CN103260644A

CN103260644A - 含有狂犬病毒抗原的副痘病毒载体

Info

Publication number: CN103260644A
Application number: CN2011800357117A
Authority: CN
Inventors: O.M.马蒂诺; N.K.D.雷迪
Original assignee: Pfizer Inc
Current assignee: Zoetis Services LLC
Priority date: 2010-05-21
Filing date: 2011-04-27
Publication date: 2013-08-21
Also published as: AR081409A1; US20110287051A1; RU2012149036A; RU2545694C2; ZA201208264B; EP2571521A1; MX2012013451A; CO6670515A2; CA2798055A1; BR112012029633A8; CL2012003219A1; CA2798055C; UY33400A; AU2011254315B2; AU2011254315A1; KR20130008645A; WO2011145013A1; JP5890399B2; NZ603431A; BR112012029633A2

Abstract

本发明涉及在其基因组中包含源自狂犬病毒的异源性DNA的重组副痘病毒，还涉及此类构建体的制备，以及其在免疫原性组合物和疫苗中的应用。本发明还涉及重组副痘病毒在诊断学中的应用。

Description

含有狂犬病毒抗原的副痘病毒载体

技术领域

本发明涉及含有源自狂犬病毒(RV)的异源性DNA的重组副痘病毒及其在免疫原性组合物和疫苗中的应用。本发明还涉及用于针对由狂犬病毒造成的疾病进行疫苗接种、治疗或预防的方法。本发明还涉及重组副痘病毒在诊断学中的应用。

背景技术

痘病毒科病毒是卵形的极大的双链DNA病毒。副痘病毒属(PPV)包含于此类病毒中。其尺寸为约220nm~300nm长、140nm~170nm宽。它们拥有使其与其它痘病毒区分开的独特螺旋衣壳。

PPV被分为三种不同的种。然而，仍然还未弄清这些病毒是副痘病毒属中的自主性物种还是它们为相同的物种。第一种物种，绵羊副痘病毒(Parapoxvirus ovis)被认为是该病毒属的原型。其也被称作羊痘疮病毒(ecthyma contagiosum virus)、传染性化脓性皮炎病毒或orf病毒。第二种物种，牛副痘病毒1(Parapoxvirus bovis1)被称作牛丘疹性口炎病毒或水泡性口炎病毒。第三种物种，牛副痘病毒2也称为乳房痘病毒(udderpoxvirus)、副痘苗病毒、假牛痘病毒或挤奶工结节病毒。

副痘病毒物种在反刍动物中流行。已在马鹿、驯鹿、红松鼠和斑海豹中发现了PPV。受PPV感染可能会导致动物和人的局部疾病。PPV物种的动物传染病宿主是绵羊、山羊和牛。其通过与受感染动物的直接接触导致人的感染，并与未经结痂而愈合的局部性表皮损伤起作用。如疫苗等预防性措施可以用于控制这类疾病。

此前已经描述了基于禽痘病毒、浣熊痘病毒、羊痘病毒、猪痘病毒或牛痘病毒的用于表达外来遗传信息的载体(参见US5,942,235和US7,094,412)。副痘病毒代表了可以用在载体疫苗中的不同候选物。然而，由于痘病毒各个属之间的形态学、结构和遗传学差异，用于这些痘病毒的方法不能用于副痘病毒。这种差异的一个实例是ORFV缺失胸苷激酶(TK)基因，后者用于选择不同正痘病毒中的重组物。此外，某些痘病毒能够借由表面蛋白(血凝素)而粘着红细胞，而副痘病毒不能。

PPV可具有免疫调节效应，因为其刺激脊椎动物中的广义(非特异性)免疫反应。其已被成功用于兽医药物中以增加动物的一般抵抗力。可将其与同源性和/或异源性抗原组合，以提供具有持续数月至数年的病原体特异性效应以及快速非病原体特异性效应的疫苗。

绵羊副痘病毒此前已被用作载体，如美国专利6,365,393和Rziha等，2000,J.Biotechnol.,83,137-145所述。其在用作载体时提供了显著的优点，包括极窄的宿主范围、不存在系统感染、短期载体特异性免疫(允许重复免疫)、早期接种(免疫的诱导可以在存在母体抗体时启动)以及有益的免疫调节性质。本发明涉及使用副痘病毒作为用于源自狂犬病毒的异源性DNA的载体。

绵羊副痘病毒毒株D1701是高减毒毒株，其可在细胞培养物中以与野生型病毒相当的滴度进行繁殖。其在支持感染性载体病毒的宿主(例如，绵羊和山羊)和对此不支持的宿主(例如，狗、猪、马、小鼠和大鼠)中均具有优异的免疫刺激性质。(此前称为

)是源自菌株D1701的化学失活的绵羊副痘病毒的制备物，其用于对传染病的预防、后期预防(metaphylaxis)和愈疗性治疗和防止动物中由应激诱导的疾病。

狂犬病毒(RV)(嗜神经狂犬病病毒(Neurotropic lyssavirus))是弹状病毒科的成员。它是嗜神经病毒，在任何其它哺乳动物中导致致命性疾病。狂犬病最常见是通过患狂犬病动物咬伤而传播，而传播经由动物的唾液发生。每年报告至美国疾病控制与预防中心(CDC)的大多数狂犬病案例发生在野生动物中，如浣熊、臭鼬、蝙蝠和狐狸。狂犬病仍然是高度流行的疾病，尤其是在发展中国家。每年约有50,000人死于狂犬病。对于人最高的感染风险是来自患狂犬病的狗。

狂犬病毒是单链的反义RNA病毒，其编码5种蛋白：核蛋白(N)、磷蛋白(P)、基质蛋白(M)、糖蛋白(G)和聚合酶(L)。成熟的弹形蛋白平均具有约180nm的长度和75nm的宽度，具有核糖核蛋白核心、蛋白衣壳和脂质包膜。糖蛋白突出体覆盖了该病毒外表面，所述突出体长约5nm~10nm且直径为约3nm。其形成约400个三聚体式紧密排列的尖刺体。

RV具有对神经组织的高亲和力。其原因尚未知晓。然而，可能是由于狂犬病毒G蛋白能结合乙酰胆碱受体(神经传递质受体)。在RV经由病毒G蛋白附着于宿主细胞后，病毒被细胞通过吞噬而吸收。

发明内容

本发明一般性涉及重组副痘病毒，特别是绵羊副痘病毒(PPVO)。重组副痘病毒用于介导快速先天免疫应答，以及针对狂犬病毒的长期持续性外来基因特异性免疫。在一个实施方式中，重组副痘病毒包含源自狂犬病毒的异源性DNA。在一个实施方式中，重组副痘病毒包含绵羊副痘病毒毒株D1701。在一个实施方式中，重组副痘病毒包含绵羊副痘病毒毒株D1701-V。

在一个实施方式中，重组副痘病毒包含编码狂犬病毒的G蛋白的基因或其片段。在一个实施方式中，重组副痘病毒包含SEQ ID NO:4或具有与SEQ ID NO:4至少98%同一性的多核苷酸分子。在一个实施方式中，异源性DNA被插入到绵羊副痘病毒毒株D1701的HindIII片段H/H中。在另一个实施方式中，异源性DNA被插入到绵羊副痘病毒毒株D1701的HindIII片段H/H内的VEGF编码序列或相邻的非编码序列中。在再一个实施方式中，重组副痘病毒是绵羊副痘病毒D1701-V-RabG。

本发明涵盖了重组副痘病毒的制备方法，其包括将异源性DNA插入副痘病毒的基因组。在一个实施方式中，所述方法包括使用绵羊副痘病毒。在一个实施方式中，所述方法包括使用绵羊副痘病毒毒株D1701。在一个实施方式中，所述方法包括使用绵羊副痘病毒毒株D1701-V。在一个实施方式中，该方法中所用异源性DNA包含编码狂犬病毒的G蛋白的基因或其片段。在一个实施方式中，该方法中所用异源性DNA包含SEQ ID NO:4或具有与SEQ ID NO:4至少98%同一性的多核苷酸分子。在该方法的一个实施方式中，异源性DNA被插入到绵羊副痘病毒毒株D1701的HindIII片段H/H中。在另一个实施方式中，异源性DNA被插入到绵羊副痘病毒毒株D1701的HindIII片段H/H内的VEGF编码序列或相邻的非编码序列中。在一个实施方式中，所述方法包括绵羊副痘病毒D1701-V-RabG的制备。

本发明涵盖了包含重组副痘病毒和载剂的免疫原性组合物，所述重组副痘病毒包含源自狂犬病毒的异源性DNA。本发明涵盖了制备免疫原性组合物的方法，所述方法包括将包含源自狂犬病毒的异源性DNA的重组副痘病毒与载剂组合。本发明还涵盖了包含重组副痘病毒和载剂的疫苗，所述重组副痘病毒包含源自狂犬病毒的异源性DNA。本发明还涵盖了制备疫苗的方法，其包括将包含源自狂犬病毒的异源性DNA的重组副痘病毒与载剂组合。在这些实施方式的某一些中，重组副痘病毒包含绵羊副痘病毒，而在某些实施方式中重组副痘病毒包含绵羊副痘病毒毒株D1701，且在其它实施方式中重组副痘病毒包含绵羊副痘病毒毒株D1701-V。在这些实施方式的某一些中，异源性DNA包含编码狂犬病毒的G蛋白的基因或其片段，而在其它实施方式中，异源性DNA包含SEQ ID NO:4或具有与SEQ ID NO:4至少98%同一性的多核苷酸分子。在这些实施方式的某一些中，异源性DNA被插入到绵羊副痘病毒毒株D1701的HindIII片段H/H中。在这些实施方式的其它中，异源性DNA被插入到绵羊副痘病毒毒株D1701的HindIII片段H/H内的VEGF编码序列或相邻的非编码序列中。在这些实施方式的某一些中，重组副痘病毒是绵羊副痘病毒D1701-V-RabG。

本发明涵盖了在动物中诱导抵抗狂犬病毒的免疫应答的方法，该方法包括对所述动物施用治疗有效量的包含重组副痘病毒和载剂的疫苗组合物，所述重组副痘病毒包含源自狂犬病毒的异源性DNA。本发明涵盖了包含源自狂犬病毒的异源性DNA的重组副痘病毒在制备用于在动物中诱导抵抗狂犬病毒的免疫应答的药物中的应用。本发明涵盖了包含源自狂犬病毒的异源性DNA的重组副痘病毒在制备用于对动物进行抗狂犬病毒预防接种的药物中的应用。在这些实施方式的某一些中，重组副痘病毒包含绵羊副痘病毒，而在某些实施方式中重组副痘病毒包含绵羊副痘病毒毒株D1701，且在其它实施方式中重组副痘病毒包含绵羊副痘病毒毒株D1701-V。在这些实施方式的某一些中，异源性DNA包含编码狂犬病毒的G蛋白的基因或其片段，而在其它实施方式中，异源性DNA包含SEQ ID NO:4或具有与SEQ ID NO:4至少98%同一性的多核苷酸分子。在这些实施方式的某一些中，异源性DNA被插入到绵羊副痘病毒毒株D1701的HindIII片段H/H中。在这些实施方式的其它中，异源性DNA被插入绵羊副痘病毒毒株D1701的HindIII片段H/H内的VEGF编码序列或相邻的非编码序列中。在这些实施方式的某一些中，重组副痘病毒是绵羊副痘病毒D1701-V-RabG。在这些实施方式的某一些中，诱导了抗G蛋白特异性保护性免疫应答。在其它此类实施方式中，免疫应答是对抗G蛋白血清抗体的诱导。在另一些此类实施方式中，诱导导致抗体滴度超过0.5国际单位/ml。

本发明提供了确定存在于动物中的副痘病毒来源的方法。本文所述副痘病毒可在其基因组组成和所表达的蛋白方面区别于野生型毒株。这种差异使得可以辨别经接种的动物和受感染的动物。本发明涵盖了如本文所教导的重组副痘病毒在用于将受感染动物从经接种的动物分开(DIVA)的测试中的应用。在一个实施方式中，重组绵羊副痘病毒D1701-V-RabG被用在DIVA测试中。

这些实施方式和其它实施方式公开和涵盖于以下详细描述中。

附图说明

通过参考附图可以得到对本发明更好的理解，其中：

图1：质粒pdV-RabG的构建。将狂犬病毒的G基因作为BamHI-EcoRI片段插入pdV-Rec1的多克隆位点(框出的碱基)，产生质粒pdV-RabG(大小为7.7kbp)。显示了引物ORF32N(SEQ ID NO:1)和ORF31N(SEQ ID NO:2)的位置。SEQ ID NO:3显示于图中。

缩写：Sm=SmaI,H3=HindIII,EcoV=EcoRV，P=PstI,B=BamHI,K=KpnI,E=EcoRI,S=SalI。F9L和ORF3表示PPVO基因F9L(ORF131)和ORF3(ORF133)的存在。Pvegf表示用于控制所插入的G基因的表达的vegF-E启动子。(P)和(H3)图示了质粒pSPT-18的载体主链的被破坏的PstI和HindIII限制位点，分别显示出pSPT-18的T7和SP6启动子。该图并非按比例绘制。

图2：在用不同剂量的D1701-V-RabG进行免疫后的病毒中和性血清抗体(SNT)应答。将多组C57/BL6小鼠(每日n=6或7)用使用10⁷PFU(斑块形成单位)(A)、10⁶PFU(B)、10⁵PFU(C)和10⁴PFU(D)的单次剂量的D1701-V-RabG进行免疫。在免疫后的14天期间(d1至d14)每日取得个体的血清。

图3：受免疫小鼠的攻击实验。C57/BL6小鼠如指示接受单次剂量的D1701-V-RabG(10⁷PFU~10⁴PFU)，并在2周后用至少3,400LD₅₀(4.8×10⁵PFU)的RV有毒力菌株CVS对其进行颅内攻击。(A)显示了每组中的个体动物的存活曲线，而(B)中以存活百分比对相同结果作图。

图4：SEQ ID NO:4——狂犬病毒的G基因的全长编码区(1575nt)加上作为用于限制酶分子的连接子序列(BamHI和EcoRI)的5’端的7nt和3’端的6nt的序列。

图5：T细胞对于保护性免疫的作用。CD4-Imm是用对CD4细胞特异的抗血清进行免疫的组。CD8-Imm是用对CD8T细胞特异的抗血清进行免疫的组。CD4/8-Imm是用对CD4/CD8-T细胞特异的抗血清进行免疫的组。Imm C是用D1701-V-RabG预防接种的对照组，其未接受抗血清。Non-Imm C是未用D1701-V-RabG预防接种且未接受抗血清的对照组。“攻击后天数”是用狂犬菌株CVS攻击后的天数。

图6：在接触后预防接种后所观察到的保护。Non-Imm是未用D1701-V-RabG预防接种的对照组。D1701-V-RabG是用D1701-V-RabG预防接种的组。CVS是有毒力的狂犬病毒菌株。“攻击后天数”是用RV菌株CVS攻击后的天数。

图7：采用各种接触后预防接种方案所观察到的保护。灰色方块指示小鼠接受D1701-V-RabG预防接种的天数。

图8：免疫后6天和13天的血清抗体应答(作为血清中和抗体(SNT)确定)。在阴道内(i.vag.)、通过划痕(scarification)、腹膜内(i.p.)、皮内(i.d.)、鼻内(i.n.)、皮下(s.c.)、肌内(i.m.)或静脉内(i.v.)用D1701-V-RabG对小鼠进行免疫。

具体实施方式

除非在本文中另外限定，与本发明相关使用的科技术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。此外，除非在上下文中另外需要，单数术语应包含复数而复数术语应包含单数。

以下定义可适用于本发明的实施方式的描述中所采用的术语。其替代本文中通过援引并入的每篇单独参考文献中所含的任何与之矛盾的定义。

“约”或“大约”在与可测定数值变量结合使用时，是指该变量的指定值以及所有处在该指定值的实验误差内(例如，处在平均值的95%置信区间内)或指定值的10%内(两者中的较大一者)的值，除非“约”用在涉及以周计的时间间隔时，其中“约3周”是指17天至25天，而约2周至约4周是指10天至40天。

本文所用的“佐剂”是指充当免疫应答的非特异性刺激物的任何物质。对佐剂的进一步描述参见下文。

本文所用的术语“动物”或“动物受试对象”包括易受狂犬病感染的任何动物，包括驯化的和野生的哺乳动物。

本文所用的“抗体”是包含抗原结合位点的任何多肽，不论其来源、制备方法或其它特性如何。其指代作为对抗原的免疫应答的结果而与该抗原特异性结合的免疫球蛋白分子或其片段。免疫球蛋白是由具有“恒定”区和“可变”区的“轻”多肽和“重”多肽构成的血清蛋白，且其基于恒定区的组成而被分为各类(例如，IgA、IgD、IgE、IgG和IgM)。对于给定的抗原“特异”的抗体是指抗体的可变区专门地识别和结合特定的抗原。抗体可以为多克隆混合物或单克隆物。抗体可以为源自天然来源或重组来源的无损免疫球蛋白，或可为无损免疫球蛋白的免疫反应性部分。“抗体”可以被转化为抗原结合性蛋白，这包括但不限于抗体片段。

本文所用术语“抗原”或“免疫原”是指含有一个或多个表位(线性和/或构象表位)的分子，所述表位在与受试对象接触时会诱导对于该抗原特异的免疫应答。术语“抗原”可以指代减毒的、失活的或改性的活细菌、病毒、真菌、寄生物或其它微生物。本文所用的术语“抗原”还可以指代亚基抗原，其与该抗原天然关联的整体生物体分离且分开。术语抗原还指如抗独特型抗体或其片段等抗体，也指能模拟抗原或抗原决定物(表位)的合成肽模拟表位。术语“抗原”还可指代在体内表达抗原或抗原决定物的寡核苷酸或多核苷酸，如DNA免疫应用中的那些。

“缓冲物”是指避免另一种化学物质的浓度变化的化学物质体系，例如，质子供体和接受体体系充当避免氢离子浓度(pH)显著变化的缓冲物。缓冲物的另一实例是含有弱酸及其盐(共轭碱)或弱碱及其盐(共轭酸)的混合物的溶液。

本文所用术语“细胞系”或“宿主细胞”是指其中病毒可能复制或被维持的原核细胞或真核细胞。

“细胞免疫应答”或“细胞介导的免疫应答”是由T淋巴细胞和/或其它白细胞介导的免疫应答，且包括细胞因子、趋化因子和由活化T细胞和/或白细胞产生的类似分子的产生。

“保守取代”如本领域所定义和本领域技术人员已知，且据认为其根据残基的相关物理性质对它们进行分类。

本文所用的术语“培养物”是指在不存在其它物种或类型存在时生长的细胞或微生物群体。

本文所用术语“DIVA”是指对被感染动物和经疫苗接种的动物的区分。

“剂量”是指给予受试对象的疫苗或免疫原性组合物。“首剂”或“启动疫苗”是指于第0天给予的此类组合物的剂量。“第二剂”或“第三剂”或者“年度剂量”是指继首剂后基于的此类组合物的量，其可以是或不是与首剂相同的疫苗或免疫原性组合物。

“表位”是结合T细胞受体或特定抗体的抗原的特定位点，且通常包含约3个氨基酸残基至约20个氨基酸残基。

“赋形剂”是指疫苗或免疫原性组合物的任何非抗原组分。

“片段”是指蛋白或基因的截短部分。“功能片段”或“生物活性片段”是指保留了全长蛋白或基因的生物学性质的片段。“免疫原性活性片段”是指引发免疫应答的片段。

本文所用术语“G蛋白”是指覆盖狂犬病毒的外表面的糖蛋白突出部中的蛋白。

本文所用术语“异源性”是指源自不同物种或毒株。

本文所用术语“同源性”是指源自相同物种或毒株。

“同源性”或“百分比同源性”是指在经过比对序列并在必要时为获得最大百分比序列同一性而引入空位(gap)后并且还考虑到任何保守取代作为序列同一性的一部分，候选序列中与对比物序列中的残基相同的核苷酸或氨基酸残基的百分比。

“体液免疫应答”是指至少部分地由抗体介导的免疫应答。

“同一性”或“百分比同一性”是指在经过比对两条序列并在必要时为获得最大百分比序列同一性而引入空位后并且不考虑任何保守取代作为序列同一性的一部分，候选序列中与对比物序列中的残基相同的核苷酸或氨基酸的百分比。

受试对象中的“免疫应答”是指响应于抗原的体液免疫应答、细胞免疫应答或体液和细胞免疫应答的发展。免疫原性应答可能足以应对诊断目的或其它测试，或可能足够避免由疾病原感染所导致的疾病(包括其负面健康影响或并发症)的体征或症状。免疫响应通常可以使用本领域中已知的标准免疫测试或中和测试来确定。

本文所用“免疫原性的”或“免疫原性”是指能引发特异性地针对抗原的免疫应答的能力。

本文所用术语“免疫原性组合物”或者“免疫原性有效量”或“可产生免疫应答的有效量”是指在单独或与药物可接受载剂一起施用于动物时能够被免疫系统识别从而导致产生特异性免疫应答(即具有免疫原性活性)的组合物或抗原。

本文所用“分离的”是指单独或以在异源性宿主细胞或染色体或载体(例如，质粒、噬菌体等)中的形式从其天然存在的环境中移走。“分离细菌”、“分离厌氧菌”、“分离细菌菌株”、“分离病毒”和“分离病毒毒株”等是指例如当从其天然存在的环境分离时其中细菌或病毒(例如在培养基中)基本不含其它微生物的组合物。“分离的”在用于描述任何特别定义的物质(例如多核苷酸或多肽)时是指与物质(如多肽或核酸)通常所见于的原始细胞环境分离的物质。因此如本文所用，仅举例而言，用本发明的多核苷酸构建的重组细胞系利用了“分离的”核酸。替代性地，如果特别的蛋白或特定的免疫原性片段被声明或用作疫苗或其它组合物，其将被认为是分离的，因为与其可能在自然中存在的状况相比其已经被鉴定、分离且在某种程度上纯化。如果蛋白或其特定免疫原性片段在重组细菌或产生抗原的真核细胞表达载体中产生，其被认为作为分离的蛋白或核酸存在。例如，用多核苷酸构建的重组细胞系利用了“分离的”核酸。

“药用试剂”是指可用在疾病的预防、治疗或改善或者某些生理学状况或发生的预防的任何试剂。

术语“感染多样性”(MOI)是指每个细胞的生物体数目的比例，其详细说明了在给定感染中将使用的接种物的量。

本文所用术语“副痘病毒”、“副痘病毒毒株”是指属于痘病毒科和副痘病毒属的病毒。

本文所用术语“绵羊副痘病毒”和“副痘病毒ORFV”是指属于痘病毒科、副痘病毒属和绵羊副痘病毒种的病毒。这些病毒也称羊痘疮病毒、传染性化脓性皮炎病毒或orf病毒。它们具有将其与其它痘病毒区分开的独特螺旋状衣壳。

术语“绵羊副痘病毒毒株D1701”是指如美国专利第6,365,393号(本文通过援引并入)所述的病毒。“绵羊副痘病毒毒株D1701-V”是指改良用于猿细胞系Vero的绵羊副痘病毒毒株D1701。

“胃肠外施用”是指将如疫苗等物质通过或借由不包括消化道的途径引入受试对象体内。胃肠外施用包括皮下、肌内、透皮、皮内、腹膜内、眼内和静脉内施用。

本文所用术语“病原体”或“病原体微生物”是指能够在其宿主动物中诱导或导致疾病、病态或异常态的微生物，例如狂犬病毒。

“药物可接受”是指在合理的医学判断范围内适用于与受试对象的组织接触而不会有不当的毒性、不适和过敏响应等、与合理的效益风险比相当且可有效用于其预期用途的物质。

本文所用术语“痘病毒”是指属于痘病毒科的病毒。这些病毒是卵形的极大的双链DNA病毒。

本文所用术语“多核苷酸”或“多核苷酸分子”是指由在链中共价键合的核苷酸单体构成的有机聚合物分子。DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)是具有明确生物学功能的多核苷酸的实例。

本文所用术语“预防”、“进行预防”是指抑制微生物的复制、抑制微生物的传播或抑制微生物在其宿主中自身的建立。本文中所用的这些术语还可以指抑制或阻断一种或多种感染体征或症状。如果存在微生物载量的减少，那么也认为所述处理是愈疗性的。

本文对于疫苗或其它组合物所用的“保护”、“进行保护”是指疫苗或组合物避免或减少了疾病症状，所述疾病由该疫苗或组合物中所用的抗原所源自的生物体导致。术语“保护”也指可用于愈疗性治疗受试对象中已经存在的疾病或者疾病的一种或多种症状的疫苗或组合物。

术语“狂犬病毒”是指嗜神经狂犬病病毒，其为弹状病毒科的成员。它是在其外表面具有糖蛋白突出部的单链的反义RNA病毒。

“重组PPV”或“重组PPV”是在其基因组内具有插入和/或缺失的PPV。所述插入和缺失使用分子生物学方法制备。

“物种同源物”包括在两种或多于两种的拥有显著的多核苷酸序列同源性并且拥有相同或相似的生物学功能和/或性质的不同物种中发现的基因。优选地，代表物种同源物的多核苷酸序列如本文通过实施例所述会在中等严格条件下杂交，并且拥有相同或相似的生物学活性或性质。在另一方面，代表物种同源物的多核苷酸会共享大于约60%的序列同源性、大于约70%的序列同源性、大于约80%的序列同源性、大于约90%的序列同源性、大于约95%的序列同源性、大于约96%的序列同源性、大于约97%的序列同源性、大于约98%的序列同源性或大于约99%的序列同源性。

术语“特异性结合”被定义为形成复合物的两个或多个分子，所述复合物可以在生理条件或测试条件下测定并且具有选择性。如果在经适当选择的条件下所述结合没有被显著抑制，而同时非特异性结合被抑制，则称抗体或其抑制剂与蛋白“特异性结合”。特异性结合的特征在于高亲和力，且对于化合物或蛋白具有选择性。非特异性结合通常具有较低亲和力。例如，IgG抗体中的结合通常以至少约10^-7M以上的亲和力、例如至少约10^-8M以上、至少约10^-9M以上、至少约10^-10M以上、至少约10^-11M以上或至少约10^-12M以上。该术语也适用于例如抗原结合域对于许多抗原均不携带的特定表位具有特异性的情形，在该情形中携带所述抗原结合域的抗体通常不会结合其它抗原。

本文所用的“特异性免疫原性片段”是指可以被对于序列具有特异性的抗体或T细胞识别的该序列的一部分。

“受试对象”是指易受狂犬病感染的任何动物，包括驯化的和野生的哺乳动物。

本文所用的“基本相同”是指至少约90%、至少约95%、至少约96%、至少约97%、至少约98%或至少约99%的序列同一性程度。

本文所用“治疗有效量”是指会在接受抗原、疫苗或组合物的受试对象(例如，狗)中诱导免疫应答的抗原、疫苗或组合物的量，其足以避免或减轻由病原体(诸如病毒、细菌、寄生物或真菌)的感染所导致的疾病(包括其负面健康影响或并发症)的体征或症状。可以诱导体液免疫或细胞介导的免疫或诱导体液免疫和细胞介导的免疫。动物对抗原、疫苗或组合物的免疫原性应答可以通过抗体滴度的测定、淋巴细胞增殖测试来间接评估，或通过监测用野生型毒株攻击后的体征和症状来直接评估。由疫苗或组合物所赋予的保护性免疫可以通过测定攻击生物体脱落物的减少和/或临床指征(如死亡率、发病率、体温以及受试对象的整体身体状况、健康和行为能力)的减少来评估。具有治疗有效性的疫苗或组合物的量可能根据所用的特定免疫原或受试对象的状况而有所不同，且可以由本领域技术人员确定。

本文所用术语“治疗”、“进行治疗”是指减少或消除微生物的感染。该术语也可指减少微生物复制、减少微生物传播或减少微生物在其宿主中自身的建立。本文所用的该术语还可指减少、缓和或消除微生物感染的一种或多种体征或症状，或者加速从微生物感染的恢复。

术语“疫苗接种”和“进行疫苗接种”是指对动物施用疫苗或免疫原性组合物。

本文所用术语“疫苗”和“疫苗组合物”是指预防或减少感染或者预防或减少感染的一个或多个体征或症状的组合物。疫苗组合物针对病原体的保护效应通常通过在受试对象中诱导免疫应答而实现。一般而言，感染发生率的废止或减少、体征或症状的缓和或者微生物从受感染对象的消除的加快都标示着疫苗组合物的保护效果。本发明的疫苗组合提供了针对由狂犬病毒造成的感染的保护性效果。

本文所用术语“变体”是指给定的蛋白和/或基因序列的衍生物，其中衍生的序列与该给定序列基本相同，但具有突变差异。所述差异可以是天然存在的或者通过合成或遗传学产生的。

“载体”或“载体病毒”是适用于异源性DNA的插入的PPV，其能将插入的DNA转运至细胞或生物体内并且在适当时能使该异源性DNA被表达。

本文所用术语“兽医学可接受载体”是指在合理的医学判断范围内适用于与动物的组织接触而不会有不当的毒性、不适和过敏响应等、与合理的效益风险比相当且可有效用于其预期用途的物质。

提供以下描述以便辅助本领域技术人员实施本发明。即便如此，该描述也不应被认为会过度限制本发明，因为本领域普通技术人员可以在不背离本发明的发现的主旨或范围的情况下作出对本文所讨论的实施方式的修改和变化。

病毒、免疫原性组合物和疫苗

本发明涵盖了副痘病毒在制备包含源自狂犬病毒的异源性DNA的重组副痘病毒中的应用。

在一个实施方式中，使用了绵羊副痘病毒(PPVO)以用于制备包含源自狂犬病毒的异源性DNA的重组副痘病毒。在另一个实施方式中，使用了绵羊副痘病毒毒株D1701。在再一个实施方式中，使用了绵羊副痘病毒毒株D1701-V。

插入副痘病毒的基因序列包括源自狂犬病毒的异源性DNA。在一个实施方式中，异源性DNA包含编码狂犬病毒的G蛋白的基因或其片段。在一个实施方式中，异源性DNA包含SEQ ID NO:4或具有与SEQ ID NO:4至少98%同一性的多核苷酸分子。该基因的结构进一步公开于例如Anilionis等，Nature294,275-278(1981)中。插入物的大小为1588nt。插入物的完整序列(SEQ ID NO:4)示于图4中。其包含狂犬病毒的G基因的全长编码区(1575nt)加上作为用于限制酶分析(BamHI和EcoRI)的连接子序列的5’端的7nt和3’端的6nt。

对多核苷酸序列的了解使得该多核苷酸的每个可能片段易于获取。因此，本发明提供了G蛋白的片段。在一个实施方式中，提供了功能性片段。片段可以通过常规方法如过滤或色谱等进行纯化。片段可以通过本领域技术人员已知的方法通过重组产生。

在制备重组副痘病毒时，异源性DNA被插入到绵羊副痘病毒毒株D1701的HindIII片段H/H中。在另一个实施方式中，异源性DNA被插入到绵羊副痘病毒毒株D1701的HindIII片段H/H内的VEGF编码序列或相邻非编码序列中。用于将异源性DNA插入副痘病毒的方法是标准方法且是本领域技术人员所已知。其描述于美国专利第6,365,393号中。

在一个实施方式中，包含源自狂犬病毒的异源性DNA的重组副痘病毒为绵羊副痘病毒D1701-V-RabG。

在一个实施方式中，包含源自狂犬病毒的异源性DNA的重组副痘病毒为绵羊副痘病毒D1701-VrV RabG(K-UC1002)，遵照《国际承认用于专利程序的微生物保藏的布达佩斯条约》，该重组副痘病毒以

专利保藏标识PTA-1166被保藏于美国典型菌种保藏中心

(Manassas,VA20108，美国)。

质粒pdV-RabG(7.692nt)的序列为SEQ ID NO:5，其显示在序列表中。

本发明还涵盖了具有与本文所述的序列至少约99%、至少约98%、至少约97%、至少约96%、至少约95%、至少约93%、至少约90%、至少约85%、至少约80%、至少约75%、至少约70%、至少约65%、至少约60%、至少约55%和至少约50%的同一性和/或同源性的多核苷酸序列。

本发明还涵盖了在中度至高度严格条件下与本文所述的SEQ IDNO中任一项的非编码链或补充链杂交的多核苷酸序列及其物种同源物。示例性高度严格条件包括于65°C~75°C在包含0.2×SSC/0.1%SDS的缓冲液中的最终冲洗，而示例性中度严格条件包括于35°C~45°C在包含2×SSC/0.1%SDS的缓冲液中的最终冲洗。可以理解，在本领域中，通过温度和缓冲液或者盐浓度的变化可以实现等同严格性的条件，如Ausubel等(编著)，Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons(1994),第6.0.3~6.4.10页中所述。

重组PPV可以在细胞、细胞系和宿主细胞中增殖。所述细胞、细胞系或宿主细胞可以例如为但不限于哺乳动物细胞和非哺乳动物细胞。其中PPV可增殖的细胞、细胞系和宿主细胞是本领域普通技术人员熟知和可获取的。在一个实施方式中，采用Vero细胞。在其它实施方式中，采用牛肾细胞或绵羊睾丸细胞。

重组PPV在用于免疫原性组合物或疫苗中之前可以进一步被减毒或失活。减毒或失活的方法是本领域技术人员所公知的。减毒方法包括但不限于在合适的细胞系的细胞培养物中连续传代、紫外照射和化学诱变。失活方法包括但不限于用福尔马林、β-丙内酯(BPL)或二乙烯亚胺(BEI)处理或者其它本领域技术人员已知的方法。

通过福尔马林失活可以通过将病毒悬浮液与37%甲醛混合至最终甲醛浓度为0.05%来进行。病毒-甲醛混合物通过在室温持续搅拌约24小时来混合。然后通过分析测试在合适的细胞系上的生长来测试残余活病毒。

通过BEI失活可以通过将本发明的病毒悬浮液与0.1M BEI(2-溴乙胺在0.175N NaOH中的溶液)混合至最终BEI浓度为1mM。病毒-BEI混合物通过在室温持续搅拌约49小时来混合，接着添加1.0M硫代硫酸钠至最终浓度为0.1mM。继续混合额外的2小时。通过分析测试在合适的细胞系上的生长来测试残余活病毒。

重组PPV可以用于免疫原性组合物和疫苗中。

免疫原性组合物和疫苗可以可选地包含一种或多种兽医学可接受载剂，包括充当药物承载剂、赋形剂或介质的液体、半固体或固体稀释剂。如本文所用，“兽医学可接受载剂”包括任何及所有溶剂、分散介质、涂敷剂、佐剂、稳定剂、稀释剂、防腐剂、抗细菌和抗真菌剂、等渗剂和吸附延缓剂等。稀释剂可以包括水、盐水、右旋葡萄糖、乙醇和甘油等。等渗剂可以包括氯化钠、右旋葡萄糖、甘露醇、山梨糖醇和乳糖以及本领域技术人员已知的其它等渗剂。稳定剂包括白蛋白以及本领域技术人员已知的其它等渗剂。防腐剂包括硫柳汞钠以及本领域技术人员已知的其它防腐剂。

佐剂包括但不限于RIBI佐剂体系(Ribi Inc.)、明矾、氢氧化铝凝胶、水包油乳化剂(例如，Freund完全和非完全佐剂)、嵌段共聚物(CytRx,Atlanta Ga.)、SAF-M(Chiron,Emeryville，加州)、

佐剂、皂甙、Quil A、QS-21(Cambridge Biotech Inc.,Cambridge，马萨诸塞州)、GPI-0100(Galenica Pharmaceuticals,Inc.,Birmingham,AL)或其它皂甙组分、单磷酰脂A、Avridine脂-胺佐剂、来自大肠杆菌的不耐热肠毒素(重组或非重组)、霍乱毒素或胞壁酰二肽以及本领域技术人员已知的其它佐剂。可用在本发明背景下的佐剂和添加剂的量与浓度可以由本领域技术人员容易地确定。在一个实施方式中，本发明涉及包含约50μg~约2000μg佐剂的免疫原性组合物和疫苗。在另一个实施方式中，所包含的佐剂的量为约100μg~约1500μg、约250μg~约1000μg或约350μg~约750μg。在另一个实施方式中，所包含的佐剂的量为约500μg/2ml剂量的免疫原性组合物或疫苗。

免疫原性组合物和疫苗还可包含抗生素。此类抗生素包括但不限于来自氨基糖苷、碳青霉烯、头孢菌素、糖肽、大环内酯、青霉素、多肽、喹诺酮、磺胺和四环素等类别的抗生素。在一个实施方式中，本发明涉及包含约1μg/ml~约60μg/ml抗生素的免疫原性组合物和疫苗。在另一个实施方式中，免疫原性组合物和疫苗包含约5μg/ml~约55μg/ml抗生素、约10μg/ml~约50μg/ml抗生素、约15μg/ml~约45μg/ml抗生素、约20μg/ml~约40μg/ml抗生素或约25μg/ml~约35μg/ml抗生素。在再一个实施方式中，免疫原性组合物和疫苗包含少于约30μg/ml抗生素。

除重组PPV外，免疫组合物和疫苗可以包含其它抗原。抗原可以为失活的微生物整体或部分制剂的形式，或为通过基因工程技术或化学合成获得的抗原分子的形式。适用于本发明的其它抗原包括但不限于源自病原性细菌或病原性病毒的抗原。

在狗的情形中，重组的狂犬病免疫原性组合物和疫苗还可以可选地包含具有一种或多种额外犬科抗原的混合物，例如，犬埃里希体、犬细小病毒(CPV)、犬瘟热、犬副流感病毒(CPI)、II型犬腺病毒(CAV-2)、犬腺病毒(CDV)、犬钩端螺旋体(LC)、感冒伤寒型钩端螺旋体(LG)、波蒙那钩端螺旋体(LP)和博氏疏螺旋体等。一种抗原组合包含犬细小病毒、犬瘟热、犬腺病毒和犬副流感病毒的分离物，且带有或不带有冠状病毒和钩端螺旋体(包括新兴的血清变型感冒伤寒型钩端螺旋体和波蒙那钩端螺旋体)。

在猫的情形中，重组的狂犬病免疫原性组合物和疫苗还可以可选地包含具有一种或多种额外猫科抗原的混合物，例如，猫杯状病毒(FCV)、猫嗜衣原体(C.felis，此前通常也称为鹦鹉热衣原体(FCP))、猫白血病病毒(FeLV)、猫泛白细胞减少症病毒(FPV)、猫鼻气管炎病毒(FVR)、猫免疫缺陷病毒(FIV)、猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)和汉氏巴尔通体(例如，猫抓病)等。

在马的情形中，重组的狂犬病免疫原性组合物和疫苗还可以可选地包含具有一种或多种额外马科抗原的混合物，例如，马流感病毒、马疱疹病毒1和4、马动脉炎病毒、西尼罗病毒、马轮状病毒、马链球菌和破伤风类毒素等。

可以将本文所述的免疫原性组合物和疫苗施用于动物以诱导针对RV的有效免疫应答。因此，本文描述了刺激针对RV的有效免疫应答的方法，其包括对动物施用治疗有效量的免疫原性组合物或疫苗，该组合物或疫苗包含含有源自狂犬病毒的异源性DNA的重组副痘病毒。该方法导致对抗G蛋白血清抗体的诱导。

本文所述的免疫原性组合物和疫苗可以施用于动物以对该动物进行针对狂犬病的预防接种。可以将免疫原性组合物和疫苗施用于动物以预防或治疗动物中的狂犬病。因此，本文描述了对动物进行针对狂犬病的预防接种和预防或治疗狂犬病的方法，该方法包括对动物施用治疗有效量的免疫原性组合物或疫苗，该组合物或疫苗包含含有源自狂犬病毒的异源性DNA的重组副痘病毒。

形式、剂量、施用途径

可以根据施用途径将免疫原性组合物和疫苗制备为各种形式。例如，免疫原性组合物和疫苗可以被制备为用于可注射用途的无菌水溶液或分散液，或利用冷冻干燥计数制备为冻干形式。冻干的免疫原性组合物和疫苗通常保持在约4°C，且可以在如盐水或HEPES等稳定化溶液中重建。替代性地，免疫原性组合物和疫苗可以通过冷冻干燥来贮藏。免疫原性组合物和疫苗也可被制成悬浮液或乳化液的形式。

免疫原性组合物和疫苗包含治疗有效量的上述重组PPV。纯化的病毒可以直接用在免疫原性组合物或疫苗中，或可以经进一步减毒或失活。通常，免疫原性组合物或疫苗含有约1×10²PFU~约1×10¹²PFU、约1×10³PFU~约1×10¹¹PFU、约1×10⁴PFU~约1×10¹⁰PFU、约1×10⁵PFU~约1×10⁹PFU或约1×10⁶PFU~约1×10⁸PFU。可提供保护效果的免疫原性组合物或疫苗中的准确病毒量可以由本领域技术人员确定。

免疫原性组合物和疫苗通常包含体积为约0.5ml~约5ml的兽医学可接受载剂。在另一个实施方式中，载剂体积为约1ml~约4ml或约2ml~约3ml。在另一个实施方式中，载剂的体积为约1ml、约2ml、约3ml或约5ml。适用于免疫原性组合物和疫苗中的兽医学可接受载剂可以为本文所述的任何兽医学可接受载剂。

本领域技术人员能够容易地确定病毒在施用前是否需要减毒或失活。在另一个实施方式中，重组PPV可以不经额外减毒而直接施用于动物。具有治疗有效性的病毒量可能根据包括动物的状况和感染程度在内的几种因素中的任一种而有所不同，且可由本领域技术人员确定。

根据本发明的方法，可以对动物施以单次剂量，或替代性地，可以以约2周至约10周的间隔进行两次或多于两次接种。可能需要加强方案，并且可调整剂量方案以提供最佳的免疫。本领域技术人员能容易地确定最佳施用方案。

免疫原性组合物和疫苗可以被直接施用于血流中、肌肉内或内脏器官内。合适的胃肠外施用方式包括静脉内、动脉内、腹膜内、鞘内、心室内、尿道内、胸骨内、颅内、肌内和皮下。合适的胃肠外施用装置包括针(包括微针)式注射器、无针注射器和输注技术。

胃肠外制剂通常为可以含有如盐、糖等赋形剂和缓冲剂(优选至pH为约3~约9、约4~约8、约5~约7.5、约6~约7.5或约7~约7.5)的水溶液，但对于某些应用，其可更适合地被配制为无菌非水溶液或者待与合适的承载剂(如无菌无热原水)结合使用的干燥形式。

无菌条件下的胃肠外制剂的制备(例如，通过冻干)可以使用本领域技术人员公知的标准药学技术来容易地完成。

本文所述的重组副痘病毒和免疫原性组合物及疫苗可用于制备用于针对狂犬病对动物进行预防接种的药物。

本发明提供了确定动物中存在的副痘病毒的来源的方法。

利用DIVA疫苗(其能区分受感染的动物与经接种的动物)的预防接种提供了确定动物中存在的副痘病毒来源的方式。这种区分可以经由多种诊断方法中的任一种来实现，这些诊断方法包括但不限于ELISA、蛋白印迹和PCR。这些与其它方法可容易地由本领域普通技术人员认知和了解。

本文所述的副痘病毒可以在其基因组组成和所表达的蛋白方面与野生型菌株区分开。这种区分使得能够辨别经疫苗接种的动物与受感染的动物。例如，可以确定在某些实验室测试中测试为副痘病毒阳性的动物是否携带野生型副痘病毒毒株或者携带此前通过疫苗接种获得的经重组产生的副痘病毒。

可以采用许多测试进行上述确定。例如，可以从测试为副痘病毒阳性的动物分离出病毒，并可以使用基于核酸的测试来确定副痘病毒基因组的存在，这指示了此前的疫苗接种。基于核酸的测试包括DNA印迹分析或RNA印迹分析、PCR和测序。替代性地，可以采用基于蛋白的测试。在基于蛋白的测试中，可以从测试为副痘病毒阳性的动物分离出疑似感染的细胞或组织。可以从这些细胞或组织制备细胞提取物并可使用抗病毒蛋白的合适抗体对其进行例如蛋白质印迹，该抗体能区别鉴定出此前接种的重组制得的副痘病毒或野生型副痘病毒。

通过使用多种技术可以评估在动物中诱导的免疫应答的程度和性质。例如，可以从经接种的动物采集血清，并例如在常规ELISA中测试对于副痘病毒特异的抗体的存在或缺失。对于淋巴样组织中的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)可以通过如T细胞增殖等测试来检测，因其指示了细胞免疫应答的诱导。相关技术在本领域中有详尽描述，例如，Coligan等，Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons Inc.(1994)。

重组绵羊副痘病毒D1701-V-RabG可以用在DIVA测试中。在一个实施方式中，其可用在检测狂犬病N基因或蛋白以区分受感染动物与接种动物的测试中。在另一个实施方式中，其可以用在检测狂犬病P基因或蛋白以区分受感染动物与接种动物的测试中。在再一个实施方式中，其可以用在检测狂犬病L基因或蛋白以区分受感染动物与接种动物的测试中。在另一个实施方式中，其可以用在检测狂犬病M基因或蛋白以区分受感染动物与接种动物的测试中。

另外，通过以下描述性而非限制性实施例来描述本发明。

实施例

产生了包含编码RV的G蛋白的基因。评估了G蛋白的表达以及该重组病毒针对RV的免疫刺激性和保护性。

实施例1.表达重组病毒D1701-V-RabG的狂犬病G蛋白的产生

产生了含有编码RV的G蛋白的基因的经重组生成的绵羊副痘病毒。评估了G蛋白的表达以及该重组病毒针对RV的免疫刺激性和保护性。

转移质粒的构建

为了产生重组绵羊副痘病毒D1701-V-RabG，使用了绵羊副痘病毒(PPVO)载体体系(美国专利第6,365,393号；Rziha等，2000,J.Biotechnol.,83,137-145；Fischer等，2003,J.Virol.77,9312-9323；Henkel等，2005,J.Virol.79,314-325)。狂犬病毒G蛋白基因经化学合成(Blue HeronBiotech；美国)，并提供在pUC质粒中。通过琼脂糖凝胶(0.8%，重量/体积比)电泳将完整G基因分离为大小1,582bp的BamHI-EcoRI DNA片段，并通过Qiaex II凝胶提取试剂盒(Qiagen；德国)纯化。将质粒pdV-Rec1(Fischer等，2003)用BamHI和EcoRI双重消化并用于连接(快速连接试剂盒，Promega；德国)。在大肠杆菌DH5αF'(Invitrogen,ThermoFisher Scientific；德国)转化后，通过对质粒DNA的EcoRI–BamHI的限制酶消化来选择插入物阳性集落。这产生了转移质粒pdV-RabG(图1)，其通过Qiagen Plasmid Maxi试剂盒(Qiagen；德国)制备并用于DNA测序。至此，分别使用了位于插入位点上游的引物ORF32N(SEQ ID NO:1；5'-GCGCGCTGCGGGTGCGCTACCAATTCGCGC-3')和位于pdV-Rec1中的插入位点下游的引物ORF31N(SEQ ID NO:2；5'-GCATCCCGTTACCACCGGAGACCGACGCTCCC-3')以及内部G基因特异性引物RabG-F(SEQ ID NO:6；5'-GGAGTCTCTCGTTATCATATCTC-3')和RabG-R(SEQ ID NO:7；5'-CTAAACAAGGTGCTCAATTTCGT-3')。这使得可以确定所插入的G基因的完整序列(SEQ ID NO:4)。

通过Bluo-Gal染色的重组物的选择

用0.1MOI(感染多重性)的lacZ表达病毒D1701-VrV感染Vero细胞(10⁶个细胞)，并在2小时后用2μg的pdV-RabG质粒DNA根据制造商建议(Amaxa Nucleofector,Lonza；德国)通过核转染进行转染。3~4天后收集病毒裂解物病用于6孔板(Fisher Scientific；德国)中的Vero细胞滴定。当斑块可见时，如上所述覆盖含琼脂糖Bluo-Gal(Fischer等，2003)。捡取具有白色外观的病毒斑块，并将单斑块洗脱物(于4°C在磷酸盐缓冲盐水(PBS)中过夜)用于在48孔板的单个孔中的Vero细胞(1×10⁵个细胞)同时感染。

通过斑块PCR的重组物选择

采用Pasamontes等(J.Virol.Methods35:137–141；1991)的改良形式从各个病毒斑块中分离出DNA。将病毒裂解物(0.2ml)冷冻(-70°C)并融化(37°C)三次，并在冰上超声3次，每次20秒至30秒(超声水浴)。经苯酚和氯仿提取后，在乙醇沉淀前添加10μg酵母菌tRNA或3μlGlycoBlue(Ambion；德国)。将DNA沉淀用70%(体积比)乙醇洗涤两次，并在14μl微孔过滤纯化水(aqua bidest)中干燥后溶解。

对于RabG特异性PCR，将4μl的DNA与1μl由4.0pmol RabG-F(SEQ ID NO:6)和4.0pmol RabG-R(SEQ ID NO:7)引物构成的引物混合物以及5μl ReddyMix2X PCR(Abgene,Thermo Fisher Scientific；德国)在冰上混合。如下在Trio Thermoblock(Biometra；德国)中进行PCR：在98°C温育2分钟，然后进行96°C1分钟、60°C30秒、72°C30秒的40次循环，和最终在72°C进行2分钟的延伸步骤。在水平的1%(重量/体积比)琼脂糖-溴乙锭(0.3毫克/ml)凝胶中将PCR产物分离。将显示出大小为433bp的G基因特异性PCR片段的来自斑块分离物的病毒裂解物稀释并进而使用如上所述的Bluo-Gal琼脂糖覆盖进行至少3次斑块纯化。最后，使用4μl DNA、3.95pmol引物lacZ-F(SEQ ID NO:8；5'-CGATACTGTCGTCGTCCCCTCAA-3')和4.13pmol引物lacZ-R(SEQ ID NO:9；5'-CAACTCGCCGCACATCTGAACT-3')在LacZ基因特异性PCR中测试对于G基因阳性的重组病毒斑块分离物的DNA。在添加5μl AccuPrime SuperMix II(Invitrogen,Fisher Scientific；德国)后，如下进行PCR：在98°C加热2分钟，然后进行96°C1分钟、62°C30秒、68°C90秒的40次循环，和最终在68°C进行2分钟的延伸步骤。如上所述进行PCR产物的分离。大小为508bp的LacZ基因特异性片段的缺失表明，对应的重组病毒斑块分离物在经过3轮斑块纯化后不含表达lacZ的亲本病毒D1701-VrV。在制备高滴度的D1701-V-RabG病毒储备液后，如下所述制备病毒DNA，并用于RabG-PCR和LacZ-PCR中的测试。

重组病毒斑块的免疫组织化学染色(IPMA)

首先通过IPMA测试所插入的外来基因的成功表达，其涉及在24孔板中在Vero细胞上滴定的重组病毒斑块的免疫组织化学染色。在病毒斑块出现后，将培养基从各孔抽吸走，并让板在层状通风橱中敞开10分钟以使细胞干燥。其后，用冰冷的纯甲醇于-20°C将细胞固定15分钟至20分钟。在用冰冷1%(体积比)胎牛血清(FCS)的PBS溶液洗涤两次后，将细胞用含10%(体积比)FCS的PBS在室温(RT)封闭90分钟。在室温与G蛋白特异性小鼠单克隆抗体G559一同温育60分钟后，在FCS的1%PBS溶液(FLI-Tuebingen；德国)中稀释为1:200。用PBS-T(PBS containing0.05%(v/v)Tween-20)洗涤3次后，添加经1:2000稀释的过氧化酶偶联的抗小鼠二抗(Jackson-ImmunoRes.,DIANOVA；德国)并在室温温育60分钟。用PBS-T和PBS彻底洗涤后，按制造商说明所建议添加底物(Vector Nova Red,Axxora；德国)，直至红棕色阳性染色可见为止。作为阴性对照的包括有未经感染的细胞和用D-1701-VrV或D-1701-V感染的细胞。发现病毒斑块和感染细胞对于狂犬病毒G蛋白呈强阳性。

实施例2.D1701-V-RabG的表征

病毒储备液的制备

为获得高滴度的重组病毒储备液将10~20个T150培养瓶(Greiner；德国)同时以0.5的MOI感染。3日后，观察到约80%的细胞病原性效应(CPE)，并收集所有烧瓶中的细胞和上清液以进行离心(在4°C、13,000rpm离心2小时)。小心移除上清液，并将病毒沉淀于4°C过夜溶解于1ml~2ml PBS中。使用3次10秒脉冲(100W)在冰上通过超声(Soniccell disruptor,Branson；德国)令病毒悬浮液完全分散(每次脉冲期间休息10秒)，接着离心(500×g~700×g,10分钟,4°C)以除去细胞碎片。将上清液储存在冰上，同时将细胞沉淀重悬于1.0ml PBS中，并在冰上超声(2次20秒，且期间休息10秒，然后1次30秒)。在低速离心后，将上清液与第一次的上清液合并，分为等分试样、滴定并在-70°C储存。

病毒DNA的表征

以MOI0.5感染Vero细胞，并于2至3日后通过胰蛋白酶化和在4°C简短低速离心收集(约80%CPE)。使用Master Pure DNA分离试剂盒Epicentre Biotechnology,Biozym Scientific；德国)根据制造商规程来分离DNA。

为验证G基因在正确的基因座的插入，将2μgDNA通过限制酶消化，在0.8%(重量/体积比)琼脂糖凝胶中分离，并转移至尼龙膜(GEHealthcare；德国)根据标准程序进行DNA印迹杂交。将狂犬病G基因特异性探针(Rabg-F/-R PCR的产物)经凝胶分离，使用RediPrime(GEHealthcare；德国)进行放射性标记(³²P-dCTP，MP Biomedicals；德国)。然后将其用于DNA印迹杂交，杂交于50°C在含有0.5%(重量/体积比)脱脂奶粉、1.0%(重量/体积比)十二烷基硫酸钠(SDS)和0.5mg/ml变性胎牛胸腺DNA(KT-DNA,Sigma；德国)的4×SSPE(1×=0.18M NaCl,10mM PP，1mM EDTA,pH7.4)中的条件下进行。在X射线(KodakX-Omat；德国)曝光后，通过在0.4N NaOH中于45°C温育30分钟至60分钟来从过滤物中除去探针，然后于100°C在0.1×SSC,0.5%SDS,0.2M Tris-HCl(pH7.4)中简短温育。对于二次杂交，如Cottone等，1998.Virus Res.56,53-67所述使用D1701-V的含vegF-E基因座的HindIII片段H。DNA印迹结果证实G基因正确插入D1701-VrV的基因组。

G基因特异性DNA的检测

以3~5的MOI感染Vero细胞，并在感染后(p.i.)使用SurePrep TotalRNA提取试剂盒(Fisher Scientific；德国)在不同时机分离总RNA。另外，在阿糖胞苷(AraC；0.04mg/ml,Sigma；德国)或环己酰亚胺(CHX,0.1mg/ml,Serva；德国)存在时从被感染细胞提取RNA，以测试插入的G基因的早期表达。作为对照，从未经感染的细胞分离RNA。在含福尔马林的变性用1%琼脂糖凝胶中分离RNA，并如Kroczek,R.A.&Siebert,E.Anal.Biochem.184:9095,1990所述将其转移至尼龙膜。将放射性标记的狂犬病G PCR(RabG-F/-R)片段于42°C在UltraHyb溶液(Ambion；德国)中用作探针。结果明确展示出狂犬病G基因的及早表达，这是由于其在ORFV的早期vegF-E启动子的控制下受到调节(Rziha等，1999,J.Biotechnol.,73,235-242)。

通过免疫荧光的G蛋白检测

对于免疫荧光，以0.1或3.0的MOI在4室载玻片(BD Falcon；德国)中感染Vero细胞(1×10⁵细胞/ml)。在感染后的不同时间，用培养基洗涤细胞，并用无甲醇的3.7%(体积比)福尔马林(Pierce,Thermo FisherScientific；德国)在37°C固定15分钟。在用PBS洗涤3次后，通过用0.2%(体积比)Triton X-100在37°C处理5分钟来使细胞具渗透性(permeabilized)。经PBS洗涤后，用5%FCS的PBS溶液在37°C封闭细胞30分钟至40分钟。对于G蛋白检测，将细胞在37°C与以1:1000稀释在含1%FCS的PBS中的小鼠单克隆抗体G559(FLI；Tuebingen,德国)一同温育1小时。在PBS中洗涤5次后，将载玻片于37°C在黑暗中与以1:1000稀释于PBS中的抗小鼠Alexa-555二抗(MolecularProbes；德国)温育30分钟。

在以ORFV感染后较晚时期的细胞的检测通过使用由RudigerRaue博士(Pfizer,英国)提供的ORFV特异性兔抗血清PAS2274来进行。血清在具有1%FCS的PBS中以1:100稀释，而二抗(抗兔Alexa-488)以1:1000稀释使用。

根据制造商说明(Biotium；德国)用进行肌动蛋白染色，随后用0.04μg/ml DAPI(4’,6-二脒-2’-苯基吲哚二盐酸盐；Roche MolecularBiochemicals；德国)对核染色，在室温于暗处进行20分钟至30分钟。在PBS中充分洗涤后，将载玻片嵌入Mowiol-DABCO，并利用Axiovision软件使用Zeiss ApoTome进行荧光成像。

结果清楚展示出在D1701-V-RabG感染后早期(感染后4小时)和晚期(感染后24小时)的狂犬病G蛋白的强表达。晚期受感染的细胞可以通过用抗血清PAS2274进行特异性染色来额外鉴定。此外，荧光染色证实了G蛋白的表面表达的证据。通过使用未经感染的细胞来测试染色的特异性。

通过蛋白印迹的G蛋白检测

以1.0的MOI同时感染Vero细胞(3×10⁵细胞)，并于37°C在5%CO₂气氛中温育。在感染后不同时期，收集细胞和上清液并离心(8,900×g,10分钟,4°C)，用1.0ml PBS将细胞沉积物洗涤3次并重悬于含1%(体积比)Triton X-100的0.15ml PBS中。在冰上30分钟后，将裂解物在15,000×g和4°C离心15分钟，并保留上清液用于SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)。此时，将3份裂解物与1份4×DualColor蛋白加样缓冲液(Fermentas；德国)混合，煮沸5分钟并超声，使用8%(重量/体积比)ProSieve50凝胶与Tris-Tricine-SDS电泳缓冲液通过SDS-PAGE将10μg蛋白分离。使用预先染色的蛋白梯(Fermentas；德国)作为分子量标记物。电泳后，根据制造商说明(Pierce,Thermo Fisher Scientific；德国)将蛋白转移至PVDF膜。于室温在3×Rotiblock(Roth；德国)对膜封闭3小时后，使用了以1:10,000稀释于1×RotiBlock中的对于狂犬病毒G蛋白的C端特异的兔抗肽抗血清(由德国慕尼黑Max-von-Pettenkofer Institute的K.-K.Conzelmann博士惠赠)。在4°C过夜温育后，将膜在TBS-T(带有0.05%(体积比)Tween-20的Tris缓冲盐水)中彻底清洗5次，并与过氧化物酶偶联的抗兔抗体(1:20,000；Jackson-ImmunoRes.,Dianova；德国)在室温温育1小时。经TBS-T洗涤后，根据建议使用ECL底物(Immobilon Western,Millipore；德国)。通过使用化学发光X射线膜(CL-XPosure,Pierce,Thermo FisherScientific；德国)来检测经过反应的蛋白。

在感染后不同时期证实了具有预期分子量(58kDa~60kDa)的狂犬病毒G蛋白的表达。

实施例3.用D1701-V-RabG对小鼠免疫后的特异性免疫应答的诱导

抗G血清抗体的剂量依赖性诱导

G蛋白可以被视作用于保护性免疫应答的最重要抗原，而诱导的病毒中和性血清抗体(SNT)的程度可以与针对狂犬病毒攻击感染的保护相关。根据OIE(世界动物卫生组织)和WHO(世界卫生组织)，抗体滴度存在超过0.5IU/ml~1.0IU/ml(国际单位)的SNT被认为具保护性。因此，在用D1701-V-RabG对小鼠首次免疫后的第1天至第14天期间确定G蛋白特异性SNT抗体的诱导。

将育种于FLI(Friedrich-Loeffler-Institute,联邦动物卫生研究所免疫所；Tuebingen,德国)的6周龄至8周龄C57/BL6小鼠(每组n=6或7)用0.1ml的指定量PFU(斑块形成单位)的D1701-V-RabG(对每条后腿的大腿用0.05ml)在肌内进行免疫接种。每日提取个体血清样品，并用于如下所述在快速荧光灶抑制测试(RFFIT)中的SNT确定(OIEManual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals.2007.第2部分，第2.2节，第2.2.5章，狂犬病,也可见于下述网站：www.oie.int/fr/normes/mmanual/A_00044.htm；Cox,J.H.and L.G.Schneider,1976,J.Clin.Microbiol.3,96-101)。简言之，在RPMI培养基中制备血清5倍系列稀释液，并将0.05ml的每种稀释液(双份)在96孔板的板孔中与0.05ml狂犬病毒毒株CVS11(批号47,1,7×10⁵PFU/ml)混合。在37°C和5%CO₂温育90分钟后，将0.1ml的BHK21细胞悬浮液(1×10⁶细胞/ml)添加至各板孔并混合，并在37°C的5%CO₂中温育24小时。在用PBS洗涤培养板的板孔并与80%(体积比)丙酮预先冷却，将细胞于4°C在新鲜80%(体积比)丙酮中固定额外30分钟。除去丙酮并空气干燥后，在37°C于30分钟添加0.05ml的FITC抗狂犬病单克隆球蛋白(Centocor；美国)以使狂犬病毒感染细胞染色。在用PBS洗涤两次和用aqua bidest洗涤一次后，通过荧光显微镜监测病毒感染。使感染细胞数目减少至50%的血清稀释液被解读为阳性。血清的滴度以IU/ml表达，且将其与阳性WHO参照血清比较。

图2展示了用指定量PFU的D1701-V-RabG重组病毒对小鼠进行单次肌内免疫接种后的SNT发展。在由FFIT免疫后指定天数(d)测试血清。如图2(D)中可见，到第8日时，即使低剂量(10⁴PFU)免疫也导致5.5IU/ml的平均SNT，逐渐增加直至免疫后第14天时为约13IU/ml。使用10⁶PFU或10⁷PFU免疫后(图2A和2B)，到1周后，分别诱导了约10IU/ml~20IU/ml的平均SNT，其在初免后14天增加至多达约50IU/ml。使用10⁷PFU的D1701-V-RabG，到免疫后第4日，检测到保护性血清抗体滴度(0.6IU/ml~3.0IU/ml)，其不同于使用受测较低免疫剂量时的情形(图2)。

另一组小鼠实验(数据未显示)表明，使用10⁶PFU或10⁷PFU的重组病毒的加强免疫仅导致在初免(以10⁶PFU或10⁷PFU)后14天的SNT的微小增加。

综上，这些结果表明在用不同剂量的D1701-V-RabG对小鼠免疫接种后第1周期间成功诱导了保护性SNT抗体滴度。

实施例4.由D1701-V-RabG介导的小鼠中保护性免疫应答

根据OIE建议(Manual of Diagnostic Tests and Vaccines forTerrestrial Animals.2007.第2部分，第2.2节，第2.2.5章，狂犬病；也见于www.oie.int/fr/normes/mmanual/A_00044.htm)，通过对经不同免疫的小鼠(C57/BL6)的攻击感染来进行对D1701-V-RabG的保护性能力的评估。在6周龄至8周龄时，将小鼠(每组n=11或12)如上所述用指定量PFU的D1701-V-RabG进行免疫接种。对未经免疫接种的对照小鼠(n=15)用PBS注射。免疫后3周，对所有动物用具毒性狂犬病毒毒株(0.03ml，含4.8×10⁵PFU)进行颅内攻击。对动物进行观察，直到攻击感染后21天。将遭受严重神经元症状的濒死动物施安乐死。

如图3所示，用10⁷PFU的D1701-V-RabG单次肌内免疫接种完全保护小鼠(11/11)抵抗高剂量的颅内施用的攻击病毒。来自该组的一直经免疫的动物在第12天死亡，但这并非由于攻击狂犬病毒感染所致。因此，将该动物从数据分析中排除。施用1剂含低10倍量(10⁶PFU)的D1701-V-RabG仍获得了73%的保护(8/11存活)。进一步减少免疫剂量将保护率降至58%(10⁵PFU；7/12)或27%(10⁴PFU；3/11)，而所有对照免疫小鼠(n=15)均在攻击感染后第6至第9日死亡(图3)。

实施例5.T细胞的保护性免疫作用

以下实验研究了T细胞(CD4-、CD8-或CD4/8阳性细胞)对于诱导小鼠中重组D1701-V-RabG的保护性免疫的贡献。如图5A所示，在用10⁷PFU的D1701-V-RabG免疫接种的第0天之前和之后(即，第-1天、第0天、第+1天和第+5天)，对各组小鼠(动物数目显示于图中)在腹膜内施用对于CD4-或CD8-T细胞特异的抗血清，以耗尽体内的各T细胞群。

其后，在第15天，用剂量为500LD₅₀的具毒性RV毒株CVS对所有动物进行脑内攻击。

如图5A所示，CD4阳性T细胞耗尽的动物通常不受保护，如通过未经免疫接种的对照动物的类似应答可以看出。

如图5B所示，将动物组在第0天用D1701-V-RabG免疫，然后在用具毒性RV菌株CVS攻击感染第15天之前和之后(即，第13天(攻击感染前2天)、第15天、第19天和第23天)在体内耗尽CD4-和/或CD8-细胞。结果表明，在通过D1701-V-RabG的抗狂犬病毒免疫应答成功初免后，14天后T细胞的耗尽并未负面影响保护，因为75%~90%的T细胞群在体内耗尽的动物在攻击中存活。

综上，所述结果显示，CD4阳性T细胞(最可能是生产抗G蛋白所必须的T辅助细胞)是由重组D1701-V-RabG诱导的保护性免疫的主要决定物。

实施例6.接触后疫苗接种

在小鼠中测试了重组D1701-V-RabG对于治疗性疫苗接种的效力。为此，在第0天、第1天和第4天用10⁷PFU的D1701-V-RabG对各组动物于肌内(i.m.)进行疫苗接种。在第0天用1×10⁶PFU的具毒性RV毒株CVS攻击小鼠。如图6所示，除一只外的免疫组中所有小鼠受到针对狂犬病的保护。

在小鼠中进行额外实验以测试对具毒性RV菌株CVS的各种接触后免疫接种方案。在图7中，灰色方块指示了用D1701-V-RabG对小鼠接种的天数。结果(存活者)总结在图中。

结果表明了D1701-V-RabG对小鼠的治疗性疫苗接种的能力。如图7中可见，在攻击当日和次日给予的双重接种介导了80%的保护，且在外周RV攻击感染后3天后开始的4次每日免疫接种保护了至少60%的动物。

实施例7.由不同免疫途径诱导的免疫应答

以以下施用途径用1×10⁶PFU的D1701-V-RabG对小鼠进行免疫接种：阴道内(i.vag.)、结痂化、腹膜内(i.p.)、皮内(i.d.)、鼻内(i.n.)、皮下(s.c.)、肌内(i.m.)和静脉内(i.v.)。在免疫接种后第6日(灰色条)和第13日(黑色条)诱导的血清抗体应答(确定为血清中和抗体或SNT)如图8所述。免疫接种后的14天用100LD₅₀的毒性RV毒株CVS在脑内感染小鼠，并计算存活百分比。

结果显示，通过i.v.、i.p.和i.m.接种诱导了最高SNT滴度(以UI/ml计)，其也分别导致86%、100%和78%的最佳保护率。