmente) um ou mais com-
postos antimicrobianos, tais como os fármacos antituberculose convencio- nais (por exemplo, rifampicina, isoniazid, etambutol ou pirizinamida). A formulação terapêutica, o medicamento ou a formulação profi-
Iática (por exemplo, vacina) pode conter 5°/0 a 95% de ingrediente ativo, tal como pelo menos 1O°/o ou 25°6 de ingrediente ativo, ou pelo menos 40°6 de ingrediente ativo ou pelo menos 50, 55, 60, 70 ou 75% de ingrediente ativo.
A formulação terapêutica, o medicamento ou a formulação profi-
lática (por exemplo, uma vacina) é administrada em um modo compatível com a formulação de dosagem, e em tal quantidade como será profilática e/ou terapeuticamente efetiva.
Com relação a isto, conforme usada neste documento, uma "quantidade efetiva" é uma dosagem ou quantidade que é suficiente para obter um resultado biológico desejado, Conforme üsada neste documento, uma "quantidade terapeuticamente efetiva" é uma quantidade que é efetiva, com a administração de uma única dose ou de doses múltiplas a um pacien- te (tal como um mamífero - por exemplo, um paciente humano, bovino, suí- no, ovino, caprino, equino, corvino, canino ou felino), para tratar, prevenir,
curar, retardar, reduzir a gravidade de, melhorar pelo menos um sintoma de um distúrbio ou distúrbio recorrente, ou prolongar a sobrevivência do pacien- te mais do que esperada na ausência de tal tratamento.
Desse modo, a quantidade de ingrediente ativo a ser administra- do, que está geralmente na faixa de 5 microgramas a 250 microgramas. de antígeno por dose (ou maior, se liberado oralmente ou na forma de vetores virais), depende do paciente a ser tratado, da capacidade do sistema imune do paciente de gerar uma resposta imune protetora, e do grau de proteção desejada.
As quantidades exatas de ingrediente ativo requerido a ser admi- nistrado podem depender do julgamento do profissional e podem ser particu- lares para cada paciente.
De acordo com um aspecto adicional da invenção, o primeiro e o segundo antígenos micobacterianos (e os antígenos micobacterianos adicio- nais opcionais) da invenção, como descritos neste documento, são úteis em imunoensaios para detectar a presença em uma amostra de teste dos anti-
corpos para os ditos primeiro e segundo antígenos micobacterianos.
Em uma modalidade, os ditos primeiro e segundo antígenos micobacterianos (e os antígenos adicionais opcionais) são usados na forma de uma composição antigênica, conforme descrita neste documento.
De acordo com outro aspecto da invenção, o primeiro e o se- gundo anticorpos (e os anticorpos adicionais opcionais) da invenção, como descritos neste documento, são úteis em imunoensaios para detectar a pre- sença em uma amostra de teste dos ditos primeiro e segundo antígenos mi- cobacterianos.
Em uma modalidade, os ditos primeiro e segundo anticorpos (e os anticorpos adicionais opcionais) são usados na forma de uma compo- sição que contém anticorpo, imunogênica, conforme descrita neste docu- mento.
Uma amostra de teste pode ser uma amostra biológica, tal como uma amostra clínica ou amostra ambiental.
Conforme usada neste documen- to, uma 'amostra clínica' refere-se a uma amostra de tecido ou fluido isolado de um indivíduo, incluindo, porém não limitado ao, por exemplo, plasma, so- ro, fluido espinhal, fluido da linfa, às partes externas da pele, tratos respirató- rios, intestinais, e geniturinários, lágrimas, saliva, leite, células sanguíneas, tumores, órgãos, e também às amostras dos constituintes da cultura de célu- las in vitro (incluindo, porém não Iimitados ao meio condicionado resultante do crescimento de células no meio de cultura de células, células putativa- mente infectadas, células recombinantes, e componentes das células). No contexto dos métodos diagnósticos discutidos abaixo, um 'paciente' é qualquer paciente animal que se beneficiaria da detecção da infecção micobaderiana, tal como a infecção por M. tuberculos/s.
Os pacien- tes animais típicos são os mamlferos, por exemplo, os pacientes humanos, bovinos, suínos, ovinos, caprinos, equinos, corvinos, caninos ou felinos.
Em uma modalidade, o paciente é humano, bovino, suíno ou equino.
O projeto do imunoensaio está sujeito a muita variação, e muitos formatos são conhecidos na técnica.
Os protocolos podem ser baseados, por exemplo, na competição, na reação direta, ou em ensaios do tipo im- prensar.
Os protocolos podem também, por exemplo, usar suportes sólidos, ou podem empregar imunoprecipitação.
A maior parte dos ensaios envolve o uso de anticorpos ou polipeptídeos marcados; as marcas podem ser, por exemplo, enzimáticas, fluorescentes, quimioiuminescentes, radioativas, ou moléculas de corantes.
Os ensaios que compreendem a amplificação do sinal são também conhecidos; por exemplo, os ensaios que utilizam biotina e avidina, ou os imunoensaios marcados e mediados por enzimas, tais como os ensaios ELISA.
Em um aspecto da invenção, os primeiro e segundo antígenos micobacterianos (ou a composição antigênica) da invenção são úteis para detectar a presença de um Iinfócito T que tenha sido previamente exposto a um componente antigênico de uma infecção micobacteriana em um pacien- te.
Desse modo, em uma modalidade, a invenção proporciona um método in vitro de diagnosticar uma infecção micobacteriana, tal como uma infecção micobacteriana no estágio inicial, compreendendo incubar ('desafi- ar') uma amostra de teste contendo uma célula imune, tal como um linfócito T, de um paciente (por exemplo, um mamífero, tal como um paciente huma- no, bovino, suíno ou equino), com um primeiro antígeno micobacteriano da invenção e um segundo antígeno micobacteriano da invenção, como defini- dos neste documento; ou uma composição antigênica da invenção, como definida neste documento; e detectar a ativação da dita célula imune (por exemplo, linfócito T). A ativação da dita célula imune é indicativa de uma infecção micobacteriana no paciente.
Em uma modalidade do dito métoclo in vitro, o dito primeiro antí- geno micobacteriano é selecionado a partir de (i) um primeiro poIipeptídeo antigênico micobacteriano compreendendo uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou 7, ou um seu fragmento ten- do pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; ou (ii) uma primeira sequência de polinucleotídeos micobacterianos compreendendo uma se- quência de po|inUc|eotÍdeos codificando o dito primeiro polipeptídeo antigê- nico micobacteriano.
Em uma modalidade do dito método ln vitro, o dito se-
gundo antígeno micobacteriano é selecionado a partir de (iii) um segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano compreendendo uma sequência de poIipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de amino-
ácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, ou um seu frag- mento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; ou (iv) uma segunda sequência de polinucleotÍdeos micobacterianos compreen- dendo uma sequência de poHnucleotídeos codificando o dito segundo poIi- peptldeo antigênico micobacteriano.
Uma célula imune, tal como um linfócito T, que tenha sido previ- amente exposta a um ou a ambos o primeiro e o segundo antígenos mico- bacterianos tornar-se-á 'ativada' no desafio subsequente pelo mesmo antí- geno.
Como tal, a ativação da dita célula imune (por exemplo, o linfócito T) é indicativa de uma infecção micobacteriana no paciente, e proporciona um meio para identificar um diagnóstico positivo da infecção micobacteriana.
Em contraste, a mesma ativação não é atingida por uma célula imune (por e- xemplo, o linfócito T) que não tenha sido previamente exposta ao antígeno particular.
A 'ativação' acima descrita de uma célula imune (por exemplo, o linfócito T) é algumas vezes referida como uma 'resposta de lembrança' e pode ser medida, por exemplo, determinando a liberação de interferon '(por exemplo, o lFN-y) da célula imune ativada (por exemplo, o linfócito T). Desse modo, a presença de uma infecção micobacteriana em um paciente pode ser determinada por detecção da ativação da célula imune (por exemplo, o linfóciot T) em resposta a um desafio in vitro com o primeiro e o segundo antígenos micobacterianos (ou composição antigênica) da pre- sente invenção - por exemplo, por detecção da liberação de uma concentra- ção mínima de interferon da célula imune (por exemplo, linfócito T) após um período de tempo definido seguindo o desafio.
O ensaio diagnóstico da célula imune (por exemplo, linfócito T) acima mencionado pode adicionalmente incluir uma célula apresentadora de antigeno (APC) que expressa pelo menos uma molécula de complexo de histocompatibilidade principal (MHC) classe ll expressa pelo paciente em questão.
A APC pode ser inerentemente proporcionada na amostra biológi- ca, ou pode ser adicionada de modo exógeno.
Em uma modalidade, o linfó- cito T é um linfócito T CD4.
Os ensaios alternativos para diagnosticar a infecção micobacte- riana dependem da detecção dos anticorpos para o primeiro e o segundo antígenos micobacterianos (por exemplo, polipeptídeos) da invenção.
Tais ensaios podem compreender a etapa de incubar uma amostra de teste (por exemplo, uma amostra biológica) suspeita de conter os anticorpos com os - ditos primeiro e segundo antigenos (ou composição antigênica) da invenção.
Consequentemente, a invenção também proporciona um método in vltro de diagnosticar uma infecção micobacteriana, tal como uma infecção micobacteriana no estágio inicial, compreendendo incubar uma amostra de teste de um paciente (por exemplo, um mamífero, tal como um paciente hu- mano, bovino, suíno ou ecjuino) com um primeiro antígeno micobacteriano e um segundo antígeno micobacteriano da invenção, como definidos neste documento: ou uma composição antigênica da invenção, como definida nes- te documento; em que a dita incubação é efetuada sob condições que permi- tam a ligação dos ditos primeiro e segundo antígenos micobacterianos com os anticorpos na amostra, para formar complexos de antígenos-anticorpos; e então detectar a formação de tais complexos.
A presença de complexos de antígenos-anticorpos é indicativa de uma infecção micobacteriana no pacien-
te.
Em uma modalidade do dito método in vitro, o dito primeiro antí- geno micobacteriano é selecionado a partir de (i) um primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano compreendendo uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou 7, ou um seu fragmento ten- do pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; ou (ii) uma primeira sequência de poIinucleotídeos micobacterianos compreendendo uma se- quência de polinucleotÍdeos codificando o dito primeiro polipeptídeo antigê- nico micobacteriano; e o dito segundo antígeno micobacteriano é seleciona- do a partir de (iii) um segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano com- preendendo uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de i- dentidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; e (iv) uma segunda sequência de polinucleotídeos micobacterianos compreendendo uma sequência de poIinucleotídeos codifi- cando o dito segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano.
Os complexos de antígenos-anticorpos (ou no caso dos ensaios competitivos, a quantidade de anticorpo competidor) podem ser detectados por quaisquer de diversas técnicas conhecidas, dependendo do formato.
Por exemplo, os anticorpos não marcados no complexo podem ser detectados usando um conjugado de lg antixenogênica formando complexo com uma marca (por exemplo, uma marca de enzima). O imunoensaio pode ser um tipo padrão ou competitivo.
Em uma modalidade, o primeiro e o segundo antígenos mico- bacterianos são ligados a um ou mais suportes sóIidos para facilitar a sepa- ração da amostra dos antígenos, após a incubação.
Os exemplos de supor- tes sólidos que podem ser usados são a nitrocelulose (por exemplo, na for- ma de membrana ou placa de microtltulo), o poli(cloreto de vinila) (por e- xemplo, em folhas ou poços de microtítulo), o Iátex de poliestireno (por e- xemplo, em glóbulos ou placas de microtítulo, poli(fluoreto de vinilidina) (co- nhecido como Immulon)), o papel diazotado, as membranas de nãilon, qs glóbulos ativados, e os glóbulos de Proteína A.
Por exemplo, as placas de microtítulo lmmulon da Dynatech ou os glóbulos de poliestireno de 60 mm de diâmetro (Precision Plastic Ball) podem'ser usados.
O(s) suporte(s) sólido(s) contendo o primeiro e o segundo antigenos micobacterianos é(São) tipica- mente lavado(s) após a sua separação da amostra de teste, e antes da de- tecção dos anticorpos ligados.
A invenção também inclui os imunoensaios para detectar a pre- sença do primeiro e do segundo antígenos micobacterianos (por exemplo, poiipeptídeos) da invenção em uma amostra de teste (por exemplo, uma amostra biológica). Em tais métodos, uma amostra de teste suspeita de con- ter os ditos antígenos micobacterianos pode ser incubada com os anticorpos dirigidos contra o primeiro e o segundo antígenos micobacterianos.
Consequentemente, a invenção proporciona um método in vitro de diagnosticar uma infecção micobacteriana, tal como uma infecção mico-
bacteriana no estágio inicial, compreendendo incubar uma amostra de teste de um paciente (por exemplo, um mamífero, tal como um paciente humano, bovino, suíno ou equino) com um primeiro anticorpo e um segundo anticorpo da invenção, como definidos neste documento; ou uma composição imuno-
gênica da invenção, como definida neste documento; em que a dita incuba- ção é efetuada sob condições que permitam a ligação dos ditos primeiro e segundo anticorpos com os antígenos na amostra, para formar complexos de antígenos-anticorpos; e então detectar a formação de tais complexos, em que a presença dos complexos de antígenos-anticorpos é indicativa de uma infecção micobacteriana no paciente.
Em uma modalidade do dito método in vitro, o dito primeiro anti- corpo liga um primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano, em que o dito primeiro poIipeptídeo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70°6 de identidade da sequência de ami- noácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 ou 7, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; e o dito segundo anticorpo liga um segundo polipeptídeo antigênico micobac- teriano, em que o dito segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano com- preende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identi- dade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos con- secutivos da mesma.
Pode ser desejável tratar a amostra biológica antes de testar, para liberar os componentes bacterianos putativos.
Podem ser empregados diversos formatos.
Por exemplo, pode ser empregado um "ensaio de im- prensar", em que os anticorpos ligados a um suporte sólido são incubados com a amostra de teste; lavados; incubados com os segundos anticorpos marcados para o primeiro e o segundo antígenos, e o suporte é Iavado no- vamente.
O primeiro e o segundo antígenos micobacterianos são detectados determinando se o segundo anticorpo está Iigado ao suporte.
Em um forma- to competitivo, uma amostra de teste é normalmente incubada com os anti- corpos e um antígeno competidor, marcado, é também incubado, de modo sequencial ou simultâneo.
Em um aspecto, a invenção proporciona um kit de imunoensaio, compreendendo uma composição antigênica da invenção, ou os anticorpos para os ditos primeiro e segundo antígenos micobacterianos.
O kit de imu- noensaio pode adicionalmente compreender um tampão.
O termo "poIipeptldeo", por todo este relatório descritivo, é sinô- nimo com os termos "oligopeptideo", "peptídeo" e "proteína". Estes termos são usados de modo intercambiável e não se referem a um comprimento especifico clo produto.
Estes termos incluem as modificações pós- lO traducionais, tais como a glicosijação, a acetilação e a fosforilação.
Em uma modalidade, os poIipeptídeos isolados da invenção es- tão substancialmente livres de outras proteínas com as quais eles são co- produzidos, bem como de outros contaminantes.
Por exemplo, um polipeptí- deo isolado está substancialmente livre de material ou outras proteínas da fonte celular, bacteriana, ou tecidual a partir da qual ele foi derivado.
Conforme usada neste documento, uma molécula "purificada" está substancialmente livre de seu meio original e está suficientemente pura para uso em composições farmacêuticas.
Um polipeptídeo substancialmente puro, como usado neste documento, refere-se a um polipeptídeo que é pelo menos cerca de 50% (p/p) puro; ou pelo menos cerca de 60%, 70°6, 80%, 85%, 90°6 ou 95% (p/p) puro; ou pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, ou 100% (p/p) puro.
Os polipeptídeos da presente invenção podem ser purificados a partir de micobactérias, ou podem ser purificados a partir de outros tipos de células que expressem estes peptídeos (por exemplo, porque eles são trans- formados com ácidos nucleicos recombinantes que codificam estes peptí- deos). O polipeptídeo expresso pode ser purificado, por exemplo, através de uma combinação de cromatografia de interação hidrofóbica, cromatografia de troca iônica e cromatografia de hidroxil apatita cerâmica.
Podem ser usa- das outras práticas cromatográficas bastante conhecidas na técnica de puri- ficação de proteínas, tais como a cromatografia por exclusão de tamanho.
A pureza ou a homogeneidade do polipeptídeo pode ser indicada, por exem-
plo, através de eletroforese em gel de poliacrilamida de uma amostra de pro- teína, seguida por visualização de uma única banda de polipeptídeo com o tingimento do gel, ou usando HPLC.
Os polipeptídeos da invenção geralmente serão solúveis ou pre- dominantemente solúveis (por exemplo, pelo menos cerca de 70°6, 75%, 80°6, 85°6, 9O°/j, 95%, 97°6, 98%, ou mesmo 99% solúveis). A presente invenção inclui os polipeptídeos que são substanci- almente homólogos a um poIipeptÍdeo baseado em qualquer uma das SEQ ID NOS de referência, indicadas neste pedido (incluindo os seus fragmen- lO tos). Os termos "identidade da sequência" e "homologia da sequência" são considerados sinônimos neste relatório descritivo.
A tltulo de exemplo, um polipeptídeo de interesse pode compre- ender uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 70, 75, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98, 99 ou 100% de identidade da sequência de ami- noácidos com a sequência de aminoácidos de um polipeptídeo de referên- cia.
Existem muitos algoritmos estabelecidos, disponíveis para ali- nhar duas sequências de aminoácidos.
Tipicamente, uma sequência atua como uma sequência de refe- rência, com a qual as sequências de teste podem ser comparadas.
O algo- ritmo de comparação das sequências calcula a porcentagem de identidade da sequência para a(s) sequência(s) de teste em relação à sequência de referência, com base nos parâmetros do programa especificados.
O alinha- mento das sequências de aminoácidos para a comparação pode ser condu- zido, por exemplo, através dos algoritmos implementados de computador (por exemplo, GAP, BESTFIT, FASTA ou TFASTA), ou dos algoritmos BLAST e BLAST 2.0. A tabela BLOSUM62 mostrada abaixo é uma matriz de substitui- ção de aminoácido derivada de aproximadamente 2.000 alinhamentos múlti- plos locais dos segmentos das sequências de proteínas, representando re- giões altamente conservadas de mais do que 500 grupos de proteínas rela- cionadas (Henikoff e Henikoff, Proc.
Natl.
Acad.
Sci.
USA 89:1091 5-10919,
1992; incorporado neste documento por referência). Os aminoácidos são indicados pelos códigos padrões de uma letra. A porcentagem de identidade é calculada como: Número total de correspondências idênticas X 100 [comprimento da sequência ma is longa, mais o número de lacunas introduzidas na sequência mais longa para alinhar as duas sequências] Tabela BLOSUM62
ARNDCQEGHILKMFPSTWYV A4 R-l 5 N -2 0 6 D -2 -2 1 6 C 0 -3-3-3 9 Q-1100-35 E-1002-425 GO-20-1-3-2-26 H-201-1-300-28 1-1 -3 -3 -3-1 -3-3 -4 -3 4 L-1-2-3-4-1-2-3A-32 4 K-120-1-311-2-1-3-25 M-1-1-2-3-10-2-3-212-15 F-2-3-3-3-2-3-3-3-100-306 P -1 -2-2-1 -3-1 -1 -2 -2 -3 -3 -1 -2 -4 7 S1-11O-1000-1-2-20-1-2-14 TO-l 0-1-1-1-1-2-2-1-1-1-1-2-115 W-3-3AA-2-2-3-2-2-3-2-3-1 1-4-3-211 y-2-2-2-3-2-1-Z-32-1-1-2-13-3-2-227 VO-3-3-3-1-2-2-3-331-21-1-2-20-3-14 Em uma comparação da homologia, a identidade pode existir sobre uma região das sequências que é pelo menos 7 reslduos de aminoá- lO cidos de comprimento (por exemplo, pelo menos 10, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600 ou 650 resíduos de amino- ácidos de comprimento - por exemplo, até o comprimento inteiro da sequên- cia de referência). Os polipeptídeos substancialmente homólogos têm uma ou mais substituições, remoções, ou adições de aminoácidos.
Em muitas mo- dalidades, estas alterações são de uma natureza secundária, por exemplo, envolvendo somente substituições de aminoácidos conservativas.
As substi- tuições conservativas são aquelas feitas por substituição de um aminoácido por outro aminoácido, dentro dos seguintes grupos: Básicos: arginina, lisina, histidina; Ácidos: ácido glutâmico, ácido aspártico; PoIares: glutamina, aspa- ragina; Hidrofóbicos: leucina, isoleucina, valina; Aromáticos: fenilalanina, triptofano, tirosina; Pequenos: glicina, alanina, serina, treonina, metionina. \
Os polipeptídeos substancialmente homólogos também incluem aqueles que compreendem outras substituições que não afetem significativamente o do- bramento ou a atividade do polipeptideo; remoções pequenas, tipicamente de 1 a cerca de 30 aminoácidos (tais como 1-10, ou 1-5 aminoácidos); e ex- tensões amino- ou carboxil terminal pequenas, tais como um residuo de me- tionina amino terminal, um peptídeo ligador pequeno de até cerca de 20-25 resíduos, ou uma marca de afinidade.
Os polipeptídeos da presente invenção podem também compre- ender resíduos de aminoácidos que não ocorrem naturalmente.
Com relação a isto, além dos 20 aminoácidos padrões, aminoácidos não padrões (tais como a 4-hidroxiprolina, a 6-N-metil lisina, o ácido 2-aminoisobutírico, a iso- valina e uma a-metil serina) podem substituir os resíduos de aminoácidos dos poIipeptídeos micobacterianos da presente invenção.
Um número limita- do de aminoácidos não conservativos, aminoácidos que não são cod ificados pelo código genético, e aminoácidos não naturais pode substituir os resíduos de aminoácidos dos poIipeptídeos micobacterianos.
Os aminoácidos que não ocorrem naturalmente incluem, sem limitação, a trans-3-metiiprolina, a 2,4-metano-prolina, a cis-4-hidroxiprolina, a trans-4-hidróxi-prolina, a N- metilglicina, a alo-treonina, a metil-treonina, hidróxi-etilcisteína, a hidroxietil- homo-cisteina, a nitro-glutamina, a homoglutamina, o ácido pipecólico, a terc-leucina, a norvalina, a 2-azafenilalanina, a 3-azafenil-alanina, a 4- azafenii-aianina, e a 4-fluorfenilalanina.
Conhecem-se ría técnica diversos métodos para incorporar os resíduos de aminoácidos que não ocorrem naturalmente nos poIipeptídeos.
Por exemplo, pode ser empregado um sistema in vitro, em que mutações sem sentido são suprimidas usando tRNAS supressores quimicamente ami- noacilados.
Os métodos para sintetizar os aminoácidos e aminoacilar o tRNA são conhecidos na técnica.
A transcrição e a tradução dos plasmídios con-
tendo mutações sem sentido podem ser realizadas em um sistema sem cé- lulas compreendendo um extrato de E. co/i S30 e enzimas comercialmente disponlveis e outros reagentes.
Os peptídeos podem ser, por exemplo, puri- ficados por cromatografia.
Em um segundo método, a tradução é efetuada em oócitos Xenopus por microinjeção de mRNA mutado e tRNAS supresso-
lO res quimicamente aminoacilados.
Dentro de um terceiro método, as células de E.
Co// são cultivadas na ausência de um aminoácido natural que seja para ser substituldo (por exemplo, a fenilalanina) e na presença do(s) ami- noácido(s) que não ocorre(m) naturalmente desejado(s) (por exemplo, a 2- azafenilalanina, a 3-azafenilalanina, a 4-azafenilalanina, ou a 4-fluorfe- nilalanina). O aminoácido que não ocorre naturalmente é incorporado no po- lipeptídeo no lugar de seu equivalente natural.
Os resíduos de aminoácidos que ocorrem naturalmente podem ser convertidos em espécies que não o- correm naturalmente por modificação química in vitro.
A modificação qulmica pode ser combinada com a mutagênese sÍtio-dirigida para ampliar mais a faixa de substituições.
Os aminoácidos essenciais, tais como aqueles nos polipeptídeos da presente invenção, podem ser identificados de acordo com proce- dimentos conhecidos na técnica, tais como a mutagênese sítio-dirigida ou a mutagênese de varredura de alanina.
Os sÍtios de interação biológica podem também ser determinados por análise física da estrutura, como determinada por tais técnicas como a ressonância magnética nuclear, a cristalografia, a difração de elétrons ou a marcação por fotoafinidade, em conjunção com a mutação de aminoácidos de sÍtios de contato putativos.
As identidades dos aminoácidos essenciais podem também ser deduzidas a partir de análise das homologias com membros relacionados da família dos polipeptídeos de interesse.
As substituições de aminoácidos múltiplas podem ser feitas e testadas usando métodos conhecidos de mutagênese e exame. são conhe- cidos métodos para aleatorizar simultaneamente duas ou mais posições em um polipeptídeo, selecionar o poIipeptídeo funcional, e então sequenciar os polipeptídeos mutagenizados para determinar o espectro de substituições admissíveis em cada posição.
Os outros métodos que podem ser usados incluem a exibição em fago.
Podem ser efetuadas análises de remoção de rotina das molécu- las de ácidos nucleicos para obter fragmentos funcionais de uma molécula de ácido nucleico que codifica um polipeptídeo da invenção.
Como uma ilus- lO tração, as moléculas de DNA podem ser digeridas com a nuclease Bal31 para obter uma série de remoções aninhadas.
Estes fragmentos de DNA são enião inseridos em vetores de expressão em quadro de Ieitura apropriado, e os polipeptídeos expressos são isolados e testados quanto à atividade dese- jada.
Uma alternativa para a digestão com exonuclease é usar a mutagêne- se oligonucleotÍdeo-dirigida para introduzir remoções, ou códons de interrup- ção para especificar a produção de um fragmento desejado.
Alternativamen- te, podem ser sintetizados fragmentos de polinucleotídeos particulares u- ' sando a reação em cadeia por polimerase.
Um mutante de um polipeptídeo da invenção pode conter um ou mais análogos de um aminoácido (por exemplo, um aminoácido não natural), ou uma ligação substituída, em comparação com a sequência do polipeptí- deo de referência.
Em uma modalidade adicional, um polipeptídeo de inte- resse pode ser um imitador do poIipeptídeo de referência, imitador este que reproduz pelo menos um epítopo do polipeptídeo de referência.
Os mutantes das sequências de polinucleotídeos e polipeptídeos divulgadas da invenção podem ser gerados através de mistura de DNAS.
Resumidamente, os DNAs mutantes são gerados por recombinação homó- loga in vitro por fragmentação aleatória de um DNA de origem, seguida por reagrupamento usando PCR, resultando em mutações pontuais aleatoria- mente introduzidas.
Esta técnica pode ser modificada usando uma família de DNAS de origem, para introduzir variabiiidade adicional ao processo.
A sele- ção ou o exame quanto à atividade desejada, seguido por repetições adicio-
nais de mutagênese e ensaio, proporciona a "evolução" rápida das sequên- cias por seleção quanto às mutações desejáveis, ao mesmo tempo simulta- neamente selecionando contra as alterações prejudiciais.
Os métodos de mutagênese como divulgados acima podem ser combinados com métodos de exame de alto rendimento para detectar a ati- vidade de polipeptídeos mutantes clonados.
As moléculas de ácidos nuclei- cos mutagenizadas que codificam os polipeptídeos da invenção, ou os seus fragmentos, podem ser recuperadas das células hospedeiras e rapidamente sequenciadas usando equipamento moderno.
Estes métodos permitem a determinação rápida da importância dos resíduos de aminoácidos individuais em um polipeptídeo de interesse, e podem ser aplicados aos poHpeptídeos de estrutura desconhecida.
Um "fragmento" de um polipeptídeo de interesse compreende uma série de resíduos de aminoácidos consecutivos da sequência do dito polipeptídeo.
A título de exemplo, um "fragmento" de um polipeptídeo de in- teresse pode compreender (ou consistir em) pelo menos 7 resíduos de ami- noácidos consecutivos da sequência do dito polipeptídeo (por exemplo, pelo menos 10, 15, 25, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450, 475, 500, 525, 550, 575, 600, 625, 650 ou 675 resí- duos de aminoácidos consecutivos do dito polipeptídeo). Um fragmento pode incluir pelo menos um epítopo do polipeptídeo de interesse.
Um polipeptídeo de interesse, ou fragmento, pode possuir o sítio ativo do polipeptídeo de referência.
O polipeptídeo de interesse, ou o seu fragmento, pode ter uma reatividade cruzada antigênica comum e/ou substancialmente a mesma ati- vidade biológica in vivo que o peptídeo de referência.
Por exemplo, os poli- peptídeos, ou os fragmentos de polipeptídeos, e os poIipeptídeos de refe- rência compartilham uma capacidade comum de induzir uma "resposta de lembrança" de uma célula imune, tal como um Iinfócito T (por exemplo, CD4+, CD8+, célula T efetora ou célula T de memória, tal como uma TEM ou TCM), que tenha sido previamente exposta a um componente antigênico de uma infecção micobacteriana.
Novos ensaios imunológicos para medir e quantificar as respos- tas de células imunes (por exemplo, as respostas de células T) têm sido es- tabelecidos durante os últimos 10 anos.
Por exemplo, o ensaio de interferon- gama (IFN-j') ELISPOT é útil como uma leitura imunológica, porque a secre-
ção de lFN-y a partir de células T especificas para antígenos é um bom cor- relativo de proteção contra M. tubercu/os/s.
Além disso, o ensaio ELISPOT é um método muito reproduzível e sensível de quantificar o número de células imunes específicas para antígenos que secretam lFN-y (por exemplo, as cé- lulas T). Alternativamente, ou, além disso, um anticorpo capaz de ligar-se a um polipeptídeo de interesse, ou fragmento, pode também ser capaz de ligar-se ao peptídeo de referência.
Conforme usados neste documento, os termos "sequência de á- cidos nucleicos" e "pohnucleotídeo" são usados de modo intercambiável e não sugerem nenhuma restrição de comprimento.
Conforme usados neste documento, os termos "ácido nucleico" e "nucleotídeo" são usados de modo intercambiável.
Os termos "sequência de ácidos nucleicos" e "polinucleotí- deo" incluem as sequências de DNA (incluindo o CDNA) e RNA.
As sequências de poIinucleotídeos da presente invenção inclu-
em as sequências de ácidos nucleicos que tenham sido removidas de seu ambiente de ocorrência natural, os isolados de DNA recombinantes ou cIo- nados, e os análogos quimicamente sintetizados ou os análogos biologica- mente sintetizados por sistemas heterólogos.
Os polinucleotÍdeos da presente invenção podem ser prepara-
dos por qualquer meio conhecido na técnica.
Por exemplo, podem ser pro- duzidas grandes quantidades dos polinucleotídeos por replicação em uma célula hospedeira adequada.
Os fragmentos de DNA naturais ou sintéticos que codificam para um fragmento desejado serão incorporados nas constru- ções de ácidos nucleicos recombinantes, tipicamente as constmções de
DNA, capazes de introdução em, e replicação em, uma célula procariótica ou eucariótica.
Normalmente, as construções de DNA serão adequadas para a replicação autônoma em um hospedeiro unicelular, tal como as leveduras ou as bactérias, porém podem também ser pretendidas para a introdução no, e a integração no, genoma de um inseto cultivado, mamífero, planta ou outras Iinhagens de células eucarióticas.
Os polinucleotídeos da presente invenção podem também ser produzidos por síntese quimica, por exemplo, pelo método de fosforamidita ou pelo método de triéster, e podem ser efetuados sobre sintetizadores de oligonucleotídeos automatizados comerciais.
Pode ser obtido um fragmento de fita dupla a partir do produto de fita simples de sÍntese química por sinte- tização da fita comp|ementar e anelamento da fita conjuntamente, sob con-
lO dições apropriadas, ou por adição da fita complementar usando DNA polime- rase com uma sequência de iniciador apropriada.
O termo "recombinante", conforme usado neste documento, sig- nifica um polinucleotÍdeo de origem genômica, de cDNA, semissintética, ou sintética que, em virtude de sua origem ou manipulação: (1) não está asso-
ciado com todo o, ou uma parte de um, polinucleotídeo com o qual está as- sociado na natureza; ou (2) está ligado a um polinucleotídeo que não acjuele ao qual ele está ligado na natureza; e (3) não ocorre na natureza.
Esta com- binação artificial é frequentemente efetuada por meio de técnicas de sÍnte- ses químicas convencionais, ou pela manipulação artificial de segmentos isolados de ácidos nucleicos - por exemplo, por técnicas convencionais de engenharia genética.
Quando aplicado a uma sequência de ácidos nucleicos, o termo "isolada", no contexto da presente invenção, significa que a sequência de polinucleotÍdeos foi removida de seu meio genético natural e está, desse modo, livre de outras sequências de codificação estranhas ou indesejadas (porém pode incluir as regiões não traduzidas em 5' e 3' de ocorrência natu- ral, tais como os promotores e os terminadores), e está em uma forma ade- quada para uso dentro de sistemas de produção de proteínas geneticamente encjenheiradas.
Tais moléculas isoladas são aquelas que são separadas de seu ambiente natural.
Os métodos de isolar as sequências de ácidos nucleicos são co- nhecidos na técnica.
Uma sequência de ácidos nucleicos codificando um polipeptídeo da invenção pode ser obtida por procedimentos de clonagem convencionais, '
tais como a PCR, ou pode ser sintetizada usando mecanismos de sÍntese de ácidos nucleicos.
Um modo alternativo de preparar um polinucleotídeo de
5 tamanho natural é sintetizar um grupo especificado de oligonucleotídeos so-
brepostos (por exemplo, 40 a 100 nucleotídeos),. como descrito (por exem-
pIo) em Glick e Pasternak, Molecular Biotechnology, Principles & Applicati-
ons of Recombinant DNA, (1994). Podem ser adicionadas outras sequências que contenham sinais para a iniciação e a terminação adequadas da trans-
lO crição e da tradução-
Em vista da degeneração do código genético, é possÍvel uma ,
variação considerável da sequência entre os polinucleotídeos da presente invenção.
Os códons degenerados que incluem todos os códons possÍveis para um dado aminoácido são apresentados abaixo:
Aminoácido Códons Códon Degenerado Cys TGC TGT TGY Ser AGC AGT TCA TCC TCG TCT WSN Thr ACA ACC ACG ACT ACN Pro CCA CCC CCG CCT CCN Ala GCA GCC GCG GCT GCN Gly GGA GGC GGG GGT GGN Asn AAC AAT AAY Asp GAC GAT GAY Glu GAA GAG GAR Gln CAA CAG CAR His CAC CAT CAY Arg AGA AGG CGA CGC CGG CGT MGN Lys AAA AAG AAR Met ATG ATG Ile ATA ATC ATT ATH Leu CTA CTC CTG CTT TTA TTG YTN Val GTA GTC GTG GTT GTN Phe TTC TTT TTY Tyr TAC TAT TAY Trp TGG TGG Ter TAA TAG TGA TRR Asn/Asp RAY Glu/Gln SAR Qualquer NNN
Alguém de habilidade na técnica apreciará que alguma ambigui- dade é introduzida na determinação do códon degenerado, representativo de todos os códons possÍveis codificando cada aminoácido.
Por exemplo, al- guns polinucleotÍdeos incluídos pela sequência degenerada podem cod ificar sequências de aminoácidos variantes, porém alguém de habilidade comum na técnica pode facilmente identificar tais sequências variantes por referên- 5 cia às sequências de aminoácidos da presente invenção.
Uma sequência de ácidos nucleicos "variante" tem homologia substancial ou similaridade substancial com uma sequência de ácidos nucle- icos de referência (ou um fragmento da mesma). Uma sequência de ácidos nucíeicos, ou o seu fragmento, é "substancialmente homóloga" (ou "substan- lO cialmente idêntica") a uma sequência de referência se, quando otimamente alinhada (com inserções ou remoções de nucleotídeos apropriadas) com o outro ácido nucleico (ou a sua fita complementar), houver identidade da se- quência de nucleotídeos em pelo menos cerca de 70%, 75%, 80°/o, 82, 84, 86, 88, 90, 92, 94, 96, 98 ou 99°6 das bases de nucleotídeos.
A determina- . 15 ção da homologia é efetuada conforme descrito supra para os polipeptídeos. b Alternativamente, uma sequência de ácidos nucleicos "variante" é substancialmente homóioga com (ou substancialmente idêntica a) uma sequência de referência (ou um fragmento da mesma) se a "variante" e a sequência de referência forern capazes de hibridizar sob condições de hibri- 20 dização severas (por exemplo, altamente severas). A hibridização da se- " quência de ácidos nucleicos será afetada por tais condições como a concen- tração do sal (por exemplo, NaCl), a temperatura, ou os solventes orgânicos, além da composição da base, do comprimento das fitas complementares, e do número de mal emparelhamentos das bases de nucleotídeos entre os 25 ácidos nucleicos de hibridização, conforme será prontamente apreciado por aqueles versados na técnica.
São preferivelmente empregadas condições severas de temperatura, e geralmente incluem as temperaturas em excesso de 30°C, tipicamente em excesso de 37"C e preferivelmente em excessos de 45°C.
As condições severas de sal normalmente serão menos do que 30 1000 mM, tipicamente menos do que 500 mM, e preferivelmente menos do que 200 mM.
O pH é tipicamente entre 7,0 e 8,3. A combinação de parâme- tros é muito mais importante do que qualquer parâmetro individual.
Alguém de habilidade na técnica aprecia que espécies diferentes exibem "uso do códon preferencial". Conforme usado neste documento, o termo "uso do códon preferencial" refere-se aos códons que são mais fre- quentemente usados nas células de certa espécie, assim favorecendo um ou alguns representativos dos códons possÍveis que codificam cada aminoáci- do.
Por exemplo, o aminoácido treonina (Thr) pode ser codificado por ACA, ACC, ACG, ou ACT, porém, nas células hospedeiras mamlferas, o ACC é o códon mais comumente usado; em outras espécies, códons diferentes da Thr podem ser preferenciais.
Os códons preferenciais para uma espécie de célula hospedeira particular podem ser introduzidos nos poHnucleotídeos da presente invenção por uma variedade de métodos conhecidos na técnica.
A introdução das sequências de códons preferenciais no DNA recombinante pode, por exemplo, aumentar a produção da proteína, tornando a tradução da proteína mais eficiente dentro de um tipo ou espécie particular de célula.
Assim, em uma modalidade da invenção, a sequência de ácidos nucleicos é otimizada pelo códon para a expressão em uma célula hospedei- ra.
Um "fragmento" de um polinucleotídeo de interesse compreende uma série de resíduos de aminoácidos consecutivos da sequência do dito polinucleotídeo de tamanho natural.
A tltulo de exemplo, um "fragmento" de um polinucleotídeo de interesse pode compreender (ou consistir em) pelo menos 21 residuos de ácidos nucleicos consecutivos da sequência do dito polipeptídeo (por exemplo, pelo menos 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800 850, 900, 950 ou 1000 re- síduos de ácidos nucleicos consecutivos do dito polinucleotldeo). Um frag- mento pode incluir pelo menos um determinante antigênico e/ou pode codifi- car pelo menos um epitopo antigênico do polipeptídeo correspondente de interesse.
Um polinucleotídeo de interesse, ou variante ou fragmento do mesmo, pode codificar um poIipeptídeo que tenha uma reatividade cruzada antigênica comum e/ou substancialmente a mesma atividade biológica in vivo que o peptídeo de referência.
Por exemplo, os polipeptídeos codificados pelo polinucleotídeo (ou fragmento ou variante), e o poIinucleotídeo de referência podem compar- tilhar uma capacidade comum de induzir uma "resposta de lembrança" de uma célula imune, tal como um linfócito T (por exemplo, CD4+, CD8+, célula T efetora ou célula T de memória, tal como uma TEM ou TCM), que tenha sido previamente exposta a um componente antigênico de uma infecção mi- cobacteriana.
Novos ensaios imunológicos para medir e quantificar as respos- tas de células imunes (por exemplo, as respostas de células T) têm sido es- lO tabelecidos durante os últimos 10 anos.
Por exemplo, o ensaio de interferon- gama (lFN-y) ELISPOT é útil como uma Ieitura imunológica, porque a secre- ção de IFN-y a partir de células T específicas para antígenos é um bom cor- relativo de proteção contra M. tuberculosls.
Além disso, o ensaio ELISPOT é um método muito reproduzível e sensível de quantificar o número de células imunes específicas para antígenos que secretam lFN-y (por exemplo, as cé- lulas T). Altemativamente, ou além disso, um anticorpo capaz de Iigar-se a um polipeptídeo codificado pelo poIinucleotídeo de interesse, ou fragmento ou variante, pode também ser capaz de ligar-se a um polipeptídeo codificado pelo poIinucleotÍdeo de referência.
Código para as SEQ ID NOs: SEQ ID NO: 1 Peptídeo regulado pela latência RvO111 SEQ ID NO: 2 Gene regulado pela latência RVO111 (codifica a SEQ ID NO: 1) SEQ ID NO: 3 Peptídeo regulado pela latência RV1806 SEQ ID NO: 4 Gene regulado pela latência RV1806 (codifica a SEQ ID NO: 3) SEQ ID NO: 5 Peptídeo regulado pela latência RvO198 SEQ ID NO: 6 Gene regulado pela Iatência RV1098 (codifica a SEQ ID NO: 5) SEQ ID NO: 7 Peptídeo regulado pela Íatência Rv3812 SEQ ID NO: 8 Gene regulado pela latência Rv3812 (codifica a SEQ ID
NO: 7) SEQ ID NO: 9 Peptídeo micobacteriano Ag85NRv3804c SEQ ID NO:lO Peptídeo micobacteriano Ag85B/Rv1886c SEQIDNO:11 Peptídeo micobacteriano ESAT6/RV3875 SEQ ID NO: 12 Peptídeo micobacteriano TB10.4/Rv0288 SEQ ID NO: 13 Peptídeo micobacteriano RvO125 SEQ ID NO: 14 Peptídeo micobacteriano PPE18/RV1196 SEQID NO:15 Peptídeo micobacteriano P27/Rv1411C SEQ ID NO: 16 Peptídeo micobacteriano HSP65/RV0440 SEQ ID NO: 17 Peptídeo micobacteriano HBHA/Rv0475 SEQID NO:18 Peptídeo micobacteriano RV2659C SEQID NO:19 Peptídeo micobacteriano Rv2660c SEQ ID NO: 20 Peptídeo micobacteriano HspX/Rv2031c SEQ ID NO: 21 Polinucleotídeo micobacteriano codificando o peptídeo Ag85A SEQ ID NO: 22 PolinucleotÍdeo micobacteriano codificando o peptídeo Ag858 SEQ ID NO: 23 PoHnucleotídeo micobacteriano codificando o peptídeo ESAT6 SEQ ID NO: 24 Polinuc1eotÍdeo micobacteriano codificando o peptldeo TB10.4 SEQ ID NO: 25 PoKnucleotídeo micobacteriano codificando o peptídeo RVO125 SEQ ID NO: 26 Polinucleotídeo micobacteriano codificando o peptídeo Rv1196 SEQ ID NO: 27 PoHnucleotídeo micobacteriano codificando o peptídeo Rv1411 SEQ ID NO: 28 Polinucleotídeo micobacteriano codificando o peptídeo HSP65 SEQ ID NO: 29 Pohnucleotídeo micobacteriano codificando o peptídeo
HBHA SEQ ID NO: 30 PolinucleotÍdeo micobacteriano codificando o peptídeo
RV2659C SEQ ID NO: 31 Polinucleotídeo micobacteriano codificando o peptldeo RV2660C SEQ ID NO: 32 Polinucleotídeo micobacteriano codificando o peptídeo
HspX/Rv2031c SEQ ID NO: 33 Sequência da marca de PK SEQ ID NO: 34 Peptídeo micobacteriano RPFA/RV0867C SEQ ID NO: 35 Peptídeo micobacteriano RPFB/Rv1009 SEQ ID NO: 36 Peptídeo micobacteriano RPFC/RV1884c SEQ ID NO: 37 Peptídeo micobacteriano RPFD/Rv2389c SEQ ID NO: 38 Peptídeo micobacteriano RPFE/RV2450C SEQ ID NO: 39 Peptídeo micobacteriano Rv1733C SEQ ID NO: 40 Peptídeo micobacteriano RV2029c SEQ ID NO: 41 Peptídeo micobacteriano Rv2032 SEQ ID NO: 42 Peptídeo micobacteriano Rv2626C SEQ ID NO: 43 Peptídeo micobacteriano Rv2627c SEQ ID NO: 44 Peptídeo micobacteriano Rv2628 SEQ ID NO: 45 Polinucleotídeo micobacteriano codificando o peptídeo RPFA/Rv0867C SEQ ID NO: 46 Polinucleotídeo micobacteriano codificando o peptídeo RPFB/RV1009
SEQ ID NO: 47 PolinucleotÍdeo micobacteriano codificando o peptídeo RPFC/RV1884C
SEQ ID NO: 48 Polinucleotídeo micobacteriano codificando o peptídeo
RPFD/RV2389C SEQ ID NO: 49 Polinucleotídeo micobacteriano codificando o peptídeo RPFE/Rv2450c
SEQ ID NO: 50 Polinucleotídeo micobacteriano codificando o peptídeo Rv1733c
SEQ ID NO: 51 Polinucleotídeo micobacteriano codificando o peptídeo RV2029C
SEQ ID NO: 52 Polinucleotídeo micobacteriano codificando o peptídeo
Rv2032 SEQ ID NO: 53 PolinucleotÍdeo micobacteriano codificando o peptídeo RV2626C SEQ ID NO: 54 Polinucleotídeo micobacteriano codificando o peptídeo RV2627C SEQ ID NO: 55 PolinucleotÍdeo micobacteriano codificando o peptídeo RV2628 SEQ ID NO: 56 Peptídeo regulado pela latência Rv1807 SEQ ID NO: 57 Gene regulado pela latência RV1807 (codifica a SEQ ID NO: 56) SEQIDNO:I Val Pro Ala Arg Ser Val Pro Arg Pro Arg Trp Val Ala Pro Val Arg Arg Val Gly Arg Leu Ala Val Trp Asp Arg Pro Glu Arg Arg Ser Gly Ile Pro Ala Leu Asp Gly Leu Arg Ala Ile Ala Val Ala Leu val Leu Ala Ser His Gly Gly Ile Pro Gly Met Gly Gly gly Phe Ile Gly Val Asp Ala Phe Phe val Leu Ser Gly Phe Leu Ile Thr Ser Leu Leu Leu Asp Glu Leu Gly Arg Thr Gly Arg Ile Asp Leu Ser Gly Phe Trp Ile Arg Arg Ala Arg Arg Leu Leu Pro Ala Leu Val Leu Met Val Leu Thr val Ser Ala Ala Arg Ala Leu Phe Pro Asp Gln Ala Leu Thr GIy Leu Arg Ser Asp Ala Ile Ala Ala Phe Leu Trp Thr Ala Asn Trp Arg Phe Val Ala Gln Asn Thr Asp Tyr Phe Thr Gln Gly Ala Pro Pfd Ser Pro Leu Gln Hi3 Thr Trp Ser Leu Gly val Glu Glu Gln Tyr Tyr VaL Val Trp Pro Leu Leu Leu íle GLy Ala Thr Leu Leu Leu Ala Ala Arg Ala Arg Arg Arg Cys Arg Arg Ala Thr Val Gly Gly Val Arg Phe Ala Ala phe Leu Ile Ala Ser Leu Gly Thr Met Ala Ser Ala Thr Ala Ala Val Ala Phe Thr Ser Ala Ala Thr Arg Asp Arg Ile Tyr Phe Gly Thr Asp Thr Arg Ala Gln Ala Leu Leu Ile Gly Ser Ala Ala Ala Ala Leu Leu Val Arg ASp Trp Pro Ser Leu Asn Arg Gly Trp Cys Leu Ile Arg Thr Arg Trp Gly Arg Arg Ile Ala Arg Leu Leu Pro Phe Val Gly Leu Ala Gly Leu Ala Val Thr Thr His Val Ala Thr Gly Ser Val Gly Glu Phe Arg His Gly Leu Leu Ile Val Val Ala Gly Ala Ala Val Ile Val Val Ala Ser Val Ala Met Glu Gln Arg Gly Ala Val Ala Arg Ile Leu Ala Trp Arg Pro Leu Val Trp Leu Gly Thr Ile Ser Tyr Gly val Tyr Leu Trp Hís Trp Pro Ile Phe Leu Ala Leu Asn Gly Gln Arg Thr GIy Trp Ser GIy Pro Ala Leu Phe Ala Ala Arg Cys Ala Ala Thr Val Val Leu Ala Gly Ala Ser Trp Trp Leu Ile Glu Gln Pro Ile Arg Arg Trp Arg Pro Ala Arg Val Pro Leu LeU Pro Leu Ala Ala Ala Thr Val Ala Ser Ala Ala Ala Val Thr Met Leu Val Val Pro val Gly Ala Gly Pro GIy Leu Arg Glu Ile Gly Leu Ê'rcj Pro Gly Val Ser Ala val Ala Ala Val Ser Pro Ser Pro Ero Glu Ala Ser Gln Pro Aía Pro Gly Pro Arg Asp Pro Asn Arg Pro Phe Thr Val Ser val Phe Gly Asp Ser Ile Gly Trp Thr Leu Met His Tyr Leu Pro Pro Thr Pro Gly Phe Arg Phe Ile Asp His Thr Val Ile GIy Cys Ser Leu val Arg Gly Thr PrD Tyr Arg Tyr Ile Gly Gln Thr Leu Glu GIn Arg Ala Glu Cys Asp Gly Trp Pro Ala Arg Trp Ser Ala Gln Val Àsij Arg Asp GIn Pro Asp Val Aía Leu Leu Ile Val gly Arg Trp Glu Thr Val Asp Arg Val Asn Glu Gly Arg Trp Thr His Ile Gly Asp pro Thr Phe Asp Ala Tyr Leu Asn Ala GIu Leu Gln Arg Ala Leu Ser Ile Val Gly Ser Thr Gly Val Arg Val Met Val Thr Thr Val Pro Tyr Ser Arg Gly Gly Glu Lys Pro Asp Gly Arg Leu Tyr Pro Glu Asp GIn pro Glu Arg val Asn Lys Trp Asn Aía Met Leu His Asn Ala Ile Ser Gln Hís Ser Asn Val Gly Met Ile Asp Leu Asn Lys Lys Leu Cys Pro Asp Gly Val Tyr Thr Ala Lys Val Asp gly Ile Lys Val Arg Ser Asp Gly Val Hís Leu Thr Gln Glu Gly Val Lys Trp Leu rle Pro Trp Leu glu Asp Ser Val Arg val Ala Ser
SEQIDNO: 2 gtgccggcac gttctgttcc ccggccccgt tgggtggccc cggtgcgccg ggtcggtcgg ctggccgtat gggatcggcc ggagcggcgc agcggaattc cagcgttaga tggccttcgt gcgatagcgg tcgcgctggt actcgccagc catggcggca tccccggtat gggcggcggg ttcatcggcg tcgacgcctt cttcgtcttg agcggatttc tcatcacctc gctgctgctc gacgagctgg ggcgcaccgg tcgtatcgat ctgagcgggt tctggattcg ccgtgcgcgg cggctgctgc cggcgctggt gctgatggtt ctcaccgtga gcgccgcacg cgcactattt cctgaccaag ctctcaccgg gctacggagc gatgcgatcg ccgcgttcct atggacggcg aattggcggt ttgtggccca aaataccgat tacttcaccc agggcgctcc accctcgccc ctacagcaca cctggtcgtt gggggtggag gagcagtatt acgttgtctg gccactgttg ctgatcgggg cgacgctact gttggcggcc cgggcgaggc gccgttgcag acgggccacg gtgggcgggg ttcggttcgc cgcgttcctg attgccagtc tcggcacgat ggcttccgcc accgccgcgg tcgcatttac ctcggcggcc acccgcgacc ggatttactt cggcaccgat acccgtgcgc aggcgttgct gatcggctcc gcggcagcgg ctctgctggt gcgggattgg ccatcgctga accgcgggtg gtgcctgatc cggactcgct ggggacggcg gattgcccgt ctgttgccgt tcgtcgggct ggctgggctg gcggtgacga ctcacgtcgc aacgggcagt gtgggcgagt tccgccatgg tctgctgatc gtggtggcag gtgcggccgt catcgtggtt gcctcggtag ccatggagca gcgcggagcg gtggcccgca tcctggcctg gcgaccgttg gtgtggctgg gcaccatatc gtacggcgtc tatctgtggc actggccaat ctttctggcg ctcaacggcc aacgtacggg ctggtcgggc ccggccctgt ttgccgctag gtgtgcagcc acggtggtgc tggccggtgc gtcgtggtgg ctgatcgagc aacctattcg gcgctggcga ccggcacggg ttccgctgtt gccgctggca gcggcgaccg ttgccagcgc tgccgccgtg acgatgctcg ttgttccggt cggagccgga ccggggctac gcgagatCgg ccttccgccc ggcgtttcgg cggtcgccgc ggtctcgccg tcgccgccgg aagcgagtca gcccgcgccc gggccacgag atcccaaccg gccgttcacc gtttcggtat tcggtgattc gatcgggtgg actttgatgc attacctgcc gccgactccc ggattccggt tcatcgacca caccgtcatc ggctgcagcc tggtacgcgg cacaccgta.t cggtacatcg gtcaaaccct ggagcagagg gcggaatgcg acggctggcc ggccagatgg tcggcgcagg tcaaccggga ccaaccggac gttgcgttgc tgatcgtcgg ccgctgggag acggtagacc gggtcaatga ggggcggtgg acacatatcg gcgacccgac cttcgatgcg tacctcaacg ccgagctaca gcgagcgctc agcatcgttg gatccaccgg ggttcgagtg atggtcacca ccgtgcccta cagccgcggc ggcgaaaagc cggacggccg cttgtatccg gaggatcaac ccgagcgtgt gaacaaatgg aacgccatgt tacataacgc cattagccaa cactcgaacg tcggaatgat cgacctcaac aaaaagcttt gtccagacgg cgtttacacg gccaaggtcg acggcatcaa ggtccgcagt gatggtgttc atctcaccca ggaaggcgtg aagtggctga taccgtggct tgaggattcg gtgcgggtcg ccagt
SEQIDNO:3 Met Ala Phe Val Leu Val Cys Pro Asp Ala Leu Ala Ile Ala Ala Gly Gln'ljeu Arg His Val Gly Ser Val Ile Ala Ala Arg Asn Ala Val Ala Ala E'ro Ala Thr Ala Glu Leu Ala Pro Ala Ala Ala Asp Glu Val Ser Ala Leu Thr Ala Thr GIn phe Asn Phe Hi S Ala Ala Met Tyr Gln Ala Val Gly Ala Gln Ala Ile Ala Met Asn Glu Ala Phe Val Ala Met Leu Gly Ala Ser Ala Asp Ser Tyr Ala Ala Thr glu Ala Ala Asn Ile Ile
Ala Val Ser
SEQIDNO: 4 atggcgtttg ttcttgtctg tccagatgcg ctggccatcg cggccggtca gttgcgccat gttggatcgg tgatagccgc gcggaatgcg gtcgcggcac cggcaactgc cgaattggcc ccggcggccg ctgacgaagt atcagctttg actgcaacac aattcaactt ccatgccgcc atgtaccaag cggtcggcgc ccaggcgatc gccatgaatg aggcgttcgt cgcgatgttg ggcgccagcg cggattctta cgcggctacc gaagccgcca acatcattgc tgtgagc
SEQIDNO:5 Val Thr Leu Ala Ile Pro Ser Gly Ile Asp Leu Ser His Ile Asp Ala Asp Ala Arg Pro Gln Asp Asp Leu Phe Gly His val Asn Gly Arg Trp Leu Ala Glu His Glu Ile Pro Ala Asp Arg Ala Thr Asp Gly Ala Phe Arg Ser Leu Phe Asp Arg Ala Glu Thr Gln Val Arg Asp Leu Ile Ile Gln Ala Ser GIn Ala Gly Ala Ala Val Gly Thr ASp Ala Gln Arg Ile Gly Asp Leu Tyr Ala Ser Phe Leu Asp Glu Glu Ala Val Glu Arg Ala Gly Val Gln Pro Leu His Asp Glu Leu Ala Thr Ile Asp Ser Ala Ala Asp Ala Thr Glu Leu Ala Ala Ala Leu Gly Thr Leu Gln Arg Ala GIy Val Gly Gly Gly Ile Gly Val Tyr Val Asp Thr Asp Ser Lys Asp Ser Thr Arg Tyr Leu Val His Phe Thr Gln Ser Gly Ile Gly Leu Pro Asp Glu Ser Tyr Tyr Arg Asp glu Gln His Ala Ala Val Leu Ala Ala Tyr Pro Gly His Ile Ala Arg Met Phe Gly Leu Val Tyr Gly Gly Glu Ser Arg Asp His Ala Lys Thr Ala Asp Arg Ile Val Ala Leu Glu Thr Lys Leu Ala Asp Ala His Trp Asp Val Val Lys Arg Arg Asp Ala Asp Leu Gly Tyr Asn Leu Arg Thr Phe Ala Gln Leu Gln Thr Glu GIy Ala Gly Phe Asp Trp Val Ser Trp Val Thr Ala Leu Gly Ser Ala Pro Asp Ala Met Thr GIu Leu Val Val Arg Gln Pro Asp Tyr Leu Val Thr Phe Ala Ser Leu Trp Ala Ser Val Asn Val Glu Asp Trp Lys Cys Trp Ala Arg Trp Arg Leu Ile Arg Ala Arg Ala Pro Trp Leu Thr Arg Ala Leu Val Ala Glu Asp Phe Glu Phe Tyr Gly Arg Thr Leu Thr Gly Ala Gln Gln Leu Arg Asp Arg Trp Lys Arg GIy Val Ser Leu Val Glu Asn Leu Met Gly asp Ala Val Gly Lys Leu Tyr Val Gln Arg His Phe Pro Pro Asp Ala Lys Ser Arg Ile Asp Thr Leu Val Asp Asn Leu Gln glu Ala Tyr Arg Ile Ser Ile Ser Glu Leu Asp Trp Met Thr Pro GIn Thr Arg Gln Arg Ala Leu Ala Lys Leu Asn Lys Phe Thr Ala Lys Val Gly Tyr Pro Ile Lys Trp Arg Asp Tyr Ser Lys Leu Ala Ile Asp Arg Asp Asp Leu Tyr Gly Asn Val Gln Arg Gly Tyr Ala Val Asn His Asp Arg Glu Leu Ala Lys Leu E'he Gly Pro Val Asp Arg Asp Glu Trp Phe Met Thr Pro Gln Thr Val Asn Ala Tyr Tyr Asn Pro Gly Met Asn Glu Ile Val Phe Pro Ala Ala Ile Leu Gln Pro Pro phe Phe Asp Pro Gln Ala Asp GIu Ala Ala Asn Tyr Gly Gly Ile Gly Ala Val Ile Gly His Glu Ile Gly His GIy Phe Asp Asp GIn Gly Ala Lys Tyr Asp Gly Asp Gly Asn Leu Val Asp Trp Trp Thr Asp Asp Asp Arg Thr Glu Phe Ala Ala Arg Thr Lys Ala Leu Ile Glu Glm Tyr His Ala Tyr Thr Pro Arg Asp Leu Val Asp His Pro Gly Pro E'ro His Val GIn Gly Ala Fhe Thr Ile Gly gIu Asn Ile Gly Asp Leu Gly Gly Leu Ser Ile Ala Leu Leu Ala Tyr GIn ' Leu Ser Leu Asn Gly Asn ' Pro Ala Pro Val Ile Asp Gly Leu Thr Gly " Met gln Arg Val Phe Phe GIy Trp Ala Gln Ile Trp Arg Thr Lys Ser Arg Ala Ala Glu Ala Ile Arg Arg Leu Ala Val Asp Pro His Ser Pro Pro Glu Phe Arg Cys Asn Gly Val Val Arg Asn Val Asp Ala Phe Tyr Gln Ala Phe Asp Val Thr Glu Asp Asp Ala Leu Phe Leu Asp Pro Gln Arg Arg Val Arg Ile Trp Asn
S,EQ ID NO: 6 gtgacacttg ccatcccctc gggtatcgac ctgagccaca tcgacgctga tgcccgaccc caagacgacc tgttcggcca cgttaacggc cgctggctgg ctgaacacga gataccagcg gaccgagcga ccgacggcgc cttccgtagc ctgttcgacc gcgccgagac acaagtgcga gacctgatca tccaggccag ccaagcaggt gctgcggtag gcaccgatgc gcagcgcatc ggcgacctct acgccagctt cctcgacgag gaagccgtcg agcgcgcagg ggtgcaaccg ctgcacgacg aattggccac gattgacagc gcggccgacg ccaccgaatt ggccgccgcc cttggcactc tgcaacgtgc cggcgtgggc ggcggcatcg gagtctatgt cgataccgat tccaaagact cgacccgtta cttggtgcat ttcacccaat ccggcatcgg attacccgac gagtcctact accgtgacga gcaacacgcc gccgtgctag cggcctaccc ggggcacatc gcccggatgt tcggcctggt gtacgggggc gagagccgtg accatgccaa aaccgcggac cgcatcgtcg cgctggagac caaactcgcc gacgcgcatt gggatgtggt gaagcgccgc gacgccgacc ttggctacaa cctgcgcacg tttgcccagc tgcagaccga aggggcgggt ttcgactggg tcagctgggt gaccgcattg gggagcgctc cggacgccat gacggaactg gttgtgcgcc aacctgatta cctcgtcacc tttgcctcgc tgtgggcgag cgttaacgtt gaagactgga aatgctgggc gcgttggcgt ttgatccgcg cccgggcccc ctggctgacc cgcgccctgg tcgccgagga cttcgaattc tacggccgca cgcttaccgg cgcacagcag cttcgggacc gttggaagcg tggggtgtca ctggtggaga acctgatggg cgatgccgtc ggaaagctct atgtacaacg ccatttcccg ccggatgcca agtcccgcat cgacaccctg gtggacaacc tgcaggaggc gtatcggatc agcatcagcg agctggattg gatgacgccg cagacccggc aacgcgcgct agcgaagctg aacaagttca ccgccaaagt cggctatccg atcaagtggc gcgactactc gaagctggcg atcgaccgcg acgacctcta cggtaacgtc cagcgcggct acgccgtcaa ccatgaccgc gagctagcca agcttttcgg cccggtcgac cgcgacgagt ggttcatgac accacaaacc gtcaacgcct actacaaccc ggggatgaac gaaatcgtct tccccgcagc gat'tttacag ccaccatttt tcgatccgca ggccgacgag gccgccaact acggcgggat cggggcggtg atcgggcacg agatcgggca cggtttcgac gatcagggcg ccaaatacga cggcgacggc aatctggtcg attggtggac cgacgacgat cgcaccgagt tcgccgcccg caccaaagcg ttgatcgagc agtaccacgc ttacacgccg cgcgatctcg tcgaccaccc cggcccgcct catgtgcaag gcgcgttcac cataggcgag aacatcggcg acctgggcgg gctgtcgatc gccctgctgg cttaccagct ctcgctgaac ggcaaccccg ctccggttat cgacgggctg accggcatgc aacgggtgtt cttcggctgg gcacaaatat ggcgaaccaa atcgcgtgca gccgaagcaa tccgccggtt ggcggtcgat ccgcactccc cgccggagtt ccggtgcaac ggtgtggttc gcaacgtgga cgctttttat caggccttcg acgtcaccga ggatgacgeg ctgtttctgg acccgcagcg cagggtccgg atctggaac
SEQIDNO:7 Val Ser Phe Val Val Thr Val Pro gIu Ala Val Ala Ala Ala Ala Gly Asp Leu Ala Ala Ile Gly Ser Thr Leu Arg Glu Ala Thr Ala AJ-a Ala Ala Gly Pro Thr Thr Gly Leu Ala Ala Ala Ala Ala Asp Asp Val Ser Ile Ala Val Ser Gln Leu Phe GIy Arg Tyr Gly Glm Glu Phe Gln Thr Val Ser Asn Gln Leu Ala Ala Phe His Thr Glu Phe Val Arg Thr Leu Asn Arg Gly Ala Ala Ala Tyr Leu Asn Thr Glu Ser Ala Asn Gly Gly Gln Leu Phe Gly Gln Ile Glu Ala Gly Gln Arg Ala Val Ser Ala Ala Ala Ala Ala Ala Pro Gly Gly Ala Tyr GIy Gln Leu Val Ala Asn Thr Ala Thr Asn Leu glu Ser Leu Tyr Gly Ala Trp Ser Ala Asn Pro Phe Pro Phe Leu Arg Gln Ile Ile Ala Asn Gln Gln Val Tyr Trp Gln Gln Ile Ala Ala Ala Leu Ala Asn Ala Val GIn Asn Phe Pro Ala Leu Val Ala Asn Leu Pro Ala Ala Ile Asp Ala Ala Val Gln Gln Phe Leu Ala Phe Asn Ala Ala Tyr Tyr Ile Gln GIn Ile Ile Ser Ser Gln Ile GIy Phe Ala Gln Leu Phe Ala Thr Thr Val Gly GIn Gly Val Thr Ser Val Ile Ala Gly Trp pro Asn Leu Ala Ala Glu Leu Gln Leu Ala Phe Gln GIn Leu Leu Val Gly Asp Tyr Asn Ala Ala Val Ala Asn Leu GIy Lys Ala Met Thr Asn Leu Leu Val Thr Gly Phe Asp Thr Ser Asp Val Thr Ile Gly Thr Met Gly Thr Thr Ile Ser Val Thr Ala Lys Pro Lys Leu Leu Gly Pro Leu Gly Asp Leu Phe Thr Ile Met Thr Ile Pro Ala Gln Glu Ala Gln Tyr Phe Thr Asn Leu Met Pro Pro Ser Ile Leu Arg Asp Met Ser Gln Asn Phe Thr Asn Val Leu Thr Thr Leu Ser Asn Pro Asn Ile Gln Ala Val Ala Ser Phe Asp Ile Ala Thr Thr Ala Gly Thr Leu Ser Thr Phe Phe Gly Val Pro Leu Val Leu Thr Tyr Ala Thr Leu Gly Ala Pro Phe Ala Ser Leu Asn Ala Ile Ala Thr Ser Ala Glu Thr Ile GIu Gln Ala Leu Leu Ala GIy Asn Tyr Leu gly Ala Val Gly Ala Leu Ile Asp Ala Pro Ala Hís Ala Leu Asp Gly Phe Leu Asn Ser Ala Thr Val Tjeu asp Thr Pro Ile Leu Val Pro Thr Gly Leu Pro Ser Pro Leu Pro Pro Thr Val Gly Ile Thr Leu His Leu Pro Phe Asp GIy Ile Leu Val Pro Pro His Pro Val Thr Ala Thr Ile Ser Phe Pro Gly Ala Pro Val Pro Ile Pro Gly Phe Pro Thr Thr Val Thr Val Phe GIy Thr Pro Phe Met Gly Met Ala Pro Leu Leu Ile Asn Tyr Ile Pro Gln Gln Leu Ala Leu Ala Ile Lys Pro Ala Ala
SEQIDNO: 8 gtgtcgttcg tggtcacagt gccggaggcc gtggcggctg cggcggggga tttggcggcc atcggctcga cgcttcggga agcgaccgct gcggcggcgg gccccacgac cgggctggcg gccgcggccg ccgacgacgt gtcgatcgct gtctcgcagc tgttcggcag gtacggccag gaatttcaaa ccgtgagcaa ccaactggcc gcgtttcata ccgagttcgt acgcacgttg aaccgcggcg cggcggcgta tctcaacacc gaaagcgcta acggcgggca gctgttcggt cagatcgagg cgggacagcg cgccgtttcc gcggccgcgg ccgccgctcc gggcggcgca tacggccaac tcgttgccaa cacggccacc aacctggaat ccctctacgg cgcatggtcg gccaacccgt tcccattcct ccgccagatc atcgccaacc agcaggttta ctggcagcag atcgccgcgg cgctcgccaa cgccgtccag aacttccccg ccctggtggc gaatttgcca gcggccatcg acgcggccgt ccagcaattc ctggccttca acgcggcgta ctacatccaa cagattatta gctcgcagat cggcttcgcc cagctattcg ccacgacggt cggtcagggg gtcaccagcg tcattgccgg gtggcccaac cttgcggcgg agcttcagct agcgtttcaa cagcttctgg tgggtgacta caacgccgcg gtggcgaacc tgggtaaggc catgacaaac cttctggtca ccgggttcga caccagcgac gtgacgatcg gcacaatggg caccaccatt agtgtcaccg cgaaacccaa gctgctgggc ccgctgggag atctgttcac catcatgacc atcccggcac aagaggcgca gtacttcacc aacctgatgc ccccctccat cctgcgagac atgtcgcaga acttcaccaa cgtgctcacg acgctctcca acccgaacat ccaggcggtc gcttcgttcg atatcgcaac caccgccggg actttgagca ccttcttcgg ggtgccattg gtgctcactt acgccacatt gggtgcgccg ttcgcgtcac tgaacgcgat tgcgacgagc gcggaaacca tcgagcaggc cctgttggcc ggcaactacc taggggcggt gggtgcgctt atcgacgccc cggcccacgc gttagacggc ttcctcaaca gcgcaaccgt gttggatacg ccgatcctgg tgcccacggg gctcccgtcc cctctgcccc cgacggtcgg gatcacgctg cacttgcctt tcgacgggat tctcgtgccg ccgcatcccg tcaccgcgac gatcagcttc ccgggtgctc cggttcctat tcccggtttc ccaaccaccg taaccgtttt cggcacaccc ttcatgggaa tggctccgct gctgatcaac tacattcccc aacagctcgc cctggcaatc aaaccggcgg ct SEQIDNO:9
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MSQIMYNYPAMLGIIAGDMAGYAGTLQSLGRIAWQAALQSAWQGDTGITYQAWQAQWNQ AMEDLVRAYHAMSSTHEANTMNMARDTAEAAKWGG
SEQIDNO:13 MSNSRRRSLRWSWLLSVLAAVGLGLATAPAQAAPPALSQDRFADFPALPLDPS~AQVG pQVVNINTKLgYNNAVGAGTGIVIDPNGVVLàTNNHVIAGATDINAFSVGSGQTYGVDVVG YDRTQDVAVIjQLRGAGGT,PSAAIGGGVAVGEPVVAMGNSGGQGGTPRAVPGRWALGQTV QAsDsLTgAEETLNgLIQFDAAIQpgDsggpmgLgQvvgMNTAAsDNFQLsQggQgFA IpIgqAMAIAgqIRSGGGSPTVHIGPTAFLGLGVVDNNGNGARVQRWGSAPAASLGIST GDVITAVDGAPINSATAMADALNGHHPGDVISVTWQTKSGGTRTGN"VTLAEGPPA SEQIDNO:14 MVDFgALppEINSARMYAGPGSASLVAAAQMWDSVASDLFS4SAFQSWWGLTVGSWIG SSAGLMVAAASPYVAWMSVTAGQAELTAAQVRVAAAAYETAYGLTVPPPVIAF,NRAFT,MI
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E GQMGARAGGGLSGVLRV'PPRPYVMPHSPAAG SEQIDNO:15 » MRTpRRHCRRIAVLAAVSIAATWAGCSSGSKPSGGPLPDKPLVEEATAQTKALKSAHM VLTVNgKIpglSLKTLSgDLTTNPTAATGNVKLTLGGSDID-ADFVVFDGILYATLTPNQW sDFgpAADIYDpAQvLNpDTgLANvLANFADAmgRDTINgQNTIRIsgKvsAQAvNQI AppFNATqpVpATVWIqETGDHQLAQAQLDRGSGNSVQMTLSKWGEKVQVTKPPVS SEQIDNO:16 MAKTIAYDEEARRGLERGLNALADAVKVTLGPKG"LEKKWGAPTITNDGVSIAKEIE
LEDPYEKIGAELVKEVAKKTDDVAGDGTTTATVLAQALVREGLRNVAAGWPLGLKRGIE
KAVEKVTETLLKGAKEVZTKEQIAATAAISAGDQSIGDLIAEWDKVGNEGVITWESNT FgLqLELTEgMRFDKGYISGYWTDPERQEAVLEDPYILLVSSKVSTVKDLLPLLEKVIG AgKpLLIIAEDVEgEALSTLVVNKIRGTFKSVAVKAPGFGDRR-QDMAILTGGQVIS EEVgLTLENADLSLLGKA-RKVWTKDETTIVEGAGDTDAIAGRVAQIRQEIENSDSDYDR EKLqERLAKLAGgVAVIKAGAATEVELKERKHRIEDAVRNVEEGIVAGGGVTLLQA ApTLDELKLEgDEATGANIVKVALEAPLKQIAFNSGLEPGVVkKVRNLPAGHGLNAQTG wEDLLmgvADp~TRs&QN4sIAgLFLTTEAwADKpERmsvpgggDMggmF SEQIDNO:17
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AAAKKAPAKKAAAKKVTQK SEQIDNO:18 vTQTgKRQRRKFgRIRQFNsgRwQAsYTgpDgRwIApKTFNAKIDAEAwLTDmEIDR qLWSpASgqEDRpgApFgEYAEGWLKQRGIKDRTRAHYRKLLDNHILATFADTDLRDITP AAYRRWYATTAVGTPTMRAHSYSLLRAíMQTALADDLIDSNPCRISGASTARRVHKIRPA TLDELETITKAMPDPYQAF\/LMAAWLAMRYGELTELRRKDIDLHGEVARVRRA"WVGEG FKvTTpKsDAgvRDIsIppHLIpAIEDHLHKHvNpgmsLLFpsmDpNRHLApsALYRM FyKARKAAgRpDLRVHDLRHSGAVLAASTGATLAELMQRLGHSTAG~RYQHAAKGRDR
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SEQIDNO:24 atgtcgcaaatcatgtacaactaccccgcgatgttgggtcacgccggggatatggccgga tatgccggcacgctgcagagcttgggtgccgagatcgccgtggagcaggccgcgttgcag agtgcgtggcagggcgataccgggatcacgtatcaggcgtggcaggcacagtggaaccag gccatggaagatttggtgcgggcctatcatgcgatgtccagcacccatgaagccaacacc atggcgatgatggcccgcgacacggccgaagccgccaaatggggcggctag
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SEQIDNO:51 atgacggagccagcggcgtgggacgaaggcaagccgcgaatcatcactttgaccatgaac cccgccttggacatcacgacgagcgtcgacgtggtgcgcccgaccgagaaaatgcgttgt ggcgcacctcgctacgatcccggcggcggcggtatcaatgtcgcccgcattgtgcatgtc ctcggcggttgctcgacagcactgttcccggccggcgggtcgaccgggagcctgctgatg gcgctgctcggtgatgcgggagtgccatttcgcgtcattccgatcgcggcctcgacgcgg gagagcttcacggtcaacgagtccaggaccgccaagcagtatcgtttcgtgcttccgggg ccgtcgctgaccgtcgcggagcaggagcaatgcctcgacgaactgcgcggtgcggcggct tcggccgcctttgtggtggccagtggcagcctgccgccaggtgtggctgccgactactat .cagcgggttgccgacatctgccgccgatcgagcactccgctgatcctggatacatctggt ggcgggttgcagcacatttcgtccggggtgtttcttctcaaggcgagcgtgcgggaactg cgcgagtgcgtcggatccgaactgctgaccgagcccgaacaactggccgccgcacacgaa ctcattgaccgtgggcgcgccgaggtcgtggtggtctcgcttggatctcagggcgcgcta ttggccacacgacatgcgagccatcgattttcgtcgattccgatgaccgcggttagcggt gtcggcgccggcgacgcgatggtggccgcgattaccgtgggcctcagccgtggctggtcg ctcatcaagtccgttcgcttgggaaacgcggcaggtgcagccatgctgctgacgccaggc accgcggcctgcaatcgcgacgatgtggagaggttcttcgagctggcggccgaacccacc gaagtcgggcaggatcaatacgtttggcacccgatcgttaacccggaagcctcgccatga
SEQIDNO:52 atgccggacaccatggtgaccaccgatgtcatcaagagcgcggtgcagttggcctgccgc gcaccgtcgctccacaacagccagccctggcgctggatagccgaggaccacacggttgcg ctgttcctcgacaaggatcgggtgctttacgcgaccgaccactccggccgggaagcgctg ctggggtgcggcgccgtactcgaccactttcgggtggcgatggcggccgcgggtaccacc gccaatgtggaacggtttcccaaccccaacgatcctttgcatctggcgtcaattgacttc agcccggccgatttcgtcaccgagggccaccgtctaagggcggatgcgatcctactgcgc cgtaccgaccggctgcctttcgccgagccgccggattgggacttggtggagtcgcagttg cgcacgaccgtcaccgccgacacggtgcgcatcgacgtcatcgccgacgatatgcgtccc gaactggcggcggcgtccaaactcaccgaatcgctgcggctctacgattcgtcgtatcat gccgaactcttttggtggacaggggcttttgagacttctgagggcataccgcacagttca ttggtatcggcggccgaaagtgaccgggtcaccttcggacgcgacttcccggtcgtcgcc aacaccgataggcgcccggagtttggccacgaccgctctaaggtcctggtgctctccacc tacgacaacgaacgcgccagcctactgcgctgcggcgagatgctttccgccgtattgctt gacgccaccatggctgggcttgccacctgcacgctgacccacatcaccgaactgcacgcc agccgagacctggtcgcagcgctgattgggcagcccgcaactccgcaagccttggttcgc gtcggtctggccccggagatggaagagccgccaccggcaacgcctcggcgaccaatcgat qaaqtqtttcacqttcqqqctaaqqatcaccqqtaq
SEQIDNO:53 atgaccaccgcacgcgacatcatgaacgcaggtgtgacctgtgttggcgaacacgagacg ctaaccgctgccgctcaatacatgcgtgagcacgacatcggcgcgttgccgatctgcggg gacgacgaccggctgcacggcatgctcaccgaccgcgacattgtgatcaaaggcctggct gcgggcctagacccgaataccgccacggctggcgagttggcccgggacagcatctactac gtcgatgcgaacgcaagcatccaggagatgctcaacgtcatggaagaacatcaggtccgc cgtgttccggtcatctcagagcaccgcttggtcggaatcgtcaccgaagccgacatcgcc cgacacctgcccgagcacgccattgtgcagttcgtcaaggcaatctgctcgcccatggcc ctcgccagctag SEQJDNO:54 atggcaagttctgcgagcgacggcacccacgaacgctcggcttttcgcctgagtccaccg gtcttgagcggcgccatgggaccgttcatgcacaccggtctgtacgtcgctcaatcgtgg cgcgactatctgggtcaacagcccgataaactgccgatcgcacggcccactattgcctta gcggcgcaagcctttcgagacgaaatcgtcctgctgggcctcaaggcacgacgtccggtc agcaatcatcgagtgttcgagcgcatcagccaagaagtggccgctggactggagttctat gggaatcgcagatggctggagaagcctagcggattttttgcccagcccccaccgctcacc gaggtcgcggtccgaaaggtcaaggaccgcagacgctccttttatcgcatcttcttcgac agtgggtttacgccgcatccgggtgaaccgggcagccaacggtggctctcatacactgcg aacaatcgcgagtacgccctgtta-ctgcggcacccagagccgcgtccctggctggtttgt gtacacggcaccgagatgggcagggccccgttggatctcgcggtgttccgcgcctggaag ctgcatgacgaactcggcctgaacattgtcatgccggttcttccgatgcatggtccccgc gggcaaggtctgccgaagggcgccgtttttcccggagaagatgttctcgacgatgtgcat gggacggctcaagcggtgtgggatatccggcggctgttgtcctggataCgatcgcaggag gaggagtcgctgatcgggttgaacggtctctcgctgggcggctacatcgcgtcattggtc gccagcctcgaagaaggtctcgcctgcgcgattctcggtgtcccagtggctgatctgatc gagttgttgggccgccactgcggtcttcggcacaaagacccccgccgccacaccgtcaag atggccgaaccgatcggccgaatgatctcgccgctctcacttacgccactggtgcccatg ccgggccgctttatctacgcgggcattgccgaccgactcgtgcatccacgcgaacaggtg actcgcctctgggagcactggggcaaacccgaaatcgtgtggtatccaggcggtcacact ggcttcttccagtcgcggccggtacgacggtttgtccaggctgcgctggagcagtcgggc ctgttggacgcgccacggacacagcgcgaccgttccgcctaa SEQIDNO:55 atgtccacgcaacgaccgaggcactccggtattcgggctgttggcccctacgcatgggcc ggccgatgtggtcggataggcaggtggggggtgcaccaggaggcgatgatgaatctagcg ' atatggcacccgcgcaaggtgcaatccgccaccatctatcaggtgaccgatcgctcgcac gacgggcgcaCagcacgggtgcctggtgacgagatcactagcaccgtgtccggttggttg tcggagttgggcacccaaagcccgttggccgatgagcttgcgcgtgcggtgcggatcggc gactggcccgctgcgtacgcaatcggtgagcacctgtccgttgagattgccgttgcggtc taa SEQIDNO:56 LDFATLPPEINSARMYSGAGSAPML4ASAWHGLSAELRASALSYSSVLSTLTGEEWHGP AsAsMTAAAApYvAwMsvTAvRAEQAgAQAEAAAAAYEmF»TvpppvIEANRAQLmL
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SEQ ID NO: 57 cttgacttcgccacgctaccgcccgaaatcaactcggcgcgtatgtattccggcgcgggc tcggccccgatgctggccgcagcgtcagcctggcacggcttgtccgcagaactgcgcgcc agcgcactgtcatacagctcggtgctttcgacgctgaccggtgaagaatggcacggtccg gcgtcggcatcgatgacagccgcggccgccccctacgtggcctggatgagcgtcaccgcc gtccgggccgagcaggccggggcacaggcggaggctgccgctgcagcgtacgaagccgcg ttcgcagcaacggtgcccccgccggtcatcgaggccaaccgcgcccagctcatggcgctg atcgccaccaatgtgctaggccaaaacgcccccgcgatcgcggccaccgaggcccagtac gccgaaatgtggtcccaggacgcgatggccatgtacggctacgccggcgcctcggcagcc gctacccagctgaccccgttcaccgagccggtgcagactaccaacgcgtccggcctggcg gcccagtcggctgcgattgcccacgccaccggcgcctcggctggtgctcagcaaacgacg ctgtcgcagctgatcgccgccataccgtctgtactgcaaggactttcgtcatcgactgca . gccacgttcgcgtcggggccgtccggattgctgggcattgtcgggtctggatcttcctgg ctcgacaaactctgggcgttactggaccccaactccaatttctggaacacgatagcttcg tccggactgttcttgccgagtaacacgattgcgccctttttgggtctactcggcggcgtg gcagctgcggatgcggccggggatgtgttgggagaggccaccagtggcgggctcggtggc gcgctggtggcgccgcttggctcagcgggcgggctaggcggcactgtcgcggccggcctg ggcaacgcggccaccgtcggaaccttgtcggtgccgccgagctggacggcggccgcacca ctagccagccccttgggctccgcgttgggaggcacaccgatggtggcaccgcccccagca gtggcggccggcatgcccggaatgcctttcggcaccatgggcggtcaaggcttcgggcgt gccgtgccccagtatggcttccgccccaacttcgtcgcacgaccgcccgccgccggg A invenção será adicionalmente clarificada pelos exemplos que se seguem, os quais são pretendidos para serem puramente ilustrativos da invenção e, de modo algum, limitadores.
EXEMPLOS Exemplo 1 - Vacinas de subunidades contendo os polipeptideos da in- venção Para preparar as vacinas de subunidades que compreendem os polipeptídeos, é necessário, antes de tudo, obter um fornecimento de poli- lO peptídeo para preparar a vacina. lsto pode ser obtido purificando as proteí- nas de interesse a partir da cultura de TB, ou cionando o gene de interesse e produzindo uma proteína recombinante. As sequências de codificação para os genes de interesse são amplificadas por PCR, com os sÍtios de restrição inseridos na extremidade de N e na extremidade de C para permitir a clonagem em quadro em um vetor de expressão de proteína, tal como o pET-15b. Os genes são inseridos através de um promotor induzível, tal como o lacZ. O vetor é então transfor- mado na E. co/i, a qual é desenvolvida em cultura. A proteína recombinante é superexpressa e é purificada. Um dos métodos de purificação comuns é produzir uma proteína recombinante com uma marca N terminal para a purificação - por exemplo, uma marca de His. A proteína pode então ser purificada de acordo com a afinidade da marca de His pelos Íons de metais sobre uma coluna de Ni- NTA, após o que a marca de His é clivada. A proteína purificada é então administrada aos animais em um adjuvante adequado. Onde forem usados em combinação pelo menos 2 antígenos mi- cobacterianos, o 1° e o 2° antígenos micobacterianos podem ser expressos como polipeptídeos separados e usados em combinação por mistura com adjuvante e inoCulação em um único local. Altemativamente, o 1° e o 2° an- lO tígenos micobacterianos podem ser expressos como uma proteína de fusão, misturados com o adjuvante e usados para inocular em um único local. Exemplo 2 - uso do BCG como um veículo microbiano A sequência de polinucleotÍdeos de interesse é amplificada por PCR. O produto amplificado é purificado e clonado em um plasmídio (pMV306) que integra o sÍtio especificamente no genoma micobacteriano no sÍtio de união (att8) para o micobacteriófago L5. O BCG é transformado com o plasmídio por eletroporação, que envolve danificar o envoltório da célula com pulsos elétricos de alta volta- gem, resultando na captação do DNA. O plasmídio integra-se no cromosso- mo do BCG no sÍtio att8, gerando recombinantes estáveis. Os recombinan- tes são selecionados e são checados por PCR ou Southern blotting para assegurar que o gene foi integrado. A cepa recombinante é então usada pa- ra os estudos de proteção. A sequência de polinucleotÍdeos de interesse pode compreender um único antígeno micobacteriano, o 1° e o 2° antígenos micobacterianos, ou os fragmentos deles, como definidos neste documento.
Exemplo 3 - Vetores virais (por exemplo, o vírus da Vacínia atenuado) expressando genes micobacterianos Região Esquerda Promotor Gene(s) Alvo(s) Região Direita Flanqueante Flanqueante
Um dos melhores exemplos deste tipo de abordagem é o uso do vÍrus da Vacínia Modificada Ancara (MVA). As metodologias que permitem a recombinação de genes estranhos ou alvos no gene da MVA são bastante conhecidas na técnica [1.2]. A inserção do(s) gene(s) alvo(s) é mediada pelo DNA de transfe- rência, com características similares àquelas mostradas acima. O DNA de transferência pode estar na forma de um plasmídio, que pode ser propagado em uma cepa bacteriana, otimizada para procedimentos de clonagem de rotina. O(s) gene(s) alvo(s) é(São) introduzido(s) no cassete a jusante de um promotor, tal como o mH5, o p7.5 ou outro. O(s) gene(s) alvo(s) pode(m) compreender um ou mais dos poHnucleotídeos da invenção e/ou seus frag- mentos. O(s) gene(s) alvo(s) pode(m) também compreender cofatores auxi- liares, tais como o B7-1 ou a IL-12, confome está bem descrito na técnica
[3]. O(s) gene(s) alvo(s) é(São) posicionado(s) a jusante e em quadro com uma sequência de Kozak otimizada - por exemplo, GCCACCATGG. O(s) gene(s) alvo(s) pode(m) também ser posicionado(s) a·jusante e em quadro com uma sequência Ilder - por exemplo, tPA. O(S) gene(s) alvo(s) pode(m) ser posicionado(s) a montante de uma marca em quadro - por exemplo, V5, HIS ou outra. A transferência do cassete para o genoma de MVA é mediada por regiões flanqueantes homólogas, bastante conhecidas na técnica - por exemplo, Del j - Vl. T
1. Earl PL e col. Current Protocols in Protein Science, (2001) "Generation of recombinant vaccinia viruses".
2. Earl PL e col. Current Protocols in Protein Science, (2001) "Preparation of cell cultures and vaccine virus stocks".
3. Carroll MW e col. Journal of the National Cancer lnstitute, (1998) "Construction and characterization of a triple-recombinant vaccine virus encoding B7-1, lnterleukin 12 and a model tumor antigen". Exempjo 4 - Vacinas de DNA do pIasmídio que carregam poIinucleotí- deos micobacterianos Uma sequência de po|jnuc|eotídeos de interesse é amplificada por PCR, purificada e inserida em vetores especializados, desenvolvidos para o desenvolvimento de vacinas, tais como o pVAXl. Estes vetores con- têm sequências promotoras (por exemplo, promotores de CMV ou SV40), que orientam a forte expressão do polinucleotÍdeo introduzido (que codifica o antígeno candidato) nas células eucarióticas; e sinais de poliadenilação (por exemplo, SV40 ou hormônio do crescimento bovino) para estabilizar o trans- crito de mRNA. O vetor é transformado na E. co/i e os transformantes são sele- cionados usando um marcador, tal como a resistência à canamicina, codifi- cado pelo plasmídio. O plasmídio é então recuperado das colônias transfor- lO madas e é sequenciado para checar que o polinucleotídeo de interesse está presente e é codificado apropriadamente, sem mutações geradas pela PCR. São então produzidas grandes quantidades do plasmidio na E. co/i e o plasmídio é recuperado e purificado usando kits comercialmente dis- poníveis (por exemplo, preparação de plasmídio Endofree da Qiagen). A va- cina é então administrada aos animais (por exemplo, por injeção intramuscu- Iar), na presença ou na ausência de um adjuvante, O DNA do plasmídio que codifica os 1°' antígenos micobacteria- nos ou os 2°' antlgenos micobacterianos separadamente pode ser misturado b e inoculado em um único Iocal de administração. Um único plasmidio pode ser construído que expresse tanto o 1° quanto o 2° antígenos micobacteria- nos (e opcionalmente o terceiro antígeno micobacteriano). Exemplo 5 - Vacinas de DNA do plasmídio que carregam múltiplos poli- nudeotídeos micobacterianos O DNA do pIasmídio adicional que codifica um 3° antlgeno mi- cobacteriano e/ou os antígenos micobacterianos adicionais (por exemplo, o 4° e o 5") separadamente pode ser preparado conforme descrito no Exemplo
4. Os plasmídios separados que codificam o 3° antígeno micobacteriano e/ou os antígenos micobacterianos adicionais podem ser inoculados em um único local de administração, de modo simultâneo ou sequencial, com o DNA do plasmídio que codifica o 1° e o 2° antígenos micobacterianos (por exemplo, conforme preparados no Exemplo 4). Alternativamente, um único plasmídio pode ser construído, con-
forme descrito no Exemplo 4, que expressa o 3° antígeno micobacteriano e um ou mais antígenos micobacterianos adicionais (por exemplo, o 4° e o 5°). Este pIasmídio individual pode ser inoculado em um único local de adminis- tração, de modo simultâneo ou sequencial, com o DNA do pIasmídio que codifica o 1° e o 2° antígenos micobacterianos separadamente ou a partir de um único plasmídio. Alternativamente, um único plasmídio pode ser constru- Ído, conforme descrito no Exemplo 4, que expressa o 1°, o 2° e o 3° antíge- nos micobacterianos (e opcionalmente um ou mais antígenos micobacteria- nos adicionais - por exemplo, o 4° e o 5°). Exemplo 6 - Preparação dos vetores de expressão de DNA As vacinas de DNA consistem em uma sequência de ácidos nu- cleicos de interesse, cIonada em um plasmídio bacteriano. O vetor de plas- mídio pVAXl é comumente usado na preparação das vacinas de DNA. O vetor é projetado para facilitar a replicação com alto número de cópias na E. co/i e a expressão transiente de alto nível do peptídeo de interesse na maior parte das células mamíferas (quanto a detalhes, ver o protocolo dos fabri- cantes para o pVAXl (No. do catálogo V260-20 www.invitroqen.com). O vetor contém os seguintes elementos: > Promotor imediato-jnicja| de citomegalovírus humano (CMV) para a expressão de alto nível em uma variedade de células mamíferas > Promotor T7/sítio de iniciação para permitir a transcrição in vitro na orientação do sentido e o sequenciamento através do inserto > Sinal de poliadenilação do hormônio do crescimento bovino (BGH) para a terminação eficiente da transcrição e a poliadenilação do mR-
NA > Gene de resistência à canamicina para a seleção em E. co/i > Um sÍtio de clonagem múltipla > Origem de pUC para a replicação com alto número de có- pias e o desenvolvimento em E. co/i > SÍtio de iniciação invertido do BGH para permitir o sequenci- amento através do inserto Os vetores podem ser preparados por meio de práticas recombi-
nantes padrões que são conhecidas na técnica, por exemplo, Sambrook e · COI. (1989). Os estágios chave na preparação da vacina são como se se- guem: > O polinucleotÍdeo de interesse é ligado no pVAXl por meio de um dos sítios de clonagem múltipla > A mistura de ligação é então transformada em uma cepa de E. co/i competente (por exemplo, TOPlO) e as placas de LB contendo 50 µg/ml de canamicina são usadas para selecionar os transformantes. > Os clones são selecionados e podem ser sequenciados para confirmar a presença e a orientação do gene de interesse. > Assim que a presença do gene tiver sido verificada, o vetor pode ser usado para transfectar uma linhagem de células mamíferas para checar quanto à expressão da proteína. Os métodos para a transfecção são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, a eletroporação, o fosfato de cálcio, e a lipofecção. > Assim que a expressão do polipeptídeo tiver sido confirma- da, grandes quantidades do vetor podem ser produzidas e purificadas a par- tir do hospedeiro de célula apropriado, por exemplo, E. co/i O pVAXl não se integra no cromossomo do hospedeiro. Todas as sequências não essenciais foram removidas para minimizar a possibilida- de de integração. Quando se constrói um vetor específico, uma sequência Ííder pode ser incluída para orientar a secreção da protelna codificada quan- do expressa dentro da célula eucariótica. Os outros exemplos de vetores que podem ser usados incluem o V1jns.tPA e o pCMV4. Podem ser usados vetores de expressão que se integram no genoma do hospedeiro, entretanto, é mais comum e mais preferível usar um vetor que não se integra. A integração resultaria na geração de um hospe- deiro geneticamente modificado que promoveria outros problemas.
Exemplo 7 - Preparação dos vetores de expressão de DNA contendo múltiplos antígenos As vacinas de DNA consistem em uma sequência de ácidos nu-
cleicos de interesse, clonada em um plasmídio bacteriano. O vetor de pIas- mídio pVAXI é comumente usado na preparação das vacinas de DNA. O vetor é projetado para facilitar a replicação com alto número de cópias na E.
co/i e a expressão transiente de alto nível do peptídeo de interesse na maior parte das células mamíferas (quanto a detalhes, ver o protocolo dos fabri- cantes para o pVAXl (No. do catálogo V260-20 www.invitroqen.com).
O vetor contém os seguintes elementos: > Promotor imediato-inicial de citomegalovírus humano (CMV) para a expressão de aito nível em uma variedade de células mamíferas > Promotor T7/sítio de iniciação para permitir a transcrição in vitro na orientação do sentido e o sequenciamento através do inserto > Sinal de poliadenilação do hormônio do crescimento bovino (BGH) para a terminação eficiente da transcrição e a poliadenilação do mR-
NA > Gene de resistência à canamicina para a seleção em E., co/i > Um sÍtio de clonagem múltipla > Origem de pUC para a replicação com alto número de có- pias e o desenvolvimento em E. co/i > SÍtio de iniciação invertido do BGH para permitir o sequenci- amento através do inserto Os vetores podem ser preparados por meio de práticas recombi- nantes padrões que são conhecidas na técnica, por exemplo, Sambrook e CoI. (1989), clonagem Gateway® (invitrogen, UK)- Os estágios chave na pre- paração da vacina são como se seguem: > Os polinucleotídeos de interesse são ligados no pVAXl por meio de um dos sÍtios de clonagem múltipla, por meio da cIonagem Gate- way®.
> Os polinucleotídeos para mai do que um antígeno podem ser expressos como uma fusão recombinante.
> A cepa de E. co/i competente (por exemplo, TOPl 0) é trans- formada e as placas de LB contendo 50 µg/ml de canamicina são usadas para selecionar os transformantes.
> Os clones são selecionados e podem ser sequenciados para confirmar a presença e a orientação dos genes de interesse. > Assim que a presença dos genes tiver sido verificada, o ve- tor pode ser usado para transfectar uma linhagem de células mamíferas para checar quanto à expressão da proteína.
Os métodos para a transfecção são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, a eletroporação, o fosfato de cálcio, e a lipofecção. > Assim que a expressão do polipeptídeo tiver sido confirma- da, grandes quantidades do vetor podem ser produzidas e purificadas a par- lO tir do hospedeiro de célula apropriado, por exemplo, E. co/i.
O pVAXl não se integra no cromossomo do hospedeiro.
Todas as sequências não essenciais foram removidas para minimizar a possibilida- de de integração.
Quando se constrói um vetor específico, uma sequência líder pode ser incluída para orientár a secreção da proteína codificada quan- do expressa dentro da célula eucariótica.
Os outros exemplos de vetores que podem ser usados incluem o V1Jns.tPA e o pCMV4. Podem ser usados vetores de expressão que se integram no genoma do hospedeiro; entretanto, é mais comum e mais preferível usar um vetor que não se integra.
A integração resultaria na geração de um hospe- deiro geneticamente modificado que promoveria outros problemas.
Um único plasmídio pode ser, assim, construído que expressa múltiplos antígenos micobacterianos.
Por exemplo, o plasmídio individual pode codificar tanto o 1° quando o 2° antígenos micobacterianos.
O plasmí- dio individual pode adicionalmente codificar um ou mais antígenos micobac- terianos adicionais, tais como um 3° antígeno micobacteriano (e opcional- mente um ou mais antígenos micobacterianos adicionais - por exemplo, o 4° e o 5°). Exemplo 8 - Vacina de RNA O RNA pode ser introduzido diretamente no hospedeiro.
Desse modo, uma construção de vetor pode ser usada para gerar o RNA in vitm e o RNA purificado é então injetado no hospedeiro.
O RNA então serve como um molde para a tradução na célula hospedeira.
Nesta modalidade, a inte- gração normalmente não ocorreria.
Uma opção alternativa é usar um agente infeccioso, tal como o genoma retroviral carregando o RNA correspondendo ao gene de interesse.
Nesta modalidade, a integração no genoma do hospedeiro ocorrerá.
Outra opção é o uso de vacinas de replicons de RNA que podem ser derivadas de vetores de vÍrus, tais como o vÍrus Sindbis ou o vÍrus da Floresta de Semliki.
Estas vacinas são autorreplicadoras e autoiimitadoras e podem ser administradas como RNA ou DNA, que é então transcrito nos replicons de RNA in vivo.
O vetor no fim causa a lise das células transfecta- das, desse modo reduzindo as preocupações sobre a integração no genoma do hospedeiro.
Exemplo 9 - Ensaios diagnósticos baseados na avaliação das respos- tas de células imunes Para um ensaio diagnóstico baseado na avaliação das respostas de células imunes (por exemplo, as respostas de células T), seria suficiente obter uma amostra de sangue do paciente.
As células mononucleares (mo- nócitos, linfócitos T e B) podem ser separadas do sangue usando gradientes de densidades, tais como os gradientes Ficoll.
Tanto os monócitos quanto os linfócitos B são ambos capazes de apresentar o antígeno, embora menos eficientemente do que as células apresentadoras de antÍgenos (apcs) profissionais, tais como as células dendrlticas.
Estas estão mais localizadas no tecido linfoide.
A abordagem mais simples seria adicionar o antígeno às células mononucleares separadas e incubar por uma semana e então avaliar a quantidade de proliferação- Se o indivlduo tiver sido exposto ao antígeno previamente através da infecção, então os clones das células imunes (por exemplo, o clones das células T) específicos para o antígeno seriam mais predominantes na amostra e responderiam.
Também é possÍvel separar as diferentes populações celulares, se for desejado controlar a razão de células T para APCs.
Outra variação deste tipo de ensaio é medir a produção de cito-
cinas pelos linfócitos respondedores, como um indicador da resposta.
O en- saio ELISPOT é um exemplo adequado deste ensaio.
Exemplo 10 - detecção das micobactérias latentes A presença de antígeno associado às micobactérias latentes po- de ser detectada por detecção do anticorpo especifico para o antígeno, ou por detecção das células imunes, tais como as células T, nas amostras de sangue.
Uma placa de 96 poços é revestida com anticorpo específico pa- ra citocina (por exemplo, interferon-, IL-2). Os monócitos do sangue periféri- lO co são então isolados do sangue integral do paciente e são aplicados aos poços.
O antígeno é adicionado para estimular células imunes específi- cas (por exemplo, as células T) que possam estar presentes e as placas são incubadas por 24 h.
O antígeno e.stimula as células imunes (por exemplo, as células T) a produzir citocinas, que ligam um anticorpo específico.
As placas são lavadas, deixando uma impressão digital genética em que as células imunes específicas para os antígenos (por exemplo, as céiulas T) estavam presentes.
Um segundo anticorpo acoplado com um sis- tema de detecção adequado, por exemplo, enzima, é então adicionado e o número de pontos é enumerado após o substrato apropriado ter sido adicio- nado.
O número de pontos, cada um correspondendo a uma única célula imune específica para o antígeno (por exemplo, a célula T), é relacionado ao número total de células originalmente adicionadas.
O ensaio acima descrito pode também ser usado para distinguir os indivíduos infectados com TB dos indivíduos vacinados com BCG.
Exemplo 11 - atividade antigênica dos múltiplos antígenos Os camundongos são imunizados com pelo menos um 1" e um 2° antígeno micobacteriano.
Os sistemas de distribuição incluem (porém não estão restritos às) as vacinas de DNA, a MVA recombinante, a proteína com adjuvante.
As rotas de distribuição incluem (porém não estão restritas à) a administração subcutânea, intradérmica, intramuscular.
O regime de imuni- zação pode envolver o início-reforço heteróiogo - por exemplo, 'pré-ativar'
com uma vacina de DNA, seguida por 'reforço' com uma vacina de MVA.
O regime de imunização pode envolver múltiplas doses.
Após a vacinação (por exemplo, cerca de 2 semanas mais tar- de), os esplenócitos são removidos dos animais vacinados e estimulados com (um) polipeptídeo(s) representativo(s) do antígeno, ou antígenos, imuni- zador.
Uma resposta imune é mensurável através da indução da liberação de citocina específica para o antlgeno - por exemplo, lFN-y, e é indicação da imunização contra o antígeno alvo.
Em que um animal tiver sido imunizado com uma vacina com-
lO preendendo um 1° e um 2° antlgeno micobacteriano, uma resposta de lem- brança do antígeno ao 1° e ao 2° antígeno micobacteriano na mesma amos- tra demonstra a imunogenicidade de ambos os antígenos quando coadminis- trados.
A imunogenicidade é um pré-requisito para a eficácia protetora.
Os dados gerados de acordo com este Exemplo são ilustrados nas figuras 1-6. As figuras 1A e B ilustram a resposta dos esplenócitos aos antí- genos Ag85A e Rv1807, sozinhos e em combinação (fig. 1A = intramuscular; fig. 1 B = intradérmico). A figura 2 ilustra a resposta dos esplenócitos aos antígenos Ag85A e RvO111, sozinhos e em combinação.
A figura 3 ilustra a resposta dos esplenócitos aos antígenos Ag85A e RVO198, sozinhos e em combinação. ' A figura 4 ilustra a resposta dos esplenócitos aos antígenos Ag85A e RV1807, sozinhos e em combinação (repetição dos dados IM na figura 1B)- A figura 5 ilustra a resposta dos esplenócitos aos antlgenos Ag85A e RV1806, sozinhos e em combinação.
A figura 6 ilustra a resposta dos esplenócitos aos antígenos RV1806, RV1807, RVO198 e RVO111, sozinhos e em combinação.
Exemplo 12 - demonstrando a eficácia das vacinas em um modelo ex- perimental A eficácia dos candidatos de vacinas em porquinhos-da-índia pode ser avaliada de acordo com a redução da carga bacteriana de M. tu- bercu/osis nos pulmões e/ou nos baços, em 4 semanas após o desafio com aerossol.
O 1° e o 2° antígenos micobacterianos são distribuídos como vacinas de subunidades de DNA ou proteína em um adjuvante indutor de Thl, tal como DDNMPL, ou por vetores de expressão, tais como os vÍrus recombinantes ou o BCG (ver os Exemplos 1-4). O 1" e o 2° antígenos mi- cobacterianos são distribuídos em um modo projetado para pré-ativar o sis- tema imune, o que inclui tanto quanto o acima descrito.
Pelo menos um 're- lO forço' à pré-ativação inicial é dado através da inoculação de DNA, polipepti- deo ou vetor viral ou (menos comumente) BCG recombinante.
Os grupos de seis a oito porquinhos-da-índia são imunizados duas ou três vezes, com um repouso de 2 a 3 semanas entre cada imunização.
Após a inoculação final, os porquinhos-da-índia são repousados por 6 semanas, antes do desafio.
Um grupo de animais de controle positivos é inoculado de modo subcutâneo com 5 x 10' unidades formadoras de coIônias (CFU) de BCG Dinamarquês (1331), e a um grupo de animais de controle negativos é dada a solução salina.
Seis semanas após a vacinação final, os aerossóis de partículas finas de M. tubercu/osis (2 µm de diâmetro médio; gerados em um nebuliza- dor Collison) são distribuídos diretamente no focinho do animal, usando um aparelho Henderson incluído.
Uma suspensão da cepa de desafio, M tuber- culosis H37RV (NCTC 7416), cultivada sob condições definidas em um qui- miostato, é diluída até 1 x 106 CFU/M para obter uma dose inalada, retida,
estimada, de aproximadamente 10 CFU/pulmão.
Quatro semanas após o desafio com aerossol, os animais são humanamente mortos, e os pulmões removidos para a determinação da CFU.
As amostras homogeneizadas são diluídas em série e prepara- das sobre ágar seletivo Middlebrook 7H11 e a CFU média para cada grupo de tratamento é determinada.
A eficácia da vacina é avaliada em termos de redução nas contagens bacterianas nos pulmões ou nos baços, em compa-
ração com o grupo de controle de solução salina.
O |og10 CFU médio das vacinas de teste é comparado com os controles negativos e as diferenças entre os grupos são analisadas estatisticamente usando um teste apropria- do, tal como Mann-Whitney.
Qualquer combinação do 1° e do 2° antlgenos micobacterianos dando uma redução no número de M. tubercu/osis viável que seja estatística e significativamente (p="0,05) menor do que os controles falsos vacinados (solução salina) demonstra a eficácia protetora dos antígenos quando coad- ministrados.
A eficácia protetora nos porquinhos-da-índia é indicativa da ca- pacidade da vacina em combinação de proteger os seres humanos e os a- nimais da infecção micobacteriana patogênica.
Exemplo 13 - demonstrando a eficácia das vacinas em um modelo ex- perimental A eficácia dos candidatos de vacinas em porquinhos-da-índia pode ser avaliada de acordo com a redução da carga bacteriana de M. tu- bemu/osis nos baços, em 4 semanas após o desafio com aerossol.
O 1° e o 2° antígenos micobacterianos são distribuídos como vacinas de subunidades de DNA ou proteína em um adjuvante indutor de Thl, tal como DDNMPL, ou por vetores de expressão, tais como os vÍrus recombinantes ou o BCG (ver os Exemplos 1-4). O 1° e o 2° antígenos mi- cobacterianos são distribuídos em um modo projetado para pré-ativar o sis- tema imune, o que inclui tanto quanto o acima descrito.
Pelo menos um 're- forço' à pré-ativação inicial é dado através da inoculação de DNA, polipeptí- deo ou vetor viral ou (menos comumente) BCG recombinante.
Os grupos de seis a oito porquinhos-da-índia são imunizados duas ou três vezes, com um repouso de 2 a 3 semanas entre cada imunização.
Após a inoculação final, os porquinhos-da-índia são repousados por 6 semanas, antes do desafio.
Um grupo de animais de controle positivos é inoculado de modo subcutâneo com 5 x 10' unidades formadoras de colônias (CFU) de BCG Dinamarquês (1331), e um grupo de animais de controle negativos recebe a solução salina ou permanece não vacinado.
Seis semanas após a vacinação final, os aerossóis de partículas finas de M. tubercu/osis (2 µm de diâmetro médio; gerados em um nebuliza- dor Collison) são distribuldos diretamente no focinho do animal, usando um aparelho Henderson incluido.
Uma suspensão da cepa de desafio, M tuber- cu/osis H37RV (NCTC 7416), cultivada sob condições definidas em um qui- miostato, é diluída até 1 x 106 CFU/M para obter uma dose inalada, retida, r estimada, de aproximadamente 10 CFU/pulmão.
Quatro semanas após o desafio com aerossol, os animais são humanamente mortos, e os baços removidos para a deteminação da CFU.
As amostras homogeneizadas são diluídas em série e prepara- das sobre ágar seletivo Middlebrook 7H11 e a CFU média para cada grupo de tratamento é determinada.
A eficácia da vacina é avaliada em termos de redução nas contagens bacterianas nos baços, em comparação com o grupo de controle de solução salina ou não vacinado.
O |Og'0 CFU médio das vaci-
nas de teste é comparado com os controles negativos e as diferenças entre os grupos são analisadas estatisticamente usando um teste apropriado, tal como Mann-Whitney.
Qualquer combinação do 1° e do 2° antígenos micobacterianos dando uma redução no número de M. tuberculosis viável que seja estatística e significativamente (p="0,05) menor do que os controles não vacinados demonstra a eficácia protetora dos antígenos quando coadministrados.
A eficácia protetora nos porquinhos-da-índia é indicativa da ca- pacidade da vacina em combinação de proteger os seres humanos e os a- nimais da infecção micobacteriana patogênica.
Os dados gerados de acordo com este Exemplo são ilustrados na figura 7. A figura 7 ilustra a redução na carga bacteriana em resposta a cada um dos antígenos RvO111, RvO198c, Rv3812, Rv1806 e Rv180 sozi- nhos, e em resposta a uma combinação dos antígenos RVO111 e RVO198C.
Exemplo 14 - atividade antigênica dos múltiplos antígenos Os camundongos são imunizados com pelo menos um 1° e um 2° antígeno micobacteriano.
Os sistemas de distribuição incluem (porém não estão restritos às) as vacinas de DNA, a MVA recombinante ou a proteína com adjuvante.
As rotas de distribuição incluem (porém não estão restritas à) a administração subcutânea, intradérmica ou intramuscular.
O regime de imunização pode envolver o início-reforço heterólogo - por exemplo, 'pré- ativar' com uma vacina de DNA, seguida por 'reforço' com uma vacina de MVA, e/ou pode envolver múltiplas doses.
Após a vacinação (por exemplo, cerca de 2 semanas mais tar- de), os soros são removidos dos animais vacinados e examinados quanto à presença de anticorpos.
Uma resposta imune é mensurável através da de- tecção de anticorpos específicos para o antígeno imunizador - por exemplo, conforme detectados por meio de ELISA.
Em que um animal tiver sido imunizado com uma vacina com- preendendo um 1° e um 2° antígeno micobacteriano, a presença na mesma amostra de anticorpos para o 1° e o 2" antígeno micobacteriano demonstra a imunogenicidade de ambos os antígenos quando coadministrados.
A imuno- genicidade é um pré-requisito para a eficácia protetora.

Claims (30)

REIVINDICAÇÕES
1. Composição antigênica compreendendo: (i) um primeiro poIipeptídeo antigênico micobacteriano, em que o dito primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da se- quência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; ou (ii) um primeiro polinucleotídeo micobacteriano, em que o dito primeiro polinucleotideo micobacteriano compreende uma sequência de po- linucleotídeos codificando o dito primeiro polipeptídeo antigênico micobacte- riano; e adicionalmente compreendendo: (iii) um segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano, em que o dito segundo poIipeptÍdeo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da se- quência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos dela; ou (iv) um segundo polinucleotídeo micobacteriano, em que o dito segundo polinucleotÍdeo micobacteriano compreende uma sequência de po- linucleotídeos codificando o dito segundo poIipeptídeo micobacteriano.
2. Composição antigênica de acordo com a reivindicação 1, em que o dito primeiro polinucleotídeo micobacteriano compreende uma se- quência de polinucleotídeos tendo pelo menos 70% de identidade da se- quência de nucleotideos com a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID NO: 2, ou um seu fragmento tendo pelo menos 21 nucleotídeos consecutivos da mesma .
3. Composição antigênica de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que o dito segundo polinucleotídeo micobacteriano compreende uma sequência de polinucleotÍdeos tendo pelo menos 7O°/j de identidade da se- quência de nucleotídeos com a sequência de ácidos nucleicos de SEQ ID
NO: 6, ou um seu fragmento tendo pelo menos 21 nucleotídeos consecutivos da mesma.
4. Composição antigênica de acordo com quaisquer das reivindi- cações 1 a 3, adicionalmente compreendendo pelo menos um polipeptídeo antigênico micobacteriano adicional, o qual é diferente do dito primeiro poIi- peptídeo antigênico micobacteriano e/ou do dito segundo polipeptídeo anti- gênico micobacteriano; ou adicionalmente compreendendo pelo menos um polinucleotÍdeo micobacteriano adicional, o qual é diferente do dito primeiro polinucleotídeo micobacteriano e/ou do dito segundo polinucleotídeo mico- lO bacteriano.
5. Composição antigênica de acordo com a reivindicação 4, em que o dito pelo menos um poIipeptídeo antigênico micobacteriano adicional compreende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de i- dentidade da sequência de aminoácidos com uma sequência de aminoáci- dos selecionada a partir de quaisquer de SEQ ID NOS: 3, 7, 9-20, 34-44 ou 56, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma.
6. Composição anticjênica de acordo com a reivindicação 4, em que o dito pelo menos um polinucleotÍdeo micobacteriano adicional compre- ende uma sequência de polinucleotideos codificando uma sequência de po- Hpeptídeos como definida na Reivindicação 5; tal como uma sequência de polinucieotídeos tendo pelo menos 70°6 de identidade da sequência de nu- cleotídeos com uma sequência de ácidos nucleicos selecionada a partir de SEQ ID NOS: 4, 8, 21-32, 45-55 ou 57, ou um seu fragmento tendo pelo me- nos 21 nucleotídeos consecutivos da mesma.
7. Composição antigênica de acordo com qualquer reivindicação anterior, em que a dita composição antigênica compreende pelo menos um vetor; em que o dito vetor compreende pelo menos um dos ditos polinucleo- tídeos micobacterianos.
8. Composição antigênica de acordo com a reivindicação 7, em que o dito vetor compreende o dito primeiro polinucleotídeo micobacteriano e o dito segundo polinucleotÍdeo micobacteriano.
9. Composição antigênica de acordo com a reivindicação 7 ou 8, em que o dito vetor é um vetor de expressão, ou um vetor viral, tal como um vetor do vÍrus da vacínia atenuado ou vetor adenoviral.
10. Composição antigênica de acordo com qualquer reivindica- ção anterior, em que a dita composição antigênica compreende pelo menos uma célula, e em que a dita célula compreende pelo menos um dos ditos polipeptídeos antigênicos micobacterianos e/ou polinucleotídeos micobacte- rianos; tal como em que a dita célula é um veículo microbiano atenuado, tal como a salmonela atenuada, a M. bovis atenuada (por exemplo, a cepa de BCG) ou a M. tubercu/osis atenuada.
11. Composição imunogênica compreendendo um primeiro anti- corpo e um segundo anticorpo, em que o dito primeiro anticorpo liga um pri- meiro polipeptídeo antigênico micobacteriano e o dito segundo anticorpo Iiga um segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano; em que o dito primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 7O°/j de i- dentidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; e em que o dito segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de i- dentidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma.
12. Método para produzir uma formulação terapêutica ou profilá- tica (por exemplo, vacina), o método compreendendo combinar um veículo farmaceuticamente aceitável com: (i) um primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano, em que o dito primeiro polipeptideo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da se- quência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; ou (ii) um primeiro polinucleotídeo micobacteriano, em que o dito primeiro pohnucleotídeo micobacteriano compreende uma sequência de po- linucleotídeos codificando o dito primeiro polipeptídeo antigênico micobacte- riano; e com: (iii) um segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano, em que o dito segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da se- lO quência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; ou (iv) um segundo polinucleotídeo micobacteriano, em que o dito segundo polinucleotídeo micobacteriano compreende uma sequência de po- linucleotídeos codificando o dito segundo polipeptídeo micobacteriano.
13. Método de acordo com a reivindicação 12, compreendendo combinar o dito veiculo farmaceuticamente aceitável com uma composição antigênica como definido em quaisquer das reivindicações 1 a 10.
14. Método para produzir uma formulação terapêutica ou profilá- tica (por exemplo, vacina), o método compreendendo combinar um veículo farmaceuticamente aceitável com um primeiro anticorpo e um segundo anti- corpo; em que o dito primeiro anticorpo liga um primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano; em que o dito primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; e em que o dito segundo anticorpo liga um segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano, em que o dito segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma.
15. Método de acordo com a reivindicação 14, compreendendo combinar o dito veículo farmaceuticamente aceitável com uma composição imunogênica como definido na reivindicação 11.
16. Formulação terapêutica ou profilática (por exemplo, vacina), . compreendendo um veiculo farmaceuticamente aceitável e: (i) um primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano, em que o dito primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70°6 de identidade da se- quência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; ou (ii) um primeiro polinucleotÍdeo micobacteriano, em que o dito primeiro polinucleotÍdeo micobacteriano compreende uma sequência de po- linucleotÍdeos codificando o dito primeiro polipeptídeo antigênico micobacte- riano; e: (iii) um segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano, em que o dito segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de polipeptÍdeos tendo pelo menos 70% de identidade da se- quência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de Seq ÍD NO: 5, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; ou (iv) um segundo polinucleotídeo micobacteriano, em que o dito segundo polinucleotídeo micobacteriano compreende uma sequência de po- linucleotídeos codificando o dito segundo polipeptldeo micobacteriano; em que a dita formulação é para a administração simultânea ou sequencial do dito primeiro polipeptÍdeo ou polinucleotídeo antigênico mico- bacteriano e do dito segundo polipeptídeo ou poIinucleotÍdeo antigênico mi- cobacteriano.
17. Formulação de acordo com a reivindicação 16, compreen-
— 6/11 dendo uma composição antigênica como definido em quaisquer das reivindi- cações 1 a 10.
18. Formulação terapêutica ou profilática (por exemplo, vacina), compreendendo um veículo farmaceuticamente aceitável e: (a) um primeiro anticorpo, em que o dito primeiro anticorpo Iiga um primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano; em que o dito primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de poli- peptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de aminoáci- dos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, ou um seu fragmen- lO to tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; e (b) um segundo anticorpo, em que o dito segundo anticorpo li- ga um segundo polipeptldeo antigênico micobacteriano; em o dito segundo antígeno micobacteriano compreende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70°6 de identidade da sequência de aminoácidos com a se- quência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; em que a dita formulação é para a administração simultânea ou sequencial dos ditos primeiro e segundo anticorpos.
19. Formulação de acordo com a reivindicação 18, compreen- dendo uma composição imunogênica como definido na reivindicação 11.
20. Primeiro poIipeptldeo antigênico micobacteriano ou primeiro poHnucleotídeo micobacteriano, e um segundo polipeptídeo antigênico mico- bacteriano ou segundo poHnucleotídeo micobacteriano, para uso no estímulo de uma resposta imune em um paciente; em que (i) o dito primeiro polipep- tídeo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de polipeptl- deos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; (ii) a dita primeira sequência de polinucleotídeos micobacteria- nos compreende uma sequência de po|jnuc|eotídeos codificando o dito pri- meiro polipeptídeo antigênico micobacteriano; (iii) - o dito segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de i- dentidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; e 5 (iv) a dita segunda sequência de polinucleotÍdeos micobacteri- anos compreende uma sequência de poiinucleotÍdeos codificando o dito se- gundo polipeptídeo antigênico micobacteriano.
21. Primeiro polipeptídeo ou poHnucleotldeo antigênico micobac- teriano e um segundo polipeptídeo ou polinucleotídeo antigênico micobacte- lO riano para uso de acordo com a reivindicação 20, em que o dito primeiro po- . lipeptídeo ou polinucleotideo antigênico micobacteriano e o dito segundo polipeptídeo ou polinucleotÍdeo antigênico micobacteriano são para a admi- nistração ao paciente substancialmente de modo simultâneo, ou sequencial.
22. Primeiro polipeptídeo ou polinucleotÍdeo antigênico micobac- . 15 teriano e um segundo polipeptídeo ou polinucleotÍdeo antigênico micobacte- 0 n riano para uso de acordo com a reivindicação 20 ou 21, em que os ditos . pri-. meiro e segundo polipeptídeos ou poHnucleotídeos antigênicos micobacteri- anos estão na forma de uma formulação como definido na reivindicação 16 ou 17. 20
23. Primeiro anticorpo e um segundo anticorpo para uso no es- tímuio de uma resposta imune em um paciente; em que o dito primeiro anticorpo Iiga um primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano, em que o dito primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo 25 menos 70% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; e em que o dito segundo anticorpo Iiga um segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano, em que o dito segundo poIipeptídeo antigênico 30 micobacteriano compreende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma.
24. Primeiro anticorpo e um segundo anticorpo para uso de a- cordo com a reivindicação 23, em que os ditos primeiro e segundo anticor- pos são para a administração ao paciente substancialmente de modo simul- tâneo, ou sequencial.
25. Primeiro anticorpo e um segundo anticorpo para uso de a- cordo com a reivindicação 23 ou 24, em que os ditos primeiro e segundo anticorpos estão na forma de uma formulação como definido na reivindica- ção 18 ou 19.
26. Primeiro polipeptídeo ou polinucleotÍdeo antigênico micobac- teriano e um segundo polipeptídeo ou polinucleotídeo antigênico micobacte- riano para uso de acordo com quaisquer das reivindicações 20 a 22, ou um primeiro anticorpo e um segundo anticorpo para uso como definido em quaisquer das reivindicações 23 a 25, em que o dito uso é para tratar ou prevenir uma infecção micobacteriana (por exemplo, TB) no dito paciente, tal como em que a dita infecção micobacteriana for uma infecção no estágio inicial.
27. Método in vitm de diagnosticar uma infecção micobacteriana, tal como uma infecção micobacteriana no estágio inicial, compreendendo incubar uma amostra de teste contendo uma célula imune, tal como um lin- fócito T, de um paciente com: (a) uma composição antigênica de acordo com quaisquer das reivindicações 1 a 10; ou (b) um primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano ou pri- meiro poIinucleotÍdeo micobacteriano, e um segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano ou segundo polinucleotídeo micobacteriano; em que (i) o dito primeiro poIipeptídeo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70°6 de i- dentidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; (ii) a dita primeira sequência de polinucleotídeos micobacteria-
nos compreende uma sequência de polinucleotídeos codificando o dito pri- meiro polipeptídeo antigênico micobacteriano; (iii) o dito segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de polipeptideos tendo pelo menos 70% de i- 5 dentidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; e (iv) a dita segunda sequência de poHnucleotídeos micobacteri- anos compreende uma sequência de poKnucleotídeos codificando o dito se- lO gundo polipeptídeo antigênico micobacteriano; e detectar a ativação da dita célula imune, em que a ativação da dita célula imune é indicativa de uma infecção micobacteriana no paciente.
28. Método in vitro de diagnosticar uma infecção micobacteriana, tal como uma infecção micobacteriana no estágio inicial, compreendendo incubar uma amostra de teste de um paciente com: (a) uma composição antigênica de acordo com quaisquer das reivindicações 1 a 10; ou (b) um primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano ou pri- meiro poIinucleotideo micobacteriano, e um segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano ou segundo polinucleoüdeo micobacteriano; em que (i) o dito primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de poIipeptídeos tendo pelo menos 70% de i- dentidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; (ii) a dita primeira sequência de polinuc!eotídeos micobacteria- nos compreende uma sequência de polinucleotideos codificando o dito pri- meiro polipeptídeo antigênico micobacteriano; (iii) o dito segundo polipeptideo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de poIipeptídeos tendo pelo menos 70% de i- dentidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; e (iv) a dita segunda sequência de polinucleotÍdeos micobacteri- anos compreende uma sequência de poHnucleotídeos codificando o dito se- gundo polipeptídeo antigênico micobacteriano; em que a dita incubação é efetuada sob condições que permi- tam a ligação dos ditos primeiro e segundo antígenos micobacterianos com os anticorpos na amostra, para formar complexos de antígenos-anticorpos; e então detectar a formação de tais complexos, em que a presença dos com- plexos de antígenos-anticorpos é indicativa de uma infecção micobacteriana no paciente.
29. Método in vitro de diagnosticar urria infecção micobacteriana, tal como uma infecção micobacteriana no estágio inicial, compreendendo incubar uma amostra de teste de um paciente com: (a) uma composição imunogênica de acordo com a reivindica- ção11;ou (b) um primeiro anticorpo e um segundo anticorpo, em que o dito primeiro anticorpo liga um primeiro polipeptídeo antigênico micobacteri- ano e o dito segundo anticorpo (iga um segundo polipeptídeo antigênico mi- cobacteriano; em que o dito primeiro polipeptídeo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70°/o de i- dentidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; e em que o dito segundo polipeptídeo antigênico micobacteriano compreende uma sequência de polipeptídeos tendo pelo menos 70% de identidade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 5, ou um seu fragmento tendo pelo menos 7 aminoácidos consecutivos da mesma; em que a dita incubação é efetuada sob condições que permi- tam a ligação dos ditos primeiro e segundo anticorpos com os antigenos na amostra, para formar complexos de antígenos-anticorpos; e então detectar a formação de tais complexos, em que a presença dos complexos de antíge-
nos-anticorpos é indicativa de uma infecção micobacteriana no paciente.
30. Composição antigênica, composição imunogênica, célula, método ou uso como mais acima descrito, e/ou como ilustrado nas figuras e/ou nos exemplos.
BR112012029643-4A 2010-05-21 2011-05-23 composição de antígeno micobacteriano BR112012029643A2 (pt)

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