CN118108815A - 结核分枝杆菌多免疫原抗原、编码其的mRNA、应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了结核分枝杆菌多免疫原抗原、编码其的mRNA、应用，属于生物医药技术领域。本发明的结核分枝杆菌多免疫原抗原包含免疫原I和以下免疫原中的至少一种：免疫原II、免疫原III；免疫原I为Ag85B蛋白或其抗原性片段，免疫原II为ESAT6蛋白或其抗原性片段，免疫原III为Rv2660c蛋白或其抗原性片段。本发明公开了编码上述抗原的多核苷酸mRNA。本发明还公开了上述结核分枝杆菌多免疫原抗原或多核苷酸mRNA的应用。利用该结核分枝杆菌多免疫原抗原能制备mRNA疫苗。实验结果显示，本发明的mRNA疫苗能激发针对结核分枝杆菌的特异性免疫反应。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及结核分枝杆菌多免疫原抗原、编码其的mRNA、应用。
背景技术
结核病（Tuberculosis，TB）是由结核分枝杆菌复合群（Mycobacterium TuberculosisComplex，MTBC）感染而引起的一种以肺结核为特征的慢性传染病。MTBC中人型、牛型和非洲型M.tb为人类致病菌，其中90%感染病例为人型M. tb所致。全球约25%人群感染M.tb，但只有5～10%的感染人群会发展成活动性结核（active tuberculosis，ATB），其余90%～95%感染者则表现为TB隐性感染（latent TB infection，LTBI），但其终生仍有发展成为ATB的风险，尤其是HIV阳性的LTBI患者发展成ATB的风险更高。
卡介苗（Bacillus Calmette-Guerin，BCG）作为目前唯一获准使用的结核病疫苗，虽然在预防婴幼儿结核性脑膜炎和播散性结核病中已表现出良好的免疫效果，但是其针对青少年和成人的保护效果十分有限，并且对结核分枝杆菌的原发感染以及潜伏感染的激活也缺乏有效保护。当前尚无针对青少年和成人群体预防性和暴露后的结核疫苗。因此，迫切需要开发新型疫苗以预防结核病。
M.tb与其他病原微生物不同，其可以感染人体中几乎所有的器官组织，并且可在胞内长期存活。为了抑制菌体在机体中的生长，受感染的单核细胞招募更多的单核细胞、巨噬细胞和T细胞形成有组织的肉芽肿，使得菌体处于休眠状态。目前针对M.tb亚单位疫苗的开发主要聚焦菌体细胞壁和膜蛋白、菌体早期分泌蛋白、菌体休眠期抗原、菌体复苏期抗原以及BCG缺失区蛋白等。受M.tb表达蛋白数量大的限制，抗原选择困难等因素的影响，给结核疫苗的开发带来了难度。Ag85B（又称为，Rv1886）是M.tb早期高表达分泌蛋白之一，属于乙酰/分枝酰转移酶。利用该蛋白免疫小鼠后可以诱导机体产生强烈的T和B细胞免疫应答，刺激机体产生特异性IgG和IFN-γ；缺失Ag85B基因后影响M.tb对巨噬细胞的感染能力，是目前开发结核亚单位疫苗的热门靶点之一。ESAT-6是M.tb差异区1（region of difference1,RD1）中的Rv3875基因编码的一个非信号肽依赖的分泌型小分子抗原，是M.tb重要的毒力因子之一。在M.tb感染宿主过程中，esxA基因编码的ESAT-6与esxB基因编码的培养滤液蛋白10（culture filtrate protein-10，CFP10）形成紧密的螺旋状异源二聚体，并以复合物的形式由ESX-1分泌系统经细胞壁分泌至细胞外，参与M.tb与宿主细胞表面受体的特异性结合。ESAT-6具有多个T、B细胞抗原表位，是M.tb重要的T细胞抗原，能够刺激机体生产特异性的细胞免疫应答，并能诱导机体产生记忆性T细胞应答，保护宿主抵抗M.tb的感染。Rv2660c是M.tb潜伏期持续性高表达的蛋白之一，含有多个B细胞和T细胞抗原表位，能被B细胞、CD4+细胞和CD8+细胞识别，具有良好的诱导体液免疫和细胞免疫的潜能。因此，Rv2660c成为开发针对M.tb潜伏期的潜在抗原靶点。
随着mRNA疫苗技术的不断成熟，与传统疫苗比较，mRNA疫苗具有诸多优势，尤其是其可通过递送系统，将编码多个抗原的mRNA递送至宿主细胞，同时可表达多个抗原。因此，开发针对M.tb的多抗原mRNA疫苗有望弥补现有BCG疫苗的不足。
发明内容
本发明的目的之一在于，提供一种结核分枝杆菌多免疫原抗原，能利用其制备mRNA疫苗，可以激发针对结核分枝杆菌的特异性免疫反应，具有极大的临床应用前景。
本发明的目的之二在于，提供一种编码上述结核分枝杆菌多免疫原抗原的多核苷酸mRNA。
本发明的目的之三在于，提供上述的结核分枝杆菌多免疫原抗原或多核苷酸或核酸构建体或表达载体在制备用于预防和/或治疗结核分枝杆菌感染的药物中的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明提供的一种结核分枝杆菌多免疫原抗原，所述多免疫原抗原为嵌合抗原或混合抗原，所述多免疫原抗原包含免疫原I和以下免疫原中的至少一种：免疫原II、免疫原III；
其中免疫原I为Ag85B蛋白或其抗原性片段；
免疫原II为ESAT6蛋白或其抗原性片段；
免疫原III为Rv2660c蛋白或其抗原性片段；
其中，嵌合抗原为一个或多个免疫原I、II、III以串联方式形成的单链；
混合抗原为免疫原I、II、III的混合物，或一个或多个免疫原I、II、III以串联方式形成的单链与免疫原I、II、III中至少一种的混合物。
本发明的部分实施方案中，所述嵌合抗原具有如式①所示结构：
式①：B-L1-E-L2-R
B表示结核分枝杆菌Ag85B蛋白，或与其具有至少90%，92%，95%，96%，97%，98%或99%同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列，
E表示结核分枝杆菌ESAT6蛋白，或与其具有至少90%，92%，95%，96%，97%，98%或99%同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列，
R表示结核分枝杆菌Rv2660c蛋白，或与其具有至少90%，92%，95%，96%，97%，98%或99%同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；
L1、L2各自独立地为无，或者linker序列(GGGGS)n，其中，n为1-10的任意整数。
本发明的部分实施方案中，所述多免疫原抗原为由Ag85B、ESAT6和Rv2660c组成的融合/嵌合抗原蛋白的全长或该融合/嵌合抗原蛋白的一部分。
本发明的部分实施方案中，所述多免疫原抗原具有如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
本发明公开的一种多核苷酸mRNA，其编码上述的结核分枝杆菌多免疫原抗原。
本发明的部分实施方案中，所述多核苷酸mRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，或者由SEQ ID NO:2所示独立的Ag85B mRNA序列、SEQ ID NO:3所示独立的ESAT6 mRNA序列与SEQ ID NO:4所示独立的mRNA序列共同组成。
本发明的部分实施方案中，所述多核苷酸mRNA包括以下结构：A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-poly(A)；其中A1为5’UTR序列，A2为信号肽序列；A3、A5、A7为结核分枝杆菌抗原编码序列；A4、A6相同或者不同，为linker序列；A8为3’UTR序列；poly(A)为多聚腺苷酸。
本发明的部分实施方案中，所述A1为人β珠蛋白基因的5’UTR序列；
和/或，A2为人血清免疫球蛋白κ轻链的信号肽序列；
和/或，A3为Ag85B蛋白编码序列，
和/或，A5为ESAT6蛋白编码序列、
和/或，A7为Rv2660c蛋白编码序列；
和/或，A4和A6相同，linker序列(GGGGS)n，其中，n为1-10之间的任意整数；
和/或，A8为人α珠蛋白基因的3’UTR序列；
和/或，poly(A)的个数为80-200；优选为100。
优选地，5’UTR序列如SEQ ID NO:5所示；
优选地，3’UTR序列如SEQ ID NO:6所示；
优选地，信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示；
优选地，linker的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。
本发明提供了一种生产如上述mRNA的体外转录（IVT）质粒，所述IVT质粒包括质粒骨架序列和编码结核分枝杆菌抗原肽的DNA序列。
优选地，所述编码结核分枝杆菌抗原肽的DNA序列如SEQ ID NO:9所示；
或SEQ ID NO:10的Ag85B的DNA序列、SEQ ID NO:11所示ESAT6的DNA序列和SEQ IDNO:12所示Rv2660c的DNA序列共同组成。
作为优选，所述质粒骨架序列包括T7启动子序列、5’端UTR区、信号肽序列、3’端UTR区、5’末端帽结构和3’末端poly(A)尾。
本发明公开的上述结核分枝杆菌多免疫原抗原或多核苷酸mRNA的应用，所述应用为在制备用于预防和/或治疗结核分枝杆菌感染的药物中的应用。
本发明的部分实施方案中，所述药物为用于增强卡介苗免疫效果的药物。
本发明公开的一种结核分枝杆菌核酸疫苗，包括上述的多核苷酸mRNA。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明利用本发明的结核分枝杆菌多免疫原抗原，能制备mRNA疫苗。本发明的多抗原嵌合mRNA疫苗可以同时表达2个结核分枝杆菌抗原，实验结果显示，本发明的mRNA疫苗可以激发针对结核分枝杆菌的特异性免疫反应，能被开发成肺结核的预防和/或治疗性疫苗产品，具有极大的临床应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1中构建的结核分枝杆菌mRNA疫苗BE60的结构示意图；其上标注了mRNA疫苗的各个区段，其中，5’UTR表示5’端非翻译区，3’UTR表示3’端非翻译区，poly(A)表示多聚腺苷酸尾，linker表述抗原间的连接序列。
图2为小鼠接种BE60 mRNA疫苗后14天血清中抗原特异性IgG滴度考察结果图。
图3为小鼠接种BE60 mRNA疫苗后21天血清中抗原特异性IgG滴度考察结果图。
图4为本发明实施例4中所采用的疫苗免疫小鼠程序和采样程序示意图；其中A表示BE60 mRNA两针免疫的程序示意图，B表示BCG初免+BE60 mRNA加强免疫的程序示意图，两组免疫策略中均以BCG免疫为对照。
图5为本发明实施例4中各组小鼠脾淋巴细胞分泌IFN-γ的T淋巴细胞斑点数考察结果图。
图6为本发明实施例4中各组小鼠免疫mRNA疫苗后诱导的抗原特异性CD4+和CD8+百分比考察结果图。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或试剂提供商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
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实施例1 结核分枝杆菌mRNA构建体的mRNA编码区的序列设计
本实施例公开了本发明的mRNA构建体BE60，其结构如附图1所示。
构建方法如下：选取结核分枝杆菌H37Rv菌株（AL123456.3）为参考序列，获取Ag85B、ESAT6和Rv2660c 3个抗原的野生型序列。进一步对其抗原的分子量、信号肽和跨膜域进行了预测分析，根据3个抗原的分子结构特点设计了BE60 mRNA抗原序列。
BE60 mRNA抗原的氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示，其中第1～325位：Ag85B的氨基酸序列；326～340位：linker的氨基酸序列；341～435位： ESAT6的氨基酸序列；436～450位：linker的氨基酸序列；451～525位：Rv2660c的氨基酸序列。
然后对BE60的氨基酸序列以人为宿主进行密码子优化，获得BE60 mRNA抗原的DNA编码序列，如SEQ ID NO:9所示。
实施例2mRNA体外转录与脂质纳米颗粒包装
1. mRNA表达质粒构建
选择本单位自主设计的pIVT-D2作为质粒载体，通过常规分子生物学手段引入mRNA疫苗的抗原编码序列和其他DNA表达元件。pIVT-D2质粒包括质粒骨架序列和编码结核分枝杆菌抗原肽的DNA序列。所述质粒骨架序列包括复制起点Ori、T7启动子序列、5’端UTR区、Kozak序列、3’端UTR区和3’末端poly(A)尾。按照从上游到下游的顺序依次包括：
（1）T7启动子，
（2）在编码区上游的5’端UTR序列（如SEQ ID NO:5所示序列），
（3）疫苗抗原的DNA编码序列（BE60如SEQ ID NO:9所示），
（4）单个抗原序列之间的linker序列（linker序列如SEQ ID NO:8所示），
（5）下游的3’端UTR序列（如SEQ ID NO:6所示序列），
（6）和多聚腺苷酸尾（Poly-A-tail）。最终得到pIVT-D2-BE60 mRNA疫苗的表达质粒。
2. mRNA的体外转录与加帽
使用限制性内切酶BspQI对上述mRNA疫苗的表达质粒进行酶切，将其线性化；使用采用磁珠法对其进行DNA纯化；对纯化的线性DNA采用Nano-drop测定浓度，取200～300 ng进行凝胶电泳检测其酶切效率。接下来，基于线性DNA模板，使用T7 RNA体外转录试剂盒进行体外转录，获得体外转录mRNA（为了降低mRNA的免疫原性，采用N1-甲基假尿嘧啶替代尿嘧啶）；然后使用脱氧核糖核酸酶I（DNase I）对线性化的DNA模板进行消化处理；接着采用磁珠法对mRNA进行纯化以获得提纯的体外转录mRNA。
使用加帽试剂盒对提纯的体外转录mRNA进行5’端Cap1加帽，使其满足在真核细胞内被翻译的条件；其后，采用磁珠法对加帽后的mRNA进行纯化，获得纯化的、经5’端加帽修饰的mRNA。
3. 脂质体包装mRNA
将氨基阳离子脂质SM-102、二硬脂酰磷脂酰胆碱（DSPC）、胆固醇和1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基聚乙二醇2000（DMG-PEG2000）按照50:10:38.5:1.5的摩尔比进行混合，然后使用迈安纳公司生产的纳米药物生产系统INanoTML，将混合物与上述5’端加帽修饰的mRNA（体积比1:3）进行混合、包装，得到脂质体包装的蛋白BE60 mRNA-LNP。包装完成后，使用离心或透析的方法更换缓冲溶液为PBS。最后，使用Thermo Fisher公司的Quan-iTRibo green RNA reagent试剂盒对mRNA包装效率进行鉴定，同时使用zeta电位分析仪和马尔文粒度分析仪分别测定mRNA疫苗的电位和粒径，使得包装效率、电位和粒径符合mRNA疫苗的标准。
表1 mRNA-LNP疫苗的质量指标
实施例3 肺结核mRNA疫苗接种剂量探究实验
1. 实验动物免疫和样品采集
本实施例中，使用6～8周龄的BALB/c品系的小鼠进行动物实验；实验组分为mRNA疫苗免疫组和阴性对照组，每组4只小鼠，雌雄各半，其中，mRNA疫苗免疫组包括1μg免疫剂量组（G1）、5μg免疫剂量组（G2）和25μg免疫剂量组（G3），所述阴性对照组为PBS免疫对照组（G4）。
mRNA疫苗免疫组的所有小鼠在第0天和第14天分别免疫接种一剂实施例2中所制备的BE60 mRNA疫苗，接种部位为后腿肌肉，接种剂量设3个梯度，分别为每只小鼠每次接1、5和25μg mRNA疫苗（体积为100μl）；阴性对照组的小鼠则在同样的时间经后腿肌肉注射100ml PBS溶液。分别在每次接种疫苗后1～4天内观察小鼠的临床表现；在接种疫苗后第14天和第21天采集小鼠血清样本，用于检验免疫血清的结合抗体滴度和中和抗体滴度。
观察小鼠的临床表现发现，接种疫苗后小鼠多表现为饮水减少、被毛粗乱、扎堆和粪便干燥的症状，BE60 mRNA疫苗组的小鼠症状持续3天，而PBS仅在注射后的0.5天出现轻微的症状，1天后即可恢复；随着疫苗接种剂量的增加，小鼠临床症状的也表现越为严重，并且持续时常也增大，其中25μg接种剂量的小鼠多持续长达3天，而1μg基本都在1天后恢复。
表2 mRNA疫苗免疫后小鼠的临床症状
2. 肺结核mRNA疫苗免疫小鼠血清的抗原特异性IgG检测
（1）包被：使用PBS将大肠杆菌重组表达的蛋白（Ag85B、ESAT6、Rv2660c和BE60）稀释至2μg/ml，使用排枪按照每孔100μl加入96孔酶标板中，4℃包被过夜；
（2）封闭：每孔使用150μl的磷酸缓冲液（PBST）清洗3次，拍干板中液体。使用1mg/ml的牛血清血蛋白（BSA）溶液加入96孔酶标板于37℃封闭1.5h；
（3）加样：每孔使用150μl的PBST清洗3次，拍干板中液体。将本实施例各组小鼠血清样本按照1:400、1:800、1:1600、1:3200、1:6400、1:12800、1:25600、1:51200的稀释梯度进行倍比稀释，再按照每孔100μl将稀释的血清加入96孔酶标板中，37℃孵育2h；
（4）二抗孵育：每孔使用150μl的PBST清洗4次，拍干板中液体。使用1mg/ml BSA将羊抗鼠IgG二抗按照1:50000稀释，每孔100μl，37℃孵育1h；
（5）显色：每孔使用100μl的PBST（含0.1%吐温20）清洗3次，拍干板中液体。加入100μl TMB显色液，室温避光显色10～20min；
（6）终止：每孔加入100μl的2M HCl终止显色，使用酶标仪于450nm读数；
（7）采用终点稀释度（Endpoint dilution）来评价抗原特异性IgG的滴度，即血清产生的吸光度(如上所述，450nm的吸光度)大于背景值2.1倍时对应的血清稀释倍数。
免疫小鼠血清的抗原特异性IgG检测结果如图2（14天）和图3（21天）所示。结果表明：BE60 mRNA疫苗免疫14天后，1μg剂量条件下仅RV2660c抗原特异性抗体滴度略微上升，5μg剂量条件下Ag85B、RV2660c蛋白抗原特异性抗体滴度有明显上升，25μg剂量条件下Ag85B、ESAT6、RV2660c、BE60蛋白抗原特异性抗体滴度均有明显上升；在免疫后的21天，25μg剂量条件下Ag85B、ESAT6、RV2660c、BE60抗原特异性抗体滴度较其它免疫剂量表现出显著地上升。
实施例4 肺结核mRNA疫苗的免疫学评价
通过上述mRNA疫苗免疫剂量的探究证实，以5μg/只的小鼠接种剂量较为合适。故本实施例选择5μg/只的接种剂量开展进一步研究。
1. 实验动物免疫和样品采集
本实施例中，使用6～8周龄的BALB/c品系的小鼠进行动物实验；实验组分为BE60mRNA疫苗2针免疫组、BE60 mRNA疫苗初免+BCG加强免疫组、BCG阳性对照组。BE60 mRNA疫苗的接种部位为后腿肌肉，接种剂量为5μg mRNA疫苗（体积为100μl）；BCG的接种部位为腹股沟皮下注射，每只小鼠的接种剂量为1ⅹ106CFU（体积为100μl）。BE60 mRNA疫苗2针免疫组和对应的BCG阳性对照组在接种疫苗后第28天采集小鼠脾脏样本，BE60 mRNA疫苗初免+BCG加强免疫组和对应的BCG阳性对照组则在免疫后第42天采集小鼠脾脏样本，用于检验细胞免疫应答。具体的免疫小鼠及采样程序如图4所示。
2. 小鼠脾脏样品处理
（1）无菌取脾脏后用预冷的PBS溶液清洗2次，置于200目的筛网上用注射器的推头研磨，研磨过程中要确保脾脏始终在RPMI 1640培养液中，充分研磨后的细胞；将研磨后的细胞悬液收集至15ml离心管中，短暂离心去上清后加入2ml红细胞裂解液；
（2）将脾细胞用红细胞裂解液裂解2min后，加入2倍体积的RPMI 1640培养液洗清洗1遍，留离心后的底层细胞；
（3）加入10ml的Ficoll淋巴细胞分离液，吹打混匀后2200rpm室温离心20min，进一步分离云雾层的脾淋巴细胞；
（4）将Ficoll分离后的脾脏细胞，用RPMI 1640培养液洗两遍，1500rpm，室温下离心10min；
（5）弃上清，用1ml小鼠完全培养基重悬细胞，显微镜下细胞计数，将细胞浓度调整至5×106个细胞/ml浓度备用。
3. ELISpot检验
（1）用稀释好的抗小鼠IFN-γ coating antibody包被96孔PVDF板，每孔加入100μl，4℃包被过夜。
（2）每孔加200μl完全培养基（含有10%FBS、1%双抗、1%L-谷氨酰胺的RPMI 1640培养液）洗1次板，用200μl完全培养基于室温条件下封闭2h，备用。
（3）弃掉封闭液，在96孔ELISPOT板中加入刺激液（每孔加入刺激液100μl，所有刺激均用小鼠完全培养基配制）。实验孔中加入100μl结核抗原蛋白（Ag85B和ESAT6），抗原刺激浓度为10μg/ml（每孔200μl培养体系）。阳性对照孔中加入5μg/ml ConA，阴性孔中加入100μl完全培养基作为空白对照。加完刺激液后，将本实施例中步骤2分离的脾胀淋巴细胞悬液100μl，即每孔细胞数为2×105个细胞。
（4）96孔ELISPOT板置于CO2培养箱中培养20h（注意：不要挪动板子）。
（5）按照小鼠IFN-γ ELISPOT试剂盒说明书，进一步进行酶学和显色反应，用蒸馏水冲洗以终止显色反应。最后用蒸馏水充分洗涤5次ELISPOT板，于室温避光、风干过夜。用酶联斑点计数仪计算斑点数。
由于疫苗包含的抗原多，选择2个单一抗原（Ag85B和ESAT6）进行脾淋巴细胞刺激。结果如图5所示，与阳性对照BCG免疫的小鼠对比，mRNA两针免疫的小鼠的抗原特异性IFN-γ阳性的细胞数量略低于BCG免疫的小鼠。针对BCG初免+mRNA加强免疫后抗原特异性IFN-γ阳性的细胞数量，与BCG免疫的阳性对照相比，BCG初免+mRNA加强免疫的策略诱导更多的IFN-γ阳性的细胞数量，且比mRNA两针免疫的策略也更显著。
4. ICS检验
（1）将本实施例中步骤2分离的脾淋巴细胞按照106个细胞/孔铺96孔细胞板，每孔加100μl细胞悬液；
（2）每孔加100μl刺激液，所有刺激均用小鼠完全培养基配制，即每孔实验体系为200μl。实验孔中加入10μg/ml结核抗原蛋白（Ag85B和ESAT6）；阴性孔中加入100μl完全培养基作为空白对照。实验孔和阴性孔均在37℃条件下孵育20h。阳性对照孔中加入含有50ng/ml豆蔻酰佛波醇乙酯（Phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA）和500ng/ml Ionomycin的混合刺激液，阳性对照孔的刺激在实验孔刺激结束前5h加入；
（3）细胞刺激结束前5h，每孔加入GolgiStop Solution，阻止细胞分泌的细胞因子释放到上清中；
（4）细胞刺激结束，96孔板离心，2000rpm，5min。弃上清，细胞用PBS洗一遍，然后进行流式细胞染色；
（5）细胞表面分子染色：分别用FITC标记抗小鼠CD3流式抗体、Elab Fluor® Red780标记抗小鼠CD4流式抗体、PerCP/Cyanine5.5标记抗小鼠CD8流式抗体，用FACS Buffer（含2%FBS的PBS）稀释抗体到工作浓度，每孔加100μl染色体系重悬细胞，4℃避光染色30min。
（6）胞外染色结束后，每孔加100μl FACS Buffer后离心，弃上清，每孔再加200μlFACS Buffer洗一遍（离心条件：2000rpm，5min），弃上清。
（7）细胞固定和破膜：用固定/透化试剂盒中的破膜液，每孔加入100μl破膜液重悬细胞，4℃避光破膜20-30min。
（8）每孔加100μl破膜洗液（将试剂盒中的洗液稀释到1×后使用）后离心，弃上清，每孔再加200μl破膜洗液洗一遍（离心条件：2000rpm，5 min），弃上清。
（9）胞内细胞因子染色：分别用藻红蛋白PE（phycoerythrin）标记抗小鼠IFN-γ流式抗体、别藻蓝蛋白APC（allophycocyanin）标记抗小鼠IL-2流式抗体，用1×破膜稀释抗体到工作浓度，每孔加入100μl抗体混合液重悬细胞，4℃避光染色40min。
（10）胞内染色结束后，每孔加100μl破膜洗液后离心，弃上清，每孔再加200μl破膜洗液洗两遍（离心条件：2000rpm，5min），弃上清。
（11）用200μl PBS重悬细胞，将细胞转移到流式管中。用流式细胞仪进行检测。
T细胞在应答结核分枝杆菌的感染中发挥了关键性的作用。采用流式细胞术评估疫苗免疫后抗原特异性CD4+和CD8+ T细胞的应答情况。结果如附图6所示，针对mRNA两针免疫的小鼠，流式细胞术的结果显示，经单一抗原（Ag85B和ESAT6）刺激的小鼠脾淋巴细胞均会分泌CD4+和CD8+细胞的功能性细胞因子。与BCG阳性对照相比，无论是BE60 mRNA两针免疫，还是BCG初免+BE60 mRNA加强免疫后，均检测到更高比例CD4+和CD8+ T细胞分泌的IFN-γ、IL-2；对比BE60 mRNA两针免疫与BCG初免+BE60 mRNA加强免疫之间小鼠CD4+和CD8+ T细胞分泌的IFN-γ、IL-2发现，BCG初免+BE60 mRNA加强免疫的方式诱导较高的细胞因子分泌。已有的研究证实，IFN-γ和IL-2等Th1型细胞因子是宿主抵抗M.tb感染的关键分子，宿主分泌较高的IFN-γ和IL-2可降低组织器官中的荷菌数（Nemes E, Fiore-Gartland A,Boggiano C, Coccia M, D'Souza P, Gilbert P, Ginsberg A, Hyrien O, Laddy D,Makar K, McElrath MJ, Ramachandra L, Schmidt AC, Shororbani S, Sunshine J,Tomaras G, Yu WH, Scriba TJ, Frahm N; BCG Correlates PIs Study Team, M72Correlates PIs Study Team. The quest for vaccine-induced immune correlates ofprotection against tuberculosis. Vaccine Insights. 2022 Jul;1(3):165-181.）。由此可见，采用BCG初免+mRNA加强免疫的方式可提高机体预防M.tb感染的效果。
综上，本发明的多抗原嵌合mRNA疫苗可以激发针对结核分枝杆菌的特异性免疫反应，能被开发成肺结核的预防和/或治疗性疫苗产品，具有极大的临床应用前景。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种结核分枝杆菌多免疫原抗原，其特征在于，所述多免疫原抗原为嵌合抗原或混合抗原，所述多免疫原抗原包含免疫原I和以下免疫原中的至少一种：免疫原II、免疫原III；
其中免疫原I为Ag85B蛋白或其抗原性片段；
免疫原II为ESAT6蛋白或其抗原性片段；
免疫原III为Rv2660c蛋白或其抗原性片段；
其中，嵌合抗原为一个或多个免疫原I、II、III以串联方式形成的单链；
混合抗原为免疫原I、II、III的混合物，或一个或多个免疫原I、II、III以串联方式形成的单链与免疫原I、II、III中至少一种的混合物。
2.根据权利要求1所述的一种结核分枝杆菌多免疫原抗原，其特征在于，
所述嵌合抗原具有如式①所示结构：
公式①：B-L1-E-L2-R
B表示结核分枝杆菌Ag85B蛋白，或与其具有至少90%，92%，95%，96%，97%，98%或99%同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列，
E表示结核分枝杆菌ESAT6蛋白，或与其具有至少90%，92%，95%，96%，97%，98%或99%同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列，
R表示结核分枝杆菌Rv2660c蛋白，或与其具有至少90%，92%，95%，96%，97%，98%或99%同一性且与其具有相同或基本相同的免疫原性的氨基酸序列；
L1、L2各自独立地为无，或者linker序列(GGGGS)n，其中，n为1-10的任意整数。
3.根据权利要求1所述的一种结核分枝杆菌多免疫原抗原，其特征在于，所述多免疫原抗原为由Ag85B、ESAT6和Rv2660c组成的融合/嵌合抗原蛋白的全长或该融合/嵌合抗原蛋白的一部分。
4. 根据权利要求1所述的一种结核分枝杆菌多免疫原抗原，其特征在于，所述多免疫原抗原具有如SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。
5.一种多核苷酸mRNA，其特征在于，其编码如权利要求1-4任一项所述的结核分枝杆菌多免疫原抗原。
6. 根据权利要求5所述的多核苷酸mRNA，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，或者由SEQ ID NO:2所示独立的Ag85B mRNA序列、SEQ ID NO:3所示独立的ESAT6 mRNA序列与SEQ ID NO:4所示独立的Rv2660c mRNA序列共同组成。
7.根据权利要求5所述的多核苷酸mRNA，其特征在于，包括以下结构：A1-A2-A3-A4-A5-A6-A7-A8-poly(A)；其中A1为5’UTR序列，A2为信号肽序列；A3、A5、A7为结核分枝杆菌抗原编码序列；A4、A6相同或者不同，为linker序列；A8为3’UTR序列；poly(A)为多聚腺苷酸。
8.根据权利要求7所述的多核苷酸mRNA，其特征在于，所述A1为人β珠蛋白基因的5’UTR序列；
和/或，A2为人血清免疫球蛋白κ轻链的信号肽序列；
和/或，A3为Ag85B蛋白编码序列，
和/或，A5为ESAT6蛋白编码序列，
和/或，A7为Rv2660c蛋白编码序列；
和/或，A4和A6相同，linker序列(GGGGS)n，其中，n为1-10之间的任意整数；
和/或，A8为人α珠蛋白基因的3’UTR序列；
和/或，poly(A)的个数为80-200。
9.如权利要求1-4任意一项所述的结核分枝杆菌多免疫原抗原或权利要求5-7任意一项所述的多核苷酸mRNA的应用，其特征在于，在制备用于预防和/或治疗结核分枝杆菌感染的药物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述药物为用于增强卡介苗免疫效果的药物。
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