CN111944769A

CN111944769A - 一种狂犬病毒g蛋白-羊痘病毒重组疫苗的构建方法

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Publication number: CN111944769A
Application number: CN202010798191.6A
Authority: CN
Inventors: 李有文; 童剑军; 何川川; 张雪萍; 米丽开姆·托合提尼亚孜; 高娜; 杨勇飞
Original assignee: Tarim University
Current assignee: Tarim University
Priority date: 2020-08-10
Filing date: 2020-08-10
Publication date: 2020-11-17
Anticipated expiration: 2040-08-10
Also published as: CN111944769B

Abstract

本发明公开了一种狂犬病毒G蛋白‑羊痘病毒重组疫苗的构建方法，包括以下步骤：步骤1、重组病毒疫苗构建模型设计；步骤2、各基因的扩增及各组合基因的融合扩增；步骤3、各种组合重组转移载体的构建；步骤4、狂犬病毒G蛋白‑羊痘病毒的重组及病毒纯化；步骤5、狂犬病毒G蛋白表达检测；步骤6、狂犬病毒G蛋白‑山羊痘重组病毒疫苗株免疫效果检测。本发明的方法构建的疫苗可有效预防羊狂犬病，并且具有生产高效、简便、实用的特点，适合推广应用。

Description

一种狂犬病毒G蛋白-羊痘病毒重组疫苗的构建方法

技术领域

本发明属于医药技术领域，涉及一种狂犬病毒G蛋白-羊痘病毒重组疫苗的构建方法。

背景技术

狂犬病是由狂犬病毒引起的高度致死性和接触性人兽共患病，几乎所有哺乳动物均可感染。我国是狂犬病高发国家之一，加之疆土富远辽阔，狼、狐狸等野生动物携带狂犬病毒的可能性较大，因此牧区牛羊受野生动物攻击而感染狂犬病的情况时有发生；加之宠物业兴起，宠物犬咬伤羊只而发病者亦有报道。如山西、内蒙、新疆等地均有牛羊被犬咬伤感染狂犬病的案例。羊痘病毒是痘病毒科的成员，是大型的线形DNA病毒，其基因组可容纳大量外源基因而不影响病毒的正常生长繁殖，因此其往往被作为载体构建生产活载体疫苗。

虽然目前狂犬疫苗可以有效的预防狂犬病的发生，但是注射狂犬疫苗成本高，周期长，程序复杂，很难在羊群中推广使用。为有效预防羊狂犬病，生产高效、简便、实用的疫苗非常必要，狂犬病毒G蛋白-羊痘病毒重组疫苗可能是最好选择。

发明内容

本发明的目的在于提供一种狂犬病毒G蛋白-羊痘病毒重组疫苗及其构建方法，该方法以山羊痘病毒疫苗株为病毒活载体，以其腺甘酸酶基因(TK)为复制非必需区，以VV7.5基因或GTPV-A8R基因为启动子，绿色荧光蛋白(GFP)为报告基因，利用基因工程技术设计了10种能够重组狂犬病毒保护性抗原(G蛋白：GQ为G蛋白全长，GW为G蛋白膜外区)的表达载体；制备培养了羔羊睾丸原代细胞，用LipofectamineTM 2000转染试剂通过脂质体转染法将构建成功的8株重组转移载体分别转入预先感染羊痘病毒疫苗株的羔羊睾丸细胞中，经同源重组成功并将其培养获得能够表达狂犬病毒G蛋白的重组羊痘病毒，然后运用低熔点琼脂糖固定、挑荧光斑点和倍比稀释传代的方式进行纯化，一般纯化4-6代即可获得较纯的重组病毒毒株，并通过细胞GFP基因表达率、细胞病变及PCR方法确定重组病毒是否纯化。并通过Western-blot和ELISA方法初步评价G蛋白在重组病毒中的表达效果。免疫羊只后，用ELISA方法检测其血清中和抗体产生情况。

其具体技术方案为：

一种狂犬病毒G蛋白-羊痘病毒重组疫苗的构建方法，包括以下步骤：

步骤1、重组病毒疫苗构建模型设计

根据痘病毒重组疫苗设计原理，选择羊痘病毒TK基因为外源基因插入的非必需区，痘苗病毒VV7.5和山羊痘病毒A8R双向启动子为备选启动子，绿色荧光光蛋白为报告基因，与狂犬病毒G蛋白构建重组病毒的表达载体。为了筛选最选的疫苗组合，共设计了10种组合，G蛋白选用了全长和膜外区两种形式。

(1)TK基因中插入位点选Acc65 I；

(2)以VV7.5启动子融合表达GFP和G蛋白：分为GFP在N端，G蛋白在C端和G蛋白在N端，GFP在C端两种情况。G蛋白又有全长和膜外区两种情况，总计设计4种整合表达的情况；

(3)以VV7.5分别为GFP和G蛋白的启动子分别表达各自的蛋白，分表达方向相背和表达方向同向两种情况。考虑G蛋白有全长和膜外区之分，共设计4种单独表达的组合；

(4)以山羊痘病毒双向启动子A8R两侧分别表达G蛋白和GFP蛋白构建G蛋白全长和膜外区两种情况。

步骤2、各基因的扩增及各组合基因的融合扩增

(1)引物设计

根据不同组合的具体设计需要，设计不同引物用于扩增目的基因片段，引物的序列如SEQ：ID：NO：1-SEQ：ID：NO：27所示。

(2)PCR扩增

G蛋白与GFP融合表达的形式采用三片段融合PCR法将两蛋白基因与VV7.5启动子融合在一起，先分别扩增单个基因片段，再将3个片段融合扩增在一起，TK基因直接普通PCR扩增。

VV7.5与G蛋白或GFP蛋白表达的情况以及A8R双向启动子与G蛋白和GFP蛋白的连接，先分别扩增单个基因片段，采用两片段融合，再用酶切连接的方式构建；

单一基因片段扩增体系及程序为：25μL扩增体系为：Primer star酶0.3μL，Buffer5μL，dNTP 1μL，上下游引物各0.6μL，模板0.8μL，ddH2O 16.7μL；扩增程序为：预变性95℃5min，变性95℃30s，退火55℃30s，延伸72℃90s，再延伸72℃10min，共循环35次。

融合扩增体系及程序为：分别用要融合的几个扩增单一基因产物为模板，用第一基因的上游引物和最后基因的下游引物进行直接融合扩增出目的片段。25μL扩增体系为：primer star酶0.3μL，Buffer 5μL，dNTP 1μL，上下游引物各0.6μL，多个模板总和为0.8μL，ddH2O 16.7μL；扩增程序为：预变性95℃5min，变性95℃30s，退火55℃30s，延伸72℃90s，后延伸72℃10min，共循环30次。

各PCR产物的纯化回收及鉴定：采用切胶回收法

步骤3、各种组合重组转移载体的构建

(1)TK基因：将扩增的TK基因直接与克隆载体PGEM-T载体连接得PGEM13-TK载体，并鉴定。

(2)酶切：PGEM13-TK载体，各融合PCR产物均进行Acc65 I的酶切。50μL酶切体系为：载体和PCR产物分别为35μL和30μL，Buffer各5μL，Acc65 I各3μL，ddH2O分别为7μL和12μL，混匀后于37℃水浴酶切3-4h，并对酶切产物进行切胶回收纯化。对载体的酶切产物进行去磷酸化：去磷酸化酶2μL，10×Buffer 5μL，酶切载体20μL，ddH2O 23μL。37℃1h，45℃15min。纯化回收，-20℃保存。

(3)连接

处理好的PCR产物及载体运用T4 DNA连接酶进行连接。10μL体系：PGM-TK13载体1μL，目的片段5μL，T4 DNA连接酶1μL，10×T4 DNA连接酶Buffer 1μL，ddH2O 2μL，并设立空白对照(无目的片段，其余条件一致)。

(4)转化

将各连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并涂板培养。(常规方法)

(5)转移载体构建的鉴定

挑取单菌落振摇培养6-8h，以菌液为模板进行PCR扩增鉴定。

提取质粒做酶切鉴定。

最终成功构建狂犬病毒G蛋白-山羊痘病毒重组病毒转移载体8种：PGM-TK13-GFP-7.5-RVGQ-7.5、PGM-TK13-GFP-7.5-RVGW-7.5、PGM-TK13-7.5-GFP-RVGQ、PGM-TK13-7.5-GFP-RVGW、PGM-TK13-7.5-RVGQ-GFP、PGM-TK13-7.5-RVGW-GFP、PGM-TK13-RVGQ-A8R-GFP、PGM-TK13-RVGW-A8R-GFP，其序列如SEQ：ID：NO：28-SEQ：ID：NO：35所示。

步骤4、狂犬病毒G蛋白-羊痘病毒的重组及病毒纯化

(1)细胞制备：制备羊睾丸原代细胞(常规方法)。

(2)羊痘病毒疫苗株的培养：待羊睾丸原代细胞长好，接种山羊痘病毒疫苗株AV41，AV41是我国现在广泛用于羊痘预防的山羊痘病毒疫苗株，该产品可以直接在市场上(动物疾控中心)购买商品化的山羊痘冻干苗而获得。并观察生长情况。

(3)病毒重组：将构建并测序正确的重组转移载体PGM-TK13-GFP-7.5-RVGQ-7.5、PGM-TK13-GFP-7.5-RVGW-7.5、PGM-TK13-7.5-GFP-RVGQ、PGM-TK13-7.5-GFP-RVGW、PGM-TK13-7.5-RVGQ-GFP、PGM-TK13-7.5-RVGW-GFP、PGM-TK13-RVGQ-A8R-GFP、PGM-TK13-RVGW-A8R-GFP用Lip2000脂质体转染试剂转染转染至已经感染了山羊痘病毒疫苗株的羊睾丸原代细胞，培养并观察细胞病变情况及绿色荧光情况。具体步骤如下：

待12孔板中羊睾丸原代细胞长至85-90％，吸弃细胞培养液，每孔接种10μL的羊痘病毒疫苗株病毒液和细胞维持液，37℃二氧化碳培养箱培养12h。每孔准备2个无菌离心管，加入250μL DMEM，一管中加入转染试剂LipofectamineTM 2000 1.5μL，用移液器混匀，静置5min，另一管中加入转移载体质粒；将转染试剂混匀液加入质粒中，混匀之后静置18～20min；将混匀液加入细胞板孔中，6～8h后换细胞维持液，于细胞接着箱中培养，并于12h、24h、36h、48h分别观察绿色荧光出现情况，出现荧光细胞即为重组病毒细胞。同时作不接种病毒直接转染质粒的对照。

(4)重组病毒的纯化

确认有带荧光的重组病毒后，吸弃培养液，加入已融化的无菌低熔点琼脂糖，并置于4℃的冰箱中5～10min，待固定液凝固后取出，在荧光显微镜下挑取荧光斑点于50μLDMEM纯培养液中备用。将挑取的荧光斑点收集液反复冻融三次后，对其进行10倍比稀释至10^6-7，然后分别接种羊睾丸原代细胞培养，再挑取荧光斑点稀释，如此传代4-6次即可得到纯化的重组病毒。

(5)重组病毒纯化的鉴定

镜检：荧光显微镜观察有几乎99％的细胞均带荧光，说明重组病毒已经纯化，最终得到重组纯化的重组病毒两株：rGTPV-GFP-7.5-RVGQ-7.5和rGTPV-GFP-7.5-RVGW-7.5；

PCR检测：取重组病毒的细胞培养物，提取其基因组，PCR检测其中G蛋白基因、GFP基因及TK基因，同时与山羊痘病毒疫苗株的细胞培养物做比较。

步骤5、狂犬病毒G蛋白表达检测

(1)G蛋白Western-blot检测

细胞培养纯化的重组病毒，细胞裂解液200μL裂解其培养物并用细胞铲刮取裂解产物，加SDS-PAGE上样Buffer并于沸水浴煮沸10min；做SDS-PAGE电泳，并按常规方法做考染或western blot检测。

(2)ELISA法检测细胞培养物中G蛋白表达情况

培养标准山羊痘疫苗株及已纯化的狂犬病毒G蛋白-羊痘疫苗重组病毒株rGTPV-GFP-7.5-RVGQ-7.5和rGTPV-GFP-7.5-RVGW-7.5，细胞全部被感染后，收取培养上清液并刮取底层细胞，细胞加细胞裂解液裂解并超声破碎，将其离心分为细胞上清和细胞沉淀。购买狂犬病毒G蛋白抗原检测ELISA试剂盒，常规方法检测以上处理样品中G蛋白含量。两株重组病毒G蛋白表达量与对照组(山羊痘疫苗株)显著升高，差异极显著，且G蛋白膜外区的表达量明显高于全长。另外对细胞培养液、细胞破碎后上清及沉淀中G蛋白含量的检测结果是细胞培养液和细胞破碎后上清中G蛋白含量接近，且明高于细胞破碎后沉淀中，说明G蛋白表达后主要以分泌型蛋白形式表达在细胞外，非常适合做免疫抗原，是制备疫苗的最佳抗原蛋白。

步骤6、狂犬病毒G蛋白-山羊痘重组病毒疫苗株免疫效果检测

(1)重组羊痘疫苗株注射液的制备

取标准羊痘疫苗株及已纯化的狂犬病毒G蛋白-羊痘疫苗重组病毒株rGTPV-GFP-7.5-RVGQ-7.5和rGTPV-GFP-7.5-RVGW-7.5各取50μL接入至含5mL羔羊睾丸原代细胞的小25mL的细胞瓶中。5天细胞全部感染后反复冻融三次，12000rpm 10min离心取上清液，于-80℃保存。

(2)免疫接种试验

将12只健康状态一致的成年绵羊分为三组并标记，标准疫苗株：A、B、C、D；G蛋白全长重组疫苗株rGTPV-GFP-7.5-RVGQ-7.5：I、II、III、IV；G蛋白膜外区重组疫苗株rGTPV-GFP-7.5-RVGW-7.5：1、2、3、4，采集羊免疫前血清待检。按分组在羊尾根部皮内注射0.5mL重组羊痘疫苗株注射液。观察羊只健康状况，并分别于0、5、12、19d采集羊全血分离血清待检。

(3)血清中G蛋白中和抗体检测

购买绵羊源G抗体检测试剂盒，按说明书进行操作检测羊血清中G蛋白中和抗体水平情况，与山羊痘病毒疫苗株的免疫血清为对照。两株重组病毒免疫组羊血清中G蛋白中和抗体与对照组显著升高，差异极显著，且G蛋白膜外区的中和抗体浓度明显高于全长。

具体操作如下：

(1)标准品稀释：将试剂盒提供的标准品与标准品稀释液1∶1稀释；

(2)加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。在酶标包被板上标准品加样50μL，待测样品孔中先加样品稀释液40μL，然后再加待测样品10μL并轻轻混匀；

(3)温育：用封板膜封板后置37℃温育30min；

(4)配液：将30倍浓缩稀释液用蒸馏水30倍稀释后备用；

(5)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30s后弃去，如此反复5次，拍干；

(6)加酶：每孔加入酶标试剂μL，空白孔除外；

(7)温育：操作同3；

(8)洗涤：操作同5；

(9)显色：每孔先加入显色剂A 50μL，再加入显色剂B 50μL，轻轻振荡混匀，37℃避光显色10min；

(10)终止：每孔加终止液50μL，终止反应(此时蓝色立转黄色)；

(11)测定：以空白孔调零，450nm波长依次测量各孔的吸光值(OD值)。测定应在加终止液后15min内进行，根据标准曲线计算每孔中G蛋白抗体的浓度。

与现有技术相比，本发明的有益效果：

1、本发明是将狂犬病毒保护性抗原-一G蛋白基因插入羊痘病毒疫苗株非必需区TK基因中，构建的重组活疫苗，是一种二价疫苗，具有打一针防两病的效果。本发明成功构建8种重组病毒转移载体PGM-TK13-GFP-7.5-RVGQ-7.5、PGM-TK13-GFP-7.5-RVGW-7.5、PGM-TK13-7.5-GFP-RVGQ、PGM-TK13-7.5-GFP-RVGW、PGM-TK13-7.5-RVGQ-GFP、PGM-TK13-7.5-RVGW-GFP、PGM-TK13-RVGQ-A8R-GFP、PGM-TK13-RVGW-A8R-GFP。

2、本发明是以羊痘病毒疫苗株为载体，其稳定性和免疫效果早已得到专家认可和生产实践的证明，所以关于羊痘病毒疫苗的性能是可信的。只要证明狂犬病毒G蛋白能产生稳定且显著的免疫效果即可。

3、本发明中选用了VV7.5启动子和山羊痘病毒自身的A8R双向启动子。VV7.5启动子是痘病毒类研究中经常用到的启动子，而本发明还选用了山羊痘病毒的双向启动子A8R/A7L。使用会使疫苗的构建过程大副简化，并且是山羊痘病毒自身的启动子，可能有较好的启动转录和翻译的作用。

4、本发明中以绿色荧光蛋白GFP为报告基因，构建指示系统，容易观察和判断，也容易纯化重组病毒。相较常用的Lac Z或大肠杆菌gμt等报告基因有相对优势。

5、本发明是针对羊的疫苗产品，具有有效预防羊痘的发生外还预防羊狂犬病。本产品是的初衷是解决牧区因野生动物咬伤牛羊而引起牛羊发生狂犬病的问题，但随着宠物业的兴起和家区看家护院养犬业的产生，农区牛羊患狂犬病和案例也屡见不鲜，因此本发明可以普遍用于羊痘防控中。

6、本发明选择羊痘病毒疫苗株做载体体主要是因为一方面羊痘病毒疫苗株使用非常有效，几乎可能有效的控制羊痘的规模化流行，另一方面目前全世界羊痘的预防都是用羊痘病毒弱毒苗；第三，羊痘在OIE规定为A类疫病，我国列为一类疫病，按照有关法规，一类疫病是要强制免疫的，在我国一些规模化羊场对羊痘的预防也确实是必防的，因此注射羊痘疫苗是必须的。

7、羊患狂犬病的发病率确实不是很高，但由于野生动物带毒，或宠物犬猫的普遍饲养，羊狂犬病也确实给养殖户或牧民带来较大的经济损失。但是狂犬病的预防需要注射疫苗，及时注射狂犬疫苗的治愈率也很高，但是狂犬疫苗的注射需要连续注射3-5针，且其价格也比较高，因此对于羊来讲，感染后治疗几乎不可能，但本发明的产品把狂犬病毒最有效的保护性抗原插入羊痘病毒中，做成二价疫苗，农牧民通过预防羊痘就预防了狂犬病，不增加成本，不增加劳动力，实现一苗防两病，为农牧民发展养业提供保障和提高经济效益。

8、本发明所用的细胞是羔羊睾丸原代细胞；成功制备羔羊睾丸原代细胞，生长速度较快稳定性较好，用以进行细胞转染、基因重组、重组病毒筛选纯化，得到rGTPV-GFP-7.5-RVGQ-7.5、rGTPV-GFP-7.5-RVGW-7.5、rGTPV-7.5-RVGW-GFP等3株重组病毒，稳定性较好。与之前有人报道用vero细胞得到的重组病毒稳定性相对较差有较好的改进。

9、本发明目前重组纯化了2株狂犬病毒G蛋白-羊痘病毒重组疫苗病毒：rGTPV-GFP-7.5-RVGQ-7.5、rGTPV-GFP-7.5-RVGW-7.5经Western-blot鉴定和免疫羊只抗体的ELISA检测均取得较好的效果。为狂犬病病毒G蛋白-羊痘病毒重组疫苗研发奠定了基础，也为羊狂犬病防控提供了新思路和技术路线。

10、本发明是将狂犬病毒G蛋白插入山羊痘病毒疫苗株中构建二价重组疫苗，主要预防羊痘和羊狂犬病。而之前有将狂犬病毒G蛋白插入痘苗病毒构建二价疫苗，主要预防人的天花和狂犬病；也有在羊痘疫苗中插入口蹄疫病毒保护性抗原VP1，或插入小反刍兽疫病毒的H蛋白或F蛋白，用以保护羊的口蹄疫或小反刍兽疫与羊痘，没有本发明的报道。

附图说明

图1为狂犬病毒G蛋白-羊痘病毒重组疫苗转移载体模型设计；

图2为三个基因融合PCR法连接原理模式；

图3为两个基因融合PCR法连接原理模式；

图4为各基因片段分别PCR扩增电泳结果，其中，M：DNA Marker 2K；1：GFP基因；2、4：G蛋白基因全长；3、7.5-GFP基因；5：G蛋白膜外区基因；6：启动子VV7.5基因；

图5为二基因融合PCR扩增电泳结果，其中，M：DNA Marker 2K Plus；1：7.5-GFP融合基因；2：7.5-RVGQ融合基因；3：7.5-RVGW融合基因；

图6为三基因融合PCR扩增电泳结果，其中，M：DNA Marker 2K Plus；1：7.5-GFP-RVGQ融合基因；2：7.5-GFP-RVGW融合基因；3：7.5-RVGQ-GFP融合基因；4：7.5-RVGW-GFP融合基因；

图7为部分重组病毒转移载体酶切鉴定结果，其中，M：DNA Marker 2K Plus；1-8：依次是质粒PGM-TK13-7.5-GFP-RVGW、PGM-TK13-7.5-RVGW-GFP、PGM-TK13-GFP-7.5-RVGW-7.5、PGM-TK13-7.5-GFP-RVGQ、PGM-TK13-RCGW-A8R-GFP、PGM-TK13-7.5-RVGQ-GFP、PGM-TK13-GFP-7.5-RVGW-7.5、PGM-TK13-RCGQ-A8R-GFP；

图8为重组病毒rGTPV-GFP-7.5-RVGQ-7.5重组纯化结果；

图9为重组病毒rGTPV-GFP-7.5-RVGW-7.5重组纯化结果；

图10为重组病毒纯化的PCR结果，其中，M：DNA Marker 2K Plus；1、2：羊痘病毒疫苗；

图11为重组病毒G蛋白表达的SDS-PAGE结果，其中，泳道M：Protein Marker；泳道1，2为rGTPV-GFP-7.5--RVGQ7.5重组病毒上清与沉淀检测结果；泳道3，4为rGTPV-GFP-7.5-RVGW-7.5重组病毒上清与沉淀检测结果；泳道5，6为疫苗株病毒上清及沉淀检测结果；

图12为重组病毒G蛋白表达的Western blot鉴定结果；其中，M：Protein Marker；1，2：rGTPV-GFP-7.5--RVGQ7.5重组病毒上清与沉淀检测结果显示G蛋白成功表达；泳道3，4为rGTPV-GFP-7.5-RVGW-7.5重组病毒上清与沉淀检测结果显示G蛋白成功表达；泳道5，6为疫苗株病毒上清及沉淀检测结果；

图13为重组病毒G蛋白表达的ELISA鉴定结果；

图14为重组病毒免疫羊血清中和抗体检测结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步详细地说明。

一种狂犬病毒G蛋白-羊痘病毒重组疫苗构建方法，包括以下步骤：

步骤1、重组病毒疫苗构建模型设计

根据痘病毒重组疫苗设计原理，选择羊痘病毒TK基因为外源基因插入的非必需区，痘苗病毒VV7.5和山羊痘病毒A8R双向启动子为备选启动子，绿色荧光光蛋白为报告基因，与狂犬病毒G蛋白构建重组病毒的表达载体。为了筛选最选的疫苗组合，共设计了10种组合，G蛋白选用了全长和膜外区两种形式。具体设计模型如图1。

(1)TK基因中插入位点选Acc65 I；

步骤2、各基因的扩增及各组合基因的融合扩增

(1)引物设计

根据不同组合的具体设计需要，设计不同引物用于扩增目的基因片段，引物如1表：

表1引物设计与合成

注：有下划线的的序列为酶切位点：GGTACC为Acc65 I酶切位点、GGATCC为BamH I酶切位点GAATT为EcoR I酶切位点，CTGCAG为Pst I酶切位点。

(2)PCR扩增

G蛋白与GFP融合表达的形式采用三片段融合PCR法将两蛋白基因与VV7.5启动子融合在一起，先分别扩增单个基因片段，再将3个片段融合扩增在一起，如图2模式：TK基因直接普通PCR扩增。

VV7.5与G蛋白或GFP蛋白表达的情况以及A8R双向启动子与G蛋白和GFP蛋白的连接，先分别扩增单个基因片段，采用两片段融合，再用酶切连接的方式构建；如图3模式：

单一基因片段扩增体系及程序为：25μL扩增体系为：Primer star酶0.3μL，Buffer5μL，dNTP 1μL，上下游引物各0.6μL，模板0.8μL，ddH2O 16.7μL；扩增程序为：预变性95℃5min，变性95℃30s，退火55℃30s，延伸72℃90s，再延伸72℃10min，共循环35次。扩增结果如图4。

融合扩增体系及程序为：分别用要融合的几个扩增单一基因产物为模板，用第一基因的上游引物和最后基因的下游引物进行直接融合扩增出目的片段。25μL扩增体系为：primer star酶0.3μL，Buffer 5μL，dNTP 1μL，上下游引物各0.6μL，多个模板总和为0.8μL，ddH2O 16.7μL；扩增程序为：预变性95℃5min，变性95℃30s，退火55℃30s，延伸72℃90s，后延伸72℃10min，共循环30次。扩增结果如图5、图6。

各PCR产物的纯化回收及鉴定：采用切胶回收法(常规方法)

步骤3、各种组合重组转移载体的构建

(1)TK基因：将扩增的TK基因直接与克隆载体PGEM-T载体连接得PGEM13-TK载体，并鉴定。(常规方法)

(3)连接

(4)转化

(5)转移载体构建的鉴定

挑取单菌落振摇培养6-8h，以菌液为模板进行PCR扩增鉴定。

提取质粒做酶切鉴定，如图7。

最终成功构建狂犬病毒G蛋白-山羊痘病毒重组病毒转移载体8种：PGM-TK13-GFP-7.5-RVGQ-7.5、PGM-TK13-GFP-7.5-RVGW-7.5、PGM-TK13-7.5-GFP-RVGQ、PGM-TK13-7.5-GFP-RVGW、PGM-TK13-7.5-RVGQ-GFP、PGM-TK13-7.5-RVGW-GFP、PGM-TK13-RVGQ-A8R-GFP、PGM-TK13-RVGW-A8R-GFP。

步骤4、狂犬病毒G蛋白-羊痘病毒的重组及病毒纯化

(1)细胞制备：制备羊睾丸原代细胞(常规方法)。

(2)羊痘病毒疫苗株的培养：待羊睾丸原代细胞长好，接种山羊痘病毒疫苗株AV41。并观察生长情况。

(4)重组病毒的纯化

(5)重组病毒纯化的鉴定

镜检：荧光显微镜观察有几乎99％的细胞均带荧光，说明重组病毒已经纯化，最终得到重组纯化的重组病毒两株：rGTPV-GFP-7.5-RVGQ-7.5和rGTPV-GFP-7.5-RVGW-7.5，结果如图8、图9；

PCR检测：取重组病毒的细胞培养物，提取其基因组，PCR检测其中G蛋白基因、GFP基因及TK基因，同时与山羊痘病毒疫苗株的细胞培养物做比较。结果如图10；

步骤5、狂犬病毒G蛋白表达检测

(1)G蛋白Western-blot检测

细胞培养纯化的重组病毒，细胞裂解液200μL裂解其培养物并用细胞铲刮取裂解产物，加SDS-PAGE上样Buffer并于沸水浴煮沸10min；做SDS-PAGE电泳，并按常规方法做考染或western blot检测。结果如图11、图12；

(2)ELISA法检测细胞培养物中G蛋白表达情况

培养标准山羊痘疫苗株及已纯化的狂犬病毒G蛋白-羊痘疫苗重组病毒株rGTPV-GFP-7.5-RVGQ-7.5和rGTPV-GFP-7.5-RVGW-7.5，细胞全部被感染后，收取培养上清液并刮取底层细胞，细胞加细胞裂解液裂解并超声破碎，将其离心分为细胞上清和细胞沉淀。购买狂犬病毒G蛋白抗原检测ELISA试剂盒，常规方法检测以上处理样品中G蛋白含量。两株重组病毒G蛋白表达量与对照组(山羊痘疫苗株)显著升高，差异极显著，且G蛋白膜外区的表达量明显高于全长。另外对细胞培养液、细胞破碎后上清及沉淀中G蛋白含量的检测结果是细胞培养液和细胞破碎后上清中G蛋白含量接近，且明高于细胞破碎后沉淀中，说明G蛋白表达后主要以分泌型蛋白形式表达在细胞外，非常适合做免疫抗原，是制备疫苗的最佳抗原蛋白。结果如图13；

步骤6、狂犬病毒G蛋白-山羊痘重组病毒疫苗株免疫效果检测

(1)重组羊痘疫苗株注射液的制备

(2)免疫接种试验

(3)血清中G蛋白中和抗体检测

购买绵羊源G抗体检测试剂盒，按说明书进行操作检测羊血清中G蛋白中和抗体水平情况，与山羊痘病毒疫苗株的免疫血清为对照。两株重组病毒免疫组羊血清中G蛋白中和抗体与对照组显著升高，差异极显著，且G蛋白膜外区的中和抗体浓度明显高于全长。结果如图14。

具体操作如下：

(3)温育：用封板膜封板后置37℃温育30min；

(4)配液：将30倍浓缩稀释液用蒸馏水30倍稀释后备用；

(6)加酶：每孔加入酶标试剂μL，空白孔除外；

(7)温育：操作同3；

(8)洗涤：操作同5；

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，本发明的保护范围不限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，可显而易见地得到的技术方案的简单变化或等效替换均落入本发明的保护范围内。

序列表

<110> 塔里木大学

<120> 一种狂犬病毒G蛋白-羊痘病毒重组疫苗的构建方法

<160> 35

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

ggggtaccgg atccatatgc cggtagttgc g 31

<210> 2

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

ggagagcctg aggaaccatc ttgtacagct cgtc 34

<210> 3

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gacgagctgt acaagatggt tcctcaggct ctcc 34

<210> 4

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

ggggtacctc acagtctggt ctcacc 26

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggggtacctt acttccccca gttcgg 26

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

ggggtaccgg atccatatgc cggtagttgc g 31

<210> 7

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

ggagagcctg aggaaccatg atccgtcact gttcttt 37

<210> 8

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

aaagaacagt gacggatcat ggttcctcag gctctcc 37

<210> 9

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

cgcggatcct cacagtctgg tctcacc 27

<210> 10

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

cgcggatcct tacttccccc agttcgg 27

<210> 11

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

ggggtaccgg atccatatgc cggtagttgc g 31

<210> 12

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

ggggtacctt acttgtacag ctcgtc 26

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

ggggtaccat atgccggtag ttgcg 25

<210> 14

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

ggagagcctg aggaaccatg atccgtcact gttcttt 37

<210> 15

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

aaagaacagt gacggatcat ggttcctcag gctctcc 37

<210> 16

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

ctcgcccttg ctcaccattc acagtctggt ctcacc 36

<210> 17

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

ggtgagacca gactgtgaat ggtgagcaag ggcgag 36

<210> 18

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

ggggtacctt acttgtacag ctcgtc 26

<210> 19

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

ctcgcccttg ctcaccatct tcccccagtt cgg 33

<210> 20

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

ccgaactggg ggaagatggt gagcaagggc gag 33

<210> 21

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

ggggtacctc acagtctggt ctcaccccca ct 32

<210> 22

<211> 38

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

cagtataaat aaagccacca tggttcctca ggctctcc 38

<210> 23

<211> 98

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

ggagagcctg aggaaccatg gtggctttat ttatactgta taaagtgaaa ttctatacct 60

attacataaa cttttgttat tgccaccatg gtgagcaa 98

<210> 24

<211> 47

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

ggggtacctt agtggtggtg gtggtggtgc ttgtacagct cgtccat 47

<210> 25

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

ggggtacctt acttccccca gttcgggaga 30

<210> 26

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

gaattccaag ccactacaag aacc 24

<210> 27

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

ctgcagctga tccaacatat acta 24

<210> 28

<211> 2505

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

caacatttat actgcgctat ttggtaccgg atccatatgc cggtagttgc gatatacata 60

aactgatcac taattccaaa cccacccgct ttttatagta agtttttcac ccataaataa 120

taaatacaat aattaatttc tcgtaaaagt agaaaatata ttctaattta ttgcacggta 180

aggaagtaga atcataaaga acagtgacgg atcatggtga gcaagggcga ggagctgttc 240

accggggtgg tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg taaacggcca caagttcagc 300

gtgtccggcg agggcgaggg cgatgccacc tacggcaagc tgaccctgaa gttcatctgc 360

accaccggca agctgcccgt gccctggccc accctcgtga ccaccctgac ctacggcgtg 420

cagtgcttca gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg acttcttcaa gtccgccatg 480

cccgaaggct acgtccagga gcgcaccatc ttcttcaagg acgacggcaa ctacaagacc 540

cgcgccgagg tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc gcatcgagct gaagggcatc 600

gacttcaagg aggacggcaa catcctgggg cacaagctgg agtacaacta caacagccac 660

aacgtctata tcatggccga caagcagaag aacggcatca aggtgaactt caagatccgc 720

cacaacatcg aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact accagcagaa cacccccatc 780

ggcgacggcc ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga gcacccagtc cgccctgagc 840

aaagacccca acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg agttcgtgac cgccgccggg 900

atcactctcg gcatggacga gctgtacaag atggttcctc aggctctcct gtttgtaccc 960

cttctggttt ttccattgtg ttttgggaaa ttccctattt acacgatacc agacaagctt 1020

ggtccctgga gtccgattga catacatcac ctcagctgcc caaacaattt ggtagtggag 1080

gacgaaggat gcaccaacct gtcagggttc tcctacatgg aacttaaagt tggatacatc 1140

ttagccataa aagtgaacgg gttcacttgc acaggcgttg tgacggaggc tgaaacctac 1200

actaacttcg ttggttatgt cacaaccacg ttcaaaagaa agcatttccg cccaacacca 1260

gatgcatgta gagccgcgta caactggaag atggccggtg accccagata tgaagagtct 1320

ctacacaatc cgtaccctga ctaccgctgg cttcgaactg taaaaaccac caaggagtct 1380

ctcgttatca tatctccaag tgtggcagat ttggacccat atgacagatc ccttcactcg 1440

agggtcttcc ctagcgggaa gtgctcagga gtagcggtgt cttctaccta ctgctccact 1500

aaccacgatt acaccatttg gatgcccgag aatccgagac tagggatgtc ttgtgacatt 1560

tttacctcca gtagagggaa gagagcatcc aaagggagtg agacttgcgg ctttgtagat 1620

gaaagaggcc tatataagtc tttaaaagga gcatgcaaac tcaagttatg tggagttcta 1680

ggacttagac ttatggatgg aacatgggtc tcgatgcaaa catcaaatga aaccaaatgg 1740

tgccctcccg ataagttggt gaacctgcac gactttcgct cagacgaaat tgagcacctt 1800

gttgtagagg agttggtcag gaagagagag gagtgtctgg atgcactaga gtccatcatg 1860

acaaccaagt cagtgagttt cagacgtctc agtcatttaa gaaaacttgt ccctgggttt 1920

ggaaaagcat ataccatatt caacaagacc ttgatggaag ccgatgctca ctacaagtca 1980

gtcgaaactt ggaatgagat cctcccttca aaagggtgtt taagagttgg ggggaggtgt 2040

catcctcatg tgaacggggt gtttttcaat ggtataatat taggacctga cggcaatgtc 2100

ttaatcccag agatgcaatc atccctcctc cagcaacata tggagttgtt ggaatcctcg 2160

gttatccccc ttgtgcaccc cctggcagac ccgtctaccg ttttcaagga cggtgacgag 2220

gctgaggatt ttgttgaagt tcaccttccc gatgtgcaca atcaggtctc aggagttgac 2280

ttgggtctcc cgaactgggg gaagtatgta ttactgagtg caggggccct gactgccttg 2340

atgttgataa ttttcctgat gacatgttgt agaagagtca atcgatcaga acctacgcaa 2400

cacaatctca gagggacagg gagggaggtg tcagtcactc cccaaagcgg gaagatcata 2460

tcttcatggg aatcacacaa gagtgggggt gagaccagac tgtga 2505

<210> 29

<211> 2303

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 29

caacatttat actgcgctat ttggtaccgg atccaatgcc ggtagttgcg atatacataa 60

actgatcact aattccaaac ccacccgctt tttatagtaa gtttttcacc cataaataat 120

aaatacaata attaatttct cgtaaaagta gaaaatatat tctaatttat tgcacggtaa 180

ggaagtagaa tcataaagaa cagtgacgga tcatggtgag caagggcgag gagctgttca 240

ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt aaacggccac aagttcagcg 300

tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct acggcaagct gaccctgaag ttcatctgca 360

ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac caccctgacc tacggcgtgc 420

agtgcttcag ccgctacccc gaccacatga agcagcacga cttcttcaag tccgccatgc 480

ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga cgacggcaac tacaagaccc 540

gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg catcgagctg aagggcatcg 600

acttcaagga ggacggcaac atcctggggc acaagctgga gtacaactac aacagccaca 660

acgtctatat catggccgac aagcagaaga acggcatcaa ggtgaacttc aagatccgcc 720

acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg ccgaccacta ccagcagaac acccccatcg 780

gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag cacccagtcc gccctgagca 840

aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg tcctgctgga gttcgtgacc gccgccggga 900

tcactctcgg catggacgag ctgtacaaga tggttcctca ggctctcctg tttgtacccc 960

ttctggtttt tccattgtgt tttgggaaat tccctattta cacgatacca gacaagcttg 1020

gtccctggag tccgattgac atacatcacc tcagctgccc aaacaatttg gtagtggagg 1080

acgaaggatg caccaacctg tcagggttct cctacatgga acttaaagtt ggatacatct 1140

tagccataaa agtgaacggg ttcacttgca caggcgttgt gacggaggct gaaacctaca 1200

ctaacttcgt tggttatgtc acaaccacgt tcaaaagaaa gcatttccgc ccaacaccag 1260

atgcatgtag agccgcgtac aactggaaga tggccggtga ccccagatat gaagagtctc 1320

tacacaatcc gtaccctgac taccgctggc ttcgaactgt aaaaaccacc aaggagtctc 1380

tcgttatcat atctccaagt gtggcagatt tggacccata tgacagatcc cttcactcga 1440

gggtcttccc tagcgggaag tgctcaggag tagcggtgtc ttctacctac tgctccacta 1500

accacgatta caccatttgg atgcccgaga atccgagact agggatgtct tgtgacattt 1560

ttacctccag tagagggaag agagcatcca aagggagtga gacttgcggc tttgtagatg 1620

aaagaggcct atataagtct ttaaaaggag catgcaaact caagttatgt ggagttctag 1680

gacttagact tatggatgga acatgggtct cgatgcaaac atcaaatgaa accaaatggt 1740

gccctcccga taagttggtg aacctgcacg actttcgctc agacgaaatt gagcaccttg 1800

ttgtagagga gttggtcagg aagagagagg agtgtctgga tgcactagag tccatcatga 1860

caaccaagtc agtgagtttc agacgtctca gtcatttaag aaaacttgtc cctgggtttg 1920

gaaaagcata taccatattc aacaagacct tgatggaagc cgatgctcac tacaagtcag 1980

tcgaaacttg gaatgagatc ctcccttcaa aagggtgttt aagagttggg gggaggtgtc 2040

atcctcatgt gaacggggtg tttttcaatg gtataatatt aggacctgac ggcaatgtct 2100

taatcccaga gatgcaatca tccctcctcc agcaacatat ggagttgttg gaatcctcgg 2160

ttatccccct tgtgcacccc ctggcagacc cgtctaccgt tttcaaggac ggtgacgagg 2220

ctgaggattt tgttgaagtt caccttcccg atgtgcacaa tcaggtctca ggagttgact 2280

tgggtctccc gaactggggg aag 2303

<210> 30

<211> 2502

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 30

caacatttat actgcgctat ttggtaccat atgccggtag ttgcgatata cataaactga 60

tcactaattc caaacccacc cgctttttat agtaagtttt tcacccataa ataataaata 120

caataattaa tttctcgtaa aagtagaaaa tatattctaa tttattgcac ggtaaggaag 180

tagaatcata aagaacagtg acggatcatg gttcctcagg ctctcctgtt tgtacccctt 240

ctggtttttc cattgtgttt tgggaaattc cctatttaca cgataccaga caagcttggt 300

ccctggagtc cgattgacat acatcacctc agctgcccaa acaatttggt agtggaggac 360

gaaggatgca ccaacctgtc agggttctcc tacatggaac ttaaagttgg atacatctta 420

gccataaaag tgaacgggtt cacttgcaca ggcgttgtga cggaggctga aacctacact 480

aacttcgttg gttatgtcac aaccacgttc aaaagaaagc atttccgccc aacaccagat 540

gcatgtagag ccgcgtacaa ctggaagatg gccggtgacc ccagatatga agagtctcta 600

cacaatccgt accctgacta ccgctggctt cgaactgtaa aaaccaccaa ggagtctctc 660

gttatcatat ctccaagtgt ggcagatttg gacccatatg acagatccct tcactcgagg 720

gtcttcccta gcgggaagtg ctcaggagta gcggtgtctt ctacctactg ctccactaac 780

cacgattaca ccatttggat gcccgagaat ccgagactag ggatgtcttg tgacattttt 840

acctccagta gagggaagag agcatccaaa gggagtgaga cttgcggctt tgtagatgaa 900

agaggcctat ataagtcttt aaaaggagca tgcaaactca agttatgtgg agttctagga 960

cttagactta tggatggaac atgggtctcg atgcaaacat caaatgaaac caaatggtgc 1020

cctcccgata agttggtgaa cctgcacgac tttcgctcag acgaaattga gcaccttgtt 1080

gtagaggagt tggtcaggaa gagagaggag tgtctggatg cactagagtc catcatgaca 1140

accaagtcag tgagtttcag acgtctcagt catttaagaa aacttgtccc tgggtttgga 1200

aaagcatata ccatattcaa caagaccttg atggaagccg atgctcacta caagtcagtc 1260

gaaacttgga atgagatcct cccttcaaaa gggtgtttaa gagttggggg gaggtgtcat 1320

cctcatgtga acggggtgtt tttcaatggt ataatattag gacctgacgg caatgtctta 1380

atcccagaga tgcaatcatc cctcctccag caacatatgg agttgttgga atcctcggtt 1440

atcccccttg tgcaccccct ggcagacccg tctaccgttt tcaaggacgg tgacgaggct 1500

gaggattttg ttgaagttca ccttcccgat gtgcacaatc aggtctcagg agttgacttg 1560

ggtctcccga actgggggaa gtatgtatta ctgagtgcag gggccctgac tgccttgatg 1620

ttgataattt tcctgatgac atgttgtaga agagtcaatc gatcagaacc tacgcaacac 1680

aatctcagag ggacagggag ggaggtgtca gtcactcccc aaagcgggaa gatcatatct 1740

tcatgggaat cacacaagag tgggggtgag accagactgt gaatggtgag caagggcgag 1800

gagctgttca ccggggtggt gcccatcctg gtcgagctgg acggcgacgt aaacggccac 1860

aagttcagcg tgtccggcga gggcgagggc gatgccacct acggcaagct gaccctgaag 1920

ttcatctgca ccaccggcaa gctgcccgtg ccctggccca ccctcgtgac caccctgacc 1980

tacggcgtgc agtgcttcag ccgctacccc gaccacatga agcagcacga cttcttcaag 2040

tccgccatgc ccgaaggcta cgtccaggag cgcaccatct tcttcaagga cgacggcaac 2100

tacaagaccc gcgccgaggt gaagttcgag ggcgacaccc tggtgaaccg catcgagctg 2160

aagggcatcg acttcaagga ggacggcaac atcctggggc acaagctgga gtacaactac 2220

aacagccaca acgtctatat catggccgac aagcagaaga acggcatcaa ggtgaacttc 2280

aagatccgcc acaacatcga ggacggcagc gtgcagctcg ccgaccacta ccagcagaac 2340

acccccatcg gcgacggccc cgtgctgctg cccgacaacc actacctgag cacccagtcc 2400

gccctgagca aagaccccaa cgagaagcgc gatcacatgg tcctgctgga gttcgtgacc 2460

gccgccggga tcactctcgg catggacgag ctgtacaagt aa 2502

<210> 31

<211> 2300

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 31

cggttattgt agatagttaa aggtaccata tgccggtagt tgcgatatac ataaactgat 60

cactaattcc aaacccaccc gctttttata gtaagttttt cacccataaa taataaatac 120

aataattaat ttctcgtaaa agtagaaaat atattctaat ttattgcacg gtaaggaagt 180

agaatcataa agaacagtga cggatcatgg ttcctcaggc tctcctgttt gtaccccttc 240

tggtttttcc attgtgtttt gggaaattcc ctatttacac gataccagac aagcttggtc 300

cctggagtcc gattgacata catcacctca gctgcccaaa caatttggta gtggaggacg 360

aaggatgcac caacctgtca gggttctcct acatggaact taaagttgga tacatcttag 420

ccataaaagt gaacgggttc acttgcacag gcgttgtgac ggaggctgaa acctacacta 480

acttcgttgg ttatgtcaca accacgttca aaagaaagca tttccgccca acaccagatg 540

catgtagagc cgcgtacaac tggaagatgg ccggtgaccc cagatatgaa gagtctctac 600

acaatccgta ccctgactac cgctggcttc gaactgtaaa aaccaccaag gagtctctcg 660

ttatcatatc tccaagtgtg gcagatttgg acccatatga cagatccctt cactcgaggg 720

tcttccctag cgggaagtgc tcaggagtag cggtgtcttc tacctactgc tccactaacc 780

acgattacac catttggatg cccgagaatc cgagactagg gatgtcttgt gacattttta 840

cctccagtag agggaagaga gcatccaaag ggagtgagac ttgcggcttt gtagatgaaa 900

gaggcctata taagtcttta aaaggagcat gcaaactcaa gttatgtgga gttctaggac 960

ttagacttat ggatggaaca tgggtctcga tgcaaacatc aaatgaaacc aaatggtgcc 1020

ctcccgataa gttggtgaac ctgcacgact ttcgctcaga cgaaattgag caccttgttg 1080

tagaggagtt ggtcaggaag agagaggagt gtctggatgc actagagtcc atcatgacaa 1140

ccaagtcagt gagtttcaga cgtctcagtc atttaagaaa acttgtccct gggtttggaa 1200

aagcatatac catattcaac aagaccttga tggaagccga tgctcactac aagtcagtcg 1260

aaacttggaa tgagatcctc ccttcaaaag ggtgtttaag agtggggggg aggtgtcatc 1320

ctcatgtgaa cggggtgttt ttcaatggta taatattagg acctgacggc aatgtcttaa 1380

tcccagagat gcaatcatcc ctcctccagc aacatatgga gttgttggaa tcctcggtta 1440

tcccccttgt gcaccccctg gcagacccgt ctaccgtttt caaggacggt gacgaggctg 1500

aggattttgt tgaagttcac cttcccgatg tgcacaatca ggtctcagga gttgacttgg 1560

gtctcccgaa ctgggggaag atggtgagca agggcgagga gctgttcacc ggggtggtgc 1620

ccatcctggt cgagctggac ggcgacgtaa acggccacaa gttcagcgtg tccggcgagg 1680

gcgagggcga tgccacctac ggcaagctga ccctgaagtt catctgcacc accggcaagc 1740

tgcccgtgcc ctggcccacc ctcgtgacca ccctgaccta cggcgtgcag tgcttcagcc 1800

gctaccccga ccacatgaag cagcacgact tcttcaagtc cgccatgccc gaaggctacg 1860

tccaggagcg caccatcttc ttcaaggacg acggcaacta caagacccgc gccgaggtga 1920

agttcgaggg cgacaccctg gtgaaccgca tcgagctgaa gggcatcgac ttcaaggagg 1980

acggcaacat cctggggcac aagctggagt acaactacaa cagccacaac gtctatatca 2040

tggccgacaa gcagaagaac ggcatcaagg tgaacttcaa gatccgccac aacatcgagg 2100

acggcagcgt gcagctcgcc gaccactacc agcagaacac ccccatcggc gacggccccg 2160

tgctgctgcc cgacaaccac tacctgagca cccagtccgc cctgagcaaa gaccccaacg 2220

agaagcgcga tcacatggtc ctgctggagt tcgtgaccgc cgccgggatc actctcggca 2280

tggacgagct gtacaagtaa 2300

<210> 32

<211> 2706

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 32

tccagggacc aagcttgtct ggtatcgtgt aaatagggaa tttcccaaaa cacaatggaa 60

aaaccagaag gggtacaaac aggagagcct gaggaaccat gatccgtcac tgttctttat 120

gattctactt ccttaccgtg caataaatta gaatatattt tctactttta cgagaaatta 180

attattgtat ttattattta tgggtgaaaa acttactata aaaagcgggt gggtttggaa 240

ttagtgatca gtttatgtat atcgcaacta ccggcatatg gtacctttaa ctatctacaa 300

taaccgatgg ttcctcaggc tctcctgttt gtaccccttc tggtttttcc attgtgtttt 360

gggaaattcc ctatttacac gataccagac aagcttggtc cctggagccc gattgacata 420

catcacctaa gctgcccaaa caatttggta gtggaggacg aaggatgcac caacctgtca 480

gggttctcct acatggaact taaagttgga tacaacttag ccataaaaat gaacgggttc 540

acttgcacag gcgttgtgac ggaggctgaa acctacacta acttcgttgg ttatgtcaca 600

accacgttca aaagaaagca tttccgccca acaccagatg catgtagagc cgcgtacaac 660

tggaagatgg ccggtgaccc cagatatgaa gagtctctac acaatccgta ccctgactac 720

cgctggcttc gaactgtaaa aaccaccaag gagtctctcg ttatcatatc tccaagtgtg 780

gcagatttgg acccatatga cagatccctt cactcgaggg tcttccctag cgggaagtgc 840

tcaggagtag cggtgtcttc tacctactgc tccactaacc acgattacac catttggatg 900

cccgagaatc cgagactagg gatgtcttgt gacattttta ccaatagtag agggaagaga 960

gcatccaaag ggagtgagac ttgcggcttt gtagatgaaa gaggcctata taagtcttta 1020

aaaggagcat gcaaactcaa gttatgtgga gttctaggac ttagacttat ggatggaaca 1080

tgggtcgcga tgcaaacatc aaatgaaacc aaatggtgcc ctcccgatca gttggtgaac 1140

ctgcacgact ttcgctcaga cgaaatagag caccttgttg tagaggagtt ggtcaggaag 1200

agagaggagt gtctggatgc actagagtcc atcatgacaa ccaagtcagt gagtttcaga 1260

cgtctcagtc atttaagaaa acttgtccct gggtttggaa aagcatatac catattcaac 1320

aagaccttga tggaagccga tgctcactac aagtcagtca gaacttggaa tgagatcctc 1380

ccttcaaaag ggtgtttaag agttgggggg aggtgtcatc ctcatgtgaa cggggtgttt 1440

ttcaatggta taatattagg acctgacggc aatgtcttaa tcccagagat gcaatcatcc 1500

ctcctccagc aacatatgga gttgttggaa tcctcggtta tcccccttgt gcaccccctg 1560

gcagacccgt ctaccgtttt caaggacggt gacgaggctg aggattttgt tgaagttcac 1620

cttcccgatg tgcacaatca ggtctcagga gttgacttgg gtctcccgaa ctgggggaag 1680

tccagggacc aagcttgtct ggtatcgtgt aaatagggaa tttcccaaaa cacaatggaa 1740

aaaccagaag gggtacaaac aggagagcct gaggaaccat gatccgtcac tgttctttat 1800

gattctactt ccttaccgtg caataaatta gaatatattt tctactttta cgagaaatta 1860

attattgtat ttattattta tgggtgaaaa acttactata aaaagcgggt gggtttggaa 1920

ttagtgatca gtttatgtat atcgcaacta ccggcatatg gtacctttaa ctatctacaa 1980

taaccgatgg tgagcaaggg cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag 2040

ctggacggcg acgtaaacgg ccacaagttc agcgtgtccg gcgagggcga gggcgatgcc 2100

acctacggca agctgaccct gaagttcatc tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg 2160

cccaccctcg tgaccaccct gacctacggc gtgcagtgct tcagccgcta ccccgaccac 2220

atgaagcagc acgacttctt caagtccgcc atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc 2280

atcttcttca aggacgacgg caactacaag acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac 2340

accctggtga accgcatcga gctgaagggc atcgacttca aggaggacgg caacatcctg 2400

gggcacaagc tggagtacaa ctacaacagc cacaacgtct atatcatggc cgacaagcag 2460

aagaacggca tcaaggtgaa cttcaagatc cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag 2520

ctcgccgacc actaccagca gaacaccccc atcggcgacg gccccgtgct gctgcccgac 2580

aaccactacc tgagcaccca gtccgccctg agcaaagacc ccaacgagaa gcgcgatcac 2640

atggtcctgc tggagttcgt gaccgccgcc gggatcactc tcggcatgga cgagctgtac 2700

aagtaa 2706

<210> 33

<211> 2909

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 33

tccagggacc aagcttgtct ggtatcgtgt aaatagggaa tttcccaaaa cacaatggaa 60

aaaccagaag gggtacaaac aggagagcct gaggaaccat gatccgtcac tgttctttat 120

gattctactt ccttaccgtg caataaatta gaatatattt tctactttta cgagaaatta 180

attattgtat ttattattta tgggtgaaaa acttactata aaaagcgggt gggtttggaa 240

ttagtgatca gtttatgtat atcgcaacta ccggcatatg gtacctttaa ctatctacaa 300

taaccgatgg ttcctcaggc tctcctgttt gtaccccttc tggtttttcc attgtgtttt 360

gggaaattcc ctatttacac gataccagac aagcttggtc cctggagtcc gattgacata 420

catcacctca gctgcccaaa caatttggta gtggaggacg aaggatgcac caacctgtca 480

gggttctcct acatggaact taaagttgga tacatcttag ccataaaagt gaacgggttc 540

acttgcacag gcgttgtgac ggaggctgaa acctacacta acttcgttgg ttatgtcaca 600

accacgttca aaagaaagca tttccgccca acaccagatg catgtagagc cgcgtacaac 660

tggaagatgg ccggtgaccc cagatatgaa gagtctctac acaatccgta ccctgactac 720

cgctggcttc gaactgtaaa aaccaccaag gagtctctcg ttatcatatc tccaagtgtg 780

gcagatttgg acccatatga cagatccctt cactcgaggg tcttccctag cgggaagtgc 840

tcaggagtag cggtgtcttc tacctactgc tccactaacc acgattacac catttggatg 900

cccgagaatc cgagactagg gatgtcttgt gacattttta cctccagtag agggaagaga 960

gcatccaaag ggagtgagac ttgcggcttt gtagatgaaa gaggcctata taagtcttta 1020

aaaggagcat gcaaactcaa gttatgtgga gttctaggac ttagacttat ggatggaaca 1080

tgggtctcga tgcaaacatc aaatgaaacc aaatggtgcc ctcccgataa gttggtgaac 1140

ctgcacgact ttcgctcaga cgaaattgag caccttgttg tagaggagtt ggtcaggaag 1200

agagaggagt gtctggatgc actagagtcc atcatgacaa ccaagtcagt gagtttcaga 1260

cgtctcagtc atttaagaaa acttgtccct gggtttggaa aagcatatac catattcaac 1320

aagaccttga tggaagccga tgctcactac aagtcagtcg aaacttggaa tgagatcctc 1380

ccttcaaaag ggtgtttaag agttgggggg aggtgtcatc ctcatgtgaa cggggtgttt 1440

ttcaatggta taatattagg acctgacggc aatgtcttaa tcccagagat gcaatcatcc 1500

ctcctccagc aacatatgga gttgttggaa tcctcggtta tcccccttgt gcaccccctg 1560

gcagacccgt ctaccgtttt caaggacggt gacgaggctg aggattttgt tgaagttcac 1620

cttcccgatg tgcacaatca ggtctcagga gttgacttgg gtctcccgaa ctgggggaag 1680

tatgtattac tgagtgcagg ggccctgact gccttgatgt tgataatttt cctgatgaca 1740

tgttgtagaa gagtcaatcg atcagaacct acgcaacaca atctcagagg gacagggagg 1800

gaggtgtcag tcactcccca aagcgggaag atcatatctt catgggaatc acacaagagt 1860

gggggtgaga ccagactgtg avvtccaggg accaagcttg tctggtatcg tgtaaatagg 1920

gaatttccca aaacacaatg gaaaaaccag aaggggtaca aacaggagag cctgaggaac 1980

catgatccgt cactgttctt tatgattcta cttccttacc gtgcaataaa ttagaatata 2040

ttttctactt ttacgagaaa ttaattattg tatttattat ttatgggtga aaaacttact 2100

ataaaaagcg ggtgggtttg gaattagtga tcagtttatg tatatcgcaa ctaccggcat 2160

atggtacctt taactatcta caataaccga tggtgagcaa gggcgaggag ctgttcaccg 2220

gggtggtgcc catcctggtc gagctggacg gcgacgtaaa cggccacaag ttcagcgtgt 2280

ccggcgaggg cgagggcgat gccacctacg gcaagctgac cctgaagttc atctgcacca 2340

ccggcaagct gcccgtgccc tggcccaccc tcgtgaccac cctgacctac ggcgtgcagt 2400

gcttcagccg ctaccccgac cacatgaagc agcacgactt cttcaagtcc gccatgcccg 2460

aaggctacgt ccaggagcgc accatcttct tcaaggacga cggcaactac aagacccgcg 2520

ccgaggtgaa gttcgagggc gacaccctgg tgaaccgcat cgagctgaag ggcatcgact 2580

tcaaggagga cggcaacatc ctggggcaca agctggagta caactacaac agccacaacg 2640

tctatatcat ggccgacaag cagaagaacg gcatcaaggt gaacttcaag atccgccaca 2700

acatcgagga cggcagcgtg cagctcgccg accactacca gcagaacacc cccatcggcg 2760

acggccccgt gctgctgccc gacaaccact acctgagcac ccagtccgcc ctgagcaaag 2820

accccaacga gaagcgcgat cacatggtcc tgctggagtt cgtgaccgcc gccgggatca 2880

ctctcggcat ggacgagctg tacaagtaa 2909

<210> 34

<211> 2363

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 34

tcacagtctg gtctcacccc cactcttgtg tgattcccat gaagatatga tcttcccgct 60

ttggggagtg actgacacct ccctccctgt ccctctgaga ttgtgttgcg taggttctga 120

tcgattgact cttctacaac atgtcatcag gaaaattatc aacatcaagg cagtcagggc 180

ccctgcactc agtaatacat acttccccca gttcgggaga cccaagtcaa ctcctgagac 240

ctgattgtgc acatcgggaa ggtgaacttc aacaaaatcc tcagcctcgt caccgtcctt 300

gaaaacggta gacgggtctg ccagggggtg cacaaggggg ataaccgagg attccaacaa 360

ctccatatgt tgctggagga gggatgattg catctctggg attaagacat tgccgtcagg 420

tcctaatatt ataccattga aaaacacccc gttcacatga ggatgacacc tccccccaac 480

tcttaaacac ccttttgaag ggaggatctc attccaagtt tcgactgact tgtagtgagc 540

atcggcttcc atcaaggtct tgttgaatat ggtatatgct tttccaaacc cagggacaag 600

ttttcttaaa tgactgagac gtctgaaact cactgacttg gttgtcatga tggactctag 660

tgcatccaga cactcctctc tcttcctgac caactcctct acaacaaggt gctcaatttc 720

gtctgagcga aagtcgtgca ggttcaccaa cttatcggga gggcaccatt tggtttcatt 780

tgatgtttgc atcgagaccc atgttccatc cataagtcta agtcctagaa ctccacataa 840

cttgagtttg catgctcctt ttaaagactt atataggcct ctttcatcta caaagccgca 900

agtctcactc cctttggatg ctctcttccc tctactggag gtaaaaatgt cacaagacat 960

ccctagtctc ggattctcgg gcatccaaat ggtgtaatcg tggttagtgg agcagtaggt 1020

agaagacacc gctactcctg agcacttccc gctagggaag accctcgagt gaagggatct 1080

gtcatatggg tccaaatctg ccacacttgg agatatgata acgagagact ccttggtggt 1140

ttttacagtt cgaagccagc ggtagtcagg gtacggattg tgtagagact cttcatatct 1200

ggggtcaccg gccatcttcc agttgtacgc ggctctacat gcatctggtg ttgggcggaa 1260

atgctttctt ttgaacgtgg ttgtgacata accaacgaag ttagtgtagg tttcagcctc 1320

cgtcacaacg cctgtgcaag tgaacccgtt cacttttatg gctaagatgt atccaacttt 1380

aagttccatg taggagaacc ctgacaggtt ggtgcatcct tcgtcctcca ctaccaaatt 1440

gtttgggcag ctgaggtgat gtatgtcaat cggactccag ggaccaagct tgtctggtat 1500

cgtgtaaata gggaatttcc caaaacacaa tggaaaaacc agaaggggta caaacaggag 1560

agcctgagga accatggtgg ctttatttat actgtataaa gtgaaattct atacctatta 1620

cataaacttt tgttattgcc accatggtga gcaagggcga ggagctgttc accggggtgg 1680

tgcccatcct ggtcgagctg gacggcgacg taaacggcca caagttcagc gtgtccggcg 1740

agggcgaggg cgatgccacc tacggcaagc tgaccctgaa gttcatctgc accaccggca 1800

agctgcccgt gccctggccc accctcgtga ccaccctgac ctacggcgtg cagtgcttca 1860

gccgctaccc cgaccacatg aagcagcacg acttcttcaa gtccgccatg cccgaaggct 1920

acgtccagga gcgcaccatc ttcttcaagg acgacggcaa ctacaagacc cgcgccgagg 1980

tgaagttcga gggcgacacc ctggtgaacc gcatcgagct gaagggcatc gacttcaagg 2040

aggacggcaa catcctgggg cacaagctgg agtacaacta caacagccac aacgtctata 2100

tcatggccga caagcagaag aacggcatca aggtgaactt caagatccgc cacaacatcg 2160

aggacggcag cgtgcagctc gccgaccact accagcagaa cacccccatc ggcgacggcc 2220

ccgtgctgct gcccgacaac cactacctga gcacccagtc cgccctgagc aaagacccca 2280

acgagaagcg cgatcacatg gtcctgctgg agttcgtgac cgccgccggg atcactctcg 2340

gcatggacga gctgtacaag taa 2363

<210> 35

<211> 2165

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 35

tcacttcccc cagttcggga gacccaagtc aactcctgag acctgattgt gcacatcggg 60

aaggtgaact tcaacaaaat cctcagcctc gtcaccgtcc ttgaaaacgg tagacgggtc 120

tgccaggggg tgcacaaggg ggataaccga ggattccaac aactccatat gttgctggag 180

gagggatgat tgcatctctg ggattaagac attgccgtca ggtcctaata ttataccatt 240

gaaaaacacc ccgttcacat gaggatgaca cctcccccca actcttaaac acccttttga 300

agggaggatc tcattccaag tttcgactga cttgtagtga gcatcggctt ccatcaaggt 360

cttgttgaat atggtatatg cttttccaaa cccagggaca agttttctta aatgactgag 420

acgtctgaaa ctcactgact tggttgtcat gatggactct agtgcatcca gacactcctc 480

tctcttcctg accaactcct ctacaacaag gtgctcaatt tcgtctgagc gaaagtcgtg 540

caggttcacc aacttatcgg gagggcacca tttggtttca tttgatgttt gcatcgagac 600

ccatgttcca tccataagtc taagtcctag aactccacat aacttgagtt tgcatgctcc 660

ttttaaagac ttatataggc ctctttcatc tacaaagccg caagtctcac tccctttgga 720

tgctctcttc cctctactgg aggtaaaaat gtcacaagac atccctagtc tcggattctc 780

gggcatccaa atggtgtaat cgtggttagt ggagcagtag gtagaagaca ccgctactcc 840

tgagcacttc ccgctaggga agaccctcga gtgaagggat ctgtcatatg ggtccaaatc 900

tgccacactt ggagatatga taacgagaga ctccttggtg gtttttacag ttcgaagcca 960

gcggtagtca gggtacggat tgtgtagaga ctcttcatat ctggggtcac cggccatctt 1020

ccagttgtac gcggctctac atgcatctgg tgttgggcgg aaatgctttc ttttgaacgt 1080

ggttgtgaca taaccaacga agttagtgta ggtttcagcc tccgtcacaa cgcctgtgca 1140

agtgaacccg ttcactttta tggctaagat gtatccaact ttaagttcca tgtaggagaa 1200

ccctgacagg ttggtgcatc cttcgtcctc cactaccaaa ttgtttgggc agctgaggtg 1260

atgtatgtca atcggactcc agggaccaag cttgtctggt atcgtgtaaa tagggaattt 1320

cccaaaacac aatggaaaaa ccagaagggg tacaaacagg agagcctgag gaaccatggt 1380

ggctttattt atactgtata aagtgaaatt ctatacctat tacataaact tttgttattg 1440

ccaccatggt gagcaagggc gaggagctgt tcaccggggt ggtgcccatc ctggtcgagc 1500

tggacggcga cgtaaacggc cacaagttca gcgtgtccgg cgagggcgag ggcgatgcca 1560

cctacggcaa gctgaccctg aagttcatct gcaccaccgg caagctgccc gtgccctggc 1620

ccaccctcgt gaccaccctg acctacggcg tgcagtgctt cagccgctac cccgaccaca 1680

tgaagcagca cgacttcttc aagtccgcca tgcccgaagg ctacgtccag gagcgcacca 1740

tcttcttcaa ggacgacggc aactacaaga cccgcgccga ggtgaagttc gagggcgaca 1800

ccctggtgaa ccgcatcgag ctgaagggca tcgacttcaa ggaggacggc aacatcctgg 1860

ggcacaagct ggagtacaac tacaacagcc acaacgtcta tatcatggcc gacaagcaga 1920

agaacggcat caaggtgaac ttcaagatcc gccacaacat cgaggacggc agcgtgcagc 1980

tcgccgacca ctaccagcag aacaccccca tcggcgacgg ccccgtgctg ctgcccgaca 2040

accactacct gagcacccag tccgccctga gcaaagaccc caacgagaag cgcgatcaca 2100

tggtcctgct ggagttcgtg accgccgccg ggatcactct cggcatggac gagctgtaca 2160

agtaa 2165

Claims

1.一种狂犬病毒G蛋白-羊痘病毒重组疫苗的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤1、重组病毒疫苗构建模型设计

根据痘病毒重组疫苗设计原理，选择羊痘病毒TK基因为外源基因插入的非必需区，痘苗病毒VV7.5和山羊痘病毒A8R双向启动子为备选启动子，绿色荧光光蛋白为报告基因，与狂犬病毒G蛋白构建重组病毒的表达载体；为了筛选最选的疫苗组合，共设计了10种组合，G蛋白选用了全长和膜外区两种形式；

步骤2、各基因的扩增及各组合基因的融合扩增

(1)引物设计

根据不同组合的具体设计需要，设计不同引物用于扩增目的基因片段，引物的序列如SEQ：ID：NO：1-SEQ：ID：NO：27所示；

(2)PCR扩增

G蛋白与GFP融合表达的形式采用三片段融合PCR法将两蛋白基因与VV7.5启动子融合在一起，先分别扩增单个基因片段，再将3个片段融合扩增在一起，TK基因直接普通PCR扩增；

步骤3、各种组合重组转移载体的构建

(1)TK基因：将扩增的TK基因直接与克隆载体PGEM-T载体连接得PGEM13-TK载体，并鉴定；

(2)酶切：PGEM13-TK载体，各融合PCR产物均进行Acc65 I的酶切；50μL酶切体系为：载体和PCR产物分别为35μL和30μL，Buffer各5μL，Acc65 I各3μL，ddH2O分别为7μL和12μL，混匀后于37℃水浴酶切3-4h，并对酶切产物进行切胶回收纯化；对载体的酶切产物进行去磷酸化：去磷酸化酶2μL，10×Buffer 5μL，酶切载体20μL，ddH2O 23μL；37℃1h，45℃15min；纯化回收，-20℃保存；

(3)连接

处理好的PCR产物及载体运用T4 DNA连接酶进行连接；10μL体系：PGM-TK13载体1μL，目的片段5μL，T4 DNA连接酶1μL，10×T4 DNA连接酶Buffer 1μL，ddH2O 2μL，并设立空白对照；

(4)转化

将各连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞并涂板培养；

(5)转移载体构建的鉴定

挑取单菌落振摇培养6-8h，以菌液为模板进行PCR扩增鉴定；

提取质粒做酶切鉴定；

最终成功构建狂犬病毒G蛋白-山羊痘病毒重组病毒转移载体8种：PGM-TK13-GFP-7.5-RVGQ-7.5、PGM-TK13-GFP-7.5-RVGW-7.5、PGM-TK13-7.5-GFP-RVGQ、PGM-TK13-7.5-GFP-RVGW、PGM-TK13-7.5-RVGQ-GFP、PGM-TK13-7.5-RVGW-GFP、PGM-TK13-RVGQ-A8R-GFP、PGM-TK13-RVGW-A8R-GFP，其序列如SEQ：ID：NO：28-SEQ：ID：NO：35所示；

步骤4、狂犬病毒G蛋白-羊痘病毒的重组及病毒纯化

(1)细胞制备：制备羊睾丸原代细胞；

(2)羊痘病毒疫苗株的培养：待羊睾丸原代细胞长好，接种山羊痘病毒疫苗株AV41，并观察生长情况；

(3)病毒重组：将构建并测序正确的重组转移载体PGM-TK13-GFP-7.5-RVGQ-7.5、PGM-TK13-GFP-7.5-RVGW-7.5、PGM-TK13-7.5-GPP-RVGQ、PGM-TK13-7.5-GFP-RVGW、PGM-TK13-7.5-RVGQ-GFP、PGM-TK13-7.5-RVGW-GFP、PGM-TK13-RVGQ-A8R-GFP、PGM-TK13-RVGW-A8R-GFP用Lip2000脂质体转染试剂转染转染至已经感染了山羊痘病毒疫苗株的羊睾丸原代细胞，培养并观察细胞病变情况及绿色荧光情况；具体步骤如下：

待12孔板中羊睾丸原代细胞长至85-90％，吸弃细胞培养液，每孔接种10μL的羊痘病毒疫苗株病毒液和细胞维持液，37℃二氧化碳培养箱培养12h；每孔准备2个无菌离心管，加入250μL DMEM，一管中加入转染试剂LipofectamineTM 20001.5μL，用移液器混匀，静置5min，另一管中加入转移载体质粒；将转染试剂混匀液加入质粒中，混匀之后静置18～20min；将混匀液加入细胞板孔中，6～8h后换细胞维持液，于细胞接着箱中培养，并于12h、24h、36h、48h分别观察绿色荧光出现情况，出现荧光细胞即为重组病毒细胞；同时作不接种病毒直接转染质粒的对照；

(4)重组病毒的纯化

确认有带荧光的重组病毒后，吸弃培养液，加入已融化的无菌低熔点琼脂糖，并置于4℃的冰箱中5～10min，待固定液凝固后取出，在荧光显微镜下挑取荧光斑点于50μL DMEM纯培养液中备用；将挑取的荧光斑点收集液反复冻融三次后，对其进行10倍比稀释至10^6-7，然后分别接种羊睾丸原代细胞培养，再挑取荧光斑点稀释，如此传代4-6次，得到纯化的重组病毒；

(5)重组病毒纯化的鉴定

PCR检测：取重组病毒的细胞培养物，提取其基因组，PCR检测其中G蛋白基因、GFP基因及TK基因，同时与山羊痘病毒疫苗株的细胞培养物做比较；

步骤5、狂犬病毒G蛋白表达检测

(1)G蛋白Western-blot检测

细胞培养纯化的重组病毒，细胞裂解液200μL裂解其培养物并用细胞铲刮取裂解产物，加SDS-PAGE上样Buffer并于沸水浴煮沸10min；做SDS-PAGE电泳，并按常规方法做考染或western blot检测；

(2)ELISA法检测细胞培养物中G蛋白表达情况

培养标准山羊痘疫苗株及已纯化的狂犬病毒G蛋白-羊痘疫苗重组病毒株rGTPV-GFP-7.5-RVGQ-7.5和rGTPV-GFP-7.5-RVGW-7.5，细胞全部被感染后，收取培养上清液并刮取底层细胞，细胞加细胞裂解液裂解并超声破碎，将其离心分为细胞上清和细胞沉淀；购买狂犬病毒G蛋白抗原检测ELISA试剂盒，常规方法检测以上处理样品中G蛋白含量；两株重组病毒G蛋白表达量与对照组山羊痘疫苗株显著升高，差异极显著，且G蛋白膜外区的表达量明显高于全长；另外对细胞培养液、细胞破碎后上清及沉淀中G蛋白含量的检测结果是细胞培养液和细胞破碎后上清中G蛋白含量接近，且明高于细胞破碎后沉淀中，说明G蛋白表达后主要以分泌型蛋白形式表达在细胞外，非常适合做免疫抗原，是制备疫苗的最佳抗原蛋白；

步骤6、狂犬病毒G蛋白-山羊痘重组病毒疫苗株免疫效果检测

(1)重组羊痘疫苗株注射液的制备

取标准羊痘疫苗株及已纯化的狂犬病毒G蛋白-羊痘疫苗重组病毒株rGTPV-GFP-7.5-RVGQ-7.5和rGTPV-GFP-7.5-RVGW-7.5各取50μL接入至含5mL羔羊睾丸原代细胞的小25mL的细胞瓶中；5天细胞全部感染后反复冻融三次，12000rpm 10min离心取上清液，于-80℃保存；

(2)免疫接种试验

将12只健康状态一致的成年绵羊分为三组并标记，标准疫苗株：A、B、C、D；G蛋白全长重组疫苗株rGTPV-GFP-7.5-RVGQ-7.5：I、II、III、IV；G蛋白膜外区重组疫苗株rGTPV-GFP-7.5-RVGW-7.5：1、2、3、4，采集羊免疫前血清待检；按分组在羊尾根部皮内注射0.5mL重组羊痘疫苗株注射液；观察羊只健康状况，并分别于0、5、12、19d采集羊全血分离血清待检；

(3)血清中G蛋白中和抗体检测

购买绵羊源G抗体检测试剂盒，按说明书进行操作检测羊血清中G蛋白中和抗体水平情况，与山羊痘病毒疫苗株的免疫血清为对照；两株重组病毒免疫组羊血清中G蛋白中和抗体与对照组显著升高，差异极显著，且G蛋白膜外区的中和抗体浓度明显高于全长。

2.根据权利要求1所述的狂犬病毒G蛋白-羊痘病毒重组疫苗的构建方法，其特征在于，步骤1中，具体为：

(1)TK基因中插入位点选Acc65 I；

(2)以VV7.5启动子融合表达GFP和G蛋白：分为GFP在N端，G蛋白在C端和G蛋白在N端，GFP在C端两种情况；G蛋白又有全长和膜外区两种情况，总计设计4种整合表达的情况；

(3)以VV7.5分别为GFP和G蛋白的启动子分别表达各自的蛋白，分表达方向相背和表达方向同向两种情况；考虑G蛋白有全长和膜外区之分，共设计4种单独表达的组合；

3.根据权利要求1所述的根据权利要求1所述的狂犬病毒G蛋白-羊痘病毒重组疫苗的构建方法，其特征在于，单一基因片段扩增体系及程序为：25μL扩增体系为：Primer star酶0.3μL，Buffer 5μL，dNTP 1μL，上下游引物各0.6μL，模板0.8μL，ddH2O 16.7μL；扩增程序为：预变性95℃5min，变性95℃30s，退火55℃30s，延伸72℃90s，再延伸72℃10min，共循环35次；

融合扩增体系及程序为：分别用要融合的几个扩增单一基因产物为模板，用第一基因的上游引物和最后基因的下游引物进行直接融合扩增出目的片段；25μL扩增体系为：primer star酶0.3μL，Buffer 5μL，dNTP 1μL，上下游引物各0.6μL，多个模板总和为0.8μL，ddH2O 16.7μL；扩增程序为：预变性95℃5min，变性95℃30s，退火55℃30s，延伸72℃90s，后延伸72℃10min，共循环30次；

各PCR产物的纯化回收及鉴定：采用切胶回收法。

4.根据权利要求1所述的根据权利要求1所述的狂犬病毒G蛋白-羊痘病毒重组疫苗的构建方法，其特征在于，步骤6中，血清中G蛋白中和抗体检测的具体操作如下：

(2)加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔；在酶标包被板上标准品加样50μL，待测样品孔中先加样品稀释液40μL，然后再加待测样品10μL并轻轻混匀；

(3)温育：用封板膜封板后置37℃温育30min；

(4)配液：将30倍浓缩稀释液用蒸馏水30倍稀释后备用；

(6)加酶：每孔加入酶标试剂μL，空白孔除外；

(7)温育：操作同(3)；

(8)洗涤：操作同(5)；

(10)终止：每孔加终止液50μL，终止反应，此时蓝色立转黄色；

(11)测定：以空白孔调零，450nm波长依次测量各孔的吸光值OD值，测定应在加终止液后15min内进行，根据标准曲线计算每孔中G蛋白抗体的浓度。