JP2001513630A - 組換えキメラウイルスとその使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、シチメンチョウのヘルペスウイルスのユニークな長いウイルスゲノム領域及びマレック病ウイルスのユニークな短いウイルスゲノム領域を有するシチメンチョウのヘルペスウイルス−マレック病ウイルス組換えキメラを提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 組換えキメラウイルスとその使用 本願は、1997年２月21に出願のU.S.出願番号08/804,372号の優先権を主張する 。 本願全体を通じて種々の文献は括弧内のアラビア数字で引用する。参考文献の 詳しい内容は、請求項のすぐ後にアルファベット順で記載してある。これらの参 考文献全体を、本願で参照することにより本願に組み込み、本願発明が属する技 術分野での最新技術について詳細に記載する。発明の背景 ＤＮＡを単離して、その単離されたＤＮＡを細菌プラスミドへクローニングす ることが可能であることから、ウイルスワクチン調製の手法が発展した。本願発 明で使用した方法では、動物の種々のウイルス性病原体からクローン化したＤＮ Ａ配列を、挿入、欠失、１またはそれ以上の塩基の変異、により修飾し、それに 続いて、この修飾済み配列をウイルスゲノムへ挿入することを行った。外来性配 列を付加することの一つの有用性は、外来性配列が、動物のウイルス感染時に発 現される外来性タンパク質をコードする時に成し遂げられる。得られる生ウイル スを次いでワクチンに使用して、宿主動物での免疫反応を惹起して、該動物を疾 患より保護する。このような特徴を有するウイルスはウイルスベクターと呼ばれ るが、それは外来性タンパク質を運び、宿主動物内で外来性タンパク質を発現す る生ベクターとなるからである。実際、それは外来性タンパク質の運搬用の精巧 な系となる。 組換えＤＮＡ技術を動物ウイルスへ適用することは、比較的歴史が浅い。改変 されたウイルスの最初の例は、ゲノムが最も小さいウイルスであった。パポバウ イルスの場合は、これらのウイルスが小さく、余分なＤＮＡを保持できないため に、それらは遺伝子工学で複製欠損レプリコンとして使用されていた。これらの ウイルスを利用して、外来性遺伝子の発現を行うには、野生型のヘルパーウイル スが必要であり、細胞培養系に限定されている。アデノウイルスの場合は、外来 性配列で置換することが可能な少量の非必須ＤＮＡが存在する。アデノウイルス で発現されたと思われる唯一の外来性ＤＮＡは、パポバウイルスのＴ抗原遺伝子 群（Mansour et al.，Proc．Natl．Acad．Scl．US，1985，Thummel et al.，Cel l 1983；Scolnick，et al.，Cell．1981；Thummel et al.，Cell．1981）、及び 単純ヘルペスウイルス(ＨＳＶ)のチミジンキナーゼ遺伝子(Haj−Ahmed and Grah am，J．of Virology，1986)である。これらの文献では、外来性ＤＮＡが挿入さ れている可能性のある、ＨＶＴの非必須領域を同定しておらず、またＨＶＴ内で 如何に外来性遺伝子を発現させるかについて、例えば、どのようなプロモータや 終結配列を使用するかも教示していない。 改変された別のウイルス群はポックスウイルスである、この群の一つの構成員 であるワクシニアは、外来性遺伝子発現に関しての多くの研究主題であった。ボ ックスウイルスは、感染細胞の細胞質内で複製する、大型のＤＮＡ含有ウイルス である。このウイルスは、正二十面体又は螺旋状の対称性に基づくカプシドを有 さないという点において、ユニークな構造を有する。ポヅクスウイルスは、機能 の喪失と縮退により、細菌様の微生物から進化した可能性が高い、一部、このユ ニークさのため、ポックスウイルスの遺伝子工学でなされた進歩は、ヘルペスウ イルスやＨＶＴを含む他のウイルス系へ直接適用することができない。ワクシニ アウイルスの組換え構築物は、数多くの研究室で作成されており、以下のような 外来性の挿入遺伝子が発現されている：ＨＳＶチミジンキナーゼ遺伝子（Macket t，etal.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1982；PanlcalI and Paoletti，Proc ．Natl．Acad．Sci USA，1982）、Ｂ型肝炎表面抗原（Paoletti et al.，Proc． Natl．Acad．Sci．USA，1984；Smith et al.，Nature，1983）、ＨＳＶ糖タンパ ク質Ｄ遺伝子、インフルエンザ血球凝集素遺伝子（Panicali et al.，Proc．Nat l．Acad．Sci．USA，1983；Smith et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1983 ）、マラリア抗原遺伝子（Smith，et al.，Science，1984）、及び水庖性口内炎 ウイルス糖タンパク質Ｇ遺伝子（Macket，et al.，Scinece，1986）。ワクシニ アの組換えＤＮＡ技術の全体の一般的特徴は、全てのウイルスで使用するものと 同様であり、特に参考文献（Maniatis et al.，Molecular Cloning，1982）の技 術に関してはそうである。しかしながら詳細には、ワクシニアでの技術はヘルペ スウイルスやＨＶＴには適 用できない。ワクチンベクターとしてのワクシニアの利用性には疑間がもたれて いるが、それはワクシニアがヒトの天然痘ウイルスに近縁であって、またヒトに 対して病原性があることが知られているためである。故に、宿主特異的なヘルペ スウイルスＨＶＴを使用することは、家禽のワクチン接種に対する、よりよい解 決策である。 霊長類のヘルペスウイルスの中では、ヒトのＨＳＶのみが外来性ＤＮＡ配列を 含有するように改変されていて、また、限られてはいるが、リスザルヘルペスウ イルスも外来性ＤＮＡ配列を含有するように改変されている。組換えＤＮＡを使 用してＨＳＶを操作した最初の例は、L-Sジャンクション領域のＤＮＡ断片をＨ ＳＶＤＮＡのユニークな長領域（long region)、特にチミジンキナーゼ遺伝子ベ クローニングしていたものである（Mocarski et al.，Cell．1980）。この挿入 物は外来性ＤＮＡ断片ではなくて、ゲノムの他の部位で増幅された、天然のヘル ペスウイルスＤＮＡ断片であった。このＤＮＡ断片は、タンパク質を発現するた めに特別に改変したものではなく、よってこの実験では、ヘルペスウイルスでの タンパク質発現は行われていない。ＨＳＶの次の操作は、組換えＤＮＡ技術とチ ミジンキナーゼ選択との組み合わせにより、ウイルスゲノムに欠失を作りだすこ とである。この方法を使用して、ＨＳＶアルファー22遺伝子が欠失され（Post e t al.，Cell．1981）、また15,000塩基対のＤＮＡ配列がＨＳＶの内部繰り返し から欠失された（Poffenberger，et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1981） 。 以下の場合では、タンパク質をコードする遺伝子の、ヘルペスウイルスへの挿 入が行なわれている：ＨＳＶ中の該遺伝子の天然欠失変異体へのＨＳＶの糖タン パク質Ｃの挿入（Gibson and Spear，J．of Virology，1983）；１型ＨＳＶへの ２型ＨＳＶの糖タンパク質Ｄの挿入（Lee et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA ，1982）（この遺伝子は「外来性」でないので、プロモータ配列の操作は行われ ていない）；ＨＳＶ ＩＣＰ４プロモーターの制御下でのＢ型肝炎表面抗原のＨ ＳＶへの挿入（Shih et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，1984）；及びＳＶ ４０プロモーターを伴ったウシ成長ホルモンのリスザルヘルペスウイルスへの挿 入（このプロモーターは、この系では機能しないが、内在性の上流プロモーター が該遺伝子の転写を行った）（Desrosiers et al.，1984）。 さらに二つの外来遺伝子（ニワトリ・オバルブミン遺伝子と、エプスタイン・ バールウイルスの核抗原）がＨＳＶに挿入されていて（Arsenakis and Roizman ，1984）、また仮性狂犬病ウイルスの糖タンパク質Ｘも、ＨＳＶへ挿入されてい る（Post et al.，1985）。 遺伝子の欠損、または挿入をヘルペスウイルスへ導入した、以上の例は、組換 えＤＮＡ技術によりヘルペスウイルスのゲノムを遺伝的に改変することが可能で あることを証明している、遺伝子を挿入するのに用いたこの方法では、プラスミ ドにクローニングされたウイルスＤＮＡと、同じ動物細胞にトランスフェクトさ れた、精製ウイルスＤＮＡとの間で相同性組換えを行わせる。しかしながら、欠 損の位置と外来性遺伝子の挿入部位をどの程度一般化できるかは、これらの先行 技術からは分からない。 本発明の一つの目標は、マレック病に対するワクチンである。マレック病ウイ ルス（ＭＤＶ）は、一般的なニワトリのリンパ球増殖性疾患であり、家禽の麻痺 を伴うマレック病の病原体である。この疾患は生後２〜５ケ月の若いニワトリで 最も頻繁に起こる。顕著な臨床的症状は、一以上の四肢の進行性麻痺、脚の麻痺 による協働運動不能、翼の関与による肢のしおれ、及び首の筋肉の関与により、 頭の位置が低くなることがあげられる。急性の場合、重度の抑鬱が起き得る。腫 瘍性がことに高い株の場合は、特徴的なブルサ及び胸腺の萎縮がおきる。更に、 生殖腺、肺、肝臓、脾臓、腎臓、胸腺に影響するリンパ腫がある（Mohanty and Dutta，1981）。 多くのニワトリは、生涯ＭＤＶから保護するために、生後１日目にＭＤＶに対 するワクチンを接種される。本発明よい以前は、ＭＤＶに対するワクチン接種方 法の原理は、シチメンチョウヘルペスウイルス（ＨＶＴ）の天然株を使用するも のであった。この、生後１目目のワクチンに他の抗原を取り込ませることは有益 であると思われるが、病原体間での競合と免疫抑制のために、通常のワクチンと 組み合わせる試みが満足のいくものであることは、現在のところ証明されていな い。本発明で作成された、多価のＨＶＴベースのワクチンは、数多くの異なる病 原体に対して、同時にワクチン接種する新規な方法となる。外来遺伝子がＨＶＴ ゲノムの非必須領域に挿入された組換えＨＶＴを初めて開示する。 これらのヘルペスウイルスに対して行なわれた遺伝子工学のタイプには、細菌 プラスミドへのウイルスＤＮＡの一部のクローニング、ＤＮＡがある配列を欠失 するように、クローン化した状態で前記ウイルスＤＮＡを再構築すること、さら に、外来性ＤＮＡ配列を上記の欠損部分と置き換えるか、または欠損により取り 除かれた部位へ加えること、がある。 ＨＶＴのゲノムに挿入する外来性遺伝子は、如何なる所望の病原体から得ても よい。典型的には、興味ある遺伝子とは、家禽に疾患を引き起こす病原体で、家 禽産業に経済的インパクトのあるものである。この遺伝子はすでにワクチンが存 在している生物体から得てもよく、ベクター(Vectoring)技術の新規利点のため 、ＨＶＴ由来ワクチンはより優れているであろう。さらに、所望の遺伝子は、現 在ワクチンが存在していないが、その疾患を制御する必要性のある病原体から由 来するものでもよい。典型的には、所望の遺伝子は病原体の免疫原性ポリペプチ ドをゴードしており、表面タンパク質、分泌型タンパク質、及び構造タンパク質 であり得る。 ＨＶＴのベクター化の標的となる適切なトリの病原体は、伝染性喉頭気管炎ウ イルス（ILTV）である。ILTVはヘルペスウイルス科の構成員であり、この病原体 は、呼吸抑制、息切れ、及び血の濠出した疾で特徴付けられる、ニワトリの急性 疾患を引き起こす。ウイルスの複製は、呼吸路の細胞に限られ、ここでは気管で の感染が、組織の侵食と出血を引き起こす。ニワトリでは、病変形成の程度を減 少させるか、または臨床的症状を減少させるのに効果的な薬剤はない。 細胞の継代、及び／又は煩雑な投与方法から得られたILTウイルスの種々の修 飾型でトリにワクチン接種すると、感受性のあるニワトリに満足な保護が与えら れる。現在のILTワクチンの弱毒化の程度からすると、正しいレベルのウイルス が確実に維持されるように注意を払わなければならない。すなわち、保護を与え るのには十分であるが、群れに疾患を引き起こすには不十分なものでなければな らない。 ＨＶＴベクター法のさらなる標的は、ニューカッスル病ウイルス(ＮＤＶ)によ って引き起こされる、伝染性で、極めて伝染性の高い衰弱性の疾病である、ニュ ーカッスル病である。ＮＤＶは、バラミクソウイルス科の一本鎖ＤＮＡウイルス である。ＮＤＶの様々な病原型（ヴェロ原性株、亜病原性株、レント原性株）は 、疾病の重症度、特異性、及び症状が異なるが、多くの型は呼吸器型、及び神経 系に感染するようである。ＮＤＶは主に、ニワトリ、シチメンチョウ、及びその 他のトリの種に感染する。歴史的には、ワクチン接種が疾患予防のために使われ てきたが、母親由来抗体の干渉、トリの寿命、及び投与経路のため、生産者は、 特異的な要求に合うように、免疫化プロトコールを適合せしめる必要がある。 本発明のウイルスベクターで運ばれる治療薬は、ブタポックスウイルス複製の 副産物である生物学的分子でなくてはならない。これは、第一の分析における治 療薬をＤＮＡ、ＲＮＡ、またはタンパク質の何れかに限定する。このようなクラ スの化合物で、次のような形態の治療薬の例がある：アンチセンスＤＮＡ、アン チセンスRＮＡ(S．Joshi，et al.，J．of Virology，1991)、リボザイム（M．Wa chsman，et al.，J．of General Virology，1989）、サプレッサーtRＮＡ（R．A ．Bhat，et al.，Nucleic Acids Research，1989）、インターフェロン誘導性二 本鎖RＮＡ、及びインシュリンのようなホルモンから、インターフェロンやイン ターロイキンのようなリンホカイン、天然のオピオイドまでの種々のタンパク性 治療薬の例。これら治療薬が発見され、またそれらの構造と機能が解明されたが 、ウイルスベクターによるデリバリーシステムでそのような治療薬を使用する能 力については明らかではない。 サイトカインをコードする多くの遺伝子が、哺乳類の種でクローニングされて いる。トリの種でクローニングされたサイトカイン遺伝子は、より数が少ない。 １型及び２型インターフェロンをコードする遺伝子は、数種の哺乳動物でクロー ニングされ、特性が決定されている。ニワトリインターフェロンａの遺伝子はク ローニングされており、哺乳類のインターフェロン１型のアミノ酸配列と比較さ れ、20〜24%のアミノ酸配列の同一性を有することが示された。ＣｈＩＦＮ−ａ は、哺乳類のＩＦＮ−ｇとは無関係である(59,65)。ニワトリインターフェロン- gの遺伝子がクローニングされており、ＣｈＩＦＮ−ａのアミノ酸配列と15%の同 一性を有している。ＣｈＩＦＮ−ｇは、ウマ及びヒトのＩＦＮ−ｇと、それぞれ 35及び32%同一である(62、63、66)。アヒルのインターフェロンの遺伝子がクロ ーニングされ、アミノ酸レベルでＣｈＩＦＮ−ａと50%同一である(64)。ニワト リ は、未だ分類されていない20を超えるインターフェロン遺伝子を有している。ク ローニングされたアヒルのＩＦＮが、ＩＦＮ−ａ、−ｂ、又は−ｇに分類される かどうかは分かっていない。トリのインターフェロンの活性は、種特異的である 。あるトリのインターフェロンは、別のトリ若しくは哺乳類の種、又は別のトリ 若しくは哺乳類細胞株では不活性である。種間でインターフェロン活性がなく、 異なる種のインターフェロンの間では、アミノ酸配列の同一性の割合が低いので 、異なるトリ又は哺乳類の種から遺伝子をクローンニングして発現できるかは明 らがでない。発明の概要 本発明は、シチメンチョウヘルペスウイルスのユニークなウイルスゲノム長領 域とマレック病ウイルスのユニークなウイルスゲノム短領域とを具備する組換え シチメンチョウヘルペスウイルス−マレック病ウイルスキメラを提供する。図の簡単な説明 図１Ａ〜１Ｃ：ＨＶＴ構築とマップデータの詳細。 図１Ａは、ＨＶＴゲノムのＢａｍＨＩ制限断片のマップを示す図である。断片 は、サイズが大きい順番に番号が付けられていて、文字は、比較上の大きさが決 定されていない小断片を示す。 図１Ｂは、ＨＶＴゲノムのＢａｍＨＩの＃16断片を示し、これはＳ−ＨＶＴ− ００１中ベータガラクトシダーゼ遺伝子の挿入場所を示している。 図１Ｃは、ＨＶＴゲノムのＢａｍＨＩの＃19を示し、これはベータガラクトシ ダーゼ遺伝子の挿入場所を示している。 凡例：Ｂ＝ＢａｍＨＩ、Ｘ＝ＸｈｏＩ、Ｈ＝Ｈｉｎｄ III、Ｐ＝ＰｓｔＩ、Ｓ ＝ＳａＩＩ、Ｎ＝ＮｄｅＩ、Ｒ＝ＥｃｏＲＩ。 図２：ＨＶＴゲノムのＢａｍＨＩ、ＮｏｔＩ制限酵素地図。ユニークな長領域 (UL)、及びユニークな短領域(US)を示している。長及び短領域の繰り返しは、四 角で囲って示している。ＢａｍＨＩ断片はサイズの大きい順に番号を付している 。プローブＰ１−Ｐ４の位置を示している。それぞれのプローブの期限は以下の とおりである：Ｐ１−ＢａｍＨＩ＃６、Ｐ２−ＢａｍＨＩ＃２、Ｐ３−ＢａｍＨ Ｉ＃13、及びＰ４−ＨＶＴゲノムのＸｂａＩ断片＃５(8.0kb)のＢｇlIIからＳｔ ｕ Ｉまでの４．０kbの亜断片。 図３Ａ〜３Ｂ：ＸｈｏＩ部位（ヌクレオチド＃１３３３〜１３３８；配列番号 12）に、合成ＤＮＡ配列を挿入することによって、ＨＶＴゲノムのＢａｍＨＩ＃ 10断片のユニークなＸｈｏＩ部位をＰａｃＩ部位及びＮｃｏＩ部位に転換する方 法を示している。図３Ａは、ＸｈｏＩ部位をＰａｃＩ部位に転換して作成したプ ラスミド654-45.1（配列番号17）を示し、図3Bは、ＸｈｏＩ部位をＮｏｔＩ部位 に転換して作成したプラスミド686-63.A1（配列番号18）を示している。 図４：ＨＶＴの長いユニーク部分（配列番号12）内の挿入部位を取り囲む配列 の制限酵素地図と読み取り枠。この地図は、外来性遺伝子の挿入に使用されたＸ ｈｏＩ制限部位（配列番号12；ヌクレオチド1333-1338）を示す。また、この配 列内の４つの読み取り枠も示されている。ＯＲＦ Ａは、ＸｈｏＩ部位へのＤＮ Ａの挿入により分断されている。ＯＲＦ Ａのアミノ酸配列（配列番号14；ヌク レオチド1402-602；267アミノ酸）は、タンパク質データベースの既知の如何な るアミノ酸配列とも顕著な配列相同性を示さない。ＵＬ５４（配列番号13；ヌク レオチド146〜481；112アミノ酸）及びＵＬ５５（配列番号51；ヌクレオチド159 9-2135；179アミノ酸）は、それぞれ、単純ヘルペスウイルス１型のUL54及びUL5 5タンパク質に顕著な配列相同性を示している。ＯＲＦ Ｂ（配列番号16；２６ ３４〜２３０８；109アミノ酸）は、タンパク質データベースの既知の如何なる アミノ酸配列とも顕箸な配列相同性を示さない。プラスト・ソフトウェアを使用 してNCBTデータベースのサーチを行った。コスミド４０７−３２．１Ｃ１、６７ ２−０１．Ａ４０、６７２−０７．Ｃ４０、及び６５４−４５．１の制限酵素地 図。ＨＶＴゲノムＤＮＡ断片ＥｃｏＲＩ＃９とＢａｍＨＩ＃10と重なり合う部分 を示している。ＥｃｏＲＩ＃９とＢａｍＨＩ＃10断片内のユニークなＸｈｏＩ部 位は、プラスミド６５４−４５．１内ではＰａｃＩ部位に変換され、またプラス ミド６８６−６３．Ａ１内ではＮｏｔＩ部位に変換された。 図５：コスミド４０７−３２．１Ｃ１、６７２−０１．Ａ４０、６７２−０７ ．Ｃ４０、及び６５４−４５．１の制限地図。ＨＶＴゲノムＤＮＡ断片ＥｃｏＲ Ｉ＃９とＢａｍＨＩ＃10の重なりが示されている。ＥｃｏＲＩ＃９とＢａｍＨＩ ＃10断片中のユニークなＸｈｏＩ部位は、プラスミド６５４−４５．１ではユニ ー クなＰａｃＩ部位に、又はプラスミド６８６−６３．Ａ１ではユニークなＮｏｔ Ｉ部位に変換されている。 図６：ＢＥＳ処置したニワトリ胚繊維芽細胞での一過性トランスフェクション アッセイにおけるニワトリ貧血ウイルスプロモーター及びＨＣＭＶ前初期プロモ ーターからのβ−ガラクトシダーゼの発現。β−ガラクトシダーゼの発現は、０ 、20、40、及び60分の時点で、ＯＮＰＧアッセイによって測定し、ＯＤ₄₁₅とし て表した。プロトコールは、一過性トランスフェクションアッセイに記載されて いる。プラスミド３８８−６５．２は、前初期プロモーターを含有している。プ ラスミド８５０−８０．２、８５０−２５．１８及び８５０−６９．１は、物質 と方法に記載されているように、ニワトリ貧血ウイルスプロモーターを含有して いる。 図７：シチメンチョウ組換えヘルペスウイルス又はマレック病ウイルス短領域 とシチメンチョウヘルペスウイルス長領域のキメラを具備する組換えキメラウイ ルスワクチン中の外来ＤＮＡを発現させるのに有用な伝染性喉頭気管炎ウイルス (ＩＬＴＶ)糖タンパク質Ｄ(ｇＤ)のＤＮＡ配列（配列番号 ）。 図８：シチメンチョウ組換えヘルペスウイルス又はマレック病ウイルス短領域 とシチメンチョウヘルペスウイルス長領域のキメラを具備する組換えキメラウイ ルスワクチン中の外来ＤＮＡを発現させるのに有用な伝染性喉頭気管炎ウイルス (ＩＬＴＶ)糖タンパク質Ｉ(ｇＩ)のＤＮＡ配列（配列番号）。発明の詳細な説明 本発明は、シチメンチョウヘルペスウイルスの長ウイルスゲノム領域とマレッ ク病ウイルスの短ウイルスゲノム領域とを具備する組換えシチメンチョウヘルペ スウイルス−マレック病ウイルスキメラを提供する。本発明は、シチメンチョウ ヘルペスウイルスのユニークな長ウイルスゲノム領域とマレック病ウイルスのユ ニークな短ウイルスゲノム領域とを具備する組換えシチメンチョウヘルペスウイ ルス−マレック病ウイルスキメラを提供する。 １の態様では、外来ＤＮＡ配列は、シチメンチョウ−マレック病ウイルスキメ ラウイルスゲノムの非必須領域中に挿入され、宿主細胞中で発現され得る。別の 態様では、外来ＤＮＡ配列は、シチメンチョウ−マレック病ウイルスキメラウイ ルスゲノムのユニークな長領域のＥｃｏＲＩ＃９断片中に挿入される。 別の態様では、外来ＤＮＡ配列はポリペプチドをコードしている。例えば、外 来ＤＮＡ配列は、ニワトリ骨髄性単球増殖因子(ｃＭＧＦ)、ニワトリインターフ ェロン(ｃＩＦＮ)、又はウズラインターフェロン(ｑＩＦＮ)のようなサイトカイ ンをコードし得る。あるいは、外来ＤＮＡ配列は、マレック病ウイルス、ニュー カッスル病ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、及 び伝染性粘液ブルザ病ウイルスからなる群から選択される抗原性ポリペプチドを コードし得る。 別の態様では、外来ＤＮＡ配列は、内在性上流ヘルペスウイルスプロモーター の制御下にある。プロモーターの例には、ＰＲＶ ｇｘ、ＨＳＶ-1α4、ＨＣＭ Ｖ前初期、ＭＤＶ ｇＡ、ＭＤＶ ｇＢ、ＭＤＶ ｇＤ、ＩＬＴ ｇＢ、ＢＨＶ −１．１ ＶＰ８、ＩＬＴ ｇＤ及びニワトリ貧血ウイルス(ＣＡＶ)プロモータ ーのような異種性上流プロモーターが含まれるが、これらに限定されない。組換 えキメラウイルスの例には、Ｓ−ＨＶＹ−１４５、Ｓ−ＨＶＹ−１４９及びＳ− ＨＶＹ−１５２が含まれるが、これらに限定されない。 本発明は、ニワトリインターフェロンをコードする単離された核酸分子のを具 備するベクターを提供する。本発明は、該ベクターを含有する宿主細胞を提供す る。本発明は、ニワトリインターフェロンをコードする単離された核酸分子の相 補配列を具備する組換えＤＮＡを提供する。相補配列はアンチセンス鎖である。 ある態様では、アンチセンス核酸分子は、ニワトリインターフェロンのｍＲＮＡ にハイブリダイズする。 本発明は、外来ＤＮＡを具備する組換えウイルスを用いて動物にワクチン接種 することによって、動物の免疫応答を増強する方法を提供する。外来ＤＮＡの例 には、ウズラインターフェロン及びニワトリインターフェロンをコードする核酸 配列のセンス鎖のようなサイトカイン、ニワトリ貧血ウイルス、ＭＤＶ、ＮＤＶ 、ＩＬＴ、又はＩＢＤＶのようなウイルスが含まれるがこれらに限定されない。 あるいは、動物の免疫応答を増強するために、組換えウイルスから発現される単 離されたポリペプチドを、不活化又は弱毒化したウイルスのワクチンと組み合わ せて使用し得ると推定される。 本発明は、ニワトリインターフェロンをコードする単離された核酸分子のセン ス鎖の相補配列を具備するベクターを含有するワクチンを動物に接種することに よって、動物の免疫応答を増強する方法を提供する。 本発明は、ニワトリインターフェロンをコードする単離された核酸分子を具備 するベクターを提供する。 本発明は、通常の状態ではニワトリ貧血ウイルス(ＣＡＶ)の遺伝子の転写に関 与するプロモーター配列を具備する単離された核酸を提供する。 本発明は、ニワトリ貧血ウイルスプロモーターをコードする単離された核酸を 提供する。ある態様では、ニワトリ貧血ウイルスプロモーターをコードする単離 された核酸は、配列番号23に示されている核酸配列を有する。 本発明は、ニワトリ貧血ウイルスプロモーターをコードする単離された核酸を 具備するベクターを提供する。本発明は、ニワトリ貧血ウイルスプロモーターの 制御下にある外来ＤＮＡ配列を具備する組換えヘルペスウイルスを提供する。 本発明は、ＨＶＴゲノム中の非必須部位に挿入された外来ＤＮＡ配列を具備す る組換えヘルペスウイルス又は組換えポックスウイルスであって、前記外来ＤＮ Ａ配列が組換えＨＶＴに感染した宿主細胞中で発現することができ、その発現が ニワトリ貧血ウイルスプロモーターの制御下にある組換えヘルペスウイルス又は 組換えポックスウイルスを提供する。 本発明は、ＨＶＴゲノム中の非必須部位に挿入された外来ＤＮＡ配列を具備す る組換えキメラウイルスを提供する。前記外来ＤＮＡ配列は組換えキメラウイル スに感染した宿主細胞中で発現することができ、その発現は外来ＤＮＡ配列の上 流に位置するプロモーターの制御下にある組換えヘルペスウイルス又は組換えポ ックスウイルスを提供する。 本明細書において、組換えキメラウイルスゲノム又ＨＶＴゲノム中の「非必須 部位」とは、ウイルス感染又は複製に必要のないウイルスゲノム中の領域を意味 する。 本明細書において、「ウイルスゲノム」又は「ゲノムＤＮＡ」とは、ウイルス 中に天然に存在するＤＮＡ全体を意味する。本明細書において、「外来ＤＮＡ配 列」又は「遺伝子」とは、ゲノムＤＮＡにとって外因性である任意のＤＮＡ又は 遺伝子をを意味する。 本明細書において、「読み取り枠」とは、アミノ酸配列に翻訳され得るＲＮＡ であり、停止コドンを含有していないＲＮＡに転写され得るコドンを含有するＤ ＮＡのセグメントである。 本発明は、さらに、本発明の組換えキメラウイルスを構築するのに有用な、Ｈ ＶＴ又はＭＤＶゲノムの何れかのウイルス中に存在する幾つかの適切な挿入部位 を提供する。挿入部位には、ＨＶＴゲノムのＥｃｏＲＩ＃９断片及びＢａｍＨＩ ＃10断片が含まれ、両断片内部の好ましい挿入部位は、ＸｈｏＩ制限エンドヌク レアーゼである。 本発明は、シチメンチョウヘルペスウイルスのウイルスゲノムのＥｃｏＲＩ＃ ９断片内に挿入された外来ＤＮＡ配列を具備する組換えキメラウイルスを提供す る。前記外来ＤＮＡ配列は、シチメンチョウヘルペスウイルスに感染した宿主細 胞内で発現され得る。 ある態様では、外来ＤＮＡ配列は、ＥｃｏＲＩ＃９断片の読み取り枠Ａ(ＯＲ ＦＡ)内に挿入される。ＥｃｏＲＩ＃９のＸｈｏＩ部位中に外来ＤＮＡが挿入さ れてORFAを分断しているということは、ＯＲＦＡの全領域が、組換え体の複製に 非必須であることを示している。 本発明の用途において、「組換えキメラウイルス」及び「組換えシチメンチョ ウヘルペスウイルス」とは、当業者に周知の組換え法、例えば、物質と方法中の 組換え体を作成するためのＤＮＡトランスフェクションに示されている方法によ って作成された生きたウイルスであり、該ウイルスは、組換えキメラウイルス又 は組換えシチメンチョウヘルペスウイルスの複製に必須の遺伝物質を欠失してい る。精製された組換えキメラウイルス及び組換えシチメンチョウヘルペスウイル スは、ＥｃｏＲＩ＃９断片又はＢａｍＨＩ＃１０断片中に外来ＤＮＡ配列又は遺 伝子を安定に挿入する。 本発明は、さらに、外来ＤＮＡ配列が、組換えキメラウイルスが導入された動 物中で抗原性を示すポリペプチドをコードする組換えキメラウイルスを提供する 。 ある態様では、ポリペプチドは検出可能なマーカーである。本発明の用途にお いて、「検出可能なマーカーであるポリペプチド」には、二量体、三量体、及び 四量体の形態であるポリペプチドが含まれる。大腸菌β−ガラクトシダーゼは、 ４つのポリペプチドすなわちモノマーサブユニットから構成される四量体である 。ある態様では、ポリペプチドは大腸菌β−ガラクトシダーゼである。 本発明は、ＨＶＴゲノム中の非必須部位に挿入された外来ＤＮＡ配列を具備す る組換えシチメンチョウヘルペスウイルス(ＨＶＴ)を提供する。該外来ＤＮＡ配 列は、組換えＨＶＴに感染した宿主細胞中で発現することができ、その発現は、 外来ＤＮＡ配列の上流に位置するプロモーターの制御下にある。 別の態様では、外来ＤＮＡ配列はサイトカインをコードする。別の態様では、 サイトカインは、ニワトリ骨髄性単球増殖因子(ｃＭＧＦ)、ニワトリインターフ ェロン(ｃＩＦＮ)、又はウズラインターフェロンである。好ましい態様では、組 換えシチメンチョウヘルペスウイルスは、S-ＨＶＴ-144と称される。 本発明は、さらに、そのウイルスゲノムが、マレック病ウイルス(ＭＤＶ)、ニ ューカッスル病ウイルス(ＮＤＶ)、伝染性喉頭気管炎ウイルス(ＩＬＴＶ)、伝染 性気管支炎ウイルス(ＩＢＶ)、又は伝染性粘液ブルザ病ウイルス(IBDV)由来の抗 原性ポリペプチドをコードする外来ＤＮＡを含有する組換えシチメンチョウヘル ペスウイルスを提供する。 本発明は、ＥｃｏＲＩ＃９断片中に外来ＤＮＡ配列が挿入された組換えシチメ ンチョウヘルペスウイルスであって、さらに、マレック病ウイルス、ニューカッ スル病ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、又は伝 染性粘液ブルザ病ウイルスからなる群から選択される、抗原性ポリペプチドをコ ードする外来ＤＮＡ配列を具備する組換えシチメンチョウヘルペスウイルスを提 供する。 ある態様では、抗原性ポリペプチドをコードする外来ＤＮＡ配列は、マレック 病ウイルスから得られ、マレック病ウイルス糖タンパク質ｇＡ、マレック病ウイ ルス糖タンパク質ｇＢ、又はマレック病ウイルス糖タンパク質ｇＤをコードする 。ある態様では、マレック病ウイルス糖タンパク質ｇＡ、糖タンパク質ｇＢ、又 は糖タンパク質ｇＤをコードする外来ＤＮＡ配列は、シチメンチョウヘルペスウ イルスのＵＳ２遺伝子コード領域のユニークなＳｔｕＩ部位に挿入される。 本発明は、さらに、そのゲノムＤＮＡがマレック病ウイルスから得られる抗原 性ポリペプチドをコードする外来ＤＮＡを含有する組換えシチメンチョウヘルペ スウイルスを提供する。好ましくは、抗原性ポリペプチドは、マレック病ウイル スの糖タンパク質、ｇＢ、ｇＡ、又はｇＤである。 ある態様では、外来ＤＮＡ配列を含有する組換えＨＶＴは、ＩＢＤＶ、ＶＰ２ 、ＭＤＶ ｇＡ、及びＭＤＶ ｇＢをコードする。好ましくは、このような組換 えウイルスは、Ｓ−ＨＶＴ−１３７及びＳ−ＨＶＴ−１４３と称される。 本発明は、ニューカッスル病ウイルス(ＮＤＶ)から得られる抗原性ポリペプチ ドをコードする外来ＤＮＡ配列を含有する組換えキメラウイルスを提供する。こ のような場合、抗原性ポリペプチドは、ニューカッスル病ウイルス融合(Ｆ)タン パク質若しくはニューカッスル病ウイルスヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ( ＨＮ)であるか、又はニューカッスル病ウイルスヘマグルチニン−ノイラミニダ ーゼ(ＨＮ)に融合された大腸菌β−ガラクトシダーゼを具備する組換えタンパク 質であることが好ましい。 本発明は、ＭＤＶ由来の抗原性ポリペプチドをコードする一以上の外来ＤＮＡ 配列とＮＤＶ由来の抗原性ポリペプチドをコードする一以上の外来ＤＮＡ配列を 含有するように改変された組換えキメラウイルスも提供する。好ましくは、ＭＤ Ｖ抗原性ポリペプチドは、ＭＤＶ ｇＢ、ｇＤ又はｇＡとＮＤＶ F又はＨＮで ある。 本発明は、さらに、そのゲノムＤＮＡが、マレック病ウイルス由来の抗原性ポ リペプチドをコードする外来ＤＮＡを含有し、ニューカッスル病ウイルス由来の 抗原性ポリペプチドをコードする外来ＤＮＡを具備する組換えキメラウイルスを 提供する。 さらに、ある態様では、外来ＤＮＡ配列は、伝染性喉頭気管炎ウイルス由来の 抗原性ポリペプチドをコードし、且つ伝染性喉頭気管炎ウイルスの糖タンパク質 ｇＢ、伝染性喉頭気管炎ウイルスの糖タンパク質ｇＩ、又は伝染性喉頭気管炎ウ イルス糖タンパク質ｇＤをコードする。 別の態様では、外来ＤＮＡ配列は、ＭＤＶ ｇＡ、ＭＤＶ ｇＢ、ＭＤＶ ｇ Ｄ、ＮＤＶ ＨＮ、ＮＤＶ Ｆ、ＩＬＴ ｇＢ、ＩＬＴ ｇＬ ＩＬＴ ｇＤ、 ＩＢＶ、ＩＢＤＶ ＶＰ２、ＩＢＤＶ ＶＰ３、ＩＢＤＶ ＶＰ４、トリ脳脊髄 炎ウイルス、ト リレオウイルス、トリパラミクソウイルス、トリインフルエンザウイルス、トリ アデノウイルス、鶏ポックスウイルス、トリコロナウイルス、トリロタウイルス 、ニワトリ貧血ウイルス(因子)、サルモネラ属、大腸菌、パスツレラ属、ボルデ テラ属、アイメリア属、ヒストモナス属、トリコモナス属、家禽線虫、条虫、吸 虫、家禽ダニ／シラミ、家禽プロトゾアからなる群らら得られる、又は得ること が可能な抗原性ポリペプチドをコードする。好ましい態様では、組換えシチメン チョウヘルペスウイルスはＳ−ＨＶＴ−１３６と称される。 本発明は、さらに、伝染性喉頭気管炎ウイルス由来の抗原性ポリペプチドをコ ードする外来ＤＮＡ配列を含有する組換えシチメンチョウヘルペスウイルスを提 供する。抗原性ポリペプチドはＩＬＴＶ糖タンパク質ｇＢ、ＩＬＴＶ ｇＤ、又 はＩＬＴＶ ｇＩであることが好ましい。 ある態様では、外来ＤＮＡ配列は、伝染性喉頭気管炎ウイルス由来であり、伝 染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパク質ｇＤ、又は喉頭気管炎ウイルス糖タンパク 質ｇＩをコードする。 本発明は、シチメンチョウヘルペスウイルスのウイルスゲノムのＥｃｏＲＩ ＃９断片中に挿入された外来ＤＮＡ配列を含有する組換えシチメンチョウヘルペ スウイルスを提供する。前記外来ＤＮＡ配列は、ニューカッスル病ウイルス由来 であり、ニューカッスル病ウイルスＨＮ又はニューカッスル病ウイルスＦをコー ドする。 このような抗原性ポリペプチドは、以下のネコの病原体、イヌの病原体、ウマ の病原体、ウシの病原体、トリの病原体、ブタの病原体、又はヒトの病原体から 得られ、又は得ることが可能であり得る。 別の態様では、ヒトの病原体の抗原性ポリペプチドは、ヒトヘルペスウイルス 、単純ヘルペスウイルス-1、単純ヘルペスウイルス-2、ヒトサイトメガロウイル ス、エブスタイン−バールウイルス、水痘−帯状ヘルペスウイルス、ヒトヘルペ スウイルス−６、ヒトヘルペスウイルス−７、ヒトインフルエンザ、ヒト免疫不 全症ウイルス、狂犬病ウイルス、麻疹ウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、及びＣ型肝 炎ウイルスに由来する。さらに、ヒトの病原体の抗原性ポリペプチドは、熱帯熱 マラリア原虫、百日咳菌、及び悪性腫瘍からなる群から選ばれるマラリア又は悪 性腫 瘍と関連するものであり得る。 本発明は、さらに、そのゲノムＤＮＡがニューカッスル病ウイルス融合（Ｆ） タンパク質をコードする外来ＤＮＡを含有し、さらに組換えタンパク質をコード するＤＮＡを具備する組換えシチメンチョウヘルペスウイルスであって、大腸菌 β−ガラクトシダーゼがニューカッスル病ウイルスヘマグルチニン−ノイラミニ ダーゼ(ＨＮ)に融合されている組換えシチメンチョウヘルペスウイルスを提供す る。本発明は、さらに、そのゲノムＤＮＡがマレック病ウイルス糖タンパク質ｇ Ｂとマレック病ウイルス糖タンパク質ｇＡを含有し、さらにニューカッスル病ウ イルスのヘマグルチニン−ノイラミニダーゼ(ＨＮ)をコードする外来ＤＮＡを具 備する組換えキメラウイルスを提供する。 本発明は、シチメンチョウヘルペスウイルスのユニークな長ウイルスゲノム領 域とマレック病ウイルスのユニークな短領域とを具備する組換えシチメンチョウ ヘルペスウイルス−マレック病ウイルスキメラを提供する。１の態様では、組換 えシチメンチョウヘルペスウイルス−マレック病ウイルスキメラは、シチメンチ ョウヘルペスウイルスゲノムのＥｃｏＲＩ＃９断片中に挿入された外来ＤＮＡ配 列を含有し、該外来ＤＮＡ配列は、シチメンチョウヘルペスウイルスに感染した 宿主細胞内で発現することができる。 一つの態様において、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスは、ポリ ペプチドをコードする外来性ＤＮＡ配列を有する。このポリペプチドは、組換え 型のヘルペスウイルスが導入された動物内で抗原性となり得る。 別の態様において、ポリペプチドは、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）のβ-ガラクト シダーゼである。別の態様において、外来性ＤＮＡ配列は、サイトカインをコー ドする。別の態様において、サイトカインは、ニワトリ骨髄単球性増殖因子（ｃ ＭＧＦ）、ニワトリ・インターフェロン（ｃＩＦＮ）またはウズラ・インターフ ェロンである。 本発明は更に、前記外来性ＤＮＡ配列が、組換え型のヘルペスウイルスが導入 された動物内で抗原性となるポリペプチドをコードする、組換え型のシチメンチ ョウ・ヘルペスウイルスを提供する。 更に、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスは、以下のものから成る 群より選択される抗原性ポリペプチドをコードする外来性ＤＮＡ配列を更に具備 する：マレック病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイ ルス、伝染性気管支炎ウイルス、および伝染性ファブリーキウスブルザ病ウイル ス。 本発明は、前記外来性ＤＮＡ配列が、内在性の上流ヘルペスウイルスプロモー ターの制御下にある、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する 。一つの態様において、外来性ＤＮＡ配列は、異種の上流プロモーターの制御下 にある。別の態様において、該プロモーターは、以下のものより選択される：Ｃ Ａｖ、ＰＲＶ ｇＸ、ＨＳＶ−１ アルファ４、ＨＣＭＶ前初期、ＭＤＶ ｇＡ 、ＭＤＶ ｇＢ、ＭＤＶ ｇＤ、ＩＬＴ ｇＢ、ＢＨＶ−１．１ ＶＰ８、およ びＩＬＴ ｇＤ。 本発明は、外来性ＤＮＡをウイルスゲノム内に挿入することにより、組換え型 のキメラウイルスを産生させるための相同性ベクターを提供する。相同性ベクタ ーの例には、以下のものを含む：３０１−０７．ＹＤ１、８５２−５２．ＩＩ４ 、８６４−７４．１８、８８１−２３．２８、および７３９−２７．１６。 本発明は、以下のものを本質的に有する二本鎖ＤＮＡ分子を具備したシチメン チョウ・ヘルペスウイルスのウイルスゲノム内に外来性ＤＮＡを挿入することに より、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを産生させるための相同性 ベクターを提供する：ａ）シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのウイルスゲノム 内には通常存在しない二本鎖の外来性ＤＮＡ；ｂ）前記外来性ＤＮＡの一方の末 端にある二本鎖のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスＤＮＡであって、該ＤＮＡ が、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのウイルスゲノムのコード領域であるＥ ｃｏＲＩ＃９部位の一方の末端側に位置するウイルスゲノムに対して相同的であ るもの；並びにｃ）前記外来性ＤＮＡのもう一方の末端にある二本鎖のシチメン チョウ・ヘルペスウイルスＤＮＡであって、該ＤＮＡが、シチメンチョウ・ヘル ペスウイルスのウイルスゲノムのコード領域であるＥｃｏＲＩ ＃９部位のもう 一方の末端側に位置するウイルスゲノムに対して相同的であるもの。相同性ベク ターの例は、７５１−８７．Ａ８と称されるものである。 一つの態様において、ポリペプチドは、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペス ウイルスが導入された動物内で抗原性である。別の態様においては、抗原性ポリ ペプチドは、サイトカイン、マレック病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、 伝染性喉頭気管炎ウイルス、または伝染性気管支炎ウイルス由来である。好まし い態様において、抗原性ポリペプチドは、以下のものである：ニワトリ骨髄単球 性増殖因子（ｃＭＧＦ）もしくはニワトリ・インターフェロン（ｃＩＦＮ）、ウ ズラ・インターフェロン、伝染性ファブリーキウスブルザ病ウイルスのポリタン パク質、伝染性ファブリーキウスブルザ病ウイルスのＶＰ２タンパク質、マレッ ク病ウイルスの糖タンパク質ｇＢ、マレック病ウイルスの糖タンパク質ｇＡ、マ レック病ウイルスの糖タンパク質ｇＤ、ニューカッスル病ウイルスの融合タンパ ク質、ニューカッスル病ウイルスの血球凝集素・ノイラミニダーゼ、伝染性喉頭 気管炎ウイルスの糖タンパク質ｇＢ、伝染性喉頭気管炎ウイルスの糖タンパク質 ｇＤ、伝染性気管支炎ウイルスのスパイクタンパク質、または伝染性気管支炎ウ イルスのマトリックスタンパク質。 別の態様において、前記相同性ベクター内の二本鎖の外来性ＤＮＡ配列は、ウ マの病原体由来の抗原性ポリペプチドをコードする。ウマの病原体の抗原性ポリ ペプチドは、ウマインフルエンザウイルスまたはウマヘルペスウイルスから由来 することが可能である。このような抗原性ポリペプチドの例には、次のようなも のがある：ウマインフルエンザウイルス タイプＡ/アラスカ91 ノイラミニダ ーゼ、ウマインフルエンザウイルス タイプＡ/プラハ56 ノイラミニダーゼ、 ウマインフルエンザウイルス タイプＡ/マイアミ63 ノイラミニダーゼ、ウマ インフルエンザウイルス タイプＡ/ケンタッキー81 ノイラミニダーゼ、ウマ ヘルペスウイルス タイプ１ 糖タンパク質Ｂ、およびウマヘルペスウイルス タイプ１ 糖タンパク質Ｄ。 別の態様において、前記相同性ベクター内の二本鎖の外来性ＤＮＡ配列は、ウ シ呼吸器性シンシチアルウイルスまたはウシパラインフルエンザウイルスから由 来する抗原性ポリペプチドをコードする。ウシ呼吸器性シンシチアルウイルスま たはウシパラインフルエンザウイルスから由来する抗原性ポリペプチドには、次 のようなものがある：ウシ呼吸器性シンシチアルウイルス 付着タンパク質(Ｂ ＲＳＶ Ｇ)、ウシ呼吸器性シンシチアルウイルス融合タンパク質(ＢＲＳＶ Ｆ )、 ウシ呼吸器性シンシチアルウイルス ヌクレオキャブシドタンパク質（ＢＲＳＶ Ｎ）、ウシパラインフルエンザウイルス タイプ３融合タンパク質、およびウシ パラインフルエンザウイルス タイプ３血球凝集素・ノイラミニダーゼ。 別の態様において、前記相同性ベクター内の二本鎖の外来性ＤＮＡ配列は、ヒ トの免疫応答を刺激することが可能なサイトカインをコードする。例えば、サイ トカインは、インターロイキン−１、インターロイキン−１５、インターフェロ ン、ウズラ・インターフェロン、ニワトリ・インターフェロン、顆粒球マクロフ ァージコロニー刺激因子、およびインターロイキン受容体であり得るが、これら に限定されない。 本発明の目的に適した「相同性ベクター」は、シチメンチョウ・ヘルペスウイ ルスのゲノム上の特定部位に外来性ＤＮＡを挿入するように構築されたプラスミ ドである。 本発明の一つの態様において、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスの二本鎖Ｄ ＮＡは、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスゲノムのＥｃｏＲＩ＃９断片内に存 在するＤＮＡ配列に対して相同性がある。好ましくは、この相同性ベクターは、 172-63.1と称されるものである。 別の態様において、外来性ＤＮＡ配列は、スクリーニング可能なマーカーをコ ードする。スクリーニング可能なマーカーの例には、Ｅ．ｃｏｌｉのβ-ガラク トシダーゼまたはＥ．ｃｏｌｉのβ-グルクロニダーゼが含まれるが、これらに 限定されない。 本発明は更に、有効な免疫量の本発明の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウ イルスおよび適切な担体を具備したワクチンを提供する。 本発明は、マレック病ウイルスに対してトリを免疫化するのに有効なワクチン であって、有効な免疫量の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスおよび適 切な担体を具備したワクチンを提供する。 本発明は、ニューカッスル病ウイルスに対してトリを免疫化するのに有効なワ クチンであって、有効な免疫量の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスお よび適切な担体を具備したワクチンを提供する。 本発明は、伝染性喉頭気管炎ウイルスに対してトリを免疫化するのに有効なワ クチンであって、有効な免疫量の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスお よび適切な担体を具備したワクチンを提供する。 本発明は、伝染性気管支炎ウイルスに対してトリを免疫化するのに有効なワク チンであって、有効な免疫量の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスおよ び適切な担体を具備したワクチンを提供する。 本発明は、伝染性ファブリーキウスブルザ病ウイルスに対してトリを免疫化す るのに有効なワクチンであって、有効な免疫量の組換え型シチメンチョウ・ヘル ペスウイルスおよび適切な担体を具備したワクチンを提供する。 本発明は、マレック病ウイルスおよびニューカッスル病ウイルスに対してトリ を免疫化するのに有効な多価ワクチンであって、有効な免疫量の組換え型シチメ ンチョウ・ヘルペスウイルスおよび適切な担体を具備した多価ワクチンを提供す る。 本発明は、マレック病ウイルスおよび伝染性喉頭気管炎ウイルスに対してトリ を免疫化するのに有効な多価ワクチンであって、有効な免疫量の組換え型シチメ ンチョウ・ヘルペスウイルスおよび適切な担体を具備した多価ワクチンを提供す る。 本発明は、マレック病ウイルスおよび伝染性気管支炎ウイルスに対してトリを 免疫化するのに有効な多価ワクチンであって、有効な免疫量の組換え型シチメン チョウ・ヘルペスウイルスおよび適切な担体を具備した多価ワクチンを提供する 。 本発明は、マレック病ウイルスおよび伝染性ファブリーキウスブルザ病ウイル スに対してトリを免疫化するのに有効な多価ワクチンであって、有効な免疫量の 組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスおよび適切な担体を具備した多価ワ クチンを提供する。 本発明は更に、家禽を免疫化する方法を提供する。本発明の目的に適したこの 方法には、以下のものに対して家禽を免疫化することが含まれる：マレック病ウ イルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、または伝染性 気管支炎ウイルス。この方法は、家禽に対して、本発明のワクチンを免疫的に有 効な量で投与することを具備する。このワクチンは、当業者によく知られた任意 の方法により投与することができ、例えば、筋内接種、皮下接種、腹腔内接種、 または静脈内接種による。あるいは、ワクチンは、鼻腔内または経口的に投与す ることが可能である。 本発明は、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスに感染した宿主細胞 を提供する。一つの態様において、宿主細胞はトリの細胞である。 本発明の目的に適した「宿主細胞」は、ベクターおよびその挿入物を増殖させ るのに使用される細胞である。細胞感染は、当業者によく知られた方法により行 われるが、例としては、実験材料および実験方法の項の「組換えヘルペスウイル スを作成するためのＤＮＡトランスフェクション」に記載されているものがある 。組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスを構築し、選択し、精製する方 法は、以下に詳述されている。 本発明は、上記ワクチンを投与したニワトリまたはその他の家禽を、天然のメ レック病ウイルスに感染したものと識別する方法であって、ニワトリまたはその 他の家禽から得た体液サンプルを分析して、天然のマレック病ウイルスに感染し たニワトリまたはその他の家禽では通常発現している糖タンパク質ｇＧおよび少 なくとも一の他の抗原の存在を調べることを具備した方法であり、感染したニワ トリで通常発現しているこのような抗原は存在するが、糖タンパク質ｇＧが存在 しないことは、上記ワクチンの接種を受けたことを示し、天然のマレック病ウイ ルスに感染していないことを示す、上記の方法を提供する。 本発明は、組換え型のシチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、以下のも のを含むがこれらに限定されない鳥類または哺乳類の種において、ワクチンとし て有効な外来性ＤＮＡを発現しているものを提供する：ニワトリ、シチメンチョ ウ、アヒル、ネコ、イヌ、ウシ、ウマ、およびヒトを含む霊長類。本ワクチンは 、不活化または生の組換え型ウイルスの何れを含んでいてもよい。 本発明の目的に適した、「免疫的に有効な量」の本発明の組換え型ネコヘルペ スウイルスは、10³〜10⁹PFU/投与量の範囲にある。別の態様において、免疫量は 、10⁵〜10⁷PFU/投与量である。好ましい態様において、免疫量は、10⁶PFU/投与 量である。 本方法は、動物に対して、本発明のワクチンを免疫的に有効な量で投与するこ とを具備する。ワクチンは、当業者によく知られた任意の方法により投与するこ とができ、例えば、筋内接種、皮下接種、腹腔内接種、または静脈内接種による 。あるいは、ワクチンは、鼻腔内または経口的に投与することが可能である。 組み換え型ウイルスのための適切な担体は、当業者によく知られており、タン パク質、糖などが含まれるが、これらに限定されない。このような適切な担体の 一例は、生理学的に均衡のとれた培養液であって、加水分解済タンパク質、ラク トースなどの一以上の安定化剤を含有するものである。好ましくは、生のワクチ ンは、組織培養液を採取して、安定性のある加水分解済タンパク質などの安定化 剤を添加することにより作成される。好ましくは、不活化ワクチンは、ウイルス の不活化後すぐに組織培養液を使用する。 本発明は、ウズラ・インターフェロン タイぷ１をコードする単離された核酸 分子を提供する。一つの態様において、ウズラ・インターフェロン タイプ１を コードする単離された核酸分子は、配列認識番号３１に記載されているような核 酸配列を有する。 一つの態様において、単離された核酸分子はゲノムＤＮＡである。別の態様に おいて、単離された核酸分子はｃＤＮＡである。別の態様において、ＲＮＡは、 単離された核酸分子に由来するか、あるいは単離された核酸分子とハイブリダイ ズすることができる。 「核酸配列」とは、５'末端から３'末端まで読まれるデオキシリボヌクレオチ ドまたはリボヌクレオチド塩基の一本または二本鎖ポリマーをいう。核酸配列に は、自己複製するプラスミド、ＤＮＡまたはＲＮＡの感染性ポリマー、非機能的 なＤＮＡまたはＲＮＡを含む。 特定の配列表について言及する場合、その言及には、僅かな配列の間違い、一 塩基の変化、欠失、置換などを許容範囲に含めた、配列表に実質的に該当する配 列およびその相補鎖が含まれ、その結果、このような配列の変化が、その配列表 に関する病原性生物もしくは疾患マーカーの核酸配列に該当することが、当業者 に容易に理解されるであろう。 本発明は、少なくとも１４ヌクレオチドの核酸分子であって、ウズラ・インタ ーフェロン タイプ１をコードする単離された核酸分子に特異的にハイブリダイ ズすることができるものを提供する。本発明は、少なくとも１４ヌクレオチドの 核酸分子であって、ウズラ・インターフェロン タイプ１をコードする単離され た核酸分子のセンス鎖の相補的な配列に特異的にハイブリダイズすることができ るものを提供する。相補的な配列は、ウズラ・インターフェロン タイプ１をコ ードする単離された核酸分子のアンチセンス鎖である。 一つの態様において、該分子は、８ないし３６ヌクレオチドである。別の態様 において、該分子は、１２ないし２５ヌクレオチドである。別の態様において、 該分子は１４ヌクレオチドである。一つの態様において、該分子はＤＮＡである 。一つの態様において、該分子はＲＮＡである。 本発明は、単離された核酸分子にハイブリダイズすることができるアンチセン ス分子を提供する。一つの態様において、アンチセンス分子はＤＮＡである。別 の態様において、アンチセンス分子はＲＮＡである。別の態様において、アンチ センス分子は、核酸誘導体（例えば、タンパク骨格を有するＤＮＡまたはＲＮＡ ）である。 本発明は、アンチセンス核酸でｍＲＮＡをマスクするか、あるいはリボザイム でｍＲＮＡを切断することにより、ポリペプチドの発現を妨害するのに使用され 得る、アンチセンス核酸もしくはその断片、並びにリボザイムを調製することま で及ぶ。一つの態様において、アンチセンス核酸分子は、ウズラ・インターフェ コンのｍＲＮＡにハイブリダイズする。 ＤＮＡを標的にする方法は、幾つかのカテゴリーに分類される。核酸を、二重 らせんＤＮＡの主溝に結合するように設計して、三重らせん、即ち「トリプレッ クス」構造を形成することができる。あるいは、抑制性核酸は、複製または転写 の間に二重らせんＤＮＡの開裂により得られる一本鎖ＤＮＡの領域に結合するよ うに設計される。 より一般的には、抑制性核酸は、ｍＲＮＡもしくはｍＲＮＡ前駆体に結合する ように設計される。抑制性核酸は、ｍＲＮＡ前駆体の成熟を阻害するために使用 される。抑制性核酸は、ＲＮＡプロセシング、スプライシングまたは翻訳を妨害 するように設計することができる。単離された核酸分子に相補的な鎖は、アンチ センス鎖とも呼ばれる。 最後に、抑制性核酸は、標的遺伝子の化学的不活性化または切断を誘発するの に使用することができる。化学的不活性化は、抑制性核酸と標的核酸との間の細 胞内での交差の誘発により起こり得る。適切に誘導体化された（derivatized） 抑制性核酸により誘発された、標的核酸の他の化学的修飾を使用することもでき る。 高ストリンジェンシーなハイブリダイゼーション条件は、規定のイオン強度お よびｐＨにおける特定配列に対する熱融解点（Ｔｍ）より約５℃低い温度で選択 される。Tmは、塩濃度の５０％がｐＨ７で少なくとも約0.02モルであるときの（ 規定のイオン強度およびｐＨにおける）温度であり、該温度は少なくとも約６０ ℃である。他の因子、とりわけ相補鎖の塩基組成およびサイズ、有機溶媒の存在 （即ち塩もしくはホルムアミドの濃度）、および塩基ミスマッチの程度が、ハイ ブリダイゼーションのストリンジェンシーに有意に影響を及ぼすため、パラメー ターの組み合わせは、どれか一つの絶対指標より重要である。例えば、高ストリ ンジェンシーは、約６８℃において６×ＳＳＣ溶液中で一晩ハイブリダイゼーシ ョンさせ、室温において６×ＳＳＣ溶液で洗浄し、次いで約６８℃において０６ ×ＳＳＣ溶液中で洗浄することにより達成され得る。 適度なストリンジェンシーでのハイブリダイセーションは、例として以下の工 程により達成され得る：１）３×ＳＳＣ溶液、５０％ホルムアミド、ｐＨ７．５ における０．１Ｍトリス緩衝液、５×デンハルト溶液によるフィルター・プレハ イブリタイジングおよびハイブリダイジング；２）３７℃における４時間のプレ ハイブリダイゼーション；３）全体で3,000,000cpmに相当する量の標識プローブ による３７℃における１６時間のハイブリダイゼーション；４）×ＳＳＣおよび ０．１％ＳＤＳ溶液中での洗浄；５）４×ＳＳＣ中で室温で各１分間、６０℃で 各３０分間の４×洗浄；並びに６）乾燥およびフィルムへの露出。 核酸プローブ技術は当業者に公知であり、当業者は、プローブの検出を容易に するために、該プローブの長さを大きく変化させ、検出可能なラベル（例えば放 射性同位元素もしくは蛍光色素）で標識できることを認識している。当該分野で 公知の方法を用いて、ＤＮＡウイルスの単離された核酸分子の完全長もしくは断 片を有するＤＮＡ分子を、適切なベクター（例えばプラスミドもしくはバクテリ オファージ）に挿入し、次いで適切な細菌宿主細胞に形質転換し、形質転換され た細菌宿主細胞において複製し、そしてＤＮＡプローブを回収することにより、 ＤＮＡプローブ分子を産生することができる。あるいは、プローブはＤＮＡ合成 機から化学的に作成することができる。 ＲＮＡプローブは、バクテリオファージ・プロモーター（例えばT3、T7、また はSP6）の下流に、ＤＮＡウイルスの単離された核酸分子の完全長もしくは断片 を挿入することにより作成することができる。大量のＲＮＡプローブは、適切な ＲＮＡポリメラーゼの存在下で、ＤＮＡウイルスの単離された直鎖状核酸分子も しくはその断片であって、上流プロモーターを含有するものとともに、標識され たヌクレオチドをインキュベートすることにより産生することができる。 ここで規定したとおり、核酸プローブはＤＮＡもしくはＲＮＡ断片であり得る 。ＤＮＡ断片は、例えばプラスミドＤＮＡを消化することにより、またはＰＣＲ の利用により調製することができ、あるいはホスホラミダイト法（Beaucage and Carruthers，1981，Tetrahedron Lett．22，1859−1862記載）もしくはトリエ ステル法（Matteucciら，1981，Am.Chem.Soc．103:3185記載）により合成するこ とができる。その後、所望ならば、適切な条件下で化学的に合成された一本鎖を アニーリングすることにより、あるいは適切なプライマー配列を用いてＤＮＡポ リメラーゼにより相補鎖を合成させることにより、二本鎖の断片を得ることがで きる。核酸プローブのための特定配列が規定されたところでは、相補鎖も同定さ れ、包含されることが理解される。相補鎖は、標的が二本鎖の核酸である状況に おいて、完全に同じ作用をするであろう。特定配列が、核酸プローブの使用のた めに同定されると、２５塩基対（bp）以上の長さのリスト配列のサブ配列も、プ ローブとしての使用に包含されることが更に理解される。 本発明の核酸分子には、更に、天然に存在する形態とは一以上のアミノ酸残基 の同一性もしくは位置において異なるが、天然に存在する形態の特性を一部もし くは全て共有するような、抗原性ポリペプチドのポリペプチド類縁体、断片、も しくは誘導体（ポリペプチドを指定する全残基より少ない残基を含有する欠失類 縁体、指定された一以上の残基が他の残基に置き換えられた置換類縁体、および 一以上のアミノ酸残基がポリペプチドの末端部分もしくは中間部分に付加された 付加類縁体）をコードする分子を含む。 「ＳＳＣ」という用語は、０．１５Ｍ塩化ナトリウムおよび２０ｍＭクエン酸 ナ トリウムのクエン酸−食塩水溶液のことをいう。溶液は、この濃度の倍数もしく は小数として表示される。例えば、６×ＳＳＣは、この量の６倍の塩化ナトリウ ムおよびクエン酸ナトリウム濃度、即ち０．９Ｍ塩化ナトリウムおよび１２０ｍ Ｍクエン酸ナトリウムを有する溶液のことをいう。０．２×ＳＳＣは、０．２倍 のＳＳＣ濃度、即ち０．０３Ｍ塩化ナトリウムおよび４ｍＭクエン酸ナトリウム の溶液のことをいう。 「特異的にハイブリダイズする」という用語は、細胞内の全ＤＮＡもしくはＲ ＮＡの調製液中に標的配列が存在するときに、特定の標的ＤＮＡもしくはＲＮＡ 配列にのみハイブリダイズ、二本鎖形成、もしくは結合する核酸プローブを説明 している。選択的にハイブリダイズするとは、プローブが、高ストリンジェンシ ーなハイブリダイゼーションの条件下において、非標的配列とは異なった、検出 可能な方法で、所定の標的に結合することを意味する。 「コードする核酸分子」という用語は、特定のポリペプチドの発現を指図する 核酸分子のことをいう。該核酸の配列には、ＲＮＡに転写されるＤＮＡ鎖配列、 それに相補的なＤＮＡ鎖、およびタンパク質に翻訳されるＲＮＡ配列を含む。該 核酸分子には、完全長の核酸配列、並びに不完全な長さの配列を含む。該配列に は、天然の配列の縮重コドン、もしくは特定の宿主細胞においてコドン選択を付 与するために導入され得る配列の縮重コドンを含むことが更に理解される。 本発明は、ＲＮＡ転写のプロモーターに機能的に連結した単離されたＤＮＡを 提供する。ここで使用する「機能的に連結した」という用語は、プロモーターが ＤＮＡ配列の転写を仲介するように、ＤＮＡ配列の上流におけるプロモーターの 連結をいう。 本発明は、ウズラ・インターフェロン タイプ１をコードする単離された核酸 分子を具備するベクターを提供する。本発明は、ウズラ・インターフェロン タ イプ１をコードする単離された核酸分子を具備する組換えＤＮＡを提供する。 本発明は、ウズラ・インターフェロン タイプ１をコードする単離された核酸 分子のセンス鎖に相補的な配列を具備するベクターを提供する。本発明は、ウズ ラ・インターフェロン タイプ１をコ−ドする単離された核酸分子のセンス鎖に 相補的な配列を具備する組換えＤＮＡを提供する。 ベクターは、以下のものを含むがこれらに限定されない：プラスミド、コスミ ド、λファージ、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、または単離された核酸分子を含有 する組換え型ウイルス。 ベクターを得るために、挿入ＤＮＡとベクターＤＮＡの双方を、制限酵素にさ らして、両分子上に互いに塩基対を形成する相補的な末端をつくり、次いで、Ｄ ＮＡリガーゼで互いを連結することができる。あるいは、ベクターＤＮＡ内の制 限部位に対応するリンカーを挿入ＤＮＡに連結し、次いでベクターＤＮＡを、制 限部位で切断する制限酵素で処理することができる。その他の手段も利用するこ とができ、当業者に公知である。 本発明は、ベクターを含有する宿主細胞を提供する。適切な宿主細胞には、細 菌（例えばＥ．ｃｏｌｉ）、酵母、真菌、植物、昆虫、および哺乳動物の細胞が 含まれるが、これらに限定されない。適切な動物の細胞には、ＣＥＦ、ＱＴ−３ ５、ＥＳＫ−４、Ｖｅｒｏ細胞、Ｈｅｌａ細胞、Ｃｏｓ細胞、ＣＶ１細胞、およ び種々の一次哺乳類細胞が含まれるが、これらに限定されない。 本発明は、ウズラ・インターフェロン タイプＩの生物学的活性を有する単離 されたポリペプチドを提供する。別の態様において、単離されたポリペプチドは 、ウズラ・インターフェロン タイプ１をコードしており、配列認識番号３２に 記載されているようなアミノ酸配列を有する。 ここで使用する「ポリペプチド」という用語は、核酸によりコードされる完全 長の遺伝子産物またはその一部のことをいう。従って、「ポリペプチド」には、 完全長のタンパク質だけでなく、５０アミノ酸残基より短いペプチドなど、不完 全長の断片をも含む。 更に、単離されたポリペプチドは、単離された核酸分子を第二の核酸分子に結 合させ、適切な宿主細胞で発現させることにより、第二のポリペプチドに結合し て融合タンパク質を形成することができる。一つの態様において、第二の核酸分 子は、β-ガラクトシダーゼをコードする。融合タンパク質を形成するために使 用される他の核酸分子は、当業者に公知である。 本発明は、単離された核酸分子によりコードされるポリペプチドに特異的に結 合する抗体を提供する。一つの態様において、抗体はモノクローナル抗体である 。 別の態様において、ポリペプチドの一つのエピトープを認識する。別の態様にお いて、抗体はポリクローナル抗体である。別の態様において、ポリペプチドの一 以上のエピトープを認識する。別の態様において、抗体は抗イディオタイプ抗体 である。 抗体、ポリペプチド、または単離された核酸分子は、以下のものを含むがこれ らに限定されない検出可能なマーカーで標識することができる：放射性ラベル、 または比色定量マーカー、発光マーカーもしくは蛍光マーカー、または金。放射 性ラベルは、以下のものを含むがこれらに限定されない：³Ｈ、¹⁴Ｃ、³²Ｐ、³³ Ｐ、³⁵Ｓ、³⁶Ｃｌ、⁵¹Ｃｒ、⁵⁷Ｃｏ、⁵⁹Ｃｏ、⁵⁹Ｆｅ、⁹⁰Ｙ、¹²⁵Ｉ、¹³¹Ｉ、お よび¹⁸⁶Ｒｅ。蛍光マーカーは、フルオレセイン、ローダミン、およびオーラミ ンを含むがこれらに限定されない。比色定量マーカーは、ビオチン、およびジゴ キシゲニンを含むがこれらに限定されない。ポリクローナル抗体またはモノクロ ーナル抗体を産生する方法は、通常の当業者に公知である。 更に、抗体、ポリペプチド、または核酸分子は、酵素、例えばアルカリホスフ ァターゼもしくは西洋ワサビペルオキシダーゼに結合し得る二次抗体により検出 することができる。使用可能なその他の酵素は、通常の当業者に公知である。 本発明は、単離された核酸分子によりコードされるポリペプチドを産生する方 法であって、ポリペプチドの産生を可能にする適切な条件下で宿主−ベクターシ ステムを増殖させることと、産生されたポリペプチドを回収することとを具備す る方法を提供する。適切な宿主細胞には、細菌、酵母、糸状真菌類、植物、昆虫 、および哺乳動物の細胞が含まれる。ポリペプチドを産生し回収するための宿主 −ベクターシステムは、当業者に公知であり、以下のものを含むがこれらに限定 されない：Ｅ．ｃｏｌｉおよびｐＭＡＬ（New England Biolabs）、Sf9昆虫細胞 −バキュロウイルス発現システム、およびリポフェクション（Gibco-BRL）もし くはリン酸カルシウムの沈殿、またはベクターを細胞に導入するためのその他の 方法により、哺乳動物の発現ベクターをトランスフェクトされた哺乳動物の細胞 （例えば、ＨｅＬａ、ＣＯＳ、ＮＩＨ３ Ｔ３、およびＨＥＫ２９３）。 本発明は、抗体を作成するためのポリペプチドの単離された核酸分子によりコ ードされるポリペプチド上の特定の領域を選択するための方法を提供する。アミ ノ酸配列は、当業者に公知の方法により分析することができ、そのアミノ酸配列 が構築するポリペプチド内に疎水性領域もしくは親水性領域を作り出すかどうか を決定する。細胞膜のポリペプチドの場合、疎水性領域は、細胞膜の脂質二重層 に挿入されるポリペプチド部分を形成し、親水性領域は水性環境の細胞表面に位 置することが知られている。通常、親水性領域は、疎水性領域より免疫抗原性と なるであろう。従って、親水性アミノ酸配列は、ＤＮＡウイルスをコードする単 離された核酸分子によりコードされるポリペプチドに特異的な抗体を作成するた めに選択し使用することができる。選択されたペプチドは、商業的に入手可能な 機械を用いて調製することができる。あるいは、核酸をクローニングして発現さ せ、得られたポリペプチドを回収し、免疫抗原として使用することができる。 更に、酵素を標識として使用することができる。適切な酵素には、アルカリホ スファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、グルコース-６-リン酸デヒドロゲナーゼ 、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、およびペルオキシダーゼが含まれる。酵素免疫検 定法の二種類の主要タイプは、酵素結合イムノソルベント検定法（ＥＬＩＳＡ） 、および酵素増幅免疫測定法（EMIT，Syva corporation，Palo Alto，CA）とし ても公知のホモジニアス酵素免疫検定法である。ＥＬＩＺＡシステムにおいては 、例えば固相に結合した抗体の使用により、分離を行うことができる。ＥＭＩＴ システムでは、トレーザーと抗体との複合体における酵素活性の不活化に依存す る。従って、分離工程の必要性もなく、活性は測定される。 その上、化学発光性化合物を、標識として使用することができる。典型的な化 学発光性化合物には、ルミノール、イソルミノール、芳香族アクリジニウムエス テル、イミダゾール、アクリジニウム塩、およびシュウ酸エステルが含まれる。 同様に、生物発光性化合物を標識のために使用することができ、生物発光性化合 物には、ルシフェリン、ルシフェラーゼ、およびエクオリンが含まれる。 ラジオイムノアッセイ(ＲＩＡ)の記載は、以下のものに見出すことができるLa boratory Technlques in Biochemlstry and Molecular Biology(1978)NorthHoll and Publishing Company，New York、とりわけT.Chardによる「Introduction t o Radioimmune Assay and Relared Techniques」という題の章。種々のタイプの 一般的な免疫定量アッセイの記載は、以下のものに見出すことができる：米国特 許第4,376,110号（Davidら）、または第4,098,876号（Piasio）。 本発明は、組み換え型ウイルスであって、ウイルスゲノムの非必須領域に挿入 され、且つ宿主細胞で発現させることができる外来性ＤＮＡを具備し、前記外来 性ＤＮＡが、ウズラ・インターフェロン タイプＩであるものを提供する。 該ウイルスは、以下のものから構成される群より選択される：シチメンチョウ ヘルペスウイルス、豚痘ウイルス、仮性狂犬病ウイルス、伝染性ウシ鼻気管炎ウ イルス、ウマヘルペスウイルス、ネコヘルペスウイルス、鶏痘ウイルス、伝染性 喉頭気管炎ウイルス、マレック病ウイルス、ポックスウイルス、カナリア痘ウイ ルス、ラクーン痘ウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ関連ウイルス、アデノ ウイルス、イヌヘルペスウイルス、伝染性ファフリーキウスブルザ病ウイルス、 単純ヘルペスフイルス、およびアルファウイルス。 本発明は、有効な免疫量のウズラ・インターフェロン タイプ１のポリペプチ ドおよび適切な薬学的担体を具備したワクチンを提供する。 前記ワクチンは、フクチン投与に慣用的な任意の方法、例として経口的および 非経口的（例えば皮下もしくは筋内）注入などの方法により投与することができ る。好ましくは筋内投与である。その処置は、一回投与量のワクチン、もしくは ある期間にわたっての複数回の投与量から構成され得る。該投与量が、生後８ケ 月以内にヒトの患者に投与されることが好ましい。本発明の抗原は、適切な投与 量の化合物、例としてインフルエンザ抗原（例えばインフルエンザ タイプＡ抗 原）などの化合物と組み合わせることができる。また、本発明の抗原は、経口投 与に適合し得る組換え型ワクチンの構成要素となり得る。 本発明のワクチンは、多価ワクチンを産生するために、他の疾患のための他の ワクチンと組み合わせることができる。薬学的に有効な量の抗原は、タンパク質 のような薬学的に許容し得る担体、または哺乳類、特にヒトのワクチン投与に有 効な希釈剤とともに使用することができる。他のワクチンは、当業者によく知ら れた方法に従って調製することできる。 当業者なら、有効な免疫保護を引き出すためには、適切なエピトープに哺乳動 物をさらすことのみが必要であると容易に認識するであろう。エピトープは、典 型的にはタンパク質全体の一部であるアミノ酸断片である。組換え遺伝学を使用 して、天然に存在するエピトープと同一もしくは実質的に同一の（免疫学的に等 価な）エピトープを含む誘導体を生成するために、天然のタンパク質の一次構造 を変えることは慣例である。このような誘導体には、ペプチド断片、ポリペプチ ドのアミノ酸配列のアミノ酸置換、アミノ酸欠失、およびアミノ酸付加を含む。 例えば、タンパク質の分野では、あるアミノ酸残基を、タンパク質の生物学的活 性に影響を与えることなく、同じサイズおよび極性のアミノ酸と置換できること は公知である。 本発明は、組換え型ウイルスを高い力価まで増殖させる方法であって、ウズラ ・インターフェロンをコードする単離された核酸分子のセンス鎖に相補的で且つ 発現している配列を含有する細胞株内で、組換え型ウイルスを増殖させることに よる方法を提供する。別の態様において、該ウイルスは、殺されているか、ある いは弱毒化されている。一つの態様において、核酸はセンス鎖である。別の態様 において、核酸はアンチセンス鎖である。 本発明は、組換え型ウイルスの複製を増大させる方法を提供する。一つの態様 において、該ウイルスは、殺されているか、あるいは弱毒化されている。本発明 は、鳥類種のＩＦＮ産生を抑制する方法を提供する。一つの態様において、核酸 はセンス鎖である。別の態様において、核酸はアンチセンス鎖である。 本発明は、ウズラ・インターフェロンを発現するトランスジェニック鳥類の種 を提供する。鳥類の種には、以下のものを含むが、これらに限定されない：ウズ ラ、シチメンチョウ、ニワトリ、ガチョウ、アヒル、ダチョウ、ハト、または家 禽。 本発明は、動物の免疫応答を高めるための方法であって、動物に対して、ウズ ラ・インターフェロンをコードする単離された核酸分子を含むベクターまたはプ ラスミドを含有するワクチンを投与することによる方法を提供する。本発明は、 動物の免疫応答を高めるための方法であって、動物に対して、ウズラ・インター フェロンをコードする単離された核酸分子のセンス鎖に相補的な配列を含むベク ターまたはプラスミドを含有するワクチンを投与することによる方法を提供する 。動物にワクチン投与するために使用される組換え型ウイルスと同時に、または 引き続き、またはその後に、前記ベクターを投与し得ることは、本発明により想 定 される。 本発明は、動物の体重を増加させる方法であって、ウズラ・インターフェロン をコードする単離された核酸分子を含むワクチンを、鳥類の動物に投与すること を具備する方法を提供する。一つの態様において、核酸はセンス鎖である。別の 態様において、核酸はアンチセンス鎖である。 以下に続く実験の詳細な記載部で本発明を更に説明する。この部分は発明を理 解する補助として書かれているが、その後に書かれている請求の範囲に示される 発明を、如何なるようにしても限定することを意図しているものではなく、また そのように解釈すべきものでもない。 実験の詳細： 材料と方法： シチメンチョウのヘルペスウイルスストック試料の調製。２ｍＭグルタミン、 １００単位／ｍｌペニシリン、１００単位／ｍｌストレプトマイシンを含有する ダルベッコー改変イーグル培地(ＤＭＥＭ)（これらの成分は、Ｉｒｖｉｎｅ Ｓ ｃｉｅｎｔｉｆｉｃまたは同等の会社から得られ、以後完全ＤＭＥ培地と呼ぶ） に１％ウシ胎児血清を加えた培地中、０．０１ＰＦＵ／細胞の感染多重度で組織 培養細胞を感染させて、シチメンチョウのヘルペスウイルスストック試料を調製 した。細胞変性作用が完了後、培地と細胞を採取し、細胞を臨床用遠心分離機中 で３０００ｒｐｍで５分遠心分離してペレットにした。感染した細胞を２０％ウ シ胎児血清、１０％ＤＭＳＯを含有する完全培地中に再懸濁し、−７０℃で保存 した。 シチメンチョウのヘルペスウイルスＤＮＡの調製。シチメンチョウのヘルペス ワイルス（ＨＶＴ）のすべての操作は、ＦＣ−１２６株（ＡＴＣＣ＃５８４−Ｃ ）を用いて行なった。感染細胞の細胞質からのＨＶＴウイルスＤＮＡの調製のた めに、初代ニワトリ胚線維芽細胞を、細胞の増殖が始まる前に広範な細胞変性作 用を引き起こすのに充分な感染多重度で感染させた。インキュベートはすべて、 空気中に５％炭酸ガスを有する加湿インキュベーター中で行なった。最大に感染 したが不完全な細胞溶解を示した単層を採取することにより最大のＤＮＡ収率が 得られた（典型的には５〜７日目）。細胞掻き取り器（Ｃｏｓｔａｒブランド） を用いて、培地中に感染した細胞を採取した。細胞懸濁液をＧＳ−３ロータ（Ｓ ｏｒｖａｌｌ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）中で３０００ｒｐｍで５℃で１０分間 遠心分離した。得られたペレットを冷ＰＢＳ（２０ｍｌ／ローラービン（Ｒｏｌ ｌｅｒ Ｂｏｔｔｌｅ））に再懸濁し、冷却してさらに３０００ｒｐｍで１０分 間遠心分離した。ＰＢＳをデカント後、細胞ペレットを４ｍｌ／ローラービンの ＲＳＢ緩衝液（１０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）１ｍＭ ＥＤＴＡ、および１．５ ｍＭ ＭｇＣｌ₂）に再懸濁した。ＮＰ−４０（ノニデットＰ−４０^TM、Ｓｉｇ ｍａ）を、０．５％になるように時々攪拌して試料に加えた。試料を３０００ｒ ｐｍで１０分冷却遠心分離して、核をペレットにし、細胞破片を除去した。上清 液を注意深く、１５ｍｌのＣｏｒｅｘ遠心分離管に移した。ＥＤＴＡ（０．５Ｍ 、ｐＨ８．０）とＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム、ストック２０％）の両者を 、それぞれ最終濃度５ｍＭと１％になるように試料へ加えた。試料４ｍｌに対し て１００μｌのプロテイナーゼ−Ｋ（１０ｍｇ／ｍｌ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ− Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を加え、混合し、４５℃で１〜２時間インキュベートした。 インキュベート後、等量の水飽和フェノールを試料に加え、手で静かに混合した 。臨床用遠心分離機で試料を３０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、相を分離した 、ＮａＡｃを最終濃度０．３Ｍ（ストック溶液３Ｍ、ｐＨ５．２）になるように 水相に加え、２．５容量の冷無水エタノールを添加後−７０℃で３０分間核酸を 沈殿させた。ＨＢ−４ロータ中で５℃で８０００ｒｐｍで２０分間遠心分離して 試料中のＤＮＡをペレットにした。上清を注意深く除去し、ＤＮＡペレットを２ ５ｍｌの８０％エタノールで洗浄した。真空下で短時間（２〜３分）乾燥し、Ｔ Ｅ緩衝液（１０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）の５０μｌ／ロ ーラービンの感染細胞に再懸濁した。典型的にはウイルスＤＮＡの収率は、５〜 １０μｇ／ローラービンの感染細胞の範囲であった。すべてのウイルスＤＮＡを 約１０℃で保存した。 ポリメラーゼ埋め込み（ｆｉｌｌ−ｉｎ）反応。５０ｍＭトリス（ｐＨ７４） 、５０ｍＭ ＫＣｌ、５ｍＭ ＭｇＣｌ₂、および４種類のデオキシヌクレオチ ドを各４０μＭを含有する緩衝液中にＤＮＡを再懸濁した。１０単位のクレノウ ＤＮＡポリメラーゼ（ＢＲＬ）を加え、室温で１５分反応を進行させた。 次にＤＮＡをフェノールで抽出し、前述のようにエタノールで沈殿させた。 ＤＮＡ配列決定。ＵＳＢシーケナーゼキット（Ｓｅｑｕｅｎａｓｅ Ｋｉｔ） と³⁵Ｓ−ｄＡＴＰ（ＮＥＮ）を用いて、配列決定を行なった。ｄＧＴＰ混合物と ｄＩＴＰ混合物の両方を用いて、圧縮のある領域を解明した。あるいは、圧縮の ある領域をホルムアミドゲルで分離した。鋳型は２本鎖プラスミドサブクローン または１本鎖Ｍ１３サブクローンであり、プライマーは、配列決定されるべき挿 入体のすぐ外でベクターに、またはあらかじめ得られた配列に作成した。得られ た配列を集合させ、Ｄｎａｓｔａｒソフトウェアを用いて比較した。得られた配 列の操作と比較は、Ｃｏｒａｌ ＳｏｆｔｗａｒｅのＳｕｐｅｒｃｌｏｎｅ ａ ｎｄ Ｓｕｐｅｒｓｅｅプログラムを用いて行なった。 分子生物学的方法。制限エンドヌクレアーゼによる消化、ゲル電気泳動、ゲル からのＤＮＡの抽出、連結、キナーゼによるリン酸化、ホスファターゼによる処 理、細菌培養物の増殖、ＤＮＡによる細菌の形質転換、および他の分子生物学的 方法を含む、細菌やＤＮＡの操作方法は、マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら （１９８２）およびサンブルック（Ｓａｍｂｒｏｏｋ）ら（１９８９）により記 載されている。種々のＤＮＡの操作に便利な制限部位を導入するために、ポリメ ラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を行なった。使用した方法は、インニス（Ｉｎｎｉｓ ）ら（１９９０）により記載されたものである。一般に増幅された断片のサイズ は５００塩基対未満であり、増幅断片の決定的に重要な領域は、ＤＮＡ配列決定 により確認された。特に明記していない限りこれらの方法に若干変更を加えて使 用した。 ＤＮＡのサザンブロッティング。サザンブロッティングの一般的な方法は、マ ニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ）ら（１９８２）の方法を使用した。ＤＮＡを２ ０×ＳＳＣ（１×ＳＳＣ＝０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍクエン酸ナトリ ウム、ｐＨ７．０）中でニトロセルロースフィルター（Ｓ＆Ｓ ＢＡ８５）にブ ロットし、３０％ホルムアミド、１×デンハルツ溶液（０．０２％ポリビニルピ ロリドン（ＰＶＰ）、０．０２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．０２％フ ィコール）、６×ＳＳＣ、５０ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄、ｐＨ６．８、２００μｇ／ ｍｌサケ精子ＤＮＡよりなるハイブリダイゼーション溶液中で、５５℃で４ 〜２４時間プレハイブリダイゼーションを行なった。Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓ ｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（ＢＲＬ）のキットと１つの³²Ｐ−標識 ヌクレオチドを用いてニックトランスレーションにより標識した標識プローブＤ ＮＡを加えた。ＮＡＣＳカラム（ＢＲＬ）またはセファデックスＧ５０カラム（ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）により、取り込まれなかったヌクレオチドからプローブＤ ＮＡを分離した。５５℃で一晩ハイブリダイゼーション後、フィルターを室温で ２×ＳＳＣで１回洗浄し、次に０．１×ＳＳＣ、０．１％ドデシル硫酸ナトリウ ム（ＳＤＳ）で５５℃で３０分間の洗浄を２回行なった。フィルターを乾燥しオ ートラジオグラフィーを行なった。 ｃＤＮＡクローニング操作。ｃＤＮＡクローニングとは、現状の技術を用いて ＲＮＡ分子をＤＮＡ分子に変換するために使用する方法を意味する。本出願人の 方法は、グブラーとホフマン（Ｇｕｂｌｅｒ ａｎｄ Ｈｏｆｆｍａｎ １９８ ３）に記載されている。Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔ ｏｒｉｅｓ（Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、メリーランド州）は、本出願人の方法 にきわめて類似したｃＤＮＡクローニングキットを考案し、これは我々と同じよ うな結果を得るために使用できる試薬のセットと方法を含む。 ウイルスｍＲＮＡをクローニングするために、ウイルスによる感染に感受性の 宿主細胞株を５〜１０プラーク形成単位／細胞で感染させた。細胞変性作用が明 らかになったが、完全に破壊される前に、培地を除去し、１０ｍｌの溶解緩衝液 （４Ｍグアニジンチオシアネート、０．１％消泡剤Ａ、２５ｍＭクエン酸ナトリ ウム（ｐＨ７．０）、０．５％Ｎ−ラウリルサルコシン、０．１Ｍベータ−メル カプトエタノール）中で細胞を溶解させた。細胞溶解液を、滅菌したダウンスホ モジナイザー中に注ぎ、溶液が均一になるまで氷の上で８〜１０回ホモジネート した。ＲＮＡ精製のために、８ｍｌの細胞溶解液をＢｅｃｋｍａｎ ＳＷ４１遠 心分離管中の３．５ｍｌのＣｓＣｌ溶液（５．７Ｍ ＣｓＣｌ、２５ｍＭクエン 酸ナトリウム（ｐＨ７．０））に静かに重層した。試料をＢｅｃｋｍａｎ ＳＷ ４１ロータ中で２０℃で３６０００ｒｐｍで１８時間遠心分離した。遠心分離管 を氷の上に置き、遠心分離管の上清を注意深く除去してＲＮＡペレットを乱さな いように残した。ペレットを４００μｌのガラスで蒸留した水に再懸濁し、２． ６ｍｌのグアニジン溶液（７．５Ｍグアニジン−塩酸、２５ｍＭクエン酸ナトリ ウム（ｐＨ７．０）、５ｍＭジチオスレイトール）を加えた。０．３７容量の１ Ｍ酢酸を加え、次に０．７５容量の冷エタノールを加え、試料を−２０℃で１８ 時間置いてＲＮＡを沈殿させた。ＳＳ３４ロータ中で４℃で１００００ｒｐｍで １０分間遠心分離して沈殿物を集めた。ペレットを１．０ｍｌの蒸留水に溶解し 、１３０００ｒｐｍで再度遠心分離し、上清を採取した。ペレットからさらに２ 回上述のように０．５ｍｌの蒸留水でＲＮＡを再抽出し、上清をプールした。０ ．１容量の２Ｍ酢酸カリウム溶液を試料に加え、次に冷エタノールを２容量加え て、試料を−２０℃に１８時間置いた。沈殿したＲＮＡを、ＳＳ３４ロータ中で ４℃で１００００ｒｐｍで１０分間遠心分離して集めた。ペレットを１ｍｌの蒸 留水に溶解し、Ａ２６０／２８０の吸光度から濃度を求めた。ＲＮＡを−７０℃ に保存した。 オリゴ−ｄＴセルロース（Ｐｈａｒｍａｃｉａ＃２７ ５５４３−０）を用い て、ポリアデニル酸テイル（ポリ−Ａ）を含有するｍＲＮＡを選択した。３ｍｇ の全ＲＮＡをボイルし、冷却して、結合緩衝液（０．１Ｍトリス（ｐＨ７．５） 、０．５Ｍ ＬｉＣｉ、５ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．１％ドデシル硫 酸リチウム）中で１００ｍｇのオリゴ−ｄＴセルロースカラムにかけた。保持さ れたポリ−Ａ ＲＮＡを、溶出緩衝液（５ｍＭトリス（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．１％ドデシル硫酸ナトリウム）でカラムから溶出 した。このｍＲＮＡを結合緩衝液中で再びオリゴ−ｄＴセルロースカラムにのせ 、溶出緩衝液で再度溶出した。試料を２００ｍＭの酢酸ナトリウムで沈殿させ、 ２体積の冷エタノールを加えて、−２０℃で１８時間置いた。ＲＮＡを５０μｌ の蒸留水に再懸濁した。 １０μｇのポリ−Ａ ＲＮＡを２０ｍＭの水酸化メチル水銀中で２２℃で６分 間変性させた。β−メルカプトエタノールを７５ｍＭになるように加え、試料を ２２℃で５分間インキュベートした。第１の鎖のｃＤＮＡ合成のための反応混合 物は０．２５ｍｌ中に、１μｇのオリゴ−ｄＴプライマー（Ｐ−Ｌ Ｂｉｏ−ｃ ｈｅｍｉｃｌａｓ）または１μｇ合成プライマー、２８単位の胎盤リボヌクレア ーゼインヒビター（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒ ｉｅｓ ＃５５１８ＳＡ）、１００ｍＭトリス（ｐＨ８．３）、１４０ｍＭ Ｋ Ｃｌ、１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂、０．８ｍＭ ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよ びｄＴＴＰ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）、１００μＣｉの³²Ｐ−標識ｄＣＴＰ（Ｎｅ ｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｎｕｃｌｅａｒ ＃ＮＥＧ−０１３Ｈ）、および１８０単 位のＡＭＶ逆転写酵素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｒｅｓｏｕｒ ｃｅｓ ＃ＭＧ １０１）を含有した。反応物を４２℃で９０分間インキュベー トし、次に２０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）で反応を停止させた。試料を等体 積のフェノール／クロロホルム（１：１）で抽出し、２Ｍの酢酸アンモニウムと ２体積の冷エタノールで−２０℃で３時間沈殿させた。沈殿と遠心分離後、ペレ ットを１００μｌの蒸留水に溶解した。試料を緩衝液（１００ｍＭトリス（ｐＨ ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、１００ｍＭ ＮａＣｌ）中で１５ ｍｌのＧ−１００セファデックスカラム（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）にかけた。溶出 するＤＮＡ画分の先端をプールし、容量が約１００μｌになるまでＤＮＡを凍結 乾燥して濃縮し、次に酢酸アンモウムとエタノールで前記したように沈殿させた 。 第１の鎖の全試料を第２の鎖の反応に使用した。第２の鎖の反応は、全量５０ μｌ中の５０μｇ／ｍｌ ｄＮＴＰ、５．４単位のＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｂｏ ｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ ＃６４２−７１１）、および１００単位 ／ｍｌの大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡリガーゼ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂ ｉｏｌａｂｓ ＃２０５）を用いた以外は、グブラーとホフマン（Ｇｕｂｌｅｒ ａｎｄ Ｈｏｆｆｍａｎ（１９８３））の方法に従った。第２の鎖の合成後、 ｃＤＮＡをフェノール／クロロホルムで抽出し沈殿させた。このＤＮＡを１０μ ｌの蒸留水に再懸濁し、１μｇのＲＮアーゼＡで２２℃で１０分間処理し、４０ ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ６．８５）中１％アガロースゲル（Ｓｉｇｍａ II型ア ガロース）で電気泳動した。ゲルを臭化エチジウムで染色し、予想される範囲の サイズのＤＮＡをゲルから切り出し、８ｍＭトリス−酢酸（ｐＨ６．８５）で電 気泳動した。電気泳動したＤＮＡを凍結乾燥して約１００μｌにし、前記したよ うに酢酸アンモニウムとエタノールで沈殿させた。ＤＮＡを２０μｌの水に再懸 濁した。 クローニングを促進するためにＤＮＡにオリゴ−ｄＣを加えた。反応物は、５ ０μｌ中にＤＮＡ、１００ｍＭカコジル酸カリウム（ｐＨ７．２）、０．２ｍＭ ジチオスレイトール、２ｍＭ ＣａＣｌ₂、８０μモルｄＣＴＰ、および２５単 位のターミナルデオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（Ｍｏｌｅｃｕｌａ ｒ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ ＃１００１）を含有した。３７℃ で３０分後、１０ｍＭ ＥＤＴＡで反応を停止させ、試料をフェノール／クロロ ホルムで抽出し、前記したように沈殿させた。 ｄＣテイルのあるＤＮＡ試料を、２００μｌの０．０１Ｍトリス（ｐＨ７．５ ）、０．１Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）中の、オリゴ−ｄＧ テイル(Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ ＃５３５５ ＳＡ／ ＳＢ)を含有する２００ｎｇのプラスミドベクターｐＢＲ３２２に、６５℃で２ 分間、次に５７℃で２時間アニーリングさせた、新鮮なコンピタント大腸菌（Ｅ ．ｃｏｌｉ）ＤＨ−１細胞を調製し、ハナハン（Ｈａｎａｈａｎ（１９８３）） が記載したように、２００μｌの一定分割量の細胞２０個中のアニーリングした ｃＤＮＡ試料の半分を用いて形質転換した。形質転換した細胞を１０μｇ／ｍｌ テトラサイクリン含有するＬ−ブロス寒天プレートに広げた。Ａｍｐｓｃｒｅｅ ｎ（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ＃５５ ３７ＵＡ）を用いて、アンピシリン遺伝子中の挿入体の存在についてコロニーを スクリーニングし、陽性のクローンを取り上げて分析に供した。 組換えヘルペスウイルス作製のためのＤＮＡトランスフェクション。本方法は 、以下の変更を有する、カワイとニシザワ（Ｋａｗａｉ ａｎｄ ＮｉＳｈｉｚ ａｗａ（１９８４））のポリブレン−ＤＭＳＯ法に基づく。組換えＨＶＴウイル スの作製は、ＨＶＴウイルスＤＮＡと、適当なヘルペスウイルスクローン化配列 が隣接する目的の外来性ＤＮＡを含有するプラスミド相同性ベクターとの相同的 組換えに依存する。トランスフェクションは、６ｃｍのプレート（Ｃｏｒｎｉｎ ｇ ｐｌａｓｔｉｃ）の５０％コンフルエンスの初代ニワトリ胚線維芽（ＣＥＦ ）細胞中で行なった。細胞を前日に、４μｇ／ｍｌのポリプレン（１×ＨＢＳＳ 中ストック４ｍｇ／ｍｌ）を含有するＣＥＦ増殖培地（１×Ｆ１０／１９９、５ ％ウシ胎児血清、２％グルタミン、１％非必須アミノ酸、および２％ペニシリン ／ストレプトマイシン）中に広げた。ＣＥＦ細胞へのコトランスフェクション （cotransfection）のために、５μｇの完全なＨＶＴ ＤＮＡを、３０μｇ／ｍ ｌポリプレン（１×ＨＢＳＳ中ストック４ｍｇ／ｍｌ）を含有するＣＥＦ培地１ ｍｌ中に懸濁した。次にＤＮＡ−ポリプレン懸濁液（１ｍｌ）を６ｃｍプレート のＣＥＦ細胞に加え、ここから培地を吸引し、３９℃で３０分間インキュベート した。接種物を再分散させろために、この間プレートを定期的に揺らせた。この 時間の後、４ｍｌのＣＥＦ増殖培地を洗浄プレートに直接加え、３９℃でさらに ２．５時間インキュベートした。この時、各プレートから培地を除去し、１×Ｈ ＢＳＳ中の３０％ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド、Ｊ．Ｔ．Ｂａｋｅｒ Ｃｈ ｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．）２ｍｌで室温で４分間細胞にショックを与えた。３０％ ＤＭＳＯを注意深く除去し、単層を室温で１×ＨＢＳＳで１回洗浄した。次に５ ｍｌのＣＥＦ増殖培地を添加後、細胞を３９℃でインキュベートした。翌日、残 存するＤＭＳＯを除去し細胞増殖を刺激するために、培地を交換した。６日以内 にウイルスの細胞変性作用が明らかになる。この日から通常１週間以内に、より 高力価（８０％〜９０％ＣＰＥ）の作製が可能になる。感染細胞を、２０％ウシ 胎児血清、１０％ＤＭＳＯを含有するＣＥＦ増殖培地中に再懸濁してＨＶＴスト ック試料を調製し、−７０℃に保存した。 サブゲノムＤＮＡ断片からの組換えヘルペスウイルスの作製方法。クローン化 した重複サブゲノム断片のコ・トランスフェクションによるヘルペスウイルスを 作製する能力は、仮性狂犬病ウイルス（Ｚｉｊｌら、１９８８）について証明さ れている。欠失および／または挿入は、コ・トランスフェクションの前に直接サ ブゲノム断片に行われるなら、この方法によりゲノム変更を含有する高頻度のウ イルスが得られ、組換えウイルスの精製に必要なスクリーニングの量を大幅に低 下させる。この方法は組換えＨＶＴの構築に使用された。 重複するＨＶＴサブゲノム断片を含有するサブクローンのライブラリーを、以 下のように作製した。ＨＶＴ ＤＮＡは、アメリカンタイプカルチャーコレクシ ヨン（ＦＣ−１２６（「Ｃａｌｎｅｋ」））から得た。これを剪断し、次にｖａ ｎ Ｚｉｊｌら（１９８８）が記載したように、４０〜５０ｋｂの断片を挿入体 集団として選択して、グリセロール勾配によりサイズ選択した。プールした画分 をＴＥで２倍希釈し、１／１０容量の３Ｍ ＮａＡａｃと２．５体積のエタノー ルを加え、ＤＮＡをＢｅｃｋｍａｎ ＳＷ４１ロータ中で３０Ｋｒｐｍで１時間 沈殿させた。３’オーバーハングの除去を促進するために低濃度のＤＮＴＰを用 いて、まずＴ４ ＤＮＡポリメラーゼにより剪断した断片を処理し、次にへこん だ３’末端をクレノウポリメラーセで充填して平滑末端にした。次にこれらの挿 入体断片を、ＢａｍＨＩで消化しウシ小腸ホスファターゼで処理し、クレノウポ リメラーゼで平滑末端としたｐＷＥ１５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）コスミドベク ターに連結した。次に、連結した混合物をＧｉｇａｐａｃｋ ＸＬパッケージ抽 出物（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用いてパッケージングした。連結とパッケージ ングは、製造業者の薦めるように行なった。 酵素ＢａｍＨＩ、Ｈｉｎｄ III、およびＸｈｏＩの公開された制限酵素地図の ため、サブクローニングした断片を特異的プローブとして使用して、ゲノムをま たぐサブクローニングのコスミドライブラリーをスクリーニングすることができ た。サブクローニングした制限断片からプローブを作製した。次に非放射性シス テム（Ｇｅｎｉｕｓ，Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を用いて、断 片を標識した。コロニーを取り上げて培地に入れ次に一晩増殖させてスクリーニ ングを促進させた。５個のフイルターとマスタープレートのセットを、マイクロ タイターディッシュからスタンプして、再び一晩増殖させた。グリセロールを１ ５％になるようにウェルに入れ、プレートを−２０℃で凍結して、各コロニーの ストック培養物を得た。フィルターは、Ｂｉｏ Ｒａｄ Ｃｏｌｏｎｙ Ｌｉｆ ｔ Ｍｅｍｂｒａｎｅｓであり、製造業者の薦めるように処理しハイブリダイズ させ、０．１×ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳ中で６５℃で洗浄した。非放射性プロー ブとハイブリダイズしたコロニーを、Ｇｅｎｉｕｓキットの説明書に従って検出 した。 ２つまたはそれ以上の特異的プローブへのハイブリダイゼーションに基づき、 さらに解析してコロニーを選択した。次にこれらをＢａｍＨＩで消化し、ＨＶＴ の公開されている地図（Ｂｕｃｋｍａｓｔｅｒら、１９８８）と比較した。こう して３つのコスミド（４０７−３２．２Ｃ３、４０７−３２．ＩＧ７、４０７− ３２．５Ｇ６）を得た。各クローンの詳細な説明は後述する。これらのコロニー から妥当な収率のＤＮＡを得るには、クロラムフェニコール増幅（Ｍａｎｉａｔ ｉｓら、１９８２）が必要であることが見いだされた。さらに、１つのコスミド クローン（４０７−３２．５Ｇ６）は不安定であり、満足できるＤＮＡ調製物を 得るには、元の凍結ストックから増殖する必要があった。 ｐＷＥ１５ベクターは、挿入体をＮｏｔＩで切断することを可能にする。しか し、ＨＶＴゲノムには４つのＮｏｔＩ部位があり、これらの部位にまたがってい る挿入体はＮｏｔＩで切断できない。ＨＶＴのＢａｍＨＩ＃２断片にはＮｏｔＩ 部位の２つがあり、この断片は直接ｐＳＰ６４中でクローン化された。他の２つ の部位は、ＢａｍＨＩ＃１断片内のユニークな短い領域中に存在した。この断片 はｐＷＥ１５ベクター中で直接クローン化された。３つの剪断したコスミドと２ つのＢａｍＨＩ断片は、ＨＶＴゲノムの末端のすべてのしかし小さな部分をカバ ーする。これらの領域はゲノムの内部で繰り返されているため、ゲノム情報のす べてが利用できる。 ＨＶＴ ＵＳ２遺伝子内のＳｔｕＩ部位は、「組換えヘルペスウイルスを作製 するための相同的組換え法」（例６を参照されたい）を用いて、外来性ＤＮＡ挿 入のための有用な部位として確立された。ＨＶＴ ＵＳ２遺伝子は、５つのＳｔ ｕＩ部位を含有するＢａｍＨＩ＃１断片内に位置する。この部位の使用を外来性 ＤＮＡの挿入のために容易化するために、ＵＳ２遺伝子内のＳｔｕＩ部位をユニ ークなＨｉｎｄ III郵位に変換した。このために、ＢａｍＨＩ＃１サブクローン をＳｔｕＩ部位で部分的に消化し、次にＨｉｎｄ IIIリンカーを用いてこの部位 内にカノマイシン耐性（ＮｅｏＲ）を与える１０ｋｂの断片を挿入した。カノマ イシン耐性遺伝子により、組換えクローンの陽性の選択が可能になった。このＮ ｅｏＲ断片はＨｉｎｄ IIIで消化して除去し、次に再連結してクローン４３０− ８４．２１５を作製した。 ＨＶＴ挿入部分の外または隣接するサブクローンを切断する酵素で制限消化し て、再構築実験のためにＤＮＡを調製した。ある場合には、再構築中の１つのコ スミドを消化しないで使用した。消化したＤＮＡをフェノールで１回抽出し、エ タノールで沈殿させた。ＤＮＡを０．５〜１μｇ／ｍｌの濃度で再懸濁した。ト ランスフェクションを仲介するためにウィルス再構築実験をリポフェクチン（Ｂ ＲＬ）を用いて行なった。各サブクローン２〜３μｇを、１％非必須アミノ酸と ２％ペニシリン／ストレプトマイシンを補足したＭＥＭ培地（アール塩溶液）（ ＭＥＭ＋）０．５ｍｌに加えた。対照は、ＤＮＡを含ないＭＥＭ＋であり、数μ ｇのＨＶＴ ＤＮＡを含むかまたは５つのサブクローンのうち４つを含むもので ある。別途、３０μｌのリポフェクチンを別の０．５ｍｌのＭＥＭ＋に加えた。 次に、これらの２つの混合物を一緒にし、ＲＴで１５分間インキュベートした。 ニワトリ胚線維芽（ＣＥＦ）細胞をトランスフェクションのために、以下のよ うに調製した。ＣＥＦ（Ｓｐａｆａｓ）を６ウェルディッシュ中で、１％非必須 アミノ酸、２％ペニシリン／ストレプトマイシン、および５％ウシ胎児血清を含 有するＦ１０／Ｍ１９９（１：１）培地（ＣＥＦ＋）中で３９℃で増殖させた。 細胞を９０〜９５％のコンフルエンスでトランスフェクトした。トランスフェク ションのために、ウェルを吸引し、ＭＥＭ＋で３回洗浄し、次に前記の１ｍｌリ ポフェクチン／ＤＮＡ混合物とともに３９℃で４時間インキュベートした。次に さらに１ｍｌのＣＥＦ＋をウェルに加え、細胞を一晩インキュベートし、ＣＥＦ ＋を与えた。次にプラークの出現について毎日プレートを試験した。 対照ＨＶＴ ＤＮＡを有するリポフェクチンでは、５日以内にプラークが出現 した。５クローンのうち４つのみを使用すると、プラークは得られなかった。Ｈ ＶＴの５つの重複するゲノムの断片を使用してウイルスを再構築すると、最初の リポフェクション後５〜１９日のどこかでプラークが出現した。遅く出現するプ ラークの場合は、感染した単層に最初プラークは見えず、単層を継代して大きな 表面に再度広げるとプラークが現れた。継代後、一般に３日以内にプラークが現 れた。組換えウイルスを約３回プラーク精製し、次に、外来性ＤＮＡの挿入につ いて解析した。 組換えヘルペスウイルスのＢｌｕｏｇａｌスクリーニング。外来性ＤＮＡが酵 素β−ガラクトシダーゼをコードする場合、その遺伝子を含有するプラークはよ り容易に目で見えた。プラーク測定の間、化学物質ＢｌｕｏｇａｌＴＭ（Ｂｅｔ ｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ）は２００〜３００μｇ／ｍｌのレベ ルでアガロース重層中に取り込まれ、活性なβ−ガラクトシダーゼを発現するプ ラークは青くなった。赤色プラークのための化学物質ＣＰＲＧ（クロロフェノー ルレッド ガラクトピラノシド、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ） は、プラーク測定の間、アガロース重層中に取り込まれ、活性β−ガラクトシダ ーゼを発現するプラークは赤くなった。次に青色プラーク又は赤色プラークを取 り上げ、さらに青色プラーク又は赤色プラークを単離して精製した。他の外来性 ＤＮＡを、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を置換するように相同的組換えにより挿 入した。この場合、組換えウイルスの精製のために青くないプラークを取り上げ た。 黒色プラーク測定法を用いる組換えＨＶＴでの外来遺伝子発現のスクリーニン グ。組換えＨＶＴウイルスにより発現される外来性抗原の発現を解析するために 、ＣＥＦ細胞の単層を組換えＨＶＴで感染させて、栄養アガロース培地を重層し 、３９℃で４〜５日間インキュベートした。プラーク出現後、アガロース重層を ディッシュから除去し、単層をＰＢＳで１回洗浄し、１００％メタノールで室温 で１０分間固定し、細胞を空気乾燥した。ＰＢＳでプレートを再び水和した後、 一次抗体をＰＢＳで適当な希釈率で希釈し、室温で２時間から一晩細胞単層とと もにインキュベートした。次に室温でＰＢＳで３回洗浄して、結合しなかった抗 体を細胞から除去した。アルカリ性ホスファターゼ結合２次抗体をＰＢＳで希釈 し、細胞単層とともに室温で２時間インキュベートした。次に室温で細胞をＰＢ Ｓで３回洗浄して、結合しなかった２次抗体を除去した。発色緩衝液（１００ｍ Ｍトリス（ｐＨ９．５）／１００ｍＭ ＮａＣｌ／５ｍＭ ＭｇＣｌ₂）で単層 を洗浄し、次に新たに調製した基質溶液（発色緩衝液中０．３ｍｇ／ｍｌニトロ プルーテトラゾリウム＋０．１５ｍｇ／ｍｌ ５−プロモ−４−クロロ−３−イ ンドリルホスフェート）で室温で１０分〜一晩インキュベートした。最後に、基 質溶液をＴＥ（１０ｍＭトリス（ｐＨ７．５）／１ｍＭ ＥＤＴＡ）で置換して 反応を停止させた。正しい抗原を発現するプラークは黒く染色される。 組換えＨＶＴストックの純度を評価するためのプラークハイブリダイゼーショ ン法。組換えＨＶＴウイルス中の特定の抗原の存在を検出するための適当な免疫 学的試薬が存在しない場合、ストックの純度を評価するためにプラークハイブリ ダイゼーション法が使用される。まずＣＥＦ細胞単層を種々の希釈率のウイルス ストックでインフェクションさせて、約５０まで〜１００プラーク／１０ｃｍデ ィッシュを得、栄養アガロース培地を重層し、３９℃で４〜５日間インキュベ ートする。いったんプラークが出現したら、各プラークの位置をディッシュの底 にマークする。次にアガロース重層を除去し、プレートをＰＢＳで洗浄し、残存 するＣＥＦ単層をＰＢＳであらかじめ浸潤させたＮＣ膜またはＢｉｏＲａｄナイ ロン膜に移動させる（プレートに対して膜の位置を記録しておく）。次に膜を１ ．５ｍｌの１．５Ｍ ＮａＣｌおよび０．５Ｍ ＮａＯＨに５分間入れて、ＮＣ 膜上に含有される細胞を溶解する。膜を１．５ｍｌの３Ｍ酢酸ナトリウム（ｐＨ ５．２）中に５分間入れて中和する。次に溶解した細胞からのＤＮＡを８０℃で １時間ベークしてＮＣ膜に結合させる。この時間の後、膜を、６×ＳＳＣ、３％ スキムミルク、０．５％ＳＤＳ、（±）サケ精子ＤＮＡ（５０μｇ／ｍｌ）を含 有する溶液中で６５℃で１時間プレハイブリダイゼーションする。次に、放射標 識プローブＤＮＡ（アルファ³²Ｐ−ｄＣＴＰ）を加え、膜を６５℃で一晩（約１ ２時間まで）インキュベートした。ハイブリダイゼーション後ＮＣ膜を６５℃で ２×ＳＳＣで２回洗浄（各３０分）し、次に６５℃で０．５×ＳＳＣでさらに２ 回洗浄する。次にＮＣ膜を乾燥し、−７０℃で１２時間Ｘ線フィルム（Ｋｏｄａ ｋ ＸＯＭＴ，ＡＲ）に露光させる。陽性のシグナルをディッシュ上のプラーク の位置と合わせて、ストックの純度を、全体に対する陽性プラークのパーセント として記録する。 ＨＶＴ ＵＳ２遺伝子へのベータガラクトシダーゼ遺伝子の挿入のための相同 ベクターの作製。ベータガラクトシダーゼ（ｌａｃＺ）遺伝子を、ＨＶＴ Ｅｃ ｏＲＩ＃７断片中のユニークなＳｔｕＩ部位に挿入した。マーカー遺伝子はＵＳ ２遺伝子と同じ配向である。これは標準的組換えＤＮＡ法（Ｍａｎｉａｔｉｓら 、１９８２およびＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）を用いて、以下の供給源から の制限断片を合成ＤＮＡ配列と結合させて構築される。断片１は、ＰＲＶ Ｂａ ｍＨＩ制限断片１０（Ｌｏｍｎｉｃｚｉら、１９８４）の約４１３塩基対のＳａ ｌＩからＢａｍＨＩ制限サブ断片である。断片２は、プラスミドｐＪＦ７５１（ Ｆｅｒｒａｒｉら、１９８５）の約３０１０塩基対のＢａｍＨＩからＰｖｕII制 限断片である。断片３は、ＰＲＶ ＢａｍＨＩ制限断片＃７（Ｌｏｍｎｉｃｚｉ ら、１９８４）の約７５４塩基対のＮｄｅＩからＳａｌＩ制限サブ断片である。 コンカナバリンＡで刺激したニワトリ脾臓細胞から単離されたＲＮＡ：ＳＰ ＡＦＡＳ，Ｉｎｃの３週令のヒョコからニワトリ脾臓を切開し、洗浄し、そして シリンジ／針で破壊し細胞を放出させた。間質と破片を沈降させた後、細胞をペ レットにし、ＰＢＳで２回洗浄した。細胞ペレットを低張溶解緩衝液で処理して 赤血球を溶解し、脾臓細胞を回収し、ＰＢＳで２回洗浄した。脾臓細胞を、５％ ＦＢＳおよび５μｇ／ｍｌコンカナバリンＡを含有するＲＰＭＩ中に５×１０⁶ 細胞／ｍｌで再懸濁し、３９℃で４８時間インキュベートした。グアニジンイソ シアネート溶解試薬とＰｒｏｍｅｇａ ＲＮＡ単離キット（Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃ ｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マジソン、ウィスコンシン州）の試薬を用いて、細胞か ら全ＲＮＡを単離した。適当なアンチセンスプライマーとＡＭＶ逆転写酵素（Ｐ ｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、マジソン、ウィスコンシン州）を含有 する各第１の鎖反応物に、４μｇの全ＲＮＡを使用した。ｃＤＮＡ合成は、逆転 ポリメラーゼ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、ベセスダ、メ リーランド州）を用いて行なった。 組換えＰＰＶ又はＳＰｖを創製するための相同的組換え操作。この方法は、Ｆ ＰＶ又はＳＰＶ ＤＮＡと、ＦＰＶ又はＳＰＶ ＤＮＡ及びトランスフェクトさ れたプラスミド相同性ベクターの両者を含有する組織培養細胞において発生する プラスミド相同性ベクターＤＮＡとの間の相同的組換えに基づく。相同的組換え が発生するためには、単層のＣＥＦ細胞が、Ｓ−ＥＰＶ ００１（弱い鶏痘ワク チン株(Ａｇｒｉ−Ｂｌｏ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｇａｉｎｓｖｉｌｌｅ、 ジョージア州からＢｉｏ−Ｐｏｘ^TMとして入手可能)）又はＳｐｖ−００１（カ スザ(Kasza)株）により、細胞内に複製ＦＰＶを導入するために（すなわち、Ｄ ＮＡ合成）又はＳＰＶを導入するために、０．０１ＰＦＵ／細胞の多重感染度で インフェクトされる。次いで、プラスミド相同性ベクターＤＮＡは、「インフェ クション−トランスフェクション操作」に従い、これらの細胞内にトランスフェ クトされる。 インフェクション−トランスフェクション操作。６ｃｍプレート内のＣＥＦ細 胞（約８０％のコンフルエンス）をＳ−ＦＰＶ−００１により、ＣＥＦネガティ ブ培地中の０．０１ＰＦＵ／細胞の感染多重度でインフェクションし、加湿５％ ＣＯ₂インキュベーター中で５時間インキュベートした。６ｃｍプレート中のＥ ＳＫ−４細胞ＣＥＦ細胞（約８０％のコンフルエンス）をＳ−ＳＰＶ−００１に より、ＣＥＦネガティブ培地中の０．０１ＰＦＵ／細胞の感染多重度でインフェ クションし、加湿５％ＣＯ₂インキュベーター中で５時間インキュベートした。 用いたトランスフェクション操作は、本質的には、リポフェクチンＴＭ 試薬（ ＬｉｐｏｆｅｃｔｉｎＴＭ Ｒｅａｇｅｎｔ（ＢＲＬ））のために推薦されるも のである。要約すると、各々の６ｃｍプレートにてついて、１５マイクログラム のプラスミドＤＮＡをＨ₂Ｏにより１００マイクロリットルにまで希釈した。別 途、５０マイクログラムのリポフェクチンＴＭ試薬をＨ₂Ｏにより１００マイク ロリットルに希釈した。１００マイクロリットルの希釈したリポフェクチンＴＭ 試薬を、ポリスチレン５ｍｌスナップキャップ試験管中に含有される希釈したプ ラスミドＤＮＡに滴下し、穏やかに混合した。次いで、混合物を室温で１５〜２ ０分間インキュベートした。この時間中、ウイルス摂取物を６ｃｍプレートから 除去し、細胞単層をＣＥＦネガティブ培地により１回洗浄した。３ミリリットル のＣＥＦネガティブ培地をプラスミドＤＮＡ／リポフェクチン混合物に添加し、 内容物を細胞単層上にピペットでかけた。加湿５％ＣＯ₂インキュベーターにお いて３７℃で一晩（約１６時間）インキュベートした後、培地を除去し、５ｍｌ のＣＥＦ完全培地で置換した。細胞を、ウイルスによる細胞変性作用が８０ １ ００％になるまで、３〜７日間、加湿５％ＣＯ₂中、３７℃でインキュベートし た。ウイルスを上述したように回収し、ウイルスストックの調製物に供した。こ のストックをトランスフェクションストックといい、引き続き、「組換えＦＰＶ を精製するためのプラークハイブリダイゼーション操作」により組換えウイルス をスクリーニングした。 組換え鳥類キメラＨＶＴ／ＭＤＶヘルペスウイルスを生成させるための相同組 換えタンパク質：コンフルエンス前(subconfluent)１°または２°ニワトリ胚繊 維芽細胞単層（７０〜８０％コンフルエンス）をトランスフェクトする。使用の 日に、培地（Ｆ１０培地＋Ｍ１９９培地（１：１ミックス）、１％胎児ウシ血清 ；２％グメタミン；１％ ＮＥＡＡ；１％ペニシリン−ストレプトマイシン）を 維持するために培地を交換する。（１）ＤＮＡ：２０μｌ親ウイルスＤＮＡ（ゲ ル上で目に見える量）；２−３μｇ挿入ベクター；ｄＨ₂Ｏないし３００μｌを 混合する。（２）リン酸カルシウムｐｐｔ．：３００μｌ ＤＮＡ；３７μｌ ２．５Ｍ ＣａＣｌ₂；３４０μｌ ２×ＨＥＰＥＳ−緩衝化生理食塩水。（３ ）混合物を室温で１分間混合し、次いで細胞に（培地に）滴下し、反応混合物を ２×３５ｍｍディッシュ（６−ウェルディッシュの２ウェル）上に均等に分割す る。（４）３９℃で３時間インキュベートする。（５）培地／反応混合物をＰＢ Ｓ中の１５％グリセロール１ｍｌで置き換えることによって細胞に１分間グリセ ロールショックを付す。（６）細胞に維持培地を供給し、３９℃で一晩インキュ ベートする。（７）次の日、新鮮な培地で置き換え、ＣＰＥが観察されるまでイ ンキュベーションを継続し、培地を各２〜３日交換する。感染した培地を、ＣＰ Ｅに到達するまでより大きなディッシュに１回以上継代する。 サブゲノミッククローン１７２−０７．ＢＡ２。プラスミド１７２−０７．Ｂ Ａ２を組換えＨＶＴを生成させる目的で構築した。それはゲノミックＨＶＴＤＮ Ａのほぼ２５，０００塩基対領域を含有する。それは、組換えＨＶＴの構築のた めの「重複サブゲノミックフラグメントから組換えヘルペスウイルスを生成させ るための手法」に従って、他のサブゲノミッククローンと組み合わせて使用する ことができる。このプラスミドは、以下の源からの２つの制限断片を連結させる ことによって、標準的な組換えＤＮＡ技術（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２およ びＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）を利用して構築することができる。最初の断 片はｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ）のほぼ２９９９塩基対ＢａｍＨＩないしＢａ ｍＨＩ制限断片である。第２の断片はＨＶＴのほぼ２５，０００塩基対ＢａｍＨ Ｉ＃２断片である（Ｂｕｃｋｍａｓｔｅｒら、１９８８）。 相同性ベクター１７２−２９．３１。プラスミド１７２−２９．３１は外来性 ＤＮＡをＨＶＴに挿入する目的で構築した。それは、外来性ＤＮＡを挿入するこ とができるユニークなＸｈｏＩ制限酵素部位を含有する。ＸｈｏＩ部位に外来性 ＤＮＡ挿入物を含有するプラスミドを、「組換えヘルペスウイルスを生成させる ためのＤＮＡコ・トランスフェクション」または「重複サブゲノミック断片から 組換えヘルペスウイルスを生成させるための手法」に従って使用し、外来性ＤＮ Ａを含有するウイルスが得られる。このプラスミドは、以下の源からの２つの 制限断片を連結させることによって、標準的な組換えＤＮＡ技術（Ｍａｎｉａｔ ｉｓら、１９８２およびＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）を利用して構築するこ とができる。最初の断片はｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ）のほぼ２９９９塩基対 ＢａｍＨＩないしＢａｍＨＩ制限断片である。第２の断片はＨＶＴのほぼ３３０ ０塩基対ＢａｍＨＩ＃１６断片である（Ｂｕｃｋｍａｓｔｅｒら、１９８８）。 ＢａｍＨＩ＃１６断片の完全な配列は配列番号１に与えられる。該断片は、ＵＬ ４３ ＯＲＦがｐＳＰ６４ β−ラクタマーゼ遺伝子に対して反対の転写向きで あるようにクローン化する。 相同性ベクター１７２−６３．１。プラスミド１７２−６３．１を外来性ＤＮ ＡをＨＶＴに挿入する目的で構築した。それは外来性ＤＮＡを挿入することがで きるユニークなＸｈｏＩ制限酵素部位を含有する。ＸｈｏＩ部位に外来性ＤＮＡ 挿入物を含有するプラスミドを、「組換えヘルペスウイルスを生成させるための ＤＮＡコトランスフェクション」または「重複サブゲノミック断片から組換えヘ ルペスウイルスを生成させるための手法」に従って使用し、外来性ＤＮＡを含有 するウイルスが得られる。このプラスミドは、以下の源からの２つの制限断片を 連結させることによって、標準的な組換えＤＮＡ技術（Ｍａｎｉａｔｉｓら、１ ９８２およびＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）を利用して構築することができる 。最初の断片はｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ）のほぼ２９９９塩基対ＥｃｏＲＩ ないしＥｃｏＲＩ制限断片である。第２の断片はＨＶＴのほぼ５５００塩基対Ｅ ｃｏＲＩ＃９断片である。ＥｃｏＲＩ断片は、ユニークなＸｈｏＩ部位がｐＳＰ ６４ベクター中のユニークなＨｉｎｄＩＩＩ部位に最も近いようにクローン化す る。 サブゲノミッククローン４０７−３２．１Ｃ１。コスミド４０７−３２．１Ｃ １は、組換えＨＶＴならびにマレック病ウイルス短領域およびシチメンチョウ長 領域のヘルペスウイルスを含む組換えキメラウイルスワクチンを生成させる目的 で構築した。それは、ゲノムＨＶＴ ＤＮＡのほぼ３８，８５０塩基対領域を含 有する（図２参照）。この領域はＢａｍＨＩ断片１１、７、８、２１、６、１８ 、断片１３のほぼ１２５０塩基対を含有する。それは、組換えＨＶＴの構築のた めの「重複サブゲノミックフラグメントから組換えヘルペスウイルスを生成さ せるためる手法」に従って、他のサブゲノミッククローンと組み合わせて使用す ることができる。このコスミドは、恐らくは、「重複サブゲノミック断片から組 換えヘルペスウイルスを生成させるための手法」において前記したごとくに構築 することができる。それはプローブＰ１およびＰ４でスクリーニングすることに よって、剪断をかけたＤＮＡライブラリーから単離した（図２に記載）。このコ スミドを含有する細菌株は、特許手続目的の微生物の国際寄託に関するブダペス ト条約に従って、受託番号７５４２８の下で、米国２０８５２、メリーランド州 、ロックビル、パークレーン・ドライブ１２３０１番地のＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔ ｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに１９９３年３月３日に寄託さ れている。 サブゲノミッククローン４０７−３２．２Ｃ３。コスミド４０７−３２．２Ｃ ３は、組換えＨＶＴを生成させる目的で構築した。それは、ゲノムＨＶＴ ＤＮ Ａのほぼ４０，１７０塩基対領域を含有する（図２参照）。この領域はＢａｍＨ Ｉ断片１０、１４、１９、１７、５、および断片２のほぼ２，１００塩基対を含 有する。それは、組換えＨＶＴの構築のための「重複サブゲノミックフラグメン トから組換えヘルペスウイルスを生成させるための手法」に従って、他のサブゲ ノミッククローンと組み合わせて使用することができる。このコスミドは、「重 複サブゲノミック断片から組換えヘルペスウイルスを生成させるための手法」に おいて前記したごとくに構築することができる。それはプローブＰ１およびＰ２ でスクリーニングすることによって、剪断をかけたＤＮＡライブラリーから単離 した（図２に記載）。このコスミドを含有する細菌株は、特許手続目的の微生物 の国際寄託に関するブダペスト条約に従って、受託番号７５４３０の下で、米国 ２０８５２、メリーランド州、ロックビル、バークレーン・ドライブ１２３０１ 番地のＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに 寄託されている。 サブゲノミッククローン４０７−３２．５Ｇ６。コスミド４０７−３２．５Ｇ ６は、組換えＨＶＴを生成させる目的で構築した。それは、ゲノムＨＶＴ ＤＮ Ａのほぼ４０，０００塩基対領域を含有する（図２参照）。この領域はＢａｍＨ Ｉ断片９、３、２０、１２、１６、１３、および断片２のほぼ１，６５０塩基 対を含有する。それは、組換えＨＶＴの構築のための「重複サブゲノミックフラ グメントから組換えヘルペスウイルスを生成させるための手法」に従って、他の サブゲノミッククローンと組み合わせて使用することができる。このコスミドは 、「重複サブゲノミック断片から組換えヘルペスウイルスを生成させるための手 法」において前記したごとくに構築することができる。それはプローブＰ２およ びＰ３でスクリーニングすることによって、剪断をかけたＤＮＡライブラリーか ら単離した（図２に記載）。このコスミドを含有する細菌株は、特許手続目的の 微生物の国際寄託に関するブダペスト条約に従って、受託番号７５４２７の下で 、米国２０８５２、メリーランド州、ロックビル、パークレーン・ドライブ１２ ３０１番地のＡｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉ ｏｎに１９９３年３月３日に寄託されている。 相同性ベクター４３５−４７．１。プラスミド４３５−４７．１は外来性ＤＮ ＡをＨＶＴに挿入する目的で構築した。それは、外来性ＤＮＡを挿入することが できるユニークなＨｎｉｄＩＩＩ制限酵素部位を含有する。ＨｉｎｄＩＩＩＩ部 位に外来性ＤＮＡ挿入物を含有するプラスミドを、ＤＮＡ「組換えヘルペスウイ ルスを生成させるためのＤＮＡコトランスフェクション」または「重複サブゲノ ミック断片から組換えヘルペスウイルスを生成させるための手法」に従って使用 し、外来性ＤＮＡを含有するウイルスが得られる。このプラスミドは、以下の源 からの２つの制限断片を連結させることによって、標準的な組換えＤＮＡ技術（ Ｍａｎｉａｔｉｓら、１９８２およびＳａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）を利用し て構築することができる。最初の断片はｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ）のほぼ２ ９９９塩基対ＥｃｏＲＩないしＥｃｏＲＩ制限断片である。第２の断片はＨＶＴ のほぼ７３００塩基対ＥｃｏＲＩ＃７断片である。ｐＳＰ６４ベクターのＨｉｎ ｄＩＩＩＩ部位は、ＨｉｎｄＩＩＩＩでサブクローンを消化し、続いて反応およ び再連結におけるクレノウ充填によって除去したことに注意されたし。次いで、 合成ＨｉｎｄＩＩＩＩリンカー（ＣＡＡＧＣＴＴＧ）をＥｃｏＲＩ ＃７断片の ユニークなＳｔｕＩ部位に挿入した。 サブゲノミッククローン４３７−２６．２６。コスミド４３７−２６．２６は 、組換えＨＶＴを生成させる目的で構築した。それは、ゲノムＨＶＴ ＤＮＡ のほぼ１５，３００塩基対領域を含有する。それは、組換えＨＶＴの構築のため の「重複サブゲノミックフラグメントから組換えヘルペスウイルスを生成させる ための手法」に従って、他のサブゲノミッククローンと組み合わせて使用するこ とができる。このプラスミドは、以下の源からの２つの制限断片を連結すること によって、標準的な組換えＤＮＡ技術（Ｍａｎｉａｔｉｓら，１９８２およびＳ ａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）を利用して構築することができる。最初の断片は ｐＳＰ６４（Ｐｒｏｍｅｇａ）のほぼ２９７０塩基対ＨｉｎｄＩＩＩＩないしＢ ａｍＨＩ制限断片である。第２の断片はＨＶＴのＢａｍＨＩ＃２断片のほぼ１５ ，３００塩基対ＢａｍＨＩないしＳｔｕＩサブ断片である（Ｂｕｃｋｍａｓｔｅ ｒら，１９８８）。ＢａｍＨＩ＃２断片は５つのＳｔｕＩ部位を含有し、このサ ブクローニングで利用した部位は、「重複サブゲノミックフラグメントから組換 えヘルペスウイルスを生成させるための手法」において、前記したごとくにＨｉ ｎｄＩＩＩＩ部位に変換した。 サブゲノミッククローン４１５−０９．ＢＡ１。コスミド４１５−０９．ＢＡ １は、組換えＨＶＴを生成させる目的で構築した。それは、ゲノムＨＶＴ ＤＮ Ａのほぼ２９，５００塩基対領域を含有する。それは、組換えＨＶＴの構築のた めの「重複サブゲノミックフラグメントから組換えヘルペスウイルスを生成させ るための手法」に従って、他のサブゲノミッククローンと組み合わせて使用する ことができる。このコスミドは、以下の源のからの２つの制限断片を連結するこ とによって（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）構築した。該ベクターはｐＨＣ７ ９に由来するｐＳＹ１００５のほぼ４４３０塩基対ＢａｍＨＩないしＢａｍＨＩ 制限断片である（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．） 。最初の断片はＨＶＴゲノムのほぼ２９，５００塩基対ＢａｍＨＩ＃１断片であ る（Ｂｕｃｋｍａｓｔｅｒら，１９８８）。 サブゲノミッククローン６７２−０１．Ａ４０。コスミド６７２−０１．Ａ４ ０は、組換えＨＶＴを生成させる目的で構築した。それは、コスミド４０７−３ ２．１Ｃ１のサブクローンとして単離した（図２および３参照）。コスミド６７ ２−０１．Ａ４０はほぼ１４，０００塩基対ＮｏｔＩないしＡｓｃＩサブ断片お よびコスミド４０７−３２．１Ｃ１のほぼ１３００塩基対ＡｓｃＩないしＢａ ｍＨＩサブ断片を含有する。該コスミドは、以下の源からの制限断片を連結する ことによって（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）構築した。該ベクターはＳｍａ Ｉ部位に挿入されたＮｏｔＩリンカーを含有するｐＮＥＢ１９３（Ｎｅｗ Ｅｎ ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）から構築されたほぼ２７００塩基対Ｎ ｔｏＩないしＢａｍＨＩ断片である。断片１はゲノムＨＶＴ ＤＮＡのほぼ１５ ，３００塩基対である。この領域は、ＢａｍＨＩ断片１１および７、および断片 １３のほぼ１２５０塩基対を含む。それは、組換えＨＶＴの構築のための「重複 サブゲノミックフラグメントから組換えヘルペスウイルスを生成させるための手 法」に従って他のサブゲノミッククローンと組み合わせて使用した。 サブゲノミッククローン６５４−４５．１。プラスミド６５４−４５．１は、 組換えＨＶＴを生成させる目的で構築した。それは、コスミド４０７−３２．１ Ｃ１のＡｓｃＩサブクローンとして単離した（図２および５参照）。該コスミド は、以下の源からの制限断片を連結することによって（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１ ９８９）構築した。該ベクターはクレノウＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、 ＡｓｃＩリンカーが挿入されたｐＮＥＢ１９３（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉ ｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）の２０００塩基対ＡａｔＩＩないしＰｖｕＩＩ断片から 構築されたほぼ２０００塩基対ＡｓｃＩ断片である。断片ＩはゲノムＨＶＴ Ｄ ＮＡのほぼ８６００塩基対ＡｓｃＩないしＡｓｃＩ断片である。この領域は、Ｂ ａｍＨＩ断片１０および２１、および断片６のほぼ１１００塩基対および断片７ のほぼ１３００塩基対を含む。ＸｈｏＩ部位（ヌクレオチド＃１３３９〜１３４ ４；配列番号１２）は合成ＤＮＡリンカーを用いてユニークなＰａｃＩ前位に変 換されている。該ＰａｃＩ部位はＨＶＴにおける外来性遺伝子の挿入および発現 で使用した。（図３Ａ）参照。それは、組換えＨＶＴの構築のための「重複サブ ゲノミックフラグメントから組換えヘルペスウイルスを生成させるための手法」 に従って他のサブゲノミッククローンと組み合わせて使用した。 サブゲノミッククローン６８６−６３．Ａ１。プラスミド６８６−６３．Ａ１ は、組換えＨＶＴを生成させる目的で構築した。それは、コスミド４０７−３２ ．１Ｃ１のＡｓｃＩサブクローンとして単離した（図２および５参照）。該コス ミドは、以下の源からの制限断片を連結することによって（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ら，１９８９）構築した。該ベクターはクレノウＤＮＡポリメラーゼで平滑末端 とし、ＡｓｃＩリンカーが挿入されたｐＮＥＢ１９３（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）の２０００塩基対ＡａｔＩＩないしＰｖｕＩＩ断 片から構築されたほぼ２０００塩基対ＡｓｃＩ断片である。断片１はゲノムＨＶ Ｔ ＤＮＡのほぼ８６００塩基対ＡｓｃＩないしＡｓｃＩ断片である。この領域 は、ＢａｍＨＩ断片１０および２１、および断片６のほぼ１１００塩基対および 断片７のほぼ１３００塩基対を含む。ＸｈｏＩ部位（ヌクレオチド＃１３３９〜 １３４４；配列番号１２）は合成ＤＮＡリンカーを用いてユニークなＮｏｔＩ部 位に変換されている。該ＮｏｔＩ部位はＨＶＴにおける外来性遺伝子の挿入およ び発現で使用した。（図３Ｂ参照）。それは、組換えＨＶＴの構築のための「重 複サブゲノミックフラグメントから組換えヘルペスウイルスを生成させるための 手法」に従って他のサブゲノミッククローンと組み合わせて使用した。 サブゲノミッククローン６７２−０７．Ｃ４０。コスミド６７２−０７．Ｃ４ ０は、組換えＨＶＴを生成させる目的で構築した。それは、コスミド４０７−３ ２．１Ｃ１のサブクローンとして単離した（図２および５参照）。コスミド６７ ２−０７．Ｃ４０は、コスミド４０７−３２．１Ｃ１のほぼ１１００塩基対Ｂａ ｍＨＩないしＡｓｃＩサブ断片およびほぼ１３，０００塩基対ＡｓｃＩないしＮ ｏｔＩサブ断片を含有する。該コスミドは、以下の源からの制限断片を連結する ことによって（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）構築した。該ベクターはＳｍａ Ｉ部位に挿入されたＮｏｔＩリンカーを含有するｐＮＥＢ１９３（Ｎｅｗ Ｅｎ ｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）の２７００塩基対ＮｏｔＩないしＢａ ｍＨＩ断片である。断片１はゲノムＨＶＴ ＤＮＡのほぼ１４，１００塩基対領 域である。この領域は、ＢａｍＨＩ断片６および１８、およびＢａｍＨＩ断片＃ １内のほぼ２６００塩基対ＢａｍＨＩないしＮｏｔＩ断片を含む。それは、組換 えＨＶＴの構築のための「重複サブゲノミックフラグメントから組換えヘルペス ウイルスを生成させるための手法」に従って他のサブゲノミッククローンと組み 合わせて使用した。 サブゲノミッククローン７２０−５１．３。コスミド７２０−５１．３は、組 換えＨＶＴを生成させ、およびマレック病ウイルス短領域およびシチメンチョ ウ長領域のヘルペスウイルスを含む組換えキメラウイルスワクチンを生成させる 目的で構築した。それは、ゲノムＨＶＴ ＤＮＡのほぼ３４，７００塩基対領域 を含有する（図２参照）。この領域はＢａｍＨＩ断片１１、７、８、２１、６、 １８、断片１３のほぼ１２５０塩基対、およびＢａｍＨＩ断片１のほぼ２，６０ ０塩基対を含有する。それは、組換えＨＶＴの構築のための「重複サブゲノミッ クフラグメントから組換えヘルペスウイルスを生成させるための手法」に従って 、他のサブゲノミッククローンと組み合わせて使用することができる。コスミド ７２０−５１．３は、以下の手法でコスミド４０７−３２．１Ｃ１から構築した 。コスミド４０７−３２．１Ｃ１を制限エンドヌクレアーゼＮｏｔＩで消化して 、ほぼ３４，７００塩基対ＨＶＴゲノム断片、ほぼ４，１００塩基対ＨＶＴゲノ ム断片、およびほぼ８，０００塩基対ｐＷＥ１５コスミドベクターを得た。該３ ４，７００塩基対ＨＶＴゲノム断片および８，０００塩基対ｐＷＥ１５コスミド ベクターを連結して、コスミド７２０−５１．３を形成させた。コスミド７２０ −５１．３は、コスミド４０７−３２．１Ｃ１に存在するＨＶＴ ＢａｍＨＩゲ ノム断片からのほぼ４，１００塩基対を欠いている。コスミド７２０−５１．３ は組換えＨＶＴへのおよびマレック病ウイルス短領域およびシチメンチョウ長領 域のヘルペスウイルスのキメラを含む組換えキメラウイルスワクチンへの外来性 ＤＮＡの挿入に有用なＨＶＴゲノム断片ＥｃｏＲＩ＃９内にＸｈｏＩ部位を含有 する。 サブゲノミッククローン７２１−３８．１Ｊ。コスミド７２１−３８．１Ｊは 、ＭＤＶ ｇＡ、ｇＤおよびｇＢ遺伝子をＨＶＴのユニークな短領域に挿入し、 および組換えＨＶＴを生成させる目的で構築した。コスミド７２１−３８．１Ｊ はＨＶＴのユニークな短領域のＢａｍＨＩ＃１断片内のユニークなＨｉｎｄＩＩ ＩＩ部位に変換されたＨＶＴ ＵＳ１遺伝子におけるＳｔｕＩ部位に挿入された ＭＤＶ ｇＡ、ｇＤおよびｇＤ遺伝子を含有する。ＭＤＶ遺伝子を含有するＨＶ Ｔ ＢａｍＨＩ＃１断片のこの領域はＳ−ＨＶＴ−０６２に由来した。コスミド ７２１−３８．１Ｊは、Ｓ−ＨＶＴ−０６２ ＤＮＡのＢａｍＨＩでの部分的制 限消化およびほぼ３９，３００塩基対断片の単離によって構築した。該コスミド は、以下の源からの制限断片を連結させることによって、標準的なＤＮＡ技術を 利用して（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）構築した。該ベクターはコスミドベ クターｐＷＥ１５からのほぼ８２００塩基対ＢａｍＨＩ断片である。最初の断片 はＨＶＴゲノムの反復領域からのほぼ９００塩基対ＢａｍＨＩ断片である。第２ の断片はＨＶＴのＢａｍＨＩ＃１のほぼ１５，５００塩基対ＢａｍＨＩないしＳ ｔｕＩサブ断片である。第３の断片はＭＤＶ ｇＡ、ｇＤおよびｇＢ遺伝子を含 有するほぼ８４００塩基対カセットである。第４の断片はＨＶＴのＢａｍＨＩ＃ １のほぼ１４，５００塩基対ＨｉｎｄＩＩＩないしＢａｍＨＩサブ断片である。 サブゲノミッククローン７２２−６０．Ｅ２。コスミド７２２−６０．Ｅ２は 、ＭＤＶ ｇＡ、ｇＤおよびｇＢ遺伝子およびＮＤＶ ＨＮおよびＦ遺伝子をＨ ＶＴのユニークな短領域に挿入する目的で、および組換えＨＶＴを生成させる目 的で構築した。コスミド７２２−６０．Ｅ２はＨＶＴのユニークな短領域のＢａ ｍＨＩ＃１断片内のユニークなＨｉｎｄＩＩＩＩ部位に変換されたＨＶＴ ＵＳ ２遺伝子におけるＳｔｕＩ部位に挿入されたＭＤＶ ｇＡ、ｇＤおよびｇＢ遺伝 子ならびにＮＤＶ ＨＮおよびＦ遺伝子を含有する。全ての５つの遺伝子はＨＶ Ｔ ＵＳ２遺伝子と同一の転写向きに挿入された。ＭＤＶおよびＮＤＶ遺伝子を 含有するＨＶＴ ＢａｍＨＩ＃１断片のこの領域はＳ−ＨＶＴ−１０６に由来し た。コスミド７２２−６０．Ｅ２は、Ｓ−ＨＶＴ−１０６のＢａｍＨＩでの部分 的制限消化およびほぼ４６，３００塩基対断片の単離によって構築した。該コス ミドは、以下の源からの制限断片を連結させることによって、標準的なＤＮＡ技 術を利用して（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）構築した。該ベクターはｐＨＣ ７９（Ｂｅｔｈｅｓｄａ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）およびｐＷ Ｅ１５（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｉｎｃ．）に由来するコスミドベクターｐＳＹ １６２６からのほぼ６１００塩基対ＢａｍＨＩ断片である。最初の断片はＨＶＴ ゲノムの反復領域からのほぼ９００塩基対ＢａｍＨＩ断片である。第２の断片は ＨＶＴのＢａｍＨＩ＃１のほぼ１５，５００塩基対ＢａｍＨＩないしＳｔｕＩサ ブ断片である。第３の断片はＭＤＶ ｇＡ遺伝子（配列番号：６）、ＰＲＶ ｇ Ｘプロモーター（Ｌｏｍｎｉｃｚｉら，１９８４）、ＮＤＶ ＨＮ遺伝子（配列 番号：８）、ＰＲＶ ｇＸポリアデニル化部位（Ｌｏｍｎｉｃｚｉら，１９８４ ）、ＨＣＭＶ前初期プロモーター(Ｄ.Ｒ．Ｔｈｏｍｓｅｎら，１９８１)、ＮＤ Ｖ Ｆ遺伝子（配列番号：１０）、ＨＳＶ ＴＫポリアデニル化部位（ＭｃＧｅ ｏｃｈ ら，１９８５）、ＭＤＶ ｇＤ遺伝子、ほぼ４５０塩基対ＩＬＴＶ ＵＳ３ポリ アデニル化部位、およびＭＤＶ ｇＢ遺伝子を含有するほぼ１５，４００塩基対 カセットである。第４の断片はＨＳＶのＢａｍＨＩ＃１のほぼ１４，５００塩基 対ＳｔｕＩないしＢａｍＨＩサブ断片である。 サブゲノミッククローン７３９−２７．１６。コスミド７３９−２７．１６は ユニークな長領域のＨＶＴ遺伝子およびユニークな短領域のＭＤＶタイプ１遺伝 子を含有するキメラＨＳＶ／ＭＤＶウイルスを構築する目的で構築した。コスミ ド７３９−２７．１６はＭＤＶタイプ１の完全なユニークな短領域を含有する。 この領域は、全ＳｍａＩ断片および２つのＳｍａＩ Ｋ断片を含有する。コスミ ド７３９−２７．１６はＭＤＶ ＤＮＡのＳｍａＩでの部分的制限消化およびほ ぼ２９，０００ないし３３，０００塩基対断片の単離によって構築した。該コス ミドは、以下の源からの制限断片を連結させることによって、標準的なＤＮＡ技 術を利用して（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）構築した。該ベクターはコスミ ドベクターｐＷＥ１５からの（レノウＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とした）ほ ぼ８２００塩基対ＢａｍＨＩ断片である。最初の断片はＭＤＶゲノムの短い内部 反復領域からのほぼ４０５０塩基対ＳｍａＩ Ｋ断片である。第２の断片はＭＤ Ｖのほぼ２１，０００塩基対断片ＳｍａＩ Ｂである。第３の断片はＭＤＶゲノ ムの短い末端反復領域からのほぼ３，６５０塩基対ＳｍａＩ Ｋ断片である（Ｆ ｕｋｕｃｈｉら，１９８４，１９８５）。 サブゲノミッククローン７５１−８７．Ａ８。プラスミド７５１−８７．Ａ８ は組換えＨＶＴを生成させる目的で構築した。プラスミド７５１−８７．Ａ８は プラスミド６５４−４５．１のＰａｃＩ部位に挿入されたニワトリ骨髄単球増殖 因子（ｃＧＭＦ）遺伝子を含有する。該ｃＧＭＦ遺伝子はＨＣＭＶ前初期プロモ ーターおよびＨＳＶ−１ ＴＫポリアデニル化シグナルを使用する。該コスミド は標準的な組換えＤＮＡ技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら．１９８９）を利用して構築 した。以下の断片をＨＶＴサブゲノムクローン６５４−４５．１のＰａｃＩ部位 に挿入した。最初の断片はＨＣＭＶゲノムＸｂａＩ Ｅ断片（Ｄ．Ｒ．Ｔｈｏｍ ｓｅｎら，１９８１）のほぼ１１９１塩基対ＰｓｔＩないしＡｖａＩＩ制限サブ 断片である。第２の断片は、「コンカナバリンＡ刺激ニワトリ脾臓細胞から単 離されたＲＮＡ」の逆転写およびポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（Ｓａｍｂｒｏ ｏｋら，１９８９）によって誘導されたｃＭＧＦ遺伝子（５８）につきコードす るほぼ６４０塩基対断片である。逆転写およびＰＣＲで使用したアンチセンスプ ライマーは５’−ＣＧＣＡＧＧＡＴＣＣＧＧＧＧＣＧＴＣＡＧＡＧＧＣＧＧＧＣ ＧＡＧＧＴＧ−３’（配列番号：１９）であった。ＰＣＲで使用したセンスプラ イマーは５’−ＧＡＧＣＧＧＡＴＣＣＴＧＣＡＧＧＡＧＧＡＧＡＣＡＣＡＧＡＧ ＣＴＧ−３’（配列番号：２０）であった。ｃＭＧＦ断片を、ＰＣＲプライマー によって生じたＢａｍＨＩ部位を用い、ＨＣＭＶ ＩＥプロモーターの次にサブ クローンした。該ＤＮＡ断片は、アミノ末端の２３個のアミノ酸リーダー配列お よび成熟ｃＭＧＦタンパク質の１７８個のアミノ酸を含むｃＭＧＦタンパク質（ ５８）のアミノ酸１ないしアミノ酸２０１のコーディング配列を含有する。第３ の断片はＨＳＶ−１ ＢａｍＨＩ制限断片Ｑのほぼ７８４塩基対ＳｍａＩないし ＳｍａＩ制限サブ断片である（ＭｃＧｅｏｃｈら，１９８５）。 サブゲノミッククローン７６１−０７．Ａ１。プラスミド７６１−０７．Ａ１ は組換えＨＶＴを生成させる目的で構築した。プラスミド７６１−０７．Ａ１は 、プセスミド６５４−４５．１のＰａｃＩ部位に挿入されたニワトリ・インター フェロン遺伝子を含有する。該ニワトリ・インターフェロン遺伝子は、ＨＣＭＶ 前初期プロモーターおよびＨＳＶ−１ ＴＫポリアデニル化シグナルを使用する 。該コスミドは標準的な組換えＤＮＡ技術（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）を 利用して構築した。以下の断片をＨＶＴサブ断片クローン６５４−４５．１のＰ ａｃＩ部位に挿入した。最初の断片は、ＨＣＭＶゲノムＸｂａＩ Ｅ断片（Ｄ． Ｒ．Ｔｈｏｍｓｅｎら，１９８１）のほぼ１１９１塩基対ＰｓｔＩないしＡｖａ ＩＩ制限サブ断片である。第２の断片は、「コンカナバリンＡ刺激ニワトリ脾臓 細胞から単離されたＲＮＡ」の逆転写およびポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）（Ｓ ａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）によって誘導されたニワトリ・インターフェロン 遺伝子（５８）につきコードするほぼ５７７塩基対断片である。逆転写およびＰ ＣＲで使用したアンチセンスプライマーは５’−ＴＧＴＡＧＡＧＡＴＣＴＧＧＣ ＴＡＡＧＴＧＣＧＣＧＴＧＴＴＧＣＣＴＧ−３’（配列番号：２１）であった。 ＰＣＲで使用したセンス・プライマーは５’−ＴＧＴＡＣＡＧＡＴＣＴＣＡＣＣ ＡＴＧＧＣＴＧＴＧＣＣＴＧＣＡＡＧＡ−３’（配列番号：２２）であった。ニ ワトリ・インターフェロン遺伝子断片は、ＰＣＲプライマーによって生じたＢｇ ＩＩＩ部位を用いてＨＣＭＶ ＩＥプロモーターの次にサブクローンした。該Ｄ ＮＡ断片は、アミノ末端の３１個アミノ酸シグナル配列およびニワトリ・インタ ーフェロンをコードする成熟タンパク質の１６２個アミノ酸を含むニワトリ・イ ンターフェロンタンパク質（５９）のコーディング配列を含有する。第３の断片 は、ＨＳＶ−１ ＢａｍＨＩ制限断片Ｑ（ＭｃＧｅｏｃｈ，１９８５）のほぼ７ ８４塩基対ＳｍａＩないしＳｍａＩ制限サブ断片である。 サブゲノミッククローン３０１−０７．Ｙ＃Ｄ１：外来性ＤＮＡ配列を発現す る組換えキメラＨＶＴ／ＭＤＣワクチンを生成させる目的で構築した。Ｅ．ｃｏ ｌｉ ＬａｃＺ遺伝子はＰＲＶ ｇＸプロモーターの制御下で発現させる。該Ｈ ＶＴ ＤＮＡはコスミド４０７−３２.１Ｃ１のＡｓｃＩサブクローンである(図 ２および５参照)。該コスミドは以下の源から制限断片を連結することによって （Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）構築した。該ベクターはクレノウＤＮＡポリ メラーゼで平滑末端とし、ＡｓｃＩリンカーを挿入したｐＮＥＢ１９３（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）の２０００塩基対ＡａｔＩＩない しＰｖｕＩＩ断片から構築したほぼ２０００塩基対ＡｓｃＩ断片である。該ＨＶ Ｔ断片はゲノムＨＶＴ ＤＮＡのほぼ８６００塩基対ＡｓｃＩないしＡｓｃＩ断 片である。この領域は、ＢａｍＨＩ断片１０および２１、断片６のほぼ１１００ 塩基対および断片７のほぼ１３００塩基対を含む。該ＸｈｏＩ部位（ヌクレオチ ド＃１３３９〜２３４４：配列番号１２）をＨＶＴにおける外来性遺伝子の挿入 および発現で用いた。（図３Ｂ参照）。ＨＶＴのＸｈｏＩ部位に挿入された外来 性ＤＮＡは以下の通りである：断片１はＰＲＶ ＢａｍＨＩ制限断片１０（Ｌｏ ｍｉｃｚｉら，１９８４）のほぼ４１３塩基対ＳａｌＩないしＢａｍＨＩ制限サ ブ断片である。断片２は、プラスミドｐＪＦ７５１（Ｆｅｒａｒｉら，１９８５ ）のほぼ３０１０塩基対ＢａｍＨＩないしＰｖｕＩＩ制限断片である。断片３は 、ＰＲＶ ＢａｍＨＩ制限断片＃７（Ｌｏｍｎｉｚｉら，１９８４）のほぼ７５ ４塩基対ＮｄｅＩないしＳａｌＩＩ制限サブ断片である。プラスミド３０１−０ ７Ｙ＃Ｄ１は組換えキメラＨＶＴ／ＭＤＶワクチンの構築のための「組換えウイ ル スを生成させるためのＤＮＡトランスフェクション」に従ってＳ−ＨＶＹ−１４ ５と組み合わせて使用した。 サブゲノミッククローンＢ５２−５２．ＩＩ４。プラスミドＢ５２−５２．Ｉ Ｉ４は、外来性ＤＮＡ配列を発現する組換えキメラＨＶＴ／ＭＤＶワクチンを生 成させる目的で構築した。感染性喉頭気管炎（ＩＬＴ）ウイルス糖タンパク質Ｄ （ｇＤ）およびタンパク質Ｉ（ｇＩ）遺伝子はＩＬＴウイルスｇＤおよびｇＩプ ロモーターの制御下で発現させる。該ＨＶＴ ＤＮＡはコスミド４０７−３２１ ＣｉのＡｓｃＩサブクローンである（図２および５参照）。該コスミドは以下の 源からの制限断片を連結させることによって（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９） 構築した。該ベクターはクレノウＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、ＡｓｃＩ リンカーを挿入したｐＮＥＢ１９３（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｌａｂｓ， Ｉｎｃ．）の２０００塩基対ＡａｔＩＩないしＰｖｕＩＩ断片から構築したほぼ ２０００塩基対ＡｓｃＩ断片である。該ＨＶＴ断片はゲノムＨＶＴ ＤＮＡのほ ぼ８６００塩基対ＡｓｃＩないしＡｓｃＩ断片である。この領域はＢａｍＨＩ断 片１０および２１、および断片６のほぼ１１００塩基対および断片７のほぼ１３ ００塩基対を含む。該ＸｈｏＩ部位（ヌクレオチド＃１３３９〜２３４４：配列 番号１２）をＨＶＴにおける外来性遺伝子の挿入および発現で用いた。（図３Ｂ 参照）。ＨＶＴのＸｈｏＩ部位に挿入された外来性ＤＮＡは以下の通りである： 該断片はＩＬＴＶ Ａｓｐ７１８１ゲノム断片＃８（１０．６ｋｂ）のほぼ３５ ５６塩基対ＳａｌＩないしＨｉｎｄＩＩＩ制限サブ断片である。プラスミド８５ ２−５２．ＩＩ４はは組換えＨＶＴの構築のための「重複サブゲノム断片からの 組換えヘルペスウイルスを生成させるための手法」に従って他のサブゲノムクロ ーンと組み合わせた使用した。 サブゲノミッククローンＢ５４−３３．６。プラスミド８５４−３３．８は外 来性ＤＮＡ配列を発現する組換えＨＶＴを生成させ、マレック病ウイルス短領域 および外来性ＤＮＡ配列を発現するシチメンチョウ長領域のヘルペスウイルスを 含む組換えキメラウイルスワクチンを生成させる目的で構築した。ニューキャッ スル病ウイルス（ＮＤＶ）ヘマグルチニン（ＨＮ）遺伝子はＰＲＶ ｇＸプロモ ーターの制御下で発現させる。ＨＶＤ融合（Ｆ）遺伝子はＨＣＭＶ前初期プロ モーターの制御下で発現させる。それらの各プロモーターの制御下のＮＤＶ Ｈ ＮおよびＦ遺伝子は隣接ＨＴＶゲノムＤＮＡにおけるＨＶＴ ＵＬ５２、ＵＬ５ ４およびＵＬ５５遺伝子から反対方向に転写される。該ＨＶＴ ＤＮＡは、コス ミド４０７−３２．１Ｃ１のサブクローンであるコスミド７２０−５１．３に由 来する（図２、５参照）。該ＨＶＴ断片はゲノムＨＶＴ ＤＮＡのほぼ３４，７ ００塩基対である。この領域はＢａｍＨＩ断片１１、７、８、２１、６、１８、 および断片１３のほぼ１２５０塩基対および断片１のほぼ２６００塩基対を含む 。該ＸｈｏＩ部位（ヌクレオチド＃１３３９〜２３４４：配列番号１２）をＨＶ Ｔにおける外来性遺伝子の挿入および発現で用いた。（図３Ｂ参照）。該コスミ ドは以下の源からの制限断片を連結することによって（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１ ９８９）構築した。該ベクターはｐＮＷ１５のほぼ８０００塩基対ＮｏｔＩ断片 である。ＨＶＴのＸｈｏＩ部位に挿入された外来性ＤＮＡは以下の通りである： 断片１はＰＲＶ ＢａｍＨＩ断片＃１０（Ｌｏｍｎｉｃｚｉら，１９８４）のほ ぼ４１３塩基対ＳａｌＩないしＢａｍＨＩ制限サブ断片である。断片２は全長Ｎ ＤＶ ＨＮ ｃＤＮＡクローンのほぼ１８１１塩基対ＡｖａＩＩないしＮａｅＩ 制限断片である（Ｂ１株）。断片３はＰＲＶ ＢａｍＨＩ＃７（Ｂ．Ｌｏｍｎｉ ｃｚｉら）のほぼ７５４塩基対ＮｄｅＩないしＳａｌＩサブ断片である。断片４ は、ＨＣＭＶゲノムＸｂａＩ Ｅ断片（Ｄ．Ｒ．Ｔｈｏｍｓｅｎら，１９８１） のほぼ１１９１塩基対ＰｓｔＩないしＡｖａＩＩ制限サブ断片である。断片５は 全長ＮＤＶ Ｆ ｃＤＮＡクローン（Ｂ１株：文献：ＷＯ９６／０５２９１）の ほぼ１８１２塩基対ＢａｍＨＩないしＰｓｔＩ制限断片であろ。断片６はＨＳＶ −１ ＢａｍＨＩ制限断片Ｑ（ＭｃＧｅｏｎら，１９８５）のほぼ７８４塩基対 ＳｍａＩないしＳｍａＩ制限サブ断片である。 相同性ベクター８６４−７４．１８：プラスミド８６４−７４．１８は、外来 性ＤＮＡ配列を発現する組換えキメラＨＶＴ／ＭＤＶワクチンを生成させる目的 で構築した。Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子はＰＲＶ ｇＸプロモーターの制御 下で発現させる。該ＨＶＴ ＤＮＡはコスミド４０７−３２．１Ｃ１のＡｃＩサ ブクローンである。（図２および５参照）。該コスミドは以下の源からの制限断 片を連結することによって（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）構築した。該ベク ターはクレノウＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、ＡｓｃＩリンカーを挿入し たｐＮＥＢ１９３（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）の２ ０００塩基対ＡａｔＩＩないしＰｖｕＩＩ断片から構築したほぼ２０００塩基対 ＡｓｃＩ断片である。該ＨＶＴ断片はゲノムＨＶＴ ＤＮＡのほぼ８６００塩基 対ＡｓｃＩないしＡｓｃＩ断片である。この領域は、ＢａｍＨＩ断片１０および ２１、断片６のほぼ１１００塩基対および断片７のほぼ１３００塩基対を含む。 ＸｈｏＩ部位（ヌクレオチド＃１３３９〜１３４４：配列番号１２）は、ＨＶＴ における外来性遺伝子の挿入および発現で使用した。（図３Ｂ参照）。ＨＶＴの ＸｈｏＩ部位に挿入された外来性ＤＮＡは以下の通りである：断片１はＩＬＴＶ Ａｓｐ７１８１ゲノム断片＃８（１０．６ｋｂ）のほぼ３５５６塩基対Ｓａｌ ＩないしＨｉｎｄＩＩＩ制限サブ断片である。断片２はＰＲＶ ＢａｍＨＩ制限 断片１０（Ｌｏｍｎｉｃｚｉら，１９８４）のほぼ４１３塩基対ＳａｌＩないし ＢａｍＨＩ制限サブ断片である。断片３は、プラスミドｐＪＦ７５１（Ｆｅｒｒ ａｒｉら，１９８５）のほぼ３０１０塩基対ＢａｍＨＩないしＰｖｕＩＩ制限断 片である。断片４はＰＲＶ ＢａｍＨＩ制限断片＃７（Ｌｏｍｎｉｃｚｉら，１ ９８４）のほぼ７５４塩基対ＮｄｅＩないしＳａｌＩ制限サブ断片である。プラ スミド８６４−７４．１８を組換えキメラＨＴＶ／ＭＤＶワクチンの構築のため に「組換えウイルスを生成させるためのＤＮＡトランスフェクション」に従って Ｓ−ＨＶＹ−１４５と組み合わせて使用した。 サブゲノミッククローン８６７−９６．Ｂ９。プラスミド８６７−９６．Ｂ９ は外来性ＤＮＡ配列を発現する組換えＨＶＴを生成させる目的で構築した。Ｅ． ｃｏｌｉβ−ガラクトシダーゼ遺伝子は新規ニワトリ貧血ウイルスプロモーター の制御下で発現させる。ＨＶＴ ＤＮＡはコスミド４０７−３２．１Ｃ１のＡｓ ｃＩサブクローンである（図２および５参照）。このコスミドは以下の源からの 制限断片を連結することによって（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）構築した。 該ベクターはクレノウＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、ＡｓｃＩリンカーを 挿入したｐＮＥＢ１９３（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ． ）の２０００塩基対ＡａｔＩＩないしＰｖｕＩＩ断片から構築したほぼ２０００ 塩基対ＡｓｃＩ断片である。該ＨＶＴ断片はゲノムＨＶＴ ＤＮＡのほぼ８６０ ０ 塩基対ＡｓｃＩないしＡｓｃＩ断片である。この領域は、ＢａｍＨＩ断片１０お よび２１、断片６のほぼ１１００塩基対および断片７のほぼ１３００塩基対を含 む。ＸｈｏＩ部位（ヌクレオチド＃１３３９〜１３４４：配列番号１２）は、Ｈ ＶＴにおける外来性遺伝子の挿入および発現で使用した。（図３Ｂ参照）。ＨＶ ＴのＸｈｏＩ部位に挿入された外来性ＤＮＡは以下の通りである：断片１はＣＡ Ｖ株ＣＬ−１（ＮＶＳＬ：Ｄ．Ｂ．Ｓｙｎｄｅｒ博士、Ｕｎｉｖ．メリーランド 州：配列番号２３）からの３８６ｂｐ ＥｃｏＲＩないしＢａｍＨＩ断片として ＰＣＲによって合成したＣＡＶプロモーターである。断片２はプラスミドｐＪＦ ７５１（Ｆｅｒｒａｒｉら，１９８５）のほぼ３００１塩基対ＢａｍＨＩないし ＰｖｕＩＩ制限断片である。断片３はＰＲＶ ＢａｍＨＩ制限断片＃７（Ｌｏｍ ｎｉｃｚｉら，１９８４）のほぼ７５４塩基対ＮｄｅＩないしＳａｌＩ制限サブ 断片である。プラスミド８６７−９６．Ｂ９は組換えＨＶＴの構築のための「重 複サブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを生成させるための手法」に従っ て他のサブゲノミッククローンと組み合わせて使用した。 サブゲノミッククローン ８９０−７７．１０。プラスミド８９０−７７．１ ０は、外来性ＤＮＡ配列を発現する組換えＨＶＴを生成させ、マレック病ウイル ス短領域および外来性ＤＮＡ配列を発現するシチメンチョウ長領域のヘルペスウ イルスのキメラを含む組換えキメラウイルスワクチンを生成させる目的で構築し た。Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子はＰＲＶ ｇＸプロモーターの制御下で発現 させる。ニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）融合（Ｆ）遺伝子はＨＣＭＶ前 初期プロモーターの制御下で発現させる。ＨＶＴ ＤＮＡはコスミド４０７−３ ２．１Ｃ１のＡｓｃＩサブクローンである（図２、５参照）。それらの各プロモ ーターの制御下のＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子およびＮＤＶ Ｆ遺伝子は、隣 接ＨＶＴゲノムＤＮＡにおけるＨＶＴ ＵＬ５２、ＵＬ５４およびＵＬ５５遺伝 子と反対方向で転写される。該コスミドは以下の源からの制限断片を連結するこ とによって（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）構築した。該ベクターはクレノウ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、ＡｓｃＩリンカーを挿入したｐＮＥＢ１９ ３（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）の２０００塩基対Ａ ａｔＩＩないしＰｖｕＩＩ断片から構築したほぼ２０００塩基対ＡｓｃＩ断片で あ る。該ＨＶＴ断片はゲノムＨＶＴ ＤＮＡのほぼ８６００塩基対ＡｓｃＩないし ＡｓｃＩ断片である。この領域は、ＢａｍＨＩ断片１０および２１、断片６のほ ぼ１１００塩基対および断片７のほぼ１３００塩基対を含む。ＸｈｏＩ部位（ヌ クレオチド＃１３３９〜１３４４：配列番号１２）は、ＨＶＴにおける外来性遺 伝子の挿入および発現で使用した。（図３Ｂ参照）。ＨＶＴのＸｈｏＩ部位に挿 入された外来性ＤＮＡは以下の通りである：断片１はＰＲＶ ＢａｍＨＩ断片＃ １０（Ｌｏｍｎｉｃｚｉら，１９８４）のほぼ４１３塩基対ＳａｌＩないしＢａ ｍＨＩ制限サブ断片である。断片２は、ｐＪＦ７５１（Ｆｅｒｒａｒｉら）のほ ぼ３００６塩基対ＰｖｕＩＩないしＢａｍＨＩサブ断片である。断片３は、ＰＲ Ｖ ＢａｍＨＩ＃７（Ｂ．Ｌｏｍｎｉｃｚｉら）のほぼ７５４塩基対ＮｄｅＩな いしＳａｌＩサブ断片である。断片４は、ＨＣＭＶゲノムＸｂａＩ Ｅ断片（Ｄ ．Ｒ．Ｔｈｏｍｓｅｎら，１９８１）のほぼ１１９１塩基対ＰｓｔＩないしＡｖ ａＩＩ制限サブ断片である。断片５は、全長ＮＤＶ Ｆ ｃＤＮＡクローン（Ｂ １株；文献：ＷＯ９６／０５２９１）のほぼ１８１２塩基対ＢａｍＨＩないしＰ ｓｔＩ制限断片である、断片６はＨＳＶ−１ ＢａｍＨＩ制限断片Ｑ（ＭｃＧｅ ｏｃｈら，１９８５）のほぼ７８４塩基対ＳｍａＩないしＳｍａＩ制限サブ断片 である。 サブゲノミッククローン９００−８７．Ｈ８。プラスミド９００−８７．Ｈ８ は外来性ＤＮＡを発現する組換えＨＶＴを生成させ、マレック病ウイルス短領域 および外来性ＤＮＡ配列を発現するシチメンチョウ長領域のヘルペスウイルスの キメラを含む組換えキメラウイルスワクチンを生成させる目的で構築した。感染 性ブルザ病ウイルス（ＩＢＤＶ）ＶＰ２遺伝子は、ニワトリ貧血ウイルス（ＣＡ Ｖ）プロモーターの制御下で発現させる。ＣＡＶプロモーターの制御下のＩＢＤ Ｖ ＶＰ２遺伝子は隣接するＨＶＴゲノムＤＮＡにおけるＨＶＴ ＵＬ５２、Ｕ Ｌ５４およびＵＬ５５遺伝子と反対方向で転写される。該ＨＶＴ ＤＮＡはコス ミド４０７−３２．１Ｃ１のＡｓｃＩサブクローンである（図２、５参照）。該 コスミドは以下の源からの制限断片を連結することによって（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ら，１９８９）構築した。該ベクターはクレノウＤＮＡポリメラーゼで平滑末端 とし、ＡｓｃＩリンカーを挿入したｐＮＥＢ１９３（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）の２０００塩基対ＡａｔＩＩないしＰｖｕＩＩ断片 から構築したほぼ２０００塩基対ＡｓｃＩ断片である。該ＨＶＴ断片はゲノムＨ ＶＴ ＤＮＡのほぼ８６００塩基対ＡｓｃＩないしＡｓｃＩ断片である。この領 域は、ＢａｍＨＩ断片１０および２１、断片６のほぼ１１００塩基対および断片 ７のほぼ１３００塩基対を含む。ＸｈｏＩ部位（ヌクレオチド＃１３３９〜１３ ４４：配列番号１２）は、ＨＶＴにおける外来性遺伝子の挿入および発現で使用 した。（図３Ｂ参照）。ＨＶＴのＸｈｏＩ部位に挿入された外来性ＤＮＡは以下 の通りである：断片１はＣＡＶ株ＣＬ−１からの３８６ｂｐ ＥｃｏＲＩないし ＢａｍＨＩ断片（ＮＶＳＬ；配列番号）としてＰＣＲによって合成されたＣＡＶ プロモーターである。ＢａｍＨＩ部位はこの構築においてＥｃｏＲＩ部位に変更 した。断片２はプラスミド７７０−５４．１に由来するＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子 につきコードするほぼ１３５６塩基対ＨｉｎｃＩＩないしＥｃｏＲＩ断片である 。Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ第１鎖／第２鎖ｃＤＮＡ合成を用い、ＩＢＤＶ Ｂ ｕｒｓｖａｃ Ｍ大セグメントＲＮＡをまず重複する断片におけるｃＤＮＡとし てクローン化した。これらのクローンをユニークな制限部位で連結させてプラス ミド２．４０／８４＃３を生成させた。プラスミド７７９−５４．１は、鋳型と してのプラスミド２．４０／８４＃３を用い、２パーツにて、ＰＣＲによって生 成させた。第１半体についてのセンスおよびアンチセンスプライマーは、各々、 ５’−ＧＣＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡＴＡＣＧＡＴＣＧＧＴＣＴＧＡＣＣＣＣ ＧＧ−３’および５’−ＴＴＧＴＧＴＧＣＡＣＣＧＣＧＧＡＧＴＡＣＣＣＣ−３ ’であった。第２半体についてのセンスおよびアンチセンスプライマーは、各々 、５’−ＴＣＧＣＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＣＡＧＧＴＧＣＣＣＣ−３’および５’ −ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＣＣＡＡＴＴＴＧＧＧＡＴＧＴＴＧＴＡＡＧＧＣＣＧＡ− ３’であった。２つの半体はユニークなＳａｌＩ部位で連結した。断片３は、Ｉ ＬＴＶのＵＳＤＡ攻撃株からの１４４ｂｐ ＳａｌＩ断片としてＰＣＲによって 合成したＩＬＴＶ ＰＫポリアデニル化シグナルである。ＰＣＲで使用したセン スおよびアンチセンスプライマーは、各々、５’−ＧＧＴＧＣＣＡＣＧＧＴＣＧ ＡＣＧＡＧＴＧＡＡＧＧＴＴＡＡＴ−３’（配列番号）および５’−ＡＧＡＣＣ ＧＡＧＣＡＧＡＧＴＣＧＡＣＧＣＧＣＧＡＡＡＧ−３’（配列番号）であっ た。 サブゲノミッククローン９２８−４７．１。コスミド９２８−４７．１は外来 性ＤＮＡを発現する組換えＨＶＴを生成させ、マレック病ウイルス短領域および 外来性ＤＮＡ配列を発現するシチメンチョウ長領域のヘルペスウイルスのモメラ を含む組換えキメラウイルスワクチンを生成させる目的で構築した。該ベクター はｐＷＥ１５のほぼ８０００塩基対ＮｏｔＩ断片である。ウイルスＤＮＡ挿入物 は、２つのセグメントよりなる。断片１は、組換えキメラウイルスＨＶＴ−１４ ５からのＨＶＴ長反復領域およびＭＤＶ短領域の間の連結領域を含有するほぼ８ ．６ｋｂ ＡｓｃＩないしＳｃａＩ断片である。断片２は、７３９．２７．１６ に由来する２８．８ｋｂのＳｃａＩないしＮｏｔＩ断片であり、そのクローンか らのＭＤＶ短領域の残りを含有する。 サブゲノミッククローン９２８−５８．Ｊ２。プラスミド９２８−５８．Ｊ２ は外来性ＤＮＡを発現する組換えＨＶＴを生成させ、マレック病ウイルス短領域 および外来性ＤＮＡ配列を発現するシチメンチョウ長領域のヘルペスウイルスの キメラを含む組換えキメラウイルスワクチンを生成させる目的で構築した。Ｅ． ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）糖タンパク 質Ｉ（ｇＩ）プロモーターの制御下で発現させる。ＩＬＴＶ ｇＩプロモーター の制御下のＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は、隣接するＨＶＴゲノムＤＮＡにお けるＨＶＴ ＵＬ５２、ＵＬ５４およびＵＬ５５遺伝子とは反対方向に転写され る。ＨＶＴ ＤＮＡはコスミド４０７−３２．１Ｃ１のＡｓｃＩサブクローンで ある（図２、５参照）。該コスミドは、以下の源からの制限断片を連結すること によって（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）構築した。該ベクターはクレノウＤ ＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、ＡｓｃＩリンカーを挿入したｐＮＥＢ１９３ （Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）の２０００塩基対Ａａ ｔＩＩないしＰｖｕＩＩ断片から構築したほぼ２０００塩基対ＡｓｃＩ断片であ る。該ＨＶＴ断片はゲノムＨＶＴ ＤＮＡのほぼ８６００塩基対ＡｓｃＩないし ＡｓｃＩ断片である。この領域は、ＢａｍＨＩ断片１０および２１、断片６のほ ぼ１１００塩基対および断片７のほぼ１３００塩基対を含む。ＸｈｏＩ部位（ヌ クレオチド＃１３３９〜１３４４：配列番号１２）は、ＨＶＴにおける外来性遺 伝子 の挿入および発現で使用した。（図３Ｂ参照）。ＨＶＴのＸｈｏＩ部位に挿入さ れた外来性ＤＮＡは以下の通りである：断片１はＩＬＴＶのＵＳＤＡ攻撃株から の２７９ｂｐ ＰｍｅＩないしＢａｍＨＩ断片としてＰＣＲによって合成された ＩＬＴＶ ｇＩプロモーターである。ＰＣＲで使用したセンスおよびアンチセン スプライマーは、各々、５’−ＣＡＧＴＴＴＡＡＡＣＴＣＧＧＡＴＴＣＴＧＡＣ ＴＡＴＴＡＣ−３’（配列番号）および５’−ＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧＣＴＴＴＴ ＣＧＡＡＣＧＴＣＣ−３’（配列番号）であった。（図８参照）。断片２は、ｐ ＪＦ７５１（Ｆｅｒｒａｒｉら）のほぼ３００６塩基対ＰｖｕＩＩないしＢａｍ ＨＩサブ断片である。断片３は、ＩＬＴＶのＵＳＤＡ攻撃株からの１４４ｂｐ ＳａｌＩ断片としてＰＣＲによって合成したＩＬＴＶ ＰＫポリアデニル化シグ ナルである。ＰＣＲで使用したセンスおよびアンチセンスプライマーは、各々、 ５’−ＧＧＴＧＣＣＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＡＧＴＧＡＡＧＧＴＴＡＡＴ−３’( 配列番号)および５’−ＡＧＡＣＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＣＧＡＣＧＣＧＣＧＡＡ ＡＧ−３’（配列番号ＸＸ）であった。 サブゲノミッククローン９２８−５８．Ｋ７。プラスミド９２８−５８．Ｋ７ は外来性ＤＮＡを発現する組換えＨＶＴを生成させ、マレック病ウイルス短領域 および外来性ＤＮＡ配列を発現するシチメンチョウ長領域のヘルペスウイルスの キメラを含む組換えキメラウイルスワクチンを生成させる目的で構築した。Ｅ． ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は感染性喉頭気管炎ウイルス(ＩＬＴＶ)糖タンパク質 Ｄ（ｇＤ）プロモーターの制御下で発現させる。ＩＬＴＶ ｇＤプロモーターの 制御下のＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は、隣接するＨＶＴゲノムＤＮＡにおけ るＨＶＴ ＵＬ５２、ＵＬ５４およびＵＬ５５遺伝子とは反対方向に転写される 。ＨＶＴ ＤＮＡはコスミド４０７−３２．１Ｃ１のＡｓｃＩサブクローンであ る（図２、５参照）。該コスミドは、以下の源からの制限断片を連結することに よって（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）構築した。該ベクターはクレノウＤＮ Ａポリメラーゼで平滑末端とし、ＡｓｃＩリンカーを挿入したｐＮＥＢ１９３（ Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）の２０００塩基対Ａａｔ ＩＩないしＰｖｕＩＩ断片から構築したほぼ２０００塩基対ＡｓｃＩ断片である 。該ＨＶＴ断片はゲノムＨＶＴ ＤＮＡのほぼ８６００塩基対ＡｓｃＩないしＡ ｓ ｃＩ断片である。この領域は、ＢａｍＨＩ断片１０および２１、断片６のほぼ１ １００塩基対および断片７のほぼ１３００塩基対を含む。ＸｈｏＩ部位（ヌクレ オチド＃１３３９〜１３４４：配列番号１２）は、ＨＶＴにおける外来性遺伝子 の挿入および発現で使用した。（図３Ｂ参照）。ＨＶＴのＸｈｏＩ部位に挿入さ れた外来性ＤＮＡは以下の通りである：断片１はＩＬＴＶのＵＳＤＡ攻撃株から の５３０ｂｐ ＰｍｅＩないしＢａｍＨＩ断片としてＰＣＲによって合成された ＩＬＴＶ ｇＤプロモーターである。逆転写およびＰＣＲで使用したセンスおよ びアンチセンスプライマーは、各々、５’−ＧＧＴＴＴＡＡＡＣＡＧＣＴＧＴＡ ＣＴＡＣＡＧＡＧＴＡＡＣ−３’（配列番号）および５’−ＣＧＧＡＴＣＣＡＴ ＡＧＣＧＴＴＧＣＧＴＡＣＡＡＡＧ−３’（配列番号）であった。（図７参照） 。断片２は、ｐＪＦ７５１（Ｆｅｒｒａｒｉら）のほぼ３００６塩基対ＰｖｕＩ ＩないしＢａｍＨＩサブ断片である。断片３は、ＩＬＴＶのＵＳＤＡ攻撃株から の１４４ｂｐ ＳａｌＩ断片としてＰＣＲによって合成したＩＬＴＶ ＰＫポリ アデニル化シグナルである。ＰＣＲで使用したセンスおよびアンチセンスプライ マーは、各々、５’−ＧＧＴＧＣＣＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＡＧＴＧＡＡＡＧＧＴ ＴＡＡＴ−３’（配列番号）および５’−ＡＧＡＣＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＣＧＡ ＣＧＣＧＣＧＡＡＡＧ−３’（配列番号）であった。 サブゲノミッククローン９４９−０１．１２。プラスミド９４９−０１．Ｉ２ は外来性ＤＮＡを発現する組換えＨＶＴを生成させ、マレック病ウイルス短領域 および外来性ＤＮＡ配列を発現するシチメンチョウ長領域のヘルペスウイルスの キメラを含む組換えキメラウイルスワクチンを生成させる目的で構築した。感染 性ブルザ病ウイルス(ＩＢＤＶ)ＶＰ２遺伝子は感染性喉頭気管炎ウイルス(ＩＬ ＴＶ)糖タンパク質Ｉ(ｇＩ)プロモーターの制御下で発現させる。ＩＬＴＶ ｇ Ｉプロモーターの制御下のＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子は、隣接するＨＶＴゲノムＤ ＮＡにおけるＨＶＴ ＵＬ５２、ＵＬ５４およびＵＬ５５遺伝子とは反対方向に 転写される。ＨＶＴ ＤＮＡはコスミド４０７−３２．１Ｃ１のＡｓｃＩサブク ローンである（図２、５参照）。該コスミドは、以下の源からの制限断片を連結 することによって（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）構築した。該ベクターはク レノウＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、ＡｓｃＩリンカーを挿入したｐＮＥ Ｂ１９３（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）の２０００塩 基対ＡａｔＩＩないしＰｖｕＩＩ断片から構築したほぼ２０００塩基対ＡｓｃＩ 断片である。該ＨＶＴ断片はゲノムＨＶＴ ＤＮＡのほぼ８６００塩基対Ａｓｃ ＩないしＡｓｃＩ断片である。この領域は、ＢａｍＨＩ断片１０および２１、断 片６のほぼ１１００塩基対および断片７のほぼ１３００塩基対を含む。ＸｈｏＩ 部位（ヌクレオチド＃１３３９〜１３４４：配列番号１２）は、ＨＶＴにおける 外来性遺伝子の挿入および発現で使用した。（図３Ｂ参照）。ＨＶＴのＸｈｏＩ 部位に挿入された外来性ＤＮＡは以下の通りである：断片１はＩＬＴＶのＵＳＤ Ａ攻撃株からの２７９ｂｐ ＰｍｅＩないしＢａｍＨＩ断片としてＰＣＲによっ て合成されたＩＬＴＶ ｇＩプロモーターである。ＰＣＲで使用したセンスおよ びアンチセンスプライマーは、各々、５’−ＣＡＧＴＴＴＡＡＡＣＴＣＧＧＡＴ ＴＣＴＧＡＣＴＡＴＴＡＣ−３’（配列番号）および５’−ＣＧＧＡＴＣＣＡＴ ＧＣＴＴＴＴＣＧＡＡＣＧＴＣＣ−３’（配列番号）であった。（図８参照）。 断片２は、プラスミド７７９−５４．１に由来するＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子につ きコードするほぼ１３５６塩基対ＨｉｎｃＩＩないしＥｃｏＲＩ断片である。Ｏ ｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ第１鎖／第２鎖ｃＤＮＡ合成を用い、ＩＢＤＶブルザＭ 大セグメントＲＮＡをまず２つの重複断片にてｃＤＮＡとしてクローン化した。 これらのクローンをユニークな制限部位において連結してプラスミド２．４０／ ８４＃３を生成させた。第１半体についてのセンスおよびアンチセンスプライマ ーは、各々、５’−ＧＣＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡＴＡＣＧＡＴＣＧＧＴＣＴ ＧＡＣＣＣＣＧＧ−３’および５’−ＴＴＧＴＧＴＧＣＡＣＣＧＣＧＧＡＧＴＡ ＣＣＣＣ−３’であった。第２半体についてのセンスおよびアンチセンスプライ マーは、各々、５’−ＴＣＧＣＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＣＡＧＧＴＧＣＣＣＣ−３ ’および５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＣＣＡＡＴＴＴＧＧＡＴＧＴＴＧＴＡＡＧＧ ＣＣＧＡ−３’であった。２つの半体をユニークなＳａｌＩ部位にて連結した。 断片３はＩＬＴＶのＵＳＤＡ攻撃株からの１４４ｂｐ ＳａｌＩ断片としてＰＣ Ｒによって合成したＩＬＴＶ ＰＫポリアデニル化シグナルである。ＰＣＲで使 用したセンスおよびアンチセンスプライマーは、各々、５’−ＧＧＴＧＣＣＡＣ ＧＧＴＣＧＡＣＧＡＧＴＧＡＡＧＧＴＴＡＡＴ−３’（配列番号）および５’− ＡＧＡＣＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＣＧＡＣＧＣＧＣＧＡＡＡＧ−３’（配列番号） であった。 サブゲノミッククローン９４９−１９．２。プラスミド９４９−１９．２は、 外来性ＤＮＡ配列を発現する組換えＨＶＴを生成させ、マレック病ウイルス短領 域および外来性ＤＮＡ配列を発現するシチメンチョウ長領域のヘルペスウイルス のキメラを含む組換えキメラウイルスワクチンを生成させる目的で構築した。感 染性ブルザ病ウイルス(ＩＢＤＶ)ＶＰ２遺伝子は感染性喉頭気管炎ウイルス(Ｉ ＬＴＶ)糖タンパク質Ｉ(ｇＩ)プロモーターの制御下で発現させる。ＩＬＴＶ ｇＩプロモーターの制御下にあるＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子は、隣接ＨＶＴゲノム ＤＮＡにおけるＨＶＴ ＵＬ５２、ＵＬ５４およびＵＬ５５遺伝子と反対方向で 転写される。該ＨＶＴ ＤＮＡは、コスミド４０７−３２．１Ｃ１のサブクロー ンであるコスミド７２０−５１．３に由来する。（図２、５参照）。該ＨＶＴ断 片はゲノムＨＶＴ ＤＮＡのほぼ３４，７００塩基対断片である。この領域は、 ＢａｍＨＩ断片１１、７、８、２１、６、１８、および断片１３のほぼ１２５０ 塩基対および断片１のほぼ２６００塩基対を含む。ＸｈｏＩ部位（ヌクレオチド ＃１３３９〜１３４４：配列番号１２）は、ＨＶＴにおける外来性遺伝子の挿入 および発現で使用した。（図３Ｂ参照）。該コスミドは以下の源からの制限断片 (Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９)を連結することによって構築した。該ベクター はｐＷＥ１５のほぼ８０００塩基対ＮｏｔＩ部位である。ＨＶＴのＸｈｏＩ部位 に挿入された外来性ＤＮＡは以下の通りである：断片１はＩＬＴＶのＵＳＤＡ攻 撃株からの２７９ｂｐ ＰｍｅＩないしＢａｍＨＩ断片としてＰＣＲによって合 成されたＩＬＴＶ ｇＩプロモーターである。ＰＣＲで使用されるセンスおよび アンチセンスプライマーは、各々、５’−ＣＡＧＴＴＴＡＡＡＣＴＣＧＧＡＴＴ ＣＴＧＡＣＴＡＴＴＡＣ−３’（配列番号）および５’−ＣＧＧＡＴＣＣＡＴＧ ＣＴＴＴＴＣＧＡＡＣＧＴＣＣ−３（配列番号）であった。（図８参照）。次い で、ＢａｍＨＩ部位をリンカーを用いてＥｃｏＲＶ部位に変更させた。断片２は プラスミド７７９−５４．１に由来するＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子につきコードす るほぼ１３５６塩基対ＨｉｎｃＩＩないしＥｃｏＲＩ断片である。Ｏｋａｙａｍ ａ−Ｂｅｒｇ第１鎖／第２鎖ｃＤＮＡ合成を用い、ＩＢＤＶ Ｂｕｒｓｖａｃ Ｍ大セグメントＲＮＡをまず重複する断片におけるｃＤＮＡとしてクローン化し た。これらのクローンをユニークな制限部位で連結させてプラスミド２．４０／ ８４＃３を生成させた。プラスミド７７９−５４．１は、鋳型としてのプラスミ ド２．４０／８４＃３を用い、２パーツにて、ＰＣＲによって生成させた。第１ 半体についてのセンスおよびアンチセンスプライマーは、各々、５’−ＧＣＣＧ ＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡＴＡＣＧＡＴＣＧＧＴＣＴＧＡＣＣＣＣＧＧ−３’およ び５’−ＴＴＧＴＧＴＧＣＡＣＣＧＣＧＧＡＧＴＡＣＣＣＣ−３’であった。第 ２半体についてのセンスおよびアンチセンスプライマーは、各々、５’−ＴＣＧ ＣＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＣＡＧＧＴＧＣＣＣＣ−３’および５’−ＣＧＧＡＡＴ ＴＣＴＣＣＡＡＴＴＴＧＧＧＡＴＧＴＴＧＴＡＡＧＧＣＣＧＡ−３’であった。 ２つの半体はユニークなＳａｌＩ部位で連結した。断片３は、ＩＬＴＶのＵＳＤ Ａ攻撃株からの１４４ｂｐ ＳａｌＩ断片としてＰＣＲによって合成したＩＬＴ Ｖ ＰＫポリアデニル化シグナルである。ＰＣＲで使用したセンスおよびアンチ センスプライマーは、各々、５’−ＧＧＴＧＣＣＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＡＧＴＧ ＡＡＧＧＴＴＡＡＴ−３’（配列番号）および５’−ＡＧＡＣＣＧＡＧＣＡＧＡ ＧＴＣＧＡＣＧＣＧＣＧＡＡＡＧ−３’（配列番号）であった。 サブゲノミッククローン９４９−２４．Ｄ１。プラスミド９４９−２４．Ｄ１ は、外来性ＤＮＡ配列を発現する組換えＨＶＴを生成させ、マレック病ウイルス 短領域および外来性ＤＮＡ配列を発現するシチメンチョウ長領域のヘルペスフイ ルスのキメラを含む組換えキメラウイルスワクチンを生成させる目的で構築した 。感染性ブルザ病ウイルス（ＩＢＤＶ）ＶＰ２遺伝子は感染性喉頭気管炎ウイル ス（ＩＬＴＶ）糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）プロモーターの制御下で発現させる。Ｉ ＬＴＶ ｇＤプロモーターの制御下にあるＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子は、隣接ＨＶ ＴゲノムＤＮＡにおけるＨＶＴ ＵＬ５２、ＵＬ５４およびＵＬ５５遺伝子と反 対方向で転写される。該ＨＶＴ ＤＮＡは、コスミド４０７−３２．１Ｃ１のサ ブクローンであるコスミド７２０−５１．３に由来する。（図２、５参照）。該 ＨＶＴ断片はゲノムＨＶＴ ＤＮＡのほぼ３４，７００塩基対断片である。この 領域は、ＢａｍＨＩ断片１１、７、８、２１、６、１８、および断片１３のほぼ １２５０塩基対および断片１のほぼ２６００塩基対を含む。ＸｈｏＩ部位（ヌ クレオチド＃１３３９〜１３４４：配列番号１２）は、ＨＶＴにおける外来性遺 伝子の挿入および発現で使用した。（図３Ｂ参照）。該コスミドは以下の源から の制限断片（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）を連結することによって構築した 。該ベクターはｐＷＥ１５のほぼ８０００塩基対ＮｏｔＩ部位である。ＨＶＴの ＸｈｏＩ部位に挿入された外来性ＤＮＡは以下の通りである：断片１はＩＬＴＶ のＵＳＤＡ攻撃株からの５３０ｂｐ ＰｍｅＩないしＢａｍＨＩ断片としてＰＣ Ｒによって合成されたＩＬＴＶ ｇＤプロモーターである。逆転写およびＰＣＲ で使用されるセンスおよびアンチセンスプライマーは、各々、５’−ＧＧＴＴＴ ＡＡＡＣＡＧＣＴＧＴＡＣＴＡＣＡＧＡＧＴＡＡＣ−３’（配列番号）および５ ’−ＣＧＧＡＴＣＣＡＴＡＧＣＧＴＴＧＣＧＴＡＣＡＡＡＧ−３’（配列番号） であった。（図７参照）。断片２はプラスミド７７９−５４．１に由来するＩＢ ＤＶ ＶＰ２遺伝子につきコードするほぼ１３５６塩基対ＨｉｎｃＩＩないしＥ ｃｏＲＩ断片である。Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ第１鎖／第２鎖ｃＤＮＡ合成を 用い、ＩＢＤＶ Ｂｕｒｓｖａｃ Ｍ大セグメントＲＮＡをまず２つの重複する 断片におけるｃＤＮＡとしてクローン化した。これらのクローンをユニークな制 限部位で連結させてプラスミド２．４０／８４＃３を生成させた。プラスミド７ ７９−５４．１は、鋳型としてのプラスミド２．４０／８４＃３を用い、２パー ツにて、ＰＣＲによって生成させた。第１半体についてのセンスおよびアンチセ ンスプライマーは、各々、５’−ＧＣＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡＴＡＣＧＡＴ ＣＧＧＴＣＴＧＡＣＣＣＣＧＧ−３’および５’−ＴＴＧＴＧＴＧＣＡＣＣＧＣ ＧＧＡＧＴＡＣＣＣＣ−３’であった。第２半体についてのセンスおよびアンチ センスプライマーは、各々、５’−ＴＣＧＣＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＣＡＧＧＴＧ ＣＣＣＣ−３’および５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＣＣＡＡＴＴＴＧＧＧＡＴＧＴ ＴＧＴＡＡＧＧＣＣＧＡ−３’であった。２つの半体はユニークなＳａｌＩ部位 で連結した。断片３は、ＩＬＴＶのＵＳＤＡ攻撃株からの１４４ｂｐ ＳａｌＩ 断片としてＰＣＲによって合成したＩＬＴＶ ＰＫポリアデニル化シグナルであ る。ＰＣＲで使用したセンスおよびアンチセンスプライマーは、各々、５’−Ｇ ＧＴＧＣＣＡＣＧＧＴＣＧＡＣＧＡＧＴＧＡＡＧＧＴＴＡＡＴ−３’（配列番号 ）および５’−ＡＧＡＣＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＣＧＡＣＧＣＧＣＧＡＡＡＧ −３’（配列番号）であった。 サブゲノミッククローン９４９−２４．Ｉ２。プラスミド９４９−２４．Ｉ２ は、外来性ＤＮＡ配列を発現する組換えＨＶＴを生成させ、マレック病ウイルス 短領域および外来性ＤＮＡ配列を発現するシチメンチョウ長領域のヘルペスウイ ルスのキメラを含む組換えキメラウイルスワクチンを生成させる目的で構築した 。感染性ブルザ病ウイルス（ＩＢＤＶ）ＶＰ２遺伝子は感染性喉頭気管炎ウイル ス（ＩＬＴＶ）糖タンパク質Ｉ（ｇＩ）プロモーターの制御下で発現させる。Ｉ ＬＴＶ ｇＩプロモーターの制御下にあるＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子は、隣接ＨＶ ＴゲノムＤＮＡにおけるＨＶＴ ＵＬ５２、ＵＬ５４およびＵＬ５５遺伝子と反 対方向で転写される。該ＨＶＴ ＤＮＡは、コスミド４０７−３２．１Ｃ１のサ ブクローンであるコスミド７２０−５１．３に由来する。（図２、５参照）。該 ＨＶＴ断片はゲノムＨＶＴ ＤＮＡのほぼ３４，７００塩基対断片である。この 領域は、ＢａｍＨＩ断片１１、７、８、２１、６、１８、および断片１３のほぼ １２５０塩基対および断片１のほぼ２６００塩基対を含む。ＸｈｏＩ部位（ヌク レオチド＃１３３９〜１３４４：配列番号１２）は、ＨＶＴにおける外来性遺伝 子の挿入および発現で使用した。（図３Ｂ参照）。該コスミドは以下の源からの 制限断片（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）を連結することによって構築した。 該ベクターはｐＷＥ１５のほぼ８０００塩基対ＮｏｔＩ断片である。ＨＶＴのＸ ｈｏＩ部位に挿入された外来性ＤＮＡは以下の通りである：断片１はＩＬＴＶの ＵＳＤＡ攻撃株からの２７９ｂｐ ＰｍｅＩないしＢａｍＨＩ断片としてＰＣＲ によって合成されたＩＬＴＶ ｇＩプロモーターである。ＰＣＲで使用されるセ ンスおよびアンチセンスプライマーは、各々、５’−ＣＡＧＴＴＴＡＡＡＣＴＣ ＧＧＡＴＴＣＴＧＡＣＴＡＴＴＡＣ−３’（配列番号）および５’−ＣＧＧＡＴ ＣＣＡＴＧＣＴＴＴＴＣＧＡＡＣＧＴＣＣ−３’（配列番号）であった。（図８ 参照）。断片２はプラスミド７７９−５４．１に由来するＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝 子につきコードするほぼ１３５６塩基対ＨｉｎｃＩＩないしＥｃｏＲＩ断片であ る。Ｏｋａｙａｍａ−Ｂｅｒｇ第１鎖／第２鎖ｃＤＮＡ合成を用い、ＩＢＤＶ Ｂｕｒｓｖａｃ Ｍ大セグメントＲＮＡをまず２つの重複する断片におけるｃＤ ＮＡとしてクローン化した。これらのクローンをユニークな制限部位で連結させ てプラスミド２．４０／８４＃３を生成させた。プラスミド７７９−５４．１は 、鋳型としてのプラスミド２．４０／８４＃３を用い、２パーツにて、ＰＣＲに よって生成させた。第１半体についてのセンスおよびアンチセンスプライマーは 、各々、５’−ＧＣＣＧＧＣＧＧＣＣＧＣＧＧＡＴＡＣＧＡＴＣＧＧＴＣＴＧＡ ＣＣＣＣＧＧ〜３’およひ５’−ＴＴＧＴＧＴＧＣＡＣＣＧＣＧＧＡＧＴＡＣＣ ＣＣ−３’であった。第２半体についてのセンスおよびアンチセンスプライマー は、各々、５’−ＴＣＧＣＧＡＡＴＣＴＡＴＴＣＣＡＧＧＴＧＣＣＣＣ−３’お よび５’−ＣＧＧＡＡＴＴＣＴＣＣＡＡＴＴＴＧＧＧＡＴＧＴＴＧＴＡＡＧＧＣ ＣＧＡ−３’であった。２つの半体はユニークなＳａｌＩ部位で連結した。断片 ３は、ＩＬＴＶのＵＳＤＡ攻撃株からの１４４ｂｐ ＳａｌＩ断片としてＰＣＲ によって合成したＩＬＴＶ ＰＫポリアデニル化シグナルである。ＰＣＲで使用 したセンスおよびアンチセンスプライマーは、各々、５’−ＧＧＴＧＣＣＡＣＧ ＧＴＣＧＡＣＧＡＧＴＧＡＡＧＧＴＴＡＡＴ−３’（配列番号）および５’−Ａ ＧＡＣＣＧＡＧＣＡＧＡＧＴＣＧＡＣＧＣＧＣＧＡＡＡＧ−３’（配列番号）で あった。 相同性ベクター８８１−２３．＃２８：プラスミド８８１−２３．＃２８は、 外来性ＤＮＡ配列を発現する組換えキメラＨＶＴ／ＭＤＶワクチンを生成させる 目的で構築した。Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子はＨＳＶ−１ ＴＫプロモータ ーの制御下で発現させる。ニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）ヘマトグルチ ニン（ＨＮ）遺伝子はＰＲＶ ｇＸプロモーターの制御下にあり、ニューキャッ スル病ウイルス（ＮＤＶ）融合（Ｆ）遺伝子はＨＣＭＶ前初期プロモーターの制 御下にある。該ＨＶＴ ＤＮＡはコスミド４０７−３２．１Ｃ１のＡｃＩサブク ローンである。（図２および５参照）。該コスミドは以下の源からの制限断片を 連結することによって（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）構築した。該ベクター はクレノウＤＮＡポリメラーゼで平滑末端とし、ＡｓｃＩリンカーを挿入したｐ ＮＥＢ１９３（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）の２００ ０塩基対ＡａｔＩＩないしＰｖｕＩＩ断片から構築したほぼ２０００塩基対Ａｓ ｃＩ断片である。該ＨＶＴ断片はゲノムＨＶＴ ＤＮＡのほぼ８６００塩基対Ａ ｓｃＩないしＡｓｃＩ断片である。この領域は、ＢａｍＨＩ断片１０および２１ 、 断片６のほぼ１１００塩基対および断片７のほぼ１３００塩基対を含む。Ｘｈｏ Ｉ部位（ヌクレオチド＃１３３９〜１３４４：配列番号１２）は、ＨＶＴにおけ る外来性遺伝子の挿入および発現で使用した。（図３Ｂ参照）。ＨＶＴゲノムＤ ＮＡのＸｈｏＩ部位に挿入された外来性ＤＮＡは以下の通りである：断片１はＨ ＳＶ−１ ＢａｍＨＩ制限断片Ｎのほぼ２６６塩基対ＲｓａＩないしＨａｅＩＩ Ｉ制限サブ−断片である。断片２はプラスミドｐＪＦ７５１（Ｆｅｒｒａｒｉら ，１９８５）のほぼ３３３０塩基対ＢａｍＨＩないしＢａｌＩ制限断片である。 断片３はＰＲＶ ＢａｍＨＩ制限断片１０（Ｌｏｍｎｉｃｚｉら，１９８４）の ほぼ４１３塩基対ＳａｌＩないしＢａｍＨＩ制限サブ断片である。断片４は、全 長ＮＤＶ ＨＮｃＤＮＡクローン（Ｂ１株）のほぼ１８１１塩基対ＡｖａＩＩな いしＮａｅＩ制限断片である。断片５は、ＰＲＶ ＢａｍＨＩ制限断片＃７（Ｌ ｏｍｎｉｃｚｉ，１９８４）のほぼ７５４塩基対ＮｄｅＩないしＳａｌＩ制限サ ブ断片である。断片６はＨＣＭＶゲノムＸｂａＩ Ｅ断片（Ｄ．Ｒ．Ｔｈｏｍｓ ｅｎら，１９８１）のほぼ１１９１塩基対ＰｓｔＩないしＡｖａＩＩ制限サブ断 片である。断片７は全長ＮＤＶ Ｆ ｃＤＮＡクローン（Ｂ１株）のほぼ１８１ ２塩基対ＢａｍＨＩないしＰｓｔＩ制限断片である。断片８はＨＳＶ−１ Ｂａ ｍＨＩ制限断片Ｑ（ＭｃＧｅｏｃｈら，１９８５）のほぼ７８４塩基対ＳｍａＩ ないしＳｍａＩ制限サブ−断片である。プラスミド８８１０２３．＃２８は組換 えキメラＨＶＴ／ＭＤＶワクチンの構築のためのＤＮＡ ＴＲＡＮＳＦＥＣＴＩ ＯＮ ＦＯＲ ＧＥＮＥＲＡＴＩＮＧ ＲＥＣＯＭＢＩＮＡＮＴ ＶＩＲＵＳ（ 組換えウイルスを生成させるためのＤＮＡトランスフェクション）に従ってＳ− ＨＶＹ−１４５と組み合わせて使用した。 相同性ベクター８８３−１０．Ａ１：相同性ベクター８８３−１０．Ａ１は、 新規ニワトリ貧血ウイルスプロモーターの制御下にあるｌａｃＺマーカー遺伝子 をユニークなＮｏｔＩ部位における鶏痘ウイルス（ＥＰＶ）に挿入する目的で構 築した。２．８ＫＢ ＦＰＶゲノムＥｃｏＲＩ断片は外来性ＤＮＡのＦＰＶへの 挿入のために使用した。ＮｏｔＩ／ＳｆｉＩリンカーはＦＰＶ断片中のユニーク なＳｎａＢＩ部位に挿入した。該カセットは、示された合成ＤＮＡ配列を持つ以 下の源からの制限断片を連結することによって（Ｍａｎｉａｔｉｓら，１９８２ およびＳａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）を利用した構築した。ＦＰＶのＮｏｔＩ 部位に挿入された外来性ＤＮＡは以下の通りである：断片１はＣＡＶ株ＣＬ−１ （ＮＶＳＬ；Ｄ．Ｂ．Ｓｎｙｄｅｒら，Ｕｎｉｖ．メリーランド州：配列番号２ ３）からの３８６ｂｐ ＥｃｏＲＩないしＢａｍＨＩ断片としてＰＣＲによって 合成されたＣＡＶプロモーターである。断片２はプラスミドｐＪＦ７５１（Ｆｅ ｒｒａｒｉら，１９８５）のほぼ３００１塩基対ＢａｍＨＩないしＰｖｕＩＩ制 限断片である。断片３はＰＲＶ ＢａｍＨＩ制限断片＃７（Ｌｏｍｎｉｃｚｉら ，１９８４）のほぼ７５４塩基対ＮｄｅＩないしＳａｌＩ制限サブ−断片である 。組換え鶏痘ウイルスは「組換えＦＰＶを生成させるための相同組換え手法」の 手法によって生成させた。 一過性トランスフェクションアッセイ：６ｃｍディッシュ中の８０〜９０％コ ンフルエンスのニワトリ胚繊維芽細胞またはＱＴ−３５細胞は増殖培地を除去さ れ、５ｍｌの維持培地を添加する。１０〜２０μのプラスミドＤＮＡを水中に希 釈し、ＣａＣｌ₂を０．２５Ｍの濃度および６００μｌの体積まで添加する。こ れに、６００μｌの２×ＨＥＰＥＳ緩衝液(０.２８Ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ Ｈ ＥＰＥＳ（Ｎ−２−ヒドロキシエチルピペラジン−Ｎ’−エタンスルホン酸）、 １．５ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄、ｐＨ７．０５）を添加して、室温で１分間インキュ ベートし、次いで、この溶液を２つの６００μｌアルコットに分割し、２つの６ ｃｍディッシュ上に滴下する。３時間後、該溶液を除去し、ＰＢＳ中の１０％グ リセロール溶液を添加し、細胞上で１時間放置する。これを除去し、細胞をＰＢ Ｓで１回洗浄し、５ｍｌの維持培地を補充する。２４〜４８時間後、細胞を収穫 し、Ｓｏｒｖａｌｌ ＲＴ７中２．８Ｋでペレット化し、５００μｌ ＰＢＳに 再懸濁する。試料を３サイクルの凍結および解凍に付し、細胞夾雑物をミクロ遠 心管中で回転させる。１１μｌの各上清よりなる二連の試料を、１００μｌのＯ ＮＰＧアッセイ溶液（０．８ｍｇ／ｍｌオルト−ニトロ−フェニル−ガラクトシ ド、６０ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄、４０ｍＭ Ｎａ₂Ｈ₂ＰＯ₄、１０ｍＭ ＫＣｌ、 １ｍＭ ＭｇＳＯ₄、５０ｍＭ β−メルカプトエタノール、ｐＨ７．５）を用 いてマイクロタイタープレート中でテストし、３７℃でインキュベートし、４１ ５ｎｍにおける読みを、各１５分毎に、ＢｉｏＲａｄモデル４５０マイクロプレ ートリーダーで取る。 プラスミド３８８−６５．２。プラスミド３８８−６５．２は外来性ＤＮＡ配 列を発現させるためのＨＣＭＶ前初期（ＩＥ）プロモーターを生成させる目的で 構築した。Ｅ．ｃｏｌｉβ−ガラクトシダーゼ遺伝子はＨＣＭＶ ＩＥプロモー ターの制御下で発現させる。該プラスミドは、以下の源からの制限断片（Ｓａｍ ｂｒｏｏｋら，１９８９）を連結することによって構築した。該ベクターはｐＮ ＥＢ１９３（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）のほぼ２０ ００塩基対ＡａｔＩＩないしＰｖｕＩＩ断片である。断片１はＨＣＭＶ Ｔｏｗ ｎｅ株のＸｂａＩ Ｅ断片のほぼ１１４９塩基対ＰｓｔＩないしＡｖａＩＩサブ 断片である。断片２は、プラスミドｐＪＦ７５１（Ｆｅｒｒａｒｉら，１９８５ ）のほぼ３００１塩基対ＢａｍＨＩないしＰｖｕＩＩ制限断片である。断片３は 、ＰＲＶ ＢａｍＨＩ制限断片＃７（Ｌｏｍｎｉｃｚｉら，１９８４）のぼ７５ ４塩基対ＮｄｅＩないしＳａｌＩ制限サブ断片である。プラスミド３８８−６５ ．２は「一過性トランスフェクションアッセイ」に従って使用して、ＣＡＶプロ モーターの強度を測定する。 プラスミド８５０−２５．１８。プラスミド８５０−２５．１８は外来性ＤＮ Ａ配列を発現させるための新規ＣＡＶプロモーターを生成させる目的で構築した 。Ｅ．ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ遺伝子は修飾されたニワトリ貧血ウイル スプロモーターの制御下で発現させる。該プラスミドは、以下の源からの制限断 片（Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）を連結することによって構築した。該ベク ターはｐＮＥＢ１９３（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．） のほぼ２０００塩基対ＡａｔＩＩないしＰｖｕＩＩ断片である。断片１は、ＰＣ Ｒプライマー５’−ＡＴＣＧＡＡＴＴＣＣＧＡＧＴＧＧＴＴＡＣＴＡＴＴＣＣ− ３’（配列番号：２４）および５’−ＣＧＴＧＧＡＴＣＣＡＴＣＴＴＡＣＡＧＴ ＣＴＴＡＴＡＣ−３’（配列番号：２５）を用い、ＣＡＶ株ＣＬ−１（ＮＶＳＬ ；Ｄ．Ｂ．Ｓｙｎｄｅｒ博士、Ｕｎｉｖ．メリーランド）からの８５４ｂｐ Ｅ ｃｏＲＩないしＢａｍＨＩ断片としてＰＣＲによって合成したＣＡＶプロモータ ーである。断片２は、ｐＪＦ７５１（Ｆｅｒｒａｒｉら，１９８５）のほぼ３０ ０１塩基対ＢａｍＨＩないしＰｖｕＩＩ制限断片である。断片３は、ＰＲＶ Ｂ ａ ｍＨＩ制限断片＃７（Ｌｏｍｎｉｃｚｉ，１９８４）のほぼ７５４塩基対Ｎｄｅ ＩないしＳａｌＩ制限サブ−断片である。プラスミド８５０−２５．１８を「一 過性トランスフェクションアッセイ」に従って使用して、ＣＡＶプロモーターの 強度を測定する。 プラスミド８５０−６９．１。プラスミド８５０−６９．１は外来性ＤＮＡ配 列を発現させるための新規ＣＡＶプロモーターを生成させる目的で構築した。Ｅ .ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ遺伝子は修飾されたニワトリ貧血ウイルスプロ モーターの制御下で発現させる。該プラスミドは、以下の源からの制限断片(Ｓ ａｍｂｒｏｏｋら，１９８９)を連結することによって構築した。該ベクターは ｐＮＥＢ１９３（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）のほぼ ２０００塩基対ＡａｔＩＩないしＰｖｕＩＩ断片である。断片１は、ＰＣＲプラ イマー５’−ＡＴＣＧＡＡＴＴＣＣＧＡＧＴＧＧＴＴＡＣＴＡＴＴＣＣ−３’( 配列番号：２４)および５’−ＣＧＴＧＧＡＴＣＣＡＴＣＴＴＡＣＡＧＴＣＴＴ ＡＴＡＣ−３’（配列番号：２５）を用い、ＣＡＶ株ＣＬ−１（ＮＶＳＬ；Ｄ． Ｂ．Ｓｙｎｄｅｒ博士、Ｕｎｉｖ．メリーランド）からの８５８ｂｐ ＥｃｏＲ ＩないしＢａｍＨＩ断片としてＰＣＲによって合成したＣＡＶプロモーターであ る。ＢａｍＨＩ部位近くのＨｉｎｄＩＩＩ部位はＣＡＶアポプチンリーディング フレーム内にある。断片２は、プラスミドｐＪＦ７５１（Ｆｅｒｒａｒｉら，１ ９８５）のほぼ３００１塩基対ＢａｍＨＩないしＰｖｕＩＩ制限断片である。断 片３は、ＰＲＶ ＢａｍＨＩ制限断片＃７（Ｌｏｍｎｉｃｚｉ，１９８４）のほ ぼ７５４塩基対ＮｄｅＩないしＳａｌＩ制限サブ−断片である。プラスミド８５ ０−６９．１を「一過性トランスフェクションアッセイ」に従って使用して、Ｃ ＡＶプロモーターの強度を測定する。 プラスミド８５０−８０．２。プラスミド８５０−８０．２は外来性ＤＮＡ配 列を発現させるための新規ＣＡＶプロモーターを生成させる目的で構築した。Ｅ .ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ遺伝子は修飾されたニワトリ貧血ウイルスプロ モーターの制御下で発現させる。該プラスミドは、以下の源からの制限断片(Ｓ ａｍｂｒｏｏｋら，１９８９)を連結することによって構築した。該ベクターは ｐＮＥＢ１９３（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）のほぼ ２０００塩基対ＡａｔＩＩないしＰｖｕＩＩ断片である。断片１は、ＰＣＲプラ イマー５’−ＧＴＴＣＧＧＡＴＣＣＡＴＣＣＴＣＣＣＧＧＡＣＣＧＣＣＴＴＧ− ３’（配列番号：２６）および５’−ＧＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＣＣＡＡＴＡＣＧ −３’（配列番号：２７）を用い、ＣＡＶ株ＣＬ−１（ＮＶＳＬ；Ｄ．Ｂ．Ｓｙ ｎｄｅｒ博士、Ｕｎｉｖ．メリーランド）からの３８１ｂｐ ＥｃｏＲＩないし ＢａｍＨＩ断片(配列番号：２３)としてＰＣＲによって合成したＣＡＶプロモー ターである。断片２は、プラスミドｐＪＦ７５１（Ｆｅｒｒａｒｉら，１９８５ ）のほぼ３００１塩基対ＢａｍＨＩないしＰｖｕＩＩ制限断片である。断片３は 、ＰＲＶ ＢａｍＨＩ制限断片＃７（Ｌｏｍｎｉｃｚｉ，１９８４）のほぼ７５ ４塩基対ＮｄｅＩないしＳａｌＩ制限サブ−断片である。プラスミド８５０−８ ０．２を「一過性トランスフェクションアッセイ」に従って使用して、ＣＡＶプ ロモーターの強度を測定する。 プラスミド８８３−１１．Ａ５。プラスミド８８３−１１．Ａ５は外来性ＤＮ Ａ配列を発現させるための新規ＣＡＶプロモーターを生成させる目的で構築した 。Ｅ.ｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ遺伝子は修飾されたニワトリ貧血ウイルス プロモーターの制御下で発現させる。該プラスミドは、以下の源からの制限断片 （Ｓａｍｂｒｏｏｋら，１９８９）を連結することによって構築した。該ベクタ ーはｐＮＥＢ１９３（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｉｎｃ．）の ほぼ２０００塩基対ＡａｔＩＩないしＰｖｕＩＩ断片である。断片１は、ＰＣＲ プライマー５’−ＧＴＴＣＧＧＡＴＣＣＡＴＣＣＡＣＣＣＧＧＡＣＣＧＣＣＴＴ Ｇ−３’（配列番号：２８）および５’−ＧＣＧＧＡＡＧＡＧＣＧＣＣＡＡＴＡ ＣＧ−３’（配列番号：２７）を用い、ＣＡＶ株ＣＬ−１（ＮＶＳＬ；Ｄ．Ｂ． Ｓｙｎｄｅｒ博士、Ｕｎｉｖ．メリーランド）からの３８１ｂｐ ＥｃｏＲＩな いしＢａｍＨＩ断片としてＰＣＲによって合成したＣＡＶプロモーターである。 断片２は、プラスミドｐＪＦ７５１（Ｆｅｒｒａｒｉら，１９８５）のほぼ３０ ０１塩基対ＢａｍＨＩないしＰｖｕＩＩ制限断片である。断片３は、ＰＲＶ Ｂ ａｍＨＩ制限断片＃７（Ｌｏｍｎｉｃｚｉ，１９８４）のほぼ７５４塩基対Ｎｄ ｅＩないしＳａｌＩ制限サブ−断片である。プラスミド８８３−１１．Ａ５を[ 一過性トランスフェクションアッセイ]に従って使用して、ＣＡＶプロモーター の強 度を測定する。 相同性ベクター８４８−６９．Ａ１：相同性ベクター８４８−６９．Ａ１は、 外来性ＤＮＡ配列を発現する組換え豚痘ウイルスベクターを生成させる目的で構 築した。Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子はＬＰ１プロモーターの制御下で発現さ せろ。ウズラ・インターフェロンのタイプＩ（ｑＩＰＥ−１）遺伝子はＬＰ２Ｅ Ｐ２プロモーターの制御下で発現させる。ｑＩＰＥ−１ ＯＲＦ（５９４塩基対 ）は、ＳＰＶ相同性ベクター７５２−２２．１にクローニングするための適合す るＥｃｏｒＲＩおよびＢａｍＨＩ末端を用いる（例２３Ｂで記載した）ＰＣＲに よって生成させた（ＷＯ９６／２２３６３参照）。プラスミド８４８−６９．Ａ １は組換えウイルスベクターの構築のための「組換えＦＰＶまたはＳＰＶを生成 させるための相同組換え手法」の手法によって生成させた。 例１９Ａ Ｓ−ＨＶＹ−１４５ 組換えＨＶＴ／ＭＤＶキメラウイルス Ｓ−ＨＶＹ−１４５はＭＤＶを含有する組換えキメラウイルスであり、ワクチ ン処方にてマレック病に対して保護するＨＶＴゲノム配列は、「重複するサブゲ ノム断片から組換えヘルペスウイルスを創製するための方法」に従って、ビルレ ントＭＤＶ血清タイプ１の重要な保護抗原およびＨＶＴゲノムＤＮＡのコスミド につきコードする遺伝子を含有するＭＤＶゲノムＤＮＡのコスミドを組合せこと によって生成したマレック病に対してワクチン処方にて保護するＭＤＶおよびＨ ＶＴゲノム配列を含有する組換えキメラウイルスである。得られたウイルスは、 ビルレントＭＤＶ血清タイプ１に対する保護免疫応答およびＨＶＴの弱減化され た増殖特徴を有する。１つの例において、該キメラウイルスは、ユニークな短領 域のＨＶＴ遺伝子およびユニークな長領域を含有し、ニワトリにおいてマレック 病に対するワクチンとして有用である。もう１つの例において、該キメラウイル スは、該短領域のＭＤＶ遺伝子および該長領域のＨＶＴ遺伝子を含有し、ニワト リにおいてマレック病に対するワクチンとして有用である。 該ユニークな短領域内のＭＤＶ保護抗原（ｇＤ、ｇＥおよびｇＩ）はＭＤＶに 対する保護免疫応答を誘導し、他方、ＭＤＶのユニークな長領域に存在するビル レンスエレメント（５５、５６、５７）は、ＨＶＴの弱毒化ユニーク長配列によ って置き換える。その結果、マレック病に対して保護する弱毒化ウイルスワクチ ンが得られる。マレック病、感染性喉頭気管炎、感染性ブルザ病、ニューキャッ スル病、またはもう１つの家禽病原体に対する多価保護は、ＩＬＴＶ ｇＢ、ｇ ＤおよびｇＩ遺伝子、ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子、ＮＤＶ ＨＮおよびＦ遺伝子、 または家禽病原体からの抗原遺伝子を、ＨＶＴ／ＭＤＶ組換えウイルスのユニー ク長領域内のＥｃｏＲＩ ＃９（ＢａｍＨＩ＃１０）断片中においてＰａｃＩ部 位またはＮｏｔＩ部位に変換されたＸｈｏＩ部位に挿入することによって達成さ れる。 全ＭＤＶ短領域を含有するコスミドを構築した。ＭＤＶゲノムＤＮＡは該ウイ ルスのユニーク長および内部および末端反復中にＳｍａＩ部位を含有するが、該 ウイルスのユニーク短領域内にＳｍａＩ部位を含有しない。ＭＤＶの全短領域は 、ＳｍａＩでのＭＤＶゲノムＤＮＡの部分的制限消化によって単離した。ほぼ２ ９，０００ないし３３，０００塩基対のＤＮＡ断片を単離し、コスミドベクター ｐＷＥ１５の平滑末端部位にクローン化した。Ｓ−ＨＶＹ−１４５、組換えＨＶ Ｔ／ＭＤＶキメラウイルスを生成させるために、「重複するサブゲノム断片から 組換えヘルペスウイルスを創製するための方法」に従って、ＭＤＶ短領域を含有 するコスミドをＨＴＶ長領域を含有するコスミドと組み合わせた。サブゲノムク ローンおよび酵素の以下の組合せを用いた：ＮｏｔＩと４０７−３２．２Ｃ３、 ＢａｍＨＩと１７２−０７．ＢＡ２、ＮｏｔＩと４０７−３２．５Ｇ６、Ｎｏｔ Ｉと４０７−３２．１Ｃ１、およびＮｏｔＩと７３９−２７．１６。 得られたウイルスワクチンは、マレック病に対する優れた保護を供し、または マレック病および感染性喉頭気管炎、感染性ブルザ病、ニューキャッスル病、ま たはもう１つの家禽病原体に対する多価ワクチンとして供される。このワクチン は、ＨＶＴ／ＭＤＶキメラワクチンにおけるＭＤＶ遺伝子の発現が、ＨＶＴおよ びＭＤＶタイプ２（ＳＢ−１）またはＨＶＴ単独を含有する現在入手可能なワク チンよりも安全でマレック病に対して良好な保護を供するので、優れている。第 ２に、診断および調整目的双方のために、相同ＨＶＴ遺伝子の不存在下における ＭＤＶ糖タンパク質遺伝子の発現を証明することができる。これは、ＭＤＶ糖タ ンパク質に対する抗体が相同ＨＶＴ糖タンパク質と交差反応するので有用である 。 最後に、各糖タンパク質の単一コピーを含有する組換えＨＶＴ／ＭＤＶウイルス は、相同組換えによって欠失できるＨＶＴおよびＭＤＶからの相同糖タンパク質 遺伝子の２つのコピーを含有する組換えウイルスよりも安定している。 別の例において、ユニーク長領域からのＭＤＶ保護抗原を含有するコスミド( ＭＤＶ ｇＢおよびｇＣ)を、短および長領域からのＨＶＴ遺伝子配列を含有す るコスミドと組合せ、ユニーク長／内部反復連結およびユニーク長／末端反復連 結においてＭＤＶビルレンス遺伝子を回避する（５５、５６および５７）。 ＳＢ−１株は弱毒化病原性を持つＭＤＶ血清タイプ２である。ＨＶＴおよびＳ Ｂ−１生ウイルスの組合せのワクチン接種は、いずれかのウイルス単独でのワク チン接種よりもビルレントＭＤＶ攻撃に対して良好に保護する。本発明の別の例 において、組換えウイルスワクチンは、ＳＢ−１およびＨＶＴのごとき、非ビル レントＭＤＶ血清タイプ１および３の弱毒化遺伝子と組み合わせたビルレントＭ ＤＶ血清タイプ２の保護抗原遺伝子を含む。ユニーク長領域に対応するゲノムＤ ＮＡはＳＢ−１血清タイプによって寄与される。ユニーク短領域に対応するゲノ ムＤＮＡはＨＶＴ血清タイプによって寄与される。ＭＤＶ血清タイプ１からの３ つの主要糖タンパク質抗原（ｇＢ、ｇＡおよびｇＤ）は該ウイルスのユニーク短 領域に挿入される。 ＨＶＴサブゲノムクローン７２１−３８．１Ｊを利用して組換えウイルスを構 築して、ユニーク短領域を再構築する。サブゲノムクローン７２１−３８．１Ｊ はＭＤＶ ｇＢ、ｇＡおよびｇＤ遺伝子の挿入を含有する。大モル過剰のこれら のクローンを、Ｓｂ−１ゲノムＤＮＡの亜感染性用量とコトランスフェクトする 。適当な亜感染性用量を決定するために、ＳＢ−１でのトランスフェクションを 、細胞培養においてウイルスプラークをもはや生じない用量まで滴定する。かか る用量は、ＨＶＴユニーク短サブゲノムクローンと組換えられるＳＢ−１のユニ ーク長領域にわたるサブゲノム断片を含有する。従って、ＳＢ−１およびＨＶＴ サブゲノム断片の重複する相同領域間の組換えから得られるウイルスはかなり有 利となる。あるいは、ユニーク長領域からのＳＢ−１ゲノム断片をコスミドベク ターにクローン化する。「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルス を創製するための方法」を用い、ＳＢ−１のユニーク長およびＨＶＴのユニーク 短 領域を含有する組換えウイルスを生成させた。また、この手法は、限定されるも のではないが、感染性喉頭気管炎ウイルス、ニューキャッスル病ウイルスおよび 感染性ブルザ病ウイルスを含めた他の鳥類病原体からの抗原遺伝子を挿入するた めに、ＨＶＴサブゲノムクローンと共に使用される。 例１９Ｂ Ｓ−ＨＶＹ−１４９ Ｓ−ＨＶＹ−１４９は、マレック病ウイルスの短領域およびシチメンチョウ長 領域のヘルペスウイルスのキメラを含む組換えキメラウイルスである。Ｓ−ＨＶ Ｙ−１４９は、該キメラウイルスのユニーク長領域内のＥｃｏＲ１＃９断片中の ＸｈｏＩ部位に挿入された感染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）お よび糖タンパク質Ｉ（ｇＩ）遺伝子からの外来性ＤＮＡを含む。該ＩＬＴウイル スｇＤおよびｇＩ遺伝子はＩＬＴウイルスｇＤおよびｇＩプロモーターの制御下 にある。該組換えキメラウイルスワクチンはビルケントマレック病ウイルスおよ び感染性喉頭気管炎ウイルスでの攻撃に対して有用である。 Ｓ−ＨＶＹ−１４９を生成させるために、「重複するサブゲノム断片から組換 えヘルペスウイルスを創製するための方法」において、サブゲノムクローンおよ び酵素の以下の組合せを使用した：ＮｏｔＩと４０７−３２．２Ｃ３、ＢａｍＨ Ｉと１７２−０７．ＢＡ２、ＮｏｔＩと４０７−３２．５Ｇ６、ＮｏｔＩと８５ ２−５２．Ｉ１４、およびＮｏｔＩと７３９−２７．１６。 平板培養およびプラーク精製によってＳ−ＨＶＹ−１４９を精製し、ＢＬＡＣ Ｋ ＰＬＡＱＵＥ ＡＳＳＡＹ（黒色プラークアッセイ）によって純度につきテ ストした。Ｓ−ＨＶＹ−１４９は、回復しつつあるＩＬＴウイルス抗血清を用い るＢＬＡＣＫ ＰＬＡＱＵＥ ＡＳＳＡＹ（黒色プラークアッセイ）によると１ ００％純度であった。 例１９Ｃ Ｓ−ＨＶＹ−１５１ Ｓ−ＨＶＹ−１５１はマレック病ウイルスの短領域およびシチメンチョウ長領 域のヘルペスウイルスのキメラを含む組換えキメラウイルスである。Ｓ−ＨＶＹ −１５１は、該キメラウイルスのユニークな長領域内のＥｃｏＲＩ＃９断片中の ＸｈｏＩ部位に挿入されたＥ．ｃｏｌｉからの外来性ＤＮＡを含む組換えキメラ ウイルスワクチンである。該Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子はＰＲＶ ｇＸプロ モ ーターの制御下にある。組換えキメラウイルスワクチンはビルレントなマレック 病ウイルスでの攻撃に対して有用である。 Ｓ−ＨＶＹ−１５１はＳ−ＨＶＹ−１４５から誘導した。これは、初代ニワト リ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）細胞への「組換えウイルスを生成させるためのＤＮＡ トランスフェクション」手法において、相同性ベクター３０１−０７．Ｙ＃Ｄ１ およびウイルスＳ−ＨＶＹ−１４５を用いて達成された。トランスフェクション ストックから得られた青色ウイルスは、「組換えヘルペスウイルスのためのブル オガルスクリーン」手法を用いる順次プラーク精製によって精製される。 Ｓ−ＨＶＹ−１５１は、マレック病ウイルスでの攻撃に対するワクチンとして 有用である。 例１９Ｄ Ｓ−ＨＶＹ−１５２ Ｓ−ＨＶＹ−１５２はマレック病ウイルスの短領域およびシチメンチョウ長領 域のヘルペスウイルスのキメラを含む組換えキメラウイルスである。Ｓ−ＨＶＹ −１５２は、該キメラウイルスのユニークな長領域内のＥｃｏＲＩ＃９断片中の ＸｈｏＩ部位に挿入されたＥ.ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子および感染性喉頭気管炎 （ＩＬＴ）ウイルス糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）および糖タンパク質Ｉ（ｇＩ）遺伝 子からの外来性ＤＮＡを含む組換えキメラウイルスワクチンであろ。該Ｅ．ｃｏ ｌｉ ｌａｃＺ遺伝子はＰＲＶ ｇＸプロモーターの制御下にある。ＩＬＴウイ ルスｇＤおよびｇＩプロモーターは、各々、ＩＬＴウイルスｇＤおよびｇＩプロ モーターの制御下にある。 Ｓ−ＨＶＹ−１５２はＳ−ＨＶＹ−１４５から誘導した。これは、初代ニワト リ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）細胞への「組換えウイルスを生成させるためのＤＮＡ トランスフェクション」手法において、相同性ベクター８６４−７４．１８およ びウイルスＳ−ＨＶＹ−１４５を用いて達成された。Ｓ−ＨＶＹ−１５２は、Ｉ ＬＴウイルスに対する回復しつつある抗血清およびウサギ抗−β−ガラクトシダ ーゼ抗血清を用いる「黒色プラークアッセイ」によって純度につきテストし、順 次プラーク精製および「黒色プラークアッセイ」によって精製した。 Ｓ−ＨＶＹ−１５２は、マレック病ウイルスおよび喉頭気管炎ウイルスでの攻 撃に対するワクチンとして有用である。例１９Ｅ Ｓ−ＨＶＹ−１５３ Ｓ−ＨＶＹ−１５３はマレック病ウイルスの短領域およびシチメンチョウ長領 域のヘルペスウイルスのキメラを含む組換えキメラウイルスである。Ｓ−ＨＶＹ −１５３は、該キメラウイルスのユニークな長領域内のＥｃｏＲＩ＃９断片中の ＸｈｏＩ部位に挿入されたＥ.ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子およびニューキャッスル 病ウイルス（ＮＤＶ）ヘマトグルチニン（ＨＮ）および融合（Ｆ）遺伝子からの 外来性ＤＮＡを含む組換えキメラウイルスワクチンである。該Ｅ．ｃｏｌｉ ｌ ａｃｚ遺伝子はＨＳＶ−１ ＴＫプロモーターの制御下にある。ＮＤＶ ＨＮ遺 伝子はＰＲＶ ｇＸプロモーターの制御下にあり、ＮＤＶ Ｆ遺伝子はＨＣＭＶ 前初期プロモーターの制御下にある。 Ｓ−ＨＶＹ−１５３はＳ−ＨＶＹ−１４５から誘導した。これは、初代ニワト リ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）細胞への「組換えウイルスを生成させるためのＤＮＡ トランスフェクション」手法において、相同性ベクター８８１−２３．＃２８お よびウイルスＳ−ＨＶＹ−１４５を用いて達成された。トランスフェクションス トックから得られた赤色プラークウイルスは、「組換えヘルペスウイルスのため のブルオガルおよびＣＰＲＧスクリーン」手法を用いる順次プラーク精製によっ て精製した。 Ｓ−ＨＶＹ−１５３は、抗−β−ガラクトシダーゼおよび抗−ＮＤＶ抗体を用 いるＢＬＡＣＫ ＰＬＡＱＵＥ ＡＳＳＡＹ（黒色プラークアッセイ）によって 純度につきテストした。 Ｓ−ＨＶＹ−１５３はマレック病ウイルスおよびニューキャッスル病ウイルス での攻撃に対するワクチンとして有用である。 例２０ ニワトリ骨髄単球性増殖因子（ｃＭＧＦ）、ニワトリインターフェロン（ｃＩ ＦＮ）又はウズラインターフェロン（ｑＩＦＮ）を発現する組換えＨＶＴは、マ レック病ウイルスに対するワクチンとして、および家禽の他の疾患に対する免疫 応答を増強するために有用である。ニワトリ骨髄単球性増殖因子（ｃＭＧＦ）は 哺乳動物Ｇ−ＣＳＦやインターロイキン−６タンパク質と関係があり（５８）、 ニワトリインターフェロンタイプ１（ｃＩＦＮ）は哺乳動物インターフェロンタ イプ１と相同性がある（５９）。前記例で記載したワクチンと組合せて使用する と、Ｓ−ＨＶＴ−１４４またはｃＩＦＮを発現するＨＶＴは、鳥に疾患を引き起 こすウイルス（例えば、マレック病ウイルス、ニューキャッスル病ウイルス、伝 染性咽頭気管炎ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、伝染性ブルザウイルスがあ るが、これらに限定されない）に対する粘液性、体液性または細胞性免疫を与え るのに有用である。ｃＭＧＦまたはｃＩＦＮを発現する組換えＨＶＴは、例１５ に記載の鳥類の疾患を引き起こす生物に対して増強された免疫を与えるのに有用 である。 例２０Ａ Ｓ−ＨＶＴ−１４４ Ｓ−ＨＶＴ−１４４は、ＨＶＴのユニークな長い領域内のＥｃｏＲＩ＃９断片 中のＰａｃＩ部位に変換したＸｈｏＩ部位に挿入されたニワトリ骨髄単球性増殖 因子（ｃＭＧＦ）遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスで ある。ｃＭＧＦ遺伝子は、ＨＶＴゲノムのＥｃｏＲＩ＃９断片内のオープン読み とり枠（ＯＲＦ Ａ）と反対の転写配向である(図４，配列認識番号１２と１３) 。ｃＭＧＦ遺伝子は、ヒトサイトメガロウイルス極初期プロモーターから発現さ れる。Ｓ−ＨＶＴ−１４４は、マレック病に対する家禽のワクチンとして有用で ある。 Ｓ−ＨＶＴ−１４４は、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイル スを創製するための方法」に従って構築した。サブゲノムクローンと酵素の以下 の組合せを使用した：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ２ とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、６７２−０７．Ｃ４０とＮｏ ｔＩ、６７２−０１．Ａ４０とＮｏｔＩ、７５１−８７．Ａ８とＡｓｃＩ、およ び４１５−０９．ＢＡ１とＢａｍＨＩ。 例２０Ｂ ニワトリインターフェロンを発現する組換えＨＶＴ シチメンチョウの組換えＨＶＴは、ＨＶＴのユニークな長い領域内のＥｃｏＲ Ｉ＃９断片中のＰａｃＩ部位に変換したＸｈｏＩ部位に挿入されたニワトリイン ターフェロンタイプ１（ｃＩＦＮ）遺伝子を含有する。ｃＩＦＮ遺伝子は、ヒト サイトメガロウイルス極初期プロモーターから発現される。ｃＩＦＮを発現する 組換えＨＶＴは、マレック病に対する家禽のワクチンとして有用である。 ｃＩＦＮを発現する組換えＨＶＴは、「重複するサブゲノム断片から組換えヘ ルペスウイルスを創製するための方法」に従って構築する。サブゲノムクローン と酵素の以下の組合せを使用した：４０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２− ０７．ＢＡ２とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６とＮｏｔＩ、６７２−０７． Ｃ４０とＮｏｔＩ、６７２−０１．Ａ４０とＮｏｔＩ、７６１−０７．Ａ１とＡ ｓｃＩ、および４１５−０９．ＢＡ１とＢａｍＨＩ。 鳥類サイトカインを発現する組換えＨＶＴは、免疫応答を増強するために鳥類 の疾患抗原の遺伝子を発現するＨＶＴと組合される。ＨＶＴ中で発現され、免疫 刺激作用を有する追加のサイトカインには、トランスフォーミング増殖因子ベー タ、上皮増殖因子ファミリー、線維芽細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、インスリ ン様増殖因子、Ｂ−神経増殖因子、血小板由来増殖因子、血管内皮増殖因子、イ ンターロイキン１、ＩＬ−１受容体アンタゴニスト、インターロイキン２、イン ターロイキン３、インターロイキン４、インターロイキン５、インターロイキン ６、ＩＬ−６可溶性受容体、インターロイキン７、インターロイキン８、インタ ーロイキン９、インターロイキン１０、インターロイキン１１、インターロイキ ン１２、インターロイキン１３、アンギオゲニン、ケモカイン、コロニー刺激因 子、顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子、エリスロポエチン、インターフ ェロン、インターフェロンガンマ、白血病阻害因子、オンコスタチンＭ、プレイ オトロフイン、分泌性白血球プロテアーゼインヒビター、幹細胞因子、腫瘍壊死 因子、および可溶性ＴＮＦ受容体があるが、これらに限定されない。これらのサ イトカインは、鳥類種またはヒト、ウシ、ウマ、ネコ、イヌもしくはブタを含む 他の動物由来である。 例２０Ｃ マレック病ウイルス遺伝子およびニワトリインターフェコン遺伝子を発現する 組換えＨＶＴ シチメンチョウの組換えヘルペスウイルスは、ＨＶＴのユニークな長い領域内 のＥｃｏＲＩ＃９断片中のＰａｃＩ部位に変換したＸｈｏＩ部位に挿入されたニ ワトリインターフェロンタイプ１（ｃＩＦＮ）遺伝子を含有し、さらにＨＶＴ ＵＳ２遺伝子のＨｉｎｄIII部位に変換したユニークなＳｔｕＩ部位に挿入され たＭＤＶ ｇＡ、ｇＤ、およびｇＢ遺伝子を含有する。ｃＩＦＮ遺伝子は、ヒト サイトメガロウイルス極初期プロモーターから発現される。ＭＤＶ遺伝子は、内 因性ＭＤＶプロモーターから発現される。ｃＩＦＮ並びにＭＤＶ ｇＡ、ｇＢ、 およびｇＤを発現する組換えＨＶＴは、マレック病に対する家禽の免疫応答が増 強したワクチンとして有用である。 ＭＤＶ遺伝子とｃＩＦＮ遺伝子を発現する組換えＨＶＴは、「重複するサブゲ ノム断片から組換えヘルペスウイルスを創製するための方法」に従って構築する 。サプゲノムクローンと酵素の以下の組合せを使用する：４０７−３２．２Ｃ３ とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ２とＢａｍＨＩ、４０７−32．５Ｇ６とＮｏｔ Ｉ、６７２−０７．Ｃ４０とＮｏｔＩ、６７２−０１．Ａ４０とＮｏｔＩ、７６ １−０７．Ａ１とＡｓｃＩ、および切断しない７２１−３８．１Ｊ。例２０Ｄ マレック病ウイルス遺伝子、ニューキャッスル病ウイルス遺伝子およびニワト リインターフェロン遺伝子を発現する組換えＨＶＴ シチメンチョウの組換えヘルペスウイルスは、ＨＶＴのユニークな長い領域内 のＥｃｏＲＩ＃９断片中のＰａｃＩ部位に変換したＸｈｏＩ部位に挿入されたニ ワトリインターフェロンタイプ１（ｃＩＦＮ）遺伝子を含有し、さらにＨＶＴ ＵＳ２遺伝子のＨｉｎｄIII部位に変換したユニークなＳｔｕＩ部位に挿入され たＭＤＶ ｇＡ、ｇＤ、およびｇＢ遺伝子並びにＮＤＶ ＨＮおよびＦ遺伝子を 含有する。ｃＩＦＮ遺伝子は、ヒトサイトメガロウイルス極初期プロモーターか ら発現される。ＭＤＶ遺伝子は、内因性ＭＤＶプロモーターから発現される。Ｎ ＤＶ ＨＮ遺伝子はＰＲＶ ｇＸプロモーターに制御され、ＮＤＶ Ｆ遺伝子は ＨＣＭＶ極初期プロモーターに制御される。ｃＩＦＮ並びにＭＤＶ ｇＡ、ｇＢ 、およびｇＤを発現する組換えＨＶＴは、マレック病およびニューキャッスル病 に対する家禽の免疫応答が増強したワクチンとして有用である。 ＭＤＶ遺伝子、ＮＤＶ遺伝子およびｃＩＦＮを発現する組換えＨＶＴは、「重 複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを創製するための方法」に従 って構築する。サブゲノムクローンと酵素の以下の組合せを使用する：４０７− ３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ２とＢａｍＨＩ、４０７−３２． ５Ｇ６とＮｏｔＩ、６７２−０７．Ｃ４０とＮｏｔＩ、６７２−０１．Ａ４０と ＮｏｔＩ、７６１−０７．Ａ１とＡｓｃＩ、および切断しない７２２−６０．Ｅ ２。 例２０Ｅ マレック病ウイルス遺伝子およびニワトリ骨髄単球性増殖因子遺伝子を発現す る組換えＨＶＴ シチメンチョウの組換えヘルペスウイルスは、ＨＶＴのユニークな長い領域内 のＥｃｏＲＩ＃９断片中のＰａｃＩ部位に変換したＸｈｏＩ部位に挿入されたニ ワトリ骨髄単球性増殖因子（ｃＭＧＦ）遺伝子を含有し、さらにＨＶＴ ＵＳ２ 遺伝子のＨｉｎｄIII部位に変換したユニークなＳｔｕＩ部位に挿入されたＭＤ Ｖ ｇＡ、ｇＤ、およびｇＢ遺伝子を含有する。ｃＭＧＦ遺伝子は、ヒトサイト メガロウイルス極初期プロモーターから発現される。ＭＤＶ遺伝子は、内因性Ｍ ＤＶプロモーターから発現される。ｃＭＧＦ並びにＭＤＶ ｇＡ、ｇＢ、および ｇＤを発現する組換えＨＶＴは、マレック病に対する家禽の免疫応答が増強した ワクチンとして有用である。 ｃＭＧＦ遺伝子およびＭＤＶ遺伝子を発現する組換えＨＶＴは、「重複するサ ブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを創製するための方法」に従って構築 する。サブゲノムクローンと酵素の以下の組合せを使用する：４０７−３２．２ Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ２とＢａｍＨＩ、４０７−３２．５Ｇ６と ＮｏｔＩ、６７２−０７．Ｃ４０とＮｏｔＩ、６７２−０１．Ａ４０とＮｏｔＩ 、７５１−８７．Ａ８とＡｓｃＩ、および切断しない７２１−３８．１Ｊ。 例２０Ｆ マレック病ウイルス遺伝子、ニューキャッスル病ウイルス遺伝子、およびニワ トリ骨髄単球性増殖因子遺伝子を発現する組換えＨＶＴ シチメンチョウの組換えヘルペスウイルスは、ＨＶＴのユニークな長い領域内 のＥｃｏＲＩ＃９断片中のＰａｃＩ部位に変換したＸｈｏＩ部位に挿入されたニ ワトリ骨髄単球性増殖因子（ｃＧＭＦ）遺伝子を含有し、さらにＨＶＴ ＵＳ２ 遺伝子のＨｉｎｄIII部位に変換したユニークなＳｔｕＩ部位に挿入されたＭＤ Ｖ ｇＡ、ｇＤ、およびｇＢ遺伝子並びにＮＤＶ ＨＮおよびＦ遺伝子を含有す る。ｃＧＭＦ遺伝子は、ヒトサイトメガロウイルス極初期プロモーターから発現 される。ＭＤＶ遺伝子は、内因性ＭＤＶプロモーターから発現される。ＮＤＶ ＨＮ遺伝子はＰＲＶ ｇＸプロモーターに制御され、ＮＤＶ Ｆ遺伝子はＨＣＭ Ｖ極初期プロモーターに制御される。ｃＩＦＮ並びにＭＤＶ ｇＡ、ｇＢ、およ びｇＤを発現する組換えＨＶＴは、マレック病およびニューキャッスル病に対す る家禽の免疫応答が増強したワクチンとして有用である。 ＭＤＶ遺伝子、ＮＤＶ遺伝子およびｃＧＭＦ遺伝子を発現する組換えＨＶＴは 、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを創製するための方法 」に従って創製する。サブゲノムクローンと酵素の以下の組合せを使用する：４ ０７−３２．２Ｃ３とＮｏｔＩ、１７２−０７．ＢＡ２とＢａｍＨＩ、４０７− ３２．５Ｇ６．とＮｏｔＩ、６７２−０７．Ｃ４０とＮｏｔＩ、６７２−０１． Ａ４０とＮｏｔＩ、切断しない７５１−８７．Ａ８、および切断しない７２２− ６０．Ｅ２。 例２１ 疾患を引き起こす微生物からの抗原を発現するシチメンチョウの組換えヘルペ スウイルス シチメンチョウの組換えヘルペスウイルス（ＨＶＴ）は、鳥類種とともに動物 からの疾患を引き起こす微生物の抗原を発現するのに有用である。組換えＨＶＴ は、ヒト、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、およびネコを含む動物のワクチンとして有 用であるが、これらに限定されるものではない。 組換えＨＶＴは、疾患または疾患生物からの外来性抗原がＨＶＴベクター中で 発現される場合、ウマの疾患に対するワクチンとして有用である。これらには、 ウマインフルエンザウイルス、ウマヘルペスウイルス−１およびウマヘルペスウ イルス−４があるが、これらに限定されない。組換えＨＶＴは、以下の疾患また は疾患生物からの外来性抗原がＨＶＴベクター中で発現される場合、ウシの疾患 に対するワクチンとして有用である。これらには、ウシヘルペスウイルスタイプ １、ウシウイルス性下痢ウイルス、ウシの呼吸器性シンシチアルウイルス、ウシ パラインフルエンザウイルスがあるが、これらに限定されない。組換えＨＶＴは 、以下の疾患または疾患生物からの外来性抗原がＨＶＴベクター中で発現される 場合、ブタの疾患に対するワクチンとして有用である。これらには、仮性狂犬病 ウイルス、ブタ生殖器および呼吸器症候群（ＰＲＲＳ／ＳＩＲＳ）、ブタコレラ ウイルス、ブタインフルエンザウイルス、ブタパルボウイルス、ブタロタウイル スがあるが、これらに限定されない。組換えＨＶＴは、以下の疾患または疾患生 物からの外来性抗原がＨＶＴベクター中で発現される場合、ネコまたはイヌの疾 患に対するワクチンとして有用である。これらには、ネコヘルペスウイルス、ネ コ白血病ウイルス、ネコ免疫不全症ウイルス、および糸状虫（Ｄｉｒｏｆｉｌａ ｒｉａ ｉｍｉｔｉｓ）（心糸状虫症）があるが、これらに限定されない。イヌ の疾患を引き起こす微生物には、イヌヘルペスウイルス、イヌジステンパー、イ ヌアデノウイルスタイプ１（肝炎）、アデノウイルスタイプ２（呼吸系疾患）、 パラインフルエンザウイルス、レプトスピラカニコーラ(Ｌｅｐｔｏｓｐｉｒａ ｃａｎｉｃｏｌａ）、黄疸性出血病、パルボウイルス、コロナウイルス、ボレ リア・ブルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａｂｕｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、イヌヘ ルペスウイルス、ボルデテラ・ブロンキセプチカ（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｂｒ ｏｎｃｈｉｓｅｐｔｉｃａ）、イヌ糸状虫（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ ｉｍｉｔ ｉｓ）（心糸状虫症）および狂犬病があるが、これらに限定されない。 例２２ シチメンチョウの組換えヘルペスウイルスをベクターとして用いるヒトワクチ ン シチメンチョウの組換えヘルペスウイルス（ＨＶＴ）は、ヒトの疾患に対する ワクチンとして有用である。例えば、ヒトのインフルエンザは、中和性ウイルス エピトープが急速に変化する、急速に進化するウイルスである。有用な組換えＨ ＶＴワクチンはインフルエンザ中和性エピトープがインフルエンザウイルスの新 しい株に対して防御するように急速に変化するものである。ヒトのインフルエン ザＨＡとＮＡ遺伝子は、ポリメラーゼ連鎖反応を利用して組換えＨＶＴにクロー ン化される。組換えＨＶＴは、以下の疾患または疾患生物からの外来性抗原がＨ ＶＴベクター中で発現される場合、他のヒトの疾患に対するワクチンとして有用 である。これらには、Ｂ型肝炎ウイルス表面抗原およびコア抗原、Ｃ型肝炎ウイ ルス、ヒト免疫不全症ウイルス、単純ヘルペスウイルス−１、単純ヘルペスウイ ルス−２、ヒトサイトメガロウイルス、エプスタイン−バーウイルス、水痘−帯 状庖疹ウイルス、ヒトヘルペスウイルス−６、ヒトヘルペスウイルス−７、ヒト インフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ハンターンウイルス（ｈａｎｔａａｎ ｖｉｒｕｓ）、肺炎ウイルス、ライノウイルス、ポリオウイルス、ヒト呼吸系発 疹ウイルス、レトロウイルス、ヒトＴ細胞白血病ウイルス、狂犬病ウイルス、お たふくかぜウイルス、マラリア(Ｐｌａｓｍｏｄｉｕｍ ｆａｌｃｉｐａｒｕｍ) 、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）、ジフテリア、リケ ッチア・プロワゼキイ(Ｒｉｃｈｅｔｓｉａ ｐｒｏｗａｚｅｋｉｉ)、ボレリア ・ベルグドルフェリ（Ｂｏｒｒｅｌｉａ ｂｅｒｇｄｏｒｆｅｒｉ）、破傷風毒 素、悪性腫瘍抗原があるが、これらに限定されない。 ヒトサイトカインを発現する組換えＨＶＴは、免疫応答を増強するためにヒト の疾患抗原の遺伝子を発現するＨＶＴと組合される。追加のサイトカイン（ヒト および他の動物のトランスフォーミング増殖因子ベータ、上皮増殖因子ファミリ ー、線維芽細胞増殖因子、肝細胞増殖因子、インスリン様増殖因子、Ｂ−神経増 殖因子、血小板由来増殖因子、血管内皮増殖因子、インターロイキン１、ＩＬ− １受容体アンタゴニスト、インターロイキン２、インターロイキン３、インター ロイキン４、インターロイキン５、インターロイキン６、ＩＬ−６可溶性受容体 、インターロイキン７、インターロイキン８、インターロイキン９、インターロ イキン１０、インターロイキン１１、インターロイキン１２、インターロイキン １３、アンギオゲニン、ケモカイン、コロニー刺激因子、顆粒球−マクロファー ジコロニー刺激因子、エリスロポエチン、インターフェロン、インターフェロン ガンマ、白血病阻害因子、オンコスタチンＭ、プレイオトロフィン、分泌性白血 球プロテアーゼインヒビター、幹細胞因子、腫瘍壊死因子、および可溶性腫瘍壊 死因子受容体があるが、これらに限定されない）は、ＨＶＴ中で発現され、免疫 刺激作用を有する。 例２３Ａ シチメンチョウの組換えヘルペスウイルスワクチンの改良製造法 インターフェロンやインターロイキンのようなサイトカインは、培養細胞や動 物のウイルスの複製を阻害する。細胞性インターフェロンまたはインターロイキ ンの産生の阻害は、細胞培養による組換えＨＶＴの増殖を改良する。組換え豚痘 ベクターから発現されるニワトリインターフェロンタイプ１（ｃＩＦＮ）を、ニ ワトリ胚線維芽（ＣＥＦ）細胞培養物に加え、β−ガラクトシダーゼを発現する Ｓ−ＨＶＴ−０１２でインフェクションした。細胞培養培地に加えたｃＩＦＮは 、β−ガラクトシダーゼの発現とＳ−ＨＶＴ−０１２力価の両方を用量依存的に 低下させた。この結果は、ＨＶＴの増殖は、ニワトリインターフェロンの外因性 添加により制限されることを示す。ＣＥＦ細胞中でニワトリインターフェロン活 性を除去または不活性化することにより、ＣＥＦ細胞中のＨＶＴの増殖を改良す るためにいくつかの方策が利用可能である。 一つの態様において、ニワトリインターフェロン中和性抗体は、ニワトリイン ターフェロン活性を阻害し、ＣＥＦ細胞培養物中の組換えＨＶＴの増殖を改良す るために、培地に加えられる。抗−ｃＩＦＮ抗体は、ニワトリンターフェロンタ ンパク質を注射したマウス又はウサギの血清から得られ、好ましくはｃＩＦＮは 、ニワトリインターフェロンを発現する組換え豚痘ウイルス由来である。 ポックスウイルスは、免疫逃避方法としてサイトカイン阻害性タンパク質を分 泌する。ある型のポックスウイルス免疫逃避機序では、サイトカインを不活性化 し、ウイルスの複製を可能にするインターロイキン、インターフェロン、または 腫瘍壊死因子のポックスウイルス可溶性受容体が関与する（６０）。本発明の一 つの態様において、鶏痘ウイルスは、ニワトリインターフェロン阻害性タンパク 質及び他の免疫逃避タンパク質の供給源として有用である。インターフェロン活 性を阻害しＨＶＴ力価を増加させるために、ＦＰＶ感染ＣＥＦ細胞培養物からの 調整培地をＨＶＴ感染ＣＥＦに加える。さらなる態様において、組換えニワトリ インターフェロン阻害性タンパク質又は他のポックスウイルス免疫逃避タンパク 質は、ＨＶＴ力価を増加させるためにＨＶＴワクチン組成物と組み合わせてベク ター中で発現される。 外来性遺伝子を発現するために、ニワトリ胚線維芽（ＣＥＦ）細胞が作製され た（６１）。さらなる態様において、ニワトリインターフェロンのアンチセンス ＲＮＡをコードする遺伝子を発現するベクターをＣＥＦ細胞株に導入して、イン ターフェロン陰性ＣＥＦ細胞株を作製する。インターフェロン陰性ＣＥＦ細胞株 中で増殖させた組換えＨＶＴは、インターフェロン産生性ＣＥＦ細胞株中で増殖 させたＨＶＴに比較して、改良されたウイルス力価を示す。さらなる態様におい て、ニワトリ骨髄単球性増殖因子（ｃＭＧＦ）遺伝子を発現するベクターをＣＥ Ｆ細胞に導入して、ｃＭＧＦ陽性ＣＥＦ細胞株を構築する。ｃＭＧＦ陽性ＣＥＦ 細胞株中で増殖させた組換えＨＶＴは、ｃＭＧＦ陰性ＣＥＰ細胞株中で増殖させ たＨＶＴに比較して、改良されたウイルス力価を示す。 前記例で概説したように、本発明の組換えＨＶＴは、マレック病及び他の疾患 に対するワクチンとして有用である。ＣＥＦ細胞での組換えＨＶＴの増殖効率が 上昇すれば、ワクチンの生産に有用である。 例２３Ｂ ウズラ・インターフェロン、タイプ１のクローニング サザーンブロットは、³²Ｐ−標識ニワトリ・インターフェロン−１遺伝子断片 がウズラ細胞系ＱＴ−35からの５．０ｂｐ ＢａｍＨＩゲノムＤＮＡ断片にハイ ブリダイズすることを示した。この情報に基づき、ニワトリ・インターフェロン のタイプ１に対する相同プライマーにてＰＣＲ方法を利用して、ウズラ・インタ ーフェロンのタイプ１についての遺伝子をクローン化した。（ＰＣＲプライマー は、ウズラＩＦＮ遺伝子の５’末端からの５’−ＴＧＴＡＣＡＧＡＴＣＣＴＣＡ ＣＣＡＴＧＧＣＴＧＴＧＣＣＴＧＣＡＡＧＣ−３’（配列番号：２９）；ウズラ ＩＦＮ遺伝子の３’末端からの５’−ＧＧＣＧＡＡＴＴＣＧＧＣＴＡＡＧＴＧＣ ＡＣＧＴＧＴＴＧ−３’（配列番号：３０）であった。）平滑５９４ｂｐ ＱＴ −３５ゲノムＰＣＲ ＤＮＡ断片はＰＣＲによって生成させ、ｐＢＬＵｅｓｃｒ ｉｐｔ ＩＩ ＫＳ−プラスミド（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ， ＣＡ）の多重クローニング部位中のユニークＳｍａＩ部位に挿入した。得られた プラスミドは８３２−７１．Ｂ１１である。ＤＮＡおよびアミノ酸配列を分析し 、３つの公表されている鳥類インターフェロンタイプＩ遺伝子、例えば、アヒル 、シチメンチョウおよびニワトリ間の重要な構造的遺伝モチーフの配列相同性お よび保存に基づき、ウズラ・インターフェロンタイプＩの完全なオープンレーデ ィ ングフレーム（配列番号３１および３２）であると決定された。ウズラＩＦＮ− １ ＯＲＦは、翻訳開始出発コドンＡＴＧおよびアンバー翻訳停止シグナルＴＡ Ｇを含めた、１９８アミノ酸をコードする５９４ヌクレオチドを含有する。該配 列は６個のシステイン残基を含有し、これは他の鳥類ＩＦＮタイプＩ遺伝子間で 保存されたモチーフである。該アミノ酸配列は３１個のアミノ酸疎水性シグナル 配列および２つの推定Ｎ−グリコシル化部位を含有する。ニワトリ、シチメンチ ョウおよびアヒルＩＦＮ−１と比較したウズラＩＦＮ−１の配列相同性（Ｊｏｔ ｕｎ Ｈｅｉｎ Ｍｅｔｈｏｄ，ＤＮＡＳＴＡＲ ＭｅｇＡｌｉｇｎ Ｐｒｏｇ ｒａｍ）は、各々、８２．０％、７６．０％および４９．０％である。タンパク 質疎水性Ｌｙｔｅ−Ｄｏｏｌｉｔｔｌｅプロットは、ウズラＩＦＮ−１タンパク 質構造および電荷特性がニワトリ、シチメンチョウおよびアヒルＩＦＮ−１と同 様であることを示す。ウズラＤＮＡを含有するプラスミドｐＳＹ８３２−７１． Ｂ１１は、特許手続目的の微生物の国際寄託に関するブダペスト条約に従い、Ａ ＴＣＣ受託番号９７８９２の下で、１９９７年２月２１日に、米国２０８５２メ リーランド州、ロックビル、パークローン・ドライブ１２３０１番のＡｍｅｒｉ ｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎに寄託された。 発現プラスミド８３２−７１．Ｂ１１はニワトリ、アヒル、ウズラ、シチメン チョウ、バンタム、ホロホロチョウその他のごとき鳥類種における鳥類病に対す るワクチンとして有用である。ウズラＩＦＮ−１は、鳥類ベクター単独または他 の鳥類病を引き起こす抗原と組み合わせて供すると、病気を引き起こす微生物に 対する免疫反応を改良する。発現プラスミド８３２−７１．Ｂ１１は鳥類種にお ける体重増加を改良するためのワクチンとして有用である。 例２３Ｃ アンチセンス・ウズラ・インターフェロン用の発現プラスミド：８６６−７９ ．２ ビシストロニック発現プラスミドｐＩＲＥＳｌｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｐ ａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）をクローニングベクターとして使用した。この発現カ セットはヒト・サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）主要前初期タンパク質／エンハ ンサー、続いて多重クローニング部位（ＭＣＳ）；合成イントロン；および脳心 筋炎ウイルス内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）、続いてネオマイシン ホスホトランスフェラーゼ遺伝子を下流のウシ成長ホルモンポリアデニル化シグ ナルと共に含有する。ウズラ・インターフェロンタイプＩのＤＮＡオープンリー ディングフレーム用のアンチセンスをＣＭＶプロモーターおよびｐＩＲＥＳｌｎ ｅｏの転写開始部位のＭＣＳ下流のユニークなＢａｍＨＩ部位に挿入した。ウズ ラ・インターフェロンタイプ１を含有する得られた発現ｐＩＲＥＳｌｎｅｏプラ スミドは８６６−７９．２であった。 アンチセンス・ウズラ・インターフェロンタイプ１プラスミド８６６−７９． ２で安定に形質転換された細胞系ＱＴ−３５ 安定に形質転換されたニワトリ細胞系はニワトリ・インターフェロンマウナイ 細胞系を作成するのに容易に入手できるので、ウズラＩＦＮ−１アンチセンス発 現プラスミドで形質転換されたＱＴ−３５細胞系を設計して、ＨＶＴのごとき鳥 類ウイルスの増殖用の新しい改良された細胞基質を作成した。該ＱＴ−３５は細 胞系を安定に形質転換し、ウズラ・インターフェロン・タイプ１に対するアンチ センスｃＤＮＡを発現するベクターを利用した。 ウズラＩＦＮ−１タイプ１用のアンチセンスＤＮＡおよび選択マーカー遺伝子 、ネオマイシンホスホトランスフェラーゼを含有するプラスミドでＱＴ−３５細 胞をトランスフェクトした。該ＤＮＡプラスミド８６６−７９．２をカルシウム およびＨＥＰＥＳ緩衝液の存在下で沈殿させ、ＱＴ−３５増殖培地と混合し、３ ９℃でＱＴ−３５細胞の単層と共にインキュベートした。５−６時間後、細胞を １５％グリセロールで３分間ショックを与え、ＰＢＳで洗浄し、増殖培地を供給 した。細胞に密集単層を形成せしめ、次いで、トリプシン処理し、密集下濃度に て６ｃｍディッシュ上に平板培養した。細胞がプラスチックに付着し、順応した 後、培地を４００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８を含有する増殖培地で置き換えた。Ｇ４ １８に対して耐性の細胞に、４００−８００μｇ／ｍｌのＧ４１８の存在下で２ −３週間、またはＧ４１８に耐性でない非トランスフェクトＱＴ−３５細胞が死 滅するまでコロニーを形成させ、１０ｃｍの培養皿上に平板培養した。クローン を継代培養し、要すれば、８００μｇ／ｍｌのＧ４１８を含有する培地中、１週 間に１回増殖させた。 ８００μｇ／ｍｌ Ｇ４１８の存在下で、その増殖安定性に基づいてＱＴ−３ ５クローンを選択した。Ｇ４１８耐性クローンおよび親ＱＴ−３５細胞からのゲ ノムＤＮＡのサザーンブロット分析を行った。ジコキシゲニンｄＵＴＰ（Ｂｏｅ ｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅｉｍ）で標識したネオマイシンホスホトランスフェ ラーゼＤＮＡプローブを用いて、ゲノムＤＮＡに安定に組み込まれた遺伝子構築 体の存在を同定した。Ｇ４１８に耐性でサザーンブロットによるネオマイシン遺 伝子につき陽性の細胞クローンは、染色体ゲノム細胞ＤＮＡに安定にクローン全 発現プラスミド８６６−７９．２を有すると考えられる。 ウズラＩＦＮ−１アンチセンス発現プラスミドで形質転換した改良されたＱＴ −３５細胞系は、ＨＶＴ、ＨＶＴ／ＭＤＶリワトリウイルスベクター、鶏痘ウイ ルス、アビポックスウイルスその他のウイルスのごとき鳥類ウイルスの生産で有 用である。鳥類ウイルスは、当該細胞系におけるインターフェロン生産の阻害の ため、改良されたＱＴ−３５細胞系において高力価まで増殖する。 Ｓ−ＳＰＶ−１２９ Ｓ−ＳＰＶ−１２９は、ＳＰＶ ＨｉｎｄＩＩＩ Ｍゲノム断片のＨｉｎｄＩ ＩＩないしＢｇｌＩＩサブ断片内の（ＯＩＬ ＯＲＦ内の）ユニークなＡｃｃＩ 部位に挿入された２つの遺伝子、ウズラ・インターフェロンタイプ１（ｇＩＦＮ −１）遺伝子およびｌａｃＺ遺伝子を含有する組換え豚痘ウイルスである。ｇＩ ＦＮ−１遺伝子は後期プロモーター２初期プロモーター２（ＬＰ２ＥＰ２）の制 御下にあり、ｌａｃＺ遺伝子は後期プロモーター１（ＬＰ１）の制御下にある。 Ｓ−ＳＰＶ−１２９は、ＥＳＫ−４細胞系におけるＳ−ＳＰＶ−００１および 相同性ベクター８４９０６９．Ａ１間にて「組換えＦＰＶおよびＳＰＶを生成さ せるための相同組換え手法」によって生成させた（ＷＯ９６／２２３６３参照） 。トランスフェクションショックは、「酵素マーカー遺伝子を発現する組換えＳ ＰＶのためのスクリーン」によってスクリーニングした。青色プラーク精製の最 終結果は、Ｓ−ＳＰＶ−１２９と命名された組換えウイルスであった。このウイ ルスを、材料および方法に記載したごとくに、青色プラークアッセイによってモ ニターした多重継体により、β−ガラクトシダーゼ発現、純度および挿入物安定 性につきアッセイした。精製の最初の３ラウンドの後、観察された全てのプラー ク は青色であり、これは該ウイルスが純粋で、安定であって、マーカー遺伝子を発 現することを示す。 ウズラＩＦＮ−１の生物学的活性を確認するために、Ｓ−ＳＰＶ−１２９を感 染させたＥＳＫ−４細胞からの上清を収集し、ＣＥＦ細胞の小胞口腔炎ウイルス （ＶＳＶ）インターフェロンを阻害するその能力につきテストした。 Ｓ−ＳＰＶ−１２９はニワトリ、アヒル、シチメンチョウ、バンタム、ホロホ ロチョウその他のごとき鳥類種において鳥類病に対するワクチンとして有用であ る。ウズラＩＦＮ−１は、単独または他の鳥類病を引き起こす抗原と組み合わせ て供すると、病気を引き起こす微生物に対して免疫応答を改良する。Ｓ−ＳＰＶ −１２９は鳥類種において体重増加を改良するワクチンとして有用である。 Ｓ−ＳＰＶ−１２９におけるまたはｐＩＲＥＳｌｎｅｏ（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ， Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ，ＣＡ）のごとき真核生物発現プラスミドにおけるウズラＩ ＦＮ−１の発現は、トランスジェニックニワトクまたは他の鳥類種を生成するた めにニワトクまたは他の鳥類種の生殖系に注入すると有用である。 例２４ 新規ニワトリ貧血ウイルス（ＣＡＶ）プロモーターをＨＭＣＶ前初期プロモー ターと比較する一過性発現アッセイ ニワトリ貧血ウイルス（ＣＡＶ）は、１つの主要オープンリーディングフレー ム（５１ｋｄａｌカプシド）およびいくつかのより小さいＯＲＦを含有する、２ ３００ヌクレオチドの一本鎖ＤＮＡウイルスである。ＣＡＶはニワトリのリンパ 芽球様細胞を感染し、１つの区別されるプロモーター領域からの２１００ヌクレ オチドＤＮＡ転写体を生産する（文献６７〜７２）。 β−ガラクトシダーゼを発現する４つの異なるＣＡＶプロモーター構築体を一 過性アッセイにおいて活性につきアッセイした。これらのプロモーター構築体は プラスミド８５０−２５．１８、８５０−６９．１、８５０−８０．２および８ 8３−１１．Ａ５であり、その全ては異なるＣＡＶプロモーターを使用して、β −ガラクトシダーゼの発現を駆動する。ＣＥＦおよび他の細胞系における多数の 一過性アッセを、これらの構築体およびＨＣＭＶ−ＩＥプロモーターを使用して β−ガラクトシダーゼを発現させるプラスミド３８８−６５．２で行った。 プラスミド８５０−２５．１８は、ＯＲＦ１および２用の最初の２つの転写開 始を通って、ＯＲＦ３、ＣＡＶカプシドタンパク質遺伝子用の転写開始まで延び るＣＡＶプロモーターの８５４ｂｐバージョンを含有する。このプロモーターは アポプチン遺伝子（ＯＲＦ２）用の機能的コーディング配列を含む。 プラスミド８６０−６９．１は、アポプチンリーディングフレーム内のＨｉｎ ｄＩＩＩ部位が満たされて、とりわけ３’末端近くのアポプチンリーディングフ レームを破壊する以外は、８５０−２５．１８と同様である新規ＣＡＶプロモー ターである。 プラスミド８８３−１１ Ａ５は、従前の２つのプロモーターと同一の上流部 位において開始するＣＡＶプロモーターを含有するが、３８１ｂｐ長に過ぎず、 ＯＲＦ１の転写開始まで延びる。 プラスミド８５０−８０．２は、８８３−１１．Ａ５と同様であるＣＡＶプロ モーター（配列番号２３）を含有するが、転写開始に対して−３位はヌクレオチ ドＴからＡに変更されており（配列番号２３のヌクレオチド３７７）、これはＫ ｏｚａｃによって他の真核生物プロモーターにつき記載されているごときコンセ ンサスリボソームエントリー部位により近い。 一過性トランスフェクションアッセイの結果は、ＣＡＶプロモータープラスミ ド８５０−８０．２が、高度に活性にＨＭＣＶ ＩＥプロモーターを含有する、 プラスミド３８８−６５．２で観察されたレベルに匹敵する高レベルのβ−ガラ クトシダーゼを発現することを示す。提案されたリボソームエントリー部位でＴ からＡのヌクレオチド変化を有するＣＡＶプロモータープラスミド８５０−８０ ．２は、ＣＡＶプロモータープラスミド８５０−２５．１８、８５０−６９．１ および８８３−１１．Ａ５よりも高い一過性レベルのβ−ガラクトシダーゼを発 現する（図６参照）。一過性トランスフェクションアッセイの結果は、ニワトリ 胚繊維芽細胞およびＱＴ−３５（ウズラ）細胞双方で観察される。プラスミド８ ５０−８０．２におけるＣＡＶプロモーターは、高レベルのウイルスもしくは細 菌抗原、サイトカイン、免疫調節タンパク質および細胞質もしくは細胞表面受容 体を発現するワクチンとして有用であり、それを組換えウイルスで使用される優 れたプロモーターとする。プラスミド８５０−８０．２におけるＣＡＶプロモー タ ーを用いて、組換えＳ−ＨＣＴ−１４８およびＳ−ＦＰＶ−１０６を作成する。 例２５ ニワトリ貧血ウイルスプロモーターからの外来性ＤＮＡを発現する組換えＨＶ Ｔおよび組換えＦＰＶ Ｓ−ＨＶＴ−１４８ Ｓ−ＨＶＴ−１４８はＨＶＴのユニークな長領域内のＥｃｏＲＩ＃９断片にお けるＸｈｏＩ部位に挿入されたイー・コリ β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有す るシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである。このプラスミドはニワトリ 貧血ウイルス（ＣＡＶ）プロモーターの制御下にあるＥ．ｃｏｌｉ β−ガラク トシダーゼ遺伝子を含有する。該ＣＡＶプロモーターはＣＡＶの最初のＯＲＦま でのＣＡＶプロモーター配列を含有する３８１ｂｐ断片であり、−３位はＴから Ａに変化している（配列番号２３のヌクレオチド３７７）。 Ｓ−ＨＶＴ−１４８は「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルス を生成させるための手法」に従って構築した。サブゲノムクローンおよび酵素の 以下の組合せを使用する：ＮｏｔＩと４０７−３２．２Ｃ３、ＮｏｔＩと４０７ −３２．５Ｇ６、ＢａｍＨＩと１７２−０７．ＢＡ２、ＢａｍＨＩと４１５−０ ９．ＢＡ１、ＮｏｔＩと６７２−０１．Ａ４０、ＮｏｔＩと６７２−０７．Ｃ４ ０、および未切断の相同ベクター８６７−９６．Ｂ９。ＨＶＴ−１４８は純粋な ウイルスであって、ＯＮＰＧおよび青色プラークアッセイによって証明されるご とくベーターガラクトシダーゼを発現する。 Ｓ−ＨＶＴ−１４８はマレック病に対する家禽におけるワクチンとして有用で ある。注目する他の外来性ＤＮＡは、家禽におけるワクチンとして使用されるＣ ＡＶプロモーターの制御下で挿入される。ＣＡＶプロモーターはＨＶＴ、キメラ ＨＶＴ／ＭＤＶウイルスワクチン、および他のヘルペスウイルスで有用であり、 病気を引き起こす微生物かせの外来性ＤＮＡを挿入すると、イヌ、ネコ、ウシ、 ブタ、ウマおよびヒト種においてワクチンとして有用である。 Ｓ−ＦＰＶ−１０６ Ｓ−ＦＰＶ−１０６は２．８ｋｂのＦＰＶゲノムＥｃｏＲＩ断片におけるユニ ークなＳｎａＢＩ部位（ＮｏｔＩ部位に変換されたもの）に挿入されたＥ．ｃｏ ｌｉ β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有する組換え鶏痘ウイルスである。Ｓ− ＦＰＶ−１０６は、新規ニワトリ貧血ウイルス（ＣＡＶ）プロモーターの制御下 にあるＥｃｏｌｉ β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有する。該ＣＡＶプロモー ターはＣＡＶの最初のＯＲＦまでのＣＡＶプロモーター配列を含有する３８１ｂ ｐ断片であり、−３位はＴからＡに変更されている（配列番号２３のヌクレオチ ド３７７）。 Ｓ−ＦＰＶ−１０６は、８８３−１０．Ａ１および相同性ベクターＳ−ＦＰＶ −００１間にて「組換えＦＰＶおよびＳＰＶを生成させるための相同組換え手法 」によって生成された（ＷＯ９４／１９０１５参照）。トランスフェクションシ ョックは、「酵素マーカー遺伝子を発現する組換えＳＰＶのためのスクリーン」 によってスクリーニングした。青色プラーク精製の最終結果は、Ｓ−ＦＰＶ−１ ０６と命名された組換えウイルスであった。このウイルスを、材料および方法に 記載したごとくに、青色プラークアッセイによってモニターした多重継代により 、β−ガラクトシダーゼ発現、純度および挿入安定性につきアッセイした。精製 の最初の３ラウンドの後、観察された全てのプラークは青色であり、これは該ウ イルスが純粋で、安定であって、マーカー遺伝子を発現することを示す。 Ｓ−ＦＰＶ−１０６は鶏痘病に対して家禽におけるワクチンとして有用である 。注目する他の外来性ＤＮＡば家禽においてワクチンとして使用するＣＡＶプロ モーターの制御下にて挿入される。該ＣＡＶプロモーターはＦＰＶ、豚痘ウイル ス、ラコーンポックスウイルスおよび他のポックスウイルスにおいてワクチンと して有用であり、病気を引き起こす微生物からの外来性ＤＮＡを挿入すると、イ ヌ、ネコ、ウシ、ブタ、ウマ、およびヒト種においてワクチンとして有用である 。 例２６ Ｓ−ＨＶＹ−１４８ Ｓ−ＨＶＹ−１４８は、マレック病ウイルスの短領域およびシチメンチョウ長 領域のヘルペスウイルスのキメラを含む組換えキメラウイルスである。Ｓ−ＨＶ Ｙ−１４８は、該キメラウイルスのユニーク長領域内のＥｃｏＲ１＃９断片中の ＸｈｏＩ部位に挿入されたニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）ヘマトグルチ ニン（ＨＮ）および融合（Ｆ）遺伝子からの外来性ＤＮＡを含む組換えキメラウ イルスである。該ＮＤＶ ＨＮ遺伝子はＰＲＶ ｇＸプロモーターの制御下にあ り、ＮＤＶ Ｆ遺伝子はＨＣＮＶ前初期プロモーターの制御下にある。それらの 各プロモーターの制御下にあるＮＤＶ ＨＮおよびＦ遺伝子は、隣接するＨＶＴ ゲノムＤＮＡにおいてＨＶＴ ＵＬ５２、ＵＬ５４およびＵＬ５５遺伝子とは反 対方向に転写される。 Ｓ−ＨＶＹ−１４８を生成させるために、「重複するサブゲノム断片から組換 えヘルペスウイルスを生成させるための手法」において、サブゲノムクローンお よび酵素の以下の組合せを使用した：ＮｏｔＩと４０７−３２．２Ｃ３、Ｂａｍ ＨＩと１７２−０７．ＢＡ２、ＮｏｔＩと４０７−３２．５Ｇ６、Ｓｆｉｌと８ ５４−３３．６、およびＮｏｔＩと７３９−２７．１６。 平板培養およびプラーク精製によってＳ−ＨＶＹ−１４８を精製し、ＢＬＡＣ Ｋ ＰＬＡＱＵＥ ＡＳＳＡＹ（黒色プラークアッセイ）によって純度につきテ ストした。Ｓ−ＨＶＹ−１４８は、抗−ＮＤＶ−Ｆモノクローナル抗血清（＃３ −１Ｇ５）および抗−ＮＤＶ−ＨＮモノクローナル抗血清を用いるＢＬＡＣＫ ＰＬＡＱＵＥ ＡＳＳＡＹ（黒色プラークアッセイ）によると１００％純度であ った。 ＮＤＶ ＨＮおよびＦ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳ−ＨＶＹ −１４８で感染させ、感染細胞溶解物の試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル 電気泳動に付した。該ゲルをブロットし、ＷＥＳＴＥＲＮ ＢＬＯＴＴＩＮＧ ＰＲＯＣＥＤＵＲＥ（ウェスタンブロッティング手法）を用いて分析した。ＮＤ ＶＨＮおよびＦに対する抗血清を用いて、ＮＤＶ ＨＶおよびＦタンパク質の発 現を検出した。Ｓ−ＨＶＹ−１４８感染細胞からの溶解物は、天然ＮＤＶ ＨＮ およびＦで予測されるサイズにおいてバンドを呈した。 組換えキメラウイルスワクチンＳ−ＨＶＹ−１４８はビルレントマレック病ウ イルスおよびニューキャッスル病ウイルスでの攻撃に対する保護で有用である。 組換えウイルスＳ−ＨＶＹ−１４８は、診断アッセイで、またはワクチンとして 組換えタンパク質ＮＤＶ ＨＮおよびＦの生産で有用である。 例２７ Ｓ−ＨＶＹ−１５４ Ｓ−ＨＶＹ−１５４は、マレック病ウイルスの短領域およびシチメンチョウ長 領域のヘルペスウイルスのキメラを含む組換えキメラウイルスである。Ｓ−ＨＶ Ｙ−１５４は、該キメラウイルスのユニーク長領域内のＥｃｏＲ１＃９断片中の ＸｈｏＩ部位に挿入されたニューキャッスル病ウイルス（ＮＤＶ）融合（Ｆ）遺 伝子およびＥ.ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子からの外来性ＤＮＡを含む組換えキメラ ウイルスである。該ＮＤＶ Ｆ遺伝子はＨＣＮＶ前初期プロモーターの制御下に あり、該Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子はＰＲＶ ｇＸプロモーターの制御下に ある。それらの各プロモーターの制御下にあるＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子お よびＮＤＶ Ｆ遺伝子は、隣接するＨＶＴゲノムＤＮＡにおいてＨＶＴ ＵＬ５ ２、ＵＬ５４およびＵＬ５５遺伝子とは反対方向に転写される。 Ｓ−ＨＶＹ−１５４はＳ−ＨＶＹ−１４５から誘導した。これは、初代ニワト リひな胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）細胞への「組換えウイルスを生成させるためのＤ ＮＡトランスフェクション」手法において相同性ベクター８９０−７７．１０お よびウイルスＳ−ＨＶＹ−１４５を用いて達成された。トランスフェクションス ショックから得られた魚色ウイルスは、「組換えヘルペスウイルス用のＣＰＲＧ スクローン」手法を用い、順次プラーク精製によって精製する。 ＮＤＶ ＨＮおよびＦ遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳ−ＨＶＹ −１５４で感染させ、感染細胞溶解物の試料をＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル 電気泳動に付した。該ゲルをブロットし、「ウェスタンブロッティング手法」を 用いて分析した。ＮＤＶ ＨＮおよびＦに対する抗血清を用いて、ＮＤＶ ＨＶ およびＦタンパク質の発現を検出した。Ｓ−ＨＶＹ−１５４感染細胞からの溶解 物は、天然ＮＤＶ ＨＮおよびＦで予測されるサイズにおいてバンドを呈した。 Ｓ−ＨＶＹ−１５４はビルレントマレック病ウイルスおよびニューキャッスル 病ウイルスでの攻撃に対するワクチンとして有用である。組換えウイルスＳ−Ｈ ＶＹ−１５４は、診断アッセイで、またはワクチンとして組換えタンパク質ＮＤ Ｖ Ｆの生産で有用である。 例２８ Ｓ−ＨＶＴ−１４９ Ｓ−ＨＶＴ−１４９は、ＨＶＴのユニーク長領域内のＥｃｏＲＩ９断片中のＸ ｈｏＩ部位に挿入された感染性ブルザ病ウイルス（ＩＢＤＶ）ＶＰ２遺伝子から の外来性ＤＮＡを含むシチメンチョウワクチンの組換えヘルペスウイルスである 。ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子はニワトリ貧血ウイルス（ＣＡＶ）プロモーターの制 御 下にある。ＣＡＶプロモーターの制御下にあるＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子は、隣接 するＨＶＴゲノムＤＮＡにおいてＨＶＴ ＵＬ５２、ＵＬ５４およびＵＬ５５遺 伝子と反対方向に転写される。 Ｓ−ＨＶＴ−１４９を生成させるために、「重複するサブゲノム断片から組換 えヘルペスウイルスを生成させるための手法」において、サブゲノムクローンお よび酵素の以下の組合せを使用した：ＮｏｔＩと４０７−３２．２Ｃ３、Ｂａｍ ＨＩと１７２−０７．ＢＡ２、ＮｏｔＩと４０７−３２．５Ｇ６、ＮｏｔＩと６ ７２−０１．Ｃ４０、ＮｏｔＩと９００−８７．Ｈ８、ＮｏｔＩと６７２−０１ ．Ａ４０およびＢａｍＨＩと４１５−０９．ＢＡ１。 平板培養およびプラーク精製によってＳ−ＨＶＹ−１４９を精製し、ＢＬＡＣ Ｋ ＰＬＡＱＵＥ ＡＳＳＡＹ（黒色プラークアッセイ）によって純度につきテ ストした。Ｓ−ＨＶＹ−１４９は、抗−ＩＢＤＶ抗血清を用いるＢＬＡＣＫ Ｐ ＬＡＱＵＥ ＡＳＳＡＹ（黒色プラークアッセイ）によると１００％純度であっ た。 ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子産物の発現を確認するために、細胞をＳ−ＨＶＴ−１ ４９で感染させ、感染細胞溶解物の試料をＳＤＳ−アクリルアミドゲル電気泳動 に付した。該ゲルをブロツトし、ＷＥＳＴＥＲＮ ＢＬＯＴＴＩＮＧ ＰＲＯＣ ＥＤＵＲＥ（ウェスタンブロッティング）手法を用いて分析した。ＩＢＤＶ Ｖ Ｐ２に対する抗血清を用いて、ＩＢＤＶ ＶＰ２タンパク質の発現を検出した。 Ｓ−ＨＶＴ−１４９感染細胞からの溶解物は天然ＩＢＤＶ ＶＰ２で予測される サイズにバンドを呈した。 組換えウイルスワクチンＳ−ＨＶＹ−１４９はマレック病ウイルスおよび感染 性ブルザ病気ウイルスでの攻撃に対する保護で有用である。組換えウイルスＳ− ＨＶＴ−１４９は、診断アッセイで、またはワクチンとして組換えタンパク質Ｉ ＢＤＶ ＶＰ２の生産で有用である。組換えウイルスＳ−ＨＶＴ−１４９は組換 えウイルスにおいて外来性ＤＮＡを発現するＣＡＶプロモーターの利用性を説明 する。 例２９ Ｓ−ＨＶＴ−１５４ Ｓ−ＨＶＴ−１４９は、ＨＶＴのユニーク長領域内のＥｃｏＲＩ＃９断片中の ＸｈｏＩ部位に挿入された感染性ブルザ病ウイルス（ＩＢＤＶ）ＶＰ２遺伝子か らの外来性ＤＮＡを含むシチメンチョウワクチンの組換えヘルペスウイルスであ る。ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子はニワトリ貧血ウイルス（ＣＡＶ）プロモーターの 制御下にある。ＣＡＶプロモーターの制御下にあるＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子は、 隣接するＨＶＴゲノムＤＮＡにおいてＨＶＴ ＵＬ５２、ＵＬ５４およびＵＬ５ ５遺伝子とは反対方向に転写される。 Ｓ−ＨＶＴ−１４９を生成させるために、「重複するサブゲノム断片から組換 えヘルペスウイルスを生成させるための手法」において、サブゲノムクローンお よび酵素の以下の組合せを使用した：ＮｏｔＩと４０７−３２．２Ｃ３、Ｂａｍ ＨＩと１７２−０７．ＢＡ２、ＮｏｔＩと４０７−３２．５Ｇ６、ＮｏｔＩと６ ７２−０１．Ｃ４０、ＮｏｔＩと９００−８７．Ｈ８、ＮｏｔＩと６７２−０１ ．Ａ４０およびＢａｍＨＩと４１５−０９．ＢＡ１。 平板培養およびプラーク精製によってＳ−ＨＶＹ−１４９を精製し、ＢＬＡＣ Ｋ ＰＬＡＱＵＥ ＡＳＳＡＹ（黒色プラークアッセイ）によって純度につきテ ストした。Ｓ−ＨＶＹ−１４９は、抗−ＩＢＤＶ抗血清を用いるＢＬＡＣＫ Ｐ ＬＡＱＵＥ ＡＳＳＡＹ（黒色プラークアッセイ）によると１００％純度であっ た。Ｓ−ＨＶＴ−１４９によって生産された組換えタンパク質ＩＢＤＶ ＶＰ２ はＷＥＳＴＥＲＮ ＢＬＯＴ ＡＳＳＡＹ（ウェスタンブロットアッセイ）によ って天然ＩＢＤＶ ＶＰ２とサイズが同様であることが示された。 平板培養およびプラーク精製によってＳ−ＨＶＹ−１５４を精製し、ＢＬＡＣ Ｋ ＰＬＡＱＵＥ ＡＳＳＡＹ（黒色プラークアッセイ）によって純度につきテ ストした。Ｓ−ＨＶＹ−１５４は、抗−ＩＢＤＶ抗血清を用いる「黒色プラーク アッセイ」によると１００％純度であった。 組換えウイルスワクチンＳ−ＨＶＹ−１５４はマレック病ウイルスおよび感染 性ブルザ病気ウイルスでの攻撃に対する保護で有用である。組換えウイルスＳ− ＨＶＹ−１５４は、診断アッセイで、またはワクチンとして組換えタンパク質Ｉ ＢＤＶ ＶＰ２の生産で有用である。組換えウイルスＳ−ＨＶＴ−１５４は組換 えウイルスにおいて外来性ＤＮＡを発現するＩＬＴＶ ｇＩプロモーターの利用 性を説明する。例３０ Ｓ−ＨＶＴ−１５５ Ｓ−ＨＶＴ−１５５は、ＨＶＴのユニーク長領域内のＥｃｏＲＩ＃９断片中の ＸｈｏＩ部位に挿入された感染性ブルザ病ウイルス（ＩＢＤＶ）ＶＰ２遺伝子か らの外来性ＤＮＡを含むシチメンチョウワクチンの組換えヘルペスウイルスであ る。ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子は感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）糖タンパ ク質Ｉ（ｇＩ）プロモーターの制御下にある。ＩＬＴＶ ｇＩプロモーターの制 御下にあるＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子は、隣接するＨＶＴゲノムＤＮＡにおいてＨ ＶＴ ＵＬ５２、ＵＬ５４およびＵＬ５５遺伝子と同一方向に転写される。 Ｓ−ＨＶＴ−１５５を生成させるために、「重複するサブゲノム断片から組換 えヘルペスウイルスを生成させるための手法」において、サブゲノムクローンお よび酵素の以下の組合せを使用した：ＮｏｔＩと４０７−３２．２Ｃ３、Ｂａｍ ＨＩと１７２−０７．ＢＡ２、ＮｏｔＩと４０７−３２．５Ｇ６、ＮｏｔＩとＩ −ＳｃｅＩと９４９−１９．２、およびＢａｍＨＩと４１５−０９．ＢＡ１。 平板培養およびプラーク精製によってＳ−ＨＶＹ−１５５を精製し、「黒色プ ラークアッセイ」によって純度につきテストした。Ｓ−ＨＶＹ−１５５は、抗− ＩＢＤＶ抗血清を用いる「黒色プラークアッセイ」によると１００％純度であっ た。 組換えウイルスワクチンＳ−ＨＶＴ−１５５はマレック病ウイルスおよび感染 性ブルザ病気ウイルスでの攻撃に対する保護で有用である。組換えウイルスＳ− ＨＶＴ−１５５は、診断アッセイで、またはワクチンとして組換えタンパク質Ｉ ＢＤＶ ＶＰ２の生産で有用である。組換えウイルスＳ−ＨＶＴ−１５５は組換 えウイルスにおいて外来性ＤＮＡを発現するＩＬＴＶ ｇＩプロモーターの利用 性を説明する。 例３１ Ｓ−ＨＶＴ−１５６ Ｓ−ＨＶＴ−１５６は、ＨＶＴのユニーク長領域内のＥｃｏＲＩ＃９断片中の ＸｈｏＩ部位に挿入された感染性ブルザ病ウイルス（ＩＢＤＶ）ＶＰ２遺伝子か らの外来性ＤＮＡを含むシチメンチョウワクチンの組換えヘルペスウイルスであ る。ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子は感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）糖タンパ ク質Ｄ（ｇＤ）プロモーターの制御下にある。ＩＬＴＶ ｇＤプロモーターの制 御下にあるＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子は、隣接するＨＶＴゲノムＤＮＡにおいてＨ ＶＴ ＵＬ５２、ＵＬ５４およびＵＬ５５遺伝子と反対方向に転写される。 Ｓ−ＨＶＴ−１５６を生成させるために、「重複するサブゲノム断片から組換 えヘルペスウイルスを生成させるための手法」において、サブゲノムクローンお よび酵素の以下の組合せを使用した：ＮｏｔＩと４０７−３２．２Ｃ３、Ｂａｍ ＨＩと１７２−０７．ＢＡ２、ＮｏｔＩと４０７−３２．５Ｇ６、Ｉ−ＳｃｅＩ と９４９−２４．Ｄ１、およびＢａｍＨＩと４１５−０９．ＢＡ１。 平板培養およびプラーク精製によってＳ−ＨＶＹ−１５６を精製し、ＢＬＡＣ Ｋ ＰＬＡＱＵＥ ＡＳＳＡＹ（黒色プラークアッセイ）によって純度につきテ ストした。Ｓ−ＨＶＹ−１５６は、抗−ＩＢＤＶ抗血清を用いる「黒色プラーク アッセイ」によると１００％純度であった。 組換えウイルスワクチンＳ−ＨＶＴ−１５６はマレック病ウイルスおよび感染 性ブルザ病気ウイルスでの攻撃に対する保護で有用である。組換えウイルスＳ− ＨＶＴ−１５６は、診断アッセイで、またはワクチンとして組換えタンパク質Ｉ ＢＤＶ ＶＰ２の生産で有用である。組換えウイルスＳ−ＨＶＴ−１５６は組換 えウイルスにおいて外来性ＤＮＡを発現するＩＬＴＶ ｇＤプロモーターの利用 性を説明する。 例３２ Ｓ−ＨＶＴ−１５９ Ｓ−ＨＶＴ−１５９は、マレック病ウイルス短領域およびシチメンチョウ長領 域のヘルペスウイルスのキメラを含む組換えキメラウイルスワクチンである。Ｓ −ＨＶＴ−１５９は、キメラウイルスのユニーク長領域内のＥｃｏＲＩ＃９断片 中のＸｈｏＩ部位に挿入された感染性ブルザ病ウイルス（ＩＢＤＶ）ＶＰ２遺伝 子からの外来性ＤＮＡを含む組換えキメラウイルスワクチンである。ＩＢＤＶＶ Ｐ２遺伝子は感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）糖タンパク質Ｉ（ｇＩ）プ ロモーターの制御下にあろ。ＩＬＴＶ ｇＩプロモーターの制御下にあるＩＢＤ Ｖ ＶＰ２遺伝子は、隣接するＨＶＴゲノムＤＮＡにおいてＨＶＴ ＵＬ５２、 ＵＬ５４およびＵＬ５５遺伝子と同一方向に転写される。 Ｓ−ＨＶＴ−１５９を生成させるために、「重複するサブゲノム断片から組換 えヘルペスウイルスを生成させるための手法」において、サブゲノムクローンお よび酵素の以下の組合せを使用した：ＮｏｔＩと４０７−３２．２Ｃ３、Ｂａｍ ＨＩと１７２−０７．ＢＡ２、ＮｏｔＩと４０７−３２．５Ｇ６、Ｉ−ＳｃｅＩ と９４９−１９．２、およびＮｏｔＩと９２８−４７．１。 平板培養およびプラーク精製によってＳ−ＨＶＴ−１５９を精製し、「黒色プ ラークアッセイ」によって純度につきテストした。Ｓ−ＨＶＴ−１５９は、抗− ＩＢＤＶ抗血清を用いる「黒色プラークアッセイ」によると１００％純度であっ た。 組換えウイルスワクチンＳ−ＨＶＴ−１５９はマレック病ウイルスおよび感染 性ブルザ病気ウイルスでの攻撃に対する保護で有用である。組換えウイルスＳ− ＨＶＴ−１５９は、診断アッセイで、またはワクチンとして組換えタンパク質Ｉ ＢＤＶ ＶＰ２の生産で有用である。組換えウイルスＳ−ＨＶＴ−１５９は組換 えウイルスにおいて外来性ＤＮＡを発現するＩＬＴＶ ｇＩプロモーターの利用 性を説明する。 例３３ Ｓ−ＨＶＴ−１６０ Ｓ−ＨＶＴ−１６０は、マレック病ウイルス短領域およびシチメンチョウ長領 域のヘルペスウイルスのキメラを含む組換えキメラウイルスワクチンである。Ｓ −ＨＶＴ−１６０は、キメラウイルスのユニーク長領域内のＥｃｏＲＩ＃９断片 中のＸｈｏＩ部位に挿入された感染性ブルザ病ウイルス（ＩＢＤＶ）ＶＰ２遺伝 子からの外来性ＤＮＡを含む組換えキメラウイルスワクチンである。ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子は感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）糖タンパク質Ｉ（ｇＩ） プロモーターの制御下にある。ＩＬＴＶ ｇＩプロモーターの制御下にあるＩＢ ＤＶ ＶＰ２遺伝子は、隣接するＨＶＴゲノムＤＮＡにおいてＨＶＴ ＵＬ５２ 、ＵＬ５４およびＵＬ５５遺伝子と反対方向に転写される。 Ｓ−ＨＶＴ−１６０を生成させるために、「重複するサブゲノム断片から組換 えヘルペスウイルスを生成させるための手法」において、サブゲノムクローンお よび酵素の以下の組合せを使用した：ＮｏｔＩと４０７−３２．２Ｃ３、Ｂａｍ ＨＩと１７２−０７．ＢＡ２、ＮｏｔＩと４０７−３２．５Ｇ６、Ｉ−ＳｃｅＩ と９４９−２４．１２、およびＮｏｔＩと９２８−４７．１。 平板培養およびプラーク精製によってＳ−ＨＶＴ−１６０を精製し、ＢＬＡＣ Ｋ ＰＬＡＱＵＥ ＡＳＳＡＹ（黒色プラークアッセイ）によって純度につきテ ストした。Ｓ−ＨＶＴ−１６０は、抗−ＩＢＤＶ抗血清を用いるＢＬＡＣＫ Ｐ ＬＡＱＵＥ ＡＳＳＡＹ（黒色プラークアッセイ）によると１００％純度であっ た。 組換えウイルスワクチンＳ−ＨＶＴ−１６０はマレック病ウイルスおよび感染 性ブルザ病気ウイルスでの攻撃に対する保護で有用である。組換えウイルスＳ− ＨＶＴ−１６０は、診断アッセイで、またはワクチンとして組換えタンパク質Ｉ ＢＤＶ ＶＰ２の生産で有用である。組換えウイルスＳ−ＨＶＴ−１６０は組換 えウイルスにおいて外来性ＤＮＡを発現するＩＬＴＶ ｇＩプロモーターの利用 性を説明する。 例３４ Ｓ−ＨＶＴ−１５０ Ｓ−ＨＶＴ−１５０は、ＨＶＴのユニーク長領域内のＥｃｏＲＩ＃９断片中の ＸｈｏＩ部位に挿入されたＥ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子からの外来性ＤＮＡを 含むシチメンチョウワクチンの組換えヘルペスウイルスである。Ｅ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は、感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）糖タンパク質Ｉ（ｇ Ｉ）プロモーターの制御下にある。ＩＬＴＶ ｇＩプロモーターの制御下にある ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子は、隣接するＨＶＴゲノムＤＮＡにおいてＨＶＴ ＵＬ ５２、ＵＬ５４およびＵＬ５５遺伝子と反対方向に転写される。 Ｓ−ＨＶＴ−１５０を生成させるために、「重複するサブゲノム断片から組換 えヘルペスウイルスを生成させるための手法」において、サブゲノムクローンお よび酵素の以下の組合せを使用した：ＮｏｔＩと４０７−３２．２Ｃ３、Ｂａｍ ＨＩと１７２−０７．ＢＡ２、ＮｏｔＩと４０７−３２．５Ｇ６、ＮｏｔＩと６ ７２−０７．Ｃ４０、ＮｏｔＩと９２８−５８．Ｊ２、ＮｏｔＩと６７２−０１ ．Ａ４０、およびＢａｍＨＩと４１５−０９．ＢＡ１。 平板培養およびプラーク精製によってＳ−ＨＶＴ−１５０を精製し、「黒色プ ラークアッセイ」によって純度につきテストした。Ｓ−ＨＶＴ−１５０は、抗− β−ガラクトシダーゼ抗血清を用いる「黒色プラークアッセイ」によると１００％ 純度であった。 組換えウイルスワクチンＳ−ＨＶＴ−１５０はマレック病ウイルスでの攻撃に 対する保護で有用である。組換えウイルスＳ−ＨＶＴ−１５０は、診断アッセイ で、またはワクチンとして有用である。組換えウイルスＳ−ＨＶＴ−１５０は組 換えウイルスにおいて外来性ＤＮＡを発現するＩＬＴＶ ｇＩプロモーターの利 用性を説明する。 例３５ Ｓ−ＨＶＴ−１５１ Ｓ−ＨＶＴ−１５１は、ＨＶＴのユニーク長領域内のＥｃｏＲＩ＃９断片中の ＸｈｏＩ部位に挿入されたＥｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子からの外来性ＤＮＡを含 むシチメンチョウワクチンの組換えヘルペスウイルスである。Ｅ．ｃｏｌｉ ｌ ａｃＺ遺伝子は、感染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）糖タンパク質Ｄ（ｇＤ ）プロモーターの制御下にある。ＩＬＴＶ ｇＤプロモーターの制御下にあるＥ ．ｃｏｌｉ ｌａｃＺ遺伝子は、隣接するＨＶＴゲノムＤＮＡにおいてＨＶＴ ＵＬ５２、ＵＬ５４およびＵＬ５５遺伝子と反対方向に転写される。 Ｓ−ＨＶＴ−１５１を生成させるために、「重複するサブゲノム断片から組換 えヘルペスウイルスを生成させるための手法」において、サブゲノムクローンお よび酵素の以下の組合せを使用した：ＮｏｔＩと４０７−３２．２Ｃ３、Ｂａｍ ＨＩと１７２−０７．ＢＡ２、ＮｏｔＩと４０７−３２．５Ｇ６、ＮｏｔＩと６ ７２−０７．Ｃ４０、ＮｏｔＩと９２８−５８．Ｋ７、ＮｏｔＩと６７２−０１ ．Ａ４０、およびＢａｍＨＩと４１５−０９．ＢＡ１。 平板培養およびプラーク精製によってＳ−ＨＶＴ−１５１を精製し、「黒色プ ラークアッセイ」によって純度につきテストした。Ｓ−ＨＶＴ−１５１は、抗− β−ガラクトシダーゼ抗血清を用いる「黒色プラークアッセイ」によると１００％ 純度であった。 組換えウイルスワクチンＳ−ＨＶＴ−１５１はマレック病ウイルスでの攻撃に 対する保護で有用である。組換えウイルスＳ−ＨＶＴ−１５１は、診断アッセイ で、またはワクチンとして有用である。組換えウイルスＳ−ＨＶＴ−１５１は組 換えウイルスにおいて外来性ＤＮＡを発現するＩＬＴＶ ｇＤプロモーターの利 用性を説明する。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１１年３月２６日（１９９９．３．２６） 【補正内容】 請求の範囲 １．シチメンチョウのヘルペスウイルスのユニークな長いウイルスゲノム領域 及びマレック病ウイルスのユニークな短いウイルスゲノム領域を有するシチメン チョウのヘルペスウイルス−マレック病ウイルス組換えキメラ。 ２．外来ＤＮＡ配列が、前記シチメンチョウのヘルペスウイルス−マレック病 ウイルスキメラウイルスゲノムの非必須領域内に挿入されており、宿主細胞にお いて発現可能である請求の範囲第１項のシチメンチョウのヘルペスウイルス−マ レック病ウイルス組換えキメラ。 ３．前記外来ＤＮＡ配列が、前記シチメンチョウのヘルペスウイルス−マレッ ク病ウイルスキメラウイルスゲノムのユニークな長い領域のＥｃｏＲＩ＃９領域 内に挿入されている請求の範囲第２項のシチメンチョウのヘルペスウイルス−マ レック病ウイルス組換えキメラ。 ４．前記外来ＤＮＡ配列が、ポリペプチドをコードする請求の範囲第２項のシ チメンチョウのヘルペスウイルス−マレック病ウイルス組換えキメラ。 ５．前記外来ＤＮＡ配列が、サイトカインをコードする請求の範囲第２項のシ チメンチヨウのヘルペスウイルス−マレック病ウイルス組換えキメラ。 ６．前記サイトカインが、ニワトリ骨髄単球性成長因子（ｃＭＧＦ）、ニワト リインターフェロン（ｃＩＦＮ）又は１型ウズラインターフェロン（ｑＩＦＮ） である請求の範囲第５項のシチメンチョウのヘルペスウイルス−マレック病ウイ ルス組換えキメラ。 ７．前記外来ＤＮＡ配列が、マレック病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス 、伝染性喉頭気管炎ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス及び染性ブルザ病ウイル スからなる群から選択される抗原性ポリペプチドをコードする請求の範囲第２項 のシチメンチョウのヘルペスウイルス−マレック病ウイルス組換えキメラ。 ８．前記ポリペプチドが、Ｅ．ｃｏｌｉベーターガラクトシダーゼである請求 の範囲第２項のシチメンチョウのヘルペスウイルス−マレック病ウイルス組換え キメラ。 ９．前記抗原性ポリペプチドが、マレック病ウイルス糖タンパク質Ａ（ｇＡ） 、マレック病ウイルス糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）又はマレック病ウイルス糖タンパ ク 質Ｄ（ｇＤ）である請求の範囲第７項のシチメンチョウのヘルペスウイルス−マ レック病ウイルス組換えキメラ。 10．前記抗原性ポリペプチドが、ニューカッスル病ウイルス融合タンパク質又 はニューカッスル病ウイルス血球凝集素ノイラミニダーゼである請求の範囲第７ のシチメンチョウのヘルペスウイルス−マレック病ウイルス組換えキメラ。 11．前記抗原性ポリペプチドが、伝染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパク質Ｂ（ ｇＢ）、伝染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパク質Ｉ（ｇＩ）又は糖タンパク質Ｄ （ｇＤ）である請求の範囲第７項のンチメンチョウのヘルペスウイルス−マレッ ク病ウイルス組換えキメラ。 12．前記抗原性ポリペプチドが、伝染性気管支炎ウイルススパイクタンパク質 又は伝染性気管支炎ウイルスマトリックスタンパク質である請求の範囲第７項の シチメンチョウのヘルペスウイルス−マレック病ウイルス組換えキメラ。 13．前記抗原性ポリペプチドが、伝染性ブルザ病ウイルスＶＰ２、伝染性ブル ザ病ウイルスＶＰ３又は伝染性ブルザ病ウイルスＶＰ４である請求の範囲第７項 のシチメンチョウのヘルペスウイルス−マレック病ウイルス組換えキメラ。 14．前記抗原性ポリペプチドが、鳥類脳脊髄炎ウイルス、鳥類レオウイルス、 鳥類パラミクソウイルス、鳥類インフルエンザウイルス、鳥類アデノウイルス、 鶏痘ウイルス、鳥類コロナウイルス、鳥類ロタウイルス、ニワトリ貧血ウイルス （因子）、サルモネラ属Ｅ．ｃｏｌｉ、パステウレラ属、ボルデテラ属、エイメ リア属、ヒストモナス属、トリコモナス属、家禽線虫、条虫、吸虫類及び鳥類ダ ニ／シラミ、鳥類原生動物からなる群から選択される請求の範囲第７項のシチメ ンチョウのヘルペスウイルス−マレック病ウイルス組換えキメラ。 15．前記外来ＤＮＡ配列が、内在性の上流ヘルペスウイルスプロモーターの制 御下にある請求の範囲第２項のンチメンチョウのヘルペスウイルス−マレック病 ウイルス組換えキメラ。 16．前記外来ＤＮＡが、異種の上流プロモーターの制御下にある請求の範囲第 ２項のシチメンチョウのヘルペスウイルス−マレック病ウイルス組換えキメラ。 17．前記プロモーターが、ニフトリ貧血ウイルスプロモーター、仮性狂犬病ウ イルスｇＸプロモーター、ヘルペス単純ウイルス−１アルファ４プロモーター、 ヒト・サイトメガロウイルス前初期プロモーター、マレック病ウイルスｇＡプロ モーター、ｇＢプロモーター、マレック病ウイルスｇＤプロモーター、伝染性喉 頭気管炎ｇＢプロモーター、ウシヘルペスウイルス−１．１ ＶＰ８プロモータ ー及び伝染性喉頭気管炎ｇＤプロモーターからなる群から選択される請求の範囲 第16項のシチメンチョウのヘルペスウイルス−マレック病ウイルス組換えキメラ 。 18．Ｓ−ＨＶＹ−１４９と命名されているシチメンチョウのヘルペスウイルス −マレック病ウイルス組換えキメラ。 19．Ｓ−ＨＶＹ−１５２と命名されているシチメンチョウのヘルペスウイルス −マレック病ウイルス組換えキメラ。 20．請求の範囲第２項のシチメンチョウのヘルペスウイルス−マレック病ウイ ルス組換えキメラを免疫化に有効な量及び好適な賦形剤を含むワクチン。 21．請求の範囲第２項のシチメンチョウのヘルペスウイルス−マレック病ウイ ルス組換えキメラを免疫化に有効な量及び好適な賦形剤を含む多価ワクチン。 22．請求の範囲第20項のワクチンを免疫化に有効な投与量を投与することを含 む鳥類病原体に対してトリを免疫化する方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｃ１２Ｒ 1:93） Ｃ１２Ｒ 1:93） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，ＫＥ，ＬＳ，Ｍ Ｗ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，Ｅ Ｓ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＧＷ，ＨＵ，ＩＤ ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ， ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，Ｍ Ｇ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ， ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，Ｖ Ｎ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 ウインスロウ、バーバラ・ジェイ アメリカ合衆国、カリフォルニア州 92014、デルマール、ストラトフォード・ コート・ナンバー７ 703

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．シチメンチョウのヘルペスウイルスのユニークな長いウイルスゲノム領域 及びマレック病ウイルスのユニークな短いウイルスゲノム領域を有するシチメン チョウのヘルペスウイルス−マレック病ウイルス組換えキメラ。 ２．外来ＤＮＡ配列が、前記シチメンチョウ−マレック病ウイルスキメラウイ ルスゲノムの非必須領域内に挿入されており、宿主細胞において発現可能である 請求の範囲第１項のシチメンチョウのヘルペスウイルス−マレック病ウイルス組 換えキメラ。 ３．前記外来ＤＮＡ配列が、前記シチメンチョウ−マレック病ウイルスキメラ ウイルスゲノムのユニークな長い領域のＥｃｏＲＩ＃９領域内に挿入されている 請求の範囲第２項のシチメンチョウのヘルペスウイルス−マレック病ウイルス組 換えキメラ。 ４．前記外来ＤＮＡ配列が、ポリペプチドをコードする請求の範囲第２項のシ チメンチョウのヘルペスウイルス−マレック病ウイルス組換えキメラ。 ５．前記外来ＤＮＡ配列が、サイトカインをコードする請求の範囲第２項のシ チメンチョウのヘルペスウイルス−マレック病ウイルス組換えキメラ。 ６．前記サイトカインが、ニワトリ骨髄単球性成長因子（ｃＭＧＦ）、ニワト リインターフェロン（ｃＩＦＮ）又はウズラインターフェロンタイプ１（ｑＩＦ Ｎ）である請求の範囲第４項のシチメンチョウのヘルペスウイルス−マレック病 ウイルス組換えキメラ。 ７．前記外来ＤＮＡ配列が、マレック病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス 、伝染性喉頭気管炎ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス及び染性ブルザ病ウイル スからなる群から選択される抗原性ポリペプチドをコードする請求の範囲第２項 のシチメンチョウのヘルペスウイルス−マレック病ウイルス組換えキメラ。 ８．前記ポリペプチドが、Ｅ．ｃｏｌｉβ−ガラクトシダーセである請求の範 囲第２項のシチメンチョウのヘルペスウイルス−マレック病ウイルス組換えキメ ラ。 ９．前記抗原性ポリペプチドが、マレック病ウイルス糖タンパク質Ａ（ｇＡ） 、マレック病ウイルス糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）又はマレック病ウイルス糖タンパ ク 質Ｄ（ｇＤ）である請求の範囲第７項のシチメンチョウのヘルペスウイルス−マ レック病ウイルス組換えキメラ。 10．前記抗原性ポリペプチドが、ニューカッスル病ウイルス融合タンパク質又 はニューカッスル病ウイルス血球凝集素ノイラミニダーゼである請求の範囲第７ のシチメンチョウのヘルペスウイルス−マレック病ウイルス組換えキメラ。 11．前記抗原性ポリペプチドが、伝染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパク質Ｂ（ ｇＢ）、伝染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパク質Ｉ（ｇＩ）又は糖タンパク質Ｄ （ｇＤ）である請求の範囲第７項のシチメンチョウのヘルペスウイルス−マレッ ク病ウイルス組換えキメラ。 12．前記抗原性ポリペプチドが、伝染性気管支炎ウイルススパイクタンパク質 又は伝染性気管支炎ウイルスマトリックスタンパク質である請求の範囲第７項の シチメンチョウのヘルペスウイルス−マレック病ウイルス組換えキメラ。 13．前記抗原性ポリペプチドが、伝染性ブルザ病ウイルスＶＰ２、伝染性ブル ザ病ウイルスＶＰ３又は伝染性ブルザ病ウイルスＶＰ４である請求の範囲第７項 のシチメンチョウのヘルペスウイルス−マレック病ウイルス組換えキメラ。 14．前記抗原性ポリペプチドが、鳥類脳脊髄炎ウイルス、鳥類レオウイルス、 鳥類パラミクソウイルス、鳥類インフルエンザウイルス、鳥類アデノウイルス、 鶏痘ウイルス、鳥類コロナウイルス、鳥類ロタウイルス、ニワトリ貧血ウイルス （因子）、サルモネラ属Ｅ．ｃｏｌｉ、パステウレラ属、ボルデテラ属、エイメ リア属、ヒストモナス属、トリコモナス属、家禽線虫、条虫、吸虫類及び鳥類ダ ニ／シラミ、鳥類原生動物からなる群から選択される請求の範囲第７項のシチメ ンチョウのヘルペスウイルス−マレック病ウイルス組換えキメラ。 15．前記外来ＤＮＡ配列が、内在性の上流ヘルペスウイルスプロモーターの制 御下にある請求の範囲第２項のシチメンチョウのヘルペスウイルス−マレック病 ウイルス組換えキメラ。 16．前記外来ＤＮＡが、異種の上流プロモーターの制御下にある請求の範囲第 ２項のシチメンチョウのヘルペスウイルス−マレック病ウイルス組換えキメラ。 17．前記プロモーターが、ニワトリ貧血ウイルス、ＰＲＶ ｇＸ、ＨＳＶ−１ アルファ４、ＨＣＭＶ前初期、ＭＤＶ ｇＡ、ＭＤＶ ｇＢ、ＭＤＶ ｇＤ、Ｉ ＬＴ ｇＢ、ＢＨＶ−１．１ ＶＰ８及びＩＬＴ ｇＤからなる群から選択され る請求の範囲第２項のシチメンチョウのヘルペスウイルス−マレック病ウイルス 組換えキメラ。 18．Ｓ−ＨＶＹ−１４９と命名されていろシチメンチョウのヘルペスウイルス −マレック病ウイルス組換えキメラ。 19．Ｓ−ＨＶＹ−１５２と命名されているシチメンチョウのヘルペスウイルス −マレック病ウイルス組換えキメラ。 20．請求の範囲第２項のシチメンチョウのヘルペスウイルス−マレック病ウイ ルス組換えキメラを免疫化に有効な量及び好適な賦形剤を含むワクチン。 21．請求の範囲第２項のシチメンチョウのヘルペスウイルス−マレック病ウイ ルス組換えキメラを免疫化に有効な量及び好適な賦形剤を含む多価ワクチン。 22．請求の範囲第20項のワクチンを免疫化に有効な投与量を投与することを含 む鳥類病原体に対してトリを免疫化する方法。