CN101376891B - 新型结核病疫苗的制备及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种可共表达结核杆菌Ag85a、ESAT6和/或Ag85a/ESAT6融合蛋白质以及任选的免疫辅助因子的重组病毒载体，所述重组病毒载体的基因组DNA中插入了包含结核杆菌Ag85a编码序列、ESAT6编码序列、Ag85a/ESAT6融合蛋白质编码序列中至少一种和任选的免疫辅助因子编码序列的表达盒。本发明还涉及包含所述病毒载体的宿主细胞、药物组合物、以及制备该病毒载体的方法。本发明的重组病毒载体可共表达多种结核抗原和/或细胞因子，对结核病具有增强的预防和/或治疗效果。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程和免疫领域，具体而言涉及一种新型结核病疫苗及其制备方法。
背景技术
近20年来，曾经控制在很低水平的结核病，在世界范围内又有死灰复燃的趋势。全球现有结核病人2000万人，其中95％的病人是在发展中国家，如果不加控制，今后10年还将有3亿人受到结核杆菌的感染。为此，世界卫生组织于1993年宣布全球进入结核病紧急状态，1998年又重申遏制结核病的行动。
结核病的致病菌是结核杆菌，属于放线菌目分支杆菌科分支杆菌属。结核杆菌主要通过呼吸道传播，还可通过消化道进入人体。结核杆菌被吞噬细胞吞噬后可经淋巴-血循环散播到全身，在人体免疫力低下时而造成多种系统或脏器的结核病变，如骨结核、肾结核、生殖器结核、结核性脑膜炎等。
对于结核病的预防和治疗已成为许多科研人员关注的焦点。传统疫苗卡介苗(BCG)免疫效果存在不足，对成年人没有保护作用，并且无法应用于免疫缺陷患者。因而，目前结核病疫苗的研究一方面集中于改善BCG的免疫原性，另一方面则集中于开发新型疫苗以代替传统的疫苗。
本领域迫切需要开发出同时具有预防和治疗效果的新型结核病疫苗。
发明内容
本发明正是提供一种兼具预防性和治疗性的新型结核病疫苗。
在本发明的第一方面，提供了一种重组病毒载体，所述重组病毒载体的基因组DNA中插入了一表达盒，所述表达盒从5’到3’依次包含以下元件(a)、元件(b)和元件(c)或依次包含以下元件(a)、元件(c)和元件(b)：
(a)启动子；
(b)选自下组的至少一种结核杆菌抗原序列：
(b1)Ag85a的编码序列；
(b2)ESAT6的编码序列；和/或
(b3)Ag85a/ESAT6融合蛋白的编码序列；
(c)任选的免疫辅助因子的编码序列，所述辅助因子选自下组的人细胞因子：IL-2、IL-10、IL-12、GM-CSF、IFN、IL-4和/或IL-6，
附加条件是当(b2)和(b3)均不存在时，所述免疫辅助因子的编码序列必须存在。
在另一优选例中，所述的元件(b)和(c)之间还可存在连接序列。
在本发明的一个实施方式中，在所述表达盒中，所述人细胞因子为IL-2；和/或所述的元件(b)为Ag85a/ESAT6融合蛋白的编码序列。
在本发明的另一个实施方式中，所述的表达盒还包含位于所述的元件(b)和(c)之间的元件(d)核糖体进入位点IRES。
在另一优选例中，当元件(b)包括二种或3种结核杆菌抗原序列时，所述的二抗原序列之间可存在或不存在连接序列。在另一优选例中，当元件(b)包括二种或3种结核杆菌抗原序列时，所述的二抗原序列之间存在IRES序列。在另一优选例中，所述的IRES位于以下位置：元件(b1)和(b2)之间、(b1)和(b3)之间、(b2)和(b3)之间、或(b)和(c)之间。在另一优选例中，所述表达盒含有元件(b3)Ag85a/ESAT6融合蛋白序列和元件(c)，以及位于元件(b3)和(c)之间的IRES。
在本发明的另一个实施方式中，所述病毒载体选自下组：痘病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、微小RNA病毒、或黄病毒。
在本发明的一个优选例中，所述病毒载体为腺病毒或痘病毒。在本发明的另一个优选例中，所述病毒载体选自下组：牛痘病毒MVA株或复制缺陷型腺病毒Ad5。
在本发明的另一个实施方式中，所述表达盒包含以下结构：
Promoter-Ag85a-IRES-IL-2 式Ia；
Promoter-Ag85a-IRES-ESAT6 式Ib；
Promoter-Ag85a-Fus-ESAT6 式Ic；或
Promoter-Ag85a-Fus-ESAT6-IRES-IL-2 式Id，
式中，Promoter表示启动子；Ag85a表示：结核杆菌Ag85a的编码序列；IRES表示：核糖体进入位点；ESAT6表示：结核杆菌ESAT6的编码序列；IL-2表示：白介素-2的编码序列；“-”表示连接序列或无；“-Fus-”表示直接融合而无连接序列。
在另一优选例中，所述启动子选自：痘病毒P11K启动子或痘病毒P7.5启动子。
在本发明的第二方面提供了一种宿主细胞，所述细胞被前述的任一种重组病毒载体转染。
在另一优选例中，所述的宿主细胞为哺乳动物细胞。更佳地，所述宿主细胞选自BHK21、BSC40、293、或鸡胚细胞。
在本发明的第三方面提供了一种组合物，其包含有效量的木发明的重组病毒载体和药学上可接受的载体或赋形剂。
在本发明的一个实施方式中，所述的组合物为药物组合物或疫苗组合物。
在本发明的第四方面提供了一种制备本发明重组病毒载体的方法，所述方法包括以下步骤：
(A)提供包含一表达盒的构建物，所述表达盒从5’到3’依次包含以下元件(a)、元件(b)和元件(c)或依次包含以下元件(a)、元件(c)和元件(b)：
(a)启动子；
(b)选自下组的至少一种结核杆菌抗原序列：
(b1)Ag85a的编码序列；
(b2)ESAT6的编码序列；和/或
(b3)Ag85a/ESAT6融合蛋白序列；
(c)任选的免疫辅助因子的编码序列，所述辅助因子选自下组的人细胞因子：IL-2、IL-10、IL-12、GM-CSF、IFN、IL-4和/或IL-6，
附加条件是当(b2)和(b3)均不存在时，所述免疫辅助因子的编码序列必须存在；
(B)用步骤(A)的构建物转化病毒载体，从而获得基因组中插入了所述表达盒的重组病毒载体。
本发明的第五方面提供了本发明重组病毒载体在制备预防和/或治疗结核病的组合物中的用途。
另外，本发明还提供了一种预防和/或治疗结核病的方法，包括步骤：给需要的对象使用本发明上述的重组病毒载体。
附图说明
图1所示为本发明实施例中构建的5种重组质粒。其中A为：pAg85a(实施例6)；B为：pAg85a-Fus-ESAT6(实施例7)；C为：pAg85a-IRES-ESAT6(实施例6)；D为：pAg85a-IRES-IL-2(实施例5)；E为：pAg85a-Fus-ESAT6-IRES-IL-2(实施例8)。
图2所示为实施例中构建的重组病毒克隆表达的蛋白质印迹鉴定图。
图3所示为重组结核抗原蛋白刺激对重组痘病毒免疫后小鼠淋巴细胞增殖反应的影响(MTT法测定)。图3A中所用重组结核融合蛋白体外刺激浓度为10μg/ml；图3B中所用浓度为4μg/ml；图3C中所用浓度为2μg/ml。
图4所示为重组结核抗原蛋白对重组痘病毒免疫后小鼠脾淋巴细胞产生细胞因子IFN-γ的影响(通过ELISA测得)。图4A中所用重组结核融合蛋白浓度为4μg/ml；图4B中所用浓度为10μg/ml。
图5所示为重组痘病毒免疫后对小鼠PPD的迟发型超敏反应的影响。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，筛选了多种抗原组合，结果发现：将结核杆菌抗原Ag85a编码序列、抗原ESAT6编码序列与免疫辅助因子的编码序列(例如IL-2等)构建在一起，转入病毒载体，可形成非常有效的结核病疫苗。在此基础上完成了本发明。
具体而言，木发明人将结核杆菌抗原Ag85a编码序列、抗原ESAT6编码序列与免疫辅助因子的编码序列(例如IL-2等)构建在一起，形成产生包含Ag85a、ESAT6及其融合蛋白和/或免疫辅助因子的重组病毒载体。此外，发明人还在构建共表达载体时采用了引入内部核糖体结合位点(Internal Ribosome EntrySite，IRES)的策略，在一个mRNA分子上进行两种不同机制的蛋白转译，从而成功地产生了结核杆菌抗原和免疫辅助因子。
本发明的所述融合蛋白或共表达蛋白具有多重生物学功能，既可通过Ag85a刺激机体免疫应答，也可通过ESAT6实现刺激应答作用，还可通过所表达的IL-2等辅助因子增强免疫功能，因此可非常有效地激发针对结核病的免疫反应。
术语
术语“免疫活性”或“免疫原性”指由天然、重组或合成的肽诱导哺乳动物体内的特异性体液和/或细胞免疫应答的能力。本文所用的术语“抗原性多肽”或“抗原性肽”指可引发哺乳动物免疫应答的氨基酸序列，无论是单独或融合，或与辅助分子结合(如I或II类主要组织相容性抗原分子)。
本文所用的术语“免疫应答”包括细胞性和/或体液性免疫应答，它们足以抑制或防止感染；或防止或抑制由微生物(尤其是病原性微生物)导致的疾病的发作。
本文中术语“对象”或“个体”或“患者”指需要进行诊断或治疗的任何目标，尤其是哺乳动物对象，特别是人，其它对象包括牛、狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠、马等。特别受关注的是那些易受或已受结核杆菌感染的对象。
表达盒
在本发明中，术语“共表达结核杆菌Ag85a编码序列和免疫辅助因子的表达盒”、“Ag85a编码序列和免疫辅助因子表达盒”和“本发明的表达盒”，可互换使用，所述表达盒从5’到3’依次包含以下元件(a)、元件(b)和元件(c)或依次包含以下元件(a)、元件(c)和元件(b)：
(a)启动子；
(b)选自下组的至少一种结核杆菌抗原序列：
(b1)Ag85a的编码序列；
(b2)ESAT6的编码序列；和/或
(b3)Ag85a/ESAT6融合蛋白的编码序列；
(c)任选的免疫辅助因子的编码序列，所述辅助因子选自下组的人细胞因子：IL-2、IL-10、IL-12、GM-CSF、IFN、IL-4和/或IL-6，
附加条件是当(b2)和(b3)均不存在时，所述免疫辅助因子的编码序列必须存在。
此外，该表达盒还可以含有或不含有其他序列，其中包括但并不限于：增强子、分泌信号肽序列等。
可以适用于本发明表达盒的启动子可以是任何一种常见的启动子，它可以是组成型启动子或诱导型启动子。较佳地，该启动子是组成型的强启动子，例如牛痘病毒P11K启动子、牛痘病毒P7.5启动子、巨细胞病毒启动子、牛乳头瘤病毒启动子等其它适用于真核表达的启动子。
本文中术语“Ag85a”指结核杆菌分泌性蛋白Ag85中的a组分，其可引起结核杆菌感染者T细胞增殖和INF-γ释放，优选包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列。本发明所用Ag85a编码序列可为结核杆菌中天然存在的Ag85a序列，也可人工合成，只要其编码的蛋白质具有与天然Ag85a相同或类似的功能，优选包含SEQ ID NO：1所示的序列。
本文中术语“ESAT6”即“结核早期分泌抗原性靶-6”(Early secretory antigenic target-6)，其能广泛地被感染结核菌的不同种属动物及不同遗传背景的个体细胞所识别，并在保护性免疫中发挥作用，优选包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列。本发明所用ESAT6基因可以是结核杆菌中天然存在的ESAT6序列，也可为人工合成的序列，只要其编码的蛋白质具有与天然ESAT6相同或类似的功能，优选包含SEQ ID NO：3的序列。
本文中术语“Ag85a/ESAT6融合蛋白”指Ag85a和ESAT6融合而形成的蛋白，其中Ag85a和ESAT6之间可具有或不具有连接肽，优选包含SEQ ID NO：6的氨基酸序列。本发明的Ag85a/ESAT6融合蛋白优选由包含SEQ ID NO：5所示的序列编码。
本文中术语“免疫辅助因子”是指对结核杆菌具有免疫原性、或增强对结核杆菌免疫反应的因子，其不会干扰Ag85a、ESAT6或Ag85a/ESAT6融合蛋白的免疫作用，并能增强免疫应答。
本文中术语“人细胞因子基因”指天然存在的或人工合成的人细胞因子编码序列，人细胞因子的编码序列可以编码各种具有免疫活性的天然的细胞因子，如IL-2、IL-10、IL-12、GM-CSF、IFN、IL-4、IL-6、TNF及其变异形式(例如IL-2的保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体，或其活性片段)。在本发明中优选IL-2。
“IL-2”即白介素-2，其可导致感染部位T细胞数量迅速，具有免疫增强的效果。本发明所用“IL-2”优选包含SEQ ID NO：8本发明所用IL-2基因可以是天然存在的IL-2序列，也可以是人工合成的序列，只要其具有与天然IL-2相同或类似的功能，优选包含SEQID NO：7所示的序列。
本文中术语“IRES”、“核糖体进入位点”或“核糖体进入位点IRES”可互换使用，是指介导核糖体插入，使一条mRNA上可同时翻译其上游及下游蛋白的一段DNA序列。在本发明的一个实施方式中，其具有SEQ ID NO：9所示的序列。在本发明的另一实施方式中，所述的IRES位于元件(b)之间、(b)和(c)之间。辅助因子包括人细胞因子，且在Ag85a的编码序列与ESAT6的编码序列构成融合基因的实施方式中，所述的IRES位于所述融合基因和人细胞因子编码序列之间。
编码本发明融合蛋白的DNA序列，可以全部人工合成。也可用PCR扩增或合成的方法获得Ag85a、ESAT6和/或人细胞因子的编码DNA序列，然后将其拼接在一起，形成编码本发明的DNA序列。
本文中术语“连接序列”是指位于Ag85a序列和ESAT6序列或人细胞因子基因(例如IL-2)序列之间，起连接作用的序列。连接序列的长度没有特别限制，通常为0-100个。连接肽的长度也可为0，此时表示基因序列直接相连。通常，连接肽不影响或不显著影响所连接序列的表达和正确折叠。
病毒载体
在获得了编码本发明新融合蛋白的DNA序列之后，将其连入合适的表达载体，再转入合适的宿主细胞与相应载体病毒进行重组。最后，通过分离选择纯化得到本发明的新的重组病毒克隆。
本文中术语“病毒载体”包括痘病毒、腺病毒、单纯疱疹病毒、微小RNA病毒、黄病毒。优选痘病毒和腺病毒，例如牛痘病毒MVA株或复制缺陷型腺病毒Ad5。
术语“牛痘病毒MVA株”即改良安卡拉牛痘病毒(Mo dified Viccinia Ankara，MVA)，其为高度减毒的牛痘病毒株，其中大约10％的痘苗病毒基因组被缺失，但保留了在特异细胞内的复制能力。MVA在人体细胞内的重组基因表达水平，与具有完全复制能力的痘苗病毒载体相近。研究表明，MVA是安全的病毒载体，且对动物具有免疫原性。
术语“腺病毒”是指一类小DNA病毒，其很容易在体外培养，在细胞分裂增殖时，病毒DNA的拷贝数很高，病毒的染色体有很强的启动子，可以插入长达7000bp外源基因序列。由于腺病毒有很多不同的血清型，因而可以用来加强免疫，前后两次接种的腺病毒血清型不同，可以避免由初次免疫产生的腺病毒抗体对加强免疫的腺病毒载体的抑制作用。
组合物
本发明还提供了包含本发明的重组病毒载体的各种组合物，包括药物组合物和疫苗组合物。
包含本发明的重组病毒载体的各种组合物可以包含按重组病毒载体的实际用途所选用的缓冲剂；还可包含适用于预定用途的其它物质。本领域技术人员都善于选择的缓冲剂，本领域已知有多种缓冲剂适用于预定用途。在有些实例中，该组合物可含有药学上可接受的赋形剂，本领域已知有多种而无需在此详细讨论。药学上可接受的各种赋形剂在多种出版物已有详述，包括如“Remington’s Pharmaceutical Sciences”(《雷明顿药物科学》，第19版(1995)Mack Publishing Co.)。
可将药物组合物或疫苗组合物制备成各种剂型，如注射剂、粒剂、片剂、丸剂、栓剂、胶囊、悬浮液、喷雾、栓剂、透皮药物(如贴片等)、油膏、洗剂等。适用于口服或局部使用的药用级别的有机或无机载体和/或稀释剂，可用于配制包含治疗活性化合物的各种组合物。本领域已知的稀释剂包括水性介质、植物性和动物性油和脂肪。还可用稳定剂、润湿剂和乳化剂、改变渗透压的盐类或维持合适pH值的各种缓冲剂、和皮肤渗透增强剂等作为辅助性材料。
当用作疫苗时，本发明的重组病毒载体可采用各种方法进行配制。通常，按本领域熟知的各种方法，用合适的药用载体和/或运载体(vehicle)配制本发明的疫苗或药物。合适的载体是无菌盐水。为此也可使用其它水性和非水性等渗无菌注射液以及水性和非水性无菌悬浮液(已知都是本领域技术人员所熟知的药学上可接受的载体)。
另外，本发明的疫苗组合物的配制还可含有其它成分，包括如佐剂、稳定剂、pH调节剂、防腐剂等。这些成分是疫苗领域技术人员所熟知的。佐剂类包括(但不限制于)铝盐佐剂；皂苷佐剂；Ribi佐剂(Ribi ImmunoChem Research In.，Hamilton，MT)；MontanideISA佐剂(Seppic，Paris，France)；Hunter’s TiterMax佐剂(CytRx Corp.，Norcross，GA)；Gerbu佐剂(Gerbu Biotechnik GmbH，Gaiberg，Germany)等。另外，在制剂中也可包含调节免疫应答的其它成分。
给药途径和剂量
当用作疫苗时，可用已知的方法将本发明的重组病毒载体施用于个体。通常采用与常规疫苗相同的施用途径和/或模拟病原体感染路径施用这些疫苗。可以采用疫苗组合物的形式时，还可包括药学上可接受的载体。此外，这种组合物还可包括佐剂、矫味剂或稳定剂等。
给予本发明药物组合物或疫苗组合物的常规和药学上可接受的途径包括：鼻内、肌内、气管内、皮下、皮内、肺内、静脉内、经鼻、经口服或其它肠胃外给药途径。如果需要可以组合给药途径，或按抗原肽或疾病情况进行调节。疫苗组合物可以单剂量或多剂量给予，且可以包括给予加强剂量以引发和/或维持免疫力。
应以“有效量”给予重组病毒载体疫苗，即重组病毒载体的量在所选用的给药路径中足以引发免疫应答，能有效促使保护宿主抵抗结核杆菌感染或结核病症状。
在各疫苗剂份中所选用的重组病毒载体的量，是按可引发免疫保护性应答而无明显的副作用的量而定。通常，在感染宿主细胞后，各剂份的疫苗足以产生约1μg-1000mg，较佳地为1μg-200mg，更佳地10μg-100mg蛋白质。以重组病毒载体核酸为基础计算的疫苗有效剂量，通常包括给予约1μg-1000mg核酸。另外，重组病毒载体疫苗的有效剂量的般范围为约102-107，103-106或104-105空斑形成单位(PFU)。可用包括观察对象中的抗体滴定度和其它反应的标准研究方法来确定具体疫苗的最佳用量可通过。监控疫苗提供的免疫力水平来确定是否需要增强剂量。在评估了血清中的抗体滴定度后，可能需要选用增强剂量免疫接种。施用佐剂和/或免疫刺激剂就可提高对本发明的蛋白质的免疫应答。
本发明的主要优点在于：
(1)本发明的重组病毒可在体内产生出抗原或抗原融合蛋白和共表达蛋白，既可通过Ag85a和ESAT6刺激机体免疫应答，也可通过免疫辅助因子来刺激和增强免疫应答。由此，获得了免疫效果优于单蛋白免疫效果的疫苗。
(2)给药方便，给予本发明的重组病毒可在体内产生一个以上抗原或抗原融合蛋白和共表达蛋白，方便了单药的配比，方便了患者使用，提高了患者的顺应性。
(3)可与其它结核病疫苗或治疗药物联合应用，不仅可进一步提高疗效，而且可减轻毒副反应。
实施例
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件(例如可参考通常按照常规条件如Sambrook等人，《分子克隆：实验室指南》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的条件)、或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
重组病毒构建试验材料：
菌株：结核杆菌H37Rv，大肠杆菌Top10(获自上海生物制品研究所)
毒株：牛痘病毒MVA株(购自ATCC)
细胞株：病毒扩增细胞株BHK21，病毒表达细胞株BSC40(购自ATCC)
表达质粒：pA(获自上海生物制品研究所)
试剂：QIAprep Miniprep kit，QIA quick Gel Exaction kit(QIAGEN公司)
限制性内切酶、pfu酶、DNA连接酶(MBI公司)
细胞培养基：α-MEM(10％FBS)、DMEM(10％FBS)、细胞培养试剂(GIBCO公司)
细胞培养胎牛血清(Hyclone公司)
转染试剂盒：FuGENE6转染试剂(罗氏)、麦考酚酸(MPA)、黄嘌呤、次黄嘌呤(SIGMA)
抗体：购自KPL公司。
实施例1.pIL-2重组质粒的构建
1.PCR获得并扩增IL-2(480bp)片段
IL-2正向引物：gcgcatgcatgtacaggatgcaactcctg(SEQ ID NO：10)
IL-2反向引物：gcaagcttacttaattatcaagtcagtg(SEQ ID NO：11)
模板：人IL-2DNA片段或用常规方法制备的人cDNA。
PCR反应体系：(μl)
| 模板 | 正向引物 | 反向引物 | 10×Tag缓冲液 | 10mM dNTP | 25mM MgCL2 | ddH2O | Tag酶 |
| 1 | 1 | 1 | 5 | 1 | 3 | 37 | 1 |
PCR反应条件：94℃5分钟→(94℃30秒→56℃30秒→72℃90秒)30个循环→72℃10分钟
PCR产物的回收：用PCR产物快速纯化试剂盒(博大泰克)进行切胶回收，得到IL-2(480bp)片段40μl。
2.将目的片段插到表达质粒中，构建重组质粒
2.1酶切片段和载体(μl)(限制性内切酶及反应缓冲液均为MBI公司产品)
| 样品名 | 表达质粒pA | IL-2(PCR产物) | 10×tango缓冲液 | SphI | HindIII | ddH2O |
| 载体 | 6 | / | 6 | 1 | 1 | 46 |
| 插入片段 | / | 20 | 6 | 1 | 1 | 32 |
混匀后，37℃反应1小时。酶切产物用核酸胶回收试剂盒QIA quick Gel Exactionkit(QIAGEN公司)纯化，得到50μl产物。
2.2片段和载体的连接(μl)(连接酶及反应缓冲液均为MBI公司产品)
| 样品名 | 表达质粒pA(酶切产物) | IL-22(酶切产物) | 5×连接缓冲液 | T4连接酶 | ddH2O |
| pIL-2 | 2 | 4 | 4 | 1 | 9 |
| 空白对照 | 2 | / | 4 | 1 | 13 |
混匀后，22℃反应1小时，移至冰浴终止反应，从而获得连接产物，即质粒pIL-2。
2.3重组质粒的转化
取10μl连接产物，加到100μl感受态细胞(E.coli Top10′)中，轻弹混匀，冰浴30分钟→42℃水浴1.5分钟→立即至冰浴2分钟→将转化好的菌液涂布于LB(AMP+)平板上→37℃培养过夜→第二天从阳性平板挑取10个克隆，接种于LB(AMP+)液体培养基试管37℃摇床培养过夜，以扩增阳性克隆。
3.阳性重组克隆的鉴定
将所挑取的克隆用质粒抽提试剂盒QIAprep miniprep kit(QIAGEN公司)抽提质粒，然后对所抽得的质粒进行双酶切。
酶切反应体系(μl)
| 样品 | 10×tango缓冲液 | SphI | HindIII | ddH2O |
| 5 | 3 | 1 | 1 | 20 |
混匀后，37℃反应1小时。电泳鉴定，有目的条带(IL-2480bp)的为阳性克隆，并抽取1个阳性克隆送去测序，测序结果正确.扩增正确的阳性克隆，保种(50％甘油，-80℃保存)，得到了pIL-2重组克隆。
实施例2.pESAT6重组质粒的构建
1.PCR获得并扩增ESAT6(380bp)片段
ESAT6正向引物(SEQ ID NO：12)：gcgcatgcatggatgcaatgaagagagggctctgctgtgtgctgctgctgtgtggagcagtcttcgtttcgcccagcacagagcagcagtggaatttc
ESAT6反向引物(SEQ ID NO：13)：gcaagcttcgttgccctatgcgaacatcc
模板：结核杆菌H37Rv基因组
PCR反应体系：(μl)
| 模板 | 正向引物 | 反向引物 | 含MgSO4的10×Pfu缓冲液 | 10mM dNTP | ddH2O | Pfu酶 |
| 1 | 1 | 1 | 5 | 1 | 40 | 1 |
PCR反应条件：95℃5分钟→(95℃30秒→60℃30秒→72℃60秒)30个循环→72℃10分钟
PCR产物的回收：用PCR产物快速纯化试剂盒(博大泰克)进行切胶回收，得到ESAT6(380bp)片段40μl。
此外，ESAT6的380bp也可用人工合成方法制备。
2.将目的片段插到表达质粒中，构建重组质粒
2.1酶切片段和载体(μl)(限制性内切酶及反应缓冲液均为MBI公司产品)
| 样品名 | 质粒pA-IL2 | ESAT6(PCR产物) | 10×B缓冲液 | SphI | ddH2O |
| 载体(SphI) | 10 | / | 4 | 4 | 2 |
| 插入片段(SphI) | / | 36 | 5 | 4 | 5 |
混匀后，37℃反应1小时。电泳鉴定载体酶切完全，酶切产物用核酸胶回收试剂盒QIA quick Gel Exaction kit(QIAGEN公司)纯化。
| 样品名 | 质粒p-IL2(SphI) | ESAT6(SphI) | 10*R缓冲液 | HindIII | ddH2O |
| 载体(SphI/HindIII) | 31 | / | 4 | 4 | 1 |
| 插入片段(SphI/Hi ndIII) | / | 29 | 4 | 4 | 3 |
混匀后，37℃反应1小时。酶切产物用核酸胶回收试剂盒QIA quick Gel Exactionkit(QIAGEN公司)切胶回收纯化。各得到30μl产物(载体：5.5kb，插入片段380bp)。
2.2片段和载体的连接(μl)(连接酶及反应缓冲液均为MBI公司产品)
| 样品名 | 表达质粒pA(SphI/HindIII酶切产物) | 插入片段ESAT6(SphI/HindIII酶切产物) | 10×连接缓冲液 | T4连接酶 | ddH2O |
| pESAT6 | 4 | 12 | 2 | 2 | / |
| 空白对照 | 4 | / | 2 | 2 | 12 |
混匀后，22℃反应4小时，移至冰浴终止反应，从而获得连接产物，即质粒pESAT6
2.3重组质粒的转化
取10μl连接产物，加到100μl感受态细胞(E.coliTop10′)中，轻弹混匀，冰浴30分钟→42℃水浴1.5分钟→立即至冰浴2分钟→将转化好的菌液涂布于LB(AMP+)平板上→37℃培养过夜→第二天从阳性平板挑取11个克隆，接种于LB(AMP+)液体培养基试管37℃摇床培养过夜，以扩增阳性克隆。
3.阳性重组克隆的鉴定
将所挑取的克隆用质粒抽提试剂盒QIAprep miniprep kit(QIAGEN公司)抽提质粒，然后对所抽得的质粒进行双酶切。
酶切反应体系(μl)
| 样品 | 10×tango缓冲液 | SphI | HindIII | ddH2O |
| 4 | 4 | 1 | 1 | 10 |
混匀后，37℃反应1小时。电泳鉴定，有目的条带(ESAT6380bp)的为阳性克隆，并抽取1个阳性克隆送去测序，测序结果正确.扩增正确的阳性克隆，保种(50％甘油，-80℃保存)，得到了pESAT6重组克隆。
实施例3.pIRES-IL-2重组质粒的构建
1.PCR获得并扩增IRES(650bp)片段
IRES正向引物(SEQ ID NO:14)：GCGTCGACCCGAAGTAACTTAGAAGCTG
IRES反向引物(SEQ ID NO:15)：GCGCATGCATGTTTGATTGTGTTGAGGG
模板：市售的含核糖体进入位点IRES的质粒
PCR反应体系：(μl)
| 模板 | 正向引物 | 反向引物 | 含MgSO4的10×Pfu缓冲液 | 10mM dNTP | ddH2O | Pfu酶 |
| 1 | 1 | 1 | 5 | 1 | 40 | 1 |
PCR反应条件；
95℃5分钟→(95℃30秒→65℃30秒→72℃1.5分钟)30个循环→72℃10分钟
PCR产物的回收：用PCR产物快速纯化试剂盒(博大泰克)进行进行切胶回收，得到得到IRES(650bp)片段50μl。
2.将目的片段插到表达质粒中，构建重组质粒
2.1酶切片段和载体(μl)(限制性内切酶及反应缓冲液均为MBI公司产品)
| 样品名 | 表达质粒pIL-2 | IRES PCR产物 | 10*B缓冲液 | SphI | ddH2O |
| 载体(SphI) | 10 | 0 | 4 | 4 | 2 |
| IRES(SphI) | 0 | 46 | 6 | 4 | 4 |
混匀后，37℃反应1小时，电泳鉴定载体酶切完全。
2.2酶切产物用核酸胶回收试剂盒QIA qui ck Gel kit(QIAGEN公司)纯化。
| 样品名 | 重组质粒pIL2(SphI) | ESAT6(SphI) | 10*0缓冲液 | SalI | ddH2O |
| 载体(SalI/SphI) | 47 | / | 6 | 4 | 3 |
| 插入片段(SalI/SphI) | / | 22 | 4 | 4 | 10 |
混匀后，37℃反应1小时。
酶切产物用核酸胶回收试剂盒QIA quick Gel Exaction kit(QIAGEN公司)切胶回收纯化。得到30μl产物，质粒pIL-2(SalI/SphI)和IRES(SalI/SphI)片段
2.3片段和载体的连接(μl)(连接酶及反应缓冲液均为MBI公司产品)
| 样品名 | 表达质粒pA(SalI/SphI酶切产物) | IRES(SalI/SphI酶切产物) | 10×连接缓冲液 | T4连接酶 | ddH2O |
| pIRES-IL-2 | 5 | 12.5 | 2.5 | 2 | 3 |
混匀后，22℃连接4小时，移至冰浴终止反应，从而获得连接产物，即pIRES-IL-2。
2.4重组质粒的转化
取10μl连接产物，加到100μl感受态细胞(E.coli Top10′)中，轻弹混匀，冰浴30分钟→42℃水浴1.5分钟→立即至冰浴2分钟→将转化好的菌液涂布于LB(AMP+)平板上→37℃培养过夜→第二天从阳性平板各挑取11个克隆，接种于LB(AMP+)液体培养基试管37℃摇床培养过夜，以扩增阳性克隆。
3.阳性重组克隆的鉴定
将所挑取的克隆用质粒抽提试剂盒QIAquick Mini prep kit(QIAGEN公司)抽提质粒，然后对所抽得的质粒进行双酶切。
酶切反应体系(μl)
| 样品 | 10*tango缓冲液 | SphI | HindIII | ddH2O |
| 4 | 4 | 1 | 1 | 10 |
混匀后，37℃反应1小时。电泳鉴定，有目的条带(IRES-IL-21.1kb)的为阳性克隆，并抽取1个阳性克隆送去测序，测序结果正确.扩增正确的阳性克隆，保种(50％甘油，-80℃保存)，得到了pIRES IL2重组克隆。
实施例4.pIRES-ESAT6重组质粒的构建
1.将目的片段插到表达质粒中，构建重组质粒
1.1酶切片段和载体(μl)(限制性内切酶及反应缓冲液均为MBI公司产品)
| 样品名 | 重组质粒pESAT6 | 重组质粒pIRES-IL-2 | 10*B缓冲液 | SphI | ddH2O |
| 载体(SphI) | 6 | 0 | 4 | 3 | 27 |
| IRES(SphI) | 0 | 8 | 4 | 4 | 24 |
混匀后，37℃反应1小时，电泳鉴定载体酶切完全。
2.2酶切产物用核酸胶回收试剂盒QIA quick Gel kit(QIAGEN公司)纯化。
| 样品名 | 重组质粒pESAT6(SphI) | 重组质粒pIRES-IL-2(SphI) | 10*0缓冲液 | SalI | ddH2O |
| 载体(SalI/SphI) | 40 | / | 6 | 3 | 11 |
| 插入片段(SalI/SphI) | / | 40 | 6 | 3 | 11 |
混匀后，37℃反应1.5小时。
酶切产物用核酸胶回收试剂盒QIA quick Gel Exaction kit(QIAGEN公司)切胶回收纯化。得到40μl产物，质粒pIL-2(SalI/SphI)和IRES(SalI/SphI)片段
2.3片段和载体的连接(μl)(连接酶及反应缓冲液均为MBI公司产品)
| 样品名 | 重组质粒pESAT6(SalI/SphI酶切产物) | IRES(SalI/SphI酶切产物) | 10×连接缓冲液 | T4连接酶 | ddH2O |
| pIRES-ESAT6 | 8 | 12 | 3 | 2 | 5 |
混匀后，22℃连接3小时，移至冰浴终止反应，从而获得连接产物，即pIRES-ESAT6。
2.4重组质粒的转化
取10μl连接产物，加到100μl感受态细胞(E.coliTop10′)中，轻弹混匀，冰浴30分钟→42℃水浴1.5分钟→立即至冰浴2分钟→将转化好的菌液涂布于LB(AMP+)平板上→37℃培养过夜→第二天从阳性平板各挑取6个克隆，接种于LB(AMP+)液体培养基试管37℃摇床培养过夜，以扩增阳性克隆。
2.阳性重组克隆的鉴定
将所挑取的克隆用质粒抽提试剂盒QIAquick Mini prep kit(QIAGEN公司)抽提质粒，然后对所抽得的质粒进行双酶切。
酶切反应体系(μl)
| 样品 | 10*tango缓冲液 | SphI | BamHI | ddH2O |
| 4 | 3 | 1 | 1 | 21 |
混匀后，37℃反应2.5小时。电泳鉴定，有目的条带(IRES约650bp)的为阳性克隆，并抽取1个阳性克隆送去测序，测序结果正确.扩增正确的阳性克隆，保种(50％甘油，-80℃保存)，得到了pIRES-ESAT6重组克隆。
实施例5.pAg85a-IRES-IL-2重组质粒的构建
1.运用PCR技术得到并扩增所需的目的基因片段
| SEQ ID NO | 引物 | 序列(5’-3’) |
| 16 | Ag85a正向引物1 | GCTGCTGCTGTGTGGAGCAGTCTTCGTTTCGCCCAGCTTTTCCCGGCCGGGCTTGCCG |
| 17 | Ag85a正向引物2 | CGAATTCATGGATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAGCAG |
| 18 | Ag85a反向引物 | CGGATCCTCTTCGGAGCTAGGCGCCCTG |
1.1PCR1反应体系：(μl)模板为常规方法制备结核杆菌H37Rv基因组DNA。
| TB基因组 | 正向引物1 | 反向引物 | 含MgSO4的10Pfu缓冲液 | 10mM dNTP | ddH2O | Pfu DNA聚合酶 |
| 1 | 1 | 1 | 5 | 1 | 40 | 1 |
PCR1反应条件；
95℃5分钟→(95℃1分钟→64.3℃1分钟→72℃2分钟)30个循环→72℃10分钟
PCR1产物的回收：用PCR产物快速纯化试剂盒(购自博大泰克)进行过柱纯化，得到40μl PCR产物。
1.2PCR2反应体系：(μl)
| PCR1产物 | 正向引物2 | 反向引物 | 含MgSO4的10Pfu缓冲液 | 10mM dNTP | ddH2O | Pfu DNA聚合酶 |
| 1 | 1 | 1 | 5 | 1 | 40 | 1 |
PCR2反应条件；
95℃5分钟→(95℃1分钟→70.2℃1分钟→72℃2分钟)30个循环→72℃10分钟
PCR2产物用PCR产物快速纯化试剂盒进行切胶回收，得到Ag85a片段40μl。
2.将目的片段插到表达质粒中，构建重组质粒
2.1酶切片段和载体(μl)(限制性内切酶及反应缓冲液均为MBI公司产品)
| 样品名 | 重组质粒pIRES-IL-2 | Ag85a(PCR产物) | 10*tango缓冲液 | BamHI | EcoRI | ddH2O |
| 载体(BamHI/EcoRI) | 6 | / | 8 | 2 | 2 | 32 |
| 插入片段(BamHI/EcoRI) | 20 | 10 | 2 | 2 | 16 |
混匀后，37℃反应2小时。电泳鉴定载体酶切完全，
酶切产物用核酸胶回收试剂盒QIA quick Gel Exaction kit(QIAGEN公司)纯化。
2.2片段和载体的连接(μl)(连接酶及反应缓冲液均为MBI公司产品)
| 样品名 | 重组质粒pIRES-IL-2(BamHI/EcoRI酶切产物) | Ag85a(BamHI/EcoRI)酶切产物) | 10×连接缓冲液 | T4连接酶 | ddH2O |
| p Ag85aIRES-IL-2 | 12 | 15 | 4 | 2 | 7 |
混匀后，22℃反应4小时，移至冰浴终止反应，从而获得连接产物，即p Ag85a-IRES-IL-2。
2.3重组质粒的转化
取10μl连接产物，加到90μl感受态细胞(E.coli Top10′)中，轻弹混匀，冰浴30分钟→42℃水浴1.5分钟→立即至冰浴2分钟→将转化好的菌液涂布于LB(AMP+)平板上→37℃培养过夜→第二天从阳性平板挑取6个克隆，接种于LB(AMP+)液体培养基试管37℃摇床培养过夜，以扩增阳性克隆。
3.阳性重组克隆的鉴定
将所挑取的克隆用质粒抽提试剂盒QIAquick Mini prep kit(QIAGEN公司)抽提质粒，然后对所抽得的质粒进行双酶切。
酶切反应体系(μl)
| 样品 | 10×Tango缓冲液 | BamHI | EcoRI | ddH2O |
| 4 | 6 | 1 | 1 | 18 |
混匀后，37℃反应2小时。
电泳鉴定，有目的条带的为阳性克隆，并抽取1个阳性克隆送去测序，测序结果正确.扩增正确的阳性克隆，保种(50％甘油，-80℃保存)，得到了pAg85a-IRES-IL-2(如图1D所示)重组克隆。
实施例6.pAg85a和pAg85a-IRES-ESAT6重组质粒的构建
1.酶切片段和载体(μl)(限制性内切酶及反应缓冲液均为MBI公司产品)
| 样品名 | 表达质粒pA | 重组质粒pIRES-ESAT6 | 重组质粒pAg85a-IRES-IL-2 | tango缓冲液 | BamHI | EcoRI | ddH2O |
| pA(BamHI/EcoRI) | 4 | 0 | 0 | 6 | 1 | 1 | 18 |
| pIRES-ESAT6(BamHI/EcoRI) | 0 | 4 | 0 | 6 | 1 | 1 | 18 |
| 插入片段Ag85a(BamHI/EcoRI) | 0 | 0 | 8 | 10 | 2 | 2 | 28 |
混匀后，37℃反应2小时。
酶切产物用核酸胶回收试剂盒QIA qui ck Gel Exaction kit(QIAGEN公司)切胶回收载体pA(BamHI/EcoRI)(5.5kb)、pIRES-ESAT6(BamHI/EcoRI)(约6.5kb)和片段Ag85a(BamHI/EcoRI)(约1kb)。
2.片段和载体的连接(μl)(连接酶及反应缓冲液均为MBI公司产品)
| 样品名 | pA(BamHI/EcoRI酶切产物) | pIRES-ESAT6(BamHI/EcoRI酶切产物) | Ag85a(BamHI/EcoRI酶切产物) | 10×连接缓冲液 | T4连接酶 | ddH2O |
| pAg85a | 10 | 0 | 14 | 4 | 2 | 10 |
| pAg85a-IRES-ESAT6 | 0 | 10 | 14 | 4 | 2 | 10 |
混匀后，22℃连接2hr，移至冰浴终止反应，从而获得连接产物，即pAg85a-IRES-ESAT6。
3.重组质粒的转化
取10μl连接产物，加到90μl感受态的常规大肠杆菌细胞(E.coliTop10′)中，轻弹混匀，冰浴30分钟→42℃水浴1.5分钟→立即至冰浴2分钟→将转化好的菌液涂布于LB(AMP+)平板上→37℃培养过夜→第二天从阳性平板挑取6个克隆，接种于LB(AMP+)液体培养基试管37℃摇床培养过夜，以扩增阳性克隆。
4.阳性重组克隆的鉴定
将所挑取的克隆用质粒抽提试剂盒QIAquick Mini prep kit(QIAGEN公司)抽提质粒，然后对所抽得的质粒进行双酶切。
酶切反应体系(μl)
| 样品 | 10*Tango缓冲液 | BamHI | EcoRI | ddH2O |
| 4 | 6 | 1 | 1 | 18 |
混匀后，37℃反应1小时。
电泳鉴定，有目的条带的为阳性克隆，并抽取1个阳性克隆送去测序，测序结果正确.扩增正确的阳性克隆，保种(50％甘油，-80℃保存)，得到了pAg85a(如图1A所示)和pAg85a-IRES-ESAT6(如图1C所示)重组克隆。
实施例7.pAg85a-Fus-ESAT6重组质粒的构建
1.运用PCR技术得到并扩增所需的目的基因片段
| SEQ ID NO | 引物 | 序列(5’-3’) |
| 17 | Ag85a正向引物2 | CGAATTCATGGATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAGCAG |
| 19 | Ag85a-Fus-ESAT6反向引物 | GCTGCTCTGTGGCGCCCTGGGGCGCGGGCC |
| 20 | ESAT6-Fus-Ag85a正向引物 | GCCCCAGGGCGCCACAGAGCAGCAGTGGAATTTC |
| 21 | ESAT6反向引物2 | GCGGATCCCGTTGCCCTATGCGAACATCC |
1.1PCR1反应体系：(μl)模板为常规方法制备结核杆菌H37Rv基因组DNA
| 重组质粒pAg85a | Ag85a正向引物2 | Ag85a-Fus-ESAT6反向引物 | 含MgSO1的10Pfu缓冲液 | 10mMdNTP | ddH2O | Pfu DNA聚合酶 |
| 1 | 1 | 1 | 5 | 1 | 40 | 1 |
PCR1反应条件；
95℃5分钟→(95℃1分钟→56℃1分钟→72℃2分钟)30个循环→72℃10分钟
PCR1产物用PCR产物快速纯化试剂盒(购自博大泰克)进行过柱纯化，得到40μlPCR产物Ag85a’。
1.2PCR2反应体系：(μl)
| 重组质粒pESAT6 | ESAT6-Fus-Ag85a正向引物 | ESAT6反向引物 | 含MgSO4的10Pfu缓冲液 | 10mM dNTP | ddH2O | Pfu DNA聚合酶 |
| 1 | 1 | 1 | 5 | 1 | 40 | 1 |
PCR2反应条件；
95℃5分钟→(95℃30秒→60℃30秒→72℃1分钟)30个循环→72℃10分钟
PCR2产物用PCR产物快速纯化试剂盒(博大泰克)进行切胶回收，得到ESAT6’片段40μl。
1.3PCR3反应体系：(μl)
| PCR产物1 | PCR产物2 | 含MgSO4的10Pfu缓冲液 | 10mM dNTP | ddH2O | Pfu DNA聚合酶 |
| 2 | 1 | 5 | 1 | 38 | 1 |
PCR3反应条件；
95℃10分钟→(95℃30秒→56℃60秒→72℃2分钟)10个循环→72℃10分钟→4℃保存
在PCR3反应体系中补加
| Ag85a正向引物2 | 1μl | ESAT6反向引物2 | 1μl |
继续PCR
95℃10分钟→(95℃30S→60℃60S→72℃2分钟)35个循环→72℃10分钟→4℃保存
PCR3产物用PCR产物快速纯化试剂盒(博大泰克)进行切胶回收，得到Ag85a-Fus-ESAT6片段50μl。
2.将目的片段插到表达质粒中，构建重组质粒
2.1酶切片段和载体(μl)(限制性内切酶及反应缓冲液均为MBI公司产品)
| 样品名 | 表达质粒pA | Ag85a-Fus-ESAT6(PCR产物) | tango缓冲液 | BamHI | EcoRI | ddH2O |
| 载体(BamHI/EcoRI) | 6 | / | 6 | 1.5 | 1.5 | 15 |
| 插入片段(BamHI/EcoRI) | 49 | 14 | 3 | 3 | 1 |
混匀后，37℃反应1小时。电泳鉴定载体酶切完全，
酶切产物用核酸胶回收试剂盒QIA quick Gel Exaction kit(QIAGEN公司)纯化。
2.2片段和载体的连接(μl)(连接酶及反应缓冲液均为MBI公司产品)
| 样品名 | 表达质粒pA(BamHI/EcoRI酶切产物) | Ag85a-Fus-ESAT6(BamHI/EcoRI)酶切产物) | 10×连接缓冲液 | T4连接酶 | ddH2O |
| pAg85a-Fus-ESAT6 | 5 | 9 | 4 | 2 | 20 |
混匀后，22℃连接过夜，移至冰浴终止反应，从而获得连接产物，即pAg85a-Fus-ESAT6。
2.3重组质粒的转化
取10μl连接产物，加到100μl感受态细胞(E.coliTop10′)中，轻弹混匀，冰浴30分钟→42℃水浴1.5分钟→立即至冰浴2分钟→将转化好的菌液涂布于LB(AMP+)平板上→37℃培养过夜→第二天从阳性平板挑取6个克隆，接种于LB(AMP+)液体培养基试管37℃摇床培养过夜，以扩增阳性克隆。
3.阳性重组克隆的鉴定
将所挑取的克隆用质粒抽提试剂盒QIAqui ckMini prep kit(QIAGEN公司)抽提质粒，然后对所抽得的质粒进行双酶切.
酶切反应体系(μl)
| 样品 | 10×Tango缓冲液 | BamHI | EcoRI | ddH2O |
| 4 | 6 | 1 | 1 | 18 |
混匀后，37℃反应1小时。
电泳鉴定，有目的条带的为阳性克隆，并抽取1个阳性克隆送去测序，测序结果正确.扩增正确的阳性克隆，保种(50％甘油，-80℃保存)，得到了pAg85a-Fus-ESAT6(如图1B所示)重组克隆。
实施例8.pAg85a-Fus-ESAT6-IRES-IL-2重组质粒的构建
1.酶切片段和载体(μl)(限制性内切酶及反应缓冲液均为MBI公司产品)
| 样品名 | pAg85a-IRES-IL-2 | pAg85a-Fus-ESAT6 | tango缓冲液 | SalI | EcoRI | ddH2O |
| pIRES-IL-2(SalI/EcoRI) | 6 | 0 | 3.5 | 1.5 | 1.5 | 22.5 |
| 插入片段Ag85a-Fus-ESAT6(SalI/EcoRI) | 0 | 4 | 3.5 | 1.5 | 1.5 | 24.5 |
混匀后，37℃反应2小时。
酶切产物用核酸胶回收试剂盒QIA qui ck Gel kit(QIAGEN公司)切胶回收载体pIRES-IL-2(BamHI/EcoRI)(约6kb)和片段Ag85a-Fus-ESAT6(BamHI/EcoRI)(约1.3kb)。
2.片段和载体的连接(μl)(连接酶及反应缓冲液均为MBI公司产品)
| 样品名 | pIRES-IL-2(SalI/EcoRI酶切产物) | Ag85a-Fus-ESAT6(SalI/EcoRI酶切产物) | 10×连接缓冲液 | T4连接酶 | ddH2O |
| pAg85a-Fus-ESAT6-IRES-IL-2 | 2 | 4 | 1.5 | 1 | 6.5 |
混匀后，22℃连接1.5小时，移至冰浴终止反应，从而获得连接产物，即pAg85a-Fus-ESAT6-IRES-IL-2。
3.重组质粒的转化
取10μl连接产物，加到100μl感受态细胞(E.coli Top10′)中，轻弹混匀，冰浴30分钟→42℃水浴1.5分钟→立即至冰浴2分钟→将转化好的菌液涂布于LB(AMP+)平板上→37℃培养过夜→第二天从阳性平板挑取6个克隆，接种于LB(AMP+)液体培养基试管37℃摇床培养过夜，以扩增阳性克隆。
4.阳性重组克隆的鉴定
将所挑取的克隆用质粒抽提试剂盒QIAprep miniprep kit(QIAGEN公司)抽提质粒，然后对所抽得的质粒进行双酶切。
酶切反应体系(μl)
| 样品 | 10*Tango缓冲液 | SalI | EcoRI | ddH2O |
| 4 | 3 | 1 | 1 | 21 |
混匀后37℃反应1小时。
电泳鉴定，有目的条带(Ag85a-Fus-ESAT6约1.3kb)的为阳性克隆，抽取1个阳性克隆，保种(50％甘油，-80℃保存)，得到了pAg85a-Fus-ESAT6-IRES-IL-2(如图1E所示)重组克隆。
实施例9.重组病毒颗粒的获得、扩增与鉴定
通过同源重组将实施例5-8中制得的5种重组表达质粒分别导入牛痘病毒MVA中。方法如下：
1.密度约为75％的BHK21细胞感染0.1PFU的MVA。
2.MVA感染后5小时，分别转染上述5种重组表达质粒。
3.37℃培养3天后收获细胞，并冻融3次。
4.将冻融后的细胞裂解液再次感染HBK21细胞。用MPA选择培养基37℃培养-5天。
5.挑取单个空斑，扩增。反复克隆、纯化所得空斑。
最后得到5个种类的重组病毒单克隆。经过鉴定确认后，以常规方法大量扩增重组病毒。
鉴定重组病毒克隆方法：让重组病毒感染BSC40细胞，表达外源抗原。用特异抗体做蛋白质印迹试验鉴定确认重组病毒克隆。结果如图2所示。
结果表明，各类重组病毒按照设计要求表达出了结核杆菌抗原和人类白介素2。
下表所列为实施例5-8中制备的重组质粒及由其分别得到的重组MVA
实施例10.动物免疫试验
1.试验动物及主要试剂
BALB/c小鼠，雌性，6周龄，SPF级(购自中国科学院上海实验动物中心)，分7组(五种重组MVA组、空MVA组、NS对照组)，5只/组。
EZ-SepTM小鼠1×淋巴细胞分离液(购自达科为生物技术有限公司)
小鼠IFN-γELISA试剂盒(购自Biosource公司)
2.疫苗的免疫原性评价
2.1免疫方案
其中，rMVA包括Ag85(A)、Ag85-ESAT6(A-E)、Ag85-Fus-ESAT6(AE)、Ag85-IL-2(A-I)、Ag85-Fus-ESAT6-IL-2(AE-I)
2.2小鼠脾淋巴细胞悬液的制备
a.第二次免疫两周后，心脏采血后立即颈椎脱臼处死小鼠，75％乙醇浸泡2-3分钟，酒精棉球消毒腹部，超静台内无菌取脾(注意观察脾脏外观、颜色)，立即置于盛有无菌冷PBS的平皿中漂洗以去除血污及坏死组织。
b.在60mm培养皿中放入4mL EZ-SepTM小鼠1×淋巴细胞分离液，用镊子固定尼龙筛网于培养皿上，将脾脏置于筛网中心，用玻璃注射器活塞的钝头轻轻研磨组织，即成细胞悬液。
c.收集细胞悬液于15ml离心管中，覆盖上1ml RPMI-1640培养液，2000r/分钟，4℃，离心20分钟。吸取中间淋巴细胞层，培养液洗2次，每次1000r/分钟，4℃，离心5分钟，去除上清液。
d.用含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液(内含2mM谷氨酰胺，2g/LNaHCO3，青霉素和链霉素各100U/ml)悬浮细胞，血球计数板下计数细胞，调整细胞浓度为1×107个细胞/ml备用。
e.取上述1×107个细胞/ml的脾淋巴细胞悬液100μl加入96孔细胞培养板内(106个细胞/孔)，37℃，5％CO2培养箱培养1h。
2.3MTT体外测小鼠脾淋巴细胞增殖反应
向上述脾淋巴细胞悬液中加入不同浓度的刺激剂Ag85-ESAT6融合蛋白(由本实验室构建重组，大肠杆菌表达并纯化，100μl/孔)。刺激剂的浓度分别为10μg/ml、4μg/ml和2μg/ml，每个浓度均设2个平行孔，并分别设生理盐水对照孔(仅加细胞、RPMI-1640培养液和生理盐水)。37℃，5％CO2培养箱共培养48h。取出培养板，每孔吸弃上清液100μl，各孔加入5mg/ml的MTT10μl，继续培养4h，取出培养板，各孔加10％SDS裂解液100μl，充分混匀，置37℃，5％CO2培养箱过夜。于570nm处测吸光度(A)值。
2.4ELISA测脾淋巴细胞产生的细胞因子
分别收集与10μg/ml、4μg/ml Ag85-ESAT6融合蛋白共培养48h的细胞培养上清液和对照组培养上清液，用小鼠IFN-γELISA试剂盒检测上清液中IFN-γ的含量，用酶标仪于450nm处测吸光度(A)值，绘制标准曲线。
2.5迟发型超敏反应
第2次免疫2周后，将浓缩后的结核菌素纯蛋白衍生物(PPD，100μg/ml)注射入上述7组免疫过的小鼠左后爪垫内，生理盐水作为阴性对照同时注射入小鼠右后爪垫，每只爪垫分别注射50μl。注射24h后用游标卡尺测量爪垫厚度(mm)。爪垫厚度增加用注射PPD侧的爪垫厚度减对侧注射生理盐水的爪垫厚度，以此来衡量针对特异结核抗原的迟发型超敏反应。
3.统计学分析
数据以均数±标准差(x±SD)表示，显著性检验用SPSS13.0统计软件进行t检验分析，以P<0.05为有统计学意义。
4.结果
4.1MTT测淋巴细胞增殖反应
5例标本小鼠脾淋巴细胞体外与Ag85-ESAT6融合蛋白共培养后五种rMVA免疫组(A、A-E、AE、A-I、AE-I)OD值均较其生理盐水对照组有所升高。生理盐水和空MVA免疫组小鼠脾淋巴细胞体外与Ag85-ESAT6融合蛋白共培养后OD值与其生理盐水对照组相比无明显变化。结果示于下表1和图3中。
表1.不同免疫组小鼠脾淋巴细胞增殖反应MTT值比较(x±SD，n＝5)
注：与对照组相比，*P<0.01
由此可知，五种重组疫苗具有免疫原性，在小鼠体内诱导了针对结核杆菌的特异性免疫应答。
4.2ELISA测脾淋巴细胞产生的细胞因子IFN-γ
5例标本小鼠脾淋巴细胞体外与Ag85-ESAT6融合蛋白共培养48h后的细胞上清液中，五种rMVA免疫组的IFN-γ的浓度均较对照组升高。生理盐水和空MVA免疫组细胞上清液中IFN-γ的浓度与其对照组相比无明显变化。见表2和图4。
表2.同免疫组小鼠脾淋巴细胞体外刺激产生的IFN-γ(pg/ml)比较
注：与对照组相比，*P<0.05；(x±SD，n＝5)
由此可知，五种重组疫苗诱导了针对结核杆菌的Th1型细胞免疫应答，产生了IFN-γ。
4.3迟发型超敏反应
分别检测7个免疫组小鼠的迟发型超敏反应，结果如图5所示。
由图5可见，盐水组未出现对PPD的迟发型超敏反应；与空MVA免疫组相比，5个重组MVA免疫组小鼠均出现了对PPD的显著的迟发型超敏反应应答，且有统计学意义(P<0.05)。
5.结论
使用重组DNA技术构建完成五种不同类型的表达结核杆菌特异抗原的重组亚牛痘病毒。这些重组病毒能在小鼠体内激发针对结核杆菌的特异性细胞免疫。
实施例11.含重组病毒载体的疫苗组合物
将实施例5-8制备的重组牛痘病毒Ag85a-IL-2、Ag85a-ESAT6、Ag85a-Fus-ESAT6和Ag85a-Fus-ESAT6-IL-2，分别用注射用水稀释、分装成1×1010pfu/ml，每小瓶1ml，保存于-80℃。
该制备的疫苗按实施例10的方式施用于小鼠，结果表明，4种疫苗组合物都可有效激发针对结核病的免疫应答。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对木发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110>上海生物制品研究所
<120>新型结核病疫苗的制备及其应用
<130>074300
<160>21
<170>PatentIn version3.3
<210>1
<211>966
<212>DNA
<213>结核杆菌(Bacillus tuberculosis)
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<213>结核杆菌(Bacillus tuberculosis)
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<220>
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<210>21
<211>29
<212>DNA
<213>寡核苷酸
<400>21
Claims (9)
1.一种重组病毒载体，其特征在于，所述重组病毒载体的基因组DNA中插入了一表达盒，所述表达盒从5’到3’依次包含以下元件(a)、元件(b)和任选的元件(c)或依次包含以下元件(a)、任选的元件(c)和元件(b)：
(a)启动子；
(b)选自下组的至少一种结核杆菌抗原序列：
(b1)Ag85a的编码序列；
(b2)ESAT6的编码序列；和/或
(b3)Ag85a/ESAT6融合蛋白的编码序列；
(c)任选的免疫辅助因子的编码序列，所述辅助因子选自下组的人细胞因子：IL-2、IL-10、IL-12、GM-CSF、IFN、IL-4和/或IL-6，
附加条件是当(b2)和(b3)均不存在时，所述免疫辅助因子的编码序列必须存在，
其中，所述病毒载体为痘病毒。
2.如权利要求1所述的重组病毒载体，其特征在于，在所述表达盒中，
所述人细胞因子为IL-2；和/或
所述的元件(b)为Ag85a/ESAT6融合蛋白的编码序列。
3.如权利要求1所述的重组病毒载体，其特征在于，所述的表达盒还包含位于所述的元件(b)和(c)之间的元件(d)核糖体进入位点IRES。
4.如权利要求1所述的重组病毒载体，其特征在于，所述表达盒包含以下结构：
Promoter-Ag85a-IRES-IL-2 式Ia；
Promoter-Ag85a-IRES-ESAT6 式Ib；
Promoter-Ag85a-Fus-ESAT6 式Ic；或
Promoter-Ag85a-Fus-ESAT6-IRES-IL-2 式Id，
式中，
Promoter表示：启动子；
Ag85a表示：结核杆菌Ag85a的编码序列；
IRES表示：核糖体进入位点；
ESAT6表示：结核杆菌ESAT6的编码序列；
IL-2表示：白介素-2的编码序列；
“-”表示：连接序列或无；
“-Fus-”表示：直接融合而无连接序列。
5.一种宿主细胞，其特征在于，所述细胞被权利要求1-4中任一项所述的重组病毒载体转染。
6.一种组合物，其包含有效量的权利要求1-4中任一项所述的重组病毒载体和药学上可接受的载体或赋形剂。
7.如权利要求6所述的组合物，其特征在于，所述的组合物为药物组合物或疫苗组合物。
8.一种制备权利要求1所述的重组病毒载体的方法，所述方法包括以下步骤：
(A)提供包含一表达盒的构建物，所述表达盒从5’到3’依次包含以下元件(a)、元件(b)和任选的元件(c)或依次包含以下元件(a)、任选的元件(c)和元件(b)：
(a)启动子；
(b)选自F组的至少一种结核杆菌抗原序列：
(b1)Ag85a的编码序列；
(b2)ESAT6的编码序列；和/或
(b3)Ag85a/ESAT6融合蛋白序列；
(c)任选的免疫辅助因子的编码序列，所述辅助因子选自下组的人细胞因子：IL-2、IL-10、IL-12、GM-CSF、IFN、IL-4和/或IL-6，
附加条件是当(b2)和(b3)均不存在时，所述免疫辅助因子的编码序列必须存在；
(B)用步骤(A)的构建物转化病毒载体，从而获得基因组中插入了所述表达盒的重组病毒载体。
9.权利要求1-4中任一项所述的重组病毒载体的用途，其特征在于，用于制备预防和/或治疗结核病的组合物。
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Cited By (1)
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|---|---|---|---|---|
| CN106755107A (zh) * | 2016-11-22 | 2017-05-31 | 上海健信生物医药科技有限公司 | 一种car新分子及其在肿瘤治疗中的应用 |
Families Citing this family (9)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101721693B (zh) * | 2009-12-15 | 2012-03-14 | 四川大学 | 一种改良的重组卡介苗 |
| CN101850112B (zh) * | 2010-04-07 | 2013-07-31 | 四川大学 | 一种用于结核病预防的新型重组疫苗 |
| CN102268446B (zh) * | 2010-06-03 | 2013-01-02 | 上海海规生物科技有限公司 | 结核杆菌Ag85ab嵌合基因疫苗、其制备方法及应用 |
| CN101891825B (zh) * | 2010-07-15 | 2015-01-07 | 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 | 乙肝核心蛋白与结核抗原或抗原片段的重组融合蛋白及用途 |
| JP6605480B2 (ja) * | 2014-01-09 | 2019-11-13 | トランスジェン・ソシエテ・アノニム | ヘテロオリゴマーマイコバクテリア抗原の融合物 |
| CN104313127B (zh) * | 2014-09-02 | 2016-05-18 | 哈尔滨医科大学 | 一种用于快速特异检测结核杆菌感染的试剂盒及其用途 |
| CN104689343A (zh) * | 2015-03-27 | 2015-06-10 | 中国人民解放军第四五八医院 | 治疗性结核分枝杆菌dna疫苗及其制备方法与应用 |
| CN105087616B (zh) * | 2015-09-10 | 2018-10-02 | 河北师范大学 | 一种猪肺炎支原体的融合基因及其制备方法 |
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Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1736490A (zh) * | 2004-11-19 | 2006-02-22 | 李忠明 | 结核杆菌嵌合基因疫苗及其制备方法 |
-
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1736490A (zh) * | 2004-11-19 | 2006-02-22 | 李忠明 | 结核杆菌嵌合基因疫苗及其制备方法 |
Non-Patent Citations (4)
| Title |
|---|
| Fan Xiong-lin,等.Cloning and expression of the fusion protein of interleukin-2 and ESAT6 in Mycobac terium bovis Bacillus Calmette Guérin strain.Chin Med J.2005,118(9),762－765. * |
| 刘焰,等.结核杆菌Ag85B与ESAT_6双顺反子真核表达质粒的构建及体外表达.免疫学杂志.2005,21(1),33-36. * |
| 谢勇恩，等.结核杆菌Ag85A及ESAT_6双价抗原融合表达载体的构建及其在大肠杆菌中的高效.中国人兽共患病杂志.2002,18(2),28－31. * |
| 陈峻崧,等.结核杆菌Ag85A和mGM_CSF共同表达载体的构建与CTL活性的诱导.现代免疫学.2004,24(5),399-403. * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106755107A (zh) * | 2016-11-22 | 2017-05-31 | 上海健信生物医药科技有限公司 | 一种car新分子及其在肿瘤治疗中的应用 |
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