JP2020502161A - 鳥類の病原体の複数の抗原を発現する組換えｈｖｔベクターおよびそれを含むワクチン - Google Patents

Abstract

本発明は、鳥類病原体の抗原を含有し発現する組換え七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶＴ）ベクター、組換えＨＶＴベクターを含む組成物および組換えＨＶＴベクターを含む多価ワクチンを提供する。本発明は、様々な鳥類病原体に対するワクチン接種の方法および組換えＨＶＴベクターの生成方法をさらに提供する。

Description

関連出願への相互参照
本出願は、２０１６年１２月１４日に出願の米国特許仮出願第６２／４３３，８４２号への優先権を主張する。
本発明は、様々な病原体から保護するための安全な免疫化媒体として使用するための、外来遺伝子の挿入および発現のための組換えウイルスベクターに関する。それは、様々な病原体からの保護のための１つまたは複数の組換えウイルスベクターを含む多価の組成物またはワクチンにも関する。本発明は、組換えウイルスベクターを作製して、使用する方法に関する。

家禽の群れをニューカッスル病（ＮＤ）、感染性嚢症（ＩＢＤ）、マレック病（ＭＤ）、感染性気管支炎（ＩＢ）、感染性喉頭気管炎（ＩＬＴ）および鳥インフルエンザ（ＡＩ）を含む破壊的な疾患から保護するために、家禽ワクチン接種が広く使用されている。ＮＤは、パラミキソウイルス科に属するＮＤウイルス（ＮＤＶ）とも呼ばれる鳥類のパラミキソウイルス１型（ＡＰＭＶ−１）によって引き起こされる。ＭＤは、ＭＤウイルス血清型１（ＭＤＶ１）とも呼ばれるニワトリヘルペスウイルス２型（ヘルペスウイルス科）によって引き起こされる。ＩＢは、コロナウイルス科に属するＩＢウイルス（ＩＢＶ）によって引き起こされ、ＩＬＴは、ＩＬＴウイルス（ＩＬＴＶ）とも呼ばれるニワトリヘルペスウイルス１型（ヘルペスウイルス科）によって引き起こされ、ＡＩは、オルソミクソウイルス科に属するＡＩウイルス（ＡＩＶ）によって引き起こされる。

これらの鳥類病原体に対して鳥類をワクチン接種する目的で、いくつかの組換え鳥類ウイルスベクターが提案されている。使用されるウイルスベクターには、アビポックスウイルス、特に鶏痘（ＥＰ−Ａ−０，５１７，２９２）、マレックのウイルス、例えば血清型１、２および３（ＨＶＴ）（ＷＯ８７／０４４６３；ＷＯ２０１３／０８２３１７）、あるいはＩＴＬＶ、ＮＤＶおよび鳥アデノウイルスが含まれる。これらの組換え鳥類ウイルスベクターのいくつかがワクチン接種のために使用されたとき、それらは様々なレベルの保護を示す。

いくつかの組換え七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶＴ、メレアグリッドヘルペスウイルス１型またはＭＤＶ血清型３とも呼ばれる）、ＩＢＤＶ、ＮＤＶ、ＩＬＴＶおよびＡＩＶを含む様々な病原体に由来する抗原を発現するベクター（米国特許第５，９８０，９０６号、５，８５３，７３３号、６，１８３，７５３号、５，１８７，０８７号）が開発され、ライセンスを与えられている。特に関心があるのは、古典的なＩＢＤワクチンに勝る明らかな利点を示した、ＩＢＤＶ ＶＰ２保護遺伝子を発現するＨＶＴベクターである（Bublot et al J.Comp. Path.2007,Vol.137, S81-S84；米国特許第５，９８０，９０６号）。関心がある他のＨＶＴベクターは、ＮＤＶ（Morgan et al 1992, Avian dis. 36, 858-70；米国特許第６，８６６，８５２号；米国特許第５，６５０，１５３号）、ＩＬＴＶ（Johnson et al, 2010 Avian Dis 54, 1251-1259；米国特許第６，２９９，８８２号；米国特許第５，８５３，７３３号、欧州特許第１８０１２０４号）またはＮＤＶおよびＩＢＤＶ（米国特許第９，１１４，１０８号；ＷＯ２０１６１０２６４７、ＷＯ２０１３／０５７２３５、ＷＯ２０１５０３２９１０、ＷＯ２０１３１４４３５５）保護遺伝子を発現するものである。米国特許出願公開第２０１６／０１５８３４７号は、ＨＶＴベクターによって発現される抗原に対する免疫応答を増加させるための、オリゴデオキシヌクレオチドＴＬＲ２１アゴニストの使用を報告した。

いくつかのＨＶＴベースの組換えワクチンを一緒に使用することの実際上の問題点の１つは、それらの干渉である。異なる抗原を発現する２つのＨＶＴ組換えが混合されるとき、少なくとも疾患の１つからのより低い保護が誘導される（Rudolf Heine 2011; Issues of the Poultry Recombinant Viral Vector Vaccines which May Cause an Effect on the Economic Benefits of those Vaccines；the XVII World Veterinary Poultry Association (WVPA) Congress in Cancun, Mexico, August 14-18, 2011、で提出された論文；Slacum G, Hein R. and Lynch P., 2009, The compatibility of HVT recombinants with other Marek's disease vaccines, 58th Western Poultry Disease Conference, Sacramento, CA, USA, March 23^rd-25^th, p 84）。

獣医学的公衆衛生および経済に及ぼすＮＤＶおよびＩＢＤＶなどの動物病原体の潜在的影響を考慮すると、感染予防および動物保護の効率的な方法が必要である。組み合わされた有効なベクターワクチンのソルーション、および２つのＨＶＴベースのベクターワクチンの間で観察される干渉の問題を緩和できるワクチンを作製するための適する方法が必要とされている。

本発明は意外な結果を示した。組換えＨＶＴベクターを含む多価の組成物またはワクチンが、干渉なしで動物を様々な鳥類病原体から保護するのに有効だったのである。さらに、意外な結果が観察され、プロモーター／リンカー、コドン最適化遺伝子、ポリＡテールおよび挿入部位の様々な組合せがｉｎ ｖｉｖｏおよびｉｎ ｖｉｔｒｏで１つまたは複数の異種遺伝子の発現に異なるレベルの有効性および安定性を付与した。本発明は、複数の遺伝子を効率的に発現すること、および複数の挿入断片を有するＨＶＴベクターがより不安定であるという周知の問題点を克服することができる、安定したＨＶＴベクターを提供する。
本発明は、鳥類の病原体の少なくとも１つの抗原をコードし、発現する、１つ、２つまたはそれより多くの異種ポリヌクレオチドを含む組換えＨＶＴベクターに関する。
本発明は、鳥類の病原体の少なくとも１つの抗原をコードし、発現する、１つ、２つまたはそれより多くの異種ポリヌクレオチドを含む１つまたは複数の組換えＨＶＴベクターを含む組成物またはワクチンを提供する。
本発明は、動物にワクチン接種をする、または動物において免疫原性もしくは保護性の応答を誘導する方法であって、本発明の組成物またはベクターの少なくとも１回の投与を含む方法に関する。
例として与えられ、記載される具体的な実施形態に本発明を限定するものではない以下の詳細な記載は、参照により本明細書に組み込まれる付随する図と合わせて理解することができる。

各ＤＮＡおよびタンパク質配列に割り当てられる配列番号を示す表である。 ＨＶＴのゲノム構造およびその挿入部位を示す図である。 ｐＦＳＶ４０ＶＰ２プラスミドマップを示す図である。 ｖＨＶＴ３０９のためのプライマー結合部位の概略図である。 ｖＨＶＴ３０９のＰＣＲアイデンティティ結果を示す図である。 ｐＦＩＲＥＳＶＰ２プラスミドマップを示す図である。 ｖＨＶＴ３１０のためのプライマー結合部位の概略図である。 ｖＨＶＴ３１０のＰＣＲアイデンティティ結果を示す図である。 ｐＦＰ２ＡＶＰ２プラスミドマップを示す図である。 ｖＨＶＴ３１１のためのプライマー結合部位の概略図である。 ｖＨＶＴ３１１のＰＣＲアイデンティティ結果を示す図である。 ｐＶＰ２ＩＲＥＳｇＤプラスミドマップを示す図である。 ｖＨＶＴ３１７のためのプライマー結合部位の概略図である。 ｖＨＶＴ３１７のＰＣＲアイデンティティ結果を示す図である。 ｐＦｗｔＳＶ４０ＶＰ２プラスミドマップを示す図である。 ｖＨＶＴ３１３のためのプライマー結合部位の概略図である。 ｖＨＶＴ３１３のＰＣＲアイデンティティ結果を示す図である。 ｐＶＰ２ＩＲＥＳＦｗｔプラスミドマップを示す図である。 ｖＨＶＴ３１６のためのプライマー結合部位の概略図である。 ｖＨＶＴ３１６のＰＣＲアイデンティティ結果を示す図である。 ＤＮＡおよびタンパク質配列のアラインメントを示す図である。 ＤＮＡおよびタンパク質配列のアラインメントを示す図である。 ＤＮＡおよびタンパク質配列のアラインメントを示す図である。 ＤＮＡおよびタンパク質配列のアラインメントを示す図である。 ＨＶＴ ＵＳ２ＳＶｇＤｗｔｓｙｎプラスミドマップを示す図である。 ｐＨＶＴＩＧ１ｇＤＣａＦｏｐｔプラスミドマップを示す図である。 ｖＨＶＴ３０８のためのプライマー結合部位の概略図である。 ｖＨＶＴ３０８のＰＣＲアイデンティティ結果を示す図である。 ｐＦｗｔＩＲＥＳｇＤプラスミドマップを示す図である。 ｖＨＶＴ３２２のためのプライマー結合部位の概略図である。 ｖＨＶＴ３２２のＰＣＲアイデンティティ結果を示す図である。 ｐＨＶＴＵＳ２ＳＶｇＤｗｔｓｙｎプラスミドマップを示す図である。 ｖＨＶＴ４０６のためのプライマー結合部位の概略図である。 ｖＨＶＴ４０６のＰＣＲアイデンティティ結果を示す図である。

本発明はその具体的な実施形態に関連して記載されているが、それが、一般に本発明の原理に従って、ならびに本発明が関係する技術分野の範囲内の公知のまたは通常の慣行に含まれるような、および前記の本質的な特徴に適用され得るような、および添付の特許請求の範囲の通りの、本開示からの逸脱を含むさらなる改変が可能であること、および本出願が本発明のいかなる変形、使用または適応も包含するものであることが理解されよう。本発明は、適用法によって許可される最高程度まで、本明細書で提供される態様または請求項で列挙される対象発明の全ての改変および同等物を含む。

この開示では、特に請求項では、「含む」、「含まれる」、「含んでいる」などの用語は、米国特許法においてそれに帰される意味を有することができること；例えば、それらは、「含む」、「含まれる」および「含んでいる」を意味することができること；ならびに、「から本質的になっている」および「から本質的になる」などの用語は、米国特許法においてそれらに帰される意味を有すること、例えば、それらは明示的に列挙されていない要素を可能にするが、先行技術に見出されるかまたは本発明の基本的もしくは新規の特徴に影響する要素を排除することに注意する。

単数形の用語「ａ（１つの）」、「ａｎ（１つの）」および「ｔｈｅ（１つの）」は、文脈が明らかに別途指示しない限り、複数形の指示語を含む。同様に、単語「または」は、文脈が明らかに別途指示しない限り、「および」を含むものである。単語「または」は、特定のリストの任意の１メンバーを意味し、そのリストのメンバーの任意の組合せも含む。

様々な要素を記載するために本明細書において第１、第２、等の用語を使用することができるが、これらの要素はこれらの用語によって限定されるべきでないことも理解される。これらの用語は、１つの要素を別の要素と区別するために使用されるだけである。例えば、本発明の範囲を逸脱しない範囲で、第１のジェスチャーを第２のジェスチャーと呼ぶことができ、同様に、第２のジェスチャーを第１のジェスチャーと呼ぶことができる。本明細書に記載される全ての方法またはプロセスは、本明細書で特記されない限り、さもなければ文脈によって明らかに否定されない限り、任意の適する順序で実施することができる。

本明細書において、用語「動物」は、全ての哺乳動物、鳥類および魚類を含むべく使用される。本明細書で使用される動物は、ウマ類（例えば、ウマ）、イヌ類（例えば、イヌ、オオカミ、キツネ、コヨーテ、ジャッカル）、ネコ類（例えば、ライオン、トラ、イエネコ、野生のネコ、他の大きいネコ、ならびにチータおよびオオヤマネコを含む他のネコ）、ウシ類（例えば、ウシ）、ブタ類（例えば、ブタ）、ヒツジ類（例えば、ヒツジ、ヤギ、ラマ、野牛）、鳥類（例えば、ニワトリ、カモ、ガチョウ、七面鳥、ウズラ、キジ、オウム、フィンチ、タカ、カラス、ダチョウ、エミューおよびヒクイドリ）、霊長類（例えば、原猿、メガネザル、サル、テナガザル、類人猿）、ヒトおよび魚類からなる群から選択することができる。用語「動物」には、胚および胎児の段階を含む、発生の全ての段階の個体動物も含まれる。

本明細書で用いる用語「約」は、概ね、ほぼ、だいたい、または周辺を意味する。用語「約」が数値の範囲と一緒に使用されるとき、それは、示される数値の上下の境界を拡張することによってその範囲を変更する。一般に、本明細書において、用語「約」は明記される値の上下の数値を１０％の変動によって修飾するために使用される。一態様では、用語「約」は、それが使用される数の数値のプラスマイナス２０％を意味する。したがって、約５０％は、４５％〜５５％の範囲を意味する。エンドポイントによって本明細書に列挙される数値範囲は、その範囲の中に包含される全ての数および小数を含む（例えば、１〜５は、１、１．５、２、２．７５、３、３．９０、４および５を含む）。全ての数およびその小数は、用語「約」によって修飾されると推定されることも理解される。
用語「ポリペプチド」および「タンパク質」は本明細書で互換的に使用され、連続したアミノ酸残基のポリマーを指す。

用語「核酸」、「ヌクレオチド」および「ポリヌクレオチド」は互換的に使用され、ＲＮＡ、ＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはｃＲＮＡおよびその誘導体、例えば改変された主鎖を含有するものを指す。本発明は、本明細書に記載される配列に相補性の配列を含むポリヌクレオチドを提供することを認識するべきである。本発明で企図される「ポリヌクレオチド」は、フォワード鎖（５’から３’）およびリバース相補鎖（３’から５’）の両方を含む。本発明によるポリヌクレオチドは、異なる方法（例えば、化学合成によって、遺伝子クローニング等によって）で調製することができ、様々な形態（例えば、直鎖もしくは分枝状、一本鎖もしくは二本鎖、またはそのハイブリッド、プライマー、プローブ等）をとることができる。
用語「ゲノムＤＮＡ」または「ゲノム」は互換的に使用され、宿主生物体の遺伝性の遺伝情報を指す。ゲノムＤＮＡは、核のＤＮＡ（染色体ＤＮＡとも呼ばれる）だけでなく、プラスチド（例えば、クロロプラスト）および他の細胞性オルガネラ（例えば、ミトコンドリア）のＤＮＡも含む。本発明で企図されるゲノムＤＮＡまたはゲノムは、ウイルスのＲＮＡも指す。ＲＮＡは、正の鎖または負の鎖のＲＮＡであってよい。本発明において企図される用語「ゲノムＤＮＡ」は、本明細書に記載される配列に相補性の配列を含有するゲノムＤＮＡを含む。用語「ゲノムＤＮＡ」は、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、相補性ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）および相補性ＲＮＡ（ｃＲＮＡ）も指す。

用語「遺伝子」は、生物学的機能に関連したポリヌクレオチドの任意のセグメントを指すために、広義に使用される。したがって、遺伝子またはポリヌクレオチドは、ゲノム配列におけるようにイントロンおよびエクソンを、または開始コドン（メチオニンコドン）から開始し、終止シグナル（終止コドン）で終わる、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）などのｃＤＮＡにおけるコード配列だけを含む。遺伝子およびポリヌクレオチドは、転写開始、翻訳および転写終止などの、それらの発現を調節する領域を含むこともできる。したがって、プロモーターおよびリボソーム結合領域（一般的に、これらの調節エレメントはコード配列または遺伝子の開始コドンの概ね６０〜２５０ヌクレオチドの間の上流にある；Doree S M et al.；Pandher K et al.；Chung J Y et al.）、転写ターミネーター（一般的に、ターミネーターはコード配列または遺伝子の終止コドンの概ね５０ヌクレオチド下流の範囲内に位置する；Ward C K et al.）も含まれる。遺伝子またはポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡまたは機能的ＲＮＡを発現するか、または、調節配列を含む特異的タンパク質をコードする、核酸断片も指す。
本明細書で用いる用語「異種ＤＮＡ」は、異なる細胞型またはレシピエントと異なる種などの異なる生物体に由来するＤＮＡを指す。本用語は、その元の位置と異なるゲノムの領域に異種ＤＮＡが挿入されている、宿主ＤＮＡの同じゲノムの上のＤＮＡまたはその断片も指す。

本明細書で用いるように、用語「抗原」または「免疫原」は、宿主動物において特異的免疫応答を誘導する物質を意味する。抗原は、死滅した、弱毒化された、または生きている、完全な生物体；生物体のサブユニットまたは部分；免疫原特性を有する挿入断片を含有する組換えベクター；宿主動物に提示後に免疫応答を誘導することが可能なＤＮＡの一片または断片；ポリペプチド、エピトープ、ハプテンまたはその任意の組合せを含むことができる。あるいは、免疫原または抗原は、毒素または抗毒素を含むことができる。

本明細書で用いる用語「免疫原性タンパク質またはペプチド」は、宿主に投与されると、それがタンパク質に対して体液性および／または細胞型の免疫応答を呼び起こすことができるという点で、免疫学的に活性であるポリペプチドを含む。好ましくは、タンパク質断片は、それが全タンパクと実質的に同じ免疫学的活性を有するようなものである。したがって、本発明によるタンパク質断片は、少なくとも１つのエピトープまたは抗原決定基を含むか、それから本質的になるか、またはそれからなる。「免疫原性」タンパク質またはポリペプチドは、本明細書で用いるように、タンパク質の完全長配列、そのアナログまたはその免疫原性断片を含む。「免疫原性断片」は、１つまたは複数のエピトープを含み、したがって上記の免疫学的応答を導き出す、タンパク質の断片を意味する。そのような断片は、当技術分野で周知である任意の数のエピトープマッピング技術を使用して同定することができる。例えば、線状のエピトープは、例えば固体支持体の上で多数のペプチドを同時に合成することによって決定することができ、ペプチドはタンパク質分子の部分に対応し、ペプチドを抗体と反応させ、その間、ペプチドは支持体になお付着している。同様に、例えばＸ線結晶学および二次元核磁気共鳴によってアミノ酸の空間的立体配置を決定することによって、立体配置的エピトープは容易に同定される。

用語「免疫原性タンパク質またはペプチド」は、そのポリペプチドが本明細書に規定される免疫学的応答を引き起こす機能を果たす限り、その配列に対する欠失、付加および置換をさらに企図する。用語「保存的変更」は、コードされるアミノ酸残基が変化しないかまたは別の生物学的に類似の残基であるような、別の生物学的に類似した残基によるアミノ酸残基の置き換え、または核酸配列中のヌクレオチドの置き換えを表す。この点に関して、特に好ましい置換は、一般的に本質的に保存的である、すなわち、アミノ酸のファミリーの中で起こる置換である。例えば、アミノ酸は、一般的に４つのファミリーに分けられる：（１）酸性 − アスパラギン酸およびグルタミン酸；（２）塩基性 − リシン、アルギニン、ヒスチジン；（３）非極性 − アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、メチオニン、トリプトファン；ならびに（４）非荷電極性 − グリシン、アスパラギン、グルタミン、システイン、セリン、トレオニン、チロシン。フェニルアラニン、トリプトファンおよびチロシンは、芳香族アミノ酸に時には分類される。保存的変更の例には、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンなどの１つの疎水性残基の別の疎水性残基への置換、または１つの極性残基の別の極性残基への置換、例えば、アルギニンのリシンへの置換、グルタミン酸のアスパラギン酸への置換、またはグルタミンのアスパラギンへの置換など；または、生物活性に大きな影響を及ぼさない構造的に関連するアミノ酸によるアミノ酸の類似の保存的置き換えが含まれる。参照分子と実質的に同じアミノ酸配列を有するが、タンパク質の免疫原性に実質的に影響しない軽微なアミノ酸置換を有するタンパク質は、したがって、参照ポリペプチドの定義の範囲内にある。これらの改変によって生成されるポリペプチドの全ては、本明細書に含まれる。置換されたポリペプチドに対する抗体が未置換のポリペプチドとも免疫反応するならば、用語「保存的変更」は、未置換の親アミノ酸の代わりに置換されたアミノ酸の使用も含む。
用語「エピトープ」は、特異的Ｂ細胞および／またはＴ細胞が応答する抗原またはハプテンの上の部位を指す。本用語は、「抗原決定基」または「抗原決定基部位」と互換的にも使用される。同じエピトープを認識する抗体は、標的抗原への別の抗体の結合をブロックする１つの抗体の能力を示す、単純なイムノアッセイで同定することができる。

組成物またはワクチンへの「免疫学的応答」は、宿主における目的の組成物またはワクチンへの細胞性および／または抗体媒介性の免疫応答の発達である。通常、「免疫学的応答」は、以下の効果の１つまたは複数を含むがこれらに限定されない：目的の組成物またはワクチンに含まれる抗原（複数可）に特異的に向けられた抗体、Ｂ細胞、ヘルパーＴ細胞および／または細胞傷害性Ｔ細胞の生成。好ましくは、宿主は、新しい感染への抵抗性が強化されるように、および／または疾患の臨床重症度が低減されるように、治療的または保護的な免疫学的応答を示す。そのような保護は、感染宿主によって通常示される症状の低減もしくは減少、感染宿主におけるより速い回復時間および／またはウイルス力価の低下によって実証される。

用語「組換え」および「遺伝的改変」は互換的に使用され、その生来の形態もしくは構造のポリヌクレオチドもしくはタンパク質の任意の改変、変更もしくは操作、またはその生来の環境もしくは周囲におけるポリヌクレオチドもしくはタンパク質の任意の改変、変更もしくは操作を指す。ポリヌクレオチドまたはタンパク質の改変、変更または操作は、１つまたは複数のヌクレオチドまたはアミノ酸の欠失、遺伝子全体の欠失、遺伝子のコドン最適化、アミノ酸の保存的置換、１つまたは複数の異種ポリヌクレオチドの挿入を含むことができるが、これらに限定されない。

用語「多価のワクチンまたは組成物」、「組合せまたはコンボのワクチンまたは組成物」および「多価性のワクチンまたは組成物」は互換的に使用されて、１つより多い組成物またはワクチンを含有する組成物またはワクチンを指す。多価のワクチンまたは組成物は、２、３、４またはそれより多くの組成物またはワクチンを含有することができる。多価のワクチンまたは組成物は、組換えウイルスベクター、活性であるか弱毒化されたか死滅した野生株ウイルス、または組換えウイルスベクターと活性であるか弱毒化されたか死滅した形態の野生株ウイルスとの混合物を含むことができる。
本発明の一実施形態は、鳥類の病原体の少なくとも１つの抗原またはポリペプチドをコードし、発現する、１つ、２つまたはそれより多くの異種ポリヌクレオチドを含む組換えＨＶＴウイルスベクターを提供する。組換えウイルスベクターのために使用されるＨＶＴ株は、ＨＶＴ株ＦＣ１２６を含むがこれらに限定されない任意のＨＶＴ株であってよい（Igarashi T. et al., J. Gen. Virol. 70, 1789-1804, 1989）。

抗原またはポリペプチドをコードする遺伝子は、ニューカッスル病ウイルス融合タンパク質（ＮＤＶ−Ｆ）、ニューカッスル病ウイルス血球凝集素ノイラミニダーゼ（ＮＤＶ−ＨＮ）、マレック病ウイルス糖タンパク質Ｃ（ｇＣ）、マレック病ウイルス糖タンパク質Ｂ（ｇＢ）、マレック病ウイルス糖タンパク質Ｅ（ｇＥ）、マレック病ウイルス糖タンパク質Ｉ（ｇＩ）、マレック病ウイルス糖タンパク質Ｈ（ｇＨ）またはマレック病ウイルス糖タンパク質Ｌ（ｇＬ）、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）ＶＰ２、ＩＢＤＶ ＶＰＸ、ＩＢＤＶ ＶＰ３、ＩＢＤＶ ＶＰ４、ＩＬＴＶ糖タンパク質Ｂ、ＩＬＴＶ糖タンパク質Ｉ、ＩＬＴＶ ＵＬ３２、ＩＬＴＶ糖タンパク質Ｄ、ＩＬＴＶ糖タンパク質Ｅ、ＩＬＴＶ糖タンパク質Ｃ、インフルエンザ血球凝集素（ＨＡ）、インフルエンザノイラミニダーゼ（ＮＡ）、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ（ＭＧ）もしくはＭｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｙｎｏｖｉａｅ（ＭＳ）に由来する保護遺伝子、またはその組合せをコードするものであってよい。抗原またはポリペプチドは、鳥脳脊髄炎ウイルス、鳥レオウイルス、鳥パラミキソウイルス、鳥メタニューモウイルス、鳥インフルエンザウイルス、鳥アデノウイルス、鶏痘ウイルス、鳥コロナウイルス、鳥ロタウイルス、ひな貧血ウイルス、鳥アストロウイルス、鳥パルボウイルス、鳥レトロウイルス、鳥ピコルナウイルス、コクシジウム症（アイメリア属の種）、カンピロバクター属の種、サルモネラ属の種、パスツレラ属の種、アビバクテリウム属の種、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｙｎｏｖｉａｅ、クロストリジウム属の種およびＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉからなる群から選択される家禽病原体に由来する任意の抗原であってよい。

さらに、前記の抗原またはポリヌクレオチドのホモログは、本発明の範囲内にあるものである。本明細書で用いるように、用語「ホモログ」は、オルソログ、アナログおよびパラログを含む。用語「アナログ」は、同じかまたは類似の機能を有するが、無関係の生物体において別々に発生した２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。用語「オルソログ」は、異なる種に由来するが、種分化によって共通の先祖遺伝子から発生した２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。通常は、オルソログは、同じかまたは類似の機能を有するポリペプチドをコードする。用語「パラログ」は、ゲノムの中の複製によって関連している２つのポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。パラログは通常異なる機能を有するが、これらの機能は関連していることがあり得る。野生型ポリペプチドのアナログ、オルソログおよびパラログは、翻訳後修飾によって、アミノ酸配列の差によって、またはその両方によって、野生型ポリペプチドと異なることがあり得る。特に、本発明のホモログは、上記の抗原のポリヌクレオチドまたはポリペプチド配列の全部または一部と少なくとも８０〜８５％、８５〜９０％、９０〜９５％または９５％、９６％、９７％、９８％、９９％の配列同一性を一般的に示し、類似の機能を示す。

一実施形態では、本発明は、ＮＤＶ−Ｆ抗原もしくはポリペプチド、ＩＢＤＶ ＶＰ２抗原もしくはポリペプチド、ＩＬＴＶ ｇＤ抗原もしくはポリペプチド、またはその組合せをコードし、発現する、１つ、２つまたはそれより多くの異種ポリヌクレオチドを含む組換えＨＶＴウイルスベクターを提供する。この実施形態の１つの態様では、ＮＤＶ−Ｆ抗原またはポリペプチドは、配列番号５または２２に示す配列を有するポリペプチド、または、これらのポリペプチドの１つの少なくとも８または少なくとも１０個の連続アミノ酸を含む保存的な変種、対立遺伝子変種、ホモログもしくは免疫原性断片、またはこれらのポリペプチドの組合せと、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。この実施形態の別の態様では、異種ポリヌクレオチドは、配列番号５に示す配列を有するポリペプチドと、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するＮＤＶ−Ｆ抗原またはポリペプチドをコードする。この実施形態のさらに別の態様では、異種ポリヌクレオチドは、配列番号３、４または２１に示す配列を有するポリヌクレオチドと、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。

この実施形態の別の態様では、ＩＢＤＶ ＶＰ２抗原またはポリペプチドは、配列番号２に示す配列を有するポリペプチド、または、これらのポリペプチドの１つの少なくとも８または少なくとも１０個の連続アミノ酸を含む保存的な変種、対立遺伝子変種、ホモログもしくは免疫原性断片、またはこれらのポリペプチドの組合せと、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。この実施形態の別の態様では、異種ポリヌクレオチドは、配列番号２に示す配列を有するポリペプチドと、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するＩＢＤＶ ＶＰ２抗原またはポリペプチドをコードする。この実施形態のさらに別の態様では、異種ポリヌクレオチドは、配列番号１に示す配列を有するポリヌクレオチドと、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。

この実施形態の別の態様では、ＩＬＴＶ ｇＤ抗原またはポリペプチドは、配列番号１７に示す配列を有するポリペプチド、または、これらのポリペプチドの１つの少なくとも８または少なくとも１０個の連続アミノ酸を含む保存的な変種、対立遺伝子変種、ホモログもしくは免疫原性断片、またはこれらのポリペプチドの組合せと、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。この実施形態の別の態様では、異種ポリヌクレオチドは、配列番号１７に示す配列を有するポリペプチドと、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するＩＬＴＶ ｇＤ抗原またはポリペプチドをコードする。この実施形態のさらに別の態様では、異種ポリヌクレオチドは、配列番号１６に示す配列を有するポリヌクレオチドと、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。

変種は、対立遺伝子変種を含む。用語「対立遺伝子変種」は、タンパク質のアミノ酸配列における変化につながる、および天然の集団（例えば、ウイルスの種または変種）に存在する、多型を含有するポリヌクレオチドまたはポリペプチドを指す。そのような天然の対立遺伝子の変異は、ポリヌクレオチドまたはポリペプチドにおける１〜５％の変動を一般的にもたらすことができる。対立遺伝子変種は、いくつかの異なる種における目的の核酸配列を配列決定することによって同定することができ、それは、それらの種における同じ遺伝子の遺伝子座を同定するためにハイブリダイゼーションプローブを使用することによって容易に実行することができる。あらゆるそのような核酸変動、および結果として生じる、天然の対立遺伝子の変動の結果であり、目的の遺伝子の機能的活性を変更しないアミノ酸の多型または変動は、本発明の範囲内にあるものである。

配列に関する用語「同一性」は、例えば、２つの配列のより短い方におけるヌクレオチドまたはアミノ酸の数で割った同一のヌクレオチドまたはアミノ酸を有する位置の数を指すことができ、ここで、２つの配列のアラインメントは、ウィルバーおよびリップマンのアルゴリズム（ウィルバーおよびリップマン）により決定することができる。２つのアミノ酸配列の配列同一性もしくは配列類似性、または２つのヌクレオチド配列の間の配列同一性は、Ｖｅｃｔｏｒ ＮＴＩソフトウェアパッケージ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、１６００ Ｆａｒａｄａｙ Ａｖｅ．、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して決定することができる。ＲＮＡ配列がＤＮＡ配列と類似しているか、またはある程度の配列同一性もしくは相同性を有すると言われるとき、ＤＮＡ配列の中のチミジン（Ｔ）はＲＮＡ配列の中のウラシル（Ｕ）と同等であるとみなされる。したがって、ＲＮＡ配列は本発明の範囲内にあり、ＤＮＡ配列中のチミジン（Ｔ）をＲＮＡ配列中のウラシル（Ｕ）と等価であるとみなすことによって、ＤＮＡ配列から派生させることができる。

本開示のポリヌクレオチドは、遺伝子コード、例えば、特異的宿主のための最適化されたコドン利用の結果として縮重している配列を含む。本明細書で用いるように、「最適化された」は、所与の種におけるその発現を増加させるために遺伝子操作されているポリヌクレオチドを指す。ＮＤＶ−Ｆ、ＩＢＤＶ ＶＰ２またはＩＬＴＶ ｇＤポリペプチドをコードする最適化されたポリヌクレオチドを提供するために、これらの遺伝子のＤＮＡ配列は、１）特定の種における高度発現遺伝子によって好まれるコドンを含むように；２）前記種において実質的に見出されるものとなるようなヌクレオチド塩基組成におけるＡ＋ＴまたはＧ＋Ｃ含有量を含むように；３）前記種の開始配列を形成するように；または４）ＲＮＡの不安定化、不適当なポリアデニル化、分解および終止を引き起こす配列、または二次構造ヘアピンもしくはＲＮＡスプライス部位を形成する配列を排除するように改変することができる。前記種におけるＮＤＶ Ｆ、ＩＢＤＶ ＶＰ２またはＩＬＴＶ ｇＤタンパク質の発現の増加は、真核生物および原核生物における、または特定の種におけるコドン利用の分布頻度を利用することによって達成することができる。用語「好ましいコドン利用の頻度」は、所与のアミノ酸を指定するためのヌクレオチドコドンの利用において特異的宿主細胞によって示される優先度を指す。２０個の天然アミノ酸があり、そのほとんどは１つを超えるコドンによって指定される。したがって、ヌクレオチド配列によってコードされるＮＤＶ−Ｆ、ＩＢＤＶ ＶＰ２またはＩＬＴＶ ｇＤポリペプチドのアミノ酸配列が機能的に変更されない限り、全ての縮重ヌクレオチド配列が本開示に含まれる。

組換え／改変された感染性ウイルスによる異種ポリヌクレオチドの発現の成功は、２つの条件を必要とする。１番目に、異種ポリヌクレオチドは、改変されたウイルスが生存可能なままであるように、ウイルスゲノムの領域に挿入または導入されなければならない。挿入される異種ポリヌクレオチドの発現のための第２の条件は、ウイルスバックグラウンドにおける遺伝子の発現を可能にする調節配列の存在である（例えば：プロモーター、エンハンサー、ドナーおよびアクセプタースプライシング部位およびイントロン、コザック翻訳開始コンセンサス配列、ポリアデニル化シグナル、非翻訳配列エレメント）。

挿入部位はＨＶＴゲノムの任意の非必須領域であってよく、ＯＲＦ ＵＬ５５の終止コドンと隣接した反復配列領域とのＵＬの接合部の間の領域（遺伝子間領域１、ＩＧ１遺伝子座、米国特許第５，９８０，９０６号）、ＩＧ２（遺伝子間領域２）遺伝子座、ＩＧ３（遺伝子間領域３）遺伝子座、ＵＬ４３遺伝子座、ＵＳ１０遺伝子座、ＵＳ２遺伝子座、ＳＯＲＦ３／ＵＳ２遺伝子座（図２を参照する）が含まれるが、これらに限定されない。

一般に、真核生物の細胞において機能的である強力なプロモーターを用いることが有利である。プロモーターには、前初期の（ＩＥ）ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）（ｈＣＭＶ）プロモーター、マウスＣＭＶ（ｍＣＭＶ）ＩＥプロモーター、モルモットＣＭＶ（ｇｐＣＭＶ）ＩＥプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、糖タンパク質Ｘプロモーターのそれなどの仮性狂犬病ウイルスプロモーター、アルファ４プロモーターなどの単純ヘルペスウイルス−１、糖タンパク質ｇＣ、ｇＢ、ｇＥまたはｇＩ発現を促進するそれらなどのマレック病ウイルス（ＭＤＶ−１、ＭＤＶ−２およびＨＶＴを含む）プロモーター、ＨＨＶ３ｇＢプロモーター（ヒトヘルペスウイルス３型糖タンパク質Ｂプロモーター）、糖タンパク質ｇＢ、ｇＥ、ｇＩ、ｇＤ、ｇＣ遺伝子のそれらなどの伝染性喉頭気管炎ウイルスプロモーター、または他のヘルペスウイルスプロモーターが含まれるが、これらに限定されない。

本発明の一実施形態は、ＩＢＤＶ ＶＰ２抗原またはポリペプチドをコードし発現する第１の異種ポリヌクレオチド、およびＮＤＶ−Ｆ抗原またはポリペプチドをコードし発現する第２のポリヌクレオチドを含む組換えＨＶＴベクターを提供する。この実施形態の１つの態様では、ＮＤＶ−Ｆ抗原またはポリペプチドは、配列番号５に示す配列を有するポリペプチドと、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。この実施形態の別の態様では、ＩＢＤＶ ＶＰ２抗原またはポリペプチドは、配列番号２に示す配列を有するポリペプチドと、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。別の態様では、ＮＤＶ−Ｆポリペプチドをコードするポリヌクレオチドは、配列番号７に示す配列を有するＳＶ４０プロモーターに作動可能に連結しており、ＮＤＶ−Ｆ抗原またはポリペプチドの発現はＳＶ４０プロモーターによって調節される。さらに別の態様では、ＮＤＶ−Ｆ抗原またはポリペプチドの発現は、配列番号８に示す配列を有するＳＶ４０ポリＡシグナル、または配列番号９に示す配列を有する合成ポリＡシグナルによって調節される。別の態様では、ＩＢＤＶ ＶＰ２抗原またはポリペプチドの発現は、配列番号６に示す配列を有するｍＣＭＶ−ＩＥプロモーターおよび配列番号８に示す配列を有するＳＶ４０ポリＡシグナル、または配列番号９に示す配列を有する合成ポリＡシグナルによって調節される。

本発明の別の実施形態は、ＩＢＤＶ ＶＰ２抗原またはポリペプチドをコードし発現する第１の異種ポリヌクレオチド、およびＮＤＶ−Ｆ抗原またはポリペプチドをコードし発現する第２のポリヌクレオチドを含み、第２のポリヌクレオチドの発現を調節する配列をさらに含む組換えＨＶＴベクターを提供する。調節配列またはリンカーは、リボソーム内部進入部位（ＩＲＥＳ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）に由来するＲＮＡ配列、または自己切断性のブタのテッショウウイルス−１ ２Ａもしくは口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）ペプチド（Ｐ２Ａ）をコードする配列であってよい。

この実施形態の１つの態様では、組換えＨＶＴベクターは、ＩＢＤＶ ＶＰ２抗原をコードする第１のポリヌクレオチドおよびＮＤＶ−Ｆ抗原をコードする第２のポリヌクレオチドを含み、配列番号１０に示す配列を有するＩＲＥＳをさらに含む。この実施形態の別の態様では、組換えＨＶＴは、ＩＢＤＶ ＶＰ２抗原をコードする第１のポリヌクレオチドおよびＮＤＶ−Ｆ抗原をコードする第２のポリヌクレオチドを含み、配列番号１１に示す配列を有するポリヌクレオチドをコードするＰ２Ａをさらに含む。

本発明の一実施形態は、ＮＤＶ Ｆ抗原またはポリペプチドをコードし発現する第１の異種ポリヌクレオチド、およびＩＬＴＶ ｇＤ抗原またはポリペプチドをコードし発現する第２のポリヌクレオチド、を含み、第２のポリヌクレオチドの発現を調節する配列をさらに含む組換えＨＶＴベクターを提供する。調節配列またはリンカーは、リボソーム内部進入部位（ＩＲＥＳ）、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）に由来するＲＮＡ配列、または自己切断性のブタのテッショウウイルス−１２Ａもしくは口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）ペプチド（Ｐ２Ａ）をコードする配列であってよい。この実施形態の１つの態様では、ＩＬＴＶ ｇＤ抗原またはポリペプチドは、配列番号１７に示す配列を有するポリペプチドと、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。この実施形態の別の態様では、ＮＤＶ Ｆ抗原またはポリペプチドは、配列番号５または２２に示す配列を有するポリペプチドと、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。この実施形態のさらに別の態様では、組換えＨＶＴベクターは、ＮＤＶ Ｆ抗原をコードする第１のポリヌクレオチドおよびＩＬＴＶ ｇＤ抗原をコードする第２のポリヌクレオチドを含み、配列番号１０に示す配列を有するＩＲＥＳをさらに含む。

本発明の別の実施形態は、ＮＤＶ Ｆ抗原またはポリペプチドをコードし発現する第１の異種ポリヌクレオチド、およびＩＬＴＶ ｇＤ抗原またはポリペプチドをコードし発現する第２のポリヌクレオチドを含む組換えＨＶＴベクターを提供する。この実施形態の１つの態様では、ＩＬＴＶ ｇＤ抗原またはポリペプチドは、配列番号１７に示す配列を有するポリペプチドと、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。この実施形態の別の態様では、ＮＤＶ Ｆ抗原またはポリペプチドは、配列番号５または２２に示す配列を有するポリペプチドと、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。一態様では、ＮＤＶ ＦポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはＳＶ４０プロモーターに作動可能に連結しており、ＮＤＶ Ｆ抗原またはポリペプチドの発現はＳＶ４０プロモーターによって調節される。別の態様では、ＩＬＴＶ ｇＤポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはＨＨＶ３ｇＢプロモーターに作動可能に連結しており、ＩＬＴＶ ｇＤ抗原またはポリペプチドの発現はＨＨＶ３ｇＢプロモーターによって調節される。さらに別の態様では、ＨＨＶ３ｇＢプロモーターは、リバース方向である。さらに別の態様では、ＮＤＶ Ｆ抗原およびＩＬＴＶ ｇＤ抗原の発現はＳＶ４０プロモーターおよびリバースＨＨＶ３ｇＢプロモーターによって調節されるので、反対方向である。

本発明の別の実施形態は、ＩＢＤＶ ＶＰ２抗原またはポリペプチドをコードし発現する第１の異種ポリヌクレオチド、およびＩＬＴＶ ｇＤ抗原またはポリペプチドをコードし、発現する第２のポリヌクレオチドを含む組換えＨＶＴベクターを提供する。この実施形態の１つの態様では、ＩＬＴＶ ｇＤ抗原またはポリペプチドは、配列番号１７に示す配列を有するポリペプチドと、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。この実施形態の別の態様では、ＩＢＤＶ ＶＰ２抗原またはポリペプチドは、配列番号２に示す配列を有するポリペプチドと、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。この実施形態のさらに別の態様では、組換えＨＶＴベクターは、ＩＢＤＶ ＶＰ２抗原をコードする第１のポリヌクレオチドおよびＩＬＴＶ ｇＤ抗原をコードする第２のポリヌクレオチドを含み、配列番号１０に示す配列を有するＩＲＥＳをさらに含む。

本発明の別の実施形態は、ＩＬＴＶ ｇＤ抗原またはポリペプチドをコードし発現する異種ポリヌクレオチドを含む組換えＨＶＴベクターを提供する。この実施形態の１つの態様では、ＩＬＴＶ ｇＤ抗原またはポリペプチドは、配列番号１７に示す配列を有するポリペプチドと、少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有する。本実施形態の別の態様では、ＩＬＴＶ ｇＤポリペプチドをコードするポリヌクレオチドはＳＶ４０プロモーターに作動可能に連結し、ＩＬＴＶ ｇＤ抗原またはポリペプチドの発現はＳＶ４０プロモーターによって調節される。
一実施形態では、ＩＢＤＶ ＶＰ２抗原、および／またはＮＤＶ−Ｆ抗原、および／またはＩＬＴＶ ｇＤ抗原をコードするポリヌクレオチドは、ＨＶＴゲノムのＩＧ１、ＩＧ２、ＵＳ１０、ＵＳ２、ＳＯＲＦ３−ＵＳ２およびｇＤからなる群から選択される１つまたは複数の遺伝子座領域に挿入することができる。別の実施形態では、ＩＢＤＶ ＶＰ２抗原、および／またはＮＤＶ−Ｆ抗原、および／またはＩＬＴＶ ｇＤ抗原をコードするポリヌクレオチドは、ＨＶＴゲノムの同じ遺伝子座、例えばＩＧ１に挿入される。

一実施形態では、本発明は、本発明の１つまたは複数の組換えＨＶＴベクター、および薬学的または獣医学的に許容される担体、賦形剤、ビヒクルまたはアジュバントを含む医薬組成物またはワクチンに関する。ＨＶＴベクターは２つの異種ポリヌクレオチドを含むことができ、ここで、第１のポリヌクレオチドは、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）ＶＰ２抗原、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）抗原およびニューカッスル病ウイルスＦ（ＮＤＶ−Ｆ）抗原からなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、第２のポリヌクレオチドは、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）ＶＰ２抗原、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）抗原およびニューカッスル病ウイルスＦ（ＮＤＶ−Ｆ）抗原からなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む。

別の実施形態では、本発明は、ｉ）ＩＢＤＶ ＶＰ２抗原またはＮＤＶ−Ｆ抗原をコードし、発現する第１の異種ポリヌクレオチド；ｉｉ）ＮＤＶ−Ｆ抗原またはＩＢＤＶ ＶＰ２抗原をコードし、発現する第２のポリヌクレオチド；およびｉｉｉ）任意選択で、薬学的にまたは獣医学的に許容される担体、賦形剤、ビヒクルまたはアジュバントを含むＨＶＴウイルスベクターを含む組成物またはワクチンを提供する。さらに別の実施形態では、本発明は、ｉ）ＩＢＤＶ ＶＰ２抗原またはＩＬＴＶ ｇＤ抗原をコードし発現する第１の異種ポリヌクレオチド；ｉｉ）ＩＬＴＶ ｇＤ抗原またはＩＢＤＶ ＶＰ２抗原をコードし発現する第２のポリヌクレオチド；およびｉｉｉ）任意選択で、薬学的にまたは獣医学的に許容される担体、賦形剤、ビヒクルまたはアジュバントを含むＨＶＴウイルスベクターを含む組成物またはワクチンを提供する。さらに別の実施形態では、本発明は、ｉ）ＮＤＶ−Ｆ抗原またはＩＬＴＶ ｇＤ抗原をコードし、発現する第１の異種ポリヌクレオチド；ｉｉ）ＩＬＴＶ ｇＤ抗原またはＮＤＶ−Ｆ抗原をコードし、発現する第２のポリヌクレオチド；およびｉｉｉ）任意選択で、薬学的にまたは獣医学的に許容される担体、賦形剤、ビヒクルまたはアジュバントを含むＨＶＴウイルスベクターを含む組成物またはワクチンを提供する。さらに別の実施形態では、本発明は、ＩＬＴＶ ｇＤ抗原をコードし、発現する異種ポリヌクレオチド、および任意選択で、薬学的にまたは獣医学的に許容される担体、賦形剤、ビヒクルまたはアジュバントを含む、ＨＶＴウイルスベクターを含む組成物またはワクチンを提供する。さらに別の実施形態では、本発明は、配列番号１、３、４、１２、１３、１４、１５、１６、１８、１９、２０、２１、２５、２６または２７に示す配列を有するポリヌクレオチドと少なくとも７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９６％、９７％、９８％または９９％の配列同一性を有するポリヌクレオチドを含むＨＶＴを含む組成物またはワクチンを提供する。一実施形態では、１つの遺伝子座における２つまたはそれより多くの異種ポリヌクレオチドの挿入が、複数の遺伝子座における挿入より優れた保護および効能を付与することが示される。別の実施形態では、ＩＲＥＳまたはＰ２Ａを通して単一のｍＲＮＡから１つより多い異種ポリヌクレオチドを発現することが、鳥類の疾患に対してより優れた保護および効能を提供することが示される。さらに別の実施形態では、本発明によって提供される実験データは、ＩＲＥＳエレメントを含む構築物がＰ２Ａエレメントを含む構築物より優れた保護を提供したことを開示する。

薬学的にまたは獣医学的に許容される担体またはアジュバントまたはビヒクルまたは賦形剤は、当業者に周知である。例えば、薬学的にまたは獣医学的に許容される担体またはアジュバントまたはビヒクルまたは賦形剤は、ＭＤワクチンのために使用されるマレック病ワクチン希釈剤であってよい。本発明の方法のために使用することができる他の薬学的または獣医学的に許容される担体またはアジュバントまたはビヒクルまたは賦形剤には、０．９％ＮａＣｌ（例えば、生理食塩水）溶液またはリン酸緩衝液、ポリ（Ｌ−グルタミン酸）、乳酸加リンゲル液希釈剤（塩化ナトリウム、乳酸ナトリウム、塩化カリウムおよび塩化カルシウム）またはポリビニルピロリドンが含まれるがこれらに限定されない。薬学的または獣医学的に許容される担体またはビヒクルまたはアジュバントまたは賦形剤は、ベクター（または、ｉｎ ｖｉｔｒｏで発明のベクターから発現されるタンパク質）の投与を促進するか、またはトランスフェクションもしくは感染を促進する、および／またはベクター（または、タンパク質）の保存を向上させる任意の化合物または化合物の組合せであってよい。本明細書において、用量および投与量は一般的な記載として議論され、当分野の知識と合わせて読まれるこの開示から、当業者はいかなる過度の実験も行わずに決定することもできる。

他の化合物、例えば、ミョウバン；ＣｐＧオリゴヌクレオチド（ＯＤＮ）、特にＯＤＮ ２００６、２００７、２０５９または２１３５（Pontarollo R.A. et al., Vet. Immunol. Immunopath, 2002, 84: 43-59；Wernette C.M. et al., Vet. Immunol. Immunopath, 2002, 84: 223-236；Mutwiri G. et al., Vet. Immunol. Immunopath, 2003, 91: 89-103）；ポリＡ−ポリＵ、ジメチルジオクタデシルアンモニウムブロミド（ＤＤＡ）（"Vaccine Design The Subunit and Adjuvant Approach", edited by Michael F. Powell and Mark J. Newman, Pharmaceutical Biotechnology, 6: p.03, p.157）；Ｎ，Ｎ−ジオクタデシル−Ｎ’，Ｎ’−ビス（２−ヒドロキシエチル）プロパンジアミン（ＡＶＲＩＤＩＮＥ（登録商標）など）（同書、p.148）；カルボマー、キトサン（米国特許出願第５，９８０，９１２号を参照）（これらに限定されない）を薬学的または獣医学的に許容される担体またはアジュバントまたはビヒクルまたは賦形剤として加えてもよい。

本発明による医薬組成物およびワクチンは、１つまたは複数のアジュバントを含むことができるかまたはそれから本質的になることができる。本発明の実施で使用するのに適するアジュバントは、（１）アクリルまたはメタクリル酸のポリマー、無水マレイン酸およびアルケニル誘導体ポリマー、（２）免疫刺激性の配列（ＩＳＳ）、例えば１つまたは複数の非メチル化ＣｐＧ単位を有するオリゴデオキシリボヌクレオチド配列（Klinman et al., 1996；ＷＯ９８／１６２４７）、（３）水中油型エマルジョン、例えば"Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" published by M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995の１４７頁に記載されるＳＰＴエマルジョン、および同じ論文の１８３頁に記載されるエマルジョンＭＦ５９、（４）四級アンモニウム塩、例えばＤＤＡを含有するカチオン脂質、（５）サイトカイン、（６）水酸化アルミニウムまたはリン酸アルミニウム、（７）サポニン、または（８）本出願の中に参照により引用され、組み込まれる任意の文書で議論される他のアジュバント、または（９）その任意の組合せまたは混合物である。

一実施形態では、アジュバントは、ＴＳ６、ＴＳ７、ＴＳ８およびＴＳ９（米国特許第７，３７１，３９５号）、ＬＲ２、ＬＲ３およびＬＲ４（米国特許第７，６９１，３６８号）、ＴＳＡＰ（米国特許出願公開第２０１１０１２９４９４号）、ＴＲＩＧＥＮ（商標）（Ｎｅｗｐｏｒｔ Ｌａｂｓ）、合成ｄｓＲＮＡ（例えば、ポリ−ＩＣ、ポリ−ＩＣＬＣ［ＨＩＬＴＯＮＯＬ（登録商標）］）、ならびにＭＯＮＴＡＮＩＤＥ（商標）アジュバント（Ｗ／Ｏ、Ｗ／Ｏ／Ｗ、Ｏ／Ｗ、ＩＭＳおよびゲル；全てＳＥＰＰＩＣによって生成される）を含むことができる。
別の実施形態では、本発明は、標的細胞における組換えＨＶＴベクターの送達のための、ワクチンまたは組成物の治療的有効量の投与を可能にする。治療的有効量の決定は、当業者にとってルーチンの実験である。

本発明の別の態様は、１つまたは複数の抗原に対する免疫学的応答を動物において誘導するか、または１つまたは複数の鳥類の病原体に対する保護応答を動物において誘導するための方法であって、本発明のワクチンまたは医薬組成物で少なくとも１回動物を接種することを含む方法に関する。本発明のさらに別の態様は、少なくとも１つの共通のポリペプチド、抗原、エピトープまたは免疫原を使用する、少なくとも１回の最初の投与および少なくとも１回の追加免疫投与で構成される初回刺激−追加免疫投与レジメンにおいて、１つまたは複数の抗原に対する免疫学的応答を動物において誘導するか、または１つまたは複数の鳥類の病原体に対する保護応答を動物において誘導するための方法に関する。最初の投与で使用される免疫学的組成物またはワクチンは、追加免疫として使用されるものと本質的に同じであっても、異なってもよい。

鳥類の病原体は、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（すなわち、ＩＢＤＶまたはガムボロ病ウイルス）、マレック病ウイルス（ＭＤＶ）、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）、鳥脳脊髄炎ウイルス、鳥レオウイルス、鳥パラミキソウイルス、鳥メタニューモウイルス、鳥インフルエンザウイルス、鳥アデノウイルス、鶏痘ウイルス、鳥コロナウイルス、鳥ロタウイルス、鳥パルボウイルス、鳥アストロウイルスおよびひな貧血ウイルスコクシジウム症（アイメリア属の種）、カンピロバクター属の種、サルモネラ属の種、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｙｎｏｖｉａｅ、パスツレラ属の種、アビバクテリウム属の種、Ｅ．ｃｏｌｉまたはクロストリジウム属の種であってよい。
通常、鳥におけるワクチンの１回の投与は、１日齢に皮下か筋肉内の経路により、または１７〜１９日齢の胚にｉｎ ｏｖｏにより実行される。第２の投与は、第１の投与の後の０〜３０日以内に実行することができる。
１日齢ひなにおいては、様々な投与経路、例えば皮下、または筋肉内、皮内、経皮を使用することができる。ｉｎ ｏｖｏワクチン接種は、羊膜腔および／または胚において実行することができる。市販されているｉｎ ｏｖｏおよびＳＣ投与デバイスをワクチン接種のために使用することができる。

組成物またはワクチンは、ウイルスベクター、プラスミドまたはバキュロウイルスからｉｎ ｖｉｔｒｏまたはｉｎ ｖｉｖｏで生成される、約１０²〜約１０²⁰、約１０³〜約１０¹⁸、約１０⁴〜約１０¹⁶、約１０⁵〜約１０¹²のＶＬＰ（ウイルス様粒子）の用量を含有することができる。ウイルスベクターは、ＦＦＡ（フォーカス形成アッセイ）またはＦＦＵ（フォーカス形成単位）、ＴＣＩＤ₅₀（５０％組織培養感染用量）、ＰＦＵ（プラーク形成単位）およびＦＡＩＤ₅₀（５０％蛍光抗体感染用量）を限定されずに含む、任意のウイルス滴定法に基づいて滴定することができ、ｉｎ ｖｉｔｒｏで生成されるＶＬＰは、血球凝集アッセイ、ＥＬＩＳＡおよび電子顕微鏡法によって滴定することができる。ＶＬＰのタイプによって、他の方法も適用可能である。
組成物またはワクチンは、約１０^2.0〜約１０^7.0のＴＣＩＤ₅₀またはＰＦＵ／用量、約１０^2.0〜約１０^7.0のＴＣＩＤ₅₀またはＰＦＵ／用量、および約１０^2.0〜約１０^6.5のＴＣＩＤ₅₀またはＰＦＵ／用量を含有することができる。
投与量は、約０．０１〜約１０ｍｌ、約０．０１〜約５ｍｌの間であってよい。
本発明は、以下の非限定的な例によってここからさらに記載される。

ＤＮＡ挿入断片、プラスミドおよび組換えウイルスベクターの構築は、J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 2014)によって記載された標準の分子生物学技術を使用して実行された。

（例１）
２つの遺伝子を発現する組換えＨＶＴベクターの構築
（例１．１）
ＩＢＤＶ−ＶＰ２およびＮＤＶ−Ｆを発現する組換えｖＨＶＴ３０９の構築
本研究の目的は、マウスサイトメガロウイルスプロモーター（ｍＣＭＶ）、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスのウイルスタンパク質２（ＶＰ２）をコードする遺伝子、シミアンウイルス４０ポリＡテール（ＳＶ４０ポリＡ）、シミアンウイルス４０プロモーター（ＳＶ４０プロモーター）、ニューカッスル病ウイルス融合タンパク質（ＮＤＶ−Ｆ）をコードする遺伝子および合成ポリＡテール（ｓｙｎポリＡテール）を含有する発現カセットが遺伝子間部位１（ＩＧ１）に組み込まれている、組換えＨＶＴを構築することである。

構築物において使用される親ウイルスは、ｖＨＶＴ１３（ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子を発現するＨＶＴベクター、ＭｅｒｉａｌのＶＡＸＸＩＴＥＫ（登録商標）（ＨＶＴ＋ＩＢＤ）ワクチンの有効成分、米国特許第５，９８０，９０６号の中のｖＨＶＴ１７としても知られる）である。ｖＨＶＴ１３ベクターは、ＩＧ１挿入部位に挿入されているｍＣＭＶ ＩＥプロモーター（配列番号６）、ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子（配列番号２をコードする配列番号１）およびＳＶ４０ポリＡテール（配列番号８）で構成される発現カセットを含有する。遺伝子型ＶＩＩｄ配列に対応するニューカッスル病ウイルス融合タンパク質（ＮＤＶ−Ｆ）を化学合成し、コドン最適化した（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）。この合成遺伝子のＦタンパク質切断部位は、長潜伏期性Ｆ切断部位配列に一致するように変更し、結果として生じたＮＤＶ−Ｆ遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（ＡＹ３３７４６４）に寄託したＮＤＶ−Ｆ配列と９９％のアミノ酸配列同一性を有する。ＩＢＤ−ＶＰ２のためにマウスＣＭＶ ＩＥプロモーターを使用し、ＮＤＶ−ＦのためにＳＶ４０プロモーターを使用した。挿入遺伝子座は、ＨＶＴの中の遺伝子間部位１（ＩＧ１）である（図２）。ドナープラスミドｐＦＳＶ４０ＶＰ２（ＶＰ２／ＳＶ４０ポリＡおよびＩＧ１＋ＳＶ４０プロモーター＋ＮＤＶ−Ｆ＋合成ポリＡの隣接腕を含有する挿入プラスミド）を、下記のように構築した。ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えのために使用した。

ドナープラスミド構築
ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子（配列番号２をコードする配列番号１）、ＳＶ４０ポリＡテール（配列番号８）、ＳＶ４０プロモーター（配列番号７）、ＮＤＶ−Ｆ遺伝子（配列番号５をコードする配列番号３）および合成ポリＡテール（配列番号９）を含有するｐＵＣ５７の中の合成ＤＮＡは、ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔによって合成した（図３）。Ｔｏｐ１０ Ｏｎｅｓｈｏｔキット（カタログ番号Ｃ４０４００２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してプラスミドｐＦＳＶ４０ＶＰ２を形質転換し、大規模培養物を増殖させ、Ｑｉａｇｅｎｓ Ｍａｘｉ Ｐｒｅｐキットを使用してプラスミド抽出を実行した。ｍａｘｉ ｐｒｅｐの一時的発現は、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）のＦｕｇｅｎｅトランスフェクション試薬およびＮＤＶに対するニワトリのポリクローナル血清を使用して検証した。

組換え体の生成
標準の相同組換え手順の後に、ｐＦＳＶ４０ＶＰ２プラスミドおよびｖＨＶＴ１３ワクチンから単離されたウイルスＤＮＡを使用した二次ＣＥＦ細胞の共エレクトロポレーションが続いた。共エレクトロポレーションは、３００μｌのＯｐｔｉ−ＭＥＭ中の１×１０⁷の２°ＣＥＦを使用して実行し、２ｍｍエレクトロポレーションキュベットの中で９５０キャパシタンスにより１５０ボルトで衝撃を与えた。トランスフェクションした細胞は９６ウェルプレートに播種し、４日間インキュベートした。９６ウェルプレートで増殖させた細胞は、次に２つの９６ウェルプレートに複製し、さらに３日間インキュベートした。組換え体を含有する陽性ウェルを同定するためにＮＤＶ−Ｆに対するニワトリポリクローナル血清を使用したＩＦＡのために１セットの９６ウェルプレートを使用し、陽性ウェルから感染細胞を回収するために別のセットの９６ウェルプレートを使用した。

９６ウェルプレート複製および最も多くのＩＦＡ陽性プラークを含有してＩＦＡ陰性プラークの量が最少であるウェルのＩＦＡ選択によって、組換えウイルス精製方法を先ず実行した。それらの基準にマッチしているウェルを次に採取し、ＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ中の１ｍｌに調整した。１ｍｌ保存液から５〜２０μｌを取り出し、１０ｍｌのＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳ中の１×１０⁷個のＣＥＦと混合し、１ウェルにつき単一のウイルスプラークを有するように新しい９６ウェルプレートに小分けした。５日間のインキュベーションの後に９６ウェルプレートを複製し、プラークを含有するウェルを二重組換えの存在およびｖＨＶＴ１３親ウイルスの不在についてＩＦＡおよびＰＣＲにより試験した。再び、ＰＣＲバンド形成結果を比較することによって、より多くの組換えウイルスを有するようであったウェルを採取し、１ｍｌに調整し、新しい９６ウェルプレートに小分けした。ウイルス感染細胞の２回の精製の後、ＮＤＶ−Ｆタンパク質を発現する組換えウイルスを単離し、組換えウイルスの純度をＩＦＡおよびＰＣＲによって試験して親ウイルスの不在を確認した。

ＰＣＲによる組換え体の分析
フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈殿によって保存液ウイルスからＤＮＡを抽出し、２０ｍＭのＨＥＰＥＳに再懸濁させた。ＰＣＲプライマー（表１）は、ＩＢＤＶ−ＶＰ２およびＮＤＶ−Ｆ ＶＩＩｄ遺伝子、プロモーター、ポリＡ、ならびにＶａｘｘｉｔｅｋ親ウイルスに由来する組換えウイルスの純度を特異的に同定するように設計された。プライマー結合部位の位置は図４に示す。２００μｇのＤＮＡ鋳型を表１に示す指定されたプライマー対と一緒に使用して、ＰＣＲを実行した。ＰＣＲサイクル条件は以下の通りである：９４℃−２分間；９４℃−３０秒間、６０℃−４５秒間、６８℃−３分間を３０サイクル（ＭＢ０８０＋ＭＢ０８１プライマーセットの場合５分間）；６８℃−５分間（ＭＢ０８０＋ＭＢ０８１プライマーセットの場合７分間）。

発現分析
免疫蛍光試験のために、組換え材料を培地の中に１：１００で希釈した。希釈したウイルスの概ね５０μｌを、２×１０⁷個のＣＥＦを含む２０ｍｌのＤＭＥＭ＋２％ＦＢＳに加え、次に２つの９６ウェルプレートに小分けした（１００μｌ／ウェル）。ウイルスのプラークが視認可能になるまで、プレートは３７℃＋５％ＣＯ₂で４日間インキュベートした。プレートを９５％の氷冷アセトンで３分間固定し、１０分間風乾させ、水で３回洗浄した。プレート番号１について、二重免疫蛍光染色を、１：５００のニューカッスル病ウイルスに対するニワトリ抗血清（ＮＤＶ Ｐａｂ）（ロット番号Ｃ０１１７Ａ、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）および１：３０００のＨＶＴ Ｌ７８モノクローナル抗体（ＨＶＴ Ｍａｂ）（Lee et al. 1983, J. Immunol. 130 (2) 1003-6；Ｍｅｒｉａｌバッチ）を使用して実行し、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。プレート番号２について、二重免疫蛍光を、１：５００の伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスに対するニワトリ抗血清（ＩＢＤＶ Ｐａｂ）（ロット番号Ｇ０１１７、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒｓ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）および１：３０００のＨＶＴ Ｌ７８モノクローナル抗体（ＨＶＴ Ｍａｂ）（Ｍｅｒｉａｌ）を使用して実行し、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。１時間のインキュベーションの後に、プレートをＰＢＳで３回洗浄した。プレート番号１および番号２に対して、１：５００のＦＩＴＣ標識抗ニワトリＩｇＧ（カタログ番号Ｆ８８８８、Ｓｉｇｍａ）および１：３００のＴＲＩＴＣ標識Ａｌｅｘ Ｆｌｕｏｒロバ抗マウス（カタログ番号Ａ１００３７、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を加えた。再び、プレートを３７℃で１時間インキュベートした。１時間のインキュベーションの後、細胞をＰＢＳで３回すすぎ、フルオレセインイソチオシアネート（ＦＩＴＣ）フィルターおよびテトラメチルローダミンイソチオシアネート（ＴＲＩＴＣ）フィルターを使用して蛍光顕微鏡で可視化した。
結果
ドナープラスミドｐＦＳＶ４０ＶＰ２のヌクレオチドおよびアミノ酸配列には、図１に示す配列番号を割り当てる。

組換え体生成および発現分析
相同組換え技術を使用して組換え体を生成するために、ｖＨＶＴ１３ウイルスのゲノムＤＮＡをｐＦＳＶ４０ＶＰ２ドナープラスミドと一緒に共エレクトロポレーションした。
複数回のプラーク精製における免疫蛍光陽性ウェル選択およびＰＣＲスクリーニングによって、組換えウイルスを親のＶａｘｘｉｔｅｋウイルスから分離した。ＮＤＶ−Ｆタンパク質を発現する、ｖＨＶＴ３０９と呼ばれるプラーク精製組換えウイルスは、組織培養フラスコから５×８５０ｃｍ²のローラーボトルにスケールアップした。感染から約７２時間後、感染したＣＥＦを採取した。アリコートを液体窒素中で凍結させ、各アリコートは１０％ＦＢＳおよび１０％ＤＭＳＯを含有した。ＣＥＦで滴定を３反復実行し、ｖＨＶＴ３０９について１．５×１０⁵ｐｆｕ／ｍｌの力価が得られた。

１：５００のニワトリ抗血清（Ｐａｂ）および１：３０００のＨＶＴ Ｌ７８モノクローナル抗体（Ｍａｂ）を使用し、続いて１：５００のＦＩＴＣ標識抗ニワトリＩｇＧおよび１：３００のＴＲＩＴＣ標識Ａｌｅｘ Ｆｌｕｏｒロバ抗マウスを使用して、二重免疫蛍光染色を実行した。プレート番号１はニューカッスル病ウイルスの発現をＨＶＴと比較し、プレート番号２は伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスの発現をＨＶＴと比較する。ｖＨＶＴ３０９の全ての調べたＨＶＴ ＴＲＩＴＣ陽性プラークは、ＮＤＶ−ＦおよびＩＢＤＶ−ＶＰ２タンパク質を発現することが見出された。

ｖＨＶＴ３０９のＰＣＲ分析
ＨＶＴ隣接腕、プロモーター、ＮＤＶ−ＦおよびＩＢＤＶ−ＶＰ２遺伝子ならびにポリＡテールに特異的であるプライマー対を使用して、組換えウイルスの純度をＰＣＲによって検証した。ＰＣＲ結果は、組換えウイルスｖＨＶＴ３０９が意図された発現カセットを有し、ウイルス保存液が親のＶａｘｘｉｔｅｋウイルスの検出可能な量を含有しないことを実証する（表１および図５）。
結論
ＰＣＲ試験および免疫蛍光分析に基づいて、ｖＨＶＴ３０９は、ｍＣＭＶプロモーターの制御下のＩＢＤＶ−ＶＰ２遺伝子およびＳＶ４０プロモーターの制御下のＮＤＶ−Ｆ遺伝子を含有する組換えウイルスである。新たに生成されたｖＨＶＴ３０９は、いかなる検出可能な親ｖＨＶＴ１３ウイルスも含有しない。

（例１．２）
ＩＢＤＶ−ＶＰ２およびＮＤＶ−Ｆを発現する組換えｖＨＶＴ３１０の構築
本研究の目的は、マウスサイトメガロウイルスプロモーター（ｍＣＭＶ）、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスのウイルスタンパク質２（ＶＰ２）をコードする遺伝子、リボソーム内部進入部位（ＩＲＥＳ）、ニューカッスル病ウイルス融合タンパク質（ＮＤＶ−Ｆ）をコードする遺伝子およびシミアンウイルス４０ポリＡテール（ＳＶ４０ポリＡ）を含有する発現カセットが遺伝子間部位１（ＩＧ１）に組み込まれている、組換えＨＶＴを構築することである（図２）。

構築物において使用される親ウイルスは、ｖＨＶＴ１３である。遺伝子型ＶＩＩｄ配列に対応するニューカッスル病ウイルス融合タンパク質（ＮＤＶ−Ｆ）を化学合成し、コドン最適化した（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）。この合成遺伝子のＦタンパク質切断部位は、長潜伏期性Ｆ切断部位配列に一致するように変更し、結果として生じたＮＤＶ−Ｆ遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（ＡＹ３３７４６４）に寄託したＮＤＶ−Ｆ配列と９９％のアミノ酸配列同一性を有する。ＩＢＤ−ＶＰ２（親のＶａｘｘｉｔｅｋウイルスの中の）のためにマウスＣＭＶ ＩＥプロモーターを使用した。ＩＲＥＳの位置の直ぐ下流のｍＲＮＡの中で翻訳の開始を可能にする、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）に由来するＲＮＡ配列であるＩＲＥＳは、下流のＮＤＶ−Ｆ遺伝子の翻訳を開始するためにＶＰ２遺伝子の末端に挿入された。ＩＲＥＳがＨＶＴベクターにおいて使用されたのは、これが最初であった。
挿入遺伝子座は、ＨＶＴの中の遺伝子間部位１（ＩＧ１）である（図２）。ドナープラスミドｐＦＩＲＥＳＶＰ２（ＶＰ２遺伝子＋ＩＲＥＳ＋ＮＤＶ−ＦおよびＩＧ１のＳＶ４０ポリＡ／隣接腕を含有する挿入プラスミド）は、下記のように構築した。ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えのために使用した。

ドナープラスミド構築：
ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子（配列番号２をコードする配列番号１）、ＩＲＥＳ（配列番号１０）、ＮＤＶ−Ｆ遺伝子（配列番号５をコードする配列番号３）およびＳＶ４０ポリＡテール（配列番号８）を含有するｐＵＣ５７の中の合成ＤＮＡを、ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔによって合成した（図６）。Ｔｏｐ１０ Ｏｎｅｓｈｏｔキット（カタログ番号Ｃ４０４００２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してプラスミドｐＦＩＲＥＳＶＰ２を形質転換し、大規模培養物を増殖させ、Ｑｉａｇｅｎｓ Ｍａｘｉ Ｐｒｅｐキットを使用してプラスミド抽出を実行した。
組換え生成
例１．１に記載の相同組換え手順に従って、組換えｖＨＶＴ３１０を作製した。
ＰＣＲによる組換え体の分析
例１．１に記載のＰＣＲ分析手順を実行して、ｖＨＶＴ３１０を検証した。
発現分析
例１．１に記載の発現分析を実行して、ｖＨＶＴ３１０の発現を分析した。
結果
ドナープラスミドｐＦＩＲＥＳＶＰ２のヌクレオチドおよびアミノ酸配列には、図１に示す配列番号を割り当てる。

組換え体生成および発現分析
相同組換え技術を使用して組換えウイルスを生成するために、ＶａｘｘｉｔｅｋウイルスのゲノムＤＮＡをｐＦＩＲＥＳＶＰ２ドナープラスミドと一緒に共エレクトロポレーションした。複数回のプラーク精製における免疫蛍光陽性ウェル選択およびＰＣＲスクリーニングによって、組換えウイルスを親のｖＨＶＴ１３ウイルスから分離した。ＮＤＶ−Ｆタンパク質を発現する、ｖＨＶＴ３１０と呼ばれるプラーク精製組換えウイルスは、組織培養フラスコから５×８５０ｃｍ²のローラーボトルにスケールアップした。感染から約７２時間後、感染したＣＥＦを採取した。アリコートを液体窒素中で凍結させ、各アリコートは１０％ＦＢＳおよび１０％ＤＭＳＯを含有した。ＣＥＦで滴定を３反復実行し、ｖＨＶＴ３１０について２．０×１０⁶ｐｆｕ／ｍｌの力価が得られた。

１：５００のニワトリ抗血清（Ｐａｂ）および１：３０００のＨＶＴ Ｌ７８モノクローナル抗体（Ｍａｂ）を使用し、続いて１：５００のＦＩＴＣ標識抗ニワトリＩｇＧおよび１：３００のＴＲＩＴＣ標識Ａｌｅｘ Ｆｌｕｏｒロバ抗マウスを使用して、二重免疫蛍光染色を実行した。プレート番号１はニューカッスル病ウイルスの発現をＨＶＴと比較し、プレート番号２は伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスの発現をＨＶＴと比較する。ｖＨＶＴ３１０の全ての調べたＨＶＴ ＴＲＩＴＣ陽性プラークは、ＮＤＶ−ＦおよびＩＢＤＶ−ＶＰ２タンパク質を発現することが見出された。

ｖＨＶＴ３１０のＰＣＲ分析
ＨＶＴ隣接腕、プロモーター、ＮＤＶ−ＦおよびＩＢＤＶ−ＶＰ２遺伝子ならびにポリＡテールに特異的であるプライマー対を使用して、組換えウイルスの純度をＰＣＲによって検証した。ＰＣＲ結果は、組換えウイルスｖＨＶＴ３１０が意図された発現カセットを有し、ウイルス保存液が親のＶａｘｘｉｔｅｋウイルスの検出可能な量を含有しないことを実証する（表２および図７〜８）。

結論
ＰＣＲ試験および免疫蛍光分析に基づいて、ｖＨＶＴ３１０は、ｍＣＭＶプロモーターの制御下のＩＢＤＶ−ＶＰ２およびＮＤＶ−Ｆ遺伝子を含有する組換えウイルスであり、ＮＤＶ−Ｆ遺伝子の翻訳はＥＭＣＶに由来するＩＲＥＳによって開始される。新たに生成された組換えｖＨＶＴ３１０は、いかなる検出可能な親のｖＨＶＴ１３ウイルスも含有しない。

（例１．３）
ＩＢＤＶ−ＶＰ２およびＮＤＶ−Ｆを発現する組換えｖＨＶＴ３１１の構築
本研究の目的は、マウスサイトメガロウイルスプロモーター（ｍＣＭＶ）、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスのウイルスタンパク質２（ＶＰ２）をコードする遺伝子、自己切断性ブタテッショウウイルス−１ ２Ａペプチド（Ｐ２Ａ）、ニューカッスル病ウイルス融合タンパク質（ＮＤＶ−Ｆ）をコードする遺伝子およびシミアンウイルス４０ポリＡテール（ＳＶ４０ポリＡ）を含有する発現カセットが遺伝子間部位１（ＩＧ１）に組み込まれている、組換えＨＶＴを構築することである（図２）。

構築物において使用される親ウイルスは、ｖＨＶＴ１３（ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子を発現するＨＶＴベクター、ＭｅｒｉａｌのＶＡＸＸＩＴＥＫ（登録商標）（ＨＶＴ＋ＩＢＤ）ワクチン）である。野生型遺伝子型ＶＩＩｄニューカッスル病ウイルス融合タンパク質（ＮＤＶ−Ｆ）配列に対応するポリヌクレオチドを化学合成した（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）。この合成遺伝子のＦタンパク質切断部位は、長潜伏期性Ｆ切断部位配列に一致するように変更し、結果として生じたＮＤＶ−Ｆ遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（ＡＹ３３７４６４）に寄託したＮＤＶ−Ｆ配列と９９％のアミノ酸配列同一性を有する。ＩＢＤ−ＶＰ２（親のＶａｘｘｉｔｅｋウイルスの中の）のためにマウスＣＭＶ ＩＥプロモーターを使用した。単一のプロモーターｍＣＭＶからの上流および下流の遺伝子ＶＰ２およびＦのそれぞれの共翻訳的「切断」を可能にする自己切断性ブタテッショウウイルス−１ ２Ａペプチド（Ｐ２Ａ）は、ＶＰ２遺伝子の末端に挿入した。Ｐ２ＡがＨＶＴベクターにおいて使用されたのは、これが最初である。
挿入遺伝子座は、ＨＶＴの中の遺伝子間部位１（ＩＧ１）である（図２）。ドナープラスミドｐＦＰ２ＡＶＰ２（ＶＰ２＋Ｐ２Ａ＋ＮＤＶ−ＦおよびＩＧ１のＳＶ４０ポリＡ／隣接腕を含有する挿入プラスミド）は、下記のように構築した。ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えのために使用した。

ドナープラスミド構築
ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子（配列番号２をコードする配列番号１）、Ｐ２ＡをコードするＤＮＡ（配列番号１１）、ＮＤＶ−Ｆ遺伝子（配列番号５をコードする配列番号４）およびＳＶ４０ポリＡテール（配列番号８）を含有するｐＵＣ５７の中の合成ＤＮＡは、ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔによって合成された（図９）。Ｔｏｐ１０ Ｏｎｅｓｈｏｔキット（カタログ番号Ｃ４０４００２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用してプラスミドｐＦＰ２ＡＶＰ２を形質転換し、大規模培養物を増殖させ、Ｑｉａｇｅｎｓ Ｍａｘｉ Ｐｒｅｐキットを使用してプラスミド抽出を実行した。
組換え体生成
例１．１に記載の相同組換え手順に従って、組換えｖＨＶＴ３１１を作製した。
ＰＣＲによる組換え体の分析
例１．１に記載のＰＣＲ分析手順を実行して、ｖＨＶＴ３１１を検証した。
発現分析
例１．１に記載の発現分析を実行して、ｖＨＶＴ３１１の発現を分析した。
結果
ドナープラスミドｐＦＰ２ＡＶＰ２のヌクレオチドおよびアミノ酸配列には、図１に示す配列番号を割り当てる。

組換え体生成および発現分析
相同組換え技術を使用して組換えウイルスを生成するために、ＶａｘｘｉｔｅｋウイルスのゲノムＤＮＡをｐＦＰ２ＡＶＰ２ドナープラスミドと一緒に共エレクトロポレーションした。複数回のプラーク精製における免疫蛍光陽性ウェル選択およびＰＣＲスクリーニングによって、組換えウイルスを親のＶａｘｘｉｔｅｋウイルスから分離した。ＮＤＶ−Ｆタンパク質を発現する、ｖＨＶＴ３１１と呼ばれるプラーク精製組換えウイルスは、組織培養フラスコから５×８５０ｃｍ²のローラーボトルにスケールアップした。感染から約７２時間後、感染したＣＥＦを採取した。アリコートを液体窒素中で凍結させ、各アリコートは１０％ＦＢＳおよび１０％ＤＭＳＯを含有した。ＣＥＦで滴定を３反復実行し、ｖＨＶＴ３１１について２．５×１０⁶ｐｆｕ／ｍｌの力価が得られた。

１：５００のニワトリ抗血清（Ｐａｂ）および１：３０００のモノクローナル抗体（Ｍａｂ）を使用して、続いて１：５００のＦＩＴＣ標識抗ニワトリＩｇＧおよび１：３００のＴＲＩＴＣ標識Ａｌｅｘ Ｆｌｕｏｒロバ抗マウスを使用して、二重免疫蛍光法を実行した。プレート番号１はニューカッスル病ウイルスの発現をＨＶＴと比較し、プレート番号２は伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスの発現をニューカッスル病ウイルスと比較する。ｖＨＶＴ３１１の全ての調べたＨＶＴ ＴＲＩＴＣ陽性プラークはＮＤＶ−Ｆを発現することが見出され、全てのＮＤＶ ＴＲＩＴＣ陽性プラークはＩＢＤＶ−ＶＰ２タンパク質を発現することが見出された。

ｖＨＶＴ３１１のＰＣＲ分析
ＨＶＴ隣接腕、プロモーター、ＮＤＶ−ＦおよびＩＢＤＶ−ＶＰ２遺伝子ならびにポリＡテールに特異的であるプライマー対を使用して、組換えウイルスの純度をＰＣＲによって検証した。ＰＣＲ結果は、組換えウイルスｖＨＶＴ３１１が意図された発現カセットを有し、ウイルス保存液が親のＶａｘｘｉｔｅｋウイルスの検出可能な量を含有しないことを実証する（表３および図１０〜１１）。

結論
ＰＣＲ試験および免疫蛍光分析に基づいて、ｖＨＶＴ３１１は、ｍＣＭＶプロモーターの制御下のＩＢＤＶ−ＶＰ２およびＮＤＶ−Ｆ遺伝子を含有する組換えウイルスであり、ここで、２Ａペプチド媒介切断はＶＰ２およびＦタンパク質の共発現をもたらす。新たに生成された組換えｖＨＶＴ３１１は、いかなる検出可能な親のｖＨＶＴ１３ウイルスも含有しない。

（例１．４）
ＩＢＤＶ−ＶＰ２およびＩＬＴＶ−ｇＤを発現する組換えｖＨＶＴ３１７の構築
本研究の目的は、マウスサイトメガロウイルスプロモーター（ｍＣＭＶ）、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスのウイルスタンパク質２（ＶＰ２）をコードする遺伝子、リボソーム内部進入部位（ＩＲＥＳ）、感染性の喉頭気管炎糖タンパク質Ｄタンパク質（ＩＬＴＶ−ｇＤ）をコードする遺伝子およびシミアンウイルス４０ポリＡテール（ＳＶ４０ポリＡ）を含有する発現カセットが遺伝子間部位１（ＩＧ１）に組み込まれている、組換えＨＶＴを構築することである（図２）。

構築物において使用される親ウイルスは、ｖＨＶＴ１３である。化学合成された（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）伝染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパク質Ｄ（ＩＬＴＶ ｇＤ）配列が、構築物において使用された。ＩＢＤ−ＶＰ２（親ｖＨＶＴ１３ウイルスの中の）のために、マウスＣＭＶ ＩＥプロモーターを使用した。ＩＲＥＳの位置の直ぐ下流のｍＲＮＡの中の翻訳の開始を可能にする、脳心筋炎ウイルス（ＥＭＣＶ）に由来するＲＮＡ配列（ＩＲＥＳ）は、下流のＩＬＴＶ−ｇＤ遺伝子の翻訳を開始するためにＶＰ２遺伝子の末端に挿入された。
挿入遺伝子座は、ＨＶＴの中の遺伝子間部位１（ＩＧ１）である（図２）。ドナープラスミドｐＶＰ２ＩＲＥＳｇＤ（ＶＰ２遺伝子＋ＩＲＥＳ＋ＩＬＴＶ−ｇＤおよびＩＧ１のＳＶ４０ポリＡ／隣接腕を含有する挿入プラスミド）は、下記のように構築した。ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）をｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えのために使用した。

ドナープラスミド構築
ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子（配列番号２をコードする配列番号１）、ＩＲＥＳ（配列番号１０）、ＩＬＴＶ−ｇＤ遺伝子（配列番号１７をコードする配列番号１６）およびＳＶ４０ポリＡテール（配列番号８）を含有するｐＵＣ５７の中の合成ＤＮＡを、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔによって合成した。プラスミドｐＦＩＲＥＳＶＰ２をｄｃｍ−／ｄａｍ−コンピテント細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｃ２９２５Ｉ）に形質転換し、次にＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩで消化した。５ｋｂ断片をゲル抽出した。部分的ＩＲＥＳ、ＩＬＴＶ−ｇＤ野生型およびＳＶ４０ポリＡテールを含有するｐＵＣ５７の中の合成ＤＮＡを、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔによって合成した。プラスミドＳａｌ−Ｆｓｅ ｇＤ−ＩＲＥＳを、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩで消化した。１．９ｋｂ断片を、ゲル抽出した。Ｔｏｐ１０ Ｏｎｅｓｈｏｔキット（カタログ番号Ｃ４０４００２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、２つの断片をライゲーションし、形質転換した。ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳｂｆＩにより、正しいパターンについてコロニーをスクリーニングした。最終ドナープラスミドを配列決定し、検証して、ｐＶＰ２ＩＲＥＳｇＤと命名した（図１２を参照）。
組換え体生成
例１．１に記載の相同組換え手順に従って、組換えｖＨＶＴ３１７を作製した。
ＰＣＲによる組換え体の分析
例１．１に記載のＰＣＲ分析手順を実行して、ｖＨＶＴ３１７を検証した。
発現分析
例１．１に記載の発現分析を実行して、ｖＨＶＴ３１７の発現を分析した。
結果
ドナープラスミドｐＶＰ２ＩＲＥＳｇＤのヌクレオチドおよびアミノ酸配列には、図１に示す配列番号を割り当てる。

組換え体生成および発現分析
１：５００のニワトリ抗血清（ポリクローナル抗体）および１：３０００のモノクローナル抗体（Ｍａｂ）を使用して、続いて１：５００のＦＩＴＣ標識抗ニワトリＩｇＧおよび１：３００のＴＲＩＴＣ標識Ａｌｅｘ Ｆｌｕｏｒロバ抗マウスを使用して、二重免疫蛍光を実行した。ｖＨＶＴ３１７の全ての調べたプラークは、ＨＶＴ陽性プラークと比較してＩＢＤＶ−ＶＰ２タンパク質を発現することが見出され、全てのプラークはＩＢＤＶ陽性プラークと比較した場合ＩＬＴＶ−ｇＤタンパク質を発現することが見出された。

ｖＨＶＴ３１７のＰＣＲ分析
ＨＶＴ隣接腕対、プロモーター、ＩＬＴＶ−ｇＤおよびＩＢＤＶ−ＶＰ２遺伝子ならびにポリＡテールに特異的であるプライマーを使用して、組換えウイルスの純度をＰＣＲによって検証した。ＰＣＲ結果は、組換えウイルスｖＨＶＴ３１７が意図された発現カセットを有し、ウイルス保存液が親のＶａｘｘｉｔｅｋウイルスの検出可能な量を含有しないことを実証する（表４および図１３〜１４）。

結論
ＰＣＲ試験および免疫蛍光分析に基づいて、ｖＨＶＴ３１７は、ｍＣＭＶプロモーターの制御下のＩＢＤＶ−ＶＰ２およびＩＬＴＶ−ｇＤ遺伝子を含有する組換えウイルスであり、ＩＬＴＶ−ｇＤ遺伝子の翻訳はＥＭＣＶに由来するＩＲＥＳによって開始される。新たに生成された組換えｖＨＶＴ３１７は、いかなる検出可能な親のｖＨＶＴ１３ウイルスも含有しない。

（例１．５）
ＩＢＤＶ−ＶＰ２およびＮＤＶ−Ｆを発現する組換えｖＨＶＴ３１３の構築
本研究の目的は、マウスサイトメガロウイルスプロモーター（ｍＣＭＶ）、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスのウイルスタンパク質２（ＶＰ２）をコードする遺伝子、シミアンウイルス４０ポリＡテール（ＳＶ４０ポリＡ）、シミアンウイルス４０プロモーター（ＳＶ４０プロモーター）、野生型ニューカッスル病ウイルス融合タンパク質（ＮＤＶ−Ｆ）をコードする遺伝子および合成ポリＡテール（ｓｙｎポリＡテール）を含有する発現カセットが遺伝子間部位１（ＩＧ１）に組み込まれている、組換えＨＶＴを構築することである（図２）。

構築物において使用される親ウイルスは、ｖＨＶＴ１３である。遺伝子型ＶＩＩｄ野生型配列に対応するニューカッスル病ウイルス融合タンパク質（ＮＤＶ−Ｆ）を化学合成した（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）。この合成遺伝子のＦタンパク質切断部位は、長潜伏期性Ｆ切断部位配列に一致するように変更し、結果として生じたＮＤＶ−Ｆ遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（ＡＹ３３７４６４）に寄託したＮＤＶ−Ｆ配列と９９％のアミノ酸配列同一性を有する。ＩＢＤ−ＶＰ２（親のＶａｘｘｉｔｅｋウイルスの中の）のためのマウスＣＭＶ ＩＥプロモーターおよびＮＤＶ−ＦのためのＳＶ４０プロモーターを使用した。
挿入遺伝子座は、遺伝子間部位１（ＩＧ１）である（図２）。ドナープラスミドｐＦｗｔＳＶ４０ＶＰ２（ＶＰ２／ＳＶ４０ポリＡおよびＩＧ１＋ＳＶ４０プロモーター＋ＮＤＶ−Ｆ＋合成ポリＡの隣接腕を含有する挿入プラスミド）を、下記のように構築した。ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えのために使用した。

ドナープラスミド構築
ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子（配列番号２をコードする配列番号１）、ＳＶ４０ポリＡテール（配列番号８）、ＳＶ４０プロモーター（配列番号７）、ＮＤＶ−Ｆ遺伝子（配列番号５をコードする配列番号４）および合成ポリＡテール（配列番号９）を含有するｐＵＣ５７の中の合成ＤＮＡは、ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔによって合成した

プラスミドｐＦＳＶ４０ＶＰ２を、ＳｂｆＩ／ＡｖｒＩＩで次に消化し、５．６ｋｂ断片をゲル抽出した。プラスミドｐＨＭ１０３ＮＤＶＦｗｔｓｙｎもＳｂｆＩ／ＡｖｒＩＩで消化し、１．９ｋｂ断片をゲル抽出した。Ｔｏｐ１０ Ｏｎｅｓｈｏｔキット（カタログ番号Ｃ４０４００２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、次に断片をライゲーションし、形質転換した。ＰｓｔＩにより、正しいパターンについてコロニーをスクリーニングした。ｍａｘｉ ｐｒｅｐの一時的発現は、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）のＦｕｇｅｎｅトランスフェクション試薬およびＮＤＶに対するニワトリのポリクローナル血清を使用して検証した。最終ドナープラスミドを配列決定し、検証して、ｐＦｗｔＳＶ４０ＶＰ２と命名した（図１５を参照）。
組換え体生成
例１．１に記載の相同組換え手順に従って、組換えｖＨＶＴ３１３を作製した。
ＰＣＲによる組換え体の分析
例１．１に記載のＰＣＲ分析手順を実行して、ｖＨＶＴ３１３を検証した。
発現分析
例１．１に記載の発現分析を実行して、ｖＨＶＴ３１３の発現を分析した。
結果
ドナープラスミドｐＦｗｔＳＶ４０ＶＰ２のヌクレオチドおよびアミノ酸配列には、図１に示す配列番号を割り当てる。

組換え体生成および発現分析
ニワトリ抗血清（Ｐａｂ）および抗ＨＶＴモノクローナル抗体（Ｍａｂ）を使用し、続いてＦＩＴＣ標識抗ニワトリＩｇＧおよびＴＲＩＴＣ標識Ａｌｅｘ Ｆｌｕｏｒロバ抗マウスを使用して、二重免疫蛍光法を実行した。ｖＨＶＴ３１３の全ての調べたＴＲＩＴＣ陽性プラークは、ＮＤＶ−ＦおよびＩＢＤＶ−ＶＰ２タンパク質を発現することが見出された。

ｖＨＶＴ３１３のＰＣＲ分析
ＨＶＴ隣接腕、プロモーター、ＮＤＶ−ＦおよびＩＢＤＶ−ＶＰ２遺伝子ならびにポリＡテールに特異的であるプライマー対を使用して、組換えウイルスの純度をＰＣＲによって検証した。ＰＣＲ結果は、組換えウイルスｖＨＶＴ３１３が意図された発現カセットを有し、ウイルス保存液が親のＶａｘｘｉｔｅｋウイルスの検出可能な量を含有しないことを実証する（表５および図１６〜１７）。

結論
ＰＣＲ試験および免疫蛍光分析に基づいて、ｖＨＶＴ３１３は、ｍＣＭＶプロモーターの制御下のＩＢＤＶ−ＶＰ２遺伝子およびＳＶ４０プロモーターの制御下のＮＤＶ−Ｆ野生型遺伝子を含有する組換えウイルスである。新たに生成されたｖＨＶＴ３１３は、いかなる検出可能な親のＶａｘｘｉｔｅｋウイルスも含有しない。

（例１．６）
ＩＢＤＶ−ＶＰ２およびＮＤＶ−Ｆを発現する組換えｖＨＶＴ３１６の構築
本研究の目的は、マウスサイトメガロウイルスプロモーター（ｍＣＭＶ）、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスのウイルスタンパク質２（ＶＰ２）をコードする遺伝子、リボソーム内部進入部位（ＩＲＥＳ）、野生型ニューカッスル病ウイルス融合タンパク質（ＮＤＶ−Ｆ）をコードする遺伝子およびシミアンウイルス４０ポリＡテール（ＳＶ４０ポリＡ）を含有する発現カセットがＩＧ１遺伝子座に組み込まれている、組換えＨＶＴを構築することである（図２）。

構築物において使用される親ウイルスは、ｖＨＶＴ１３である。遺伝子型ＶＩＩｄ野生型配列に対応するニューカッスル病ウイルス融合タンパク質（ＮＤＶ−Ｆ）を化学合成した（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）。この合成遺伝子のＦタンパク質切断部位は、長潜伏期性Ｆ切断部位配列に一致するように変更し、結果として生じたＮＤＶ−Ｆ遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（ＡＹ３３７４６４）に寄託したＮＤＶ−Ｆ配列と９９％のアミノ酸配列同一性を有する。ＩＢＤ−ＶＰ２（親のＶａｘｘｉｔｅｋウイルスの中の）のためにマウスＣＭＶ ＩＥプロモーターを使用した。ＩＲＥＳは、下流のＮＤＶ−Ｆ遺伝子の翻訳を開始するために、ＶＰ２遺伝子の末端に挿入した。
挿入遺伝子座は、ＩＧ１である（図２）。ドナープラスミドｐＶＰ２ＩＲＥＳＦｗｔ（ＶＰ２遺伝子＋ＩＲＥＳ＋ＮＤＶ−ＦおよびＩＧ１のＳＶ４０ポリＡ／隣接腕を含有する挿入プラスミド）は、下記のように構築した。ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）をｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えのために使用した。

ドナープラスミド構築
ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子（配列番号２をコードする配列番号１）、ＩＲＥＳ（配列番号１０）、ＮＤＶ−Ｆ遺伝子（配列番号５をコードする配列番号４）およびＳＶ４０ポリＡテール（配列番号８）を含有するｐＵＣ５７の中の合成ＤＮＡを、ＧｅｎｅＳｃｒｉｐｔによって合成した。プラスミドｐＦＩＲＥＳＶＰ２をｄｃｍ−／ｄａｍ−コンピテント細胞（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ、カタログ番号Ｃ２９２５Ｉ）に形質転換し、次にＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩで消化した。５ｋｂ断片をゲル抽出した。部分的ＩＲＥＳ、ＮＤＶ−Ｆ野生型およびＳＶ４０ポリＡテールを含有するｐＵＣ５７の中の合成ＤＮＡを、ＧｅｎＳｃｒｉｐｔによって合成した。プラスミドＳａｌ−Ｈｉｎｄ−Ｆｗｔ＋を、ＨｉｎｄＩＩＩ／ＳａｌＩで消化した。２．２ｋｂ断片をゲル抽出した。Ｔｏｐ１０ Ｏｎｅｓｈｏｔキット（カタログ番号Ｃ４０４００２、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を使用して、２つの断片をライゲーションし、形質転換した。最終ドナープラスミドを配列決定し、検証して、ｐＶＰ２ＩＲＥＳＦｗｔと命名した（図１８を参照）。
組換え体生成
例１．１に記載の相同組換え手順に従って、組換えｖＨＶＴ３１６を作製した。
ＰＣＲによる組換え体の分析
例１．１に記載のＰＣＲ分析手順を実行して、ｖＨＶＴ３１６を検証した。
発現分析
例１．１に記載の発現分析を実行して、ｖＨＶＴ３１６の発現を分析した。
結果
ドナープラスミドｐＶＰ２ＩＲＥＳＦｗｔのヌクレオチドおよびアミノ酸配列には、図１に示す配列番号を割り当てる。

組換え体生成および発現分析
ニワトリ抗血清（Ｐａｂ）およびモノクローナル抗体（Ｍａｂ）を使用し、続いてＦＩＴＣ標識抗ニワトリＩｇＧおよびＴＲＩＴＣ標識Ａｌｅｘ Ｆｌｕｏｒロバ抗マウスを使用して、二重免疫蛍光染色を実行した。ｖＨＶＴ３１６の全ての調べたプラークは、ＨＶＴ陽性プラークと比較してＩＢＤＶ−ＶＰ２タンパク質を発現することが見出され、全てのプラークはＮＤＶ陽性プラークと比較した場合ＩＢＤＶ−ＶＰ２タンパク質を発現することが見出された。

ｖＨＶＴ３１６のＰＣＲ分析
ＨＶＴ隣接腕、プロモーター、ＮＤＶ−ＦおよびＩＢＤＶ−ＶＰ２遺伝子ならびにポリＡテールに特異的であるプライマー対を使用して、組換えウイルスの純度をＰＣＲによって検証した。ＰＣＲ結果は、組換えウイルスｖＨＶＴ３１６が意図された発現カセットを有し、ウイルス保存液が親のＶａｘｘｉｔｅｋウイルスの検出可能な量を含有しないことを実証する（表６および図１９〜２０）。

結論
ＰＣＲ試験および免疫蛍光分析に基づいて、ｖＨＶＴ３１６は、ｍＣＭＶプロモーターの制御下のＩＢＤＶ−ＶＰ２およびＮＤＶ−Ｆ遺伝子を含有する組換えウイルスであり、ＮＤＶ−Ｆ遺伝子の翻訳はＥＭＣＶに由来するＩＲＥＳによって開始される。新たに生成された組換えｖＨＶＴ３１６は、いかなる検出可能な親のＶａｘｘｉｔｅｋウイルスも含有しない。

（例１．７）
ＩＢＤＶ−ＶＰ２およびＩＬＴＶ−ｇＤを発現する組換えｖＨＶＴ４０７の構築
本研究の目的は、ＳＶ４０プロモーター、ＩＬＴＶ糖タンパク質Ｄおよび合成ポリＡを含有する発現カセットが、ｖＨＶＴ１３のＳＯＲＦ３−ＵＳ２部位に組み込まれている、組換えＨＶＴを構築することである。

構築物において使用される親ウイルスは、ｖＨＶＴ１３である。化学合成された（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）伝染性喉頭気管炎ウイルス糖タンパク質Ｄ（ＩＬＴＶ ｇＤ）配列が、構築物において使用された。ＳＶ４０プロモーターは、ＩＬＴＶ ｇＤのために使用した。挿入遺伝子座は、ＩＬＴＶ ｇＤの場合ＳＯＲＦ３−ＵＳ２であり、ｖＶＨＴ１３に由来するＩＢＤＶ ＶＰ２の場合ＩＧ１である（図２）。ＳＯＲＦ３−ＵＳ２腕、ＳＶ４０プロモーター（配列番号７）、ＩＬＴＶ野生型ｇＤをコードする遺伝子（配列番号１７をコードする配列番号１６）、および合成ポリＡ（配列番号９）を含有するドナープラスミドＨＶＴ ＵＳ２ＳＶｇＤｗｔｓｙｎを構築した（図２２を参照）。ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）をｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えのために使用した。
組換え体生成
例１．１に記載の相同組換え手順に従って、組換えｖＨＶＴ４０７を作製した。
ＰＣＲによる組換え体の分析
例１．１に記載のＰＣＲ分析手順を実行して、ｖＨＶＴ４０７を検証した。
発現分析
例１．１に記載の発現分析を実行して、ｖＨＶＴ４０７の発現を分析した。
結果
ドナープラスミドＨＶＴ ＵＳ２ＳＶｇＤｗｔｓｙｎのヌクレオチドおよびアミノ酸配列には、図１に示す配列番号を割り当てる。

組換え体生成および発現分析
ニワトリ抗血清（Ｐａｂ）およびモノクローナル抗体（Ｍａｂ）を使用し、続いてＦＩＴＣ標識抗ニワトリＩｇＧおよびＴＲＩＴＣ標識Ａｌｅｘ Ｆｌｕｏｒロバ抗マウスを使用して、二重免疫蛍光染色を実行した。ｖＨＶＴ４０７の全ての調べたプラークは、ＩＢＤＶ−ＶＰ２およびＩＬＴＶ ｇＤタンパク質を発現することが見出された。

ｖＨＶＴ４０７のＰＣＲ分析
ＨＶＴ隣接腕、プロモーター、ＩＬＴＶ ｇＤおよびＩＢＤＶ−ＶＰ２遺伝子ならびにポリＡテールに特異的であるプライマー対を使用して、組換えウイルスの純度をＰＣＲによって検証した。ＰＣＲ結果は、組換えウイルスｖＨＶＴ４０７が意図された発現カセットを有し、ウイルス保存液が親のｖＨＶＴ１３ウイルスの検出可能な量を含有しないことを実証する
結論
ＰＣＲ試験および免疫蛍光分析に基づいて、ｖＨＶＴ４０７は、ＩＢＤＶ−ＶＰ２およびＩＬＴＶ ｇＤ遺伝子を含有する組換えウイルスである。新たに生成された組換えｖＨＶＴ４０７は、いかなる検出可能な親のｖＨＶＴ１３ウイルスも含有しない。

（例１．８）
反対の方向でＮＤＶ−ＦおよびＩＬＴＶ−ｇＤを発現する組換えｖＨＶＴ３０８の構築
本研究の目的は、ＨＶＴ ＦＣ１２６への相同組換えのために、合成ポリＡテール、ＮＤＶ Ｆ、ＳＶ４０プロモーター、ＨＨＶ３ｇＢプロモーター、ＩＬＴＶ ｇＤおよびＳＶ４０ポリＡテールを含有する、遺伝子間領域Ｉ部位のための挿入プラスミドを構築することである。

構築物において使用される親ウイルスは、ＨＶＴ ＦＣ１２６である。遺伝子型Ｖ配列に対応する合成ニューカッスル病ウイルス融合タンパク質（ＮＤＶ−Ｆ）（配列番号２２をコードする配列番号２１）を化学合成し、コドン最適化した（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）。この合成遺伝子のＦタンパク質切断部位は、長潜伏期性Ｆ切断部位配列に一致するように変更した。合成野生型ＩＬＴＶ糖タンパク質Ｄ（配列番号１７をコードする配列番号１６）を、化学合成した。ＩＬＴＶ−ｇＤ＋ＳＶ４０ポリＡテールを推進する逆方向のＨＨＶ３ｇＢプロモーター（ヒトヘルペスウイルス３型糖タンパク質Ｂプロモーター）、およびニューカッスル融合タンパク質＋合成ポリＡテールを推進するＳＶ４０プロモーターを含有するドナープラスミドｐＨＶＴＩＧ１ｇＤＣａＦｏｐｔを構築した（図２３を参照）。ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）をｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えのために使用した。
組換え体生成
例１．１に記載の相同組換え手順に従って、組換えｖＨＶＴ３０８を作製した。連続継代をｐｒｅ−ＭＳＶ＋１３に対して実行した。
ＰＣＲによる組換え体の分析
例１．１に記載のＰＣＲ分析手順を実行して、組換えｖＨＶＴ３０８を検証した。
発現分析
例１．１に記載の発現分析を実行して、組換えｖＨＶＴ３０８の発現を分析した。
結果
ドナープラスミドｐＨＶＴＩＧ１ｇＤＣａＦｏｐｔのヌクレオチドおよびアミノ酸配列には、図１に示す配列番号を割り当てる。

組換え体生成および発現分析
ニワトリ抗血清（Ｐａｂ）およびモノクローナル抗体（Ｍａｂ）を使用し、続いてＦＩＴＣ標識抗ニワトリＩｇＧおよびＴＲＩＴＣ標識Ａｌｅｘ Ｆｌｕｏｒロバ抗マウスを使用して、二重免疫蛍光染色を実行した。ｖＨＶＴ３０８の全ての調べたプラークは、ＮＤＶ−ＦおよびＩＬＴＶ−ｇＤタンパク質を発現することが見出された。

ｖＨＶＴ３０８のＰＣＲ分析
ＨＶＴ隣接腕、プロモーター、ＮＤＶ−ＦおよびＩＬＴＶ−ｇＤ遺伝子およびポリＡテールに特異的であるプライマー対を使用して、組換えウイルスの純度をＰＣＲによって検証した。ＰＣＲ結果は、組換えウイルスｖＨＶＴ３０８が意図された発現カセットを有し、ウイルス保存液が親のＨＶＴウイルスの検出可能な量を含有しないことを実証する（表６．１と図２４および２５）。

全てのプライマー対によるＰＣＲ反応は、予想されるＰＣＲ生成物およびバンド形成パターンをもたらした。上に示すように、ｖＨＶＴ３０８の中の親のＨＶＴウイルスの証拠はなく、ｖＨＶＴ３０８はｐｒｅ−ＭＳＶ＋１３継代で安定している。
結論
ＰＣＲ試験および免疫蛍光分析に基づいて、ｖＨＶＴ３０８は、ＳＶ４０プロモーターの制御下のＮＤＶ−Ｆ遺伝子およびＨＨＶ３ｇＢプロモーターの制御下のＩＬＴＶ−ｇＤ遺伝子を含有する組換えＨＶＴウイルスである。ｖＨＶＴ３０８は、いかなる検出可能な親のＨＶＴウイルスも含有しない。

（例１．９）
ＮＤＶ−ＦおよびＩＬＴＶ−ｇＤを発現する組換えｖＨＶＴ３２２の構築
本研究の目的は、ｍＣＭＶプロモーター、ニューカッスル病ウイルス融合タンパク質（ＮＤＶ−Ｆ）、リボソーム内部進入部位（ＩＲＥＳ）、感染性の喉頭気管炎糖タンパク質Ｄタンパク質（ＩＬＴＶ−ｇＤ）およびシミアンウイルス４０ポリＡテール（ＳＶ４０ポリＡ）を含有する発現カセットが、ｖＨＶＴ１３（ＨＶＴ＋ＩＢＤ）の遺伝子間領域１（ＩＧ１）の中の隣接腕で相同的に組み換えられる、組換えＨＶＴを構築することである。

構築物において使用される親ウイルスは、ｖＨＶＴ１３である。野生型遺伝子型ＶＩＩｄ配列（配列番号５をコードする配列番号４）に対応するニューカッスル病ウイルス融合タンパク質（ＮＤＶ−Ｆ）を化学合成した（ＧｅｎＳｃｒｉｐｔ）。この合成遺伝子のＦタンパク質切断部位は、長潜伏期性Ｆ切断部位配列に一致するように変更し、結果として生じたＮＤＶ−Ｆ遺伝子配列は、ＧｅｎＢａｎｋ（ＡＹ３３７４６４）に寄託したＮＤＶ−Ｆ配列と９９％のヌクレオチドならびにアミノ酸配列同一性を有する。合成野生型ＩＬＴＶ糖タンパク質Ｄ（配列番号１７をコードする配列番号１６）を、化学合成した。ドナープラスミドｐＦｗｔＩＲＥＳｇＤは、ＩＧ１の左の隣接腕、ｍＣＭＶ（マウスＣＭＶ ＩＥ）プロモーター、ＮＤＶ−Ｆ、ＩＲＥＳ、ＩＬＴＶ−ｇＤ、ＳＶ４０ポリＡおよびＩＧ１の右の隣接腕を含有した（図２６を参照）。ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）をｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えのために使用した。
組換え体生成
例１．１に記載の相同組換え手順に従って、組換えｖＨＶＴ３２２を作製した。連続継代をｐｒｅ−ＭＳＶ＋１３に対して実行した。
ＰＣＲによる組換え体の分析
例１．１に記載のＰＣＲ分析手順を実行して、組換えｖＨＶＴ３２２を検証した。
発現分析
例１．１に記載の発現分析を実行して、組換えｖＨＶＴ３２２の発現を分析した。
結果
ドナープラスミドｐＦｗｔＩＲＥＳｇＤのヌクレオチドおよびアミノ酸配列には、図１に示す配列番号を割り当てる。

組換え体生成および発現分析
ニワトリ抗血清（Ｐａｂ）およびモノクローナル抗体（Ｍａｂ）を使用し、続いてＦＩＴＣ標識抗ニワトリＩｇＧおよびＴＲＩＴＣ標識Ａｌｅｘ Ｆｌｕｏｒロバ抗マウスを使用して、二重免疫蛍光染色を実行した。ｖＨＶＴ３２２の全ての調べたＴＲＩＴＣ陽性プラークは、ＮＤＶ−ＦおよびＩＬＴＶ−ｇＤタンパク質を発現することが見出された。

ｖＨＶＴ３２２のＰＣＲ分析
ＨＶＴ隣接腕、プロモーター、ＮＤＶ−ＦおよびＩＬＴＶ−ｇＤ遺伝子ならびにポリＡテールに特異的であるプライマー対を使用して、組換えウイルスの純度をＰＣＲによって検証した。ＰＣＲ結果は、組換えウイルスｖＨＶＴ３２２が意図された発現カセットを有し、ウイルス保存液が親のｖＨＶＴ１３の検出可能な量を含有しないことを実証する（表６．２と図２７および２８）。

全てのプライマー対によるＰＣＲ反応は、予想されるＰＣＲ生成物およびバンド形成パターンをもたらした。上に示すように、ｖＨＶＴ３２２の中の親のｖＨＶＴ１３ウイルスの証拠はない。
結論
ＰＣＲ試験および免疫蛍光分析に基づいて、ｖＨＶＴ３２２は、ｍＣＭＶプロモーターの制御下のＮＤＶ−ＦおよびＩＬＴＶ−ｇＤ遺伝子を含有する組換えＨＶＴウイルスである。ｖＨＶＴ３２２は、いかなる検出可能な親のｖＨＶＴ１３ウイルスも含有しない。

（例１．１０）
ＩＬＴ−ｇＤｗｔを発現する組換えｖＨＶＴ４０６の構築
本研究の目的は、ＨＶＴ ＦＣ１２６の中への相同組換えのために、そのＳＯＲＦ３−ＵＳ２部位がＳＶ４０プロモーター、伝染性喉頭気管炎ｇＤおよび合成ポリＡテールを含有する、組換えＨＶＴを構築することである。

構築物において使用される親ウイルスは、ＨＶＴ ＦＣ１２６である。合成伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）野生型糖タンパク質Ｄ（ｇＤｗｔ）を、化学合成した。ドナープラスミドｐＨＶＴＵＳ２ＳＶｇＤｗｔｓｙｎは、ＨＶＴ ＦＣ１２６のＳＯＲＦ３およびＵＳ２腕、ＳＶ４０プロモーター、ＩＬＴＶ ｇＤｗｔ（配列番号１７をコードする配列番号１６）ならびに合成ポリＡを含有した（図２９を参照）。ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）を、ｉｎ ｖｉｔｒｏ組換えのために使用した。
組換え体生成
例１．１に記載の相同組換え手順に従って、組換えｖＨＶＴ４０６を作製した。連続継代をｐｒｅ−ＭＳＶ＋１３（ｘ＋１２）に対して実行した。
ＰＣＲによる組換え体の分析
例１．１に記載のＰＣＲ分析手順を実行して、組換えｖＨＶＴ４０６を検証した。
発現分析
例１．１に記載の発現分析を実行して、組換えｖＨＶＴ４０６の発現を分析した。
結果
ドナープラスミドｐＨＶＴＵＳ２ＳＶｇＤｗｔｓｙｎのヌクレオチドおよびアミノ酸配列には、図１に示す配列番号を割り当てる。

組換え体生成および発現分析
相同組換え技術を使用して組換えＨＶＴを生成するために、ＨＶＴウイルスのゲノムＤＮＡをｐＨＶＴＵＳ２ＳＶｇＤｗｔｓｙｎドナープラスミドと一緒に共エレクトロポレーションした。複数回のプラーク精製における免疫蛍光陽性ウェル選択およびＰＣＲスクリーニングによって、組換えウイルスを親のＨＶＴウイルスから分離した。ＩＬＴＶ−ｇＤタンパク質を発現するプラーク精製組換えＨＶＴウイルスは、ｖＨＶＴ４０６と命名した。

二重染色のためにＴＲＩＴＣおよびＦＩＴＣフィルターを使用して、組換えｖＨＶＴ４０６ウイルスのプラークを可視化した。ＦＩＴＣはＩＬＴＶ−ｇＤｗｔ発現を示し、ＴＲＩＴＣはＨＶＴ発現を示した。９６ウェルプレートのウェルが小さいので、プラークを先ずＴＲＩＴＣフィルターで数え、次にＦＩＴＣフィルターで数えて、各ウェルを記録した。合わせた６００＋のプラークを、ｐｒｅ−ＭＳＶとｐｒｅ−ＭＳＶ＋１３継代の間で数えた。両継代について、全てのプラークはＦＩＴＣおよびＴＲＩＴＣの両方に陽性であった。

ｖＨＶＴ４０６のＰＣＲ分析
表６．３に掲載されるＰＣＲプライマーを使用して、ｖＨＶＴ４０６のＰＣＲ分析を実行した（図３０を参照）。図３１に示すように、ゲル電気泳動の後のＰＣＲ生成物のサイズは予想されるサイズおよびバンド形成パターンとよく対応する。ｖＨＶＴ４０６の中の親のＨＶＴ ＦＣ１２６ウイルスの証拠はない。

結論
ＰＣＲ試験および免疫蛍光分析に基づいて、ｖＨＶＴ４０６は、ＳＯｒｆ３−ＵＳ２部位にＳＶ４０プロモーター、ＩＬＴＶ−ｇＤｗｔ遺伝子および合成ポリＡテールを含有する組換えＨＶＴウイルスである。ｖＨＶＴ４０６は、いかなる検出可能な親のＨＶＴウイルスも含有しない。

（例１．１１）
ＨＶＴベクターのｉｎ ｖｉｔｒｏ安定性研究
上で構築されたＨＶＴベクターは、ニワトリ胚線維芽細胞（ＣＥＦ）における複数のｉｎ ｖｉｔｒｏ継代の後のゲノム／発現安定性について試験した。２つの遺伝子を発現するＨＶＴベクターは、複数継代の後に安定していた。複数の挿入断片を有するＨＶＴはより不安定であるという一般常識に反して、結果は、本発明のＨＶＴベクターが安定していること、および２つの遺伝子を効率的に発現することを驚くべきことに実証した。

（例２）
ＳＰＦひなにおいてｖＨＶＴ３０６、ｖＨＶＴ３０９、ｖＨＶＴ３１０およびｖＨＶＴ３１１によってＤ２８に誘導されたニューカッスル病（ＮＤ）効能
本研究の目的は、Ｄ２８に実行された、ニューカッスル病チャレンジ（Ｔｅｘａｓ ＧＢ株）に対する、１日齢ＳＰＦニワトリに投与された、ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子およびＮＤＶ Ｆ遺伝子を発現する４つのＨＶＴ組換え構築物（ｖＨＶＴ３０６、ｖＨＶＴ３０９、ｖＨＶＴ３１０およびｖＨＶＴ３１１）の効能を調査することであった。
これらのワクチン候補の特徴は、下の表７に記載される。

９５羽の１日齢特定病原体未感染（ＳＰＦ）ひなを、表８に示す５群に振り分けた。群１〜４からの全ての鳥（２０羽の鳥／群）を、示す用量の０．２ｍＬの異なるＨＶＴ−ＩＢＤ＋ＮＤ構築物で皮下（ＳＣ）経路によりワクチン接種をした（表８を参照）。群５からの１５羽の鳥は、ワクチン未接種のままにした。ワクチン接種から２８日後（Ｄ２８）、各群の鳥に、筋肉内（ＩＭ）経路によりＮＤＶ Ｔｅｘａｓ ＧＢ株でチャレンジした（０．１ｍＬ／鳥において１０^4.0の卵感染用量５０％（ＥＩＤ５０））。チャレンジから１４日間、鳥を臨床徴候について観察した。チャレンジから最高１４日の間いかなるＮＤ臨床徴候（中枢神経系、または呼吸系の徴候および／または致死を含む）も示さなかった鳥は、保護されていると考えた。
保護の結果は、表８に示す。群５の全ての対照の鳥は、チャレンジの後に死んだ。ワクチン接種をした群における保護は、少なくとも９０％に到達した。

（例３）
Ｄ３５における標準のＩＢＤＶチャレンジに対してｖＨＶＴ３０９、ｖＨＶＴ３１０、ｖＨＶＴ３１１およびｖＨＶＴ４０７によって誘導されたＩＢＤ効能
本研究の目的は、Ｄ３５に実行された、標準のＩＢＤＶチャレンジに対する、１日齢ＳＰＦニワトリに投与された、ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子およびＮＤＶ Ｆ遺伝子を発現する３つのＨＶＴ組換え構築物（ｖＨＶＴ３０９、ｖＨＶＴ３１０およびｖＨＶＴ３１１）ならびにＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子およびＩＬＴＶ ｇＤ遺伝子を発現する１つの構築物（ｖＨＶＴ４０７）の効能を調査することであった。

１日齢特定病原体未感染（ＳＰＦ）ひなを、表９に示す４群に振り分けた。群１〜４からの全ての鳥（２０羽の鳥／群）を、示す用量の０．２ｍＬの異なるＨＶＴ−ＩＢＤ＋ＮＤまたはＨＶＴ−ＩＢＤ＋ＩＬＴ構築物で皮下（ＳＣ）経路によりワクチン接種をした。群５からの２０羽の鳥は、ワクチン未接種のままにした。ワクチン接種の３５日後（Ｄ３５）に、全ての鳥に、眼内（ＩＯ）経路により伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）古典的ＳＴＣ株でチャレンジした（０．０３ｍＬ／鳥において１０２．０のＥＩＤ５０）。チャレンジの４日後（Ｄ３９）に、全ての鳥を致死させ、肉眼的嚢病変の検査のために検死を行った。
保護の結果は、表９に示す。全てのワクチン接種をした鳥（２羽のｖＨＶＴ３１１でワクチン接種をした鳥以外）はＩＢＤから保護されていたが、対照の鳥のいずれも保護されていなかった。

（例４）
Ｄ３５における変種ＩＢＤＶチャレンジに対してｖＨＶＴ３０９、ｖＨＶＴ３１０、ｖＨＶＴ３１１およびｖＨＶＴ４０７によって誘導されたＩＢＤ効能
本研究の目的は、Ｄ３５に実行された、変種（Ｄｅｌａｗａｒｅ Ｅ）ＩＢＤＶチャレンジに対する、１日齢ＳＰＦニワトリに投与された、ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子およびＮＤＶ Ｆ遺伝子を発現する３つのＨＶＴ組換え構築物（ｖＨＶＴ３０９、ｖＨＶＴ３１０およびｖＨＶＴ３１１）ならびにＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子およびＩＬＴＶ ｇＤ遺伝子を発現する１つの構築物（ｖＨＶＴ４０７）の効能を調査することであった。

１日齢特定病原体未感染（ＳＰＦ）ひなを、表１０に示す６群に振り分けた。群１〜４からの全ての鳥（１９〜２０羽の鳥／群）を、示す用量の０．２ｍＬの異なるＨＶＴ−ＩＢＤ＋ＮＤまたはＨＶＴ−ＩＢＤ＋ＩＬＴ構築物で皮下（ＳＣ）経路によりワクチン接種をした。群５（１９羽の鳥）および群６（１８羽の鳥）からの鳥は、ワクチン未接種のままにした。Ｄ３５において、群１〜５からの全ての鳥に、眼内（ＩＯ）経路により伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）変種Ｄｅｌａｗａｒｅ Ｅ株でチャレンジした（０．０３ｍＬ／鳥において１０^3.0のＥＩＤ５０）。群６からの鳥は、ワクチン未接種のままにした。Ｄ４６において、全ての鳥の体重および嚢重量を測定した。全ての群について、Ｂ／Ｂ質量比（嚢重量／体重比×１００）を計算した。

保護の結果は、表１０に示す。群１および２からのワクチン接種をした鳥は、ワクチン接種をしていないチャレンジをしていない対照（群６）のそれと類似の、およびワクチン接種をしていないチャレンジをした対照（群５）のそれらより大きい平均Ｂ／Ｂ質量比を有した。群３の鳥は保護されておらず、群４の鳥は部分的に保護された。驚くべきことに、ＩＲＥＳを含有するｖＨＶＴ３１０は、Ｐ２Ａを含有するｖＨＶＴ３１１より優れた保護を提供した。

（例５）
ブロイラーにおいてＤ２８におけるｖｖＩＢＤＶチャレンジに対してｖＨＶＴ３０６、ｖＨＶＴ３０９およびｖＨＶＴ３１０によって誘導されたＩＢＤ効能
本研究の目的は、Ｄ２８に実行された、ｖｖＩＢＤＶチャレンジに対する、１日齢ブロイラートリに投与された、ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子およびＮＤＶ Ｆ遺伝子を発現する３つのＨＶＴ組換え構築物（ｖＨＶＴ３０６、ｖＨＶＴ３０９およびｖＨＶＴ３１０）の効能を調査することであった。

７０羽の１日齢ブロイラーひな（Ｈｕｂｂａｒｄ ＪＡ９５７系）を、表１１に示す５群に振り分けた。群２〜５からの全ての鳥（約１５羽の鳥／群）を、示す用量の０．２ｍＬの異なるＨＶＴ−ＩＢＤ＋ＮＤ構築物で皮下（ＳＣ）経路によりワクチン接種をした。群１からの１０羽の鳥は、ワクチン未接種のままにした。ワクチン接種の２８日後（Ｄ２８）に、全ての鳥に、眼内（ＩＯ）経路により非常に強い病原性のＩＢＤＶ（ｖｖＩＢＤＶ）９１−１６８株でチャレンジした（０．０５ｍＬ／鳥において１０^4.3のＥＩＤ５０）。チャレンジの１０日後（Ｄ３８）に、全ての鳥を致死させ、肉眼的嚢病変の検査のために検死を行った。嚢および体を計量し、組織病理学的に嚢を調べた。嚢の組織学的病変は、以下のスケールによって０〜５に評価した：０−無病変、正常な嚢；１−小胞の１％〜２５％は、リンパ系消失（すなわち、１つの罹患小胞において５０％未満の消失）を示す、病変におけるヘテロフィルの流入；２−小胞の２６％〜５０％は、ほとんど完全なリンパ系消失（すなわち、１つの罹患小胞において７５％を超える消失）を示す、罹患小胞は壊死病変を示し、ヘテロフィルの激しい流入を検出することができる；３−小胞の５１％〜７５％は、リンパ系消失を示す；罹患小胞は壊死病変を示し、ヘテロフィルの激しい流入が検出される；４−小胞の７６％〜１００％は、ほとんど完全なリンパ系消失を示す；過形成および嚢胞構造が検出される；罹患小胞は壊死病変を示し、ヘテロフィルの激しい流入が検出される；および５−小胞の１００％は、ほとんど完全なリンパ系消失を示す；小胞構造の完全な喪失；厚く折り重なった上皮；嚢状組織の線維化。チャレンジ後にそれらが臨床徴候を示さなかったならば、およびそれらの組織学スコアが≦２であったならば、鳥は保護されたと考えた。

おそらく大腸菌症のために、このバッチのブロイラーにおいて１週目に多少の初期の死亡数があった。試験したワクチンの用量は、予想より低かった（２０００ｐｆｕ）。保護の結果を表１１に示す。ワクチン接種によって部分的保護が誘導され、それは、ｖＨＶＴ３１０がｖＨＶＴ３０６およびｖＨＶＴ３０９より高いことを示す。

（例６）
ブロイラーにおいてＤ４２における短潜伏期性ＮＤＶチャレンジに対してｖＨＶＴ３０６、ｖＨＶＴ３０９およびｖＨＶＴ３１０によって誘導されたＮＤ効能
本研究の目的は、Ｄ４２に実行された、短潜伏期性ＮＤＶチャレンジに対する、１日齢ブロイラートリに投与された、ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子およびＮＤＶ Ｆ遺伝子を発現する３つのＨＶＴ組換え構築物（ｖＨＶＴ３０６、ｖＨＶＴ３０９およびｖＨＶＴ３１０）の効能を調査することであった。

１日齢ブロイラーひな（Ｈｕｂｂａｒｄ ＪＡ９５７系）を、表１２に示す４群に振り分けた。群２〜４からの全ての鳥（１６〜２０羽の鳥／群）を、示す用量の０．２ｍＬの異なるＨＶＴ−ＩＢＤ＋ＮＤ構築物で皮下（ＳＣ）経路によりワクチン接種をした。群１からの１２羽の鳥は、ワクチン未接種のままにした。ワクチン接種の４２日後（Ｄ４２）に、全ての鳥に、筋肉内（ＩＭ）経路により短潜伏期性ＮＤＶ Ｈｅｒｔｓ３３株でチャレンジした（０．２ｍＬ／鳥において１０^5.0のＥＩＤ５０）。チャレンジから１４日間、全ての鳥を臨床徴候について観察した。それらが死に至らなかったかＮＤ臨床徴候を示さなかったならば、鳥は保護されたと考えた。

おそらく大腸菌症のために、このバッチのブロイラーにおいて１週目に多少の初期の死亡数があった。試験したワクチンの用量は、予想より低かった（２０００ＰＦＵ）。保護の結果は、表１２に示す。ｖＨＶＴ３０９およびｖＨＶＴ３１０、続いてｖＨＶＴ３０６によるワクチン接種によって、最良の保護が誘導された。

（例７）
ブロイラーにおいてＤ４２における短潜伏期性ＮＤＶチャレンジに対してｖＨＶＴ３０６、ｖＨＶＴ３０９およびｖＨＶＴ３１０によって誘導されたＮＤ効能
本研究の目的は、Ｄ４２に実行された、短潜伏期性ＮＤＶチャレンジに対する、１日齢ブロイラートリに投与された、ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子およびＮＤＶ Ｆ遺伝子を発現する３つのＨＶＴ組換え構築物（ｖＨＶＴ３０６、ｖＨＶＴ３０９およびｖＨＶＴ３１０）の効能を再調査することであった。

１日齢ブロイラーひな（Ｈｕｂｂａｒｄ ＪＡ９５７系）を、表１３に示す４群に振り分けた。群２〜４からの全ての鳥（１６〜２０羽の鳥／群）を、２０００ＰＦＵの０．２ｍＬの異なるＨＶＴ−ＩＢＤ＋ＮＤ構築物で皮下（ＳＣ）経路によりワクチン接種をした。群１からの１９羽の鳥は、ワクチン未接種のままにした。ワクチン接種の４２日後（Ｄ４２）に、全ての鳥に、筋肉内（ＩＭ）経路により短潜伏期性ＮＤＶ Ｈｅｒｔｓ３３株でチャレンジした（０．２ｍＬ／鳥において１０^5.0のＥＩＤ５０）。チャレンジから１４日間、全ての鳥を臨床徴候について観察した。それらが死に至らなかったかＮＤ臨床徴候を示さなかったならば、鳥は保護されたと考えた。
保護の結果は、表１３に示す。全体として、保護のレベルは以前の研究（例６を参照する）より高かったが、それらは同じ傾向をたどる：ｖＨＶＴ３０９およびｖＨＶＴ３１０、続いてｖＨＶＴ３０６によるワクチン接種によって、最良の保護が誘導された。
結果は、ＳＰＦならびにブロイラーにおけるＮＤチャレンジに対してｖＨＶＴ３０９がｖＨＶＴ３０６より有効であることを示し（表１２および１３）、１つの遺伝子座に異種ポリヌクレオチドを挿入することは、複数の遺伝子座に挿入することよりウイルスの全体的フィットネスにより少ない負の影響を及ぼすことを示唆する。

（例８）
ＳＰＦひなにおいてＤ１４における標準のＩＢＤＶチャレンジに対してｖＨＶＴ３０６、ｖＨＶＴ３０９およびｖＨＶＴ３１０によって誘導されたＩＢＤ効能
本研究の目的は、Ｄ１４に実行された、標準のＩＢＤＶチャレンジに対する、１日齢ＳＰＦニワトリに投与された、ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子およびＮＤＶ Ｆ遺伝子を発現する３つのＨＶＴ組換え構築物（ｖＨＶＴ３０６、ｖＨＶＴ３０９およびｖＨＶＴ３１０）の効能を調査することであった。

１日齢特定病原体未感染（ＳＰＦ）ひなを、表１４に示す４群に振り分けた。群１〜３からの全ての鳥（２１〜２２羽の鳥／群）を、示す用量の０．２ｍＬの異なるＨＶＴ−ＩＢＤ＋ＮＤ構築物で皮下（ＳＣ）経路によりワクチン接種をした。群４からの２２羽の鳥は、ワクチン未接種のままにした。ワクチン接種の１４日後（Ｄ１４）に、全ての鳥に、眼内（ＩＯ）経路により伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）古典的ＳＴＣ株でチャレンジした（０．０３ｍＬ／鳥において１０^1.4のＥＩＤ５０）。チャレンジの４日後（Ｄ１８）に、全ての鳥を致死させ、肉眼的嚢病変の検査のために検死を行った。
保護の結果は、表１４に示す。ＩＢＤ保護の類似のレベルが３つの実験的ワクチンによって誘導されたが、１羽以外の対照鳥の全ては感染した。

（例９）
ＳＰＦひなにおいてＤ１４における変種ＩＢＤチャレンジの後にｖＨＶＴ３０６、ｖＨＶＴ３０９およびｖＨＶＴ３１０によって誘導されたＩＢＤ効能
本研究の目的は、Ｄ１４に実行された、変種ＩＢＤＶチャレンジに対する、１日齢ＳＰＦニワトリに投与された、ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子およびＮＤＶ Ｆ遺伝子を発現する３つのＨＶＴ組換え構築物（ｖＨＶＴ３０６、ｖＨＶＴ３０９およびｖＨＶＴ３１０）の効能を調査することであった。

１日齢特定病原体未感染（ＳＰＦ）ひなを、表１５に示す５群に振り分けた。群１〜３からの全ての鳥（２０羽の鳥／群）を、示す用量の０．２ｍＬの異なるＨＶＴ−ＩＢＤ＋ＮＤ構築物で皮下（ＳＣ）経路によりワクチン接種をした。群４および群５からの鳥（１９〜２０羽の鳥／群）は、ワクチン未接種のままにした。Ｄ１４に、群１〜４からの全ての鳥に、眼内（ＩＯ）経路により伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）変種Ｄｅｌａｗａｒｅ Ｅ株でチャレンジした（０．０３ｍＬ／鳥において１０^2.2のＥＩＤ５０）。群５からの鳥は、ワクチン未接種のままにした。Ｄ２５において、全ての鳥の体重および嚢重量を測定した。全ての群について、Ｂ／Ｂ質量比（嚢重量／体重比×１００）を計算した。
保護の結果は、表１５に示す。部分的保護が３つのワクチンによってＤ１４において誘導され、保護はｖＨＶＴ３０９およびｖＨＶＴ３１０でより高かった。

組換えｖＨＶＴ３０６およびｖＨＶＴ３０９は、２つの独立した発現カセット（２つのｍＲＮＡ）を有する。ＩＲＥＳまたはＰ２Ａを通して２つの遺伝子を発現する構築物（例えば、ｖＨＶＴ３１０、ｖＨＶＴ３１７、ｖＨＶＴ３１１、ｖＨＶＴ３１６、ｖＨＶＴ３２２）が１つの挿入部位にあるだけでなく、遺伝子は単一のｍＲＮＡから発現される。表１１〜１９に提示される全てのデータを比較すると、それは、１挿入部位組換え体ｖＨＶＴ３０９およびｖＨＶＴ３１０が、２挿入部位組換え体ｖＨＶＴ３０６よりも有効であることを示し、１つの挿入遺伝子座に１つより多い異種ポリヌクレオチドを有するＨＶＴ組換え体が、複数の挿入遺伝子座に異種ポリヌクレオチドを有するＨＶＴ組換え体より生物学的に適合していることを示す。さらに、驚くべきことに、ＩＲＥＳを通して発現される単一のｍＲＮＡから１つより多い異種ポリヌクレオチドを発現させることは、特にブロイラーにおいてＩＢＤ効能により少ない負の影響を及ぼす（表１１の結果を参照する）。

（例１０）
ＳＰＦひなにおいてＤ２８における標準のＩＢＤＶチャレンジに対してｖＨＶＴ３０６、ｖＨＶＴ３０９およびｖＨＶＴ３１０によって誘導されたＩＢＤ効能
本研究の目的は、Ｄ２８に実行された、標準のＩＢＤＶチャレンジに対する、１日齢ＳＰＦニワトリに投与された、ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子およびＮＤＶ Ｆ遺伝子を発現する３つのＨＶＴ組換え構築物（ｖＨＶＴ３０６、ｖＨＶＴ３０９およびｖＨＶＴ３１０）の効能を調査することであった。

１日齢特定病原体未感染（ＳＰＦ）ひなを、表１６に示す４群に振り分けた。群１〜３からの全ての鳥（２０〜２２羽の鳥／群）を、示す用量の０．２ｍＬの異なるＨＶＴ−ＩＢＤ＋ＮＤ構築物で皮下（ＳＣ）経路によりワクチン接種をした。群４からの２２羽の鳥は、ワクチン未接種のままにした。ワクチン接種の２８日後（Ｄ２８）に、全ての鳥に、眼内（ＩＯ）経路により伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）古典的ＳＴＣ株でチャレンジした（０．０３ｍＬ／鳥において１０^2.0のＥＩＤ５０）。チャレンジの４日後（Ｄ３２）に、全ての鳥を致死させ、肉眼的嚢病変の検査のために検死を行った。
保護の結果は、表１６に示す。完全な保護がｖＨＶＴ３１０によって誘導されたが、他のワクチン候補についてはわずかな鳥だけが保護されていなかった。

（例１１）
ＳＰＦひなにおいてＤ２８における変種ＩＢＤチャレンジの後にｖＨＶＴ３０６、ｖＨＶＴ３０９およびｖＨＶＴ３１０によって誘導されたＩＢＤ効能
本研究の目的は、Ｄ２８に実行された、変種ＩＢＤＶチャレンジに対する、１日齢ＳＰＦニワトリに投与された、ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子およびＮＤＶ Ｆ遺伝子を発現する３つのＨＶＴ組換え構築物（ｖＨＶＴ３０６、ｖＨＶＴ３０９およびｖＨＶＴ３１０）の効能を調査することであった。

１日齢特定病原体未感染（ＳＰＦ）ひなを、表１７に示す５群に振り分けた。群１〜３からの全ての鳥（２０羽の鳥／群）を、示す用量の０．２ｍＬの異なるＨＶＴ−ＩＢＤ＋ＮＤ構築物で皮下（ＳＣ）経路によりワクチン接種をした群４および群５からの鳥（１８〜１９羽の鳥／群）は、ワクチン未接種のままにした。Ｄ２８に、群１〜４からの全ての鳥に、眼内（ＩＯ）経路により伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）変種Ｄｅｌａｗａｒｅ Ｅ株でチャレンジした（０．０３ｍＬ／鳥において１０^2.2のＥＩＤ５０）。群５からの鳥は、ワクチン未接種のままにした。Ｄ３９において、全ての鳥の体重および嚢重量を測定した。全ての群について、Ｂ／Ｂ質量比（嚢重量／体重比×１００）を計算した。

保護の結果は、表１７に示す。群５（抗原未投与群）は予想外にもＳＴＣ ＩＢＤＶ株に感染したので、この群のＢ／Ｂ質量比は得られなかった。ｖＨＶＴ３１０によって誘導された保護は、ｖＨＶＴ３０６およびｖＨＶＴ３０９によって誘導されたものより高かった。

（例１２）
ＳＰＦひなにおいてｖＨＶＴ３０６、ｖＨＶＴ３０９およびｖＨＶＴ３１０によってＤ２１およびＤ２８に誘導されたニューカッスル病（ＮＤ）効能
本研究の目的は、Ｄ２１およびＤ２８に実行された、ニューカッスル病チャレンジ（Ｔｅｘａｓ ＧＢ株）に対する、１日齢ＳＰＦニワトリに投与された、ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子およびＮＤＶ Ｆ遺伝子を発現する３つのＨＶＴ組換え構築物（ｖＨＶＴ３０９、ｖＨＶＴ３１０およびｖＨＶＴ３１１）の効能を調査することであった。

１日齢特定病原体未感染（ＳＰＦ）ひなを、表１８に示す４群に振り分けた。群１〜３からの全ての鳥（５０羽の鳥／群）を、示す用量の０．２ｍＬの異なるＨＶＴ−ＩＢＤ＋ＮＤ構築物で皮下（ＳＣ）経路によりワクチン接種をした。群４からの３０羽の鳥は、ワクチン未接種のままにした。ワクチン接種から２１日後（Ｄ２１）、群１〜３の２０羽の鳥および群４の１５羽の鳥に、筋肉内（ＩＭ）経路によりＮＤＶ Ｔｅｘａｓ ＧＢ株でチャレンジした（０．１ｍＬ／鳥において１０^4.2の卵感染用量５０％（ＥＩＤ５０））。ワクチン接種から２８日後（Ｄ２８）、群１〜３の３０羽の鳥および群４の１５羽の鳥に、筋肉内（ＩＭ）経路によりＮＤＶ Ｔｅｘａｓ ＧＢ株でチャレンジした（０．１ｍＬ／鳥において１０^4.3の卵感染用量５０％（ＥＩＤ５０））。チャレンジから１４日間、鳥を臨床徴候について観察した。チャレンジから最高１４日の間いかなるＮＤ臨床徴候（中枢神経系、または呼吸系の徴候および／または致死を含む）も示さなかった鳥は、保護されていると考えた。
保護の結果は、表１８に示す。群４の全ての対照の鳥は、チャレンジの後に死んだ。ｖＨＶＴ３１０によって誘導された保護が最良であり、ｖＨＶＴ３０６およびｖＨＶＴ３０９が続いた。

（例１３）
ＳＰＦひなにおいてｖＨＶＴ３０６、ｖＨＶＴ３０９およびｖＨＶＴ３１０によって誘導されたマレック病（ＭＤ）効能
本研究の目的は、マレック病チャレンジ（ＧＡ株、２バッチおよび２希釈液）に対する、１日齢ＳＰＦニワトリに投与された、ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子およびＮＤＶ Ｆ遺伝子を発現する３つのＨＶＴ組換え構築物（ｖＨＶＴ３０９、ｖＨＶＴ３１０およびｖＨＶＴ３１１）の効能を調査することであった。

１日齢特定病原体未感染（ＳＰＦ）ひなを、表１９に示す４群に振り分けた。群１〜３からの全ての鳥（２０羽の鳥／群）を、示す用量の０．２ｍＬの異なるＨＶＴ−ＩＢＤ＋ＮＤ構築物で皮下（ＳＣ）経路によりワクチン接種をした群４からの２０羽の鳥は、ワクチン未接種のままにした。ワクチン接種の４日後（Ｄ４）、群１〜４からの１８〜２０羽の鳥を、ｖＭＤＶ ＧＡ２２株の２つの異なるバッチ（番号１および番号２）の２つの希釈液（１：５および１：４０）でＳＣ経路によってチャレンジした。孵化から４６〜５０日の間、マレック病に起因する臨床徴候について鳥を観察した。Ｄ４６〜Ｄ５０に、全ての残りの鳥の検死を行い、マレック病の病変について検査した。いかなるＭＤ臨床徴候も病変も示さなかった鳥は、保護されていると考えた。
保護の結果は、表１９に示す。群４の対照の鳥における感染性は、７５〜９０％の間で変化した。全体として、ｖＨＶＴ３１０によって誘導された保護が最良であり、ｖＨＶＴ３０６がわずかに劣り、次にｖＨＶＴ３０９が続いた。

（例１４）
ＳＰＦひなにおいてＤ２１の古典的ＩＢＤＶチャレンジに対してｖＨＶＴ３０６およびｖＨＶＴ４０７によって誘導されたＩＢＤ効能
本研究の目的は、Ｄ２１に実行された、古典的ＩＢＤＶチャレンジに対する、１日齢ＳＰＦニワトリに投与された、１つ（ｖＨＶＴ３０６）はＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子およびＮＤＶ Ｆ遺伝子を発現し、他（ｖＨＶＴ４０７）はＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子およびＩＬＴＶ ｇＤ遺伝子を発現する、２つのＨＶＴ組換え構築物の効能を調査することであった。

４０羽の１日齢ＳＰＦひな（白色レグホン）を、表２０に示す３群に振り分けた。群２および３からの全ての鳥（約１５羽の鳥／群）を、示す用量の０．２ｍＬのｖＨＶＴ３０６またはｖＨＶＴ４０７構築物で皮下（ＳＣ）経路によりワクチン接種をした。群１からの１０羽の鳥は、ワクチン未接種のままにした。ワクチン接種の２１日後（Ｄ２１）に、全ての鳥に、眼内（ＩＯ）経路により古典的５２／７０ Ｆａｒａｇｈｅｒ ＩＢＤＶ株でチャレンジした（０．０５ｍＬ／鳥において１０^2.0のＥＩＤ５０）。チャレンジの１１日後（Ｄ３２）に、全ての鳥を致死させ、肉眼的嚢病変の検査のために検死を行った。嚢対体重比を計算するために、嚢および体を計量した。チャレンジ後にそれらが臨床徴候も嚢病変も示さなかったならば、鳥は保護されたと考えた。
保護の結果は、表２０に示す。ｖＨＶＴ３０６またはｖＨＶＴ４０７によるワクチン接種によって、完全なＩＢＤ保護が誘導された。

（例１５）
ＳＰＦひなにおいてＤ２１のＩＬＴＶチャレンジに対してｖＨＶＴ４０７によって誘導されたＩＬＴ効能
本研究の目的は、Ｄ２１に実行された、ＩＬＴＶチャレンジに対する、１日齢ＳＰＦニワトリに投与された、ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子およびＩＬＴＶ ｇＤ遺伝子を発現する２つのｖＨＶＴ４０７組換え構築物の効能を調査することであった。

２４羽の１日齢ＳＰＦひな（白色レグホン）を、表２１に示す２群に振り分けた。全ての鳥（約１２羽の鳥／群）を、示す用量の０．２ｍＬのｖＨＶＴ１３（陰性対照として使用）またはｖＨＶＴ４０７構築物で皮下（ＳＣ）経路によりワクチン接種をした。ワクチン接種の２１日後（Ｄ２１）に、全ての鳥に、気管内（ＩＴ）経路によりＩＬＴ−９６−３ ＩＬＴＶ株でチャレンジした（０．５ｍＬ／鳥において１０^3.6のＥＩＤ５０）。チャレンジから１１日間、鳥を臨床徴候について観察した。試験の２５〜２９日目および３２日目に、呼吸パターン、結膜炎、抑うつおよび死亡を含む臨床徴候について全ての鳥を観察した。試験の３２日目に、全ての残りの鳥を致死させた。それらが、死亡を含む、せき、くしゃみ、ラ音、抑うつ、喘ぎおよび／または血液性の粘液浸出に関連した呼吸窮迫などのＩＬＴ臨床徴候を示さなかったならば、鳥は保護されていると考えた。
保護の結果は、表２１に示す。これらのチャレンジ条件において、ｖＨＶＴ４０７によるワクチン接種によってかなりのＩＬＴ保護が誘導された。

（例１６）
ブロイラーひなにおいてＤ２１のＩＬＴＶチャレンジに対してｖＨＶＴ４０７、市販のＨＶＴ−ＩＬＴおよび市販のニワトリ胚起源（ＣＥＯ）のワクチンによって誘導されたＩＬＴ効能
本研究の目的は、Ｄ２１に実行された、ＩＬＴＶチャレンジに対する、市販のＨＶＴ−ＩＬＴワクチン（ＩＮＮＯＶＡＸ（登録商標）ＩＬＴ）と比較した、１日齢ブロイラーニワトリに投与された、ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子およびＩＬＴＶ ｇＤ遺伝子を発現するｖＨＶＴ４０７組換え構築物の効能を調査することであった。

４８羽の１日齢の市販のブロイラーひなを、表２２に示す３群に振り分けた。群１〜３の全ての鳥（約１２羽の鳥／群）を、示す用量の０．２ｍＬのｖＨＶＴ１３（陰性対照として使用）、ｖＨＶＴ４０７またはＩＮＮＯＶＡＸ（登録商標）ＩＬＴ（陽性対照として使用）構築物で皮下（ＳＣ）経路によりワクチン接種をした。ワクチン接種の２１日後（Ｄ２１）に、全ての鳥に、気管内（ＩＴ）経路によりＩＬＴ−９６−３ ＩＬＴＶ株でチャレンジした（０．５ｍＬ／鳥において１０^4.2のＥＩＤ５０）。チャレンジから１２日間、鳥を臨床徴候について観察した。試験の２５〜２９日目および３２〜３３日目に、呼吸パターン、結膜炎、抑うつおよび死亡を含む臨床徴候について全ての鳥を観察し、評価した。試験の３４日目に、全ての残りの鳥を致死させた。それらが、死亡を含む、せき、くしゃみ、ラ音、抑うつ、喘ぎおよび／または血液性の粘液浸出に関連した呼吸窮迫などのＩＬＴ臨床徴候を示さなかったならば、鳥は保護されていると考えた。
保護の結果は、表２２に示す。ｖＨＶＴ４０７によるワクチン接種によってＩＬＴ保護が誘導され、それは、ＩＮＮＯＶＡＸ ＩＬＴによって誘導されたものより高かった。

（例１７）
ＳＰＦひなにおいてｖＨＶＴ３１０およびｖＨＶＴ３１６によってＤ１４、Ｄ２１およびＤ３２に誘導されたニューカッスル病（ＮＤ）効能
本研究の目的は、Ｄ１４、Ｄ２１およびＤ３２に実行された、ニューカッスル病チャレンジ（Ｔｅｘａｓ ＧＢ株）に対する、１日齢ＳＰＦニワトリに投与された、ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子およびＮＤＶ Ｆ遺伝子を発現する２つのＨＶＴ組換え構築物（ｖＨＶＴ３１０およびｖＨＶＴ３１６）のＮＤ免疫の開始を比較することであった。

１日齢特定病原体未感染（ＳＰＦ）ひなを、表２３に示す３群に振り分けた。群１〜２からの全ての鳥（５９〜７０羽の鳥／群；表を参照）を、示す用量の０．２ｍＬの異なるＨＶＴ−ＩＢＤ＋ＮＤ構築物で皮下（ＳＣ）経路によりワクチン接種をした。群３からの４５羽の鳥は、ワクチン未接種のままにした。Ｄ１４、Ｄ２１およびＤ３２に、群１〜３からの１５〜３０羽の鳥（表を参照）に、筋肉内（ＩＭ）経路によりＮＤＶ Ｔｅｘａｓ ＧＢ株でチャレンジした（０．１ｍＬ／鳥において１０^4.0のＥＩＤ５０／鳥）。チャレンジから１４日間、鳥を臨床徴候について観察した。チャレンジから最高１４日の間いかなるＮＤ臨床徴候（中枢神経系、または呼吸系の徴候および／または致死を含む）も示さなかった鳥は、保護されていると考えた。
保護の結果は、表２３に示す。群３の全ての対照の鳥は、チャレンジの後に死んだ。ｖＨＶＴ３１０およびｖＨＶＴ３１６によって誘導された保護レベルは類似し、免疫の可能な早期の開始がｖＨＶＴ３１６によって誘導された。

（例１８）
ＩＬＴＶ ｇＤおよびＩＢＤＶ ＶＰ２を発現するか、またはＩＬＴＶ ｇＤおよびＮＤＶ Ｆを発現するＨＶＴベクターによって誘導されたＩＬＴＶ効能
本研究の目的は、ＩＬＴＶチャレンジに対してニワトリに投与された、ＩＬＴＶ ｇＤおよびＩＢＤＶ ＶＰ２を発現するか（ｖＨＶＴ３１７およびｖＨＶＴ４０７など）またはＩＬＴＶ ｇＤおよびＮＤＶ Ｆ遺伝子を発現する（ｖＨＶＴ３０８およびｖＨＶＴ３２２など）、ＨＶＴ組換え構築物の効能を調査することである。

ニワトリを、異なる群に振り分ける。鳥は、０．２ｍＬの異なるＨＶＴ構築物で、皮下（ＳＣ）経路によってワクチン接種をする。１群からの鳥は、ワクチン未接種のままにする。気管内（ＩＴ）または眼窩下洞経路によって、ＩＬＴＶで鳥にチャレンジする。チャレンジから１１〜１４日間、鳥を臨床徴候について観察する。チャレンジから最高１４日間、いかなるＩＬＴＶ臨床徴候（せき、くしゃみ、ラ音、抑うつ、喘ぎおよび／もしくは血液性の粘液浸出に関連した呼吸窮迫ならびに／または死亡を含む）も示さない鳥は、保護されていると考える。
結果は、ＨＶＴベクターがＩＬＴＶ感染からの保護を提供することを示す。

（例１９）
ＩＬＴＶ ｇＤおよびＩＢＤＶ ＶＰ２を発現するＨＶＴベクターによって誘導されたＩＢＤ効能
本研究の目的は、ＩＢＤチャレンジに対してニワトリに投与された、ＩＬＴＶ ｇＤおよびＩＢＤＶ ＶＰ２を発現するＨＶＴ組換え構築物（ｖＨＶＴ３１７およびｖＨＶＴ４０７など）の効能を調査することである。
ニワトリを、異なる群に振り分ける。鳥は、０．２ｍＬの異なるＨＶＴ構築物で、皮下（ＳＣ）経路によってワクチン接種をする。１群からの鳥は、ワクチン未接種のままにする。眼内（ＩＯ）経路によって、鳥をＩＢＤでチャレンジする。チャレンジから４〜１０日間、鳥を臨床徴候について観察する。チャレンジから最高１０日の間いかなるＩＢＤ臨床徴候（抑うつおよび／または死を含む）も示さない、ならびに嚢の病変および／または萎縮を示さない鳥は、保護されていると考える。
結果は、ＨＶＴベクターがＩＢＤ感染からの保護を提供することを示す。

（例２０）
ＩＬＴＶ ｇＤおよびＮＤＶ Ｆを発現するＨＶＴベクターによって誘導されたＮＤＶ効能
本研究の目的は、ＮＤＶチャレンジに対してニワトリに投与された、ＩＬＴＶ ｇＤおよびＮＤＶ Ｆ遺伝子を発現するＨＶＴ組換え構築物（ｖＨＶＴ３０８およびｖＨＶＴ３２２など）の効能を調査することである。

ニワトリを、異なる群に振り分ける。鳥は、０．２ｍＬの異なるＨＶＴ構築物で、皮下（ＳＣ）経路によってワクチン接種をする。１群からの鳥は、ワクチン未接種のままにする。筋肉内（ＩＭ）経路によって、鳥をＮＤＶでチャレンジする。チャレンジから１４日間、鳥を臨床徴候について観察する。チャレンジから最高１４日の間いかなるＮＤ臨床徴候（中枢神経系、または呼吸系の徴候および／または致死を含む）も示さない鳥は、保護されていると考える。
結果は、ＨＶＴベクターがＮＤＶ感染からの保護を提供することを示す。

（例２１）
ＳＰＦひなにおいてＤ２８の標準のＩＢＤＶチャレンジに対してｖＨＶＴ３１６およびｖＨＶＴ３１７によって誘導されたＩＢＤ効能
本研究の目的は、Ｄ２８に実行された、標準のＩＢＤＶチャレンジに対する、１日齢ＳＰＦニワトリに投与された、ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子およびＮＤＶ Ｆ遺伝子（ｖＨＶＴ３１６）またはＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子およびＩＬＴＶ ｇＤ遺伝子（ｖＨＶＴ３１７）を発現する２つのＨＶＴ組換え構築物（ｖＨＶＴ３１６およびｖＨＶＴ３１７）の効能を調査することであった。

１日齢特定病原体未感染（ＳＰＦ）ひなを、表２４に示す３群に振り分けた。群１および２からの全ての鳥（１５羽の鳥／群）を、示す用量の０．２ｍＬのｖＨＶＴ３１６およびｖＨＶＴ３１７で皮下（ＳＣ）経路によりワクチン接種をした。群３からの１５羽の鳥は、ワクチン未接種のままにした。ワクチン接種の２８日後（Ｄ２８）に、全ての鳥に、眼内（ＩＯ）経路により伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）古典的ＳＴＣ株でチャレンジした（０．０３ｍＬ／鳥において１０^2.0のＥＩＤ５０）。チャレンジから４日後（Ｄ３２）、全ての鳥を致死させ、肉眼的嚢病変の検査のために検死を行った。
保護の結果は、表２４に示す。ｖＨＶＴ３１６およびｖＨＶＴ３１７によって、それぞれ１００％および８０％の保護が誘導された；しかし、ｖＨＶＴ３１７の投与された用量は、ｖＨＶＴ３１６のそれよりほぼ３倍低かった。

（例２２）
ＳＰＦひなにおいてＤ２８における変種ＩＢＤチャレンジの後にｖＨＶＴ３１０、ｖＨＶＴ３１６およびｖＨＶＴ３１７によって誘導されたＩＢＤ効能
本研究の目的は、Ｄ２８に実行された、変種ＩＢＤＶチャレンジに対する、１日齢ＳＰＦニワトリに投与された、ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子およびＮＤＶ Ｆ遺伝子（ｖＨＶＴ３１０およびｖＨＶＴ３１６）またはＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子およびＩＬＴＶ ｇＤ遺伝子（ｖＨＶＴ３１７）を発現する３つのＨＶＴ組換え構築物（ｖＨＶＴ３１０、ｖＨＶＴ３１６およびｖＨＶＴ３１７）の効能を調査することであった。

１日齢特定病原体未感染（ＳＰＦ）ひなを、表２５に示す５群に振り分けた。群１〜３からの全ての鳥（１５羽の鳥／群）を、示す用量の０．２ｍＬのｖＨＶＴ３１０、ｖＨＶＴ３１６およびｖＨＶＴ３１７で皮下（ＳＣ）経路によりワクチン接種をした。群４および群５からの鳥（１５羽の鳥／群）は、ワクチン未接種のままにした。Ｄ２８に、群１〜４からの全ての鳥に、眼内（ＩＯ）経路により伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）変種Ｄｅｌａｗａｒｅ Ｅ株でチャレンジした（０．０３ｍＬ／鳥において１０^3.0のＥＩＤ５０）。群５からの鳥は、ワクチン未接種のままにした。Ｄ３９において、全ての鳥の体重および嚢重量を測定した。全ての群について、Ｂ／Ｂ質量比（嚢重量／体重比×１００）を計算した。

保護の結果は、表２５に示す。全てのワクチン接種群において、保護を観察した。ｖＨＶＴ３１７による保護は、そのより低い用量にもかかわらず、ｖＨＶＴ３１０およびｖＨＶＴ３１６によって誘導されたものよりわずかに高かった。

（例２３）
ＳＰＦひなにおいてＤ２８のＩＬＴＶチャレンジに対してｖＨＶＴ３１７によって誘導されたＩＬＴ効能
本研究の目的は、Ｄ２８に実行された、ＩＬＴＶチャレンジに対する、１日齢ＳＰＦニワトリに投与された、ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子およびＩＬＴＶ ｇＤ遺伝子を発現するｖＨＶＴ３１７組換え構築物の効能を調査することであった。

３６羽の１日齢ＳＰＦひな（白色レグホン）を、表２６に示す２群に振り分けた。全ての鳥（約１８羽の鳥／群）を、０．２ｍＬのｖＨＶＴ３１７で皮下（ＳＣ）経路によりワクチン接種をしたかまたはワクチン未接種のままにした。ワクチン接種の２８日後（Ｄ２８）に、全ての鳥に、気管内（ＩＴ）経路によりＩＬＴ−９６−３ ＩＬＴＶ株でチャレンジした（０．２ｍＬ／鳥において１０^3.0のＥＩＤ５０）。Ｄ３２、Ｄ３６およびＤ３９に、臨床徴候および死亡率について鳥を観察した。臨床徴候には、呼吸パターン、結膜炎、抑うつおよび死亡率が含まれた。試験の３２日目に、全ての残りの鳥を致死させた。保護の評価は、３つの異なる基準を用いて使用した：（１）任意の臨床徴候を３日連続で示すか、またはチャレンジの後に死亡したいかなる鳥もＩＬＴ陽性と考える；（２）任意のカテゴリーの任意の中等度もしくは重度の臨床徴候を任意の日に示すか、またはチャレンジの後に死亡したいかなる鳥もＩＬＴ陽性と考える；および（３）任意のカテゴリーの任意の中等度もしくは重度の臨床徴候を２日連続で示すか、またはチャレンジの後に死亡したいかなる鳥もＩＬＴ陽性と考える。
３つの異なる基準に基づく保護の結果を、表２６示す。ＩＬＴチャレンジは、それがワクチン未接種の鳥の８６．７％を死滅させた（または、それらが非常に重度の臨床徴候を示すとき、倫理上の理由のために鳥を安楽死させた）ので、苛酷であった。これらのチャレンジ条件において、ｖＨＶＴ３１７によるワクチン接種によって高レベルのＩＬＴ保護が誘導された。

（例２４）
ブロイラーひなにおいてＤ２１のＩＬＴＶチャレンジに対してｖＨＶＴ３１７、市販のＨＶＴ−ＩＬＴおよび市販のニワトリ胚起源（ＣＥＯ）のワクチンによって誘導されたＩＬＴ効能
本研究の目的は、Ｄ２８に実行された、ＩＬＴＶチャレンジに対する、市販のＨＶＴ−ＩＬＴワクチン（ＩＮＮＯＶＡＸ（登録商標）ＩＬＴ、Ｍｅｒｃｋ Ａｎｉｍａｌ Ｈｅａｌｔｈ）と比較した、１日齢ブロイラーニワトリに投与された、ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子およびＩＬＴＶ ｇＤ遺伝子を発現するｖＨＶＴ３１７組換え構築物の効能を調査することであった。

５１羽の１日齢の市販のブロイラーひなを、表２７に示す３群に振り分けた。全ての鳥（１７羽の鳥／群）を、示した用量の０．２ｍＬのｖＨＶＴ３１７もしくはＩＮＮＯＶＡＸ（登録商標）ＩＬＴ（陽性対照として使用）で皮下（ＳＣ）経路によりワクチン接種をしたかまたはワクチン未接種のままにした。Ｄ２６に、１群あたりの鳥の数を１５に減らし、各鳥を計量した。ワクチン接種の２８日後（Ｄ２８）に、全ての鳥に、眼内経路により６３１４０ＩＬＴＶ株でチャレンジした（０．２ｍＬ／鳥において１０^4.3のＥＩＤ５０）。試験の３１〜３５日目と試験の３８日目に、全ての鳥を臨床徴候について個々に観察した。試験の３８日目に、全ての残りの鳥を個々に計量し、致死させた。保護の評価は、３つの異なる基準を用いて実行した：（１）任意の臨床徴候を３日連続で示すか、またはチャレンジの後に死亡したいかなる鳥もＩＬＴ陽性と考える；（２）任意のカテゴリーの任意の中等度もしくは重度の臨床徴候を任意の日に示すか、またはチャレンジの後に死亡したいかなる鳥もＩＬＴ陽性と考える；および（３）任意のカテゴリーの任意の中等度もしくは重度の臨床徴候を２日連続で示すか、またはチャレンジの後に死亡したいかなる鳥もＩＬＴ陽性と考える。体重は、Ｄ２６およびＤ３８にも比較した。

３つの基準を使用した保護の結果を、表２７に示す。全ての対照は、３つの基準に関して保護されていないと考えられた。試験した両ワクチンは、高くかつ類似したＩＬＴ保護を誘導した。Ｄ２６（チャレンジの前）には、体重の間に有意差はなかった；しかし、チャレンジの後、ワクチン接種をした鳥の体重は非ワクチン接種の鳥のそれらより有意に高く（ｐ＜０．０００１）、体重減少からの保護を示している。

（例２５）
ＳＰＦひなにおいて２８日齢での変種ＩＢＤチャレンジの後にｖＨＶＴ３１７のｉｎ ｏｖｏ投与によって誘導されたＩＢＤ効能
本研究の目的は、２８日齢（ワクチン接種から３１日後）に実行された、変種ＩＢＤＶチャレンジに対する、ＳＰＦニワトリからの１８〜１９日齢の胚にｉｎ ｏｖｏで投与された、ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子およびＩＬＴＶ ｇＤ遺伝子を発現するｖＨＶＴ３１７の効能を調査することであった。

特定病原体未感染（ＳＰＦ）ニワトリからの１８〜１９日齢の胚を、表２８に示す３群に振り分けた。群１および２からの全ての鳥（約３０個の卵／群）を、示す用量の０．０５ｍＬのｖＨＶＴ３１７でｉｎ ｏｖｏ（ＳＣ）経路によりワクチン接種をした。群３からの胚形成卵を、０．０５ｍＬのＭａｒｅｋのワクチンの希釈剤で偽接種した。孵化時に、１群につき２２羽のひなを飼育し、チャレンジの前に、全３群を２０羽に減らした。ワクチン接種から３１日後（２８日齢）に、全３群からの鳥に、眼内（ＩＯ）経路により伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）変種Ｄｅｌａｗａｒｅ Ｅ株でチャレンジした（０．０３ｍＬ／鳥において１０^3.0のＥＩＤ５０の標的用量）。群５からの鳥を、ＴＰＢ（リン酸トリプトース培養液、０．０３ｍＬ／鳥）で偽チャレンジした。チャレンジから１１日後、全ての鳥の体重および嚢重量を測定した。全ての群について、Ｂ／Ｂ質量比（嚢重量／体重比×１００）を計算した。
保護の結果は、表２８に示す。全ての非ワクチン接種のチャレンジ鳥において、明瞭な嚢萎縮が観察された。ｖＨＶＴ３１７ワクチン接種群において、２つの試験用量で保護が観察された。

（例２６）
ＳＰＦひなにおいてＤ２８のＩＬＴＶチャレンジに対してｉｎ ｏｖｏ経路で投与されたｖＨＶＴ３１７によって誘導されたＩＬＴ効能
本研究の目的は、ＳＰＦニワトリにおいてＤ２８（２５日齢）に実行されたＩＬＴＶチャレンジに対する、１８〜１９日齢の胚にｉｎ ｏｖｏ経路で投与された、ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子およびＩＬＴＶ ｇＤ遺伝子を発現するｖＨＶＴ３１７組換え構築物の効能を調査することであった。

特定病原体未感染（ＳＰＦ）ニワトリからの１８〜１９日齢の胚を、表２９に示す２群に振り分けた。群１からの全ての鳥（約３０個の卵／群）を、示す用量の０．０５ｍＬのｖＨＶＴ３１７でｉｎ ｏｖｏ（ＳＣ）経路によりワクチン接種をした。群２からの胚形成卵を、０．０５ｍＬのＭａｒｅｋのワクチンの希釈剤で偽接種した。孵化時に、１群につき２２羽のひなを飼育し、チャレンジの１日前に、両群を２０羽に減らした。ワクチン接種の２５日後（Ｄ２８）に、両群の鳥に、眼窩下洞に投与した６３１４０ＩＬＴＶ株でチャレンジした（０．２ｍＬ／鳥において１０^4.7のＥＩＤ５０）。Ｄ２８〜Ｄ３８に、臨床徴候および死亡率について鳥を観察した。試験の３８日目に、全ての残りの鳥を致死させた。ＩＬＴチャレンジに対する効能は、一般的なＩＬＴ臨床徴候、例えば、抑うつ、血液性および／または粘液性の分泌物の有る無しの、せき、くしゃみ、ラ音、伸長した頸部を伴う喘ぎと関連した呼吸窮迫；呼吸困難および口呼吸；排膿の有る無しの眼窩下洞腫脹；ならびに／または目の部分的もしくは完全な閉鎖を伴う腫脹した結膜の不在によって判定された。外傷、または鳥を試験から除外するいかなる明らかな状態によるもの以外のチャレンジ後のいかなる死亡も、ＩＬＴ陽性と考えた。
ＩＬＴ保護の結果は、表２９に示す。結果は、ｖＨＶＴ３１７ワクチン接種をしたほとんどの鳥が保護されていたことを示した。

（例２９）
ＳＰＦニワトリにおいてＤ２１における短潜伏期性ＮＤＶチャレンジに対してｖＨＶＴ３０９およびｖＨＶＴ３１０によって誘導されたＮＤ効能
本研究の目的は、Ｄ２１に実行された短潜伏期性ＮＤＶチャレンジに対する、１日齢ＳＰＦニワトリに投与された、ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子およびＮＤＶ Ｆ遺伝子を発現する２つのＨＶＴ組換え構築物（ｖＨＶＴ３０９およびｖＨＶＴ３１０）の効能を調査することであった。

１日齢ＳＰＦひな（白色レグホン）を、表３０に示す３群の鳥に振り分けた。群２および３からの全ての鳥は、２０００ＰＦＵの標的用量の０．２ｍＬのｖＨＶＴ３０９（１４羽の鳥；群２）またはｖＨＶＴ３１０（１５羽の鳥；群３）で皮下（ＳＣ）経路によってワクチン接種をした。群１からの鳥（５羽）は、ワクチン未接種のままにした。群２の２羽の鳥は、未知の理由のためにＤ５に死亡した。ワクチン接種の２１日後（Ｄ２１）に、群３からの１０羽の鳥の血液を、血清学のために採集した；その後、全３群の全ての鳥に、筋肉内（ＩＭ）経路により短潜伏期性ＮＤＶ Ｈｅｒｔｓ３３株でチャレンジした（０．２ｍＬ／鳥において１０^5.0のＥＩＤ５０）。チャレンジから１４日間、全ての鳥を臨床徴候について観察した。それらが死に至らなかったかＮＤ臨床徴候を示さなかったならば、鳥は保護されたと考えた。

保護の結果は、表３０に要約する。群１の全ての非ワクチン接種の鳥は、チャレンジの後に死亡した。ワクチン接種をした全ての鳥は、保護されていた。ｖＨＶＴ３１０構築物は、Ｄ２１に試料採取した全ての１０Ｇ３鳥血清において、有意な抗ＮＤＶ（ＥＬＩＳＡ（ＩＤ−ＶＥＴからのＩＤ Ｓｃｒｅｅｎニューカッスル病間接キット）により平均３．７±０．３（標準偏差）ｌｏｇ１０およびＨＩ検査により平均３．９±０．７ ｌｏｇ２）および抗ＩＢＤＶ（ＥＬＩＳＡ（ＺｏｅｔｉｓからのＰｒｏＦＬＯＫ ＩＢＤ Ｐｌｕｓ ＥＬＩＳＡキット）により平均３．７ ｌｏｇ１０±０．２ ｌｏｇ１０）抗体を誘導した。

（例２８）
ＳＰＦひなにおいてＤ２１の古典的ＩＢＤＶチャレンジに対してｖＨＶＴ３０９およびｖＨＶＴ３１０によって誘導されたＩＢＤ効能
本研究の目的は、Ｄ２１に実行された古典的ＩＢＤＶチャレンジに対する、１日齢ＳＰＦニワトリに投与された、ＩＢＤＶ ＶＰ２遺伝子およびＮＤＶ Ｆ遺伝子を発現する２つのＨＶＴ組換え構築物（ｖＨＶＴ３０９およびｖＨＶＴ３１０）の効能を調査することであった。

１日齢ＳＰＦひな（白色レグホン）を、表３１に示す３群に振り分けた。群２および３からの全ての鳥（約１５羽／群）は、２０００ＰＦＵの標的用量の０．２ｍＬのｖＨＶＴ３０９（群２）またはｖＨＶＴ３１０（群３）構築物で皮下（ＳＣ）経路によってワクチン接種をした。群１からの１０羽の鳥は、ワクチン未接種のままにした。２つの未特定の早期死亡が、群２において記録された。ワクチン接種の２１日後（Ｄ２１）に、全ての鳥に、眼内（ＩＯ）経路により古典的５２／７０ Ｆａｒａｇｈｅｒ ＩＢＤＶ株でチャレンジした（０．０５ｍＬ／鳥において１０^2.0のＥＩＤ５０）。チャレンジから１１日後（Ｄ３２）、全ての鳥を致死させ、肉眼的嚢病変の検査のために検死を行った。嚢対体重比を計算するために、嚢および体を計量した。嚢は、その後組織学のためにホルムアルデヒドに保存した。嚢の組織学的病変は、表３２に示すスケールによって評価した。チャレンジの苛酷性は、（１）チャレンジ対照の少なくとも５０％が死亡したか、または２日間を超えて疾患の特徴的徴候、特に無気力／乱れた羽、または虚脱を示した場合、および（２）生存していているチャレンジ対照の１００％が≧３のファブリキウス嚢組織学スコアを示した場合に検証された。ニワトリの少なくとも９０％が保護されていたならば、ワクチン候補の効能が実証された。ニワトリは、（１）それらが生存し、２日間を超えて疾患の顕著な臨床徴候、特に無気力／乱れた羽、または虚脱を示さなかった場合、および（２）それらが＜３のファブリキウス嚢組織学スコアを示した場合、保護されたと考えた。

保護の結果は、表３１に示す。全ての対照は、ＩＢＤ感染に陽性であった。ｖＨＶＴ３０９またはｖＨＶＴ３１０によるワクチン接種によって、完全なＩＢＤ保護が誘導された。

（例２９）
ＳＰＦひなの孵化率に及ぼすｖＨＶＴ３１７のｉｎ ｏｖｏ投与の影響
本研究の目的は、ｉｎ ｏｖｏ経路によって投与されるときの、孵化率へのｖＨＶＴ３１７の安全性を調査することであった。

結果は、例２３、２４、２５および２６に記載されるものを含む、いくつかの研究からのデータの編さん物である。インキュベーションの１８〜１９日目の胚形成卵を、２０００もしくは３０００ＰＦＵの標的用量のｖＨＶＴ３１７、またはマレック病ワクチン希釈物を接種した。孵化百分率を、群ごとに評価した。結果は表３３に要約したが、ワクチン接種卵において優れたレベルの孵化率を示した。

（例３０）
ＩＬＴＶチャレンジに対してｖＨＶＴ４０６によって誘導されたＩＬＴ効能
（例３０．１）
Ｄ２８のＩＬＴＶチャレンジに対してｖＨＶＴ４０６によって誘導されたＩＬＴ効能
本研究の目的は、ＩＬＴチャレンジに対する、ＩＬＴＶ ｇＤ遺伝子を発現するｖＨＶＴ４０６組換え構築物および市販のＨＶＴ−ＩＬＴベクターワクチンの効能を調査、比較することである。

十二（１２）羽の１日齢ＳＰＦ鳥を、各群に振り分けた。群１〜２の鳥は、１羽につき０．２ｍｌでＳＱによりワクチン接種をした。ワクチン接種の後、全ての鳥をそれらのそれぞれのユニットに入れた。２８日目に、全ての鳥は、気管内（ＩＴ）経路を通して伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴ）、ＩＬＴ−９３−３ ＥＰ２でチャレンジした。チャレンジから１１日間、全ての鳥をチャレンジによる臨床徴候について観察した。３２日目に、気管および結膜スワブを全ての残りの鳥から収集した。スワブは、ｑ−ＰＣＲ分析のために処理した。３９日目に、全ての残りの鳥を致死させた。

結果は、下の表３４に示す。結果は、ｖＨＶＴ４０６ワクチン接種をした全ての鳥が保護されていたことを示した。驚くべきことに、結果は、より低い用量（６，９６０ｐｆｕ／０．２ｍｌ）を使用したとき、市販品Ｉｎｎｏｖａｘ ＨＶＴ−ＩＬＴのために使用されたより高い用量（１０，３４０ｐｆｕ／０．２ｍｌ）と比較した場合、優れた保護（１００％の保護）がｖＨＶＴ４０６群において達成されたことも示した。

（例３０．２）
Ｄ２１のＩＬＴＶチャレンジに対してｖＨＶＴ４０６によって誘導されたＩＬＴ効能
本研究の目標は、ＩＬＴチャレンジに対する、ｖＨＶＴ４０６および２つの市販のＨＶＴ−ＩＬＴベクターワクチンの効能を調査、比較することである。
十二（１２）羽の１日齢ＳＰＦ鳥を、各群に振り分けた。無作為化により、鳥が置かれる隔離ユニットも割り当てた（ユニットあたり１２羽の鳥、１群につき１つのユニット）。群１〜３の鳥は、１羽につき０．２ｍｌでＳＱによりワクチン接種をした。２１日目に、群１〜２の全ての鳥は、気管内（ＩＴ）経路を通して伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴ）、ＩＬＴ−９６−３ ＥＰ２でチャレンジした。チャレンジから１１日間、鳥をチャレンジによる臨床徴候について観察した。２５日目に、気管および結膜スワブを全ての残りの鳥で採集した。スワブ試料は、ｑ−ＰＣＲのために処理した。３２日目に、全ての残りの鳥を致死させた。

結果は、下の表３５に示す。結果は、ｖＨＶＴ４０６ワクチン接種をした１羽以外の全ての鳥が保護されていたことを示した。驚くべきことに、結果は、より低い用量（８１０ｐｆｕ／０．２ｍｌ）を使用したとき、同じ保護レベル（９１．７％）を達成するために市販品Ｉｎｎｏｖａｘ ＨＶＴ−ＩＬＴのために使用されたより高い用量（１５９０ｐｆｕ／０．２ｍｌ）と比較した場合、優れた保護（９１．７％の保護）がｖＨＶＴ４０６群において達成されたことも示した。さらに、より低い用量で使用したとき、ｖＨＶＴ４０６は７５％の保護を提供しただけだった市販品Ｖｅｃｔｏｒｍｕｎｅ ＨＶＴ−ＩＬＴより優れた保護（９１．７％）を提供した。

本発明の好ましい実施形態をこのように詳述したが、本発明の精神または範囲を逸脱しない範囲でその多くの明らかな変形形態が可能であるので、上の例によって規定される発明は、上の記載に示される特定の詳細に限定されるものではないことを理解すべきである。

本明細書で引用または参照される全ての文書（「本明細書で引用される文書」）、ならびに本明細書で引用される文書で引用または参照される全ての文書は、本明細書でまたは参照により本明細書に組み込まれる任意の文書で指摘される任意の製品のための任意の製造業者の説明書、記載、製品仕様書および製品シートと一緒に、これにより参照により本明細書に組み込まれ、本発明の実施において用いることができる。

Claims (27)

1. 鳥類の病原体の少なくとも１つの抗原をコードする少なくとも１つまたはそれより多くの異種ポリヌクレオチドを含む１つまたは複数の組換え七面鳥ヘルペスウイルス（ＨＶＴ）ベクターを含む、組成物またはワクチン。
2. １）ＨＶＴベクターが２つの異種ポリヌクレオチドを含み、第１のポリヌクレオチドが、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）ＶＰ２抗原、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）抗原およびニューカッスル病ウイルスＦ（ＮＤＶ−Ｆ）抗原からなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、第２のポリヌクレオチドが、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）ＶＰ２抗原、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）抗原およびニューカッスル病ウイルスＦ（ＮＤＶ−Ｆ）抗原からなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む；または
   ２）ＨＶＴベクターが、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）ＶＰ２抗原、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）抗原およびニューカッスル病ウイルスＦ（ＮＤＶ−Ｆ）抗原からなる群から選択されるポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む、
   請求項１に記載の組成物またはワクチン。
3. 伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）ＶＰ２抗原が配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項１または２に記載の組成物またはワクチン。
4. 伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）抗原が配列番号１７に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項１から３までのいずれか１項に記載の組成物またはワクチン。
5. ニューカッスル病ウイルスＦ（ＮＤＶ−Ｆ）抗原が配列番号５または２２に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項１から４までのいずれか１項に記載の組成物またはワクチン。
6. 伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）ＶＰ２抗原をコードするポリヌクレオチドが配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有する、請求項１から５までのいずれか１項に記載の組成物またはワクチン。
7. 伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）抗原をコードするポリヌクレオチドが配列番号１６と少なくとも７０％の配列同一性を有する、請求項１から６までのいずれか１項に記載の組成物またはワクチン。
8. ニューカッスル病ウイルスＦ（ＮＤＶ−Ｆ）抗原をコードするポリヌクレオチドが配列番号３、４または２１と少なくとも７０％の配列同一性を有する、請求項１から７までのいずれか１項に記載の組成物またはワクチン。
9. ポリヌクレオチドが、ｍＣＭＶＩＥプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＨＶ３ｇＢプロモーターおよびリバースＨＨＶ３ｇＢプロモーターからなる群から選択されるプロモーターに作動可能に連結している、請求項１から８までのいずれか１項に記載の組成物またはワクチン。
10. ２つの異種ポリヌクレオチドがＩＲＥＳまたはＰ２Ａによって連結されている、請求項１から９までのいずれか１項に記載の組成物またはワクチン。
11. 異種ポリヌクレオチドがＨＶＴゲノムのＩＧ１遺伝子座および／またはＳＯＲＦ−ＵＳ２遺伝子座に挿入されている、請求項１から１０までのいずれか１項に記載の組成物またはワクチン。
12. 第１のポリヌクレオチドが５’末端でｍＣＭＶ ＩＥまたはＳＶ４０プロモーターに作動可能に連結している、および３’末端でＩＲＥＳまたはＰ２Ａに作動可能に連結している、請求項１から１１までのいずれか１項に記載の組成物またはワクチン。
13. 薬学的にまたは獣医学的に許容される担体、賦形剤、ビヒクルまたはアジュバントをさらに含む、請求項１から１２までのいずれか１項に記載の組成物またはワクチン。
14. １）鳥類病原体の２つの抗原をコードする２つの異種ポリヌクレオチドを含み、第１のポリヌクレオチドが、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）ＶＰ２抗原、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）抗原およびニューカッスル病ウイルスＦ（ＮＤＶ−Ｆ）抗原からなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含み、第２のポリヌクレオチドが、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）ＶＰ２抗原、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）抗原およびニューカッスル病ウイルスＦ（ＮＤＶ−Ｆ）抗原からなる群から選択されるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを含む、組換えＨＶＴベクター；または、
    ２）伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）ＶＰ２抗原、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）抗原およびニューカッスル病ウイルスＦ（ＮＤＶ−Ｆ）抗原からなる群から選択されるポリペプチドをコードする異種ポリヌクレオチドを含む、組換えＨＶＴベクター。
15. 伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）ＶＰ２抗原が配列番号２に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項１４に記載の組換えＨＶＴベクター。
16. 伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）抗原が配列番号１７に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項１４または１５に記載の組換えＨＶＴベクター。
17. ニューカッスル病ウイルスＦ（ＮＤＶ−Ｆ）抗原が配列番号５または２２に示すアミノ酸配列と少なくとも８０％の配列同一性を有する、請求項１４から１６までのいずれか１項に記載の組換えＨＶＴベクター。
18. 伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）ＶＰ２抗原をコードするポリヌクレオチドが配列番号１と少なくとも７０％の配列同一性を有する、請求項１４から１７までのいずれか１項に記載の組換えＨＶＴベクター。
19. 伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）糖タンパク質Ｄ（ｇＤ）抗原をコードするポリヌクレオチドが配列番号１６と少なくとも７０％の配列同一性を有する、請求項１４から１８までのいずれか１項に記載の組換えＨＶＴベクター。
20. ニューカッスル病ウイルスＦ（ＮＤＶ−Ｆ）抗原をコードするポリヌクレオチドが配列番号３、４または２１と少なくとも７０％の配列同一性を有する、請求項１４から１９までのいずれか１項に記載の組換えＨＶＴベクター。
21. ポリヌクレオチドが、ｍＣＭＶ ＩＥプロモーター、ＳＶ４０プロモーター、ＨＨＶ３ｇＢプロモーターおよびリバースＨＨＶ３ｇＢプロモーターからなる群から選択されるプロモーターに作動可能に連結している、請求項１４から２０までのいずれか１項に記載の組換えＨＶＴベクター。
22. ２つの異種ポリヌクレオチドがＩＲＥＳまたはＰ２Ａによって連結している、請求項１４から２１までのいずれか１項に記載の組換えＨＶＴベクター。
23. 異種ポリヌクレオチドがＨＶＴゲノムのＩＧ１遺伝子座および／またはＳＯＲＦ−ＵＳ２遺伝子座に挿入されている、請求項１４から２２までのいずれか１項に記載の組換えＨＶＴベクター。
24. 第１のポリヌクレオチドが５’末端でｍＣＭＶ ＩＥまたはＳＶ４０プロモーターに作動可能に連結している、および３’末端でＩＲＥＳまたはＰ２Ａに作動可能に連結している、請求項１４から２３までのいずれか１項に記載の組換えＨＶＴベクター。
25. 請求項１から２４までのいずれか１項に記載の組成物またはベクターの少なくとも１回の投与を含む、１つまたは複数の鳥類病原体に対して動物にワクチン接種をする方法、または動物において免疫もしくは保護性の応答を誘導する方法。
26. 鳥類病原体が、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）、伝染性ファブリキウス嚢病ウイルス（ＩＢＤＶ）、マレック病ウイルス（ＭＤＶ）、伝染性喉頭気管炎ウイルス（ＩＬＴＶ）、鳥脳脊髄炎ウイルス、鳥レオウイルス、鳥パラミキソウイルス、鳥メタニューモウイルス、鳥インフルエンザウイルス、鳥アデノウイルス、鶏痘ウイルス、鳥コロナウイルス、鳥ロタウイルス、鳥パルボウイルス、鳥アストロウイルスおよびひな貧血ウイルスコクシジウム症（アイメリア属の種）、カンピロバクター属の種、サルモネラ属の種、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｇａｌｌｉｓｅｐｔｉｃｕｍ、Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ ｓｙｎｏｖｉａｅ、パスツレラ属の種、アビバクテリウム属の種、Ｅ．ｃｏｌｉおよびクロストリジウム属の種からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
27. 動物が鳥類である、請求項２５または２６に記載の方法。