KR20190098168A - 조류 병원체의 다중 항원을 발현하는 재조합 hvt 벡터 및 그를 포함하는 백신 - Google Patents

조류 병원체의 다중 항원을 발현하는 재조합 hvt 벡터 및 그를 포함하는 백신 Download PDF

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Abstract

본 발명은 조류 병원체의 항원을 함유하고 발현하는 재조합 칠면조 헤르페스바이러스 (HVT) 벡터, 재조합 HVT 벡터를 포함하는 조성물 및 재조합 HVT 벡터를 포함하는 다가 백신을 제공한다. 본 발명은 나아가 다양한 조류 병원체에 대항하는 백신접종 방법 및 재조합 HVT 벡터의 제조 방법을 제공한다.

Description

조류 병원체의 다중 항원을 발현하는 재조합 HVT 벡터 및 그를 포함하는 백신
관련 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2016 년 12 월 14 일에 제출한 미국 가출원 제 62/433,842 호에 대한 우선권을 주장한다.
본 발명의 분야
본 발명은 각종 병원체에 대항해 보호하기 위한 안전한 면역 비히클로서 사용되는 외래 유전자의 삽입 및 발현용 재조합 바이러스 벡터에 관한 것이다. 본 발명은 또한 각종 병원체에 대항해 보호하기 위한 하나 이상의 재조합 바이러스 벡터를 포함하는 다중가 (multivalent) 조성물 또는 백신에 관한 것이다. 본 발명은 재조합 바이러스 벡터를 제조 및 이용하는 방법에 관한 것이다.
가금류 백신접종은 뉴캐슬병 (ND), 감염성 점액낭병 (IBD), 마렉병 (MD), 감염성 기관지염 (IB), 감염성 후두기관염 (ILT) 및 조류 인플루엔자 (AI) 을 비롯한 파괴적인 질병에 대항해 가금류를 보호하는데 널리 사용된다. ND 는 파라믹소대 (Paramyxoviridae) 패밀리에 속하는 ND 바이러스 (NDV) 로 지칭되기도 하는 조류 파라믹소바이러스 1 (APMV-1) 에 의해 유발된다. MD 는 MD 바이러스 혈청형 1 (MDV1) 로서도 지칭되는 칠면조 헤르페스바이러스 2 (헤르페스비리대 (Herpesviridae) 패밀리) 에 의해 유발된다. IB 는 코로나비리대 (Coronaviridae) 패밀리에 속하는 IB 바이러스 (IBV) 에 의해 유발되고, ILT 는 ILT 바이러스 (ILTV) 로도 지칭되는 칠면조 헤르페스바이러스 1 (헤르페스비리대 패밀리) 에 의해 유발되고, AI 는 오르토믹소비리대 (Orthomyxoviridae) 패밀리에 속하는 AI 바이러스 (AIV) 에 의해 유발된다.
다수의 재조합 조류 바이러스 벡터가 이들 조류 병원체에 대항해 새들을 백신접종하는 견지에서 제시된 바 있다. 사용된 바이러스 벡터는 조류폭스 바이러스, 특히 계두 (EP-A-0,517,292), 마렉 바이러스, 예컨대 혈청형 1, 2 및 3 (HVT) (WO87/04463; WO2013/082317), 또는 다르게는 ITLV, NDV 및 조류 아데노바이러스를 포함한다. 이들 재조합 조류 바이러스 벡터 중 일부를 백신접종에 사용하는 경우, 이들은 가변적인 수준의 보호를 보인다.
IBDV, NDV, ILTV 및 AIV 를 포함하는 각종 병원체로부터의 항원을 발현하는 몇몇의 재조합 칠면조 헤르페스바이러스 (HVT, 또한 멜리아그리드 (Meleagrid) 헤르페스바이러스 1 또는 MDV 혈청형 3 으로도 지칭) 벡터가 (US 특허 번호 5,980,906, 5,853,733, 6,183,753, 5,187,087) 개발되어 허가된 바 있다. 특히 관심 있는 것은 전통적인 IBD 백신보다 분명한 이점을 보이는 IBDV VP2 보호 유전자를 발현하는 HVT 벡터이다 (Bublot et al J.Comp. Path.2007,Vol.137, S81-S84; US 5,980,906). 여타 관심 있는 HVT 벡터는 NDV (Morgan et al 1992, Avian dis. 36, 858-70; US 6,866,852; US5,650,153), ILTV (Johnson et al, 2010 Avian Dis 54, 1251-1259; US6,299,882; US5,853,733, EP 1801204), 또는 NDV 및 IBDV (US9,114,108; WO2016102647, WO2013/057235, WO2015032910, WO2013144355) 보호 유전자(들)를 발현하는 것이다. US2016/0158347 에는 HVT 벡터에 의해 발현된 항원에 대항하는 면역 반응을 증가시키기 위한 올리고데옥시뉴클레오티드 TLR21 아고니스트의 용도가 보고되어 있다.
여러 HVT-기재 재조합 백신을 함께 이용하는데 있어서 실용적인 문제점 중 하나는 이들의 간섭 (interference) 이다. 상이한 항원을 발현하는 2 개의 HVT 재조합체들을 혼합하는 경우 그 질병 중 적어도 하나에 대항해서는 낮은 보호가 유도된다 (Rudolf Heine 2011; Issues of the Poultry Recombinant Viral Vector Vaccines which May Cause an Effect on the Economic Benefits of those Vaccines; paper presented at the XVII World Veterinary Poultry Association (WVPA) Congress in Cancun, Mexico, August 14-18, 2011; Slacum G, Hein R. and Lynch P., 2009, The compatibility of HVT recombinants with other Marek’s disease vaccines, 58th Western Poultry Disease Conference, Sacramento, CA, USA, March 23rd-25th, p 84).
동물 병원체, 예컨대 NDV 및 IBDV 의, 수의과적 공중 위생 및 경제에 대한 잠재적인 효과를 고려할 때, 감염을 예방하고 동물을 보호하는 효율적인 방법이 필요하다. 2 개의 HVT-기재 벡터 백신 사이에서 관찰된 간섭이라는 문제점을 완화시킬 수 있는 백신을 제조하기 위한 적합한 방법 및 조합된 효과적인 벡터 백신 용액에 대한 요구가 존재한다.
본 발명의 개요
본 발명은 재조합 HVT 벡터를 포함하는 다가 (polyvalent) 조성물 또는 백신이 간섭 없이 각종 조류 병원체에 대항하여 동물을 보호하는데 효과적인 경우 놀라운 결과를 보였다. 놀라운 결과는 또한 프로모터/링커, 코돈-최적화된 유전자, polyA 꼬리 (tail) 및 삽입 부위의 다양한 조합이 상이한 수준의 효능 및 안정성이 생체 내 및 시험관 내 하나 이상의 이종 (heterologous) 유전자의 발현에 대해 부여될 때 관찰되었다. 본 발명은 다수 유전자를 효율적으로 발현시킬 수 있는 안정한 HVT 벡터를 제공하고, 다수의 삽입물을 갖는 HVT 벡터가 덜 안정적이라는 익히 공지되어 있는 문제점을 극복한다.
본 발명은 조류 병원체의 적어도 하나의 항원을 코딩하고 발현하는 하나, 둘 또는 그 이상의 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 HVT 벡터에 관한 것이다.
본 발명은 조류 병원체의 적어도 하나의 항원을 코딩 및 발현하는 하나, 둘 또는 그 이상의 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 재조합 HVT 벡터를 포함하는 조성물 또는 백신을 제공한다.
본 발명은 본 발명의 조성물 또는 벡터의 적어도 1 회 투여를 포함하는, 동물의 백신접종 방법 또는 동물에서의 면역원성 또는 보호 반응을 유도하는 방법에 관한 것이다.
하기 상세한 설명은 예로서 제공되나, 본 발명을 기술된 특정 구현예로 제한하려는 것이 아니며, 참조로서 본원에서 통합된 하기 첨부된 도면과 함께 이해될 수 있다:
도 1 은 각 DNA 및 단백질 서열에 부여된 SEQ ID NO 를 보여주는 표이다.
도 2 는 HVT 의 게놈 구조 및 그의 삽입 부위를 나타낸다.
도 3 은 pFSV40VP2 플라스미드 맵 (지도) 을 나타낸다.
도 4 는 vHVT309 에 있어서 프라이머 결합 부위의 개략도를 나타낸다.
도 5 는 vHVT309 의 PCR 동일성 결과를 나타낸다.
도 6 은 pFIRESVP2 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 7 은 vHVT310 에 있어서 프라이머 결합 부위의 개략도를 나타낸다.
도 8 은 vHVT310 의 PCR 동일성 결과를 나타낸다.
도 9 는 pFP2AVP2 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 10 은 vHVT311 에 있어서 프라이머 결합 부위의 개략도를 나타낸다.
도 11 은 vHVT311 의 PCR 동일성 결과를 나타낸다.
도 12 는 pVP2IRESgD 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 13 은 vHVT317 에 있어서 프라이머 결합 부위의 개략도를 나타낸다.
도 14 는 vHVT317 의 PCR 동일성 결과를 나타낸다.
도 15 는 pFwtSV40VP2 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 16 은 vHVT313 에 있어서 프라이머 결합 부위의 개략도를 나타낸다.
도 17 은 vHVT313 의 PCR 동일성 결과를 나타낸다.
도 18 은 pVP2IRESFwt 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 19 는 vHVT316 에 있어서 프라이머 결합 부위의 개략도를 나타낸다.
도 20 은 vHVT316 의 PCR 동일성 결과를 나타낸다.
도 21A-21D 는 DNA 및 단백질 서열 정렬을 나타낸다.
도 22 는 HVT US2SVgDwtsyn 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 23 은 pHVTIG1gDCaFopt 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 24 는 vHVT308 에 있어서 프라이머 결합 부위의 개략도를 나타낸다.
도 25 는 vHVT308 의 PCR 동일성 결과를 나타낸다.
도 26 은 pFwtIRESgD 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 27 은 vHVT322 에 있어서 프라이머 결합 부위의 개략도를 나타낸다.
도 28 은 vHVT322 의 PCR 동일성 결과를 나타낸다
도 29 는 pHVTUS2SVgDwtsyn 플라스미드 맵을 나타낸다.
도 30 은 vHVT406 에 있어서 프라이머 결합 부위의 개략도를 나타낸다.
도 31 은 vHVT406 의 PCR 동일성 결과를 나타낸다.
본 발명은 그의 특정 구현예와 연결하여 설명되었지만, 본 발명은 추가의 변형이 가능하다는 점은 이해될 것이며, 본 출원이 일반적으로 본 발명의 원리를 따르고 본 발명이 속하는 기술 분야 내에서 공지된 또는 통상적인 관행 내 존재하는 본 개시로부터의 일탈을 포함해 본 발명의 임의의 변형, 사용 또는 적용을 포괄하고자 의도된 것으로서, 이하 본원에서 기술되고 첨부된 청구항의 범위에서 하기와 같이 본질적인 특징에 적용될 수 있다. 본 발명은 관련 법에서 허용하는 최대 한도 내에서 본원에 제시된 측면 또는 청구항에서 인용된 주제의 모든 수정 및 등가물을 포함한다.
본 명세서에서, 특히 청구항에서, "포함하다", "포함되는", "포함하는" 등과 같은 용어는 미국 특허법에서 이에 부여된 의미를 가질 수 있으며; 예를 들어, 이들은 "포함하다", "포함되는", "포함하는" 등을 의미할 수 있고; "~ 로 본질적으로 이루어지는" 및 "~ 로 본질적으로 이루어지다" 와 같은 용어는 미국 특허법에서 이에 부여된 의미를 갖고, 예를 들어, 이들은 명백하게 언급되지 않은 요소를 포함하나, 선행 기술에서 발견되거나 본 발명의 기본적인 또는 신규한 특성에 영향을 미치는 요소는 배재한다는 점에 유의한다.
단수형 용어에는 문맥이 명백하게 다르게 표시하지 않는 한 복수의 지시대상이 포함된다. 유사하게는, "또는" 이라는 단어는 문맥이 명백하게 다르게 표시하지 않는 한 "및" 을 포함하는 것으로 의도된다. 단어 "또는" 은 특정 리스트의 임의의 한 구성원을 포함하고, 또한 그 리스트의 구성원의 임의의 조합을 포함한다.
용어 제 1, 제 2 등이 본원에서 다양한 요소를 기술하는데 이용될 수 있지만, 이들 요소는 이들 용어에 의해 제한되어서는 안되는 것도 또한 이해될 것이다. 이들 용어는 하나의 요소를 다른 요소와 구별하기 위해서만 사용된다. 예를 들어, 제 1 의 제스쳐는 제 2 의 제스쳐라고 불릴 수 있고, 마찬가지로, 제 2 의 제스쳐는 본 발명의 범주에서 벗어나지 않고 제 1 의 제스쳐로 불릴 수 있다. 본원에서 기재된 모든 방법 또는 프로세스는 달리 본원에서 지시되지 않는 한 또는 그 밖에 명백하게 문맥에 의해 부인되지 않는 한 임의의 적절한 순서로 수행될 수 있다.
용어 "동물" 은 모든 포유류, 새, 물고기를 포함하는 것으로 본원에서 사용된다. 본원에서 사용되는 동물은 하기로 이루어지는 군으로부터 선택될 수 있다: 말류 (예를 들어, 말), 개류 (예를 들어, 개, 늑대, 여우, 코요테, 자칼), 고양이류 (예를 들어, 사자, 호랑이, 집고양이, 들고양이, 기타 큰 고양이, 및 치타 및 스라소니를 비롯한 기타 고양이과), 소류 (예를 들어, 소), 돼지류 (예를 들어, 돼지), 양류 (예를 들어, 양, 염소, 어린양, 들소), 조류 (예를 들어, 닭, 오리, 거위, 칠면조, 메추라기, 꿩, 앵무새, 핀치, 매, 까마귀, 타조, 에뮤 및 화식조), 영장류 (예를 들어, 원원류, 안경원숭이, 원숭이, 긴팔원숭이, 유인원), 인간 및 물고기. "동물" 이라는 용어에는 또한 배아 및 태아 단계를 비롯한, 모든 발달 단계의 개개의 동물이 포함된다.
본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "약"은 대략적으로, 그 부근에서, 대충, 또는 대략을 의미한다. 용어 "약"이 수치 범위와 함께 사용되는 경우, 이것은 제시된 수치값의 상하 경계를 확장함으로써 해당 범위를 수정한다. 일반적으로, 용어 "약"은 본원에서 10% 의 분산으로 언급된 값의 상하 수치를 수정하는데 사용된다. 하나의 측면에서, 용어 "약"은 이것이 사용되어진 숫자의 수치값의 ± 20% 를 의미한다. 따라서, 약 50% 란, 45%-55% 의 범위를 의미한다. 본원에서 종단점으로 열거된 수치 범위에는 그 범위 내에 포함되는 모든 숫자 및 분수를 포함한다 (예를 들어, 1 내지 5 는 1, 1.5, 2, 2.75, 3, 3.90, 4, 및 5 를 포함한다). 또한 그의 모든 숫자 및 분수는 용어 "약"에 의해 수정되는 것으로 생각되는 것 또한 이해된다.
용어 "폴리펩티드" 및 "단백질" 은 본원에서 상호교환적으로 사용되고, 연이은 아미노산 잔기들의 중합체를 지칭한다.
용어 "핵산", "뉴클레오티드", 및 "폴리뉴클레오티드" 는 상호교환적으로 사용되고, RNA, DNA, cDNA, 또는 cRNA 및 개질된 백본을 포함하는 것과 같은 이들 유도체를 지칭한다. 본 발명은 본원에 기재된 것과 상보적인 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다는 점이 인지되어야 한다. 본 발명에서 고려되는 "폴리뉴클레오티드" 는 전향적 가닥 (5' -> 3') 및 역향적 상보성 가닥 (3' -> 5') 모두를 포함한다. 본 발명에 따른 폴리뉴클레오티드는 상이한 방법 (예, 화학적 합성, 유전자 클로닝 등) 으로 제조될 수 있고, 각종 형태 (예, 선형 또는 분지형, 단일 또는 이중 가닥, 또는 이의 하이브리드, 프라이머, 프로브 등) 을 취할 수 있다.
용어 "게놈 DNA" 또는 "게놈" 은 상호교환적으로 사용되며, 숙주 생물체의 유전학적 유전자 정보를 지칭한다. 게놈 DNA 는 핵의 DNA (염색체 DNA 로도 지칭됨) 뿐 아니라 또한 원형자 (예, 엽록체) 의 DNA 및 기타 세포소기관 (예, 미토콘드리아) 의 DNA 를 포함한다. 본 발명에서 고려되는 게놈 DNA 및 게놈은 또한 바이러스의 RNA 를 지칭한다. RNA 는 + 가닥 또는 - 가닥 RNA 일 수 있다. 본 발명에서 고려되는 용어 "게놈 DNA" 는 본원에 기재된 것과 상보적인 서열을 포함하는 게놈 DNA 를 포함한다. 용어 "게놈 DNA" 는 또한 메신져 RNA (mRNA), 상보성 DNA (cDNA), 및 상보성 RNA (cRNA) 을 지칭한다.
용어 "유전자" 는 생물학적 기능과 연관되는 폴리뉴클레오티드의 임의의 분절을 언급하는데 폭넓게 사용된다. 따라서, 유전자 또는 폴리뉴클레오티드에는 게놈 서열에서와 같은 인트론 및 엑손, 또는 단지 cDNA 에서와 같은 코딩 서열, 예컨대 시작 코돈 (메티오닌 코돈) 으로부터 시작하고 종결 시그널 (중지 코돈) 으로 종결되는 열린 해독틀 (open reading frame (ORF)) 이 포함된다. 유전자 및 폴리뉴클레오티드는 또한 전사 시작, 번역 및 전사 종료와 같이 이의 발현을 조절하는 영역을 포함할 수도 있다. 따라서 또한 프로모터 및 리보솜 결합 영역 (일반적으로는 코딩 서열 또는 유전자의 시작 코돈의 상류 (upstream) 에서 대략적으로 60 내지 250 뉴클레오티드에 놓인 이들 조절 요소; Doree S M et al.; Pandher K et al.; Chung J Y et al.), 전사 터미네이터 (일반적으로, 터미네이터는 코딩 서열 또는 유전자의 중지 코돈의 하류 (downstream) 대략적으로 50 뉴클레오티드 내에 위치됨; Ward C K et al.) 이 포함된다. 유전자 또는 폴리뉴클레오티드는 또한 mRNA 또는 기능성 RNA 를 발현하거나, 특정 단백질을 인코딩하고 (encode), 조절성 서열을 포함하는 핵산 단편을 또한 언급한다.
본원에서 사용되는 바 용어 "이종 DNA" 는 상이한 유기체, 예컨대 수용자와 상이한 세포 유형 또는 상이한 종으로부터 유래된 DNA 를 지칭한다. 이 용어는 또한 숙주 DNA 의 동일한 게놈 상에서의 이의 DNA 또는 단편을 지칭하는데, 이때 이종 DNA 는 이의 원래 위치와는 상이한 게놈의 영역에 삽입된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항원" 또는 "면역원" 이라는 용어는 숙주 동물에서 특이적 면역 반응을 유도하는 물질을 의미한다. 항원은 사멸된, 약독화된 또는 살아 있는 전체 유기체; 유기체의 서브유닛 또는 일부; 면역원성 특성을 갖는 삽입체를 함유하는 재조합 벡터; 숙주 동물에 제시되었을 때 면역 반응을 유도할 수 있는 DNA의 조각 또는 단편; 폴리펩티드, 에피토프, 합텐 또는 이의 임의의 조합을 포함할 수 있다. 대안적으로는, 면역원 또는 항원은 독소 또는 항독소를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "면역원성 단백질 또는 펩티드" 에는 일단 숙주에 투여되면 그 단백질에 대한 체액성 및/또는 세포성 유형의 면역 반응을 유발할 수 있다는 의미에서 면역적으로 활성인 폴리펩티드가 포함된다. 바람직하게는 단백질 단편은 총 단백질과 실질적으로 동일한 면역적 활성을 갖는다. 따라서, 본 발명에 따른 단백질 단편은 하나 이상의 에피토프 또는 항원성 결정인자를 포함하거나 이로 본질적으로 이루어지거나 이로 이루어진다. 본원에서 사용되는 "면역원성" 단백질 또는 폴리펩티드에는 단백질의 전장 서열, 그의 유사체, 또는 그의 면역원성 단편이 포함된다. "면역원성 단편" 은 하나 이상의 에피토프를 포함하고 따라서 상기 기술된 면역적 반응을 유발하는 단백질의 단편을 의미한다. 상기 단편은 당업계에 잘 알려진 임의의 수의 에피토프 맵핑 기술을 사용하여 식별될 수 있다. 예를 들어, 선형 에피토프는, 예를 들어, 많은 수의 펩티드를 고체 지지체 상에서 동시에 합성하고 (이 경우, 펩티드는 단백질 분자의 일부에 해당함), 펩티드가 지지체에 아직 부착되어 있는 동안 펩티드를 항체와 반응시킴으로써 측정될 수 있다. 유사하게는, 입체형태적 에피토프는 예컨대, 예를 들어, x-선 결정술 및 2차원 핵 자기 공명에 의해 아미노산의 공간적 입체구조를 확인함으로써 용이하게 식별된다.
용어 "면역원성 단백질 또는 폴리펩티드" 는 폴리펩티드가 본원에서 정의된 바와 같은 면역적 반응을 초래하는 기능을 하는 한, 서열에 대한 결실, 부가 및 치환을 추가로 고려한다. 용어 "보존성 변이" 는 아미노산 잔기의 또다른 생물학적으로 유사한 잔기에 의한 대체, 또는 인코딩된 아미노산 잔기가 변화하지 않거나 또다른 생물학적으로 유사한 잔기가 되도록 하는 핵산 서열 내 뉴클레오티드의 대체를 의미한다. 이와 관련하여, 특히 바람직한 치환은 일반적으로 성질이 보존성일 것이며, 즉 그러한 치환이 아미노산의 하나의 패밀리 내에서 일어날 것이다. 예를 들어, 아미노산은 일반적으로 하기와 같은 4 개의 패밀리로 분류된다: (1) 산성--아스파르테이트 및 글루타메이트; (2) 염기성--리신, 아르기닌, 히스티딘; (3) 비(非)극성--알라닌, 발린, 류신, 이소류신, 프로린, 페닐알라닌, 메티오닌, 트립토판; 및 (4) 비하전된 극성--글리신, 아스파라긴, 글루타민, 시스테인, 세린, 트레오닌, 타이로신. 페닐알라닌, 트립토판, 및 타이로신은 때때로 방향족 아미노산으로 분류된다. 보존성 변이의 예에는 하나의 소수성 잔기 예컨대 이소류신, 발린, 류신 또는 메티오닌의 또다른 소수성 잔기로의 치환, 또는 하나의 극성 잔기의 또다른 극성 잔기로의 치환, 예컨대 아르기닌의 리신으로의 치환, 글루탐산의 아스파르트산으로의 치환, 또는 글루타민의 아스파라긴으로의 치환 등; 또는 생물학적 활성에 중대한 영향을 미치지 않을, 아미노산의 구조적으로 관련된 아미노산에 의한 유사한 보존성 대체가 포함된다. 그러므로, 참조 분자와 실질적으로 동일한 아미노산 서열을 갖지만 단백질의 면역원성에 실질적으로 영향을 미치지 않는 작은 아미노산 치환을 보유하는 단백질은 참조 폴리펩티드의 정의 안에 있다. 이들 개질에 의해 생성되는 모든 폴리펩티드가 본원에 포함된다. 용어 "보존성 변이" 는 치환된 폴리펩티드에 대해 생성된 항체가 비치환된 폴리펩티드와도 면역반응한다는 전제 하에 비치환된 부모 아미노산 대신 치환된 아미노산의 사용도 포함한다.
용어 "에피토프"는 특이적 B 세포 및/또는 T 세포가 반응하는 항원 또는 합텐 상 부위를 지칭한다. 상기 용어는 또한 "항원성 결정인자" 또는 "항원성 결정인자 부위"와 상호교환적으로 사용된다. 동일 에피토프를 인지하는 항원들은 하나의 항체의 또 다른 항체의 표적 항원에 대한 결합을 차단하는 능력을 보여주는 간단한 면역검정에서 동정될 수 있다.
조성물 또는 백신에 대한 "면역학적 반응" 은 관심의 조성물 또는 백신에 대한 세포성 및/또는 항체-매개 면역 반응의 숙주에서의 전개이다. 통상, "면역학적 반응" 에는 관심의 조성물 또는 백신에 포함되는 항원 또는 항원들에게 특이적으로 대항하는, 항체, B 세포, 조력자 T 세포, 및/또는 세포독성 T 세포의 생성이라는 효과 중 하나 이상이 포함되나 이에 제한되는 것은 아니다. 바람직하게는, 숙주는 새로운 감염에 대한 저항성이 향상될 것이고/거나 질병의 임상적 심각성이 감소되는 식의, 치료적 또는 보호적 면역학적 반응을 나타낼 것이다. 이러한 보호는 감염된 숙주에 의해 정상적으로 나타나는 증상의 감소 또는 결핍, 감염된 숙주에서 보다 빠른 회복 시간 및/또는 보다 낮은 바이러스 역가에 의해 증명될 것이다.
용어 "재조합" 및 "유전적 개질된" 은 상호교환적으로 사용되고, 그의 천연 형태 또는 구조에서 폴리뉴클레오티드 또는 단백질의 임의의 개질, 변경 또는 조작, 또는 그의 천연 환경 또는 주위에서 폴리뉴클레오티드 또는 단백질의 임의의 개질, 변경 또는 조작을 지칭한다. 폴리뉴클레오티드 또는 단백질의 개질, 변경 또는 조작은 이에 제한되는 것은 아니나, 하나 이상의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 결실, 전체 유전자의 결실, 유전자의 코돈-최적화, 아미노산의 보존적 치환, 하나 이상의 이종 폴리뉴클레오티드의 삽입을 포함한다.
용어 "다가 백신 또는 조성물", "조합 또는 콤보 백신 또는 조성물" 및 "다중가 백신 또는 조성물"은 하나 초과의 조성물 또는 백신을 포함하는 조성물 또는 백신을 지칭하는데 상호교환적으로 사용된다. 다가 백신 또는 조성물은 2, 3, 4 또는 그 이상의 조성물 또는 백신을 포함할 수 있다. 다가 백신 또는 조성물은 재조합 바이러스 벡터, 활성 또는 약독화 또는 사멸된 야생형 바이러스, 또는 재조합 바이러스 백터와 야생형 바이러스 백터 (활성 또는 약독화 또는 사멸 형태) 의 혼합물을 포함할 수 있다.
본 발명의 한 구현예는 조류 병원체의 적어도 하나의 항원 또는 폴리펩티드를 코딩 및 발현하는 1, 2, 또는 그 이상의 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 HVT 바이러스 벡터를 제공한다. 재조합 바이러스 벡터에 사용되는 HVT 균주는 이에 제한되는 것은 아니나 HVT 균주 FC126 를 비롯한 임의의 HVT 균주일 수 있다 (Igarashi T. et al., J. Gen. Virol. 70, 1789-1804, 1989).
항원 또는 폴리펩티드를 코딩하는 유전자는, 뉴캐슬 질병 바이러스 융합 단백질 (NDV-F), 뉴캐슬 질병 바이러스 적혈구응집소 뉴라미니다아제 (NDV-HN), 마렉병 바이러스 당단백질 C (gC), 마렉병 바이러스 당단백질 B (gB), 마렉병 바이러스 당단백질 E (gE), 마렉병 바이러스 당단백질 I (gI), 마렉병 바이러스 당단백질 H (gH) 또는 마렉병 바이러스 당단백질 L (gL), 감염성 점액낭병 바이러스 (IBDV) VP2, IBDV VPX, IBDV VP3, IBDV VP4, ILTV 당단백질 B, ILTV 당단백질 I, ILTV UL32, ILTV 당단백질 D, ILTV 당단백질 E, ILTV 당단백질 C, 인플루엔자 적혈구응집소 (HA), 인플루엔자 뉴라미니다아제 (NA) 를 코딩하는 것, 마이코플라스마 갈리셉티쿰 (Mycoplasma gallisepticum; MG), 또는 마이코플라스마 시노비애 (Mycoplasma synoviae; MS) 로부터 유래된 보호 유전자, 또는 그 조합물일 수 있다. 항원 또는 폴리펩티드는 조류 뇌척수염 바이러스, 조류 레오바이러스, 조류 파라믹소바이러스, 조류 메타뉴모바이러스, 조류 인플루엔자 바이러스, 조류 아데노바이러스, 계두 바이러스, 조류 코로나바이러스, 조류 로타바이러스, 닭 빈혈 바이러스, 조류 아스트로바이러스, 조류 파르보바이러스, 조류 레트로바이러스, 조류 피코르나바이러스, 콕시디아증 (에이머리아 종; Eimeria sp.), 캄필로박터 종 (Campylobacter sp.), 살모넬라 종 (Salmonella sp.), 파스테우렐라 종 (Pasteurella sp.), 아비박테리움 종 (Avibacterium sp.), 마이코플라스마 갈리셉티쿰, 마이코플라스마 시노비애, 클로스트리듐 종 (Clostridium sp.), 및 대장균 (Escherichia coli) 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 가금류 병원체로부터의 임의의 항원일 수 있다.
더욱이, 상술된 항원 또는 폴리뉴클레오티드의 상동체는 본 발명의 범주 내에 존재하는 것으로 의도된다. 본원에서 이용되는 바, 용어 "상동체"에는 이종상동체 (ortholog), 유사체 (analog) 및 동족체 (paralog) 가 포함된다. 용어 "유사체" 는 동일 또는 유사한 기능을 가지나, 무관한 유기체에서 별도로 진화되어 온 2 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. 용어 "이종상동체" 는 상이한 종으로부터이나, 공통의 조상 유전자로부터 종분화에 의해 진화되어 온 2 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. 보통, 이종 상동체는 동일 또는 유사한 기능을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 용어 "동족체" 는 게놈 내 중복에 의해 관련되는 2 개의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 의미한다. 동족체는 보통 상이한 기능을 갖지만, 이들 기능은 관련될 수 있다. 야생형 폴리펩티드의 유사체, 이종상동체, 및 동족체는 번역후 개질에 의해, 아미노산 서열 차이에 의해, 또는 둘 다에 의해 야생형 폴리펩티드와 상이할 수 있다. 특히, 본 발명의 상동체는 일반적으로 상술된 항원의 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드의 전부 또는 일부와 적어도 80-85%, 85-90%, 90-95%, 또는 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성을 나타낼 것이고, 유사한 기능을 나타낼 것이다.
한 구현예에서, 본 발명은 NDV-F 항원 또는 폴리펩티드, IBDV VP2 항원 또는 폴리펩티드, ILTV gD 항원 또는 폴리펩티드 또는 그 조합물을 코딩 및 발현하는 1개, 2 개 또는 그 이상의 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 HVT 바이러스 벡터를 제공한다. 구현예의 한 측면에서, NDV-F 항원 또는 폴리펩티드는 SEQ ID NO:5 또는 22 에 제시된 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 이들 폴리펩티드 중 하나의 적어도 8 개 또는 적어도 10 개의 연이은 아미노산을 포함하는 보존성 변이체, 대립 변이체, 상동체, 또는 면역원성 단편, 또는 이들 폴리펩티드의 조합과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는다. 구현예의 또 다른 측면에서, 이종 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:5 에 제시된 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩티드와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 NDV-F 항원 또는 폴리펩티드를 인코딩한다. 또한 구현예의 또 다른 측면에서, 이종 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:3, 4 또는 21 에 제시된 바와 같은 서열을 가진 폴리뉴클레오티드와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가진다.
구현예의 또 다른 측면에서, IBDV VP2 항원 또는 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2 에 제시된 바와 같은 서열을 가진 폴리펩티드, 또는 이들 폴리펩티드 중 하나의 적어도 8 개 또는 적어도 10 개의 연이은 아미노산을 포함하는 보존성 변이체, 대립 변이체, 상동체, 또는 면역원성 단편, 또는 이들 폴리펩티드의 조합과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는다. 구현예의 또 다른 측면에서, 이종 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:2 에 제시된 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩티드와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 IBDV VP2 항원 또는 폴리펩티드를 인코딩한다. 또한 구현예의 또 다른 측면에서, 이종 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:1 에 제시된 바와 같은 서열을 가진 폴리뉴클레오티드와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는다.
구현예의 또 다른 측면에서, ILTV gD 항원 또는 폴리펩티드는 SEQ ID NO:17 에 제시된 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩티드, 또는 이들 폴리펩티드 중 하나의 적어도 8 개 또는 적어도 10 개의 연이은 아미노산을 포함하는 보존성 변이체, 대립 변이체, 상동체, 또는 면역원성 단편, 또는 이들 폴리펩티드의 조합과 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는다. 구현예의 또 다른 측면에서, 이종 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:17 에 제시된 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩티드와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 ILTV gD 항원 또는 폴리펩티드를 인코딩한다. 또한 구현예의 또 다른 측면에서, 이종 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:16 에 제시된 바와 같은 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는다.
변이체는 대립 변이체를 포함한다. 용어 "대립 변이체" 는 단백질의 아미노산 서열에 변화를 초래하고 자연 집단 (예, 바이러스 종 또는 변종) 에 존재하는 다형성을 포함하는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 언급한다. 그러한 자연 대립 변이는 전형적으로는 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드에 1-5% 변동을 초래할 수 있다. 대립 변이체는 다수의 상이한 종에서 관심의 핵산 서열을 서열분석함으로써 식별될 수 있고, 이는 하이브리드형성 프로브를 사용하여 이들 종에서 동일한 유전자 유전자좌를 식별함으로써 용이하게 수행될 수 있다. 자연 대립 변이의 결과이고 관심의 유전자의 기능적 활성을 변경하지 않는 임의의 모든 상기 핵산 변이 및 결과적인 아미노산 다형성 또는 변이가 본 발명의 범주 내에 있는 것으로 의도된다.
서열과 관련하여 "동일성" 은 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산이 있는 위치의 수를 2 개의 서열 중 더 짧은 것의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 수로 나눈 값을 언급할 수 있으며, 이 경우 2 개의 서열의 정렬은 Wilbur and Lipman algorithm (Wilbur and Lipman) 에 따라 측정될 수 있다. 두 아미노산 서열의 서열 동일성 또는 서열 유사성 또는 두 뉴클레오티드 서열간의 서열 동일성은 Vector NTI 소프트웨어 패키지 (Invitrogen, 1600 Faraday Ave., Carlsbad, CA) 를 이용하여 측정될 수 있다. RNA 서열이 DNA 서열과 유사하다거나, DNA 서열과 어느 정도의 서열 동일성 또는 상동성을 갖는다고 언급되는 경우, DNA 서열 내 티미딘 (T) 은 RNA 서열 내 우라실 (U) 과 동등하다고 여겨진다. 따라서, RNA 서열은 본 발명의 범주 안에 있고, DNA 서열 내 티미딘 (T) 을 RNA 서열 내 우라실 (U) 과 동등하다고 여김으로써 DNA 서열로부터 유도될 수 있다.
본 개시의 폴리뉴클레오티드에는 유전적 코드, 예를 들어, 특정 숙주에 대해 최적화된 코돈 사용의 결과로서 축퇴성인 서열이 포함된다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "최적화된 (optimized)" 은 특정 종에서 그의 발현을 증가시키도록 유전적으로 조작된 폴리뉴클레오티드를 의미한다. NDV-F, IBDV VP2 또는 ILTV gD 폴리펩티드를 코딩하는 최적화된 폴리뉴클레오티드를 제공하기 위해, 이들 유전자의 DNA 서열은 1) 특정 종에서 고발현되는 유전자에 의해 선호되는 코돈을 포함하거나; 2) 뉴클레오티드 염기 조성 중 A+T 또는 G+C 함량을 상기 종에서 실질적으로 발견되는 정도까지 포함하거나; 3) 상기 종의 개시 서열을 형성하거나; 또는 4) RNA 의 불안정화, 부적절한 폴리아데닐화, 붕괴 및 종결을 야기하거나, 2 차 구조 헤어핀 또는 RNA 스플라이스 자리를 형성하는 서열을 제거하도록 개질될 수 있다. 상기 종에서 NDV F, IBDV VP2 또는 ILTV gD 단백질의 증가된 발현은 진핵생물 및 원핵생물에서의, 또는 특정 종에서의 코돈 사용의 분포 빈도를 이용함으로써 달성될 수 있다. 용어 "바람직한 코돈 사용의 빈도" 는 특정한 아미노산을 지정하기 위해 뉴클레오티드 코돈의 사용시 특정 숙주 세포에 의해 나타나는 선호도를 언급한다. 20 개의 자연 아미노산이 존재하고, 이들 중 대부분은 하나 이상의 코돈에 의해 지정된다. 그러므로, 뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되는 NDV-F, IBDV VP2 또는 ILTV gD 폴리펩티드의 아미노산 서열이 기능적으로 변화되지 않는 한 모든 축퇴성 뉴클레오티드 서열이 본 개시에 포함된다.
재조합체/개질된 감염성 바이러스에 의한 이종 폴리뉴클레오티드의 성공적인 발현은 두 조건을 요구한다. 먼저, 이종 폴리뉴클레오티드가 개질된 바이러스가 생존되도록 바이러스의 게놈 영역에 삽입 또는 도입되어야 한다. 삽입된 이종 폴리뉴클레오티드의 발현을 위한 두 번째 조건은 바이러스 배경 (예, 프로모터, 인핸서, 공여체 및 수용체 슬라이싱 부위 및 인트론, Kozak 번역 개시 공통 서열, 폴리아데닐화 시그널, 미번역 서열 요소) 에서 유전자의 발현을 허용하는 조절 서열의 존재이다.
삽입 부위는 이에 제한되는 것은 아니나, (유전자간 영역 ((intergenic region) 1, IG1 유전자좌, US5,980,906), IG2 (유전자간 영역 2) 유전자좌, IG3 (유전자간 영역 3) 유전자좌, UL43 유전자좌, US10 유전자좌, US2 유전자좌, SORF3/US2 유전자좌와 같이 인접 반복 영역을 갖는 UL 접합부와 ORF UL55 의 STOP 코돈 사이의 영역을 포함하는 HVT 게놈의 비필수 영역일 수 있다 (도 2 참조).
일반적으로, 진핵 세포에서 기능하는 강한 프로모터를 이용하는 것이 유리하다. 프로모터에는 이에 제한되는 것은 아니나 전초기 (IE) 인간 거대세포바이러스 (CMV) (hCMV) 프로모터, 마우스 CMV (mCMV) IE 프로모터, 기니아피그 CMV (gpCMV) IE 프로모터, SV40 프로모터, 거짓광견병 바이러스 프로모터, 예컨대 당단백질 X 프로모터, 단순 헤르페스 바이러스-1, 예컨대 알파 4 프로모터, 마렉병 바이러스 (MDV-1, MDV-2 및 HVT 포함) 프로모터, 예컨대 당단백질 gC, gB, gE, 또는 gI 발현을 구동하는 것, HHV3gB 프로모터 (인간 헤르페스바이러스 유형 3 당단백질 B 프로모터), 감염성 후두기관염 바이러스 프로모터, 예컨대 당단백질 gB, gE, gI, gD, gC 유전자의 것, 또는 기타 헤르페스바이러스 프로모터가 포함된다.
본 발명의 한 구현예는 IBDV VP2 항원 또는 폴리펩티드를 코딩 및 발현하는 제 1 의 이종 폴리뉴클레오티드 및 NDV-F 항원 또는 폴리펩티드를 코딩 및 발현하는 제 2 의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 HVT 벡터를 제공한다. 구현예의 한 측면에서, NDV-F 항원 또는 폴리펩티드는 SEQ ID NO:5 에 제시된 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩티드와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 가진다. 구현예의 또 다른 측면에서, IBDV VP2 항원 또는 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2 에 제시된 바와 같은 서열을 가진 폴리펩티드와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는다. 또 다른 측면에서, NDV-F 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:7 에 제시된 바와 같은 서열을 가진 SV40 프로모터와 작동적으로 연결되고, NDV-F 항원 또는 폴리펩티드의 발현은 SV40 프로모터에 의해 조절된다. 또한 또 다른 측면에서 NDV-F 항원 또는 폴리펩티드의 발현은 SEQ ID NO:8 에 제시된 바와 같은 서열을 갖는 SV40 polyA 시그널, 또는 SEQ ID NO:9 에 제시된 바와 같은 서열을 갖는 합성 polyA 시그널에 의해 조절된다. 또 다른 측면에서, IBDV VP2 항원 또는 폴리펩티드의 발현은 SEQ ID NO:6 에 제시된 바와 같은 서열을 가진 mCMV-IE 프로모터 및 SEQ ID NO:8 에 제시된 바와 같은 서열을 가진 SV40 polyA 시그널, 또는 SEQ ID NO:9 에 제시된 바와 같은 서열을 가진 합성 polyA 시그널에 의해 조절된다.
본 발명의 또 다른 구현예는 IBDV VP2 항원 또는 폴리펩티드를 코딩 및 발현하는 제 1 의 이종 폴리뉴클레오티드 및 NDV-F 항원 또는 폴리펩티드를 코딩 및 발현하는 제 2 의 폴리뉴클레오티드를 포함하며, 제 2 의 폴리뉴클레오티드의 발현을 조절하는 서열을 추가로 포함하는 재조합 HVT 벡터를 제공한다. 조절 서열 또는 링커는 내부 리보솜 결합 부위 (internal ribosome entry site; IRES), 뇌심근염 바이러스 (EMCV) 로부터 유래된 RNA 서열, 또는 자가-절단 돼지 테스코바이러스-1 2A 또는 구제역 바이러스 (foot and mouth disease virus; FMDV) 펩티드 (P2A)를 인코딩하는 서열일 수 있다.
구현예의 또 다른 측면에서, 재조합 HVT 벡터는 IBDV VP2 항원을 인코딩하는 제 1 의 폴리뉴클레오티드 및 NDV-F 항원을 인코딩하는 제 2 의 폴리뉴클레오티드를 포함하고, SEQ ID NO:10 에 제시된 바와 같은 서열을 갖는 IRES 를 추가로 포함한다. 구현예의 또 다른 측면에서, 재조합 HVT 는 IBDV VP2 항원을 인코딩하는 제 1 의 폴리뉴클레오티드 및 NDV-F 항원을 인코딩하는 제 2 의 폴리뉴클레오티드를 포함하고, SEQ ID NO:11 에 제시된 바와 같은 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드를 인코딩하는 P2A 를 추가로 포함한다.
본 발명의 한 구현예는 NDV F 항원 또는 폴리펩티드를 코딩 및 발현하는 제 1 의 이종 폴리뉴클레오티드 및 ILTV gD 항원 또는 폴리펩티드를 코딩 및 발현하는 제 2 의 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 제 2 의 폴리뉴클레오티드의 발현을 조절하는 서열을 추가로 포함하는 재조합 HVT 벡터를 제공한다. 조절 서열 또는 링커는 내부 리보솜 결합 부위 (IRES), 뇌심근염 바이러스 (EMCV) 로부터 유래된 RNA 서열, 또는 자가-절단 돼지 테스코바이러스-1 2A 또는 구제역 바이러스 (FMDV) 펩티드 (P2A) 를 인코딩하는 서열일 수 있다. 구현예의 한 측면에서, ILTV gD 항원 또는 폴리펩티드는 SEQ ID NO:17 에서 제시된 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩티드와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는다. 구현예의 또 다른 측면에서, NDV F 항원 또는 폴리펩티드는 SEQ ID NO:5 또는 22 에 제시된 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩티드와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는다. 구현예의 또한 또 다른 측면에서, 재조합 HVT 벡터는 NDV F 항원을 인코딩하는 제 1 의 폴리뉴클레오티드 및 ILTV gD 항원을 인코딩하는 제 2 의 폴리뉴클레오티드를 포함하고, SEQ ID NO:10 에 제시된 바와 같은 서열을 갖는 IRES 를 추가로 포함한다.
본 발명의 또 다른 구현예는 NDV F 항원 또는 폴리펩티드를 코딩 및 인코딩하는 제 1 의 이종 폴리뉴클레오티드 및 ILTV gD 항원 또는 폴리펩티드를 코딩 및 발현하는 제 2 의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 HVT 벡터를 제공한다. 구현예의 한 측면에서, ILTV gD 항원 또는 폴리펩티드는 SEQ ID NO:17 에 제시된 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩티드와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는다. 구현예의 또 다른 측면에서, NDV F 항원 또는 폴리펩티드는 SEQ ID NO:5 또는 22 에 제시된 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩티드와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는다. 한 측면에서, NDV F 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 SV40 프로모터에 작동적으로 연결되어 있고, NDV F 항원 또는 폴리펩티드의 발현은 SV40 프로모터에 의해 조절된다. 또 다른 측면에서, ILTV gD 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 HHV3gB 프로모터에 작동적으로 연결되고 ILTV gD 항원 또는 폴리펩티드의 발현은 HHV3gB 프로모터에 의해 조절된다. 또한 또 다른 측면에서, HHV3gB 프로모터는 역향적 방향이다. 또한 또 다른 측면에서, NDV F 항원 및 ILTV gD 항원의 발현은 SV40 프로모터 및 역향적 HHV3gB 프로모터에 의해 조절되고, 이는 반대 방향이다.
본 발명의 또 다른 구현예는 IBDV VP2 항원 또는 폴리펩티드를 코딩 및 발현하는 제 1 의 이종 폴리뉴클레오티드 및 ILTV gD 항원 또는 폴리펩티드를 코딩 및 발현하는 제 2 의 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 HVT 벡터를 제공한다. 구현예의 한 측면에서, ILTV gD 항원 또는 폴리펩티드는 SEQ ID NO:17 에서 제시된 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩티드와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는다. 구현예의 또 다른 측면에서, IBDV VP2 항원 또는 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2 에 제시된 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩티드와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는다. 구현예의 또한 또 다른 측면에서, 재조합 HVT 벡터는 IBDV VP2 항원을 인코딩하는 제 1 의 폴리뉴클레오티드 및 ILTV gD 항원을 인코딩하는 제 2 의 폴리뉴클레오티드를 포함하고, SEQ ID NO:10 에 제시된 바와 같은 서열을 갖는 IRES 를 추가로 포함한다.
본 발명의 또 다른 구현예는 ILTV gD 항원 또는 폴리펩티드를 코딩 및 발현하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 재조합 HVT 벡터를 제공한다. 구현예의 한 측면에서, ILTV gD 항원 또는 폴리펩티드는 SEQ ID NO:17 에 제시된 바와 같은 서열을 갖는 폴리펩티드와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는다. 구현예의 또 다른 측면에서, ILTV gD 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 SV40 프로모터와 작동적으로 연결되고 ILTV gD 항원 또는 폴리펩티드의 발현은 SV40 프로모터에 의해 조절된다.
한 구현예에서, IBDV VP2 항원, 및/또는 NDV-F 항원, 및/또는 ILTV gD 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 HVT 게놈의 IG1, IG2, US10, US2, SORF3-US2 및 gD 으로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자좌 영역에 삽입될 수 있다. 또 다른 구현예에서, IBDV VP2 항원, 및/또는 NDV-F 항원, 및/또는 ILTV gD 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 동일한 유전자좌, 예컨대 HVT 게놈의 IG1 에 삽입된다.
한 구현예에서, 본 발명은 본 발명의 하나 이상의 재조합 HVT 벡터 및 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 비히클 또는 아쥬번트를 포함하는 약학적 조성물 또는 백신에 관한 것이다. HVT 벡터는 2 개의 이종 폴리뉴클레오티드를 포함할 수 있고, 이때 제 1 의 폴리뉴클레오티드는 감염성 점액낭병 바이러스 (IBDV) VP2 항원, 감염성 후두기관염 바이러스 (ILTV) 당단백질 D (gD) 항원 및 뉴캐슬병 바이러스 F (NDV-F) 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 제 2 의 폴리뉴클레오티드는 감염성 점액낭병 바이러스 (IBDV) VP2 항원, 감염성 후두기관염 바이러스 (ILTV) 당단백질 D (gD) 항원 및 뉴캐슬병 바이러스 F (NDV-F) 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하는 HVT 바이러스 벡터를 포함하는 조성물 또는 백신을 제공한다: i) IBDV VP2 항원 또는 NDV-F 항원을 코딩 및 발현하는 제 1 의 이종 폴리뉴클레오티드; ii) NDV-F 항원 또는 IBDV VP2 항원을 코딩 및 발현하는 제 2 의 폴리뉴클레오티드; 및 iii) 임의로는, 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 비히클 또는 아쥬번트. 또한 또 다른 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하는 HVT 바이러스 벡터를 포함하는 조성물 또는 백신을 제공한다: i) IBDV VP2 항원 또는 ILTV gD 항원을 코딩 및 발현하는 제 1 의 이종 폴리뉴클레오티드; ii) ILTV gD 항원 또는 IBDV VP2 를 코딩 및 발현하는 제 2 의 폴리뉴클레오티드; 및 iii) 임의로는, 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 비히클 또는 아쥬번트. 또한 또 다른 구현예에서, 본 발명은 하기를 포함하는 HVT 바이러스 벡터를 포함하는 조성물 또는 백신을 제공한다: i) NDV-F 항원 또는 ILTV gD 항원을 코딩 및 발현하는 제 1 의 이종 폴리뉴클레오티드; ii) ILTV gD 항원 또는 NDV-F 항원을 코딩 및 발현하는 제 2 의 폴리뉴클레오티드; 및 iii) 임의로는, 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 비히클 또는 아쥬번트. 또한 또 다른 구현예에서, 본 발명은 ILTV gD 항원을 코딩 및 발현하는 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 HVT 바이러스 벡터 및 임의로는 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 비히클 또는 아쥬번트를 포함하는 조성물 또는 백신을 제공한다. 또한 또 다른 구현예에서, 본 발명은 SEQ ID NO:1, 3, 4, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 21, 25, 26 또는 27 에 제시된 바와 같은 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드와 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 HVT 를 포함하는 조성물 또는 백신을 제공한다. 한 구현예에서, 하나의 유전자좌 내 둘 이상의 이종 폴리뉴클레오티드의 삽입은 다수의 유전자좌 내 삽입보다 더 나은 보호 및 효능을 부여하는 것으로 나타났다. 또 다른 구현예에서, IRES 또는 P2A 를 통해 단일 mRNA 로부터 하나 초과의 이종 폴리뉴클레오티드를 발현하는 것이 조류 질병에 대해 더 나은 보호 및 효능을 제공하는 것으로 나타났다. 또한 또 다른 구현예에서, 본 발명에 의해 제공된 실험 데이타는 IRES 요소를 포함하는 구축물이 P2A 요소를 포함하는 구축물보다 더 나은 보호를 제공한다는 점을 개시한다.
약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체 또는 아쥬반트 또는 비히클 또는 부형제가 당업자에게 잘 알려져 있다. 예를 들어, 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체 또는 아쥬반트 또는 비히클 또는 부형제는 MD 백신에 사용된 마렉병 백신 희석제일 수 있다. 본 발명의 방법에서 사용될 수 있는 기타 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체 또는 아쥬반트 또는 비히클 또는 부형제는, 이에 제한되는 것은 아니나, 0.9% NaCl (예, 식염) 용액 또는 포스페이트 완충액, 폴리-(L-글루타메이트), 젖산 링게르 (Lactated Ringer) 주사 희석제 (나트륨 클로라이드, 나트륨 락테이트, 칼륨 클로라이드 및 칼슘 클로라이드), 또는 폴리비닐피롤리돈을 포함한다. 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체 또는 비히클 또는 아쥬번트 또는 부형제는 벡터 (또는 본 발명의 벡터로부터 시험관 내 발현되는 단백질) 의 투여를 촉진하는 임의의 화합물 또는 화합물의 조합일 수 있고, 트랜스펙션 또는 감염을 촉진할 수 있고/거나 벡터 (또는 단백질) 의 보존을 향상시킬 수 있다. 용량 및 용량 부피는 본원의 일반적 기술에서 논의되어 있고, 당업자가 당업계의 지식과 함께 본 개시를 읽음으로써 임의의 과도한 실험 없이 결정할 수 있다.
임의로는 이에 제한되는 것은 아니나 하기를 포함하는 기타 화합물이 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체 또는 아쥬반트 또는 비히클 또는 부형제로서 첨가될 수 있다: 알룸 (alum); CpG 올리고뉴클레오티드 (ODN), 특히 ODN 2006, 2007, 2059, 또는 2135 (Pontarollo R.A. et al., Vet. Immunol. Immunopath, 2002, 84: 43-59; Wernette C.M. et al., Vet. Immunol. Immunopath, 2002, 84: 223-236; Mutwiri G. et al., Vet. Immunol. Immunopath, 2003, 91: 89-103); polyA-polyU, 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 (DDA) ("Vaccine Design The Subunit and Adjuvant Approach", edited by Michael F. Powell and Mark J. Newman, Pharmaceutical Biotechnology, 6: p.03, p.157); N,N-디옥타데실-N',N'-비스(2-히드록시에틸) 프로판디아민 (예컨대, AVRIDINE® (Ibid, p. 148); 카르보머, 키토산 (예를 들어, US 특허 일련 번호 5,980,912 참조).
본 발명에 따른 약학적 조성물 및 백신은 하나 이상의 아쥬반트를 포함하거나 이로 본질적으로 이루어질 수 있다. 본 발명의 실시에서의 사용에 적합한 아쥬반트는 하기이다: (1) 알케닐 유도체 중합체, 말레산 무수물, 및 아크릴 또는 메타크릴산의 중합체, (2) 면역자극 서열 (ISS), 예컨대 하나 이상의 비-메틸화 CpG 유닛을 갖는 올리고데옥시리보뉴클레오티드 서열 (Klinman et al., 1996; WO98/16247), (3) 수중유 에멀젼, 예컨대 M. Powell, M. Newman, Plenum Press 1995 에 의해 출판된 "Vaccine Design, The Subunit and Adjuvant Approach" 의 페이지 147 에 기술되어 있는 SPT 에멀젼, 및 동일한 문헌의 페이지 183 에 기술되어 있는 에멀젼 MF59, (4) 4차 암모늄 염, 예를 들어, DDA 를 함유하는 양이온 지질 (5) 사이토카인, (6) 알루미늄 히드록시드 또는 알루미늄 포스페이트, (7) 사포닌 또는 (8) 본 출원에 참조로 포함되고 임의의 언급된 문헌에서 논의된 다른 아쥬반트, 또는 (9) 그의 임의의 조합 또는 혼합물.
하나의 구현예에서, 아쥬번트는 TS6 TS7, TS8 및 TS9 (US7,371,395), LR2, LR3 및 LR4 (US7,691,368), TSAP (US20110129494), TRIGEN™ (Newport Labs), 합성 dsRNA (예, poly-IC, poly-ICLC [HILTONOL®]), 및 MONTANIDE™ 아쥬번트 (W/O, W/O/W, O/W, IMS 및 겔; 모두 SEPPIC 제조) 을 포함할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본 발명은 표적 세포 내 재조합 HVT 벡터의 전달을 위한 치료학적 유효량의 백신 또는 조성물의 투여를 제공한다. 치료학적 유효량의 결정은 당업자에게 있어서는 통상적인 실험이다.
본 발명의 또 다른 측면은 하나 이상의 항원에 대항해 동물에서 면역학적 반응을 유도하거나, 또는 하나 이상의 조류 병원체에 대항해 동물에서 보호 반응을 유도하는 방법에 관한 것으로서, 이때 상기 방법은 본 발명의 약학적 조성물 또는 백신으로 적어도 1 회 동물에 접종하는 것을 포함한다. 또한, 본 발명의 또 다른 측면은 프라임-부스트 (prime-boost) 투여 요법으로 하나 이상의 조류 병원체에 대한 동물에서의 보호 반응을 유도하거나, 또는 하나 이상의 항원에 대한 동물에서의 면역학적 반응을 유도 방법에 관한 것으로, 이는 하나 이상의 공통의 폴리펩티드, 항원, 에피토프 또는 면역원을 사용하는 적어도 1 회의 1 차 투여 및 적어도 1 회의 부스터 투여로 이루어진다. 1 차 투여에 사용되는 면역학적 조성물 또는 백신은 부스터로서 사용되는 것과 성질이 동일하거나 상이할 수 있다.
조류 병원체는 뉴캐슬 질병 바이러스 (NDV), 감염성 점액낭병 바이러스 (즉, IBDV 또는 검보로 질병 바이러스), 마렉병 바이러스 (MDV), 감염성 후두기관염 바이러스 (ILTV), 조류 뇌척수염 바이러스, 조류 레오바이러스, 조류 파라믹소바이러스, 조류 메타뉴모바이러스, 조류 인플루엔자 바이러스, 조류 아데노바이러스, 계두 바이러스, 조류 코로나바이러스, 조류 로타바이러스, 조류 파르보바이러스, 조류 아스트로바이러스 및 닭 빈혈 바이러스, 콕시디아증 (에이머리아 종), 캄필로박터 종, 살모넬라 종, 마이코플라스마 갈리셉티쿰, 마이코플라스마 시노비애, 파스테우렐라 종, 아비박테리움 종, 대장균 또는 클로스트리듐 종일 수 있다.
통상적으로, 조류에서 백신의 1차 투여는 1일령에서, 피하 또는 근육내 경로로써, 또는 17 내지 19 일령 배아에서 난 내 (in ovo) 수행된다. 2차 투여는 1차 투여 후 0-30 일 이내에 수행될 수 있다.
피하 또는 근육내, 피내, 경피와 같이 다양한 투여 경로가 1일령 닭에서 이용될 수 있다. 난 내 백신접종은 양막 낭 및/또는 배아에서 수행될 수 있다. 시판중인 난 내 및 SC 투여 장치가 백신접종에 사용될 수 있다.
조성물 또는 백신은 바이러스 벡터, 플라스미드 또는 배큘로바이러스로부터 시험관 내 또는 생체 내 제조된 약 102 내지 약 1020, 약 103 내지 약 1018, 약 104 내지 약 1016, 약 105 내지 약 1012 VLP (virus like particle; 바이러스 유사 입자) 용량을 함유할 수 있다. 바이러스 벡터는 제한없이 FFA (Focus Forming Assay) 또는 FFU (Focus Forming Unit), TCID50 (50% Tissue Culture Infective Dose), PFU (Plaque Forming Units), 및 FAID50 (50% Fluorescent Antibody Infectious Dose) 를 비롯한 임의의 바이러스 적정 방법을 기반으로 적정될 수 있고, 시험관 내 제조된 VLP 는 적혈구응집반응 검정, ELISA 및 전자 현미경검사에 의해 적정될 수 있다. 여타의 방법이 또한 VLP 의 유형에 따라 적용가능할 수도 있다.
조성물 또는 백신은 약 102.0 내지 약 107.0 TCID50 또는 PFU/용량, 약 102.0 내지 약 107.0 TCID50 또는 PFU/용량, 및 약 102.0 내지 약 106.5 TCID50 또는 PFU/용량을 함유할 수 있다.
용량 부피는 약 0.01 내지 약 10 ml, 약 0.01 내지 약 5 ml 일 수 있다.
본 발명을 이제 하기 비제한적인 실시예를 통해 추가로 기술할 것이다.
실시예
DNA 삽입물, 플라스미드 및 재조합 바이러스 벡터의 구축을 문헌 [J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 2014)] 에 의해 기술된 표준 분자 생물학 기술을 이용하여 수행했다.
실시예 1 2 개의 유전자를 발현하는 재조합 HVT 벡터의 구축
실시예 1.1 IBDV-VP2 및 NDV-F 를 발현하는 재조합 vHVT309 의 구축
본 연구의 목적은 마우스 거대세포바이러스 프로모터 (mCMV), 감염성 점액낭병 바이러스 바이러스성 단백질 2 (VP2) 를 인코딩하는 유전자, 원숭이 바이러스 40 Poly A 꼬리 (SV40 Poly A), 원숭이 바이러스 40 프로모터 (SV40 프로모터), 뉴캐슬병 바이러스 융합 단백질 (NDV-F) 을 인코딩하는 유전자 및 합성 Poly A 꼬리 (syn Poly A tail) 를 함유하는 발현 카세트가 유전자간 부위 1 (IG1) 에 혼입되어 있는 재조합 HVT 를 구축하는 것이다.
구축물에 사용된 부모 바이러스는 vHVT13 (IBDV VP2 유전자를 발현하는 HVT 벡터로서, Merial 의 VAXXITEK® (HVT+IBD) 백신의 활성 성분으로, US 5,980,906 에 vHVT17 로도 공지되어 있음) 이다. vHVT13 벡터는 IG1 삽입 부위에 삽입된 mCMV IE 프로모터 (SEQ ID NO:6), IBDV VP2 유전자 (SEQ ID NO:2 를 인코딩하는 SEQ ID NO:1), 및 SV40 Poly A 꼬리 (SEQ ID NO:8) 로 구성된 발현 카세트를 함유한다. 유전형 VIId 서열에 상응하는 뉴캐슬병 바이러스 융합 단백질 (NDV-F) 을 화학적으로 합성하고 코돈 최적화하였다 (GenScript). 이 합성 유전자의 F 단백질 절단 부위를 변경시켜 약독형 (렌토제닉; lentogenic) F 절단 부위 서열과 매칭시키고, 생성 NDV-F 유전자 서열은 GenBank 에 기탁된 NDV-F 서열 (AY337464) 과 99% 아미노산 서열 동일성을 지닌다. IBD-VP2 에 있어서는 마우스 CMV IE 프로모터를 이용하였고, NDV-F 에 있어서는 SV40 프로모터를 이용했다. 삽입 유전자좌는 HVT 에서 유전자간 부위 1 (IG1) 이다 (도 2). 공여체 플라스미드 pFSV40VP2 (VP2/SV40 Poly A 및 IG1 의 측면화 (flanking) 팔 (arm) +SV40 프로모터+NDV-F+합성 Poly A 을 함유하는 삽입 플라스미드) 를 하기와 같이 기술한 대로 구축하였다. 닭 배아 섬유모세포 세포 (CEF) 를 시험관 내 재조합에 사용했다.
공여체 플라스미드 구축
IBDV VP2 유전자 (SEQ ID NO:2 를 인코딩하는 SEQ ID NO:1), SV40 Poly A 꼬리 (SEQ ID NO:8), SV40 프로모터 (SEQ ID NO:7), NDV-F 유전자 (SEQ ID NO:5 를 인코딩하는 SEQ ID NO:3), 및 합성 Poly A 꼬리 (SEQ ID NO:9) 를 함유하는 pUC57 에서 합성 DNA 를 GeneScript에 의해 합성했다 (도 3). 플라스미드, pFSV40VP2 를 Top10 Oneshot 키트 (cat#C404002, Invitrogen) 를 이용하여 형질전환하고, 대규모 배양물을 성장시키고, 플라스미드 추출을 Qiagens Maxi Prep 키트를 이용하여 수행했다. 맥시 프렙 (maxi prep) 의 일시적 발현은 NDV 에 대항하는 닭 폴리클로날 혈청 및 닭 배아 섬유모세포 세포 (CEF) 에서 Fugene 트랜스펙션 시약을 이용해 검증했다.
재조합체 제조
표준 상동 재조합 절차 후에, vHVT13 백신으로부터 단리된 바이러스 DNA 및 pFSV40VP2 플라스미드를 이용하여 2차 CEF 세포의 공동-전기천공을 후속시켰다. 공동-전기천공은 300 ㎕ Opti-MEM 중 1x107 2o CEF 를 이용하여 수행하고, 150 볼트에서 950 정전용량으로 2 mm 전기천공 큐벳에서 충격을 가했다. 트랜스펙션된 세포를 96-웰 플레이트에 시딩하고 4 일 동안 인큐베이션하였다. 96-웰 플레이트에서 성장된 세포를 이어서 2 개의 96-웰 플레이트로 복제하고, 3 일 더 인큐베이션하였다. 96-웰 플레이트의 한 세트를 NDV-F 에 대항하는 닭 폴리클로날 혈청을 이용하는 IFA 에서 이용하여 재조합체를 함유하는 양성의 웰을 동정하였고 96-웰 플레이트의 나머지 다른 한 세트는 양성 웰로부터 감염된 세포를 회수하는데 사용했다.
재조합 바이러스 정제 방법을 먼저 96-웰 플레이트 복제 및 대부분 IFA 양성 플라크 (plaque) 를 함유하고 가장 적은 양의 IFA 음성 플라크를 가진 웰의 IFA 선택으로써 수행했다. 이어서 이런 기준에 매칭하는 웰을 수확하고 DMEM+2% FBS 중 1 ml 로 조절했다. 1 ml 스톡으로부터, 5-20ul 을 제거하고, 10ml DMEM+2% FBS 중 1x107 CEF 와 혼합하고, 웰 당 단일의 바이러스 플라크를 갖도록 새로운 96-웰 플레이트로 분취했다. 96-웰 플레이트를 5 일의 인큐베이션 후 복제하고, 플라크를 함유하는 웰을 이중 재조합체의 존재 및 vHVT13 부모 바이러스의 부재에 대해 IFA 및 PCR 로써 시험했다. 다시, PCR 밴딩 결과를 비교함으로써, 더 많은 재조합 바이러스를 가진 것으로 보이는 웰을 수확하고, 1 ml 로 조절하고, 새로운 96-웰 플레이트 상으로 분취했다. 2 라운드의 바이러스 감염된 세포의 정제 후, NDV-F 단백질을 발현하는 재조합 바이러스를 단리하고, 재조합 바이러스의 순도를 IFA 및 PCR 로써 시험해 부모 바이러스의 부재를 확인했다.
PCR 에 의한 재조합체의 분석
DNA 를, 페놀/클로로포름 추출로써 스톡 바이러스로부터 추출하고, 에탄올 침전시키고, 20 mM HEPES 중 재현탁했다. PCR 프라이머 (표 1) 를 고안해 IBDV-VP2 및 NDV-F VIId 유전자, 프로모터, Poly A 뿐 아니라, Vaxxitek 부모 바이러스로부터 재조합 바이러스의 순도도 구체적으로 동정하였다. 프라이머 결합 부위의 위치는 도 4 에 나타낸다. 표 1 에 기재된 특이적 프라이머 쌍과 함께 200 μg 의 DNA 주형을 이용하여 PCR 을 수행했다. PCR 사이클링 조건은 하기와 같다: 94℃ - 2 분; 94℃ - 30 초, 60℃ - 45 초, 68℃ - 3 분 (MB080+MB081 프라이머 세트에 대해서는 5 분) 의 30 주기; 68℃ - 5 분 (MB080+MB081 프라이머 세트에 대해서는 7 분).
표 1 특이적 프라이머 세트를 이용한 예상되는 PCR 밴드
Figure pct00001
발현 분석
면역형광 시험을 위해, 재조합체 물질을 배지 중 1:100 희석했다. 약 50 ㎕ 의 희석된 바이러스를, 2x107 CEF 를 가진 DMEM+2% FBS 20 ml 에 첨가한 다음, 2 개의 96 웰 플레이트 상으로 분취했다 (100 ㎕/웰). 플레이트를 4일 동안 37℃+5% CO2 에서, 바이러스 플라크가 눈에 보일 때까지 인큐베이션하였다. 플레이트를 95% 빙냉 아세톤으로 3 분간 고정시키고, 10 분간 통풍 건조시키고 물로 3 회 세정했다. 뉴캐슬병 바이러스에 대항하는 닭 항혈청 (NDV Pab) (lot# C0117A, Charles Rivers Laboratories) (1:500) 및 HVT L78 모노클로날 항체 (HVT Mab) (Lee et al. 1983, J. Immunol. 130 (2) 1003-6; Merial batch) (1:3000) 를 이용하는 플레이트 #1 에 대해 듀얼 면역형광 염색을 수행하고, 플레이트를 1 시간 동안 37℃ 에서 인큐베이션하였다. 감염성 점액낭병 바이러스에 대항하는 닭 항혈청 (IBDV Pab) (lot# G0117, Charles Rivers Laboratories) (1:500) 및 HVT L78 모노클로날 항체 (HVT Mab) (Merial) (1:3000) 을 이용하는 플레이트 #2 에 대해 듀얼 면역형광을 수행하고, 플레이트를 37℃ 에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 1 시간 인큐베이션 후, 플레이트들을 3 회 PBS 로 세정했다. 두 플레이트 #1 및 #2 모두에, FITC 라벨링된 항-닭 IgG (cat# F8888, Sigma) (1:500) 및 TRITC 라벨링된 Alex Fluor 당나귀 항-마우스 (cat# A10037, Invitrogen) (1:300) 을 첨가했다. 다시, 플레이트들을 37℃ 에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 1 시간 인큐베이션 후, 세포를 3 회 PBS 로 린스하고, 플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC) 필터 및 테트라메틸 로다민 이소-티오시아네이트 (TRITC) 필터를 이용하는 형광 현미경으로 가시화하였다.
결과
공여체 플라스미드 pFSV40VP2 의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 도 1 에 나타낸 바와 같이 SEQ ID NO 로 부여한다.
재조합체 제조 및 발현 분석
상동 재조합 기술을 이용하여 재조합체를 제조하기 위해 vHVT13 바이러스의 게놈 DNA 를 pFSV40VP2 공여체 플라스미드와 공동-전기천공하였다. 재조합 바이러스를, 다수 라운드의 플라크 정제에서 PCR 스크리닝 및 면역형광 양성 웰 선택으로써 부모 Vaxxitek 바이러스로부터 분리시켰다. NDV-F 단백질을 발현하는 플라크 정제된 재조합 바이러스 (vHVT309 로 지명) 를, 조직 배양 플라스크로부터 5 x 850 ㎠ 롤러 보틀로 스케일 업했다. 약 72 시간 감염 후, 감염된 CEF 를 수확했다. 분취물을 액체 질소에서 동결하였는데, 각각의 분취물은 10% FBS 및 10% DMSO 를 함유했다. 3세트로 CEF 상에서 적정을 수행하고, 1.5x105 pfu/ml 의 역가를 vHVT309 에 대해서 수득했다.
듀얼 면역형광 염색을 닭 항혈청 (Pab) (1:500) 및 HVT L78 모노클로날 항체 (Mab) (1:3000) 이후 FITC 라벨링된 항-닭 IgG (1:500) 및 TRITC 라벨링된 Alex Fluor 당나귀 항-마우스 (1:300) 을 이용하여 수행했다. 플레이트 #1 은 HVT 와 뉴캐슬병 바이러스의 발현을 비교하고, 플레이트 #2 는 HVT 와 감염성 점액낭병 바이러스의 발현을 비교한다. vHVT309 의 검사된 모든 HVT TRITC 양성 플라크는 NDV-F 및 IBDV-VP2 단백질을 발현하는 것으로 밝혀졌다.
vHVT309 의 PCR 분석
재조합 바이러스의 순도를 하기에 특이적인 프라이머 쌍: HVT 측면화 팔, 프로모터, NDV-F 및 IBDV-VP2 유전자, 및 Poly A 꼬리를 이용해 PCR 로써 확인했다. PCR 결과, 재조합 바이러스 vHVT309 는 의도된 발현 카세트를 보유하고, 바이러스 스톡에는 검출가능한 양의 부모 Vaxxitek 바이러스가 없었음이 증명되었다 (표 1 및 도 5).
결론
PCR 시험 및 면역형광 분석을 기준으로 하면, vHVT309 는 mCMV 프로모터의 제어 하에 IBDV-VP2 유전자 및 SV40 프로모터의 제어 하에 NDV-F 유전자를 함유하는 재조합 바이러스이다. 새롭게 제조된 vHVT309 는 어떠한 검출가능한 부모 vHVT13 바이러스도 없다.
실시예 1.2 IBDV-VP2 및 NDV-F 를 발현하는 재조합 vHVT310 의 구축
본 연구의 목적은 마우스 거대세포바이러스 프로모터 (mCMV), 감염성 점액낭병 바이러스 바이러스 단백질 2 (VP2) 를 인코딩하는 유전자, 내부 리보솜 결합 부위 (IRES), 뉴캐슬병 바이러스 융합 단백질 (NDV-F) 을 인코딩하는 유전자, 및 원숭이 바이러스 40 Poly A 꼬리 (SV40 Poly A) 를 함유하는 발현 카세트가 유전자간 부위 1 (IG1) 에 혼입되어 있는 재조합 HVT 를 구축하는 것이다 (도 2).
구축물에 사용된 부모 바이러스는 vHVT13 이다. 유전형 VIId 서열에 상응하는 뉴캐슬병 바이러스 융합 단백질 (NDV-F) 을 화학적으로 합성하고 코돈 최적화하였다 (GenScript). 이 합성 유전자의 F 단백질 절단 부위를 변경시켜 약독형 F 절단 부위 서열과 매칭시키고, 생성 NDV-F 유전자 서열은 GenBank 에 기탁된 NDV-F 서열 (AY337464) 과 99% 아미노산 서열 동일성을 지닌다. IBD-VP2 (부모 Vaxxitek 바이러스에서) 에 대해서는 마우스 CMV IE 프로모터를 이용했다. 뇌심근염 바이러스 (EMCV) 으로부터 유래된 RNA 서열인 IRES 는 IRES 가 위치된 바로 하류인 mRNA 내의 번역 개시를 허용하는데, 이를 VP2 유전자의 말단에 삽입하여 하류 NDV-F 유전자의 번역을 개시하였다. IRES 가 HVT 벡터에 사용된 것은 이번이 처음이었다.
삽입 유전자좌는 HVT 에서 유전자간 부위 1 (IG1) 이다 (도 2). 공여체 플라스미드 pFIRESVP2 (VP2 유전자 + IRES+NDV-F 및 SV40 Poly A/IG1 의 측면화 팔을 함유하는 삽입 플라스미드) 를 하기와 같이 기술한 대로 구축하였다. 닭 배아 섬유모세포 세포 (CEF) 를 시험관 내 재조합에 사용했다.
공여체 플라스미드 구축:
IBDV VP2 유전자 (SEQ ID NO:2 를 인코딩하는 SEQ ID NO:1), IRES (SEQ ID NO:10), NDV-F 유전자 (SEQ ID NO:5 를 인코딩하는 SEQ ID NO:3), SV40 Poly A 꼬리 (SEQ ID NO:8) 를 함유하는 pUC57 에서 합성 DNA 를 GeneScript 에 의해 합성했다 (도 6). 플라스미드, pFIRESVP2 를 Top10 Oneshot 키트 (cat#C404002, Invitrogen) 를 이용하여 형질전환하고, 대규모 배양물을 성장시키고, 플라스미드 추출을 Qiagens Maxi Prep 키트를 이용하여 수행했다.
재조합체 제조
실시예 1.1 에 기술된 바와 같은 상동 재조합 절차를 행한 후 재조합 vHVT310 를 제조하였다.
PCR 에 의한 재조합체의 분석
실시예 1.1 에 기술된 바와 같은 PCR 분석 절차를 행하여 vHVT310 를 확인했다.
발현 분석
실시예 1.1 에 기술된 발현 분석을 행하여 vHVT310 의 발현을 분석했다.
결과
공여체 플라스미드 pFIRESVP2 의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 도 1 에 나타낸 바와 같이 SEQ ID NO 로 부여한다.
재조합체 제조 및 발현 분석
상동 재조합 기술을 이용하여 재조합 바이러스를 제조하기 위해 pFIRESVP2 공여체 플라스미드와 Vaxxitek 바이러스의 게놈 DNA 를 공동-전기천공하였다. 재조합 바이러스를, 다수 라운드의 플라크 정제에서 PCR 스크리닝 및 면역형광 양성 웰 선택에 의해 부모 vHVT13 바이러스로부터 분리시켰다. NDV-F 단백질을 발현하는 플라크 정제된 재조합 바이러스 (vHVT310 로 지명) 를, 조직 배양 플라스크로부터 5 x 850㎠ 롤러 보틀로 스케일 업했다. 약 72 시간 감염 후, 감염된 CEF 를 수확했다. 분취물을 액체 질소에서 동결하였는데, 각각의 분취물은 10% FBS 및 10% DMSO 을 함유했다. 3세트로 CEF 상에서 적정을 수행하고, 2.0x106 pfu/ml 의 역가를 vHVT310 에 대해서 수득했다.
듀얼 면역형광 염색을 닭 항혈청 (Pab) (1:500) 및 HVT L78 모노클로날 항체 (Mab) (1:3000) 이후 FITC 라벨링된 항-닭 IgG (1:500) 및 TRITC 라벨링된 Alex Fluor 당나귀 항-마우스 (1:300) 을 이용하여 수행했다. 플레이트 #1 은 HVT 와 뉴캐슬병 바이러스의 발현을 비교하고, 플레이트 #2 는 HVT 와 감염성 점액낭병 바이러스의 발현을 비교한다. vHVT310 의 검사된 모든 HVT TRITC 양성 플라크는 NDV-F 및 IBDV-VP2 단백질을 발현하는 것으로 밝혀졌다.
vHVT310 의 PCR 분석
재조합 바이러스의 순도를 하기에 특이적인 프라이머 쌍: HVT 측면화 팔, 프로모터, NDV-F 및 IBDV-VP2 유전자, 및 polyA 꼬리를 이용해 PCR 로써 확인했다. PCR 결과, 재조합 바이러스 vHVT310 는 의도된 발현 카세트를 보유하고, 바이러스 스톡에는 검출가능한 양의 부모 Vaxxitek 바이러스가 없었음이 증명되었다 (표 2 및 도 7-8).
표 2 특이적 프라이머 세트를 이용한 예상되는 PCR 밴드
Figure pct00002
결론
PCR 시험 및 면역형광 분석을 기준으로 하면, vHVT310 는 mCMV 프로모터의 제어 하에 IBDV-VP2 및 NDV-F 유전자를 함유하는 재조합 바이러스로서, 여기서 NDV-F 유전자의 번역은 EMCV 로부터의 IRES 에 의해 개시된다. 새롭게 제조된 재조합 vHVT310 는 어떠한 검출가능한 부모 vHVT13 바이러스도 없다.
실시예 1.3 IBDV-VP2 및 NDV-F 를 발현하는 재조합 vHVT311 의 구축
본 연구의 목적은 마우스 거대세포바이러스 프로모터 (mCMV), 감염성 점액낭병 바이러스 바이러스 단백질 2 (VP2) 를 인코딩하는 유전자, 자가-절단 돼지 테스코바이러스-1 2A 펩티드 (P2A), 뉴캐슬병 바이러스 융합 단백질 (NDV-F) 를 인코딩하는 유전자, 및 원숭이 바이러스 40 Poly A 꼬리 (SV40 Poly A) 를 함유하는 발현 카세트가 유전자간 부위 1 (IG1) 에 혼입되어 있는 재조합 HVT 를 구축하는 것이다 (도 2).
구축물에 사용된 부모 바이러스는 vHVT13 (IBDV VP2 유전자를 발현하는 HVT 벡터로서, Merial 의 VAXXITEK® (HVT+IBD) 백신) 이다. 야생형 유전형 VIId 뉴캐슬병 바이러스 융합 단백질 (NDV-F) 서열에 상응하는 폴리뉴클레오티드를 화학적으로 합성했다 (GenScript). 이 합성 유전자의 F 단백질 절단 부위를 변경시켜 약독형 F 절단 부위 서열과 매칭시키고, 생성 NDV-F 유전자 서열은 GenBank 에 기탁된 NDV-F 서열 (AY337464) 과 99% 아미노산 서열 동일성을 지닌다. (부모 Vaxxitek 바이러스에서) IBD-VP2 에 있어서는 마우스 CMV IE 프로모터를 이용하였다. 상류 및 하류 유전자, VP2 및 F 각각의 단일 프로모터 mCMV 로부터의 공동-번역 '절단'을 허용하는 자가-절단 돼지 테스코바이러스-1 2A 펩티드 (P2A) 를 VP2 유전자의 말단에 삽입했다. 이것은 P2A 를 HVT 벡터에서 사용한 첫번째였다.
삽입 유전자좌는 HVT 에서 유전자간 부위 1 (IG1) 이다 (도 2). 공여체 플라스미드 pFP2AVP2 (VP2+P2A+NDV-F 및 SV40 polyA/IG1 의 측면화 팔을 함유하는 삽입 플라스미드) 를 하기와 같이 기술한 대로 구축하였다. 닭 배아 섬유모세포 세포 (CEF) 를 시험관 내 재조합에 사용했다.
공여체 플라스미드 구축
IBDV VP2 유전자 (SEQ ID NO:2 를 인코딩하는 SEQ ID NO:1), P2A 인코딩 DNA (SEQ ID NO:11), NDV-F 유전자 (SEQ ID NO:5 를 인코딩하는 SEQ ID NO:4) 및 SV40 Poly A 꼬리 (SEQ ID NO:8) 를 함유하는 pUC57 에서 합성 DNA 를 GeneScript 에 의해 합성했다 (도 9). 플라스미드, pFP2AVP2 를 Top10 Oneshot 키트 (cat#C404002, Invitrogen) 를 이용하여 형질전환하고, 대규모 배양물을 성장시키고, 플라스미드 추출을 Qiagens Maxi Prep 키트를 이용하여 수행했다.
재조합체 제조
실시예 1.1 에 기술된 바와 같은 상동 재조합 절차를 행한 후 재조합 vHVT311 를 제조하였다.
PCR 에 의한 재조합체의 분석
실시예 1.1 에 기술된 바와 같은 PCR 분석 절차를 행하여 vHVT311 를 확인했다.
발현 분석
실시예 1.1 에 기술된 발현 분석을 행하여 vHVT311 의 발현을 분석했다.
결과
공여체 플라스미드 pFP2AVP2 의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 도 1 에 나타낸 바와 같이 SEQ ID NO 로 부여한다.
재조합체 제조 및 발현 분석
상동 재조합 기술을 이용하여 재조합 바이러스를 제조하기 위해 Vaxxitek 바이러스의 게놈 DNA 를 pFP2AVP2 공여체 플라스미드와 공동-전기천공하였다. 재조합 바이러스를, 다수 라운드의 플라크 정제에서 PCR 스크리닝 및 면역형광 양성 웰 선택으로써 부모 Vaxxitek 바이러스로부터 분리시켰다. NDV-F 단백질을 발현하는 플라크 정제된 재조합 바이러스 (vHVT311 로 지명) 를, 조직 배양 플라스크로부터 5 x 850 ㎠ 롤러 보틀로 스케일 업했다. 약 72 시간 감염 후, 감염된 CEF 를 수확했다. 분취물을 액체 질소에서 동결하였는데, 각각의 분취물은 10% FBS 및 10% DMSO 를 함유했다. 3세트로 CEF 상에서 적정을 수행하고, 2.5x106 pfu/ml 의 역가를 vHVT311 에 대해서 수득했다.
듀얼 면역형광 염색을 닭 항혈청 (Pab) (1:500) 및 모노클로날 항체 (Mab) (1:3000) 이후 FITC 라벨링된 항-닭 IgG (1:500) 및 TRITC 라벨링된 Alex Fluor 당나귀 항-마우스 (1:300) 을 이용하여 수행했다. 플레이트 #1 은 HVT 와 뉴캐슬병 바이러스의 발현을 비교하고, 플레이트 #2 는 뉴캐슬병 바이러스와 감염성 점액낭병 바이러스의 발현을 비교한다. vHVT311 의 검사된 모든 HVT TRITC 양성 플라크는 NDV-F 를 발현하고, 모든 NDV TRITC 양성 플라크는 IBDV-VP2 단백질을 발현하는 것으로 밝혀졌다.
vHVT311 의 PCR 분석
재조합 바이러스의 순도를 하기에 특이적인 프라이머 쌍: HVT 측면화 팔, 프로모터, NDV-F 및 IBDV-VP2 유전자, 및 Poly A 꼬리를 이용해 PCR 로써 확인했다. PCR 결과, 재조합 바이러스 vHVT311 는 의도된 발현 카세트를 보유하고, 바이러스 스톡에는 검출가능한 양의 부모 Vaxxitek 바이러스가 없었음이 증명되었다 (표 3 및 도 10-11).
표 3 특이적 프라이머 세트를 이용한 예상되는 PCR 밴드
Figure pct00003
결론
PCR 시험 및 면역형광 분석을 기준으로 하면, vHVT311 는 2A 펩티드-매개 절단으로 VP2 및 F 단백질이 공동-발현되는 mCMV 프로모터의 제어 하 IBDV-VP2 및 NDV-F 유전자를 함유하는 재조합 바이러스이다. 새롭게 제조된 재조합 vHVT311 는 어떠한 검출가능한 부모 vHVT13 바이러스도 없다.
실시예 1.4 IBDV-VP2 및 ILTV-gD 를 발현하는 재조합 vHVT317 의 구축
본 연구의 목적은 마우스 거대세포바이러스 프로모터 (mCMV), 감염성 점액낭병 바이러스 바이러스 단백질 2 (VP2) 를 인코딩하는 유전자, 내부 리보솜 결합 부위 (IRES), 감염성 후두기관염 당단백질 D 단백질 (ILTV-gD) 을 인코딩하는 유전자, 및 원숭이 바이러스 40 Poly A 꼬리 (SV40 Poly A) 를 함유하는 발현 카세트가 유전자간 부위 1 (IG1) 에 혼입되어 있는 재조합 HVT 를 구축하는 것이다 (도 2).
구축물에 사용된 부모 바이러스는 vHVT13 이다. 화학적으로 합성된 (GenScript) 감염성 후두기관염 바이러스 당단백질 D (ILTV gD) 서열을 구축물에 이용했다. 마우스 CMV IE 프로모터를 (부모 vHVT13 바이러스에서) IBD-VP2 에 대해서 이용했다. 뇌심근염 바이러스 (EMCV) 으로부터 유래된 RNA 서열 (IRES) 는 IRES 가 위치된 바로 하류인 mRNA 내의 번역 개시를 허용하는데, 이를 VP2 유전자의 말단에 삽입하여 하류 ILTV-gD 유전자의 번역을 개시한다.
삽입 유전자좌는 HVT 에서 유전자간 부위 1 (IG1) 이다 (도 2). 공여체 플라스미드 pVP2IRESgD (VP2 유전자 + IRES+ILTV-gD 및 SV40 Poly A/IG1 의 측면화 팔을 함유하는 삽입 플라스미드) 를 하기와 같이 기술한 대로 구축하였다. 닭 배아 섬유모세포 세포 (CEF) 를 시험관 내 재조합에 사용했다.
공여체 플라스미드 구축
IBDV VP2 유전자 (SEQ ID NO:2 를 인코딩하는 SEQ ID NO:1), IRES (SEQ ID NO:10), ILTV-gD 유전자 (SEQ ID NO:17 을 인코딩하는 SEQ ID NO:16), 및 SV40 Poly A 꼬리 (SEQ ID NO:8) 를 함유하는 pUC57 에서 합성 DNA 를 GenScript 에 의해 합성했다. 플라스미드, pFIRESVP2 를 dcm-/dam- 적격 세포 (New England Biolabs, cat# C2925I) 에 형질전환한 다음 HindIII/SalI 로 소화 (digest) 시켰다. 5kb 단편을 겔 추출했다. 부분 IRES, ILTV-gD 야생형, 및 SV40 Poly A 꼬리를 함유하는 pUC57 에서 합성 DNA 를 GenScript 로써 합성했다. 플라스미드, Sal-Fse gD-IRES 를 HindIII/SalI 로 소화시켰다. 1.9kb 단편을 겔 추출하였다. 2 개의 단편들을 리게이션하고 Top10 Oneshot 키트 (cat#C404002, Invitrogen) 을 이용해 형질전환하였다. 콜로니를 정확한 패턴을 찾기 위해 HindIII/SbfI 에 의해 스크린했다. 최종 공여체 플라스미드를 서열 검증해, pVP2IRESgD 로 지정했다 (도 12 참조).
재조합체 제조
실시예 1.1 에 기술된 바와 같은 상동 재조합 절차를 행한 후 재조합 vHVT317 를 제조하였다.
PCR 에 의한 재조합체의 분석
실시예 1.1 에 기술된 바와 같은 PCR 분석 절차를 행하여 vHVT317 를 확인했다.
발현 분석
실시예 1.1 에 기술된 발현 분석을 행하여 vHVT317 의 발현을 분석했다.
결과
공여체 플라스미드 pVP2IRESgD 의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 도 1 에 나타낸 바와 같이 SEQ ID NO 로 부여한다.
재조합체 제조 및 발현 분석
듀얼 면역형광을 닭 항혈청 (폴리클로날 항체) (1:500) 및 모노클로날 항체 (Mab) (1:3000) 이후 FITC 라벨링된 항-닭 IgG (1:500) 및 TRITC 라벨링된 Alex Fluor 당나귀 항-마우스 (1:300) 을 이용하여 수행했다. vHVT317 의 검사된 모든 플라크는 HVT 양성 플라크에 비해 IBDV-VP2 단백질을 발현하고, 모두 및 플라크는 IBDV 양성 플라크와 비교했을 때 ILTV-gD 단백질을 발현하는 것으로 밝혀졌다.
vHVT317 의 PCR 분석
재조합 바이러스의 순도를 하기에 특이적인 프라이머 쌍: HVT 측면화 팔, 프로모터, ILTV-gD 및 IBDV-VP2 유전자, 및 Poly A 꼬리를 이용해 PCR 로써 확인했다. PCR 결과, 재조합 바이러스 vHVT317 는 의도된 발현 카세트를 보유하고, 바이러스 스톡에는 검출가능한 양의 부모 Vaxxitek 바이러스가 없었음이 증명되었다 (표 4 및 도 13-14).
표 4 특이적 프라이머 세트를 이용한 예상되는 PCR 밴드
Figure pct00004
결론
PCR 시험 및 면역형광 분석을 기준으로 하면, vHVT317 는 mCMV 프로모터의 제어 하에 IBDV-VP2 및 ILTV-gD 유전자를 함유하는 재조합 바이러스로서, 여기서 ILTV-gD 유전자의 번역은 EMCV 로부터의 IRES 에 의해 개시된다. 새롭게 제조된 재조합 vHVT317 는 임의 검출가능한 부모 vHVT13 바이러스는 없다.
실시예 1.5 IBDV-VP2 및 NDV-F 를 발현하는 재조합 vHVT313 의 구축
본 연구의 목적은 마우스 거대세포바이러스 프로모터 (mCMV), 감염성 점액낭병 바이러스 바이러스 단백질 2 (VP2) 를 인코딩하는 유전자, 원숭이 바이러스 40 Poly A 꼬리 (SV40 Poly A), 원숭이 바이러스 40 프로모터 (SV40 프로모터), 야생형 뉴캐슬병 바이러스 융합 단백질 (NDV-F) 를 인코딩하는 유전자, 및 합성 Poly A 꼬리 (syn Poly A tail) 를 함유하는 발현 카세트가 유전자간 부위 1 (IG1) 에 혼입되어 있는 재조합 HVT 를 구축하는 것이다 (도 2).
구축물에 사용된 부모 바이러스 vHVT13 이다. 유전형 VIId 야생형 서열에 상응하는 뉴캐슬병 바이러스 융합 단백질 (NDV-F) 을 화학적으로 합성하였다 (GenScript). 이 합성 유전자의 F 단백질 절단 부위를 변경시켜 약독형 F 절단 부위 서열과 매칭시키고, 생성 NDV-F 유전자 서열은 GenBank 에 기탁된 NDV-F 서열 (AY337464) 과 99% 아미노산 서열 동일성을 지닌다. (부모 Vaxxitek 바이러스에서) IBD-VP2 에 있어서는 마우스 CMV IE 프로모터를 이용하였고, NDV-F 에 대해서 SV40 프로모터를 이용했다.
삽입 유전자좌는 유전자간 부위 1 (IG1) 이다 (도 2). 공여체 플라스미드 pFwtSV40VP2 (VP2/SV40 Poly A 및 IG1의 측면화 팔+SV40 프로모터+NDV-F+ 합성 Poly A 을 포함하는 삽입 플라스미드) 를 하기와 같이 기술한 대로 구축하였다. 닭 배아 섬유모세포 세포 (CEF) 를 시험관 내 재조합에 사용했다.
공여체 플라스미드 구축
IBDV VP2 유전자 (SEQ ID NO:2 를 인코딩하는 SEQ ID NO:1), SV40 Poly A 꼬리 (SEQ ID NO:8), SV40 프로모터 (SEQ ID NO:7), NDV-F 유전자 (SEQ ID NO:5 를 인코딩하는 SEQ ID NO:4), 및 합성 Poly A 꼬리 (SEQ ID NO:9) 를 함유하는 pUC57 에서 합성 DNA 를 GeneScript 로써 합성했다.
플라스미드, pFSV40VP2 를 이어서 SbfI/AvrII 로 소화시키고, 5.6kb 단편을 겔 추출하였다. 플라스미드, pHM103NDVFwtsyn 를 또한 SbfI/AvrII 로 소화시키고, 1.9 kb 단편을 겔 추출하였다. 이어서, 단편을 함께 리게이션하고, Top10 Oneshot 키트 (cat#C404002, Invitrogen) 를 이용하여 형질전환하였다. 콜로니를 정확한 패턴을 위해 PstI 로 스크리닝했다. 맥시 프렙의 일시적 발현은 NDV 에 대응하는 닭 폴리클로날 혈청 및 닭 배아 섬유모세포 세포 (CEF) 에서 Fugene 트랜스펙션 시약을 이용해 확인했다. 마지막 공여체 플라스미드를 서열 확인하고 pFwtSV40VP2 로 지정했다 (도 15 참조).
재조합체 제조
실시예 1.1 에 기술된 바와 같은 상동 재조합 절차를 행한 후 재조합 vHVT313 를 제조하였다.
PCR 에 의한 재조합체의 분석
실시예 1.1 에 기술된 바와 같은 PCR 분석 절차를 행하여 vHVT313 를 확인했다.
발현 분석
실시예 1.1 에 기술된 발현 분석을 행하여 vHVT313 의 발현을 분석했다.
결과
공여체 플라스미드 pFwtSV40VP2 의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 도 1 에 나타낸 바와 같이 SEQ ID NO 로 부여한다
재조합체 제조 및 발현 분석
듀얼 면역형광을 닭 항혈청 (Pab) 및 항-HVT 모노클로날 항체 (Mab) 이후 FITC 라벨링된 항-닭 IgG 및 TRITC 라벨링된 Alex Fluor 당나귀 항-마우스를 이용하여 수행했다. vHVT313 의 검사된 모든 TRITC 양성 플라크는 NDV-F 및 IBDV-VP2 단백질을 발현하는 것으로 밝혀졌다.
vHVT313 의 PCR 분석
재조합 바이러스의 순도를 하기에 특이적인 프라이머 쌍: HVT 측면화 팔, 프로모터, NDV-F 및 IBDV-VP2 유전자, 및 Poly A 꼬리를 이용해 PCR 로써 확인했다. PCR 결과, 재조합 바이러스 vHVT313 는 의도된 발현 카세트를 보유하고, 바이러스 스톡에는 검출가능한 양의 부모 Vaxxitek 바이러스가 없었음이 증명되었다 (표 5 및 도 16-17).
표 5 특이적 프라이머 세트를 이용한 예상되는 PCR 밴드
Figure pct00005
결론
PCR 시험 및 면역형광 분석을 기준으로 하면, vHVT313 는 mCMV 프로모터의 제어 하에 IBDV-VP2 유전자 및 SV40 프로모터의 제어 하에 NDV-F 야생형 유전자를 함유하는 재조합 바이러스이다. 새롭게 제조된 vHVT313 는 어떠한 검출가능한 부모 Vaxxitek 바이러스도 없다.
실시예 1.6 IBDV-VP2 및 NDV-F 을 발현하는 재조합 vHVT316 의 구축
본 연구의 목적은 마우스 거대세포바이러스 프로모터 (mCMV), 감염성 점액낭병 바이러스 바이러스 단백질 2 (VP2) 를 인코딩하는 유전자, 내부 리보솜 결합 부위 (IRES), 야생형 뉴캐슬병 바이러스 융합 단백질 (NDV-F) 를 인코딩하는 유전자, 및 원숭이 바이러스 40 Poly A 꼬리 (SV40 Poly A) 를 함유하는 발현 카세트가 IG1 유전자좌에 혼입되어 있는 재조합 HVT 를 구축하는 것이다 (도 2).
구축물에 사용된 부모 바이러스는 vHVT13 이다. 유전형 VIId 야생형 서열에 상응하는 뉴캐슬병 바이러스 융합 단백질 (NDV-F) 을 화학적으로 합성했다 (GenScript). 이 합성 유전자의 F 단백질 절단 부위를 변경시켜 약독형 F 절단 부위 서열과 매칭시키고, 생성 NDV-F 유전자 서열은 GenBank 에 기탁된 NDV-F 서열 (AY337464) 과 99% 아미노산 서열 동일성을 지닌다. (부모 Vaxxitek 바이러스에서) IBD-VP2 에 있어서는 마우스 CMV IE 프로모터를 이용하였다. IRES 를 VP2 유전자의 말단에 삽입하여 하류 NDV-F 유전자의 번역을 개시하였다.
삽입 유전자좌는 IG1 이다 (도 2). 공여체 플라스미드 pVP2IRESFwt (VP2 유전자 + IRES+NDV-F 및 SV40 Poly A/IG1 의 측면화 팔을 함유하는 삽입 플라스미드) 를 하기와 같이 기술한 대로 구축하였다. 닭 배아 섬유모세포 세포 (CEF) 를 시험관 내 재조합에 사용했다.
공여체 플라스미드 구축
IBDV VP2 유전자 (SEQ ID NO:2 를 인코딩하는 SEQ ID NO:1), IRES (SEQ ID NO:10), NDV-F 유전자 (SEQ ID NO:5 를 인코딩하는 SEQ ID NO:4), 및 SV40 Poly A 꼬리 (SEQ ID NO:8) 를 함유하는 pUC57 에서 합성 DNA 를 GeneScript 에 의해 합성했다. 플라스미드, pFIRESVP2 를 dcm-/dam- 적격 세포 (New England Biolabs, cat# C2925I) 로 형질전환한 다음 HindIII/SalI 로 소화시켰다. 5kb 단편을 겔 추출했다. 부분 IRES, NDV-F 야생형, 및 SV40 Poly A 꼬리를 함유하는 pUC57 에서 합성 DNA 를 GenScript 에 의해 합성했다. 플라스미드, Sal-Hind-Fwt+ 를 HindIII/SalI 로 소화시켰다. 2.2kb 단편을 겔 추출했다. 2 개의 단편을 리게이션하고, Top10 Oneshot 키트 (cat#C404002, Invitrogen) 을 이용해 형질전환하였다. 최종 공여체 플라스미드를 서열 검증하고, pVP2IRESFwt 로 지정했다 (도 18 참조).
재조합체 제조
실시예 1.1 에 기술된 바와 같은 상동 재조합 절차를 행한 후 재조합 vHVT316 를 제조하였다.
PCR 에 의한 재조합체의 분석
실시예 1.1 에 기술된 바와 같은 PCR 분석 절차를 행하여 vHVT316 를 확인했다.
발현 분석
실시예 1.1 에 기술된 발현 분석을 행하여 vHVT316 의 발현을 분석했다.
결과
공여체 플라스미드 pVP2IRESFwt 의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 도 1 에 나타낸 바와 같이 SEQ ID NO 로 부여한다.
재조합체 제조 및 발현 분석
듀얼 면역형광 염색을 닭 항혈청 (Pab) 및 모노클로날 항체 (Mab) 이후 FITC 라벨링된 항-닭 IgG 및 TRITC 라벨링된 Alex Fluor 당나귀 항-마우스를 이용하여 수행했다. vHVT316 의 검사된 모든 플라크는 HVT 양성 플라크에 비해 IBDV-VP2 단백질을 발현하고, 모든 및 플라크는 NDV 양성 플라크와 비교했을 때 IBDV-VP2 단백질을 발현하는 것으로 밝혀졌다.
vHVT316 의 PCR 분석
재조합 바이러스의 순도를 하기에 특이적인 프라이머 쌍: HVT 측면화 팔, 프로모터, NDV-F 및 IBDV-VP2 유전자, 및 Poly A 꼬리를 이용해 PCR 로써 확인했다. PCR 결과, 재조합 바이러스 vHVT316 는 의도된 발현 카세트를 보유하고, 바이러스 스톡에는 검출가능한 양의 부모 Vaxxitek 바이러스가 없었음이 증명되었다 (표 6 및 도 19-20).
표 6 특이적 프라이머 세트를 이용한 예상되는 PCR 밴드
Figure pct00006
결론
PCR 시험 및 면역형광 분석을 기준으로 하면, vHVT316 는 mCMV 프로모터의 제어 하에 IBDV-VP2 및 NDV-F 유전자를 함유하는 재조합 바이러스로서, 여기서 NDV-F 유전자의 번역은 EMCV 로부터의 IRES 에 의해 개시된다. 새롭게 제조된 재조합 vHVT316 는 어떠한 검출가능한 부모 Vaxxitek 바이러스도 없다.
실시예 1.7 IBDV-VP2 및 ILTV-gD 를 발현하는 재조합 vHVT407 의 구축
본 연구의 목적은 SV40 프로모터, ILTV 당단백질 D, 및 합성 Poly A 를 함유하는 발현 카세트가 vHVT13 의 SORF3-US2 부위 내에 있는 재조합 HVT 를 구축하는 것이다.
구축물에 사용된 부모 바이러스는 vHVT13 이다. 화학적으로 합성된 (GenScript) 감염성 후두기관염 바이러스 당단백질 D (ILTV gD) 서열을 구축물에서 사용했다. SV40 프로모터를 ILTV gD 에 대해서 이용했다. 삽입 유전자좌는 vVHT13 로부터 IBDV VP2 에 대해서는 IG1 및 ILTV gD 에 대해서는 SORF3-US2 이다 (도 2). SORF3-US2 팔, SV40 프로모터 (SEQ ID NO:7), ILTV 야생형 gD 를 인코딩하는 유전자 (SEQ ID NO:17 를 인코딩하는 SEQ ID NO:16), 및 합성 polyA (SEQ ID NO:9) 를 함유하는 공여체 플라스미드 HVT US2SVgDwtsyn 를 구축했다 (도 22 참조). 닭 배아 섬유모세포 세포 (CEF) 를 시험관 내 재조합에 사용했다.
재조합체 제조
실시예 1.1 에 기술된 바와 같은 상동 재조합 절차를 행한 후 재조합체 vHVT407 를 제조하였다.
PCR 에 의한 재조합체의 분석
실시예 1.1 에 기술된 바와 같은 PCR 분석 절차를 행하여 vHVT407 를 확인했다.
발현 분석
실시예 1.1 에 기술된 발현 분석을 행하여 vHVT407 의 발현을 분석했다.
결과
공여체 플라스미드 HVT US2SVgDwtsyn 의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 도 1 에 나타낸 바와 같이 SEQ ID NO 로 부여한다.
재조합체 제조 및 발현 분석
듀얼 면역형광 염색을 닭 항혈청 (Pab) 및 모노클로날 항체 (Mab) 이후 FITC 라벨링된 항-닭 IgG 및 TRITC 라벨링된 Alex Fluor 당나귀 항-마우스를 이용하여 수행했다. vHVT407 의 검사된 모든 플라크는 IBDV-VP2 및 ILTV gD 단백질을 발현하는 것으로 밝혀졌다.
vHVT407 의 PCR 분석
재조합 바이러스의 순도를 하기에 특이적인 프라이머 쌍: HVT 측면화 팔, 프로모터, ILTV gD 및 IBDV-VP2 유전자, 및 Poly A 꼬리를 이용해 PCR 로써 확인했다. PCR 결과, 재조합 바이러스 vHVT407 는 의도된 발현 카세트를 보유하고, 바이러스 스톡에는 검출가능한 양의 부모 vHVT13 바이러스가 없었음이 증명되었다.
결론
PCR 시험 및 면역형광 분석을 기준으로 하면, vHVT407 는 IBDV-VP2 및 ILTV gD 유전자를 함유하는 재조합 바이러스이다. 새롭게 제조된 재조합 vHVT407 는 어떠한 검출가능한 부모 vHVT13 바이러스도 없다.
실시예 1.8 NDV-F 및 ILTV-gD 을 반대 방향으로 발현하는 재조합 vHVT308 의 구축
본 연구의 목적은 HVT FC126 내로 상동 재조합을 위해 합성 Poly A 꼬리, NDV F, SV40 프로모터, HHV3gB 프로모터, ILTV gD, 및 SV40 Poly A 꼬리를 함유할 유전자간 영역 I 부위에 대한 삽입 플라스미드를 구축하는 것이다.
구축물에 사용된 부모 바이러스는 HVT FC126 이다. 유전형 V 서열에 상응하는 합성 뉴캐슬병 바이러스 융합 단백질 (NDV-F) (SEQ ID NO:22 를 인코딩하는 SEQ ID NO:21) 를 화학적으로 합성하고 코돈 최적화하였다 (GenScript). 이 합성 유전자의 F 단백질 절단 부위를 변경시켜 약독형 F 절단 부위 서열과 매칭시켰다. 합성 야생형 ILTV 당단백질 D (SEQ ID NO:17 을 인코딩하는 SEQ ID NO:16) 을 화학적으로 합성하였다. 역향적 방향으로 ILTV-gD + SV40 Poly A 꼬리를 구동하는 HHV3gB 프로모터 (인간 헤르페스바이러스 유형 3 당단백질 B 프로모터) 및 뉴캐슬 융합 단백질 + 합성 Poly A 꼬리를 구동하는 SV40 프로모터를 함유하는 공여체 플라스미드 pHVTIG1gDCaFopt 를 구축했다 (도 23 참조). 닭 배아 섬유모세포 세포 (CEF) 를 시험관 내 재조합에 사용했다.
재조합체 제조
실시예 1.1 에 기술된 바와 같은 상동 재조합 절차를 행한 후 재조합 vHVT308 를 제조하였다. 연속 계대를 pre-MSV+13 로 수행하였다.
PCR 에 의한 재조합체의 분석
실시예 1.1 에 기술된 바와 같은 PCR 분석 절차를 행하여 재조합 vHVT308 를 확인했다.
발현 분석
실시예 1.1 에 기술된 발현 분석을 행하여 재조합 vHVT308 의 발현을 분석했다.
결과
공여체 플라스미드 pHVTIG1gDCaFopt 의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 도 1 에 나타낸 바와 같이 SEQ ID NO 로 부여한다.
재조합체 제조 및 발현 분석
듀얼 면역형광 염색을 닭 항혈청 (Pab) 및 모노클로날 항체 (Mab) 이후 FITC 라벨링된 항-닭 IgG 및 TRITC 라벨링된 Alex Fluor 당나귀 항-마우스를 이용하여 수행했다. vHVT308 의 검사된 모든 플라크는 NDV-F 및 ILTV-gD 단백질을 발현하는 것으로 밝혀졌다
vHVT308 의 PCR 분석
재조합 바이러스의 순도를 하기에 특이적인 프라이머 쌍: HVT 측면화 팔, 프로모터, NDV-F 및 ILTV-gD 유전자, 및 Poly A 꼬리를 이용해 PCR 로써 확인했다. PCR 결과, 재조합 바이러스 vHVT308 는 의도된 발현 카세트를 보유하고, 바이러스 스톡에는 검출가능한 양의 부모 HVT 바이러스가 없었음이 증명되었다 (표 6.1 및 도 24 및 25).
표 6.1 특이적 프라이머 세트를 이용한 예상되는 PCR 밴드
Figure pct00007
모든 프라이머 쌍과의 PCR 반응은 예상되는 PCR 생성물 및 밴딩 패턴을 초래하였다. 상기에서 나타낸 바와 같이, vHVT308 에는 부모 HVT 바이러스의 흔적은 없었고, vHVT308 는 pre-MSV+13 계대에서 안정적이었다.
결론
PCR 시험 및 면역형광 분석을 기준으로 하면, vHVT308 는 SV40 프로모터의 제어 하에 NDV-F 유전자 및 HHV3gB 프로모터의 제어 하에 ILTV-gD 유전자를 함유하는 재조합 HVT 바이러스이다. vHVT308 는 어떠한 검출가능한 부모 HVT 바이러스도 없다.
실시예 1.9 NDV-F 및 ILTV-gD 를 발현하는 재조합 vHVT322 의 구축
본 연구의 목적은 mCMV 프로모터, 뉴캐슬병 바이러스 융합 단백질 (NDV-F), 내부 리보솜 결합 부위 (IRES), 감염성 후두기관염 당단백질 D (ILTV-gD), 및 원숭이 바이러스 40 Poly A 꼬리 (SV40 Poly A) 를 함유하는 발현 카세트가 vHVT13 (HVT+IBD) 의 유전자간 영역 1 (IG1) 에서 측면화 팔과 상동적으로 재조합되는 재조합 HVT 를 구축하는 것이다
구축물에 사용된 부모 바이러스는 vHVT13 이다. 야생형 유전형 VIId 서열에 상응하는 뉴캐슬병 바이러스 융합 단백질 (NDV-F) (SEQ ID NO:5 를 인코딩하는 SEQ ID NO:4) 를 화학적으로 합성하였다 (GenScript). 이 합성 유전자의 F 단백질 절단 부위를 변경시켜 약독형 F 절단 부위 서열과 매칭시키고, 생성 NDV-F 유전자 서열은 GenBank 에 기탁된 NDV-F 서열 (AY337464) 과 99% 아미노산 서열 동일성을 지닌다. 합성 야생형 ILTV 당단백질 D (SEQ ID NO:17 를 인코딩하는 SEQ ID NO:16) 를 화학적으로 합성하였다. 공여체 플라스미드 pFwtIRESgD 는 IG1 의 좌측 측면화 팔, mCMV (마우스 CMV IE) 프로모터, NDV-F, IRES, ILTV-gD, SV40 Poly A 및 IG1 의 우측 측면화 팔을 함유했다 (도 26 참조). 닭 배아 섬유모세포 세포 (CEF) 를 시험관 내 재조합에 사용했다.
재조합체 제조
실시예 1.1 에 기술된 바와 같은 상동 재조합 절차를 행한 후 재조합 vHVT322 를 제조하였다. 연속 계대를 pre-MSV+13 로 수행했다.
PCR 에 의한 재조합체의 분석
실시예 1.1 에 기술된 바와 같은 PCR 분석 절차를 행하여 재조합 vHVT322 를 확인했다.
발현 분석
실시예 1.1 에 기술된 발현 분석을 행하여 재조합 vHVT322 의 발현을 분석했다.
결과
공여체 플라스미드 pFwtIRESgD 의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 도 1 에 나타낸 바와 같이 SEQ ID NO 로 부여한다.
재조합체 제조 및 발현 분석
듀얼 면역형광 염색을 닭 항혈청 (Pab) 및 모노클로날 항체 (Mab) 이후 FITC 라벨링된 항-닭 IgG 및 TRITC 라벨링된 Alex Fluor 당나귀 항-마우스를 이용하여 수행했다. vHVT322 의 검사된 모든 TRITC 양성 플라크는 NDV-F 및 ILTV-gD 단백질을 발현하는 것으로 밝혀졌다.
vHVT322 의 PCR 분석
재조합 바이러스의 순도를 하기에 특이적인 프라이머 쌍: HVT 측면화 팔, 프로모터, NDV-F 및 ILTV-gD 유전자, 및 Poly A 꼬리를 이용해 PCR 로써 확인했다. PCR 결과, 재조합 바이러스 vHVT322 는 의도된 발현 카세트를 보유하고, 바이러스 스톡에는 검출가능한 양의 부모 vHVT13 가 없었음이 증명되었다 (표 6.2 및 도 27 및 28).
표 6.2 특이적 프라이머 세트를 이용한 예상되는 PCR 밴드
Figure pct00008
모든 프라이머 쌍과의 PCR 반응은 예상되는 PCR 생성물 및 밴딩 패턴을 초래하였다. 상기에서 나타낸 바와 같이, vHVT322 에는 부모 vHVT13 바이러스의 증거는 없다.
결론
PCR 시험 및 면역형광 분석을 기준으로 하면, vHVT322 는 mCMV 프로모터의 제어 하 NDV-F 및 ILTV-gD 유전자를 함유하는 재조합 HVT 바이러스이다. vHVT322 는 어떠한 검출가능한 부모 vHVT13 바이러스도 없다.
실시예 1.10 ILT-gDwt 를 발현하는 재조합 vHVT406 의 구축
본 연구의 목적은 재조합 HVT 를 구축하는 것으로서, 이의 SORF3-US2 부위는 HVT FC126 내로의 상동 재조합을 위해, SV40 프로모터, 감염성 후두기관염 gD, 및 합성 Poly A 꼬리를 함유한다.
구축물에 사용된 부모 바이러스는 HVT FC126 이다. 합성 감염성 후두기관염 바이러스 (ILTV) 야생형 당단백질 D (gDwt) 를 화학적으로 합성했다. 공여체 플라스미드 pHVTUS2SVgDwtsyn 는 HVT FC126 의 SORF3 및 US2 팔, SV40 프로모터, ILTV gDwt (SEQ ID NO:17 를 인코딩하는 SEQ ID NO:16) 및 합성 Poly A 를 함유했다 (도 29 참조). 닭 배아 섬유모세포 세포 (CEF) 를 시험관 내 재조합에 사용했다.
재조합체 제조
실시예 1.1 에 기술된 바와 같은 상동 재조합 절차를 행한 후 재조합 vHVT406 를 제조하였다. 연속 계대를 pre-MSV+13 (x+12) 에 수행했다.
PCR 에 의한 재조합체의 분석
실시예 1.1 에 기술된 바와 같은 PCR 분석 절차를 행하여 재조합 vHVT406 를 확인했다.
발현 분석
실시예 1.1 에 기술된 발현 분석을 행하여 재조합 vHVT406 의 발현을 분석했다.
결과
공여체 플라스미드 pHVTUS2SVgDwtsyn 의 뉴클레오티드 및 아미노산 서열을 도 1 에 나타낸 바와 같이 SEQ ID NO 로 부여한다.
재조합체 제조 및 발현 분석
상동 재조합 기술을 이용하여 재조합 HVT 를 제조하기 위해 HVT 바이러스의 게놈 DNA 를 pHVTUS2SVgDwtsyn 공여체 플라스미드와 공동-전기천공하였다. 재조합 바이러스를, 다수 라운드의 플라크 정제에서 PCR 스크리닝 및 면역형광 양성 웰 선택으로써 부모 HVT 바이러스로부터 분리시켰다. ILTV-gD 단백질을 발현하는 플라크 정제된 재조합 HVT 바이러스를 vHVT406 로 지명했다.
재조합 vHVT406 바이러스 플라크를 듀얼 염색을 위해 TRITC 및 FITC 양자 모두를 이용하여 육안으로 관찰했다. FITC 는 ILTV-gDwt 발현을 보였으며, TRITC 는 HVT 발현을 보였다. 96 웰 플레이트의 작은 웰 때문에, 각 웰을 TRITC 필터로 먼저 카운트한 다음 FITC 필터로 재카운트한 플라크로 기록하였다. 조합된 600+ 플라크를 pre-MSV 와 pre-MSV+13 계대 사이에서 카운트하였다. 모든 플라크는 양 계대에 있어서 FITC 및 TRITC 모두에 대해 양성이었다.
vHVT406 의 PCR 분석
표 6.3 에 열거된 PCR 프라이머를 이용하여 vHVT406 의 PCR 분석을 수행했다 (도 30). 도 31 에 나타낸 바와 같이, 겔 전기영동 후 PCR 생성물의 크기는 예상된 크기 및 밴딩 패턴과 잘 일치한다. vHVT406 에서 부모 HVT FC126 바이러스의 흔적은 없었다.
표 6.3 특이적 프라이머 세트를 이용한 예상되는 PCR 밴드
Figure pct00009
결론
PCR 시험 및 면역형광 분석을 기준으로 하면, vHVT406 는 SV40 프로모터, ILTV-gDwt 유전자, 및 합성 Poly A 꼬리를 SOrf3-US2 부위에 함유하는 재조합 HVT 바이러스이다. vHVT406 는 어떠한 검출가능한 부모 HVT 바이러스도 없다.
실시예 1.11 HVT 벡터의 시험관 내 안정성 연구
상기 구축된 HVT 벡터를 닭 배아 섬유모세포 세포 (CEF) 에서 다수의 시험관 내 계대 후 게놈/발현 안정성에 대해 시험하였다. 2 개의 유전자를 발현하는 HVT 벡터는 다수의 계대 후 안정적이었다. 다중 삽입물을 갖는 HVT 가 덜 안정적이라는 통상적인 지식과는 달리, 그 결과는 놀랍게도 본 발명의 HVT 벡터는 안정적이고 2 개의 유전자를 효율적으로 발현한다는 것을 나타냈다.
실시예 2 SPF 닭에서 vHVT306, vHVT309, vHVT310 & vHVT311 에 의해 D28 에 유도된 뉴캐슬병 (ND) 효능
본 연구의 목적은, D28 에 수행된 뉴캐슬병 챌린지 (Texas GB 균주) 에 대항하는 1일령 SPF 닭에 투여된 IBDV VP2 유전자 및 NDV F 유전자를 발현하는 4 개의 HVT 재조합 구축물 (vHVT306, vHVT309, vHVT310 & vHVT311) 의 효능을 평가하는 것이다.
이들 백신 후보의 특징을 하기 표 7 에 기술한다.
표 7 챌린지 연구에 사용된 벡터의 특징
Figure pct00010
1일령의 특정 무병원체 (SPF) 닭 95 마리를 표 8 에 나타낸 바와 같이 5 개의 그룹으로 배정하였다. 그룹 1 내지 4 (20 마리의 새/그룹) 로부터의 모든 새들에게 표시된 용량에서의 (표 8 참조) 상이한 HVT-IBD+ND 구축물 0.2 mL 를 피하 (SC) 경로로 백신접종하였다. 그룹 5 로부터의 15 마리의 새들은 백신접종을 하지 않은 채 두었다. 백신 접종 후 28 일 (D28) 에, 각 그룹에서 새들을 근육내 (IM) 경로로 NDV Texas GB 균주로 챌린지했다 (0.1 mL/새 중 104.0 계란 감염량 50% (EID50)). 챌린지 후 14 일 동안 새를 임상적 징후에 대해 관찰했다. 감염 후 최대 14 일 동안 어떠한 ND 임상적 징후 (중추 신경, 또는 호흡기 징후 및/또는 사망 포함) 도 나타내지 않는 새들은 보호된 것으로 간주되었다.
보호 결과를 표 8 에 나타낸다. 그룹 5 의 모든 대조군 새는 챌린지 후 사망했다. 백신접종된 그룹에서 보호는 적어도 90% 에 달했다.
표 8 SPF 닭에서 상이한 HVT-IBD+ND 이중 구축물에 의해 유도된 ND 효능
Figure pct00011
실시예 3 D35 에 표준 IBDV 챌린지에 대항하는 vHVT309, vHVT310, vHVT311 및 vHVT407 에 의해 유도된 IBD 효능
본 연구의 목적은, D35 에 수행된 표준 IBDV 챌린지에 대항하는 1일령 SPF 닭에 투여된 IBDV VP2 유전자 및 ILTV gD 유전자를 발현하는 하나의 구축물 (vHVT407) 및 IBDV VP2 유전자 및 NDV F 유전자를 발현하는 3 개의 HVT 재조합 구축물 (vHVT309, vHVT310 & vHVT311) 의 효능을 평가하는 것이다.
1일령 특정 무병원체 (SPF) 닭을 표 9 에 나타낸 바와 같이 4 개의 그룹으로 배정하였다. 그룹 1 내지 4 (20 마리의 새/그룹) 으로부터의 모든 새들에게, 지시된 용량에서의 상이한 HVT-IBD+ND 또는 HVT-IBD+ILT 구축물 0.2 mL 를 피하 (SC) 경로로 백신접종하였다. 그룹 5 로부터의 20 마리의 새들은 백신접종을 하지 않은 채 두었다. 백신 접종후 35 일 후 (D35 에), 모든 새들을 안내 (IO) 경로로써 감염성 점액낭병 바이러스 (IBDV) 고전적인 STC 균주로 챌린지하였다 (0.03 mL/새 중 102.0 EID50). 챌린지 후 4 일 후 (D39 에), 모든 새들을 종결시켜 부검하여 총 점액낭 병변에 대해 검사하였다.
보호 결과를 표 9 에 나타낸다. 백신접종된 모든 새 (2 마리의 vHVT311-백신접종된 새 제외) 는 IBD 에 대항하여 보호된 반면에, 대조군 새들 중 어떤 새들도 보호되지 않았다.
표 9 STC IBDV 균주로 D35 에 챌린지 후 SPF 닭에서 상이한 HVT-IBD+ND 또는 HVT-IBD+ILT 이중 구축물에 의해 유도된 IBD 효능
Figure pct00012
실시예 4 D35 에 변이체 IBDV 챌린지에 대항하는 vHVT309, vHVT310, vHVT311 및 vHVT407 에 의해 유도된 IBD 효능
본 연구의 목적은 D35 때 수행된 변이체 (Delaware E) IBDV 챌린지에 대항하는 1일령 SPF 닭에 투여된 IBDV VP2 유전자 및 NDV F 유전자를 발현하는 3 개의 HVT 재조합 구축물 (vHVT309, vHVT310 & vHVT311) 및 IBDV VP2 유전자 및 ILTV gD 유전자를 발현하는 1 개의 구축물 (vHVT407) 의 효능을 평가하는 것이다.
1일령 특정 무병원체 (SPF) 닭을 표 10 에 나타낸 바와 같이 6 개의 그룹으로 배정하였다. 그룹 1 내지 4 (19-20 마리의 새/그룹) 으로부터의 모든 새들에게 지시된 용량에서의 상이한 HVT-IBD+ND 또는 HVT-IBD+ILT 구축물 0.2 mL 를 피하 (SC) 경로로 백신접종하였다. 그룹 5 (19 마리의 새) 및 그룹 6 (18 마리의 새) 로부터의 새들은 백신접종을 하지 않은 채 두었다. D35 에, 그룹 1 내지 5 로부터의 모든 새들을 안내 (IO) 경로로써 감염성 점액낭병 바이러스 (IBDV) 변이체 Delaware E 균주로 챌린지하였다 (0.03 mL/새 중 103.0 EID50). 그룹 6 으로부터의 새들은 챌린지하지 않은 채 두었다. D46 에, 모든 새들의 바디 중량 및 점액낭 중량을 측정했다. B/B 중량비 (점액낭 중량/바디 중량 비율 * 100) 를 모든 그룹에 대해 산출하였다.
보호 결과를 표 10 에 나타낸다. 그룹 1 및 2 로부터의 백신접종된 새들은 백신접종하지 않은 비챌린지된 대조군 (그룹 6) 의 것과 유사하고 백신접종하지 않은 챌린지된 대조군 (그룹 5) 의 것보다 큰 평균 B/B 중량비를 가졌다. 그룹 3 의 새는 보호되지 않았으며, 그룹 4 의 새는 부분적으로 보호되었다. 놀랍게도, IRES 를 함유한 vHVT310 는 P2A 를 함유한 vHVT311 보다 더 나은 보호를 제공하였다.
표 10 D35 에 변이체 E IBDV 균주로 챌린지 후 SPF 닭에서 상이한 HVT-IBD+ND 또는 HVT-IBD+ILT 이중 구축물에 의해 유도된 IBD 효능
Figure pct00013
실시예 5 브로일러 (broiler) 에서 D28 에서 vvIBDV 에 대항하는 vHVT306, vHVT309 & vHVT310 에 의해 유도된 IBD 효능
본 연구의 목적은 D28 때 수행된 vvIBDV 챌린지에 대항하는 1일령 브로일러 닭에 투여된 IBDV VP2 유전자 및 NDV F 유전자를 발현하는 3 개의 HVT 재조합 구축물 (vHVT306, vHVT309 & vHVT310) 의 효능을 평가하는 것이다.
70 마리의 1일령 브로일러 닭 (Hubbard JA957 라인) 를 표 11 에 나타낸 바와 같이 5 개의 그룹으로 배정했다. 그룹 2 내지 5 (약 15 마리의 새/그룹) 로부터의 모든 새들에게 지시된 용량에서의 상이한 HVT-IBD+ND 구축물 0.2 mL 를 피하 (SC) 경로로써 백신접종하였다. 그룹 1 의 10 마리의 새들은 백신접종을 하지 않은 채 두었다. 백신접종 후 28 일 후에 (D28 에), 모든 새들을 안내 (IO) 경로로써 고독성 IBDV (vvIBDV) 91-168 균주로 챌린지하였다 (0.05 mL/새 중 104.3 EID50). 챌린지 후 10 일 후 (D38 에), 모든 새들을 종결시켜 부검하여 총 점액낭 병변에 대해 검사하였다. 점액낭 및 바디를 칭량하고, 조직병리학을 점액낭에서 수행했다. 점액낭의 조직학적 병변을 하기의 규모에 따라 0 내지 5 로 점수를 매겼다: 0 - 병변 부재, 정상 점액낭 ; 1- 모낭의 1% 내지 25% 이 림프구 결실 (즉, 1 종의 발병 모낭에서 50% 미만의 결실) 을 보이고, 병변 내 이염색백혈구의 유입; 2 - 모낭의 26% 내지 50% 이 거의 완전한 림프구 결실 (즉, 1 종의 발병 모낭에서 75% 초과의 결실)을 나타내고, 발병된 모낭은 괴사 병변을 보이고, 극심한 유입의 이염색백혈구가 검출될 수 있음; 3 - 모낭의 51% 내지 75% 이 림프구 결실을 나타내고; 발병 모낭은 괴사 병변을 나타내고, 극심한 유입의 이염색백혈구가 검출됨; 4 - 모낭의 76% 내지 100% 이 거의 완전한 림프구 결실을 나타내고; 과다형성 및 낭종 구조가 검출됨; 발병된 모낭은 괴사 병변을 나타내고, 극심한 유입의 이염색백혈구가 검출됨; 및 5 - 모낭의 100% 가 거의 완전한 림프구 결실을 나타내고; 모낭 구조의 완전한 손실; 증후 및 폴딩된 상피; 점액낭 조직의 섬유화. 챌린지 후 임상적 징후를 나타내지 않고 이의 조직학적 점수가 2 이하인 경우 새들은 보호된 것으로 간주되었다.
첫번째 주에 브로일러의 이러한 뱃치 (batch) 에서 아마도 대장균증으로 인해 일부의 이른 사망이 있었다. 시험된 백신의 용량은 예상보다 낮았다 (2000PFU). 보호 결과를 표 11 에 나타낸다. 부분 보호가 백신접종에 의해 유도되었는데, 이는 vHVT310 이 vHVT306 및 vHVT309 보다 높은 것을 나타낸다.
표 11 D28 에 vvIBDV 균주로의 챌린지 후 브로일러 닭에서 상이한 HVT-IBD+ND 이중 구축물에 의해 유도된 IBD 효능
Figure pct00014
실시예 6 브로일러에서 D42 에 강독형 (velogenic) NDV 챌린지에 대항하는 vHVT306, vHVT309 & vHVT310 에 의해 유도된 ND 효능
본 연구의 목적은 D42 때 수행된 강독형 NDV 챌린지에 대항하는 1일령 브로일러 닭에 투여된 IBDV VP2 유전자 및 NDV F 유전자를 발현하는 3 개의 HVT 재조합 구축물 (vHVT306, vHVT309 & vHVT310) 의 효능을 평가하기 위한 것이다.
1일령 브로일러 닭 (Hubbard JA957 라인) 를 표 12 에 나타낸 바와 같이 4 개의 그룹으로 배정하였다. 그룹 2 내지 4 (16-20 마리의 새/그룹) 로부터의 모든 새들에게 지시된 용량에서의 상이한 HVT-IBD+ND 구축물 0.2 mL 로 피하 (SC) 경로로써 백신접종하였다. 그룹 1 로부터의 12 마리의 새들은 백신접종하지 않은 채 두었다. 백신접종 후 42 일 후에 (D42 에), 모든 새들을 근육내 (IM) 경로로써 강독형 NDV Herts 33 균주로 챌린지하였다 (0.2 mL/새 중 105.0 EID50). 모든 새들을 챌린지 후 14 일 동안 임상적 징후에 대해 관찰했다. 새들이 죽지 않거나 또는 ND 임상적 징후를 보이지 않는다면 보호된 것으로서 간주하였다.
첫번째 주에 브로일러의 이러한 뱃치에서 아마도 대장균증으로 인해 일부의 이른 사망이 있었다. 시험된 백신의 용량은 예상된 것보다 낮았다 (2000PFU). 보호 결과는 표 12 에 나타낸다. 최상의 보호는 vHVT309 & vHVT310 이후 vHVT306 로의 백신접종에 의해 유도되었다.
표 12 강독형 NDV 균주로 D42 에 챌린지 후 브로일러 닭에서의 상이한 HVT-IBD+ND 이중 구축물에 의해 유도된 ND 효능
Figure pct00015
실시예 7 브로일러에서 D42 에 강독형 NDV 챌린지에 대항하는 vHVT306, vHVT309 & vHVT310 에 의해 유도된 ND 효능
본 연구의 목적은 D42 때 수행된 강독형 NDV 챌린지에 대항하는 1일령 브로일러 닭에 투여된 IBDV VP2 유전자 및 NDV F 유전자를 발현하는 3 개의 HVT 재조합 구축물 (vHVT306, vHVT309 & vHVT310) 의 효능을 재평가하는 것이다.
1일령 브로일러 닭 (Hubbard JA957 라인) 을 표 13 에 나타낸 바와 같이 4 개의 그룹으로 배정하였다. 그룹 2 내지 4 로부터의 모든 새 (16-20 마리의 새/그룹) 를 2000 PFU 로 상이한 HVT-IBD+ND 구축물 0.2 mL 로 피하 (SC) 경로로써 백신접종하였다. 그룹 1 로부터의 19 마리의 새들은 백신접종하지 않은 채 두었다. 백신접종 후 42 일 후 (D42 에), 모든 새들을 근육내 (IM) 경로로써 강독형 NDV Herts 33 균주로 챌린지하였다 (0.2 mL/새 중 105.0 EID50). 모든 새들을 챌린지 후 14 일 동안 임상적 징후에 대해 관찰했다. 새들이 죽지 않거나 ND 임상적 징후를 나타내지 않는다면 보호된 것으로 간주하였다.
보호 결과를 표 13 에 나타낸다. 전반적으로, 보호 수준은 이전 연구보다 높았지만 (실시예 6 참조), 동일한 추세를 따른다; 최상의 보호는 vHVT309 & vHVT310, 다음 vHVT306 로의 백신접종에 의해 유도되었다.
그 결과는 vHVT309 이 브로일러뿐 아니라 SPF 에서도 ND 챌린지에 대항해서 vHVT306 보다 더 효과적이라는 것을 나타내는데 (표 12 및 13), 이는 하나의 유전자좌에 이종 폴리뉴클레오티드를 삽입하는 것이 다수의 유전자좌에 삽입하는 것보다 바이러스의 전반적인 적합성에 있어서 덜 부정적인 영향을 미친다는 것을 시사한다.
표 13 강독형 NDV 균주로 D42 에 챌린지 후 브로일러 닭에서 상이한 HVT-IBD+ND 이중 구축물로써 유도된 ND 효능
Figure pct00016
실시예 8 SPF 닭에서 D14 에 표준 IBDV 챌린지에 대항하는 vHVT306, vHVT309 & vHVT310 에 의해 유도된 IBD 효능
본 연구의 목적은 D14 에 수행된 표준 IBDV 챌린지에 대항하는 1일령 SPF 닭에 투여된 IBDV VP2 유전자 및 NDV F 유전자를 발현하는 3 개의 HVT 재조합 구축물 (vHVT306, vHVT309 & vHVT310) 의 효능을 평가하는 것이다.
1일령 특정 무병원체 (SPF) 닭을 표 14 에 나타낸 바와 같이 4 개의 그룹으로 배정하였다. 그룹 1 내지 3 으로부터의 모든 새들 (21-22 마리의 새/그룹) 을 지시된 용량에서의 상이한 HVT-IBD+ND 구축물 0.2 mL 로 피하 (SC) 경로로써 백신접종하였다. 그룹 4 로부터의 22 마리의 새들은 백신접종하지 않은 채 두었다. 백신접종 후 14 일 후에 (D14 에), 모든 새들을 안내 (IO) 경로로써 감염성 점액낭병 바이러스 (IBDV) 고전적인 STC 균주로 챌린지하였다 (0.03 mL/새 중 101.4 EID50). 챌린지 후 4 일 후 (D18 에), 모든 새들을 종결시켜 부검하여 총 점액낭 병변에 대해 검사하였다.
보호 결과를 표 14 에 나타낸다. IBD 보호의 유사한 수준이 3 가지 실험 백신에 의해 유도된 반면, 하나의 대조군 새를 제외하고는 모두 감염되었다.
표 14 STC IBDV 균주로 D14 에 챌린지 후 SPF 닭에서 상이한 HVT-IBD+ND 이중 구축물에 의해 유도된 IBD 효능
Figure pct00017
실시예 9 D14 에 변이체 IBD 챌린지 후 SPF 닭에서 vHVT306, vHVT309 & vHVT310 에 의해 유도된 IBD 효능
본 연구의 목적은 D14 에 수행된 변이체 IBDV 챌린지에 대항하는 1일령 SPF 닭에 투여된 IBDV VP2 유전자 및 NDV F 유전자를 발현하는 3 개의 HVT 재조합 구축물 (vHVT306, vHVT309 & vHVT310) 의 효능을 평가하는 것이다.
1일령 특정 무병원체 (SPF) 닭을 표 15 에 나타낸 바와 같이 5 개의 그룹으로 배정하였다. 그룹 1 내지 3 으로부터의 모든 새들 (20 마리의 새/그룹) 을 지시된 용량에서의 상이한 HVT-IBD+ND 구축물 0.2 mL 로 피하 (SC) 경로로써 백신접종하였다. 그룹 4 및 그룹 5 로부터의 새들 (19-20 마리의 새/그룹) 은 백신접종을 하지 않은 채 두었다. D14 에, 그룹 1 내지 4 로부터의 모든 새들을 안내 (IO) 경로로써 감염성 점액낭병 바이러스 (IBDV) 변이체 Delaware E 균주로 챌린지하였다 (0.03 mL/새 중 102.2 EID50). 그룹 5 로부터의 새들은 백신접종하지 않은 채 두었다. D25 에, 모든 새들의 바디 중량 및 점액낭 중량을 측정했다. B/B 중량비 (점액낭 중량/바디 중량 비율 × 100) 을 모든 그룹에 대해서 산출하였다.
보호 결과는 표 15 에 나타낸다. 부분적 보호가 3 개의 백신에 의해 D14 에 유도되었으며, 이때의 보호는 vHVT309 및 vHVT310 에 있어서 더 높았다.
재조합 vHVT306 및 vHVT309 은 2 개의 독립적인 발현 카세트 (2 개의 mRNA) 를 가진다. IRES 또는 P2A 를 통해 2 개의 유전자를 발현하는 구축물 (예, vHVT310, vHVT317, vHVT311, vHVT316, vHVT322) 은 하나의 삽입 부위에 존재하는 것뿐만 아니라 또한 그 유전자는 하나의 mRNA 로부터 발현된다. 표 11 내지 19 에 제시된 데이타 모두를 비교해보면, 하나의 삽입 부위 재조합 vHVT309 및 vHVT310 가 2 개의 삽입 부위 재조합 vHVT306 보다 더 효과적인데, 이는 하나의 삽입 유전자좌에 하나 초과의 이종 폴리뉴클레오티드를 보유하는 HVT 재조합체가 다수의 삽입 유전자좌에 이종 폴리뉴클레오티드를 보유하는 HVT 재조합체보다 생물학적으로 더 적합하다는 것을 지시한다. 더욱이, 놀랍게도, IRES 를 통해 발현된 단일의 mRNA 로부터 하나 초과의 이종 폴리뉴클레오티드를 발현하는 것이 특히 브로일러에서 IBD 효능에 대해 덜 부정적인 영향을 미친다 (표 11 의 결과 참조).
표 15 변이체 E IBDV 균주로 D14 에 챌린지 후 SPF 닭에서 상이한 HVT-IBD+ND 이중 구축물에 의해 유도된 IBD 효능
Figure pct00018
실시예 10 SPF 닭에서 D28 에 표준 IBDV 챌린지에 대항하는 vHVT306, vHVT309 & vHVT310 에 의해 유도된 IBD 효능
본 연구의 목적은 D28 에 수행된 표준 IBDV 챌린지에 대항하는 1일령 SPF 닭에 투여된 IBDV VP2 유전자 및 NDV F 유전자를 발현하는 3 개의 HVT 재조합 구축물 (vHVT306, vHVT309 & vHVT310) 의 효능을 평가하는 것이다.
1일령 특정 무병원체 (SPF) 닭을 표 16 에 나타낸 바와 같이 4 개의 그룹으로 배정하였다. 그룹 1 내지 3 으로부터의 모든 새들 (20-22 마리의 새/그룹) 을 지시된 용량에서의 상이한 HVT-IBD+ND 구축물 0.2 mL 로 피하 (SC) 경로로써 백신접종하였다. 그룹 4 로부터의 22 마리의 새들은 백신접종하지 않은 채 두었다. 백신접종 후 28 일 후 (D28 에), 모든 새들을 안내 (IO) 경로로써 감염성 점액낭병 바이러스 (IBDV) 고전적인 STC 균주로 챌린지하였다 (0.03 mL/새 중 102.0 EID50). 챌린지 후 4 일 후 (D32 에), 모든 새들을 종결시켜 부검하여 총 점액낭 병변에 대해 검사하였다.
보호 결과를 표 16 에 나타낸다. vHVT310 에 의해 완전한 보호가 유도되었지만, 다른 백신 후보들에 대해서는 단지 몇 마리의 새들만이 보호되지 않았다.
표 16 STC IBDV 균주로 D28 에 챌린지 후 SPF 닭에서 상이한 HVT-IBD+ND 이중 구축물에 의해 유도된 IBD 효능
Figure pct00019
실시예 11 D28 에 변이체 IBD 챌린지 후 SPF 닭에서 vHVT306, vHVT309 & vHVT310 에 의해 유도된 IBD 효능
본 연구의 목적은 D28 에 수행된 변이체 IBDV 챌린지에 대항하는 1일령 SPF 닭에 투여된 IBDV VP2 유전자 및 NDV F 유전자를 발현하는 3 개의 HVT 재조합 구축물 (vHVT306, vHVT309 & vHVT310) 의 효능을 평가하는 것이다.
1일령 특정 무병원체 (SPF) 닭을 표 17 에 나타낸 바와 같이 5 개의 그룹으로 배정하였다. 그룹 1 내지 3 으로부터의 모든 새들 (20 마리의 새/그룹) 을 지시된 용량에서의 상이한 HVT-IBD+ND 구축물 0.2 mL 로 피하 (SC) 경로로써 백신접종하였다. 그룹 4 및 그룹 5 로부터의 새 (18-19 마리의 새/그룹) 는 백신접종하지 않은 채 두었다. D28 에, 그룹 1 내지 4 로부터의 모든 새들을 안내 (IO) 경로로써 감염성 점액낭병 바이러스 (IBDV) 변이체 Delaware E 균주로 챌린지하였다 (0.03 mL/새 중 102.2 EID50). 그룹 5 로부터의 새들은 챌린지하지 않은 채 두었다. D39 에, 모든 새들의 바디 중량 및 점액낭 중량을 측정하였다. B/B 중량비 (점액낭 중량/바디 중량 비율 * 100) 을 모든 그룹에 대해 산출하였다.
보호 결과는 표 17 에 나타낸다. 그룹 5 (챌린지하지 않은 그룹) 에 대한 B/B 중량비는 이 그룹이 뜻밖에도 STC IBDV 균주에 감염되었기 때문에 수득될 수 없었다. vHVT310 에 의해 유도된 보호는 vHVT306 및 vHVT309 에 의해 유도된 것보다 더 높았다.
표 17 변이체 E IBDV 균주로 D28 에 챌린지 후 SPF 닭에서 상이한 HVT-IBD+ND 이중 구축물에 의해 유도된 IBD 효능
Figure pct00020
실시예 12 SPF 닭에서 vHVT306, vHVT309 & vHVT310 에 의해 D21 및 D23 에 유도된 뉴캐슬병 (ND) 효능
본 연구의 목적은 D21 및 D28 때 수행된 뉴캐슬병 챌린지 (Texas GB 균주) 에 대항하는 1일령 SPF 닭에 투여된 IBDV VP2 유전자 및 NDV F 유전자를 발현하는 3 개의 HVT 재조합 구축물 (vHVT309, vHVT310 & vHVT311) 의 효능을 평가하는 것이다.
1일령 특정 무병원체 (SPF) 닭을 표 18 에 나타낸 바와 같이 4 개의 그룹으로 배정하였다. 그룹 1 내지 3 으로부터의 모든 새들 (50 마리의 새/그룹) 을 지시된 용량에서의 상이한 HVT-IBD+ND 구축물 0.2 mL 로 피하 (SC) 경로로써 백신접종하였다. 그룹 4 로부터의 30 마리의 새들은 백신접종하지 않은 채 두었다. 백신접종 후 21 일 (D21) 후에, 그룹 1-3 로부터의 20 마리의 새 및 그룹 4 로부터의 15 마리의 새를 근육내 (IM) 경로로써 NDV Texas GB 균으로 챌린지하였다 (0.1 mL/새 중 104.2 계란 감염량 50% (EID50)). 백신 접종 후 28 일 (D28) 후에, 그룹 1-3 으로부터의 30 마리의 새 및 그룹 4 로부터의 15 마리의 새를 근육내 (IM) 경로로써 NDV Texas GB 균주로 챌린지했다 (0.1 mL/새 중 104.3 계란 감염량 50% (EID50)). 챌린지 후 14 일 동안 새들을 임상적 징후에 대해 관찰했다. 챌린지 후 최대 14 일 동안 어떠한 ND 임상적 징후 (중추 신경, 또는 호흡기 징후 및/또는 사망 포함) 도 나타내지 않는 새들은 보호된 것으로 간주되었다.
보호 결과를 표 18 에 나타낸다. 그룹 4 의 모든 대조군 새들은 챌린지 후 죽었다. vHVT310 에 의해 유도된 보호는 최고였고, vHVT306 및 vHVT309 가 그 뒤를 따랐다.
표 18 SPF 닭에서 상이한 HVT-IBD+ND 이중 구축물에 의해 유도된 D21 및 D28 에서의 ND 효능
Figure pct00021
실시예 13 SPF 닭에서 vHVT306, vHVT309 & vHVT310 에 의해 유도된 마렉병 (MD) 효능
본 연구의 목적은 마렉병 챌린지 (GA 균주, 2 뱃치 & 2 희석물) 에 대항하는 1일령 SPF 닭에 투여된 IBDV VP2 유전자 및 NDV F 유전자를 발현하는 3 개의 HVT 재조합 구축물 (vHVT309, vHVT310 & vHVT311) 의 효능을 평가하는 것이다.
1일령 특정 무병원체 (SPF) 닭을 표 19 에 나타낸 바와 같이 4 개의 그룹으로 배정하였다. 그룹 1 내지 3 으로부터의 모든 새들 (20 마리의 새/그룹) 을 지시된 용량에서의 상이한 HVT-IBD+ND 구축물 0.2 mL 로 피하 (SC) 경로로써 백신접종하였다. 그룹 4 로부터의 20 마리의 새들은 백신접종하지 않은 채 두었다. 백신접종 후 4 일 (D4) 후에, 그룹 1-4 로부터의 새들은 SC 경로로써 vMDV GA22 균주의 2 가지의 상이한 뱃치 (#1 및 #2) 의 두 희석물 (1:5 및 1:640) 로 챌린지하였다. 부화 후 46-50 일 동안 새들을 마렉병에 기인하는 임상적 징후에 대해 관찰하였다. D46-D50 에, 남아 있는 모든 새들을 부검하여 마렉병 병변에 대해 체크하였다. 어떠한 MD 임상적 징후 또는 병변을 나타내지 않는 새들은 보호된 것으로 간주되었다.
보호 결과를 표 19 에 나타낸다. 그룹 4 의 대조군 새에서의 감염성은 75-90% 사이에서 다양하였다. 전반적으로, vHVT310 에 의해 유도된 보호가 최상이였으며, 그 후 밀접하게 vHVT306 다음 vHVT309 이 뒤따른다.
표 19 1:5 또는 1:640 희석된 GA22 챌린지의 2 가지의 상이한 무리 (lot) 에 대항하는 SPF 닭에서의 상이한 HVT-IBD+ND 이중 구축물에 의해 유도된 MD 효능
Figure pct00022
실시예 14 SPF 닭에서 D21 에 고전적인 IBDV 챌린지에 대항하는 vHVT306 및 vHVT407 에 의해 유도된 IBD 효능
본 연구의 목적은 D21 때 수행된 고전적 IBDV 챌린지에 대항하는 1일령 SPF 닭에 투여된 2 개의 HVT 재조합 구축물인, IBDV VP2 유전자 및 NDV F 유전자를 발현하는 하나 (vHVT306) 와 IBDV VP2 유전자 및 ILTV gD 유전자를 발현하는 나머지 하나 (vHVT407) 의 효능을 평가하는 것이다.
40 마리의 1일령 SPF 닭 (백색 레그혼종; white Leghorn) 을 표 20 에 나타낸 바와 같이 3 개의 그룹으로 배정하였다. 그룹 2 & 3 으로부터의 모든 새들 (약 15 마리의 새/그룹) 을, 지시된 용량에서의 vHVT306 또는 vHVT407 구축물 0.2 mL 로 피하 (SC) 경로로써 백신접종하였다. 그룹 1 로부터의 10 마리의 새들은 백신접종하지 않은 채 두었다. 백신접종 후 21 일 후에 (D21 에), 모든 새들을 안내 (IO) 경로로써 고전적인 52/70 Faragher IBDV 균주로 챌린지하였다 (0.05 mL/새 중 102.0 EID50). 챌린지 후 11 일 후에 (D32 에), 모든 새들을 종결시켜 부검해 총 점액낭 병변에 대해 검사하였다. 점액낭 및 바디를 칭량해 바디에 대한 점액낭 중량 비율을 산출하였다. 챌린지 후 임상적 징후 또는 점액낭 병변을 나타내지 않는다면 새들이 보호된 것으로 간주하였다.
보호 결과는 표 20 에 나타낸다. 완전한 IBD 보호는 vHVT306 또는 vHVT407 로의 백신접종에 의해 유도되었다.
표 20 Faragher IBDV 균주로 D21 에 챌린지 후 SPF 닭에서 2 개의 유전자를 발현하는 2 개의 HVT 구축물에 의해 유도된 IBD 효능
Figure pct00023
실시예 15 SPF 닭에서 D21 에 ILTV 챌린지에 대항하는 vHVT407 에 의해 유도된 ILT 효능
본 연구의 목적은 D21 때 수행된 ILTV 챌린지에 대항하는 1일령 SPF 닭에 투여된 IBDV VP2 유전자 및 ILTV gD 유전자를 발현하는 2 개의 vHVT407 재조합 구축물의 효능을 평가하는 것이다.
24 마리의 1일령 SPF 닭 (백색 레그혼종) 을 표 21 에 나타낸 바와 같이 2 그룹으로 배정하였다. 모든 새들 (약 12 마리의 새/그룹) 을, 지시된 용량에서의 vHVT13 (음성 대조군으로서 이용) 또는 vHVT407 구축물 0.2 mL 로 피하 (SC) 경로로써 백신접종하였다. 백신접종 후 21 일 후 (D21 에), 모든 새들을 기관내 (IT) 경로로써 ILT-96-3 ILTV 균주로 챌린지하였다 (0.5 mL/새 중 103.6 EID50). 챌린지 후 11 일 동안 새들을 임상적 징후에 대해 관찰했다. 연구 제 25-29 일 및 제 32 일에 모든 새들을 호흡 패턴, 결막염, 우울증 및 사망을 비롯한 임상적 징후에 대해 관찰하였다. 연구 제 32 일에, 남아 있는 모든 새들을 종결시켰다. 새들이 사망을 비롯해, 기침, 재채기, 수포음, 우울증, 헐떡임 및/또는 출혈성 점액 삼출물과 연관된 호흡 곤란과 같은 ILT 임상적 징후를 나타내지 않는다면 보호된 것으로 간주되었다.
보호 결과를 표 21 에 나타낸다. 유의미한 ILT 보호는 이들 챌린지 조건에서 vHVT407 로의 백신접종에 의해 유도되었다.
표 21 ILT-96-3 ILTV 균주로의 D21 에서의 챌린지 후 SPF 닭에서 vHVT407 구축물에 의해 유도된 ILT 효능
Figure pct00024
실시예 16 브로일러 닭에서 D21 에서 ILTV 챌린지에 대항하는 vHVT407, 상업용 HVT-ILT 및 상업용 닭 배아 기원 (CEO) 백신에 의해 유도된 ILT 효능
본 연구의 목적은 D21 때 수행된 ILTV 챌린지에 대항하는, 상업용 HVT-ILT 백신 (INNOVAX® ILT) 에 필적하는 1일령 브로일러 닭에 투여된 IBDV VP2 유전자 및 ILTV gD 유전자를 발현하는 vHVT407 재조합 구축물의 효능을 평가하는 것이다.
48 마리의 1일령 상업용 브로일러 닭을 표 22 에 나타낸 바와 같이 3 개의 그룹으로 배정하였다. 그룹 1-3 의 모든 새들 (약 12 마리의 새/그룹) 을 지시된 용량에서의 vHVT13 (음성 대조군으로서 이용), vHVT407 또는 INNOVAX® ILT (양성 대조군으로서 이용) 구축물 0.2 mL 로 피하 (SC) 경로로써 백신접종하였다. 백신접종 후 21 일 후 (D21 에), 모든 새들을 기관내 (IT) 경로로써 ILT-96-3 ILTV 균주로 챌린지하였다 (0.5 mL/새 중 104.2 EID50). 새들을 챌린지 후 12 일 동안 임상적 징후에 대해 관찰했다. 연구 제 25-29 일 및 제 32-33 일에, 모든 새들을 관찰하고 호흡 패턴, 결막염, 우울증 및 사망을 포함하는 임상적 징후에 대해 점수를 매겼다. 연구 제 34 일에, 남아 있는 모든 새들을 종결시켰다. 사망을 비롯해, 기침, 재채기, 수포음, 우울증, 헐떡임 및/또는 출혈성 점액 삼출물과 연관된 호흡 곤란과 같은 ILT 임상적 징후를 나타내지 않으면 새들은 보호된 것으로서 간주하였다.
보호 결과를 표 22 에 나타낸다. ILT 보호는 vHVT407 로의 백신접종으로써 유도되었으며, 이는 INNOVAX ILT 에 의해 유도된 것보다 더 높았다.
표 22 ILT-96-3 ILTV 균주로 D21 에 챌린지 후 브로일러 닭에서 vHVT407 및 INNOVAX ILT 구축물로써 유도된 ILT 효능
Figure pct00025
실시예 17 SPF 닭에서 vHVT310 & vHVT316 에 의한 D14, D21 및 D32 에서 유도된 뉴캐슬병 (ND) 효능
본 연구의 목적은 D14, D21 및 D32 때 수행된 뉴캐슬병 챌린지 (Texas GB 균주) 에 대항하는 1일령 SPF 닭에 투여된 IBDV VP2 유전자 및 NDV F 유전자를 발현하는 2 개의 HVT 재조합 구축물 (vHVT310 & vHVT316) 의 ND 면역성 개시를 비교하기 위한 것이다.
1일령 특정 무병원체 (SPF) 닭을 표 23 에 나타낸 바와 같이 3 개의 그룹으로 배정하였다. 그룹 1 내지 2 로부터의 모든 새들 (59-70 마리의 새/그룹; 표 참조) 을, 지시된 용량에서의 상이한 HVT-IBD+ND 구축물 0.2 mL 로 피하 (SC) 경로로써 백신접종하였다. 그룹 3 으로부터의 45 마리의 새들은 백신접종하지 않은 채 두었다. D14, D21 및 D32 에, 그룹 1-3 으로부터의 15-30 마리의 새들 (표 참조) 을 근육내 (IM) 경로로써 NDV Texas GB 균주로 챌린지하였다 (0.1 mL/새 중 104.0 EID50/새). 챌린지 후 14 일 동안 새들을 임상적 징후에 대해 관찰하였다. 챌린지 후 최대 14 일 동안 어떠한 ND 임상적 징후 (중추 신경, 또는 호흡기 징후 및/또는 사망 포함) 를 보이지 않는 새들은 보호된 것으로 간주되었다.
보호 결과를 표 23 에 나타낸다. 그룹 3 의 모든 대조군 새는 챌린지 후 죽었다. vHVT310 및 vHVT316 양자 모두에 의해 유도된 보호 수준은 유사하였고, vHVT316 에 의해 유도된 가능한 조기 면역성 개시가 존재하였다.
표 23 SPF 닭에서 상이한 HVT-IBD+ND 이중 구축물에 의해 유도된 D14, D21 및 D32 에서의 ND 효능
Figure pct00026
실시예 18 ILTV gD 및 IBDV VP2 를 발현하거나 또는 ILTV gD 및 NDV F 를 발현하는 HVT 벡터에 의해 유도된 ILTV 효능
본 연구의 목적은 ILTV 챌린지에 대항하는 닭에 투여된 ILTV gD 및 IBDV VP2 를 발현하는 HVT 재조합 구축물 (예, vHVT317 및 vHVT407) 또는 ILTV gD 및 NDV F 유전자를 발현하는 HVT 재조합 구축물 (예, vHVT308 및 vHVT322) 의 효능을 평가하는 것이다.
닭을 상이한 그룹으로 배정하였다. 새들을 상이한 HVT 구축물 0.2 mL 로 피하 (SC) 경로로써 백신접종하였다. 하나의 그룹으로부터의 새들은 백신접종하지 않은 채 두었다. 새들을 기관내 (IT) 또는 안와하 공동 (infraorbital sinus) 경로로써 ILTV 로 챌린지하였다. 새들을 챌린지 후 11-14 일 동안 임상적 징후에 대해 관찰하였다. 챌린지 후 최대 14 일 동안 임의의 ILTV 임상적 징후 (사망 및/또는 기침, 재채기, 수포음, 우울증, 헐떡임 및/또는 출혈성 점액 삼출물과 연관된 호흡 곤란 포함) 를 보이지 않는 새들은 보호된 것으로 간주한다.
그 결과는 HVT 벡터가 ILTV 감염에 대항해 보호를 제공한다는 것을 나타낸다.
실시예 19 ILTV gD 및 IBDV VP2 를 발현하는 HVT 벡터에 의해 유도된 IBD 효능
본 연구의 목적은 IBD 챌린지에 대항하는 닭에 투여된 ILTV gD 및 IBDV VP2 를 발현하는 HVT 재조합 구축물 (예, vHVT317 및 vHVT407) 의 효능을 평가하는 것이다.
닭을 상이한 그룹으로 배정하였다. 새들을 상이한 HVT 구축물 0.2 mL 로 피하 (SC) 경로로써 백신접종하였다. ?하나의 그룹으로부터의 새들은 백신접종하지 않은 채 두었다. 새들을 안내 (IO) 경로로써 IBD 로 챌린지하였다. 새들을 챌린지 후 4 내지 10 일 동안 임상적 징후에 대해 관찰했다. 챌린지 후 최대 10 일 동안 어떠한 IBD 임상적 징후 (우울증 및/또는 사망 포함) 을 나타내지 않고 점액낭 병변 및/또는 위축증을 보이지 않는 새들은 보호된 것으로 간주되었다.
그 결과, HVT 벡터가 IBD 감염에 대항하는 보호를 제공한다는 점이 밝혀졌다.
실시예 20 ILTV gD 및 NDV F 를 발현하는 HVT 벡터에 의해 유도된 NDV 효능
본 연구의 목적은 NDV 챌린지에 대항하는 닭에 투여된 ILTV gD 및 NDV F 유전자를 발현하는 HVT 재조합 구축물 (예, vHVT308 및 vHVT322) 의 효능을 평가하는 것이다.
닭을 상이한 그룹으로 배정하였다. 새들을 상이한 HVT 구축물 0.2 mL 로 피하 (SC) 경로로써 백신접종하였다. 하나의 그룹으로부터의 새들은 백신접종하지 않은 채 두었다. 새들을 근육내 (IM) 경로로써 NDV 로 챌린지하였다. 새들을 챌린지 후 14 일 동안 임상적 징후에 대해 관찰했다. 챌린지 후 최대 14 일 동안 어떠한 ND 임상적 징후 (중추 신경, 또는 호흡기 징후 및/또는 사망 포함) 도 나타내지 않는 새들은 보호된 것으로 간주하였다.
그 결과는 HVT 벡터가 NDV 감염에 대항하는 보호를 제공한다는 점을 나타낸다.
실시예 21 SPF 닭에서 D28 에 표준 IBDV 챌린지에 대항하는 vHVT316 & vHVT317 에 의해 유도된 IBD 효능
본 연구의 목표는 D28 에 수행된 표준 IBDV 챌린지에 대항하는 1일령 SPF 닭에 투여된 IBDV VP2 유전자 및 NDV F 유전자를 발현하거나 (vHVT316) 또는 IBDV VP2 유전자 및 ILTV gD 유전자를 발현하는 (vHVT317) 2 개의 HVT 재조합 구축물 (vHVT316 & vHVT317) 의 효능을 평가하는 것이다.
1일령 특정 무병원체 (SPF) 닭을 표 24 에 나타낸 바와 같이 3 개의 그룹으로 배정하였다. 그룹 1 & 2 로부터의 모든 새들 (15 마리의 새/그룹) 을 지시된 용량에서의 vHVT316 & vHVT317 0.2 mL 로 피하 (SC) 경로로써 백신접종하였다. 그룹 3 으로부터의 15 마리의 새들은 백신접종하지 않은 채 두었다. 백신접종 후 28 일 후에 (D28 에), 모든 새들을 안내 (IO) 경로로써 감염성 점액낭병 바이러스 (IBDV) 고전적인 STC 균주로 챌린지하였다 (0.03 mL/새 중 102.0 EID50). 챌린지 후 4 일 후에 (D32 에), 모든 새들을 종결시켜 부검하여 총 점액낭 병변에 대해 검사하였다.
보호 결과를 표 24 에 나타낸다. 100% 및 80% 보호가 각각 vHVT316 및 vHVT317 에 의해 유도되었으나; 그러나, vHVT317 의 투여된 용량은 vHVT316 의 것보다 거의 3 배 더 낮았다.
표 24 STC IBDV 균주로 D28 에 챌린지 후 SPF 닭에서 HVT-IBD+ND (vHVT316) 및 HVT-IBD+ILT (vHVT317) 이중 구축물에 의해 유도된 IBD 효능
Figure pct00027
실시예 22 D28 에 변이체 IBD 챌린지 후 SPF 닭에서 vHVT310, vHVT316 & vHVT317 에 의해 유도된 IBD 효능
본 연구의 목적은 D28 에 수행된 변이체 IBDV 챌린지에 대항하는 1일령 SPF 닭에 투여된, IBDV VP2 유전자 및 NDV F 유전자를 발현하거나 (vHVT310 & vHVT316), 또는 IBDV VP2 유전자 및 ILTV gD 유전자를 발현하는 (vHVT317) 3 개의 HVT 재조합 구축물 (vHVT310, vHVT316 & vHVT317) 의 효능을 평가하는 것이다.
1일령 특정 무병원체 (SPF) 닭을 표 25 에 나타낸 바와 같이 5 개의 그룹으로 배정했다. 그룹 1 내지 3 으로부터의 모든 새들 (15 마리의 새/그룹) 을 지시된 용량에서의 vHVT310, vHVT316 & vHVT317 0.2 mL 로 피하 (SC) 경로로써 백신접종하였다. 그룹 4 및 그룹 5 로부터의 새들 (15 마리의 새/그룹) 은 백신접종하지 않은 채 두었다. D28 에, 그룹 1 내지 4 로부터의 모든 새들을 안내 (IO) 경로로써 감염성 점액낭병 바이러스 (IBDV) 변이체 Delaware E 균주로 챌린지하였다 (0.03 mL/새 중 103.0 EID50). 그룹 5 로부터의 새들은 챌린지하지 않은 채 두었다. D39 에, 모든 새들의 바디 중량 및 점액낭 중량을 측정하였다. B/B 중량비 (점액낭 중량/바디 중량 비율 × 100) 을 모든 그룹에 대해 산출하였다.
보호 결과를 표 25 에 나타낸다. 보호는 모든 백신접종된 그룹에서 관찰되었다. vHVT317 로의 보호는 그의 낮은 용량에도 불구하고 vHVT310 및 vHVT316 에 의해 유도된 것보다 약간 더 높았다.
표 25 변이체 E IBDV 균주로 D28 에 챌린지 후 SPF 닭에서 이중 삽입물을 갖는 상이한 HVT 구축물에 의해 유도된 IBD 효능
Figure pct00028
실시예 23 SPF 닭에서 D28 에 ILTV 챌린지에 대항하는 vHVT317 에 의해 유도된 ILT 효능
본 연구의 목적은 D28 때 수행된 ILTV 챌린지에 대항하는 1일령 SPF 닭에 투여된 IBDV VP2 유전자 및 ILTV gD 유전자를 발현하는 vHVT317 재조합 구축물의 효능을 평가하는 것이다.
36 마리의 1일령 SPF 닭 (백색 레그혼종) 을 표 26 에 나타낸 바와 같이 2 개의 그룹으로 배정하였다. 모든 새들 (약 18 마리의 새/그룹) 을 vHVT317 0.2 mL 로 피하 (SC) 경로로써 백신접종하였거나, 백신접종하지 않은 채 두었다. 백신접종 후 28 일 후에 (D28 에), 모든 새들을 기관내 (IT) 경로로써 ILT-96-3 ILTV 균주로 챌린지하였다 (0.2 mL/새 중 103.0 EID50). 새들을 D32, D36 & D39 에 임상적 징후 및 사망에 대해서 관찰했다. 임상적 징후는 호흡 패턴, 결막염, 우울증 및 사망을 포함한다. 연구 제 32 일 때, 모든 남아 있는 새들을 종결시켰다. 3 가지 상이한 기준을 이용하여 보호 평가를 사용했다: (1) 챌린지 후 죽거나 연속의 3 일 동안 임의의 임상적 징후를 보이는 임의의 새는 ILT 양성으로 간주함; (2) 챌린지 후 죽거나 또는 임의의 날 동안 임의의 범주에서 임의의 중간정도 또는 중증의 임상적 징후를 보이는 임의의 새는 ILT 양성으로서 간주함; 및 (3) 챌린지 후 죽거나 또는 연속 2 일 동안 임의의 범주에서 임의의 중간 정도 또는 중증의 임상적 징후를 보이는 임의의 새는 ILT 양성으로서 간주함.
3 개의 상이한 기준을 바탕으로 하는 보호 결과를 표 26 에 나타낸다. ILT 챌린지는 백신접종하지 않은 새들의 86.7% 를 사망 (또는 매우 심각한 임상적 징후를 보이는 경우 윤리적인 이유로 새들을 안락사시킴) 시키기 때문에 심각했다. 높은 수준의 ILT 보호가 이들 챌린지 조건에서 vHVT317 로의 백신접종에 의해 유도되었다.
표 26 ILT-96-3 ILTV 균주로의 D28 에 챌린지 후 SPF 닭에서 vHVT317 구축물에 의해 유도된 ILT 효능
Figure pct00029
실시예 24 브로일러 닭에서 D21 에 ILTV 챌린지에 대항하는 vHVT317, 상업용 HVT-ILT 및 상업용 닭 배아 기원 (CEO) 백신에 의해 유도된 ILT 효능
본 연구의 목적은 D28 때 수행된 ILTV 챌린지에 대항하는, 상업용 HVT-ILT 백신 (INNOVAX® ILT, Merck Animal Health) 에 필적하는 1일령 브로일러 닭에 투여된 IBDV VP2 유전자 및 ILTV gD 유전자를 발현하는 vHVT317 재조합 구축물의 효능을 평가하는 것이다.
51 마리의 1일령 상업용 브로일러 닭을 표 27 에 나타낸 바와 같이 3 개의 그룹으로 배정하였다. 모든 새들 (17 마리의 새/그룹) 을 지시된 용량에서의 vHVT317 또는 INNOVAX® ILT (양성 대조군으로서 이용) 0.2 mL 로 피하 (SC) 경로로써 백신접종하거나, 또는 백신접종하지 않은 채 두었다. D26 에, 그룹 당 새들의 마릿수는 15 마리로 감소하였고, 각각의 새를 칭량하였다. 백신접종 후 28 일 후 (D28 에), 모든 새들을 안와하 경로로써 63140 ILTV 균주로 챌린지하였다 (0.2 mL/새 중 104.3 EID50). 연구 제 31 일 내지 제 35 일 때, 및 연구 제 38 일 때, 모든 새들을 임상적 징후에 대해 개별적으로 관찰했다. 연구 제 38 일 때, 남아있는 모든 새들을 개별적으로 칭량하고 종결시켰다. 보호 평가는 3 가지 상이한 기준을 이용하여 수행했다: (1) 챌린지 후 죽거나 연속의 3 일 동안 임의의 임상적 징후를 보이는 임의의 새는 ILT 양성으로 간주함; (2) 챌린지 후 죽거나 또는 임의의 날 동안 임의의 범주에서 임의의 중간정도 또는 중증의 임상적 징후를 보이는 임의의 새는 ILT 양성으로서 간주함; 및 (3) 챌린지 후 죽거나 또는 연속 2 일 동안 임의의 범주에서 임의의 중간 정도 또는 중증의 임상적 징후를 보이는 임의의 새는 ILT 양성으로서 간주함. 바디 중량을 또한 D26 및 D38 에 비교하였다.
3 가지 기준을 이용하는 보호 결과를 표 27 에 나타낸다. 모든 대조군은 3 가지 기준에 대해 보호되지 않은 것으로 간주되었다. 테스트된 양자 모두의 백신은 높고 유사한 ILT 보호를 유도했다. D26 (챌린지 전) 에 바디 중량 간에는 유의미한 차이가 없었다; 그러나, 챌린지 후, 백신접종된 새들의 바디 중량은 백신접종하지 않은 새들의 것보다 유의미하게 (p<0.0001) 더 높았는데, 이는 중량 감소에 대항하는 보호를 시사한다.
표 27 63140 ILTV 균주로의 D28 에 챌린지 후 브로일러 닭에서 vHVT317 및 INNOVAX ILT (양성 대조군) 구축물에 의해 유도된 ILT 효능
Figure pct00030
실시예 25 SPF 닭에서 28 일령에서 변이체 IBD 챌린지 후 vHVT317 의 난 내 (in ovo) 투여에 의해 유도된 IBD 효능
본 연구의 목적은 28일령 (백신접종 후 31 일) 에 수행된 변이체 IBDV 챌린지에 대항하는 SPF 닭으로부터의 18-19 일령 배아에 난 내 투여된 IBDV VP2 유전자 및 ILTV gD 유전자를 발현하는 vHVT317 의 효능을 평가하는 것이다.
특정 무병원체 (SPF) 닭의 18-19 일령 배아를 표 28 에 나타낸 바와 같이 3 개의 그룹으로 배정하였다. 그룹 1 & 2 로부터의 모든 새들 (약 30 개의 계란/그룹) 을 지시된 용량에서의 vHVT317 0.05 mL 로 난 내 (SC) 경로로써 백신접종하였다. 그룹 3 으로부터의 발육 계란을 Marek 백신 희석제 0.05 mL 로 허위접종하였다. 부화시, 그룹 당 22 마리의 닭을 사육하고, 챌린지 전에 3 개의 모든 그룹을 20 마리의 새로 감소시켰다. 백신접종 후 31 일 후에 (28일령에), 3 개의 모든 그룹으로부터의 새들을 안내 (IO) 경로로써 감염성 점액낭병 바이러스 (IBDV) 변이체 Delaware E 균주로 챌린지하였다 (0.03 mL/새 중 103.0 EID50 의 표적 용량). 그룹 5 로부터의 새들은 TPB (트립토오스 포스페이트 브로쓰, 0.03 mL/새) 로 허위 챌린지하였다. 챌린지 후 11 일 후, 모든 새들의 바디 중량 및 점액낭 중량을 측정하였다. B/B 중량비 (점액낭 중량/바디 중량 비율 × 100) 을 모든 그룹에 대해 산출하였다.
보호 결과를 표 28 에 나타낸다. 백신접종하지 않은 챌린지된 모든 새에서 분명한 점액낭 위축이 관찰되었다. 보호는 2 회 시험된 용량에서의 vHVT317-백신접종된 그룹에서 관찰되었다.
표 28 SPF 닭에서 28 일령때 변이체 E IBDV 균주로 챌린지 후 난 내 투여된 vHVT317 에 의해 유도된 IBD 효능
Figure pct00031
실시예 26 SPF 닭에서 D28 에 ILTV 챌린지에 대항하는 난 내 경로에 의해 투여된 vHVT317 에 의해 유도된 ILT 효능
본 연구의 목적은 SPF 닭에서 D28 때 (25 일령에) 수행된 ILTV 챌린지에 대항하는 18-19 일령 배아에 난 내 경로로써 투여된 IBDV VP2 유전자 및 ILTV gD 유전자를 발현하는 vHVT317 재조합 구축물의 효능을 평가하는 것이다.
특정 무병원체 (SPF) 닭으로부터 18-19 일령 배아를 표 29 에 나타내 바와 같이 2 개의 그룹으로 배정했다. 그룹 1 로부터의 모든 새들 (약 30 개의 계란/그룹) 을 지시된 용량에서의 vHVT317 0.05 mL 로 난 내 (SC) 경로로써 백신접종하였다. 그룹 2 로부터의 발육 계란을 Marek 백신 희석제 0.05 mL 로 허위 접종하였다. 부화 때, 그룹 당 22 마리의 닭을 사육하고, 챌린지 하루 전에, 양자 모두의 그룹을 20 마리의 새로 감소시켰다. 백신접종 후 25 일 후에 (D28 에), 양자 모두의 그룹으로부터의 새들을 안와하 공동에서 투여된 63140 ILTV 균주로 챌린지하였다 (0.2 mL/새 중 104.7 EID50). 새들을 임상적 징후 및 사망에 대해 D28 내지 D38 때에 관찰했다. 연구 제 38 일 때에, 남아있는 모든 새들을 종결시켰다. ILT 챌린지에 대항하는 효능은, 하기와 같은 전형적인 ILT 임상적 징후의 부재에 의해 결정되었다: 우울증, 기침, 재채기, 수포음, 헐떡임 (확장 목 포함) 과 관련된 호흡 곤란, 유혈 및/또는 점액 분비물 유무; 호흡곤란 및 입 호흡; 안와하 공동 팽윤, 배액 유무; 및/또는 눈이 부분적 또는 완전히 감기는 부어오른 결막. 트라우마로 인한 경우를 제외로 하는 챌린지 후 임의 사망, 또는 연구로부터 새를 제외시키는 임의의 명확한 상태를 ILT 에 대해 양성인 것으로 간주하였다.
ILT 결과를 표 29 에 나타낸다. 그 결과는 대부분의 vHVT317 백신접종된 새들이 보호되었음을 나타내었다.
표 29 SPF 닭에서 63140 ILTV 균주로 D28 에 안와하 공동 챌린지 후 난 내 경로에 의해 투여된 vHVT317 에 의해 유도된 ILT 효능
Figure pct00032
실시예 29 SPF 닭에서 D21 에서 강독형 NDV 챌린지에 대항하는 vHVT309 & vHVT310 에 의해 유도된 ND 효능
본 연구의 목적은 D21 때 수행된 강독형 NDV 챌린지에 대항하는 1일령 SPF 닭에 투여된 IBDV VP2 유전자 및 NDV F 유전자를 발현하는 2 개의 HVT 재조합 구축물 (vHVT309 & vHVT310) 의 효능을 평가하는 것이다.
1일령 SPF 닭 (백색 레그혼종) 을 표 30 에 나타낸 바와 같이 3 개의 그룹의 새로 배정하였다. 그룹 2 및 3 으로부터의 모든 새들을 2000 PFU 의 표적 용량에서의 vHVT309 (14 마리의 새 ; 그룹 2) 또는 vHVT310 (15 마리의 새; 그룹 3) 0.2 mL 로 피하 (SC) 경로로써 백신접종하였다. 그룹 1 로부터의 새 (5 마리의 새) 는 백신접종하지 않은 채 두었다. 그룹 2 의 2 마리의 새는 D5 때 알 수 없는 이유로 사망했다. 백신접종 후 21 일 후에 (D21 에), 그룹 3 으로부터의 10 마리의 새의 혈액을 혈청검사를 위해 수집했다; 그런 다음, 3 개의 그룹 전부에서부터의 모든 새들을 근육내 (IM) 경로로써 강독형 NDV Herts 33 균주로 챌린지하였다 (0.2 mL/새 중 105.0 EID50). 모든 새들을 챌린지 후 14 일 동안 임상적 징후에 대해 관찰했다. 새들이 죽지 않거나 또는 ND 임상적 징후를 보이지 않는다면 보호된 것으로 간주하였다.
보호 결과를 표 30 에 요약하였다. 그룹 1 로부터의 백신접종받지 않은 모든 새들은 챌린지 후 죽었다; 백신접종한 모든 새들은 보호되었다. vHVT310 구축물은 D21 때 샘플링된 모든 10 개의 G3-새 혈청에서 유의미한 항-NDV (ELISA (ID Screen 뉴캐슬병 간접 키트, ID-VET) 에 의한 평균 3.7 ± 0.3 (표준 편차) log10 및 HI 시험에 의한, 평균 3.9 ± 0.7 log2) 및 항-IBDV (ELISA (ProFLOK IBD Plus ELISA 키트, Zoetis) 에 의한 평균 3.7 log10 ± 0.2 log10) 항체를 유도했다.
표 30 강독형 NDV 균주로 D21 에 챌린지 후 브로일러 닭에서의 상이한 HVT-IBD+ND 이중 구축물에 의해 유도된 ND 효능
Figure pct00033
실시예 28 SPF 닭에서 D21 에 고전적인 IBDV 챌린지에 대항하는 vHVT309 및 vHVT310 에 의해 유도된 IBD 효능
본 연구의 목적은 D21 때 수행된 고전적인 IBDV 챌린지에 대항하는 1일령 SPF 닭에 투여된 IBDV VP2 유전자 및 NDV F 유전자를 발현하는 2 개의 HVT 재조합 구축물 (vHVT309 & vHVT310) 의 효능을 평가하는 것이다.
1일령 SPF 닭 (백색 레그혼종) 을 표 31 에 나타낸 바와 같이 3 개의 그룹으로 배정하였다. 그룹 2 & 3 으로부터의 모든 새들 (약 15 마리의 새/그룹) 을 2000 PFU 의 표적 용량에서의 vHVT309 (그룹 2) 또는 vHVT310 (그룹 3) 구축물 0.2 mL 로 피하 (SC) 경로로써 백신접종하였다. 그룹 1 로부터의 10 마리의 새들은 백신접종하지 않은 채 두었다. 그룹 2 에서 두 마리의 불명확한 조기 사망이 기록되었다. 백신접종 후 21 일 후에 (D21 에), 모든 새들을 안내 (IO) 경로로써 고전적인 52/70 Faragher IBDV 균주로 챌린지하였다 (0.05 mL/새 중 102.0 EID50). 챌린지 후 11 일 후 (D32 에), 모든 새들을 종결시켜 부검하여 총 점액낭 병변에 대해서 검사하였다. 점액낭 및 바디를 칭량하여 바디에 대한 점액낭 중량비를 산출하였다. 점액낭을 이어서 조직학을 위해 포름알데히드 중 보관하였다. 점액낭의 조직학적 병변을 표 32 에 제시된 규모에 따라 점수를 매겼다. 챌린지의 중증도는, (1) 챌린지 대조군의 적어도 50% 가 죽거나 또는 질병의 특징적인 징후, 특히 2 일 초과 동안 무감각/주름진 깃털 또는 탈진을 나타내는 경우, 및 (2) 살아남은 챌린지 대조군의 100% 가 파브리키우스낭 조직학 점수 ≥3 를 보이는 경우 입증되었다. 닭의 적어도 90% 가 보호된다면 백신 후보의 효능은 입증되었다. (1) 닭이 살아남고 질병의 주목할만한 임상적 징후를 보이지 않는다면, 특히 2일 초과 동안 무감각/주름진 깃털을 보이지 않거나 또는 탈진이 부재한 경우, 및 (2) 닭이 파브리키우스낭의 조직학 점수 <3 를 나타내는 경우, 닭은 보호된 것으로 간주되었다.
보호 결과를 표 31 에 나타낸다. 모든 대조군은 IBD 감염에 대해 양성이었다. 완전한 IBD 보호는 vHVT309 또는 vHVT310 로의 백신접종에 의해 유도되었다.
표 31 Faragher IBDV 균주로 D21 에 챌린지 후 SPF 닭에서 2 개의 유전자를 발현하는 2 개의 HVT 구축물에 의해 유도된 IBD 효능
Figure pct00034
표 32 파브리키우스낭* 의 조직학적 병변의 스코어링 규모
Figure pct00035
실시예 29 SPF 닭의 부화력에 대한 vHVT317 의 난 내 투여의 영향
본 연구의 목적은 난 내 경로에 의해 투여될 때 부화력에 대한 vHVT317 의 안전성을 평가하는 것이다.
결과는 실시예 23, 24, 25 및 26 에 기술된 것을 포함하는 여러 연구들로부터 데이터를 편집한 것이다. 인큐베이션 18-19 일에서의 발육 계란을 2000 또는 3000 PFU 의 표적 용량에서의 vHVT317 로, 또는 마렉병 백신 희석제로 접종하였다. 부화력 백분율은 각 그룹별로 평가하였다. 결과는 표 33 에 요약하였으며, 백신접종된 계란에서 우수한 수준의 부화력을 보였다.
표 33 vHVT317 의 난 내 투여 후 부화력
Figure pct00036
실시예 30 ILTV 챌린지에 대항하는 vHVT406 에 의해 유도된 ILT 효능
실시예 30.1 D28 에 ILTV 챌린지에 대항하는 vHVT406 에 의해 유도된 ILT 효능
본 연구의 목적은 ILT 챌린지에 대항하는 상업용 HVT-ILT 벡터화 백신 및 ILTV gD 유전자를 발현하는 vHVT406 재조합 구축물의 효능을 비교 및 평가하는 것이다.
열두 (12) 마리의 1일령 SPF 새를 각각의 그룹으로 배정했다. 그룹 1-2 에서의 새들을 새 당 0.2 ml 로 SQ 백신접종했다. 백신접종 후, 모든 새들을 그들의 각 유닛에 놓았다. 제 28 일에, 모든 새들을 감염성 후두기관염 바이러스 (ILT), ILT-93-3 EP2 로 기관내 (IT) 경로를 통해 챌린지하였다. 모든 새들을 챌린지로 인한 임상적 징후에 대해 챌린지 후 11 일 동안 관찰했다. 제 32 일에, 기관 및 결막 면봉표본을 남아 있는 모든 새들로부터 수집했다. 면봉표본을 q-PCR 분석을 위해 처리했다. 제 39 일에, 모든 남아 있는 새들을 종결시켰다.
결과를 하기 표 34 에 나타낸다. 그 결과는 vHVT406 로 백신접종된 모든 새들이 보호되었음을 나타냈다. 놀랍게도, 그 결과는 또한 vHVT406 그룹에서 상업용 제품 Innovax HVT-ILT 에 대해 사용돈 더 높은 용량 (10,340pfu/0.2ml) 에 비해 더 낮은 용량 (6,960pfu/0.2ml) 이 사용했을 때 양호한 보호 (100% 보호) 가 달성되었음을 나타냈다.
표 34 그룹별 ILT 에 대한 양성인 새의 마릿수 및 양성 백분율1
Figure pct00037
실시예 30.2 D21 에서 ILTV 챌린지에 대항하는 vHVT406 에 의해 유도된 ILT 효능
본 연구의 목표는 ILT 챌린지에 대항하는 vHVT406 및 2 개의 상업용 HVT-ILT 벡터화 백신의 효능을 평가 및 비교하는 것이다.
열두 (12) 마리의 1일령 SPF 새를 각 그룹에 배정하였다. 무작위화로 새들이 놓여진 단리 유닛을 배정하였다 (유닛 당 12 마리의 새, 그룹 당 한 유닛). 그룹 1-3 에서의 새는 새 당 0.2 ml 로 SQ 백신접종했다. 제 21 일에, 그룹 1-2 에서의 모든 새들을 감염성 후두기관염 바이러스 (ILT), ILT-96-3 EP2 로 기관내 (IT) 경로를 통해 챌린지하였다. 새들을 챌린지에 의한 임상적 징후에 대해 챌린지 후 11 일 동안 관찰했다. 제 25 일에, 기관 및 결막 면봉표본을 남아 있는 모든 새들에 대해 수집했다. 면봉 샘플을 q-PCR 을 위해 처리했다. 제 32 일에 남아 있는 모든 새들을 종결시켰다.
결과를 하기 표 35 에 나타낸다. 그 결과는 한 마리를 제외한 모든 vHVT406 백신접종한 새들은 보호되었음을 나타냈다. 놀랍게도, 그 결과는 또한 vHVT406 그룹에서, 동일한 보호 (91.7% 보호) 를 달성하기 위해 상업용 제품 Innovax HVT-ILT 에 사용된 더 높은 용량 (1590pfu/0.2ml) 에 비해 더 낮은 용량 (810pfu/0.2ml) 을 사용했을 때 양호한 보호 (91.7% 보호) 가 달성되었음을 나타낸다. 게다가, vHVT406 은 상업용 제품 Vectormune HVT-ILT (오직 75% 보호를 제공함) 보다 더 낮은 용량으로 이용시에 더 양호한 보호 (91.7%) 를 제공했다.
표 35 그룹별 ILT 에 대해 양성인 새의 마릿수 및 양성 백분율1
Figure pct00038
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본 발명의 바람직한 구현예에서 이와 같이 상세히 기술했지만, 상기 실시예에 의해 규정되는 본 발명은, 본 발명의 취지 또는 범주에서 이탈하지 않으면서 그의 많은 명백한 변형이 가능하기 때문에 상기 기술에서 제시된 특정 세부사항에 제한되지 않음을 이해해야 한다.
본원에서 언급되거나 참조된 모든 문헌 ("본원에서 언급된 문헌"), 및 본원에서 언급된 문헌에서 언급되거나 참조된 모든 문헌은, 본원에서 또는 본원에서 참조에 의해 포함된 임의의 문헌에서 언급된 임의의 제품에 대한 임의의 제조사의 지침, 설명, 제품 사양, 및 제품 설명서와 함께, 이로써 본원에 참조로 포함되며, 본 발명의 실시에 이용될 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Merial, Inc. Bublot, Michel Mebatsion, Teshome Prichard, Joyce Linz, Perry Kassa, Aemro <120> RECOMBINANT HVT VECTORS EXPRESSING MULTIPLE ANTIGENS OF AVIAN PATHOGENS AND USES THEREOF <130> MER 16-307 <150> 62/433,842 <151> 2016-12-14 <160> 27 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1359 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> DNA encoding IBDV VP2 <400> 1 atgacaaacc tgcaagatca aacccaacag attgttccgt tcatacggag ccttctgatg 60 ccaacaaccg gaccggcgtc cattccggac gacaccctgg agaagcacac tctcaggtca 120 gagacctcga cctacaattt gactgtgggg gacacagggt cagggctaat tgtctttttc 180 cctggattcc ctggctcaat tgtgggtgct cactacacac tgcagagcaa tgggaactac 240 aagttcgatc agatgctcct gactgcccag aacctaccgg ccagctacaa ctactgcaga 300 ctagtgagtc ggagtctcac agtgaggtca agcacactcc ctggtggcgt ttatgcacta 360 aacggcacca taaacgccgt gaccttccaa ggaagcctga gtgaactgac agatgttagc 420 tacaatgggt tgatgtctgc aacagccaac atcaacgaca aaattgggaa tgtcctggta 480 ggggaagggg tcactgtcct cagcctaccc acatcatatg atcttgggta tgtgaggctt 540 ggtgacccca ttcccgctat agggcttgac ccaaaaatgg tagctacatg cgacagcagt 600 gacaggccca gagtctacac cataactgca gccgatgatt accaattctc atcacagtac 660 caaccaggtg gggtaacaat cacactgttc tcagccaaca ttgatgctat cacaagcctc 720 agcattgggg gagagctcgt gtttcaaaca agcgtccaag gccttgtact gggcgccacc 780 atctacctta taggctttga tgggactgcg gtaatcacca gagctgtagc cgcagataat 840 gggctgacgg ccggcaccga caatcttatg ccattcaatc ttgtcattcc aaccaatgag 900 ataacccagc caatcacatc catcaaactg gagatagtga cctccaaaag tggtggtcag 960 gcaggggatc agatgtcatg gtcggcaagt gggagcctag cagtgacgat ccatggtggc 1020 aactatccag gggccctccg tcccgtcaca ctagtagcct acgaaagagt ggcaacagga 1080 tccgtcgtta cggtcgctgg ggtgagtaac ttcgagctga ttccaaatcc tgaactagca 1140 aagaacctgg ttacagaata cggccgattt gacccaggag ccatgaacta cacaaaattg 1200 atactgagtg agagggaccg tcttggcatc aagaccgtct ggccaacaag ggagtacact 1260 gattttcgtg agtacttcat ggaggtggcc gacctcaact ctcccctgaa gattgcagga 1320 gcatttggct tcaaagacat aatccgggct ataaggagg 1359 <210> 2 <211> 453 <212> PRT <213> artificial 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ggactgcatc 600 aagatcaccc agcaggtggg cgtggagctg aacctgtacc tgaccgagct gaccacagtg 660 ttcggccccc agatcacaag cccagccctg acacagctga ccatccaggc cctgtacaac 720 ctggctggcg gcaacatgga ctatctgctg acaaagctgg gaatcggcaa caaccagctg 780 tccagcctga tcggaagcgg cctgatcacc ggctacccca tcctgtacga cagccagaca 840 cagctgctgg gcatccaggt gaacctgccc agcgtgggca acctgaacaa catgcgcgcc 900 acctacctgg aaaccctgag cgtgtccacc accaagggct acgccagcgc cctggtgccc 960 aaggtggtga cacaggtggg cagcgtgatc gaggaactgg acaccagcta ctgcatcgag 1020 agcgacctgg acctgtactg caccagaatc gtgaccttcc caatgagccc cggcatctac 1080 agctgcctga gcggcaacac cagcgcctgc atgtacagca agaccgaagg cgcactgaca 1140 acaccctaca tggccctgaa gggaagcgtg atcgccaact gcaagatcac cacctgcaga 1200 tgcaccgacc ccccaggcat catcagccag aactacggcg aggccgtgag cctgatcgat 1260 cgccattcct gtaacgtgct gtccctggac ggcatcacac tgagactgag cggcgagttc 1320 gatgccacct accagaagaa catcagcatc ctggacagcc aggtgatcgt gaccggcaac 1380 ctggacatca gcaccgagct gggcaacgtg aataacagca tcagcaacgc cctggacaga 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cttgatatat caactgaact tggaaacgtc aacaattcaa tcagcaatgc cttggatagg 1440 ttggcagaaa gcaacagcaa gctagaaaaa gtcaatgtca gactaaccag cacatctgct 1500 ctcattacct atattgttct aactgtcatt tctctagttt tcggtgcact tagtctggtg 1560 ttagcgtgtt acctgatgta caaacagaag gcacaacaaa agaccttgct atggcttggg 1620 aataataccc tcgatcagat gagagccact acaagagca 1659 <210> 5 <211> 553 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> NDV-F VIId <400> 5 Met Gly Ser Lys Pro Ser Thr Arg Ile Pro Ala Pro Leu Met Leu Ile 1 5 10 15 Thr Arg Ile Met Leu Ile Leu Gly Cys Ile Arg Pro Thr Ser Ser Leu 20 25 30 Asp Gly Arg Pro Leu Ala Ala Ala Gly Ile Val Val Thr Gly Asp Lys 35 40 45 Ala Val Asn Val Tyr Thr Ser Ser Gln Thr Gly Ser Ile Ile Val Lys 50 55 60 Leu Leu Pro Asn Met Pro Arg Asp Lys Glu Ala Cys Ala Lys Ala Pro 65 70 75 80 Leu Glu Ala Tyr Asn Arg Thr Leu Thr Thr Leu Leu Thr Pro Leu Gly 85 90 95 Asp Ser Ile Arg Lys Ile Gln Gly Ser Val Ser Thr Ser Gly Gly Gly 100 105 110 Lys Gln Gly Arg Leu Ile Gly Ala Val Ile Gly Ser Val Ala Leu Gly 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ctttatccga tcgcagacac 1200 caatacacga cacgcggacg acgtatatcg gggatacgaa gatattctgc agcgctggaa 1260 taatttgctg aggaaaaaga atcctagcgc gccagaccct cgtccagata gcgtcccgca 1320 agaaattccc gctgtaacca agaaagcgga agggcgcacc ccggacgcag aaagcagcga 1380 aaagaaggcc cctccagaag actcggagga cgacatgcag gcagaggctt ctggagaaaa 1440 tcctgccgcc ctccccgaag acgacgaagt ccccgaggac accgagcacg atgatccaaa 1500 ctcggatcct gactattaca atgacatgcc cgccgtgatc ccggtggagg agactactaa 1560 aagttctaat gccgtctcca tgcccatatt cgcggcgttc gtagcctgcg cggtcgcgct 1620 cgtggggcta ctggtttgga gcatcgtaaa atgcgcgcgt agctaatcga gcctagaggc 1680 aataaaatat ctttattttc attacatctg tgtgttggtt ttttgtgtga atcgatagta 1740 ctaacatacg ctctccatca aaacaaaacg aaacaaaaca aactagcaaa ataggctgtc 1800 cccagtgcaa gtgcaggtgc cagaacattt ctct 1834 <210> 21 <211> 1659 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> Polynucleotide encoding NDV-F of genotype V, codon-optimized in pHVTIG1gDCaFopt (vHVT308) <400> 21 atgggcagca agcccagcac ctggatcagc gtgaccctga 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900 acctacctgg aaaccctgag cgtgtccacc accaagggct tcgccagcgc cctggtgccc 960 aaggtggtga cacaggtggg cagcgtgatc gaggaactgg acaccagcta ctgcatcgag 1020 agcgacatcg acctgtactg caccagagtg gtgaccttcc caatgagccc cggcatctac 1080 agctgcctga gcggcaacac cagcgcctgc atgtacagca agaccgaagg agcactgaca 1140 acaccctaca tggccctgaa gggaagcgtg atcgccaact gcaagatgac cacctgcaga 1200 tgcgccgacc ccccaggcat catcagccag aactacggcg aggccgtgag cctgatcgac 1260 aaacattcct gtagcgtgct gtccctggat ggcatcacac tgagactgag cggcgagttc 1320 gacgccacct accagaagaa catcagcatc ctggacagcc aggtgatcgt gaccggcaac 1380 ctggacatca gcaccgagct gggcaacgtg aacaacagca tcagcagcac cctggacaag 1440 ctggccgagt ccaacaacaa gctgaacaaa gtgaacgtga acctgaccag cacaagcgcc 1500 ctgatcacct acatcgtgct ggccatcgtg tccctggcct tcggcgtgat cagcctggtg 1560 ctggcctgct acctgatgta caagcagaga gcccagcaga aaaccctgct gtggctgggc 1620 aataacaccc tggaccagat gagggccacc accagaacc 1659 <210> 22 <211> 553 <212> PRT <213> artificial sequence <220> <223> NDV-F of genotype V (vHVT308) 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atcgtagatt acgacggtat tctggtcgat 240 ccctgtttct ccactttgaa taatagccac aaggggacat gtttcttcgt acgttaaata 300 aatgccgtct aagggtccgt gggaactgcc tataccttta ggttgagacg tgcacccgcg 360 tggatcctta cctagacggt caacgcgaca taaccgcacc tccccacaat ggaaaacaga 420 ggtgaatagt gtggttgcaa acacaagctc cctaatatat ttccaggcaa gtctct 476 <210> 24 <211> 476 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> HHV3gB promoter <400> 24 agagacttgc ctggaaatat attagggagc ttgtgtttgc aaccacacta ttcacctctg 60 ttttccattg tggggaggtg cggttatgtc gcgttgaccg tctaggtaag gatccacgcg 120 ggtgcacgtc tcaacctaaa ggtataggca gttcccacgg acccttagac ggcatttatt 180 taacgtacga agaaacatgt ccccttgtgg ctattattca aagtggagaa acagggatcg 240 accagaatac cgtcgtaatc tacgattcag acgttttttc tcttctatac accctaatgc 300 agcggctggc tccggattca acggacccgg cgttttcata acatccgtta cgggggtgtg 360 gttatgcttt ttatgcatat tttctttgtt tgttacggcg gttgtgtcgg tctctccaag 420 ctcgtttttt gagagtttac aagtagagcc cacacaatca gaagatataa cccggg 476 <210> 25 <211> 4347 <212> DNA <213> 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caatagggac 960 tttccattgg gttttgccca gtacaaaagg tcaatagggg gtgagtcaat gggtttttcc 1020 cattattggc acgtacataa ggtcaatagg ggtgagtcat tgggtttttc cagccaattt 1080 aattaaaacg ccatgtactt tcccaccatt gacgtcaatg ggctattgaa actaatgcaa 1140 cgtgaccttt aaacggtact ttcccatagc tgattaatgg gaaagtaccg ttctcgagcc 1200 aatacacgtc aatgggaagt gaaagggcag ccaaaacgta acaccgcccc ggttttcccc 1260 tggaaattcc atattggcac gcattctatt ggctgagctg cgttctacgt gggtataaga 1320 ggcgcgacca gcgtcggtac cgtcgcagtc ttcggtctga ccaccgtaga acgcagagct 1380 cctcgctgca ggcggccgca tgggctccaa accttctacc aggatcccag cacctctgat 1440 gctgatcacc cggattatgc tgatattggg ctgtatccgt ccgacaagct ctcttgacgg 1500 caggcctctt gcagctgcag gaattgtagt aacaggagat aaggcagtca atgtatacac 1560 ttcgtctcag acagggtcaa tcatagtcaa gttgctcccg aatatgccca gggataagga 1620 ggcgtgtgca aaagccccat tagaggcata taacagaaca ctgactactt tgctcactcc 1680 tcttggcgac tccatccgca agatccaagg gtctgtgtcc acatctggag gaggcaagca 1740 aggccgcctg ataggtgctg ttattggcag tgtagctctt ggggttgcaa cagcggcaca 1800 gataacagca gctgcggccc taatacaagc caaccagaat gccgccaaca tcctccggct 1860 taaggagagc attgctgcaa ccaatgaagc tgtgcatgaa gtcaccgacg gattatcaca 1920 actatcagtg gcagttggga agatgcagca gtttgtcaat gaccagttta ataatacggc 1980 gcgagaattg gactgtataa aaatcacaca acaggttggt gtagaactca acctatacct 2040 aactgaattg actacagtat tcgggccaca gatcacctcc cctgcattaa ctcagctgac 2100 catccaggca ctttataatt tagctggtgg caatatggat tacttattaa ctaagttagg 2160 tatagggaac aatcaactca gctcgttaat tggtagcggc ctgatcactg gttaccctat 2220 actgtatgac tcacagactc aactcttggg catacaagtg aatttaccct cagtcgggaa 2280 cttaaataat atgcgtgcca cctatttgga gaccttatct gtaagtacaa ccaaaggata 2340 tgcctcagca cttgtcccga aagtagtgac acaagtcggt tccgtgatag aagagcttga 2400 cacctcatac tgtatagagt ccgatctgga tttatattgt actagaatag tgacattccc 2460 catgtcccca ggtatttatt cctgtttgag cggcaacaca tcagcttgca tgtattcaaa 2520 gactgaaggc gcactcacta cgccgtatat ggcccttaaa ggctcagtta ttgccaattg 2580 taaaataaca acatgtagat gtacagaccc tcctggtatc atatcgcaaa attatggaga 2640 agctgtatcc ctgatagata gacattcgtg caatgtctta tcattagacg ggataactct 2700 aaggctcagt ggggaatttg atgcaactta tcaaaagaac atctcaatac tagattctca 2760 agtcatcgtg acaggcaatc ttgatatatc aactgaactt ggaaacgtca acaattcaat 2820 cagcaatgcc ttggataggt tggcagaaag caacagcaag ctagaaaaag tcaatgtcag 2880 actaaccagc acatctgctc tcattaccta tattgttcta actgtcattt ctctagtttt 2940 cggtgcactt agtctggtgt tagcgtgtta cctgatgtac aaacagaagg cacaacaaaa 3000 gaccttgcta tggcttggga ataataccct cgatcagatg agagccacta caagagcatg 3060 agcggccgcc cccccccccc ctaacgttac tggccgaagc cgcttggaat aaggccggtg 3120 tgcgtttgtc tatatgttat tttccaccat attgccgtct tttggcaatg tgagggcccg 3180 gaaacctggc cctgtcttct tgacgagcat tcctaggggt ctttcccctc tcgccaaagg 3240 aatgcaaggt ctgttgaatg tcgtgaagga agcagttcct ctggaagctt cttgaagaca 3300 aacaacgtct gtagcgaccc tttgcaggca gcggaacccc ccacctggcg acaggtgcct 3360 ctgcggccaa aagccacgtg tataagatac acctgcaaag gcggcacaac cccagtgcca 3420 cgttgtgagt tggatagttg tggaaagagt caaatggctc tcctcaagcg tattcaacaa 3480 ggggctgaag gatgcccaga aggtacccca ttgtatggga tctgatctgg ggcctcggtg 3540 cacatgcttt acatgtgttt agtcgaggtt aaaaaacgtc taggcccccc gaaccacggg 3600 gacgtggttt tcctttgaaa aacacgatga taataccatg caccgtcctc atctcagacg 3660 gcactcgcgt tactacgcga aaggagaggt gcttaacaaa cacatggatt gcggtggaaa 3720 acggtgctgc tcaggcgcag ctgtattcac tcttttctgg acttgtgtca ggattatgcg 3780 ggagcatatc tgctttgtac gcaacgctat ggaccgccat ttatttttga ggaatgcttt 3840 ttggactatc gtactgcttt cttccttcgc tagccagagc accgccgccg tcacgtacga 3900 ctacatttta ggccgtcgcg cgctcgacgc gctaaccata ccggcggttg gcccgtataa 3960 cagatacctc actagggtat caagaggctg cgacgttgtc gagctcaacc cgatttctaa 4020 cgtggacgac atgatatcgg cggccaaaga aaaagagaag gggggccctt tcgaggcctc 4080 cgtcgtctgg ttctacgtga ttaagggcga cgacggcgag gacaagtact gtccaatcta 4140 tagaaaagag tacagggaat gtggcgacgt acaactgcta tctgaatgcg ccgttcaatc 4200 tgcacagatg tgggcagtgg actatgttcc tagcaccctt gtatcgcgaa atggcgcggg 4260 actgactata ttctccccca ctgctgcgct ctctggccaa tacttgctga ccctgaaaat 4320 cgggagattt gcgcaaacag ctctcgtaac tctagaagtt aacgatcgct gtttaaagat 4380 cgggtcgcag cttaactttt taccgtcgaa atgctggaca acagaacagt atcagactgg 4440 atttcaaggc gaacaccttt atccgatcgc agacaccaat acacgacacg cggacgacgt 4500 atatcgggga tacgaagata ttctgcagcg ctggaataat ttgctgagga aaaagaatcc 4560 tagcgcgcca gaccctcgtc cagatagcgt cccgcaagaa attcccgctg taaccaagaa 4620 agcggaaggg cgcaccccgg acgcagaaag cagcgaaaag aaggcccctc cagaagactc 4680 ggaggacgac atgcaggcag aggcttctgg agaaaatcct gccgccctcc ccgaagacga 4740 cgaagtcccc gaggacaccg agcacgatga tccaaactcg gatcctgact attacaatga 4800 catgcccgcc gtgatcccgg tggaggagac tactaaaagt tctaatgccg tctccatgcc 4860 catattcgcg gcgttcgtag cctgcgcggt cgcgctcgtg gggctactgg tttggagcat 4920 cgtaaaatgc gcgcgtagct aagcggccgc ggggatccag acatgataag atacattgat 4980 gagtttggac aaaccacaac tagaatgcag tgaaaaaaat gctttatttg tgaaatttgt 5040 gatgctattg ctttatttgt aaccattata agctgcaata aacaagttaa caacaacaat 5100 tgcattcatt ttatgtttca ggttcagggg gaggtgtggg aggtttttt 5149 <210> 27 <211> 1857 <212> DNA <213> artificial sequence <220> <223> plasmid pHVTUS2SvgDwtsyn for vHVT406 <220> <221> SV40 promoter <222> (1)..(362) <220> <221> ILTV gD <222> (379)..(1683) <220> <221> Syn Poly A <222> (1695)..(1857) <400> 27 gagctcggta cagcttggct gtggaatgtg tgtcagttag ggtgtggaaa gtccccaggc 60 tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt agtcagcaac caggtgtgga 120 aagtccccag gctccccagc aggcagaagt atgcaaagca tgcatctcaa ttagtcagca 180 accatagtcc cgcccctaac tccgcccatc ccgcccctaa ctccgcccag ttccgcccat 240 tctccgcccc atggctgact aatttttttt atttatgcag aggccgaggc cgcctcggcc 300 tctgagctat tccagaagta gtgaggaggc ttttttggag gcctaggctt ttgcaaaaag 360 ctgcggccgg ccgccaccat gcaccgtcct catctcagac ggcactcgcg ttactacgcg 420 aaaggagagg tgcttaacaa acacatggat tgcggtggaa aacggtgctg ctcaggcgca 480 gctgtattca ctcttttctg gacttgtgtc aggattatgc gggagcatat ctgctttgta 540 cgcaacgcta tggaccgcca tttatttttg aggaatgctt tttggactat cgtactgctt 600 tcttccttcg ctagccagag caccgccgcc gtcacgtacg actacatttt aggccgtcgc 660 gcgctcgacg cgctaaccat accggcggtt ggcccgtata acagatacct cactagggta 720 tcaagaggct gcgacgttgt cgagctcaac ccgatttcta acgtggacga catgatatcg 780 gcggccaaag aaaaagagaa ggggggccct ttcgaggcct ccgtcgtctg gttctacgtg 840 attaagggcg acgacggcga ggacaagtac tgtccaatct atagaaaaga gtacagggaa 900 tgtggcgacg tacaactgct atctgaatgc gccgttcaat ctgcacagat gtgggcagtg 960 gactatgttc ctagcaccct tgtatcgcga aatggcgcgg gactgactat attctccccc 1020 actgctgcgc tctctggcca atacttgctg accctgaaaa tcgggagatt tgcgcaaaca 1080 gctctcgtaa ctctagaagt taacgatcgc tgtttaaaga tcgggtcgca gcttaacttt 1140 ttaccgtcga aatgctggac aacagaacag tatcagactg gatttcaagg cgaacacctt 1200 tatccgatcg cagacaccaa tacacgacac gcggacgacg tatatcgggg atacgaagat 1260 attctgcagc gctggaataa tttgctgagg aaaaagaatc ctagcgcgcc agaccctcgt 1320 ccagatagcg tcccgcaaga aattcccgct gtaaccaaga aagcggaagg gcgcaccccg 1380 gacgcagaaa gcagcgaaaa gaaggcccct ccagaagact cggaggacga catgcaggca 1440 gaggcttctg gagaaaatcc tgccgccctc cccgaagacg acgaagtccc cgaggacacc 1500 gagcacgatg atccaaactc ggatcctgac tattacaatg acatgcccgc cgtgatcccg 1560 gtggaggaga ctactaaaag ttctaatgcc gtctccatgc ccatattcgc ggcgttcgta 1620 gcctgcgcgg tcgcgctcgt ggggctactg gtttggagca tcgtaaaatg cgcgcgtagc 1680 taatcgagcc tagaggcaat aaaatatctt tattttcatt acatctgtgt gttggttttt 1740 tgtgtgaatc gatagtacta acatacgctc tccatcaaaa caaaacgaaa caaaacaaac 1800 tagcaaaata ggctgtcccc agtgcaagtg caggtgccag aacatttctc tctcgag 1857

Claims (27)

  1. 조류 병원체의 적어도 하나의 항원을 인코딩하는 적어도 하나 이상의 이종 폴리뉴클레오티드를 포함하는 하나 이상의 재조합 칠면조 헤르페스바이러스 (HVT) 벡터를 포함하는 조성물 또는 백신.
  2. 제 1 항에 있어서, HVT 벡터가 하기를 포함하는, 조성물 또는 백신:
    1) 2 개의 이종 폴리뉴클레오티드로서, 이때 제 1 의 폴리뉴클레오티드는 감염성 점액낭병 바이러스 (IBDV) VP2 항원, 감염성 후두기관염 바이러스 (ILTV) 당단백질 D (gD) 항원 및 뉴캐슬병 바이러스 F (NDV-F) 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 제 2 의 폴리뉴클레오티드는 감염성 점액낭병 바이러스 (IBDV) VP2 항원, 감염성 후두기관염 바이러스 (ILTV) 당단백질 D (gD) 항원 및 뉴캐슬병 바이러스 F (NDV-F) 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 2 개의 이종 폴리뉴클레오티드; 또는
    2) 감염성 점액낭병 바이러스 (IBDV) VP2 항원, 감염성 후두기관염 바이러스 (ILTV) 당단백질 D (gD) 항원 및 뉴캐슬병 바이러스 F (NDV-F) 항원으로 이루어진 군으로부터 선택되는 폴리펩티드를 인코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 감염성 점액낭병 바이러스 (IBDV) VP2 항원이 SEQ ID NO:2 에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 조성물 또는 백신.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서, 감염성 후두기관염 바이러스 (ILTV) 당단백질 D (gD) 항원이 SEQ ID NO:17 에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 조성물 또는 백신.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴캐슬병 바이러스 F (NDV-F) 항원이 SEQ ID NO:5 또는 22 에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 조성물 또는 백신.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서, 감염성 점액낭병 바이러스 (IBDV) VP2 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO:1 과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는, 조성물 또는 백신.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서, 감염성 후두기관염 바이러스 (ILTV) 당단백질 D (gD) 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO:16 과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는, 조성물 또는 백신.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴캐슬병 바이러스 F (NDV-F) 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO:3, 4 또는 21 과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는, 조성물 또는 백신.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 mCMV IE 프로모터, SV40 프로모터, HHV3gB 프로모터, 및 역향적 HHV3gB 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터와 작동적으로 연결된, 조성물 또는 백신.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서, 2 개의 이종 폴리뉴클레오티드가 IRES 또는 P2A 에 의해 연결된, 조성물 또는 백신.
  11. 제 1 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 폴리뉴클레오티드가 HVT 게놈의 IG1 유전자좌 및/또는 SORF-US2 유전자좌에 삽입된, 조성물 또는 백신.
  12. 제 1 항 내지 제 11 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 의 폴리뉴클레오티드가 5' 말단에서 mCMV IE 또는 SV40 프로모터에, 및 3' 말단에서 IRES 또는 P2A 에 작동적으로 연결된, 조성물 또는 백신.
  13. 제 1 항 내지 제 12 항 중 어느 한 항에 있어서, 약학적으로 또는 수의학적으로 허용가능한 담체, 부형제, 비히클 또는 아쥬번트를 추가로 포함하는, 조성물 또는 백신.
  14. 하기를 포함하는 재조합 HVT 벡터:
    1) 조류 병원체의 2 개의 항원을 인코딩하는 2 개의 이종 폴리뉴클레오티드로서, 이때 제 1 의 폴리뉴클레오티드는 감염성 점액낭병 바이러스 (IBDV) VP2 항원, 감염성 후두기관염 바이러스 (ILTV) 당단백질 D (gD) 항원 및 뉴캐슬병 바이러스 F (NDV-F) 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고, 제 2 의 폴리뉴클레오티드는 감염성 점액낭병 바이러스 (IBDV) VP2 항원, 감염성 후두기관염 바이러스 (ILTV) 당단백질 D (gD) 항원 및 뉴캐슬병 바이러스 F (NDV-F) 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는, 조류 병원체의 2 개의 항원을 인코딩하는 2 개의 이종 폴리뉴클레오티드; 또는
    2) 감염성 점액낭병 바이러스 (IBDV) VP2 항원, 감염성 후두기관염 바이러스 (ILTV) 당단백질 D (gD) 항원 및 뉴캐슬병 바이러스 F (NDV-F) 항원으로 이루어진 군으로부터 선택된 폴리펩티드를 인코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드.
  15. 제 14 항에 있어서, 감염성 점액낭병 바이러스 (IBDV) VP2 항원이 SEQ ID NO:2 에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 재조합 HVT 벡터.
  16. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서, 감염성 후두기관염 바이러스 (ILTV) 당단백질 D (gD) 항원이 SEQ ID NO:17 에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 재조합 HVT 벡터.
  17. 제 14 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴캐슬병 바이러스 F (NDV-F) 항원이 SEQ ID NO:5 또는 22 에 제시된 바와 같은 아미노산 서열과 적어도 80% 서열 동일성을 갖는, 재조합 HVT 벡터.
  18. 제 14 항 내지 제 17 항 중 어느 한 항에 있어서, 감염성 점액낭병 바이러스 (IBDV) VP2 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO:1 과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는, 재조합 HVT 벡터.
  19. 제 14 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서, 감염성 후두기관염 바이러스 (ILTV) 당단백질 D (gD) 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO:16 과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는, 재조합 HVT 벡터.
  20. 제 14 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서, 뉴캐슬병 바이러스 F (NDV-F) 항원을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO:3, 4 또는 21 과 적어도 70% 서열 동일성을 갖는, 재조합 HVT 벡터.
  21. 제 14 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 있어서, 폴리뉴클레오티드가 mCMV IE 프로모터, SV40 프로모터, HHV3gB 프로모터, 및 역향적 HHV3gB 프로모터로 이루어진 군으로부터 선택된 프로모터와 작동적으로 연결된, 재조합 HVT 벡터.
  22. 제 14 항 내지 제 21 항 중 어느 한 항에 있어서, 2 개의 이종 폴리뉴클레오티드가 IRES 또는 P2A 에 의해 연결된, 재조합 HVT 벡터.
  23. 제 14 항 내지 제 22 항 중 어느 한 항에 있어서, 이종 폴리뉴클레오티드가 HVT 게놈의 IG1 유전자좌 및/또는 SORF-US2 유전자좌에 삽입된, 재조합 HVT 벡터.
  24. 제 14 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 1 의 폴리뉴클레오티드가 5' 말단에서 mCMV IE 또는 SV40 프로모터에, 및 3' 말단에서 IRES 또는 P2A 에 작동적으로 연결된, 재조합 HVT 벡터.
  25. 제 1 항 내지 제 24 항 중 어느 한 항의 조성물 또는 벡터의 적어도 1 회 투여를 포함하는, 하나 이상의 조류 병원체에 대항하는 동물에서의 백신접종 방법, 또는 면역 또는 보호 반응의 유도 방법.
  26. 제 25 항에 있어서, 조류 병원체가 뉴캐슬병 바이러스 (NDV), 감염성 점액낭병 바이러스 (IBDV), 마렉병 바이러스 (MDV), 감염성 후두기관염 바이러스 (ILTV), 조류 뇌척수염 바이러스, 조류 레오바이러스, 조류 파라믹소바이러스, 조류 메타뉴모바이러스, 조류 인플루엔자 바이러스, 조류 아데노바이러스, 계두 바이러스, 조류 코로나바이러스, 조류 로타바이러스, 조류 파르보바이러스, 조류 아스트로바이러스 및 닭 빈혈 바이러스 콕시디아증 (에이머리아 종), 캄필로박터 종, 살모넬라 종, 마이코플라스마 갈리셉티쿰, 마이코플라스마 시노비애, 파스테우렐라 종, 아비박테리움 종, 대장균 및 클로스트리듐 종으로 이루어진 군으로부터 선택된, 백신접종 방법, 또는 면역 또는 보호 반응의 유도 방법.
  27. 제 25 항 또는 제 26 항에 있어서, 동물이 조류인, 백신접종 방법, 또는 면역 또는 보호 반응의 유도 방법.
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