CN104689343A - 治疗性结核分枝杆菌dna疫苗及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及生物技术和DNA疫苗领域，具体提供一种治疗性结核分枝杆菌DNA疫苗、及其制备方法及与应用。治疗性结核分枝杆菌DNA疫苗(简称TB DNA疫苗)为含有编码外源免疫保护性抗原蛋白Ag85a-ESAT6的融合基因表达载体，其由5’端带有人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)信号肽的Ag85a-ESAT6融合基因插入pVAX1载体后得到。所述信号肽能够提高抗原蛋白的分泌，增强其免疫效果。本发明利用基因重组技术构建包含多个免疫保护性抗原的融合基因结核分枝杆菌DNA疫苗，通过在体电脉冲技术(in vivo electroporation,EP)将DNA疫苗注射小鼠双侧胫前肌，可诱导针对结核抗原分泌高水平IFNγ的Th1型免疫应答和特异性杀伤应答，是一种可预防和治疗结核病的疫苗。

Description

治疗性结核分枝杆菌DNA疫苗及其制备方法与应用

技术领域

本发明涉及DNA疫苗领域，具体地说，涉及一种治疗性结核分枝杆菌DNA疫苗及其制备方法与应用。

背景技术

结核病是一种由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的严重危害人类健康的传染性疾病。卡介苗(BacilleCalmette Guerin,BCG)是目前唯一上市用于预防结核病的疫苗，自1921年发现以来一直受到人们的关注，主要应用于儿童期结核病的预防。但是，卡介苗的保护效率随时间的推移而逐渐降低，而且对于不同地区，不同人群，其保护率从0到80％不等。研究表明，目前正在使用的卡介苗菌株都缺乏在致病结核杆菌和牛型结核分枝杆菌中存在的编码某些有保护性免疫效应的DNA片段。WHO已于1995年宣布BCG不是预防结核病的有效疫苗。

20世纪40年代后，多种抗结核药物(异烟肼、链霉素、利福平、乙氨丁醇等)相继出现，给结核病的治疗带来曙光。但是，服用这些药物具有较多副作用，并且长期服用会导致结核分枝杆菌出现耐药突变，使抗结核药物的治疗效果大大降低。此外，伴随人类免疫缺陷病毒(HIV)合并结核病，以及移民等社会问题的出现，使结核病疫情“死灰复燃”。据世界卫生组织(World Health Organization,WHO)2014年TB报告，全球每年大约有900万新增结核病患者，150万人死于结核病，其中36万人同时感染HIV；我国是仅次于印度的结核病第二大流行国家，年发病人数达120万。鉴于结核病发生的严重态势，加强结核病的防治工作，探索结核病的早期诊断及研发有效预防和治疗结核病的生物制剂，已成为当前全球关注的课题。

目前国内外结核病疫苗的研究进展主要在预防儿童、成人感染结核；预防潜伏期结核向活动性结核的发展；以及施行BCG初免-蛋白加强的策略；同时也注意到研究结核病治疗性核酸疫苗(nucleic acidvaccine)的紧迫性。目前研究的结核病疫苗主要有重组卡介苗、蛋白多肽疫苗、活载体疫苗和核酸疫苗等，已经有几种重组疫苗产品进入了临床试验阶段。其中核酸DNA疫苗是世界瞩目的防治传染病的研究新热点。与传统疫苗相比，DNA疫苗有诸多优点，尤其是它可诱导特异性CTL反应，使其在抗细胞内感染中独具优势。它将编码外源性抗原蛋白的基因表达载体直接导入机体，通过宿主细胞摄取外源DNA，进入核内进行转录，然后在胞质中翻译，翻译产物进一步与MHC-I类分子结合，提呈至细胞表面，被CD8⁺T细胞识别，产生较强的CTL细胞免疫反应。同时，有一部分短肽可进入溶酶体/核内体与MHC-II类分子结合，被CD4⁺T细胞识别，产生CD4⁺T细胞介导体液免疫应答。CD4⁺T细胞介导的免疫应答偏向Th1，产生高水平的IFN-γ，并刺激产生IgG2同种型抗体，有效杀死寄生于巨噬细胞内的结核菌。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型的治疗性结核分枝杆菌DNA疫苗及其制备方法与应用。

为了实现本发明目的，本发明首先提供一种治疗性结核分枝杆菌DNA疫苗，所述DNA疫苗由5’端带有人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)信号肽的Ag85a-ESAT6融合基因插入pVAX1载体后得到。

进一步地，所述Ag85a-ESAT6融合基因的核苷酸序列如Seq IDNo.1所示。

进一步地，所述信号肽的核苷酸序列为：

5’-GGGCTGCAGAGCCTGCTGCTCTTGGGCACTGTGGCCTGCAGCATCTCT-3’。

进一步地，所述Ag85a-ESAT6融合基因由Ag85a基因和ESAT6基因通过linker序列连接，所述Linker的核苷酸序列为：

5’-ACACGAACCCCCGCCTCCTGACCC-3’。

进一步地，带有信号肽的Ag85a-ESAT6融合基因插入载体pVAX1的启动子pCMV下游，并在融合基因起始处引入KOZAK序列，其氨基酸序列为：ANNATGG。

进一步地，所述融合基因利用内切酶BamHI和XbaI通过双酶切插入载体。

本发明还提供了一种治疗性结核分枝杆菌DNA疫苗的制备方法，所述方法包括如下步骤：

1)提取结核分枝杆菌标准株H37Rv的总DNA作为模板，利用引物85a-F1/85a-R1和ESAT6-F1/ESAT6-R1分别扩增得到结核分枝杆菌Ag85a和ESAT6的编码基因；构建含人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子信号肽的Ag85a和ESAT6重组质粒；

所述信号肽的核苷酸序列为：

5’-GGGCTGCAGAGCCTGCTGCTCTTGGGCACTGTGGCCTGCAGCATCTCT-3’。

2)再分别以含信号肽的Ag85a和ESAT6重组质粒为模板，利用引物RH-85a-F1/RH-85a-R1和RH-ESAT6-F1/RH-ESAT6-R1扩增得到带有Linker的Ag85a和ESAT6的DNA片段，所述Linker的核苷酸序列为：5’-ACACGAACCCCCGCCTCCTGACCC-3’；

3)通过重叠PCR方法获得5’端带有信号肽的Ag85a-ESAT6融合基因；

4)利用内切酶BamHI和XbaI将上述带有信号肽的Ag85a-ESAT6融合基因插入pVAX1载体的启动子pCMV下游，得到治疗性结核分枝杆菌DNA疫苗。

其中：

所述步骤1)中引物的核苷酸序列如下：

85a-F1：

5’-CGGGATCCAGGATGGGGCTGCAGAGCCTGCTGCTCTTGGGCACTGTGGCCTGCAGCATCTCTCAGCTTGTTGACAGGGTT-3’；

85a-R1：

5’-GGTCTAGACTAGGCGCCCTGGGGCGC-3’；

ESAT6-F1：

5’-CGGGATCCAGGATGGCAGAGCAGCAGTGGAATTTC-3’；

ESAT6-R1：

5’-GGTCTAGACTACTGCAGCGCGTTGTTCAGC-3’。

所述步骤2)中引物的核苷酸序列如下：

RH-85a-F1：

5’-CGGGATCCAGGATGGGG CTGCAGAG-3’；

RH-85a-R1：

5’-ACACGAACCCCCGCCTCCTGACCCGGCGCCCTGGGGCGC-3’；

RH-ESAT6-F1：

5’-GGGTCAGGAGGCGGGGGTTCGTGTATGACAGAGCAGCAGTGGAATTTC-3’；

RH-ESAT6-R1：

5’-GGTCTAGACTACTGCAGCGCGTTGTTCAGC-3’。

本发明还进一步提供了所述DNA疫苗在制备抗结核病药物中的应用。

本发明的有益效果在于：

本发明提供的治疗性结核分枝杆菌DNA疫苗，一方面，使用细胞因子GM-CSF信号肽，提高抗原蛋白的分泌，增强其免疫效果。另一方面，本发明将两个抗原编码基因融合构建的双基因疫苗能达到用一种载体表达两种不同抗原的目的。在选取两种具有协同增效作用的优势抗原作为融合基因疫苗的抗原最为重要。利用各种结核杆菌保护性抗原的编码核酸(基因)疫苗预防或治疗结核感染的动物实验已有许多成功报道。ESAT6(Early secreted antigenic target 6-kD protein)，是从结核杆菌短期培养滤液中纯化分离出的一种低分子量分泌性蛋白，具有较强的细胞免疫活性，在抗结核感染的免疫记忆应答中起重要作用。ESAT6基因在90％以上非致病性分枝杆菌菌株和BCG中缺乏，也可作为诊断是否感染致病性结核分枝杆菌的特异诊断分子；结核杆菌Ag85复合物是结核分枝杆菌和BCG的主要分泌性蛋白，在结核分枝杆菌H37Rv株中，Ag85约占分泌蛋白的30％，由Ag85A、Ag85B和Ag85C组成，分子量为30KD-32KD。其中Ag85A和Ag85B，是结核杆菌重要的保护性抗原。Ag85a不仅能刺激机体产生体液免疫，还能激发较强Th1型细胞免疫，引起CD8⁺T细胞增殖和IL-2及IFN-γ等细胞因子水平的上升。本发明将Ag85a与ESAT6融合，在编码区前面插入GM-CSF信号肽以提高分泌蛋白表达，在融合区采用韧性linker肽3(GS4)连接，采用美国FDA批准的唯一用于临床试验的DNA疫苗载体pVAX1，利用基因重组技术构建融合基因结核分枝杆菌DNA疫苗，从而为临床提供一种新的结核病治疗手段。

附图说明

图1为Ag85a F1/R1扩增产物电泳图；其中，1为DNA分子量标准DL2000(2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp和100bp，下同)，2为Ag85a的PCR扩增产物，片段大小约为1080bp。

图2为Esat6F1/R1扩增产物电泳图；其中，1为DNA分子量标准DL2000，2和3为ESAT6的PCR扩增产物，片段大小约为220bp。

图3为Ag85a-ESAT6融合基因第一次(左)和第二次PCR(右)产物电泳图；其中，左图中，1为DNA分子量标准DL2000，2和3为ESAT6第一次扩增产物，大小约为240bp；4和5为Ag85a第一次扩增产物，大小约为1100bp；右图中，1为DNA分子量标准DL2000，2和3为ESAT6和Ag85a融合PCR产物，大小约为1300bp。

图4为Ag85a/pVAX1重组质粒酶切鉴定结果；其中，1为DNA分子量标准DL2000，2和3为Ag85a/pVAX1重组质粒鉴定结果，酶切后载体片段大小约为2900bp，目的基因Ag85a大小约为1080bp。

图5为Ag85a-ESAT6融合基因/pVAX1重组质粒酶切鉴定结果；其中，1为DNA分子量标准DL2000，2和3为Ag85a-ESAT6/pVAX1重组质粒鉴定结果，酶切后载体大小约为2900bp，目的基因Ag85a-ESAT6大小约为1300bp。

图6为Western Blot检测结果；其中，1为无质粒转染空白对照组，2为不含信号肽Ag85a-ESAT6融合基因转染组，3为含信号肽Ag85a-ESAT6融合基因转染组。

图7为各组ELISPOT斑点计数结果。

图8为各组ELISPOT斑点直观图；其中a:阴性对照孔；b:PHA阳性对照孔；c:生理盐水组；d:卡介苗；e:Ag85a-ESAT6(10μg)；e:Ag85a-ESAT6(20μg)；e:Ag85a-ESAT6(50μg)。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例均按照常规实验条件，如Sambrook等分子克隆实验手册(Sambrook J&Russell DW,Molecular cloning:a laboratorymanual,2001)，或按照制造厂商说明书建议的条件。

实施例1治疗性结核分枝杆菌DNA疫苗及其制备方法

一、实验材料

1.菌株

E.coli DH5ɑ，为本实验室保存。

结核分枝杆菌株H37Rv标准株，由广州市胸科医院谭守勇教授提供，已于121℃，5分钟高温灭活。

2.真核表达载体

pVAX1购自Invitrogen公司。

3.试剂盒

细菌DNA提取试剂盒(TIANamp Bacteria DNA Kit细菌基因组DNA提取试剂盒，DP302)。

质粒(小量)提取试剂盒(Takara miniBEST Plasmid Purification kitver 4.0,Code No.9760)。

胶回收试剂盒(Takara MinBEST Agarose Gel Extraction kit Ver3.0,D823A)。

4.酶类：pfu DNA聚合酶(天根)、BamHI(Takara)，XbaI(Takara)、T4DNA连接酶(Takara)。

5.一般试剂

琼脂糖、DNA Marker(Takara)、Gelred^TM染料(BIOTIUM)、甘油、Kana抗生素(MDbio.Inc)。

6.培养基、缓冲液

1)LB培养基(1L)

加水至1L，121℃高温灭菌。

2)50×电泳缓冲液

二、实验方法

1.菌株基因组DNA的提取(按试剂盒说明书操作)。

2.引物设计和PCR扩增目的片段

Ag85a和ESAT6的GenBank登录号分别为：AY207395.1、和AF004671.1；

采用真核表达载体pVAX1，根据载体的要求，设计上游引物时加上KOZAK序列，即ANNATGG，-3为A，+4为G，以增强目的基因表达；

85a-F1：5’-CGGGATCCAGGATGGGGCTGCAGAGCCTGCTGCTCTTGGGCACTGTGGCCTGCAGCATCTCTCAGCTTGTTGACAGGGTT-3’

85a-R1：5’-GGTCTAGACTAGGCGCCCTGGGGCGC-3’

Esat6-F1：5’-CGGGATCCAGGATGGCAGAGCAGCAGTGGAATTTC-3’

Esat6-R1：5’-GGTCTAGACTACTGCAGCGCGTTGTTCAGC-3’

上、下游引物5‘端分别引入BamHI和XbaI酶切位点(下划线)。上游引物还引入人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)信号肽，以增强分泌性蛋白表达。引物均由上海生工生物公司合成。

3.PCR扩增目的片段

1)PCR反应体系(25μl)

2)PCR扩增程序：95℃5min；(95℃50s，55℃50s，72℃60s)×30个循环；72℃5min。

4.琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果及产物回收

1)用1×TAE缓冲液配制1％的琼脂糖凝胶。

2)向25μl PCR产物加入5μl的6×上样缓冲液，混匀后，全部加入凝胶上样孔内。100V电泳约30-40min。

3)紫外分析检测，拍照，并切下目的片段。

4)切下含目的DNA的琼脂糖凝胶块放入1.5ml离心管中，按Takara胶回收试剂盒的说明书操作，回收目的片段DNA。

5.含空载体pVAX1的菌株复苏扩增及提取质粒

1)按0.1％的比例取保存的菌株加入LB液体培养基中，37℃恒温振荡培养箱中过夜培养。

2)按质粒提取试剂盒的说明书操作，提取质粒。

6.双酶切和连接

用BamHI和XbaI在37℃水浴双酶切目的片段和pVAX1，酶切4h后琼脂糖电泳鉴定并回收片段。

Takara双酶切体系(30μl)：

取上述酶切回收的pVAX1片段和目的基因片段，按下述方法4℃过夜连接：

Takara连接体系(15μl)：

7.感受态细胞制备及转化

I.感受态细胞的制备

1)取菌液划于不含Kana的LB培养板上，置37℃培养箱过夜，次日观察。

2)从平板上挑取单克隆接种于5ml LB培养液中，37℃震荡培养过夜，次晨按2％转接于LB培养瓶(100ml)，继续振荡。

3)待培养菌液OD600＝0.4左右(约2h)，停止培养，在无菌条件下将细菌转移至无菌的50ml离心管中，冰上放置10min，使培养液冷却。

4)4℃4000rpm离心10min。

5)倒出上清，将管倒置1min使最后残留的痕量培养液流尽。

6)以10ml冰预冷的0.1mol/L CaCl2重悬菌体。

7)同步骤4)。

8)同步骤5)。

9)以2ml冰预冷的0.1M CaCl2重悬细菌沉淀，加甘油至15％。

10)按每管200μl分装，于-70℃保存。

II.宿主菌的转化

1)将质粒产物5μl加入200μl感受态细胞DH5α中，轻轻混匀，在冰上放置30min。同时另设空白对照管(5μl H2O)、阴性对照管(酶切后载体)和阳性对照管(酶切前载体)。

2)将反应管置于42℃水浴中90s，不摇动反应管。

3)快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1-2min。

4)每管加800μl LB，37℃水浴预温后，将管转移到37℃摇床上，温育45min使细菌复苏，并且表达质粒编码的抗生素抗性标记基因。

5)4000rpm离心1min，弃掉上清，保留150μl，轻弹悬浮菌体，取全部菌液涂布于含100μg/ml Kana的LB平板上，用一无菌的弯头玻棒轻轻地在琼脂平板上表面涂匀。

6)将平板置于37℃培养箱过夜培养16h。

7)第二天挑取单克隆，菌液培养，提取质粒，然后进行酶切鉴定和测序验证。

8)鉴定正确的细菌用15％甘油，-80℃保存。

8.含Ag85a-ESAT6融合基因的构建

融合基因的构建除使用重叠引物PCR扩增出目的片段外，其余步骤与以上方法相同。融合基因以AGSGGGGS这一韧性连接肽连接，核苷酸序列为5′-ACACGAACCCCCGCCTCCTGACCC-3′。

引物设计如下：

RH-85a-F1：5’-CGGGATCCAGGATGGGGCTGCAGAG-3’

RH-85a-R1：5’-ACACGAACCCCCGCCTCCTGACCCGGCGCCCTGGGGCGC-3’

RH-ESAT6-F1：5’-GGGTCAGGAGGCGGGGGTTCGTGTATGACAGAGCAGCAGTGGAATTTC-3’

RH-ESAT6-R1：同ESAT6-R1。

重叠引物PCR包括两步PCR，第一次PCR，以RH-85a-F1和RH-85a-R1，以及RH-ESAT6-F1和RH-ESAT6-R1为引物，以构建的含信号肽Ag85a和ESAT6重组质粒为模板进行PCR分别扩增出含Linker序列的Ag85a和ESAT6片段。琼脂糖电泳鉴定并切胶回收目的片段DNA。

第二次PCR，以上述回收片段DNA为模板，以RH-85a-F1和RH-ESAT6-R1为引物，分别扩增出含信号肽Ag85a-ESAT6融合基因。

第一次PCR反应体系(25μl)：

PCR扩增程序：95℃5min；(95℃50s，55℃50s，72℃60s)×30个循环；72℃5min。

第二次PCR反应体系(25μl)：

PCR扩增程序：95℃5min；(95℃30s，55℃30s，72℃60s)×30个循环；72℃5min。

三、实验结果

1.PCR产物经琼脂糖凝胶电泳后可见有明显的目的条带。其中Ag85a F1/R1的扩增产物大小约为1100bp；Esat6F1/R1的约为200bp；Ag85a-Esat6融合产物约为1300bp(见图1-3)。

2.重组质粒经酶切和琼脂糖凝胶电泳后均可见有两条目的带。其中重组质粒Ag85a可见2981bp和1077bp两条带；重组质粒Ag85a-Esat6可见2981bp和1309bp两条带。经酶切和测序验证，成功构建重组质粒Ag85a-ESAT6。(图4、图5)

实施例2治疗性TB DNA疫苗的细胞转染和Western Blot检测

一、实验材料

1)RPMI 1640培养基(Hyclone)

2)10％胎牛血清：将10％胎牛血清按1:10的体积比加入1)中已配好的1640培养基中。胎牛血清购自Hyclone公司。

3)0.25％胰酶：Asanced Technology&Industrial company。

4)细胞株：非洲绿猴肾细胞COS-7，购自中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所。

8.Lipofectamine^TM2000转染试剂，购自广州英韦创津生物科技有限公司。

二、实验方法

1、细胞转染实验

1)接种细胞

于转染前1天取生长良好的COS-7细胞，用胰酶进行消化，离心1000r/min，5min，计数，取6孔培养板，每孔接种细胞3×10⁵个，将细胞悬浮在含10％胎牛血清但不含抗生素的RPMI 1640培养基1.5ml中，于37℃，5％CO₂孵箱培养24h，实验时细胞融合度应达90-95％左右。

2)转染

准备2个0.5ml无菌硅化离心管，分别加入250μl无血清不含抗生素的RPMI 1640培养基，然后在第1管中加入Lipofectamine^TM2000转染试剂10μl；在第2管中加入4μg质粒,并于5min内将上述2管混合制备复合物，室温下孵育20min；吸走6孔板培养液，每孔加含10％胎牛血清但不含抗生素的RPMI 1640培养基1ml，再将复合物加入细胞中，轻轻混匀，于5％CO₂，37℃培养箱中培养48h。同时做不加质粒转染的空白对照组。

3)收集上清与抗原表达测定

48h后吸取上清于1.5ml离心管中以备Western Blot检测使用。

2、Western Blot检测

1)取上述细胞转染上清按常规方法进行SDS-PAGE；

2)电泳结束后，取出凝胶，剪滤纸、PVDF膜和胶同样大小，并将滤纸置于转移缓冲液中浸泡半小时，PVDF膜置甲醇中浸泡10min；

3)按照：滤纸---PVDF膜---胶---滤纸的顺序层叠放好，注意不要有气泡，夹住后，凝胶一侧置负极，通电按0.65mA/cm²，设置电流约为40mA，转移过夜；

4)次日取出膜用TBS-T漂洗三次，每次10min(胶用考马斯亮蓝染色)；

5)加入封闭液(3％的BSA的TBS-T)，37℃封闭1h，TBS-T洗三次；

6)加一抗(mouse anti TB Ag85，按1：500稀释)，37℃温浴1小时；

7)取出PVDF膜，TBS-T漂洗三次，每次10min；

8)加入二抗(1：500稀释)，37℃1小时，取出PVDF膜，TBS-T漂洗三次，每次10min；

9)配置化学发光法显色液：将两种显色底物1:1等体积混合；

10)显影和定影；

11)干燥拍片。

三、实验结果

未转染细胞对照组未检测到目的产物，实验组均有清晰特异性的目的条带，目的蛋白Ag85a分子大小约为30KDa。其中含信号肽融合基因转染组目的蛋白条带明显比不含信号肽融合基因转染组目的蛋白条带深，说明信号肽提高分泌蛋白的量。(图6)

实施例3治疗性结核分枝杆菌DNA疫苗的小鼠体内免疫试验

1、实验材料

动物免疫剂量、分组及观察时间：SPF级健康Balb/c小鼠50只，18-20g，6-8周龄，随机分为5组，每组10只：第一组注射生理盐水；第二组采用背部皮下注射“卡介苗”；第三～五组采用在体电脉冲小鼠双侧胫前肌注射不同剂量Ag85a-ESAT6融合基因疫苗实验组，分别为10μg/只、20μg/只、50μg/只。每2周免疫一次，共免疫3次。卡介苗组仅注射一次。

实验中所用Ag85a抗原购自Prospec公司；ELISPOT检测试剂盒购自美国BD Pharmingen公司；淋巴细胞分离液购自Thermo公司。

2、动物免疫

(1)取准备接种的小鼠，称重，用75％乙醇消毒腹部后，腹腔注射戊巴比妥钠(75mg/kg)麻醉小鼠；

(2)双侧胫前肌部剃毛，75％乙醇消毒，用1ml注射器吸取实施例1所制备的治疗性TB DNA疫苗，安装好4#针头及定位胶套并排除空气；

(3)于双侧胫前肌内注射疫苗，注射剂量为20μg/每鼠，注射后停留10秒拔出针头，阳性对照组小鼠，于背部皮下注射卡介苗1×10⁵CFU即可；

(4)立即将电转染仪的针式电极插入肌肉注射孔，电极针插入肌肉10秒后放电，电场强度为60v/cm，共放电6次，然后拔出电极，密切观察小鼠情况，至小鼠麻醉复苏。

(5)初次接种后第14和28天，以同样方法及剂量增强免疫各组小鼠1次，并于初次免疫后第42天，每组采血用ELISA法测血清中抗-Ag85a水平，再处死动物取脾脏淋巴细胞作ELISPOT检测。

3、体液免疫ELISA，测定小鼠血清抗Ag85抗体不同亚型(lgG、lgG1、lgG2a)的平均滴度

采集小鼠血清，以3,000r/min离心10min，取上层血清用于抗-Ag85a血清水平的抗体检测。

①包被：用0.05M碳酸盐包被缓冲液(pH9.6)将已知抗原稀释至1-10μg/ml，在酶标板每孔加0.1ml，4℃过夜。次日，弃去孔内溶液，用洗涤缓冲液注满各孔，静置30-60s，甩干，重复5次后，在干净的吸水纸上拍干。

②封闭：每孔加入0.1mL封闭液，37℃静置1-2h。洗涤。

③加样：加一定稀释的实验组待检样品(从100～6400，2倍梯度稀释)0.1ml于上述已包被之反应孔中，置于37℃孵育1h，洗涤。同时做空白孔、生理盐水阴性孔。

④加酶标抗体：加入新鲜稀释的HRP酶标第二抗体0.1ml，手工轻轻震荡10s，37℃孵育30-60min，洗涤,最后一遍用双蒸水洗涤。

⑤加底物液显色：洗涤结束后立即于各反应孔中加入显色剂A、显色剂B各50μl，混匀。用手轻轻震荡10s，于37℃放置10-30min。

⑥终止反应：于各反应孔中加入50μl终止液，震荡反应5s，使之充分混匀。

⑦酶标仪检测OD450值，计算抗Ag85抗体lgG、lgG1和lgG2a的平均滴度，以及计算IgG2a/IgG1比例以判断主要诱导哪种免疫。

4、细胞免疫ELISPOT检测

小鼠脾脏淋巴细胞准备：

①颈椎脱臼法处死小鼠，置盛有75％乙醇的烧杯中，使小鼠体毛完全润湿约3分钟以上，然后切开小鼠腹腔，取出脾脏；

②将分离的脾脏放于无菌烧杯的200目筛网上(有培养液滴)，用研磨棒(可用玻璃注射器内芯代)轻轻捻碎脾组织，研磨挤压出脾细胞，取5ml无血清1640培养液缓缓冲下细胞至烧杯中；

③将5ml脾细胞悬液缓慢加入装有2.5ml淋巴细胞分离液的离心管中，2000-2500r/min离心20min，收集分离淋巴细胞后，离心洗涤细胞2次，每次1500r/min离心6min；

④重悬脾淋巴细胞，台盼兰染色计数，调整细胞密度至3×10⁵/ml，37℃5％CO₂培养箱中培养。

ELISPOT检测：

①准备好刺激抗原(Ag85a)，用5％FBS-1640配制为15μg/ml。

②加样：依次加100μl(3×10⁵/孔)效应细胞和刺激抗原100μl入样品孔，对照孔中加完全培养基(不加抗原)，置37℃，5％CO₂，孵育24h。每个样品设计3个复孔。同时做空白孔、生理盐水阴性孔。

③洗板：用去离子水洗两遍，每遍浸孔3-5min，再用PBS-T洗板三遍。

④用Assay Diluent稀释生物素标记的抗小鼠IFN-γ抗体至2.0μg/ml，以100μl/孔加入96孔板中，盖好盖板，置室温2h。洗板：用PBST洗板3次，每次浸孔1-2min。用Assay Diluent稀释亲和素-HRP至5.0μg/ml，以100μl/孔加入96孔板中，盖好盖板，置室温1h。

⑤洗板：弃去亲和素-HRP，用PBST洗板4次，再用PBS洗板2次。

⑥取AEC 200μl加入到10ml底物缓冲液中混匀。100μl/孔加入，室温避光置5-60min，观察斑点形成。

⑦终止反应，用去离子水冲洗终止反应。

⑧室温干燥96孔Minipore multiscreen反应板，用酶联斑点成像系统(Champ Spot II)计斑点数目。

5、实验结果

(1)ELISA半定量测定结果

阳性判断标准：当阴性对照孔>0.05时，所得结果的吸光度>(阴性对照孔×2.1)，则说明为阳性；当阴性对照孔<0.05时，所得结果的吸光度>0.105，则说明为阳性。由结果可知，Ag85a-Esat6质粒三个注射量阳性率均为100％。由表1可知，当质粒注射量为20μg/只时效果最佳，小鼠血清特异性抗Ag85a的IgG抗体平均滴度GMT达1600±876，与卡介苗组比较具有显著性差异(p＜0.05)。由表2可知，Ag85a-Esat6质粒产生小鼠血清特异性抗Ag85a抗体亚型IgG2a/IgG1＞1，表明主要诱导Th1型免疫应答。

表1 ELISA测定IgG抗体平均滴度GMT结果

盐水组IgG的GMT均小于100；*p＜0.05

表2 ELISA测定抗体不同亚型的平均滴度GMT结果

盐水组IgG1，IgG2a的GMT均小于100；*p＜0.05

(2)ELISPOT测定结果

ELISPOT检测中，抗原刺激组的点数-无抗原刺激组的点数>5，抗原刺激组的点数/无抗原刺激组的点数>2，判定实验样品的细胞免疫为阳性答应。由结果可知，Ag85a-Esat6质粒三个注射量阳性率均为100％。当注射量为20μg/只时效果最佳，与卡介苗比较具有显著性差异(p＜0.05)。见表3、图7和图8。

表3 ELISPOT测定结果

有刺激组-无刺激组斑点数

阳性率％

卡介苗	95.1±12.8	100
			生理盐水	1.7±1.5	0
Ag85a-Esat6(10μg)	106.8±20.0	100
			Ag85a-Esat6(20μg)	302.9±19.5*	100
Ag85a-Esat6(50μg)	218.9±14.2	100

*P＜0.05

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

参考文献

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[7]Douglas B lowrie.Tuberculosis vaccine research in China.Emerging Microbs and Infections.2012,1,e7；doi:10.1038.

Claims (10)

1.一种治疗性结核分枝杆菌DNA疫苗，其特征在于，所述DNA疫苗由5’端带有人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子信号肽的Ag85a-ESAT6融合基因插入pVAX1载体后得到。

2.根据权利要求1所述的DNA疫苗，其特征在于，

所述Ag85a-ESAT6融合基因的核苷酸序列如Seq ID No.1所示。

3.根据权利要求1或2所述的DNA疫苗，其特征在于，所述信号肽的核苷酸序列为：

5’-GGGCTGCAGAGCCTGCTGCTCTTGGGCACTGTGGCCTGCAGCATCTCT-3’。

4.根据权利要求3所述的DNA疫苗，其特征在于，所述Ag85a-ESAT6融合基因由Ag85a基因和ESAT6基因通过linker序列连接，所述Linker的核苷酸序列为：

5’-ACACGAACCCCCGCCTCCTGACCC-3’。

5.根据权利要求4所述的DNA疫苗，其特征在于，带有信号肽的Ag85a-ESAT6融合基因插入载体pVAX1的启动子pCMV下游，并在融合基因起始处引入KOZAK序列，其氨基酸序列为：ANNATGG。

6.根据权利要求5所述的DNA疫苗，其特征在于，所述融合基因利用内切酶BamHI和XbaI通过双酶切插入载体。

7.一种治疗性结核分枝杆菌DNA疫苗的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

1)提取结核分枝杆菌标准株H37Rv的总DNA作为模板，利用引物85a-F1/85a-R1和ESAT6-F1/ESAT6-R1分别扩增得到结核分枝杆菌Ag85a和ESAT6的编码基因；构建含人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子信号肽的Ag85a和ESAT6重组质粒；

所述信号肽的核苷酸序列为：

5’-GGGCTGCAGAGCCTGCTGCTCTTGGGCACTGTGGCCTGCAGCATCTCT-3’。

2)再分别以含信号肽的Ag85a和ESAT6重组质粒为模板，利用引物RH-85a-F1/RH-85a-R1和RH-ESAT6-F1/RH-ESAT6-R1扩增得到带有Linker的Ag85a和ESAT6的DNA片段，所述Linker的核苷酸序列为：5’-ACACGAACCCCCGCCTCCTGACCC-3’；

3)通过重叠PCR方法获得5’端带有信号肽的Ag85a-ESAT6融合基因；

4)利用内切酶BamHI和XbaI将上述带有信号肽的Ag85a-ESAT6融合基因插入pVAX1载体的启动子pCMV下游，得到治疗性结核分枝杆菌DNA疫苗。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中引物的核苷酸序列如下：

85a-F1：

5’-CGGGATCCAGGATGGGGCTGCAGAGCCTGCTGCTCTTGGGCACTGTGGCCTGCAGCATCTCTCAGCTTGTTGACAGGGTT-3’；

85a-R1：

5’-GGTCTAGACTAGGCGCCCTGGGGCGC-3’；

ESAT6-F1：

5’-CGGGATCCAGGATGGCAGAGCAGCAGTGGAATTTC-3’；

ESAT6-R1：

5’-GGTCTAGACTACTGCAGCGCGTTGTTCAGC-3’。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤2)中引物的核苷酸序列如下：

RH-85a-F1：

5’-CGGGATCCAGGATGGGG CTGCAGAG-3’；

RH-85a-R1：

5’-ACACGAACCCCCGCCTCCTGACCCGGCGCCCTGGGGCGC-3’；

RH-ESAT6-F1：

5’-GGGTCAGGAGGCGGGGGTTCGTGTATGACAGAGCAGCAGTGGAATTTC-3’；

RH-ESAT6-R1：

5’-GGTCTAGACTACTGCAGCGCGTTGTTCAGC-3’。

10.权利要求1-6任一项所述的DNA疫苗在制备抗结核病药物中的应用。