ES2229220T3 - Vacuna contra la tuberculosis. - Google Patents
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A ANTIGENOS SEGREGADOS DE MICOBACTERIAS CAPACES DE EVOCAR RAPIDAS RESPUESTAS INMUNOLOGICAS (EN 4 DIAS) DE CELULAS AUXILIARES T A MODO DE LIBERACION DE GAMMA-INTERFERON EN ANIMALES INMUNES CON MEMORIA TRAS UNA INFECCION REINCIDENTE CON MICOBACTERIAS DEL COMPLEJO DE LA TUBERCULOSIS. LOS ANTIGENOS SE ENCUENTRAN PRESENTES A MODO DE FILTRADOS A CORTO PLAZO (ST-CF) DE MICOBACTERIAS CULTIVADAS QUE PERTENECEN AL COMPLEJO DE LA TUBERCULOSIS. SE HA IDENTIFICADO UNO DE ESTOS ANTIGENOS, UN POLIPEPTIDO CON UN PESO MOLECULAR APARENTE DE 6 KDA, Y SE HA CLONADO Y SECUENCIADO EL ADN QUE CODIFICA EL POLIPEPTIDO. SE CREE QUE LOS ANTIGENOS DE LA INVENCION SON UTILES ESPECIALMENTE EN VACUNAS, PERO TAMBIEN LO SON EN COMPOSICIONES DE DIAGNOSTICO. TAMBIEN SE PRESENTAN FRAGMENTOS DE ACIDOS NUCLEICOS QUE CODIFICAN LOS ANTIGENOS ASI COMO METODOS PARA INMUNIZAR A ANIMALES/SERES HUMANOS Y METODOS PARA EL DIAGNOSTICO DE LA TUBERCULOSIS.
Description
Vacuna contra la tuberculosis.
La presente invención se refiere a una vacuna
novedosa para inmunizar a un animal, incluyendo un ser humano,
contra la tuberculosis.
La tuberculosis humana causada por
Mycobacterium tuberculosis es un problema de salud global
responsable de aproximadamente 3 millones de muertes anualmente
(informe NIH). La incidencia mundial de nuevos casos de tuberculosis
ha ido bajando progresivamente durante la última década pero los
años recientes esta tendencia ha cambiado marcadamente debido a la
llegada del SIDA y a la aparición de cepas
multifármaco-resistentes de Mycobacterium
tuberculosis (Rieder).
La única vacuna actualmente disponible es BCG,
una vacuna cuya eficacia permanece como una materia de controversia.
BCG induce generalmente un alto nivel de resistencias adquiridas en
modelos animales de tuberculosis (Smith), pero varias pruebas
humanas en países en desarrollo han fallado en demostrar protección
significativa (Fine).
Esto hace del desarrollo de una vacuna nueva y
mejorada contra la tuberculosis una materia urgente la cual se ha
dado una importancia muy alta por el WHO (WHO BULL). Se han hecho
muchos intentos para definir sustancias micobacterianas
protectoras, y de 1950 a 1970 varios investigadores han comunicado
una resistencia incrementada después de la vacunación experimental.
Sin embargo, la demostración de una respuesta inmune protectora
específica a largo plazo con la potencia de BCG aún no se ha
logrado mediante la administración de proteínas solubles o
fragmentos de pared celular. La inmunidad a M. tuberculosis
se caracteriza por tres características básicas: i) los bacilos
vivos inducen eficientemente una respuesta inmune protectora en
contraste con preparaciones muertas (Orme); ii) los linfocitos T
sensibilizados específicamente median esta protección (Mackaness,
Orme); iii) la más importante molécula mediadora parece ser
interferón gamma (INF-\gamma) (Rook, Flesh).
Se ha demostrado que las proteínas segregadas por
M. tuberculosis cuando crece en cultivo funcionan como
estimuladores de respuestas inmunes celulares específicas en
ratones, y se ha sugerido que posibles antígenos útiles en nuevas
vacunas contra la tuberculosis se buscarían entre tales proteínas,
cf. Scand. J. Inmunol. 36, 823-831 (1992) e
Infection and Immunity, 61, 844-851 (1993). Sin
embargo, no se ha aislado o identificado ningún antígeno
inmunodominante.
Es un objeto de la presente invención
proporcionar una vacuna para inmunizar un animal, incluyendo un ser
humano contra la tuberculosis causada por micobacteria que
pertenece al complejo tuberculosis.
Se demuestra en el presente documento que
antígenos segregados administrados conjuntamente con un coadyuvante
apropiado inducen células Th-1 de larga vida
específicas capaces de proteger contra una prueba subsiguiente con
M. tuberculosis virulentas. De forma importante, se ha
encontrado sorprendentemente que una vacuna basada en polipéptidos
solubles tiene la misma potencia protectora que BCG vivas,
especialmente polipéptidos como se describen más adelante.
Consecuentemente, un aspecto de la invención es
una vacuna para inmunizar una animal, incluyendo un ser humano,
contra tuberculosis causada por micobacterias que pertenecen al
complejo tuberculosis, comprendiendo como el componente efectivo al
menos un polipéptido purificado al menos parcialmente, el cual
se libera de una micobacteria metabolizada y
presente en filtrados a corto plazo a partir de tales micobacterias
cultivadas crecidas con agitación durante 7 días, e induce una
liberación de INF-\gamma a partir de linfocitos T
de memoria reactivados retirados de un ratón C57BI/6j en los 4 días
después de que el ratón se ha vuelto probar infectado con
micobacterias que pertenecen al complejo tuberculosis, la inducción
se lleva a cabo mediante la adición del polipéptido a una
suspensión que comprende aproximadamente 200.000 células T de
memoria reactivadas por ml, dando como resultado la adición del
polipéptido una concentración de 1 \mug de polipéptido por ml de
suspensión, y siendo la liberación de INF-\gamma
evaluable por determinación de INF-\gamma en el
sobrenadante cosechado 2 días tras la adición del polipéptido a la
suspensión, y comprende la secuencia de aminoácidos explicada en la
SEQ ID Nº.:2,
o el análogo y/o subsecuencia del polipéptido,
siendo dicho análogo y/o dicha subsecuencia inmunológicamente
equivalente al polipéptido con respecto a la capacidad de evocar
una respuesta inmune protectora contra tuberculosis o con respecto
a la capacidad de facilitar una respuesta inmune diagnósticamente
significativa con la condición de que el polipéptido comprende una
secuencia de aminoácidos que tiene un grado de homología de al
menos el 80% con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID
Nº.:2 con una subsecuencia del mismo que comprende un epítopo de
célula T.,
estando dicho polipéptido opcionalmente acoplado
a un vehículo o portador farmacéuticamente aceptable y/o
formulándose conjuntamente con una sustancia coadyuvante.
El complejo tuberculosis tiene su significado
usual, es decir el complejo de micobacterias que causa tuberculosis
las cuales son Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis,
y Mycobacterium africanum.
En el contexto presente el término
"micobacteria metabolizante" significa micobacteria viva que se
multiplica logarítmicamente y libera polipéptidos en el medio de
cultivo.
Mediante el término "polipéptido" se quiere
significar aquí tanto péptidos cortos con una longitud de al menos
dos residuos aminoácidos y como máximo 10 residuos aminoácidos,
oligopéptidos (11-100 residuos aminoácidos), y
péptidos más largos (la interpretación usual de "polipéptido",
es decir más de 100 residuos aminoácidos de longitud) igual que
proteínas (la entidad funcional que comprende al menos un péptido,
oligopéptido o polipéptido la cual se puede modificar químicamente
glicosilándose, lipidándose, o comprendiendo grupos prostéticos).
La definición de polipéptidos también comprende formas nativas de
péptidos/proteínas en micobacteria igual que proteínas recombinantes
o péptidos en cualquier tipo de vectores de expresión que
transforman cualquier clase de hospedador, y también péptidos
químicamente sintetizados.
Mediante los términos "análogo" y
"subsecuencia" cuando se usan en conexión con polipéptidos se
quiere decir cualquier polipéptido que tiene las mismas
características inmunológicas que los polipéptidos de la invención
descritos anteriormente con respecto a la capacidad de conferir
resistencia incrementada a infecciones con bacterias que pertenecen
al complejo tuberculosis. Así, también está incluido un polipéptido
a partir de diferentes fuentes, tales como otras bacterias o
incluso a partir de células eucariotas.
Los términos "análogo" y "subsecuencia"
con respecto a un polipéptido de la invención se usan también en el
presente contexto para indicar una proteína o polipéptido de una
composición de aminoácidos o secuencia similar a la secuencia de
aminoácidos característica mostrada en la SEQ ID Nº.:2, que permite
leves variaciones las cuales no tienen un efecto adverso sobre las
propiedades de unión a ligando y/o la función biológica y/o la
inmunogenicidad, o las cuales pueden dar propiedades de unión
novedosas interesantes y útiles o funciones biológicas e
inmunogenicidades interesantes y útiles, etc. El polipéptido o
proteína análogos se pueden derivar a partir de otros
microorganismos, células, o animales y el análogo también puede
derivarse del uso de técnicas de DNA recombinantes como se describe
más adelante.
Además, en el contexto presente el término
"inmunológicamente equivalente" significa que el análogo o
subsecuencia del polipéptido es funcionalmente equivalente al
polipéptido con respecto a la capacidad de evocar una respuesta
inmune protectora contra tuberculosis y/o facilitar una respuesta
inmune diagnósticamente significativa (por ejemplo una reacción
Dth).
El término "respuesta inmune protectora"
tiene su significado usual, es decir que la respuesta inmune
evocada mediante el polipéptido en cuestión protege a la persona
inmunizada de contraer tuberculosis, o que la respuesta inmune
evocada por el polipéptido confiere al menos una resistencia
sustancialmente incrementada a las infecciones con micobacterias
pertenecientes al complejo tuberculosis.
La capacidad de un polipéptido para evocar una
respuesta inmune protectora se puede valorar midiendo en un animal
experimental, por ejemplo un ratón o un conejillo de indias, la
reducción en los contajes de micobacterias del bazo, pulmón, u
otros órganos homogenados aislados de los animales experimentales
los cuales han recibido una infección de prueba con una cepa
virulenta de Mycobacterium tuberculosis después de haberse
inmunizado previamente con el polipéptido, en comparación con las
cuentas de micobacterias en un grupo control de animales de
experimentación infectados con la misma cepa virulenta de
Mycobacterium tuberculosis, animales de experimentación los
cuales no han sido inmunizados contra tuberculosis previamente. La
comparación de las cuentas de micobacterias pueden también llevarse
a cabo con cuentas de micobacterias de un grupo de animales
experimentales que reciben una infección de prueba con la misma
cepa virulenta después de haberse inmunizado con Mycobacterium
bovis BCG.
Los contajes de micobacterias en homogenados de
los animales de experimentación inmunizados con un polipéptido de
acuerdo con la presente invención deben ser como mucho 5 veces los
contajes en los ratones o conejillos de indias inmunizados con
Mycobacterium bovis BCG, tal como 3 veces los contajes como
máximo, y preferiblemente 2 veces los contajes como máximo.
"Inmunológicamente equivalente" puede
significar también que el análogo o subsecuencia es funcionalmente
equivalente al polipéptido con respecto a facilitar una reacción de
hipersensibilidad de tipo retardado (Dth) a una extensión de al
menos 45% de la reacción Dth facilitada por el polipéptido bajo las
mismas condiciones, tal como al menos el 65%, y preferiblemente el
85% medido como el diámetro de la reacción Dth.
Los inventores de la presente invención han
demostrado que los polipéptidos tal como se definen anteriormente
son de gran importancia en evocar una repuesta inmune protectora
contra tuberculosis debido a que inducen una liberación de
INF-\gamma a partir de linfocitos T reactivados a
partir de un animal o un ser humano poco después de que el animal o
ser humano se haya reinfectado.
Esto se ha confirmado midiendo la liberación de
INF-\gamma inducida a partir de linfocitos T
reactivados retirados de un ratón C57BI/6j en los 4 días después de
que el ratón se haya vuelto a poner a prueba infectado con
micobacterias que pertenecen al complejo tuberculosis. Esto es
debido al hecho de que cuando un hospedador inmune prepara una
respuesta inmunológica protectora las células T específicas
responsables del reconocimiento temprano del macrófago infectado,
estimula una poderosa actividad bactericida a través de su
producción de INF-\gamma (Rook, G.A.W. 1990,
Flesch, I y col. 1987).
Se contempla que debido a que los polipéptidos
estimulan la respuesta inmune de los linfocitos T poco después de
la aparición de la infección son importantes en el control de las
micobacterias que causan la infección antes de que las
micobacterias hayan tenido éxito en multiplicarse al número de
bacterias que hubieran resultado en infección fulminante.
Así, los polipéptidos descritos en el presente
documento como componentes en la vacuna son también por derecho
propio una parte importante de la invención como los son los
fragmentos de nucleótidos que codifican los polipéptidos de la
invención.
Los polipéptidos de interés están dentro de los
dos intervalos moleculares como se describen anteriormente, pero
pueden ser de aproximadamente 4 a aproximadamente 14 kDa, tal como
de aproximadamente 6 a aproximadamente 10 kDa.
En una realización preferida el polipéptido tiene
un peso molecular en el intervalo de aproximadamente 5 kDa a
aproximadamente 6 kDa, en el intervalo de aproximadamente 6 kDa a
aproximadamente 7 kDa o en el intervalo de aproximadamente 7 kDa a
aproximadamente 8 kDa.
Los polipéptidos pueden también encontrarse en
otro intervalo molecular el cual es de aproximadamente 22 a
aproximadamente 38 kDa, o de aproximadamente 20 a aproximadamente
32 kDa, tal como de aproximadamente 22 kDa a aproximadamente 30
kDa, o incluso de aproximadamente 24 kDa a aproximadamente 28 kDa,
algunos otros polipéptidos pueden estar en el intervalo de
aproximadamente 35 a aproximadamente 40 kDa, tal como de
aproximadamente 36 a aproximadamente 39 kDa, o incluso de
aproximadamente 36 a aproximadamente 38 kDa.
En una realización más preferida el peso
molecular puede ser de aproximadamente 25 kDa a aproximadamente 27
kDa o de aproximadamente 37 kDa a aproximadamente 38 kDa.
Como se describe en los ejemplos, se han
producido y aislado tres clones de E. coli que expresan
polipéptidos micobacterianos de bajo peso molecular de
ST-CF; todas estas proteínas se sospecha que están
implicadas en la respuesta temprana a células T descrita
anteriormente. Así de acuerdo con la invención el polipéptido
- -
- producido por la cepa lisogénica de E. coli designada AA227 la cual se ha depositado el 28 de junio de 1993 con la colección de Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zelkulturen GMBH (DSM) bajo el número de acceso DSM 8378,
- -
- el depósito de acuerdo con las disposiciones del Tratado de Budapest, se considera como un aspecto interesante de la invención.
Se ha demostrado que una proteína de bajo peso
molecular expresada por la cepa AA227 muestra el perfil
inmunológico descrito anteriormente, es decir, tiene la capacidad
de inducir liberación de INF-\gamma a partir de
T-linfocitos de memoria reactivados retirados de
ratones C57BI/6j 4 días después de volver a realizar una infección
de prueba con micobacterias; esta proteína es así un aspecto
especialmente preferido de esta invención.
La proteína expresada mediante esta cepa se une
específicamente a un anticuerpo monoclonal designado
HYB76-8. Así, un aspecto interesante de la
invención es también un polipéptido que reacciona en un ensayo de
bandas western con un anticuerpo monoclonal,
HYB76-8, estando producido dicho anticuerpo por la
línea celular del hibridoma designada HYB 76-8
0,5/br C8 0,25/br B3 la cual se ha depositado el 30 de junio de
1993 en la colección de Deutsche Sammlum von Mikroorganismen und
Zelkulturen GMBH (DSM) bajo el número de acceso DSM ACC2134 de
acuerdo con las disposiciones del Tratado de Budapest.
Sin embargo, se ha demostrado por los inventores
que el perfil inmunológico anteriormente descrito no se presenta
por ninguna proteína expresada por ninguna proteína expresadas por
la cepa AA226, aunque esta cepa exprese otros antígenos de bajo
peso molecular de ST-CF. Por lo tanto, parece que
no todos los antígenos de bajo peso molecular de
ST-CF son directamente responsables de o están
implicados en las propiedades inmunológicas de ST-CF
anteriormente discutidas, mientras que el antígeno reactivo
HYB76-8 puede considerarse como un candidato
principal para el componente principal inmunogénico en una vacuna de
la tuberculosis compuesta de antígenos simples. Como se discute
anteriormente, el antígeno micobacteriano expresado por AA226 pudo
tener posiblemente un efecto como un "coadyuvante" en
ST-CF, es decir, la proteína no es responsable de
la facilitación de la respuesta inmune pero tiene un efecto el cual
facilita la facilitación de respuesta inmune eficientes.
En una realización preferida de la invención la
secuencia de aminoácidos del polipéptido comprende una secuencia de
aminoácidos homóloga al aminoácido que se muestra en la SEQ ID Nº.:
2 (cf. también figura 10) en la parte
N-terminal de la secuencia u homóloga a la secuencia
de aminoácidos de un análogo y/o subsecuencia de la secuencia de
aminoácidos de SEQ ID Nº.: 2.
El término "homólogo" se usa aquí para
ilustrar el grado de identidad entre la secuencia de aminoácidos de
un polipéptido dado y la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ
ID Nº.: 2. La secuencia de aminoácidos a comparar con la secuencia
de aminoácidos mostrada en SEQ ID Nº.: 2 se puede deducir de una
secuencia de DNA, por ejemplo obtenida por hibridación como se
define anteriormente, o se puede obtener por procedimientos de
secuenciación de aminoácidos convencionales. El grado de homología
se determina preferiblemente en la secuencia de aminoácidos de un
polipéptido maduro, es decir sin tomar ninguna secuencia líder en
consideración. Se prefiere que el grado de homología sea al menos
el 80%, tal como al menos el 90%, preferiblemente al menos el 95%, o
incluso el 98%, con la secuencia de aminoácidos mostrada en SEQ ID
Nº.: 2.
Cada uno de los polipéptidos se puede
caracterizar por secuencias específicas de aminoácidos y ácidos
nucleicos. Se entenderá que tales secuencias incluyen análogos y
variantes producidos por procedimientos recombinantes en los cuales
tales secuencias de ácidos nucleicos y polipéptidos se han
modificado por sustitución, inserción, adición y/o deleción de uno
o más nucleótidos en dichas secuencias de ácidos nucleicos para
causar sustitución, inserción, adición o deleción de uno o más
residuos aminoácidos en el polipéptido recombinante. Cuando el
término DNA se usa en lo siguiente, debería entenderse que para el
número de propósitos donde DNA se puede sustituir por RNA, se puede
leer el término DNA como que incluye las realizaciones de RNA las
cuales serán patentes para el hombre experto en la técnica. Para
los propósitos de hibridación se puede usar PNA en lugar de DNA, ya
que se ha mostrado que PNA presenta un perfil de hibridación muy
dinámico (PNA se describe en Nielsen, P.E. y col., 1991, Science
254: 1497-1500).
Con el fin de evocar una respuesta inmune
protectora, un polipéptido debe ser al menos de 12 aminoácidos de
largo, preferiblemente de al menos 15 aminoácidos, tal como de 20
aminoácidos.
La secuencia nucleotídica que codifica el
polipéptido definido anteriormente es una parte de la invención, y
puede ser una secuencia nucleotídica la cual
- 1)
- es la secuencia de DNA que se muestra en la SEQ ID Nº.: 1 (mostrada en la figura 10)
- 2)
- codifica para un polipéptido de la invención.
Es bien conocido que el mismo aminoácido se puede
codificar por varios codines, estando relacionado el uso del codón,
entre otras cosas, con la preferencia de los organismos en cuestión
que expresan la secuencia de nucleótidos. Así, al menos un
nucleótido o codón de un fragmento de DNA de la invención se puede
intercambiar con otros, los cuales, cuando se expresan, dan como
resultado un polipéptido idéntico o sustancialmente idéntico al
polipéptido codificado mediante el fragmento de DNA en
cuestión.
Por lo tanto, los términos "análogo" o
"subsecuencia" se usan en el presente contexto para indicar un
fragmento de DNA o una secuencia de DNA de una composición similar
de nucleótidos o secuencia como la secuencia de DNA que codifica la
secuencia de aminoácidos que constituye ESAT6 (también citada como
"el antígeno de 6 kDa" o "el antígeno HYB76-8
reactivo") descrita en el presente documento, permitiendo
variaciones sin importancia que no tienen un efecto adverso en las
propiedades de unión a ligando y/o función biológica y/o
inmunogenicidad comparadas con ESAT6, o las cuales proporcionan
interesantes y útiles propiedades de unión novedosas o funciones
biológicas e inmunogenicidades, etc. del análogo y/o subsecuencia.
El fragmento de DNA análogo o secuencia de DNA análoga puede
derivarse de una bacteria, un animal o un humano o puede ser
parcialmente o completamente de origen sintético como se describe
anteriormente. El análogo y/o subsecuencia puede también derivarse a
través del uso de técnicas de DNA recombinante.
Además, los términos "análogo" y
"subsecuencia" se desean para permitir variaciones en la
secuencia tales como sustitución, inserción (incluyendo intrones),
adición, deleción y reorganización de uno o más nucleótidos,
variaciones las cuales no tienen efecto sustancial en el polipéptido
codificado por un fragmento de DNA o una subsecuencia del mismo. El
término "sustitución" se desea que signifique el
reemplazamiento de uno o más nucleótidos en la secuencia de
nucleótidos completa con uno o más nucleótidos diferentes, se
entiende que "adición" significa la adición de uno o más
nucleótidos a cada extremo de la secuencia completa de nucleótidos,
se desea que "inserción" signifique la introducción de uno o
más nucleótidos en la secuencia completa de nucleótidos, se desea
que "deleción" indique que uno o más nucleótidos se han
eliminado de la secuencia completa bien en cualquier extremo de la
secuencia o bien en algún punto adecuado dentro de ella, y se desea
que "reordenamiento" signifique que dos o más residuos de
nucleótido se han intercambiado entre sí.
Una subsecuencia de nucleótidos como se discute
anteriormente se refiere a una "subsecuencia efectiva" lo
cual significa que codifica un péptido el cual es inmunológicamente
funcional con respecto a la capacidad de evocar una respuesta
inmune protectora contra tuberculosis o de facilitar una reacción
Dth. La subsecuencia puede ser el resultado de un truncamiento de
cada extremo del DNA y/o de la eliminación de uno o más nucleótidos
o secuencias de nucleótido en la secuencia de DNA.
El polipéptido, como se describe anteriormente,
se libera de las micobacterias metabolizantes, y puede por lo tanto
ser un polipéptido el cual se traduce de un gen en el genoma de las
micobacterias. Sin embargo, el polipéptido liberado puede ser
también un producto de degradación de un polipéptido mayor el cual
se cataboliza o desintegra en las micobacterias con lo cual sólo los
productos de la catabolización o desintegración se liberan de las
micobacterias. Por lo tanto, la secuencia de nucleótidos que
codifica el polipéptido puede ser parte de una secuencia de
nucleótidos mayor que codifica el polipéptido mayor presente sólo
con las bacterias vivas. En esta conexión se entiende que los
cultivos agitados que han crecido durante 7 días como se describió
anteriormente sólo represente un número insignificante de
micobacterias lisadas las cuales por supuesto no segregarán ningún
polipéptido pero darán como resultado la liberación de todos los
polipéptidos dentro del filtrado (también los puramente
intracelulares).
Una vacuna de acuerdo con la invención es
preferiblemente una la cual es capaz de evocar una resistencia
inmune sustancial y específica adquirida en un ratón o conejillo de
indias contra tuberculosis causadas por micobacterias
pertenecientes al complejo tuberculosis, los cuales adquieren
resistencia inmune que corresponde al menos al 20% de la respuesta
inmune protectora facilitada por Mycobacterium bovis BCG,
como se evalúa mediante la reducción observada en los contajes de
micobacterias de homogenados de bazo, pulmón u otros órganos
aislados del ratón o conejillo de indias que reciben una infección
de prueba con un cepa virulenta de M. tuberculosis, como se
describe anteriormente.
La resistencia inmune adquirida preferida
corresponde al menos al 50% de la respuesta inmune protectora
facilitada por Mycobacterium bovis BCG, tal como al menos el
60%, o incluso más preferido al menos el 80%, de la respuesta
inmune protectora facilitada por Mycobacterium bovis BCG, tal
como al menos el 90%.
Cuando se compara con la respuesta inmune
facilitada por M. bovis es posible en un aspecto preferido
de la presente invención que la vacuna confiera a la persona
vacunada una resistencia inmune adquirida correspondiente al menos
al 100% de la respuesta inmune protectora facilitada por
Mycobacterium bovis BCG, tal como al menos el 110%.
La preparación de las vacunas las cuales
contienen secuencias de péptidos como ingredientes activos se
comprende generalmente bien en la técnica, como se ejemplifica
mediante las patentes de los Estados Unidos 4.608.251; 4.601.903;
4.599.231; 4.599.230; 4.596.792 y 4.578.770. Típicamente, tales
vacunas se preparan como inyectables bien como disoluciones
líquidas o bien como suspensiones; se pueden preparar también
formas sólidas adecuadas para disolución en, o suspensión en,
líquido antes de la inyección. La preparación se puede emulsionar
también. El ingrediente activo inmunogénico está a menudo mezclado
con excipientes los cuales son farmacéuticamente aceptables y
compatibles con el ingrediente activo. Los excipientes adecuados
son, por ejemplo, agua, medio salino, dextrosa, glicerol, etanol, o
similares, y combinaciones de los mismos. Además, si se desea, la
vacuna puede contener menores cantidades de sustancias auxiliares
tales como agentes humectantes o emulsionantes, agentes
tamponadores de pH, o coadyuvantes los cuales potencian la
efectividad de las vacunas.
Las vacunas se administran convencionalmente
parenteralmente, mediante inyección, por ejemplo, tanto subcutánea
como intramuscularmente. Las formulaciones adicionales las cuales
son adecuadas para otros modos de administración incluyen
supositorios, y, en algunos casos, formulaciones orales. Para
supositorios, los agentes de unión y los vehículos tradicionales
pueden incluir, por ejemplo, polialquilenglicoles o triglicéridos;
tales supositorios se pueden formar a partir de mezclas que
contienen el ingrediente activo en el intervalo del 0,5% al 10%,
preferiblemente 1-2%. Las formulaciones orales
incluyen tales excipientes normalmente empleados como, por ejemplo,
niveles farmacéuticos de manitol, lactosa, almidón, estearato de
magnesio, sacarina sódica, celulosa, carbonato de magnesio, y
similares. Estas composiciones toman la forma de disoluciones,
suspensiones, comprimidos, píldoras, cápsulas, formulaciones de
liberación sostenida o polvos y contienen 10-95% de
ingrediente activo, preferiblemente 25-70%.
Las proteínas se pueden formular dentro de la
vacuna como formas neutrales o salinas. Las sales farmacéuticamente
aceptables incluyen sales de adición de ácidos (formadas con los
aminoácidos libres del péptido) y las cuales se forman con ácidos
inorgánicos tales como por ejemplo, ácidos clorhídrico y fosfórico,
o ácidos orgánicos tales como acético, oxálico, tartárico,
mandélico y similares. Las sales formadas con los grupos carbonilo
libres se pueden derivar también de bases inorgánicas, tales como,
por ejemplo, hidróxidos sódico, potásico, amónico, cálcico, o
férrico, y bases orgánicas tales como isopropilamina,
trimetilamina, 2-etilaminoetanol, histidina,
procaína, y similares.
Las vacunas se administran en una manera
compatible con la formulación de dosificación, y en tal cantidad
serán terapéuticamente efectivas e inmunogénicas. La cantidad a
administrarse depende del sujeto a ser tratado, incluyendo, por
ejemplo, la capacidad del sistema inmune del individuo para montar
una respuesta inmune, y el grado de protección deseado. Los
intervalos de dosificación deseados son del orden de varios cientos
de microgramos de ingrediente activo por vacunación con un
intervalo preferido de aproximadamente 0,1 \mug a 100 \mug, tal
como en el intervalo de aproximadamente 1 \mug a
apeoximadamente300 \mug, y especialmente en el intervalo de
aproximadamente 0,1 \mug a aproximadamente 1000 \mug, tal como
en el intervalo de aproximadamente 1 \mug a 300 \mug, y
especialmente en el intervalo de aproximadamente 10 \mug a 50
\mug. Los regímenes adecuados para administración inicial y
golpes estimuladores son también variables pero están tipificados
mediante una administración inicial seguida por inoculaciones
subsiguientes u otras administraciones.
La forma de aplicación puede variar ampliamente.
Cualquiera de los procedimientos convencionales de administración
de una vacuna son aplicables. Éstos se cree que incluyen aplicación
oral en una base sólida físicamente aceptable o en una dispersión
físicamente aceptable, parenteralmente, mediante inyección o
similares. La dosificación de la vacuna dependerá de la ruta de
administración y variará de acuerdo con la edad de la persona a
vacunarse y, en un menor grado, de acuerdo con el tamaño de la
persona a vacunarse.
Algunos de los polipéptidos de la vacuna son
suficientemente inmunogénicos en una vacuna, pero para alguno de
los otros la respuesta inmune se potenciará si la vacuna comprende
también una sustancia coadyuvante.
Varios procedimientos de lograr efecto
coadyuvante para la vacuna incluyen el uso de agentes tales como
hidróxido o fosfato de aluminio (alum), usado comúnmente como una
disolución de 0,05 a 0,1 por ciento en tampón salino de fosfato,
mezcla con polímeros sintéticos de azúcares (Carbopol) usada como
disolución al 0,25 por ciento, agregación de la proteína en la
vacuna mediante tratamiento de calor con temperaturas variando
entre 70º y 101ºC durante periodos de 30 segundos-2
minutos respectivamente. Se puede emplear también agregación a
albúmina reactivando con anticuerpos tratados con pepsina (Fab),
mezcla con células bacterianas tales como C. Parvum o
endotoxinas o componentes lipopolisacáridos de bacterias
gram-negativas, emulsión en aceites transportadores
fisiológicamente aceptables tales como monooleato de anida (Aracel
A) o emulsión con una disolución al 20 por ciento de un
perfluorocarbono (Fluosol-DA) usado como un
sustituto de bloqueo. De acuerdo con la invención DDA (bromuro de
dimetildioctadecilamonio) es un candidato interesante para un
coadyuvante, pero también los coadyuvantes completos e incompletos
de Feund igual que QuilA y RIBI son posibilidades interesantes.
Otras posibilidades implican el uso de sustancias
moduladoras inmunitarias tales como linfoquinas (por ejemplo,
INF-\gamma, IL-2 e
IL-12) o inductores INF-\gamma
sintéticos tales como poli I:C en combinación con los coadyuvantes
anteriormente mencionados. Como se discute en el ejemplo 3, se
contempla que tales mezclas de antígeno y coadyuvante conducirán a
formulaciones de vacunas superiores.
En muchos casos, será necesario tener
administraciones múltiples de la vacuna, usualmente no excediendo
de seis vacunaciones, más usualmente no excediendo de cuatro
vacunaciones y preferiblemente una o más, usualmente al menos
aproximadamente tres vacunaciones. Las vacunaciones normalmente
serán a entre dos y doce semanas de intervalo, más usualmente de
tres a cinco semanas de intervalo. Los activadores periódicos a
intervalos de 1-5 años, usualmente 3 años, serán
deseables para mantener los niveles deseados de inmunidad
protectora. El curso de la inmunización se puede seguir mediante
ensayos de proliferación in vitro de PLB (linfocitos
periféricos en sangre) co-cultivados con ESAT6 o
ST-CF, y especialmente midiendo los niveles de la
forma liberada de INF-\gamma de los linfocitos
activados. Los ensayos se pueden llevar a cabo usando etiquetas
convencionales, tales como radionúclidos, enzimas, fluorescentes, y
similares. Estas técnicas son bien conocidas y se pueden encontrar
en una amplia variedad de patentes, tales como las patentes de los
Estados Unidos N^{os}. 3.791.932, 4.174.384 y 3.949.064, como es
ilustrativo de estos tipos de ensayos.
Como se describe anteriormente una medida del
efecto de los polipéptidos en la vacuna puede ser para valorar el
INF-\gamma liberado por los linfocitos T de
memoria. A respuesta inmune más fuerte más
INF-\gamma se liberará, de acuerdo con ello, una
vacuna comprende un polipéptido capaz de liberar de los linfocitos
T de memoria al menos 1500 pg/ml, tales como 2000 pg/ml,
preferiblemente 3000 pg/ml de INF-\gamma.
Debido a la variación genética, diferentes
individuos reaccionarán con una fuerza variable al mismo
polipéptido. Por lo tanto, la vacuna de acuerdo con la invención
puede comprender varios polipéptidos diferentes con el fin de
incrementar la respuesta inmune. La vacuna puede comprender dos o
más polipéptidos, donde todos los polipéptidos son como se definió
anteriormente, o algunos pero no todos los péptidos se puede
derivar de una bacteria que pertenece al complejo de M.
tuberculosis. En el último ejemplo los polipéptidos no
necesariamente cumplen los criterios anteriormente explicados para
polipéptidos que deben actuar bien debido a su propia
inmunogenicidad o bien deben actuar meramente como coadyuvantes.
Ejemplos de tales interesantes polipéptidos son MPB64, MPT64, el
polipéptido ST-3 reactivo, el polipéptido
PV-2 reactivo, y el MPB59, pero cualesquiera otras
sustancias las cuales se pueden aislar a partir de micobacterias
son posibles candidatos.
La vacuna puede comprender 3-20
polipéptidos diferentes, tales como 3-10
polipéptidos diferentes.
Una razón para mezclar los polipéptidos de la
invención con un coadyuvante es para activar de forma efectiva una
respuesta inmune celular. Sin embargo, este efecto se puede lograr
también en otras vías, por ejemplo expresando el antígeno efectivo
en una vacuna en un microorganismo no patogénico. Un ejemplo bien
conocido de un microorganismo tal es Mycobacterium bovis
BCG.
Por lo tanto, otro aspecto importante de la
presente invención es un incremento de la vacuna BCG actualmente
disponible, la cual es una vacuna para inmunizar un animal,
incluyendo un ser humano, contra tuberculosis causada por
micobacterias pertenecientes al complejo tuberculosis, comprendiendo
como el componente efectivo un microorganismo, en el que una o más
copias de la secuencia de DNA que codifican un polipéptido como se
define anteriormente o un análogo y/o subsecuencia del mismo se ha
incorporado en el genoma del microorganismo en una manera que
permite al microorganismo expresar y segregar el polipéptido.
En el contexto presente el término "genoma"
se refiere al cromosoma de los microorganismos igual que DNA o RNA
extracromosómico, tal como plásmidos.
La valoración de la capacidad de la vacuna con
respecto a evocar una respuesta inmune protectora es como se define
anteriormente, igual que la valoración del efecto de la vacuna
comparado con la vacuna convencional BCG.
\newpage
El microorganismo en la vacuna puede ser una
bacteria tal como bacterias seleccionadas del grupo que consta de
los géneros Mycobacterium, Salmonella, Pseudomonas y
Eschericia.
En una realización preferida, el microorganismo
es Mycobacterium bovis BCG, y en una realización más
preferida es la cepa de Mycobacterium bovis BCG Danish 1331,
la cual es la cepa de Mycobacterium bovis BCG de Copenhague
del Copenhagen BCG Laboratory, Statens Seruminstitut, Dinamarca.
La incorporación de una o más copias de una
secuencia de DNA que codifica el polipéptido de acuerdo con la
invención en una micobacteria a partir de una cepa Mycobacterium
bovis BCG la cual potencia el efecto inmunogénico de BCG
especialmente con respecto a la respuesta inmune a largo plazo como
se describe anteriormente. La incorporación de mas de una copia de
la secuencia de DNA se contempla para potenciar la respuesta inmune
incluso más, consecuentemente un aspecto de la invención es una
vacuna en la cual al menos 2 copias de una secuencia de DNA que
codifican un polipéptido se incorporan en el genoma del
microorganismo, tal como al menos 5 copias. Las copias de las
secuencias de DNA pueden bien estar codificando polipéptidos
idénticos o ser variantes de la misma secuencia de DNA que
codifican polipéptidos idénticos u homólogos de un polipéptido, o
en otra realización ser secuencias de DNA diferentes que codifican
diferentes polipéptidos donde al menos uno de los polipéptidos está
de acuerdo con la presente invención.
La secuencia de DNA usada en una realización tal
de la invención puede ser una secuencia de DNA la cual
1) es idéntica a la secuencia de DNA mostrada en
la SEQ ID Nº.:1
2) codifica un péptido, de la invención.
La secuencia de DNA de acuerdo con la invención
es preferiblemente una que codifica un péptido la secuencia
aminoacídica del cual es al menos homóloga en un 90% con la
secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ ID Nº.: 2 o con una
subsecuencia de la misma, o codifica el péptido con la secuencia de
aminoácidos mostrada en SEQ ID Nº.: 2, o codifica una subsecuencia
de la misma.
Como se discute anteriormente, la facilitación de
las respuestas a la infección mediadas por células se puede obtener
empleando un coadyuvante o usando vacunas vivas. Sin embargo, las
investigaciones recientes han revelado una nueva y excitante
posibilidad, en la que un fragmento de DNA clonado en un vector el
cual no es replicante en células eucariotas se introduce en un
animal (incluyendo un ser humano) por ejemplo mediante una
inyección intramuscular o administración percutánea. El DNA se toma
mediante por ejemplo células musculares y el gen de interés se
expresa mediante un promotor el cual está funcionando en eucariotas,
por ejemplo un promotor viral, y el producto del gen estimula a
partir de entonces el sistema inmune. Estos procedimientos
recientemente descubiertos se revisan en Ulmer y col., 1993.
Por lo tanto, también una parte de la invención
es una vacuna que comprende un ácido nucleico de acuerdo con la
invención, la vacuna efectúa expresión in vivo de antígenos
en un animal, incluyendo un ser humano, al cual la vacuna se ha
administrado, siendo la cantidad de antígenos expresados que
efectiva para conferir resistencia sustancialmente incrementada a
infecciones con micobacteria del complejo tuberculosis en un
animal, incluyendo un ser humano. También se describen los
procedimientos de inmunizar animales contra la tuberculosis
administrando la vacuna a los animales.
La eficacia de una "vacuna de DNA" tal puede
posiblemente potenciarse administrando el gen que codifica el
producto de expresión conjuntamente con un fragmento largo de DNA
que codifica un polipéptido el cual tiene la capacidad de modular
una respuesta inmune. Por ejemplo, un gen que codifica precursores
de linfoquina o linfoquinas (por ejemplo,
IPN-\gamma, IL-2, o
IL-12) se pueden administrar conjuntamente con el
gen que codifica la proteína inmunogénica, bien administrando dos
fragmentos de DNA por separado o administrando ambos fragmentos
incluidos en el mismo vector.
Tanto en inmunodiagnósticos como en preparación
de vacunas, a menudo es posible y práctico preparar antígenos a
partir de segmentos de una proteína o polipéptido inmunogénico
conocido. Ciertas regiones de epítopos se pueden usar para producir
respuestas similares a aquella producida por el polipéptido
antigénico entero. Las regiones potenciales antigénicas o
inmunogénicas se pueden identificar por cualquiera de un número de
aproximaciones, por ejemplo, los análisis de antigenicidad
Jameson-Wolf o Kyte-Doolitle o los
análisis de hidrofobicidad Hoop y Woods (1981) (véase, por ejemplo,
Jameson y Wolf, 1988; Kyte y Doolitle, 1982; o patente de los
Estados Unidos Nº. 4.554.101). Los análisis de hidrofobicidad
asignan valores promedio de hidrofilicidad a cada residuo
aminoácido, a partir de estos valores se pueden calcular las
hidrofilicidades y determinar las regiones de mayor hidrofilicidad.
Usando uno o más de estos procedimientos, las regiones de
antigenicidad predecida se pueden derivar de la secuencia de
aminoácidos asignada a los polipéptidos de la invención.
Por lo tanto, otro aspecto aún de la presente
invención es el polipéptido como se define anteriormente,
especialmente uno el cual comprende un epítopo para una célula T
ayudante.
Ejemplos de tales polipéptidos son aquellos
producidos mediante las cepas de E. coli depositadas
descritas anteriormente.
Además, la invención se refiere a un fragmento de
nucleótidos que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica
un polipéptido como se define anteriormente, tal como una secuencia
de nucleótidos que codifica uno cualquiera de los polipéptidos
producidos por las cepas depositadas de E. coli descritas
anteriormente, especialmente el fragmento de nucleótidos que
comprende la secuencia de DNA de SEQ ID Nº.: 1.
Aún otro aspecto de la invención es una
composición para diagnosticar tuberculosis, que comprende un
polipéptido como se define anteriormente, especialmente los
polipéptidos producidos por las cepas de E. coli depositadas
descritas anteriormente, tal como el polipéptido codificado por un
fragmento de nucleótidos el cual comprende la secuencia de DNA de
SEQ ID Nº.: 1 o una parte del mismo, o la composición que comprende
una secuencia de nucleótidos como se definió anteriormente.
Los procedimientos para determinar la presencia
de anticuerpos micobacterianos o componentes de micobacterias en
muestras o en animales también se describen, como un procedimiento
para determinar la presencia de anticuerpos dirigidos contra
micobacterias pertenecientes al complejo tuberculosis en un animal,
incluyendo un ser humano, o en una mezcla comprendiendo administrar
un polipéptido de la invención al animal o incubando la muestra con
el anticuerpo, y detectando la presencia del anticuerpo enlazado
que resulta de la administración o incubación. Asimismo, se
describe un procedimiento para determinar la presencia de un
antígeno micobacteriano en un animal, incluyendo un ser humano, o
en una mezcla, que comprende administrar un anticuerpo de la
invención al animal o incubar la muestra con el anticuerpo, o
detectar la presencia del antígeno enlazado que resulta de la
administración o incubación. Finalmente se describe también un
procedimiento para determinar la presencia de ácidos nucleicos
micobacterianos en un animal, incluyendo un ser humano, o en una
muestra, que comprende administrarle un fragmento de ácido nucleico
de la invención al animal o incubar la muestra con el fragmento de
ácido nucleico de la invención o con un fragmento de ácido nucleico
complementario con él, y detectar la presencia de ácidos nucleicos
hibridados que resultan de la incubación. Un procedimiento tal de
diagnosticar tuberculosis debe implicar el uso de una composición
que comprende al menos una parte de una secuencia de nucleótidos
como se definió anteriormente y detectar la presencia de secuencias
de nucleótidos en una muestra del animal o ser humano para probarse
las cuales hibridan con el fragmento de nucleótidos (o un fragmento
complementario) mediante el uso de una técnica de
PCR.
PCR.
Los inmunoensayos preferidos se contemplan como
que incluyen varios tipos de inmunoensayos ligados a enzimas
(ELISAS), técnicas de inmunoblot, y similares, conocidos en la
técnica. Sin embargo, se aprecia fácilmente que la utilidad no se
limita a tales ensayos, y las realizaciones útiles incluyen RIAs y
otros ensayos o procedimientos de anticuerpos no ligados a
enzimas.
Se contempla que varios ensayos para la presencia
de micobacterias o para TB se pueden desarrollar usando cualquiera
de los polipéptidos de la invención, los correspondientes
fragmentos de ácido nucleico que codifican la proteína, proteínas
funcionalmente similares y sus epítopos, o mediante detección de
otros ácidos nucleicos apropiados. Los epítopos reactivos
representan partes de secuencias polipeptídicas que se podrían
utilizar en una manera análoga.
Finalmente, se describen kits de diagnóstico para
las formas de infección de TB en curso o previas. Los kits de
diagnóstico comprenden un anticuerpo, un ácido nucleico, o un
polipéptido de acuerdo con la invención en combinación con un medio
para detectar la interacción con la sustancia relevante que
reacciona con estas sustancias de la invención; la elección de
estos medios de reacción se discuten más abajo con referencia a
fragmentos de DNA, pero se entenderá que las mismas consideraciones
se aplican para polipéptidos y anticuerpos monoclonales de la
invención.
Tanto en los medios diagnósticos, composiciones,
y kits, los anticuerpos, ácidos nucleicos o polipéptidos de acuerdo
a la invención pueden opcionalmente estar acoplados a vehículos
sólidos o semisólidos, como es bien conocido en la técnica.
En las realizaciones de diagnóstico clínico, los
segmentos de ácidos nucleicos de la presente invención se pueden
usar en combinación con un medio apropiado, tal como una etiqueta,
para determinar hibridación con DNA de un organismo patógeno. Los
procedimientos típicos de la detección deben utilizar, por ejemplo,
especies radiactivas, ligandos de enzima activa u otros ligandos
marcadores tales como avidina/biotina, los cuales son detectables
directa o indirectamente. En las realizaciones preferidas de
diagnóstico, alguien probablemente deseará emplear una etiqueta
enzimática tal como una fosfatasa alcalina o peroxidasa más que
reactivos radiactivos u otros que pueden tener efectos ambientales
indeseables. Las etiquetas enzimáticas, por ejemplo, a menudo
utilizan sustratos indicadores colorimétricos que se detectan
fácilmente espectrofotométricamente, muchos en el intervalo de
longitud de onda visible. Los sustratos luminiscentes se podrían
usar para incrementar la sensibilidad.
Los segmentos de DNA hibridables pueden incluir
cualquiera de un número de segmentos del DNA descrito. Por ejemplo,
segmentos relativamente cortos que incluyen 12 o más o menos 12
pares de bases se pueden emplear, o, más preferiblemente cuando se
desean sondas, segmentos más largos que incluyen 20, 30 o 40 pares
de bases, dependiendo de las aplicaciones particulares deseadas.
Los segmentos más cortos son preferidos como cebadores en
aplicaciones tales como PCR, mientras algunos de los segmentos más
largos son preferibles generalmente para hibridación de bandas.
Debería de señalarse, sin embargo, que mientras que las secuencias
descritas para los segmentos de DNA de la presente invención se
definen mediante SEQ ID Nº:1 se esperaría una cierta cantidad de
variación o sustitución de base, por ejemplo como se puede encontrar
en mutantes o variantes de cepas, pero las cuales no afectarían
significativamente las características de hibridación. Tales
variaciones, incluyendo modificaciones de base que tienen lugar de
forma natural o de otro modo, como se menciona anteriormente se
desean incluir en el alcance de las presentes reivindicaciones.
Como se menciona, en ciertos aspectos, la
información de la secuencia de DNA proporcionada por la invención
permite la preparación de secuencias de DNA (o RNA o PNA)
relativamente cortas que tienen la capacidad para hibridar
específicamente a las secuencias de genes de las micobacterias. En
estos aspectos, las sondas de ácidos nucleicos de una longitud
apropiada se preparan basados en una consideración de la secuencia,
por ejemplo, SEQ ID Nº.: 1. La capacidad de tales sondas de ácidos
nucleicos para hibridar específicamente a las secuencias de genes
de micobacterias les presta una particular utilidad en una variedad
de realizaciones. Más importantemente, las sondas se pueden usar en
una variedad de ensayos de diagnóstico para detectar la presencia de
organismos patógenos en una muestra dada. Sin embargo, las sondas
se puede usar en una variedad de ensayos diagnósticos para detectar
la presencia de organismos patógenos en una muestra dada. Sin
embargo, ambos usos están previstos incluyendo el uso de la
secuencia de información para la preparación de cebadores de
especies mutantes, o cebadores para usar en la preparación de otras
construcciones genéticas.
Para proporcionar ciertas de las ventajas de
acuerdo con la invención, la secuencia de ácido nucleico preferida
empleada para los estudios o ensayos de hibridación incluye
secuencias que son complementarias de al menos un tramo de
40-10, o más o menos 40-10,
nucleótidos de la secuencia seleccionada. Un tamaño de al menos 10
nucleótidos en longitud ayuda a asegurar que el fragmento será de
suficiente longitud para formar una molécula dúplex que es tanto
estable como selectiva. Se prefieren generalmente las moléculas que
tienen secuencias complementarias por encima de tramos mayores de
10 bases en longitud, aunque, con el fin de incrementar la
estabilidad y selectividad del híbrido, y de este modo incrementar
la calidad y el grado de moléculas híbridas específicas obtenidas.
Así, alguien preferirá generalmente diseñar moléculas de ácido
nucleico que tienen generalmente tramos de 15 a 20 nucleótidos, o
incluso más largos si se desea, complementarios de genes. Tales
fragmentos se pueden preparar fácilmente mediante, por ejemplo,
síntesis directa del fragmento por medios químicos, mediante
aplicación de tecnología de reproducción de ácidos nucleicos, tal
como la tecnología de PCR de la patente de los Estados Unidos
4.603.102, o introduciendo secuencias seleccionadas dentro de
vectores recombinantes para la producción recombinante.
Como se puede ver a partir del ejemplo 6, los
polipéptidos de la invención también son capaces de facilitar una
respuesta Dth en la forma de una reacción de la piel en conejillos
de indias. Los polipéptidos de la invención puede ser así útiles
como agentes en una prueba diagnóstica de piel.
Por lo tanto, se describe también un
procedimiento de diagnosticar tuberculosis causada por
Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium africanum o
Mycobacterium bovis en un animal, incluyendo un ser humano,
que comprende inyectar intradérmicamente, en el animal, una
composición farmacéutica que contiene un polipéptido como se define
anteriormente o un análogo y/o subsecuencia del mismo el cual es
inmunológicamente equivalente al péptido, siendo una respuesta
positiva de la piel en la localización de la inyección indicativa
de que el animal tiene tuberculosis, y siendo una respuesta cutánea
negativa en la localización de la inyección indicativa de que el
animal no tiene tuberculosis.
Un aspecto adicional es un procedimiento para
inmunizar un mamífero, incluyendo un ser humano, contra la
tuberculosis causada mediante micobacterias perteneciendo al
complejo tuberculosis, en el que una vacuna como se define
anteriormente se administra al mamífero, la vacuna se puede
administrar intravenosamente, intraperitonealmente,
intracutáneamente o intramuscularmente, en dosis bien conocidas
para la persona experta en la técnica (cf. la discusión
anterior de administración de las vacunas de la invención).
Otro aspecto de la invención es un anticuerpo
monoclonal, el cual está reaccionando sustancialmente
específicamente con un polipéptido como se definió anteriormente en
un ensayo inmunitario, tal como una prueba de bandas western o una
prueba BLISA, o un fragmento de unión específica de dicho
anticuerpo.
En una realización preferida el anticuerpo
monoclonal, o un fragmento de unión específico de dicho anticuerpo,
se expresa mediante la línea celular depositada la cual se ha
depositado por el solicitante el 30 de junio de 1993 en la
colección de Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen
GMBH (DSM) bajo el número de acceso DSM ACC2134.
Otro aspecto de la invención es un vector
replicable el cual expresa un polipéptido como se define
anteriormente. El vector puede ser cualquier vector el cual pueda
convenientemente someterse a los procedimientos de DNA
recombinante, y la elección del vector dependerá a menudo de la
célula hospedadora dentro de la cual se introduce. Así, el vector
puede ser un vector autónomamente replicante, es decir un vector el
cual existe como una entidad extracromosómica, la replicación del
cual es independiente de la replicación cromosómica: ejemplos de
tal vector son un plásmido, fago, cósmido, minicromosoma o virus.
Alternativamente, el vector puede ser uno el cual, cuando se
introduce en una célula hospedadora, se integra en el genoma de la
célula hospedadora y se replica conjuntamente con él o con los
cromosomas dentro de los cuales se ha integrado.
Los vectores de expresión se pueden construir
para incluir cualquiera de los segmentos descritos en el presente
documento. Tal DNA debe codificar una proteína antigénica
específica para cepas virulentas de micobacterias o incluso sondas
de hibridación para detectar ácidos nucleicos de micobacteria en
muestras. Los segmentos de DNA más largos o más cortos, dependiendo
de la proteína antigénica deseada. Las regiones epitópicas de las
proteínas expresadas o codificadas mediante el DNA descrito se
pueden incluir como segmentos relativamente cortos de DNA. Es
posible que una amplia variedad de vectores de expresión incluya,
por ejemplo, segmentos de DNA que codifican productos de genes
indicadores útiles para la identificación de productos génicos
heterólogos y/o genes de resistencia tales como genes de
resistencia a antibióticos los cuales pueden ser útiles en
identificar células transformadas.
Los vectores recombinantes tales como aquellos
descritos se prefieren particularmente para transformar células
hospedadoras bacterianas. De acuerdo con ello, se describe un
procedimiento para preparar las células bacterianas hospedadoras
transformadas que incluye generalmente las etapas de seleccionar
una célula hospedadora bacteriana adecuada, preparar un vector que
contiene un segmento de DNA deseado y transformar la bacteria
hospedadora seleccionada. Varios tipos de células hospedadoras
bacterianas se pueden emplear, incluyendo E. coli, B.
subtilis, igual que micobacterias de crecimiento rápido tales
como M. smegmatis o incluso BGG. También se pueden emplear
otras células hospedadoras procariotas y eucariotas.
Las células transformadas se pueden seleccionar
usando diversas técnicas, incluyendo rastreo mediante hibridación
diferencial, identificación de productos fusionados de genes
indicadores, marcadores de resistencia, anticuerpos antiantígeno y
similares. Después de la identificación de un clon adecuado, se
puede seleccionar y cultivar bajo condiciones apropiadas a las
circunstancias, como por ejemplo, condiciones que favorecen la
expresión o, cuando se desea DNA, condiciones de replicación.
La presente invención se refiere por lo tanto
adicionalmente a una célula que esconde al menos un vector
replicable de expresión como se define anteriormente. En
principio, esta célula puede ser de cualquier tipo celular, es
decir una célula procariota tal como una bacteria, por ejemplo E.
coli o una Mycobacterium tuberculosis, o
Mycobacterium bovis, o Mycobacterium africanum, un
organismo eucariota unicelular, un hongo o levadura, o una célula
derivada de un organismo pluricelular, por ejemplo un animal o una
planta. Es especialmente en casos donde se desea glicosilación que
se usa una célula de mamífero, aunque la glicosilación de las
proteínas es un evento raro en procariotas.
La célula puede preferiblemente ser una célula
que se selecciona del grupo que consiste en las cepas lisogénicas
de E. coli AA226, AA227 y AA228 las cuales se han depositado
el 29 de junio de 1993 en la colección del Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen GMBH (DSM) bajo los números de
acceso DSM 837, DSM 8378 y DSM 8379, respectivamente, de acuerdo con
las disposiciones del Tratado de Budapest, o una célula de M.
tuberculosis BCG bovina.
Un aspecto adicional de la invención es un
procedimiento para producir un polipéptido como se definió
anteriormente que comprende insertar un fragmento de DNA como se
define anteriormente en un vector el cual es capaz de replicarse en
una célula hospedadora, cultivando la célula hospedadora en un medio
de cultivo apropiado bajo condiciones apropiadas para expresar el
polipéptido, y recuperar el polipéptido a partir de la célula
hospedadora o medio de cultivo y someter opcionalmente el
polipéptido recuperado a las modificaciones postraduccionales,
o
aislando el polipéptido a partir de filtrado de
cultivos a corto plazo como se define en el presente documento,
o
sintetizando el polipéptido mediante síntesis de
péptidos en fase líquida o sólida.
El medio usado para crecer las células puede ser
cualquier medio convencional adecuado para el propósito. Un vector
adecuado puede ser cualquiera de los vectores descritos
anteriormente, y una célula hospedadora apropiada puede ser
cualquiera de los tipos celulares enumerados anteriormente. Los
procedimientos empleados para construir el vector y efectuar
introducción del mismo dentro de la célula hospedadora pueden ser
cualesquiera procedimientos conocidos para tales propósitos en el
campo del DNA recombinante. En lo siguiente se dará una descripción
más detallada de las posibilidades.
En general, por supuesto, se prefieren los
procariotas para la clonación inicial de las secuencias nucleicas
de la invención y construir los vectores útiles en la invención.
Por ejemplo, además de las cepas particulares mencionadas en la
descripción más específica más adelante, alguien puede mencionar
por medio de ejemplo, cepas tales como la cepa 294 de E. coli
K12 (ATCC Nº. 31446), E. coli B, y E. coli X 1776
(ATCC Nº. 31537). Estos ejemplos se desean, por supuesto, para ser
ilustrativos más que limitantes.
Los procariotas se prefieren también para
expresión. Se pueden usar las cepas anteriormente mencionadas,
igual que E. coli W3110 (F-, lambda-, prototrófica, ATCC Nº.
273325), bacilos tales como Bacillus subtilis, u otras
enterobacterias tales como Salmonella typhimurium o
Serratia marcesans, y varias especies de Pseudomonas.
Son especialmente interesantes las micobacterias de crecimiento
rápido, por ejemplo M. smegmatis, dado que esas bacterias
tienen un alto grado de semejanza con las micobacterias del
complejo tuberculosis y por lo tanto suponen una buena posibilidad
de reducir la necesidad de llevar a cabo modificaciones
postraduccionales del producto de expresión.
En general, los vectores plasmídicos que
contienen secuencias replicón y de control las cuales se derivan de
especies compatibles con la célula hospedadora se usan en conexión
con estos hospedadores. El vector lleva de forma ordinaria un sitio
de replicación, igual que secuencias marcadoras las cuales son
capaces de proporcionar selección fenotípica en células
transformadas. Por ejemplo, E. coli se transforma
típicamente usando pBR322, un plásmido derivado de una especie de
E. coli (véase, por ejemplo, Bolivar y col., 1977, Gene 2:
95). El plásmido pBR322 contiene genes para resistencia a
amplicilina o tetraciclina y así proporciona procedimientos fáciles
para identificar células transformadas. El plásmido pBR, u otro
plásmido microbiano o fago puede contener también, o modificarse
para contener, promotores los cuales se pueden usar mediante la
recombinación de microorganismos para expresión.
Aquellos promotores más comúnmente usados en
construcción de DNA recombinante incluyen la
B-lactamasa (penicilinasa) y sistema promotor de
lactosa (Chang y col., 1978; Itakura y col., 1977; Goeddel y col.,
1979) y un sistema promotor de triptófano (trp) (Goeddel y col.,
1979; EPO Appl. Publ. Nº. 0036776). Mientras estos son los más
comúnmente usados, otros promotores microbianos se han descubierto
y utilizado, y se han publicado los detalles que conciernen a sus
secuencias de nucleótidos, permitiendo a un trabajador experto
ligar su funcionalidad con vectores plasmídicos (Siebwenlist y col.,
1980). Ciertos genes de procariotas se pueden expresar
eficientemente en E. coli a partir de sus propias secuencias
promotoras, descartando la necesidad de adición de otro promotor
por medios artificiales.
Además de procariotas, microbios eucarióticos,
tales como cultivos de levaduras se pueden usar también.
Saccharomyces cerevisiae, o la levadura común de los
panaderos es el más comúnmente usado entre los microorganismos
eucarióticos, aunque un número de otras cepas está comúnmente
disponible. Para la expresión en Saccharomyces, se usa
comúnmente, por ejemplo, el plásmido YRp7 (Stinchcomb y col., 1979;
Tschemper y col., 1980). Este plásmido ya contiene el gen trpl el
cual proporciona un marcador de selección para una cepa mutante de
levaduras que carece de la capacidad para crecer en triptófano por
ejemplo ATCC Nº. 44076 o PEP4-1 (Jones, 1977). La
presencia de la lesión trpl como una característica del genoma de
la célula de levadura hospedadora proporciona después un ambiente
efectivo para detectar transformación mediante crecimiento en
ausencia de triptófano.
Las secuencias promotoras adecuadas en vectores
de levadura incluyen los promotores parea
3-fosfoglicerato quinasa (Hitzman y col., 1980) u
otras enzimas glicolíticas (Hess y col., 1968; Holland y col.,
1978), tales como enolasa,
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato decarboxilasa,
fosfofructoquinasa,
glucosa-6-fosfato isomerasa,
3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa,
triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa, y glucoquinasa. En
la construcción de plásmidos de expresión adecuados, las secuencias
de terminación asociadas con estos genes están también ligadas
dentro del vector de expresión 3' de la secuencia que se desea que
se exprese para proporcionar poliadenilación del mRNA y
terminación.
Otros promotores, los cuales tienen la ventaja
adicional de transcripción controlada por las condiciones de
crecimiento son la región promotora para alcohol deshidrogenasa 2,
isocitocromo C, fosfatasa ácida, enzimas degradativas asociadas con
metabolismo de nitrógeno, y la anteriormente mencionada
gliceraldehído-3-fosfato
deshidrogenasa, y enzimas responsables de la utilización de maltosa
y galactosa. Cualquier vector plasmídico que contiene un promotor,
origen de replicación y terminación compatible con levadura, es
aceptable.
Además de los microorganismos, los cultivos de
células derivadas de organismos pluricelulares se pueden usar
también como hospedadores. En principio, cualquier cultivo celular
tal es factible, ya sea un cultivo que parte de un vertebrado o de
un invertebrado. Sin embargo, el interés ha sido mayor en células
de vertebrados, y la propagación de los vertebrados en cultivo
(tejido de células) ha llegado a ser un procedimiento de rutina en
años recientes (Tissue Culture, 1973). Ejemplos de tales líneas
celulares hospedadoras útiles son células VERO y HeLa, células de
ovario de hámster chino (CHO), y W138, BHK, COS-7
293 y líneas celulares MDCK.
Vectores de expresión para tales células incluyen
(si es necesario) un origen de replicación, un promotor localizado
delante del gen a expresarse, junto con cualesquiera necesarios
sitios de unión al ribosoma, sitios de "splicing" del RNA,
sitio de poliadenilación, y secuencias terminadoras de
transcripción de genes.
Para usar en células de mamífero, las funciones
de control en los vectores de expresión se proporcionan a menudo
mediante material vírico. Por ejemplo, los promotores comúnmente
usados se derivan de polioma, Adenovirus 2, y más frecuentemente
virus de los simios 40 (SV40). Los promotores tempranos y tardíos
del virus SV40 son particularmente útiles porque ambos se obtienen
fácilmente del virus como un fragmento el cual también contiene el
origen de replicación viral del SV40 (Fiers y col., 1978). Los
fragmentos de SV40 menores o mayores se pueden usar también, dado
que hay incluida la secuencia de aproximadamente 250 pares de bases
que se extiende del sitio HindIII hacia el sitio BGII
localizado en el origen de replicación viral. Adicionalmente, es
también posible y a menudo deseable, utilizar el promotor o las
secuencias de control asociadas normalmente con la secuencia
deseada del gen, dado que tales secuencias de control son
compatibles con los sistemas de células hospedadoras.
Un origen de replicación se puede proporcionar
bien por construcción del vector para incluir un origen exógeno,
tal como se puede derivar de SV40 u otro virus (por ejemplo,
Polyoma, Adeno, VSV, BPV) o se puede proporcionar mediante el
mecanismo de replicación cromosómico celular. Si el vector se
integra en el cromosoma de la célula hospedadora, lo último es a
menudo suficiente.
A la luz de la descripción anterior los
procedimientos para la producción recombinante del polipéptido de
la invención son también una parte de la invención, como son los
vectores que llevan y/o son capaces de replicar los ácidos
nucleicos de acuerdo a la invención en un célula hospedadora o una
línea celular. De acuerdo a la invención el vector de expresión
puede ser por ejemplo un plásmido, un cósmido, un minicromosoma, o
un fago. Especialmente interesantes son los vectores que se
integran en el genoma de la célula hospedadora/línea celular
después de su introducción en el hospedador.
Después de la preparación recombinante del
polipéptido de acuerdo con la invención, el aislamiento del
polipéptido puede por ejemplo llevarse a cabo mediante
cromatografía de afinidad (u otros procedimientos convencionales
bioquímicos que se basan en la cromatografía), que usan un
anticuerpo monoclonal el cual une específicamente al polipéptido de
acuerdo con la invención. Otra posibilidad es emplear la técnica
simultánea de electroelución descrita por Andersen y col., en J.
Immunol. Methods 161: 29-39.
De acuerdo con la invención las modificaciones
postraduccionales implican lipidación, glicosilación, escisión, o
elongación del polipéptido.
La secuencia de DNA a modificarse puede ser de
origen de cDNA o de DNA genómico como se discute anteriormente, pero
puede ser también de origen sintético. Además, la secuencia de DNA
puede ser de cDNA mezclado o de DNA genómico mezclado, de cDNA
mezclado y DNA sintético o genómico y de origen sintético como se
discute anteriormente. La secuencia de DNA puede haberse
modificado, por ejemplo mediante mutagénesis dirigida a sitio, para
dar como resultado el fragmento de DNA deseado que codifica el
polipéptido deseado. La siguiente discusión se centra en
modificaciones de DNA que codifican el polipéptido deberían
entenderse para comprender también tales posibilidades, igual que
la posibilidad de desarrollar el DNA mediante ligazón de dos o más
fragmentos de DNA para obtener el fragmento de DNA deseado, y
combinaciones de los principios anteriormente mencionados.
La secuencia de DNA se puede modificar usando
cualquier técnica adecuada la cual resulta en la producción de un
fragmento de DNA que codifica un polipéptido de la invención.
La modificación de la secuencia de DNA que
codifica la secuencia de aminoácidos del polipéptido de la
invención debería ser una que no dificulte la función inmunológica
del polipéptido resultante.
Un procedimiento preferido de preparar variantes
de los antígenos descritos en el presente documento es la
mutagénesis dirigida a sitio. Esta técnica es útil en la
preparación de péptidos individuales, o proteínas o péptidos
funcionales biológicamente equivalentes, derivados de las secuencias
antigénicas, a través de mutagénesis específica del DNA señalado.
La técnica proporciona adicionalmente una capacidad lista para usar
para preparar y probar variantes de la secuencia, por ejemplo,
incorporar una o más de las precedentes consideraciones,
introduciendo uno o más cambios en la secuencia de nucleótidos en
el DNA. Los sitios de mutagénesis específica permiten la producción
de mutantes a través del uso de secuencias de oligonucleótidos
específicas las cuales codifican la secuencia de DNA de la mutación
deseada, igual que un número suficiente de nucleótidos adyacentes,
para proporcionar una primera secuencia de suficiente tamaño y
complejidad de secuencia para formar un dúplex estable en ambos
lados de que el empalme de deleción se atraviese. Típicamente, se
prefiere un cebador de aproximadamente 17 a 25 nucleótidos de
longitud, con aproximadamente de 5 a 10 residuos en ambos lados del
empalme de la secuencia que está alterándose.
En general, la técnica de mutagénesis específica
de sitio es bien conocida en la técnica como se ejemplifica
mediante publicaciones (Adelman y col., 1983). Como se apreciará,
la técnica emplea típicamente un vector de fago el cual existe
tanto en una forma de cadena simple como en una forma de cadena
doble. Los vectores típicos usados en mutagénesis dirigida a sitio
incluyen vectores tales como el fago M13 (Messing y col., 1981).
Este fago está fácilmente disponible comercialmente y su uso es
generalmente bien conocido por aquellos expertos en la técnica.
En general, la mutagénesis dirigida a sitio de
acuerdo con esto se lleva a cabo por medio de esto obteniendo
primero un vector de cadena simple el cual incluye en su secuencia
una secuencia de DNA la cual codifica los polipéptidos de la
invención. Se prepara un cebador oligonucleotídico que lleva la
secuencia mutada deseada, generalmente de forma sintética, por
ejemplo mediante el procedimiento de Crea y col. (1978). Este
cebador es después fortalecido por el vector de cadena simple, y
sometido a enzimas de polimerización del DNA tales como el
fragmento Klenow de la DNA polimerasa I de E. coli, con el
fin de completar la síntesis de la hebra que lleva la mutación. Así,
se forma un heterodúplex en el que una hebra codifica la secuencia
original no mutada y la segunda hebra lleva la mutación deseada.
Este vector heterodúplex se usa entonces para transformar las
células apropiadas, tales como las células de E. coli, y se
seleccionan los clones los cuales incluyen vectores recombinantes
que llevan la colocación de secuencia mutada.
La preparación de variantes de secuencia de los
fragmentos de ácidos nucleicos seleccionados de la invención que
usan la mutagénesis dirigida a sitio se proporciona como un medio
de producir especies de los genes potencialmente útiles y no
significa que sea limitante ya que hay otras vías en las cuales se
pueden obtener las variantes de secuencia de los fragmentos de
nucleótidos de la invención. Por ejemplo, los vectores
recombinantes que codifican los genes deseados se pueden tratar
con agentes mutágenos para obtener variantes de secuencia (véase,
por ejemplo, un procedimiento descrito por Eichenlaub, 1979) para la
mutagénesis del plásmido de DNA que usa hidroxilamina.
Análogos/subsecuencias de los fragmentos de
ácidos nucleicos los cuales forman parte de la invención son
fragmentos de ácidos nucleicos los cuales se funden al menos en
otro fragmento de ácido nucleico el cual codifica una proteína que
codifica la inmunogenicidad de la proteína fundida relativa a una
proteína sin el socio de fusión codificado. Tales proteínas
codificadas pueden ser por ejemplo epítopos de células T u otros
epítopos inmunogénicos que potencian la inmunogenicidad del
producto del gen diana, por ejemplo linfoquinas tales como
INF-\gamma, IL-2 e
IL-12.
Otros fragmentos de ácido nucleico forman parte
de un fragmento de ácido nucleico de la invención que codifica un
polipéptido de fusión, son aquellos polipéptidos codificantes los
cuales facilitan la expresión y/o purificación del péptido
fusionado, por ejemplo proteínas de las fimbrias bacterianas, por
ejemplo los componentes de los pelos pilina y papA; proteína A; el
péptido ZZ; la proteína de unión a la maltosa;
S-transferasa de glutatión;
\beta-galactosidasa; o polihistidina.
El polipéptido de la invención se puede producir
alternativamente por los procedimientos bien conocidos de síntesis
de péptidos de fase sólida o líquida utilizando la unión sucesiva
de los aminoácidos individuales de la secuencia polipeptídica o la
unión de aminoácido individuales que forman fragmentos de la
secuencia polipeptídica de tal forma que da como resultado el
polipéptido deseado.
Aún un aspecto adicional de la invención es un
procedimiento para producir una vacuna de acuerdo a lo que se
definió anteriormente, que comprende
producir o aislar un polipéptido como se define
anteriormente, y
solubilizar o dispersar el polipéptido en un
medio para una vacuna, y
añadir una sustancia coadyuvante,
cultivar una célula de un microorganismo que
comprende al menos una secuencia de nucleótidos como se describe
anteriormente, y transferir la célula a un medio para una vacuna,
y
añadir una sustancia coadyuvante.
En la primera realización, otros antígenos de
M. tuberculosis se pueden añadir al medio.
Figura 1: curso de la infección con M.
tuberculosis en ratones desprotegidos y ratones con memoria
inmunitaria.
Los ratones C57BI/6j se infectaron con 2,5 x
10^{5} unidades viables de M. tuberculosis y el
crecimiento de los organismos en el bazo se investigó durante un
periodo de 25 días. La cuenta en las UFC indicada representa la
media de 4-5 ratones.
Figura 2: producción in vivo de
INF-\gamma durante la infección de tuberculosis.
Los ratones desprotegidos y los ratones con memoria inmunitaria se
infectaron intravenosamente con 2,5 x 10^{5} unidades formadoras
de colonia de M. tuberculosis y el nivel de
INF-\gamma se controló en el bazo o suero de
animales durante el curso de la infección.
Figura 3: la respuesta in vitro de los
linfocitos del bazo de ratones infectados.
Los ratones desprotegidos y los ratones con
memoria inmunitaria se sacrificaron a diferentes momentos durante
el curso de la infección, y los linfocitos del bazo se estimularon
in vitro con ST-CF o bacilos muertos. Los
sobrenadantes de cultivos celulares se probaron en busca de la
presencia de INF-\gamma.
Figura 4: fracciones de filtrado de cultivo a
corto plazo.
ST-CF se dividió en 14 fracciones
mediante la técnica de multielución y las fracciones se analizaron
mediante SDS-PAGE y teñido con plata. Carril F:
ST-CP. Carriles 1-15: fracciones
1-15.
Figura 5: reactivación de las células T durante
una infección secundaria.
La liberación de INF-\gamma
mediante linfocitos de bazo aislados bien directamente de los
ratones con memoria inmunitaria o cuatro días después de que los
ratones han recibido una infección secundaria. Los linfocitos se
estimularon in vitro con fracciones ST-CF y
los sobrenadantes se recogieron para la cuantificación de
INF-\gamma. La migración de marcadores moleculares
(como se muestra en la figura 4) se indica en el fondo.
Figura 6: mapa preciso de la liberación de
INF-\gamma en respuesta a antígenos individuales
segregados.
Un panel de fracciones estrechas en las regiones
estimulatorias 4-14 y 26-34
permitió el mapeo preciso de las proteínas capaces de inducir
INF-\gamma en los microcultivos que contienen
linfocitos de ratones con memoria inmunitaria en el día 4 de volver
a ponerlos a prueba. En el lado a mano izquierda: la localización
de e inducción de INF-\gamma mediante antígenos
segregados definidos de masa molecular 5-8 kDa.
Figura 7: purificación bioquímica del antígeno
reactivo HYB76-8 (ESAT6).
El análisis mediante SDS-PAGE de
ESAT6 purificado obtenido de un procedimiento de purificación que
implica una filtración de gel final de en una columna Superdex 75.
La muestra aplicada a la columna fue el antígeno reactivo
HYB76-8 que contiene fracción eluída de la columna
Mono Q durante la segunda etapa de purificación. Los carriles 5, 6,
y 7 muestran la presencia del antígeno reactivo
HYB76-8 en la región por debajo del marcador de 14,4
kDa de peso molecular.
Figura 8: mapa físico de los productos de
expresión de los fagos lambda reactivos con Mabs que reconocen los
componentes de baja masa molecular. Barra sombreada con líneas
cruzadas; lacZ, barra sólida; DNA de M. tuberculosis,
barra abierta; lambdatg11*DNA (brazo derecho), triángulos abiertos
indican sitios de escisión con EcoRI originados a partir del
vector lambdatg11. La dirección de traducción y transcripción de
los productos génicos fusionados con
beta-galactosidasa se indica mediante una
flecha.
Figura 9: el análisis por prueba de bandas
western demuestra expresión recombinante de componentes de bajo peso
molecular. Los lisados de E. coli Y1089 se lisogenizan con
lambda AA226, lambda AA226 o lambda se analizaron en experimentos
de bandas western después de PAGE (A: 10%, B: gradiente 10 a
20%).
Panel A: carriles 1: lambda gt11; carriles 2:
lambda AA226; carriles 3: lambda AA227.
Panel B: carril 1: lambda gt11; carriles 2 y 3:
lambda AA242 y AA230 (clones idénticos).
Los anticuerpos monoclonales se indican en la
parte superior de cada panel. L24, c24 es un anticuerpo monoclonal
reactivo anti-MPT64.
Figuras 10A, 10B y 10C: ESAT 6 recombinante.
10A: mapa plasmídico de pAA249.
El fragmento EcoRI-BamHI de 1,7 kpb
de lambda AA227 se subclona en los sitios EcoRI-BamHI
de pBluescript. Barra sombreada con líneas cruzadas; DNA
micobacteriano, flecha; el gen esat6.
10B: la secuencia completa de DNA del DNA
micobacteriano de pAA249.
La secuencia se obtuvo mediante el procedimiento
de secuenciación dideoxi (Sanger, F. y col. 1977, secuenciación de
DNA con inhibidores de terminación de cadena; Proc. Natl. Acad.
Sci. 74: 5463) y secuencia de ciclo usando el sistema Terminador de
Tinción en combinación con el lector automatizado de gel, modelo
373ª de Applied Biosystems; la secuencia se muestra también en SEQ
ID Nº.: 1. ESAT6 se codifica mediante la secuencia de DNA
del codón de iniciación ATG en la posición 13-15 al
codón de parada TAG en la posición 298-300.
10C: la secuencia de aminoácidos deducida de
ESAT6 (también mostrada en SEQ ID Nº.: 2) en código convencional de
3 letras. El * indica aminoácidos los cuales se podrían alinear a
la secuencia obtenida mediante secuenciación
N-terminal de material nativo bioquímicamente
purificado.
Figura 11: fracciones ST-CF para
investigación de los patrones de respuesta de las células T en
animales genéticamente heterogéneos. La ST-CF se
separó en SDS- PAGE y se tiñó de plata. Los marcadores MW se indican
a la izquierda y los cortes usados en la preparación de las
fracciones 1-10 a la derecha. Estas fracciones se
usaron para los experimentos indicados en figuras 12 y 13.
Figuras 12A y 12B: respuestas de los conejillos
de indias a fracciones ST-CF. Resultados de
estimulación de linfocitos con linfocitos del bazo (figura 12A) y
linfocitos de sangre periférica( figura 12B).
Figura 13: respuestas a células T en diferentes
cepas genéticas de ratones.
Las células T de ratón se estimularon in
vitro con el panel de fracciones ST-CF y
liberación de INF-\gamma a los sobrenadantes de
cultivos controlados.
Figura 14: respuesta del
INF-\gamma humano a fracciones
ST-CF.
El PBL humano se estimuló in vitro con
fracciones ST-CF y sobrenadantes de cultivo celular
investigados en busca de la presencia de
INF-\gamma.
Figura 15: la prueba cutánea que induce capacidad
de ESAT6 nativa purificada en conejillos de indias infectados por
aerosol.
El diámetro de las reacciones de la prueba
cutánea se midió 3, 6, 8, y 11 días después de la exposición de 4
grupos de conejillos de indias (N = 5) a aerosoles de M.
tuberculosis.
Es un hecho establecido que la memoria
inmunológica reside a largo plazo después de la terminación de una
infección tuberculosa (Orme, I.M., 1988; Lefford, M.J. y col.,
1974). Esta memoria inmunitaria protege eficientemente el hospedador
contra una infección secundaria con M. tuberculosis más
adelante en la vida. Cuando un hospedador inmune monta una respuesta
inmune protectora, las células T específicas responsables del
reconocimiento temprano del macrófago infectado, estimula una
poderosa actividad bactericida a través de su producción de
INF-\gamma (Rook, G.A.W., 1990; Flesch, I y col.,
1987). Los antígenos protectores los cuales se incorporan en una
vacuna de subunidades han sido vistos en los ejemplos más adelante
entre las dianas moleculares de las células efectoras responsables
de la memoria de una respuesta inmune protectora. Esto ha dado como
resultado en la identificación de dianas antigénicas
inmunodominantes para las células T durante la primera fase de una
respuesta inmune protectora.
Bacterias. M. tuberculosis H37Rv
(ATCC 27294) se creció a 37ºC en medio
Löwenstein-Jensen o en suspensión en medio Sauton
modificado. BCG Copenhagen se obtuvo como una vacuna secada en frío
y se rehidrató con sauton diluido seguido de una breve sonicación
para asegurar una suspensión dispersa.
Producción de filtrado de cultivo a corto
plazo (ST-CF). ST-CF se produjo
con se describe previamente (Andersen y col., 1991b). Brevemente se
incubó M. tuberculosis (4 x 10^{6} UFC/ml) en medio Sauton
y se crecieron en un agitador orbital durante 7 días. Las bacterias
se eliminaron mediante filtración y el cultivo de sobrenadantes se
hizo pasar a través de filtros estériles (0,2 \mum) y se concentró
sobre una membrana Amicon YM 3 (Amicon, Danvers, Ass.).
Fraccionamiento de ST-CF
mediante la técnica de multielución. ST-CF (5
mg) se separó en 10-20% SDS-PAGE
durante toda una noche (11 cm de ancho respecto al centro del
pocillo, 0,75 mm de gel). Después de la terminación del proceso
electroforético el gel se recorta del exceso de gel, y se
preequilibra en 3 cambios de tampón fosfato 2 mM durante 40 minutos.
La multielución se llevó a cabo como se describió previamente
(Andersen y Heron, 1993b). Brevemente, los geles se transfirieron al
Multi-Eluter™
(KEM-EN-TECH) y se electroeluyeron
(40 V) en un tampón fosfafo 2 mM durante 20 minutos. Las fracciones
polipeptídicas se aspiraron y ajustaron a isotonía con PBS
concentrado. Todas las fracciones se estabilizaron con 0,5% de suero
de ratones y se mantuvieron congeladas a -80ºC hasta su uso.
Cultivos de linfocitos. Los linfocitos se
obtuvieron preparando suspensiones de células individuales a partir
de bazos como se describe en Andersen y col, 1991a. Brevemente,
fracciones ST-CF o antigénicas se añaden a
microcultivos que contienen 2 x 10^{5} linfocitos en un volumen de
200 \mul Rpmi 1640 suplementados con
2-mercaptoetanol 5 x 10^{5} M, penicilina,
estreptomicina, 1 mM de glutamina y 0,5% (vol/vol) suero fresco de
ratón.
El ST-CF se usó en la
concentración de 4 \mug/ml mientras las fracciones
ST-CF se usaron en 1 \mug/ml.
La proliferación celular se investigó dando un
pulso a los cultivos (1 \muCi [^{3}H] timidina/pocillo) después
de 48 horas de incubación, incubando adicionalmente las placas
durante 22 horas y recogiendo y procesando finalmente las placas
para contaje de centelleo líquido (Lkb, contador Beta). Los
sobrenadantes de cultivo se recogieron de cultivos paralelos 48
horas después de incubación y se usaron para análisis de
linfoquina.
Análisis de linfoquina. La cantidad de
INF-\gamma presente en sobrenadantes de cultivo y
en órganos homogeneizados se cuantificó mediante un kit de ELISA de
INF-\gamma (Holland Biotechnology, Leiden, Países
Bajos). Los valores por debajo de 10 pg se consideraron
negativos.
Un grupo de ratones eficientemente protegidos se
generó infectando ratones hembra de 8-12 semanas de
edad de la línea genética C57B1/6j en Statens Seruminstitut,
Copenhague, Dinamarca, con 2,5 x 10^{3} M. tuberculosis por
vía intravenosa. Después de 30 días de infección los ratones se
sometieron a un tratamiento de antibióticos de 60 días con
isoniazida y después de dejaron durante 200-240
días para asegurar el establecimiento de memoria de inmunidad a
largo plazo que queda. Los ratones se reinfectaron después con 2,5 x
10^{5} M. tuberculosis por vía intravenosa y el curso de
la infección se comparó con el de un grupo correspondiente de
ratones desprotegidos (fig. 1).
Como se ve en la figura 1, M. tuberculosis
crece rápidamente en los bazos de ratones desprotegidos mientras
que la infección se controla en los primeros pocos días en los
ratones de memoria inmunitaria. Este hallazgo enfatiza que los
eventos inmunológicos tempranos tienen lugar durante los primeros
días determinan el resultado de la infección.
El interferón gamma
(INF-\gamma) es una linfoquina la cual está
implicada directamente en la inmunidad protectora contra M.
tuberculosis (Rook G.A.W., 1990, Flesch y Kauffmann S., 1987).
Para controlar la aparición de una respuesta protectora, el
contenido de INF-\gamma en homogenados de bazo
(4% peso/volumen en PBS) y en muestras de suero se investigó durante
el curso de la infección (figura 2). Se encontró que los ratones
con memoria inmunitaria responden inmediatamente (<24 horas)
mediante una producción marcada de INF-\gamma
detectable tanto en bazo como en suero. Los ratones desprotegidos,
en contraste, tienen un retraso de 14 días antes de que cualquier
producción significativa sea evidente, un periodo durante el cual
la infección progresa rápidamente. Los ratones inmunes se
caracterizan por una liberación acelerada de
INF-\gamma y por determinar las dianas moleculares
de esta respuesta inmunológica, los linfocitos del bazo se
obtuvieron de animales en diferentes momentos durante el curso de
la infección. Los linfocitos se estimularon in vitro bien
con bacterias, muertas mediante glutaraldehído y lavadas con PBS o
bien con filtrado de cultivos a corto plazo (ST-CF)
el cual es una mezcla compleja de proteínas segregadas por M
tuberculosis durante el crecimiento (Andersen, P. y col., 1991)
(Figura 3). Se encontró que los ratones con memoria inmunitaria se
caracterizaban por una generación acelerada de células T que
producen INF-\gamma en respuesta a
ST-CF mientras que se encontró que las bacterias
muertas en contraste facilitaban sólo una respuesta marginal en un
estadio muy tardío de la infección.
Para mapear las dianas moleculares de las células
T protectoras entre las múltiples proteínas segregadas presentes en
ST-CF se llevó a cabo un rastreo de
ST-CF usando la técnica de multielución (Andersen y
Heron, 1993b). Esta técnica divide las mezclas proteicas complejas
separadas en SDS-PAGE en fracciones estrechas en un
tampón fisiológico (figura 4). Estas fracciones se usaron para
estimular linfocitos de bazo in vitro y la liberación de
INF-\gamma se controló (figura 5). La respuesta
de ratones con memoria inmunitaria a largo plazo (los ratones que
se dejaron durante 200-400 días para asegurar el
resto inmunológico) se comparó con la respuesta generada después de
cuatro días de volver a probar con infección. Esta comparación
permite el mapeo de dianas para células T efectoras de memoria
activadas para liberar INF-\gamma durante la
primera fase de una respuesta inmune protectora. Usando esta
aproximación se demostró que las dianas para estas células T
protectoras fueron proteínas segregadas o fragmentos de proteínas
de masa molecular aparente 6-10 y
26-34 kDa (figura 5).
Para mapear de forma precisa moléculas
individuales en las regiones estimulatorias se investigó la
inducción de INF-\gamma mediante un panel de
fracciones estrechas solapantes. Esto permitió la identificación de
una fracción de proteínas de 6-8 kDa con una
capacidad excesivamente estimulatoria (5100-5400 pg
de INF-\gamma unidades/ml) (figura 6). La banda
proteica de 6 kDa que produce la liberación más alta de
INF-\gamma (5.390 p/ml) se reconoció por el mAb
HYB76-8, mientras que las bandas de proteína
adyacentes se reconocieron mediante los mAbs ST-3 y
PV-2.
El mAb HYB76-8 el cual define por
lo tanto la diana principal de las células T protectora se usa para
identificar el antígeno durante una cromatografía en columna en
tres etapas:
- Se añadieron 3M de sulfato de amonio en tampón fosfato a ST-CF (carril 1, figura 7) (1-10 mg/ml) tal como para obtener una concentración final de sulfato de amonio 1 M. Las proteínas precipitadas se eliminaron mediante centrifugación, y el sobrenadante se aplicó a una columna Fenil Sefarosa CL-4B (Pharmacia) (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia). El análisis de bandas western en este punto muestra que el antígeno reactivo HYB76-8 se presentó ante todo en el sobrenadante. Un gradiente lineal de concentración decreciente de sulfato de amonio (un gradiente lineal 1M - 0M de sulfato de amonio, en 50 mM de tampón fosfato (pH 8,5) se usó. El antígeno reactivo HYB76-8 se eluyó a concentraciones de 100 mM-0 mM de sulfato de amonio.
- Las fracciones que contienen antígeno reactivo HYB76-8 se recogieron y se sometieron a intercambio de tampón. El tampón usado fue de 50 mM de TRIS/HCl, pH 8,5. La muestra se analizó en un Mono Q (Pharmacia) usando un gradiente lineal de 0 - 0,5 de NaCl. El antígeno reactivo HYB76-8 se eluyó a una concentración de NaCl de 150-200 mM de NaCl.
- Las fracciones de antígeno reactivo HYB76-8 se aplicaron directamente a columna Superdex 75 16/60 (Pharmacia), 3 ml por utilización. El tampón usado fue PBS, pH 7,4. La mitad de las fracciones que contienen antígeno reactivo HYB76-8 recogidas contienen GroES como el único otro antígeno (carriles 5, 6, y 7 en la figura 7).
Los resultados obtenidos de experimentos
similares a aquellos del ejemplo 1 se han dirigido adicionalmente a
la proteína reconocida mediante el mAb HYB76-8 como
un antígeno importante en la respuesta temprana a la reinfección
con M. tuberculosis. En experimentos con suspensiones de
células T a partir de ratones vueltos a probar se demostró que el
antígeno reactivo HYB76-8 químicamente purificado
facilitó una liberación excesivamente alta de
INF-\gamma (13933 \pm 836 pg/ml a una
concentración de proteínas de 20 \mug/ml). ST-CF
en comparación indujo en este experimento una liberación de 7300
\pm 208 pg/ml. El antígeno reactivo HYB76-8
recombinante facilitó en tales experimentos una liberación algo
menor de INF-\gamma (3500-5000
pg/ml).
Los resultados en el ejemplo 1 señalan
ST-CF como diana para células T implicadas en
inmunidad protectora, un hallazgo el cual se confirmó
adicionalmente investigando la eficacia protectora de una vacuna
experimental basada en ST-CF.
Ratones hembra de 8-12 semanas de
edad de la línea genética C57B1/6j en Statens Seruminstitut,
Copenhague, Dinamarca, se inmunizaron con 5 x 10^{4} UFC de BCG
subcutáneamente en 0,2 ml de disolución salina en la base de la
cola. Esta dosis se encontró que inducía una respuesta inmune
protectora óptima en nuestro modelo animal (resultados no
mostrados).
Las vacunas experimentales las cuales contenían
100 mg de ST-CF/dosis y aplicaban bromuro de
dimetildioctadecilamonio (DDA) (250 mg/dosis) como coadyuvante en
0,2 ml se administraron subcutáneamente tres veces con intervalos
semanales en diferentes sitios de la espalda de los ratones para
estimular una fuertes respuesta inmune celular a
ST-CF.
DDA (Eastmann Kodak, USA) se preparó mediante
suspensión del polvo en agua destilada (2,5 mg \cdot ml^{-1}).
Una buena dispersión homogénea del polvo se obtuvo calentando la
suspensión a 8ºC durante 5-10 minutos. Después de
enfriar a temperatura ambiente la suspensión se mezcló con
cantidades iguales bien de PBS o bien de ST-CF
diluido. Cada inyección contenía 250 \mug de DDA en 0,2 ml.
En la primera serie de experimentos de protección
los ratones se dejaron durante 12-14 semanas
después de la primera inyección y después se pusieron a prueba
mediante una inyección intravenosa de 1 x 10^{4} M.
tuberculosis viables. El curso de la enfermedad se controló en
los bazos y pulmones en diferentes momentos durante los primeros 28
días.
En la segunda serie de experimentos de protección
los ratones se pusieron a prueba 5-6 semanas
después de la primera inyección mediante un a inyección
intrapulmonar de 1 x 10^{6} M. tuberculosis.
Después de 2-3 semanas de
infección los ratones se mataron y el número de bacterias viables en
los bazos de ratones infectados se determinó plaqueando en una
serie doble diluciones que son homogenados de órganos diluidos 10
veces en medio Löwnstein-Jensen. Las colonias se
contaron después de 3 a 4 semanas de incubación, y los datos se
expresaron como los valores sometidos a log_{10} de las medias
geométricas de las cuentas obtenidas con de seis a doce ratones
(tabla 1).
\small\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
^{a} Ratones que se inmunizaron con BCG o se inyectaron tres veces
con las vacunas experimentales.\cr \begin{minipage}{150mm}
^{b} Los números de bacterias se expresan como los valores
sometidos a log _{10} de las medias geométricas (n = 6 en
experimento 1 y n = 12 en experimento 2). SEM es menos que 0,16 en
experimento 1 y menos de 0,32 en experimento 2. Los valores P se han
dado para números bacterianos que son significativamente diferentes
de los números encontrados para animales de control no
inmunizados.\end{minipage} \cr}
Estos experimentos demuestran convincentemente
que ST-CF contienen antígenos protectores los cuales
se pueden usar para activar una respuesta de memoria inmunitaria a
largo plazo de la misma eficacia protectora como la que se
proporciona mediante BCG vivas.
Las dianas moleculares para
INF-\gamma que producen células T implicadas en
la primera fase de una respuesta inmune protectora se encontró en la
región 6-10 y en la región 26-24
kDa de ST-CF (figura 5). Una vacuna experimental
basada en estas fracciones de antígeno seleccionadas y el DDA
coadyuvante se construyó y se probó por lo tanto en nuestro modelo
animal. Además este experimento incluye vacunas basadas en las dos
dianas antigénicas simples identificadas hasta ahora; el antígeno
85 de 31-32 kDa y una versión recombinante del
antígeno 6 kDa.
Los ratones vacunados se dejaron durante
12-14 semanas después de la primera inyección y
después se probaron mediante una inyección intravenosa de 1 x
10^{4} M. tuberculosis viables. Los ratones se mataron y
las bacterias se enumeraron como en el experimento previo (tabla
2).
\vskip1.000000\baselineskip
\dotable{\tabskip\tabcolsep#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
\begin{minipage}{150mm} ^{a)} Los ratones se inmunizaron con
BCG o se inyectaron tres veces con vacunas
experimentales.\end{minipage} \cr \begin{minipage}{150mm}
^{b)} Los números de bacterias se expresaron como los logaritmos en
base 10 de los valores de las medias geométricas. SEM es menos de
0,30.\end{minipage} \cr}
El experimento demostró que tanto la vacuna
basada en fracciones antigénicas que varía de 6-10
como la vacuna basada en las fracciones antigénicas de
26-24 kDa indujeron e incrementaron el nivel de
resistencia adquirida, un resultado que enfatiza la presencia de
antígenos protectores con estas regiones de
ST-CF.
Ni el Ag 85 purificado ni el antígeno de 6 kDa,
indujeron sin embargo ninguna protección significativa en este
experimento. La razón para la baja eficacia de estas vacunas
basadas en los productos purificados se buscó investigando los
subconjuntos de células T inducidas mediante la inmunización. Las
células T se aislaron de los ratones vacunados y se estimularon
in vitro con ST-CF. La proliferación celular
en los cultivos se investigó y la liberación de
INF-\gamma se cuantificó. Este experimento
demostró que aunque todos los protocolos diferentes de vacunación
inducen la proliferación de células T en respuesta a
ST-CF in vitro en exceso, niveles bajos de
INF-\gamma están presentes en los cultivos con
células T de ratones inmunizados con las proteínas purificadas (la
de 6kDa y Ag 85). Las células derivadas a partir de ratones
inmunizados con una mezcla de la mezcla compleja de
ST-CF y DDA en contraste, libera
1800-2000 pg/ml de INF-\gamma.
Esto resulta fuertemente sugerente de que
mientras que una vacuna basada en la mezcla de proteínas contenidas
en ST-CF induce una respuesta inmune protectora que
consta predominantemente de células Th-1
caracterizadas por la liberación de altos niveles de
INF-\gamma e IL-2 y niveles bajos
de IL-4 e IL-5 (resultados no
mostrados), una vacuna similar basada en productos individuales
purificados se caracterizó por la inducción de una respuesta
predispuesta a favor de células Th-2 no protectoras,
no capaces de producir INF-\gamma.
Una posible explicación de esta discrepancia
puede ser que las moléculas con proteínas coadyuvantes
(inmunomoduladores) existen entre las proteínas presentes en
ST-CF. El trabajo se ha continuado por tanto con el
propósito de establecer un sistema coadyuvante capaz de inducir
una respuesta de INF-\gamma poderosa, incluso con
productos purificados. DDA se ha combinado con
INF-\gamma recombinante o el inductor de
poli-IC del INF-\gamma sintético.
Estas mezclas se han mezclado con ST-CF, ratones
inmunizados y la reactividad de las células T inducida se ha
investigado estimulando las suspensiones de células T in
vitro con ST-CF (tabla 3).
\vskip1.000000\baselineskip
\newpage
Este experimento demostró que ambas de estas
adiciones inducen una respuesta proliferativa de las células T
asociada con niveles marcadamente incrementados de
INF-\gamma.
Esta línea de investigación se continuará (por
ejemplo, mediante la adición de otras citoquinas recombinantes) o
prueba de sistemas coadyuvantes alternativos. Los criterios usados
para determinar la viabilidad de un coadyuvante pueden ser la
inducción de una respuesta eficiente Th-1 como se
juzga por:
- 1)
- Alta razón INF-\gamma/IL-4 durante la respuesta de memoria in vitro.
- 2)
- Alta razón de los mRNAs de INF-\gamma/IL-4 inducida en los nódulos linfáticos regionales.
- 3)
- Alta razón IgG2a/IgGI en la inmunoglobulina específica inducida por la inmunización.
- 4)
- Alta eficacia de la vacuna contra una prueba subsiguiente.
Las proteínas purificadas se probarán
subsiguientemente en la combinación óptima de coadyuvantes.
Se demostró (en el ejemplo 1) que los componentes
de bajo peso molecular (componentes con un peso molecular aparente
menor que aquel de GroES) en filtrados de cultivos a corto plazo
reaccionó con los anticuerpos monoclonales producidos mediante 3
hibridomas ST-3, HYB76-8, y
PV-2. Con el fin de identificar la unión de los
antígenos a estos anticuerpos, se llevaron a cabo los siguientes
experimentos:
La biblioteca de DNA recombinante de M.
tuberculosis en \lambdagt11 construida mediante R. Young
(Young, R.A. y col., 1985) y obtenida a través del programa IMMTUB
de la Organización Mundial de la Salud (WHO.0032.wibr) se rastreó
en busca de fagos que expresen productos genéticos los cuales
unirían los anticuerpos monoclonales HYB76, PV-2 y
ST-3.
Aproximadamente 1x10^{5} ufc de la biblioteca
de genes (que contiene aproximadamente 25% de los fagos
recombinantes) se plaquearon sobre Eschericia coli Y1090
(\DeltalacU169, proA*, \Deltalon, araD139, supF,
trpC22::tn10[pMC9] ATCC#37197)en agar blando e
incubado durante 2,5 horas a 42ºC.
Las placas se revistieron con láminas de
isopropil-\beta-D-tioga-lactopiranósido,
láminas saturadas de nitrocelulosa y la incubación se continuó
durante 2,5 horas a 37ºC. La nitrocelulosa se eliminó e incubó con
muestras de los anticuerpos monoclonales en PBS con Tween 20
añadido a una concentración final de 0,05%. Los anticuerpos
monoclonales se visualizaron mediante inmunoglobulinas de conejo
antirratón conjugadas con peroxidasa de rábano picante (P260, Dako.
Glostrup, DK) y una reacción de tinción que implica 5, 5', 3, 3'
tetrametilbencidina y H_{2}O_{2}.
Las placas positivas se volvieron a clonar y los
fagos originados a partir de una placa individual se usaron para
lisogenizar E. coli Y1089 (\DeltalacU169, proA^{+},
\Deltalon, araD139, strA, hf1150
[chr::tn10][pMC9]ATCC nr. 37196). Las cepas
lisogénicas de E. coli resultantes se han depositado en la
Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares en
Braunschweig, FRG bajo los números de acceso DSM:
DSM 8377 = AA226 (expresando el polipéptido
reactivo ST-3),
DSM 8378 = AA227 (expresando el polipéptido
reactivo HYB76-8),
DSM 8379 = AA242 (expresando el polipéptido
reactivo PV-2).
Un mapa físico de los fagos recombinantes se
muestra en la figura 8 y la expresión de los productos de los genes
recombinantes se muestra en la figura 9.
Las proteínas de unión a HYB76-8
y ST-3 se expresan como proteínas de fusión
fusionadas a \beta-galactosidasa mientras que la
proteína de unión a PV-2 parece expresarse en una
versión no fusionada.
Secuenciación de la secuencia de nucleótidos
que codifica la proteína de unión HYB76. Con el fin de obtener
la secuencia de nucleótidos del gen que codifica la proteína de
unión a HYB76-8 el fragmento
EcoRI-BamHI de 1,7 kpb de M. tuberculosis
derivado de AA227 se subclonó en pBluescript+ (Stratagene, La Jolla,
Ca.) (figura 10ª) y se usa para transformar E. coli
XL-1 Blue (Stratagene, La Jolla, Ca.).
La secuencia de DNA completa obtenida mediante el
procedimiento de secuenciación dideoxi (Sanger, F. y col., 1977,
"DNA sequencing with chain terminating inhibitors". Proc.
Natl. Acad. Sci. 74: 5463) y secuenciación de ciclo usando el
sistema Terminador de Tinción en combinación con el lector de gel
automatizado, modelo 373a de Applied Biosystems, se muestra en la
figura 10B. Una horquilla de lectura abierta que codifica una
secuencia de 95 residuos de aminoácidos se identifica a partir de
un codón iniciador de ATG en la posición 13-15 que
se extiende a un codón de parada TAG en la posición
298-300.
La secuencia de aminoácidos deducida se muestra
en la figura 10C usando un código convencional de 3 letras. El *
indica aminoácidos los cuales se pueden alinear a la secuencia
obtenida después de la secuenciación N-terminal de
material nativo purificado bioquímicamente.
Comparación de composición aminoacídica
deducida y observada de ESAT6. (Los aminoácidos se comparan a
Leucina a la cual se asignó el valor = 1).
\vskip1.000000\baselineskip
No se encuentran secuencias homólogas buscando
las bases de datos GenEMBL usando el Paquete Software de Análisis de
Secuencias versión 7.1 del Genetics Computer Group asociado con la
Universidad de Wisconsin (Devereux, J. y col., 1984). La proteína
de unión HYB76-8 se cree por lo tanto que es
novedosa.
El potencial estimulatorio de las fracciones de
proteínas segregadas se investigó en donantes no consanguíneos
conejillos de indias y humanos. Esto se hizo para analizar la
posible influencia del diseño genotípico y experimental en la
inmunodominancia relativa de la fracción de antígenos segregados de
6-10 kDa.
Las respuestas de las células T en diferentes
cepas de ratones consanguíneos. Cepas genéticamente diferentes
de ratones consanguíneos que representan diferentes haplotipos MHC
kl 2 se infectaron con M. tuberculosis durante 14 días. Las
células T esplécnicas se aislaron y estimularon con el panel de
fracciones de proteínas segregadas (figura 11). La liberación de
INF-\gamma en los cultivos se cuantificó y el
patrón de respuesta de las diferentes cepas se comparó (figura
13).
Cinco de cada seis cepas de ratones demostraron
un reconocimiento predominante de la fracción 1, un resultado el
cual da soporte adicionalmente a la noción de que esta fracción es
generalmente inmunodominante durante la infección viva.
La capacidad estimulatoria de las fracciones
ST-CF en conejillos de indias sensibilizados.
Grupos de conejillos de indias no consanguíneos a partir de cepas
Ssc:AL se sensibilizaron mediante infección con M.
tuberculosis BCG intradérmicamente, M. tuberculosis BCG
intravenosamente, o se inmunizan con M. tuberculosis en
aceite o (como un control) sólo con aceite. Se usaron M.
tuberculosis H37Rv y M. bovis BCG Copenhagen.
Cuando se infectaron los conejillos de indias con
M. tuberculosis H37Rv se les dieron 2,5 x 10^{3} ufc en un
volumen de 0,1 ml en una vena de la oreja. La infección mediante la
misma vía (intravenosa) con BCG se hizo con 2,5 x 10^{4} ufc por
ml de la preparación reconstituida. BCG Copenhagen contenía
aproximadamente 4 x 10^{6} ufc por ml de la preparación
reconstituida. En inmunizaciones con bacterias muertas se dieron 4
x 0,1 ml de una suspensión de bacterias muertas en glutaraldehído a
4 mg (peso semiseco) por ml de aceite de parafina (Marcol 52 (M52))
intradérmicamente en el abdomen.
3-4 semanas más tarde los
linfocitos de sangre periférica y los linfocitos del bazo se
aislaron y usaron para experimentos de estimulación con un grupo de
10 fracciones de ST-CF (preparadas como en: Andersen
y Heron, 1993ª). La masa molecular de esta fracción aparece de la
figura 11.
Los linfocitos de sangre periférica se aislaron a
partir de sangre sacada por punción cardiaca usando EDTA como
anticoagulante. Los eritrocitos se lisaron mediante el tratamiento
con 0,84% de NH_{4}Cl. Los linfocitos se lavaron dos veces y la
concentración de células se ajustó a 2 x 10^{6} células/ml de RPMI
con suplementos.
0,1 ml de células se cultivaron con 0,1 ml de
antígeno o mitógeno por triplicado durante 6 días, las últimas 22
horas en la presencia de 1 \muCi de
^{3}H-timidina. Los cultivos que se cosecharon e
incorporaron ^{3}H-timidina se contaron en un
contador de centelleo. Los resultados se calcularon como medias
geométricas de cultivos por triplicado, y las medias geométricas
entre los conejillos de indias en los grupos de inmunización se
muestran en las figuras 12A y
12B.
12B.
No hubo estimulación significativa de PBL o SPL
de los conejillos de indias inmunizados de control (M52, aceite
solo). Para ambos tipos de células es evidente que la infección con
M. tuberculosis o BCG conduce a una sensibilidad superior
altamente significativa a la fracción 1 que a las otras fracciones.
Con la excepción de los linfocitos de la sangre periférica del grupo
de BCG intradérmicas el cual muestra un pico para las fracciones
5-7 y 10, no hubo diferencias sobresalientes entre
las respuestas a la fracción 2-10 en los animales
infectados. Cuando inmunizamos con M. tuberculosis muertas,
los picos que responden a la fracción 1, 7 y 10 se ven para ambos
tipos de células. Se notaría que este grupo es el único en el cual
la fracción 1 no da una respuesta significativamente más alta que
todas las otras fracciones, por lo que da soporte a la conclusión
general de que respuestas a los antígenos segregados de bajo peso
molecular están asociadas con la infección viva.
Estos resultados destacan la importancia de la
región <10000 Da en la respuesta a la infección con las
micobacterias del "complejo" M. tuberculosis.
Liberación de INF-\gamma en
cultivos de linfocitos humanos estimulados con la fracción
ST-CF. Las células mononucleares de la sangre
periférica (PBMC) se obtuvieron a partir de sangre venosa
heparinizada a partir de donantes humanos de sangre, se diluyó 1:1
en disolución salina, y se separó mediante sedimentación sobre la
densidad de gradiente de centrifugación Lymphoprep (Nycomed A/S,
Oslo, Noruega). Las células se recogieron, se lavaron dos veces y
se cultivaron en las placas de microtitulación de fondo plano
(Nunc, Roskilde, Dinamarca), a 5 x 10^{4} células por pocillo, en
un volumen de 200 \mug de RPMI 1640 que contienen 10% de suero
humano AB y fracciones ST-CF (1-2
\mug/ml). Los sobrenadantes se recogieron de los cultivos de
linfocitos en el día 5. La cantidad de INF-\gamma
presente se cuantificó mediante un kit de ensayo inmunoabsorbente
de enzima ligada a INF-\gamma (Holland
Biotechnology, Leiden, Países Bajos).
Se encontró que las proteínas segregadas de masa
molecular de 6-10 kDa poseen una capacidad superior
de inducir INF-\gamma en los pacientes activos Tb
y facilita una liberación media de 35 u/ml (6125 pg/ml).
Conclusiones. ST-CF es una
mezcla de antígenos segregados mediante M. tuberculosis
durante el crecimiento. Se demuestra en este documento que
ST-CF contiene antígenos protectores los cuales se
pueden administrar como una vacuna experimental y evocar el mismo
nivel de resistencia específica adquirida como BCG viva. El antígeno
inmunodominante de las célula T en esta mezcla compleja se ha
identificado en tres modelos diferentes.
Los pacientes humanos con tuberculosis
recientemente diagnosticada igual que los conejillos de indias y
los ratones infectados con una cepa virulenta de M.
tuberculosis responden poderosamente a los antígenos segregados
y la fracción más potente que contiene proteínas que varían de
6-10 kDa.
En las pruebas de ratones con memoria inmunitaria
a largo plazo se demuestra que una de las dianas principales para
las células efectoras de memoria activadas durante la primera fase
de una respuesta inmune protectora es la misma fracción de baja
masa molecular. Una banda proteica dentro de esta fracción
responsable de la reactividad pronunciada se ha identificado como un
antígeno proteico de 6 kDa definido mediante el mAb
HYB76-8. Se ha ideado un procedimiento para la
purificación de esta proteína y el gen que codifica la proteína se
ha clonado y
secuenciado.
secuenciado.
Se demostró el antígeno reactivo
HYB76-8 tanto purificado como recombinante posee la
capacidad poderosa de inducir INF-\gamma. Una
vacuna basada en una fracción proteica químicamente purificada
altamente enriquecida en el antígeno de 6 kDa indujo niveles
sustanciales de protección mientras que vacunas basadas en antígeno
reactivo purificado recombinante HYB76-8 provocaron
predominantemente respuestas TH-2 de baja eficacia
protectora. Los experimentos están en desarrollo para optimizar el
uso del coadyuvante, permitiendo de este modo el control de la
eficacia protectora de las proteínas purificadas también.
Con el fin de probar el posible uso de ESAT6 como
un agente diagnóstico, se llevó a cabo el siguiente
experimento:
Cuatro grupos de conejillos de indias (n = 5) se
expusieron a aerosoles de M. tuberculosis Erdman a dosis que
dan origen a un promedio de 5 lesiones tuberculosas primarias por
pulmón. Las pruebas cutáneas se llevaron a cabo después de 3, 6, 8,
y 1 semanas después de la inhalación con 1 \mug de ESAT6.
Como se puede ver a partir de la figura 15 se
observó una reacción positiva a prueba cutánea (> 5 mm) en todos
los conejillos de indias 11 semanas después de la infección. Una
división clara en un grupo que responde y un grupo que no responde
se observó en momentos más tempranos.
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(1) INFORMACIÓN GENERAL
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- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Statens Seruminstitut
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: Artillerivej, 5
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: Copenhague
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Dinamarca
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): 2300 S
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Vacuna novedosa contra la tuberculosis
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 2
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR COMPUTADORA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disquete
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: Patente en publicación #1.0, versión #1.25 (EPO)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1753 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- HEBRA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 13.300
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGGTCGACGTTGGCTCAGGTGCGGGCCGACCGGATCC
\hfill1753
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEQ. ID Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 95 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID Nº.: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (33)
1. Un polipéptido sustancialmente puro el
cual:
a): se libera a partir de micobacterias
metabolizadoras que pertenecen al complejo tuberculosis y se pueden
aislar a partir de filtrados a corto plazo a partir de cultivos
crecidos con agitación de tales micobacterias durante 7 días,
induce una liberación de
INF-\gamma a partir de la linfocitos T de memoria
reactivados retirados de un ratón C57BI/6j en los 4 días después de
que el ratón se ha vuelto a poner a prueba infectado con
micobacterias que pertenecen al complejo tuberculosis, la inducción
se llevó a cabo mediante la adición del polipéptido a una suspensión
que comprende aproximadamente 200.000 células T de memoria
reactivadas por ml, la adición del polipéptido dio como resultado
una concentración de 1 \mug de polipéptido por ml de suspensión,
siendo la liberación de INF-\gamma valorable por
determinación de INF-\gamma en sobrenadante
recogido 2 días después de la adición del polipéptido a la
suspensión, y
comprende la secuencia de aminoácidos explicada
en SEQ ID Nº.: 2,
o
b): es un análogo y/o subsecuencia de la
secuencia en a), siendo dicho análogo y/o subsecuencia
inmunológicamente equivalente a aquella con respecto a la capacidad
de evocar una respuesta inmune protectora contra tuberculosis o con
respecto a la capacidad de facilitar una respuesta inmune
diagnósticamente significativa,
con la condición de que el polipéptido comprenda
una secuencia de aminoácidos la cual tiene un grado de homología de
al menos un 80% con la secuencia de aminoácidos mostrada en la SEQ
ID Nº.: 2 o con una subsecuencia de la misma la cual comprende un
epítopo de células T.
2. Un polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 1, el cual es una subsecuencia de SEQ ID Nº.: 2, que
comprende un epítopo para una célula T ayudante.
3. Un polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2, el cual es una subsecuencia que tiene una
longitud de al menos 12 residuos aminoácido.
4. Un polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 1, el cual
- -
- es producible mediante la cepa lisogénica de E. coli designada AA227 la cual se ha depositado el 28 de junio de 1993 con la colección de Deutsche Sammlung von Mikoorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) bajo el número de acceso DSM 8378 de acuerdo con las disposiciones del Tratado de Budapest,
- -
- reacciona en un ensayo de manchas western con un anticuerpo monoclonal, HYB76-8, produciéndose dicho anticuerpo por la línea celular de hibridoma designada HYB 76-8 0,5/br C8 0,25/br B3 el cual se ha depositado el 30 de junio de 1993 con colección de Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GMBH (DSM) bajo el número de acceso DSM ACC2134 de acuerdo con las disposiciones del Tratado de Budapest.
5. Un polipéptido de acuerdo con la
reivindicación 1, en la que el grado de homología es al menos del
90%.
6. Un fragmento de ácido nucleico el cual
codifica un polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1.
7. Un fragmento de ácido nucleico de acuerdo con
la reivindicación 6, el cual es un fragmento de DNA.
8. Un fragmento de ácido nucleico de acuerdo con
la reivindicación 7, la cual comprende la secuencia de DNA de SEQ ID
Nº.: 1.
9. Un fragmento de ácido nucleico de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 6-8 para usar en
una vacuna o en una composición diagnóstica.
10. Una vacuna para inmunizar un animal,
incluyendo un ser humano, contra tuberculosis causada por
micobacterias que pertenecen al complejo tuberculosis, comprendiendo
como el componente efectivo al menos un polipéptido de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1-5.
11. Una vacuna de acuerdo a la reivindicación 10,
en la que dicho componente efectivo se unió a un vehículo o
transportador farmacéuticamente aceptable y/o se formuló
conjuntamente con una sustancia coadyuvante.
12. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación
10 u 11, la cual comprende un filtrado a corto plazo de
micobacterias metabolizadoras, y bromuro de dimetildioctadecilamonio
(DDA) como una sustancia coadyuvante.
13. Una vacuna para inmunizar un animal,
incluyendo un ser humano, contra la tuberculosis causada por
micobacterias que pertenecen al completo tuberculosis, que comprende
como un componente efectivo un microorganismo, en el que al menos
una copia de un fragmento de DNA que comprende una secuencia de DNA
que codifica un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 1-5 se ha incorporado en el genoma
del microorganismo en una manera que permite al microorganismo
expresar y opcionalmente segregar el polipéptido.
14. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación
13, en la que el microorganismo es una bacteria.
15. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación
14, en la que la bacteria se selecciona del grupo que consta de los
géneros Mycobacterium, Salmonella, Pseudomonas y
Eschericia.
16. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación
15, en la que el microorganismo es Mycobacterium bovis BCG,
tal como Mycobacterium bovis BCG, cepa: Danish 1331.
17. Una vacuna de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 13-16, en la que al menos 2 copias
del fragmento de DNA que codifican un polipéptido de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones 1-5 se incorporan
en el genoma del microorganismo.
18. Una vacuna de acuerdo con la reivindicación
17, en la que el número de copias es al menos 5.
19. Una vacuna que comprende un fragmento de
ácido nucleico de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones
6-8, la vacuna lleva a cabo la expresión in
vivo de antígenos por un animal, incluyendo un ser humano, al
cual se ha administrado la vacuna, siendo efectiva la cantidad de
antígenos expresados para conferir una resistencia sustancialmente
incrementada a infecciones con micobacterias del complejo
tuberculosis en un animal, incluyendo un ser humano.
20. Una composición para diagnosticar
tuberculosis en un animal, incluyendo un ser humano, que comprende
un polipéptido de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones
1-5, o un fragmento de ácido nucleico de acuerdo con
la reivindicación 6, 7 u 8, en combinación con un medio para
detección.
21. Un polipéptido sustancialmente puro de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5 o
codificado mediante un fragmento de ácido nucleico de acuerdo a la
reivindicación 7 u 8 para usar como un compuesto farmacéutico.
22. El uso de un polipéptido sustancialmente puro
de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-5 o
codificado mediante un fragmento de ácido nucleico de acuerdo con 7
u 8 en la preparación de una composición farmacéutica para el
diagnóstico de la, o vacunación contra la, tuberculosis causada por
Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium africanum o
Mycobacterium bovis.
23. El uso de un fragmento de ácido nucleico de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 6-8
en la preparación de una composición para el diagnóstico de
tuberculosis o en la preparación de una vacuna contra tuberculosis,
causada dicha tuberculosis por Mycobacterium tuberculosis,
Mycobacterium africanum o Mycobacterium bovis.
24. Un anticuerpo monoclonal, el cual está
reaccionando sustancialmente específicamente con un polipéptido de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5
en un inmunoensayo, o un fragmento de unión específico de dicho
anticuerpo.
25. Un anticuerpo monoclonal de acuerdo con la
reivindicación 24, el cual se expresa por la línea celular de
hibridoma designada HYB 76-B 0,5/br C8 0,25/br B3 la
cual se ha depositado el 29 de junio de 1993 en la colección de
Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GMBH (DSM)
bajo el número de acceso DSM ACC2134 de acuerdo con las
disposiciones del Tratado de Budapest o un fragmento específicamente
unido de dicho anticuerpo.
26. Un vector de expresión replicable el cual
comprende un fragmento de ácido nucleico de acuerdo con cualquiera
de las reivindicaciones 6-8.
27. Un vector de acuerdo con la reivindicación
25, el cual se selecciona del grupo que consta de virus,
bacteriófagos, plásmidos, cósmidos y microcromosomas.
28. Una célula transformada que esconde al menos
un vector de acuerdo con la reivindicación 26 ó 27.
29. Una célula transformada de acuerdo con la
reivindicación 28, la cual es una bacteria que pertenece al complejo
tuberculosis, tal como una célula Mycobacterium bovis
BCG.
30. Una célula la cual se selecciona del grupo
que consta de las cepas lisogénicas de E. coli AA227 y AA242
las cuales se han depositado el 28 de junio de 1993 en la colección
de Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GMBH (DSM)
bajo los números de acceso DSM 8378 y DSM 8379, respectivamente, en
concordancia con las disposiciones del Tratado de Budapest.
31. Una célula de acuerdo con cualquiera de las
reivindicaciones 28-30, la cual expresa un
polipéptido de acuerdo con la reivindicación 1.
32. Un procedimiento para producir un polipéptido
de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones
1-5, comprendiendo
insertar un fragmento de ácido nucleico de
acuerdo con la reivindicación 6, 7 u 8 dentro de un vector el cual
es capaz de replicarse en una célula hospedadora,
introducir el vector recombinante resultante
dentro de la célula hospedadora, cultivar la célula hospedadora en
un medio de cultivo apropiado bajo condiciones apropiadas para
expresar el polipéptido, y recuperar el polipéptido de la célula
hospedadora o del medio de cultivo;
aislar el polipéptido a partir de un filtrado de
un cultivo a corto plazo como se define en la reivindicación 1;
o
sintetizar el polipéptido mediante síntesis de
péptidos en fase sólida o líquida.
33. Un procedimiento para producir una vacuna de
acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones
10-12, que comprende:
preparar, sintetizar o aislar un polipéptido de
acuerdo con la reivindicación 1, y
solubilizar o dispersar el polipéptido en un
medio para una vacuna, y
añadir una sustancia coadyuvante,
o
cultivar una célula de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 28-31, y
transferir las células a un medio para una
vacuna, y
añadir una sustancia coadyuvante.
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