JP2006055171A - 組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルス、及びその使用 - Google Patents
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- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
【解決手段】本発明は、サイトカインをコードする外来性DNA配列を具備し、該配列がシチメンチョウ・ヘルペスウイルスのゲノムのEcoRI#9断片中のXhoI部位を具備した挿入領域へ挿入された組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、サイトカインをコードした前記の外来性DNA配列が、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスに感染した宿主細胞内で発現されることが可能な、上記の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。本発明は、シチメンチヨウ・ヘルペスウイルスのユニークな長いウイルスゲノム領域とマレック病ウイルスのユニークな短い領域とを具備した、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスとマレック病ウイルスとの組換え体キメラを提供する。
【選択図】 なし。
Description
家禽のワクチン接種に対する、よりよい解決策である。
8、及びS-HVT-062と命名されている組換え型HVTは、MDVのgA、gB、及びgDをコードした外来性DNA配列を有する組換え型HVTの態様を提供する。
G)、ウシRSウイルス融合タンパク質(BRSV F)、ウシRSウイルスヌクレオカプシドタンパク質(BRSV N)、ウシパラインフルエンザウイルス3型融合タンパク質、及びウシパラインフルエンザウイルス3型血球凝集素・ノイラミニダーゼ。
本発明は、HVTゲノムの非必須部位へ挿入された外来性DNA配列を具備した、組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスを提供する。外来性DNA配列は、組み換えHVTに感染した宿主細胞内で発現することが可能であり、その発現は、該外来性DNA配列の上流に位置するプロモーターの制御下にある。
材料と方法
シチメンチョウのヘルペスウイルスストック試料の調製
2mMグルタミン、100単位/mlペニシリン、100単位/mlストレプトマイシンを含有するダルベッコー改変イーグル培地(DMEM)(これらの成分は、Irvine Scientificまたは同等の会社から得られ、以後完全DME培地と呼ぶ)に1%ウシ胎児血清を加えた培地中、0.01PFU/細胞の感染多重度で組織培養細胞を感染させて、シチメンチョウのヘルペスウイルスストック試料を調製した。細胞変性作用が完了後、培地と細胞を採取し、細胞を臨床用遠心分離機中で3000rpmで5分遠心分離してペレットにした。感染した細胞を20%ウシ胎児血清、10%DMSOを含有する完全培地中に再懸濁し、−70℃で保存した。
シチメンチョウのヘルペスウイルス(HVT)のすべての操作は、FC−126株(ATCC#584−C)を用いて行なった。感染細胞の細胞質からのHVTウイルスDNAの調製のために、初代ニワトリ胚線維芽細胞を、細胞の増殖が始まる前に広範な細胞変性作用を引き起こすのに充分な感染多重度で感染させた。インキュベートはすべて、空気中に5%炭酸ガスを有する加湿インキュベーター中で行なった。最大に感染したが不完全な細胞溶解を示した単層(典型的には5−7日目)を採取することにより最大のDNA収率が得られた。細胞掻き取り器(Costarブランド)を用いて、培地中に感染した細胞を採取した。細胞懸濁液をGS−3ロータ(Sorvall Instruments)中で3000rpmで5℃で10分遠心分離した。得られたペレットを冷PBS(20ml/ローラービン(Roller Bottle))に再懸濁し、冷却してさらに3000rpmで10分遠心分離した。PBSをデカント後、細胞ペレットを4ml/ローラービンのRSB緩衝液(10mMトリス(pH7.5)、1mM EDTA、および1.5TmM MgCl2)に再懸濁した。NP−40(ノニデットP−40(登録商標)、Sigma)を、0.5%になるように時々攪拌して試料に加えた。試料を3000rpmで10分冷却遠心分離して、核をペレットにし、細胞破片を除去した。上清液を注意深く、15mlのCorex遠心分離管に移した。EDTA(0.5M、pH8.0)とSDS(ドデシル硫酸ナトリウム、ストック20%)を、それぞれ最終濃度5mMと1%になるように試料へ加えた。試料4mlに対して100μlのプロテイナーゼ−K(10mg/ml、Boehringer-Mannheim)を加え、混合し、45℃で1〜2時間インキュベートした。インキュベート後、等量の水飽和フェノールを試料に加え、手で静かに混合した。臨床用遠心分離機で試料を3000rpmで5分遠心分離した。酢酸ナトリウムを最終濃度0.3M(ストック溶液3M、pH5.2)になるように水層に加え、2.5容量の冷無水エタノールを添加後−70℃で30分核酸を沈殿させた。HB−4ロータ中で5℃で8000rpmで20分遠心分離して試料中のDNAをペレットにした。上清を注意深く除去し、DNAペレットを25mlの80%エタノールで洗浄した。真空下で短時間(2〜3分)乾燥し、TE緩衝液(10mMトリス(pH7.5)、1mM EDTA)の50μl/ローラービンの感染細胞に再懸濁した。典型的にはウイルスDNAの収率は、5〜10μl/ローラービンの感染細胞の範囲であった。すべてのウイルスDNAを約10℃で保存した。
50mMトリス(pH7.4)、50mM KCl、5mM MgCl2、および4種類のデオキシヌクレオチドを各400μMを含有する緩衝液中にDNAを再懸濁した。10単位のクレノウDNAポリメラーゼ(BRL)を加え、室温で15分反応を進行させた。次にDNAをフェノールで抽出し、前述のようにエタノールで沈殿させた。
USBシーケナーゼキット(Sequenase Kit)と35S−dATP(NEN)を用いて、配列決定を行なった。dGTP混合物とdITP混合物の両方を用いて、圧縮のある領域を解明した。あるいは、圧縮のある領域をホルムアミドゲルで分離した。鋳型は2本鎖プラスミドサブクローンまたは1本鎖M13サブクローンであり、プライマーは、配列決定される挿入体のすぐ外でベクターに、またはあらかじめ得られた配列に作成した。得られた配列を集合させ、Dnastarソフトウェアを用いて比較した。得られた配列の操作と比較は、Coral SoftwareのSuperclone and Superseeプログラムを用いて行なった。
制限エンドヌクレアーゼによる消化、ゲル電気泳動、ゲルからのDNAの抽出、連結、キナーゼによるリン酸化、ホスファターゼによる処理、細菌培養物の増殖、DNAによる細菌の形質転換、および他の分子生物学的方法を含む、細菌やDNAの操作方法は、マニアティス(Maniatis)ら(1982)およびサンブルック(Sambrook)ら(1989)により記載されている。種々のDNAの操作に便利な制限部位を導入するために、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を行なった。使用した方法は、インニス(Innis)ら(1990)により記載されたものである。一般に増幅された断片のサイズは500塩基対未満であり、増幅断片の決定的に重要な領域は、DNA配列決定により確認された。特に明記していない限りこれらの方法に若干変更を加えて使用した。
サザンブロッティングの一般的な方法は、マニアティス(Maniatis)ら(1982)の方法を使用した。DNAを20×SSC(1×SSC=0.15M NaCl、0.015Mクエン酸ナトリウム、pH7.0)中でニトロセルロースフィルター(S&S BA85)にブロットし、30%ホルムアミド、1×デンハルツ溶液(0.02%ポリビニルピロリドン(PVP)、0.02%ウシ血清アルブミン(BSA)、0.02%フィコール)、6×SSC、50mM NaH2PO4、pH6.8、200μg/mlサケ精子DNAよりなるハイブリダイゼーション溶液中で、55℃で4〜24時間プレハイブリダイゼーションを行なった。Bethesda Research Laboratories(BRL)のキットと1つの32p−標識ヌクレオチドを用いてニックトランスレーションにより標識した標識プローブDNAを加えた。NACSカラム(BRL)またはセファデックスG50カラム(Pharmacia)により、取り込まれなかったDNAからプローブDNAを分離した。55℃で一晩ハイブリダイゼーション後、フィルターを室温で2×SSCで1回洗浄し、次に0.1×SSC、0.1%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)で55℃で30分の洗浄を2回行なった。フィルターを乾燥しオートラジオグラフィーを行なった。
cDNAクローニングとは、現状の技術を用いてRNA分子をDNA分子に変換するために使用する方法を意味する。本出願人の方法は、グブラーとホフマン(Gubler and Hoffman 1983)、に記載されている。Bethesda Research Laboratories(Gaithersburg、メリーランド州)は、本出願人の方法にきわめて類似したcDNAクローニングキットを考案し、これは我々と同じような結果を得るために使用できる試薬のセットと方法を含む。
本方法は、カワイとニシザワ(Kawai and Nishizawa(1984))のポリブレン−DMSO法に以下の変更を加えて行なった。組換えHVTウイルスの作製は、HVTウイルスDNAと、適当なヘルペスウイルスクローン化配列が隣接する目的の外来性DNAを含有するプラスミド相同性ベクターとの相同的組換えに依存する。形質移入は、6cmのプレート(Corning plastic)の50%コンフルエンスの初代ニワトリ胚線維芽(CEF)細胞中で行なった。細胞を前日に、4μg/mlのポリブレン(1×HBSS中ストック4mg/ml)を含有するCEF増殖培地(1×F10/199、5%ウシ胎児血清、2%グルタミン、1%非必須アミノ酸、および2%ペニシリン/ストレプトマイシン)中に広げた。CEF細胞への共形質移入(コ・トランスフェクション)のために、5μgの完全なHVTDNAを、30μg/mlポリブレン(1×HBSS中ストック4mg/ml)を含有するCEF培地1ml中に懸濁した。次にDNA−ポリブレン懸濁液(1ml)を6cmプレートのCEF細胞に加え、ここから培地を吸引し、39℃で30分インキュベートした。接種物を再分散させるために、この間プレートを定期的に揺らせた。この時間の後、4mlのCEF増殖培地を洗浄プレートに直接加え、39℃でさらに2.5時間インキュベートした。この時各プレートから培地を除去し、1×HBSS中の30%DMSO(ジメチルスルホキシド、J.T.Baker Chemical Co.)2mlで室温で4分間細胞にショックを与えた。30%DMSOを注意深く除去し、単層を室温で1×HBSSで1回洗浄した。次に5mlのCEF増殖培地を添加後、細胞を39℃でインキュベートした。翌日、残存するDMSOを除去し細胞増殖を刺激するために、培地を交換した。6日以内にウイルスの細胞変性作用が明らかになる。この日から通常1週間以内に、より高力価(80%−90%CPE)の作成が可能になる。感染細胞を、20%ウシ胎児血清、10%DMSOを含有するCEF増殖培地中に再懸濁してHVTストック試料を調製し、−70℃に保存した。
クローン化した重複サブゲノムDNA断片の共形質移入(コ・トランスフェクション)によるヘルペスウイルスを作製する能力は、仮性狂犬病ウイルス(Zij1ら、1988)について証明されている。欠失および/または挿入は、共形質移入(コ・トランスフェクション)の前に直接サブゲノム断片に行われるなら、この方法によりゲノム変更を含有する高頻度のウイルスが得られ、組換えウイルスの精製に必要なスクリーニングの量を大幅に低下させる。この方法は組換えHVTの作製に使用される。
外来性DNAが酵素β−ガラクトシダーゼをコードする時、その遺伝子を含有するプラークはより容易に目で見えた。プラーク測定の間化学物質Bluogal(登録商標)(Bethesda Research Laboratories)は200〜300μg/mlのレベルでアガロース重層中に取り込まれ、活性なβ−ガラクトシダーゼを発現するプラークは青くなった。次に青いプラークを取り上げ、さらに青いプラークを単離して精製した。他の外来性DNAを、β−ガラクトシダーゼ遺伝子を置換するように相同的組換えにより挿入した。この場合組換えウイルスの精製のために青くないプラークを取り上げた。
組換えHVTウイルスにより発現される外来性抗原の発現を解析するために、CEF細胞の単層を組換えHVTで感染させて、栄養アガロース培地を重層し、39℃で4〜5日間インキュベートした。プラーク出現後、アガロース重層をプレートから除去し、単層をPBSで1回洗浄し、100%メタノールで室温で10分間固定し、細胞を空気乾燥した。PBSでプレートを再び水和した後、一次抗体をPBSで適当な希釈率で希釈し、室温で2時間から一晩細胞単層とともにインキュベートした。次に室温でPBSで3回洗浄して、結合しなかった抗体を細胞から除去した。アルカリ性ホスファターゼ結合2次抗体をPBSで希釈し、細胞とともに室温で2時間インキュベートした。次に室温で細胞をPBSで3回洗浄して、結合しなかった2次抗体を除去した。次に、発色緩衝液(100mMトリス(pH9.5)/100mM NaCl/5mM MgCl2)で単層を洗浄し、次に新たに調製した基質溶液(発色緩衝液中0.3mg/mlニトロブルーテトラゾリウム+0.15mg/ml 5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルホスフェート)で室温で10分〜一晩インキュベートした。最後に、基質溶液をTE(10mMトリス(pH7.5)/1mM EDTA)で置換して反応を停止させた。正しい抗原を発現するプラークは黒く染色される。
組換えHVTウイルス中の特定の抗原の存在を検出するための適当な免疫学的試薬が存在しない場合、ストックの純度を評価するためにプラークハイブリダイゼーション法が使用される。まずCEF細胞単層を種々の希釈率のウイルスストックで感染させて、約50〜100プラーク/10cmプレートを得て、栄養アガロース培地を重層し、39℃で4〜5日間インキュベートする。いったんプラークが出現したら、各プラークの位置をプレートの底にマークする。次にアガロース重層を除去し、プレートをPBSで洗浄し、残存するCEF単層をPBSであらかじめ浸潤させたNC膜またはBioRadナイロン膜に形質移入する(プレートに対して膜の位置を記録しておく)。次に膜を1.5mlの1.5M NaClおよび0.5M NaOHに5分間入れて、NC膜上の細胞を溶解する。膜を1.5mlの3M酢酸ナトリウム(pH5.2)中に5分間入れて中和する。次に溶解した細胞からのDNAを80℃で1時間ベークしてNC膜に結合させる。この時間の後、膜を、6×SSC、3%スキムミルク、0.5%SDS、(±)サケ精子DNA(50μg/ml)を含有する溶液中で65℃で1時間プレハイブリダイゼーションする。次に、放射標識プローブDNA(アルファ32P−dCTP)を加え、膜を65℃で一晩(約12時間)インキュベートした。ハイブリダイゼーション後NC膜を65℃で2×SSCで2回洗浄(各30分)し、次に65℃で0.5×SSCでさらに2回洗浄する。次にNC膜を乾燥し、−70℃で12時間X線フィルム(Kodak XOOMT,AR)に露光させる。陽性のシグナルをプレート上のプラークの位置と合わせて、ストックの純度を、全体に対する陽性プラークのパーセントとして記録する。
ベータガラクトシダーゼ(lacZ)遺伝子を、HVT EcoRI#7断片中のユニークなStuI部位に挿入した。マーカー遺伝子はUS2遺伝子と同じ配向である。マーカー遺伝子の詳細な説明は、図7Aと7Bに記載されている。これは標準的組換えDNA法(Maniatisら、1982およびSambrookら、1989)を用いて、以下の供給源からの制限断片を図7Aと7Bに記載の合成DNA配列と結合させて作製する。断片1は、PRVBamHI制限断片10(Lominicziら、1984)の約413塩基対のSal・BamHI制限サブ断片である。断片2は、プラスミドpJF751(Ferrariら、1985)の約3010塩基対のBamHI〜Pvu II制限断片である。断片3は、PRV BamH I制限断片#7(Lominicziら、1984)の約754塩基対のNdeI〜Sal・制限サブ断片である。
SPAFAS,Incの3週令のヒヨコからニワトリ脾臓を切開し、洗浄し、そしてシリンジ/針で破壊し細胞を放出させた。間質と破片を沈降させた後、細胞をペレットにし、PBSで2回洗浄した。細胞ペレットを低張溶解緩衝液で処理して赤血球を溶解し、脾臓細胞を回収しPBSで2回洗浄した。脾臓細胞を、5%FBSおよび5μg/mlコンカナバリンAを含有するRPMI中に5×106細胞/mlで再懸濁し、39℃で48時間インキュベートした。グアニジンイソシアネート溶解試薬とPromega RNA単離キット(Promega Corporation、マジソン、ウィスコンシン州)の試薬を用いて、細胞から全RNAを単離した。適当なアンチセンスプライマーとAMV逆転写酵素(Promega Corporation、マジソン、ウィスコンシン州)を含有する各第1の鎖反応物に、4μgの全RNAを使用した。cDNA合成は、逆転写酵素反応後の同じ試験管中で適当なセンスプライマーとVetnt(登録商標)DNAポリメラーゼ(Life Technologies,Inc.、ベセスダ、メリーランド州)を用いて行なった。
組換えHVTを作成するためにプラスミド172−07.BA2を作製した。これはゲノムHVTDNAの約25,000塩基対領域を含有する。これは、組換えHVT作製のための「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って、他のサブゲノムクローンとともに使用することができる。このプラスミドは、標準的組換えDNA法(Maniatisら、1982およびSambrookら、1989)により、以下の供給源からの2つの制限断片を結合することにより作製することができる。第1の断片はpSP64(Promega)の約2999塩基対のBamHI〜BamHI制限断片である。第2の断片は、HVT(Buckmasterら、1988)の約25,000塩基対のBamHI#2断片である。
外来性DNAをHVTに挿入するためにプラスミド172−29.31を作製した。これは、外来性DNAが挿入されるユニークなXhoI制限部位を含有する。「組換えヘルペスウイルスを作成するためのDNA共形質移入(コ・トランスフェクション)」または「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って、XhoI部位に外来性DNA挿入体を含有するプラスミドを使用すると、外来性DNAを含有するウイルスが得られる。このプラスミドは、標準的組換えDNA法(Maniatisら、1982およびSambrookら、1989)により、以下の供給源からの2つの制限断片を結合することにより作製することができる。第1の断片はpSP64(Promega)の約2999塩基対のBamHI〜BamHI制限断片である。第2の断片は、HVT(Buckmasterら、1988)の約3300塩基対のBamHI#16断片である。BamHI#16の完全な配列は配列認識番号3に記載される。この断片は、UL43 ORFがpSP64β−ラクタマーゼ遺伝子とは反対の転写配向になるようにクローン化されたことに注意すべきである。
外来性DNAをHVTに挿入するためにプラスミド172−63.1を作製した。これは、外来性DNAが挿入されるユニークなXhoI制限部位を含有する。「組換えヘルペスウイルスを作成するためのDNA共形質移入(コ・トランスフェクション)」または「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って、XhoI部位に外来性DNA挿入体を含有するプラスミドを使用すると、外来性DNAを含有するウイルスが得られる。このプラスミドは、標準的組換えDNA法(Maniatisら、1982およびSambrookら、1989)により、以下の供給源からの2つの制限断片を結合することにより作製することができる。第1の断片はpSP64(Promega)の約2999塩基対のEcoRI〜EcoRI制限断片である。第2の断片は、HVTの約5500塩基対のBamHI#9断片である。EcoRI断片は、ユニークなXhoI部位がpSP64ベクター中でユニークなHindIII部位に最も近くなるようにクローン化されたことに注意すべきである。
NDV HNとF遺伝子をHVTに挿入するために255−18.B16を作製した。NDV HNとF遺伝子は、XhoI制限部位で相同ベクター172−29.31中にSal・断片として挿入した。NDV HNとF遺伝子は、親相同ベクター中に同じ転写配向のUL43 ORF中に挿入した。Sal・断片の詳細な説明は、図12A〜12Cに記載される。挿入されたSal・断片は、標準的組換えDNA法(Maniatisら、1982およびSambrookら、1989)により、以下の供給源からの制限断片を、図12A、12Bおよび12Cに記載の合成DNA配列と結合することにより作製することができる。断片1は、PRV BamHI制限断片10(Lomnicziら、1984)の約416塩基対のSal・〜BamHI制限サブ断片である。断片2は、プラスミドpJF751(Ferrariら、1985)の約3009塩基対のBamHI〜Pvu II制限断片である。断片3は、全長NDV HN cDNAの約1200塩基対のAvaII〜EcoRI制限断片である。断片4は、プラスミドpSP64(Promega)の約179塩基対のEcoRI〜Pvu II制限断片である。断片5は、HSV−1 BamHI制限断片Nの約357塩基対のSmaI〜BamHI制限サブ断片である。断片6は、全長NDV F cDNAの約1812塩基対のBamHI〜Pst・制限断片である。断片7は、プラスミドpBR322の約235塩基対のPst・〜ScaI制限断片である。
組換えHVTを作成するためにコスミド378−50.BA1を作製した。これはゲノムHVT DNAの約29,500塩基対領域を含有する。これは、組換えヘルペスウイルス作成のための「重複するサブゲノム断片から組換えへルペスウイルスを作成するための方法」に従って、他のサブゲノムクローンとともに使用することができる。このコスミドは、以下の供給源からの2つの制限断片を結合することにより作製することができる。第1の断片はpWE15(Stratagene)の約8164塩基対のBamHI〜BamHI制限断片である。第2の断片は、HVT(Buckmasterら、1988)の約29,500塩基対のBamHI#1断片である。
組換えHVTを作成するためにコスミド407−32.1C1を作製した。これはゲノムHVT DNAの約38,850塩基対領域を含有する(図8参照)。この領域は、BamHI断片11、7、8、21、6、18、断片13の約1250塩基対、および断片1の約6,700塩基対を含有する。これは、組換えHVT作成のための「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って、他のサブゲノムクローンとともに使用することができる。このコスミドは、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って、前記したように作製することができる。これは、プローブP1とP4(図8に記載)によりスクリーニングして、剪断したDNAライブラリーから単離した。このコスミドを含有する細菌株は、特許手続き上の微生物の国際寄託に関するブダペスト条約に従って、1993年3月3日にアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)(12301パークローン・ドライブ、ロックヴィル、メリーランド州20852、米国)の特許培養物保管局に、ATCC受託番号75428で寄託されている。
組換えHVTを作成するためにコスミド407−32.5G6を作製した。これはゲノムHVT DNAの約40,000塩基対領域を含有する(図8参照)。この領域は、BamHI断片9、3、20、12、16、13、断片2の約1,650塩基対、および断片11の約4,000塩基対を含有する。これは、組換えHVT作成のための「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って、他のサブゲノムクローンとともに使用することができる。このコスミドは、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って、前記したように作製することができる。これは、プローブP2とP3(図8に記載)によりスクリーニングして、剪断したDNAライブラリーから単離した。このコスミドを含有する細菌株は、特許手続き上の微生物の国際寄託に関するブダペスト条約に従って、1993年3月3日にアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)(12301パークローン・ドライブ、ロックヴィル、メリーランド州20852、米国)の特許培養物保管局に、ATCC受託番号75427で寄託されている。
外来性DNAをHVTに挿入するためにプラスミド435−47.1を作製した。これは、外来性DNAが挿入されるユニークなHindIII制限酵素部位を含有する。「組換えヘルペスウイルスを作成するためのDNA共形質移入(コ・トランスフェクション)」または「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って、HindIII部位に外来性DNA挿入体を含有するプラスミドを使用すると、外来性DNAを含有するウイルスが得られる。このプラスミドは、標準的組換えDNA法(Maniatisら、1982およびSambrookら、1989)により、以下の供給源からの2つの制限断片を結合することにより作製することができる。第1の断片はpSP64(Promega)の約2999塩基対のEcoRI〜EcoRI制限断片である。第2の断片は、HVTの約7300塩基対のEcoRI#7断片である。pSP64ベクターのHindIII部位は、サブクローンをHindIIIで消化し、次にクレノウ充填反応と再連結により除去したことに注意すべきである。次に、合成HindIIIリンカー(CAAGCTTG)を、EcoRI#7断片のユニークなStuI部位に挿入した。
組換えHVTを作成するためにプラスミド437−26.24を作製した。これはゲノムHVT DNAの約13,600塩基対領域を含有する。これは、組換えHVT作成のための「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って、他のサブゲノムクローンとともに使用することができる。このプラスミドは、標準的組換えDNA法(Maniatisら、1982およびSambrookら、1989)により、以下の供給源からの2つの制限断片を結合することにより作製することができる。第1の断片はpSP64(Promega)の約2970塩基対のHindIII〜BamHI制限断片である。第2の断片は、HVTのBamHI#2断片の約13,600塩基対のBamHI〜StuIサブ断片である(Buckmasterら、1988)。BamHI#2断片は5つのStuI部位を含有し、このサブクローニングに使用される部位は、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に記載のようにHindIII部位に変換したことに注意すべきである。
組換えHVTを作成するためにプラスミド437−26.26を作製した。これはゲノムHVTDNAの約15,300塩基対領域を含有する。これは、組換えHVT作成のための「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って、他のサブゲノムクローンとともに使用することができる。このプラスミドは、標準的組換えDNA法(Maniatisら、1982およびSambrookら、1989)により、以下の供給源からの2つの制限断片を結合することにより作製することができる。第1の断片はpSP64(Promega)の約2970塩基対のHindIII〜BamHI制限断片である。第2の断片は、HVTのBamHI#2断片の約15,300塩基対のBamHI〜StuIサブ断片である(Buckmasterら、1988)。BamHI#2断片は5つのStuI部位を含有し、このサブクローニングに使用される部位は、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に記載のようにHindIII部位に変換したことに注意すべきである。
HVTにMDVgAおよびgB遺伝子を挿入するためにプラスミド456−18.18および456−17.22を作製した。MDV遺伝子は、ユニークなHindIII部位で相同ベクター435−47.1にカセットとして挿入した。MDV遺伝子は、平滑末端Hind III部位に、平滑末端Pst・〜EcoRI断片として挿入した(図10Aと10Bを参照)。HindIIIとEcoRI部位は、クレノウ充填反応により平滑化した。Pst・部位は、T4 DNAポリメラーゼ反応により平滑化した。MDVカセットは両方の配向で挿入されたことに注意すべきである。プラスミド456−18.18は、親相同ベクター中のUS2遺伝子と反対の転写配向で挿入されたMDV遺伝子を含有する。プラスミド456−17.22は、親相同ベクター中のUS2遺伝子と同じ転写配向で挿入されたMDV遺伝子を含有する。MDVカセットの詳細な説明は、図10Aと10Bに記載される。これは、標準的組換えDNA法(Maniatisら、1982およびSambrookら、1989)により、以下の供給源からの制限断片を図10Aと10Bに記載の合成DNA配列と結合することにより作製することができる。断片1は、MDV
EcoRIの6.9KBゲノム制限断片の約2178塩基対のPvuII〜EcoRV制限サブ断片である(Iharaら、1989)。断片2は、約3898塩基対のSal・〜EcoRIゲノムMDV断片である(Rossら、1989)。
HVTに伝染性咽頭気管炎(ILT)ウイルスgD遺伝子を挿入するためにプラスミド528−03.37を作製した。PRV gXポリアデニル化シグナルが後に続くgD遺伝子は、ユニークなHindIII部位で相同ベクター435−47.1にカセットとして挿入した。このカセットは、標準的組換えDNA法(Maniatisら、1982およびSambrookら、1989)により、以下の供給源からの制限断片を結合することにより作製することができる。第1の断片は、ILT KpnIゲノム制限断片#8の約2060塩基対のEcoRI〜BclI制限サブ断片である(10.6KB)。第2の断片は、PRV BamHI制限断片#7の約754塩基対のNdeI〜Sal・制限サブ断片である(Lomnicziら、1984)。これらの断片はBclIとNdeIが隣接するように配置されていることに注意すべきである。
HVTに伝染性咽頭気管炎(ILT)ウイルスgB遺伝子(A.M.Grifin、1991)を挿入するためにプラスミド528−11.43を作製した。gB遺伝子は、ユニークなHindIII部位で相同ベクター435−47.1にEcoRI断片として挿入した。gB遺伝子は、平滑末端HindIII部位で平滑末端EcoRI断片として挿入した。HindIIIとEcoRI部位は、クレノウ充填反応により平滑化した。gB遺伝子は、親相同ベクター中にUS2遺伝子と同じ転写配向で挿入された。EcoRI断片は、3.0KBのILTウイルスゲノム断片として得られる。
外来性DNAをHVTに挿入するためにプラスミド528−46.B3を作製した。これは、外来性DNAが挿入されるユニークなHindIII制限酵素部位を含有する。「組換えヘルペスウイルスを作成するためのDNA共形質移入(コ・トランスフェクション)」または「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って、HindIII部位に外来性DNA挿入体を含有するプラスミドを使用すると、外来性DNAを含有するウイルスが得られる。このプラスミドは、標準的組換えDNA法(Maniatisら、1982およびSambrookら、1989)により、以下の供給源からの3つの制限断片を結合することにより作製することができる。第1の断片はpSP64(Promega)の約1649塩基対のPvuII〜Sal・制限断片である。第2の断片は、pSP65(Promega)の約1368塩基対のPvuII〜Sal・制限断片である。第3の断片は、プラスミド437−47.1の約3400塩基対のXhoI〜XhoI断片である。
HVTにMDV gBとgA遺伝子およびNDV F遺伝子を挿入するためにプラスミド535−70.3を作製した。F遺伝子は、MDV gBとgA遺伝子(Junction B、図10Aを参照)の間に位置するHindIII部位で相同ベクター456−17.22にカセットとして挿入した。F遺伝子は、HCMV極初期プロモーターの制御下にあり、後ろにHSV−1 TKポリアデニル化シグナルが続く。F遺伝子は親相同ベクター中のUS2遺伝子と同じ転写配向で挿入した。このカセットは、標準的組換えDNA法(Maniatisら、1982およびSambrookら、1989)により、以下の供給源からの制限断片を結合することにより作製することができる。第1の断片は、HCMVゲノムXba・E断片(D.R. Thomsenら、1981)の約1191塩基対のPst・〜AvaII制限サブ断片である。第2の断片は、全長NDV F cDNAクローン(B1株)の約1812塩基対のBamHI〜Pst・制限断片である。最後の断片は、HSV−1BamHI制限断片Q(McGeochら、1985)の約784塩基対のSmaI〜SmaI制限サブ断片である。
HVTにMDV gBとgA遺伝子およびNDV HNとF遺伝子を挿入するためにプラスミド549−24.15を作製した。HNとF遺伝子は、MDV gAとgB遺伝子(Junction B、図10Aを参照)の間に位置するHindIII部位で相同ベクター456−17.22にカセットとして挿入した。HNとF遺伝子は、それぞれPRV gpXおよびHCMV極初期プロモーターの制御下にある。HNとF遺伝子は、後ろにそれぞれPRV gXポリおよびHSV−1 TKアデニル化シグナルが続く。このカセットは、標準的組換えDNA法(Maniatisら、1982およびSambrookら、1989)により、以下の供給源からの制限断片を結合することにより作製することができる。第1の断片は、PRV BamHI断片#10(Lomnicziら、1984)の約413塩基対のSal・〜BamHI制限サブ断片である。第2の断片は、全長NDV HN cDNAクローン(B1株)の約1811塩基対のAvaII〜NaeI制限断片である。第3の断片は、PRV BamHI断片#7(Lomnicziら、1984)の約754塩基対のNdeI〜Sal・制限サブ断片である。第4の断片は、HCMVゲノムXba・E断片(D.R.Thomsenら、1981)の約1191塩基対のPst・〜AvaII制限サブ断片である。第5の断片は、全長NDV F cDNAクローン(B1株)の約1812塩基対のBamHI〜Pst・制限断片である。最後の断片は、HSV−1 BamHI制限断片Q(McGeochら、1985)の約784塩基対のSmaI〜SmaI制限サブ断片である。
HVTにMDV gBとgA遺伝子およびNDV HNを挿入するためにプラスミド549−62.10を作製した。HN遺伝子は、MDV gAとgB遺伝子(Junction B、図10Aを参照)の間に位置するHindIII部位で相同ベクター456−17.22にカセットとして挿入した。HN遺伝子は、PRV gpXプロモーターの制御下にあり、後ろにPRV gXポリアデニル化シグナルが続く。HN遺伝子は親相同ベクター中のUS2遺伝子と同じ転写配向で挿入した。このカセットは、標準的組換えDNA法(Maniatisら、1982およびSambrookら、1989)により、以下の供給源からの制限断片を結合することにより作製することができる。第1の断片は、PRV BamHI断片#10(Lomnicziら、1984)の約413塩基対のSal・〜BamHI制限サブ断片である。第2の断片は、全長NDV HN cDNAクローン(B1株)の約1811塩基対のAvaII〜NaeI制限断片である。最後の断片は、PRV BamHI断片#7(Lomnicziら、1984)の約754塩基対のNdeI〜Sal・制限サブ断片である。
組換えHVTを作成するためにプラスミド550−60.6を作製した。これは、ゲノムHVT DNAの約12,300塩基対領域を含有する。これは、組換えHVTを作製するための「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って、他のサブゲノムクローンとともに使用することができる。このプラスミドは、標準的組換えDNA法(Maniatisら、1982およびSambrookら、1989)により、以下の供給源からの2つの制限断片を結合することにより作製することができる。第1の断片は、pBR322の約4176塩基対のEcoRV〜BamHI制限断片である。第2の断片は、HVT(Buckmasterら、1988)の約12,300塩基対のBamHI#2断片である。この断片は、以下の方法で作成した。プラスミド437−26.26をHindIIIで線状化し、次にExoIII Mung Bean Deletion Kit(Stratagene)で切除した。3および4分反応の試料を一緒にし、BamHIで消化して目的の12,300塩基対サブ断片を含有する断片の集団を得た。この集団をpBR322断片にクローン化し、得られるクローンを適当なサイズと制限地図についてスクリーニングした。偶然にもクローン550−60.6を作成した切除されたサブ断片は、pBR322のEcoRV部位(ATCC)に連結する時第2のBamHIを生成するヌクレオチドGGで終わった。このプラスミドを含有する細菌株は、特許手続き上の微生物の国際寄託に関するブダペスト条約に従って、1993年3月3日にアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)(12301パークローン・ドライブ、ロックヴィル、メリーランド州20852、米国)の特許培養物保管局に、ATCC受託番号75429で寄託されている。
HVTにMDV gA、gBおよびgD遺伝子を挿入するためにプラスミド566−41.5を作製した。MDV gD遺伝子は、MDV gAとgB(図10Aと10Bを参照)の間に位置するHindIII部位で相同ベクター456−17.22にHindIII断片として挿入した。MDV遺伝子は親相同ベクター中のgAおよびgBと同じ転写配向で挿入した。MDV gD遺伝子を含有するHindIII断片の詳細な説明は、図11Aおよび11Bに記載される。ヘルペスウイルスポリアデニル化シグナルは、gD遺伝子カセットに加えた。この挿入HindIII断片は、標準的組換えDNA法(Maniatisら、1982およびSambrookら、1989)により、以下の供給源からの制限断片を図11Aと11Bに記載の合成DNA配列に結合することにより作製することができる。第1の断片は、HSV−1 BamHI制限断片Q(McGeochら、1988)の約784塩基対のSma・〜SmaI制限サブ断片である。この断片は、ポリアデニル化配列(AATAAA)が結合部Bに最も近く位置するように配向していることに注意すべきである。断片2は、MDV BglII4.2KBのゲノム制限断片(Rossら、1991)の約2177塩基対のSal・〜NcoIサブ断片である。
HVTにMDV gB、gAおよびgD遺伝子および伝染性気管支炎ウイルス(IBV)マトリックスおよびスパイク遺伝子を挿入するためにプラスミド567−72.IDを作製した。IBV遺伝子は、MDV gD遺伝子(JunctionC、図11Bを参照)の上流に位置するユニークなNotI部位で相同ベクター566−41.5にカセットとして挿入した。IBVスパイクおよびマトリックス遺伝子は、それぞれHCMV極初期プロモーターおよびPRV gpXプロモーターの制御下にある。IBVスパイクおよびマトリックス遺伝子の後ろに、それぞれHSV−1 TKおよびPVR gXポリアデニル化シグナルが続く。IBV遺伝子は親相同ベクター中のUS2遺伝子と同じ転写配向で挿入した。このカセットは、標準的組換えDNA法(Maniatisら、1982およびSambrookら、1989)により、以下の供給源からの制限断片を結合することにより作製することができる。第1の断片は、PRV BamHI断片#10(Omnicziら、断片は、IBVマトリックス遺伝子のアミノ酸1〜223を含有する。コード領域は、IBVのArkansas株のcDNAクローンから得られた。第3の断片は、PRV BamHI制限断片#7(Omnicziら、1984)の約754塩基対のNdeI〜Sal・制限サブ断片である。第4の断片は、HCMVゲノムXba・断片(D.R.Thomsenら、1981)の約1191塩基対のPst・〜AvaII制限サブ断片である。第5の断片は、IBVスパイク遺伝子のアミノ酸4〜1162を含有する。コード領域は、IBVのArkansas株のcDNAクローンから得られた。最後の断片は、HSV−1 BamHI制限断片Q(McGeochら、1985)の約784塩基対のSmaI〜SmaI制限サブ断片である。
HVTにIBDVVP2遺伝子を挿入するためにプラスミド603−57.F1を作製した。IBDV VP2遺伝子は、ユニークなHindIII部位で相同ベクター435−47.1にカセットとして挿入した。VP2遺伝子は、HCMV極初期プロモーターの制御下にあり、後ろにHSV−1
TKポリアデニル化シグナルが続く。VP2遺伝子は親相同ベクター中のUS2と同じ転写配向で挿入した。このカセットは、標準的組換えDNA法(Maniatisら、1982およびSambrookら、1989)により、以下の供給源からの制限断片を結合することにより作製することができる。第1の断片は、HCMVゲノムXbaI E断片(D.R.Thomsenら、1981)の約1191塩基対のPst・〜AvaII制限サブ断片である。第2の断片は、全長IBDV cDNAクローン(配列認識番号1を参照)の約1081塩基対のBclI〜BamHI制限サブ断片である。BclI部位は、配列CGCAGCをTGATCAに変換することにより、VP2開始メチオニンのすぐ上流でcDNAクローンに導入されることに注意すべきである。第1と第2の断片は、AvaII部位とBclI部位が隣接するように配置される。第3の断片は、HSV−1 BamHI制限断片Q(McGeochら、1985)の約784塩基対のSmaI〜SmaI制限サブ断片である。
HVTにMDV gB、gAおよびgD遺伝子およびNDV HNとf遺伝子を挿入するためにプラスミド633−13.27を作製した。HN遺伝子とF遺伝子は、それぞれPRV gpXとHCMV極初期プロモーターの制御下にある。HN遺伝子とF遺伝子の後ろに、それぞれPRV gXポリおよびHSV−1 TKアデニル化シグナルが続く。5つのすべての遺伝子は親相同ベクター中のUS2遺伝子と同じ転写配向で挿入した。遺伝子は、MDV gA、NDVHN、NDV F、MDV gDおよびMDV gBの順序で挿入した。
HVTにILTウイルスgBとgD遺伝子を挿入するためにプラスミド634−29.16を作製した。ILT gBとgD遺伝子が後に続くlacZマーカー遺伝子は、ユニークなXhoI部位で相同ベクター172−29.31にカセットとして挿入した。このカセットは、標準的組換えDNA法(Maniatisら、1982およびSambrookら、1989)により、以下の供給源からの制限断片を結合することにより作製することができる。第1の断片は、前記のおよび図7Aと7Bに記載のlacZマーカー遺伝子から得られる約4229塩基対のSal・〜Sal・制限断片である。第2の断片は、ILT KpnIゲノム制限断片#8(10.6KB)の約2060塩基対のEcoRI〜BclI制限サブ断片である。第3の断片は、PRV BamHI制限断片#7(Lomnicziら、1984)の約754塩基対のNdeI〜Sal・制限サブ断片である。第2と第3の断片は、BclIとNdeI部位が隣接するように配置されることに注意すべきである。第4の断片は、gB遺伝子を含有する3.0KBのILTウイルスゲノムEcoRI断片である。3つのすべての遺伝子は、UL43遺伝子と同じ転写配向である。
組換えHVTを作成するためにコスミド415−09.BA1を作製した。これは、ゲノムHVT DNAの約29,500塩基対のBamHI#1断片を含有する。これは、組換えHVTを作成するための「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って、他のサブゲノムクローンとともに使用した。このコスミドは、以下の供給源からの2つの制限断片(Sambrookら、1989)を結合することにより作製した。このベクターは、pHC79(Bethesda Research Laboratories,Inc.)とpWE15(Stratagene)から得られるpSY1005の約4430塩基対のBamHI〜BamHI制限断片である。第1の断片は、HVTゲノム(Buckmasterら、1988)の約29,500塩基対のBamHI#1断片である。
組換えHVTを作成するためにコスミド672−01.A40を作製した。これは、コスミド407−32.1C1(図8と15を参照)のサブクローンとして単離した。コスミド672−01.A40は、コスミド407−32.1C1の約14,000塩基対のNotI〜AscIサブ断片と約1300塩基対のAscI〜BamHIサブ断片を含有する。このコスミドは、以下の供給源からの制限断片(Sambrookら、1989)を結合することにより作製した。このベクターは、SmaI部位に挿入されたNotIリンカーを含有するpNEB193(New England Biolabs,Inc.)から作製した約2700塩基対のNotI〜BamHI断片である。断片1は、ゲノムHVT DNAの約15,300塩基対領域である。この領域はBamHI断片11と7、および断片13の約1250塩基対を含有する。これは、組換えHVTを作成するための「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って、他のサブゲノムクローンとともに使用した。
組換えHVTを作成するためにプラスミド654−45.1を作製した。これは、コスミド407−32.1C1(図8と15を参照)のAscIサブクローンとして単離した。このコスミドは、以下の供給源からの制限断片(Sambrookら、1989)を結合することにより作製した。このベクターは、クレノウDNAポリメラーゼで平滑末端にしAscIリンカーを挿入したpNEB193(New England Biolabs,Inc.)の2000塩基対のAatII〜PvuII断片から作製した約2000塩基対のAscI断片である。断片1は、ゲノムHVT DNAの約8,600塩基対のAscI〜AscI断片である。この領域はBamHI断片10と21、および断片6の約1100塩基対、および断片7の約1300塩基対を含有する。XhoI部位(ヌクレオチド#1339−1344;配列認識番号48)は、合成DNAリンカーを用いてユニークなPacI部位に変換された。PacI部位は、HVT中のの外来性DNAの挿入と発現に使用した。(図13Aを参照)。これは、組換えHVTを作製するための「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って、他のサブゲノムクローンとともに使用した。
組換えHVTを作成するためにプラスミド686−63.A1を作製した。これは、コスミド407−32.1C1(図8、15を参照)のAscIサブクローンとして単離した。このコスミドは、以下の供給源からの制限断片(Sambrookら、1989)を結合することにより作製した。このベクターは、クレノウDNAポリメラーゼで平滑末端にしAscIリンカーを挿入したpNEB193(New England Biolabs,Inc.)の2000塩基対のAatII〜PvuII断片から作製した約2000塩基対のAscI断片である。断片1は、ゲノムHVT DNAの約8,600塩基対のAscI〜AscI断片である。この領域はBamHI断片10と21、および断片6の約1100塩基対、および断片7の約1300塩基対を含有する。XhoI部位(ヌクレオチド#1339−1344;配列認識番号48)は、合成DNAリンカーを用いてユニークなNotI部位に変換された。NotI部位は、HVT中の外来性DNAの挿入と発現に使用した。(図13Bを参照)。これは、組換えHVTを作製するための「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って、他のサブゲノムクローンとともに使用した。
組換えHVTを作成するためにコスミド672−07.C40を作製した。これは、コスミド407−32.1C1(図8と15を参照)のサブクローンとして単離した。コスミド672−07.C40は、は、コスミド407−32.1C1の約1100塩基対のBamHI〜AscIサブ断片および約13,000塩基対のAscI〜NotIサブ断片を含有する。このコスミドは、以下の供給源からの制限断片(Sambrookら、1989)を結合することにより作製した。このベクターは、SmaI部位に挿入されたNotIリンカー含有するpNEB193(New England Biolabs,Inc.)の約2700塩基対のNotI〜BamHI断片である。断片1は、ゲノムHVT DNAの約14,000塩基対領域である。この領域は、BamHI断片6と18、およびBamHI断片#1内の約2600塩基対のBamHI〜NotIを含有する。これは、組換えHVTを作製するための「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って、他のサブゲノムクローンとともに使用した。
組換えHVTを作成するためにプラスミド706−57.A3を作製した。プラスミド706−57.A3は、プラスミド654−45.1のPacI部位に挿入されたIBDV VP2遺伝子を含有する。IBDV VP2遺伝子は、IBRV VP8プロモーターとILTV US3ポリアデニル化シグナルを使用する。このコスミドは、標準的組換えDNA法(Sambrookら、1989)により作製した。第1の断片は、IBRV VP8プロモーター(Carpenterら、1991)をコードする208塩基対のHindIII〜BamHI断片である。第2の断片は、IBRV標準的感染(challenge)株(USDA)ゲノムRNA(Kibengeら、1990)の逆転写およびポリメラーゼ連鎖反応(Sambrookら、1989)により得られるIBRV VP2遺伝子をコードする約1626塩基対断片である。逆転写とPCRに使用したアンチセンスプライマーは、5’−CTGGTTCGGCCCATGATCAGATGACAAACCTGCAAGATC−3’(配列認識番号53)である。PCRに使用したセンスプライマーは、5’−CTGGTTCGGCCCATGATCAGATGACAAACCTGCAAGATC−3’(配列認識番号54)である。PCRにより作成したDNA断片を、PCR−Direct(登録商標)ベクター(Clontech Laboratories,Inc.、パロアルト(Palo Alto)、カリホルニア州)内にクローン化した。次にIBRV VP2断片を、PCRプライマーにより作成したBclI部位を用いて、VP8プロモーターにサブクローニングした。この結合部のDNA配列は、VP2活性開始メチオニンの前にアミノ酸メチオニン、アスパラギン酸およびグルタミン酸が添加されている。このDNA断片は、VP2タンパク質の全コード配列を含有するIBDVポリタンパク質(配列認識番号2)のアミノ酸1〜アミノ酸536のコード配列を含有する。第3の断片は、ILTV US3ポリアデニル化シグナルをコードする約494塩基対断片である。
gDおよびgI遺伝子は、それぞれの内因性ILTVプロモーターと1つの共通の内因性ポリアデニル化シグナルを使用する。このプラスミドは、標準的組換えDNA法(Sambrookら、1989)により作製した。第1の断片は、ILTV Asp718Iゲノム断片#8(10.6 kb)の約3556塩基対のSal・〜HindIII制限断片である。
組換えHVTを作成するためにプラスミド717−38.12を作製した。プラスミド717−38.12は、プラスミド654−45.1のPacI部位に挿入されたNDV HN遺伝子とF遺伝子を含有する。NDV HN遺伝子は、PRV gXプロモーターとPRV gXポリアデニル化シグナルを使用する。NDV F遺伝子は、HCMV極初期プロモーターとHSV TKポリアデニル化シグナルを使用する。このプラスミドは、標準的組換えDNA法(Sambrookら、1989)を用いて作製した。第1の断片は、PRV BamHI断片#10(Lomnicziら、1984)の約413塩基対のSal・〜BamHI制限サブ断片である。第2の断片は、全長NDV HN cDNAクローン(B1株)の約1811塩基対のAvaII〜NaeI制限断片である。第3の断片は、PRV BamHI制限断片#7(Lomnicziら、1984)の約754塩基対のNdeI〜Sal・制限サブ断片である。第4の断片は、HCMVゲノムXba・E断片(D.R.Thomsenら、1981)の約1191塩基対のPst・〜AvaII制限サブ断片である。第5の断片は、全長NDV F cDNAクローン(B1株:配列認識番号12)の約1812塩基対のBamHI〜Pst・制限断片である。第6の断片は、HSV−1 BamHI制限断片Q(McGeochら、1985)の約784塩基対のSmaI〜SmaI制限サブ断片である。
HVTのユニークなショートにMDV gA、gD、およびgB遺伝子を挿入するため、および組換えHVTを作成するために、コスミド721−38.1Jを作製した。コスミド721−38.1Jは、HVTのユニークな短い領域のBamHI#1断片内のユニークなHindIIIに変換したHVT US2遺伝子内のStuI部位に挿入したMDV gA、gDおよびgB遺伝子を含有する。MDV遺伝子を含有するHVT BamHI#1断片のこの領域は、S−HVT−062から得られた。コスミド721−38.1Jは、S−HVT−062 DNAのBamHIによる部分制限消化および約39,300塩基対断片の単離により作製した。このコスミドは、標準的組換えDNA法(Sambrookら、1989)
を用いて、以下の供給源からの制限断片を結合することにより作製した。このベクターは、コスミドベクターpWE15からの約8200塩基対のBamHI断片である。第1の断片は、HVTゲノムの繰り返し領域からの約900塩基対のBamHI断片である。第2の断片は、HVTのBamHI#1の約15,500塩基対のBamHI〜StuIサブ断片である。第3の断片は、MDV gA、gDおよびgB遺伝子(図10と11を参照)を含有する約8400塩基対カセットである。第4の断片は、HVTのBamHI#1の約14,500塩基対のHindIII〜BamHIサブ断片である。
HVTのユニークな短い領域にMDV gA、gD、gB遺伝子ならびにNDV HN遺伝子およびF遺伝子を挿入するため、ならびに組換えHVTを作成するために、コスミド722−60.E2を作製した。コスミド722−60.E2は、HVTのユニークな短い領域のBamHI#1断片内のユニークなHindIIIに変換したHVT US2遺伝子内のStuI部位に挿入したMDV gA、gDおよびgB遺伝子およびNDV HN遺伝子およびF遺伝子を含有する。すべての5つの遺伝子を、HVTUS2遺伝子と同じ転写配向で導入した。MDVとNDV遺伝子を含有するHVT BamHI#1断片のこの領域は、S−HVT−106から得られた。コスミド722−60.E2は、S−HVT−106のBamHIによる部分制限消化および約46,300塩基対断片の単離により作製した。このコスミドは、標準的組換えDNA法(Sambrookら、1989)を用いて、以下の供給源からの制限断片を結合することにより作製した。このベクターは、pHC79(Bethesda Research Laboratories,Inc.)およびpWE15(Stratagene,Inc.)から得られたコスミドベクターpSY1626からの約6100塩基対のBamHI断片である。第1の断片は、HVTゲノムの繰り返し領域からの約900塩基対のBamHI断片である。第2の断片は、HVTのBamHI#1の約15,500塩基対のBamHI〜StuIサブ断片である。第3の断片は、MDV gA遺伝子(図10A10b、配列認識番号8を参照)、PRV gXプロモーター(Lomnicziら、1984)、NDV HN遺伝子(配列認識番号10)、PRV gXポリアデニル化部位(Lomnicziら、1984)、HCMV極初期プロモーター(D.R.Thomsenら、1981)、NDV F遺伝子(配列認識番号
12)、HCV TKポリアデニル化部位(McGeochら、1985)、MDV gD遺伝子(図11Aおよび11B)、約450塩基対のILTV US3ポリアデニル化部位、およびMDV gB遺伝子(図10Aと10B)を含有する約15,400塩基対カセットである。第4の断片は、HVTのBamHI#1の約14,500塩基対のStuI〜BamHIサブ断片である。
組換えHVTを作成するために、プラスミド729−37.1を作製した。プラスミド729−37.1は、プラスミド686−63.AのNotI部位に挿入されたILTV gDおよびgA遺伝子を含有する。ILTV gDおよびgB遺伝子は、それぞれの内因性ILTVプロモーターを使用し、ILTV gDおよびgB遺伝子は、それぞれPRV
gXポリアデニル化シグナルが後に続く。ILTV gDおよびgB遺伝子は、標準的組換えDNA法(Sambrookら、1989)を用いて作製した。第1の断片は、ILTV Asp718Iゲノム断片#8(10.6 kb)の約2052塩基対のSal・〜Xba・制限サブ断片である。第2の断片は、PRV BamHI制限断片#7(Lomnicziら、1984)の約572塩基対のXba・〜Asp718I制限サブ断片である。第3の断片は、ILTVゲノムDNAの約3059塩基対のEcoRI〜EcoRI制限断片である。第4の断片は、PRV BamHI制限断片#7(Lomnicziら、1984)の約222塩基対のEcoRI〜Sal・制限サブ断片である。
ユニークな長い領域のHVT遺伝子とユニークな短い領域のMDV 1型遺伝子を含有する非キメラHVT/MDVウイルスを作製するために、コスミド739−27.16を作製した。コスミド739−27.16は、MDV 1型の完全なユニークな短い領域を含有する。この領域は、全SmaI B断片と2つのSmaI K断片を含有する。コスミド739−27.16は、MDV DNAのSmaIによる部分的制限消化と約29,000〜33,000塩基対断片の単離により作製した。このコスミドは、標準的組換えDNA法(Sambrookら、1989)を用いて、以下の供給源からの制限断片を結合することにより作製した。このベクターは、コスミドベクターpWE15からの約8200塩基対のBamHI断片(クレノウDNAポリメラーゼにより平滑末端にされた)である。第1の断片は、MDVゲノムの短い内部繰り返し領域からの約4050塩基対のSmaI K断片である。第2の断片は、MDVの約21,000塩基対断片SmaIである。第3の断片は、MDVゲノム(Fukuchiら、1984、1985)の短い末端繰り返し領域からの約3,650塩基対のSmaI K断片である。
組換えHVTを作成するために、プラスミド751−87.A8を作製した。プラスミド751−87.A8は、プラスミド654−45.1のPacI部位に挿入されたニワトリ骨髄単球性増殖因子(cGMF)遺伝子を含有する。cMGF遺伝子は、HCMV極初期プロモーターおよびHIV−1 TKポリアデニル化シグナルを使用する。このコスミドは標準的組換えDNA法(Sambrookら、1989)を用いて作製した。以下の断片を、HVTサブゲノムクローン654−45.1のPacI部位に挿入した。第1の断片は、HCMVゲノムXba・E断片(D.R.Thomsenら、1981)の約1191塩基対のPst・〜AvaII制限サブ断片である。第2の断片は、「コンカナバリンAで刺激したニワトリ脾臓細胞から単離されたRNA」の逆転写とポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(Sambrookら、1989)により得られたcMGF遺伝子(58)をコードする、約640塩基対の断片である。逆転写とPCRに使用したアンチセンスプライマーは、5’−CGCAGGATCCGGGGCGTCAGAGGCGGGCGAGGTG−3’(配列認識番号57)である。PCRに使用したセンスプライマーは、5’−GAGCGGATCCTGCAGGAGGAGACACAGAGCTG−3’(配列認識番号58)である。cMGF断片は、PCRプライマーにより作成したBamHI部位を用いて、HCMV IEプロモーターの隣でサブクローニングした。このDNA断片は、成熟cMGFタンパク質のアミノ末端の23個のアミノ酸のリーダー配列と178アミノ酸を含有するcMGFタンパク質(58)の、アミノ酸1からアミノ酸201のコード配列を含有する。第3の断片は、HSV−1
BamHI制限断片Q(McGeochら、1985)の約784塩基対のSmaI〜SmaI制限サブ断片である。
組換えHVTを作成するために、プラスミド761−07.A1を作製した。プラスミド761−07.A1は、プラスミド654−45.1のPacI部位に挿入されたニワトリインターフェロン遺伝子を含有する。ニワトリインターフェロン遺伝子は、HCMV極初期プロモーターおよびHIV−1 TKポリアデニル化シグナルを使用する。このコスミドは標準的組換えDNA法(Sambrookら、1989)を用いて作製した。以下の断片を、HVTサブゲノムクローン654−45.1のPacI部位に挿入した。第1の断片は、HCMVゲノムXba・E断片(D.R.Thomsenら、1981)の約1191塩基対のPst・〜AvaII制限サブ断片である。第2の断片は、「コンカナバリンAで刺激したニワトリ脾臓細胞から単離されたRNA」の逆転写とポリメラーゼ連鎖反応(PCR)(Sambrookら、1989)により得られたニワトリインターフェロン遺伝子(58)をコードする、約577塩基対の断片である。逆転写とPCRに使用したアンチセンスプライマーは、5’−TGTAGAGATCTGGCTAAGTGCGCGTGTTGCCTG−3’(配列認識番号59)である。PCRに使用したセンスプライマーは、5’−TGTACAGATCTCACCATGGCTGTGCCTGCAAGC−3’(配列認識番号60)である。ニワトリインターフェロン遺伝子断片は、PCRプライマーにより作成したBglII部位を用いて、HCMV IEプロモーターの隣でサブクローニングした。このDNA断片は、ニワトリインターフェロンをコードする成熟タンパク質のアミノ末端の31個のアミノ酸のシグナル配列と162アミノ酸を含有するニワトリインターフェロンタンパク質(59)の、アミノ酸1からアミノ酸193のコード配列を含有する。第3の断片は、HSV−1 BamHI制限断片Q(McGeochら、1985)の約784塩基対のSmaI〜SmaI制限サブ断片である。
S−HVT−001は、HVTゲノムのユニークな長い領域内に挿入された大腸菌(E.coli)β−ガラクトシダーゼ遺伝子を含有するシチメンチョウのヘルペスウイルス(HVT)である。HVTの制限酵素地図は公表されている(T.Igarashiら、1985)。この情報は、HVTに外来性DNAを挿入するための出発点として使用した。HVTのBamHI制限酵素地図は、図1Aに示す。このデータから、外来遺伝子が挿入されるHVTDNAのいくつかの異なる領域がターゲティングされる。挿入のために選択された外来遺伝子は、PRVで使用した大腸菌(E.coli)β−ガラクトシダーゼ(lacZ)遺伝子である。プロモーターはPRVgpXプロモーターである。lacZ遺伝子をHVTのユニークな長い領域内、特にBamHI#16(3329塩基対)断片のXhoI部位内に挿入し、基質Bluogal(登録商標)(Bethesda Research Laboratories)を用いると青いプラークを形成してHVT組換え体中で発現されることが証明された。同様に、lacZ遺伝子は、BamHI#19(900塩基対)断片内に含有される繰り返し領域中のSal・部位に挿入された。
S−HVT−003は、HVTゲノムのユニークな長い領域内に挿入された大腸菌(E.coli)β−ガラクトシダーゼ(lacZ)遺伝子と伝染性粘液嚢病ウイルス(IBDV)S40747のRNAの大きい断片(cDNAコピーとして)(配列認識番号1)を含有するシチメンチョウのヘルペスウイルス(HVT)である。このIBDV DNAは、3つのタンパク質をコードする1つの読みとり枠(5’VP2−VP4−VP3 3’)(配列認識番号2)を含有する(このうち2つは、ニワトリのIBDV感染を防御する抗原である)。β−ガラクトシダーゼとIBDVポリタンパク質は、仮性狂犬病ウイルス(PRV)gpX遺伝子プロモーターに支配されている。S−HVT−003は相同的組換えにより作成した。S−HVT−003は、特許手続き上の微生物の国際寄託に関するブダペスト条約に従って、1987年7月21日にアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)(12301パークローン・ドライブ、ロックヴィル、メリーランド州20852、米国)の特許培養物保管局に、ATCC受託番号2178で寄託されている。
S−HVT−004は、ユニークな長い領域内に挿入されたマレック病ウイルス(MDV)糖タンパク質A(gA)遺伝子と、ユニークな長い領域内に挿入されたβ−ガラクトシダーゼ(lacZ)遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである。MDV抗原は、HVTの同等抗原より正しい抗原応答を誘発し易い。
ニューキャッスル病ウイルス(NDV)は、全体の構造がPI−3に密接に関連している。PI−3の血球凝集(HN)遺伝子と融合(F)遺伝子を、IBR(ref)中で発現するために作成した。同様に血球凝集(HN)遺伝子と融合(F)遺伝子を、ヘルペスウイルスデリバリーシステム(シチメンチョウのヘルペスウイルス、HVT)で使用するためにNDVからクローン化した。
伝染性気管支炎ウイルス(IBV)は、全体の構造がTGEに密接に関連したニワトリのウイルスである。TGEの主要な中和抗原を、PRV(ref)中で発現するために作成した。同様に主要な中和抗原を、IBVの3つの株(Massachusetts(配列認識番号14と15)、Connecticut(配列認識番号18と19)、およびArkansas-99(配列認識番号16と17))から、ヘルペスウイルスデリバリーシステム(シチメンチョウのヘルペスウイルス、HVT)で使用するためにクローン化した。
S−HVT−045は、ユニークな短い領域内に挿入されたマレック病ウイルス(MDV)糖タンパク質B(gB)遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルス(HVT)である。このMDV抗原は、HVTの同等の抗原より正しい抗原応答を誘発し易い。S−HVT−045は、特許手続き上の微生物の国際寄託に関するブダペスト条約に従って、1992年10月15日にアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)(12301パークローン・ドライブ、ロックヴィル、メリーランド州20852、米国)の特許培養物保管局に、ATCC受託番号2383で寄託されている。
病原性マレック病ウイルスによる抗原刺激に対するこれらの組換えHVT/MDVウイルスの有効性を証明するために、2つに実験を行なった。実験Aでは、1日令の特異的病原体を含まない(SPF)ヒヨコに、S−HVT−045またはS−HVT−046をワクチン接種した。ワクチン接種7日後、ワクチン接種したヒヨコ、および対照ヒヨコである非ワクチン接種ヒヨコを、マレック病ウイルスの病原性の強いMD−5株で抗原刺激した。刺激後6週間マレック病に典型的な臨床症状を観察してから、すべてのヒヨコを剖検し、マレック病の診断ができる病変を調べた。表6に示す結果は、いずれの組換えウイルスも、非ワクチン接種対照ヒヨコの90%でマレック病を引き起こした抗原刺激に対して完全な防御を与えたことを示している。
S−HVT−012は、ユニークな短い領域中に大腸菌(E.coli)β−ガラクトシダーゼ(lacZ)遺伝子を含有するシチメンチョウの組換え型ヘルペスウイルスである。lacZ遺伝子は、HVT[ATCCF−126(”Calnek”)]中のこの挿入部位の活性を試験するために使用した。S−HVT−012は、特許手続き上の微生物の国際寄託に関するブダペスト条約に従って、1992年107月15日にアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)(12301パークローン・ドライブ、ロックヴィル、メリーランド州20852、米国)の特許培養物保管局に、ATCC受託番号2382で寄託されている。
適当な挿入部位を規定するために、HVT BamHIとEcoRI制限断片のライブラリーを作成した。これらの制限断片のいくつか(BamHI断片#16と#13、EcoRI断片#6、#7、および#9(図1を参照))に対して、制限マッピング解析を行なった。各断片で1つのユニークな制限部位を、挿入部位候補として同定した。これらの部位は、BamHI断片#13と#16とEcoRI断片#9中のXhoI部位、およびEcoRI断片#6中のSal・部位、およびEcoRI断片#7中のStuI部位である。候補部位のそれぞれにβ−ガラクトシダーゼ(lacZ)マーカー遺伝子を挿入した。
相同ベクター172−29.31は、HVT BamHI#16断片を含有し、HVTへの外来性DNAの挿入に有用である。プラスミド172−29.31は、ユニークなXhoI部位を含有し、ここに外来性DNAがクローン化される。相同ベクター172−29.31中のXhoI部位は、少なくとも3つの組換えHVT(実施例1〜3を参照)を作製して、HVTに外来性DNAを挿入するのに使用することができる。
相同ベクター435−47.R17は、HVT EcoRI#7断片を含有し、HVTへの外来性DNAの挿入に有用である。プラスミド435−47.R17は、ユニークなHindIII制限部位を含有し、ここに外来性DNAがクローン化される。プラスミド中のHindIII部位は、EcoRI断片#7の天然に存在するStuI部位にHindIIIリンカーを挿入することにより得られる。相同ベクター435−47.R17中のHindIII部位は、少なくとも25の組換えHVTの作製により、HVTに外来性DNAを挿入するために使用することができる。
相同ベクター172.63.1
相同ベクター172.63.1は、HVT EcoRI#9断片を含有し、HVTへの外来性DNAの挿入に有用である。プラスミド172.63.1は、ユニークなXhoI制限部位を含有し、ここに外来性DNAがクローン化される。相同ベクター172.63.1中のXhoI部位は、S−HVT−014の作製により、HVTに外来性DNAを挿入するために使用することができる(実施例8を参照)。
S−HVT−014は、ユニークな長い領域内に挿入された大腸菌(E.coli)β−ガラクトシダーゼ(lacZ)遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである。lacZ遺伝子は、HVT[ATCCF−126(”Calnek”)]中のこの挿入部位の活性を試験するために使用した。
DNAとプラスミドDNAは、初代ニワトリ胚線維芽細胞(CEF)中に「組換えウイルスを作成するためのDNA形質移入」法に従って共形質移入(コ・トランスフェクション)した。形質移入ストックから得られた青いウイルスを、「組換えヘルペスウイルスのBluegalスクリーニング」法を用いて、連続してプラーク精製を行って精製した。この操作の最後に、100%のプラークが青くなった。S−HVT−014は、HVTのEcoRI#9断片内にXhoI部位でゲノムに導入されたlacZ遺伝子を含有する組換えウイルスである。
S−HVT−005は、ユニークな長い領域内に挿入された大腸菌(E.coli)β−ガラクトシダーゼ(lacZ)遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである。lacZ遺伝子は、HVT[ATCCF−126(”Calnek”)]中のこの挿入部位の活性を試験するために使用した。
マレック病ウイルスからの糖タンパク質を発現する組換えHVTは、マレック病のために優れたワクチンとなる。我々は、MDV糖タンパク質を発現するいくつかの組換えHVTを作製した:S−HVT−004(実施例3)、S−HVT−045(実施例5)、S−HVT−046(実施例10A)、S−HVT−047(実施例10B)、S−HVT−062(実施例10C)。
S−HVT−046は、短いユニークな領域に挿入されたマレック病ウイルス(MDV)糖タンパク質B(gB)および糖タンパク質A(gA)遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである。MDV遺伝子は、US2遺伝子と同じ転写配向で挿入される。MDV抗原は、HVTの同等の抗原より正しい抗原性応答を誘発し易い。
S−HVT−047は、短いユニークな領域に挿入されたMDV gBおよびgA遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである。MDV遺伝子は、US2遺伝子と反対の転写配向で挿入される。MDV抗原は、HVTの同等の抗原より正しい抗原性応答を誘発し易い。
S−HVT−062は、短いユニークな領域に挿入されたMDV gB、糖タンパク質D(gD)およびgA遺伝子を含有するシチメンチヨウの組換えヘルペスウイルスである。MDV遺伝子は、US2遺伝子と同じ転写配向で挿入される。MDV抗原は、HVTの同等の抗原より正しい抗原性応答を誘発し易い。S−HVT−062は、特許手続き上の微生物の国際寄託に関するブダペスト条約に従って、1993年2月23日にアメリカンタイプカルチャーコレクション(ATCC)(12301パークローン・ドライブ、ロックヴィル、メリーランド州20852、米国)の特許培養物保管局に、ATCC受託番号2401で寄託されている。
病原性マレック病ウイルスによる抗原刺激に対する防御におけるこれらの組換えHVT/MDVウイルスの有効性を証明するために、2つに実験を行なった。実験1では、1日令の特異的病原体を含まない(SPF)ヒヨコに、S−HVT−045、S−HVT−046、またはS−HVT−047をワクチン接種した。ワクチン接種5日後、ワクチン接種したヒヨコ、および対照ヒヨコである非ワクチン接種ヒヨコを、MDVで抗原刺激した。刺激後6週間マレック病に典型的な臨床症状を観察してから、すべてのヒヨコを剖検し、マレック病の診断ができる病変を調べた。表7に示す結果は、いずれの組換えウイルスも、非ワクチン接種対照ヒヨコの84%でマレック病を引き起こした抗原刺激に対して完全な防御を与えたことを示している。
NDVからタンパク質を発現する組換えHVTは、マレック病とニューキャッスル病の両方に対して防御する2価のワクチンとなる。NDVタンパク質を発現するいくつかの組換えHVTを作成した:S−HVT−007(実施例11A)、S−HVT−048(実施例11B)、S−HVT−049(実施例11C)、S−HVT−050(実施例11D)、およびS−HVT−106(実施例11E)。
S−HVT−007は、ユニークな長い領域に挿入されたPRV gXプロモーターに制御される大腸菌(E.coli)lacZ NDV HNハイブリッドタンパク質遺伝子と、HSV−1 α4プロモーターに制御されるNDV F質遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである。NDV遺伝子は、UL43遺伝子と同じ転写配向で挿入される。
S−HVT−048は、ユニークな短い領域に挿入されたHCMV極初期プロモーターに制御されるMDV gBとgA、およびNDV F遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである。MDVとNDV遺伝子は、UL43遺伝子と同じ転写配向で挿入される。
S−HVT−049は、短いユニークな領域に挿入されたPRV gXプロモーターに制御されるMDV gBとgA、およびNDV HN遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである。MDVとNDV遺伝子は、US2遺伝子と同じ転写配向で挿入される。
S−HVT−050は、MDV gBとgA遺伝子、ならびにNDV HN遺伝子(配列認識番号10と11)およびF(配列認識番号12と13)遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである。NDV遺伝子はそれぞれPRV gXとHCMV極初期プロモーターに制御される。すべての4つの遺伝子は、US2遺伝子と同じ転写配向でユニークな短い領域に挿入される。
S−HVT−106は、MDV gA、gB、gD遺伝子、およびNDV HNとF遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである。NDV遺伝子はそれぞれPRV gXとHCMV極初期プロモーターに制御される。すべての5つの遺伝子は、ユニークな短い領域内にUS2遺伝子と同じ転写配向で挿入される。
病原性ニューキャッスル病ウイルスおよびマレック病ウイルスによる抗原刺激に対するこれらの組換えHVT/MDV/NDVウイルスの有効性を証明するために、2つに実験を行なった。実験1では、1日令の特異的病原体を含まない(SPF)ヒヨコに、S−HVT−048、S−HVT−049、S−HVT−050またはNDV B1/B2ウイルスよりなるUSDAに認可された従来のワクチンをワクチン接種した。ワクチン接種後3週間、ワクチン接種したヒヨコ、および対照ヒヨコである非ワクチン接種ヒヨコを、NDVで抗原刺激した。次に疾患に典型的な臨床症状を観察した。表8に示す結果は、これらの組換えウイルス(S−HVT−048とS−HVT−050)は、非ワクチン接種対照ヒヨコの100%でニューキャッスル病を引き起こした抗原刺激に対して完全な防御を与えたことを示している。組換えウイルスS−HVT−049は、ニューキャッスル病に対して部分的な防御を与えた。
ILTウイルスから糖タンパク質を発現する組換えHVTは、マレック病と伝染性咽頭気管炎の両方に対して防御する2価のワクチンとなる。ILTウイルス糖タンパク質を発現するいくつかの組換えHVT、S−HVT−051(実施例12A)、S−HVT−052(実施例12B)、およびS−HVT−104(実施例11C)を作成した。
S−HVT−051は、ユニークな短い領域に挿入されたILTウイルスgB遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである。ILT遺伝子は、US2遺伝子と同じ転写配向で挿入される。
S−HVT−052は、短いユニークな領域に挿入されたILTウイルスgD遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである。ILT遺伝子は、US2遺伝子と反対の転写配向で挿入される。
S−HVT−104は、6つの外来遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである。MDV gA、gB、およびgD遺伝子は、US2遺伝子と同じ転写配向でユニークな短い領域に挿入される。大腸菌(E.coli)lacZマーカー遺伝子とILT gBおよびgD遺伝子は、UL43遺伝子と同じ転写配向でBamHI#16領域に挿入される。
病原性伝染性咽頭気管炎ウイルスによる抗原刺激に対する防御におけるこれらの組換えHVT/ILTウイルスの有効性を証明するために、以下の実験を行なった。1日令の特異的病原体を含まない(SPF)ヒヨコに、S−HVT−051、S−HVT−052、S−HVT−051とS−HVT−052の組合せ、またはILTウイルスよりなるUSDAに認可された従来のワクチンをワクチン接種した。ワクチン接種後2〜3週間、ワクチン接種したヒヨコ、および対照ヒヨコである非ワクチン接種ヒヨコを、ILTで抗原刺激した。次に疾患の臨床症状を観察した。表9に示す結果は、これらの組換えウイルス(S−HVT−051とS−HVT−052)は、ILTウイルスによる抗原刺激に対して、市販のILTワクチンに匹敵する防御を与えたことを示している。
IBDVからタンパク質を発現する組換えHVTは、マレック病と伝染性粘液嚢病の両方に対して防御する2価のワクチンとなる。IBDVタンパク質を発現するいくつかの組換えHVTを作製した。これらのウイルスは、S−HVT−003(実施例2)とS−HVT−096である。
S−HVT−066は、MDV gB、gDおよびgA遺伝子、ならびにIBVスパイク遺伝子およびマトリックス遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである。IBVスパイク遺伝子およびマトリックス遺伝子は、それぞれHCMV極初期プロモーターとPRV gXプロモーターに制御される。すべての5つの遺伝子は、短いユニークな領域に挿入された。MDV遺伝子とIBV遺伝子は、US2遺伝子と同じ転写配向で挿入される。
種々の病原体からの抗原を発現するためにHVTを利用するワクチン
以下の病原体からの抗原は、家禽のワクチンを開発するのに利用できるかも知れないと予想する:ヒヨコ貧血ウイルス(物質)、トリ脳脊髄炎ウイルス、トリレオウイルス、トリパラミクソウイルス、トリインフルエンザウイルス、トリアデノウイルス、鶏痘ウイルス、トリコロナウイルス、トリロタウイルス、サルモネラ種大腸菌(Salmonella spp E.coli)、パスツレラ(Pasterrella)種、ヘモフィルス(Haemophilus)種、クラミジア種、マイコプラズマ種、キャンピロバクター種、ボルデテラ種、家禽線虫、条虫、吸虫、家禽ダニ/シラミ、家禽原虫(エイメリア(Eimeria)種、ヒストモナス(Histomonas)種、トリコモナス(Trichomonas)種)。
伝染性咽頭気管炎、マレック病およびニューカッスル病に対する3価のワクチン、および伝染性咽頭気管炎およびマレック病に対する2価のワクチンを記載する。伝染性咽頭気管炎に対する優れた防御は、S−HVT−123(ILTV gBとgDを発現する)をS−HVT−138、−139、または−140(ILTV gDとgIを発現する)と組合せたワクチンで得られる。
S−HVT−123は、HVTゲノムのEcoRI#9(BamHI#10)断片中のNotI部位に変換したXhoI部位に挿入されたILTウイルスgBとgD遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである(図13Bと15;配列認識番号48)。S−HVT−123はさらに、HVT US2遺伝子のHindIII部位に変換したユニークなStuI部位に挿入したMDV gA、gDとgB遺伝子を含有する。ILTV遺伝子とMDV遺伝子は、それぞれのプロモーターを使用する。S−HVT−123は、伝染性咽頭気管炎およびマレック病に対する家禽のワクチンとして有用である。
S−HVT−138は、HVTゲノムのEcoRI#9(BamHI#10)断片中のPacI部位に変換したXhoI部位に挿入されたILTウイルスgDとgI遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである(図13Bと15;配列認識番号48)。ILTV gDとgI遺伝子は、HVTゲノムのEcoRI#9(BamHI#10)断片内の読みとり枠(ORF A)と反対の転写配向である(図14;配列認識番号48、50)。ILTV gDとgI遺伝子は、内在性ILTVプロモーターから重複する転写体として発現され、それら自身の内在性ポリアデニル化シグナルを共有する。
S−HVT−139は、HVTゲノムのEcoRI#9(BamHI#10)断片中のPacI部位に変換したユニークなXhoI部位に挿入されたILTウイルスgDとgI遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである。ILTV gDとgI遺伝子は、HVTゲノムのEcoRI#9(BamHI#10)断片内の読みとり枠(ORFA)と反対の転写配向である(図13Aと15;配列認識番号48、50)。S−HVT−139はさらに、HVT US2遺伝子内のHindIII部位に変換したユニークなStuI部位に挿入されたMDV gA、gD、およびgB遺伝子を含有する。ILTV gDとgI遺伝子は、それら自身の内因性ILTVプロモーターから重複する転写体として発現され、MDV遺伝子もまた、それ自身の内因性プロモーターから発現される。S−HVT−139は、伝染性咽頭気管炎およびマレック病に対する家禽のワクチンとして有用である。
S−HVT−140は、HVTゲノムのEcoRI#9(BamHI#10)断片中のPacI部位に変換したユニークなXhoI部位に挿入されたILTウイルスgDとgI遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである(図13Aと15)。ILTV gDとgI遺伝子は、HVTゲノムのEcoRI#9(BamHI#10)断片内の読みとり枠(ORF A)と反対の転写配向である(図14;配列認識番号48、50)。S−HVT−140はさらに、HVT US2遺伝子内のHindIII部位に変換したユニークなStuI部位に挿入されたMDV gA、gD、およびgB遺伝子ならびにNDV FおよびHN遺伝子を含有する。ILT VgDとgI遺伝子は、それら自身の内因性ILTVプロモーターから重複する転写体として発現され、MDV遺伝子もまた、それ自身の内因性プロモーターから発現される。NDV F遺伝子は、HCMV極初期プロモーターから転写され、NDV HN遺伝子はPRV gXプロモーターから転写される。S−HVT−140は、伝染性咽頭気管炎、マレック病、およびニューキャッスル病に対する家禽のワクチンとして有用である。
伝染性粘液嚢病、マレック病およびニューキャッスル病に対する3価のワクチン、ならびに伝染性粘液嚢病およびマレック病に対する2価のワクチンが記載される。
S−HVT−126は、HVTゲノムのEcoRI#9(BamHI#10)断片中のPacI部位に変換したユニークなXhoI部位に挿入されたIBDV VP2遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである(図13Aと15)。IBDV遺伝子は、HVTゲノムのEcoRI#9(BamHI#10)断片内の読みとり枠(ORF A)と同じ転写配向である(図14;配列認識番号48、50)。IBDV VP2遺伝子は、IBRV VP8プロモーターから発現される。S−HVT−126は、伝染性粘液嚢病およびマレック病に対する家禽のワクチンとして有用である。
S−HVT−137は、HVTゲノムのEcoRI#9(BamHI#10)断片中のPacI部位に変換したユニークなXhoI部位に挿入されたIBDV VP2遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである(図13Aと15)。IBDV遺伝子は、HVTゲノムのEcoRI#9(BamHI#10)断片内の読みとり枠(ORF A)と同じ転写配向である(図14;配列認識番号48、50)。S−HVT−137はさらに、HVT US2遺伝子内のHindIII部位に変換したユニークなStuI部位に挿入されたMDV gA、gD、およびgB遺伝子を含有する。IBDV VP2遺伝子は、IBRV VP8プロモーターから発現される。MDV遺伝子は、それら自身の各内因性MDVプロモーターから発現される。S−HVT−137は、伝染性粘液嚢病およびマレック病に対する家禽のワクチンとして有用である。
S−HVT−143は、HVTゲノムのEcoRI#9(BamHI#10)断片中のPacI部位に変換したユニークなXhoI部位に挿入されたIBDV VP2遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである(図13Aと15)。IBDV遺伝子は、HVTゲノムのEcoRI#9(BamHI#10)断片内の読みとり枠(ORF A)と同じ転写配向である(図14;配列認識番号48、50)。S−HVT−143はさらに、HVT US2遺伝子内のHindIII部位に変換したユニークなStuI部位に挿入されたMDV gA、gD、およびgB遺伝子、ならびにNDV FおよびHN遺伝子を含有する。IBDV VP2遺伝子は、IBRV VP8プロモーターから発現される。MDV遺伝子は、それぞれの内因性MDVプロモーターから発現される。NDV F遺伝子は、HCMV極初期プロモーターから転写され、NDV HN遺伝子はPRV gXプロモーターから転写される。S−HVT−143は、伝染性粘液嚢病、マレック病、およびニューキャッスル病に対する家禽のワクチンとして有用である。
S−HVT−128は、HVTゲノムのEcoRI#9(BamHI#10)断片中のPacI部位に変換したユニークなXhoI部位に挿入されたNDV HNとF遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである(図13Aと15)。S−HVT−128はさらに、HVT US2遺伝子内のHindIII部位に変換したユニークなStuI部位に挿入されたMDV gA、gD、およびgB遺伝子を含有する。NDV HN遺伝子は、PRV gXプロモーターから発現され、NDV F遺伝子は、HCMV極初期プロモーターから転写される。MDV遺伝子は内因性MDVプロモーターから発現される。S−HVT−128は、ニューキャッスル病、およびマレック病に対する家禽のワクチンとして有用である。
S−HVT−136は、HVTのユニークな長い領域内のEcoRI#9(BamHI#10)断片中のPacI部位に変換したユニークなXhoI部位に挿入されたNDV
HNとF遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである(図14;配列認識番号48と50)。NDV HN遺伝子は、PRV gXプロモーターから発現され、NDV F遺伝子は、HCMV極初期プロモーターから転写される。S−HVT−136は、ニューキャッスル病、およびマレック病に対する家禽のワクチンとして有用である。
HVT/MDV組換えウイルスワクチン
S−HVT−145は、マレック病に対して防御するMDVとHVTゲノム配列を含有する組換えウイルスワクチンであり、病原性の作成した血清型2の関連する防御性抗原をコードする遺伝子を含有するMDVゲノムDNAのコスミドと、HVTゲノムDNAのコスミドを、「重複するサブゲノム断片から組換えヘルペスウイルスを作成するための方法」に従って組合せて産生される。得られるウイルスは、病原性のMDV血清型2に対する防御性免疫応答およびHVTの弱毒化増殖特性も有するワクチンである。1つの態様において、ユニークな短い領域のMDV遺伝子とユニークな長い領域のHVT遺伝子を含有するキメラウイルスワクチンは、ニワトリのマレック病に対するワクチンとして有用である。ユニークな短い領域内のMDV防御性抗原(gD、gEおよびgI)はMDVに対する防御性免疫応答を誘発し、MDVのユニークな長い領域内に存在する病原性の成分(55、56、57)は、HVTの弱毒性のユニークな長い配列により置換される。その結果、マレック病に対して防御性の弱毒化ウイルスワクチンが得られる。マレック病、伝染性咽頭気管炎、伝染性粘液嚢病、ニューキャッスル病、または他の家禽病原体に対する多価防御性は、ILTV gB、gD、およびgI遺伝子、IBDV VP2遺伝子、NDV HNおよびF遺伝子、または家禽病原体からの抗原遺伝子を、HVT/MDV組換えウイルス(図13と15)のユニークな長い領域内のEcoRI#9(BamHI#10)断片中のPacI部位またはNotI部位に変換したXhoI部位に挿入することにより得られる。
ニワトリ骨髄単球性増殖因子(cMGF)またはニワトリインターフェロン(cIFN)を発現する組換えHVTは、マレック病ウイルスに対するワクチンとして、および家禽の他の疾患に対する免疫応答を増強するために有用である。
S−HVT−144は、HVTのユニークな長い領域内のEcoRI#9断片中のPacI部位に変換したユニークなXhoI部位に挿入されたニワトリ骨髄単球性増殖因子(cMGF)遺伝子を含有するシチメンチョウの組換えヘルペスウイルスである。cMGF遺伝子は、HVTゲノムのEcoRI#9断片内の読みとり枠(ORFA)と反対の転写配向である(図14;配列認識番号48と50)。cMGF遺伝子は、ヒトサイトメガロウイルス極初期プロモーターから転写される。S−HVT−144は、マレック病に対する家禽のワクチンとして有用である。
シチメンチョウの組換えHVTは、HVTのユニークな長い領域内のEcoRI#9断片中のPacI部位に変換したXhoI部位に挿入されたニワトリインターフェロン(cIFN)遺伝子を含有する。cIFN遺伝子は、ヒトサイトメガロウイルス極初期プロモーターから転写される。cIFNを発現する組換えHVTは、マレック病に対する家禽のワクチンとして有用である。
シチメンチョウの組換えヘルペスウイルスは、HVTのユニークな長い領域内のEcoRI#9断片中のPacI部位に変換したXhoI部位に挿入されたニワトリインターフェロン(cIFN)遺伝子を含有し、さらにHVT US2遺伝子のHindIII部位に変換したユニークなStuI部位に挿入されたMDV gA、gD、およびgB遺伝子を含有する。cIFN遺伝子は、ヒトサイトメガロウイルス極初期プロモーターから転写される。MDV遺伝子は、内因性MDVプロモーターから発現される。cIFNおよびMDV gA、gB、およびgDを発現する組換えHVTは、マレック病に対する家禽の免疫応答が増強したワクチンとして有用である。
シチメンチョウの組換えヘルペスウイルスは、HVTのユニークな長い領域内のEcoRI#9断片中のPacI部位に変換したXhoI部位に挿入されたニワトリインターフェロン(cIFN)遺伝子を含有し、さらにHVT US2遺伝子のHindIII部位に変換したユニークなStuI部位に挿入されたMDV gA、gD、およびgB遺伝子ならびにNDV HNおよびF遺伝子を含有する。cIFN遺伝子は、ヒトサイトメガロウイルス極初期プロモーターから転写される。MDV遺伝子は、内因性MDVプロモーターから発現される。NDV HN遺伝子はPRV gXプロモーターに制御され、NDV F遺伝子はHCMV極初期プロモーターに制御される。cIFNおよびMDV gA、gB、およびgDを発現する組換えHVTは、マレック病およびニューキャッスル病に対するに対する家禽の免疫応答が増強したワクチンとして有用である。
シチメンチョウの組換えヘルペスウイルスは、HVTのユニークな長い領域内のEcoRI#9断片中のPacI部位に変換したXhoI部位に挿入されたニワトリ骨髄単球性増殖因子(cMGF)遺伝子を含有し、さらにHVT US2遺伝子のHindIII部位に変換したユニークなStuI部位に挿入されたMDV gA、gD、およびgB遺伝子を含有する。cMGF遺伝子は、ヒトサイトメガロウイルス極初期プロモーターから転写される。MDV遺伝子は、内因性MDVプロモーターから発現される。cMGFおよびMDV gA、gB、およびgDを発現する組換えHVTは、マレック病に対するに対する家禽の免疫応答が増強したワクチンとして有用である。
シチメンチョウの組換えヘルペスウイルスは、HVTのユニークな長い領域内のEcoRI#9断片中のPacI部位に変換したXhoI部位に挿入されたニワトリ骨髄単球性増殖因子(cGMF)遺伝子を含有し、さらにHVT US2遺伝子のHindIII部位に変換したユニークなStuI部位に挿入されたMDV gA、gD、およびgB遺伝子ならびにNDV HNおよびF遺伝子を含有する。cGMF遺伝子は、ヒトサイトメガロウイルス極初期プロモーターから転写される。MDV遺伝子は、内因性MDVプロモーターから発現される。NDV HN遺伝子はPRV gXプロモーターに制御され、NDV F遺伝子はHCMV極初期プロモーターに制御される。cIFNおよびMDV gA、gB、およびgDを発現する組換えHVTは、マレック病およびニューキャッスル病に対するに対する家禽の免疫応答が増強したワクチンとして有用である。
シチメンチョウの組換えヘルペスウイルス(HVT)は、鳥類の種とともに動物からの疾患を引き起こす微生物の抗原を発現するのに有用である。組換えHVTは、ヒト、ウマ、ウシ、ブタ、イヌ、およびネコを含む(しかし、これらに限定されない)動物のワクチンとして有用である。
シチメンチョウの組換えヘルペスウイルス(HVT)は、ヒトの疾患に対するワクチンとして有用である。例えば、ヒトのインフルエンザウイルスは、中和性ウイルスエピトープが急速に変化する急速に進化するウイルスである。有用な組換えHVTワクチンはインフルエンザウイルス中和性エピトープがインフルエンザウイルスの新しい株に対して防御するように急速に変化するものである。ヒトのインフルエンザHAとNA遺伝子は、ポリメラーゼ連鎖反応を利用して組換えHVTにクローン化される。組換えHVTは、以下の疾患または疾患生物からの外来性抗原がHVTベクター中で発現される時、他のヒトの疾患に対するワクチンとして有用である。これらには、B型肝炎ウイルス表面抗原およびコア抗原、C型肝炎ウイルス、ヒト免疫不全症ウイルス、単純ヘルペスウイルス−1、単純ヘルペスウイルス−2、ヒトサイトメガロウイルス、エプスタインバーウイルス、水痘−帯状庖疹ウイルス、ヒトヘルペスウイルス−6、ヒトヘルペスウイルス−7、ヒトインフルエンザウイルス、麻疹ウイルス、ハンターンウイルス(hantaan virus)、肺炎ウイルス、ライノウイルス、ポリオウイルス、ヒト呼吸系発疹ウイルス、レトロウイルス、ヒトT細胞白血病ウイルス、狂犬病ウイルス、おたふくかぜウイルス、マラリア(Plasmodium falciparum)、百日咳菌(Bordetella pertussis)、ジフテリア、リケッチア・プロワゼキイ(Richetsia prowazekii)、ボレリア・ベルグドルフェリ(Borrelia bergdorferi)、破傷風毒素、悪性腫瘍抗原があるが、これらに限定されない。
インターフェロンやインターロイキンのようなサイトカインは、培養細胞や動物のウイルスの複製を阻害する。細胞性インターフェロンまたはインターロイキンの産生の阻害は、細胞培養による組換えHVTの増殖を改良する。組換え豚痘ベクターから発現されるニワトリインターフェロン(cIFN)を、ニワトリ胚線維芽(CEF)細胞培養物に加え、β−ガラクトシダーゼを発現するS−HVT−012で感染させた。細胞培養培地に加えたcIFNは、β−ガラクトシダーゼの発現とS−HVT−012力価の両方を用量依存的に低下させた。この結果は、HVTの増殖は、ニワトリインターフェロンの外因性添加により制限されることを示す。CEF細胞中でニワトリインターフェロン活性を除去または不活性化することにより、CEF細胞中のHVTの増殖を改良するためにいくつかの方策が利用可能である。
サイトカインをコードする外来性DNA配列を具備し、該配列がシチメンチョウ・ヘルペスウイルスゲノムのEcoRI#9断片におけるXhoI部位を含む挿入領域に挿入されている組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルスであって、前記外来性DNA配列は、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスに感染した宿主細胞内で発現されることができるサイトカインをコードする組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルス。
(a)通常はシチメンチョウ・ヘルペスウイルスのゲノム内には存在しない外来性の二本鎖DNA;
(b)シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのゲノムのコード領域の、EcoRI#9断片の一方の末端に位置する、ウイルスゲノムに対して相同性があって、前記外来性DNAの一方の末端に存在するシチメンチョウ・ヘルペスウイルス2本鎖DNA;
(c)シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのゲノムのコード領域の、EcoRI#9断片のもう一方の末端に位置する、ウイルスゲノムに対して相同性があって、前記外来性DNAのもう一方の末端に存在する、シチメンチョウ・ヘルペスウイルス2本鎖DNA。
Claims (7)
- シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのユニークな長いウイルスゲノム、領域とマレック病ウイルスのユニークな短い領域とを具備した、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスとマレック病ウイルスとの組換え体キメラ。
- 前記の外来性DNA配列が、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスのゲノムのEcoRI#9断片中へ挿入されていて、またシチメンチョウ・ヘルペスウイルスに感染した宿主細胞内で発現することが可能であることを特徴とする、請求項1に記載の、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスとマレック病ウイルスとの組換え体キメラ。
- 前記の外来性DNA配列が、ポリペプチドをコードすることを特徴とする、請求項2に記載の、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスとマレック病ウイルスとの組換え体キメラ。
- 前記の外来性DNA配列がサイトカインをコードすることを特徴とする、請求項3に記載の、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスとマレック病ウイルスとの組換え体キメラ。
- 前記のサイトカインがニワトリ骨髄単球性成長因子(cMGF)、またはニワトリのインターフェロン(cIFN)であることを特徴とする、請求項4に記載の、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスとマレック病ウイルスとの組換え体キメラ。
- 抗原性ポリペプチドをコードする外来性DNAを更に具備した、請求項5に記載の、シチメンチョウ・ヘルペスウイルスとマレック病ウイルスとの組換え体キメラであって、該抗原性ポリペプチドが、マレック病ウイルス、ニューカッスル病ウイルス、伝染性喉頭気管炎ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、及び伝染性粘液嚢病ウイルスからなる群より選択される、上記のキメラ。
- S-HVT-145と命名されている、請求項6に記載の組換え型シチメンチョウ・ヘルペスウイルス。
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