CN110505879B - 表达禽病原体的多种抗原的重组hvt载体及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明提供含有并表达禽病原体抗原的重组火鸡疱疹病毒(HVT)载体，包含重组HVT载体的组合物和包含重组HVT载体的多价疫苗。本发明还提供了针对多种禽病原体的疫苗接种方法和产生重组HVT载体的方法。

Description

表达禽病原体的多种抗原的重组HVT载体及其用途
【相关申请的交叉引用】
本申请要求2016年12月14日提交的美国临时申请62/433,842的优先权。
【发明领域】
本发明涉及用于插入和表达外源基因的重组病毒载体，其用作安全免疫载体以保护免受各种病原体的侵害。本发明还涉及包含一种或多种重组病毒载体的多价组合物或疫苗，用于保护免受各种病原体的侵害。本发明涉及制备和使用重组病毒载体的方法。
【背景技术】
家禽疫苗接种广泛用于保护家禽群免受破坏性疾病，包括新城疫(ND)，传染性法氏囊病(IBD)，马立克氏病(MD)，传染性支气管炎(IB)，传染性喉气管炎(ILT)和禽流感(AI)。ND是由禽副粘病毒1(APMV-1)引起的，也称为属于副粘病毒科(Paramyxoviridae)的ND病毒(NDV)。MD由Gallid疱疹病毒2(疱疹病毒科(Herpesviridae))引起，也称为MD病毒血清型1(MDV1)。IB由属于冠状病毒科(Coronaviridae)的IB病毒(IBV)引起，ILT由Gallid疱疹病毒1(疱疹病毒科(Herpesviridae))也称为ILT病毒(ILTV)引起，AI由属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)的AI病毒(AIV)引起。
已经提出了许多重组禽病毒载体，目的是使禽类接种这些禽类病原体。使用的病毒载体包括禽流感病毒，尤其是禽痘(EP-A-0,517,292)，马立克氏病毒，如血清型1、2和3(HVT)(WO87/04463；WO2013/082317)，或者ITLV，NDV和禽类腺病毒。当这些重组禽病毒载体中的一些用于疫苗接种时，它们显示出不同程度的保护作用。
已经开发并授权了几种表达来自各种病原体(包括IBDV，NDV，ILTV和AIV)的抗原的重组火鸡疱疹病毒(HVT，也称为Meleagrid疱疹病毒1或MDV血清型3)载体(美国专利号5,980,906、5,853,733、6,183,753、5,187,087)。特别感兴趣的是表达HVT载体的IBDV VP2保护基因，其显示出优于经典IBD疫苗的明显优势(Bublot等人J.Comp.Path.2007，Vol.137，S81-S84；US 5,980,906)。其他感兴趣的HVT载体是表达NDV的那些(Morgan等1992，Aviandis.36，858-70；US 6,866,852；US5,650,153)，ILTV(Johnson等，2010Avian Dis 54，1251-1259；US6，299,882；US5,853,733，EP 1801204)，或NDV和IBDV(US9,114,108；WO2016102647，WO2013/057235，WO2015032910，WO2013144355)保护基因。US2016/0158347报道了使用寡脱氧核苷酸TLR21激动剂来增加针对由HVT载体表达的抗原的免疫应答。
将几种基于HVT的重组疫苗一起使用的一个实际问题是它们的干扰。当2种表达不同抗原的HVT重组体混合时，至少针对其中一种疾病诱导较低的保护作用(Rudolf Heine2011；可能对这些疫苗的经济效益产生影响的家禽重组病毒载体疫苗问题；论文发表于2011年8月14日～18日在墨西哥坎昆举行的第十七届世界兽医家禽协会(WVPA)大会；Slacum G，Hein R.和Lynch P.，2009，HVT重组与其他马立克氏病疫苗的兼容性，第58届西方家禽疾病会议，萨克拉门托，加州，美国，3月23日～25日，第84页)。
考虑到动物病原体如NDV和IBDV对兽医公共卫生和经济的潜在影响，需要有效的预防感染和保护动物的方法。需要一种组合的有效载体疫苗和制备疫苗的合适方法的解决方案，其可以减轻在2种基于HVT的载体疫苗之间观察到的干扰问题。
【发明内容】
当包含重组HVT载体的多价组合物或疫苗有效地保护动物免受各种禽类病原体而没有干扰时，本发明显示出令人惊讶的结果。当启动子/接头，密码子优化基因，多聚A尾部和插入位点的各种组合赋予体内和体外一种或多种异源基因表达的不同水平的功效和稳定性时，也观察到令人惊讶的结果。本发明提供稳定的HVT载体，其能够有效表达多个基因并克服众所周知的问题，即具有多个插入物的HVT载体不太稳定。
本发明涉及重组HVT载体，其包含编码和表达禽病原体的至少一种抗原的一种，2种或更多种异源多核苷酸。
本发明提供了包含一种或多种重组HVT载体的组合物或疫苗，所述重组HVT载体包含编码和表达禽病原体的至少一种抗原的一种，2种或更多种异源多核苷酸。
本发明涉及在动物中接种动物或诱导免疫原性或保护性应答的方法，包括至少一次给予本发明的组合物或载体。
【附图简述】
通过示例给出的以下详细描述并且不旨在将本发明限制于所描述的特定实施例，可以结合通过引用并入本文的附图来理解，其中：
图1是显示分配给每种DNA和蛋白质序列的SEQ ID NO的表。
图2描绘了HVT的基因组结构及其插入位点。
图3描绘了pFSV40VP2质粒图谱。
图4描绘了vHVT309的引物结合位点的示意图。
图5描绘了vHVT309的PCR同一性结果。
图6描绘了pFIRESVP2质粒图谱。
图7描绘了vHVT310的引物结合位点的示意图。
图8描绘了vHVT310的PCR同一性结果。
图9描绘了pFP2AVP2质粒图谱。
图10描绘了vHVT311的引物结合位点的示意图。
图11描绘了vHVT311的PCR同一性结果。
图12描绘了pVP2IRESgD质粒图谱。
图13描绘了vHVT317的引物结合位点的示意图。
图14描绘了vHVT317的PCR同一性结果。
图15描绘了pFwtSV40VP2质粒图谱。
图16描绘了vHVT313的引物结合位点的示意图。
图17描绘了vHVT313的PCR同一性结果。
图18描绘了pVP2IRESFwt质粒图谱。
图19描绘了vHVT316的引物结合位点的示意图。
图20描绘了vHVT316的PCR同一性结果。
图21A-21D描绘了DNA和蛋白质序列比对。
图22描绘了HVT US2SVgDwtsyn质粒图谱。
图23描绘了pHVTIG1gDCaFopt质粒图谱。
图24描绘了vHVT308的引物结合位点的示意图。
图25描绘了vHVT308的PCR同一性结果。
图26描绘了pFwtIRESgD质粒图谱。
图27描绘了vHVT322的引物结合位点的示意图。
图28描绘了vHVT322的PCR同一性结果。
图29描绘了pHVTUS2SVgDwtsyn质粒图谱。
图30描绘了vHVT406的引物结合位点的示意图。
图31描绘了vHVT406的PCR同一性结果。
【具体实施方式】
虽然已经结合本发明的具体实施例描述了本发明，但是应该理解，本发明能够进行进一步的修改，并且本申请一般地遵循本发明的原理，在本发明所属领域内的已知或惯常实践范围内旨在覆盖本发明的任何变型，用途或改编，并且可以应用于上文所述的基本特征，并且如下所述，在所附权利要求的范围内，本发明包括对本发明的这些偏离。本发明包括在适用法律允许的最大范围内在此呈现的方面或权利要求中所述主题的所有修改和等同物。
应注意，在本公开中，特别是在权利要求中，诸如“包含(comprises)”，“包含(comprised)”，“包含(comprising)”等术语可具有美国专利法中赋予它的含义；例如，它们可以表示“包括(includes)”，“包括(included)”，“包括(including)”等；并且诸如“基本上由......组成(consisting essentially of)”和“基本上由......组成(consistsessentially of)”的术语具有美国专利法中赋予它们的含义，例如，它们允许未明确引用的元素，但排除现有技术中发现的或影响本发明的基本或新颖特征的元素。
除非上下文另有明确说明，否则单数术语“a”，“an”和“the”包括复数个指示物。类似地，除非上下文另有明确说明，否则词语“或”旨在包括“和”。“或”一词表示特定列表中的任何一个成员，并且还包括该列表的任何成员组合。
还应该理解，尽管这里可以使用术语第一，第二等来描述各种元件，但是这些元件不应受这些术语的限制。这些术语仅用于区分一个元素与另一个元素。例如，第一手势可以被称为第二手势，并且类似地，第二手势可以被称为第一手势，而不脱离本发明的范围。除非本文另有说明或上下文明显矛盾，否则本文所述的所有方法或过程可以以任何合适的顺序进行。
术语“动物”在本文中用于包括所有哺乳动物，鸟类和鱼类。本文使用的动物可以选自：马科动物(例如，马)，犬科动物(例如，狗，狼，狐狸，土狼，豺)，猫科动物(例如，狮子，老虎，家猫，野猫，其他大型猫科动物和其他猫科动物，包括猎豹和山猫)，牛类(如牛)，猪类(如猪)，羊类(如绵羊，山羊，羊驼，野牛)，禽类(如鸡，鸭，鹅，火鸡，鹌鹑，雉鸡，鹦鹉，雀，鹰，乌鸦，鸵鸟，鸸鹋和鹤鸵)，灵长类动物(例如，狐猴，跗猴，猴子，长臂猿，猿)，人类和鱼类。术语“动物”还包括处于发育的所有阶段的个体动物，包括胚胎和胎儿阶段。
这里使用的术语“约”是指大约，大致或粗略的区域。当术语“约”与数值范围结合使用时，它通过扩展上述数值的上下边界来修改该范围。通常，术语“约”在本文中用于将所述值之上和之下的数值修改10％的方差。在一个方面，术语“约”是指其使用数的数值的加或减20％。因此，约50％意味着在45％-55％的范围内。本文通过端点列举的数值范围包括该范围内包含的所有数字和分数(例如1～5包括1、1.5、2、2.75、3、3.90、4和5)。还应理解，推测其所有数字和分数均由术语“约”修饰。
术语“多肽”和“蛋白质”在本文中可互换使用，是指连续氨基酸残基的聚合物。
术语“核酸”，“核苷酸”和“多核苷酸”可互换使用，指RNA，DNA，cDNA或cRNA及其衍生物，例如含有修饰骨架的那些。应当理解，本发明提供了包含与本文所述序列互补的序列的多核苷酸。本发明中考虑的“多核苷酸”包括正向链(5'→3')和反向互补链(3'→5')。根据本发明的多核苷酸可以以不同方式制备(例如通过化学合成，通过基因克隆等)，并且可以采取各种形式(例如线性或分支，单链或双链，或其杂交体，引物，探针等)。
术语“基因组DNA”或“基因组”可互换使用，是指宿主生物的可遗传的遗传信息。基因组DNA包含核DNA(也称为染色体DNA)，但也包括质体(例如叶绿体)和其他细胞器(例如线粒体)的DNA。本发明中考虑的基因组DNA或基因组也指病毒的RNA。RNA可以是正链或负链RNA。本发明中考虑的术语“基因组DNA”包括含有与本文所述序列互补的序列的基因组DNA。术语“基因组DNA”还指信使RNA(mRNA)，互补DNA(cDNA)和互补RNA(cRNA)。
术语“基因”广泛用于指与生物学功能相关的任何多核苷酸区段。因此，基因或多核苷酸包括基因组序列中的内含子和外显子，或仅包括cDNA中的编码序列，例如开放阅读框(ORF)，从起始密码子(甲硫氨酸密码子)开始并以终止信号结束(停止)密码子)。基因和多核苷酸还可以包括调节其表达的区域，例如转录起始，翻译和转录终止。因此，还包括启动子和核糖体结合区(通常这些调节元件位于编码序列或基因起始密码子上游约60～250个核苷酸之间；Doree SM等人；Pandher K等人；Chung JY等人)，转录终止子(通常终止子位于编码序列或基因的终止密码子下游约50个核苷酸内；Ward CK等人)。基因或多核苷酸还指表达mRNA或功能性RNA或编码特定蛋白质的核酸片段，其包括调节序列。
如本文所用的术语“异源DNA”是指衍生自不同生物的DNA，例如与受体不同的细胞类型或不同的物种。该术语还指在宿主DNA的相同基因组上的DNA或其片段，其中异源DNA插入基因组的不同于其原始位置的区域。
如本文所用，术语“抗原”或“免疫原”是指在宿主动物中诱导特异性免疫应答的物质。抗原可包含整个生物体，杀死，减毒或存活；生物的亚基或部分；含有具有免疫原性特性的插入物的重组载体；能够在呈递给宿主动物时诱导免疫应答的DNA片段或片段；多肽，表位，半抗原或其任何组合。或者，免疫原或抗原可包含毒素或抗毒素。
如本文所用的术语“免疫原性蛋白质或肽”包括具有免疫活性的多肽，其一旦施用于宿主，它能够引起针对蛋白质的体液和/或细胞类型的免疫应答。优选地，蛋白质片段具有与总蛋白质基本相同的免疫活性。因此，根据本发明的蛋白质片段包含至少一种表位或抗原决定簇或由其组成或由至少一种表位或抗原决定簇组成。如本文所用，“免疫原性”蛋白质或多肽包括蛋白质的全长序列，其类似物或其免疫原性片段。“免疫原性片段”是指包含一个或多个表位的蛋白质片段，因此引发上述免疫应答。可以使用本领域熟知的任何数量的表位作图技术鉴定此类片段。例如，线性表位可以通过例如在固体支持物上同时合成大量肽来确定，所述肽对应于蛋白质分子的部分，并且当肽仍然附着于支持物时使肽与抗体反应。类似地，通过确定氨基酸的空间构象，例如通过例如X射线晶体学和二维核磁共振，可以容易地鉴定构象表位。
术语“免疫原性蛋白质或肽”进一步涵盖序列的缺失，添加和取代，只要该多肽起到产生如本文所定义的免疫应答的作用。术语“保守变异”表示用另一种生物学上相似的残基取代氨基酸残基，或替换核酸序列中的核苷酸使得编码的氨基酸残基不改变或是另一种生物学上相似的残基。在这方面，特别优选的取代在性质上通常是保守的，即在氨基酸家族内发生的那些取代。例如，氨基酸通常分为四个家族：(1)酸性-天冬氨酸和谷氨酸；(2)碱性-赖氨酸，精氨酸，组氨酸；(3)非极性-丙氨酸，缬氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，脯氨酸，苯丙氨酸，蛋氨酸，色氨酸；(4)不带电荷的极性-甘氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺，半胱氨酸，丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸。苯丙氨酸，色氨酸和酪氨酸有时被分类为芳香族氨基酸。保守变异的实例包括用一个疏水残基如异亮氨酸，缬氨酸，亮氨酸或蛋氨酸替代另一个疏水残基，或用一个极性残基取代另一个极性残基，如精氨酸取代赖氨酸，谷氨酸取代天冬氨酸用于天冬酰胺的酸或谷氨酰胺等；或具有结构相关氨基酸的氨基酸的类似保守替代，其对生物活性不会产生重大影响。因此，具有与参考分子基本相同的氨基酸序列但具有基本上不影响蛋白质免疫原性的次要氨基酸取代的蛋白质在参考多肽的定义范围内。本文包括由这些修饰产生的所有多肽。术语“保守变异”还包括使用取代的氨基酸代替未取代的亲本氨基酸，条件是针对取代的多肽产生的抗体也与未取代的多肽发生免疫反应。
术语“表位”是指特异性B细胞和/或T细胞响应的抗原或半抗原上的位点。该术语还可与“抗原决定簇”或“抗原决定簇位点”互换使用。识别相同表位的抗体可以在简单的免疫测定中鉴定，显示一种抗体阻断另一种抗体与靶抗原结合的能力。
对组合物或疫苗的“免疫应答”是在宿主中发展对感兴趣的组合物或疫苗的细胞和/或抗体介导的免疫应答。通常，“免疫应答”包括但不限于以下一种或多种作用：抗体，B细胞，辅助性T细胞和/或细胞毒性T细胞的产生，特异性地针对包括在目标组合物或疫苗中的抗原或抗原。优选地，宿主将显示治疗性或保护性免疫应答，从而增强对新感染的抗性和/或降低疾病的临床严重性。这种保护将通过感染宿主通常显示的症状减轻或缺乏，更快恢复时间和/或感染宿主中病毒滴度降低来证明。
术语“重组”和“基因修饰的”可互换使用，指其天然形式或结构的多核苷酸或蛋白质的任何修饰，改变或工程，或其天然环境中或周围的多核苷酸或蛋白质的任何修饰，改变或工程化。多核苷酸或蛋白质的修饰，改变或工程化可包括但不限于一个或多个核苷酸或氨基酸的缺失，整个基因的缺失，基因的密码子优化，氨基酸的保守取代，插入一种或多种异源多核苷酸。
术语“多价疫苗或组合物”，“组合或组合疫苗或组合物”和“多价疫苗或组合物”可互换使用，是指含有一种以上组合物或疫苗的组合物或疫苗。多价疫苗或组合物可含有2种，三种，四种或更多种组合物或疫苗。多价疫苗或组合物可包含重组病毒载体，活性或减毒或灭活的野生型病毒，或活性或减毒或灭活形式的重组病毒载体和野生型病毒的混合物。
本发明的一个实施方式提供了重组HVT病毒载体，其包含编码和表达禽病原体的至少一种抗原或多肽的一种，2种或更多种异源多核苷酸。用于重组病毒载体的HVT菌株可以是任何HVT菌株，包括但不限于HVT菌株FC126(Igarashi T.等人，J.Gen.Virol.70，1789-1804，1989)。
编码抗原或多肽的基因可以是编码下列的基因：新城疫病毒融合蛋白(NDV-F)，新城疫病毒血凝素神经氨酸酶(NDV-HN)，马立克氏病病毒糖蛋白C(gC)，马立克氏病病毒糖蛋白B(gB)，马立克氏病病毒糖蛋白E(gE)，马立克氏病病毒糖蛋白I(gI)，马立克氏病病毒糖蛋白H(gH)或马立克氏病病毒糖蛋白L(gL)，传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2，IBDV VPX，IBDV VP3，IBDV VP4，ILTV糖蛋白B，ILTV糖蛋白I，ILTV UL32，ILTV糖蛋白D，ILTV糖蛋白E，ILTV糖蛋白C，流感血凝素(HA)，流感神经氨酸酶(NA)，源自鸡毒支原体(Mycoplasmagallisepticum)(MG)或滑液支原体(Mycoplasma synoviae)(MS)的保护性基因，或其组合。抗原或多肽可以是选自下列的家禽病原体的任何抗原：禽脑脊髓炎病毒，禽呼肠孤病毒，禽副粘病毒，禽变性肺病毒，禽流感病毒，禽腺病毒，禽痘病毒，禽冠状病毒，禽轮状病毒，鸡贫血症病毒，禽星状病毒，禽细小病毒，禽逆转录病毒，禽小核糖核酸病毒，球虫病(艾美球虫属(Eimeria sp.))，弯曲杆菌属(Campylobacter sp.)，沙门氏菌属(Salmonella sp.)，巴斯德菌属(Pasteurella sp.)，禽杆菌属(Avibacterium sp.)，鸡毒支原体(Mycoplasmagallisepticum)，滑膜支原体，梭状芽孢杆菌和大肠埃希氏菌(E.coli)。
此外，上述抗原或多核苷酸的同源物也包括在本发明的范围内。如本文所用，术语“同源物”包括直系同原物，类似物和旁系同源物。术语“类似物”是指具有相同或相似功能但在不相关生物中分别进化的2种多核苷酸或多肽。术语“直系同源物”是指来自不同物种的两个多核苷酸或多肽，但是通过物种形成从共同的祖先基因进化而来。通常，直系同源物编码具有相同或相似功能的多肽。术语“旁系同源物”是指通过基因组内的复制而相关的两个多核苷酸或多肽。旁系同源物通常具有不同的功能，但这些功能可能是相关的。野生型多肽的类似物，直系同原物和旁系同源物可以通过翻译后修饰，氨基酸序列差异或两者与野生型多肽不同。特别地，本发明的同源物通常与全部或部分上述抗原的多核苷酸或多肽序列表现出至少80～85％，85～90％，90～95％或95％，96％，97％，98％，99％的序列同一性，并将表现出类似的功能。
在一个实施方式中，本发明提供重组HVT病毒载体，其包含编码和表达下列的一种，2种或更多种异源多核苷酸：NDV-F抗原或多肽、IBDV VP2抗原或多肽、ILTV gD抗原或多肽或其组合。在该实施方式的一个方面，NDV-F抗原或多肽与具有SEQ ID NO：5或22所示序列的多肽具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，或保守变体，等位基因变体，同源物或包含这些多肽之一的至少8个或至少10个连续氨基酸的免疫原性片段，或这些多肽的组合。在该实施方式的另一个方面，异源多核苷酸编码与具有SEQ ID NO：5所示序列的多肽具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的NDV-F抗原或多肽。在该实施方式的另一个方面，异源多核苷酸与具有SEQ ID NO：3、4或21所示所示序列的多核苷酸具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
在该实施方式的另一个方面，IBDV VP2抗原或多肽与具有SEQ ID NO：2所示的序列的多肽具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，或保守变体，等位基因变体，同源物或免疫原性片段，其包含这些多肽之一的至少8个或至少10个连续氨基酸，或这些的组合多肽。在该实施方式的另一个方面，异源多核苷酸编码与具有SEQ ID NO：2所示序列的多肽具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的IBDV VP2抗原或多肽。在该实施方式的另一个方面，异源多核苷酸与具有SEQ ID NO：1所示序列的多核苷酸具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
在该实施方式的另一个方面，ILTV gD抗原或多肽与具有SEQ ID NO：17所示的序列的多肽具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性，或保守变体，等位基因变体，同源物或免疫原性片段，其包含这些多肽之一的至少8个或至少10个连续氨基酸，或这些的组合多肽。在该实施方式的另一个方面，异源多核苷酸编码与具有SEQ ID NO：17所示序列的多肽具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性的ILTV gD抗原或多肽。在该实施方式的另一个方面，异源多核苷酸与具有SEQ ID NO：16所示序列的多核苷酸具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。
变体包括等位基因变体。术语“等位基因变体”是指含有多态性的多核苷酸或多肽，其导致蛋白质的氨基酸序列的变化并且存在于天然群体(例如，病毒种类或变种)中。这种天然等位基因变异通常可导致多核苷酸或多肽中1-5％的变异。可以通过对许多不同物种中的目标核酸序列进行测序来鉴定等位变体，这可以通过使用杂交探针容易地进行以鉴定那些物种中的相同基因遗传基因座。任何和所有此类核酸变异和由此产生的天然等位基因变异导致的氨基酸多态性或变异并且不改变目的基因的功能活性，都属于本发明的范围。
关于序列的术语“同一性”可以指，例如，具有相同核苷酸或氨基酸的位置数除以两个序列中较短的核苷酸或氨基酸的数目，其中两个序列的比对可以是根据Wilbur和Lipman算法(Wilbur和Lipman)确定。可以使用Vector NTI软件包(Invitrogen，1600Faraday Ave.，Carlsbad，CA)测定两个氨基酸序列的序列同一性或序列相似性，或两个核苷酸序列之间的序列同一性。当称RNA序列相似或与DNA序列具有一定程度的序列同一性或同源性时，DNA序列中的胸苷(T)被认为与RNA序列中的尿嘧啶(U)相等。因此，RNA序列在本发明的范围内，并且可以源自DNA序列，DNA序列中的胸苷(T)被认为与RNA序列中的尿嘧啶(U)相等。
本公开内容的多核苷酸包括由于遗传密码而简并的序列，例如特定宿主的优化密码子使用。如本文所用，“优化的”是指经遗传工程改造以增加其在给定物种中的表达的多核苷酸。为了提供编码NDV-F，IBDV VP2或ILTV gD多肽的优化多核苷酸，可以将这些基因的DNA序列修饰为(1)包含特定物种中高表达基因优选的密码子；(2)核苷酸碱基组成中的A+T或G+C含量基本上存在于所述物种中；(3)形成所述物种的起始序列；或(4)消除导致不稳定，不适当的多腺苷酸化，RNA降解和终止的序列，或形成二级结构发夹或RNA剪接位点的序列。通过利用真核生物和原核生物中或特定物种中密码子使用的分布频率，可以实现所述物种中NDV F，IBDV VP2或ILTV gD蛋白的表达增加。术语“优选密码子使用的频率”是指特定宿主细胞在使用核苷酸密码子以表示给定氨基酸时表现出的偏好。有20种天然氨基酸，其中大多数由一个以上的密码子指定。因此，只要由核苷酸序列编码的NDV-F，IBDV VP2或ILTV gD多肽的氨基酸序列在功能上不变，所有简并核苷酸序列都包括在本公开内容中。
通过重组/修饰的感染性病毒成功表达异源多核苷酸需要两个条件。首先，必须将异源多核苷酸插入或引入病毒基因组的区域，以使修饰的病毒保持存活。表达插入的异源多核苷酸的第二个条件是存在允许在病毒背景中表达基因的调控序列(例如：启动子，增强子，供体和受体剪接位点和内含子，Kozak翻译起始共有序列，多腺苷酸化信号，非翻译序列元素)。
插入位点可以是HVT基因组的任何非必需区域，包括但不限于ORF UL55的终止密码子和UL与相邻重复区域的连接区域(基因间区域1，IG1基因座，US5,980,906)，IG2(基因间区域2)基因座，IG3(基因间区域3)基因座，UL43基因座，US10基因座，US2基因座，SORF3/US2基因座(参见图2)
通常，使用在真核细胞中有功能的强启动子是有利的。启动子包括但不限于，立即早期(IE)人巨细胞病毒(CMV)(hCMV)启动子，小鼠CMV(mCMV)IE启动子，豚鼠CMV(gpCMV)IE启动子，SV40启动子，伪狂犬病病毒启动子例如糖蛋白X启动子，单纯疱疹病毒-1，例如α4启动子，马立克氏病病毒(包括MDV-1，MDV-2和HVT)启动子，例如驱动糖蛋白gC，gB，gE或gI表达的那些启动子，HHV3gB启动子(人疱疹病毒属(Herpesvirus)3型糖蛋白B启动子)，传染性喉气管炎病毒启动子，例如糖蛋白gB，gE，gI，gD，gC基因的启动子或其他疱疹病毒启动子。
本发明的一个实施方式提供了重组HVT载体，其包含编码和表达IBDV VP2抗原或多肽的第一异源多核苷酸和编码和表达NDV-F抗原或多肽的第二多核苷酸。在该实施方式的一个方面，NDV-F抗原或多肽与具有SEQ ID NO：5所示序列的多肽具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在该实施方式的另一个方面，IBDV VP2抗原或多肽与具有SEQ ID NO：2所示的序列的多肽具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。另一方面，编码NDV-F多肽的多核苷酸与具有SEQ ID NO：7所示序列的SV40启动子可操作地连接，并且NDV-F抗原或多肽的表达受SV40启动子调节。另一方面，NDV-F抗原或多肽的表达受具有SEQ ID NO：8所示序列的SV40多聚A信号或具有SEQ ID NO：9所示序列的合成多聚A信号调节。另一方面，IBDV VP2抗原或多肽的表达受具有SEQ ID NO：6所示序列的mCMV-IE启动子和具有SEQ ID NO：8所示序列的SV40多聚A信号，或具有SEQ ID NO：9所示序列的合成多聚A信号调节。
本发明的另一个实施方式提供了重组HVT载体，其包含编码和表达IBDV VP2抗原或多肽的第一异源多核苷酸和编码和表达NDV-F抗原或多肽的第二多核苷酸，并且还包含调节表达的序列。第二多核苷酸的调节序列或接头可以是内部核糖体进入位点(IRES)，源自脑心肌炎病毒(EMCV)的RNA序列，或编码自切割猪捷申病毒-1 2A或口蹄疫病毒(FMDV)肽(P2A)的序列。
在该实施方式的一个方面，重组HVT载体包含编码IBDV VP2抗原的第一多核苷酸和编码NDV-F抗原的第二多核苷酸，并且还包含具有SEQ ID NO：10所示序列的IRES。在该实施方式的另一个方面，重组HVT包含编码IBDV VP2抗原的第一多核苷酸和编码NDV-F抗原的第二多核苷酸，并且还包含具有SEQ ID NO：11所示序列的P2A编码多核苷酸。
本发明的一个实施方式提供了重组HVT载体，其包含编码和表达NDV F抗原或多肽的第一异源多核苷酸和编码和表达ILTV gD抗原或多肽的第二多核苷酸，并且还包含调节第二多核苷酸的表达的序列。调节序列或接头可以是内部核糖体进入位点(IRES)，源自脑心肌炎病毒(EMCV)的RNA序列，或编码自切割猪捷申病毒-1 2A或口蹄疫病毒(FMDV)肽(P2A)的序列。在该实施方式的一个方面，ILTV gD抗原或多肽与具有SEQ ID NO：17所示的序列的多肽具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在该实施方式的另一个方面，NDV F抗原或多肽与具有SEQ ID NO：5或22所示的序列的多肽具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在该实施方式的另一个方面，重组HVT载体包含编码NDV F抗原的第一多核苷酸和编码ILTVgD抗原的第二多核苷酸，并且还包含具有SEQ ID NO：10所示的序列的IRES。
本发明的另一个实施方式提供了重组HVT载体，其包含编码和表达NDV F抗原或多肽的第一异源多核苷酸和编码和表达ILTV gD抗原或多肽的第二多核苷酸。在该实施方式的一个方面，ILTV gD抗原或多肽与具有SEQ ID NO：17所示的序列的多肽具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在该实施方式的另一个方面，NDV F抗原或多肽与具有如SEQ ID NO：5或22所示的序列的多肽具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在一个方面，编码NDVF多肽的多核苷酸与SV40启动子可操作地连接，并且NDV F抗原或多肽的表达由SV40启动子调节。另一方面，编码ILTV gD多肽的多核苷酸与HHV3gB启动子可操作地连接，并且ILTV gD抗原或多肽的表达受HHV3gB启动子调节。在另一方面，HHV3gB启动子处于反方向。另一方面，NDV F抗原和ILTV gD抗原的表达受SV40启动子和反向HHV3gB启动子的调节，并且方向相反。
本发明的另一个实施方式提供了重组HVT载体，其包含编码和表达IBDV VP2抗原或多肽的第一异源多核苷酸和编码和表达ILTV gD抗原或多肽的第二多核苷酸。在该实施方式的一个方面，ILTV gD抗原或多肽与具有SEQ ID NO：17所示的序列的多肽具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在该实施方式的另一个方面，IBDV VP2抗原或多肽与具有SEQ ID NO：2所示的序列的多肽具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在该实施方式的另一个方面，重组HVT载体包含编码IBDV VP2抗原的第一多核苷酸和编码ILTV gD抗原的第二多核苷酸，并且还包含具有SEQ ID NO：10所示序列的IRES。
本发明的另一个实施方式提供了重组HVT载体，其包含编码和表达ILTV gD抗原或多肽的异源多核苷酸。在该实施方式的一个方面，ILTV gD抗原或多肽与具有SEQ ID NO：17所示的序列的多肽具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性。在该实施方式的另一个方面，编码ILTV gD多肽的多核苷酸与SV40启动子可操作地连接，并且ILTV gD抗原或多肽的表达由SV40启动子调节。
在一个实施方式中，编码IBDV VP2抗原和/或NDV-F抗原和/或ILTV gD抗原的多核苷酸可以插入选自IG1，IG2，US10，US2，SORF3-US2和HVT基因组的gD的一个或多个基因座区域中。在另一个实施方式中，将编码IBDV VP2抗原和/或NDV-F抗原和/或ILTV gD抗原的多核苷酸插入相同的基因座，例如HVT基因组的IG1。
在一个实施方式中，本发明涉及药物组合物或疫苗，其包含一种或多种本发明的重组HVT载体和药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂、媒介物或佐剂。HVT载体可包含2种异源多核苷酸，并且其中第一多核苷酸包含编码选自下列的多肽的多核苷酸：传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2抗原、传染性喉气管炎病毒(ILTV)糖蛋白D(gD)抗原和新城疫病毒F(NDV-F)抗原，并且其中第二多核苷酸包含编码选自下列的多肽的多核苷酸：传染性法氏囊病病毒(IBDV)VP2抗原、传染性喉气管炎病毒(ILTV)糖蛋白D(gD)抗原和新城疫病毒F(NDV-F)抗原。
在另一个实施方式中，本发明提供了包含HVT病毒载体的组合物或疫苗，其包含：(i)编码和表达IBDV VP2抗原或NDV-F抗原的第一异源多核苷酸；(ii)编码和表达NDV-F抗原或IBDV VP2抗原的第二多核苷酸；(iii)任选的药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂、媒介物或佐剂。在另一个实施方式中，本发明提供了包含HVT病毒载体的组合物或疫苗，其包含：(i)编码和表达IBDV VP2抗原或ILTV gD抗原的第一异源多核苷酸；(ii)编码和表达ILTV gD抗原或IBDV VP2的第二多核苷酸；(iii)任选的药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂、媒介物或佐剂。在另一个实施方式中，本发明提供了包含HVT病毒载体的组合物或疫苗，其包含：(i)编码和表达NDV-F抗原或ILTV gD抗原的第一异源多核苷酸；(ii)编码和表达ILTV gD抗原或NDV-F抗原的第二多核苷酸；(iii)任选的药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂、媒介物或佐剂。在另一个实施方式中，本发明提供了包含HVT病毒载体的组合物或疫苗，所述HVT病毒载体包含编码和表达ILTV gD抗原的异源多核苷酸，和任选的药学上或兽医学上可接受的载体、赋形剂、媒介物或佐剂。在另一个实施方式中，本发明提供了包含HVT的组合物或疫苗，所述HVT包含与具有SEQ ID NO：1、3、4、12、13、14、15、16、18、19、20、21、25、26或27所示序列的多核苷酸具有至少70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同一性的多核苷酸。在一个实施方式中，显示在一个基因座中插入两个或更多个异源多核苷酸赋予更好的保护和功效，然后插入多个基因座。在另一个实施方式中，显示通过IRES或P2A从单个mRNA表达多于一种异源多核苷酸提供了针对禽类疾病的更好的保护和功效。在另一个实施方式中，本发明提供的实验数据公开了包含IRES元件的构建体提供比包含P2A元件的构建体更好的保护。
药学上或兽医学上可接受的载体或佐剂或载体或赋形剂是本领域技术人员熟知的。例如，药学上或兽医学上可接受的载体或佐剂或媒介物或赋形剂可以是用于MD疫苗的马立克氏病疫苗稀释剂。可用于本发明方法的其他药学上或兽医学上可接受的载体或佐剂或媒介物或赋形剂包括但不限于0.9％NaCl(例如盐水)溶液或磷酸盐缓冲液，聚-(L-谷氨酸)，乳酸林格氏注射用稀释剂(氯化钠，乳酸钠，氯化钾和氯化钙)或聚乙烯吡咯烷酮。药学上或兽医学上可接受的载体或载体或佐剂或赋形剂可以是促进载体(或从体外本发明载体表达的蛋白质)的施用的任何化合物或化合物的组合，或促进转染或感染和/或改善载体(或蛋白质)的保存。剂量和剂量体积在本文中在一般描述中讨论，并且也可以由本领域技术人员结合本领域的知识阅读，而无需任何过度的实验。
任选地，可以添加其他化合物作为药学上或兽医学上可接受的载体或佐剂或载体或赋形剂，包括但不限于明矾；CpG寡核苷酸(ODN)，特别是ODN 2006、2007、2059或2135(Pontarollo RA等，Vet.Immunol.Immunopath，2002，84：43-59；Wernette C.M.等，Vet.Immunol.Immunopath，2002，84：223-236；Mutwiri G.等，Vet.Immunol.Immunopath，2003，91：89-103)；多聚A-多聚U，二甲基二十八烷基溴化铵(DDA)(“Vaccine Design TheSubunit and Adjuvant Approach”，Michael F.Powell和Mark J.Newman编辑，Pharmaceutical Biotechnology，6：p03，p157)；N，N-二十八烷基-N'，N'-双(2-羟乙基)丙二胺(如)(同上，第148页)；卡波姆，壳聚糖(参见美国专利序列号5,980,912)。
根据本发明的药物组合物和疫苗可包含一种或多种佐剂或基本上由一种或多种佐剂组成。适用于本发明实践的佐剂是(1)丙烯酸或甲基丙烯酸，马来酸酐和链烯基衍生物聚合物的聚合物，(2)免疫刺激序列(ISS)，例如具有一个或多个非甲基化CpG单元的寡脱氧核糖核苷酸序列(Klinman等，1996；WO98/16247)，(3)水包油乳液，例如M.Powell，M.Newman，Plenum Press 1995出版的“Vaccine Design，The Subunit and AdjuvantApproach”第147页所述的SPT乳液，以及同一工作的第183页描述的乳液MF59，(4)含有季铵盐的阳离子脂质，例如DDA(5)细胞因子，(6)氢氧化铝或磷酸铝，(7)皂苷或(8)在引用的任何文献中讨论的其它佐剂，通过引用并入本申请，或(9)其任何组合或混合物。
在一个实施方式中，佐剂可包括TS6TS7，TS8和TS9(US7,371,395)，LR2，LR3和LR4(US7,691,368)，TSAP(US20110129494)，TRIGENTM(Newport Labs)，合成dsRNA(例如poly-IC，poly-ICLC)和MONTANIDETM佐剂(W/O，W/O/W，O/W，IMS和凝胶；均由SEPPIC生产)。
在另一个实施方式中，本发明提供了治疗有效量的疫苗或组合物的给药，用于在靶细胞中递送重组HVT载体。对于本领域普通技术人员来说，确定治疗有效量是常规实验。
本发明的另一方面涉及诱导动物对抗一种或多种抗原的免疫应答或动物对一种或多种禽病原体的保护性应答的方法，该方法包括用本发明的疫苗或药物组合物接种动物至少一次。本发明的另一个方面涉及在初免-加强给药方案中诱导动物对一种或多种抗原的免疫应答或动物对一种或多种禽病原体的保护性应答的方法，该方案至少包括使用至少一种常见多肽，抗原，表位或免疫原的一次初次施用和至少一次加强施用。初次给药中使用的免疫组合物或疫苗可以是相同的，可以在性质上不同于用作加强剂的那些。
禽类病原体可以是新城疫病毒(NDV)，传染性法氏囊病病毒(即IBDV或Gumboro病病毒)，马立克氏病病毒(MDV)，传染性喉气管炎病毒(ILTV)，禽脑脊髓炎病毒，禽呼肠孤病毒，禽副粘病毒，禽类偏肺病毒，禽流感病毒，禽腺病毒，禽痘病毒，禽冠状病毒，禽轮状病毒，禽细小病毒，禽星状病毒和鸡贫血症病毒球虫病(艾美球虫属(Eimeria sp.))、弯曲杆菌属(Campylobacter sp.)、沙门氏菌属(Salmonella sp.)、鸡毒支原体(Mycoplasmagallisepticum)、滑液支原体(Mycoplasma synoviae)、巴斯德菌属(Pasteurella sp.)、禽杆菌属(Avibacterium sp.)、大肠埃希氏菌(E.coli)或梭菌属(Clostridium sp.)。
通常，禽类疫苗的一次给药是在一日龄时通过皮下或肌肉内途径进行，或者在17-19天大的胚胎中进行卵内给药。第二次给药可在第一次给药后0-30天内完成。
可以使用日龄雏鸡中的各种给药途径，例如皮下或肌肉内，皮内，透皮。卵内疫苗接种可以在羊膜囊和/或胚胎中进行。卵内和SC给药装置中可商购的可用于疫苗接种。
组合物或疫苗可以含有从病毒载体，质粒或杆状病毒体外或体内产生的约102～约1020，约103～约1018，约104～约1016，约105～约1012个VLP(病毒样颗粒)的剂量。可以基于任何病毒滴定方法滴定病毒载体，包括但不限于FFA(Focus Forming Assay)或FFU(FocusForming Unit)，TCID50(50％组织培养感染剂量)，PFU(噬斑形成单位)，和FAID50(50％荧光抗体感染剂量)和体外产生的VLP可通过血细胞凝集试验，ELISA和电子显微镜滴定。根据VLP的类型，其他方法也可适用。
组合物或疫苗可含有约102.0～约107.0TCID50或PFU/剂量，约102.0～约107.0TCID50或PFU/剂量，和约102.0～约106.5TCID50或PFU/剂量。
剂量体积可以为约0.01～约10ml，约0.01～约5ml。
现在将通过以下非限制性实施例进一步描述本发明。
【实施例】
使用J.Sambrook等人(Molecular Cloning：A Laboratory Manual，4th edition，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，New York，2014)描述的标准分子生物学技术进行DNA插入物，质粒和重组病毒载体的构建。
【实施例1：构建表达2种基因的重组HVT载体】
【实施例1.1：构建表达IBDV-VP2和NDV-F的重组vHVT309】
该研究的目的是构建重组HVT，其中含有小鼠巨细胞病毒启动子(mCMV)的表达盒，该基因编码传染性法氏囊病病毒病毒蛋白2(VP2)，猿猴病毒40聚A尾(SV40多聚A))，猿猴病毒40启动子(SV40启动子)，编码新城疫病毒融合蛋白(NDV-F)和合成聚A尾(syn多聚A尾)的基因整合在基因间位点1(IG1)中。
构建体中使用的亲本病毒是vHVT13(表达IBDV VP2基因的HVT载体，Merial的(HVT+IBD)疫苗的活性成分，在US5,980,906中也称为vHVT17)。vHVT13载体含有由mCMV IE启动子(SEQ ID NO：6)，IBDV VP2基因(编码SEQ ID NO：2的SEQ ID NO：1)和插入IG1插入位点的SV40多聚A尾(SEQ ID NO：8)组成的表达盒。对应于基因型VIId序列的新城疫病毒融合蛋白(NDV-F)通过化学合成和密码子优化(GenScript)。改变该合成基因的F蛋白切割位点以匹配Lentogenic F切割位点序列，并且所得NDV-F基因序列与保藏在GenBank中的NDV-F序列具有99％氨基酸序列同一性(AY337464)。小鼠CMV IE启动子用于IBD-VP2，SV40启动子用于NDV-F。插入基因座是HVT中的基因间位点1(IG1)(图2)。如下所述构建供体质粒pFSV40VP2(含有VP2/SV40多聚A的插入质粒和IG1+SV40启动子的侧翼臂+NDV-F+合成的多聚A)。鸡胚成纤维细胞(CEF)用于体外重组。
【供体质粒构建】
含有IBDV VP2基因(编码SEQ ID NO：2的SEQ ID NO：1)，SV40多聚A尾(SEQ ID NO：8)，SV40启动子(SEQ ID NO：7)，NDV-F基因的pUC57中的合成DNA(编码SEQ ID NO：5的SEQID NO：3和合成的多聚A尾(SEQ ID NO：9)通过GeneScript合成(图3)。使用Top10Oneshot试剂盒(目录号C404002，Invitrogen)转化质粒pFSV40VP2，培养大规模培养物，并使用Qiagens Maxi Prep试剂盒进行质粒提取。使用Fugene Transfection Reagent inChicken Embryo Fibroblast Cells(CEF's)和鸡多克隆血清抗NDV验证maxi prep的瞬时表达。
【重组体产生】
标准同源重组程序之后使用pFSV40VP2质粒和从vHVT13疫苗分离的病毒DNA共培养第二CEF细胞。使用1×107 2°CEF在300μlOpti-MEM中进行共电穿孔，并在2mm电穿孔比色皿中以150伏特和950电容进行电击。将转染的细胞接种到96孔板中并孵育4天。然后将在96孔板中生长的细胞复制到两个96孔板中并再孵育3天。使用针对NDV-F的鸡多克隆血清将一组96孔板用于IFA以鉴定含有重组体的阳性孔，并使用另一组96孔板从阳性孔中回收感染的细胞。
重组病毒纯化方法首先通过96孔板复制和IFA选择进行，所述孔含有具有最少量IFA阴性噬斑的IFA阳性噬斑。然后收获与这些标准匹配的孔并在DMEM+2％FBS中调节至1ml。从1ml原液中取出5-20ul并与1×107CEF在10ml DMEM+2％FBS中混合，并等分到新的96孔板上，每孔具有单个病毒噬斑。孵育5天后复制96孔板，通过IFA和PCR测试含有噬斑的孔中是否存在双重组和不存在vHVT13亲本病毒。再次通过比较PCR条带结果，似乎具有更多重组病毒的孔被收获并调整至1ml并等分到新的96孔板上。在病毒感染细胞的两轮纯化后，分离表达NDV-F蛋白的重组病毒，并通过IFA和PCR测试重组病毒的纯度，以证实不存在亲代病毒。
【通过PCR分析重组体】
通过苯酚/氯仿提取，乙醇沉淀从原种病毒中提取DNA，并重悬于20mM HEPES中。设计PCR引物(表1)以特异性鉴定IBDV-VP2和NDV-F VIId基因，启动子，多聚As，以及来自Vaxxitek亲本病毒的重组病毒的纯度。引物结合位点的位置显示在图4中。使用200μgDNA模板以及表1中指定的指定引物进行PCR。PCR循环条件如下：94℃-2分钟；30个循环的94℃-30秒，60℃-45秒，68℃-3分钟(MB080+MB081引物组5分钟)；68℃-5分钟(MB080+MB081引物组7分钟)。
表1：使用特异性引物组的预期PCR条带
引物组 Vaxxitek vHVT309
MB080+MB081 3350 5577
MB010+NDVFVlldopt.F -- 737
MB080+VP2.F 405 2632
SV40tailR+mCMVF 3021 3021
syntailR+SV40启动子F -- 2184
【表达分析】
对于免疫荧光测试，将重组材料在培养基中以1：100稀释。将约50μl稀释的病毒加入20ml含2×107个CEF的DMEM+2％FBS中，然后等分到两个96孔板(100μl/孔)上。将板在37℃+5％CO2下孵育4天直至可见病毒噬斑。将板用95％冰冷的丙酮固定3分钟，风干10分钟并用水洗涤3次。使用针对新城疫病毒(NDV Pab)的鸡抗血清(批号#C0117A，Charles RiversLaboratories)以1:500和HVT L78单克隆抗体(HVT Mab)(Lee等人，1983，J.Immunol.130(2)1003-6；Merial批次)以1:3000对板#1进行双重免疫荧光染色，将板在37℃下保温1小时。使用针对传染性法氏囊病病毒(IBDV Pab)的鸡抗血清(批次#G0117，Charles RiversLaboratories)以1:500和HVT L78单克隆抗体(HVT Mab)(Merial)以1:3000对板#2进行双重免疫荧光，将板在37℃下培养1小时。温育1小时后，将板用PBS洗涤三次。向平板#1和#2以1:500加入FITC标记的抗鸡IgG(Cat#F8888，Sigma)和以1:300加入TRITC标记的Alex Fluor驴抗小鼠(cat#A10037，Invitrogen)。将板再次在37℃下孵育1小时。温育1小时后，用PBS冲洗细胞三次，并用荧光显微镜观察，使用异硫氰酸荧光素(FITC)过滤器和四甲基罗丹明异硫氰酸盐(TRITC)过滤器。
【结果】
供体质粒pFSV40VP2的核苷酸和氨基酸序列分配如SEQ ID NO所示，如图1所示。
【重组体产生和表达分析】
将vHVT13病毒的基因组DNA与pFSV40VP2供体质粒共电穿孔，以使用同源重组技术产生重组体。通过免疫荧光阳性孔选择和多轮噬斑纯化中的PCR筛选从亲本Vaxxitek病毒中分离重组病毒。将表达NDV-F蛋白的噬斑纯化的重组病毒(称为vHVT309)从组织培养瓶放大至5×850cm2的滚瓶。感染后约72小时后，收获感染的CEF。将等分试样在液氮中冷冻，每个等分试样含有10％FBS和10％DMSO。在CEF上一式三份进行滴定，并获得vHVT309的1.5×105pfu/ml的滴度。
使用1:500的鸡抗血清(Pab)和1:3000的HVT L78单克隆抗体(Mab)，然后用1:500的FITC标记的抗鸡IgG和1:300的TRITC标记的Alex Fluor驴抗-小鼠进行双重免疫荧光染色。平板#1比较新城疫病毒与HVT的表达，平板#2比较传染性法氏囊病病毒与HVT的表达。发现所有检查的vHVT309的HVT TRITC阳性噬斑均表达NDV-F和IBDV-VP2蛋白。
【vHVT309的PCR分析】
使用对HVT侧翼臂，启动子，NDV-F和IBDV-VP2基因以及多聚A尾特异的引物对，通过PCR验证重组病毒的纯度。PCR结果证明重组病毒vHVT309携带预期的表达盒，病毒原种不含可检测量的亲本Vaxxitek病毒(表1和图5)。
【结论】
基于PCR测试和免疫荧光分析，vHVT309是重组病毒，其含有在mCMV启动子控制下的IBDV-VP2基因和在SV40启动子控制下的NDV-F基因。新生成的vHVT309不含任何可检测的亲本vHVT13病毒。
【实施例1.2：表达IBDV-VP2和NDV-F的重组vHVT310的构建】
该研究的目的是构建重组HVT，其中含有小鼠巨细胞病毒启动子(mCMV)的表达盒，编码传染性法氏囊病病毒病毒蛋白2(VP2)的基因，内部核糖体进入位点(IRES)，基因编码新城疫病毒融合蛋白(NDV-F)和猿猴病毒40多聚A尾(SV40多聚A)整合在基因间位点1(IG1)中(图2)。
构建体中使用的亲代病毒是vHVT13。对应于基因型VIId序列的新城疫病毒融合蛋白(NDV-F)通过化学合成和密码子优化(GenScript)。改变该合成基因的F蛋白切割位点以匹配Lentogenic F切割位点序列，并且所得NDV-F基因序列与保藏在GenBank中的NDV-F序列具有99％氨基酸序列同一性(AY337464)。小鼠CMV IE启动子用于IBD-VP2(在亲本Vaxxitek病毒中)。IRES是一种源自脑心肌炎病毒(EMCV)的RNA序列，它允许在IRES所在位置的紧邻下游的mRNA内启动翻译，在VP2基因的末端插入，以启动下游NDV-F基因的翻译。这是IRES首次用于HVT载体。
插入基因座是HVT中的基因间位点1(IG1)(图2)。如下所述构建供体质粒pFIRESVP2(含有VP2基因+IRES+NDV-F的插入质粒和IG1的SV40多聚A/侧翼臂)。鸡胚成纤维细胞(CEF)用于体外重组。
【供体质粒构建】
含有IBDV VP2基因(编码SEQ ID NO：2的SEQ ID NO：1)，IRES(SEQ ID NO：10)，NDV-F基因(编码SEQ ID NO：5的SEQ ID NO：3)的pUC57中的合成DNA，通过GeneScript合成SV40多聚A尾(SEQ ID NO：8)(图6)。使用Top10Oneshot试剂盒(目录号C404002，Invitrogen)转化质粒pFIRESVP2，培养大规模培养物，并使用Qiagens Maxi Prep试剂盒进行质粒提取。
【重组体产生】
按照实施例1.1中所述的同源重组方法制备重组vHVT310。
【通过PCR分析重组体】
进行如实施例1.1中所述的PCR分析程序以验证vHVT310。
【表达分析】
进行实施例1.1中描述的表达分析以分析vHVT310的表达。
【结果】
供体质粒pFIRESVP2的核苷酸和氨基酸序列分配如SEQ ID NO所示，如图1所示。
【重组体产生和表达分析】
将Vaxxitek病毒的基因组DNA与pFIRESVP2供体质粒共电穿孔，以使用同源重组技术产生重组病毒。通过免疫荧光阳性孔选择和多轮噬斑纯化中的PCR筛选从亲本vHVT13病毒中分离重组病毒。将表达NDV-F蛋白的噬斑纯化的重组病毒(称为vHVT310)从组织培养瓶按比例放大至5×850cm2的滚瓶。感染后约72小时后，收获感染的CEF。将等分试样在液氮中冷冻，每个等分试样含有10％FBS和10％DMSO。在CEF上一式三份进行滴定，对于vHVT310获得2.0×106pfu/ml的滴度。
使用1:500的鸡抗血清(Pab)和1:3000的HVT L78单克隆抗体(Mab)，然后用1:500的FITC标记的抗鸡IgG和1:300的TRITC标记的Alex Fluor驴抗-小鼠进行双重免疫荧光染色。平板#1比较新城疫病毒与HVT的表达，平板#2比较传染性法氏囊病病毒与HVT的表达。发现所有检测的vHVT310的HVT TRITC阳性噬斑均表达NDV-F和IBDV-VP2蛋白。
【vHVT310的PCR分析】
使用对HVT侧翼臂，启动子，NDV-F和IBDV-VP2基因以及多聚A尾特异的引物对，通过PCR验证重组病毒的纯度。PCR结果表明重组病毒vHVT310携带预期的表达盒，病毒原种不含可检测量的亲本Vaxxitek病毒(表2和图7-8)。
表2：使用特异性引物组的预期PCR条带
引物组 Vaxxitek vHVT310
MB080+MB081 3350 5586
MB080+NDVFVlldopt.F -- 798
MB080+VP2.F 405 2641
SV40tailR+mCMVF 3021 5257
【结论】
基于PCR测试和免疫荧光分析，vHVT310是在mCMV启动子控制下含有IBDV-VP2和NDV-F基因的重组病毒，其中NDV-F基因的翻译由来自EMCV的IRES引发。新产生的重组vHVT310不含任何可检测的亲本vHVT13病毒。
【实施例1.3：表达IBDV-VP2和NDV-F的重组vHVT311的构建】
该研究的目的是构建重组HVT，其中含有小鼠巨细胞病毒启动子(mCMV)的表达盒，该基因编码传染性法氏囊病病毒蛋白2(VP2)，自切割猪捷申病毒-21 2A肽(P2A)，编码新城疫病毒融合蛋白(NDV-F)的基因和猿猴病毒40多聚A尾(SV40多聚A)整合在基因间位点1(IG1)中(图2)。
构建体中使用的亲本病毒是vHVT13(表达IBDV VP2基因的HVT载体，Merial的(HVT+IBD)疫苗)。对应于野生型基因型VIId新城疫病毒融合蛋白(NDV-F)序列的多核苷酸是化学合成的(GenScript)。改变该合成基因的F蛋白切割位点以匹配Lentogenic F切割位点序列，并且所得NDV-F基因序列与保藏在GenBank中的NDV-F序列具有99％氨基酸序列同一性(AY337464)。小鼠CMV IE启动子用于IBD-VP2(在亲本Vaxxitek病毒中)。在VP2基因的末端插入自切割猪捷申病毒-1 2A肽(P2A)，其允许分别来自单个启动子mCMV的上游和下游基因VP2和F的共翻译'切割'。这是第一次将P2A用于HVT载体。
插入基因座是HVT中的基因间位点1(IG1)(图2)。如下所述构建供体质粒pFP2AVP2(含有VP2+P2A+NDV-F的插入质粒和IG1的SV40多聚A/侧翼臂)。鸡胚成纤维细胞(CEF)用于体外重组。
【供体质粒构建】
含有IBDV VP2基因(编码SEQ ID NO：2的SEQ ID NO：1)，编码P2A的DNA(SEQ IDNO：11)，NDV-F基因(编码SEQ ID NO：5的SEQ ID NO：4)的pUC57中的合成DNA通过GeneScript合成SV40多聚A尾(SEQ ID NO：8)(图9)。使用Top10Oneshot试剂盒(目录号C404002，Invitrogen)转化质粒pFP2AVP2，培养大规模培养物并使用Qiagens Maxi Prep试剂盒进行质粒提取。
【重组体产生】
按照实施例1.1中所述的同源重组方法制备重组vHVT311。
【通过PCR分析重组体】
进行如实施例1.1中所述的PCR分析程序以验证vHVT311。
【表达分析】
进行实施例1.1中描述的表达分析以分析vHVT311的表达。
【结果】
供体质粒pFP2AVP2的核苷酸和氨基酸序列分配如SEQ ID NO所示，如图1所示。
【重组体产生和表达分析】
使用同源重组技术将Vaxxitek病毒的基因组DNA与pFP2AVP2供体质粒共电穿孔以产生重组病毒。通过免疫荧光阳性孔选择和多轮噬斑纯化中的PCR筛选从亲本Vaxxitek病毒中分离重组病毒。将表达NDV-F蛋白的噬斑纯化的重组病毒(称为vHVT311)从组织培养瓶放大至5×850cm2的滚瓶。感染后约72小时后，收获感染的CEF。将等分试样在液氮中冷冻，每个等分试样含有10％FBS和10％DMSO。在CEF上一式三份进行滴定，对于vHVT311获得2.5×106pfu/ml的滴度。
使用1:500的鸡抗血清(Pab)和1:3000的单克隆抗体(Mab)，然后用1:500的FITC标记的抗鸡IgG和1:300的TRITC标记的Alex Fluor驴抗小鼠进行双重免疫荧光。平板#1比较新城疫病毒与HVT的表达，平板#2比较传染性法氏囊病病毒与新城疫病毒的表达。发现所有检测的vHVT311的HVT TRITC阳性噬斑均表达NDV-F，并且发现所有NDV TRITC阳性噬斑表达IBDV-VP2蛋白。
【vHVT311的PCR分析】
使用对HVT侧翼臂，启动子，NDV-F和IBDV-VP2基因以及多聚A尾特异的引物对，通过PCR验证重组病毒的纯度。PCR结果表明重组病毒vHVT311携带预期的表达盒，病毒原种不含可检测量的亲本Vaxxitek病毒(表3和图10-11)。
表3：使用特异性引物组的预期PCR条带
引物组 Vaxxitek vHVT311
MB080+MB081 3350 5101
MB080+NDVFVlldwt.F -- 840
MB080+VP2.F 405 2156
SV40tailR+mCMVF 3021 4772
【结论】
基于PCR测试和免疫荧光分析，vHVT311是在mCMV启动子控制下含有IBDV-VP2和NDV-F基因的重组病毒，其中2A肽介导的切割导致VP2和F蛋白的共表达。新产生的重组vHVT311不含任何可检测的亲本vHVT13病毒。
【实施例1.4：构建表达IBDV-VP2和ILTV-gD的重组vHVT317】
该研究的目的是构建重组HVT，其中含有小鼠巨细胞病毒启动子(mCMV)的表达盒，编码传染性法氏囊病病毒病毒蛋白2(VP2)的基因，内部核糖体进入位点(IRES)，基因编码传染性喉气管炎糖蛋白D蛋白(ILTV-gD)和猿猴病毒40多聚A尾(SV40多聚A)整合在基因间位点1(IG1)中(图2)。
构建体中使用的亲代病毒是vHVT13。在构建体中使用化学合成的感染性喉气管炎病毒糖蛋白D(ILTV gD)序列(GenScript)。小鼠CMV IE启动子用于IBD-VP2(在亲本vHVT13病毒中)。来自脑心肌炎病毒(EMCV)的RNA序列(IRES)允许在紧邻IRES所在位置的mRNA内启动翻译，其插入VP2基因的末端以启动下游ILTV-gD基因的翻译。
插入基因座是HVT中的基因间位点1(IG1)(图2)。如下所述构建供体质粒pVP2IRESgD(含有VP2基因+IRES+ILTV-gD的插入质粒和IG1的SV40多聚A/侧翼臂)。鸡胚成纤维细胞(CEF)用于体外重组。
【供体质粒构建】
含有IBDV VP2基因(编码SEQ ID NO：2的SEQ ID NO：1)，IRES(SEQ ID NO：10)，ILTV-gD基因(编码SEQ ID NO：17的SEQ ID NO：16)的pUC57中的合成DNA，通过GenScript合成SV40多聚A尾(SEQ ID NO：8)。将质粒pFIRESVP2转化到dcm-/dam-感受态细胞(NewEngland Biolabs，cat#C2925I)中，然后用HindIII/SalI消化。凝胶提取5kb片段。通过GenScript合成含有部分IRES，ILTV-gD野生型和SV40多聚A尾的pUC57中的合成DNA。用HindIII/SalI消化质粒Sal-Fse gD-IRES。凝胶提取1.9kb片段。使用Top10Oneshot试剂盒(目录号C404002，Invitrogen)连接并转化两个片段。通过HindIII/SbfI筛选菌落以获得正确的模式。对最终的供体质粒进行测序验证并命名为pVP2IRESgD(参见图12)。
【重组体产生】
按照实施例1.1中所述的同源重组方法制备重组vHVT317。
【通过PCR分析重组体】
进行如实施例1.1中所述的PCR分析程序以验证vHVT317。
【表达分析】
进行实施例1.1中描述的表达分析以分析vHVT317的表达。
【结果】
供体质粒pVP2IRESgD的核苷酸和氨基酸序列分配如SEQ ID NO所示，如图1所示。
【重组体产生和表达分析】
使用1:500的鸡抗血清(多克隆抗体)和1:3000的单克隆抗体(Mab)，然后用1:500的FITC标记的抗鸡IgG和1:300的TRITC标记的Alex Fluor驴抗小鼠进行双重免疫荧光。与HVT阳性噬斑相比，发现所有检测的vHVT317噬斑均表达IBDV-VP2蛋白，并且当与IBDV阳性噬斑相比时，发现所有斑块和斑块均表达ILTV-gD蛋白。
【vHVT317的PCR分析】
使用对HVT侧翼臂，启动子，ILTV-gD和IBDV-VP2基因以及多聚A尾特异的引物对，通过PCR验证重组病毒的纯度。PCR结果证明重组病毒vHVT317携带预期的表达盒，并且病毒原种不含可检测量的亲本Vaxxitek病毒(表4和图13-14)。
表4：使用特异性引物组的预期PCR条带
引物组 Vaxxitek vHVT317
MB080+MB081 3350 5101
MB080+ILTgDwt.F -- 825
MB080+VP2.F 405 2272
SV40tailR+mCMVF 3021 4888
【结论】
基于PCR测试和免疫荧光分析，vHVT317是在mCMV启动子控制下含有IBDV-VP2和ILTV-gD基因的重组病毒，其中ILTV-gD基因的翻译由来自EMCV的IRES启动。新产生的重组vHVT317不含任何可检测的亲本vHVT13病毒。
【实施例1.5：表达IBDV-VP2和NDV-F的重组vHVT313的构建】
该研究的目的是构建重组HVT，其中含有小鼠巨细胞病毒启动子(mCMV)的表达盒，该基因编码传染性法氏囊病病毒病毒蛋白2(VP2)，猿猴病毒40聚A尾(SV40多聚A))，猿猴病毒40启动子(SV40启动子)，编码野生型新城疫病毒融合蛋白(NDV-F)和合成聚A尾(syn多聚A尾)的基因整合在基因间位点1(IG1)中(图2)。
构建体中使用的亲代病毒是vHVT13。新城疫病毒融合蛋白(NDV-F)对应于化学合成的基因型VIId野生型序列(GenScript)。改变该合成基因的F蛋白切割位点以匹配Lentogenic F切割位点序列，并且所得NDV-F基因序列与保藏在GenBank中的NDV-F序列具有99％氨基酸序列同一性(AY337464)。使用用于IBD-VP2(在亲本Vaxxitek病毒中)和用于NDV-F的SV40启动子的小鼠CMV IE启动子。
插入基因座是基因间位点1(IG1)(图2)。如下所述构建供体质粒pFwtSV40VP2(含有VP2/SV40多聚A的插入质粒和IG1+SV40启动子的侧翼臂+NDV-F+合成的多聚A)。鸡胚成纤维细胞(CEF)用于体外重组。
【供体质粒构建】
含有IBDV VP2基因(编码SEQ ID NO：2的SEQ ID NO：1)，SV40多聚A尾(SEQ ID NO：8)，SV40启动子(SEQ ID NO：7)，NDV-F基因的pUC57中的合成DNA(编码SEQ ID NO：5的SEQID NO：4)和合成的多聚A尾(SEQ ID NO：9)通过GeneScript合成。
然后用SbfI/AvrII消化质粒pFSV40VP2，凝胶提取5.6kb片段。还用SbfI/AvrII消化质粒pHM103NDVFwtsyn，凝胶提取1.9kb片段。然后将片段连接在一起并使用Top10Oneshot试剂盒(目录号C404002，Invitrogen)转化。用PstI筛选菌落以获得正确的模式。使用Fugene Transfection Reagent in Chicken Embryo Fibroblast Cells(CEF's)和鸡多克隆血清抗NDV验证maxi prep的瞬时表达。对最终的供体质粒进行测序验证并命名为pFwtSV40VP2(参见图15)。
【重组体产生】
按照实施例1.1中所述的同源重组方法制备重组vHVT313。
【通过PCR分析重组体】
进行如实施例1.1中所述的PCR分析程序以验证vHVT313。
【表达分析】
进行实施例1.1中描述的表达分析以分析vHVT313的表达。
【结果】
供体质粒pFwtSV40VP2的核苷酸和氨基酸序列分配SEQ ID NO，如图1所示。
【重组体产生和表达分析】
使用鸡抗血清(Pab)和抗HVT单克隆抗体(Mab)，然后用FITC标记的抗鸡IgG和TRITC标记的Alex Fluor驴抗小鼠进行双重免疫荧光。发现所有检测的vHVT313的TRITC阳性噬菌体均表达NDV-F和IBDV-VP2蛋白。
【vHVT313的PCR分析】
使用对HVT侧翼臂，启动子，NDV-F和IBDV-VP2基因以及多聚A尾特异的引物对，通过PCR验证重组病毒的纯度。PCR结果证明重组病毒vHVT313携带预期的表达盒，病毒原种不含可检测量的亲本Vaxxitek病毒(表5和图16-17)。
表5：使用特异性引物组的预期PCR条带
引物组 Vaxxitek vHVT313
MB080+MB081 3350 5574
MB080+312P6 -- 556
MB080+VP2.F 405 2629
SV40tailR+mCMVF 3021 3021
SyntailR+SV40启动子F -- 2181
【结论】
基于PCR测试和免疫荧光分析，vHVT313是重组病毒，其含有在mCMV启动子控制下的IBDV-VP2基因和在SV40启动子控制下的NDV-F野生型基因。新生成的vHVT313不含任何可检测的亲本Vaxxitek病毒。
【实施例1.6：表达IBDV-VP2和NDV-F的重组vHVT316的构建】
该研究的目的是构建重组HVT，其中含有小鼠巨细胞病毒启动子(mCMV)的表达盒，编码传染性法氏囊病病毒病毒蛋白2(VP2)的基因，内部核糖体进入位点(IRES)，基因编码野生型新城疫病毒融合蛋白(NDV-F)和猿猴病毒40多聚A尾(SV40多聚A)整合在IG1基因座中(图2)。
构建体中使用的亲代病毒是vHVT13。新城疫病毒融合蛋白(NDV-F)对应于化学合成的基因型VIId野生型序列(GenScript)。改变该合成基因的F蛋白切割位点以匹配Lentogenic F切割位点序列，并且所得NDV-F基因序列与保藏在GenBank中的NDV-F序列具有99％氨基酸序列同一性(AY337464)。小鼠CMV IE启动子用于IBD-VP2(在亲本Vaxxitek病毒中)。在VP2基因的末端插入IRES以启动下游NDV-F基因的翻译。
插入位点是IG1(图2)。如下所述构建供体质粒pVP2IRESFwt(含有VP2基因+IRES+NDV-F的插入质粒和IG1的SV40多聚A/侧翼臂)。鸡胚成纤维细胞(CEF)用于体外重组。
【供体质粒构建】
含有IBDV VP2基因(编码SEQ ID NO：2的SEQ ID NO：1)，IRES(SEQ ID NO：10)，NDV-F基因(编码SEQ ID NO：5的SEQ ID NO：4)的pUC57中的合成DNA，和SV40多聚A尾(SEQID NO：8)，由GenScript合成。将质粒pFIRESVP2转化到dcm-/dam-感受态细胞(New EnglandBiolabs，cat#C2925I)中，然后用HindIII/SalI消化。凝胶提取5kb片段。通过GenScript合成含有部分IRES，NDV-F野生型和SV40多聚A尾的pUC57中的合成DNA。用HindIII/SalI消化质粒Sal-Hind-Fwt+。凝胶提取2.2kb片段。使用Top10Oneshot试剂盒(目录号C404002，Invitrogen)连接并转化两个片段。对最终的供体质粒进行测序验证并命名为pVP2IRESFwt(参见图18)。
【重组体产生】
按照实施例1.1中所述的同源重组方法制备重组vHVT316。
【通过PCR分析重组体】
进行如实施例1.1中所述的PCR分析程序以验证vHVT316。
【表达分析】
进行实施例1.1中描述的表达分析以分析vHVT316的表达。
【结果】
供体质粒pVP2IRESFwt的核苷酸和氨基酸序列分配SEQ ID NO，如图1所示。
【重组体产生和表达分析】
使用鸡抗血清(Pab)和单克隆抗体(Mab)，然后用FITC标记的抗鸡IgG和TRITC标记的Alex Fluor驴抗小鼠进行双重免疫荧光染色。与HVT阳性噬斑相比，发现所有检测的vHVT316噬斑均表达IBDV-VP2蛋白，并且当与NDV阳性噬斑相比时，发现所有斑块和噬斑均表达IBDV-VP2蛋白。
【vHVT316的PCR分析】
使用对HVT侧翼臂，启动子，NDV-F和IBDV-VP2基因以及多聚A尾特异的引物对，通过PCR验证重组病毒的纯度。PCR结果证明重组病毒vHVT316携带预期的表达盒，病毒原种不含可检测量的亲本Vaxxitek病毒(表6和图19-20)。
表6：使用特异性引物组的预期PCR条带
引物组 Vaxxitek vHVT316
MB080+MB081 3350 5574
MB080+312P6 -- 604
MB080+VP2.F 405 2629
SV40tailR+mCMVF 3021 5245
【结论】
基于PCR测试和免疫荧光分析，vHVT316是在mCMV启动子控制下含有IBDV-VP2和NDV-F基因的重组病毒，其中NDV-F基因的翻译由来自EMCV的IRES引发。新产生的重组vHVT316不含任何可检测的亲本Vaxxitek病毒。
【实施例1.7：表达IBDV-VP2和ILTV-gD的重组vHVT407的构建】
该研究的目的是构建重组HVT，其中含有SV40启动子，ILTV糖蛋白D和合成多聚A的表达盒进入vHVT13的SORF3-US2位点。
构建体中使用的亲代病毒是vHVT13。在构建体中使用化学合成的感染性喉气管炎病毒糖蛋白D(ILTV gD)序列(GenScript)。SV40启动子用于ILTV gD。插入基因座是ILTV gD的SORF3-US2和来自vVHT13的IBDV VP2的IG1(图2)。含有SORF3-US2臂的供体质粒HVTUS2SVgDwtsyn，SV40启动子(SEQ ID NO：7)，编码ILTV野生型gD的基因(编码SEQ ID NO：17的SEQ ID NO：16)和合成的多聚A(SEQ ID NO：9)构建了(参见图22)。鸡胚成纤维细胞(CEF)用于体外重组。
【重组体产生】
按照实施例1.1中所述的同源重组方法制备重组vHVT407。
【通过PCR分析重组体】
进行如实施例1.1中所述的PCR分析程序以验证vHVT407。
【表达分析】
进行实施例1.1中描述的表达分析以分析vHVT407的表达。
【结果】
供体质粒HVT US2SVgDwtsyn的核苷酸和氨基酸序列被指定为SEQ ID NO，如图1所示。
【重组体产生和表达分析】
使用鸡抗血清(Pab)和单克隆抗体(Mab)，然后用FITC标记的抗鸡IgG和TRITC标记的Alex Fluor驴抗小鼠进行双重免疫荧光染色。发现所有检测的vHVT407噬斑均表达IBDV-VP2和ILTV gD蛋白。
【vHVT407的PCR分析】
使用对HVT侧翼臂，启动子，ILTV gD和IBDV-VP2基因以及多聚A尾特异的引物对，通过PCR验证重组病毒的纯度。PCR结果证明重组病毒vHVT407携带预期的表达盒，病毒原种不含可检测量的亲本vHVT13病毒。
【结论】
基于PCR测试和免疫荧光分析，vHVT407是含有IBDV-VP2和ILTV gD基因的重组病毒。新产生的重组vHVT407不含任何可检测的亲本vHVT13病毒。
【实施例1.8：以相反方向构建表达NDV-F和ILTV-gD的重组vHVT308】
该研究的目的是构建用于基因间区域I位点的插入质粒，其将含有合成多聚A尾，NDV F，SV40启动子，HHV3gB启动子，ILTV gD和SV40多聚A尾，用于同源重组到HVT FC126中。
在构建体中使用的亲本病毒是HVT FC126。对应于基因型V序列的合成新城疫病毒融合蛋白(NDV-F)(编码SEQ ID NO：22的SEQ ID NO：21)是化学合成和密码子优化的(GenScript)。改变该合成基因的F蛋白切割位点以匹配Lentogenic F切割位点序列。合成的野生型ILTV糖蛋白D(编码SEQ ID NO：17的SEQ ID NO：16)是化学合成的。供体质粒pHVTIG1gDCaFopt含有反向HHV3gB启动子(人疱疹病毒属(Herpesvirus)3型糖蛋白B启动子)驱动ILTV-gD+SV40多聚A尾，构建驱动Newcastle融合蛋白+合成多聚A尾的SV40启动子(见图23)。鸡胚成纤维细胞(CEF)用于体外重组。
【重组体产生】
按照实施例1.1中所述的同源重组方法制备重组体vHVT308。进行连续传代以预MSV+13。
【通过PCR分析重组体】
进行如实施例1.1中所述的PCR分析程序以验证重组vHVT308。
【表达分析】
进行实施例1.1中描述的表达分析以分析重组vHVT308的表达。
【结果】
供体质粒pHVTIG1gDCaFopt的核苷酸和氨基酸序列分配如SEQ ID NO所示，如图1所示。
【重组体产生和表达分析】
使用鸡抗血清(Pab)和单克隆抗体(Mab)，然后用FITC标记的抗鸡IgG和TRITC标记的Alex Fluor驴抗小鼠进行双重免疫荧光染色。发现所有检测的vHVT308噬斑均表达NDV-F和ILTV-gD蛋白。
【vHVT308的PCR分析】
使用对HVT侧翼臂，启动子，NDV-F和ILTV-gD基因以及多聚A尾特异的引物对，通过PCR验证重组病毒的纯度。PCR结果表明重组病毒vHVT308携带预期的表达盒，病毒原种不含可检测量的亲本HVT病毒(表6.1和图24和25)。
表6.1：使用特异性引物组的预期PCR条带
引物组 HVT FC126 vHVT308
MB080+MB081 323bp 4697bp
syntailR+SV40启动子F - 2196bp
CAoptF.RP+404P12 - 2056bp
HHV3gBF+SV40tailR - 2043bp
所有引物对的PCR反应产生了预期的PCR产物和条带模式。如上所示，vHVT308中没有亲本HVT病毒的证据，并且vHVT308在前MSV+13代时是稳定的。
【结论】
基于PCR测试和免疫荧光分析，vHVT308是重组HVT病毒，其含有在SV40启动子控制下的NDV-F基因和在HHV3gB启动子控制下的ILTV-gD基因。vHVT308不含任何可检测的亲本HVT病毒。
【实施例1.9：构建表达NDV-F和ILTV-gD的重组vHVT322】
该研究的目的是构建重组HVT，其中含有mCMV启动子，新城疫病毒融合蛋白(NDV-F)，内部核糖体进入位点(IRES)，传染性喉气管炎糖蛋白D(ILTV-gD)的表达盒，和猿猴病毒40多聚A尾(SV40多聚A)将与vHVT13(HVT+IBD)的基因间区域1(IG1)中的侧翼臂同源重组。
构建体中使用的亲代病毒是vHVT13。对应于野生型基因型VIId序列(编码SEQ IDNO：5的SEQ ID NO：4)的新城疫病毒融合蛋白(NDV-F)是化学合成的(GenScript)。改变该合成基因的F蛋白切割位点以匹配Lentogenic F切割位点序列，并且所得NDV-F基因序列与保藏在GenBank中的NDV-F序列具有99％的核苷酸以及氨基酸序列同一性(AY337464)。合成的野生型ILTV糖蛋白D(编码SEQ ID NO：17的SEQ ID NO：16)是化学合成的。供体质粒pFwtIRESgD含有IG1的左侧翼臂，mCMV(小鼠CMV IE)启动子，NDV-F，IRES，ILTV-gD，SV40多聚A和IG1的右侧翼臂(参见图26)。鸡胚成纤维细胞(CEF)用于体外重组。
【重组体产生】
按照实施例1.1中所述的同源重组方法制备重组体vHVT322。进行连续传代以预MSV+13。
【通过PCR分析重组体】
进行如实施例1.1中所述的PCR分析程序以验证重组vHVT322。
【表达分析】
进行实施例1.1中描述的表达分析以分析重组vHVT322的表达。
【结果】
供体质粒pFwtIRESgD的核苷酸和氨基酸序列分配SEQ ID NO，如图1所示。
【重组体产生和表达分析】
使用鸡抗血清(Pab)和单克隆抗体(Mab)，然后用FITC标记的抗鸡IgG和TRITC标记的Alex Fluor驴抗小鼠进行双重免疫荧光染色。发现所有检测的vHVT322的TRITC阳性噬斑均表达NDV-F和ILTV-gD蛋白。
vHVT322的PCR分析
使用对HVT侧翼臂，启动子，NDV-F和ILTV-gD基因以及多聚A尾特异的引物对，通过PCR验证重组病毒的纯度。PCR结果表明重组病毒vHVT322携带预期的表达盒，病毒原种不含可检测量的亲本vHVT13(表6.2和图27和28)。
表6.2：使用特异性引物组的预期PCR条带
引物组 vHVT13 vHVT322
MB080+MB081 3350bp 5804bp
MB080+ILTgDwtF - 1653bp
MB080+312P6 - 2485bp
mCMVF+SV40PolyA.R1 3021bp 5105bp
所有引物对的PCR反应产生了预期的PCR产物和条带模式。如上所示，vHVT322中没有亲本vHVT13病毒的证据。
【结论】
基于PCR测试和免疫荧光分析，vHVT322是重组HVT病毒，其含有在mCMV启动子控制下的NDV-F和ILTV-gD基因。vHVT322不含任何可检测的亲本vHVT13病毒。
【实施例1.10：构建表达ILT-gDwt的重组vHVT406】
该研究的目的是构建重组HVT，其中SORF3-US2位点含有SV40启动子，感染性喉气管炎gD和合成的多聚A尾用于HVT FC126的同源重组。
在构建体中使用的亲本病毒是HVT FC126。合成的传染性喉气管炎病毒(ILTV)野生型糖蛋白D(gDwt)是化学合成的。供体质粒pHVTUS2SVgDwtsyn含有HVT FC126的SORF3和US2臂，SV40启动子，ILTV gDwt(编码SEQ ID NO：17的SEQ ID NO：16)和合成的多聚A(参见图29)。鸡胚成纤维细胞(CEF)用于体外重组。
【重组体产生】
按照实施例1.1中所述的同源重组方法制备重组体vHVT406。进行连续传代以预MSV+13(x+12)。
【通过PCR分析重组体】
进行如实施例1.1中所述的PCR分析程序以验证重组vHVT406。
【表达分析】
进行实施例1.1中描述的表达分析以分析重组vHVT406的表达。
【结果】
供体质粒pHVTUS2SVgDwtsyn的核苷酸和氨基酸序列被指定为SEQ ID NO，如图1所示。
【重组体产生和表达分析】
将HVT病毒的基因组DNA与pHVTUS2SVgDwtsyn供体质粒共电穿孔，以使用同源重组技术产生重组HVT。通过免疫荧光阳性孔选择和多轮噬斑纯化中的PCR筛选从亲代HVT病毒中分离重组病毒。表达ILTV-gD蛋白的噬斑纯化的重组HVT病毒命名为vHVT406。
使用TRITC和FITC过滤器观察重组vHVT406病毒噬斑以进行双重染色。FITC显示ILTV-gDwt表达，TRITC显示HVT表达。由于96孔板的小孔，记录每个孔，首先用TRITC过滤器计数噬菌斑，然后用FITC过滤器重新计数。在前MSV和前MSV+13代之间计数合并的600+斑块。两个传代的FITC和TRITC均为阳性。
【vHVT406的PCR分析】
使用表6.3中列出的PCR引物进行vHVT406的PCR分析(参见图30)。如图31所示，凝胶电泳后PCR产物的大小与预期的大小和条带模式很好地对应。在vHVT406中没有亲代HVTFC126病毒的证据。
表6.3：使用特异性引物组的预期PCR条带
引物 HVT FC126 pHVTUS2SVgDwtsyn vHVT406
SORF3.FP+US2.RP 0.334 2.218 2.218
SORF3.FP+404P12 -- 0.733 0.733
SV40启动子F+syntailR -- 1.829 1.829
MB080+MB081 0.323 -- 0.323
引物 SB-1 pHVTUS2SVgDwtsyn vHVT406
SB1SORF4+SB1US2R 0.989 -- --
【结论】
基于PCR测试和免疫荧光分析，vHVT406是重组HVT病毒，其在SOrf3-US2位点含有SV40启动子，ILTV-gDwt基因和合成的多聚A尾。vHVT406不含任何可检测的亲本HVT病毒。
【实施例1.11：HVT载体的体外稳定性研究】
在鸡胚成纤维细胞(CEF)中多次体外传代后，测试上面构建的HVT载体的基因组/表达稳定性。表达两个基因的HVT载体在多次传代后是稳定的。与具有多个插入物的HVT较不稳定的常识相反，结果令人惊讶地证明本发明的HVT载体是稳定的并且有效地表达两个基因。
【实施例2：SPF小鸡中vHVT306，vHVT309，vHVT310和vHVT311在D28诱导的新城疫(ND)功效】
该研究的目的是评估施用给一日龄SPF鸡的表达IBDV VP2基因和NDV F基因的四种HVT重组构建体(vHVT306，vHVT309，vHVT310和vHVT311)对抗在D28进行的新城疫攻击(Texas GB菌株)的功效。
这些疫苗候选物的特征描述于下表7中。
表7：攻击研究中使用的载体的特征
vHVT306*：表达IBDV VP2和NDV F的vHVT载体(参见US9,114,108)，用作对照。
vHVT13**是基于表达IBDV VP2基因的HVT载体的许可的VAXXITEK HVT-IBD疫苗的活性成分(在US 5,980,906和EP 0 719864中描述为vHVT17)。
如表8所示，将95只1日龄无特定病原体(SPF)雏鸡分配到5组。所有1至4组(20只鸡/组)的禽类通过皮下(SC)途径接种0.2mL在所示剂量下的不同HVT-IBD+ND构建体的结果(参见表8)。来自第5组的15只鸡未接种疫苗。接种后28(D28)天，每组中的禽类通过肌肉内(IM)途径用NDV Texas GB菌株攻击(104.0卵感染剂量50％(EID50)，0.1mL/鸟)。在攻击后14天观察鸟类的临床症状。在攻击后长达14天未显示任何ND临床症状(包括中枢神经或呼吸征兆和/或死亡)的鸟被认为是受保护的。
保护结果显示在表8中。第5组的所有对照鸟在攻击后死亡。接种疫苗组的保护率至少达到90％。
表8：SPF雏鸡中不同HVT-IBD+ND双构建体诱导的ND功效
组 疫苗 剂量(PFU) D28攻击后的ND保护
1 vHVT306* 1580 95％(19/20)
2 vHVT309 1680 90％(18/20)
3 vHVT310 2840 95％(19/20)
4 vHVT311 2980 90％(18/20)
5 - - 0％(0/15)
vHVT306*：用作对照
【实施例3：vHVT309，vHVT310，vHVT311和vHVT407对D35标准IBDV攻击诱导的IBD功效】
该研究的目的是评估施用给一日龄SPF鸡的表达IBDV VP2基因和NDV F基因的三种HVT重组构建体(vHVT309，vHVT310和vHVT311)和表达IBDV VP2基因和ILTV gD基因的一种构建体(vHVT407)对抗在D35进行的标准IBDV攻击的效力。
将一日龄无特定病原体(SPF)小鸡分成4组，如表9所示。来自第1组至第4组(20只鸡/组)的所有禽类通过皮下(SC)途径接种0.2mL不同的以所示剂量的HVT-IBD+ND或HVT-IBD+ILT构建体。来自第5组的20只鸟未接种疫苗。接种后35天(在D35)，通过眼内(IO)途径(102.0EID50，0.03mL/鸟)用传染性法氏囊病病毒(IBDV)经典STC株攻击所有禽类。攻击后4天(在D39)，终止所有的禽类并进行尸体剖检以检查严重的法氏囊病变。
保护结果显示在表9中。所有接种疫苗的禽类(除了两只接种vHVT311的禽类)都受到IBD保护，而对照鸟类均未受到保护。
表9：用STC IBDV株在D35攻击后SPF小鸡中不同HVT-IBD+ND或HVT-IBD+ILT双构建体诱导的IBD功效
组 疫苗 剂量(PFU) D35攻击后的IBD STC保护
1 vHVT309 2180 100％(20/20)
2 vHVT310 3980 100％(20/20)
3 vHVT311 3180 90％(18/20)
4 vHVT407 1220 100％(20/20)
5 - - 0％(0/20)
【实施例4：vHVT309，vHVT310，vHVT311和vHVT407针对D35变异IBDV攻击诱导的IBD功效】
该研究的目的是评估施用给一日龄SPF鸡的表达IBDV VP2基因和NDV F基因的三种HVT重组构建体(vHVT309，vHVT310和vHVT311)和表达IBDV VP2基因和ILTV gD基因的一种构建体(vHVT407)对抗在D35进行的变体(Delaware E)IBDV攻击的效力。
将一日龄无特定病原体(SPF)雏鸡分为6组，如表10所示。所有1至4组鸡(19-20只鸡/组)通过皮下(SC)途径接种0.2mL在所示剂量下，不同HVT-IBD+ND或HVT-IBD+ILT构建体。来自第5组(19只鸟)和第6组(18只)的鸟未接种疫苗。在D35，来自组1至5的所有禽类通过眼内(IO)途径(103.0EID50，0.03mL/鸟)用传染性法氏囊病病毒(IBDV)变体Delaware E株进行攻击。来自第6组的鸟类没有受到攻击。在D46，测量所有鸟的体重和法氏囊重量。计算所有组的B/B wt.比(法氏囊重量/体重比x100)。
保护结果显示在表10中。来自第1组和第2组的接种疫苗的禽类具有与未接种疫苗的未攻击对照(第6组)相似，且大于未接种疫苗的对照组的平均B/B wt.比(第5组)。第3组的鸟类未受到保护，第4组的鸟类受到部分保护。令人惊讶的是，含有IRES的vHVT310比含有P2A的vHVT311提供了更好的保护。
表10：在D35用变体E IBDV株攻击后，SPF小鸡中不同HVT-IBD+ND或HVT-IBD+ILT双构建体诱导的IBD功效
组 疫苗 剂量(PFU) 鸟数 在D35的IBDV攻击 平均值B/B wt.比
1 vHVT309 2180 20 是 0.43
2 vHVT310 3980 20 是 0.50
3 vHVT311 3180 20 是 0.18
4 vHVT407 1220 19 是 0.32
5 - - 19 是 0.13
6 - - 18 否 0.45
【实施例5：vHVT306，vHVT309和vHVT310针对肉鸡D28中的vvIBDV攻击诱导的IBD功效】
该研究的目的是评估施用给一日龄肉鸡的表达IBDV VP2基因和NDV F基因的三种HVT重组构建体(vHVT306，vHVT309和vHVT310)对抗在D28进行的vvIBDV攻击的功效。
如表11所示，将70只一日龄肉鸡(Hubbard JA957系)分配到5组。来自第2组至第5组(约15只鸡/组)的所有禽类通过皮下(SC)途径接种0.2mL在所示剂量下的不同HVT-IBD+ND构建体。来自第1组的10只鸡未接种疫苗。接种后28天(在D28)，通过眼内(IO)途径(104.3EID50，0.05mL/鸟)用强毒IBDV(vvIBDV)91-168菌株攻击所有禽类。攻击后10天(在D38)，终止所有的禽类并进行尸体剖检以检查法氏囊损伤。法氏囊和身体被加权并且在法氏囊上进行组织病理学检查。根据以下等级将法氏囊的组织学损伤评分为0～5：0-无病变，正常法氏囊；1～1％～25％的卵泡显示淋巴耗尽(即，1个受影响的卵泡中耗尽少于50％)，病变中的嗜异性细胞流入；2～26％至50％的卵泡显示几乎完全淋巴耗尽(即，1个受影响的卵泡中耗尽超过75％)，受影响的卵泡显示出坏死病变并且可以检测到严重的嗜异性细胞流入；3～51％至75％的卵泡显示淋巴耗尽；受影响的卵泡显示坏死病变，并检测到严重的嗜异性细胞流入；4～76％至100％的卵泡显示几乎完全淋巴耗尽；检测到增生和囊肿结构；受影响的卵泡显示坏死病变，并检测到严重的嗜异性细胞流入；并且5-100％的卵泡显示出几乎完全的淋巴耗尽；完全丧失卵泡结构；增厚和折叠的上皮；法氏囊组织纤维化。如果它们在攻击后没有显示临床症状并且它们的组织学评分≤2，则认为鸟类受到保护。
在这批肉鸡的第一周有一些早期死亡可能是由于大肠杆菌病。测试疫苗的剂量低于预期(2000PFU)。保护结果显示在表11中。通过接种诱导部分保护，其显示vHVT310高于vHVT306和vHVT309。
表11：用vvIBDV株在D28攻击后肉鸡中不同HVT-IBD+ND双构建体诱导的IBD功效
组 疫苗 剂量(PFU) 平均法氏囊/身体重量比(*1000) 基于组织病理学评分的保护
1 - - 0.75 0％
2 vHVT306 955 1.07 20％
3 vHVT309 741 0.89 20％
4 vHVT310 708 1.38 53％
5 vHVT13* 2000 1.99 80％
vHVT13*：用作对照。
【实施例6：vHVT306，vHVT309和vHVT310针对肉鸡D42中的速发性NDV攻击诱导的ND功效】
该研究的目的是评估施用给一日龄肉鸡的表达IBDV VP2基因和NDV F基因的三种HVT重组构建体(vHVT306，vHVT309和vHVT310)对抗在D42进行的速发性NDV攻击的效力。
将一日龄肉鸡(Hubbard JA957系)分配到4组，如表12所示。来自第2组至第4组(16-20只/组)的所有禽类通过皮下(SC)途径接种0.2mL在所示剂量下的不同HVT-IBD+ND构建体。来自第1组的12只鸟未接种疫苗。接种疫苗后42天(在D42)，通过肌内(IM)途径(105.0EID50，0.2mL/鸟)用速发型NDV Herts 33菌株攻击所有禽类。在攻击后14天期间观察所有鸟的临床症状。如果鸟类没有死亡或显示ND临床症状，则认为它们受到保护。
在这批肉鸡的第一周有一些早期死亡可能是由于大肠杆菌病。测试疫苗的剂量低于预期(2000PFU)。保护结果显示在表12中。通过用vHVT309和vHVT310接种，然后用vHVT306诱导最佳保护。
表12：在D42用速发型NDV毒株攻击后肉鸡中不同HVT-IBD+ND双构建体诱导的ND效力
组 疫苗 剂量(PFU) 针对死亡率的保护 针对死亡率和发病率的保护
1 - - 8.3％ 0％
2 vHVT306 955 68.8％ 62.5％
3 vHVT309 741 85％ 85％
4 vHVT310 708 85％ 80％
【实施例7：vHVT306，vHVT309和vHVT310针对肉鸡D42的速发性NDV攻击诱导的ND效力】
该研究的目的是重新评估表达IBDV VP2基因和NDV F基因的三种HVT重组构建体(vHVT306，vHVT309和vHVT310)对一日龄肉鸡的效力，以对抗在D42进行的速发性NDV攻击。
将一日龄肉鸡(Hubbard JA957系)分配到4组，如表13所示。来自第2组至第4组(16-20只鸡/组)的所有禽类通过皮下(SC)途径接种0.2mL在2000PFU下不同的HVT-IBD+ND构建体。来自第1组的19只鸡未接种疫苗。接种疫苗后42天(在D42)，通过肌内(IM)途径(105.0EID50，0.2mL/鸟)用速发型NDV Herts 33菌株攻击所有禽类。在攻击后14天期间观察所有鸟的临床症状。如果鸟类没有死亡或显示ND临床症状，则认为它们受到保护。
保护结果显示在表13中。总体而言，保护水平高于先前的研究(参见实施例6)，但它们遵循相同的趋势：通过用vHVT309和vHVT310接种，然后接种vHVT306诱导最佳保护。
结果显示vHVT309对于SPF以及肉鸡的ND攻击比vHVT306更有效(表12和13)，表明在一个基因座中插入异源多核苷酸对病毒整体适应性的负面影响小于插入多个基因座。
表13：不同HVT-IBD+ND双构建体在D42攻击后用速发型NDV毒株诱导的ND效力
组 疫苗 剂量(PFU) 针对死亡率的保护 针对死亡率和发病率的保护
1 - - 0％ 0％
2 vHVT306 955 75％ 75％
3 vHVT309 741 94％ 89％
4 vHVT310 708 94％ 94％
【实施例8：vHVT306，vHVT309和vHVT310对SPF雏鸡D14中标准IBDV攻击诱导的IBD功效】
该研究的目的是评估施用给一日龄SPF鸡的表达IBDV VP2基因和NDV F基因的三种HVT重组构建体(vHVT306，vHVT309和vHVT310)对抗在D14进行的标准IBDV攻击的功效。
将一日龄无特定病原体(SPF)小鸡分成4组，如表14所示。来自第1组至第3组(21-22只/组)的所有禽类通过皮下(SC)途径接种0.2mL在所示剂量下的不同HVT-IBD+ND构建体。来自第4组的22只鸟未接种疫苗。接种后14天(在D14)，通过眼内(IO)途径(101.4EID50，0.03mL/鸟)用传染性法氏囊病病毒(IBDV)经典STC株攻击所有禽类。攻击后4天(在D18)，终止所有的禽类并进行尸体剖检以检查法氏囊损伤。
保护结果显示在表14中。3种实验疫苗诱导了相似水平的IBD保护，而除了一只对照禽类外，其他所有疫苗都被感染。
表14：在用STC IBDV株在D14攻击后SPF小鸡中不同HVT-IBD+ND双构建体诱导的IBD功效
组 疫苗 剂量(PFU) D14攻击后的IBD STC保护(感染的/总和)
1 vHVT306 2061 68.2％(7/22)
2 vHVT309 1476 76.2％(5/21)
3 vHVT310 1970 68.2％(7/22)
4 - - 4.5％(21/22)
【实施例9：在D14的变异IBD攻击后由vHVT306，vHVT309和vHVT310在SPF小鸡中诱导的IBD功效】
该研究的目的是评估施用给一日龄SPF鸡的表达IBDV VP2基因和NDV F基因的三种HVT重组构建体(vHVT306，vHVT309和vHVT310)对抗在D14进行的变体IBDV攻击的功效。
将一日龄无特定病原体(SPF)小鸡分配到5组，如表15所示。来自第1组至第3组(20只鸡/组)的所有禽类通过皮下(SC)途径接种0.2mL不同的以所示剂量的HVT-IBD+ND构建体。来自第4组和第5组(19-20只鸟/组)的鸟未接种疫苗。在D14，来自组1至4的所有禽类通过眼内(IO)途径(102.2EID50，0.03mL/鸟)用传染性法氏囊病病毒(IBDV)变体Delaware E株进行攻击。来自第5组的鸟类没有受到攻击。在D25，测量所有鸟的体重和法氏囊重。计算所有组的B/B wt.比(法氏囊重量/体重比x100)。
保护结果显示在表15中。3种疫苗在D14诱导部分保护，对vHVT309和vHVT310的保护作用更高。
重组vHVT306和vHVT309具有两个独立的表达盒(两个mRNA)。通过IRES或P2A表达2种基因的构建体(例如，vHVT310，vHVT317，vHVT311，vHVT316，vHVT322)不仅在一个插入位点，而且基因也从单个mRNA表达。比较表11至19中呈现的所有数据，其显示一个插入位点重组体vHVT309和vHVT310比两个插入位点重组体vHVT306更有效，表明在一个插入基因座中携带多于一个异源多核苷酸的HVT重组体在生物学上比HVT重组体在多个插入基因座中携带异源多核苷酸。此外，令人惊讶的是，通过IRES表达的单个mRNA表达多于一种异源多核苷酸对IBD功效的负面影响较小，特别是在肉鸡中(参见表11的结果)。
表15：用变体E IBDV株在D14攻击后SPF小鸡中不同HVT-IBD+ND双构建体诱导的IBD功效
组 疫苗 剂量(PFU) 鸟数 在D14的IBDV攻击 平均值B/B wt.比
1 vHVT306 2061 20 是 0.18
2 vHVT309 1476 20 是 0.33
3 vHVT310 1970 20 是 0.27
4 - - 19 是 0.13
5 - - 20 否 0.64
【实施例10：vHVT306，vHVT309和vHVT310针对SPF雏鸡中D28的标准IBDV攻击诱导的IBD功效】
该研究的目的是评估施用给一日龄SPF鸡的表达IBDV VP2基因和NDV F基因的三种HVT重组构建体(vHVT306，vHVT309和vHVT310)对抗在D28进行的标准IBDV攻击的功效。
将一日龄无特定病原体(SPF)雏鸡分为4组，如表16所示。来自第1组至第3组(20-22只鸡/组)的所有禽类通过皮下(SC)途径接种0.2mL在所示剂量下的不同HVT-IBD+ND构建体。来自第4组的22只鸟未接种疫苗。接种后28天(在D28)，通过眼内(IO)途径(102.0EID50，0.03mL/鸟)用传染性法氏囊病病毒(IBDV)经典STC株攻击所有禽类。攻击后4天(在D32)，终止所有的禽类并进行尸体剖检以检查法氏囊损伤。
保护结果显示在表16中。由vHVT310诱导完全保护，而对于其他候选疫苗仅有少数鸟没有受到保护。
表16：用STC IBDV株在D28攻击后SPF小鸡中不同HVT-IBD+ND双构建体诱导的IBD功效
组 疫苗 剂量(PFU) D28攻击后的IBD STC保护(感染的/总和)
1 vHVT306 2061 86.4％(3/22)
2 vHVT309 1476 95.0％(1/20)
3 vHVT310 1970 100％(0/22)
4 - - 4.5％(21/22)
【实施例11：在D28变异IBD攻击后由vHVT306，vHVT309和vHVT310在SPF小鸡中诱导的IBD功效】
该研究的目的是评估施用给一日龄SPF鸡的表达IBDV VP2基因和NDV F基因的三种HVT重组构建体(vHVT306，vHVT309和vHVT310)对抗在D28进行的变体IBDV攻击的功效。
将一日龄无特定病原体(SPF)小鸡分配至5组，如表17所示。来自第1组至第3组(20只鸡/组)的所有禽类通过皮下(SC)途径接种0.2mL不同的以所示剂量的HVT-IBD+ND构建体。来自第4组和第5组(18-19只鸟/组)的鸟未接种疫苗。在D28，来自组1至4的所有禽类通过眼内(IO)途径(102.2EID50，0.03mL/鸟)用传染性法氏囊病病毒(IBDV)变体Delaware E株进行攻击。来自第5组的鸟类没有受到攻击。在D39，测量所有鸟的体重和法氏囊重量。计算所有组的B/B wt.比(法氏囊重量/体重比x100)。
保护结果示于表17中。由于该组意外地用STC IBDV株感染，因此不能获得第5组(未攻击组)的B/B wt比率。vHVT310诱导的保护作用高于vHVT306和vHVT309诱导的保护作用。
表17：在用变体E IBDV株在D28攻击后，SPF小鸡中不同HVT-IBD+ND双构建体诱导的IBD功效
组 疫苗 剂量(PFU) 鸟数 在D28的IBDV攻击 平均值B/B wt.比
1 vHVT306 2061 20 是 0.21
2 vHVT309 1476 20 是 0.26
3 vHVT310 1970 20 是 0.37
4 - - 19 是 0.11
5 - - 20 否 ND*
*由于该组中的标准IBDV暴露未完成
【实施例12：SPF雏鸡中vHVT306，vHVT309和vHVT310在D21和D28诱导的新城疫(ND)功效】
该研究的目的是评估施用给一日龄SPF鸡的表达IBDV VP2基因和NDV F基因的三种HVT重组构建体(vHVT309，vHVT310和vHVT311)对抗在D21和D28进行的新城疫攻击(TexasGB菌株)的功效。
将一日龄无特定病原体(SPF)小鸡分成4组，如表18所示。来自第1组至第3组(50只鸡/组)的所有禽类通过皮下(SC)途径接种0.2mL不同的以所示剂量的HVT-IBD+ND构建体。来自第4组的30只鸡未接种疫苗。接种后二十一天(D21)，来自第1-3组的20只鸟和来自第4组的15只鸟通过肌肉内(IM)途径用NDV Texas GB菌株攻击(104.2鸡蛋感染剂量50％(EID50)在0.1mL/鸟)。疫苗接种后28天(D28)，来自1-3组的30只鸡和来自第4组的15只鸡用NDVTexas GB菌株通过肌内(IM)途径(104.3鸡蛋感染剂量50％(EID50)在0.1mL中攻击)/鸟)。在攻击后14天观察鸟类的临床症状。在攻击后长达14天未显示任何ND临床症状(包括中枢神经或呼吸征兆和/或死亡)的鸟被认为是受保护的。
保护结果显示在表18中。组4的所有对照组在攻击后死亡。vHVT310诱导的保护最好是vHVT306和vHVT309。
表18：SPF小鸡中不同HVT-IBD+ND双构建体诱导的D21和D28的ND效力
vHVT306*：用作对照
【实施例13：由SPF小鸡中的vHVT306，vHVT309和vHVT310诱导的马立克氏病(MD)功效】
该研究的目的是评估施用给1日龄SPF鸡的表达IBDV VP2基因和NDV F基因的三种HVT重组构建体(vHVT309，vHVT310和vHVT311)对马立克氏病的攻击(GA株，2批&2个稀释)的功效。
将一日龄无特定病原体(SPF)小鸡分配至4组，如表19所示。来自第1组至第3组(20只鸡/组)的所有禽类通过皮下(SC)途径接种0.2mL不同的以所示剂量的HVT-IBD+ND构建体。来自第4组的20只鸡未接种疫苗。接种后4天(D4)，来自组1-4的18-20只鸡用2个不同批次(#1和#2)的2个稀释(1:5和1:640)的vMDV GA22株通过SC途径进行攻击。在孵化后46-50天观察鸟类可归因于马立克氏病的临床症状。在D46-D50，对所有剩余的鸡进行尸体剖检并检查马立克氏病的病变。没有显示任何MD临床体征或病变的鸟被认为是受保护的。
保护结果显示在表19中。组4的对照鸟的感染性在75-90％之间变化。总体而言，vHVT310诱导的保护最好是vHVT306和vHVT309。
表19：不同HVT-IBD+ND双构建体在SPF小鸡中针对2个不同批次的以1:5或1:640稀释的GA22攻击诱导的MD效力
vHVT306*：用作对照
【实施例14：vHVT306和vHVT407针对SPF小鸡中D21的经典IBDV攻击诱导的IBD功效】
该研究的目的是评估施用给一日龄SPF鸡的2种HVT重组构建体(一种(vHVT306)表达IBDV VP2基因和NDV F基因，另一种(vHVT407)表达IBDV VP2基因和ILTV gD基因)对抗在D21进行的经典IBDV攻击的功效。
将40只一日龄SPF雏鸡(白色来亨鸡)分成3组，如表20所示。来自第2组和第3组的所有禽类(约15只鸡/组)通过皮下(SC)途径接种0.2mL vHVT306或vHVT407以所示剂量构建。来自第1组的10只鸡未接种疫苗。接种后二十一天(在D21)，通过眼内(IO)途径(0.05mL中102.0EID50/鸟)用经典的52/70Faragher IBDV株攻击所有禽类。攻击后11天(在D32)，终止所有禽类并进行尸体剖检以检查法氏囊损伤。法氏囊和身体被加权以计算法氏囊体重比。如果鸟类在攻击后未显示临床症状或法氏囊病变，则认为它们受到保护。
保护结果显示在表20中。通过用vHVT306或vHVT407接种诱导完全IBD保护。
表20：在使用Faragher IBDV株在D21攻击后在SPF小鸡中表达2种基因的2种HVT构建体诱导的IBD功效
vHVT306*：用作对照。**平均值±标准差
【实施例15：vHVT407诱导的针对SPF小鸡中D21的ILTV攻击的ILT功效】
该研究的目的是评估施用给1日龄SPF鸡的表达IBDV VP2基因和ILTV gD基因的2种vHVT407重组构建体对抗在D21进行的ILTV攻击的功效。
如表21所示，将24只1日龄SPF雏鸡(白色来亨鸡)分成2组。所有禽类(约12只鸡/组)通过皮下(SC)途径接种0.2mL vHVT13(用作所示剂量的阴性对照)或vHVT407构建体。接种后二十一天(在D21)，通过气管内(IT)途径(103.6EID50，0.5mL/鸟)用ILT-96-3ILTV株攻击所有禽类。在攻击后11天观察鸟的临床症状。在研究第25-29和32天，观察所有禽类的临床症状，包括呼吸模式，结膜炎，抑郁症和死亡率。在研究第32天，所有剩余的鸟都被终止了。如果它们没有显示ILT临床症状，例如与咳嗽，打喷嚏，罗音，抑郁，喘气和/或血性粘液渗出物相关的呼吸窘迫，包括死亡，则认为鸟类受到保护。
保护结果显示在表21中。在这些攻击条件下通过用vHVT407接种诱导显着的ILT保护。
表21：用ILT-96-3ILTV株在D21攻击后由vHVT407构建体在SPF小鸡中诱导的ILT功效
组 疫苗 剂量(PFU) 临床体征#死亡/#患病/总和 临床保护
1 vHVT13* 3420 6/2/11 27％
2 vHVT407 2880 2/0/12 83％
vHVT13*：用作阴性对照。
【实施例16：针对在肉鸡中D21的ILTV攻击而由vHVT407，商业HVT-ILT和商业鸡胚来源(CEO)疫苗诱导的ILT功效】
该研究的目的是评估施用给1日龄肉鸡的表达IBDV VP2基因和ILTV gD基因的vHVT407重组构建体与商业HVT-ILT疫苗(ILT)相比对抗在D21进行的ILTV攻击的效力。/>
如表22所示，将48只1日龄商品肉鸡分成3组。所有组(约12只鸡/组)1-3组通过皮下(SC)途径接种0.2mL vHVT13(用作阴性对照)，vHVT407或ILT(用作阳性对照)构建体，所示剂量。接种后21天(在D21)，通过气管内(IT)途径(104.2EID50，0.5mL/鸟)用ILT-96-3ILTV株攻击所有禽类。在攻击后12天观察鸟的临床症状。在研究第25-29天和第32-33天，对所有禽类进行观察并对临床症状进行评分，包括呼吸模式，结膜炎，抑郁症和死亡率。在研究第34天，所有剩余的鸟都被终止了。如果它们没有显示ILT临床症状，例如与咳嗽，打喷嚏，罗音，抑郁，喘气和/或血性粘液渗出物相关的呼吸窘迫，包括死亡，则认为鸟类受到保护。
保护结果显示在表22中。通过用vHVT407接种诱导ILT保护，其高于INNOVAX ILT诱导的保护。
表22：用ILT-96-3ILTV株在D21攻击后肉鸡中vHVT407和INNOVAX ILT构建体诱导的ILT功效
组 疫苗 剂量 临床体征#死亡/#患病/总和 临床保护
1 vHVT13* 2200PFU 5/7/12 0％
2 vHVT407 1860PFU 1/4/11 55％
3 INNOVAX ILT** 2240PFU 0/10/12 17％
vHVT13*：用作阴性对照。**ILT用作阳性对照
【实施例17：由SPF鸡中的vHVT310和vHVT316在D14，D21和D32诱导的新城疫(ND)功效】
该研究的目的是比较施用给一日龄SPF鸡的表达IBDV VP2基因和NDV F基因的2种HVT重组构建体(vHVT310和vHVT316)对抗在D14，D21和D32进行的新城疫攻击(德克萨斯GB菌株)的ND免疫的开始。
将一日龄无特定病原体(SPF)小鸡分成3组，如表23所示。来自第1组至第2组的所有禽类(59-70只鸡/组；见表)通过皮下(SC)途径接种在所示剂量下用0.2mL不同的HVT-IBD+ND构建体。来自第3组的45只鸡未接种疫苗。在D14，D21和D32，来自组1-3的15-30只鸡(见表)用NDV Texas GB菌株通过肌肉内(IM)途径(104.0EID50/鸟)以0.1mL/鸟攻击。在攻击后14天观察鸟类的临床症状。在攻击后长达14天未显示任何ND临床症状(包括中枢神经或呼吸征兆和/或死亡)的鸟被认为是受保护的。
保护结果显示在表23中。组3的所有对照组在攻击后死亡。由vHVT310和vHVT316诱导的保护水平相似，可能由vHVT316诱导的早期免疫起效。
表23：SPF雏鸡中不同HVT-IBD+ND双构建体诱导的D14，D21和D32的ND效力
【实施例18：由表达ILTV gD和IBDV VP2或表达ILTV gD和NDV F的HVT载体诱导的ILTV功效】
该研究的目的是评估施用给鸡的表达ILTV gD和IBDV VP2的HVT重组构建体(例如vHVT317和vHVT407)或表达ILTV gD和NDV F基因的HVT重组构建体(例如vHVT308和vHVT322)对抗ILTV攻击的功效。
鸡被分配到不同的组。通过皮下(SC)途径用0.2mL不同的HVT构建体接种禽类。来自一组的鸟未接种疫苗。通过气管内(IT)或眶下窦道路向ILTV攻击鸟类。在攻击后11-14天观察鸟类的临床症状。在攻击后长达14天未显示任何ILTV临床症状(包括与咳嗽，打喷嚏，罗音，抑郁，喘气和/或血性粘液渗出物和/或死亡相关的呼吸窘迫)的鸟被认为是受保护的。
结果显示HVT载体提供针对ILTV感染的保护。
【实施例19：由表达ILTV gD和IBDV VP2的HVT载体诱导的IBD功效】
该研究的目的是评估施用给鸡的表达ILTV gD和IBDV VP2的HVT重组构建体(例如vHVT317和vHVT407)对抗IBD攻击的功效。
鸡被分配到不同的组。通过皮下(SC)途径用0.2mL不同的HVT构建体接种禽类。来自一组的鸟未接种疫苗。通过眼内(IO)途径用IBD攻击鸟类。在攻击后4～10天观察鸟类的临床症状。未显示任何IBD临床症状(包括抑郁和/或死亡)并且在攻击后长达10天未显示法氏囊病变和/或萎缩的鸟被认为是受保护的。
结果显示HVT载体提供针对IBD感染的保护。
【实施例20：由表达ILTV gD和NDV F的HVT载体诱导的NDV功效】
该研究的目的是评估施用给鸡的表达ILTV gD和NDV F基因的HVT重组构建体(例如vHVT308和vHVT322)对抗NDV攻击的功效。
鸡被分配到不同的组。通过皮下(SC)途径用0.2mL不同的HVT构建体接种禽类。来自一组的鸟未接种疫苗。通过肌肉内(IM)途径使NDV对鸟类进行攻击。在攻击后14天观察鸟类的临床症状。在攻击后长达14天未显示任何ND临床症状(包括中枢神经或呼吸征兆和/或死亡)的鸟被认为是受保护的。
结果显示HVT载体提供针对NDV感染的保护。
【实施例21：vHVT316和vHVT317对SPF雏鸡D28标准IBDV攻击诱导的IBD功效】
该研究的目的是评估施用给一日龄SPF鸡的表达IBDV VP2基因和NDV F基因(vHVT316)或IBDV VP2基因和ILTV gD基因(vHVT317)的2种HVT重组构建体(vHVT316和vHVT317)对抗在D28进行的标准IBDV攻击的功效。
将一日龄无特定病原体(SPF)小鸡分成3组，如表24所示。来自第1组和第2组的所有禽类(15只鸡/组)通过皮下(SC)途径接种0.2mL vHVT316和vHVT317，剂量指示。来自第3组的15只鸡未接种疫苗。接种后28天(在D28)，通过眼内(IO)途径(102.0EID50，0.03mL/鸟)用传染性法氏囊病病毒(IBDV)经典STC株攻击所有禽类。攻击后4天(在D32)，终止所有的禽类并进行尸体剖检以检查法氏囊损伤。
保护结果示于表24。保护结构分别由vHVT316和vHVT317诱导100％和80％；然而，vHVT317的给药剂量比vHVT316的剂量低近3倍。
表24：用STC IBDV株在D28攻击后在SPF小鸡中由HVT-IBD+ND(vHVT316)和HVT-IBD+ILT(vHVT317)双构建体诱导的IBD功效
组 疫苗 剂量(PFU) D28攻击后的IBD STC保护(感染的/总和)
1 vHVT316 2910 100％(0/15)
2 vHVT317 1030 80.0％(3/15)
3 - - 6.7％(14/15)
【实施例22：在D28变异IBD攻击后由vHVT310，vHVT316和vHVT317在SPF小鸡中诱导的IBD功效】
该研究的目的是评估施用给一日龄SPF鸡的表达IBDV VP2基因和NDV F基因(vHVT310和vHVT316)或IBDV VP2基因和ILTV gD基因(vHVT317)的三种HVT重组构建体(vHVT310，vHVT316和vHVT317)对抗在D28进行的变异IBDV攻击的功效。
将一日龄无特定病原体(SPF)雏鸡分为5组，如表25所示。所有1至3组(15只鸡/组)的禽类通过皮下(SC)途径接种0.2mL vHVT310，vHVT316和vHVT317，剂量指示。来自第4组和第5组(15只鸡/组)的鸟未接种疫苗。在D28，来自组1至4的所有禽类通过眼内(IO)途径(103.0EID50，0.03mL/鸟)用传染性法氏囊病病毒(IBDV)变体Delaware E株进行攻击。来自第5组的鸟类没有受到攻击。在D39，测量所有鸟的体重和法氏囊重量。计算所有组的B/B wt.比(法氏囊重量/体重比x100)。
表25中显示了保护结果。在所有接种疫苗的组中观察到保护作用。vHVT317的保护作用略高于vHVT310和vHVT316诱导的保护，尽管其剂量较低。
表25：在具有变体E IBDV毒株的D28攻击后，在SPF小鸡中具有双插入物的不同HVT构建体诱导的IBD功效
组 疫苗 剂量(PFU) 鸟数 在D28的IBDV攻击 平均值B/B wt.比
1 vHVT310 2260 15 是 0.34
2 vHVT316 2910 15 是 0.33
3 vHVT317 1030 15 是 0.40
4 - - 15 是 0.12
5 - - 15 否 0.43
【实施例23：由vHVT317诱导的针对SPF小鸡中D28的ILTV攻击的ILT功效】
该研究的目的是评估施用给1日龄SPF鸡的表达IBDV VP2基因和ILTV gD基因的vHVT317重组构建体对抗在D28进行的ILTV攻击的功效。
如表26所示，将36只1日龄SPF雏鸡(白色来亨鸡)分成2组。所有禽类(约18只鸡/组)通过皮下(SC)途径接种0.2mL vHVT317或留下未接种疫苗。接种后28天(在D28)，通过气管内(IT)途径(103.0EID50，0.2mL/鸟)用ILT-96-3ILTV株攻击所有禽类。在D32，D36和D39观察鸟类的临床症状和死亡率。临床症状包括呼吸模式，结膜炎，抑郁症和死亡率。在研究第32天，所有剩余的鸟都被终止了。使用3种不同标准使用保护性评价：(1)任何连续三天出现任何临床症状或在攻击后死亡的鸟被认为是ILT阳性；(2)任何在任何一天或在攻击后死亡的任何类别中出现任何中度或重度临床症状的鸟被认为是ILT阳性；(3)任何连续两天出现任何类别的中度或重度临床症状或在攻击后死亡的鸟类均被视为ILT阳性。
基于3种不同标准的保护结果显示在表26中。ILT攻击是严重的，因为它杀死了(或当出于道德原因显示非常严重的临床症状时对鸟实施安乐死)86.7％的未接种疫苗的禽类。在这些攻击条件下通过用vHVT317接种诱导高水平的ILT保护。
表26：用ILT-96-3ILTV株在D28攻击后由vHVT317构建体在SPF小鸡中诱导的ILT功效
组 疫苗 剂量(PFU) 鸟数 ％死亡率 基于标准1/2/3的％保护
1 vHVT317 1030 15 0％ 100％/86.7％/100％
2 - - 15 86.7％ 6.7％/6.7％/6.7％
【实施例24：vHVT317诱导的ILT功效，商业HVT-ILT和商业鸡胚来源(CEO)疫苗针对肉鸡中D21的ILTV攻击】
该研究的目的是评估与商业HVT-ILT疫苗(ILT，Merck AnimalHealth)相比，施用给1日龄肉鸡的表达IBDV VP2基因和ILTV gD基因的vHVT317重组构建体对抗在D28进行的ILTV攻击的功效。
如表27所示，将51只1日龄商品肉鸡分成3组。所有禽类(17只鸡/组)通过皮下(SC)途径接种0.2mL vHVT317或ILT(用作阳性对照)，指示剂量或未接种疫苗。在D26，每组的鸟数减少到15只并且每只鸟被称重。接种后28天(在D28)，通过眶下途径用63140ILTV株攻击所有禽类(104.3EID50，0.2mL/鸟)。在研究第31～35天和研究第38天，分别观察所有禽类的临床症状。在研究第38天，将所有剩余的禽类单独称重并终止。使用3个不同标准进行保护评估：(1)任何连续三天出现任何临床症状或在攻击后死亡的鸟被认为是ILT阳性；(2)任何在任何一天或在攻击后死亡的任何类别中出现任何中度或重度临床症状的鸟被认为是ILT阳性；(3)任何连续两天出现任何类别的中度或重度临床症状或在攻击后死亡的鸟类均被视为ILT阳性。还在D26和D38比较体重。
使用3个标准的保护结果显示在表27中。对于3个标准，所有对照被认为是不受保护的。2种测试疫苗均诱导高度和类似的ILT保护。在D26(攻击前)的体重之间没有显着差异；然而，在攻击后，接种疫苗的禽类的体重显着(p＜0.0001)高于未接种疫苗的禽类，表明可以防止体重减轻。
表27：在D28用63140ILTV株攻击后肉鸡中vHVT317和INNOVAX ILT(阳性对照)构建体诱导的ILT功效
组 疫苗 剂量(PFU) 鸟数 基于标准1/2/3的％保护 在D26的体重* 在D38的体重*
1 vHVT317 3820 15 86.7％/86.7％/86.7％ 1544±61 2931±63
1 INNOVAX 3700 15 100％/93.3％/93.3％ 1491±61 2839±61
2 - - 15 0％/0％/0％ 1461±61 2433±63
*平均值±标准偏差，单位为g
【实施例25：在SPF雏鸡中28日龄变异IBD攻击后卵内施用vHVT317诱导的IBD功效】
该研究的目的是评估卵内施用给来自SPF鸡的18-19日龄胚胎的表达IBDV VP2基因和ILTV gD基因的vHVT317对抗在28日龄(31天)进行的变异IBDV攻击的效力。
将来自无特定病原体(SPF)鸡的18-19日龄胚胎分成3组，如表28所示。来自第1组和第2组的所有禽类(约30个卵/组)通过卵内(SC)途径接种用指定剂量的0.05mL vHVT317。将第3组的胚胎卵用0.05mL马立克氏疫苗稀释液进行假接种。在孵化时，每组保留22只雏鸡，在攻击前，所有3组减少到20只。接种疫苗后30天(28日龄)，来自所有3组的禽类通过眼内(IO)途径用传染性法氏囊病病毒(IBDV)变体特拉华E株进行攻击(在0.03mL中103.0EID50的目标剂量/鸟)。来自第5组的鸟用TPB(胰蛋白胨磷酸盐肉汤，0.03mL/鸟)进行假攻击。攻击后11天，测量所有鸟的体重和法氏囊重量。计算所有组的B/B wt.比(法氏囊重量/体重比x100)。
保护结果显示在表28中。在所有未接种疫苗的攻击禽类中观察到明显的法氏囊萎缩。在2个测试剂量下在vHVT317接种组中观察到保护。
表28：SPF雏鸡中变异E IBDV株在28日龄攻击后卵内施用的vHVT317诱导的IBD功效
组 疫苗 剂量(PFU) 鸟数 IBDV攻击 平均值B/B wt.比
1 vHVT317 2250 20 是 0.41
2 vHVT317 3225 20 是 0.60
3 - - 20 是 0.13
4 - - 20 否 0.69
【实施例26：通过卵内途径施用的vHVT317对SPF雏鸡中D28的ILTV攻击诱导的ILT功效】
该研究的目的是评估在SPF鸡中通过卵内途径施用给18-19日龄胚胎的表达IBDVVP2基因和ILTV gD基因的vHVT317重组构建体对抗在D28(在25日龄)进行的ILTV攻击的效力。
将来自无特定病原体(SPF)鸡的18-19日龄胚胎分成2组，如表29所示。来自第1组的所有禽类(约30个卵/组)通过卵内(SC)途径接种在所示剂量下的0.05mL vHVT317。将来自第2组的胚胎卵用0.05mL马立克氏疫苗稀释液进行假接种。在孵化时，每组保留22只雏鸡，在攻击前一天，两组都减少到20只。接种后25天(在D28)，来自两组的禽类用在眶下窦中施用的63140ILTV株(104.7EID50，0.2mL/鸟)进行攻击。观察鸟类在D28～D38的临床症状和死亡率。在研究第38天，所有剩余的鸟都被终止了。ILT攻击的功效通过缺乏典型的ILT临床症状来确定，例如：抑郁症，与咳嗽有关的呼吸窘迫，打喷嚏，罗音，伴有颈部伸展的喘气，有或没有血性和/或粘液分泌物；呼吸困难和口呼吸；眶下窦肿胀，有无引流；和/或肿胀的结膜，部分或完全闭合眼睛。除了由于创伤或任何将鸟类从研究中排除的明确病症外，任何死亡后的死亡率都被认为是ILT的阳性。
ILT保护的结果显示在表29中。结果显示大多数接种vHVT317的禽类受到保护。
表29：在具有63140ILTV株的SPF小鸡中在D28的眶下窦发作后通过卵内途径施用的vHVT317诱导的ILT功效
组 疫苗 剂量(PFU) 鸟数 ％保护(保护的数/总和)
1 vHVT317 2300 20 85％(17/20)
2 - - 20 5％(1/20)
【实施例29：vHVT309和vHVT310对SPF鸡D21中的速发性NDV攻击诱导的ND功效】
该研究的目的是评估施用给一日龄SPF鸡的表达IBDV VP2基因和NDV F基因的2种HVT重组构建体(vHVT309和vHVT310)对抗在D21进行的速发性NDV攻击的功效。
如表30所示，将1日龄SPF雏鸡(白色来亨鸡)分配到3组鸟类中。来自第2组和第3组的所有禽类通过皮下(SC)途径接种0.2mL vHVT309(14只鸡；组)2)或vHVT310(15只鸡；第3组)，目标剂量为2000PFU。来自第1组(5只鸡)的鸟未接种疫苗。由于不明原因，第2组的两只鸟在D5死亡。接种后21天(在D21)，收集来自第3组的10只鸡的血液用于血清学检查；然后，通过肌肉内(IM)途径(105.0EID50，0.2mL/鸟)，用速发的NDV Herts 33菌株对来自所有3组的所有禽类进行攻击。在攻击后14天期间观察所有鸟的临床症状。如果鸟类没有死亡或显示ND临床症状，则认为它们受到保护。
表30总结了保护结果。第1组的所有未接种疫苗的禽类在攻击后死亡；所有接种疫苗的鸟都受到保护。vHVT310构建体通过ELISA(来自ID-VET的ID Screen NewcastleDisease Indirect kit)和通过HI测试的平均值3.9±0.7log2(抗-IBDV)诱导显着的抗NDV(平均值3.7±0.3(标准偏差)log10(平均值)在D21上取样的所有10只G3-鸟血清中，通过ELISA(来自Zoetis的ProFLOK IBD Plus ELISA试剂盒)抗体得到3.7log10±0.2log10。
表30：在D21用速发型NDV毒株攻击后肉鸡中不同HVT-IBD+ND双构建体诱导的ND效力
组 疫苗 剂量(PFU) 鸟数 死亡和患病鸟数 保护
1 - - 5 5和0 0％
2 vHVT309 2000 12 0和0 100％
3 vHVT310 2000 15 0和0 100％
【实施例28：vHVT309和vHVT310对SPF雏鸡D21的经典IBDV攻击诱导的IBD功效】
该研究的目的是评估施用给一日龄SPF鸡的表达IBDV VP2基因和NDV F基因的2种HVT重组构建体(vHVT309和vHVT310)对抗在D21进行的经典IBDV攻击的功效。
将一日龄SPF雏鸡(白色来亨鸡)分成3组，如表31所示。来自第2组和第3组的所有禽类(约15只鸡/组)通过皮下(SC)途径接种0.2mL vHVT309(组2)或vHVT310(组3)以2000PFU的目标剂量构建。来自第1组的10只鸡未接种疫苗。在第2组中记录两个非特异性早期死亡。接种后二十一天(在D21)，通过眼内(IO)途径(0.05mL中的102.0EID50/鸟)用经典的52/70Faragher IBDV株攻击所有禽类。攻击后11天(在D32)，终止所有禽类并进行尸体剖检以检查法氏囊损伤。法氏囊和身体被加权以计算法氏囊体重比。然后将法氏囊储存在甲醛中用于组织学。根据表32中所示的量表对法氏囊的组织学损伤进行评分。如果(1)至少50％的攻击对照死亡或显示出疾病的特征性迹象，特别是超过2天冷漠/皱褶的羽毛或虚脱，和(2)100％存活的攻击对照显示法氏囊的组织学评分≥3，则验证了攻击的严重性。如果至少90％的鸡受到保护，则证明候选疫苗的功效。如果(1)它们存活并且没有显示出疾病的显着临床症状，特别是没有超过2天冷漠/皱褶的羽毛或虚脱，并且(2)它们显示了法氏囊的组织学评分＜3，则鸡被认为是受保护的。
保护结果显示在表31中。所有对照均为IBD感染阳性。通过用vHVT309或vHVT310接种诱导完全IBD保护。
表31：在使用Faragher IBDV株在D21攻击后在SPF小鸡中表达2种基因的2种HVT构建体诱导的IBD功效
**平均值±标准差
表32：法氏囊的组织学病变评分量表*
*来自欧洲药典的专著No.04/2013：0587
“禽传染性法氏囊病疫苗(现场)
【实施例29：卵内施用vHVT317对SPF雏鸡孵化率的影响】
该研究的目的是评估vHVT317在卵内途径给药时对孵化率的安全性。
结果是几个研究的数据汇编，包括实施例23、24、25和26中描述的那些。孵育18-19天的胚胎卵接种vHVT317，目标剂量为2000或3000PFU或用马立克氏病疫苗稀释剂接种。评估每组的孵化率百分比。结果总结在表33中，并显示接种卵中的优异孵化率水平。
表33：卵内施用vHVT317后的孵化率
组 疫苗 靶剂量(PFU) 免疫接种的卵数 孵化的卵数 ％孵化率
1 稀释剂 - 150 149 99.3％
2 vHVT317 2000 139 135 97.1％
3 vHVT317 3000 80 78 97.5％
【实施例30：vHVT406对ILTV攻击诱导的ILT功效】
【实施例30.1：vHVT406针对D28的ILTV攻击诱导的ILT功效】
该研究的目的是评估和比较表达ILTV gD基因的vHVT406重组构建体和商业HVT-ILT载体疫苗对抗ILT攻击的功效。
每组分配十二(12)只一日龄的SPF鸟。第1-2组的禽类接种SQ疫苗，每只鸟0.2ml。接种疫苗后，将所有禽类放入各自的单位。在第28天，通过气管内(IT)途径用传染性喉气管炎病毒(ILT)，ILT-93-3EP2攻击所有禽类。由于攻击，在攻击后11天观察所有禽类的临床症状。在第32天，从所有剩余的禽类中收集气管和结膜拭子。处理拭子用于q-PCR分析。在第39天，所有剩余的鸟被终止。
结果显示在下表34中。结果显示所有接种vHVT406的禽类均受到保护。令人惊讶的是，结果还表明，当使用较低剂量(6,960pfu/0.2ml)时，与用于商业产品Innovax HVT-ILT的较高剂量(10,340pfu/0.2ml)相比，vHVT406组获得了良好的保护(100％保护)。
表34：组间ILT阳性的数量和阳性百分比1
1如果他们连续三天出现临床症状，包括擦拭后的死亡率或死亡率，则认为鸟是阳性的。
2斑块形成单位(pfu)-皮下给药(SQ)；每剂量0.20毫升。
3由于瘫痪，vHVT406组中的一只鸟被排除在研究之外。
4MSD Animal Health的商业产品
【实施例30.2：vHVT406对D21的ILTV攻击诱导的ILT功效】
该研究的目的是评估和比较vHVT406和2种商业HVT-ILT载体疫苗对抗ILT攻击的功效。
每组分配十二(12)只一日龄的SPF鸟。随机化还分配了放置鸟类的隔离单元(每个单元12只，每组一个单元)。组1-3中的鸟用SQ接种，每只鸟0.2ml。在第21天，通过气管内(IT)途径用感染性喉气管炎病毒(ILT)，ILT-96-3EP2攻击1-2组中的所有禽类。由于攻击，在攻击后11天观察鸟类的临床症状。在第25天，对所有剩余的禽类收集气管和结膜拭子。处理拭子样品用于q-PCR。在第32天，所有剩余的鸟都被终止。
结果显示在下表35中。结果显示除了一只接种vHVT406的禽类外，其他所有鸟类都受到保护。令人惊讶的是，结果还表明，当使用较低剂量(810pfu/0.2ml)时，与用于商业产品Innovax HVT-ILT的较高剂量(1590pfu/0.2ml)相比，vHVT406组获得了良好的保护(91.7％保护)，达到相同的保护水平(91.7％)。此外，当vHVT406以低于仅提供75％保护的商品Vectormune HVT-ILT的剂量使用时，提供了更好的保护(91.7％)。
表35：组间ILT阳性的数量和阳性百分比1
1如果他们连续三天出现临床症状，包括擦拭后的死亡率或死亡率，则认为鸟是阳性的。
2噬斑形成单位(pfu)-皮下施用(SQ)；每剂量0.20毫升。
3Ceva的商业产品
***
已经详细描述了本发明的优选实施例，应该理解，由上述示例限定的本发明不限于在以上描述中阐述的特定细节，因为在不脱离本发明的的精神或范围情况下可以进行许多明显的变化。
本文引用或引用的所有文献(“本文引用文献”)，以及本文引用文献中引用或引用的所有文献，以及本文提及的任何产品或任何文件合并的任何制造商的说明，描述，产品规格和产品说明书在此引入作为参考，并且可以用于本发明的实践中。

Claims (20)

1.包含一种重组火鸡疱疹病毒载体的组合物或疫苗，其中所述重组火鸡疱疹病毒载体包含2种编码选自下列的禽病原体的2种抗原的异源多核苷酸：传染性法氏囊病病毒VP2抗原、传染性喉气管炎病毒糖蛋白D抗原和新城疫病毒F抗原；且
其中所述2种异源多核苷酸通过IRES连接，并通过IRES从单个mRNA表达；且
其中所述通过IRES连接的2种异源多核苷酸插入火鸡疱疹病毒基因组的IG1基因座。
2.权利要求1的组合物或疫苗，其中所述异源多核苷酸与选自下列的启动子可操作地连接：mCMVIE启动子、SV40启动子、HHV3gB启动子和反向HHV3gB启动子。
3.权利要求1～2之任一项的组合物或疫苗，其中所述异源多核苷酸
在5'末端与mCMVIE或SV40启动子可操作地连接，且
在3'末端与IRES可操作地连接。
4.权利要求1～2之任一项的组合物或疫苗，其中所述传染性法氏囊病病毒VP2抗原如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列所示。
5.权利要求1～2之任一项的组合物或疫苗，其中所述传染性喉气管炎病毒糖蛋白D抗原如SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列所示。
6.权利要求1～2之任一项的组合物或疫苗，其中所述新城疫病毒F(NDV-F)抗原如SEQID NO：5或22所示的氨基酸序列所示。
7.权利要求1～2之任一项的组合物或疫苗，其中所述编码所述传染性法氏囊病病毒VP2抗原的多核苷酸如SEQ ID NO：1所示。
8.权利要求1～2之任一项的组合物或疫苗，其中所述编码所述传染性喉气管炎病毒糖蛋白D抗原的多核苷酸如SEQ ID NO：16所示。
9.权利要求1～2之任一项的组合物或疫苗，其中所述编码所述新城疫病毒F抗原的多核苷酸如SEQ ID NO：3、4或21所示。
10.重组火鸡疱疹病毒载体，其包含：
2种编码选自下列的禽病原体的2种抗原的异源多核苷酸：传染性法氏囊病病毒VP2抗原、传染性喉气管炎病毒糖蛋白D抗原和新城疫病毒F抗原；且
其中所述2种异源多核苷酸通过IRES连接，并通过IRES从单个mRNA表达；且
其中所述通过IRES连接的2种异源多核苷酸插入火鸡疱疹病毒基因组的IG1基因座。
11.权利要求10的重组火鸡疱疹病毒载体，其中所述异源多核苷酸与选自下列的启动子可操作地连接：mCMV IE启动子、SV40启动子、HHV3gB启动子和反向HHV3gB启动子。
12.权利要求10～11之任一项的重组火鸡疱疹病毒载体，其中所述异源多核苷酸
在5'末端与mCMVIE或SV40启动子可操作地连接，且
在3'末端与IRES可操作地连接。
13.权利要求10～11之任一项的重组火鸡疱疹病毒载体，其中所述传染性法氏囊病病毒VP2抗原如SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列所示。
14.权利要求10～11之任一项的重组火鸡疱疹病毒载体，其中所述传染性喉气管炎病毒糖蛋白D抗原如SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列所示。
15.权利要求10～11之任一项的重组火鸡疱疹病毒载体，其中所述新城疫病毒F抗原如SEQ ID NO：5或22所示的氨基酸序列所示。
16.权利要求10～11之任一项的重组火鸡疱疹病毒载体，其中所述编码所述传染性法氏囊病病毒VP2抗原的多核苷酸如SEQ ID NO：1所示。
17.权利要求10～11之任一项的重组火鸡疱疹病毒载体，其中所述编码所述传染性喉气管炎病毒糖蛋白D抗原的多核苷酸如SEQ ID NO：16所示。
18.权利要求10～11之任一项的重组火鸡疱疹病毒载体，其中所述编码所述新城疫病毒F抗原的多核苷酸如SEQ ID NO：3、4或21所示。
19.一种组合物或疫苗，其包含权利要求10～18之任一项的重组火鸡疱疹病毒载体，且还包含药学上或兽医学上可接受的载体或佐剂。
20.权利要求10～18之任一项的重组火鸡疱疹病毒载体在制备用于在禽类中针对一种或多种禽病原体进行接种或诱导免疫或保护性应答的多价组合物或疫苗中的用途，其中所述禽病原体选自：新城疫病毒、传染性法氏囊病病毒、马立克氏病病毒和传染性喉气管炎病毒。
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Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP7046014B2 (ja) 2016-06-17 2022-04-01 インターベット インターナショナル ベー． フェー． 伝染性喉頭気管炎ウイルスおよび伝染性ファブリキウス嚢病ウイルスの抗原をコードする組換え非病原性マレック病ウイルスコンストラクト
CN117357642A (zh) 2016-12-14 2024-01-09 勃林格殷格翰动物保健美国公司 表达禽病原体的多种抗原的重组hvt载体及其用途
CN111542599A (zh) 2017-10-12 2020-08-14 英特维特国际股份有限公司 编码多种异源抗原的重组非致病性马尔克氏病病毒构建体
CN109136198B (zh) * 2018-08-21 2021-04-13 华南农业大学 一种表达鸡传染性贫血病毒vp1、vp2基因重组鸡痘病毒活载体疫苗
WO2021050701A1 (en) 2019-09-11 2021-03-18 Zoetis Services Llc Recombinant herpesvirus of turkey vectors expressing antigens of avian pathogens and uses thereof
BR112022010825A2 (pt) 2019-12-20 2022-08-23 Intervet Int Bv Vacina de vetor hvt multivalente
CA3176902A1 (en) * 2020-03-27 2021-09-30 Svenska Vaccinfabriken Produktion Ab Compositions and methods for treating and preventing coronaviruses
US20210386854A1 (en) * 2020-06-15 2021-12-16 Zoetis Services Llc Cell Line for Production of Marek's Disease Virus Vaccine and Methods of Making and Using the Same
IL299033A (en) * 2020-06-17 2023-02-01 Boehringer Ingelheim Vetmedica Gmbh Recombinant HVT vectors expressing influenza hemagglutinin and immunogenic compounds, production and uses thereof
KR102221150B1 (ko) 2020-08-19 2021-02-26 국방과학연구소 이중 항원 발현벡터 및 이를 포함한 유전자 백신
CN112375125B (zh) * 2020-11-23 2021-09-28 东北农业大学 一种多肽及其在预防鸡传染性法氏囊病中的应用
CN116648259A (zh) 2020-12-24 2023-08-25 英特维特国际股份有限公司 多价hvt载体疫苗
WO2023213946A1 (en) 2022-05-05 2023-11-09 Intervet International B.V. New multivalent hvt vector vaccine

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103074306A (zh) * 2013-02-04 2013-05-01 扬州大学 新城疫病毒rNDV-H52AH9及其构建方法和应用
WO2013082327A1 (en) * 2011-11-30 2013-06-06 Merial Limited Recombinant hvt vectors expressing antigens of avian pathogens and uses thereof
WO2016102647A1 (en) * 2014-12-24 2016-06-30 Intervet International B.V. Improved hvt-vectored nd-ibd vaccine

Family Cites Families (26)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5965138A (en) 1985-09-06 1999-10-12 Syntro Corporation Recombinant chimeric virus and uses thereof
WO1987004463A1 (en) 1986-01-27 1987-07-30 Syntro Corporation Attenuated herpesviruses, herpesviruses which include foreign dna encoding an amino acid sequence and vaccine containing same
JP2779447B2 (ja) 1988-03-20 1998-07-23 財団法人阪大微生物病研究会 弱毒マレック病ウイルス・ベクターを用いる組換え遺伝子作成法、及び該ウイルスの組換え体
EP0431668B1 (en) 1989-12-04 1995-02-15 Akzo Nobel N.V. Recombinant herpesvirus of turkeys and live vector vaccines derived thereof
BE1004877A3 (fr) 1991-05-27 1993-02-16 Solvay Virus de l'avipox recombinant, culture de cellules infectees par ce virus et vaccins pour la volaille derives de ce virus.
US5853733A (en) 1993-02-26 1998-12-29 Syntro Corporation Recombinant herpesvirus of turkeys and uses thereof
US6183753B1 (en) 1994-08-09 2001-02-06 Schering-Plough Veterinary Corp. Recombinant chimeric virus and uses thereof
FR2728795B1 (fr) 1994-12-30 1997-03-21 Rhone Merieux Vaccin vivant recombinant aviaire, utilisant comme vecteur un virus herpes aviaire
CA2216139C (en) * 1995-03-23 2013-01-08 Syntro Corporation Recombinant infectious laryngotracheitis virus and uses thereof
WO1998016247A1 (en) 1996-10-11 1998-04-23 The Regents Of The University Of California Immunostimulatory polynucleotide/immunomodulatory molecule conjugates
FR2758986B1 (fr) 1997-01-31 1999-04-30 Rhone Merieux Vaccin vivant recombinant aviaire, utilisant comme vecteur le virus de la laryngotracheite infectieuse aviaire
US5980912A (en) 1997-03-25 1999-11-09 Zonagen, Inc. Chitosan induced immunopotentiation
US6299882B1 (en) 1999-04-09 2001-10-09 Schering Corporation UL54.5 of Marek's disease virus (MDV)
US6866852B2 (en) 2002-01-31 2005-03-15 Zeon Corporation Recombinant herpesvirus of turkeys and use thereof
UA84024C2 (ru) 2003-07-24 2008-09-10 Мериал Лимитед Новые вакцинные композиции, которые содержат эмульсию типа "масло в воде"
US7691368B2 (en) 2005-04-15 2010-04-06 Merial Limited Vaccine formulations
ES2600929T3 (es) 2009-09-10 2017-02-13 Merial, Inc. Nuevas formulaciones de vacuna que comprenden adyuvantes que contienen saponina
ES2700243T3 (es) * 2011-10-21 2019-02-14 Intervet Int Bv Construcciones del virus de la enfermedad de Marek recombinantes no patógenas que codifican antígenos del virus de la laringotraqueitis infecciosa y del virus de la enfermedad de Newcastle
BR112014008161A2 (pt) 2011-10-21 2017-04-11 Intervet Int Bv vírus da doença de marek não patogênico recombinante, método para a preparação do mesmo, molécula do ácido nucleico, célula hospedeira, vacina para aves domésticas, método para a preparação de uma vacina, uso de um vírus da doença de marek não patogênico recombinante, e, método de vacinação de aves domésticas
US9114108B2 (en) 2011-11-30 2015-08-25 Merial, Inc. Recombinant HVT vectors expressing antigens of avian pathogens and uses thereof
EP2644702A1 (en) * 2012-03-30 2013-10-02 Ceva Sante Animale Multivalent recombinant avian herpes virus and vaccine for immunizing avian species
AR097029A1 (es) 2013-07-26 2016-02-17 Intervet Int Bv Aceleración de la respuesta inmune inducida por virus vectorial en aves, composición, uso, método para la vacunación y método para acelerar la respuesta inmune
EP2845904A1 (en) 2013-09-06 2015-03-11 Ceva Sante Animale Recombinant Marek's disease viruses and uses thereof
CA2990643C (en) * 2015-06-23 2023-10-17 Merial, Inc. Prrsv minor protein-containing recombinant viral vectors and methods of making and use thereof
CN117357642A (zh) 2016-12-14 2024-01-09 勃林格殷格翰动物保健美国公司 表达禽病原体的多种抗原的重组hvt载体及其用途
CN106701693A (zh) * 2017-01-19 2017-05-24 北京邦卓生物科技有限公司 表达血清ⅰ型马立克氏病病毒gb基因的重组火鸡疱疹病毒的构建及其应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2013082327A1 (en) * 2011-11-30 2013-06-06 Merial Limited Recombinant hvt vectors expressing antigens of avian pathogens and uses thereof
CN105920598A (zh) * 2011-11-30 2016-09-07 梅里亚有限公司 表达禽类病原体的抗原的重组hvt载体及其用途
CN103074306A (zh) * 2013-02-04 2013-05-01 扬州大学 新城疫病毒rNDV-H52AH9及其构建方法和应用
WO2016102647A1 (en) * 2014-12-24 2016-06-30 Intervet International B.V. Improved hvt-vectored nd-ibd vaccine

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
"Skipping the co-expression problem: the new 2A CHYSEL technology";Pablo de Felipe;《Genetic Vaccines and Therapy》;20040913;第2卷(第13期);第1-6页 *

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Publication number Publication date
ES2936117T3 (es) 2023-03-14
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