ES2278382T3 - Herpesvirus recombinante de pavos y sus usos. - Google Patents
Herpesvirus recombinante de pavos y sus usos. Download PDFInfo
- Publication number
- ES2278382T3 ES2278382T3 ES95930814T ES95930814T ES2278382T3 ES 2278382 T3 ES2278382 T3 ES 2278382T3 ES 95930814 T ES95930814 T ES 95930814T ES 95930814 T ES95930814 T ES 95930814T ES 2278382 T3 ES2278382 T3 ES 2278382T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- hvt
- virus
- fragment
- recombinant
- gene
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 241001529453 unidentified herpesvirus Species 0.000 title claims abstract description 162
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 380
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims abstract description 215
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 95
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims description 137
- 241000702626 Infectious bursal disease virus Species 0.000 claims description 108
- 241000711404 Avian avulavirus 1 Species 0.000 claims description 107
- 241000701063 Gallid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 claims description 105
- 241001502481 Meleagrid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 claims description 101
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 73
- 108010005774 beta-Galactosidase Proteins 0.000 claims description 72
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 71
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 71
- 208000006758 Marek Disease Diseases 0.000 claims description 69
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 69
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 69
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 66
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 66
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims description 66
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 59
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 54
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 claims description 53
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 claims description 50
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 50
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 50
- 101710133291 Hemagglutinin-neuraminidase Proteins 0.000 claims description 41
- 241000701024 Human betaherpesvirus 5 Species 0.000 claims description 39
- 102000005936 beta-Galactosidase Human genes 0.000 claims description 39
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 claims description 26
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 claims description 19
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 claims description 19
- 101710081079 Minor spike protein H Proteins 0.000 claims description 19
- 208000010359 Newcastle Disease Diseases 0.000 claims description 19
- 206010044302 Tracheitis Diseases 0.000 claims description 19
- 201000009837 laryngotracheitis Diseases 0.000 claims description 19
- 108010031571 Marek's disease virus glycoprotein B Proteins 0.000 claims description 17
- 206010006451 bronchitis Diseases 0.000 claims description 13
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 claims description 13
- 108060003393 Granulin Proteins 0.000 claims description 6
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 5
- 101710088235 Envelope glycoprotein C homolog Proteins 0.000 claims description 3
- 101000678879 Homo sapiens Atypical chemokine receptor 1 Proteins 0.000 claims description 3
- 102100022717 Atypical chemokine receptor 1 Human genes 0.000 claims description 2
- 235000016639 Syzygium aromaticum Nutrition 0.000 claims description 2
- 244000061408 Eugenia caryophyllata Species 0.000 claims 1
- 101001002508 Homo sapiens Immunoglobulin-binding protein 1 Proteins 0.000 claims 1
- 102100021042 Immunoglobulin-binding protein 1 Human genes 0.000 claims 1
- 101710136297 Protein VP2 Proteins 0.000 claims 1
- 101800003658 Protein VP4 Proteins 0.000 claims 1
- 101710121537 mRNA (guanine-N(7))-methyltransferase Proteins 0.000 claims 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 abstract description 513
- 241000701047 Gallid alphaherpesvirus 2 Species 0.000 abstract description 221
- 238000000034 method Methods 0.000 abstract description 173
- 239000013598 vector Substances 0.000 abstract description 95
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 abstract description 89
- 238000003780 insertion Methods 0.000 abstract description 74
- 230000037431 insertion Effects 0.000 abstract description 74
- 230000003053 immunization Effects 0.000 abstract description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 4
- 238000002649 immunization Methods 0.000 abstract description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 316
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 136
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 123
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 101
- 108010054576 Deoxyribonuclease EcoRI Proteins 0.000 description 97
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 91
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 76
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 71
- 241000701093 Suid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 62
- 241000271566 Aves Species 0.000 description 60
- 101150108190 US2 gene Proteins 0.000 description 47
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 47
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 45
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 45
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 45
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 39
- 241000711450 Infectious bronchitis virus Species 0.000 description 36
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 35
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 35
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 34
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 33
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 33
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 32
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 32
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 29
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 29
- 241000286209 Phasianidae Species 0.000 description 29
- 238000005304 joining Methods 0.000 description 28
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 27
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 27
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 26
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 26
- 241000700588 Human alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 24
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 23
- 230000004224 protection Effects 0.000 description 22
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 22
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 21
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 21
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 21
- 101150034814 F gene Proteins 0.000 description 20
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 20
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 20
- 101150008820 HN gene Proteins 0.000 description 19
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 19
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 19
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 19
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 18
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 17
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 17
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 16
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 16
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 16
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 16
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 14
- 101150050057 UL43 gene Proteins 0.000 description 14
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 14
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 14
- 238000011160 research Methods 0.000 description 14
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 13
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 13
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 13
- 101150093578 VP2 gene Proteins 0.000 description 13
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 description 13
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 13
- 208000027312 Bursal disease Diseases 0.000 description 12
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 12
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 12
- 101150036031 gD gene Proteins 0.000 description 12
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 12
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 12
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- LINMATFDVHBYOS-MBJXGIAVSA-N (2s,3r,4s,5r,6r)-2-[(5-bromo-1h-indol-3-yl)oxy]-6-(hydroxymethyl)oxane-3,4,5-triol Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=C(Br)C=C12 LINMATFDVHBYOS-MBJXGIAVSA-N 0.000 description 11
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 11
- 241000711895 Bovine orthopneumovirus Species 0.000 description 11
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 11
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 11
- 244000144977 poultry Species 0.000 description 11
- 230000004044 response Effects 0.000 description 11
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 10
- 241000700647 Variola virus Species 0.000 description 10
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 10
- 235000013594 poultry meat Nutrition 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 101000645498 Alkalihalobacillus pseudofirmus (strain ATCC BAA-2126 / JCM 17055 / OF4) Uncharacterized protein BpOF4_10220 Proteins 0.000 description 9
- 101001132313 Clostridium pasteurianum 34.2 kDa protein in rubredoxin operon Proteins 0.000 description 9
- 101000618325 Enterobacteria phage T4 Uncharacterized 12.4 kDa protein in mobB-Gp55 intergenic region Proteins 0.000 description 9
- 101000653284 Enterobacteria phage T4 Uncharacterized 9.4 kDa protein in Gp31-cd intergenic region Proteins 0.000 description 9
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 9
- 101000758676 Pyrococcus woesei Uncharacterized 24.7 kDa protein in gap 5'region Proteins 0.000 description 9
- 239000000463 material Substances 0.000 description 9
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 9
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 9
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 9
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 8
- 229940031416 bivalent vaccine Drugs 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 8
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 8
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 8
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 8
- 229940124452 immunizing agent Drugs 0.000 description 8
- XVARCVCWNFACQC-RKQHYHRCSA-N indican Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=CNC2=CC=CC=C12 XVARCVCWNFACQC-RKQHYHRCSA-N 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 8
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 8
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 8
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 8
- 241000894007 species Species 0.000 description 8
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 8
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 8
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 7
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 7
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 7
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 7
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 7
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 7
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 7
- 101150029683 gB gene Proteins 0.000 description 7
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 7
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 7
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 6
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical compound NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000701085 Human alphaherpesvirus 3 Species 0.000 description 6
- 102000004889 Interleukin-6 Human genes 0.000 description 6
- 108090001005 Interleukin-6 Proteins 0.000 description 6
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 6
- 108020005202 Viral DNA Proteins 0.000 description 6
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 239000013601 cosmid vector Substances 0.000 description 6
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 6
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 6
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 6
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 6
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 230000009385 viral infection Effects 0.000 description 6
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 6
- 101500001532 Avian infectious bursal disease virus Capsid protein VP2 Proteins 0.000 description 5
- 241000588807 Bordetella Species 0.000 description 5
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 5
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 5
- 241000282324 Felis Species 0.000 description 5
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 5
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 5
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 5
- 108010076039 Polyproteins Proteins 0.000 description 5
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 229940028617 conventional vaccine Drugs 0.000 description 5
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 5
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 5
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 5
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 5
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 5
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 5
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 5
- 210000002845 virion Anatomy 0.000 description 5
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 4
- 244000257039 Duranta repens Species 0.000 description 4
- 102100031780 Endonuclease Human genes 0.000 description 4
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 4
- 102000000589 Interleukin-1 Human genes 0.000 description 4
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 4
- 102100039064 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 4
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 description 4
- 101710187863 Myelomonocytic growth factor Proteins 0.000 description 4
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 4
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 4
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 4
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 4
- 241000702670 Rotavirus Species 0.000 description 4
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 4
- 108020004440 Thymidine kinase Proteins 0.000 description 4
- HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N [3-[hydroxy(2-hydroxyethoxy)phosphoryl]oxy-2-[(e)-octadec-9-enoyl]oxypropyl] (e)-octadec-9-enoate Chemical compound CCCCCCCC\C=C\CCCCCCCC(=O)OCC(COP(O)(=O)OCCO)OC(=O)CCCCCCC\C=C\CCCCCCCC HMNZFMSWFCAGGW-XPWSMXQVSA-N 0.000 description 4
- 238000011888 autopsy Methods 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 230000017188 evasion or tolerance of host immune response Effects 0.000 description 4
- -1 for example Substances 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- BXFFHSIDQOFMLE-UHFFFAOYSA-N indoxyl sulfate Natural products C1=CC=C2C(OS(=O)(=O)O)=CNC2=C1 BXFFHSIDQOFMLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- XVARCVCWNFACQC-UHFFFAOYSA-N indoxyl-beta-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1=CNC2=CC=CC=C12 XVARCVCWNFACQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940100601 interleukin-6 Drugs 0.000 description 4
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 4
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- 238000005096 rolling process Methods 0.000 description 4
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 4
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 4
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 4
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 4
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 4
- 238000003151 transfection method Methods 0.000 description 4
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 3
- 241000008921 Avian coronavirus Species 0.000 description 3
- 241001516406 Avian orthoreovirus Species 0.000 description 3
- 108010062580 Concanavalin A Proteins 0.000 description 3
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 3
- 241000223924 Eimeria Species 0.000 description 3
- 241000283086 Equidae Species 0.000 description 3
- 101710154606 Hemagglutinin Proteins 0.000 description 3
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 3
- 241000948219 Histomonas Species 0.000 description 3
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 3
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 3
- 102000013462 Interleukin-12 Human genes 0.000 description 3
- 108010065805 Interleukin-12 Proteins 0.000 description 3
- 102000000588 Interleukin-2 Human genes 0.000 description 3
- 108010002350 Interleukin-2 Proteins 0.000 description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N N-methyl-guanidine Natural products CNC(N)=N CHJJGSNFBQVOTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000244206 Nematoda Species 0.000 description 3
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 3
- 101710093908 Outer capsid protein VP4 Proteins 0.000 description 3
- 101710135467 Outer capsid protein sigma-1 Proteins 0.000 description 3
- 206010033799 Paralysis Diseases 0.000 description 3
- 208000002606 Paramyxoviridae Infections Diseases 0.000 description 3
- 241000606860 Pasteurella Species 0.000 description 3
- 241001674048 Phthiraptera Species 0.000 description 3
- 101710176177 Protein A56 Proteins 0.000 description 3
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 3
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 3
- 241000711798 Rabies lyssavirus Species 0.000 description 3
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 3
- 241000869417 Trematodes Species 0.000 description 3
- 241001223089 Tremovirus A Species 0.000 description 3
- 241000224526 Trichomonas Species 0.000 description 3
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 3
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 3
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 3
- 241000701792 avian adenovirus Species 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 3
- 239000013553 cell monolayer Substances 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 3
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N dimethylaminoamidine Natural products CN(C)C(N)=N SWSQBOPZIKWTGO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 3
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 3
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 3
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 3
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 3
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 3
- 229940031551 inactivated vaccine Drugs 0.000 description 3
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 3
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 3
- 229940117681 interleukin-12 Drugs 0.000 description 3
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 3
- 101150066555 lacZ gene Proteins 0.000 description 3
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 3
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 3
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 3
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 3
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 3
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 3
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 3
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 2
- 241000238876 Acari Species 0.000 description 2
- LTTLSZVJTDSACD-OWLDWWDNSA-N Ala-Thr-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O LTTLSZVJTDSACD-OWLDWWDNSA-N 0.000 description 2
- 101000774529 Alkalihalobacillus pseudofirmus (strain ATCC BAA-2126 / JCM 17055 / OF4) Uncharacterized protein BpOF4_21049 Proteins 0.000 description 2
- 102100022987 Angiogenin Human genes 0.000 description 2
- 108020005544 Antisense RNA Proteins 0.000 description 2
- 241000972773 Aulopiformes Species 0.000 description 2
- 101500001538 Avian infectious bursal disease virus Capsid protein VP3 Proteins 0.000 description 2
- 101500001537 Avian infectious bursal disease virus Protease VP4 Proteins 0.000 description 2
- 101000780391 Bacillus licheniformis Uncharacterized protein in ansA 5'region Proteins 0.000 description 2
- 101000818144 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized oxidoreductase YusZ Proteins 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 102100023995 Beta-nerve growth factor Human genes 0.000 description 2
- 241000712005 Bovine respirovirus 3 Species 0.000 description 2
- 101000583086 Bunodosoma granuliferum Delta-actitoxin-Bgr2b Proteins 0.000 description 2
- 241000680578 Canid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 2
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 2
- 108090000565 Capsid Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102100023321 Ceruloplasmin Human genes 0.000 description 2
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 2
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 2
- 241000725585 Chicken anemia virus Species 0.000 description 2
- 101000790711 Chlamydomonas reinhardtii Uncharacterized membrane protein ycf78 Proteins 0.000 description 2
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 2
- 101000827225 Dichelobacter nodosus Uncharacterized protein in lpsA 5'region Proteins 0.000 description 2
- 241000243988 Dirofilaria immitis Species 0.000 description 2
- 241000230501 Equine herpesvirus sp. Species 0.000 description 2
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 2
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 2
- 101000599641 Escherichia coli (strain K12) Insertion element IS150 protein InsJ Proteins 0.000 description 2
- 101000819098 Escherichia coli Insertion element IS1397 uncharacterized 20.1 kDa protein Proteins 0.000 description 2
- 101000763543 Escherichia coli Uncharacterized endonuclease Proteins 0.000 description 2
- 101000758678 Escherichia phage P1 Uncharacterized 36.0 kDa protein in doc-Gp10 intergenic region Proteins 0.000 description 2
- 241000701087 Felid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 2
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 2
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 108090000368 Fibroblast growth factor 8 Proteins 0.000 description 2
- 241000711549 Hepacivirus C Species 0.000 description 2
- 229920000209 Hexadimethrine bromide Polymers 0.000 description 2
- 241000701074 Human alphaherpesvirus 2 Species 0.000 description 2
- 241000701041 Human betaherpesvirus 7 Species 0.000 description 2
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 2
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 2
- NPROWIBAWYMPAZ-GUDRVLHUSA-N Ile-Asp-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)N NPROWIBAWYMPAZ-GUDRVLHUSA-N 0.000 description 2
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 2
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 2
- 102000003814 Interleukin-10 Human genes 0.000 description 2
- 108090000174 Interleukin-10 Proteins 0.000 description 2
- 102000003815 Interleukin-11 Human genes 0.000 description 2
- 108090000177 Interleukin-11 Proteins 0.000 description 2
- 102000003816 Interleukin-13 Human genes 0.000 description 2
- 108090000176 Interleukin-13 Proteins 0.000 description 2
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 2
- 102000004388 Interleukin-4 Human genes 0.000 description 2
- 108090000978 Interleukin-4 Proteins 0.000 description 2
- 102000000704 Interleukin-7 Human genes 0.000 description 2
- 108010002586 Interleukin-7 Proteins 0.000 description 2
- 102000004890 Interleukin-8 Human genes 0.000 description 2
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 2
- 102000000585 Interleukin-9 Human genes 0.000 description 2
- 108010002335 Interleukin-9 Proteins 0.000 description 2
- 101000828374 Lactobacillus johnsonii Insertion element IS1223 uncharacterized 20.7 kDa protein Proteins 0.000 description 2
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 2
- 101000750781 Listeria monocytogenes serovar 1/2a (strain ATCC BAA-679 / EGD-e) Uncharacterized oxidoreductase Lmo0432 Proteins 0.000 description 2
- 239000006137 Luria-Bertani broth Substances 0.000 description 2
- 241000002163 Mesapamea fractilinea Species 0.000 description 2
- DJJBHQHOZLUBCN-WDSOQIARSA-N Met-Lys-Trp Chemical compound [H]N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=C1C=CC=C2)C(O)=O DJJBHQHOZLUBCN-WDSOQIARSA-N 0.000 description 2
- 101000861628 Mycoplasma capricolum subsp. capricolum (strain California kid / ATCC 27343 / NCTC 10154) Uncharacterized lipoprotein MCAP_0231 Proteins 0.000 description 2
- 101000707209 Mycoplasma mycoides subsp. mycoides SC Insertion element IS1296 uncharacterized 21.4 kDa protein Proteins 0.000 description 2
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000004140 Oncostatin M Human genes 0.000 description 2
- 108090000630 Oncostatin M Proteins 0.000 description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 241000223960 Plasmodium falciparum Species 0.000 description 2
- 241000288906 Primates Species 0.000 description 2
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 101000770286 Rhizobium meliloti Uncharacterized protein ORF8 in nfe locus Proteins 0.000 description 2
- 101000791677 Rhizobium meliloti Uncharacterized protein in ackA 5'region Proteins 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- 241000700584 Simplexvirus Species 0.000 description 2
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 101000759701 Thermus thermophilus Uncharacterized protein in scsB 5'region Proteins 0.000 description 2
- 241001314440 Triphora trianthophoros Species 0.000 description 2
- 101000623306 Trypanosoma brucei brucei Uncharacterized 1.9 kDa protein in aldolase locus Proteins 0.000 description 2
- 108060008683 Tumor Necrosis Factor Receptor Proteins 0.000 description 2
- HGJRMXOWUWVUOA-GVXVVHGQSA-N Val-Leu-Gln Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N HGJRMXOWUWVUOA-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 2
- 208000036142 Viral infection Diseases 0.000 description 2
- 101000679337 Zea mays Putative AC transposase Proteins 0.000 description 2
- 108010072788 angiogenin Proteins 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N beta-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-FPRJBGLDSA-N 0.000 description 2
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 210000003837 chick embryo Anatomy 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000003184 complementary RNA Substances 0.000 description 2
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 2
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 2
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- 238000011161 development Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 229940099686 dirofilaria immitis Drugs 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 239000006196 drop Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 230000003511 endothelial effect Effects 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 101150113725 hd gene Proteins 0.000 description 2
- 239000000185 hemagglutinin Substances 0.000 description 2
- 210000003494 hepatocyte Anatomy 0.000 description 2
- 244000052637 human pathogen Species 0.000 description 2
- 230000002480 immunoprotective effect Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 229940076144 interleukin-10 Drugs 0.000 description 2
- 229940074383 interleukin-11 Drugs 0.000 description 2
- 229940076264 interleukin-3 Drugs 0.000 description 2
- 229940028885 interleukin-4 Drugs 0.000 description 2
- 229940100994 interleukin-7 Drugs 0.000 description 2
- 229940096397 interleukin-8 Drugs 0.000 description 2
- XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N interleukin-8 Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@@H](NC(C)=O)CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@H](CO)C(=O)N1[C@H](CCC1)C(N)=O)C1=CC=CC=C1 XKTZWUACRZHVAN-VADRZIEHSA-N 0.000 description 2
- 229940118526 interleukin-9 Drugs 0.000 description 2
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M lithium chloride Chemical compound [Li+].[Cl-] KWGKDLIKAYFUFQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 2
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 2
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 2
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 2
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 description 2
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 2
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 2
- 102000005162 pleiotrophin Human genes 0.000 description 2
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 2
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 2
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 2
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 2
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 2
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 2
- 239000002464 receptor antagonist Substances 0.000 description 2
- 229940044551 receptor antagonist Drugs 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 2
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 2
- 235000019515 salmon Nutrition 0.000 description 2
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 229940031418 trivalent vaccine Drugs 0.000 description 2
- 102000003298 tumor necrosis factor receptor Human genes 0.000 description 2
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 description 2
- 230000002792 vascular Effects 0.000 description 2
- 229960004854 viral vaccine Drugs 0.000 description 2
- 239000005723 virus inoculator Substances 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- KCVIRDLVBXYYKD-UHFFFAOYSA-O 1-nitrotetrazol-2-ium Chemical compound [O-][N+](=O)[NH+]1C=NN=N1 KCVIRDLVBXYYKD-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- 101150090724 3 gene Proteins 0.000 description 1
- 108010068327 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase Proteins 0.000 description 1
- AGBXEAQAOHJACV-UHFFFAOYSA-N 7-(2,3-dihydroxypropyl)-1,3-dimethyl-8-(pyridin-3-ylmethyl)purine-2,6-dione Chemical compound OCC(O)CN1C=2C(=O)N(C)C(=O)N(C)C=2N=C1CC1=CC=CN=C1 AGBXEAQAOHJACV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000030090 Acute Disease Diseases 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- GGNHBHYDMUDXQB-KBIXCLLPSA-N Ala-Glu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N GGNHBHYDMUDXQB-KBIXCLLPSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- 206010002383 Angina Pectoris Diseases 0.000 description 1
- 241000272517 Anseriformes Species 0.000 description 1
- 108020004491 Antisense DNA Proteins 0.000 description 1
- QXHVOUSPVAWEMX-ZLUOBGJFSA-N Asp-Asp-Ser Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O QXHVOUSPVAWEMX-ZLUOBGJFSA-N 0.000 description 1
- DWOGMPWRQQWPPF-GUBZILKMSA-N Asp-Leu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O DWOGMPWRQQWPPF-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 206010003591 Ataxia Diseases 0.000 description 1
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 1
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 description 1
- 241000589968 Borrelia Species 0.000 description 1
- 241000589969 Borreliella burgdorferi Species 0.000 description 1
- 241000710780 Bovine viral diarrhea virus 1 Species 0.000 description 1
- 206010006811 Bursitis Diseases 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000701101 Canine adenovirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000712083 Canine morbillivirus Species 0.000 description 1
- 235000014653 Carica parviflora Nutrition 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000994 Catalytic RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000053642 Catalytic RNA Human genes 0.000 description 1
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 description 1
- 206010008631 Cholera Diseases 0.000 description 1
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 1
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 1
- 206010010947 Coordination abnormal Diseases 0.000 description 1
- 241000711573 Coronaviridae Species 0.000 description 1
- 206010011224 Cough Diseases 0.000 description 1
- 241000700626 Cowpox virus Species 0.000 description 1
- VKAWJBQTFCBHQY-GUBZILKMSA-N Cys-Gln-Lys Chemical compound C(CCN)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)NC(=O)[C@H](CS)N VKAWJBQTFCBHQY-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 1
- 238000007400 DNA extraction Methods 0.000 description 1
- 108010008286 DNA nucleotidylexotransferase Proteins 0.000 description 1
- 102100033215 DNA nucleotidylexotransferase Human genes 0.000 description 1
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 1
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 241000709661 Enterovirus Species 0.000 description 1
- 241000991587 Enterovirus C Species 0.000 description 1
- 108010008655 Epstein-Barr Virus Nuclear Antigens Proteins 0.000 description 1
- 241000701081 Equid alphaherpesvirus 1 Species 0.000 description 1
- 241000701089 Equid alphaherpesvirus 4 Species 0.000 description 1
- 241000713800 Feline immunodeficiency virus Species 0.000 description 1
- 241000714165 Feline leukemia virus Species 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 229920001917 Ficoll Polymers 0.000 description 1
- 102000002464 Galactosidases Human genes 0.000 description 1
- 108010093031 Galactosidases Proteins 0.000 description 1
- 101000609762 Gallus gallus Ovalbumin Proteins 0.000 description 1
- 208000005577 Gastroenteritis Diseases 0.000 description 1
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 1
- 102000034354 Gi proteins Human genes 0.000 description 1
- 108091006101 Gi proteins Proteins 0.000 description 1
- YPMDZWPZFOZYFG-GUBZILKMSA-N Gln-Leu-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O YPMDZWPZFOZYFG-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 102000053187 Glucuronidase Human genes 0.000 description 1
- 108010060309 Glucuronidase Proteins 0.000 description 1
- XUORRGAFUQIMLC-STQMWFEESA-N Gly-Arg-Tyr Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)NC(=O)CN)O XUORRGAFUQIMLC-STQMWFEESA-N 0.000 description 1
- 101800000342 Glycoprotein C Proteins 0.000 description 1
- 101710181600 Glycoprotein gp2 Proteins 0.000 description 1
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100022190 Grifin Human genes 0.000 description 1
- 108700036695 Grifin Proteins 0.000 description 1
- 241000150562 Hantaan orthohantavirus Species 0.000 description 1
- 208000032843 Hemorrhage Diseases 0.000 description 1
- 241000700586 Herpesviridae Species 0.000 description 1
- WSWAUVHXQREQQG-JYJNAYRXSA-N His-Tyr-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O WSWAUVHXQREQQG-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- 241001272567 Hominoidea Species 0.000 description 1
- 241000701109 Human adenovirus 2 Species 0.000 description 1
- 101900111632 Human herpesvirus 1 Envelope glycoprotein C Proteins 0.000 description 1
- 241000701027 Human herpesvirus 6 Species 0.000 description 1
- 241000711920 Human orthopneumovirus Species 0.000 description 1
- 101150027427 ICP4 gene Proteins 0.000 description 1
- XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N IDUR Chemical compound C1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C(=O)NC(=O)C(I)=C1 XQFRJNBWHJMXHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 102000000743 Interleukin-5 Human genes 0.000 description 1
- 108010002616 Interleukin-5 Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 241000589902 Leptospira Species 0.000 description 1
- NTXYXFDMIHXTHE-WDSOQIARSA-N Leu-Val-Trp Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)C(O)=O)=CNC2=C1 NTXYXFDMIHXTHE-WDSOQIARSA-N 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000016604 Lyme disease Diseases 0.000 description 1
- 102000008072 Lymphokines Human genes 0.000 description 1
- 108010074338 Lymphokines Proteins 0.000 description 1
- 208000030289 Lymphoproliferative disease Diseases 0.000 description 1
- 241000273338 Macronyssidae Species 0.000 description 1
- 241000712079 Measles morbillivirus Species 0.000 description 1
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018697 Membrane Proteins Human genes 0.000 description 1
- 241000711386 Mumps virus Species 0.000 description 1
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 1
- BACYUWVYYTXETD-UHFFFAOYSA-N N-Lauroylsarcosine Chemical compound CCCCCCCCCCCC(=O)N(C)CC(O)=O BACYUWVYYTXETD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001606091 Neophasia menapia Species 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101900205472 Newcastle disease virus Hemagglutinin-neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- 108090001074 Nucleocapsid Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 208000012868 Overgrowth Diseases 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 1
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 208000005342 Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 1
- 101710194807 Protective antigen Proteins 0.000 description 1
- 229940096437 Protein S Drugs 0.000 description 1
- 208000033522 Proximal spinal muscular atrophy type 2 Diseases 0.000 description 1
- 101150093191 RIR1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010802 RNA extraction kit Methods 0.000 description 1
- 208000004756 Respiratory Insufficiency Diseases 0.000 description 1
- 206010038678 Respiratory depression Diseases 0.000 description 1
- 206010051497 Rhinotracheitis Diseases 0.000 description 1
- 102100037968 Ribonuclease inhibitor Human genes 0.000 description 1
- 241000606697 Rickettsia prowazekii Species 0.000 description 1
- 239000006146 Roswell Park Memorial Institute medium Substances 0.000 description 1
- 241000282695 Saimiri Species 0.000 description 1
- 241000701062 Saimiriine gammaherpesvirus 2 Species 0.000 description 1
- JGUWRQWULDWNCM-FXQIFTODSA-N Ser-Val-Ser Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O JGUWRQWULDWNCM-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- 101710198474 Spike protein Proteins 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108010008038 Synthetic Vaccines Proteins 0.000 description 1
- 206010051379 Systemic Inflammatory Response Syndrome Diseases 0.000 description 1
- 244000223014 Syzygium aromaticum Species 0.000 description 1
- 208000000389 T-cell leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000028530 T-cell lymphoblastic leukemia/lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 239000004098 Tetracycline Substances 0.000 description 1
- 108010046722 Thrombospondin 1 Proteins 0.000 description 1
- 102000006601 Thymidine Kinase Human genes 0.000 description 1
- 241000711484 Transmissible gastroenteritis virus Species 0.000 description 1
- 239000007984 Tris EDTA buffer Substances 0.000 description 1
- GEGYPBOPIGNZIF-CWRNSKLLSA-N Trp-Ser-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)N)C(=O)O GEGYPBOPIGNZIF-CWRNSKLLSA-N 0.000 description 1
- 101150099321 UL42 gene Proteins 0.000 description 1
- 101150048066 UL45 gene Proteins 0.000 description 1
- 206010046862 Vaccination failure Diseases 0.000 description 1
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 1
- 108010059722 Viral Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000018265 Virus Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010066342 Virus Receptors Proteins 0.000 description 1
- 230000003187 abdominal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 208000007502 anemia Diseases 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000003466 anti-cipated effect Effects 0.000 description 1
- 230000002421 anti-septic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 239000003816 antisense DNA Substances 0.000 description 1
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 1
- 108010068380 arginylarginine Proteins 0.000 description 1
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 1
- 230000010310 bacterial transformation Effects 0.000 description 1
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 108091008324 binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- 208000011090 bird disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 108010006025 bovine growth hormone Proteins 0.000 description 1
- 238000009933 burial Methods 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 108700021117 chicken MGF Proteins 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 229940047120 colony stimulating factors Drugs 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UFJPAQSLHAGEBL-RRKCRQDMSA-N dITP Chemical compound O1[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C[C@@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 UFJPAQSLHAGEBL-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 1
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 1
- 231100000676 disease causative agent Toxicity 0.000 description 1
- MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N dodecyl hydrogen sulfate Chemical compound CCCCCCCCCCCCOS(O)(=O)=O MOTZDAYCYVMXPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940043264 dodecyl sulfate Drugs 0.000 description 1
- 241001493065 dsRNA viruses Species 0.000 description 1
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 1
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 1
- 230000003628 erosive effect Effects 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 108010052305 exodeoxyribonuclease III Proteins 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 1
- 239000003889 eye drop Substances 0.000 description 1
- 229940012356 eye drops Drugs 0.000 description 1
- 244000144992 flock Species 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 101150030521 gI gene Proteins 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 230000037442 genomic alteration Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 210000002149 gonad Anatomy 0.000 description 1
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 1
- 101150029296 grifin gene Proteins 0.000 description 1
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 210000003128 head Anatomy 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 230000003054 hormonal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000521 hyperimmunizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 239000000677 immunologic agent Substances 0.000 description 1
- 229940124541 immunological agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 208000005562 infectious bovine rhinotracheitis Diseases 0.000 description 1
- 108091006086 inhibitor proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 238000011221 initial treatment Methods 0.000 description 1
- 239000003999 initiator Substances 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 102000002467 interleukin receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010093036 interleukin receptors Proteins 0.000 description 1
- 229940100602 interleukin-5 Drugs 0.000 description 1
- 201000006913 intermediate spinal muscular atrophy Diseases 0.000 description 1
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- SUMDYPCJJOFFON-UHFFFAOYSA-N isethionic acid Chemical compound OCCS(O)(=O)=O SUMDYPCJJOFFON-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 208000028756 lack of coordination Diseases 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 238000001638 lipofection Methods 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- YFVGRULMIQXYNE-UHFFFAOYSA-M lithium;dodecyl sulfate Chemical compound [Li+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O YFVGRULMIQXYNE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229940023832 live vector-vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 1
- PWPJGUXAGUPAHP-UHFFFAOYSA-N lufenuron Chemical compound C1=C(Cl)C(OC(F)(F)C(C(F)(F)F)F)=CC(Cl)=C1NC(=O)NC(=O)C1=C(F)C=CC=C1F PWPJGUXAGUPAHP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 1
- 230000001926 lymphatic effect Effects 0.000 description 1
- 108010003700 lysyl aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- KRZWEBVPFGCYMY-UHFFFAOYSA-M methylmercury(1+);hydroxide Chemical compound [OH-].[Hg+]C KRZWEBVPFGCYMY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 238000001823 molecular biology technique Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 210000004237 neck muscle Anatomy 0.000 description 1
- 210000000653 nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 231100000590 oncogenic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002246 oncogenic effect Effects 0.000 description 1
- 229940127240 opiate Drugs 0.000 description 1
- LCCNCVORNKJIRZ-UHFFFAOYSA-N parathion Chemical compound CCOP(=S)(OCC)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 LCCNCVORNKJIRZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 description 1
- 108010024226 placental ribonuclease inhibitor Proteins 0.000 description 1
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 238000007747 plating Methods 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- HJRIWDYVYNNCFY-UHFFFAOYSA-M potassium;dimethylarsinate Chemical compound [K+].C[As](C)([O-])=O HJRIWDYVYNNCFY-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 230000000750 progressive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 229940124551 recombinant vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001850 reproductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000000241 respiratory effect Effects 0.000 description 1
- 208000023504 respiratory system disease Diseases 0.000 description 1
- 108091092562 ribozyme Proteins 0.000 description 1
- 229940046939 rickettsia prowazekii Drugs 0.000 description 1
- 108700004121 sarkosyl Proteins 0.000 description 1
- 229920006395 saturated elastomer Polymers 0.000 description 1
- 238000006748 scratching Methods 0.000 description 1
- 230000002393 scratching effect Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 201000010740 swine influenza Diseases 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- 229960002180 tetracycline Drugs 0.000 description 1
- 229930101283 tetracycline Natural products 0.000 description 1
- 235000019364 tetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 150000003522 tetracyclines Chemical class 0.000 description 1
- 230000002992 thymic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 210000003437 trachea Anatomy 0.000 description 1
- 239000013638 trimer Substances 0.000 description 1
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- POSZUTFLHGNLHX-KSBRXOFISA-N tris maleate Chemical compound OCC(N)(CO)CO.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)\C=C/C(O)=O POSZUTFLHGNLHX-KSBRXOFISA-N 0.000 description 1
- 208000032521 type II spinal muscular atrophy Diseases 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 244000052613 viral pathogen Species 0.000 description 1
- 230000017613 viral reproduction Effects 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16311—Mardivirus, e.g. Gallid herpesvirus 2, Marek-like viruses, turkey HV
- C12N2710/16334—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/16011—Herpesviridae
- C12N2710/16311—Mardivirus, e.g. Gallid herpesvirus 2, Marek-like viruses, turkey HV
- C12N2710/16341—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/16343—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Virology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
LA INVENCION PROPORCIONA UN HERPESVIRUS RECOMBINANTE DE PAVOS, QUE COMPRENDE UNA SECUENCIA DE ADN EXTRAÑA, QUE CODIFICA PARA UNA CITOQUINA, INSERTADA EN UNA REGION DE INSERCION QUE COMPRENDE UN LUGAR XHOI, DENTRO DE UN FRAGMENTO ECOR1 9, DEL GENOMA VIRAL DE UN HERPESVIRUS DE PAVOS. SE PROPORCIONA ASIMISMO UNA SECUENCIA DE ADN EXTRAÑA, QUE CODIFICA PARA UNA CITOQUINA QUE ES CAPAZ DE EXPRESARSE EN UNA CELULA HUESPED INFECTADA CON EL HERPESVIRUS DE PAVOS. LA INVENCION PROPORCIONA UN HERPESVIRUS RECOMBINANTE DE UNA QUIMERA DEL VIRUS DE LA ENFERMEDAD DE MAREK, QUE COMPRENDE LA UNICA REGION LARGA DEL GENOMA DEL HERPESVIRUS DE PAVOS, Y LA UNICA REGION CORTA DEL VIRUS DE LA ENFERMEDAD DE MAREK. POR ULTIMO, LA INVENCION PROPORCIONA VECTORES HOMOLOGOS PARA LA PRODUCCION DE HERPESVIRUS RECOMBINANTES DE HERPESVIRUS DE PAVOS, CELULAS HUESPED, VACUNAS Y METODOS DE INMUNIZACION.
Description
Herpesvirus recombinante de pavos y sus
usos.
A lo largo de esta solicitud se mencionan varias
publicaciones con números arábigos entre paréntesis. Las citas
completas para estas publicaciones se encuentran al final de la
descripción, inmediatamente antes de las reivindicaciones.
La capacidad de aislar DNA y clonar tal DNA
aislado en plásmidos bacterianos ha expandido grandemente los
métodos disponibles para preparar vacunas virales. Los métodos
usados para conseguir la presente invención implican modificar las
secuencias de DNA clonadas de varios agentes patógenos virales de
animales, mediante inserciones, supresiones (delaciones), cambios
de bases únicos o múltiples e inserciones subsiguientes de estas
secuencias modificadas en el genoma del virus. Una utilidad de la
adición de una secuencia extraña se logra cuando la secuencia
extraña codifica una proteína extraña que es expresada durante la
infección viral del animal. El virus vivo resultante puede usarse
luego en una vacuna para producir una respuesta inmune en un animal
hospedante y proporcionar protección al animal contra la enfermedad.
Un virus con estas características se denomina un vector viral,
debido a que se convierte en un vector vivo que llevará y expresará
la proteína extraña en el animal hospedante. En efecto, llega a ser
un sistema de administración elaborado para la(s)
proteína(s) extraña(s).
El documento
EP-A1-0431668 describe herpesvirus
recombinantes de pavos (abreviadamente en lo sucesivo HVT por la
expresión inglesa Herpesvirus of Turkey) y vacunas de
vectores vivos derivadas de los mismos. En particular, el documento
EP-A1-0431668 describe HVT que
contiene un gen heterólogo incorporado en una región de inserción
del HVT. El documento WO 93/25665 también describe herpesvirus
recombinantes de pavos que comprenden un gen extraño insertado en
el DNA genómico del HVT.
El grupo de herpesvirus (familia
Herpesviridae) comprende diversos agentes patogénos que
infectan y provocan enfermedades en un número de especies dianas:
cerdos, ganado, pollos, caballos, perros, gatos, etcétera. Cada
herpesvirus es específico para su especie hospedante, pero todos
estos están relacionados en la estructura de sus genomas, su modo
de replicación, y en alguna extensión en la patología que causan en
el animal hospedante y en el mecanismo de respuesta inmune del
hospedante a la infección por el virus.
La aplicación de las técnicas de DNA
recombinante a los virus animales tiene una historia relativamente
reciente. Los primeros virus que se manipularon por ingeniería
genética han sido los que poseían los genomas más pequeños. En el
caso de los parvovirus, debido a que estos virus son tan pequeños y
no pueden acomodar mucho DNA extra, su uso en ingeniería genética
ha sido como replicones defectuosos. La expresión del gen extraño de
estos virus requiere un virus auxiliar de tipo natural y se limita
a sistemas de cultivos de células. Para los adenovirus, hay una
pequeña cantidad de DNA no esencial que puede reemplazarse por
secuencias extrañas. Los único DNA extraños que parece que se han
expresado en adenovirus son los de los genes del antígeno T de
papovavirus (Mansour et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 1985; Thummel et al., Cell, 1983; Scolnick,
et al., Cell, 1981; Thummel et al.,
Cell 1981), y el gen de la timidina-quinasa
del virus del herpes simplex (abreviadamente en lo sucesivo HSV por
la expresión inglesa Herpes Simplex Virus)
(Haj-Ahmed y Graham, J. of Virology, 1986).
Estas publicaciones no identifican las regiones no esenciales del
HVT, en donde puede injertarse el DNA extraño, ni muestran cómo se
logra la expresión de los genes extraños en el HVT, por ejemplo que
secuencia de promotor y secuencia de terminación debe
usarse.
usarse.
Otro grupo de virus que se ha manipulado por
ingeniería genética son los poxvirus. Un miembro de este grupo, el
virus de la viruela de las vacas (denominado en lo sucesivo "virus
vaccinia"), ha sido el objeto de mucha investigación sobre la
expresión de genes extraños. Los poxvirus son virus que contiene DNA
grandes que se replican en el citoplasma de la célula infectada.
Estos tienen una estructura que es única en el sentido de que no
contienen ninguna cápsida que esté basada en simetría icosaédrica o
simetría helicoidal. Los poxvirus son los que más probablemente han
evolucionado de los microorganismos similares a bacterias a través
de la pérdida de función y degeneración. En parte debido a esta
singularidad, los avances hechos en ingeniería genética de los
poxvirus no pueden extrapolarse directamente a otros sistemas
virales, incluyendo los herpesvirus y el HVT. Las construcciones de
virus recombinante del virus vaccinia se han hecho en un número de
laboratorios que expresan los siguientes genes extraños insertados:
gen de la timidina-quinasa del HSV (Mackett et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1982; Panicali y
Paoletti, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1982, antígeno de
superficie del virus de la hepatitis B (Paoletti et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1984; Smith et al.,
Nature, 1983), gen de la glicoproteína D del HSV, gen de
hemaglutinina del virus de la gripe (Panicali et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 1983; Smith et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1983), gen del antígeno del virus
de la malaria (Smith et al., Science, 1984, y gen de
la glicoproteína G del virus de la estomatitis vesicular (Mackett
et al., Science, 1986). Las características globales
generales del DNA recombinante del virus vaccinia son similares a
las técnicas usadas para todos los virus, especialmente en lo que se
refieren a las técnicas de referencia (Maniatis et al.,
Molecular Cloning, 1982). Sin embargo en detalle, las
técnicas del virus vaccinia no son aplicables al herpesvirus y al
HVT. La utilidad del virus vaccinia como vector de vacunas es un
problema, debido a su relación cercana al virus de la viruela
humana y su patogenicidad respecto a los seres humanos. Por tanto,
el uso del herpesvirus HVT específico de hospedante es una mejor
solución para la vacunación de las aves de corral.
Entre los herpesvirus de primate, solo el HSV de
los seres humanos y, en una extensión limitada, el virus de herpes
saimiri de los simios se ha manipulado por ingeniería
genética para contener secuencias de DNA extraño. El primer uso de
DNA recombinante para manipular el HSV implicó clonar un trozo de
DNA de la región de Unión L-S en la región grande
única de DNA del HSV, específicamente en el gen de
timidina-quinasa (Moccarski et al.,
Cell, 1980). Este inserto no fue un trozo extraño de DNA, más
bien fue un trozo que se presenta naturalmente de DNA de
herpesvirus que se duplicó en otro lugar en el genoma. Este trozo de
DNA no se manipuló para expresar específicamente una proteína, y
por tanto este trabajo no implica la expresión de proteínas en
herpesvirus. La siguiente manipulación del HSV implicó la creación
de deleciones en el genoma de virus mediante una combinación de
técnicas de DNA recombinantes y de selección por
timidina-quinasa. Usando este método se ha suprimido
el gen alfa-22 del HSV (Post et al.,
Cell, 1981), y se ha suprimido una secuencia de 15.000 pares
de bases de DNA de la región de repetición interna del HSV
(Poffenberger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
1981).
Los siguientes casos implican la inserción de
genes que codifican proteínas en los herpesvirus: la inserción de
la glicoproteína C del HSV en un mutante de deleción que ocurre
naturalmente de este gen en HSV (Gibson y Spear, J. of
Virology, 1983); la inserción de la glicoproteína D del HSV de
tipo 2 en HSV de tipo 1 (Lee et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 1982) sin manipulación de secuencias de promotor ya
que el gen no es "extraño"; la inserción de antígeno de
superficie del virus de la hepatitis B en el HSV bajo el control del
promotor ICP4 del HSV (Shih et al., Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 1984); y la inserción de la hormona de crecimiento
bovino en el herpesvirus saimiri con un promotor de SV40 (el
promotor no funcionó en este sistema y un promotor situado aguas
arriba (es decir, la región que se extiende en dirección 5')
endógeno sirvió para transcribir el gen) (Desrosiers et al.,
1984). Dos genes extraños adicionales (gen de ovalbúmina de pollo y
el antígeno nuclear del virus de Epstein-Barr) se
han insertado en el HSV (Arsenakis y Roizman, 1984), y la
glicoproteína X del virus de la pseudo-rabia se han
insertado en el HSV (Post et al., 1985).
Estos casos de deleción o de inserción de genes
en herpesvirus demuestran que es posible manipular genéticamente
genomas de herpesvirus mediante técnicas de DNA recombinantes. Los
métodos que se han usado para insertar genes implican la
recombinación homóloga entre el DNA viral clonado en plásmidos y el
DNA viral purificado transfectado en la misma célula animal. Sin
embargo, la extensión a la cual se puede generalizar la ubicación
de la deleción y los sitios para inserción de los genes extraños no
se conoce de estos estudios previos.
Un objeto de la presente invención es una vacuna
para la enfermedad de Marek. El virus de la enfermedad de Marek
(abreviadamente en lo sucesivo MDV por la expresión inglesa
Marek's Desease Virus) es el agente causante de la
enfermedad de Marek la cual abarca la parálisis de aves de corral,
una enfermedad linfoproliferante común de los pollos. La enfermedad
ocurre más comúnmente en los pollos jóvenes entre una edad de 2 y 5
meses. Los signos clínicos sobresalientes son una parálisis
progresiva de una o más de las extremidades, la falta de
coordinación debida a la parálisis de las patas, la caída del
miembro debido a la implicación del ala, y una posición de cabeza
descendida debido a la implicación de los músculos del cuello. En
casos agudos, da como resultado una depresión grave. En el caso de
cepas altamente oncogénicas, hay una atrofia tímica y bursal
característica. Además hay tumores linfáticos que afectan a las
gónadas, los pulmones, el hígado, el bazo, los riñones y el timo
(Mohanty y Dutta, 1981).
La mayoría de los pollos son vacunados contra el
MDV el primer día de vida para proteger por vida al ave contra el
MDV. Antes de la presente invención, el método de vacunación
principal para el MDV implicó usar cepas que se presentan
naturalmente del herpesvirus de pavos (HVT). Sería ventajoso
incorporar otros antígenos en esta vacuna del primer día de vida,
pero los esfuerzos para combinar las vacunas convencionales no han
demostrado ser satisfactorios debido a la competencia e
inmunosupresión entre los agentes patógenos. Las vacunas
multivalentes a base de HVT obtenidas por manipulación genética en
esta invención representan una forma nueva para vacunar
simultáneamente contra un número de agentes patógenos diferentes.
Por primera vez, se describe un HVT recombinante con un gen extraño
insertado en una región no esencial del genoma del HVT.
Los tipos de ingeniería genética que se han
realizado sobre estos herpesvirus consisten en clonar partes del
DNA del virus en plásmidos de bacterias, reconstruyendo los virus de
DNA mientras que están en el estado clonado de manera que el DNA
contenga deleciones (supresiones) de ciertas secuencias, y añadiendo
además secuencias de DNA extraño bien sea en el lugar de las
deleciones o bien sea en sitios separados de las deleciones.
Un gen extraño de interés señalado como diana
para la inserción en el genoma del HVT puede obtenerse de un
organismo patógeno de interés. Típicamente, el gen de interés
procederá de agentes patógenos que en las aves de corral provocan
la enfermedad que tiene un impacto económico sobre la industria
aviar. Los genes pueden proceder de organismos para los cuales
existen vacunas, y debido a las nuevas ventajas de la tecnología de
vectores las vacunas procedentes del HVT serán superiores. También,
el gen de interés puede proceder de agentes patógenos para los
cuales actualmente no hay vacuna, pero hay un requerimiento para el
control de la enfermedad. Típicamente, el gen de interés codifica
polipéptidos inmunogénicos del agente patógeno, y puede representar
proteínas de superficie, proteínas segregadas y proteínas
estructurales.
Un agente patógeno aviar relevante que es una
diana para el vector del HVT es el virus de la laringotraqueitis
infecciosa (en lo sucesivo abreviado como ILTV por la expresión
inglesa Infectious LaringoTracheitis Virus). El ILTV es un
miembro de la familia de los herpesviridiae, y este agente patógeno
provoca una enfermedad aguda en pollos que se caracteriza por una
depresión respiratoria, jadeo y expectoración de exudados
sanguinolentos. La replicación viral está limitada a las células
del tracto respiratorio, en donde en la tráquea la infección da
lugar a una erosión del tejido y a hemorragia. En pollos, ningún
fármaco ha sido eficaz en reducir el grado de formación de lesión o
en disminuir los signos clínicos. La vacunación de aves con varias
formas modificadas del ILTV derivado del pase por células y/o
regímenes tediosos de administración ha conferido una protección
aceptable en los pollos susceptibles. Debido al grado de atenuación
de las vacunas del ILTV actuales debe tenerse cuidado de asegurarse
que se mantiene el nivel correcto de virus; suficiente para
proporcionar la protección pero no para causar la enfermedad en la
bandada.
Una diana adicional para el método de
vectorización del HVT es la enfermedad de Newcastle, una enfermedad
altamente contagiosa y debilitante e infecciosa que se causa por el
virus de la enfermedad de Newcastle (abreviadamente en lo sucesivo
NDV por la expresión inglesa Newcastle Disease Virus). El NDV
es un virus de RNA monocatenario de la familia de los
paramyxovirus. Los varios patógenos del NDV (velogénico,
mesogénico, lentogénico) difieren con relación a la gravedad de la
enfermedad, la especificidad y los síntomas, pero la mayoría de los
tipos parecen infectar el sistema respiratorio y el sistema
nervioso. El NDV infecta primariamente a los pollos, los pavos y
otras especies aviares. Históricamente la vacunación se ha usado
para evitar la enfermedad, pero debido a las interferencias de los
anticuerpos maternos, el periodo de vida del ave y la ruta de
administración, el productor necesita adaptar los protocolos de
inmunización para ajustarse a necesidades específicas.
El agente terapéutico que ha de ser administrado
mediante un vector viral de la presente invención debe ser una
molécula biológica que es un subproducto de la reproducción del
virus de la viruela de los cerdos. Esto limita el agente
terapéutico en el primer análisis a bien sea DNA, RNA o bien sea
proteínas. Hay ejemplos de agentes terapéuticos de cada una de
estas clases de compuestos en la forma de un DNA antisentido, RNA
anti-sentido (S. Joshi et al., J. of
Virology, 1991), ribozimas (M. Wachsman et al., J.
of General Virology, 1989), tRNA supresores (R.A. Bhat, et
al., Nucleic Acids Research, 1989), RNA bicatenario
inductor de interferón y numerosos ejemplos de agentes terapéuticos
proteicos, hormonales, por ejemplo, insulina a linfoquinas, por
ejemplo, interferones e interleuquinas, a opiáceos naturales. El
descubrimiento de estos agentes terapéuticos y la elucidación de su
estructura y función no hacen obvia la capacidad para usarlos en un
sistema de administración de vector viral.
Esta invención proporciona un herpesvirus
recombinante de pavos que comprende una secuencia de DNA extraño
que codifica una citoquina insertada en una región de inserción la
cual comprende un sitio XhoI en el fragmento EcoRI nº
9 de un herpesvirus de un genoma viral de pavo, y la secuencia de
DNA extraño que codifica una citoquina la cual es capaz de ser
expresada en una célula hospedante infectada con el herpesvirus de
pavos.
Por último, esta invención proporciona vectores
de homología para producir herpesvirus recombinantes de pavos,
células hospedantes, y vacunas.
Figuras
1A-1C
La Figura 1A muestra un mapa de fragmentos de
restricción por BamHI del genoma del HVT. Los fragmentos
están numerados en orden de tamaño descendiente; las letras se
refieren a los fragmentos pequeños cuyo tamaño comparativo no se ha
determinado.
La Figura 1B muestra el fragmento BamHI
nº 16 del genoma del HVT mostrando la ubicación de la inserción del
gen de \beta-galactosidasa en
S-HVT-001.
La Figura 1C muestra el fragmento BamHI
nº 19 del genoma del HVT mostrando la ubicación de la inserción del
gen de \beta-galactosidasa.
Leyenda: B = BamHI; X = XhoI; H =
HindIII; P = PstI; S = SalI; N = NdeI; R
= EcoRI.
Figuras
2A-2D
La Figura 2A contiene un diagrama que muestra la
orientación de los fragmentos de DNA ensamblados en el plásmido
191-47. Las Figuras 2A a 2D muestran las secuencias
localizadas en cada una de las uniones entre los fragmentos de DNA
en el plásmido 191-47. (SEQ ID NO: 20, 21, 22, 23,
24, 25, 26, y 27).
Figuras
3A-3B
La Figura 3A muestra un mapa de restricción de
DNA del HVT en la región del fragmento BamHI nº 16. Este fragmento
está contenido en un fragmento grande HindIII.
La Figura 3A también muestra el sitio
XhoI el cual fue primero cambiado al sitio EcoRI (R)
mediante el uso de un "enlazador" y procedimientos estándares
de clonación. La Figura 3A también muestra detalles de la
construcción del gen beta-gal y del gen del virus
de la bursitis infecciosa (abreviadamente en lo sucesivo IBDV por la
expresión inglesa Infectious Bursal Disease Virus) en el fragmento
BamHI nº 16 para el uso en una recombinación de homólogos. Ambos
genes estuvieron bajo el control del promotor del gen gX del virus
de la pseudo-rabia (abreviadamente PRV por la
expresión inglesa Pseudorabies Virus) (gX).
La Figura 3B muestra el genoma del
S-HVT-003, incluyendo la ubicación
de dos genes extraños insertados, \beta-gal e
IBDV.
En la Figura 3: H = HindIII; B =
BamHI; X = XhoI; R = EcoRI; Xb = XbaI;
Hp = HpaI; S = SmaI; UL = región larga única
(unique long); US = región corta única (unique short);
IR = región de repetición interna (internal repeat); TR =
región de repetición terminal (terminal repeat).
Figura
4
La transferencia Western que indica la expresión
diferencial del antígeno del IBDV de 32 kD en lisados celulares de
células infectadas con S-HVT-003 (32
kD presente) y células infectadas con
S-HVT-001 (32 kD negativo). Los
polipéptidos específicos del IBV se identificaron mediante sondeo de
la transferencia con antisuero de rata hiperinmune dirigido contra
los viriones del IBDV desnaturalizados. Este suero reacciona
primariamente con el antígeno de 32 kD inmunodominante (VP3 del
IBDV). Las pistas de las manchas contienen: 1) patrones de peso
molecular de proteínas, 2) células fibroblastos de embrión de
pollo(abreviadamente en lo sucesivo CEF Chick Embryo
Fibroblasts) no infectadas, 3) células CEF infectadas con
S-HVT-001, 4) 5) y 6)
S-HVT-003 y 7) polipéptidos de
viriones del IBDV.
Figura
5
La transferencia Western que indica la expresión
diferencial del antígeno VP2 de 42 kD en lisados celulares de
células infectadas con S-HVT-003 (42
kD presente) y células infectadas con
S-HVT-001 (42 kD negativo). Los
polipéptidos específicos del IBDV se identificados mediante el uso
de un antisuero específico antipéptido de conejo VP2. Las pistas
contienen: 1) patrones de pesos moleculares de proteínas, 2) células
CEF infectadas con HVT de tipo natural, 3) células CEF infectadas
con S-HVT-001, 4) células infectadas
con S-HVT-003, 5) células CEF
infectadas con S-HVT-003 y 6)
polipéptidos de viriones de IBDV.
Figuras
6A-6C
La Figura 6A muestra un mapa de restricción de
DNA del HVT en la región del fragmento BamHI nº 16. Este
fragmento está contenido en un fragmento HindIII grande.
También se muestra el sitio XhoI (X) en donde los
solicitantes han hecho su inserción. Antes de la inserción, el
XhoI se cambió primeramente al sitio EcoRI (R)
mediante el uso de un "enlazador" y de procedimientos
estándares de clonación
La Figura 6B proporciona detalles de la
construcción del gen \beta-gal y el gen gA del MDV
en el fragmento BamHI nº 16 para usarse en la recombinación
de homólogos. El gen beta-gal estaba bajo el control
del promotor del gen gX del PRV (gX), mientras que el gen gA del
MDV estaba bajo el control de su promotor.
La Figura 6C es el genoma del
S-HVT-004, mostrando la ubicación de
dos genes extraños insertados, \beta-gal y gA del
MDV.
En la Figura 6: H = HindIII; B =
BamH; X = XhoI; R = EcoRI; Xb = XbaI; UL
= región larga única; US = región corta única; IR = región de
repetición interna; TR = región de repetición terminal.
Figuras
7A-7B
La descripción detallada de la inserción de gen
marcador de \beta-galactosidasa (lacZ) en
un vector de homología 467-22.A12. La Figura 7A
muestra un diagrama indicando la orientación de los fragmentos DNA
ensamblados en el gen marcador. El origen de cada fragmento está
descrito en el apartado de materiales y métodos. Las Figuras 7A y
7B muestran las secuencias de DNA localizadas en las uniones entre
los fragmentos de DNA y en los extremos del gen marcador (SEQ ID
NO: 28, 29, 30, 31, 32, y 33). Las Figuras 7A y 7B muestran además
los sitios de restricción usados para generar cada fragmento de DNA
en la unión apropiada y la ubicación de la región de codificación
del gen lacZ. Los números entre paréntesis (
\hskip0.3cm) se refieren a los aminoácidos, y los sitios de restricción entre corchetes [
\hskip0.3cm] indican los restantes sitios que se destruyen durante la construcción. Se usan las siguientes abreviaturas: virus de la pseudo-rabia (PRV por la expresión inglesa Pseudorabies Virus), gen del operón de lactosa Z (lacZ), Escherichia coli (E. coli), señal de poliadenilación (pA), y glicoproteína X (gpX).
\newpage
Figura
8
Mapa de restricción con BamHI y
NotI del genoma del HVT. Se muestran las regiones larga única
(UL) y única corta (US). Las repeticiones de regiones largas y
cortas están indicadas por las cajas o marcos. Los fragmentos
BamHI están numerados en orden decreciente. La localización
de las sondas P1-P4 están indicadas. El origen de
cada sonda es como sigue: Pl - BamHI nº 6, P2 - BamHI
nº 2, P3 - BamHI nº 3, y P4 -4,0 KB
sub-fragmento BgIII a StuI del HVT
genómico, fragmento XbaI nº 5 (8,0 KB).
Figura
9
Muestra el procedimiento para la construcción
del plásmido pSY229.
Figuras
10A-10B
Descripción detallada del inserto del casete del
gen MDV en los vectores de homología 456-18.18 y
456-17.22. Las Figuras 10A y 10-B
muestran un diagrama que indica la orientación de los fragmentos de
DNA ensamblados en el casete y la ubicación de los genes gA y gB
del MDV. El origen de cada fragmento está descrito en el apartado
titulado Materiales y Métodos. Las secuencias localizadas en las
uniones entre cada fragmento y en los extremos del gen marcador se
muestran en las Figuras 10A y 10B, incluyendo la Unión A (SEQ ID
NO: 34), Unión B (SEQ ID NO. 35), y la Unión C (SEQ ID NO. 36).
Los sitios de restricción usados para generar cada fragmento están
indicados en la unión apropiada. Los números entre paréntesis
(
\hskip0.3cm) se refieren a los aminoácidos y los sitios de restricción entre corchetes [
\hskip0.3cm] indican los restantes sitios que se destruyeron durante la construcción.
Figuras
11A-11B
La descripción detallada del inserto del
fragmento HindIII en el vector de homología
556-41.5. El diagrama de las Figuras 11A y 11B
muestra la orientación de los fragmentos de DNA ensamblados en el
casete. El origen de cada fragmento está descrito en el apartado
titulado Materiales y Métodos. Las Figuras 11A y 11B muestran
además las secuencias de DNA localizadas en las uniones entre cada
fragmento de DNA del plásmido y en los extremos del gen marcador,
incluyendo la Unión A (SEQ ID NO. 37), Unión B (SEQ ID NO. 38) y
la Unión C (SEQ ID NO. 39). Los sitios de restricción usados para
generar cada fragmento están indicados en la unión apropiada.
También se da la localización del gen gD del MDV y una parte del gen
gI. Los números entre paréntesis (
\hskip0.3cm) se refieren a aminoácidos, y los sitios de restricción entre corchetes [
\hskip0.3cm] indican los restantes sitios que se destruyeron durante la construcción.
Figuras
12A-12C
Descripción detallada del inserto del fragmento
SalI en el vector de homología 255-18.B16. La
Figura 12A muestra un diagrama que indica la orientación de los
fragmentos de DNA ensamblados en el casete. El origen de cada
fragmento está descrito en el apartado titulado Materiales y
Métodos. Las Figuras 12A a 12C muestran además las secuencias de
DNA localizadas en las uniones entre cada fragmento y en los
extremos del gen marcador, incluyendo la Unión A (SEQ ID NO. 40),
Unión B (SEQ ID NO: 41), la Unión C (SEQ ID NO: 42), la Unión D
(SEQ ID NO: 43), la Unión E (SEQ ID NO: 44), la Unión F (SEQ ID
NO: 45), la Unión G (SEQ ID NO: 46), y la unión H (SEQ ID NO:
47). Los sitios de restricción usados para generar cada fragmento
están indicados en la unión apropiada. Se muestra la localización
del gen híbrido F del NDV y lacZ-HN del NDV.
Los números entre paréntesis (
\hskip0.3cm) se refieren a aminoácidos, y los sitios de restricción entre corchetes [
\hskip0.3cm] indican los restantes sitios que se destruyeron durante la construcción.
Figuras
13A-13B
Muestran como el sitio XhoI único del
fragmento BamHI nº 10 del genoma del HVT se convirtió en un
sitio PacI y un sitio NotI mediante la inserción de
la secuencia de DNA sintético en el sitio XhoI (Nucleótidos
nº 1333-1338; SEQ ID NO: 48). La Figura 13A
muestra el sitio XhoI convertido en el sitio PacI para
generar el plásmido 654-45.1 (SEQ ID NO: 55) y la
Figura 13B muestra el sitio XhoI convertido en un sitio
NotI para generar el plásmido 686-63.A1 (SEQ
ID NO: 56).
Figura
14
Mapa de restricción y marcos de lectura abiertos
(abreviadamente en lo sucesivo OFR por la expresión inglesa Open
Reading Frame) de la secuencia que rodea el sitio de inserción
en el tramo largo único del HVT (SEQ ID NO: 48). Este mapa muestra
el sitio de restricción XhoI (SEQ ID NO: 48; nucleótidos
1333-1338) usado para la inserción de genes
extraños. También se muestran cuatro marcos de lectura abiertos en
esta secuencia. El ORF A está interrumpido por la inserción del DNA
en el sitio XhoI. La secuencia de aminoácidos del ORF A (SEQ
ID NO: 50); nucleótidos 402 a 602; 267 aminoácidos no muestra una
identidad de secuencia significativa para cualquier secuencia de
aminoácidos conocida en las bases de datos de proteínas. El UL 54
(SEQ ID NO: 49; nucleótidos 146 a 481; 112 aminoácidos) y UL 55
(SEQ ID NO: 51, nucleótidos 1599 a 2135; 179 aminoácidos) muestra
una identidad de secuencia significativa para las proteínas UL 54 y
UL 55 del tipo I de herpesvirus simplex, respectivamente. El ORF B
(SEQ ID NO: 52; nucleótidos 2634 a 2308; 109 aminoácidos) no
muestra una identidad de secuencia significativa para cualquier
secuencia de aminoácidos conocida en las bases de datos de
proteínas. Las investigaciones se llevaron a cabo sobre bases de
datos del National Center for Biotechnological Information
(NCBI) del National Health Institute (NHI) de EE.UU. usando
el programa de ordenador Blast.
Figura
15
Mapa de restricción de cósmidos
407-32.1C1, 67101.A40, 672-07.C40, y
654-45.1. Está ilustrado el solapamiento de los
fragmentos EcoRI nº 9 y BamHI nº 10 de DNA genómico
del HVT. Un sitio XhoI único en los fragmentos EcoRI
nº 9 y BamHI nº 10 se ha convertido en un sitio PacI
único en el plásmido 654-45.1 o un sitio NotI
en el plásmido 686-63.A1.
Esta invención proporciona un herpesvirus
recombinante de pavos (HVT) que comprende una secuencia de DNA
extraño insertada en un sitio no esencial en el genoma del HVT. La
secuencia de DNA extraño es capaz de ser expresada en una célula
hospedante infectada con el HVT recombinante y su expresión está
bajo el control del promotor localizado aguas arriba (es decir, la
región que se extiende en dirección 5') de la secuencia de DNA
ex-
traño.
traño.
Como se define en la presente memoria, "un
sitio no esencial del genoma del HVT" significa una región en el
genoma viral del HVT el cual no es necesario para la infección viral
o la reproducción.
Como se define en la presente memoria, "genoma
viral" o "DNA genómico" significa el DNA completo natural
que contiene el herpesvirus de pavos. Como se define en la presente
memoria, la "secuencia de DNA extraño" o el "gen"
significa cualquier DNA o gen que es exógeno al DNA genómico.
Como se define en la presente memoria, un
"marco de lectura abierto" (abreviadamente en lo sucesivo ORF
por la expresión inglesa Open Reading Frame) es un segmento
de DNA que contiene codones que pueden ser transcritos en RNA que a
su vez puede ser traducido a una secuencia de aminoácidos y que no
contiene un codón de terminación.
La invención proporciona además varios sitios de
inserción apropiados en el genoma del HVT útiles para la
construcción del herpesvirus recombinante de la presente invención.
Los sitios de inserción incluyen el fragmento EcoRI nº 9 y
el fragmento BamHI nº 10 del genoma del HVT, siendo un sitio
de inserción preferido en ambos de aquellos fragmentos una
endonucleasa de restricción XhoI.
Otro de tales sitios es el fragmento
BamHI nº 16 del genoma del HVT. Un sitio de inserción
preferido en el fragmento BamHI nº 16 cae dentro de un marco de
lectura abierto que codifica una proteína UL43 y un sitio de
inserción preferido en ese marco de lectura abierto en un sitio de
endonucleasa de restricción XhoI.
Aún otro sitio de inserción es el gen US2 del
HVT, siendo un sitio de inserción preferido en éste un sitio de
endonucleasa StuI.
Esta invención proporciona un herpesvirus
recombinante de pavos que comprende un herpesvirus del genoma viral
de pavos que contiene una secuencia de DNA extraño insertada en el
fragmento EcoRI nº 9 del herpesvirus del genoma viral de
pavos, y la secuencia de DNA extraño es capaz de ser expresada en la
célula hospedante infectada con el herpesvirus de pavos.
En una realización, la secuencia de DNA extraño
está insertada en el marco de lectura abierto A (ORF A) del
fragmento EcoRI nº 9. La inserción de las secuencias de DNA
extraño en el sitio XhoI del fragmento EcoRI nº 9
interrumpe el ORFA lo que indica que la región ORFA completa no es
esencial para la replicación del virus recombinante.
Para los fines de esta invención, "un
herpesvirus recombinante de pavos" es un herpesvirus vivo de
pavos que ha sido generado, por los métodos recombinantes muy
conocidos por os expertos en la técnica, por ejemplo, los métodos
establecidos en Transfección de DNA para generar herpesvirus
recombinantes en el apartado Materiales y Métodos, y el
virus no ha tenido suprimido material genético esencial para la
reproducción del herpesvirus de pavos. El herpesvirus de pavos
purificado dio como resultado una inserción estable de las
secuencias de DNA extraño o de un gen en el fragmento EcoRI
nº 9 o el fragmento BamHI nº 10.
La invención proporciona además herpesvirus
recombinantes de pavos en donde la secuencia de DNA extraño codifica
un polipéptido el cual es antigénico en un animal en el cual está
introducido el herpesvirus recombinante.
En una realización el polipéptido es un marcador
detectable. Para los fines de la invención, un "polipéptido que
es un marcador detectable" incluye la forma de dímero, trímero y
tetrámero del polipéptido. La \beta-galactosidasa
de E. coli es un compuesto tetrámero de cuatro polipéptídos o
subunidades de monómero. En una realización el polipéptido es una
\beta-galactosidasa de E. coli.
Preferiblemente, este herpesvirus recombinante de pavos se denomina
S-HVT-001,
S-HVT-014 ó
S-HVT-012.
El S-HVT-012 ha
sido depositado el 15 de octubre de 1992 de acuerdo con el Tratado
de Budapest en el International Depository of Microorganisms for
the Purpose of Patent Procedure with the Patent Culture Depository
of the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive,
Rockville, Maryland 20852, USA bajo el número de acceso ATTC VR.
238.2.
El S-HVT-014 ha
sido depositado el 7 de diciembre de 1993 de acuerdo con el Tratado
de Budapest en el International Depository of Microorganisms for
the Purpose of Patent Procedure with the Patent Culture Depository
of the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive,
Rockville, Maryland 20852, USA bajo el número de acceso ATTC VR.
2440.
En otra realización la secuencia de DNA extraño
codifica una citoquina. En otra realización la citoquina es un
factor de crecimiento mielomonocítico de pollos (abreviadamente en
lo sucesivo cMGF por la expresión inglesa chicken myelomonocytic
growth factor) o interferón de pollos (cIFN). En una realización
preferida, el herpesvirus recombinante de pavos se denomina
S-HVT-144.
La invención proporciona además un herpesvirus
recombinante de pavos cuyo genoma viral contiene DNA extraño que
codifica un polipéptido antigénico el cual es del virus de la
enfermedad de Marek (MDV), el virus de la enfermedad de Newcastle
(NDV), el virus de la laringotraqueitis infecciosa (ILTV), el virus
de la bronquitis infecciosa (IBV) o el virus de la enfermedad
bursal infecciosa (IBDV).
Esta invención proporciona un herpesvirus
recombinante de pavos con una inserción de secuencia de DNA extraño
en el fragmento EcoRI nº 9 el cual comprende además una
secuencia de DNA extraño que codifica el polipéptido antigénico
seleccionado del grupo que consiste en polipéptidos del virus de la
enfermedad de Marek, del virus de la enfermedad de Newcastle, del
virus de la laringotraqueitis infecciosa, del virus de la bronquitis
infecciosa y del virus de la enfermedad bursal infecciosa.
En una realización de la secuencia de DNA
extraño que codifica el polipéptido antigénico es del virus de la
enfermedad de Marek y codifica la glicoproteína gA del virus de la
enfermedad de Marek, la glicoproteína gB del virus de la enfermedad
de Marek o la glicoproteína gD del virus de la enfermedad de Marek.
En otra realización las secuencias de DNA extraño que codifican la
glicoproteína gA, la glicoproteína gB o la glicoproteína gD del
virus de la enfermedad de Marek están insertadas en el sitio
StuI único de la región codificadora del gen US2 del
herpesvirus de pavo.
La invención proporciona además herpesvirus
recombinantes de pavos cuyo DNA genómico contiene DNA extraño que
codifica el polipéptido antigénico del virus de la enfermedad de
Marek. Preferiblemente, el polipéptido antigénico es la
glicoproteína gB, gA o gD del virus de la enfermedad de Marek.
En una realización un HVT recombinante que
contiene una secuencia de DNA extraño codifica el gen VP2 del IBDV,
el gen gA del MDV y el gen gB del MDV. Preferiblemente, tal virus
recombinante se denomina S-HVT-137
y S-HVT-143.
La invención proporciona además herpesvirus
recombinantes de pavos cuyo DNA genómico contiene DNA extraño que
codifica la glicoproteína gA del virus de la enfermedad de Marek y
además comprende DNA extraño que codifica un polipéptido el cual es
un marcador detectable. Preferiblemente, este herpesvirus
recombinante de pavos se denomina
S-HVT-004.
La invención proporciona además herpesvirus
recombinantes de pavos cuyo DNA genómico contiene el DNA extraño
que codifica la glicoproteína gB del virus de la enfermedad de
Marek. Preferiblemente, este herpesvirus recombinante de pavos se
denomina S-HVT-045.
También se proporciona una realización de un HVT
recombinante que contiene una secuencia de DNA extraño que codifica
el gen gB del MDV y este HVT recombinante se denomina
S-HVT-045. El
S-HVT-045 se ha depositado el 15 de
octubre de 1992 de acuerdo con el Tratado de Budapest en el
International Depository of Microorganisms for the Purpose of
Patent Procedure with the Patent Culture Depository of the American
Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville,
Maryland 20852, USA, bajo el número de acceso ATCC VR. 2383.
La presente invención también proporciona HVT
recombinantes diseñados para contener más de una secuencia de DNA
que codifica un antígeno del MDV. Por ejemplo, una secuencia de DNA
extraño que codifica los genes gA y gB del MDV pueden ser ambos
vectorizados en el genoma del HVT. Además, puede construirse un HVT
recombinante para incluir una secuencia de DNA extraño que codifica
los genes gA, gB y gD del MDV.
Los HVT recombinantes denominados
S-HVT-046 y
S-HVT-C47 proporcionan realizaciones
de un HVT recombinante que contiene la secuencia de DNA extraño que
codifica los genes gA y gB del MDV; los virus recombinantes
denominados S-HVT-048 y
S-HVT-062 proporcionan realizaciones
de un HVT recombinante que contiene la secuencia de DNA extraño que
codifica los genes gA, gB y gD del MDV.
El S-HVT-062 ha
sido depositado el 23 de febrero de 1993 de acuerdo con el Tratado
de Budapest en el International Depository of Microorganisms for
the Purpose of Patent Procedure with the Patent Culture Depository
of the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive,
Rockville, Maryland 20852, USA, bajo el número de acceso ATCC VR.
2401.
La presente invención proporciona un HVT
recombinante que contiene una secuencia de DNA extraño que codifica
un polipéptido antigénico del virus de la enfermedad de Newcastle
(NDV). En tal caso, se prefiere que el polipéptido antigénico sea
una proteína de fusión (F) del virus de la enfermedad de Newcastle o
una hemaglutinina-neuraminidasa (HN) del virus de
la enfermedad de Newcastle, o una proteína recombinante que
comprende \beta-galactosidasa de E. coli
fusionada a una hemaglutinina-neuraminidasa (HN) del
virus de la enfermedad de Newcastle. Un ejemplo de tal virus es el
denominado S-HVT-007.
La presente invención también proporciona HVT
recombinantes manipulados por ingeniería genética para contener uno
o más secuencias de DNA extraño que codifica(n) una forma de
polipéptido antigénico del MDV, así como una o más secuencias de
DNA extraño que codifica(n) un polipéptido antigénico del
NDV. Preferiblemente, el polipéptido antigénico es gB, gD o gA del
MDV y el F ó HN del NDV.
En una realización de la invención, el HVT
recombinante contiene secuencias de DNA extraño que codifican los
genes gB del MDV, gA del MDV y F del NDV. Preferiblemente, este HVT
se denomina S-HVT-048.
En una realización de la invención, el HVT
recombinante contiene secuencias de DNA extraño que codifican el
gen gB del MDV, el gen gA del MDV y el gen HN del MDV.
Preferiblemente este HVT se denomina
S-HVT-049.
Por ejemplo, una secuencia de DNA extraño que
codifica los genes gA y gB del MDV pueden ambos ser vectorizados en
el genoma del HVT. Además, puede construirse un HVT recombinante que
incluya una secuencia de DNA extraño que codifica los genes gA, gB
y gD del MDV.
Además, en otra realización la secuencia de DNA
extraño que codifica el polipéptido antigénico es un virus de la
enfermedad de Newcastle y codifica la proteína de fusión del virus
de la enfermedad de Newcastle o la
hemaglutinina-neuraminidasa del virus de la
enfermedad de Newcastle. En otra realización las secuencias de DNA
extraño que codifican la proteína de fusión del virus de la
enfermedad de Newcastle o la
hemaglutinina-neuraminidasa del virus de la
enfermedad de Newcastle están insertados en el sitio XhoI en
EcoRI nº 9 de la región larga única del herpesvirus de
pavos. En una realización preferida, el herpesvirus recombinante de
pavos se denomina S-HVT-136.
La invención proporciona además un herpesvirus
recombinante de pavos cuyo DNA genómico contiene un DNA extraño que
codifica un polipéptido antigénico del virus de la enfermedad de
Marek y que comprende además un DNA extraño que codifica un
polipéptido antigénico del virus de la enfermedad de Newcastle.
La presente invención proporciona además un HVT
recombinante que contiene una secuencia de DNA extraño que codifica
un polipéptido antigénico de la glicoproteína gB del virus de la
enfermedad de Marek y la glicoproteína gA del virus de la
enfermedad de Marek y comprende además un DNA extraño que codifica
una proteína de fusión (F) del virus de la enfermedad de Newcastle.
Preferiblemente, el herpesvirus recombinante de pavos se denomina
S-HVT-048.
La invención proporciona además un herpesvirus
recombinante de pavos cuyo DNA genómico contiene DNA extraño que
codifica la glicoproteína gB del virus de la enfermedad de Marek y
la glicoproteína gA del virus de la enfermedad de Marek y que
comprende además DNA que codifica la
hemaglutinína-neuraminidasa (HN) del virus de la
enfermedad de Newcastle, Preferiblemente, este herpesvirus
recombinante de pavos se denomina
S-HVT-049.
La invención proporciona además un herpesvirus
recombinante de pavos cuyo DNA genómico contiene el DNA extraño que
codifica la glicoproteína gB de virus de la enfermedad de Marek y la
glicoproteína gA del virus de la enfermedad de Marek y que
comprende además la proteína de fusión (F) del virus de la
enfermedad de Newcastle y la
hemaglutinina-neuraminidasa (HN) del virus de la
enfermedad de Newcastle. Preferiblemente, este herpesvirus
recombinante de pavos se denomina
S-HVT-050.
El S-HVT-050 ha
sido depositado el 23 de febrero de 1993 de acuerdo con el Tratado
de Budapest en el International Depository of Microorganisms for
the Purpose of Patent Procedure with the Patent Culture Depository
of the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive,
Rockville, Maryland 20852, USA, bajo el número de acceso ATCC VR.
2400.
En aún otra realización de la invención, el HVT
recombinante contiene la secuencia de DNA extraño que codifica el
gen gB del MDV, el gen gA del MDV, el gen gD del MDV, el gen F del
NDV F y el gen HN del NDV. Preferiblemente, tal HVT recombinante se
denomina S-HVT-106 ó
S-HVT-128.
La invención proporciona además un herpesvirus
recombinante. Además, en una realización, la secuencia de DNA
extraño codifica el polipéptido antigénico de un virus de la
laringotraqueitis infecciosa y codifica una glicoproteína gB del
virus de la laringotraqueitis infecciosa, la glicoproteína gI del
virus de la laringotraqueitis infecciosa o la glicoproteína gD del
virus de la laringotraqueitis infecciosa.
En otra realización, la secuencia de DNA extraño
codifica un polipéptido antigénico el cual es derivado o derivable
de un grupo que consiste de: gA del MDV, gB del MDV, gD del MDV, HN
del NDV, F del NDV, gB del ILTV, gI del ILTV, gD del ILTV, VP2 del
IBV, VP3 del IBDV, VP4 del IBDV, virus de la encefalomielitis aviar,
reovirus aviar, paramixovirus aviar, virus de la gripe de las aves
de corral, adenovirus aviar, virus de viruela de los pollitos,
coronavirus aviar, rotavirus aviar, virus de la anemia del pollo
(agente), Salmonella spp., E. coli, Pasteurella
spp., Bordetella spp., Eimeria spp., Histomonas spp., Trichomonas
spp., nemátodos de aves de corral, céstodos, tremátodos,
ácaros/piojos de aves de corral, protozoos de aves de corral.
La invención proporciona además un herpesvirus
recombinante de pavos que contiene una secuencia de DNA extraño que
codifica un polipéptido antigénico del virus de la laringotraqueitis
infecciosa. Se prefiere que el polipéptido antigénico sea la
glicoproteína gB del ILTV, gD del LTV o gI del ILTV.
También se proporcionan HVT recombinantes que
están manipulados por ingeniería genética para contener más de una
secuencia de DNA extraño que codifica un antígeno del ILTV. Por
ejemplo, los genes gB y gD del ILTV pueden ser vectorizados juntos
en el genoma del HVT, de manera que se obtengan gD y gI del ILTV, y
gB, gD y gI del ILTV. El HVT recombinante denominado
SHVT-051, S-HVT-052,
y S-HVT-038 son realizaciones de tal
virus recombinante.
La presente invención también proporciona un HVT
recombinante que contiene más de una secuencia de DNA extraño que
codifica un polipéptido antigénico del MDV, así como una o más
secuencias de DNA extraño que codifica(n) un polipéptido
antigénico del ILTV. Preferiblemente, el polipéptido antigénico del
MDV es gB, gD o gA del MDV, y el polipéptido antigénico del ILTV es
gB, gD o gI del ILTV.
En una realización de la invención, el HVT
recombinante contiene las secuencias de DNA extraño que codifica gB
del MDV, gA del MDV, gD del MDV, gD del ILTV y gB del ILTV.
Preferiblemente, este recombinante HVT se denomina
S-HVT-123.
En otra realización de esta invención, el HVT
recombinante contiene secuencias de DNA extraño que codifican gB
del MDV, gA del MDV, gD del MDV, gI del ILTV y gD del ILTV.
Preferiblemente, este HVT recombinante se denomina
S-HVT-139 o
S-HVT-140.
La invención proporciona además un herpesvirus
recombinante de pavos cuyo DNA genómico contiene DNA extraño que
codifica la glicoproteína gB del virus de la enfermedad de Marek, la
glicoproteína gA del virus de la enfermedad de Marek, y la
glicoproteína gD del virus de la enfermedad de Marek y comprende
además DNA extraño que codifica una glicoproteína gD del virus de
la laringotraqueitis infecciosa, la glicoproteína gB del virus de
la laringotraqueitis infecciosa y la
\beta-galactosidasa de E. coli.
Preferiblemente, este herpesvirus recombinante de pavos se denomina
S-HVT-104.
Esta invención proporciona además un herpesvirus
recombinante de pavos cuyo DNA genómico contiene DNA extraño que
codifica proteínas del virus de la bronquitis infecciosa o una
proteína matriz del virus de la bronquitis infecciosa.
La presente invención proporciona además un HVT
recombinante que contiene una secuencia de DNA extraño que codifica
un polipéptido antigénico de un virus de la bronquitis infecciosa
(IBV). Preferiblemente, el polipéptido antigénico es una proteína
clavo (spike) del IBV o una proteína matriz del IBV.
La presente invención también proporciona un HVT
recombinante que contiene una o más secuencias de DNA extraño que
codifica(n) un polipéptido antigénico del IBV, así como una o
más secuencias de DNA extraño que codifica(n) un polipéptido
antigénico del MDV. Preferiblemente, el polipéptido antigénico del
IBV es una proteína clavo del IBV o una proteína matriz del IBV, y
el polipéptido antigénico del MDV es gB, gD o gA del MDV. Una
realización de tal virus recombinante se denomina
S-HVT-066.
La invención proporciona además un herpesvirus
recombinante de pavos cuyo DNA genómico contiene DNA extraño que
codifica un polipéptido antigénico del virus de la enfermedad bursal
infecciosa y que comprende además DNA extraño que codifica un
polipéptido que es un marcador detectable.
Además, en una realización una secuencia de DNA
extraño que codifica el polipéptido antigénico es de un virus de la
enfermedad bursal infecciosa. En otra realización la secuencia de
DNA extraño codifica un gen VP2 del virus de la enfermedad bursal
infecciosa. En otra realización la secuencia de DNA codifica un gen
VP3 del virus de la enfermedad bursal infecciosa. En otra
realización la secuencia de DNA extraño codifica un gen VP4 del
virus de la enfermedad bursal infecciosa. Preferiblemente, este
herpesvirus recombinante de pavos se denomina
S-HVT-003 o
S-HVT-096.
El HVT recombinante denominado
S-HVT-003 o SHVT-096
es una realización de un HVT recombinante que comprende la
secuencia de DNA extraño que codifica el polipéptido antigénico del
IBDV y que codifica un marcador detectable. El
SHVT-003 ha sido depositado el 21 de julio de 1987
de acuerdo con el Tratado de Budapest en el International
Depository of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure
with the Patent Culture Depository of the American Type Culture
Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852,
USA, bajo el número de acceso ATCC VR. 2178.
Esta invención proporciona un herpesvirus
recombinante de pavos que contiene una secuencia de DNA extraño
insertada en el fragmento EcoRI nº 9 del genoma viral de
herpesvirus de de pavos. en donde la secuencia de DNA es de un
virus de la laringotraqueitis infecciosa y codifica la glicoproteína
gB del virus de la laringotraqueitis infecciosa o la glicoproteína
gD del virus de la laringotraqueitis infecciosa.
En una realización, la secuencia de DNA extraño
es de un virus de la laringotraqueitis infecciosa y codifica una
glicoproteína gD del virus de la laringotraqueitis infecciosa o una
glicoproteína gI del virus de la laringotraqueitis.
Esta invención proporciona un herpesvirus
recombinante de pavos que contiene una secuencia de DNA extraño
insertada en el fragmento EcoRI nº 9 de herpesvirus del
genoma viral de pavos en donde la secuencia de DNA extraño es de un
virus de la enfermedad de Newcastle y codifica una HN del virus de
la enfermedad de Newcastle o un proteína F del virus de la
enfermedad de Newcastle.
Esta invención proporciona un herpesvirus
recombinante de pavos que contiene una secuencia de DNA extraño
insertada en el fragmento EcoRI nº 9 del genoma viral del
herpesvirus de pavos, en donde la secuencia de DNA extraño es de un
virus de la bronquitis bursal infecciosa y codifica un VP2, VP3, VP4
del virus de la enfermedad bursal infecciosa.
Esta invención proporciona un herpesvirus
recombinante de pavos que contiene una secuencia de DNA extraño
insertada en el fragmento EcoRI nº 9 del genoma viral de herpesvirus
de pavos, en donde la secuencia de DNA extraño es de un virus de la
bronquitis infecciosa y codifica una proteína matriz del virus de la
bronquitis infecciosa.
En otra realización una secuencia de DNA extraño
codifica un polipéptido antigénico que se deriva o es derivable de
un grupo que consiste de: gA del MDV, gB del MDV, gD del MDV, HN del
NDV, F del NDV, gB del ILTV, gI del ILTV, gD del ILTV, VP2 del
IBDV, VP3 del IBDV, VP4 del IBDV, virus de la encefalomielitis
aviar, reovirus aviar, paramixovirus aviar, virus de la gripe
aviar, adenovirus aviar, virus de la viruela aviar, coronavirus
aviar, rotavirus aviar, virus de la anemia de pollitos (agente),
Salmonella spp., E. coli., Pasteurella spp.,
Bordetella spp. Eimeria spp., Histomonas spp., Trichomonas spp.;
nemátodos de aves de corral, céstodos, tremátodos, ácaros/piojos,
protozoos de aves de corral. En una realización preferida el
herpesvirus recombinante de pavos se denomina
S-HVT-136.
Tal polipéptido antigénico puede ser derivado o
derivable de lo siguiente: agente patógeno felino, agente patógeno
canino, agente patógeno equino, agente patógeno bovino, agente
patógeno aviar, agente patógeno porcino o agente patógeno
humano.
En otra realización, el polipéptido antigénico
de un agente patógeno humano procede de un herpesvirus humano de
virus de herpes simplex 1, virus de herpes simplex 2, de
citomegalovirus humano, de virus Epstein-Barr, de
virus de varicela zóster, de herpesvirus-6 humano,
de herpesvirus-7 humano, de virus de la gripe
humana, de virus de la inmunodeficiencia humana, de virus de la
rabia, de virus de sarampión, de virus de la hepatitis B y de virus
de la hepatitis C. Además, el polipéptido antigénico de un agente
patógeno humano puede ser asociado con malaria o un tumor maligno
del grupo que consiste en Plasmodium falciparum, Bordetella
pertusis, y tumor maligno.
La invención proporciona además un herpesvirus
recombinante de pavos cuyo DNA genómico contiene el DNA extraño que
codifica la proteína de fusión (F) del virus de la enfermedad de
Newcastle y que comprende además DNA extraño que codifica una
proteína recombinante, en donde el gen de la
\beta-galactosidasa de E. coli está
fusionado al gen de la hemaglutinina-neuraminidasa
HN) del virus de la enfermedad de Newcastle.
La invención proporciona además un herpesvirus
recombinante de pavos cuyo DNA genómico contiene DNA extraño que
codifica la glicoproteína gB del virus de la enfermedad de Marek y
la glicoproteína gA del virus de la enfermedad de Marek y que
comprende además DNA extraño que codifica la
hemaglutinina-neuraminidasa (HN) del virus de la
enfermedad de Newcastle.
Esta invención proporciona un herpesvirus
recombinante del virus quimérico de la enfermedad de Marek en pavos
que comprende una región genómica viral larga única de herpesvirus
de pavos y una región corta única del virus de la enfermedad de
Marek. En una realización, el herpesvirus recombinante del virus
quimérico de la enfermedad de Marek en pavos contiene una secuencia
de DNA extraño insertada en el fragmento EcoRI nº 9 del
genoma viral del herpesvirus de pavos, y la secuencia de DNA
extraño capaz de ser expresada en una célula hospedante infectada
con el herpesvirus de pavos.
En una realización el herpesvirus recombinante
de pavos contiene una secuencia de DNA extraño que codifica un
polipéptido. El polipéptido puede ser antigénico en un animal en el
cual se introduce el herpesvirus recombinante.
En otra realización el polipéptido es
\beta-galactosidasa de E. coli. En otra
realización la secuencia de DNA extraño codifica una citoquina. En
otra realización, la citoquina es un factor de crecimiento
mielomonocítico de pollo (cMGF) o un interferón de pollos
(cIFN).
La invención proporciona además un herpesvirus
recombinante de pavos en donde la secuencia de DNA extraño codifica
un polipéptido que es antigénico en un animal en el cual se
introduce el herpesvirus recombinante.
Además, el herpesvirus recombinante de pavos
comprende también una secuencia de DNA extraño que codifica el
polipéptido antigénico seleccionado del grupo que consiste en el
virus de la enfermedad de Marek, el virus de la enfermedad de
Newcastle, el virus de la laringotraqueitis infecciosa, el virus de
la bronquitis infecciosa y el virus de la enfermedad bursal
infecciosa.
Esta invención proporciona un virus de herpes
recombinante de pavos en donde la secuencia de DNA extraño está
bajo el control de un promotor de herpesvirus situado aguas arriba
(es decir, la región que se extiende en dirección 5') endógeno. En
una realización, la secuencia de DNA extraño está bajo el control de
un promotor heterólogo situado aguas arriba. En otra realización,
el promotor se selecciona de gX del PRV, alfa 4 del
HSV-1, promotor temprano inmediato del HCMV, gA del
MDV, gB del MDV, gD de MDV, gB del ILTV, VP8 del
BHV-1.1 y gD del ILTV.
Esta invención proporciona un vector de
homología para producir un herpesvirus recombinante de pavos
insertando DNA extraño en el genoma viral de un herpesvirus de
pavos que comprende una molécula de DNA bicatenario que consiste
esencialmente en: a) DNA bicatenario extraño no usualmente presente
en el genoma viral del herpesvirus de pavos; b) en un extremo el
DNA extraño, el DNA bicatenario de herpesvirus de pavos homólogo al
genoma viral localizado en un lado del sitio EcoRI nº 9 de
la región codificadora del genoma viral del herpesvirus de pavos; y
c) en el otro extremo del DNA extraño, el DNA bicatenario del
herpesvirus de pavos homólogo al genoma viral localizado en el otro
lado del fragmento EcoRI nº 9 de la región codificadora del
genoma viral del herpesvirus de pavos. Los ejemplos de los vectores
de homología se denominan 751.87.A8 y 761-7.A1.
En una realización, el polipéptido es antigénico
en el animal en el que está introducido el herpesvirus recombinante
de pavos. En otra realización, el polipéptido antigénico es de una
citoquina, virus de la enfermedad de Marek, virus de la enfermedad
de Newcastle, virus de la laringotraqueitis infecciosa, o el virus
de la bronquitis infecciosa. En una realización preferida, el
polipéptido antigénico es un factor de crecimiento mielomonocítico
de pollos (cMFG) o un interferón de pollos (cIFN), una poliproteína
del virus de la enfermedad bursal infecciosa, una proteína VP2 del
virus de la enfermedad bursal infecciosa, la glicoproteína gB del
virus de la enfermedad de Marek, la glicoproteína gA del virus de
la enfermedad de Marek, la glicoproteína gD del virus de la
enfermedad de Marek, una proteína de fusión del virus de la
enfermedad de Newcastle, la
hemaglutinina-neuraminidasa del virus de la
enfermedad de Newcastle, la glicoproteína gB del virus de la
laringotraqueitis infecciosa, la glicoproteína gD del virus de la
laringotraqueitis infecciosa, una proteína clavo del virus de la
bronquitis infecciosa, o la proteína matriz del virus de la
bronquitis infecciosa.
En otra realización, la secuencia de DNA
bicatenario extraño en el vector de homología codifica un
polipéptido antigénico derivado de un agente patógeno equino. El
polipéptido antigénico de un agente patógeno equino puede proceder
del virus de la gripe equina o un herpesvirus equina. Los ejemplos
de tal polipéptido antigénico son la neuraminidasa del virus de la
gripe equina tipo A/Alaska 91, la neuraminidasa del virus de la
gripe equina tipo A/Praga 56, la neuraminidasa del virus de la
gripe equina tipo A/Miami 63, la neuraminidasa del virus de la
gripe equina tipo A/Kentucky 81, la glicoproteína B del herpesvirus
de tipo 1, y la glicoproteína D de herpesvirus equino de tipo
1.
En otra realización, la secuencia de DNA
bicatenario extraño del vector de homología codifica un polipéptido
antigénico derivado del virus sincitial respiratorio bovino o el
virus de la parainfluenza bovina. El polipéptido antigénico del
agente patógeno equino del virus sincitial respiratorio bovino que
puede proceder del virus de la gripe bovina es una proteína de
unión del virus sincitial respiratorio bovino (G del BRSV), una
proteína de fusión del virus sincitial respiratorio bovino
(abreviadamente BRSV por la expresión inglesa bovine respiratory
sincitial virus) (F del BRSV), la proteína de la nucleocápsida
del virus sincitial respiratorio bovino (N del BRSV), la proteína
de fusión del virus de la parainfluenza bovina tipo 3, y la
hemaglutinina-neuraminidasa del virus de la
parainfluenza bovina de
tipo 3.
tipo 3.
En otra realización, la secuencia de DNA
bicatenario extraño en el vector de homología codifica una citoquina
capaz de estimular la respuesta inmune humana. Por ejemplo, la
citoquina puede ser, pero sin limitación:
interleuquina-2, interleuquina-6,
interleuquina-12, interferones, factores
estimulantes colonias de granulocitos-macrófagos y
receptores de interleuquina.
En una realización de la invención, el DNA
bicatenario de herpesvirus de pavos es homólogo a las secuencias de
DNA presentes en el fragmento BamHI nº 16 del genoma del
herpesvirus de pavos. Preferiblemente, el DNA bicatenario de
herpesvirus de pavos es homólogo a las secuencias de DNA presentes
en el marco de lectura abierto que codifica la proteína UL 43 del
genoma del herpesvirus de pavos. Preferiblemente, este vector de
homología se denomina 172-29.31.
Para los fines de esta invención un "vector de
homología" es un plásmido construido para insertar DNA extraño
es un sitio específico en el genoma de un herpesvirus de pavos.
En una realización de la invención, el DNA
bicatenario de herpesvirus de pavos es homólogo a las secuencias de
DNA presentes en el fragmento EcoRI nº 9 del genoma del
herpesvirus de pavos. Preferiblemente, este vector de homología se
designa 172-63.1.
En una realización de la invención, el DNA
bicatenario del herpesvirus de pavos es homólogo a las secuencias
de DNA presentes en la región codificadora del gen US2 del genoma
del herpesvirus de pavos. Preferiblemente, este vector de homología
se denomina 435-47.1.
En otra realización, la secuencia de DNA extraño
codifica un marcador detectable. Los ejemplos de los marcadores
detectables incluyen pero sin limitación
\beta-galactosidasa de E. coli y
\beta-glucuronidasa de E. coli.
La invención proporciona además una vacuna que
comprende una cantidad de agente inmunizante eficaz de un
herpesvirus recombinante de pavos de la presente invención y un
vehículo adecuado.
Esta invención proporciona una vacuna útil para
inmunizar un ave contra el virus de la enfermedad de Marek, que
comprende una cantidad de agente inmunizante eficaz del herpesvirus
recombinante de pavos y un vehículo adecuado.
Esta invención proporciona una vacuna útil para
inmunizar un ave contra el virus de la enfermedad de Newcastle, que
comprende una cantidad de inmunizante eficaz del herpesvirus
recombinante de pavos y un vehículo adecuado.
Esta invención proporciona una vacuna útil para
inmunizar un ave contra el virus de la laringotraqueitis infecciosa,
que comprende una cantidad de inmunizante eficaz del herpesvirus
recombinante de pavos y un vehículo adecuado.
Esta invención proporciona una vacuna útil para
inmunizar un ave contra el virus de la bronquitis infecciosa, que
comprende una cantidad de agente inmunizante eficaz del herpesvirus
recombinante de pavos y un vehículo adecuado.
Esta invención proporciona una vacuna útil para
inmunizar un ave contra el virus de la enfermedad bursal infecciosa,
que comprende una cantidad de agente inmunizante eficaz del
herpesvirus recombinante de pavos y un vehículo adecuado.
Esta invención proporciona una vacuna
multivalente útil para inmunizar un ave contra el virus de la
enfermedad de Marek y el virus de la enfermedad de Newcastle, que
comprende una cantidad de agente inmunizante eficaz del herpesvirus
recombinante de pavos.
Esta invención proporciona una vacuna
multivalente útil para inmunizar un ave contra el virus de la
enfermedad de Marek y el virus de la laringotraqueitis infecciosa,
que comprende una cantidad de agente inmunizante eficaz del
herpesvirus recombinante de pavos y un vehículo adecuado.
Esta invención proporciona una vacuna
multivalente útil para inmunizar un ave contra el virus de la
enfermedad de Marek y el virus de la bronquitis infecciosa, que
comprende una cantidad de agente inmunizante eficaz del herpesvirus
recombinante de pavos y un vehículo adecuado.
Esta invención proporciona una vacuna
multivalente útil para inmunizar un ave contra el virus de la
enfermedad de Marek y el virus de la enfermedad bursal infecciosa,
que comprende una cantidad de agente inmunizante eficaz del
herpesvirus recombinante de pavos y un vehículo adecuado.
Esta invención proporciona una célula hospedante
infectada con el herpesvirus recombinante de pavos. En una
realización, la célula hospedante es una célula aviar.
Para los fines de esta invención, una "célula
hospedante" es una célula usada para propagar un vector y su
inserto. La infección de la célula se logró por los métodos muy
conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, como se
establece en Transfección de DNA para, generar herpesvirus
recombinantes en Materiales y Métodos. Los métodos para construir,
seleccionar y purificar el herpesvirus recombinante de los pavos se
detallan más adelante.
Esta invención proporciona un método para
distinguir los pollos u otras aves que están vacunadas de las que
están infectadas con la vacuna antes indicada de las que están
infectadas con un virus de la enfermedad de Marek que se presenta
de modo natural, que comprende analizar muestras de los fluidos del
cuerpo de los pollos u otras aves de corral respecto a la presencia
de glicoproteína gG y por lo menos otro antígeno normalmente
expresado en pollos u otras aves infectadas por un virus de la
enfermedad de Marek que se presenta de modo natural, pero siendo
indicativa la presencia de esos antígenos normalmente expresados en
los pollos infectados pero la ausencia de la glicoproteína gG
indicativa de la vacunación con la vacuna antes mencionada y no
infección con el virus de la enfermedad de Marek que se presenta de
modo natural.
Esta invención proporciona un herpesvirus
recombinante de pavos que expresa secuencias de DNA extraño que es
útil como vacuna en especies mamíferas o aviares incluyendo, pero
sin limitación: pollos, pavos, patos, felinos, caninos, vacas,
equinos y primates incluyendo el ser humano. Esta vacuna puede
contener bien sea un virus recombinante vivo o bien sea
inactivado.
Para los fines de esta invención, una
"cantidad inmunizante eficaz" del herpesvirus felino
recombinante de la presente invención está en el intervalo de una
dosis de 10^{3} a 10^{9} UFP/dosis. En otra realización, la
cantidad inmunizante es 10^{5} a 10^{7} UFP/dosis. En una
realización preferida, la cantidad inmunizante es de 10^{6}
UFP/dosis.
El método comprende administrar al animal una
dosis inmunizante eficaz de la vacuna de la presente invención. La
vacuna puede ser administrada por cualesquiera de los métodos muy
conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo, mediante
inyección intramuscular, subcutánea, intraperitoneal o intravenosa.
Alternativamente, la vacuna puede ser administrada intranasalmente
u oralmente.
Los vehículos adecuados para el virus
recombinante son muy conocidos por los expertos en la técnica e
incluyen, pero sin limitación proteínas, azúcares, etc. Un ejemplo
de tal vehículo adecuado es un medio cultivado equilibrado
fisiológicamente que contiene uno o más agentes estabilizantes, tal
como proteínas hidrolizadas, lactosa, etc. Preferiblemente, la
vacuna viva se crea tomando fluidos de cultivo de tejidos y
añadiendo agentes estabilizantes, tal como proteínas hidrolizadas
estabilizantes. Preferiblemente, las vacunas inactivadas usan
fluidos de cultivo de tejido directamente después de la
inactivación del virus.
Esta invención se ilustra además en el apartado
de Detalles Experimentales que sigue. Este apartado se facilita
para ayudar a un entendimiento de la invención pero no se intenta, y
no debe considerarse que limite de ninguna manera la invención como
se establece en las reivindicaciones que constituyen la parte final
de esta memoria descriptiva.
Los herpesvirus de muestras de raza de pavos se
prepararon infectando células de cultivo de tejidos con una
multiplicidad de infección (abreviadamente en lo sucesivo MOI por la
expresión inglesa Multiplicity of Infection) de 0,01
UFP/célula en un medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) que
contiene glutamina 2 mM, 100 unidades/ml de penicilina, 100
unidades/ml de estreptomicina (estos componentes se obtuvieron de
Irvine Scientific o un proveedor equivalente, y en la presente
memoria en adelante se mencionan como medio DME completo) más 1% de
suero bovino fetal. Después de que se completó el efecto citopático,
el medio y las células se cosecharon y las células se sedimentaron
a 3000 rpm durante 5 minutos en una centrífuga clínica. Las células
infectadas se volvieron a suspender en un medio completo que
contenía 20% de suero bovino fetal, 10% de DMSO y se conservaron
congeladas a -70ºC.
Preparación del herpesvirus de DNA de
pavos. Todas las manipulaciones del herpesvirus de pavos (HVT)
se hicieron usando la raza FC-126 (ATCC nº
584-C) Para la preparación del DNA viral del HVT
procedente del citoplasma de células infectadas, los fibroblastos
de embrión de pollo primarios se infectaron a una MOI suficiente
para provocar un efecto citopático extensivo antes del
sobrecrecimiento de las células. Todas las incubaciones se llevaron
a cabo a 39ºC en un incubador humidificado con 5% de CO_{2} en
aire. Los mejores rendimientos de DNA se obtuvieron cosechando
monocapas que se infectaban máximamente, pero que mostraban lisis
incompleta de células (típicamente 5-7 días). Las
células infectadas se cosecharon rascando las células en el medio
usando un rascador de células (marca Costar) La suspensión de
células se centrifugó a 300 rpm durante 10 minutos a 5ºC en un
rotor GS-3 (Sorvall Instruments). El sedimento
resultante se resuspendió en PBS frío (20 ml/matraz rodante) y se
sometió a otra centrifugación durante 10 minutos a 3000 rpm en frío.
Después de decantar el PBS, el sedimento celular se volvió a
suspender en un matraz rodante de 4 ml de un tampón RSB (Tris pH
7,5 10 mM, EDTA 1 mM, y Cl_{2}Mg 1,5 mM). Se añadió NP40 (Nonidet
P = 40; Sigma) a la muestra a una concentración final de 0,5% con
un mezclamiento ocasional. La muestra se centrifugó durante 10
minutos a 3000 rpm en frío para sedimentar los núcleos y separar
los residuos celulares. El líquido sobrenadantes se transfirió
cuidadosamente a un tubo de centrífuga Corex de 15 ml. Tanto el
EDTA (0,5 M pH 8,0) como el SDS (dodecilsulfato sódico; mezcla
madre 20%) se añadieron a la muestra a las concentraciones finales
de 5 mM y 1% respectivamente. Se añadieron 100 \mul de
proteinasa-K (10 mg/ml; Boehringer Mannheim) por
cada 4 ml de muestra, se mezclaron y se incubaron a 45ºC durante
1-2 horas. Después de este periodo, se añadió a la
muestra un volumen igual de fenol saturado con agua y se agitó
suavemente a mano. La muestra se centrifugó en una centrífuga
clínica durante 5 minutos a 3000 rpm para separar las fases. El
NaAc se añadió a la fase acuosa a una concentración final de 0,3 M
(solución madre, 3 M pH 5,2), y el ácido nucleico se precipitó a
-70ºC durante 30 minutos después de la adición de 2,5 volúmenes de
etanol absoluto frío. El DNA en la muestra se sedimentó mediante
centrifugación durante 20 minutos a 8000 rpm en un rotor
HV-4 a 5ºC. El líquido sobrenadante se retiró
cuidadosamente y el sedimento de DNA se lavó una vez con 25 ml de
etanol al 80%. El sedimento de DNA se secó brevemente a vacío
(2-3 minutos) y se volvió a suspender en un matraz
rodante de 50 \mul de células infectadas, con tampón TE (10 mM
Tris pH 7,5, EDTA 1 mM). Típicamente, los rendimientos de DNA viral
variaron de 5-10 \mug/matraz rodante de células
infectadas. Todo el DNA viral se conservó a aproximadamente
10ºC.
Reacción de relleno con polimerasa. El
DNA se volvió a suspender en tampón que contenía Tris 50 mM pH 7,4,
KCl 50 mM, MgCl_{2} 5 mM, y 400 micromoles de cada uno de los
cuatro desoxinucleótidos. Se añadieron diez unidades de
DNA-polimerasa Klenow (BRL) y la reacción se dejó
transcurrir durante 15 minutos a temperatura ambiente. El DNA se
extrajo luego con fenol y se precipitó con etanol como antes.
Secuenciación de DNA. La secuenciación se
llevó a cabo usando el kit USB Sequenase y
^{35}S-dATP (NEN). Las reacciones que usan tanto
las mezclas como dGTP y las mezclas dITP se llevaron a cabo para
clarificar áreas de compresión. Alternativamente, las áreas
comprimidas se resolvieron sobre geles de formamida. Los moldes
eran subclones de plásmidos bicatenarios o subclones M13
monocatenarios, y se prepararon los cebadores bien sea para el
vector justo fuera del inserto que va a ser secuenciado o para la
secuencia previamente obtenida. La secuencia obtenida se ensambló y
comparó usando el programa de ordenador Dnastar. La
manipulación y comparación de las secuencias obtenidas se llevó a
cabo con los programas de ordenador Superclone y
Supersee de Coral Software.
Técnicas de biología molecular. Las
técnicas para la manipulación de bacterias y el DNA, incluyendo
procedimientos tales como la digestión con endonucleasas de
restricción, electroforesis en gel, extracción de DNA de geles,
ligamiento, fosforilación con quinasa, tratamiento con fosfatasa,
crecimiento de cultivos bacterianos, transformación de bacterias
con DNA y otros métodos de biología molecular, descritos por
Maniatis et al., (1982) y Sambrook et al., (1989). La
reacción en cadena la polimerasa (PCR) se usó para introducir sitios
de restricción convenientes para la manipulación de varios DNA. Los
métodos usados están descritos por Innis et al., (1990). En
general los fragmentos amplificados eran menores de 500 pares de
bases en tamaño y se confirmaron regiones críticas de fragmentos
amplificados mediante la secuenciación de DNA. Excepto cuando se
indica, estas técnicas se usaron con pequeñas variaciones.
Transferencia southern de DNA. El método
general para la transferencia Southern se tomó de Maniatis et
al.,(1982). El DNA se transfirió a filtros de nitrocelulosa
(S&S BA85) en 20X de SSC (1X ssc = NaCl 0,15 M, citrato sódico
0,015K, pH 7,0) y se prehibridó en una solución de hibridación que
consistía en formamida al 30%, solución de Denhardt 1X (0,02% de
polivinilpirrolidona (PVP), 0,02% de seroalbúmina bobina (BSA),
0,02% de Ficoll), 6X SSC, NaH_{2}PO_{4} 50 mM, pH 6,8, DNA de
esperma de salmón 200 \mug/ml durante 4-24 horas a
55ºC. Se añadió el DNA sonda marcado que se habla marcado mediante
traslado de muesca usando un kit de Bethesda Research Laboratories
(BRL) y un nucleótido marcado con ^{32}P. El DNA sonda se separó
de los nucleótidos no incorporados mediante una columna NACS (BRL)
o una columna Sephadex G50 (Pharmacia). Después de hibridación
durante la noche a 55ºC, el filtro se lavó una vez con 2X SSC a la
temperatura ambiente seguido por dos lavados con SSC 0,1X,
dodecilsulfato sódico (SDS) al 0,1% durante 30 minutos a 55ºC. El
filtro se secó y auto-radiografió.
Método de clonación de DNA. La clonación
de cDNA se refiere a los métodos usados para convertir las moléculas
de RNA en moléculas de DNA siguiendo el estado de los métodos de la
técnica. Los métodos de los inventores están descritos (Gubler y
Hoffman, 1983). La firma Bethesda Research Laboratoires
(Gaithersburg, Maryland) ha diseñado un kit de clonación de cDNA
que es muy similar a los procedimientos usados por los inventores y
contiene un conjunto de reactivos y protocolos que pueden usarse
para duplicar nuestros resultados.
Para clonar especies de mRNA de virus, una línea
de células hospedantes sensible a la infección por el virus se
infectó en 5-10 unidades formadoras de placas por
célula. Cuando el efecto citopático fue evidente, pero antes de la
destrucción total, se separó el medio y las células se lisaron en 10
ml de tampón de lisis (tiocianato de guanidina 4 M, antiespumante A
al 0,1%, citrato sódico 25 mM pH 7,0,
N-lauroil-sarcosina al 0,5%,
beta-mercaptoetanol 1 M). El lisado de células se
virtió en un homogeneizador Dounce esterilizado y se homogeneizó
sobre hielo 8-10 veces hasta que la solución fue
homogénea. Para la purificación del RNA, 8 ml de lisado de células
se pusieron en capas cuidadosamente sobre 3,5 ml de solución de
CsCl (CsCl 5,7 M, citrato sódico 25 mM, pH 7,0) en un tubo de
centrífuga Beckman SW41. Las muestras se centrifugaron durante 18
horas a 20ºC a 36.000 rpm en un rotor Beckman SW41. Los tubos se
pusieron sobre hielo y los líquidos sobrenadantes de los tubos se
retiraron cuidadosamente mediante aspiración para dejar el
sedimento de RNA sin perturbación. El sedimento se volvió a
suspender en un vaso de agua destilada de 400 \mul y se añadieron
2,6 ml de solución guanidina (guanidina HCl 7,5 M, citrato de
sodio 25 mM, pH 7,0 ditiotreitol 5 mM). Se añadieron 0,37 volúmenes
de ácido acético 1 M, seguidos por 0,75 volúmenes de etanol frío y
la muestra se puso a -20ºC durante 18 horas para precipitar el RNA.
El precipitado se recogió mediante centrifugación en una centrífuga
Sorvall durante 10 minutos a 4ºC a 10.000 rpm en un rotor SS34. El
sedimento se disolvió en 1,0 ml de agua destilada, se volvió a
centrifugar a 13.000 rpm y se guardó el líquido sobrenadante. El
RNA se volvió a extraer del sedimento dos veces más como se indicó
antes con 0,5 ml de agua destilada, y se reunieron los líquidos
sobrenadantes. Se añadió a la muestra un volumen de 0,1 de solución
de acetato de potasio 2 M seguido por 2 volúmenes de etanol frío y
la muestra se puso a -20ºC durante 18 horas. El RNA precipitado se
recogió mediante centrifugación en el rotor SS34 a 4ºC durante 10
minutos a 10000 rpm. El sedimento se disolvió en 1 ml de agua
destilada y la concentración se tomó por lectura de la absorción a
A260/280. El RNA se conservó a -70ºC.
Se seleccionó mRNA que contiene colas de
poliadenilato (poli A) usando celulosa oligo-dT
(Pharmacia nº 27-5543-0). El RNA de
poli A retenido se eluyó de la columna con tampón de elución (Tris 5
mM, pH 7,5, EDTA 1 mM dodecilsulfato sódico al 0,1%) Tres mg de RNA
total se hirvieron y se enfriaron y se aplicaron a 100 mg de columna
de celulosa oligo-dT en un tampón aglutinante (Tris
0,1 M, pH 7,5, LiCl 0,5 M, EDTA 5 mM, pH 8,0, dodecilsulfato de
litio al 0,1%). El RNA poli-A retenido se eluyó de
la columna con un tampón de elución (Tris 5 mM, pH 7,5, EDTA 1 mM,
pH 8,0, dodecilsulfato de litio al 0,1%). Este mRNA se volvió a
aplicar a una columna de oligo-dT en un tampón
aglutinante y se eluyó contra un tampón de elución. La muestra se
precipitó con acetato sódico 200 mM y 2 volúmenes de etanol frío a
-20ºC durante 18 horas. El RNA se volvió a suspender en 50 \mul de
agua destilada.
Diez \mug de RNA de poli-A se
desnaturalizaron en hidróxido de metil-mercurio 20
mM durante 6 minutos a 22ºC. Se añadió
\beta-mercaptoetanol hasta 75 mM y la muestra se
incubó durante 5 minutos a 22ºC. La mezcla de reacción para la
síntesis de la primera cadena de cDNA en 0,25 ml contenía 1 \mug
de cebador de oligo-dT (P-L
Bio-Chemicals) o 1 \mug de cebador sintético, 28
unidades de inhibidor de ribonucleasa placentaria (Bethesda
Research Laboratoires nº 5518SA), Tris 100 mM, pH 8,3, KCl 140 mM,
MgCl_{2} 10 mM, dATP, dCTP, dGTP y dTTP 0,8 mM (Pharmacia), 100
microcurios de dCTP marcado con ^{32}P (New England Nuclear nº
NEG-013H), y 180 unidades de transcriptasa inversa
del AMV (Molecular Genetics Resources nº MG 101). La mezcla de
reacción se incubó a 42ºC durante 90 minutos, y luego se terminó
con EDTA 20 mM, pH 8,0. La muestra se extrajo con un volumen igual
de fenol/cloroformo (1:1) y se precipitó con acetato de amonio 2 M y
2 volúmenes de etanol frío a -20ºC durante 3 horas. Después de la
precipitación y centrifugación, el sedimento se disolvió en 100 ml
de agua destilada. La muestra se cargó en una columna Sephadex de 15
ml de G-100 (Pharmacia) en un tampón (Tris 100 mM.
pH 7,5, EDTA 1 mM, pH 8,0, NaCl 100 mM). El borde delantero de las
fracciones de DNA eluidas se reunió, y el DNA se concentró mediante
liofilización hasta que el volumen fue alrededor de 100 \mul,
luego el DNA se precipitó con acetato de amonio más etanol como se
indica antes.
La muestra de la primera cadena completa se usó
para la reacción de la segunda cadena que siguió el método de
Gubler y Hoffman (1983) excepto que se usaron 50 \mug/ml de los
dNTP, 5,4 unidades DNA-polimerasa I (Boerhinger
Mannheim nº 642-711), y 100 unidades/ml de
DNA-ligasa de E. coli (New England Biolabs nº
205) en un volumen total de 50 microlitros. Después de la síntesis
de la segunda cadena, el cDNA se extrajo y precipitó con
fenol/cloroformo. El DNA se resuspendió en 10 \mul de agua
destilada, se trató con 1 p\mug de RNasa A durante 10 minutos a
22ºC y se sometió a electroforesis en un gel de agarosa al 1%
(Agarosa de Tipo II de Sigma) en Tris-acetato 40
mM, pH 6,85. El gel se tiñó con bromuro etidio, y el DNA del
intervalo de tamaño esperado se retiró del gel y electroeluyó en
Tris-acetato 8 mM, pH 6,85. El DNA electroeluido se
liofilizó hasta alrededor de 100 microlitos y se precipitó con
acetato de amonio y etanol como se indicó antes. El DNA se volvió a
suspender en 20 \mul de agua.
Las colas de oligo-dC se
añadieron al DNA para facilitar la clonación. La mezcla de reacción
contenía DNA, cacodilato potásico 100 mM, pH 7,2, ditiotreitol 0,2
mM, CaCl_{2} 2 mM, 80 \mumoles de dCTP, y 25 unidades de
desoxinucleotidil-transferasa terminal (Molecular
Genetic Resources nº S1001) en 50 \mul. Después de 30 minutos a
37ºC la reacción se terminó con EDTA 10 mM, y la muestra se extrajo
con fenol/cloroformo y se precipitó como se indicó antes.
La muestra de DNA provista de colas de dC se
asoció a 200 ng del vectorplasmídico pBR322 que contenía colas de
oligo-dG (Bethesda Research Laboratoires nº 5355
SA/SB) en 200 \mul de Tris 0,01 M pH 7,5, NaCl 0,1 M, EDTA 1 mM,
pH 8,0 a 65ºC durante 2 minutos y luego a 57ºC durante 2 horas. Se
prepararon células de E. coli DH-I
competentes frescas y se transformaron como se describió por Hanahan
(1983) usando la mitad de la muestra de cDNA asociado en veinte
partes alícuotas de 200 \mul de células. Las células transformadas
se cultivaron en placas de agar de caldo de Luria (LB = Luria
broth), más 10 \mug/ml de tetraciclina. Las colonias se
escrutaron respecto de la presencia de insertos en el gen de
ampicilina usando Ampscreen (Bethesda Research Labs nº 5537 UA) y
se tomaron para análisis las colonias positivas.
Transfección de DNA para generar herpesvirus
recombinantes. El método está basado en el procedimiento de
polibreno-DMSO de Kawai y Nishizawa (1984) con las
siguientes modificaciones. La generación del virus HVT recombinante
depende de la recombinación de homólogos entre el DNA viral del HVT
y el vector de homología plasmídico que contiene el DNA extraño
deseado flanqueado por las secuencias clonadas de herpesvirus
apropiadas. Las transfecciones se llevaron a cabo en placas Petri
de 6 centímetros (plástico Corning) de células primarias
fibroblastos de embrión de pollo (abreviadamente CEF por la
expresión inglesa chick embryo fibroblast) confluentes al
50%. Las células se cultivaron en placas el día anterior en un
medio de crecimiento de CEF (1X F10/199, suero de ternero fetal al
5%, glutamina al 2%, aminoácidos no esenciales al 1%, y
penicilina/estreptomicina al 2%) que contenía 4 \mug/ml de
polibreno (solución madre 4 mg/ml en 1X HBSS). Para las
co-transfecciones en la células de CEF se usaron 5
\mug de DNA del HVT intacto y suspendido en 1 mililitro de un
medio de CEF contenía 30 \mug/ml de polibreno (solución madre 4
mg/ml en 1X HBSS. La suspensión de polibreno-DNA (1
ml) se añadió luego a una placa Petri de 6 cm de células de CEF
desde la cual el medio se había aspirado, y se incubó a 39ºC
durante 30 minutos. Las placas se hicieron balancear periódicamente
durante este tiempo para redistribuir el inóculo. Después de este
periodo, se añadieron 4 ml del medio de crecimiento de CEF
directamente para lavar la placa Petri, y se incubaron durante 2,5
horas adicionales a 39ºC. En este momento, el medio se retiró de
cada placa Petri, y las células se agitaron por sacudidas con 2 ml
de DMSO al 30% (Dimetilsulfóxído, J.T. Baker Chemical Co.) en 1X
HBSS durante 4 minutos a la temperatura ambiente. El DMSO al 30% se
retiró cuidadosamente y las monocapas se lavaron 1 vez con 1X HBSS
a la temperatura ambiente. Las células se incubaron luego a 39ºC
después de la adición de 5 ml de medio de crecimiento de CEF. El
siguiente día, el medio se cambió para retirar cualesquier indicios
últimos de DMSO y para estimular el crecimiento de las células. El
efecto citopático del virus se hace evidente en 6 días. La
generación de una solución madre de alta concentración (80%-90% de
CPE) puede usualmente hacerse en una semana desde esta fecha. Las
muestras de reserva de HVT se prepararon volviendo a poner en
suspensión las células infectadas en el medio de crecimiento de CEF
que contenía 20% de suero de ternero fetal, DMSO al 10% y
conservación a -70ºC.
Método para generar herpesvirus recombinantes
a partir de fragmentos de DNA subgenómicos. Para el virus de la
pseudo-rabia se ha demostrado la capacidad para
generar herpesvirus mediante la co-transfección de
fragmentos subgenómicos solapantes (Zijl et al., 1988). Si
se realizan por ingeniería genética deleciones y/o inserciones
directamente en los fragmentos subgenómicos antes de la
co-transfección, este procedimiento da como
resultado una frecuencia alta de virus que contiene la alteración
genómica, reduciendo grandemente la cantidad de escrutinio
requerido para purificar el virus recombinante. Este método se usó
para construir el HVT recombinante.
Una genoteca de subclones que contiene
fragmentos subgenómicos solapantes del HVT se generó como sigue. El
DNA de HVT se obtuvo de la American Type Culture Collection
(FC126 ("Calnek")). Dichos fragmentos se cizallaron y luego se
seleccionaron por tamaños sobre un gradiente de glicerol como se
describió por Van Zijl et al., (1988) con fragmentos de
40-50 KB escogidos como la población de inserto. Las
fracciones reunidas se diluyeron dos veces con TE, se añadieron un
décimo de volumen de NaAc 3 M y 2,5 volúmenes de etanol, y el DNA se
precipitó a 30K rpm en un rotor Beckman SW41 durante 1 hora. A los
fragmentos cizallados se les dio extremos romos mediante el
tratamiento inicial con DNA-polimerasa de T4, usando
concentraciones de DNTP bajas para promover la retirada de los
extremos colgantes de 3' seguido por el tratamiento con polimerasa
de Klenow para rellenar los extremos 3' rebajados (adherentes).
Estos fragmentos de inserto se ligaron luego al vector cósmido pWE15
(Strategene) el cual se digerió con BamHI, se trató con
fosfatasa intestinal de ternero, y se hizo romo mediante el
tratamiento con polimerasa de Klenow. La mezcla ligada se empaquetó
luego usando extractos de empaquetamiento Gigapack XL (Stratagene).
La ligación y empaquetamiento se recomendaron por el fabricante.
Los mapas de restricción publicados para las
enzimas BamHI, HindIII, y XhoI permitieron el
uso de fragmentos subclonados como sondas específicas para escrutar
la genoteca cosmídica respecto a los subclones que abarca el
genoma. Las sondas se generaron a partir de fragmentos de
restricción subclonados. Los fragmentos se marcaron luego usando un
sistema no radiactivo (Genius, Boehringer Mannheim). El escrutinio
se facilitó escogiendo las colonias seguido de los medios por
crecimiento durante la noche. Los conjuntos de 5 filtros y de una
placa Petri maestra se estamparon con una placa Petri de
microtitulación y de nuevo se dejaron crecer durante la noche. El
glicerol se añadió a los pocillos a 15% y las placas se congelaron a
-20ºC para proporcionar cultivos de reserva (stock) de cada
colonia. Los filtros fueron del tipo BioRad Colony Lift
Membranes y se trataron e hibridaron de acuerdo con las
instrucciones del fabricante, y se lavaron en 0,1X SSC, SDS al 0,1%,
65ºC. Los clones que se hibridaron con la sonda no radioactiva se
detectaron de acuerdo con las instrucciones del kit de Genius.
Las colonias se seleccionaron para un análisis
adicional sobre la base de su hibridación para dos o más de las
sondas específicas. Estas se digirieron luego con BamHI, y se
compararon con los mapas publicados del HVT (Buckmaster et
al., 1988). Los tres cósmidos (407-32.2C3,
407-32.IG7, y 407-32.5G6) se
obtuvieron esta manera. Una descripción detallada de cada clon se
da más adelante. Se encontró que la amplificación en cloranfenicol
(Maniatis et al., 1982) fue necesaria para lograr
rendimientos razonables de DNA de estos clones. Además, un clon
cósmido (407-32.5G6) fue inestable y tuvo que ser
cultivado de la reserva (stock) congelada original con el
fin de obtener preparaciones de DNA satisfactorias.
El vector pWE15 permitió que los insertos fueran
escindidos con NotI. Sin embargo, están presentes cuatro
sitios NotI en el genoma del HVT, de manera que los insertos
que abarcan estos sitios no pueden ser escindidos con NotI.
Dos de los sitios NotI están presentes en el fragmento BamHI nº 2
del HVT, este fragmento se clonó directamente en pSP64. Los otros
dos sitios están presentes en la región corta única en el fragmento
BamHI nº 1. Este fragmento se clonó directamente en el
vector pWE15. Los tres cósmidos cizallados y los dos fragmentos
BamHI cubren todo salvo una parte pequeña de los extremos del
genoma del HVT. Debido a que estas regiones están repetidas en las
porciones internas del genoma, está disponible toda la información
genética.
Un sitio StuI en el gen US2 del HVT se
estableció como un sitio útil para la inserción del DNA extraño
utilizando el Método de recombinación de homólogos para generar
herpesvirus recombinantes (véase el Ejemplo 6). El gen US2 del HVT
está localizado en el fragmento BamHI nº 1 el cual contiene
cinco sitios StuI. Para facilitar el uso de este sitio para
la inserción del DNA extraño por el sitio StuI dentro del gen
US2 se convirtió en un sitio único HindIII. Esto se logró
digeriendo parcialmente el subclon BamHI nº 1 con StuI
e insertando luego un fragmento de 10 KB que confiere resistencia a
kanomicina (Neo^{R}) en el sitio usando enlazadores
HindIII. El gen de resistencia a kanomicina permitió la
selección positiva de los clones recombinantes. El fragmento
Neo^{R} se retiró por digestión con HindIII seguido por el
religamiento del clon generador 430-84.215.
El DNA se preparó por experimentos de
reconstrucción mediante la digestión por restricción con enzimas las
cuales cortaron los subclones fuera o flanqueando las inserciones
del HVT. En algunos casos, se usó un cósmido no digerido en una
reconstrucción. Los DNA digeridos se extrajeron una vez con fenol y
se precipitaron con etanol. El DNA se volvió a suspender a una
concentración de 0,5 a 1 \mug/ml. Los experimentos de
reconstrucción viral se llevaron a cabo usando Lipofectina (BRL)
para mediar la transfección. Se añadieron dos a tres microgramos de
cada uno del subclon a 0,5 ml de medio MEM (sales de Earle)
complementados con aminoácidos no esenciales al 1% y de
penicilina/estreptomicina al 2%/(MEM+). Los controles consistieron
en MEM+ sin DNA, con varios \mug de DNA del HVT, o con 4 de 5 de
los subclones. Separadamente, se añadieron 30 \mul de Lipofectina
a otros 0,5 ml de MEM+. Estas dos mezclas se combinaron luego y se
incubaron a temperatura ambiente durante 15 minu-
tos.
tos.
Las células fibroblastos de embrión de pollo
(CEF) se prepararon para transfección en la siguiente manera. Los
CEF (Spafas) se cultivaron en placas Petri de 6 pocillos a 39ºC en
un medio F10/M199 (1:1) que contenía aminoácidos no esenciales al
1%, penicilina/estreptomicina al 2%, y suero de ternero fetal al 5%
(CEF+). Las células se transfectaron hasta una confluencia de
90-95%. Para la transfección, los pocillos se
aspiraron y lavaron tres veces con MEM+, y luego se incubaron
cuatro horas a 39ºC con la mezcla de 1 ml de Lipofectina/DNA antes
indicada. Luego se añadió un ml de más de CEF+ a los pocillos, y las
células se incubaron durante la noche y se alimentaron con CEF+.
Las placas Petri se examinaron luego diariamente respecto de la
aparición de placas.
La lipofectina con el DNA del HVT de control dio
como resultado la aparición de placas en cinco días. Cuando se
usaron solo cuatro de los cinco subclones, no se obtuvieron placas.
Cuando los cinco fragmentos genómicos solapantes del HVT se usaron
para reconstruir el virus, las placas aparecieron desde 5 a 19 días
después de la lipofección inicial. En el caso de las placas que
aparecieron tardías, las placas no se vieron inicialmente sobre la
monocapa infectada, y fue solo después del pase de la monocapa y el
cultivo en placas Petri sobre una superficie más grande cuando
aparecieron las placas. Después del pase, las placas generalmente
aparecieron en 3 días. Los virus recombinantes se purificaron en
placas Petri aproximadamente tres veces, y luego se analizaron para
la inserción de DNA extraños.
Escrutinio bluogal para herpesvirus
recombinantes. Cuando el gen extraño codificó la enzima
\beta-galactosidasa, las placas que contenían el
gen se visualizaron más fácilmente. El compuesto químico Bluogal®
(Bethesda Research Laboratoires) se incorporó al nivel de
200-300 \mug/ml en agarosa durante el ensayo de
placas, y las placas que expresaron
\beta-galactosidasa activa se volvieron azules.
Luego se tomaron las placas azules y se purificaron mediante
aislamientos de placas azules adicionales. Otros genes extraños se
insertaron mediante recombinación de homólogos de manera que éstos
reemplazaron al gen de \beta-galactosidasa. En
este caso no se tomaron las placas no azules para purificación del
virus recombinante.
Escrutinio para la expresión de genes
extraños en HVT recombinantes usando ensayos de placas negras.
Para analizar la expresión de antígenos extraños expresados por
virus HVT recombinantes, las monocapas de células CEF se infectaron
con HVT recombinante, se recubrieron con medio de agarosa nutriente
y se incubaron durante 4-5 días a 39ºC. Una vez que
se desarrollaron las placas, la capa de agarosa se separó de la
cápsula, la monocapa se lavó con PBS, se fijó con metanol al 100%
durante 10 minutos a la temperatura ambiente y las células se
secaron al aire.
Después de rehidratar la placa Petri con PBS, el
anticuerpo primario se diluye a la dilución apropiada con PBS y se
incuba con la monocapa de células durante 2 horas a la temperatura
ambiente durante la noche. Luego se separó el anticuerpo no unido
de las células lavando tres veces con PBS a la temperatura ambiente.
Un anticuerpo secundario conjugado con fosfatasa alcalina se diluye
con PBS y se incuba con las células durante dos horas a la
temperatura ambiente. El anticuerpo secundario no unido se separa
luego lavando las células tres veces con PBS a la temperatura
ambiente. Después, la monocapa se lava en un tampón de desarrollo de
color (Tris 100 mM, pH 9,5/NaCl 100 mM/MgCl_{2} 5 mM), y luego se
incuba 10 minutos a toda la noche a la temperatura ambiente con una
solución de sustrato recientemente preparada (0,3 mg/ml de Azul
Nitro tetrazolio + 0,15 mg/ml de
5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfatasa
en un tampón de desarrollo de color). Finalmente, la reacción se
obtuvo reemplazando la solución de sustrato con TE (Tris 10 mM, pH
7,5/EDTA 1 mM). Las placas que expresan el antígeno correcto se
tiñeron de negro.
Método para la hibridación en placas para
valorar la pureza de las cepas (stocks) de HVT
recombinantes. Cuando no existe un reactivo inmunológico
adecuado para detectar la presencia de un antígeno particular en un
virus de HVT recombinante, la hibridación de placas puede usarse
para valorar la pureza de una cepa de virus. Inicialmente, las
monocapas de células CEF se infectan con varias diluciones de las
cepas virales para dar 50-100 placas/10 cm. La
placa de Petri, se cubre con agarosa nutriente y se incuba durante
4-5 días a 39ºC. Una vez que ocurre el crecimiento
de las placas, la posición de cada placa se marca sobre el fondo de
la placa de Petri. La cubierta de agarosa se retira luego, la placa
de Petri se lava con PBS y la monocapa de CEF restante se transfiere
a una membrana de nitrocelulosa (NC) o a una membrana de nilón
BioRad pre-humedecida con PBS (tomando nota de la
posición de membrana respecto a la placa de Petri). Las células
contenidas sobre las membranas de NC se lisan luego colocando las
membranas en 1,5 ml de NaCl 3 M y NaOH 0,5 M durante 5 minutos. Las
membranas se neutralizan colocándolas en 1,5 ml de acetato sódico
3 M (pH 5,2) durante cinco minutos. El DNA de las células lisadas
se une luego a las membranas de NC mediante tratamiento en horno a
80ºC durante 1 hora. Después de este periodo las membranas se
pre-hibridan en una solución que contiene 6X SSC,
leche descremada al 3%, SDS al 0,5%, (\pm) DNA de esperma de
salmón (50 \mug/ml) durante 1 hora a 65ºC. Se añade luego DNA
sonda radiomarcado (alfa ^{32}P-dCTP) y las
membranas se incuban a 65ºC durante la noche (\sim12 horas).
Después de la hibridación las membranas NC se lavan dos veces (30
minutos cada vez) con 2X de SSC a 65ºC, seguido por dos lavados
adicionales a 65ºC con 0,5X de SSC. Las membranas NC se secan luego
y se exponen a una película de rayos X (Kodak XOMATAR) a -70ºC
durante 12 horas. Las señales positivas se alinean luego con la
posición de las placas sobre la placa de Petri y la pureza de la
cepa se registra como el porcentaje de placas positivas sobre el
total.
Construcción del vector de homología para la
inserción, del gen de beta-galactosidasa en el gen
US2 del HVT. El gen de \betagalactosidasa (lacZ) se
insertó en el fragmento EcoRI nº 7 del HVT en el sitio
StuI único. El gen marcador está orientado en la misma
dirección que el gen US2. Una descripción detallada del gen marcador
se da en las Figuras 7A y 7B. Este se construye utilizando técnicas
estándares de DNA recombinante (Maniatis et al., 1982 y
Sambrook et al., 1989) mediante la unión de fragmentos de
restricción de las siguientes fuentes con las secuencias de DNA
sintéticas indicadas en las Figuras 7A y 7B. El fragmento 1 es un
subfragmento de restricción de aproximadamente 413 de pares de
bases SalI a BamHI del fragmento de restricción
BamHI nº 10 del PRV (Lomniczi et al., 1984). El
fragmento 2 es un fragmento de restricción de aproximadamente 3010
pares de bases BamHI a PvuII del plásmido pJF751
(Ferrari et al., 1985). El fragmento 3 es un subfragmento de
restricción de aproximadamente 754 pares de bases NdeI a
SalI del fragmento de restricción BamHI nº 7 del PRV
(Lomniczi et al., 1984).
RNA aislado de células de bazo de pollo
estimuladas con concavalina A. Se diseccionaron bazos de pollo
de 3 semanas de SPAFAS, Inc., se lavaron y se fragmentaron a través
de una jeringa/aguja para liberar las células. Después de permitir
que sedimenten el estroma y los residuos, las células se
sedimentaron y se lavaron dos veces con PBS. El sedimento de
células se trató con un tampón hipotónico de lisis para lisar los
glóbulos rojos (eritrocitos), y los esplenocitos se recuperaron y
se lavaron dos veces con PBS. Los esplenocitos se resuspendieron a
5 x 10^{6} células/ml en RPMI que contenía FBS al 5% y 5 \mug/ml
de concanavalina A y se incubaron a 39ºC durante 48 horas. El RNA
total se aisló de las células usando reactivo de lisis de isetionato
guanidina y protocolos del kit de aislamiento de RNA Promega
(Promega Corporation, Madison, Wisconsin). Se usaron 4 \mug de
RNA total en cada primera cadena que contenga los cebadores
antisentido apropiados y la transcriptasa inversa del AMV (Promega
Corporation, Madison, Wisconsin). La síntesis de cDNA se llevó a
cabo en el mismo tubo siguiendo la reacción de transcriptasa
inversa, usando los cebadores con sentido apropiado y
DNA-polimerasa Vent® (Life Technologies, Inc.,
Bethesda, Maryland).
Clon subgenómico
172-07.BA2. El plásmido
172-07.BA2 se construyó con el fin de generar HVT
recombinante. Este contiene una región de aproximadamente 25.000
pares de bases de DNA del HVT genómico. Este puede ser usado junto
con otros clones subgenómicos de acuerdo con el Método para generar
herpesvirus recombinantes a partir de fragmentos subgenómicos
solapantes para la construcción del HVT recombinante. Este plásmido
puede construirse utilizando técnicas estándares de DNA
recombinantes (Maniatis et al., 1982 y Sambrook et
al., 1989) mediante la unión de dos fragmentos de restricción
de las siguientes fuentes. El primer fragmento es un fragmento de
restricción de aproximadamente 2.999 pares de bases BamHI a
BamHI de pSP64 (Promega). El segundo fragmento es de
aproximadamente 25.000 pares de bases, el fragmento BamHI nº
2 de HVT (Buckmaster et al., 1988).
Vector de homología
172-29.31. El plásmido 172-29.31
se construyó con el fin de insertar DNA extraño en el HVT. Este
contiene un sitio de enzima de restricción XhoI único en el
cual puede ser insertado el DNA extraño. Cuando un plásmido que
contiene un inserto de DNA extraño en el sitio XhoI se usa de
acuerdo con la Cotransfección de DNA para generar herpesvirus
recombinantes o el método para generar herpesvirus recombinantes a
partir de fragmentos subgenómicos solapantes resultará un virus que
contiene el DNA extraño. Este plásmido puede construirse utilizando
técnicas estándares de DNA recombinante (Maniatis et al.,
1982 y Sambrook et al., 1989), uniendo dos fragmentos de
restricción de las siguientes fuentes. El primer fragmento es un
fragmento de restricción de aproximadamente 2999 pares de bases
BamHI a BamHI de pSP64 (Promega). El segundo fragmento
es el fragmento de aproximadamente 3300 pares de bases BamHI
nº 16 del HVT (Buckmaster et al., 1988). La secuencia
completa del fragmento BamHI nº 16 se da en la SEQ ID NO:
3. Adviértase que el fragmento se clonó de tal manera que el ORF
del UL43 está en la orientación transcripcional opuesta al gen de
\beta-lactamasa del pSP64.
Vector de homología
172-63.1. El plásmido 172-63.1
se construyó con el fin de insertar DNA extraño en el HVT. Este
contiene un sitio de enzima de restricción XhoI único en el
cual puede ser insertado el DNA extraño. Cuando un plásmido que
contiene un inserto de DNA extraño en el sitio XhoI se usa de
acuerdo con la Cotransfección de DNA para generar herpesvirus
recombinantes o el método para generar herpesvirus recombinantes a
partir de fragmentos subgenómicos solapantes resultará un virus que
contiene el DNA extraño. Este plásmido puede construirse utilizando
técnicas estándares de DNA recombinante (Maniatis et al.,
1982 y Sambrook et al., 1989), uniendo dos fragmentos de
restricción de las siguientes fuentes. El primer fragmento es un
fragmento de restricción de aproximadamente 2999 pares de bases
EcoRI a EcoRI del pSP64 (Promega). El segundo
fragmento es el fragmento de aproximadamente 5500 pares de bases
EcoRI nº 9 del HVT. Adviértase que el fragmento EcoRI
se clonó de manera que el sitio XhoI único está más cerca
del sitio HindIII único en el vector pSP64.
Vectores de homología
255-18.B16. El plásmido
255-18.B16 se construyó con el fin de insertar los
genes HN y F del NDV en el HVT. Los genes HN y F del NDV se
insertaron como un fragmento SalI en el vector de homología
172-29.31 en el sitio XhoI. Los genes HN y F
del NDV se insertaron en la misma orientación transcripcional que
el ORF de UL43 en el vector de homología parental. Una descripción
detallada del fragmento SalI se muestra en las Figuras
12A-12C. El fragmento SalI insertado puede
construirse utilizando técnicas estándares de DNA recombinante
(Maniatis et al., 1982 y Sambrook et al., 1989),
uniendo fragmentos de restricción de las siguientes fuentes con las
secuencias de DNA sintético indicadas en las Figuras 12A, 12B y 12C.
El fragmento 1 es un subfragmento de restricción de aproximadamente
416 pares de bases SalI a BamHI del fragmento 10 de
restricción BamHI del PRV (Lomniczi et al., 1984). El
fragmento 2 es el fragmento de aproximadamente 3009 pares de bases
de BamHI a PvuII del plásmido pJF751 (Ferrari et
al., 1985). El fragmento 3 es un fragmento de restricción de
aproximadamente 1200 pares de bases AvaII a EcoRI de
cDNA del gen HN del NDV de longitud completa. El fragmento 4 es un
fragmento de restricción de aproximadamente 179 pares de bases
EcoRI a PvuII del plásmido pSP64 (Promega). El
fragmento 5 es un subfragmento de restricción de aproximadamente 357
pares de bases SmaI a BamHI del fragmento de
restricción N del BamHI del HSV-1. El fragmento 6 es
un fragmento de restricción de aproximadamente 1812 pares de bases
BamHI a PstI del cDNA del gen F del de longitud
completa. El fragmento 7 es un fragmento de restricción de
aproximadamente 235 pares de bases PstI a SacI del
plásmido pBR322.
Clon subgenómico
378-50.BA1. El cósmido
378-50.BA1 se construyó con el fin de generar un HVT
recombinante. Este contiene una región de aproximadamente 29.500
pares de bases de DNA genómico del HVT. Este puede ser usado junto
con otros clones subgenómicos de acuerdo con el Método para generar
herpesvirus recombinantes a partir de fragmentos subgenómicos
solapantes para la construcción del HVT recombinante. Este cósmido
puede construirse uniendo dos fragmentos de restricción de las
siguientes fuentes. El primer fragmento es un fragmento de
restricción de aproximadamente 8164 pares de bases BamHI a
BamHI del pWE15 (Stratagene) El segundo fragmento es el
fragmento de aproximadamente 29.500 pares de bases BamHI nº 1
del HVT (Buckmaster et al., 1988).
Clon subgenómico
407-32.1C1. El cósmido
407-32.1C1 se construyó con el fin de generar el HVT
recombinante. Este contiene una región de aproximadamente 38.850
pares de bases del DNA del HVT genómico (véase la Figura 8). Esta
región incluye los fragmentos BamHI 11, 7, 8, 21, 6, 18,
aproximadamente 1250 pares de bases del fragmento 13, y
aproximadamente 6.700 pares de bases del fragmento 1. Este puede ser
usado junto con otros clones subgenómicos de acuerdo con el Método
para generar herpesvirus recombinantes a partir de fragmentos
subgenómicos solapantes para la construcción de HVT recombinantes.
Este cósmido puede construirse como se describió antes en el Método
para generar herpesvirus recombinantes a partir de fragmentos
subgenómicos solapantes. Este se aisló de la genoteca de DNA
cizallada mediante escrutinio con las sondas P1 y P4 (descritas en
la Figura 8). Una cepa bacteriana que contiene el cósmido se ha
depositado el 3 de marzo de 1993 de acuerdo con el Tratado de
Budapest en el International Depository of Microorganisms for the
Purpose of Patent Procedure with the Patent Culture Depository of
the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive,
Rockville, Maryland 20852, USA, bajo el número de acceso ATCC
75428.
Clon subgenómico
407-32.2C3. El cósmido
407-32.2C3 se construyó con el fin de generar un HVT
recombinante. Este contiene una región de aproximadamente 40.170
pares de bases del DNA del HVT genómico (véase la Figura 8). Esta
región incluye los fragmentos BamHI nº 10, 14, 19, 17, 5 y
aproximadamente 2.100 pares de bases del fragmento 2. Este puede
ser usado junto con otros clones subgenómicos de acuerdo con el
Método Para generar herpesvirus recombinantes a partir de
fragmentos subgenómicos solapantes para la construcción de HVT
recombinantes. Este cósmido puede construirse como se describió
antes en el Método para generar herpesvirus recombinantes a partir
de fragmentos subgenómicos solapantes. Este se aisló de la genoteca
DNA compartida mediante el cribado con las sondas P1 y P2
(descritas en la Figura 8). Una cepa bacteriana que contiene el
cósmido se ha depositado de acuerdo con el Tratado de Budapest en
el International Depository of Microorganisms for the Purpose of
Patent Procedure with the Patent Culture Depository of the American
Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville,
Maryland 20852, USA, bajo el número de Acceso ATCC 75430.
Clon subgenómico
407-32.5G6. El cósmido
407-32.5G6 se construyó con el fin de generar el HVT
recombinante. Este contiene una región de aproximadamente 40.000
pares de bases del DNA del HVT genómico (véase la Figura 8). Esta
región incluye los fragmentos BamHI nº 9, 3, 20, 12, 16, 13
de aproximadamente 1.650 pares de bases del fragmento 2, y
aproximadamente 4.000 pares de bases del fragmento 11. Este se puede
usar junto con otros clones subgenómicos de acuerdo con el Método
para generar herpesvirus recombinantes a partir de fragmentos
subgenómicos solapantes para la construcción de HVT recombinantes.
Este cósmido puede construirse como se describió antes en el Método
para generar herpesvirus recombinantes a partir de fragmentos
subgenómicos solapantes. Este se aisló de la genoteca de DNA
cizallada mediante escrutinio con las sondas P2 y P3 (descritas en
la Figura 8). Una cepa bacteriana que contiene el cósmido se ha
depositado el 3 de Marzo de 1993 de acuerdo con el Tratado de
Budapest en el International Depository of Microorganisms for the
Purpose of Patent Procedure with the Patent Culture Depository of
the American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive,
Rockville, Maryland 20852, USA, bajo el número de acceso ATCC
75427.
Vector de homología
435-47.1. El plásmido 415-47.1
se construyó con el fin de insertar DNA extraño en el HVT. Este
contiene un sitio de enzima de restricción HindIII único en
el cual puede insertarse el DNA extraño. Cuando se usa un plásmido
que contiene un inserto de DNA extraño en el sitio HindIII de
acuerdo con la Cotransfección de DNA para generar herpesvirus
recombinantes o el método para generar herpesvirus recombinantes a
partir de fragmentos subgenómicos solapantes resultará un virus que
contiene el DNA extraño. Este plásmido puede construirse utilizando
técnicas estándares de DNA recombinante (Maniatis et al.,
1982, y Sambrook et al., 1989), uniendo los dos fragmentos
de restricción de las siguientes fuentes. El primer fragmento es un
fragmento de restricción de aproximadamente 2999 pares de bases
EcoRI a EcoRI del pSP64 (Promega). El segundo
fragmento es un fragmento de aproximadamente 7300 pares de bases de
EcoRI nº 7 del HVT. Adviértase que el sitio HindIII
del vector pSP64 se separó digiriendo el subclon con HindIII
seguido por un relleno con polimerasa de Klenow en reacción y
religamiento. Luego se insertó un enlazador HindIII sintético
(CAAGCTTG) en el sitio StuI único del fragmento EcoRI
nº 7.
Clon subgenómico
437-26.24. El plásmido 437-26.24
se construyó con el fin de generar el HVT recombinante. Este
contenía una región de aproximadamente 13.600pares de bases del DNA
de HVT genómico. Este puede ser usado junto con otros clones
subgenómicos de acuerdo con el Método para generar herpesvirus
recombinantes a partir de fragmentos subgenómicos solapantes para
la construcción de HVT recombinantes. Este plásmido se construyó
utilizando las técnicas estándares de DNA recombinante (Maniatis
et al., 1982 y Sambrook et al., 1989), uniendo dos
fragmentos de restricción de las siguientes fuentes. El primer
fragmento es un fragmento de restricción de aproximadamente 2970
pares de bases HindIII a BamHI del pSP64 (Promega). El
segundo fragmento es el subfragmento de aproximadamente 13.600
pares de bases BamHI a StuI del fragmento BamHI
nº 2 del HVT (Buckmaster et al., 1988). Adviértase que el
fragmento BamHI nº 2 contiene cinco sitios StuI, el
sitio utilizado en esta subclonación se convirtió en un sitio
HindIII como se describió en el Método para generar
herpesvirus recombinantes a partir de fragmentos subgenómicos
solapantes.
Clon subgenómico
437-26.26. El plásmido 437-26.26
se construyó con el fin del generar HVT recombinante. Este contiene
una región de aproximadamente 15300 pares de bases del DNA del HVT
genómico. Este puede ser usado junto con otros clones subgenómicos
de acuerdo con el Método para generar herpesvirus recombinantes a
partir de fragmentos subgenómicos solapantes para la construcción
de HVT recombinantes. Este plásmido se construyó utilizando
técnicas estándares de DNA recombinante (Maniatis et al.,
1982 y Sambrook et al., 1989), uniendo dos fragmentos de
restricción de las siguientes fuentes. El primer fragmento es un
fragmento de restricción de aproximadamente 2.970 pares de bases
HindIII a BamHI del pSP64 (Promega). El segundo
fragmento es el subfragmento de aproximadamente 15.300 pares de
bases BamHI a StuI del fragmento BamHI nº 2 del
HVT (Buckmaster et al., 1988). Adviértase que el fragmento
BamHI nº 2 contiene cinco sitios StuI, el sitio
utilizado en esta subclonación se convirtió en un sitio
HindIII como se describió en el Método para generar
herpesvirus recombinante de fragmentos subgenómicos solapantes.
Vectores de homología
456-18.18 y 456-17.22. Los
plásmidos 45618.18 y 456-17.22 se construyeron con
el fin de insertar los genes gA y gB del MDV en en el HVT. Los
genes del MDV se insertaron como un casete en el vector de
homología 435-47.1 en el sitio HindIII único.
Los genes del MDV se insertaron en el sitio HindIII como un
fragmento PstI a EcoRI de extremos romos (véanse las
Figuras 10A y 10B). Los sitios HindIII y EcoRI se
hicieron romos mediante llenado con polimerasa de Klenow en
reacción. El sitio PstI se hizo romo mediante la reacción
con DNA-polimerasa de T4. Adviértase que el casete
del MDV se insertó en ambas orientaciones. El plásmido
456-18.18 contiene los genes del MDV insertados en
la orientación transcripcional opuesta al gen US2 en el vector de
homología parental. El plásmido 456-17.22 contiene
los genes del MDV insertados en la misma orientación
transcripcional que el gen US2 en el vector de homología parental.
Una descripción detallada del casete del MDV se da en las Figuras
10A y 10B. Este puede construirse utilizando técnicas estándares de
DNA recombinante (Maniatis et al., 1982 y Sambrook et
al., 1989) uniendo los fragmentos de restricción de las
siguientes fuentes con las secuencias de DNA sintético indicadas en
las Figuras 10A y 10B. El fragmento 1 es un subfragmento de
restricción de aproximadamente 2178 pares de bases PvuII a
EcoRV del fragmento de restricción EcoRI del MDV
genómico de 6,9 KB (Ihara et al., 1989). El fragmento 2 es un
fragmento genómico del MDV de aproximadamente 3898 pares de bases
SalI a EcoRI (Ross et al., 1989).
Vector de homología
528-0.3.37. El plásmido
528-03.37 se construyó con el fin de insertar el gen
gD del virus de la laringotraqueítis infecciosa (ILTV) en el HVT.
El gen gD seguido por la señal de poliadenilación de gX del PRV se
insertó como un casete en el vector de homología
435-47.1 en el sitio HindIII único. El casete
se construyó utilizando técnicas estándares de DNA recombinante
(Maniatis et al., 1989 y Sambrook et al., 1989)
uniendo los fragmentos de restricción de las siguientes fuentes. El
primer fragmento es un sub-fragmento de restricción
de aproximadamente 2.060 pares de bases EcoRI a BclI
del fragmento de restricción genómico KpnI nº 8 del ILTV
(10,6 KB). El segundo fragmento es un subfragmento de restricción de
aproximadamente 754 pares de bases NdeI a SalI del
fragmento de restricción BamHI nº 7 del PRV (Lomniczi et
al., 1984). Adviértase que los fragmentos están orientados de
manera que los sitios BclI y NdeI están contiguos.
Vector de homología
528-11.43. El plásmido 528-11.43
se construyó con el fin de insertar el gen gB del virus de la
laringotraqueitis infecciosa (ILTV) (A. M. Grifin, 1991) en el HVT.
El gen gB se insertó como un fragmento EcoRI en el vector de
homología 435-47.1 en el sitio HindIII único.
El gen gB se insertó en el sitio HindIII de extremos romos
como un fragmento EcoRI de extremos romos. Los sitios
HindIII y EcoRI se hicieron romos por llenado con
polimerasa de Klenow en reacción. El gen gB se insertó en la misma
orientación transcripcional que el gen US2 en el vector de
homología parental. El fragmento EcoRI puede obtenerse como
un fragmento genómico del virus del ILTV de 3,0 KB.
Vector de homología
518-46.B3. El plásmido 518-46.B3
se construyó con el fin de insertar un DNA extraño en el HVT. Este
contiene un sitio de enzima de restricción HindIII único en
el cual puede insertarse el DNA extraño. Cuando un plásmido que
contiene un inserto de DNA extraño en el sitio HindIII se usó
de acuerdo con la Cotransfección de DNA para generar herpesvirus
recombinantes o con el método para generar herpesvirus recombinantes
a partir de fragmentos subgenómicos solapantes resultará un virus
que contiene el DNA extraño. Este plásmido puede construirse
utilizando técnicas estándares de DNA recombinante (Maniatis et
al., 1982 y Sambrook et al., 1989) uniendo tres
fragmentos de restricción de las siguientes fuentes. El primer
fragmento es un fragmento de restricción de aproximadamente 1649
pares de bases PvuI a SalI del pSP64 (Promega). El
segundo fragmento es un fragmento de restricción de aproximadamente
1368 pares de bases PvuI a SalI del PSP65 (Promega).
El tercer fragmento es el fragmento XhoI a XhoI del
plásmido 437-47.1 de aproximadamente 3400 pares de
bases.
Vector de homología
535-70.3. El plásmido 535-70.3
se construyó con el fin de insertar los genes gB y gA del MDV y el
gen F del MDV en el HVT. El gen F se insertó como un casete en el
vector de homología 456-17.22 en el sitio
HindIII entre los genes gA y gB del MDV (véase la Unión B,
Figura 10A) El gen F está bajo el control del promotor del HCMV
temprano inmediato y seguido por la señal de poliadenilación de TK
del HSV-1. El gen F se insertó en la misma
orientación transcripcional que el gen US2 en el vector de homología
parental. El casete puede construirse utilizando técnicas
estándares de DNA recombinante (Maniatis et al., 1982 y
Sambrook et al., 1989), uniendo los fragmentos de
restricción de las siguientes fuentes. El primer fragmento es un
subfragmento de restricción de aproximadamente 1191 pares de bases
PstI a AvaII del sub-fragmento
XbaI E genómico del HCMV (D.R. Thomsen et al., 1991).
El segundo fragmento es un fragmento de restricción de
aproximadamente 1812 pares de bases BamHI a PstI del
clon de cDNA del gen F del NDV de longitud completa (cepa B1). El
último fragmento es un sub-fragmento de restricción
de aproximadamente 784 pares de bases SmaI a SmaI del
fragmento de restricción Q del HSV-1 (McGeoch et
al., 1985).
Vector de homología
549-24.15. El plásmido 549-24.15
se construyó con el fin de insertar los genes gB y gA del NDV y los
genes F y HN del NDV en el HVT. Los genes HN y F se insertan como un
casete en el vector de homología 456-17.22 en el
sitio HindIII localizado entre los genes gA y gB del MDV
(véase la Unión B, Figura 10A). Los genes HN y F están bajo el
control de los promotores gpX del PRV y temprano inmediato del HCMV
respectivamente. Los genes HN y F van seguidos por las señales de
poliadenilación gX de PRV y TK de HSV-1
respectivamente. El casete puede construirse utilizando técnicas
estándares de DNA recombinante (Maniatis et al., 1982 y
Sambrook et al., 1989), uniendo los fragmentos de
restricción de las siguientes fuentes. El primer fragmento es un
subfragmento de restricción de aproximadamente 413 pares de bases
SalI a BamHI del fragmento BamHI nº 10 del PRV
(Lomniczi et al., 1984). El segundo fragmento es un fragmento
de restricción de aproximadamente 1.811 pares de bases SmaII
a SalI del clon de cDNA del gen HN del NDV de longitud
completa (cepa B1). El tercer fragmento es un subfragmento de
restricción de aproximadamente 754 pares de bases NdeI a
SalI del fragmento BamHI nº 7 de restricción del PRV
(Lomniczi et al., 1984). El cuarto fragmento es un
subfragmento de restricción PstI a AvaII de
aproximadamente 1191 pares de bases del
sub-fragmento XbaI E genómico del HCMV (D.R.
Thomsen et al., 1981). El quinto fragmento es un fragmento
de restricción de aproximadamente 1812 pares de bases de
BamHI a PstI del clon de cDNA del gen F del NDV de
longitud completa (cepa B1) El último fragmento es un subfragmento
de restricción de aproximadamente 784 pares de bases SmaI a
SmaI del fragmento Q de restricción
BamHI-1 del HSV (McGeoch et al.,
1985).
Vector de homología
549-62.10. El plásmido 549-62.10
se construyó con el fin de insertar los genes de gB y gA del NDV y
el gen HN del NDV en el HVT. El gen HN se insertó como un casete en
un vector de homología 456-17.22 en el sitio
HindIII entre los genes gA y gB del MDV (véase la Unión B,
Figura 10A). El gen HN está bajo el control del promotor gpX del
PRV y seguido por la señal de poliadenilación gX del PRV. El gen HN
se insertó en la misma orientación transcripcional que el gen US2
en el vector de homología parental. El casete se construyó
utilizando técnicas estándares de DNA recombinante (Maniatis et
al., 1982, y Sambrook et al., 1989) uniendo los
fragmentos de restricción de las siguientes fuentes. El primer
fragmento es un subfragmento de restricción de aproximadamente 413
pares de bases SalI a BamHI del fragmento BamHI
nº 10 del PRV (Lomniczi et al., 1984). El segundo fragmento
es un fragmento de restricción de aproximadamente 1811 pares de
bases AvaII a NdeI del clon de cDNA del gen HN del
NDV de longitud completa (cepa B1). El último fragmento es un
subfragmento de restricción de aproximadamente 754 pares de bases
NdeI a SalI del fragmento de restricción BamHI
nº 7 del PRV (Lomniczi et al., 1984).
Clon subgenómico
550-60.6. El plásmido 550-60.6
se construyó con el fin de generar HVT recombinantes. Este contiene
una región de aproximadamente 12.300 pares de bases del DNA del HVT
genómico. Puede usarse junto con otros clones subgenómicos de
acuerdo con el Método para generar herpesvirus recombinantes a
partir de fragmentos subgenómicos solapantes para la construcción
de un HVT recombinante. Este plásmido se construyó utilizando
técnicas estándares de DNA recombinante (Maniatis et al.,
1982, y Sambrook et al., 1989), uniendo dos fragmentos de
restricción de las siguientes fuentes. El primer fragmento es un
fragmento de restricción de aproximadamente 4176 pares de bases
EcoRV a BamHI de pBR622. El segundo fragmento es el
subfragmento de aproximadamente 12.300 pares de bases del fragmento
BamHI nº 2 del HVT (Buckmaster et al., 1988). Este
fragmento se generó de la siguiente manera. El plásmido
437-26.26 se linealizó con HindIII y luego se
recortó con el ExoIII Mung Bean Deletion Kit (Stratagene).
Las muestras de las reacciones de 3 y 4 minutos se reunieron y se
digirieron con BamHI dando como resultado una población de
fragmentos que contiene el subfragmento deseado de 12300 pares de
bases. Esta población se clonó en el fragmento pBR322 y los clones
resultantes se escrutaron para el tamaño y mapa de restricción
apropiado. Afortunadamente, el subfragmento recortado que se generó
del clon 550-60.6 terminó en los nucleótidos GG los
cuales generaron un segundo sitio BamHI cuando se ligaron al
sitio EcoRV (ATCC) de pBR322. Una cepa bacteriana que
contiene este plásmido se ha depositado el 3 de marzo de 1993 de
acuerdo con el Tratado de Budapest en el International Depository
of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure with the
Patent Culture Depository of the American Type Culture
Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852,
USA, bajo el número de acceso ATCC Nº 75429.
Vectores de homología
566-41.5. El plásmido 566-41.5
se construyó con el fin de insertar los genes gA, gB y gD del MDV
en el HVT. El gen gD del MDV se insertó como un fragmento
HindIII en el vector de homología 456-17.22
en el sitio HindIII localizado entre gA y gB del MDV (véanse
las Figuras 10A y 10B). El gen gD del MDV se insertó en la misma
orientación transcripcional que los genes gA y gB en el vector de
homología parental. Una descripción detallada del fragmento
HindIII que contiene el gen gD del MDV se muestra en las
Figuras 11A y 11B. Adviértase que la señal de poliadenación de
herpesvirus se añadió al casete del gen gD. El fragmento
HindIII insertado puede construirse utilizando técnicas
estándares de DNA recombinante (Maniatis et al., 1982 y
Sambrook et al., 1989) uniendo los fragmentos de restricción
de las siguientes fuentes con las secuencias de DNA sintético
indicadas en las Figuras 11A y 11B. El fragmento 1 es un
subfragmento de restricción de aproximadamente 784 pares de bases
SmaI a SmaI del fragmento Q de restricción
BamHI del HSV-1 (McGeoch et al.,
1988). Adviértase que este fragmento está orientado de manera que
la secuencia de poliadenilación (AATAAA) está localizado lo más
cerca a la Unión B. El fragmento 2 es un
sub-fragmento de aproximadamente 2177 pares de bases
SalI a NcoI del fragmento de restricción genómico
BglII de 4,2 KB del MDV (Ross et al., 1991).
Vector de homología
567-72.1D. El plásmido 567-72.1D
se construyó para los fines de insertar los genes gB, gA, y gD del
MDV y los genes clavo y matriz del virus de la bronquitis infecciosa
(IBV) en el HVT. Los genes del IBV están insertados en forma de un
casete en el vector de homología 566-41.5 en el
sitio NotI único localizado aguas arriba (es decir, hacia el
extremo 5') del gen gD de MDV (véase la Unión C, Figura 11B). Los
genes de las proteínas matriz y clavo del IBV están bajo el control
de los promotores temprano inmediato del HSV-1 y
gpX del PRV, respectivamente. Los genes clavo y matriz del IBV van
seguidos por las señales de poliadenilación TK del
HSV-1 y gX del PRV respectivamente. Los genes del
IBV están insertados en la misma orientación transcripcional que el
gen US2 en el vector de homología parental. El casete puede
construirse utilizando técnicas estándares de DNA recombinante
(Maniatis et al., 1982 y Sambrook et al., 1989),
uniendo los fragmentos de restricción de las siguientes fuentes. El
primer fragmento es un subfragmento de restricción de
aproximadamente 413 pares de bases SalI a BamHI del
fragmento BamHI nº 10 del PRV (Lomniczi et al., 1984).
El segundo fragmento contiene los aminoácidos 1 a 223 del gen
matriz del IBV. La región codificante se obtuvo del clon de cDNA de
la cepa Arkansas del IBV. El tercer fragmento es un subfragmento de
restricción de aproximadamente 754 pares de bases NdeI a
SalI del fragmento de restricción BamHI nº 7 del PRV
(Lomniczi et al., 1984). El cuarto fragmento es un
subfragmento de restricción de aproximadamente 1191 pares de bases
PstI a AvaII del fragmento genómico XbaI E del
HCMV (D.R. Thomsen et al., 1981). El quinto fragmento
contiene los aminoácidos 4 a 1162 aminoácidos del gen clavo del
IBV. La región codificante se obtuvo del clon de cDNA de la cepa
Arkansas del IBV. El último fragmento es un subfragmento de
restricción de aproximadamente 784 pares de bases SmaI a
SmaI del fragmento de restricción Q de BamHI del HSV1
(McGeoch et al., 1985).
Vector de homología
603-57.F1. El plásmido 603-57.F1
se construyó con el fin de insertar el gen VP2 del IBDV en el HVT.
El gen VP2 del IBDV se insertó como un casete en el vector de
homología 435-47.1 en un sitio HindIII
único. El gen VP2 está bajo el control del promotor temprano
inmediato del HCMV y va seguido por la señal de poliadenilación de
TK del HSV-1. El gen VP2 se insertó en la misma
orientación transcripcional que el US2 en el vector de homología
parental. El casete puede construirse utilizando técnicas estándares
de DNA recombinante (Maniatis et al., 1982 y Sambrook et
al., 1989), uniendo los fragmentos de restricción de las
siguientes fuentes. El primer fragmento es un subfragmento de
restricción de aproximadamente 1191 pares de bases PstI a
AvaII del fragmento genómico de XbaI E del HCMV (D.R.
Thomsen et al., 1981). El segundo fragmento es un
subfragmento de restricción de aproximadamente 1081 pares de bases
BclI a BamHI del clon de cDNA de longitud completa del
IBDV (véase la SEQ ID NO: 1). Adviértase que el sitio BclI
se introdujo en el clon de cDNA directamente aguas arriba de la
metionina del iniciador VP2 convirtiendo la secuencia CGCAGC en
TGATCA. Los fragmentos primero y segundo están orientados de manera
que los sitios AvaII y BclI estén contiguos. El tercer
fragmento es un subfragmento de restricción de aproximadamente 784
pares de bases SmaI a SmaI del fragmento de
restricción Q de BamHI de HSV-1 (McGeoch
et al., 1985).
Vector de homología
633-13.27. El plásmido 633-13.27
se construyó con el fin de insertar los genes gB, gA y gD del MDV y
los genes HN y F del NDV en el HVT. Los genes HN y F están bajo el
control de los promotores tempranos inmediatos gpX del PRV y de
HCMV respectivamente. Los genes HN y F van seguidos por las señales
de poliadenilación del gX del PRV y de TK del HSV-1,
respectivamente. Todos los cinco genes estaban insertados en la
misma orientación transcripcional que el gen US2 en el vector de
homología parental. Los genes estaban insertados en el siguiente
orden: gen gA del MDV, gen HN del NDV, gen F del NDV, gen gD del MDV
y gen gB del MDV.
Vector de homología
634-29.16. El plásmido 634-29.16
se construyó con el fin de insertar los genes gB y gD del ILTV en
el HVT. El gen marcador lacZ va seguido por los genes gB y gD
del ILTV insertados como un casete en el vector de homología
172-29.31 en el sitio XhoI único. El casete
se construyó utilizando técnicas estándares de DNA recombinante
(Maniatis et al., 1982 y Sambrook et al., 1989),
uniendo los fragmentos de restricción de las siguientes fuentes. El
primer fragmento es un fragmento de restricción de aproximadamente
4229 pares de bases SalI a SalI derivado del gen
marcador lacZ antes descrito y mostrado en las Figuras 7A y
7B. El segundo fragmento es un subfragmento de restricción de
aproximadamente 2060 pares de bases EcoRI a BclI del
fragmento de restricción genómico nº 8 de KpnI de ILTV (10,6
KB). El tercer fragmento es un subfragmento de restricción de
aproximadamente 754 pares de bases NdeI a SalI del
fragmento de restricción BamHI nº 7 del PRV (Lomniczi et
al., 1984). Adviértase que los fragmentos segundo y tercero
están orientados de manera que los sitios BclI a NdeI
estén contiguos. El cuarto fragmento es el fragmento EcoRI
genómico de 3,0 KB del ILTV que contiene el gen gB. Todos los tres
genes están en la misma orientación transcripcional que el gen
UL43.
Clon subgenómico
415-09.BA1. El cósmido
415-09.BA1 se construyó con el fin de regenerar HVT
recombinantes. Contiene un fragmento BamHI nº 1 de
aproximadamente 29.500 pares de bases de DNA del HVT genómico. Este
se usó junto con otros clones subgenómicos de acuerdo con el Método
para generar herpesvirus recombinantes a partir de fragmentos
subgenómicos solapantes para la construcción de HVT recombinantes.
Este cósmido se construyó uniendo dos fragmentos de restricción
(Sambrook et al., 1989) de las siguientes fuentes. El vector
es un fragmento de restricción de aproximadamente 4430 pares de
bases BamHI a BamHI de pSY1005 derivado de pHC79.
(Bethesda Research Laboratories, Inc.) y pWE15 (Stratagene, Inc.).
El primer fragmento es el fragmento BamHI nº 1 de
aproximadamente 29.500 pares de bases del genoma del HVT (Buckmaster
et al., 1988).
Clon subgenómico
672-01.A40. El cósmido
672-01.A40 se construyó con el fin de generar HVT
recombinantes. Este se aisló como un subclon del cósmido
407-32.1CI (véanse la Figuras 8 y 15). El cósmido
672-01.A40 contiene un subfragmento de
aproximadamente 14.000 pares de bases NotI a AscI y
aproximadamente un subfragmento de aproximadamente 1300 pares de
bases AscI a BamHI del cósmido
407-32.1C1. El cósmido se construyó uniendo los
fragmentos de restricción (Sambrook et al., 1989) de las
siguientes fuentes. El vector es un fragmento de aproximadamente
2700 pares de bases NotI a BamHI construido a partir
de pNEB193 (New England Biolabs, Inc.) el cual contiene el
enlazador NotI insertado en el sitio SmaI. El
fragmento I es una región de aproximadamente 15.300 pares de bases
del DNA del HVT genómico. Esta región incluye los fragmentos
BamHI 11 y 7, y aproximadamente 1250 pares de bases del
fragmento 13. Se usó junto con otros clones subgenómicos de acuerdo
con el Método para generar herpesvirus recombinantes a partir de
fragmentos subgenómicos solapantes para la construcción del HVT
recombinantes.
Clon subgenómico
654-45.1. El plásmido 654-45.1
se construyó con el fin de generar HVT recombinantes. Se aisló como
un subclon AscI del cósmido 407-32.1C1
(véanse las Figuras 8 y 15). El cósmido se construyó uniendo los
fragmentos de restricción (Sambrook et al., 1989) de las
siguientes fuentes. El vector es un fragmento AscI de
aproximadamente 2.000 pares de bases construido a partir de un
fragmento AatII a PvuII de 2.000 pares de bases de
pNEB 193 (New England Biolabs, Inc.) con los extremos hechos romos
con DNA-polimerasa de Klenow y enlazadores
AscI insertados. El fragmento 1 es un fragmento de
aproximadamente 8.600 pares de bases AscI a AscI de
DNA del HVT genómico. Esta región incluye los fragmentos 10 y 21 de
BamHI y aproximadamente 1.100 pares de bases del fragmento
nº 6 y aproximadamente 1.300 pares de bases del fragmento 7. El
sitio XhoI (nucleótidos nº 1339-1344; SEQ ID
NO: 48) se ha convertido en un sitio PacI único usando
enlazadores de DNA sintéticos. El sitio PacI se usó en la
inserción y expresión de genes extraños en HVT. (Véase la Figura
13A). Se usó junto con otros clones subgenómicos de acuerdo con el
Método para la generación de herpesvirus recombinantes a partir de
fragmentos subgenómicos solapantes para la construcción del HVT
recombinante.
Clon subgenómico
686-63.A1. El plásmido 686-63.A1
se construyó con el fin de generar HVT recombinante. Se aisló como
un subclon AscI del cósmido 407-32.1CI
(véanse las Figuras 8 y 15). El cósmido se construyó uniendo los
fragmentos de restricción (Sambrook et al., 1989) de las
siguientes fuentes. El vector es un fragmento de aproximadamente
2.000 pares de bases AscI construido del fragmento
AatII a PvuII de 2000 pares de bases de pNEB193 (New
England Biolabs, Inc) hecho de extremos romos con los enlazadores
DNA-polimerasa de Klenow y AscI insertados.
El fragmento 1 es un fragmento de aproximadamente 8.600 pares de
bases AscI a AscI del DNA del HVT genómico. Esta
región incluye los fragmentos BamHI 10 y 21 y aproximadamente
1.100 pares del fragmento 6 y aproximadamente 1.300 pares de bases
del fragmento 7. El sitio XhoI (Nucleótidos nº
1339-1344; SEQ ID NO: 48) se ha convertido en un
sitio NotI único usando enlazadores de DNA sintético. El
sitio NotI se usó para la inserción y expresión de genes
extraños en el HVT (véase la Figura 13B). Se usó junto con otros
clones subgenómicos de acuerdo con el Método para generar
herpesvirus recombinantes a partir de fragmentos subgenómicos
solapantes para la construcción del HVT recombinantes.
Clon subgenómico
672-07.C40. El cósmido
672-07.C40 se construyó con el fin de generar HVT
recombinante. Se aisló como un subclon del cósmido
407-32.1C1 (véanse las Figuras 8 y 15). El cósmido
672-07.C40 contiene un subfragmento BamHI a
AscI de aproximadamente 1.100 pares de bases y un
subfragmento AscI a NotI de aproximadamente 13.000
pares de bases del cósmido 407-32.11. El cósmido se
construyó uniendo los fragmentos de restricción (Sambrook et
al., 1989) de las siguientes fuentes. El vector es un fragmento
NotI a BamHI de aproximadamente 2700 pares de bases
construido a partir de pNEB193 (New England Biolabs, Inc.) que
contenía un enlazador NotI insertado en el sitio
SmaI. El fragmento 1 es una región de aproximadamente 14.100
pares de bases de DNA del HVT genómico. Esta región incluye los
fragmentos BamHI nº 6 y 18 y un fragmento BamHI a
NotI de aproximadamente 2.600 pares de bases en el fragmento
BamHI nº 1. Se usó junto con otros clones subgenómicos de
acuerdo con el Método para generar herpesvirus recombinantes a
partir de fragmentos subgenómicos solapantes para la construcción
del HVT recombinante.
Clon subgenómico
706-57.A3. El plásmido 706-57.A3
se construyó con el fin de generar HVT recombinante. El plásmido
706-57.A3 contenía el gen VP2 de IBDV insertado en
el sitio PacI del plásmido 654-45.1. El gen
VP2 del IBDV usó el promotor VP8 del IBRV y la señal de
poliadenilación US3 del ILTV. El cósmido se construyó utilizando
técnicas estándares de DNA recombinante Sambrook et al.,
1989). El primer fragmento es un fragmento de 208 pares de bases
HindIII a BamHI codificado para el promotor VP8 del
IBRV (Carpenter et al., 1991). El segundo fragmento es un
fragmento de aproximadamente 1626 pares de bases que codifica el gen
VP2 del IBDV derivado por transcripción inversa y reacción en
cadena de la polimerasa (Sambrook et al., 1989) de RNA
genómico (USDA) de la cepa de inoculación estándar del IBDV
(Kibenge et al., 1990). El cebador antisentido usado para la
transcripción inversa y el PCR fue
5'-CTGGTTCGGCCCATGATCAGATGACAAACCTGCAAGATC-3'
(SEQ ID NO: 53). El cebador con sentido usado para PCR fue
5'-CTGGTTCGGCCCATGATCAGATGACAAACCTGCAAGATC-3'
(SEQ ID NO: 54) El fragmento de DNA generado mediante PCR se clonó
en el vector PCR-Direct® (Clontech Laboratories,
Inc., Palo Alto, California). El fragmento VP2 del IBDV se subclonó
después a continuación para el promotor VP8 usando los sitios
BclI generados por los cebadores de PCR. La secuencia de DNA
en esta unión añade los aminoácidos metionina, aspartato y
glutamina antes de la metionina iniciadora natural de VP2. El
fragmento de DNA contiene la secuencia codificadora del aminoácido 1
hasta el aminoácido 536 de la poliproteína del IBDV (SEQ ID NO:
2) la cual incluye la secuencia de codificación completa de la
proteína VP2. El tercer fragmento es un fragmento de
aproximadamente 494 pares de bases que codifica la señal de
poliadenilación US3 del ILTV.
Clon subgenómico
711-92.1A. El plásmido 711-92.1A
se construyó con el fin de generar HVT recombinantes. El plásmido
711-92.1A contiene los genes gD y gI del ILTV
insertados en el sitio PacI del plásmido
654-45.1. Los genes gD y gI del ILTV usan sus
promotores del ILTV endógenos respectivos y la señal de
poliadenilación endógena compartida única. El plásmido se construyó
utilizando técnicas estándares de DNA recombinante (Sambrook et
al., 1989). El primer fragmento es un subfragmento de
restricción SalI a HindIII de aproximadamente 3556
pares de bases del fragmento nº 8 genómico Asp 718I (10,6 kb).
Clon subgenómico
717-38.12. El plásmido 717-38.12
se construyó con el fin de generar HVT recombinantes. El plásmido
717-38.12 contiene los genes HN y F del NDV
insertados en el sitio PacI del plásmido
654-45.1. El gen HN del NDV usa el promotor
temprano inmediato del HCMV y la señal de poliadenilación de gX del
PRV. El gen F del NDV usa el promotor temprano inmediato del HCMV y
la señal de poliadenilación TK de HSV. El plásmido se construyó
utilizando técnicas estándares de DNA recombinante (Sambrook et
al., 1989). El primer fragmento es un subfragmento de
restricción de aproximadamente 413 pares de bases SalI a
BamHI del fragmento BamHI nº 10 del PRV (Lomniczi
et al., 1984). El segundo fragmento es un fragmento de
restricción AvaII a NdeI de aproximadamente 1.811
pares de bases del clon de cDNA del gen HN del NDV (cepa B1). El
tercer fragmento es un subfragmento de restricción NdeI a
SalI de aproximadamente 754 pares de bases del fragmento de
restricción nº 7 de BamHI del PRV (Lomniczi et al.,
1984). El cuarto fragmento es un subfragmento de restricción
PstI a AvaII de aproximadamente 1191 pares de bases
del fragmento XbaI E genómico del HCMV (D.R. Thomsen et
al., 1981). El quinto fragmento es un fragmento de restricción
BamHI a PstI de aproximadamente 1.812 pares de bases
del clon de cDNA del gen F del NDV de longitud completa (cepa B1;
SEQ ID NO: 12). El sexto fragmento es un subfragmento de
restricción SmaI a SmaI de aproximadamente 784 pares
de bases del fragmento de restricción Q de BamHI del
HSV-1 (McGeoch et al., 1985).
Clon subgenómico
721-38.1J. El cósmido 721-38.1J
se construyó con el fin de insertar los genes gA, gD, y gB del MDV
en la región corta única del HVT y con el fin de generar HVT
recombinante. El cósmido 721-38.1J contenía los
genes gA, gD, y gB del MDV insertados en el sitio StuI en el
gen US2 del HVT convertido en un sitio HindIII único dentro
del fragmento BamHI nº 1 de la región corta única del HVT.
Esta región del fragmento BamHI nº 1 del HVT que contiene
los genes del MDV se obtuvo de
S-HVT-062. El cósmido
721-38.1J se construyó mediante una restricción
parcial digerida con BamHI de DNA de
S-HVT-062 y aislamiento de un
fragmento de aproximadamente 39.300 pares de bases. El cósmido se
construyó utilizando técnicas de estándares de DNA recombinante
(Sambrook et al., 1989), uniendo fragmentos de restricción
de las siguientes fuentes. El vector es un fragmento BamHI
de aproximadamente 8.200 pares de bases del vector cósmido pWE15. El
primer fragmento es un fragmento BamHI de aproximadamente
900 pares de bases de la región de repetición del genoma del HVT. El
segundo fragmento es un subfragmento BamHI a StuI de
aproximadamente 15.500 pares de bases del BamHI nº 1 del HVT.
El tercer fragmento es un casete de aproximadamente 8.400 pares de
bases que contiene los genes gA, gD y gB del MDV (véanse las
Figuras 10 y 11). El cuarto fragmento es un subfragmento
HindIII a BamHI de aproximadamente 14.500 pares de
bases de BamHI nº 1 del HVT.
Clon subgenómico
722-60.E2. El cósmido 722-60.E2
se construyó con el fin de insertar los genes gA, gD y gB del MDV y
los genes HN y F del NDV en la región corta única del HVT y con el
fin de generar HVT recombinantes. El cósmido
722-60.E2 contiene los genes gA, gD y gB del MDV y
los genes HN y F del NDV insertados en el sitio StuI en el
gen US2 del HVT convertido en un sitio HindIII dentro del
fragmento BamHI nº 1 de la región corta única del HVT. Todos
los cinco genes están insertados en la misma orientación
transcripcional que el gen US2 del HVT. Esta región del fragmento
BamHI nº 1 del HVT que contiene los genes del MDV y NDV se
derivó de S-HVT-106. El cósmido
722-60.E2 se construyó mediante una restricción
parcial digerida con BamHI de
S-HVT-106 y el aislamiento de un
fragmento de aproximadamente 46.300 pares de bases. El cósmido se
construyó utilizando técnicas estándares de DNA recombinante
(Sambrook et al., 1989) uniendo los fragmentos de restricción
de las siguientes fuentes. El vector es un fragmento BamHI
de aproximadamente 6100 pares de bases del vector cósmido pSY1626
derivado de pHC79 (Bethesda Research Labs, Inc.) y pWE15
(Strategene, Inc.). El primer fragmento es un fragmento BamHI
de aproximadamente 900 pares de bases de la región de repetición
del genoma del HVT. El segundo fragmento es un subfragmento
BamHI nº 1 de aproximadamente 15.500 pares de bases
BamHI a StuI del HVT. El tercer fragmento es un
casete de aproximadamente 15.400 pares de bases que contiene el gen
gA del MDV (Figuras 10A y 10B, SEQ ID NO: 8), el promotor gX del
PRV (Lomniczi et al., 1984). El gen HN del NDV (SEQ ID NO:
10), el sitio de poliadenilación gX del PRV (Lomniczi et
al., 1984), el promotor temprano inmediato del HCMV (D.R.
Thomsen et al., 1981), el gen F del NDV (SEQ ID NO: 12),
el sitio de poliadenilación de TK del HSV (McGeoch et al.,
1985), el gen gD del MDV (Figuras 11A y 11B), el sitio de
poliadenilación US3 del ILTV de aproximadamente 450 pares de bases
y el gen gB del MDV (Figuras 10A y 10B). El cuarto fragmento es un
subfragmento StuI a BamHI de aproximadamente 14.500
pares de bases del BamHI nº 1 del HVT.
Clon subgenómico
729-37.1. El plásmido 729-37.1
se construyó con el fin de generar HVT recombinante. El plásmido
729-37.1 contiene los genes gD y gB del ILTV
insertados en el sitio NotI del plásmido
686-63.A1. Los genes gD y gB del ILTV usan sus
promotores del ILTV endógenos respectivos y los genes gD y gB del
ILTV van cada uno seguido por unas señales de poliadenilación gX
del PRV. El casete de genes gD y gB del ILTV se construyó
utilizando técnicas estándares de DNA recombinante (Sambrook et
al., 1989). El primer fragmento es un subfragmento de
restricción de aproximadamente 2.052 pares de bases SalI a
XbaI del fragmento nº 8 del ILTV Asp 7l8I genómico (10,6
KB). El segundo fragmento es un subfragmento de restricción de
aproximadamente 572 pares de bases XbaI a Asp 718I del
fragmento de restricción BamHI nº 7 del PRV (Lomniczi et
al., 1984). El tercer fragmento es un fragmento de restricción
de restricción EcoRI a EcoRI de aproximadamente 3059
pares de bases de DNA genómico del ILTV. El cuarto fragmento es un
subfragmento de restricción EcoRI a SalI de
aproximadamente 222 pares de bases del fragmento de restricción
BamHI nº 7 del PRV (Lomniczi et al., 1984).
Clon subgmomico
739-27.16. El cósmido 739-27.16
se construyó con el fin de construir un virus HVT/MDV aquimérico
que contiene genes del HVT de la región larga única y genes del MDV
de tipo 1 de la región corta única. El cósmido
739-27-16 contiene la región corta
única completa del MDV tipo 1. Esta región contiene el fragmento
completo SmaI B y dos fragmentos SmaI K. El cósmido
739-27.16 se construyó mediante una restricción
parcial digerida con SmaI de DNA del MDV y el aislamiento de
un fragmento de aproximadamente 29.000 a 33.000 pares de bases. El
cósmido se construyó utilizando técnicas estándares de DNA
recombinante (Sambrook et al., 1989), uniendo los fragmentos
de restricción de las siguientes fuentes. El vector es un fragmento
BamHI de aproximadamente 8200 pares de bases (hecho de
extremos romos con DNA-polimerasa de Klenow) del
vector cósmido pWE15. El primer fragmento es un fragmento
SmaI K de aproximadamente 4.050 pares de bases de la región
de repetición interna corta del genoma del MDW. El segundo
fragmento es un fragmento SmaI B de aproximadamente 21.000
pares de bases del MDV. El tercer fragmento es un fragmento
SmaI K de aproximadamente 3.650 pares de bases de la región
de repetición terminal corta del genoma del MDV (Fukuchi et
al., 1984, 1985).
Clon subgenómico
751-87.A8. El plásmido 751-87.A8
se construyó con el fin de generar HVT recombinante. El plásmido
75-187.A8 contiene el gen del factor de crecimiento
mielomonocítico de pollo (cGMF) insertado en el sitio PacI
del plásmido 654-45.1. El gen del cMGF usó el
promotor temprano inmediato del HCMV y la señal de poliadenilación
de TK del HSV-1. El cósmido se construyó utilizando
técnicas estándares de DNA recombinante (Sambrook et al.,
1989). Se insertaron los siguientes fragmentos en el sitio
PacI del clon subgenómico 654-45.1 del HVT.
El primer fragmento es un subfragmento de restricción PstI a
AvaII de aproximadamente 1.191 pares de bases del fragmento
XbaI E del HCMV genómico (D.R. Thomsen et al., 1981).
El segundo fragmento es un fragmento de aproximadamente 640 pares
de bases que codifica el gen cMGF (58) derivado por transcripción
inversa y reacción en cadena de la polimerasa (PCR) (Sambrook et
al., 1989) de RNA de pollos estimulado con concanavalina A. El
cebador antisentido usado para la transcripción inversa y la PCR fue
5'-CGCAGGATCCGGGGCGTCAGAGGCGGGCGAGGTG-3'
(SEQ ID NO: 57). El cebador con sentido usado para la PCR fue
5'-GAGCGGATCCTGCAGGAGGAGACACAGAGCTG-3'
(SEQ ID NO: 58). El fragmento de cMGF se subclonó después al
promotor IE del HCMV usando los sitios BamHI generados por
los cebadores de PCR. El fragmento de DNA contenía la secuencia
codificadora del aminoácido 1 hasta el aminoácido 201 de la
proteína cMGF (58) que incluyó una secuencia delantera de 23
aminoácidos en el extremo amino terminal y 178 aminoácidos en la
proteína cMGF madura. El tercer fragmento es un subfragmento de
restricción SmaI a SmaI de aproximadamente 784 pares
de bases del fragmento de restricción BamHI Q del
HSV-1 (McGeoch et al., 1985).
Clon subgenómico
761-07.A1. El plásmido 761-07.A1
se construyó con el fin de generar HVT recombinante. El plásmido
761-07.A1 contiene el gen de interferón de pollo
insertado en el sitio PacI del plásmido
654-45.1. El gen del interferón de pollo usa el
promotor de HCMV temprano inmediato y la señal de poliadenilación de
TK del HSV-1. El cósmido se construyó utilizando
técnicas estándares de DNA recombinante (Sambrook et al.,
1989). Se insertaron los siguientes fragmentos en el sitio
PacI del clon subgenómico 654-45.1 del HVT.
El primer fragmento es un subfragmento de restricción PstI a
AvaII de aproximadamente 1191 pares de bases del fragmento
XbaI E del HCMV genómico (D.R. Thomsen et al., 1981).
El segundo fragmento es un fragmento de aproximadamente 577 pares
de bases que codifica el gen de interferón de pollo (59) obtenido
mediante transcripción inversa y reacción en cadena de la
polimerasa (PCR) (Sambrook et al., 1989) de RNA aislado de
esplenocitos de pollo estimulados con concanavalina A. El cebador
antisentido usado para la transcripción inversa y la PCR fue
5'-TGTAGAGATCTGGC
TAAGTGCGCGTGTTGCCTG-3' (SEQ ID NO: 59). El cebador con sentido usado para la PCR fue 5'-TGTACA
GATCTCACCATGGCTGTGCCTGCAAGC-3' (SEQ ID NO: 60). El fragmento del gen del interferón de pollo se subclonó después al promotor IE del HCMV usando los sitios BgIII generados por los cebadores de la PCR. El fragmento de DNA contiene la secuencia que codifica los aminoácidos 1 al aminoácido 193 de la proteína interferón de pollo (59) que incluye una secuencia de señal de 31 aminoácidos en el extremo amino terminal y 162 aminoácidos de la proteína madura interferón de pollo. El tercer fragmento es un subfragmento de restricción SmaI a SmaI de aproximadamente 784 pares de bases del fragmento de restricción BamHI Q del HSV-1 (McGeoch et al.,
1985).
TAAGTGCGCGTGTTGCCTG-3' (SEQ ID NO: 59). El cebador con sentido usado para la PCR fue 5'-TGTACA
GATCTCACCATGGCTGTGCCTGCAAGC-3' (SEQ ID NO: 60). El fragmento del gen del interferón de pollo se subclonó después al promotor IE del HCMV usando los sitios BgIII generados por los cebadores de la PCR. El fragmento de DNA contiene la secuencia que codifica los aminoácidos 1 al aminoácido 193 de la proteína interferón de pollo (59) que incluye una secuencia de señal de 31 aminoácidos en el extremo amino terminal y 162 aminoácidos de la proteína madura interferón de pollo. El tercer fragmento es un subfragmento de restricción SmaI a SmaI de aproximadamente 784 pares de bases del fragmento de restricción BamHI Q del HSV-1 (McGeoch et al.,
1985).
\vskip1.000000\baselineskip
El S-HVT-001 es
un herpesvirus de pavos (HVT) que contiene el gen de la
\beta-galactosidasa de E. coli insertado
en la región larga única del genoma del HVT. El mapa obtenido por
enzimas de restricción del HVT ha sido publicado (T. Igarashi et
al., 1985). Esta información se usó como un punto de partida
para diseñar la inserción de los genes extraños en el HVT. El mapa
de restricción por BamHI del HVT se muestra en la Figura 1A.
De estos datos, se identificaron como dianas diferentes regiones
del DNA de HVT en las cuales pueden hacerse las inserciones de
genes extraños. El gen extraño escogido para la inserción fue el gen
de la \beta-galactosidasa de E. coli
(lacZ), que se usó en el PRV. El promotor fue un promotor gpX del
PRV. El gen lacZ se insertó en la región larga única del
HVT, específicamente en el sitio XhoI en el fragmento
BamHI nº 16 (de 3329 pb) y se mostró que se expresaba en el
HVT recombinante por formación de placas azules usando el sustrato
Bluogal® (Bethesda Research Laboratories). Similarmente el gen
lacZ se había insertado en el sitio SalI en la región
de repetición contenida en el fragmento BamHI nº 19
(de
900 pb).
900 pb).
Estos experimentos muestran que el HVT es
susceptible de experimentar los procedimientos descritos en esta
solicitud para la inserción y expresión de genes extraños en los
herpesvirus. En particular, se han identificado dos sitios para la
inserción del DNA extraño (Figuras 1B y 1C).
\vskip1.000000\baselineskip
El S-HVT-003 es
un herpesvirus de pavos (HVT) que contiene el gen de la
\beta-galactosidasa de E. coli y el
segmento grande de la cepa S40747 de virus de la enfermedad bursal
infecciosa (IBDV) (como una copia de cDNA) (SEQ ID NO: 1)
insertado en la región larga única del genoma del HVT. Este DNA del
IBDV contiene un marco de lectura abierto que codifica tres
proteínas (5'VP2-VP4-VP3 3') (SEQ ID
NO: 2), dos de las cuales son antígenos para proporcionar
protección contra las infecciones del virus de la enfermedad bursal
infecciosa de los pollos. La expresión de los genes tanto para
\beta-galactosidasa como para la proteína del IBDV
están bajo el control del promotor del gen gpX del virus de la
pseudo-rabia (PRV). El
S-HVT-003 se obtuvo mediante una
recombinación de homólogos. El
S-HVT-003 se depositó el 21 de julio
de 1987 de acuerdo con el Tratado de Budapest en el
International Depository of Microorganisms for the Purpose of
Patent Procedure with the Patent Culture Depository of the American
Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville,
Maryland 20852, USA, bajo el número de acceso ATCC VR
2178.
2178.
Los genes DEL IBDV se clonaron por el Método de
clonación de cDNA. Los clones que representan el genoma del IBDV se
escrutaron mediante el procedimiento de Transferencia southern del
DNA frente a manchas que contienen el RNA del IBDV auténtico. Los
clones positivos se caracterizaron luego por cartografía de
restricción para identificar los grupos de clones. Se identificaron
dos de tales clones que se encontraron juntos y que representan la
región de codificación completa del segmento grande del RNA del IBDV
(RNA bicatenario de 3,3 KB). Un clon de cDNA (2-84)
contenía un fragmento de aproximadamente 2500 pares de bases que
representa la primera mitad del gen del IBDV. El segundo clon
(2-40) contenía un fragmento de aproximadamente 2000
pares de bases que representa la mitad distal del gen del IBDV. El
plásmido 2-84/2-40 que representa el
gen del IBDV completo se construyó uniendo el clon
2-84 y 2-40 en un sitio PvuII
único presente en las secuencias solapantes. El genoma del IBDV se
obtuvo del plásmido de 2-84/2-40
como un fragmento SmaI a HpaI de aproximadamente 3400
pares de bases. La confirmación de la naturaleza de las proteínas
codificadas por el gen del IBDV se obtuvo expresando el clon
(2-84/2-40) en E. coli y
detectando el antígeno VP3 usando el antisuero preparado contra las
proteínas purificadas del IBDV en trasferencias Western. El cDNA del
segmento grande del RNA del IBDV que codifica los antígenos del
IBDV muestra un marco de lectura abierto que en la presente memoria
en adelante será denominado el gen del IBDV. La secuencia de la
cepa Australiana del IBDV se ha publicado la cual lleva la
homología cercana a la secuencia de la firma solicitante (Hudson
et al., 1986). La comparación de las diferencias de
aminoácidos entre los dos virus reveló 29 cambios de aminoácidos en
la región que codifica 1012 aminoácidos. Hubo solo tres diferencias
de aminoácidos deducidas para el VP4 y solo 8 en el VP3. En
contraste el VP2 contenía 18 cambios de aminoácidos, 14 de los
cuales estaban agrupados entre los aminoácidos 139 a 332.
Para la inserción en el genoma del HVT, la
región de codificación para el gen del IBDV se clonó entre el
promotor gpX del PRV y la secuencia de la señal de
poli-A de TK del HSV, creando el plásmido
191-23. Para ayudar en la identificación de los HVT
recombinantes obtenidos mediante la recombinación de homólogos que
contienen el gen del IBDV, el fragmento del IBDV promovido por gpX
del plásmido 191-23 se insertó detrás (en tandem a)
el gen lacZ controlado por el promotor de gpX. El plásmido
resultante, 191-47 contiene el gen lacZ de
E. coli y el gen I del BDV bajo el control de los promotores
gpX individuales del PRV. En la construcción del plásmido
191-47, se unieron varios fragmentos de DNA mediante
técnicas de DNA recombinante usando bien sea los sitios de
restricción que ocurren naturalmente o bien sea el enlazador de DNA
sintético. Los detalles relativos a la construcción de estos genes
contenidos en el plásmido 191-47 pueden verse en las
Figuras 2A, 2B, 2C, y 2D.
El primer segmento de DNA (segmento 1, Figura
2A) contiene la región de promotor gpX que incluye los residuos que
codifican los primeros siete aminoácidos del gen gpX y se derivó del
subclon del fragmento BamHI nº 10 del PRV como un fragmento
SalI a BamHI de aproximadamente 800 pares de bases. El
segundo segmento de DNA (Segmento 2, Figura 2A) contiene la región
que codifica \beta-galactosidasa de E. coli
del aminoácido 10 al aminoácido 1024 y se derivó del plásmido
pJF751 (obtenido de Jim Hoch, Scripps Clinic and Research
Foundation) como un fragmento BamHI a BalI de
aproximadamente 3300 pares de bases seguido por un fragmento
AvaI a SmaI de aproximadamente 40 pares de bases. El
tercer segmento de DNA (Segmento 3, Figura 2A) contiene la secuencia
de señal poli A de gpX y se derivó del subclon del fragmento
BamHI nº 7 del PRV como un fragmento de aproximadamente
NdeI a StuI de 700 pares de bases. El segmento tres
se unió al segmento dos mediante ligamiento del extremo NdeI
el cual se había llenado de acuerdo con La reacción de llenado por
polimerasa, al sitio SmaI. El cuarto segmento de DNA
(Segmento 4, Figura 2A) contiene el promotor gpX (caja TATA y sitio
cap) y se derivó del subclon del fragmento BamHI nº
10 del PRV como un fragmento de aproximadamente 330 pares de bases
NdeI a AluI. Adicionalmente, el segmento cuatro
contiene aproximadamente 36 pares de bases de la secuencia delantera
no traducida de TK 5' del HSV como un fragmento PstI a
BglII en el cual el sitio PstI se había unido al sitio
AluI a través del uso del enlazador de DNA sintético
(McKnight y Kingbury, 1982) Los segmentos DNA cuatro a seis se
insertaron como una unidad en el sitio KpnI único del
segmento tres el cual estaba localizado 3' de la secuencia de señal
poli A de gpX. El quinto segmento de DNA (Segmento 5, Figura 2A)
contiene la región de codificación completa del segmento grande
IBDV de RNA (clon de cDNA) como un fragmento de aproximadamente 3400
pares de bases SmaI a HpaI. El sitio SmaI del
segmento cinco fue fundido al sitio BglII del segmento cuatro
el cual se había llenado de acuerdo con La reacción de llenado por
polimerasa. La expresión del gen IBDV
(5'VP2-VP4-VP3 3') está bajo el
control del promotor gpX (segmento 4) el cual utiliza sus codones
propios natural de inicio y de detención. El sexto segmento de DNA
(Segmento 6, Figura 2a) contiene la secuencia de señal de
poli-A de TK del HSV como un fragmento SmaI
a HpaI de aproximadamente 800 pares de bases (obtenido de
Bernard Roizman, Universidad de Chicago). El sitio HpaI del
segmento cinco se fusionó al sitio SmaI del segmento seis por
el uso de un enlazador de DNA
sintético.
sintético.
En resumen, la construcción usada para crear
HVT-003 (plásmido 191-47) contiene
(5' a 3') el promotor del PRV, la caja TATA del gpX, el sitio
cap del gpX, los primeros siete aminoácidos de gpX, el gen de
\beta-galactosidasa de E. coli
(lacZ), la secuencia de señal poli-A del PRV,
el promotor gpX del PRV, y la caja TATA de gpX, el sitio cap
de gpX, una fusión dentro de la secuencia delantera 5' no traducida
para el gen gpX del IBDV, el codón de iniciación del IBDV, una
fusión en el extremo 3' no traducido del IBDV para el extremo 3' no
traducida para TK del HSV, y la secuencia de señal
poli-A de TK. El casete que contiene estos genes se
manipuló por ingeniería genética de manera que estuviera franqueado
por dos sitios de endonucleasa de restricción de EcoRI. Como
resultado puede obtenerse un fragmento de aproximadamente 9100 pares
de bases que contiene tanto el gen lacZ como el gen del IBDV
mediante la digestión con EcoRI. De aquí en adelante, el
fragmento EcoRI de 9161 pares de bases que se denominará
casete IBDV/lacZ. Los siguientes procedimientos se usaron
para construir el S-HVT003 mediante la combinación
de homólogo. El casete IBDV/lacZ se insertó en el sitio
XhoI único presente dentro de un subclon del fragmento
BamHI nº 16 del HVT. Para lograr esto, el sitio XhoI
se cambió primeramente al sitio EcoRI por uso de un
enlazador de EcoRI. Se había mostrado previamente que el
sitio no esencial en el HVT mediante la inserción del lacZ
(S-HVT-001). También se mostró que
las regiones de homología flanqueantes en el BamHI nº 16 se
eficaces en una recombinación de homólogos. En las Figuras 3A y 3B
se muestra la ubicación genómica de los mapas del fragmento
BamHI nº 16 en la región larga única del HVT. El fragmento
BamHI nº 16 es de una longitud de aproximadamente 3329 pares
de bases (SEQ ID NO: 3, 4, 5, 6, y 7). El DNA del HVT se preparó
mediante el procedimiento de Preparación de DNA de herpesvirus. Las
co-transfecciones del DNA del HVT y del plásmido de
DNA en células fibroblastos de embrión de pollo (CEF) se hicieron de
acuerdo con la Transfección de DNA para generar herpesvirus
recombinantes. El virus recombinante resultante de la reserva
(stock) de co-transfección se purificó
mediante tres rondas sucesivas de purificación de placas usando el
procedimiento Escrutinio bluogal para herpesvirus recombinantes.
Cuando 100% de las placas eran azules, el DNA se analizó respecto a
la presencia del gen del IBDV por el Método de transferencia
Southern DE DNA. Las transferencias Southern del DNA de
S-HVT-003 digerido con EcoRI
con la sonda traducida específica del IBDV (plásmido
2-84/240) se confirmaron por la presencia del
fragmento EcoRI de 9100 pares de bases. Este resultado
confirmó que el S-HVT-003 contenía
tanto el gen lacZ como el gen del IBDV incorporado en su
genoma. Las transferencias Southern adicionales, usando una sonda
específica para el BamHI nº 16, confirmaron que la
recombinación de homólogos ocurrió en la posición apropiada en el
BamHI nº 16 y que no se crearon deleciones. No se observaron
diferencias in vitro en el crecimiento del
S-HVT-003 en comparación al virus
tipo natural (S-HVT-000).
La expresión de las proteínas específicas del
IBDV del S-HVT-003 se analizó in
vitro usando el Método de transferencia western de DNA. Los
lisados celulares se prepararon como se describió en Preparación de
lisados de célula de herpesvirus. Explicado en pocas palabras
consiste en lo siguiente: las proteínas contenidas en los lisados
celulares de S-HVT-003 se separaron
por electroforesis en gel de poliacrilamida, se transfirió a
nitrocelulosa, y se sondó con bien sea un antisuero producido
contra las proteínas de la cápsida del IBDV desnaturalizadas o bien
sea un antisuero producido contra un péptido sintético
correspondiente a una región dominante inmunoprecipitada de la
proteína cápsida (VP2) del IBDV de 40 KD. Los filtros se lavaron y
trataron con proteína A marcada con [^{125}I] para detectar la
posición de los anticuerpos unidos.
La Figura 4 muestra los resultados obtenidos
usando el antisuero preparado contra las proteínas de la cápsida
del IBDV purificadas desnaturalizadas, las cuales han demostrado los
solicitantes que reaccionan principalmente con VP3 (proteína de 32
kd). Como se ve, el S-HVT-003
produce una proteína la cual es inmunológicamente indistinguible de
la proteína VP3 auténtica de los viriones de IBDV intactos. Además,
la poliproteína parece ser procesada correctamente, produciendo la
especie VP3 que co-emigra con la proteína VP3
auténtica. La evidencia reciente usando la cepa de IBDV Australiana
indica que la VP4 está implicada en el procesamiento de la
poliproteína del precursor de las especies de proteína VP2 y VP3
maduras (Jagadish et al., 1988). La Figura 5 muestra los
resultados obtenidos usando un antisuero de conejo producido contra
un péptido sintético que es homólogo a una región de 14 aminoácidos
de la proteína VP2 (40 kd) de la cápsida del IBDV Como se ve, el
S-HVT-003 produce una proteína que
es inmunológicamente indistinguible de la proteína VP2 viral
auténtica. Además, la proteína VP2 producida del
SHVT-003 co-emigra con las especies
de 40 KD del VP2 aislado de los viriones del IBDV intactos. Esta
especie representa un componente principal de las partículas virales
infecciosas (completas).
En resumen, el análisis de la expresión de las
proteínas específicas del IBDV de
S-HVT-003 ha mostrado que la
poliproteína es procesada en el cultivo de células CEF, produciendo
proteínas del tamaño apropiado para reaccionar con los agentes
inmunológicos específicos para las proteínas bien sea VP2 o bien sea
VP3 en las transferencias
Western.
Western.
El siguiente conjunto de experimentos se llevó a
cabo en pollos para analizar la expresión in vivo de los
genes del IBDV contenidos en el
S-HVT-003 como se determinó mediante
los datos de seroconversión, los resultados de neutralización de
suero, y protección frente a la inoculación con IBDV.
El primer experimento se diseño para mostrar la
seroconversión de pollos para el IBDV al ser vacunados con
S-HVT-003. Once pollos de once
semanas de edad, seronegativos al HVT y al IBDV se obtuvieron de
SPAFAS Inc. Se vacunaron seis aves subcutáneamente en la región
abdominal con 0,5 ml de una suspensióncelular de células de CEF que
contenía el S-HVT-003 (40.000
UFP/ml) Las muestras de suero se obtuvieron cada siete días durante
ocho semanas para todas las aves en este estudio. En el día 28
(cuarta semana), tres de estas aves recibieron un inóculo de
recuerdo de S-HVT-003, mientras que
las otras 3 aves recibieron 0,5 ml de una vacuna del IBDV
inactivada inoculada subcutáneamente en la región cervical. A tres
aves adicionales se les administró solo la vacuna inactivada el día
28. Dos aves sirvieron como controles de contacto y no recibieron
vacunación. En el día 56, todas las aves se sacrificaron y se les
hizo la autopsia. La Tabla 1 muestra los resultados del ensayo de
neutralización de suero contra el IBDV. No se observó ninguna
actividad de SN detectable en las aves a las que se les administró
solo S-HVT-003. Adicionalmente, solo
una de las tres aves a las que se les administró solo la vacuna
inactivada demostró una actividad de SN baja pero detectable. Los
títulos de SN también se detectaron en una de las tres aves que
recibió el S-HVT-003 seguido por el
inóculo de recuerdo de vacuna de IBDV inactivado; estos títulos
tenían un valor mucho más alto que con la vacuna de IBDV inactivada
sola. Estos resultados sugieren que el
S-HVT-003 está cebando al pollo para
una respuesta secundaria contra el IBDV. El análisis in
vitro de las muestras de suero por TRANSFERENCIA WESTERN
confirmó la seroconversión de los pollos para el IBDV con la
vacunación con el S-HVT-003 tanto
antes como después de los inóculos de recuerdo administrados el día
28.
\vskip1.000000\baselineskip
En el segundo experimento, veinticinco pollitos
SPF de 1 día se vacunaron con el
S-HVT-003 (20 con 0,2 ml
subcutáneamente, y 5 con gotas bilaterales para ojos). Veinte pollos
se mantuvieron como controles. En los días 4 y 7 de la
post-infección, dos aves de control y 5 aves
vacunadas se sangraron, se sacrificaron y sus bazos se extirparon
para aislamiento del virus. Las suspensiones de esplenocitos
(células del bazo) se hicieron mediante el método estándar, y las
células \sim1 x 10^{6} en 3 ml del medio de cultivo de
fibroblasto de embrión de pollo (CEF) se inocularon directamente
sobre células secundarias. Los cultivos se incubaron durante
6-7 días y luego se calificaron respecto a los
efectos citopáticos (CPE) como se determinó observando la morfología
de las células. Los cultivos se sometieron a pase una segunda vez y
de nuevo se calificaron para el CPE. Los resultados se muestran en
la Tabla 2. Todas las aves de control no vacunadas permanecieron
negativas para el HVT respecto a los aislamientos de esplenocitos
tanto para el día 4 como para el día 7. Cuatro de cinco aves
vacunadas con el S-HVT-003 fueron
positivas para el HVT el cuarto día tanto para los pases primero
como segundo. Un ave no produjo virus, esto puede representar un
fallo de la vacunación. Cinco de cinco aves fueron positivas para
el HVT el día séptimo en ambos pases 1 y 2. Globalmente, el
experimento de recuperación de vector demuestra que el
S-HVT-003 se replica, así como el
virus HVT de tipo natural in vivo y que la inserción del
casete IBDV/lacZ en el sitio XhoI de BamHI nº
16 no da como resultado una atenuación detectable del virus. Los
experimentos subsecuentes que examinan el virus recuperado del
Escrutinio bluogal para herpesvirus recombinantes confirmaron que
la estabilidad in vivo del
S-HVT-003, demostrando la expresión
\beta-galactosidasa en 100% de los virus.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\vskip1.000000\baselineskip
En los días 0, 4, 7, 14, 21 y 27 después de la
infección, se obtuvieron muestras de sangre del resto de los pollos
para determinar los títulos de ELISA en suero contra de antígenos
del BDV y HVT, así como respecto a ensayos neutralizantes del virus
contra el IBDV. Adicionalmente, 21 días después de la
post-infección cinco pollos de control y 14 pollos
vacunados se inocularon con el IBDV virulento mediante una gota
bilateral para ojos (10^{3,8}DIH_{50}) (DIH50 = dosis que
infecta e 50% de los huevos). Todas las aves se sacrificaron seis
días después de la inoculación y se calcularon las relaciones peso
de bolsa aviar/peso corporal. Un resumen de los resultados se
muestra en las Tablas 3 y 4, respectivamente. Como se presenta en la
Tabla 3, no se detectaron anticuerpos contra los antígenos del HVT
por ELISA antes de los días 21-27 después de la
vacunación. En los pollos, la respuesta inmune durante las primeras
dos semanas después de la puesta es tanto inmadura como suprimida
parentalmente y, por tanto, estos resultados no son totalmente
inesperados. En contraste, los ensayos ELISA del IBDV eran
negativos hasta 21 días después de la vacunación, y fueron solo
detectables después de la inoculación el día 27. Los niveles de
ELISA vistos el día 27 después de la vacunación indican una
respuesta primaria al IBDV. La Tabla 4 que compara las relaciones
aves se sacrificaron seis días después de la inoculación y se
calcularon las relaciones peso de bolsa aviar/peso corporal para los
controles inoculados y los grupos vacunados/inoculados no mostró
diferencias significativas. La vacunación con
S-HVT-003 bajo estas condiciones no
evitó la infección de las aves vacunadas mediante la inoculación
del IBDV como se indicó por la muerte de cuatro aves vacunadas
después de la inoculación.
Los títulos de ELISA son valores de la media
geométrica (abreviadamente en lo sucesivo GMT por la expresión
inglesa Geometric Mean Titer) y varían de
0-9.
Los valores son valores medios. Los pesos
corporales son diferentes en el grupo de control debido a que las
aves inoculadas no se alimentaron bien. Murieron cuatro aves
tratadas e inoculadas.
Se llevó a cabo un tercer experimento repitiendo
el experimento 2 pero usando pollos inmunológicamente sensibles (3
semanas de edad). Seis pollos de tres semanas se vacunaron
intraperitonealmente con 0,2 ml de
S-HVT-003 (una gota en cada ojo).
Las muestras de suero se obtuvieron cada siete días durante seis
semanas y las aves se inocularon con el virus IBDV de inóculo
estándar USDA virulento en el día 43 después de la vacunación. Seis
días después de la inoculación, los grupos de control,
vacunado-inoculado, e inoculado se sacrificaron y
las bolsas se recogieron para sondar con anticuerpos monoclonales
(MAB) anti-IBDV (proporcionados por el Dr. David
Snyder, del Virginia-Maryland Regional Collage of
Veterinary Medicine). Los homogeneizados bursales se prepararon
mezclando 1 mL de NP40 al 0,5% con una bolsa aviar. Las bolsas
aviares se molieron luego y se trataron con ultrasonidos
brevemente. Los líquidos sobrenadantes de los homogeneizados se
hicieron reaccionar con el MAB R63 que se había fijado a las placas
de Petri ELISA de 96 pocillos a través de una unión por proteína A.
Después de la incubación se añadió una preparación marcada con
biotina del MAB R63se. Después del lavado se añadió un conjugado de
avidina-peroxidasa de rábano silvestre y se
incubaron. Los ensayos se desarrollaron con tampón
Tris-maleato (TMB) + sustrato H_{2}O_{2}. Los
resultados de los ensayos se recogen en la Tabla 5. Los datos
muestran la presencia de niveles altos de antígeno de IBDV en toda
la bolsa aviar en el grupo vacunado/inoculado y en el grupo
inoculado. No se detectó un antígeno IBDV en los controles. El
antígeno específico de IBDV no pudo ser detectado en las diluciones
de más de 1/1000, y no parece haber diferencias entre los grupos
vacunados y no vacunados inoculados. Los títulos de HVT como se
determinaron mediante ELISA fueron primeramente detectables en el
día 7 en cuatro de seis aves vacunadas. En el día 14, seis de seis
aves vacunadas mostraron títulos de HVT. Todas las seis aves
continuaron mostrando títulos de HVT a través del experimento. No
se apreciaron título de IBDV antes de la inoculación. En contraste,
el análisis de estas mismas muestras de suero por el procedimiento
de transferencia Western demostró la seroconversión de los pollos
vacunados con S-HVT-003 a IBDV
antes de la administración del inóculo de virus. El nivel de
respuesta, sin embargo, sigue siendo pequeño por la inoculación. La
comparación entre los grupos vacunados/inoculados e inoculados
solamente demuestra claramente el nivel de reacción mediante las
transferencias Western que es mucho mayor en el grupo
vacunado/inoculado. Estos resultados muestran que el
S-HVT-003 está seroconvertido en
aves vacunadas con IBDV, y sugiere que el nivel de expresión
específica del IBDV no es suficientemente alto para inducir una
respuesta de neutralización en las aves.
El S-HVT-003
muestra el mérito del método de vacunación que los solicitantes han
inventado. El HVT se ha diseñado para expresar simultáneamente los
antígenos extraños (de \beta-galactosidasa y los
antígenos de IBDV) que son reconocidos por el hospedante por una
respuesta inmune dirigida a estas proteínas.
El S-HVT-004 es
un herpesvirus recombinante de pavos que contiene el gen de la
glicoproteína (gA) del virus de enfermedad de Marek (MDV) insertado
en la región única larga, y el gen de
\beta-galactosidasa lacZ de E. coli
también insertado en la región única larga. Es más probable que el
antígeno del MDV desencadene la respuesta antigénica adecuada que
el antígeno equivalente del HVT.
El gen gA del MDV (SEQ ID NO: 8 y 9) se clonó
mediante procedimientos estándares de clonación del gen gA de DNA.
Se ha descrito un fragmento de restricción EcoRI que contiene
el gen gA del MDV (Isfort et al., 1984) y este fragmento se
identificó por tamaños en los clones de DNA. La región del DNA
descrita que contiene el gen gA se secuenció por los solicitantes y
se encontró que como se esperaba contenía un gen de glicoproteína.
El DNA de este gen se usó para encontrar el gen correspondiente en
el HVT por el Método de transferencia de southern de DNA, y en el
HVT se identificó un gen que contenía una secuencia muy similar.
Este gen es el mismo gen previamente llamado gA (Isfort et
al., 1984).
Para la inserción en el genoma del HVT, el gen
gA del MDV se usó intacto debido a que tendría ya buenas secuencias
de señal de herpesvirus. El gen lacZ se insertó en el
fragmento XhoI en el fragmento BamHI nº 16, y el gen
gA del MDV se insertó detrás del lacZ como se muestra en las
Figuras 6A y 6B. Las regiones flanqueantes en el BamHI nº 16
se usaron para la recombinación de homólogos. El DNA del HVT y el
DNA plasmídico se co-transfectaron de acuerdo con
el Método de transfección de DNA para generar herpesvirus
recombinantes en células fibroblastos primarios de embrión de pollo
(CEF). El virus de la reserva (stock) de transfección se purificó
mediante purificaciones sucesivas de placas usando el Método de
escrutinio bluogal para herpesvirus recombinantes. Al final de este
procedimiento cuando 100% de las placas eran azules, el DNA se
analizó respecto a la presencia del gen gA del MDV. El
S-HVT-004 es un virus recombinante
que contiene tanto el gen de \beta-galactosidasa y
el gen gA del MDV incorporados en su genoma.
La Figura 6C muestra la estructura de
S-HV0-004.
El virus de la enfermedad de Newcastle (NDV)
está estrechamente relacionado con PI-3 en la
estructura global. Los genes de hemaglutinina (HN) y los genes de
fusión (F) de PI-3 se manipularon por ingeniería
genética para la expresión en el virus de la rinotraqueitis
infecciosa bovina (abreviadamente en lo sucesivo IBR por la
expresión inglesa Infectious Bovine Rhinotracheitis (ref)).
Similarmente los genes de hemaglutinina (HN) y de fusión (F) se
clonaron en el NDV para usarse en el sistema de administración de
herpesvirus (herpesvirus de pavos, HVT).
El método que se utilizó para la construcción de
las secuencias de control de herpesvirus se ha aplicado al NDV.
El virus de la bronquitis infecciosa (IBV) es un
virus de pollos relacionado estrechamente con la estructura global
del virus de la gastroenteritis transmisible (abreviadamente en lo
sucesivo TGE por la expresión inglesa Transmissible
GastroEnteritis). El antígeno neutralizante principal del virus
de la TGE se manipuló por ingeniería genética para la expresión en
el PRV (ref). Similarmente los antígenos neutralizantes principales
se clonaron a partir de tres cepas del IBV: Massachusetts (SEQ ID
NO: 14 y 15), Connecticut (SEQ ID NO: 18 y 18) y
Arkansas-99 (SEQ ID NO: 16 y 17) para usarse en
el sistema de administración de herpesvirus (HVT).
Los procedimientos que se utilizaron para la
construcción de las secuencias de control de herpesvirus para la
expresión se han aplicado al IBV.
S-HVT-045 es un
herpesvirus recombinante de pavos que contiene el gen (gB) de la
glicoproteína gB del virus de la enfermedad de Marek (MDV)
insertado en una región única corta. Es más probable que el antígeno
del MDV desencadene la respuesta antígénica apropiada que el
antígeno equivalente del HVT. El
S-HVT-045 ha sido depositado el 15
de octubre de 1992 de acuerdo con el Tratado de Budapest en el
International Depository of Microorganisms for the Purpose of
Patent Procedure with the Patent Culture Depository of the American
Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville,
Maryland 20852, USA bajo el número de acceso ATTC VR. 2383.
El gen gB del MDV se clonó por técnicas
estándares de DNA recombinantes. El gen del MDV se localizó a 3,9
KB del fragmento EcoRI-SalI usando una sonda
oligonucleotídica basada en la secuencia gB del HSV en una región
que se encontró conservada entre los genes gB conocidos de
herpesvirus. El mapa de restricción del fragmento de restricción
EcoRI-SalI de 3,9 KB es similar al mapa publicado
(Ross et al., 1989).
Para la inserción en el genoma del HVT, el gen
gB del MDV se usó intacto porque ya tendría buenas secuencias de
señas de herpesvirus. El gen gB del MDV gB se insertó en un
fragmento BamHI-EcoRI de 17,15 KB derivado del
fragmento BamHI nº 1 del HVT. El sitio usado para la
inserción fue el sitio StuI en el gen US2 del HVT,
previamente utilizado para la construcción del
S-HVT-012. El sitio se alteró
inicialmente mediante la inserción de un enlazador HindIII
único, y el gen gB del MDV se insertó mediante métodos estándares de
clonación de DNA. Las regiones flanqueantes en el fragmento
BamHI-EcoRI de 17,15 KB se usaron, junto con los
fragmentos del HVT clonados restantes usando el Método para generar
herpesvirus recombinantes a partir de fragmentos subgenómicos
solapantes. El virus obtenido de la reserva (stock) de
transfección se purificó en placas y el DNA se analizó respecto a
la presencia del gen gB del MDV. El
S-HVT-045 es un virus recombinante
que contiene el gen gB del MDV incorporado en el genoma en el sitio
StuI del gen US2 del HVT.
Se llevaron a cabo dos estudios para demostrar
la eficacia de estos virus HVT/MDV recombinantes para proteger
contra la inoculación con virus virulento de la enfermedad de Marek.
En el estudio A, los pollos libres de agentes patógenos específicos
(abreviadamente SPF por la expresión inglesa specific pathogen
free) se vacunaron bien sea con el
S-HVT-045 ó bien sea el
S-HVT-046. Siete días después de la
vacunación, los pollos vacunados y los pollos de control se
inocularon con una cepa MD-5 altamente virulenta del
virus de la enfermedad de Marek. Después de un periodo de
observación después de 6 semanas de la inoculación respecto a signos
clínicos típicos de la enfermedad de Marek, a todos los pollos se
les realizó la autopsia y se examinaron respecto a un diagnóstico
de lesiones de la enfermedad de Marek. Los resultados de la Tabla 6,
muestran que ambos virus recombinantes dieron una protección
completa contra la inoculación que causaba la enfermedad de Marek en
90% de los pollos de control no vacunados.
En un segundo estudio, los pollos de un día se
vacunaron bien sea con S-HVT-045 o
bien sea con S-HVT-047. Un tercer
grupo de pollos se vacunó con la vacuna convencional con licencia de
USDA compuesta de virus HVT y SB-1. Cinco días
después de la vacunación, los pollos vacunados y un grupo de pollos
de control no vacunados se inocularon con el virus virulento de
Marek, cepa RB1B. Los pollos se observaron durante 8 semanas
respecto a signos clínicos de la enfermedad de Marek, después se
les hizo la autopsia y se observaron las lesiones de Marek. Este
estudio demostró la capacidad del HVT-045 y del
HVT-047 de proporcionar 100% de protección contra
la inoculación (Tabla 1). La vacuna comercial dio una protección de
96%, y 79% de los pollos no vacunados desarrollaron la enfermedad
de Marek.
El S-HVT-012 es
un herpesvirus recombinante de pavos que contiene el gen de la
\beta-galactosidasa (lacZ) insertado en la
región única corta. El gen lacZ se usó para determinar la
viabilidad de este sitio de inserción en el HVT [ATCC
F-126 ("Calnek")]. El
S-HVT-012 ha sido depositado el 15
de octubre de 1992 de acuerdo con el Tratado de Budapest en el
International Depository of Microorganisms for the Purpose of
Patent Procedure with the Patent Culture Depository of the American
Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville,
Maryland 20852, USA bajo el número de acceso ATTC VR. 2382.
Para la inserción en el genoma del HVT, el gen
de \beta-galactosidasa se introdujo en el sitio
StuI único del fragmento clonado EcoRI nº 7 del HVT,
es decir, el fragmento que contenía el sitio StuI dentro del
gen US2 del HVT (como se describe en el apartado Materiales y
Métodos). Las regiones flanqueantes del fragmento EcoRI nº 7
se usaron para la recombinación homóloga. El DNA del HVT y el DNA
del plásmido se co-transfectaron de acuerdo con el
Método de transfección de DNA para generar virus combinantes en
células fibroblastos primarias de embriones de pollos (CEF). Se
obtuvo un virus azul obtenido de la reserva (stock) de
transfección por sucesivas etapas de purificaciones en placas
usando el método de Escrutinio bluogal para herpesvirus
recombinantes. Al final de este método, cuando el 100% de las
placas eran azules, el DNA se analizó en cuanto a la presencia del
gen lacZ. El S-HVT-012 es un
virus recombinante que contiene el gen lacZ incorporado en su
genoma en el sitio StuI dentro del gen US2 del
HVT.
HVT.
El S-HVT-012 se
puede formular como una vacuna del mismo modo que el
S-HVT-045. Cuando se administra a
pollos, y dicha vacuna proporciona protección contra el virus de la
enfermedad de Marek.
Para definir los sitios de inserción apropiados,
se generó una genoteca de fragmentos de restricción BamHI y
EcoRI del HVT. Varios de estos fragmentos de restricción
(fragmentos BamHI nº 16 y nº 13, y los fragmentos
EcoRI nº 6, nº 7, y nº 9 (véase la Figura 1)) se sometieron a
análisis por cartografía de restricción. Se identificó un sitio de
restricción único en cada fragmento como un sitio de inserción
potencial. Estos sitios incluían XhoII en los fragmentos
BamHI nº 13 y nº 16, y el fragmento EcoRI nº 9 y
SalI en el fragmento EcoRI nº 6 y StuI en el
fragmento EcoRI nº 7. Se insertó un gen marcador de
\beta-galactosidasa (lacZ) en cada uno de
los sitios potenciales. Puede usarse un plásmido que contenía dicho
inserto de DNA extraño de acuerdo con Cotransfección de DNA para
generar herpesvirus recombinantes para construir un HVT que contiene
el DNA extraño. Para que este método sea útil es importante que el
sitio de inserción esté en una región no esencial para la
replicación del HVT y que el sitio esté flanqueado por DNA del HVT
apropiado para mediar la recombinación homóloga entre DNA de virus
y plásmidos. Se utilizarán plásmidos que contienen el gen marcador
lacZ en la Cotransfección de DNA para generar herpesvirus
recombinantes. La generación de virus recombinantes se determinó
por Esrutinio bluogal para herpesvirus recombinantes. Tres de los
cinco sitios activos se usaron satisfactoriamente para generar un
virus recombinante. En cada caso el virus resultante se purificó
esencialmente hasta 100%, definiendo claramente un sitio apropiado
para la inserción de DNA extraño. Los tres vectores de homología
usados para definir estos sitios se describen más adelante.
Ejemplo
7A
El vector de homología 172-29.31
contiene el fragmento BamHI nº 16 del HVT y es útil para la
inserción de DNA extraño en el HVT. El plásmido
172-29.31 contiene un sitio de restricción
XhoI único en el cual puede clonarse el DNA extraño. El
sitio XhoI en el vector de homología
172-29.31 se puede usar para insertar DNA extraño
en el HVT por la construcción de al menos tres HTV recombinantes
(véanse los Ejemplos 1-3).
El vector de homología 172-29.31
se caracterizó además por análisis de secuenciación de DNA. Se
determinaron las secuencias completas del fragmento BamHI nº
16. También se determinaron aproximadamente 2092 pares de bases del
fragmento adyacente BamHI nº 13 (véase la SEQ ID NO: 3).
Esta secuencia indica que el marco de lectura abierto que codifica
la glicoproteína A (gA) del HVT se extiende a la unión BamHI
nº 16 - BamHI nº 13. El gen gA del HVT es el homólogo a la
glicoproteína C (gC) del HSV-1. Este sitio
XhoI interrumpe un ORF que está directamente aguas arriba
(hacia el extremo 5') del gen gA del HVT. Este ORF muestra la
homología de secuencia de aminoácidos con el p43 del PRV y el gen
15 del virus de la varicela-zoster (abreviadamente
en lo sucesivo VZV por la expresión inglesa
Varicella-Zoster Virus) Los genes del PRV y
del VZV son los homólogos de UL43 del HSV-1. Por
tanto este ORF se denominó UL43 del HVT (SEQ ID NO: 5). Deberá
advertirse que el UL43 del HVT no exhibe una homología directa con
el UL43 del HSV-1. Aún cuando el UL43 del HVT está
localizado aguas arriba (hacia el extremo 5') del gC homólogo del
HVT está codificado en la misma cadena de DNA que el gA del HVT, en
donde como el UL43 del HSV-1 está en la cadena
opuesta respecto a gC del HSV-1. El sitio
XhoI interrumpe el UL43 en aproximadamente el aminoácido 6
lo que sugiere que el gen UL43 no es esencial para la replicación
del HVT.
Ejemplo
7B
El vector de homología
435-47.R17 contiene el fragmento EcoRI de HVT
nº 7 y es útil para la inserción del DNA extraño en el HVT. El
plásmido 435-47.R17 contiene un sitio de restricción
HindIII único en el cual puede ser clonado el DNA extraño.
El sitio de restricción HindIII en el plásmido resulta de la
inserción del enlazador HindIII en el sitio StuI que
ocurre naturalmente del fragmento EcoRI nº 7. El sitio
HindIII en el vector de homología 435-47.R17
puede ser usado para insertar el DNA extraño en el HVT mediante la
construcción de por lo menos 25 recombinantes del HVT.
El análisis de secuencias de DNA en el
StuI indicó que este fragmento contiene marcos de lectura
abiertos que codifican US10, US2 y US3. El sitio StuI
interrumpe el US2 en aproximadamente el aminoácido 124, lo que
sugiere que el gen US2 no es esencial para la replicación del
HVT.
Ejemplo
7C
El vector de homología 172-63.1
contiene el fragmento EcoRI nº 9 del HVT y es útil para la
inserción del DNA extraño en el HVT. El plásmido
172-63.1 contiene un sitio de restricción
XhoI único en el cual puede ser clonado el DNA extraño. El
sitio XhoI de un vector de homología 172-63.1
puede ser usado para insertar el DNA extraño en el HVT mediante la
construcción del S-HVT-014 (Véase el
Ejemplo 8).
El S-HVT-014 es
un herpesvirus recombinante de pavos que contiene el gen de
\beta-galactosidasa de E. coli
(lacZ) insertado en la región única larga. El gen lacZ
se usó para determinar la viabilidad de este sitio de inserción en
el HVT [ATCC F-126 ("Calnek")].
Para la inserción en el genoma del HVT, el gen
de \beta-galactosidasa se introdujo en el sitio
XhoI único del fragmento EcoRI nº 9 clonado (como se
describió en el apartado Materiales y Métodos). El sitio XhoI
en el fragmento EcoRI nº 9 del genoma del HVT es el mismo
sitio que el sitio XhoI en el fragmento BamHI nº 10
usado para la construcción de herpesvirus recombinante de pavos
descrito en los Ejemplos 16 a 19. Las regiones flanqueantes del
fragmento EcoRI nº 9 se usaron para la recombinación de
homólogo. El DNA del HVT y el DNA de plásmido se
co-transfectaron de acuerdo con el procedimiento de
Transfección de DNA para generar virus recombinantes en células
fibroblastos de embrión de pollo primarios (CEF). Se purificó un
virus azul obtenido de la reserva (stock) de transfección
mediante sucesivas purificaciones en placas usando el procedimiento
de Escrutinio bluogal para herpesvirus recombinantes. Al final de
este procedimiento 100% de las placas eran azules. El
S-HVT-014 es un virus recombinante
que contiene el gen lacZ incorporado en su genoma en el sitio
XhoI en el fragmento EcoRI nº 9 del HVT.
El S-HVT-014
puede ser formulado como una vacuna de la misma manera que el
S-HVT-045. Cuando se administra a
pollos, dicha vacuna proporciona protección contra el virus de la
enfermedad de Marek.
El S-HVT-005 es
un herpesvirus recombinante de pavos que contiene el gen de
\beta-galactosidasa de E. coli
(lacZ) insertado en la región única larga. El gen lacZ
se usó para determinar la viabilidad de este sitio de inserción en
el HVT [ATCC F-126 ("Calnek")].
Para la inserción en el genoma del HVT, el gen
de \beta-galactosidasa se introdujo en una
deleción (supresión) de aproximadamente 1300 pares de bases del
fragmento nº 9 XhoI del HVT. La deleción que cae entre los
sitios MluI y EcoRI únicos retira la región
codificadora completa del gen gA del HVT (véase la SEQ ID NO: 3).
Las regiones flanqueantes XhoI del fragmento EcoRI nº
9 se usaron para la recombinación de homólogos. El DNA del HVT y el
DNA del plásmido se co-transfectaron de acuerdo con
el Método de transfección de DNA para generar virus recombinantes
en células fibroblastos de embrión de pollo primarios (CEF). Se
purificó mediante purificaciones sucesivas en placas un virus azul
obtenido de la reserva (stock) de transfección usando el
Escrutinio bluogal para herpesvirus recombinantes. Al final de este
procedimiento, cuando 100% de las placas eran azules, se analizó el
DNA respecto a la presencia del gen lacZ. El
S-HVT-005 es un virus recombinante
que contiene el gen lacZ incorporado en el genoma en el
lugar de la deleción del gen gA delecionado (suprimido) del HVT.
El S-HVT-005
puede ser formulado como una vacuna en la misma forma que el
S-HVT-045. Cuando se administra a
pollos, dicha vacuna proporciona protección contra de la enfermedad
de Marek.
El HVT recombinante que expresa glicoproteínas
del virus de la enfermedad de Marek proporciona vacunas superiores
para la enfermedad de Marek. Nosotros hemos construido varios HVT
recombinantes que expresan glicoproteínas del MDV:
S-HVT-0:4 (Ejemplo 3),
S-HVT-045 (Ejemplo 5),
S-HVT-046 (Ejemplo 10A),
S-HVT-047 (Ejemplo 10B),
S-HVT-062 (Ejemplo 10C).
Ejemplo
10A
El S-HVT-046 es
un herpesvirus recombinante de pavos que contiene los genes de la
glicoproteína B (gB) del virus de la enfermedad de Marek (MDV) y de
la glicoproteína A (gA) insertados en la región única corta. Los
genes del MDV están insertados en la misma orientación
transcripcional que el gen US2. Es más probable que los antígenos
del MDV desencadenen la respuesta antigénica adecuada que el
antígeno equivalente del HVT.
El S-HVT-046 se
construyó de acuerdo con el Método para generar herpesvirus
recombinantes a partir de fragmentos de DNA subgenómicos. Se usaron
las siguientes combinaciones de clones subgenómicos y enzimas:
407-32.2C3 con NotI,
172-07.BA2 con BamHI,
407-32.5G6 con NotI,
407-32.1C1 con NotI,
437-26.24 con BamHI y HindIII,
437-26.26 con BamHI y HindIII, y
456-17.22 sin corte. La inserción del DNA apropiado
se confirmó mediante un análisis de transferencia Southern.
Ejemplo
10B
El S-HVT-047 es
un herpesvirus recombinante de pavos que contiene los genes gB y gA
del MDV insertados en la región única corta. Los genes del MDV
están insertados en la orientación transcripcional opuesta como el
gen US2. Es más probable que los antígenos del MDV desencadenen la
respuesta antigénica adecuada que el antigénico equivalente del
HVT.
El S-HVT-047 se
construyó de acuerdo con el Método para generar herpesvirus
recombinantes a partir de fragmentos de DNA subgenómicos. Se uso la
siguiente combinación de clones subgenómicos y enzimas:
407-32.2C3 con NotI,
172-07.BA2 con BamHI,
407-32.5G6 con NotI,
407-32.1C1 con NotI,
437-26.24 con BamHI y HindIII,
437-26.26 con BamHI y HindIII, y
456-17.18 sin corte. La inserción del DNA apropiado
se confirmó mediante un análisis de transferencia Southern.
Ejemplo
10C
El S-HVT-062 es
un herpesvirus recombinante de pavos que contiene el gen gB del MDV,
los genes de las glicoproteínas D (gD) y gA insertados en la región
única corta. Los genes del MDV están insertados en la orientación
transcripcional como el gen US2. Es más probable que los antígenos
del MDV desencadenen la respuesta antigénica adecuada que el
antígeno equivalente del HVT. El
S-HVT-062 ha sido depositado el 23
de Febrero de 1993 de acuerdo con el Tratado de Budapest en el
International Depository of Microorganisms for the Purpose of
Patent Procedure with the Patent Culture Depository of the American
Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville,
Maryland 20852, USA bajo el número de acceso ATTC VR. 2401.
El S-HVT-062 se
construyó de acuerdo con el Método para generar herpesvirus
recombinantes a partir de fragmentos de DNA subgenómicos. Se usaron
las siguientes combinaciones de clones subgenómicos y enzimas:
407-32.2C3 con NotI,
172-07.BA2 con BamHI, 40732.5G6 con
NotI, 407-32.1C1 con NotI,
437-26.24 con BamHI y HindIII,
556-60.6 con BamHI y HindIII, y
456-17.22 sin corte. La inserción del DNA apropiado
se confirmó mediante análisis por transferencia Southern.
Se llevaron a cabo dos estudios para demostrar
la eficacia de los virus HVT/MDV recombinantes para proteger contra
la inoculación con un virus virulento de la enfermedad de Marek. En
el Estudio 1, los polluelos libres de agentes patógenos específico
(SPF) de un día se vacunaron con bien sea el
S-HVT-045, el
S-HVT-046 o el
S-HVT-047. Cinco días después de la
vacunación, los polluelos vacunados y los polluelos de control no
vacunados se inocularon con el MDV. Después de 6 semanas de la
inoculación de periodo de observación para signos clínicos típicos
de la enfermedad de Marek, todos los pollos se sometieron a autopsia
y se examinaron para el diagnóstico de lesiones de la enfermedad de
Marek. Los resultados recogidos en la Tabla 7 muestran que estos
virus recombinantes dan una protección completa contra la
inoculación del virus que causa la enfermedad de Marek en 84% de los
pollos de control no
vacunados.
vacunados.
En el segundo estudio, los pollos de un día se
vacunaron con el S-HVT-062. Dos
grupos más de pollos se vacunaron con las vacunas convencionales
adquiridas con licencia de USDA compuestas de HVT y una combinación
de los virus HVT y SB-1. Cinco días después de la
vacunación, los pollos vacunados y el grupo de pollos de control no
vacunados se inocularon con el MDV. Los pollos se observaron durante
8 semanas respecto a signos clínicos de la enfermedad de Marek, y
luego se sometieron a autopsia y se observaron respecto a lesiones
de la enfermedad de Marek. Este estudio demostró la capacidad del
S-HVT-062 para proporcionar 100% de
protección contra la inoculación (Tabla 7). Las vacunas comerciales
dieron 81% y 95% de protección, respectivamente y 100% de los
pollos no vacunados desarrollaron la enfermedad de Marek.
\vskip1.000000\baselineskip
Un HVT recombinante que expresa las proteínas
del NDV produce vacunas bivalentes que protegen tanto contra la
enfermedad de Marek como la enfermedad de Newcastle. Se construyeron
varios HVT recombinantes que expresan las proteínas del NDV, a
saber: S-HVT-007 (Ejemplo 11A),
S-HVT-048 (Ejemplo 11B),
SI-IVT-049 (Ejemplo 11C),
S-HVT-050 (Ejemplo 11D), y
S-HVT-106 (Ejemplo. 11E).
Ejemplo
11A
El S-HVT-007 es
un herpesvirus recombinante de pavos que contiene un gen de proteína
híbrida lacZ de E. coli-HN del NDV bajo el control
del promotor gX del PRV gX y el gen F del NDV bajo el control del
promotor HSV-1 a4 insertado en la región única
larga. Los genes del NDV están insertados en la misma orientación
transcripcional que el gen UL43.
Para construir el
S-HVT-007, el DNA del HVT y el
plásmido 255-18.B16 se cotransfectaron de acuerdo
con el procedimiento de Transfección de DNA para generar virus
recombinantes en células fibroblastos de embrión de pollos
primarios (CEF). Por sucesivas purificaciones de placas se purificó
un virus azul obtenido de la reserva (stock) de transfección
usando el método de Escrutinio bluogal para herpesvirus
recombinantes. Al final de este procedimiento el 100% de las placas
eran azules.
Ejemplo
11B
El S-HVT-048 es
un herpesvirus recombinante de pavos que contienen los genes gB y gA
del MDV y el gen F del MDV bajo el control promotor temprano
inmediato del HCMV insertado en la región única corta. Los genes de
MDV y NDV están insertados en la misma orientación transcripcional
que el gen US2.
El S-HVT-048 se
construyó de acuerdo con el Método para generar herpesvirus
recombinantes a partir de fragmentos de DNA subgenómicos. Se usaron
las siguientes combinaciones de clones subgenómicos y enzimas:
407-32.2C3 con NotI,
172-07.BA2 con BamHI,
407-32.5G6 con NotI,
407-32.1C1 con NotI,
437-26.24 con BamHI y HindIII,
437-26.26 con BamHI y HindIII, y
535-70.3 sin corte. La inserción del DNA apropiado
se confirmó por análisis de transferencia Southern.
Ejemplo
11C
El S-HVT-049 es
un herpesvirus recombinante de pavos que contiene los genes gB y gA
del MDV y el gen HN del NDV bajo el control del promotor gX del PRV
insertado en la región única corta. Los genes de MDV y NDV están
insertados en la misma orientación transcripcional que el gen
US2.
El S-HVT-049 se
construyó de acuerdo con el Método para generar herpesvirus
recombinantes a partir de fragmentos de DNA subgenómicos. Se usaron
las siguientes combinaciones de clones subgenómicos y enzimas:
407-32.2C3 con NotI,
172-07.BA2 con BamHI,
407-32.5G6 con NotI,
407-32.1C1 con NotI,
437-26.24 con BamHI y HindIII,
437-26.26 con BamHI y HindIII y
54.9-62.10 sin corte. La inserción del DNA apropiado
se confirmó por análisis de transferencia Southern.
Ejemplo
11D
El S-HVT-050 es
un herpesvirus recombinante de pavos que contiene los genes gB y gA
del MDV y el gen HN (SEQ ID NO: 10 y 11) y los genes F (SEQ ID NO:
12 y 13) del NDV. Los genes de NDV están bajo el control de los
promotores gX de PRV y le inmediato del HCMV respectivamente. Todos
los cuatro genes están insertados en la región única corta en la
misma orientación transcripcional que el gen US2.
El S-HVT-050 se
construyó de acuerdo con el Método para generar herpesvirus
recombinantes a partir de fragmentos subgenómicos de DNA. Se usaron
las siguientes combinaciones de clones subgenómicos y enzimas:
407-32.2C3 con NotI,
172-07.BA2 con BamHI,
407-32.5G6 con NotI,
407-32.1C1 con NotI,
437-26.24 con BamHI y HindIII,
437-26.26 con BamHI y HindIII, y
549-24.15 sin corte. La inserción del DNA apropiado
se confirmó mediante análisis de transferencia Southern. El
S-HVT-050 ha sido depositado el 23
de febrero de 1993 de acuerdo con el Tratado de Budapest en el
International Depository of Microorganisms for the Purpose of
Patent Procedure with the Patent Culture Depository of the American
Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville,
Maryland 20852, USA bajo el número de acceso ATTC VR. 2400.
Ejemplo
11E
El S-HVT-106 es
un herpesvirus recombinante de pavos que contiene los genes gA, gB,
gD del MDV y los genes HN y F del NDV. Los genes de NDV están bajo
el control de los promotores gX del PRV e inmediato del HCMV
respectivamente. Todos los cinco genes están insertados en la
región única corta en la misma orientación transcripcional que el
gen US2.
El S-HVT-106 se
construyó de acuerdo con el Método para generar el herpesvirus
recombinantes a partir de fragmentos de DNA subgenómicos. Se usaron
las siguientes combinaciones de clones subgenómicos y enzimas:
407-32.2C3 con NotI,
172-07.BA2 con BamHI,
407-32.5G6 con NotI,
407-32.1C1 con NotI,
437-26.24 con BamHI y HindIII,
437-26.26 con BamHI y HindIII y
633-13.27 sin corte.
Se llevaron a cabo dos estudios para demostrar
la eficacia de estos virus HVT/MDV/NDV recombinantes para proteger
contra la inoculación con virus virulentos de la enfermedad de Marek
y Newcastle. En el Estudio 1, los pollos libres de agente patógeno
específico (SPF) de un día se vacunaron con bien sea el
S-HVT-048, el
S-HVT-049, el
S-HVT-050 o una vacuna convencional
con licencia de USDA compuesta de virus NZV B1/B1. Tres semanas
después de la vacunación, los pollos vacunados y los pollos de
control no vacunados se inocularon con NDV. Las aves se observaron
luego respecto a signos clínicos de la enfermedad. Los resultados,
de la Tabla 8, muestran que esto virus recombinantes
(S-HVT-048 y
S-HVT-050) dieron una protección
completa contra la inoculación que causó la enfermedad de Newcastle
en 100% de los pollos de control no vacunados. El virus recombinante
S-HVT-049 dio una protección
parcial contra de la enfermedad de Newcastle.
En el segundo estudio, los pollos de un día se
vacunaron con S-HVT-050. Dos grupos
más de pollos se vacunaron con las vacunas convencionales con
licencia de USDA compuesta de HVT y una combinación de virus de HVT
y SB-1. Cinco días después de la vacunación, los
pollos vacunados y un grupo de pollos de control no vacunados se
inocularon con el MDV. Los pollos se observaron durante ocho semanas
respecto a signos clínicos de la enfermedad de Marek, y luego se
les hizo la autopsia y se observaron las lesiones de Marek. Este
estudio demostró la capacidad del
S-HVT-050 para proporcionar una
protección mayor que las vacunas comerciales de la enfermedad
de
Marek.
Marek.
\vskip1.000000\baselineskip
Un HVT recombinante que expresa glicoproteínas
del virus ILT produjo vacunas bivalentes que protegen contra tanto
la enfermedad de Marek como la laringotraqueitis infecciosa. Se
obtuvieron varios HVT recombinantes que expresan glicoproteínas de
S-HVT-051 del ILTV (Ejemplo 12A),
S-HVT-052 (Ejemplo 12B) y
S-HVT-104 (Ejemplo 11C).
Ejemplo
12A
El S-HVT-051 es
un herpesvirus recombinante de pavos que contiene el gen gB del ILTV
insertado en la región única corta. El gen del ILTV está insertado
en la misma orientación transcripcional que el gen US2.
El S-HVT-051 se
construyó de acuerdo con el Método para generar herpesvirus
recombinantes a partir de fragmentos de DNA subgenómicos. Se usaron
las siguientes combinaciones de clones subgenómicos y enzimas:
407-32.2C3 con NotI,
172-07.BA2 con BamHI,
407-32.5G6 con NotI,
407-32.1C1 con NotI,
437-26.24 con BamHI y HindIII,
437-26.26 con BamHI y HindIII, y
528-11.34 sin corte. La inserción del DNA apropiado
se confirmó mediante el análisis de transferencia Southern.
Ejemplo
12B
El S-HVT-052 es
un herpesvirus recombinante de pavos que contiene el gen gD de ILTV
insertado en la región única corta. El gen del ILTV está insertado
en la orientación transcripcional opuesta al gen US2.
El S-HVT-052 se
construyó de acuerdo con el Método para generar herpesvirus
recombinantes a partir de fragmentos de DNA subgenómicos. Se usaron
las siguientes combinaciones de clones subgenómicos y enzimas:
407-32.2C3 con NotI,
172-07.BA2 con BamHI,
407-32.5G6 con NotI,
407-32.1C1 con NotI,
437-26.24 con BamHI y HindIII,
437-26.26 con BamHI y HindIII, y
528-03.37 sin corte. La inserción del DNA apropiado
se confirmó mediante análisis de transferencia Southern.
Ejemplo
12C
El S-HVT-104 es
un herpesvirus recombinante de pavos que contiene seis genes
extraños. Los genes gA, gB y gD del MDV están insertados en la
región corta única en la misma orientación transcripcional que el
gen US2. Un gen marcador lacZ de E. coli y los genes
gB y gD del ILTV están insertados insertados en la región
BamHI nº 16 en la misma orientación transcripcional que el
gen U14 3.
Para construir el
S-HVT-104, el DNA del
S-HVT-062 y el plásmido
634-29.16 se co-transfectaron de
acuerdo con el método de Transfección de DNA para generar virus
recombinantes en células fibroblastos de embrión de pollo primarios
(CEF).
El siguiente estudio se llevó a cabo para
demostrar la eficacia de estos HVT/ILTV recombinantes para proteger
contra la inoculación con el virus virulento de laringotraqueitis
infecciosa. Los pollos libres de agente patógeno específico (SPF)
de un día se vacunaron con bien sea el
S-HVT-051, el
S-HVT-052, una combinación del
S-HVT-051 o bien sea el
S-HVT-052, o una vacuna convencional
con licencia de USDA compuesta de ILTV. Dos a tres semanas después
de la vacunación, los pollos vacunados y los pollos de control no
vacunados se inocularon con el ILTV. Las aves se observaron luego
con respecto a los signos clínicos de la enfermedad. Los resultados
recogidos en la Tabla 9, muestran que estos virus recombinantes
(S-HVT-051 y
S-HVT-052) dieron una protección
contra el ILTV comparable con la vacuna ILTV comercial.
Los animales vacunados con las vacunas descritas
en la presente memoria pueden diferenciarse fácilmente de los
animales infectados con el ILTV virulento. Esto se logra mediante
analizando las aves sospechosas respecto a anticuerpos para
cualesquiera antígenos de ILTV distinto de gB o gD. Los ejemplos de
tales antígenos son las glicoproteínas C, E y G de ILTV. Las aves
no infectadas vacunadas serán negativas para estos antígenos
mientras que las aves infectadas serán positivas.
El HVT recombinante que expresa proteínas del
IBDV produce vacunas bivalentes que protegen contra tanto la
enfermedad de Marek como la enfermedad bursal infecciosa. Se
construyeron diversos HVT recombinantes que expresan proteínas del
IBDV. Estos virus incluyen el
S-HVT-003 (ejemplo 2) y el
S-HVT-096.
El S-HVT-096 es
un herpesvirus recombinante de pavos que contiene el gen VP2 del
IBDV, bajo el control del promotor temprano inmediato del HCMV,
insertado en la región única corta. El gen de IBDV está insertado en
la misma orientación transcripcional que el gen US2.
El S-HVT-096 se
construyó de acuerdo con el Método para generar herpesvirus
recombinantes a partir de fragmentos de DNA subgenómicos. Se usaron
las siguientes combinaciones de clones subgenómicos y enzimas:
407-32.2C3 con NotI,
172-07.BA2 con BamHI,
407-32.5G6 con NotI,
407-32.1C1 con NotI,
437-26.24 con BamHI y HindIII,
556-60.6 con BamHI y
602-57.F1 sin corte. La inserción del DNA apropiado
se confirmó mediante análisis de transferencia Southern.
El S-HVT-096 se
analizó para la expresión de VP2 mediante placas negras y análisis
de transferencia Western. Ambos ensayos indicaron que el virus
estaba expresando niveles altos de proteína que reaccionan
específicamente con un anticuerpo monoclonal neutralizante del
IBDV. Este virus será útil como una vacuna contra la enfermedad
bursal infecciosa.
El S-HVT-066 es
un herpesvirus recombinante de pavos que contiene los genes gB, gD y
gA del MDV y los genes clavo y matriz del IBV. Los genes clavo y
matriz IBV están bajo el control de los promotores temprano
inmediato y del HCMV y gX del PRV respectivamente. Todos los cinco
genes están insertados en la región única corta. Los genes del MDV
e IBV están insertados en la misma orientación transcripcíonal que
el gen US2.
El S-HVT-066 se
construyó de acuerdo con el Método para generar herpesvirus
recombinantes a partir de fragmentos de DNA subgenómicos. Se usaron
las siguientes combinaciones de clones subgenómicos y enzimas:
407-32.2C3 con NotI, 17207.BA2 con
BamHI, 407-32.5G6 con NotI,
407-32.1C1 con NotI, 43726.24 con
BamHI y HindIII, 556-60.6 con
BamHI, y 567-72.1D sin corte. La inserción
del DNA apropiado se confirmó mediante análisis de transferencia
Southern.
El S-HVT-066 se
analizó para la expresión de la proteína clavo del IBV mediante
placas negras y análisis de transferencia Western. Ambos análisis
indicaron que el virus estaba expresando altos niveles de proteína
que reaccionaron específicamente con el anticuerpo monoclonal
neutralizante del IBV. Estos virus serán útiles como vacuna contra
la bronquitis infecciosa.
Se anticipa que los antígenos de los siguientes
patógenos pueden ser utilizados para desarrollar vacunas para aves:
Virus de la anemia de pollos (agente), virus de la encefalomielitis
aviar, Reovirus aviar, Paramixovirus aviar, virus de la gripe
aviar, Adenovirus aviar, Virus de la viruela aviar, Coronavirus
aviar, Rotavirus aviar, Salmonella spp, E. coli.,
Pasteurella spp, Haemofilus spp, Clamidia spp, Mycoplasma spp,
Campilobacter spp, Bordetella spp, Nemátodos de aves, Céstodos,
Trematodos, ácaros de aves/piojos Protozoos de aves (Eimeria
spp, Histomonas spp, Trichomonas spp).
Se describen vacunas trivalentes contra la
laringotraqueitis infecciosa, la enfermedad de Marek y la enfermedad
de Newcastle y vacunas bivalentes contra laringotraqueitis
infecciosa y la enfermedad de Marek. La protección superior contra
la laringotraqueitis infecciosa se logra con una vacuna que combina
el S-HVT-123 (que expresa gB y gD
de ILTV) con el S-HVT-138, 139 o 143
(que expresan gD y gI del ILTV).
Ejemplo
16A
El S-HW-123 es
un herpesvirus recombinante de pavos que contiene los genes gB y gD
del ILTV insertados en un sitio XhoI convertidos en un sitio
NotI en el fragmento EcoRI nº 9 (BamHI nº 10)
del genoma del HVT (Figuras 13B y 15; (SEQ ID NO: 48). El
S-HVT-123 contiene además los genes
gA, gD y gB del MDV insertados en el sitio StuII único
convertido en el sitio HindIII en el gen
HVT-US2. Los genes del ILTV y los genes del MDV usan
cada uno sus propios promotores respectivos. El
S-HVT123 es útil como vacuna en aves en contra la
laringotraqueitis infecciosa y la enfermedad de Marek.
El S-HVT-123 se
construyó de acuerdo con el Método para generar herpesvirus
recombinantes a partir de fragmentos subgenómicos solapantes. Se
usaron las siguientes combinaciones de clones subgenómicos y
enzimas: 407-32.2C3 con NotI,
172-07.BA2 con BamHI,
407-32.5G6 con NotI,
672-07.C40 con NotI,
672-01.A40 con NotI,
721-38.1J sin corte, 729-37.1 con
AscI.
Ejemplo
16B
El S-HVT-138 es
un herpesvirus recombinante de pavos que contiene los genes gD y gI
del ILTV insertado en un sitio XhoI único convertido en el
sitio PacI en el fragmento EcoRI nº 9 (BamHI nº
10) del genoma del HVT (Figuras 13A y 15). Los genes gD y gI de
ILTV están en la orientación transcripcional opuesta al marco de
lectura abierto (ORP A) en el fragmento EcoRI nº 9
(BamHI nº 10) del genoma del HVT (Figura 14, (SEQ ID NO:
48, 58). Los genes gD y gI del ILTV están expresados como
transcritos solapantes de promotores del ILTV endógenos y comparten
su señal de poliadenilación endógena propia.
El S-HVT-138 es
útil como vacuna de pollos contra la laringotraqueitis infecciosa y
la enfermedad de Marek.
El S-HVT-138 se
construyó de acuerdo con el Método para generar herpesvirus
recombinantes a partir de fragmentos subgenómicos solapantes. Se
usaron las siguientes combinaciones de clones subgenómicos y
enzimas: 407-32.2C3 con NotI,
172-07.BA2 con BamHI,
407-32.5G6 con NotI,
672-07.C40 con NotI,
672-01.A40 con NotI,
711-92.1A sin corte, 415-09.BA1 con
BamHI.
Los sueros de pollos vacunados con
S-HVT-138 reaccionan con las
transferencias Western con la proteína gI de ILTV lo que indica que
la vacuna de S-HVT-138 expresó la
proteína de ILTV y produce una respuesta inmune en las aves. Los
pollos vacunados con S-HVT-138
estuvieron protegidos contra la inoculación del virus de la
virulento laringotraqueitis infecciosa.
Ejemplo
16C
El S-HVT-139 es
un herpesvirus recombinante de pavos que contiene los genes gD y gI
del ILTV insertados en un sitio XhoI único convertido en un
sitio PacI en el fragmento EcoRI nº 9 (BamHI
nº 10) del genoma del HVT. Los genes gD y gI de ILTV están en la
orientación transcripcional opuesta al marco de lectura abierto
(ORF A) en el fragmento EcoRI nº 9 (BamHI nº 10) del
genoma del HVT (Figuras 13A y 15; Secuencia ID NO: 48, 50). El
S-HVT-139 contiene además los genes
gA, gD y gB del MDV insertados en el sitio StuI único
convertido en un sitio HindIII en el gen US2 del HVT. Los
genes gD y gI del ILTV se expresan como transcritos solapantes de
sus propios promotores de ILTV endógenos respectivos, y los genes
del MDV también se expresan desde sus propios promotores endógenos.
El S-HVT-139 es útil como vacuna en
aves en contra la enfermedad de Marek y la laringotraqueitis
infeccio-
sa.
sa.
El S-HVT-139 se
construyó de acuerdo con el Método para generar herpesvirus
recombinantes a partir de fragmentos subgenómicos solapantes. Se
usaron las siguientes combinaciones de clones subgenómicos y
enzimas: 407-32.2C3 con NotI,
172-07.BA2 con BamHI,
407-32.5G6 con NotI,
672-07.C40 con NotI,
672-01.A40 con NotI,
711-92.1A sin corte, 721-38.1J sin
corte.
Ejemplo
16D
El S-HVT-140 es
un herpesvirus recombinante de pavos que contiene los genes gD y gI
del ILTV insertados en un sitio XhoI único convertido en un
sitio PacI en el fragmento EcoRI nº 9 (BamHI nº
10) del genoma del HTV (Figuras 13A y 15). Los genes gD y gI del
ILTV están en la orientación transcripcional opuesta al marco de
lectura abierto (ORF A) dentro del fragmento EcoRI nº 9
(BamHI nº 10) del genoma del HVT (Figura 14; Secuencia ID
NO: 48, 50). El S-HVT-140 contiene
además los genes gA, gD y gB del MDV y los genes F y HN del NDV
insertados en el sitio StuI único convertido en un sitio
HindIII en el gen US2 de HVT. Los genes gD y gI del ILTV se
expresan como transcritos solapantes de sus propios promotores del
ILTV endógenos respectivos, y los genes del lMDV también se
expresan desde sus propios promotores de MDV endógenos respectivos.
El gen F del NDV es transcrito desde el promotor temprano inmediato
del HCMV, y el gen HN del NDV es transcrito desde el promotor gX
del PRV. El S-HVT-140 es útil como
vacuna en aves contra la laringotraqueitis infecciosa, la enfermedad
de Marek y la enfermedad de Newcastle.
El S-HVT-140 se
construyó de acuerdo con el Método para generar herpesvirus
recombinantes a partir de fragmentos subgenómicos solapantes. Se
usaron las siguientes combinaciones de clones subgenómicos y
enzimas: 407-32.2C3 con NotI,
172-07.BA2 con BamHI,
407-32.5G6 con NotI,
672-07.C40 con NotI,
672-01.A40 con NotI,
711-92.1A sin corte, 722-60.E2 sin
corte.
Se describen vacunas trivalentes contra la
enfermedad bursal infecciosa, la enfermedad de Marek y la enfermedad
de Newcastle y vacunas bivalentes contra la enfermedad bursal
infecciosa y la enfermedad de Marek.
Ejemplo
17A
El S-HVT-126 es
un herpesvirus recombinante de pavos que contiene el gen VP2 del
IBDV insertado en el sitio XhoI convertido en un sitio
PacI en el fragmento EcoRI nº 9 (BamHI nº 10)
en el genoma del HVT (Figuras 13A y 15). El gen del IBDV está en la
misma orientación transcripcional que el marco de lectura abierto
(ORF A) en el fragmento EcoRI nº 9 (BamHI nº 10) del
genoma del HVT (Figura 14, SEQ ID NO: 48, 50). El gen VP2 del IBDV
se expresa desde un promotor de VP8 del IBRV. El
S-HVT-126 es útil como vacuna para
pollos contra la enfermedad bursal infecciosa y la enfermedad de
Marek.
El S-HVT-126 se
construyó de acuerdo con el Método para generar herpesvirus
recombinantes a partir de fragmentos subgenómicos solapantes. Se
usaron las siguientes combinaciones de clones subgenómicos y
enzimas: 407-32.2C3 con NotI,
172-07.BA2 con BamHI,
407-32.5G6 con NotI,
672-07.C40 con NotI,
672-01.A.40 con NotI,
706-57.A3 sin corte, 415-09.BA1 con
BamHI.
Ejemplo
17B
El S-HVT-137 es
un herpesvirus recombinante de pavos que contiene el gen VP2 del
IBDV insertado en un sitio XhoI único convertido en un sitio
PacI en el fragmento EcoRI nº 9 (BamHI nº 10)
en el genoma del HVT (Figuras 13A y 15). El gen del IBDV está en la
misma orientación transcripcional que el marco de lectura abierto
(ORF A) dentro del fragmento EcoRI nº 9 (BamHI nº 10)
del genoma del HVT (Figura 14; SEQ ID NO: 48, 50). El
S-HVT137 contiene además los genes gA, gD y gB del
MDV insertados en el sitio StuI único convertido en el sitio
HindIII en el gen US2 del HVT. El gen VP2 del IBDV se
expresa desde un promotor VP8 del IBRV. Los genes del MDV se
expresan desde sus propios promotores del MDV endógenos respectivos.
El S-HVT-137 es útil como vacuna en
pollos contra la enfermedad bursal infecciosa y la enfermedad de
Marek.
El S-HVT-137 se
construyó de acuerdo con el Método para generar herpesvirus
recombinantes a partir de fragmentos subgenómicos solapantes. Se
usaron las siguientes combinaciones de clones subgenómicos y
enzimas: 407-32.2C3 con NotI,
172-07.BA2 con BamHI,
407-32.5G6 con NotI,
672-07.40 con NotI,
672-01.A40 con NotI,
706-57.A3 sin corte, 721-38.1J sin
corte.
Ejemplo
17C
El S-HVT-143 es
un herpesvirus recombinante de pavos que contiene el gen VP2 del
IBDV insertado en el sitio XhoI único convertido en un sitio
PacI en el fragmento EcoRI nº 9 (BamHI nº 10)
del genoma del HVT (Figuras 13A y 15). El IBDV está en la misma
orientación transcripcional que el marco de lectura abierto (ORF A)
en el fragmento EcoRI nº 9 (BamHI nº 10) del genoma
del HVT (Figura 14; SEQ ID NO: 48, 50). El
S-HVT-113 contiene además los genes
gA, gD y gB del MDV y los genes F y HN del NDV insertados en el
sitio StuI único convertido en el sitio HindIII en el
gen US2 del HVT. El gen VP2 de IBDV se expresa desde un promotor VP8
del IBRV. Los genes del MDV se expresan desde sus propios
promotores del MDV endógenos respectivos. El gen F del NDV se
transcribe desde el promotor temprano inmediato del HCMV y el gen HN
del NDV se transcribe desde el promotor gX del PRV. El
S-HVT-143 es útil como vacuna en
pollos contra la enfermedad bursal infecciosa, la enfermedad de
Marek y la enfermedad de Newcastle.
El S-HVT-143 se
construyó de acuerdo con el Método para generar herpesvirus
recombinantes a partir de fragmentos subgenómicos solapantes. Se
usaron las siguientes combinaciones de clones subgenómicos y
enzimas: 407-32.2C3 con NotI,
172-07.BA2 con BamHI,
407-32.5G6 con NotI,
672-07.C40 con NotI,
672-01.A40 con NotI,
606-57.A3 sin corte, 722-60.E2 sin
corte.
El S-HVT-128 es
un herpesvirus recombinante de pavos que contiene los genes HN y F
del NDV insertados en un sitio XhoI único convertido en un
sitio PacI en el fragmento EcoRI nº 9 (BamHI nº
10) del genoma del HVT (Figuras 13A y 15). El
S-HVT-128 además contiene los genes
gA, gD y gB del MDV insertados en un sitio StuI único
convertido en el sitio HindIII en el gen US2 del HVT. El gen
HN se expresa desde el promotor gX del PRV y el gen F del NDV se
expresa desde el promotor temprano inmediato del HCMV. Los genes del
MDV se expresan desde los promotores del MDV endógenos. El
S-HVT-128 es útil como vacuna en
pollos contra la enfermedad de Newcastle y la enfermedad de
Marek.
El S-HVT-128 se
construyó de acuerdo con el Método para generar herpesvirus
recombinantes a partir de fragmentos subgenómicos solapantes. Se
usaron las siguientes combinaciones de clones subgenómicos y
enzimas: 407-32.2C3 con NotI,
172-07.BA2 con BamHI,
407-32.5G6 con NotI,
672-07.C40 con NotI,
672-01.A40 con NotI y
717-38.12 sin corte. A una mezcla de estos seis
cósmidos se añadió una dilución limitante de un virus del HVT
recombinante que contiene los genes gA, gD y gB del MDV insertados
en la región corta única (véase el HVT-062) y el gen
lacZ con el promotor gX del PRV insertado en el sitio
XhoI convertido aun sitio NotI en el fragmento
EcoRI nº 9 (BamHI nº 10) en la región larga única del
HVT. Se seleccionó un virus recombinante
S-HVT-128 que fue lacZ
negativo.
Ejemplo
18B
El S-HVT-136 es
un herpesvirus recombinante de pavos que contiene los genes HN y F
del NDV insertados en el sitio XhoI convertido en el sitio
PacI en el fragmento EcoRI nº 9 (BamHI nº 10)
en la región larga única del HVT. (Figura 14; SEQ ID NO: 48 y 50).
El gen HN del NDV se expresa desde el promotor gX del PRV y el gen F
del NDV se expresa desde el promotor temprano inmediato del HCMV.
El S-HVT-136 es útil como vacuna
para pollos contra la enfermedad de Newcastle y la enfermedad de
Marek.
El S-HVT-136 se
construyó de acuerdo con el Método para generar herpesvirus
recombinantes a partir de fragmentos subgenómicos solapantes. Se
usaron las siguientes combinaciones de clones subgenómicos y
enzimas: 407-32.2C3 con NotI,
172-07.BA2 con BamHI,
407-32.5G6 con NotI,
672-07.C40 con NotI,
672-01.A40 con NotI y
717-38.12 sin corte, y 415-09.BA1
BA1 con BamHI.
El S-HVT-145 es
una vacuna de virus recombinante, que contiene las secuencias
genómicas del MDV y del HVT, que protege contra la enfermedad de
Marek; dicho virus se produce combinando cósmidos de DNA genómico
del MDV que contiene los genes que codifican los antígenos
protectores relevantes del serotipo 1 y cósmidos de DNA genómico
del HVT de acuerdo con el Método para generar herpesvirus
recombinantes a partir de fragmentos subgenómicos solapantes. El
virus resultante es una vacuna que tiene la respuesta
inmunoprotectora para el serotipo 1 virulento del MDV y
características de crecimiento atenuadas del HVT. En una
realización, una vacuna de virus quimérico que contiene los genes
del MDV de los genes del fragmento corto único y los genes del HVT
del fragmento largo único es útil como vacuna contra la enfermedad
de Marek en pollos. Los antígenos protectores del MDV en la región
corta única (gD, gE y gI) producen una respuesta inmunoprotectora
frente al MDV mientras que los elementos virulentos presentes en el
fragmento largo único del MDV (55, 56, 57) están reemplazados por
las secuencias largas únicas atenuantes de HVT. El resultado es una
vacuna de virus atenuado que protege contra la enfermedad de Marek.
La protección multivalente contra la enfermedad de Marek, la
laringotraqueitis infecciosa, la enfermedad bursal infecciosa, la
enfermedad de Newcastle u otro agente patógeno de pollo se logra
insertando los genes gB, gD y gI de ILTV, el gen VP2 del IBDV, los
genes HN y F del NDV o un gen antígeno de agente patógeno de aves
en el sitio XhoI convertido en un sitio PacI o el
sitio NotI en el fragmento EcoRI nº 9 (BamHI
nº 10) en la región larga única del virus recombinante HVT/MDV
(Figuras 13 y 15).
Se construyó un cósmido que contenía la región
corta única completa del MDV. El DNA genómico del MDV contiene
varios sitios SmaI en las repeticiones largas únicas e
internas y terminales del virus, pero no en los sitios SmaI
en el fragmento corto único del virus. La región corta única
completa del MDV se aisló por digestión por restricción parcial del
DNA genómico del MDV con SmaI. Se asiló un fragmento de DNA
de aproximadamente 29.000 a 33.000 pares de bases y se clonó en un
sitio terminado en extremos romos del vector cósmido pWE15. Para
generar un HVT-145, un virus quimérico HVT/MDV
recombinante, el cósmido que contiene la región corta única del MDV
se combinó con cósmidos que contienen la región larga única del HVT
de acuerdo con el Método para generar herpesvirus recombinantes a
partir de fragmentos subgenómicos solapantes. Se usaron las
siguientes combinaciones de clones subgenómicos y enzimas:
407-32.2C3 con NotI,
172-07-BA2 con BamHI,
407-32.5G6 con NotI,
407-32.1C1 con NotI, y
739-27.16 con NotI.
La vacuna vírica resultante proporciona una
protección superior contra la enfermedad de Marek o como vacuna
multivalente contra la enfermedad de Marek y la laringotraqueitis
infecciosa, la enfermedad bursal infecciosa, la enfermedad de
Newcastle u otro agente patógeno aviar. Esta vacuna es superior
debido a la expresión de los genes del MDV en la vacuna quimérica
del HVT/MDV, que es más segura y proporciona una mejor protección
contra la enfermedad de Marek que las vacunas actualmente
disponibles que contienen HVT y 2(SB-1) del
tipo MVD o HVT solo. En segundo lugar se puede demostrar la
expresión de los genes de glicoproteínas del MDV en ausencia de
genes de HVT homólogos tanto para fines de diagnóstico como
reguladores. Esto es útil ya que los anticuerpos para una
glicoproteína del MDV reaccionarán de forma cruzada con las
glicoproteínas homólogas del HVT. Finalmente, un virus recombinante
de HVT/MDV que contiene una sola copia de cada gen de glicoproteína
es más estable que un virus recombinante que contiene dos copias de
un gen de glicoproteína homóloga de HVT y de MDV el cual puede
delecionarse (suprimirse) mediante recombinación de homólogos.
En una realización alternativa, los cósmidos que
contienen genes de antígenos protectores del MDV del fragmento
largo único (gB y gC del MDV) se combinan con cósmidos que contiene
secuencias de gen de HVT de la región corta única y de la región
larga única, evitando eficazmente los genes virulentos del MDV en la
unión de repetición única y en la unión de repetición
terminal/larga única (55, 56 y 57).
La cepa SB-1 es un serotipo 2
del MDV con una patogenicidad atenuada. La vacunación con una
combinación del HVT y de virus vivos SB-1 protege
contra la inoculación del MDV virulento mejor que la vacunación con
cualquier virus solo. En una realización alternativa de la presente
invención, una vacuna de virus recombinante comprende genes de
antígenos protectores de los serotipos 1 del MDV virulentos
combinados con genes atenuantes de los serotipos 2 y 3 de MDV no
virulentos, tal como el SB-1 y el HVT. El DNA
genómico correspondiente a la región larga única es contribuido por
el serotipo SB-1. El DNA genómico correspondiente a
la región corta única es contribuido por el serotipo
SB-1.Tres antígenos de las glicoproteínas
principales (gB, gA y gD) del serotipo MDV 2 están insertados en la
región corta única del virus.
El virus recombinante se construye utilizando
los clones subgenómicos del HVT 672-01.A40,
672-07.C40 y 721-38.1J para
reconstruir la región corta única. El clon subgenómico
721-38.1J contiene una inserción de los genes gB,
gA y gD del MDV. Un exceso molar grande de estos clones se
co-transfeccionó con una dosis
sub-infecciosa de DNA genómico de
SB-1. Para determinar la dosis
sub-infecciosa apropiada, la transfección del
SB-1 se titula hasta una dosis que ya no da placas
de virus en un cultivo de células. Tal dosis contiene fragmentos
subgenómicos que se extienden a la región larga única del
SB-1 que se recombina con los clones subgenómicos
cortos únicos del HVT. Por tanto, un virus resultante de la
combinación entre las regiones de homólogos solapantes de los
fragmentos subgenómicos SB-1 y HVT está altamente
favorecido. Alternativamente, los fragmentos genómicos de
SB-1 de la región larga única se subclonan en
vectores cósmidos. Se produjo un virus recombinante que contiene la
región única larga de SB-1, la corta única del HVT
con los genes gB, gA y gD del MDV usando el Método para generar
herpesvirus recombinantes a partir de fragmentos subgenómicos
solapantes. Este método también se usó con el clon subgenómico del
HVT para insertar los genes de antígenos de otros agentes patógenos
aviares incluyendo, pero sin limitación: el virus de
laringotraqueitis infecciosa, el virus de la enfermedad de Newcastle
y el virus de la enfermedad bursal infecciosa.
El HVT recombinante que expresa un factor de
crecimiento mielomonocítico de pollo (cMGF) o un interferón de
pollo (cIFN) son útiles como vacunas contra el virus de la
enfermedad de Marek y también son útiles para mejorar la respuesta
inmune frente a otras enfermedades de las aves. El factor de
crecimiento mielomonocítico de pollos (cMGF) está relacionado con
la proteína de mamífero G-CSF e
interleuquina-6 (58) y el interferón de pollo
(cIFN) es homólogo al interferón de mamífero de tipo 1 (59). Cuando
se usa en combinación con las vacunas descritas en los ejemplos
previos, el S-HVT-144 o el HVT que
expresan el cIFN son útiles para proporcionar la inmunidad mucosal,
humoral o mediada por células mejorada contra los virus que provocan
la enfermedad aviar incluyendo, pero sin limitación: virus de la
enfermedad de Marek, el virus de la enfermedad de Newcastle, el
virus de la laringotraqueitis infecciosa, el virus de la bronquitis
infecciosa, el virus de la enfermedad bursal infecciosa. El HVT
recombinante que expresa el cMGF o el cIFN son útiles para
proporcionar una inmunidad mejorada contra la enfermedad aviar
causada por los organismos descritos en el Ejemplo 15.
Ejemplo
20A
El S-HVT-144 es
un herpesvirus recombinante de pavos que contiene el gen de factor
de crecimiento mielomonocítico de pollos (cMGF) en un sitio
XhoI convertido en un sitio PacI en el fragmento
EcoRI nº 9 en la región larga única del HVT. El gen cMGF
está en la orientación transcripcional opuesta al marco de lectura
abierto (ORF A) en el fragmento EcoRI nº 9 del genoma del
HVT (Figura 14; SEQ ID NO: 48 y 50). El gen cMGF se expresa desde
un promotor temprano inmediato de citamegalovirus humano. El
S-HVT-144 es útil como vacuna para
pollos contra la enfermedad de Marek.
El S-HVT-144 se
construyó de acuerdo con el Método para generar herpesvirus
recombinantes a partir de fragmentos subgenómicos solapantes. Se
usaron las siguientes combinaciones de clones subgenómicos y
enzimas: 407-32.2C3 con NotI,
172-07.BA2 con BamHI,
407-32.5G6 con NotI,
672-07.C40 con NotI,
672-01.A40 con NotI,
751-87.A8 con AscI,
415-09.BA1 con BamHI.
Ejemplo
20B
Un herpesvirus recombinante de pavos que
contiene el gen de interferón de pollos (cIFN) insertado en un sitio
XhoI se convirtió en un sitio PacI en el fragmento
EcoRI nº 9 dentro de la región larga única del HVT. El gen
del cIFN se expresa desde un promotor temprano inmediato de
citomegalovirus humano. El HVT recombinante que expresa cIFN es
útil como vacuna para pollos contra la enfermedad de Marek.
El HVT recombinante que expresa el cIFN se
construye de acuerdo con el Método para generar herpesvirus
recombinantes a partir de fragmentos subgenómicos solapantes. Se
usaron las siguientes combinaciones de clones subgenómicos y
enzimas: 407-32.2C3 con NotI,
172-07.BA2 con BamHI,
407-32.5G6 con NotI,
672-07.C40 con NotI,
672-01.A40 con NotI,
761-07.A1 con AscI,
415-09.BA1 con BamHI.
El HVT recombinante que expresa citoquinas
aviares se combinó con HVT que expresa genes de antígenos de la
enfermedad aviar para mejorar la respuesta inmune. Las citoquinas
adicionales que se expresan en el HVT y tienen efectos estimulantes
inmunológicos incluyen, pero sin limitación: el factor beta de
crecimiento transformante, la familia de factores de crecimiento
epidérmico, los factores de crecimiento de fibroblastos, el factor
de crecimiento de hepatocitos, los factores de crecimiento de tipo
insulina, el factor de crecimiento de nervios de tipo B, el factor
de crecimiento derivado de plaquetas, el factor de crecimiento
endotelial vascular, interleuquina 1, antagonista del receptor de
IL-1, interleuquina 2, interleuquina 3,
interleuquina 4, interleuquina, interleuquina 6, receptor soluble
de IL-6, interleuquina 7, interleuquina 8,
interleuquina 9, interleuquina 10, interleuquina 11, interleuquina
12, interleuquina 13, angiogenina, quimoquinas, factores de
estimulación de colonias, factores de estimulación de colonias de
granulositos-macrófagos, eritropoyetina, interferón,
gamma-interferón, factor inhibidor de leucemia,
oncostatina M, pleiotrofina, inhibidor de proteasa de leucocitos
secretores, factor de células madres, factores de necrosis tumoral,
y receptores del TNF solubles. Estas citoquinas son de especies
aviares u otros animales incluyendo seres humanos, bovinos, equinos,
felinos, caninos o porcinos.
Ejemplo
20C
Un herpesvirus recombinante de pavos contiene el
gen de interferón de pollos (cIFN) insertado en un sitio
XhoI convertido en un sitio PacI en el fragmento
EcoRI nº 9 dentro de la región larga única del HVT y además
contiene los genes gA, gD y gB del MDV insertados en un sitio
StuI único convertido en un sitio HindIII en el gen
US2 del HVT. El gen del cIFN se expresa desde un promotor temprano
inmediato de citomegalovirus humano. Los genes del MDV se expresan
desde los promotores del MDV endógenos. El HVT recombinante que
expresa el cIFN y los genes gA, gB y gD del MDV es útil como vacuna
con una respuesta inmune mejorada para pollos contra la enfermedad
de
Marek.
Marek.
El HVT recombinante que expresa los genes del
MDV y el gen del cIFN se construye de acuerdo con el Método de la
generación de herpesvirus recombinantes a partir de fragmentos
subgenómicos solapantes. Se usó la combinación siguiente de clones
subgenómicos y enzimas: 407-32.2C3 con NotI,
172-07.Ba2 con BamHI,
407-32.5G6 con NotI,
672-07.C40 con NotI,
672-01.A40 con NotI,
761-07.A1 con AscI, 721-38.1J
sin corte.
Ejemplo
20D
Un herpesvirus recombinante de pavos contiene el
gen de interferón de pollos (cIFN) insertado en un sitio
XhoI convertido en un sitio PacI en el fragmento
EcoRI nº 9 en la región larga única de HVT y contiene además
los genes gA, gD y gB del MDV, y los genes HN y F NDV insertados en
el sitio StuI único convertido en el sitio HindIII en
el gen US2 del HVT. El gen del cIFN se expresa desde un promotor
temprano inmediato de citomegalovirus humano. Los genes del MDV se
expresan desde los promotores del MDV endógenos. El gen HN del NDV
está bajo el control del promotor gX del PRV y el gen F del NDV
está bajo el control del promotor temprano inmediato del HCMV. El
HVT recombinante que expresa el gen del cIFN y los genes gA, gB y gD
del MDV es útil como vacuna con una respuesta inmune mejorada para
pollos contra la enfermedad de Marek y la enfermedad de
Newcastle.
El HVT recombinante que expresa los genes del
MDV, los genes del NDV y el gen del cIFN se construye de acuerdo
con el Método para generar herpesvirus recombinantes a partir de
fragmentos subgenómicos solapantes. Se usaron las siguientes
combinaciones de clones subgenómicos y de enzimas:
407-32.2C3 con NotI,
172-07.BA2 con BamHI,
407-32.5G6 con NotI,
672-07.C40 con NotI,
672-01.A40 con NotI,
761-07.A1 con AscI, 722-60.E2
sin corte.
Ejemplo
20E
Un herpesvirus recombinante de pavos contiene el
gen del factor de crecimiento mielomonocítico de pollos (cMGF)
insertado en el sitio XhoI convertido en el sitio PacI
en el fragmento EcoRI nº 9 en la región larga única del HVT
y contiene además los genes gA, gD y gB del MDV insertados en el
sitio StuI único convertido en un sitio HindIII en el
gen US2 del HVT. El gen cMGF se expresa desde un promotor temprano
inmediato de citomegalovirus humano. Los genes del MDV se expresan
desde los promotores del MDV endógenos. El HVT recombinante que
expresa cMGF y gA, gB y gD del MDV es útil como vacuna para pollos
con una respuesta inmune mejorada contra la enfermedad de
Marek.
El HVT recombinante que expresa el gen cMGF y
los genes del MDV se construyó de acuerdo con el Método para
generar herpesvirus recombinantes a partir de fragmentos
subgenómicos solapantes. Se usaron las siguientes combinaciones de
clones subgenómicos y enzimas: 407-32.2C3 con
NotI, 172-07.BA2 con BamHI,
407-32.5G6 con NotI,
672-07.C40 con NotI,
672-91.A40 con NotI,
751-87.A8 con AscI, 721-38.J
sin corte.
Ejemplo
20F
Un herpesvirus recombinante de pavos contiene el
gen del factor de crecimiento mielomonocítico de pollos (cGMF)
insertado en el sitio XhoI convertido en un sitio PacI
en el fragmento EcoRI nº 9 en la región larga única del
sitio StuI y contiene además los genes gA, gD y gB del MDV y
los genes HN y F del NDV insertados en el sitio StuI único
convertido en el sitio HindIII en el gen US2 del HVT. El gen
de cGMF se expresa desde un promotor temprano inmediato de
citomegalovirus humano. Los genes del MDV se expresan desde los
promotores del MDV endógenos. El gen HN del NDV está bajo el
control del promotor gX del PRV y el gen F del NDV está bajo el
control del promotor temprano inmediato del HCMV. El HVT
recombinante que expresa el cIFN y los genes gA, gB y gD del MDV es
útil como vacuna con una respuesta inmune mejorada en pollos contra
la enfermedad de Marek y la enfermedad de Newcastle.
El HVT recombinante que expresa los genes del
MDV, los genes del NDV y el gen del cGMF se construye de acuerdo
con el Método para generar herpesvirus recombinantes a partir de
fragmentos subgenómicos solapantes. Se usaron las siguientes
combinaciones de clones subgenómicos y enzimas:
407-32.2C3 con NotI,
172-07.BA2 con BamHI,
407-32.5G6 con NotI,
672-07.C40 con NotI,
672-01.A40 con NotI,
751-87.A8 sin corte, 722-60.E2 sin
corte.
El herpesvirus recombinante de pavos (HVT) es
útil para expresar antígenos de microorganismos que causan
enfermedad en animales además de a las especies avícolas. El HVT
recombinante es útil como vacuna en animales incluyendo, pero
limitación humanos, equinos, bovinos, porcinos, caninos y
felinos.
El HVT recombinante es útil como vacuna contra
las enfermedades equinas cuando los antígenos extraños de las
enfermedades o los organismos de las enfermedades se expresan en el
vector del HVT, incluyendo pero sin limitación: la gripe equina, el
herpesvirus-1 equino y el
herpesvirus-4 equino. El HVT recombinante es útil
como vacuna contra las enfermedades bovinas cuando los antígenos
extraños de las siguientes enfermedades u organismos de
enfermedades se expresan en el vector del HVT, incluyendo pero sin
limitación: el herpesvirus de tipo 1 bovino, el virus de la diarrea
viral bovina, el virus sincitial respiratorio bovino, el virus de la
parainfluenza bovina. El HVT recombinante es útil como vacuna
contra las enfermedades de los cerdos cuando los antígenos extraños
de las siguientes enfermedades u organismos de enfermedades se
expresan en el vector HVT, incluyendo pero sin limitación: el
síndrome respiratorio y reproductivo porcino (PRRS/SIRS), el virus
del cólera de cerdo, el virus de la gripe de cerdos, el parvovirus
de cerdos, el rotavirus de cerdo. El HVT recombinante es útil como
vacuna contra las enfermedades felinas o caninas cuando los
antígenos extraños de las siguientes enfermedades u organismos de
la enfermedad se expresan en el vector del HVT, incluyendo pero sin
limitación: el herpesvirus felino, el virus de la leucemia felina,
el virus de la inmunodeficiencia felina y la Dirofilaria
immitis (gusano del corazón). Los microorganismos que causan
enfermedad en perros incluyen, pero sin limitación: el herpesvirus
canino, el virus del moquillo canino, el adenovirus canino de tipo 1
(hepatitis), el adenovirus de tipo 2 (enfermedad respiratoria), la
parainfluenza, la Leptospira canicola, la icterohemorragia,
el parvovirus, el coronavirus, el Borrelia burgdorferi, el
herpesvirus canino, la Bordetella bronquiséptica, la
Dirofilaria immitis (gusano del corazón) y virus de la
rabia.
El herpesvirus recombinante de pavos (HVT) es
útil como vacuna contra enfermedades humanas. Por ejemplo, el
agente patógeno de la gripe humana es un virus de rápida evolución
cuyos epítopos virales neutralizantes están cambiando rápidamente.
Una vacuna del HVT recombinante útil es una en la cual los epítopos
neutralizantes del virus de la gripe se cambian rápidamente para
proteger contra nuevas cepas de virus de la gripe. Los genes HA y
NA de la gripe humana se clonan usando una reacción en cadena de la
polimerasa en el HVT recombinante. El HVT recombinante es útil como
vacuna contra otras enfermedades humanas cuando los antígenos
extraños de las siguientes enfermedades u organismos enfermos se
expresan en el vector del HVT: virus de superficie y antígenos de
núcleo de la hepatitis B; virus de la hepatitis C, virus de la
inmunodeficiencia humana, virus-1 de herpes
simplex, virus-2 de herpes simplex, citomegalovirus
humano, virus de Epstein-Barr, virus de
varicela-zóster, herpesvirus
humano-6, herpesvirus humano-7,
virus de la gripe humana, virus de anginas, virus hantaan,
virus de neumonía, rinovirus, poliovirus, virus sincitial
respiratorio humano, retrovirus, virus de leucemia de células T
humanas, virus de la rabia, virus de paperas, malaria (Plasmodium
falciparum), Bordetella pertussis, Difteria,
Rickettsia prowazekii, Borrelia bergdorferi, toxoide del
tétano y antígenos de tumores malignos.
El HVT recombinante que expresa citoquinas
humanas se combina con HVT que expresa genes para de los antígenos
de la enfermedad humana para mejorar la respuesta inmune. Las
citoquinas adicionales incluyen, pero sin limitación: factor beta
del crecimiento transformante, la familia de factores de crecimiento
epidérmico, los factores de crecimiento de fibroblastos, el factor
de crecimiento de hepatocitos, los factores de crecimiento análogo
a insulina, el factor de crecimiento nervioso B, el factor de
crecimiento derivado de plaquetas, un factor de crecimiento
endotelial vascular, interleuquina 1, antagonista del receptor de
IL-1, interleuquina 2, interleuquina 3,
interleuquina 4, interleuquina 5, interleuquina 6, receptor soluble
de IL-6, interleuquina 7, interleuquina 8,
interleuquina 9, interleuquina 10, interleuquina 11, interleuquina
12, interleuquina 13, angiogenina, quimioquinas, factores
estimulantes de colonias, factores estimulantes de colonias de
granulocitos-macrófagos, eritropoyetina,
interferón, gamma-interferón, factor inhibidor de
leucemia, oncostatina M, pleiotrofina, inhibidor de proteasa de
leucocitos, factor de células madres, factores de necrosis tumoral,
y receptores de TNF solubles de seres humanos y animales se
expresan en el HVT y tienen efectos estimulantes de la
inmunidad.
Las citoquinas, tal como los interferones y las
interleuquinas inhiben la replicación o reproducción de los virus
en cultivo de células y en animales. La inhibición de la producción
del interferón celular o de la interleuquina mejora el crecimiento
del HVT recombinante en el cultivo de células. El interferón de
pollos (cIFN) expresado en un vector recombinante de viruela de
cerdo se añadió a cultivos de células de fibroblastos de embrión de
pollo (CEF) e infectados con SHVT-012 que expresa
\beta-galactosidasa. El cIFN añadido al medio de
cultivo de células reduce tanto la expresión de la
\betagalactosidasa como el título del
S-HVT-012 en una manera dependiente
de la dosis. Este resultado indica que el crecimiento del HVT está
limitado por la adición exógena de interferón de pollo. Se utilizan
varias estrategias para mejorar el crecimiento del HVT en las
células de CEF mediante la separación o inactivación de la
actividad de interferón de pollo en las células de CEF.
En una realización, un anticuerpo neutralizante
de interferón de pollo se añade al medio de cultivo para inhibir la
actividad de interferón de pollo y mejorar el crecimiento del HVT
recombinante en el cultivo de células de CEF. El anticuerpo
anti-cIFN se derivó del suero de ratón o de conejo
de animales inyectados con la proteína interferón de pollo,
preferiblemente el cIFN procede de un virus recombinante de viruela
de cerdo que expresa el interferón de pollo.
Los virus de la viruela segregan proteínas
inhibidoras de citoquinas como una estrategia de evasión inmune. Un
tipo de mecanismo de evasión inmune del virus de la viruela implica
receptores solubles de virus de viruela para interleuquinas,
interferón o factores de necrosis tumoral que inactivan las
citoquinas y permiten la replicación viral (60). En una realización
de la invención, el virus de la viruela de las aves es útil como
fuente de proteínas de inhibición de interferón de pollo y otras
proteínas de evasión inmune. El medio acondicionado de los cultivos
de célula CEF infectadas con FPV se añade a las células de CEF
infectadas con HVT para inhibir la actividad del interferón y
aumentar el título del HVT. En una realización adicional, la
proteína recombinante inhibidora de interferón de pollo u otra
proteína de evasión inmune del virus de la viruela se expresa en un
vector en combinación con una composición de vacuna del HVT para
aumentar el título del HVT.
Las células de fibroblastos de embrión de pollo
se manipularon por ingeniería genética para expresar genes extraños
(61). En una realización adicional, una línea de células de CEF
negativas al interferón se construye mediante la introducción de un
vector que expresa un gen que codifica RNA antisentido para
interferón de pollo en la línea de célula CEF. El HVT recombinante
crecido en una línea de células de CEF negativas al interferón
demostró títulos de virus mejorados en comparación con el HVT
crecido en una línea de células de CEF que producen interferón. En
una realización adicional, una línea de células CEF positiva al
factor de crecimiento mielomonocítico (cMGF) de pollo se construye
mediante la introducción de un vector que expresa el gen cMGF en las
células de CEF. El HVT recombinante crecido en la línea de células
de CEF positivas al cMGF demuestra títulos de virus mejorados en
comparación con el cultivo del HVT en línea de células de CEF
negativas al cMGF.
El HVT recombinante de la presente invención es
útil como vacuna contra la enfermedad de Marek y contra otras
enfermedades como se indicó en los ejemplos previos. Un aumento de
la eficacia en el crecimiento del HVT recombinante en las células
CEF es útil en la producción de la vacuna.
1. Buckmaster et al., J. Gen
Virol. 69:2033, 1988.
2. F.A. Ferrari et al., J. of
Bacteriology, 161, 556-562,
1985.
3. U. Gubler and B. J. Hoffman,
Gene 25, 263-269.
4. D. Hanahan, Molecular Biology
166, 557-580, 1983.
5. P.J. Hudson et al., Nucleic
Acid Research 14, 5001-5012,
1986.
6. T. Igarashi et al., 10th
International Herpesvirus Wookshop. Abstract No. 17, Ann Arbor,
Michigan, August 1985.
7. T. Ihara et al., Virus
Genes 3, 127-140, 1989.
8. M.A. Innis et al., PCR
Protocols A Guide to Methods an Aplications,
84-91, Academic Press, Inc., San Diego,
1990.
9. R.J. Isfort et al., 9th
International Herpesvirus Workshoo, Abstract 146, Seattle,
Washington, Agosto de 1984.
10. M.N. Jagadish et al., J. of
Virol. 62, 10841087, 1988.
11. Kawai y Nishizawa, Mol. and
Cell Biol. 4, 1172-1174, 1984.
12. B. Lomníczi et al., Journal
of Virology 49, 970-979, 1984.
13. Maniatis et al., Molecular
Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory, New York,
1982.
14. D. J. McGeoch et al.,
Journal of Molecular Biology, 181,
1-13, 1985.
15. S.L. McKnight and R.
Kingsbury, Science 217,
316-324, 1982.
16. L.J.N. Ross et al., Journal
of General Virology 70, 1789-1804,
1989.
17. L.J.N. Ross et al., Journal
of General Virology 72, 949-954,
1991.
18. J. Sambrook et al.,
Molecular Cloning. A Laboratory Manual Second Edition Cold
Spring Harbor Press, 1989.
19. M. Zijil et al., Journal of
Virology 62, 2191-2195, 1988.
20. Maniatis et al.,
Intervirology 16, 201-217,
1981.
21. S.L. Mansour et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 82, 1359-1363,
1985.
22. C. Thummell et al.,
Cell 33, 455-464, 1983.
23. D. Scolnick, Cell 24,
135-143, 1981.
24. C. Thummel et al., Cell
23, 825-836, 1981.
25. Y. Haj-Ahmed and F.
L. Graham, Journal of Virology 57,
264-274, 1986.
26. M. Mackett et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 79, 7415-7419,
1982.
27. D. Panicali and E. Paoletti,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79,
4927-4931, 1982.
28. E. Paoletti et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 81, 193-197,
1984.
29. G.L. Smith et al.,
Nature 302, 490-495, 1983.
30. J.H. Gillespie et al., J.
Clin. Microbiology 23, 283-288,
1986.
31. D. Panicali et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 80, 5364-5368,
1983.
32. G.L. Smith et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 80, 7155-7159,
1983.
33. G.L. Smith et al.,
Science 224, 397-399, 1984.
34. M. Mackett et al.,
Science 227, 433-435, 1985.
35. E.S. Moccarski et al.,
Cell 22, 243-255, 1980.
40. L.E. Post y B. Roizman,
Cell 25, 227-232, 1981.
41. K.L. Poffenberger et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80,
2690-2694, 1981.
42. M.G. Gibson y P.G. Spear,
Journal of Virology 48, 396-404,
1983.
43. G.T.-Y Lee et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 79, 6612-6616,
1982.
44. M.F Shih et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 81, 5867-5870,
1984.
45. R. Desrosiers et al., Ninth
Annual Herpesvirus Meeting, Seattle, Abstract No. 280,
1984.
46. M. Arsenakis and B. Roizman,
en "The High Technology Route to Virus Vaccines",
American Society for Microbiology, Washington, D.C.,
1985 (Proceedings of the First Annual Southwest Foundation
for Biomedical Research International Symposium, Houston,
Texas, 8-10 de Noviembre de 1984).
47. L.E. Post et al., Tenth
International Herpesvirus Worhshop, Ann Arbor, August
1985.
48. S.B. Mohanty and S.K Dutta,
Veterinary Virology Lea y Febiger, pubs, Philadelphia,
1981.
49. A.M: Griffin, Journal of General
Virology 72, 393-398, 1991.
50. D.R. Thomsen et al.,
Gene 16, 207-217, 1981.
51. Carpenter, D.E. and Misra, V.
Journal of General Virology 72,
3077-3084 (1991).
52. Kibenge, F. S., Jackwood, D.
J., Mercado,C.C., Journal of General Virology 71,
569-577 (1990).
53. Fukuchi et al., J. Virology
51, 102-109, 1984.
54. Fukuchi et al., J. Virology
53, 994-997, 1985.
55. Ross, N., et al., Virus
Genes 7, 33-51, 1993.
56. Maotani, K.A., et al., J.
Virology 58: 657-659, 1986.
57. Ross, L.J.N., et al., J.
General Virology 64: 2785-2790,
1983.
58. A. Leutz et al., EMBO
Journal 8: 175-182 (1989).
59. M.J. Sekellick et al.,
Journal of Interferon Research 14:
71-79 (1994).
60. G.L. Smith, Journal of General
Virology 74, 1725-1740 (1993).
61. B. Scgumacher, et al.,
Virology 203, 144-148
(1994).
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE: SYNTRO CORPORATION
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Herpesvirus recombinantes de pavos y sus usos.
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 60
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- DIRECCIÓN DE CORREPONDENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- DESTINATARIO: John P. White
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 1185 Avenue of the Americas
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: New York
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- ESTADO: New York
\vskip0.500000\baselineskip
- (E)
- PAIS: EE.UU. DE AMÉRICA
\vskip0.500000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 10036
\vskip0.800000\baselineskip
- (v)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM, PC COMPATIBLE
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA: PatentIn Release nº 1.0 Versión nº 1.25
\vskip0.800000\baselineskip
- (vi)
- DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE PRESENTACIÓN: 09-agosto-1995
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN:
\vskip0.800000\baselineskip
- (viii)
- AGENTE/INFORMACIÓN DEL AGENTE
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: White, John P.
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- NÚMERO DE REGISTRO: 28.678
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIÓN DE TELECOMUNICACIONES
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: (212) 278-0400
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TELEFAX: (212) 391-0526
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TÉLEX: 422523
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3350 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- ASPECTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 129..2522
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 797 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEQ ID NO: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 5426 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: Ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- ASPECTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 73..1182
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:/producto = "HVT UL42"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- ASPECTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1306..2574
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:/producto = "HVT UL43"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- ASPECTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 2790..4259
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:/producto = "gA de HVT"
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- ASPECTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 4701..5339
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN:/producto = "HVT UL45"
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 3:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 369 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 422 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 489 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 212 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1506 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- ASPECTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..1506
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 8:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 501 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1734 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- ASPECTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..1734
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 577 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1662 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- ASPECTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..1662
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 553 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 3469 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- ASPECTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..3489
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1162 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1846 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- ASPECTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..1846
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 615 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 18:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2116 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 18:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 19:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 705 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 19:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 20:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 36 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 20:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAATTCGAGC TCGCCCGGGG ATCCTCTAGA GTCGAC
\hfill36
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 21:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 57 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- ASPECTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 13..57
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 21:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 22:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 15 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 22:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Lys Trp Ala Thr Trp Ile Asp Pro Val Val
Leu Gln Arg Arg}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 23:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 57 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 23:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACTCGGGCAG CGTTGGGTCC TGGGACTCTA GAGGATCGAT CCCCTATGGC GATCATC
\hfill57
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 24:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 99 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 24:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 25:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 57 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 25:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCCACAGGAC CTGCAGCGAC CCGCTTAACA GCGTCAACAG CGTGCCGCAG ATCGGGG
\hfill57
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 26:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 35 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 26:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTTGATCCCG GGAGATGGGG GAGGCTAACT GAAAC
\hfill35
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 27:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 103 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 27:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 28:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 66 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 28:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 29:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 66 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- ASPECTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 16..66
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 29:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 30:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 17 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 30:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Lys Trp Ala Thr Trp Ile Asp Pro Val Val
Leu Gln Arg Arg Asp}
\sac{Trp}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 31:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 132 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- ASPECTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..93
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 31:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 32:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 31 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 32:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Asp Asp Ser Trp Ser Pro Ser Val Ser Ala Glu
Ile Gln Leu Ser Ala}
\sac{Gly Arg Tyr His Tyr Gln Leu Val Trp Cys
Gln Lys Asp Leu Glu}
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 33:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 66 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 33:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 34:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 65 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 34:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 35:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 65 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 35:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 36:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 65 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 36:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 37:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 65 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 37:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 38:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 65 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 38:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 39:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 130 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 39:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 40:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 60 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 40:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGTCGACGTCT GGGGCGCGGG GGTGGTGCTC TTCGAGACGC TGCCTACCCC AAGACGATCG
\hfill60
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 41:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 60 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 41:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAGCTCAACAA TGAAGTGGGC AACGTGGATC GATCCCGTCG TTTTACAACG TCGTGACTGG
\hfill60
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 42:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 120 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 42:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 43:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 60 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 43:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipACACAGTCAC ACTCATGGGG GCCGAAGGCA GAATTCGTAA TCATGGTCAT AGCTGTTTCC
\hfill60
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 44:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 60 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 44:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAAACCTGTCG TGCCAGCGAG CTCGGGATCC TCTAGAGGAT CCCCGGGCCC CGCCCCCTGC
\hfill60
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 45:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 60 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 45:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTCGTCCACAC GGAGCGCGGC TGCCGACACG GATCCCGGTT GGCGCCCTCC AGGTGCAGGA
\hfill60
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 46:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 60 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 46:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipAACCCCCCCC CCCCCCCCCC CCCCCCCCTG CAGGCATCGT GGTGTCACGC TCGTCGTTTG
\hfill60
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 47:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 60 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 47:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGTCATGCCA TCCGTAAGAT GCTTTTCTGT GACTGGTGAG TCGGATCCTC TAGAGTCGAC
\hfill60
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 48:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2681 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- ASPECTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 146..481
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- ASPECTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: complemento (602..1402)
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- ASPECTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1599..2135
\vskip0.800000\baselineskip
- (ix)
- ASPECTO:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: complemento (2308..2634)
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 48:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 49:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 111 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 49:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 50:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 266 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 50:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 51:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 178 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 51:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 52:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 108 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 52:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 53:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 37 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Cebador oligonucleotídico de DNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: SI
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 53:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTCGCTCGCC CATGATCATT AAGCAAGAAT TCCGTCG
\hfill37
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 54:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 39 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: sencilla
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: Cebador oligonucleotídico de DNA
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 54:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTGGTTCGGC CCATGATCAG ATGACAAACC TGCAAGATC
\hfill39
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 55:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 57 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 55:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCTCGGCGTGG TAGTTCGA GGCCTTAATT AAGGCCCTCG AGGATACATC CAAAGAG
\hfill57
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 56:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 63 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 56:
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 57:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 57:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipCGCAGGATCC GGGGCGTCAG AGGCGGGCGA GGTG
\hfill34
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 58:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 58:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipGAGCGGATCC TGCAGGAGGA GACACAGAGC TG
\hfill32
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 59:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 59:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGTAGAGATC TGGCTAAGTG CGCGTGTTGC CTG
\hfill33
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA SEQ ID NO: 60:
\vskip0.800000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- (C)
- TIPO DE CADENA: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: DNA (genómico)
\vskip0.800000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO: 60:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskipTGTACAGATC TCACCATGGC TGTGCCTGCA AGC
\hfill33
Claims (16)
1. Un virus quimérico recombinante que comprende
una región genómica viral larga única que existe de forma natural
en un herpesvirus de pavos y una región genómica viral corta única
que existe de forma natural en un herpesvirus de la enfermedad de
Marek.
2. El virus quimérico recombinante de la
reivindicación 1, en donde un DNA extraño está insertado en una
región del virus quimérico con la capacidad de ser expresado en una
célula hospedante.
3. El virus quimérico recombinante de la
reivindicación 2, en donde el DNA extraño codifica un polipéptido
antigénico,
4. El virus quimérico recombinante de la
reivindicación 2, en donde el DNA extraño codifica una
citoquina.
5. El virus quimérico recombinante de la
reivindicación 4, en donde la citoquina es factor de crecimiento
mielomonocítico de pollos (cMGF).
6. El virus quimérico recombinante de la
reivindicación 2, en donde el DNA extraño codifica
\beta-galactosidasa.
7. El virus quimérico recombinante de la
reivindicación 3, en donde el DNA extraño codifica un polipéptido
antigénico que está naturalmente presente en el virus de la
enfermedad de Marek, el virus de la enfermedad de Newcastle, el
virus de la laringotraqueitis infecciosa, el virus de la bronquitis
infecciosa o el virus de la enfermedad bursal infecciosa.
8. El virus quimérico recombinante de la
reivindicación 7, en donde el polipéptido antigénico es la
glicoproteína A o la glicoproteína B del virus de la enfermedad de
Marek.
9. El virus quimérico recombinante de la
reivindicación 7, en donde el polipéptido antigénico es la proteína
de fusión o la hemaglutinina-neuraminidasa del virus
de la enfermedad de Newcastle.
10. El virus quimérico recombinante de la
reivindicación 7, en donde el polipéptido antigénico es la
glicoproteína B, la glicoproteína I o la glicoproteína D del virus
de la laringotraqueitis infecciosa.
11. El virus quimérico recombinante de la
reivindicación 7, en donde el polipéptido antigénico es la proteína
clavo o la proteína matriz del virus del la bronquitis
infecciosa.
12. El virus quimérico recombinante de la
reivindicación 7, en donde el polipéptido antigénico es la proteína
VP2, VP3 o VP4 del virus de la enfermedad bursal infecciosa.
13. El virus quimérico recombinante de una
cualquiera de las reivindicaciones 2 a 12, en donde el DNA extraño
está bajo el control de un promotor de herpesvirus.
14. El virus quimérico recombinante de una
cualquiera de las reivindicaciones 2 a 12, en donde el DNA extraño
está bajo el control de un promotor heterólogo.
15. El virus quimérico recombinante de la
reivindicación 14, en donde el promotor es un promotor naturalmente
asociado con gX de HSV, alfa-4 de HCMV, el promotor
temprano inmediato de HCMV, gA de MDV, gB de MDV, gB de ILTV, VP8
de BHV-1.1 o gD de ILTV.
16. Una vacuna que comprende un virus de una
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15 y un vehículo
adecuado.
Applications Claiming Priority (4)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US288065 | 1988-12-22 | ||
US08/288,065 US5961982A (en) | 1985-09-06 | 1994-08-09 | Recombinant herpesvirus of turkeys and uses thereof |
US08/362,240 US5965138A (en) | 1985-09-06 | 1994-12-22 | Recombinant chimeric virus and uses thereof |
US362240 | 1994-12-22 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2278382T3 true ES2278382T3 (es) | 2007-08-01 |
Family
ID=26964815
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES95930814T Expired - Lifetime ES2278382T3 (es) | 1994-08-09 | 1995-08-09 | Herpesvirus recombinante de pavos y sus usos. |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US5965138A (es) |
EP (2) | EP0776361B1 (es) |
JP (2) | JP3756950B2 (es) |
AT (2) | ATE350467T1 (es) |
AU (1) | AU711815C (es) |
CA (1) | CA2196570C (es) |
DE (2) | DE69536138D1 (es) |
DK (1) | DK0776361T3 (es) |
ES (1) | ES2278382T3 (es) |
MX (1) | MX9700833A (es) |
WO (1) | WO1996005291A1 (es) |
Families Citing this family (34)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
IL91627A (en) * | 1988-09-13 | 1995-08-31 | Rhone Merieux | Viral nucleotide segments |
US6913751B2 (en) * | 1992-06-12 | 2005-07-05 | Schering-Plough Veterinary Corporation | Recombinant avian herpesvirus useful in vaccine production |
US6183753B1 (en) * | 1994-08-09 | 2001-02-06 | Schering-Plough Veterinary Corp. | Recombinant chimeric virus and uses thereof |
US6875856B2 (en) | 1993-09-24 | 2005-04-05 | Syntro Corporation | Recombinant infectious laryngotracheitis virus and uses thereof |
FR2728795B1 (fr) * | 1994-12-30 | 1997-03-21 | Rhone Merieux | Vaccin vivant recombinant aviaire, utilisant comme vecteur un virus herpes aviaire |
FR2728794B1 (fr) * | 1994-12-30 | 1997-03-21 | Rhone Merieux | Vaccin recombinant aviaire a base de virus herpes aviaire, notamment contre la maladie de gumboro |
US6632664B1 (en) | 1997-10-03 | 2003-10-14 | Nippon Zeon Co., Ltd. | Avian infectious herpesvirus recombinants and recombinant vaccines prepared with the use of the same |
US6506385B1 (en) | 1998-04-17 | 2003-01-14 | Embrex, Inc. | Live vaccines and methods of treatment therewith |
US6299882B1 (en) * | 1999-04-09 | 2001-10-09 | Schering Corporation | UL54.5 of Marek's disease virus (MDV) |
EP1224285A4 (en) * | 1999-10-29 | 2004-12-08 | Human Genome Sciences Inc | 27 HUMAN SECRETED PROTEINS |
US6516246B2 (en) * | 2000-09-11 | 2003-02-04 | Mimicking Man Manually, Inc. | Method and system for determining native neurological dominant hemisphere |
US7314715B2 (en) * | 2001-06-14 | 2008-01-01 | Schering-Plough Animal Health Corporation | Recombinant avian herpesvirus useful in vaccine production |
US6764684B2 (en) | 2001-09-28 | 2004-07-20 | Zeon Corporation | Avian herpesvirus-based recombinant infectious bursal disease vaccine |
WO2003100007A2 (en) | 2002-05-24 | 2003-12-04 | Schering-Plough Ltd. | Eta-1 gene and methods for use |
US7897146B2 (en) | 2003-11-17 | 2011-03-01 | Crusade Laboratories Limited | Treatment using herpes simplex virus |
US20070003520A1 (en) | 2003-11-17 | 2007-01-04 | Brown Susanne M | Mutant viruses |
GB0326798D0 (en) | 2003-11-17 | 2003-12-24 | Crusade Lab Ltd | Methods for generating mutant virus |
ES2388548T3 (es) * | 2005-04-08 | 2012-10-16 | Bayer Cropscience Nv | Suceso de élite A2704-12 y métodos y estuches para identificar a dicho suceso en muestras biológicas |
US20080241188A1 (en) | 2007-03-30 | 2008-10-02 | Zeon Corporation | Turkey herpesvirus vectored recombinant containing avian influenza genes |
US20110110887A1 (en) * | 2008-06-23 | 2011-05-12 | Wilhelmus Gerardus Johannes Degen | Recombinant herpesvirus of turkeys encoding for interleukin-12 |
US9089360B2 (en) | 2008-08-06 | 2015-07-28 | Ethicon Endo-Surgery, Inc. | Devices and techniques for cutting and coagulating tissue |
CA3146727C (en) * | 2011-10-21 | 2023-10-31 | Intervet International B.V. | Recombinant non-pathogenic marek's disease virus constructs encoding infectious laryngotracheitis virus and newcastle disease virus antigens |
EP2768529A1 (en) * | 2011-10-21 | 2014-08-27 | Intervet International B.V. | Recombinant nonpathogenic mdv vector providing multivalent immunity |
EP2644702A1 (en) | 2012-03-30 | 2013-10-02 | Ceva Sante Animale | Multivalent recombinant avian herpes virus and vaccine for immunizing avian species |
AR097029A1 (es) * | 2013-07-26 | 2016-02-17 | Intervet Int Bv | Aceleración de la respuesta inmune inducida por virus vectorial en aves, composición, uso, método para la vacunación y método para acelerar la respuesta inmune |
AR103245A1 (es) | 2014-12-24 | 2017-04-26 | Intervet Int Bv | Vacuna vectorial basada en hvt (herpes virus de los pavos) frente a nd (enfermedad de newcastle) - ibd (enfermedad de gumboro) mejorada |
WO2017216287A1 (en) | 2016-06-17 | 2017-12-21 | Intervet International B.V. | Recombinant non-pathogenic marek's disease virus constructs encoding infectious laryngotracheitis virus and infectious bursal disease virus antigens |
MA55772A (fr) | 2016-12-14 | 2022-03-02 | Boehringer Ingelheim Animal Health Usa Inc | Vecteurs hvt recombinants exprimant de multiples antigènes de pathogènes aviaires, et vaccins les contenant |
CN111542599A (zh) | 2017-10-12 | 2020-08-14 | 英特维特国际股份有限公司 | 编码多种异源抗原的重组非致病性马尔克氏病病毒构建体 |
CN114616325A (zh) | 2019-09-11 | 2022-06-10 | 硕腾服务有限责任公司 | 表达禽病原体抗原的重组火鸡疱疹病毒载体和其用途 |
US20230031097A1 (en) | 2019-12-20 | 2023-02-02 | Intervet Inc. | Multivalent hvt vector vaccine |
IL299033A (en) | 2020-06-17 | 2023-02-01 | Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh | Recombinant HVT vectors expressing influenza hemagglutinin and immunogenic compounds, production and uses thereof |
EP4267179A1 (en) | 2020-12-24 | 2023-11-01 | Intervet International B.V. | Multivalent hvt vector vaccine |
WO2023213946A1 (en) | 2022-05-05 | 2023-11-09 | Intervet International B.V. | New multivalent hvt vector vaccine |
Family Cites Families (21)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4859587A (en) * | 1984-06-04 | 1989-08-22 | Institut Merieux | Recombinant herpes simplex viruses, vaccines and methods |
US5928648A (en) | 1985-09-06 | 1999-07-27 | Syntro Corporation | Recombinant herpesvirus of turkeys and uses thereof |
US4877737A (en) * | 1985-09-06 | 1989-10-31 | Prutech Research And Development Partnership | Attenuated pseudorabies virus which has a deletion in at least a portion of a repeat sequence and vaccine containing same |
US5223424A (en) * | 1985-09-06 | 1993-06-29 | Prutech Research And Development | Attenuated herpesviruses and herpesviruses which include foreign DNA encoding an amino acid sequence |
US5047237A (en) * | 1985-09-06 | 1991-09-10 | Prutech Research And Development Partnership | Attenuated pseudorabies virus having a deletion of at least a portion of a gene encoding an antigenic, nonessential protein, vaccine containing same and methods of identifying animals vaccinated with the vaccine |
WO1988007088A1 (en) * | 1987-03-19 | 1988-09-22 | Synergen, Inc. | Viral vector system for the introduction of foreign dna expression products into gallinaceous birds |
EP0332677B1 (en) * | 1987-07-27 | 1995-07-19 | Syntro Corporation | Attenuated herpes viruses, herpes viruses which include foreign dna encoding an amino acid sequence and vaccines containing same |
JP2583115B2 (ja) * | 1988-09-10 | 1997-02-19 | 財団法人化学及血清療法研究所 | 組換えマレック病ウイルスおよびその製法 |
IL91627A (en) * | 1988-09-13 | 1995-08-31 | Rhone Merieux | Viral nucleotide segments |
US5225336A (en) * | 1989-03-08 | 1993-07-06 | Health Research Incorporated | Recombinant poxvirus host range selection system |
ES2070997T3 (es) * | 1989-12-04 | 1995-06-16 | Akzo Nobel Nv | Virus de herpes recombinante de pavos y vacunas vector vivas derivadas de los mismos. |
FR2659349B1 (fr) * | 1990-03-12 | 1993-12-24 | Rhone Merieux | Virus herpes recombinants notamment pour la realisation de vaccins, leur procede de preparation, les plasmides realises au cours de ce procede et les vaccins obtenus. |
ES2056565T3 (es) * | 1990-07-30 | 1994-10-01 | Akzo Nobel Nv | Virus recombinante de la enfermedad de marek. |
US5252717A (en) * | 1990-08-24 | 1993-10-12 | Board Of Trustees Operating Michigan State University | Marek's disease herpesvirus DNA segments encoding glycoproteins, gD, gI and gE |
WO1992003554A1 (en) * | 1990-08-24 | 1992-03-05 | Arthur Webster Pty. Ltd. | Infectious laryngotracheitis virus vaccine |
FR2666589B1 (fr) * | 1990-09-07 | 1994-08-05 | Rhone Merieux | Nouveaux virus herpes recombinants, vaccin a base de ces recombinants, leur procede de preparation, genes, vecteurs et plasmides utilises dans ce procede. |
EP0486106A3 (en) * | 1990-11-16 | 1992-12-23 | Akzo N.V. | Marek's disease virus vaccine |
US5240703A (en) * | 1991-03-01 | 1993-08-31 | Syntro Corporation | Attenuated, genetically-engineered pseudorabies virus s-prv-155 and uses thereof |
EP0575491B1 (en) * | 1991-03-07 | 2003-08-13 | Virogenetics Corporation | Genetically engineered vaccine strain |
US5853733A (en) * | 1993-02-26 | 1998-12-29 | Syntro Corporation | Recombinant herpesvirus of turkeys and uses thereof |
FR2697534A1 (fr) * | 1992-11-02 | 1994-05-06 | Rhone Merieux | Virus herpès de la dinde recombinant pour la réalisation de vaccin de la maladie de Gumboro, son procédé de préparation et vaccin obtenu. |
-
1994
- 1994-12-22 US US08/362,240 patent/US5965138A/en not_active Expired - Lifetime
-
1995
- 1995-08-09 WO PCT/US1995/010245 patent/WO1996005291A1/en active IP Right Grant
- 1995-08-09 JP JP50753196A patent/JP3756950B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1995-08-09 EP EP95930814A patent/EP0776361B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-08-09 DK DK95930814T patent/DK0776361T3/da active
- 1995-08-09 AU AU34053/95A patent/AU711815C/en not_active Expired
- 1995-08-09 DE DE69536138T patent/DE69536138D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-08-09 CA CA2196570A patent/CA2196570C/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-08-09 AT AT95930814T patent/ATE350467T1/de not_active IP Right Cessation
- 1995-08-09 EP EP06026820A patent/EP1801204B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-08-09 MX MX9700833A patent/MX9700833A/es unknown
- 1995-08-09 AT AT06026820T patent/ATE498006T1/de not_active IP Right Cessation
- 1995-08-09 ES ES95930814T patent/ES2278382T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-08-09 DE DE69535359T patent/DE69535359T2/de not_active Expired - Lifetime
-
2005
- 2005-09-21 JP JP2005274301A patent/JP4339835B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU3405395A (en) | 1996-03-07 |
DE69535359D1 (de) | 2007-02-15 |
ATE350467T1 (de) | 2007-01-15 |
CA2196570A1 (en) | 1996-02-22 |
ATE498006T1 (de) | 2011-02-15 |
MX9700833A (es) | 1997-06-28 |
EP0776361B1 (en) | 2007-01-03 |
DE69535359T2 (de) | 2007-10-11 |
DE69536138D1 (de) | 2011-03-24 |
CA2196570C (en) | 2010-10-12 |
AU711815B2 (en) | 1999-10-21 |
DK0776361T3 (da) | 2007-04-30 |
EP1801204B1 (en) | 2011-02-09 |
US5965138A (en) | 1999-10-12 |
JP2006055171A (ja) | 2006-03-02 |
EP1801204A1 (en) | 2007-06-27 |
JP3756950B2 (ja) | 2006-03-22 |
JP4339835B2 (ja) | 2009-10-07 |
AU711815C (en) | 2003-02-20 |
EP0776361A4 (en) | 2003-06-04 |
EP0776361A1 (en) | 1997-06-04 |
JPH10506782A (ja) | 1998-07-07 |
WO1996005291A1 (en) | 1996-02-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2278382T3 (es) | Herpesvirus recombinante de pavos y sus usos. | |
US5853733A (en) | Recombinant herpesvirus of turkeys and uses thereof | |
AU734085B2 (en) | Recombinant live avian vaccine, using as vector the avian infectious laryngotracheitis virus. | |
AU735265B2 (en) | Avian recombinant live vaccine using, as vector, the avian infectious laryngotracheitis virus | |
EP0332677B1 (en) | Attenuated herpes viruses, herpes viruses which include foreign dna encoding an amino acid sequence and vaccines containing same | |
US5928648A (en) | Recombinant herpesvirus of turkeys and uses thereof | |
JP4440347B2 (ja) | 組換えキメラウイルスとその使用 | |
JP2000512844A (ja) | ベクターとして鳥類の感染性喉頭気管炎ウイルスを用いた鳥類用組換え生ワクチン | |
US5961982A (en) | Recombinant herpesvirus of turkeys and uses thereof | |
CA2166371A1 (en) | Avian herpesvirus-based live recombinant avian vaccine, in particular against gumboro disease | |
US7314715B2 (en) | Recombinant avian herpesvirus useful in vaccine production | |
AU729518B2 (en) | Recombinant fowlpox viruses and uses thereof | |
JP3964458B2 (ja) | 組換え型伝染性喉頭気管炎ウイルスおよびその使用 | |
US6410033B1 (en) | Recombinant infectious bovine rhinotracheitis virus | |
AU703321B2 (en) | Recombinant infectious bovine rhinotracheitis virus S-IBR-052 and uses thereof | |
ES2360298T3 (es) | Herpesvirus recombinantes de pavos y sus usos. | |
AU750084B2 (en) | Recombinant herpesvirus of turkeys and uses thereof II | |
AU684046C (en) | Recombinant herpesvirus of turkeys and uses thereof | |
MXPA99007722A (es) | Virus quimericos recombinantes y usos para los mismos |