CN1217027A

CN1217027A - 含外源dna的副痘病毒,其制备及其在疫苗中的应用

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Publication number: CN1217027A
Application number: CN97194139A
Authority: CN
Inventors: N·施梅尔; W·斯特鲁贝; M·比特纳; H·J·兹哈
Original assignee: Bayer AG
Current assignee: Bayer AG
Priority date: 1996-02-28
Filing date: 1997-02-17
Publication date: 1999-05-19
Also published as: DE59712852D1; NO983946L; BR9707785A; TR199801702T2; AU1725797A; NZ331556A; PL190401B1; US6365393B1; PL328870A1; IL125797A0; CA2247336A1; ATE364090T1; JP2000507092A; AU718141B2; WO1997032029A1; ES2287949T3; DK0886679T3; NO983946D0; CA2247336C; HUP9901035A2

Abstract

本发明涉及重组制备的副痘病毒,在其基因组中携带缺失或以外源遗传信息形式的插入片段,且含有遗传信息,本发明还涉及该构建体的制备及其在疫苗中的应用。

Description

含外源DNA的副痘病毒，其制备及其在疫苗中的应用

本发明涉及重组副痘病毒(Parapockenviren)，其制备及含有它们的疫苗和免疫调制剂。

基因重组改变的副痘病毒在其基因组中携带缺失和/或插入。副痘病毒基因组片段的缺失和/或外源DNA的插入可导致其致病性减小或丧失(减毒)。来自病原体或生物活性物质的遗传信息以插入方式掺入副痘病毒基因组中。这种外源遗传信息作为重组副痘病毒的组分在例如，细胞培养物，组织或在完整生物体中表达。

根据本发明制备的重组副痘病毒可加入到例如，疫苗或免疫调制剂中。外源DNA在副痘病毒基因组中的表达解除了在例如，接种的个体中对由外源遗传信息所递呈的病原体的防御反应。也可刺激接种的个体的非特异性抗性。(在下文中，术语副痘病毒简称为PPV)。

PPV本身可见有免疫调制效应，因此它们在生物体中刺激非病原体特异性免疫反应，因此，例如，副痘病毒的制品可成功地用于兽医学以增强普通抗性。

具有病原体特异性效应的疫苗根据抗原的不同需要几天到几周来形成保护，但它们此后会提供持续几个月到几年的长期保护。

因此，基于重组产生的副痘病毒制备的疫苗可用作生物学产品以提高对传染病的控制，因为它们在生物体中形成了持久的病原体特异性免疫并且也诱导迅速建立的非病原体特异性保护。

PPV免疫刺激特性与诱导同源和/或异源病原体特异性保护的外源抗原的表达组合是新的。它使得制备出的产品既介导针对感染迅速建立的，广谱的非病原体特异性保护，又提供对感染持久的，病原体特异性的保护。

脊椎动物副痘病毒科(Chordopoxvirinae)被划分成不同的，独立的属。本发明涉及PPV属，它与其余副痘病毒在结构上和遗传上均有区别。PPV被分成3个不同的种(文献1)：

-Parapoxvira ovis(也称接触性深脓疱病毒，接触性脓疱性皮炎病毒或口疮病毒)，它被认为是该属的原型。

-牛副痘病毒2(也称乳房痘病毒，副牛痘苗病毒，假牛痘病毒或挤奶者结节病病毒)。

从骆驼，红鹿，小羚羊，海豹和海狮分离的副痘病毒代表已被描述。这些病毒是否是副痘病毒属内的独立的一种或者它们是否是上述种的分离物，尚没有最终确定。

PPV感染在动物和人类中均可诱发局部疾病(人兽互传的病原体)。文献1提供了迄今已被描述的综合症的综述。诸如疫苗的预防措施可用于控制疾病。然而，至今可获得的及唯一根据Parapoxvirus ovis形成的疫苗的活性还不令人满意(文献2)。

本发明的目的是使用PPV作为表达外源遗传信息的载体。

已描述了以禽痘病毒，浣熊痘病毒，山羊痘病毒，猪痘病毒或牛痘病毒为基础的载体作为表达外源遗传信息的载体。在这一体系中获得的认识不能转用于PPV。正如比较研究所证实的，在痘病毒不同属之间存在形态，结构和遗传差异。因此，例如，血清学方法可用于区分PPV与其它痘病毒属，一个事实是血清学方法有助于区分蛋白质类型和区别与此相关的遗传信息。例如，痘病毒的一些代表具有凝集红细胞的能力。该活性为表面蛋白，即所谓的血细胞凝集素(HA)的方式所介导。PPV不具有该活性。

PPV基因组的组成知识通常局限于测定基因组的大小，核酸的GC含量，比较限制性酶分析，单个基因组片段的克隆，部分区域的序列分析及相关的，单个基因的初步描述(作为回顾，见文献1，文献5，文献6)。

使用在牛痘中已知的插入位点通常是不可能的，因为在PPV中要么缺少这些位点，要么未证实这些位点的存在。

与在正痘病毒属中的情况一样，在PPV基因组中鉴定胸苷激酶基因并用其作为插入位点的尝试没有成功。尽管Mazur及其同事(文献3)描述了PPV基因组片段的鉴定并声称它们类似于牛痘病毒(一种正痘病毒)的胸苷激酶基因，但我们自己的广泛研究尚不能证实在PPV中存在该基因。其它作者(文献1)也未能发现PPV中的胸苷激酶基因。HA基因用作牛痘病毒中外源DNA的插入位点。如上所述，PPV不具有该活性。

在1992年，Robinson和Lyttle提到在PPV基因组中具有可供选择的插入位点(文献1)，然而未提供对这些位点的描述或精确鉴定。而且迄今没有成功应用PPV作为载体的任何描述。

在我们自己对PPV病毒D1701株Hind Ⅲ片段I的序列的分析研究中，我们发现了一个与来自各种哺乳动物种类(例如，小鼠，大鼠，豚鼠，奶牛和人类)的血管肉皮生长因子(VEGF)具有氨基酸同源性(36.1至38.3％的相同性；52.8至58.6％的相似性，GCG,Wisconsin Package 8.1，例如，Programm Pikup)。Seq.ID.No:1显示了D1701中基因的核苷酸序列，而Seq.ID No:15显示了相应的D1701蛋白质的氨基酸序列。最近，已描述了在PPV病毒株NZ2和NZ7中同源基因(文献6)；然而，该基因的功能是未知的。其它痘病毒，例如，正痘病毒，不知道是有相应的基因。在下文中，该基因称为VEGF基因。

我们对D1701 Hind Ⅲ片段的序列分析导致鉴定了与正痘病毒蛋白质激酶基因(其在牛痘中称为F10L)具有同源性的另一ORF。与牛痘F10L基因的相同性是51％，而相似性是70％。在本申请的下文中，该基因称为PK基因。Seq.ID.No:2,No:9和No:13显示了D1701中基因的核苷酸序列的几种形式，而Seq.ID No:14显示了相应的D1701蛋白质的氨基的序列。

已发现了与PK基因的3′端和VEGF基因的5′端重叠的另一ORF。同源性研究显示与牛痘中的F9L基因具有较低的相同性(28％)和较低的相似性(51％)。Seq.ID No:15和No:10显示了D1701中的基因核苷酸序列。在下文中，该基因称为F9L基因。

在ITR区内发现另一ORF，由于其与PPV NZ2中基因的相似性(相同性76％，相似性83％)，被称为ORF3。Seq.ID No:4显示了D1701中的基因核苷酸序列。在下文中，该基因称为ORF3基因。本发明涉及：

1．具有插入和/或缺失的重组制备的PPV。

2．在对病毒复制为非必需的基因组片段中具有插入和/或缺失的重组制备的PPV。

3．在为病毒复制所必需的基因组片段中具有插入和/或缺失的重组制备的PPV。

4．在不表达的D1701 Hind Ⅲ片段I区域中含有插入和/或缺失的重组制备的PPV。

5．在表达的D1701 Hind Ⅲ片段I区域中含有插入和/或缺失的重组制备的PPV。

6．根据1至5的重组制备的PPV，其中插入和/或缺失位于D1701Hind Ⅲ片段I中或位于来自其它PPV的相应于该片段的DNA中。

7．在VEGF基因区域或毗邻该区域的区域中含有插入和/或缺失的重组制备的PPV。

8．在PK基因区域或毗邻该区域的区域中含有插入和/或缺失的重组制备的PPV。

9．在ITR片段的区域或毗邻该区域的区域中含有插入和/或缺失的重组制备的PPV。

10．在HD1R基因区域或毗邻该区域的区域中含有插入和/或缺失的重组制备的PPV。

11．在F9L基因区域或毗邻该区域的区域中含有插入和/或缺失的重组制备的PPV。

12．在编码10 KDa蛋白质的基因区域或其邻近区域含有插入和/或缺失的重组制备的PPV。

13．在编码10KDa蛋白质的基因位于其中的D1701 Eco RⅠ片段E的区域中含有插入和/或缺失的重组制备的PPV。

14．含有D1701 Hind Ⅲ片段I或其它PPV的相应于该片段的DNA的质粒。

15．一种质粒，它含有来自D1701的Hind Ⅲ片段I，且在该片段中，在为病毒复制所必需的区域中含有缺失和/或插入。

16．一种质粒，它含有来自D1701的Hind Ⅲ片段I，且在该片段中，在对病毒复制为非必需的区域中含有缺失和/或插入。

17．一种质粒，它含有来自D1701的Hind Ⅲ片段I，且在该片段中，在对病毒复制的非必需的且不表达的区域中含有缺失和/或插入。

18．一种质粒，它含有来自D1701的Hind Ⅲ片段I，且在该片段中，在对病毒繁殖的非必需的且位于表达的区域中含有缺失和/或插入。

19．一种质粒，它含有来自D1701的Hind Ⅲ片段I，且在该片段的VEGF基因中或其邻近区域含有缺失和/或插入。

20．一种质粒，它含有来自D1701的Hind Ⅲ片段I且在该片段的PK基因中或相邻于该基因含有缺失和/或插入。

21．一种质粒，它含有来自D1701的Hind Ⅲ片段I且在该片段的ITR片段中或与其相邻的片段含有缺失和/或插入。

22．一种质粒，它含有来自D1701的Hind Ⅲ片段I，该片段在HD1R基因和/或F9L基因中或与其相邻的区域中含有缺失和/或插入。

23．一种质粒，它含有来自D1701的Eco RⅠ片段E，该片段在编码10 KDa蛋白质的基因中或相邻于该基因含有缺失和/或插入。

24．一种质粒，它含有来自D1701的Hind Ⅲ片段I的一部分，其中存在根据14至23的缺失和/或插入。

25．根据14至24的质粒，其中来自D1701的DNA片段被相应于该片段的来自于其它PPV的DNA取代。

26．根据14至25的质粒，它含有完整的Hind Ⅲ片段I或只含有其一部分。

27．具有根据序列表ID No:8或No:12的序列的D1701Hind Ⅲ片段I或其部分或相应于该片段的来自其它PPV的片段。

28．D1701 Hind Ⅲ片段I的DNA片段或其部分，或相应于该片段的来自其它PPV的片段，或其部分，它编码根据序列表IDNo:1的VEGF蛋白质。

29．D1701 Hind Ⅲ片段I的DNA片段或其部分，或相应于该片段或其部分的来自其它PPV的片段，它编码根据序列表IDNo:2,No:9或No:13的PK蛋白质。

30．HD1R基因的DNA片段或其部分，具有根据PPV的序列表IDNo:3的序列。

31．F9L的DNA片段或其部分，具有根据PPV的序列表IDNo:5或ID No:10的序列。

32．ITR区域的DNA片段或其部分，具有根据PPV序列表IDNo:4的序列。

33．以根据27至32的DNA片段的序列为基础制备的基因产物。

34．根据1至13的重组制备的PPV，它含有作为插入的，编码来自其它病毒原体的致免疫成份的外源DNA。

35．根据1至13和34的重组制备的PPV，它含有作为插入片段的，编码细胞因子的外源DNA。

36．制备根据1至13,34和35的病毒的方法，其特征在于将根据14至26的质粒与PPV以已知的方式在细胞中重组并选择所需的病毒。

37．制备根据23的质粒的方法，其特征在于：

1．选择合适的PPV病毒株，

2．纯化其基因组，

3．用限制性酶处理纯化的基因组，

4．将所得的片段插入质粒中，

5．对含有编码10 KPa蛋白质的基因的质粒进行选择，且

6．如果合适，将插入片段和/或缺失导入编码10KDa蛋白质的基因中，

7．4(上文)中所述的片段如果合适，也可使用诸如聚合酶链式反应(PCR)或寡核苷酸合成的可供选择的方法来制备。

38．制备根据14至22和24至26的质粒的方法，其特征在于：

1．选择合适的PPV病毒株，

2．纯化其基因组，

3．用限制性酶处理纯化的基因组，

4．将所得的片段插入质粒，和

5．对含有Hind Ⅲ片段I或相应于该片段的片段或成份的质粒进行选择，

6．如果合适，可在所得的质粒的这些片段中导入插入和/或缺失。

7．4中所述的片段(上文)如果合适，也可使用诸如聚合酶链式反应(PCR)或寡核苷酸合成的可供选择的方法来制备。

39．制备编码10KDa蛋白质的D1701 Hind Ⅲ片段I或Eco RⅠ片段E，或相应于该片段或链段的来自其它PPV的区域或其部分的方法，其特征在于：

1．选择合适的PPV病毒株，

2．纯化其基因组，

3．用限制性酶处理纯化的基因组，

4．选择所需的片段或链段，或

5．如果合适，所得的基因组片段起初插入质粒中并分离含有所需

片段的质粒，然后繁殖这些质粒并从中分离所需的片段。

6．4中所述的片段(上文)如果合适，也可使用诸如PCR或寡核苷酸合成的可供选择的方法来制备。

40．制备根据33的基因产物的方法，其特征在于，将根据39可获得的片段转移进合适的表达系统中且使用这些系统表达基因。

41．根据1至13的重组制备的PPV在疫苗中的用途。

42．根据1至13的重组制备的PPV在免疫和刺激非病原体特异性免疫防御的产品中的用途。

43．重组制备的PPV在刺激非病原体特异性免疫防御的免疫调制剂中的应用。

44．重组制备的PPV在异源表达外源DNA中的应用。

45．重组制备的PPV作为外源DNA的载体的应用。

46．根据14至16的质粒在表达副痘特异性基因组片段中的应用。

47．根据14至26的质粒在制备诊断试剂中的应用。

48．根据27至32的基因组片段在制备诊断试剂中的应用。

49．根据序列表ID No:6的DNA片段(VEGF基因的启动子)。

50．根据49的DNA片段用作表达DNA的启动子。

上述PPV的基因组片段可插入质粒或病毒并且可作为自由DNA片段存在，它包括给出的DNA序列和其变异体和同源物。

上述备术语具有下列含义：

-减毒是指一种过程，其中由于改变了其基因组，PPV已变得对动物或人类具有较小的致病性或无致病性，或具有较小的毒性或无毒性。

-缺失是指从PPV基因组丢失的DNA片段。

-缺失质粒是指携带除了质粒DNA外，已去掉了一些片段的PPV基因组片段的质粒。

-对病毒繁殖所必需(必要)的基因组片段是对PPV体外繁殖所必需的整个PPV基因组的一部分，即是对形成感染性病毒后代所必需的。

对病毒复制所必需的基因的干扰导致病毒复制被打断。例如，如果去掉这些基因之一的部分或该完整的基因之一，病毒复制在病毒复制周期的某些位点终止。用具有该特性的突变体感染或处理不会导致从动物释放感染性后代。如果必需基因的部分或整个必需基因被外源DNA取代，或者如果外源DNA被插入必需基因中，则可构建在接种个体中不能繁殖且因此不能作为感染性病原体分泌的载体疫苗。

-为病毒复制所不需要(非必需)的基因组片段是：

对于PPV的体外复制，即对于形成感染性病毒后代可省却的整个PPV基因组的一部分。

-外源性DNA元件(外源DNA)是：

DNA片段，例如外源性基因或核苷酸序列，它原先在根据本发明所用的PPV中不存在。

为下列原因将外源性DNA插入PPV中：

1．为表达外源性DNA

2．为使部分PPV DNA的功能失活

3．为标记PPV。

根据这些原因而插入不同的外源性DNA。如果是根据(1)，表达外源性DNA，那么插入的外源性DNA至少携带一个编码一个或多个所需外源蛋白质的开放阅读框。如果合适，外源DNA另外可含有其自身的或外源调节序列。经过在病毒基因组中产生缺失可增加接纳外源DNA的容量。一般来说，长度为1个核苷酸至35000个核苷酸，优选100至大约15,000个核苷酸。

因提及的例子是来自诸如下列病毒的基因，或基因的一部分：

猪疱疹病毒1，

马疱疹病毒，

牛疱疹病毒，

口蹄疫病毒，

牛呼吸道合胞病毒，

牛副流感病毒3，

流感病毒

杯状病毒，

黄病毒，例如，牛腹泻病毒或经典猪瘟病毒。

或细菌，如：

巴斯德氏属种类，

沙门氏菌属种类，

放线芽孢杆菌属种类，

衣原体种类，

或寄生虫，如，

弓形虫，

恶丝虫，

棘球属。

如果是根据(2)插入外源性DNA，合适的外源性核苷酸的插入基本上足以打断载体病毒的DNA序列。用于插入失活的外源DNA的最大长度取决于载体病毒提纳外源DNA的容量。一般来说，外源DNA的长度是1个核苷酸至35,000个核苷酸之间，优选100至15,000个核苷酸之间，特别优选3至100个核苷酸之间。

如果根据(3)插入DNA序列用于标记，其长度取决于用于鉴定标记病毒的检测方法。一般来说，外源DNA的长度是1至25000个核苷酸，优选20个核苷酸至15,000个核苷酸，特别优选5至100个核苷酸。

-基因文库是包含在能复制的载体中的基因组片段的全体。经过将基因组片段化并将所有的片段，一些片段或大部分片段插入能复制的载体，例如质粒中来获得该文库。

-基因组片段是能以分离的形式存在或能插入可复制的载体中的基因组片段。

-插入失活是指插入的外源DNA阻碍了天然PPV基因组序列表达或发挥功能。

-插入是指另外的DNA片段参入PPV基因组。根据插入基因，DNA片段的长度可以是1个核苷酸至几千核苷酸(也见“外源DNA”的定义)。

-插入质粒是含有两侧为PPV DNA序列的待插入的外源DNA的质粒，特别是细菌质粒。

-插入位点是病毒基因组中适于接受外源DNA的位点。

-克隆是指PPV基因组DNA的分离及片段化。然后将片段或选择的片段插入常规DNA载体(细菌质粒或唯菌体或真核载体)中。

文献#11提供了选择用于制备和克隆DNA片段的方法。使用含有PPV DNA片段作为插入片段的DNA载体，例如，用于制备最初分离的PPV DNA片段的相同拷贝。

-经插入标记是指插入的外源性DNA使得能随后鉴定修饰的PPV。

-ORF(开放阅读框)理解为限定潜在蛋白质的氨基酸序列的DNA水平上的核苷酸的顺序。它由许多核苷酸三联体组成，在5′端由起始密码于(ATG),3′端由终止密码子(TAG,TGA或TAA)限定边界，三联体的数目由其所限定的蛋白质的大小来确定。

-调节序列是对基因表达产生影响的DNA序列。具有这一特性的序列从文献15可知。

优选的是序列表ID.No:6所述的VEGF启动子。

-重组PPV是在其基因组中具有插入和/或缺失的PPV。在这点上，使用分子生物学方法制备插入和缺失。

-重复(DNA)序列是在PPV基因组中出现的相同核苷酸序列，它们直接一个接着一个存在或分散在不同的位点。

-载体病毒是PPV，它适合于插入外源DNA且可将在其基因组中的插入的外源DNA运送到感染的细胞或生物体中，如果合适，它能使外源DNA表达。

根据1至12(上文)的新PPV制备如下：

1．选择合适的PPV病毒株。

2．鉴定具有插入位点的PPV基因组中的基因组片段。

2.a．鉴定对病毒复制非必需的基因中具有插入位点的PPV基因组片段，

2.b．鉴定在对病毒复制必需的基因中具有插入位点的PPV基因组片段，

2.c．鉴定在PPV基因组和/或基因复制的基因之外的区域中的具有插入位点的基因组片段，

2.d．用于鉴定具有插入位点的基因组片段的其它方法，

2.e．在插入位点的要求，

2.1．插入位点的鉴定

2.1.1．PPV基因组的纯化

2.1.2．克隆基因组片段和建立基因文库

2.1.3．测序以鉴定基因或基因外的基因组片段

2.1.4．选择含有PPV基因组片段的克隆用于进一步处理

2.2．ITR区域，VEGF基因，PK基因，编码10KDa蛋白质的基因，PK基因和HDIR基因间的区域作为插入位点

2.2.1．克隆VEGF基因

2.2.2．克隆蛋白质激酶基因

2.2.3．克隆编码10KDa蛋白质的基因区域

2.2.4．克隆ITR区域(颠倒末端重复区)或位于PK基因和HDIR基因间的基因组片段

3．构建含有待插入的外源DNA的插入质粒或缺失质粒

3.1．鉴定或制备在克隆的基因组片段中只出现一次的限制性酶识别位点，即，单一限制性位点和插入外源DNA

3.2．在克隆的基因组片段中缺失基因组序列，和插入外源DNA。

3.3．组合#3.1和#3.2

4．构建根据1至12(上文)和重组PPV。1．选择合适的PPV病毒株

原则上，所有PPV各类均适合于完成本发明。优选的病毒株能在组织培养物中繁殖到滴度＞10⁵PFV(噬斑形成单位)/ml且能从感染的细胞的培养基中作为细胞外的感染病毒的纯化形式制备。可提及的作为优选的来自PPV属两种类是PPV ovis(口疮病毒)。

可提及的作为特别优选的PPV ovis病毒株是D1701及其变异体和突变体，D1701根据布达佩斯条约于1988年4月28日以登记号CNCMI-751保藏在巴斯德研究所，C.N.C.M。

在诸如哺乳动物细胞的动物细胞组织培养物以常规方式繁殖病毒，例如，在羊细胞或牛细胞中，优选在中细胞，如永生性牛肾细胞系BK-K1-3A(或其后代)或猴细胞，如永生性猴肾细胞MA104或Vero(或其后代)。

以已知的方式在静止，旋转或载体培养物中以致密细胞凝聚体的形式或在悬浮培养物中实现繁殖。

用于繁殖病毒的细胞或细胞层以常规方式繁殖到基本上汇合或达到最佳细胞密度。用相应于MOI(=感染复数，相应于每个细胞的感染病毒颗粒)的病毒稀释物感染细胞。

加入或不加动物血清繁殖病毒。当使用血清时，以1-30vol％，优选1-10vol％的浓度加入到繁殖培养基中。

在室温至40℃，优选32至39℃，特别优选在37℃的温度下经过几天，优选直到感染的细胞完全被破坏来实现感染和病毒繁殖。收获病毒时，仍与细胞结合的病毒可另外经机械方法或借助于超声处理或借助于温和的酶蛋白水解，例如胰蛋白酶来释放。

然后，经过例如，使用孔经为例如0.2-0.45μm进行过滤和/或低速离心去掉细胞碎片来进一步处理来自感染细胞的含病毒的培养基。

滤液离心上清可用于病毒的富集和纯化。为此，可对滤液或上清进行高速离心直到病毒颗粒沉淀。如果合适，例如可借助于在密度梯度中离心进行进一步的纯化步骤。2．鉴定在PPV基因组中具有插入位点的基因组片段

插入外源DNA时，PPV基因组的各种区域可用作插入位点。外源DNA可插入：

a．对体外和/或体内的病毒繁殖为非必需的基因中，

b．对病毒繁殖必需的基因中，和/或

c．不具有任何基因功能的区域中。

2.a．鉴定在对病毒繁殖非必需的基因中具有插入位点的PPV基因的基因组片段

ⅰ．例如，使用不同PPV种类的代表借助于进行比较研究发现对病毒繁殖非必需的病毒基因。在一种或多种PPV种类分离株或病毒株中不出现而在其它分离株或病毒株中发现的基因很可能是非必需的。

ⅱ．病毒复制非必须的基因也可用另一方式来鉴定。测序PPV基因组片段后，其中该片段可能是，例如，作为克隆片段存在，检查这些DNA序列可能的“开放阅读框”(ORF)。如果发现一个ORF，经过进行转录和/或翻译证实该ORF作为一个基因的功能。为了确定已发现的基因是否对病毒复制为非必须的，可使用分子遗传学方法从PPV基因组中去掉该基因，或借助于导入一处或多处突变而部分破坏它或打断它，然后考察所得的病毒的复制能力。如果即使不存在所加工的基因，病毒也能复制，则该基因是非必需基因。鉴定的插入位点的例子：

ⅰ．PPV ovis的VEGF基因是可提及的用作外源DNA插入位点的非必需PPV基因的一个例子。

该基因在已研究的(文献6)Parapoxvirus:ovis病毒株(NZ-2,NZ-7和D1701)中发现。在某些PPV病毒株，例如牛PPV1的代表株中尚未发现该VEGF基因。借助于序列表ID No:1中所示的DNA序列可鉴定在含VEGF基因的PPV基因组中的该区域。可使用分子生物学的常规方法借助于杂交实验，基因组序列分析和/或聚合酶链式反应发现PPV基因组中的该基因。

ⅱ．编码10KDa PPV蛋白的基因是可提及的另一潜在的非必需PPV基因的例子。该基因在Parapoxvirus ovis(NZ-2,NZ-7和D1701)病毒株中发现。可使用常规分子生物学方法鉴定PPV基因组中含10 KDa蛋白南的区域，例如，借助于聚合酶链式反应(PCR)。文献8给出了10KDa蛋白质基因的DNA序列。可用于PCR的引物在，例如文献#8中限定。序列表ID No:11显示了来自D1701的10KDa-特异性PCR产物的DNA序列。

为达到插入外源DNA的目的，可从PPV基因组中部分或全部去掉非必需基因。但是，也可不去掉PPV基因的任何区域而将外源DNA插入非必需基因中。可用例如限制性酶识别位点作为插入位点。

2.b．鉴定在PPV基因组中在必需基因中具有插入位点的PPV基因组片段

ⅰ．经过测序病毒基因组片段，例如可作为克隆片段存在的片段可鉴定必需基因，然后鉴定可能的ORF。

如果发现ORF，经过进行转录和/或翻译证实其作为基因的功能。为了确定已发现的基因是否对病毒复制是必需的，可使用分子遗传学方法破坏PPV基因组中的该基因，例如经过去掉部分基因，或整个基因、或借助于插入外源DNA，然后考查所得的病毒的繁殖能力。如果所得的病毒突变体不能复制，则该基因很可能是必需基因。

如果该病毒突变体仅能在互补细胞系上生长，那么这就证实了该基因是必需的。

插入位点的例子：

PPV D 1701的蛋白质激酶基因(PK基因)是可提及的一个例子。PK基因在病毒的繁殖循环中表达较晚。序列表ID No:2,No:9或No:13所示的DNA序列形式可用于鉴定PPV基因组的PK基因的区域，例如，借助于杂交实验，基因组序列分析和/或聚合酶链式反应。

为了达到插入外源DNA的目的，可从PPV基因组中部分或全部去掉该必需的基因。然而，也可不去掉该PPV基因的区域而将外源DNA插入必需基因中。

2.c．鉴定PPV基因组中在基因外的区域和/或在基因重复区内具有插入位点的基因组片段

不编码功能性基因产物且不具有任何必需调节功能的基因组片段(所谓的基因内片段)原则上适合于用作外源DNA的插入位点。含重复序列的区域特别合适，因为部分区域的改变可由剩余的序列重复来补偿。存在2个或多个拷贝的基因，也称基因重复也归入这一类。

在ITR区域或在PPV基因组的重复片段中的基因在病毒基因组中存在2个拷贝。去掉或改变该基因的一个拷贝并插入外源DNA后，即使这一改变的基因对病毒复制是重要的，也可获得稳定的PPV重组体。第二个，即未改变的基因拷贝可能对于发挥该基因的功能是足够的。

ⅰ．对PPV基因组的序列分析用于鉴定不编码基因产物的基因组序列。序列分析后显示出不是ORF或不显示病毒特异性转录且不具有任何调节功能的基因组区域存在潜在的插入位点。具体地说，在这些区域中的限制性酶裂解位点代表潜在的插入位点。为了检查是否存在合适的插入位点，可用已知的分子生物学方法将外源DNA插入潜在的插入位点，然后考察所得的病毒突变体的存活力。如果在可能的插入位点携带外源DNA的病毒突变体能繁殖，则所考虑的位点是合适的插入位点。

ⅱ．使用DNA杂交实验和/或序列分析鉴定重复序列和重复基因。在杂交实验中，来自PPV的克隆或分离的基因组片段用作与PPV DNA片段杂交的探针。与总PPV基因组中一个以上的片段杂交的PPV基因组片段含有一个或多个重复序列。为了将重复序列或重复基因组区域精确定位到基因组片段上，测定该片段的核苷酸序列。为了确定潜在的插入位点是否是整个PPV基因组中合适的插入位点，必须将外源性DNA插入重复序列或重复基因的一个拷贝中且含有插入片段的PPV基因组片段必须掺入病毒基因组中。然后检查含外源DNA的重组病毒繁殖的能力。如果重组病毒繁殖，则所鉴定的识别位点适合于作为插入位点。插入位点的例子

ⅰ．蛋白质激酶基因和HD1R基因之间的基因组片段(序列表IDNo:7)是可提及的基因间区域的一个例子。

ⅱ．ITR区域(序列表ID No:4)是可提及的重复序列的一个例子。

ⅲ．潜在的基因“ORF3”(在ITR区域中)和VEGF基因是可提及的PPV病毒株D1701中重复基因的例子。杂交研究证实含VEGF基因的区域已在病毒株D1701中复制并易位到病毒基因组的另一端，因此存在2个拷贝的VEGF基因。

借助于序列表ID No:4(具有“ORF3”基因的ITR序列)和ID No:7(PK和HD1R基因之间的区域)的序列，可使用常规分子生物学方法，如杂交实验，基因组序列分析和/或聚合酶链式反应找到其它PPV中相应的基因组区域。

2.d．鉴定插入位点的其它方法

一般来说，对病毒基因组序列的修饰也可用于发现PPV基因组中可能的插入位点。不阻断病毒繁殖的核苷酸取代，缺失和/或插入，或其组合的基因组位点构成可能的插入位点。为了检查潜在的插入位点是否是合适的插入位点，可使用已知的分子生物学方法将外源DNA插入潜在的插入位点并考察所得的病毒突变体的活力。如果病毒重组体能复制，则所考察的位点是合适的插入位点。

2.1．插入位点的鉴定

2.1.1．PPV基因组的纯化

为达到以分子遗传学方法克隆PPV插入位点的目的，首先要纯化PPV基因组。从根据1(上文)制备的病毒分离基因组，然后纯化。优选经过用去污剂和蛋白酶的水溶液处理纯化的病毒粒子来提取天然病毒DNA。

可提及的去污剂是阴离子，阳离子，两性和非离子去污剂。优选使用离子去污剂。特别优选十二烷基磺酸钠(月桂烷基磺酸钠)。

可提及的蛋白酶是在去污剂存在下具有功能的所有蛋白酶，如蛋白酶K和链霉素蛋白酶。优选可提及的是蛋白酶K。

采用的去污剂浓度为0.1-10vol％，优选0.5-3vol％。

采用的蛋白酶浓度为0.01-10mg/ml病毒裂解产物，优选0.05-0.5mg/ml病毒裂解产物。

优选在DNase抑制剂存在的条件下在水缓冲溶液中进行反应。可提及的缓冲物质是：具强碱性的弱酸盐，例如，三(羟甲基)氨基甲烷，具有弱碱性的强酸盐，例如，磷酸二氢盐或其混合物。

下面的缓冲液系统是优选可提及的：

三(羟甲基)氨基甲烷。

采用的缓冲物质或缓冲系统浓度应保证pH值为DNA不变性的pH值。优选pH值为5-9，特别优选6-8.5的pH值，更特别的是优选7-8的pH值；具体可提及的是在中性范围下操作。

DNase抑制剂的例子是0.1-10mM(毫摩尔)浓度的乙二胺四乙酸，优选大约1mM。

此后，提取病毒裂解物的亲脂成份。诸如酚，氯仿，异戊醇或其混合物的溶剂用作提取剂。优选开始使用酚和氯仿/异戊醇的混合物，提取在一步或多步中进行。

分离病毒DNA的其它方法的例子是在CsCl密度梯度中离心病毒裂解物或凝胶电泳(见文献14)。

核酸的提取在文献13中描述。

以这种方式提取的DNA优选用，例如醇从水溶液中沉淀，优选用乙醇或异丙醇，并在加入单价盐，如碱金属氯化物或乙酸盐，优选氯化锂，氯化钠或乙酸钠或乙酸钾(见具体位置引用的文献)的条件下进行。

2.1.2．基因组片段的克隆：

现在以这种方式纯化的病毒DNA用于制备DNA片段。为此，例如，用限制性酶处理病毒DNA。合适的限制性酶的例子是Eco.RⅠ,BamHⅠ,Hind Ⅲ,和KpnⅠ。另外，可借助于聚合酶链式反应(PCR)合成基因组片段。为此，从已知的病毒基因组序列片段选择引物，并用例如，Taq聚合酶或Pfu聚合酶体外合成以引物对确定边界的基因组片段。

限制性消化或PCR所得的DNA片段可用(Sambrock 89)所述的方法克隆进载体系统。例如，根据在各种情况下待克隆的DNA片段的大小，可获得为达到该目的的质粒载体，λ噬菌体载体或粘粒载体。

2.1.3．测序，鉴定并表征基因，以及证实其表达

首先经测序分析克隆进载体中的基因组片段。使用不同的限制性酶测插入的DNA片段的图谱并将合适的亚片段克隆进质粒载体中。例如，使用Pharmacia提供的T7测序试剂盒根据厂家说明实现测序反应。为此所需的双链质粒DNA优选使用PEG方法(Hattori和Sakaki1985)制备。借助于计算机分析(GCG，见上文)鉴定了基因组片段中存在的“开放阅读框(ORF)”。鉴定的ORF各自的功能信息可借助于比较其序列与数据库中所含的已知功能的其它基因序列来获得。鉴定的ORF经过检测其在病毒感染的细胞中各自相应的转录子来进行功能性表征，为此，例如，将AGPC方法(Chomczynski和Sacchi,(20)1987)用于从病毒感染的细胞分离总RNA。然后借助于Northern印迹分析或引物延伸及RNA保护实验鉴定特异性转录子和其5′和3′端。作为选择，可表达由体外鉴定的ORF编码的病毒蛋白质，然后使用表达产物获得抗血清并使用这些抗血清证实ORF的表达。

为了确定所发现的基因对病毒繁殖是否是非必需的，可借助于基因破坏或基因缺失破坏该基因。在本发明书中，从PPV基因组中去掉完整的基因或其部分或经过插入外源基因序列打断基因的阅读框。检查所得的病毒的繁殖能力。如果即使不存在被破坏的基因病毒也能复制，那么该基因是非必需基因。

2.1.4．选择含PPV基因组片段的克隆

根据待制备的重组PPV是(ⅰ)能够复制还是(ⅱ)具有复制缺陷来采用哪一种上述含PPV基因组片段的克隆。

ⅰ．如果待制备的重组PPV不管是插入和/或缺失的PPV均有复制能力，将对为病毒复制所非必需或含重复基因的基因或基因外的基因组区域的克隆的病毒基因组片段进行进一步加工。

使用病毒突变体试验待处理的基因或基因组区域是否是病毒基因组的必需区域或重复基因。为此，使用分子生物学方法失活被考察的PPV中的基因或基因组区域，例如，经过部分或完全缺失所述区域，检查病毒突变体的繁殖能力。如果不管所述基因或基因组区域是否被失活病毒突变体均能繁殖，则所考察的基因或基因组区域是非必需区域。

优选提供含非必需基因完整形成的PPV的克隆的基因片段。此外，还应提供基因或基因组区域两端的侧翼病毒基因组区域。侧翼区域的长度应超过100个碱基对。如果该基因组克隆不可获得，则可借助于分子生物学方法从现有基因克隆制备它们。如果克隆的基因组片段还含有该制品所不需要的基因组区域，则可借助于亚克隆去掉这些区域。

ⅱ．如果待制备的重组PPV由于插入和/或缺失而丧失了形成感染后代的能力，则可对为病毒繁殖所必需的含基因或基因外基因组区域的克隆的病毒基因组片段进行进一步加工。

病毒重组体可用于试验待处理的基因或基因组区域是否是病毒基因组的必需区域。为此，使用分子生物学方法灭活所考察的PPV中的基因或基因组区域。例如，经过部分或完全缺失所述区域，检查病毒突变体繁殖的能力。如果由于灭活了所述基因或基因组区域而使病毒突变体不能繁殖，则所研究的基因或基因组区域是必需区域。

优选提供含必需基因完整形式的PPV的克隆的基因组片段。此外，在基因或基因组区域的两端同样应提供侧翼病毒基因组区域。侧翼区域的长度超过100个碱基对。如果该基因组可获得，则可借助于分子生物学方法从现存基因组克隆来制备它们。如果克隆的基因组片段含该制品所不需要的其它基因组区域，则这些区域可借助于亚克隆来去掉。

2.2．ITR区域，VEGF基因，PK基因，编码10KDa蛋白质的基因和PK基因与HD1R基因之间的区域作为插入位点

如果ITR区域，VEGF基因，PK基因，编码10KDa蛋白质的基因或PK基因与HD1R基因之间的基因间区域用作PPV中的插入位点，则必须分离含有该插入位点的PPV基因组的相应区域。为此，克隆了PPV基因组的相应区域。

2.2.1．克隆VEGF基因

编码VEGF的基因位于PPV基因组上，部分或与其侧翼组片段一起完整地分离该基因。为此，优选按照#1繁殖PPV且按照#2.1.1．纯化基因组。

a．优选借助于聚合酶链式反应(PCR)扩增VEGF基因。为该反应所必需的起始序列(引物)来自序列表ID No:1所述的VEGF基因的DNA序列。然后优选克隆所得的扩增产物。

b．含VEGF基因及其侧翼基因组片段的区域优选经过将PPV基因组片段化并分离和克隆相应的基因组片段来获得。为此，按#2.1.2所述裂解病毒的纯化基因组，优选使用限制性酶HindⅢ。酶消化后获得的基因组片段优选借助于电泳或色谱方法分离以鉴定携带VEGF基因的其侧翼基因组片段的基因组片段。

使用下列文献所述的标准方法进行琼脂糖或聚丙烯酰胺中的电泳分离：

-分子生物学常规方法，1987-1988,Wiley-Interscience,1987。

-分子克隆实践指南，Perbal，第二版，Wiley Interscience,1988。

-分子克隆，loc.cit.

-Virologiche ArbeitsmethodenⅠ病毒学实践方法，第Ⅲ卷，Custav Fischer Verlag,1989。

携带VEGF基因及其侧翼序列的基因组片段，例如，借助于与确定的核酸探针杂交来鉴定。为此，将分离的基因组片段转移到滤纸上并按照Southern印迹方法与VEGF-特异性的标记的核酸探针杂交。转移基因组片段并杂交的方法可按标准方法，如在分子克隆loc.cit.的“Southern印迹”中所述。可用作探针的寡核苷酸或核酸片段可来自序列表Sep.ID No:1。例如，可借助于Seq.ID.No:1鉴定的Taq Ⅰ亚片段(366 bp)用作杂交探针。

分离并克隆已证实含部分或优选含完整的VEGF基因及侧翼基因组片段的基因组片段。合适的基因组片段经电泳分离，例如，借助于电洗胶或经过使用低熔点琼脂方法从合适的凝胶区域分离。

为了克隆VEGF基因，将上面制备的基因组片段插入细菌或真核载体中。开始特别优选质粒或噬菌体载体。为了插入基因组片段，用限制性酶处理双链质粒或噬菌体载体DNA分子以产生用于插入的合适的末端。

已知的质粒，例如pBR 322及其衍生物，例如pSPT 18/19,pAT153,pACYC184,pUC18119和pSP64165用作质粒。

λ噬菌体的已知变异体，如噬菌体λZAP和噬菌体λgt10/11或噬菌体M13mp18/19，例如，用作噬菌体载体。

可使用的限制性酶是已知的，例如，来自基因，92卷，(1989)Elsevier Sciencl Publishers BV Amsterdam。

已用限制性酶处理的质粒或噬菌体载体与待插入的过剩的DNA片段混合，例如，以大约5∶1的比例混合，此后，用DNA连接酶处理混合物以便将该片段连接到载体上。为了繁殖质粒或噬菌体，将连接混合物导入原核或真核细胞，优选导入细菌(例如，大肠杆菌菌株K12及其衍生物)，然后繁殖后者。

按分子克隆loc.cit.所述转化和选择细菌。

优选借助于杂交实验，特别优选借助于序列分析证实外源DNA的鉴定。如果合适则进行亚克隆。

2.2.2克隆蛋白质激酶基因

编码蛋白质激酶的基因位于PPV基因组，部分或完整地与其侧翼基因组片段一起分离该基因。

如VEGF基因的克隆中所述，经过将PPV基因组片段化(裂解位点，见图1)可分离该区域，优选接着克隆该片段并选择含部分PK基因或优选完整的PK基因及其PPV基因组的侧翼DNA序列的片段或克隆。可用作PCR引物或作为杂交探针的DNA分子可来自序列IDNo:1或ID No:9。

如果合适，则进行亚克隆。

2.2.3克隆编码10KDa蛋白质的基因

使用对VEGF基因和PK基因详细所述(上文)的方法将编码10KDa蛋白质的基因定位在PPV基因组上，部分或优选完整地与其侧翼PPV基因组序列一起进行分离。

在这种情况下，优选借助于PCR和/或克隆和鉴定及选择合适的克隆获得含10KDa蛋白质或其部分的基因的PPV基因组的区域。

文献8提供了可用作PCR引物或作为杂交探针的DNA分子的详情。如果合适，可进行亚克隆。

2.2.4．克隆位于PK基因和HD1R基因之间的基因片段的颠倒末端重复区

该研究相应于已详细描述(上文)的VEGF基因的克隆。可用作PCR引物或用作杂交探针以分离合适区域的DNA分子从序列表IDNo:4(ITR区域)和No:7(PK基因和HD1R基因之间的区域)来看是显而易见的。3．构建插入质粒或缺失质粒

可用于将外源DNA插入PPV基因组的所谓的插入质粒根据按2部分所述鉴定，定位并克隆的PPV基因组片段来制备。插入质粒携带待插入PPV的外源DNA，两侧为PPV基因组片段。为制备插入质粒有各种选择：作为例子可提及的如下：

3.1．鉴定或制备按2.1.4或2.2中所述获得的克隆的基因组片段中的单一限制性酶识别位点并插入外源DNA

仅出现一次，即是单一的限制性裂解位点，例如(见2.1.3)可在测定的PPV核苷酸序列中鉴定。

携带新的限制性酶单一裂解位点的经合成制备的寡核苷酸可掺入这些单一限制性位点中。

按前面所述繁殖并选择所得的质粒。

另外，可按Jacobs等(文献12)所述使用PCR将新的单一限制性酶识别位点插入PPV基因组片段中。

已鉴定和/或制备单一限制性酶识别位点用于将外源DNA插入PPV基因组中。

使用已知方法(文献#11)插入外源DNA。

3.2．缺失克隆的基因组片段中的基因组序列并插入外源DNA

亚片段，例如，可从克隆的PPV基因组片段缺失，这经过用限制性酶，优选具有超过一个，特别是优选2个识别位点的限制性酶处理克隆的PPV基因组片段来实现。酶处理后，按上面所述，例如经电泳分级分离所得的片段并分离，借助于连接酶处理将合适的片段再次连接起来。繁殖所得的质粒并选择缺失的质粒。

另外，PPV基因组片段上的单一限制性酶识别位点用作以核酸内切酶，例如酶Bal31双向降解该片段的起始位点。缺失的大小以酶作用的时期来确定并借助于凝胶电泳来检查。合成的寡核苷酸按3.1(上文)所述连接到新产生的片段末端上。

外源基因仅以占完整PPV群体较小的百分数转移进PPV基因组。

因此，需要选择系统来分离重组PPV与野生型PPV(文献#Moss)。

优选使用gpt选择系统，它以大肠杆菌脒基-磷酸核糖转移酶基因为基础。当在真核细胞中表达时，该基因提供对霉酚酸的抗性，它是嘌呤代谢的抑制剂。其在重组载体病毒构建中的应用已多次被描述(见文献16和17)。4．构建根据1至12的重组PPV

经过如下步骤将外源DNA插入PPV基因组：

a．在合适的宿主细胞中同时转染插入或缺失质粒的DNA并用PPV感染，

b．在合适的宿主细胞中转染插入或缺失质粒的DNA，然后用PPV感染，

c．在合适的宿主细胞中感染PPV，然后用插入或缺失质粒的DNA转染。

用于适合于该目的的程序的方法是已知的。可使用诸如磷酸钙技术，脂质体介导的转染或电穿孔的已知方法实现转染(见文献18)。

1．用PPV感染：

优选允许较好地繁殖病毒并有效转染的细胞培养物，例如，永久性牛肾细胞系BK-K1-3A，用于制备含外源DNA的PPV。

2．插入或缺失质粒DNA的制备：

繁殖以以前所述方法获得的含插入或缺失质粒的转化细胞并以已知方式从细胞中分离质粒并进行进一步的转化。例如，借助于在例如CsCl的密度梯度中的等密度离心或借助于在商业上可获得的硅质颗粒上的亲和纯化实现纯化。

3．转染：

纯化的环状或线型质粒DNA优选用于转染，例如，按2部分(上文)所示实现纯化。

4．培养转染的和感染的细胞

使用上述方法培养细胞。当出现细胞病理效应时，去掉培养基，如果合适，则经离心或过滤去掉细胞碎片，如果合适则贮存，也可使用病毒的单一噬斑纯化的常规方法来处理。

制备重组PPV时采用下列方法：

已生长至汇合的BK-KL-3A细胞用具有以0.001至5，优选0.1的MOI(感染复数)的感染剂量进行感染。2小时后，例如用质粒pMT-10的DNA(2-10μg)，使用CaPO4-甘油休克法或使用转染试剂盒根据厂家说明书(DOSPER,Boehringer-Mannheim)转染感染的细胞。然后在37℃并在5％CO₂大气中用培养基培养这些细胞培养物3至6天直到致细胞病变效应(cpe)或噬斑形成可见。

根据插入的外源DNA，以下列步骤鉴定重组PPV：

a．例如，借助于DNA/DNA杂交检测外源DNA，

b．借助于PCR扩增外源DNA

c．借助于重组病毒表达外源DNA。

关于a．

为此，从所述病毒中分离该DNA并与至少部分相同于插入的外源DNA的核酸杂交。

已进行单一噬斑纯化并被鉴定为重组体的PPV再次试验外源DNA的存在和/或表达。可获得稳定含有和/或表达外源DNA的重组PPV用于进一步使用。

关于c．

可在蛋白质水平上检测外源DNA的表达，例如，经过用病毒感染细胞，然后使用抗外源DNA编码的蛋白质的特异性抗体进行免疫荧光分析，或使用抗外源DNA编码的蛋白质的抗体及使用感染的细胞裂解物进行免疫沉淀或Westem印迹。

经过鉴定特异性转录物可在RNA水平上检测外源DNA的表达。为此，从病毒感染的细胞分离RNA并与至少部分相同于插入的外源DNA的DNA探针杂交。

实施例

下面的实施例描述了适于插入和表达同源和异源基因或其部分的PPV基因组区域。合适的基因组片段包含在PPV ovis病毒株D1701(及其各自的衍生物)的Hind Ⅲ片段I中(序列表ID No:8和IDNo:12)。

1．克隆Hind Ⅲ片段I：

用限制性酶Hind Ⅲ裂解纯化的病毒DNA后，以琼脂糖凝胶电泳分离所得的DNA片段，使用Qtaex^方法(Qingen)切下，分离并纯化大小大约为5.6kbp的片段I。使用标准技术(Maniatis等)将该DNA片段克隆进载体质粒pSPT18(Boehringer,Mannheim)，其中pSPT18已用Hind Ⅲ裂解并用CIP(小牛肠磷酸酶)处理。所得的重组质粒pORF-1和pORF-2区别仅在于插入的方向不同。限制性图谱的构建使其能进行进一步亚克隆，如图1所示。Southern印迹杂交用于试验所有的重组质粒DNA中限制性酶消化的病毒或质粒DNA以检查其相同性和病毒来源。

2．DNA测序：

经过使用不同重组质粒的双链DNA和结合载体质粒pSPT 18的克隆位点两端的SP 6-特异性和T7特异性引物实现DNA测序。在35S-〔α〕-dATP和T7-DNA聚合酶存在下按厂家(Pharmacia-Biotech)建议实施Sanger的双脱氧链终止法。然后用于测序Hind Ⅲ片段I的两条链。由于病毒DNA插入片段的G+C含量相当高(64.78％)。因此7-Deaza-GTP用于分辨测序假象或带压缩，如果需要在含甲酰胺的变性聚丙烯酰胺凝胶中分离测序产物。

3．鉴定潜在的基因

对所得的DNA序列(序列表ID No:8和ID No:12)的计算机辅助分析公开了一些可能的开放阅读框(ORF)。来自这些ORF的氨基酸序列用于基因同源性研究(例如，GCG程序)。结果检测到与下列基因具有明显的氨基酸同源性(也见图1)。

3.1．发现一个ORF与不同哺乳动物种类(例如，小鼠，大鼠，豚鼠，奶牛和人类)的血管内皮生长因子(VEGF)具有氨基酸同源性(36.1至38.3％相同性；52.8至58.6％相似性)，也与最近在PPV病毒株NZ-2和NZ-7(文献6)中描述的VEGF基因同源物具有同源性。还未发现其它痘病毒，如各种正痘病毒具有相应的基因同源性。该ORF也称为VEGF，含有399个核苷酸且编码含有132个氨基酸的多肽，其计算的分子量为14.77KDa。使用Northarn印迹杂交，RNA保护实验和引物延伸实现对总的或寡聚(dt)-选择的RNA进行转录分析证实VEGF作为早期基因在感染后(p.i.)大约2小时表达。发现特异性mRNA覆盖422至425个碱基，它直接从与共有基序的关键区域表现出100％同源性的序列下游开始，该共有基序对早期牛痘病毒基因的启动子是典型的。VEGF mRNA的3′端定位于，例如，牛痘病毒基因的早期转录子共同具有的共有序列中。以Northern印迹杂交估测该mRNA的大小为大约500个碱基，表明它具有长度大约为100个碱基的poly(A)片段。

3.2．发现另一ORF编码与存在于一些正痘病毒(例如，牛痘病毒，天花病毒或兔纤维瘤病毒)中的相应基因具有同源性的有效的蛋白质激酶(PK)并且称为F10L。该基因同源物在PPV病毒株D1701感染循环的晚期(感染后12至16小时)转录。转录起始点位于与晚期牛痘病毒基因的已知启动子表现出高度同源性的区域下游不远处。

3.3．发现的其它可能的ORF至今与已知的基因序列未表现出任何明显的同源性。其中特别感兴趣的是称为基因HD1R的潜在的基因(图1)。诸如上面所述的分析证实具有大约1.6kb大小的特异性早期mRNA转录。

3.4．最后，用计算机发现了一个与F10L 3′端和VEGF 5′端重叠的ORF(F9L，图1)。序列比较显示与牛痘病毒F9L基因具有同源性。

3.5．经过与口疮(orf)病毒株NZ-2和NZ-7的已知DNA序列比较，可将D1701基因组所谓的ITR区域的起始点定位于Hind Ⅲ片段I的核苷酸位置1611。ITR区域是在痘病毒基因组末端出现的一个序列区，它以相反方向同样存在于基因组的另一端，因此称为颠倒重复区(ITR)(见序列表ID No:4)。序列比较发现与克隆进pORF-1的D1701 Hind Ⅲ片段I在基因组中的定位实验吻合。该片段与假定相同的Hind Ⅲ片段H的图谱在图2中描述。由此可推断D1701基因组ITR包含大约2.6kbp。

测定D1701 VEGF mRNA 3′端的实验揭示至少还有一个病毒特异性RNA在过渡到ITR后以大约40至220 obp的ITR开始。由于与NZ-2具有氨基酸同源性，相应的基因称为ORF3(图1)。在ORF3 mRNA推断的5′端前，有一个早期痘病毒启动子典型的共有序列。至今尚未发现与其它基因的同源性。

4．将DNA序列导入Hind Ⅲ片段I

使用所述的Hind Ⅲ DNA片段(在质粒pORF-1和pORF-2中克隆)研究导入同源或异源DNA序列的可能性。在下文中，使用3种不同的策略实现该目的。

构建含有在11K牛痘病毒启动子控制下的来自大肠杆菌的功能性Lac Z基因的质粒pGSR用于下列实施例。为达到该目的，分离质粒pUCIILZ(见文献7)的相关DNA部分并克隆进质粒pSPT18。这一功能性11K/LacZ基因组合(下文称为LacZ表达盒)可经过从pGSRZ(图3)分离3.2kb的SmaⅠ/SalⅠ片段获得。构建选择表达盒：

使用图7所示的质粒pGSSRZ(含有在牛痘病毒启动子P11K控制下的Lac Z基因)，pMT-1(含PPV VEGF启动子)和pMT5(含大肠杆菌gpt基因)构建各种所谓的选择表达盒。制备代表VEGF启动子(PVEGF)序列的合成的互补寡核苷酸并插入pSPT18(pMT-1)的SmnⅠ裂解位点。然后经过分别借助于Bam HⅠ裂解从p18Z(将pGSRZ的Bam HⅠ片段插入pSPT18获得)去掉LacZ基因或从pMT-5中去掉gpt基因，然后将其插入pMT-1(图7)制备质粒pMT-2和pMT-4。

借助于PCR从GPT质粒pMSG(pharmacia-Biotech)扩增功能性gpt基因，然后借助于所谓的TA克隆按照厂家(Irvitrogen Inc.)说明克隆进载体pCR Ⅱ。

如图7所示，随后可构建以所示组合和取向在11K启动子和/或PVEGF控制下分别表达LacZ基因或gpt基因的双重选择表达盒。

按照实施例ⅩⅩ(LacZ-VEGF缺失)或YY(基因间的Bal31)，可在合适的限制性酶裂解和分离后将这些选择表达盒插入所述质粒pdv-500后构建质粒pMT-10,pdN-500具有312bp缺失的PPVD1701 VEGF基因。借助于这一构建过程，插入了功能性LacZ和gpt基因来代替经缺失去掉的VEG ORF。在瞬时表达试验后，可证实LacZ基因在PPV D1701-感染的细胞中的活性(未显示)以便随后选择表达gpt和Lac Z的D1701的VEGF缺失突变体。

4.1．插入基因间非编码区

鉴定或产生位于基因间，非编码区的新单一限制性位点。然后这些位点用于插入编码功能性和可检测的基因产物(例如，大肠杆菌Lac Z基因)或其部分的外源DNA序列。实施例4.1.1

质粒pORF-PB(图1)含有位于蛋白质激酶(F10L)和HD1R基因之间的单一NruⅠ裂解位点。用该限制性酶将pORE-PB线性化后，借助于钝端连接将Lac Z表达盒连接(补齐反应后)到其上。例如，用Bgl Ⅰ裂解后选择含有功能性LacZ基因的重组质粒，借助于使用LacZ特异性探针的Southeyn印迹杂交和借助于部分测序LacZ/PPVDNA过渡区证实正确插入。实施例4.1.2

与上面实施例所述相同的研究用于VEGF基因的下游(在BstE Ⅱ位点裂解，图1)和在ITP区域潜在的基因ORF 3中(用xbaⅠ部分降解以防止在pSPT 18克隆位点中的xbaⅠ位点裂解)。实施例4.1.3

PCR诱变技术可用于在克隆的PPV DNA片段的任意所需点导入一个新的，单一的限制性位点(见图10，文献12)。为达到这一目的，分别使用引物对E1+EV2(PCR A)和EV1+XB(PCR B)分别进行2次PCR反应。所有引物含有相同于给定序列位置PPV序列的25个核苷酸。而引物XB构成真实的序列，例如围绕xbaⅠ位点(图1)，新的Eco RⅠ位点导入引物E1的5′端，新的Eco RⅤ位点导入引物EV1和EV2(它们互相互补)。最初不存在于pORF-1或pORF-2的完整序列中的EcorⅤ位点插入到选择用于导入Lac Z表达盒的位点。纯化从反应A和B获得的PCR产物，变性成单链并在复性条件下混合起来；然后将它们用最后一次PCR反应，pPCR C。现在E1和XB用作引物以便在本实施例中延伸pORF-1的左侧793bp。凝胶分离和纯化后，用EcoRT和xbaⅠ裂解反应C所得的PCR产物，然后连接到已用Eco RⅠ和xbaⅠ裂解的质粒pORF-XBV上。结果，质粒pORF-1EV(图5)在所需位置含EcoRⅤ限制性位点，然后可将它用于线型化并连接进Lac Z表达盒。

另外，含有限定的碱基变化或单碱基缺失的错配引物可用于本实施例中所述的方法以便在病毒DNA序列的任何所需位点产生，例如，翻译终止密码子或氨基酸缺失。

4.2．没有缺失的ORE序列的基因内插入

在仅在选定基因出现一次的限制性位点裂解后将新的或另外的序列导入一个所述ORF的编码序列中。实施例4.2.1．

位于F10L基因同源物右侧部分的单一XcmⅠ位点用于线型化质粒pORF-1。将Lac Z表达盒和裂解的pORF-1 DNA使用T4 DNA聚合酶或Klenow DNA聚合酶均变成钝端，然后连接；然后将感受态的大肠杆菌细菌(DH₂F′)用于转化。使用Lac Z-特异性探针借助于菌落滤膜杂交试验所得的细菌菌落的阳性重组质粒，用限制性酶裂解相应的质粒DNA。实施例4.2.2

VEGF编码区含有单个StyⅠ位点，它用于插入Lac Z表达盒，如上所述。4.3．病毒序列的缺失

下列实施例描述了编码区(基因内缺失)和非编码区(基因间缺失)的去除：实施例4.3.1

限制性酶用于除去Hind Ⅲ DNA片段I中的限定部分以便经过插入外源基因或这些基因的一部分取代缺失的病毒序列。经过用限制性酶NruⅠ裂解质粒pORF-PA(在ITR区域的位点，图1)实现这点，结果缺失了396bp的片段。补齐反应后，按上文所述连接Lac Z表达盒。图4显示了从pORF-PA缺失396bp的片段并插入Lac Z表达盒。图5和6显示了以这种方式构建的且来自pORF-PA的缺失/插入质粒pCE4和pCE9。实施例4.3.2

Hind Ⅲ DNA片段中的单个限制性位点用作起点以实现在核酸内切酶Bal 31影响下双向缺失序列，如图6所示。对于质粒pORF-PA和质粒pORF-1或pORF-XB分别用酶StyⅠ和XcmⅠ进行限制性降解以分别打开编码VEGF和蛋白质激酶F10L的基因(图1和6)。加入核酸外切酶Bal31后，每隔2分钟从反应物中取出等分试样并然后终止反应。用例如，限制性酶BglⅠ裂解定时的样品并随后进行凝胶电泳，使其能评价以Bal31缺失的DNA片段的大小。然后使用合适的时间点的样品的混合物借助于补齐反应封闭DNA末端。然后杂交组成新的单一SmaⅠ,SalⅠ和Eco RⅤ限制性位点的两个互补的寡核苷酸并将所得的双链引物分子(称为Eco RⅤ接头)连接到钝端化的Bal31产物上。转化细菌后，分离质粒DNA并用Eco RⅤ裂解，Eco RⅤ在PPV Hind Ⅲ片段I的DNA序列中不见有任何识别位点。因此，具有Eco RⅤ位点的每个质粒DNA含有插入的接头序列并随后用于将

钝端化的Lac Z表达盒连接进新的Eco RⅤ位点。使用单链Eco RⅤ接头和使用合适的LacZ基因特异性引物借助于测序可测定在各所得的重组质粒DNA中产生的DNA缺失的精确大小。5．检测和鉴定其它副痘病毒中的VEGF基因

对D1701中编码VEGF的DNA区域的了解使其可制备特异性DNA探针和PCR引物，用于鉴定在其它副痘病毒株中限制性图谱有许多区别的这种基因。为达到这一目的试验下面的可能性：(ⅰ)分离pORF-PA的TagⅠ亚片段(366 bp)作为代表D1701 VEGF基因的中央部分的杂交探针；(ⅱ)使用合适的合成引物扩增完整的VEGFORF并将PCR产物克隆进质粒；(ⅲ)含有VEGF基因不同部分的引物用于PCR，其中PPV DNA作为模板，也作为特异性杂交探针。

经放射性标记后，这些探针成功地用于与Parqpox ovis，牛副痘病毒1(牛丘疹性口炎；BPS)和牛副痘病毒2(挤奶者结节病)的各种分离株和病毒株的基因组DNA进行Southern和斑点印迹杂交。Southern印迹杂交显示具有限定PPV DNA片段的VEGF-阳性信号，它使得可更详细地定位各种PPV中的VEGF基因。

另外，可使用相同探针用于比较RNA分析，如Northern印迹杂交，以便试验潜在的VEGF基因在其它PPV病毒株中的表达。6．D1701重组体的生产

用moi(感染复数)为0.1的感染剂量感染生长到汇合的BK-KL-3A细胞。2小时后，借助于CaPO₄-甘油休克方法或使用转染试剂盒(DOSPER,Boehtinger-Mannhein)按照厂家说明用例如，质粒pMT-10的DNA(2至10μg)转染感染的细胞。然后用选择培养基(HAT培养基+MPA霉酚酸-黄嘌呤-5％FCS)在37℃下5％CO₂的大气中培养这些细胞培养物3到6天直到致细胞病变效应或噬斑形成可见。根据病毒诱导的致细胞病变效应的程度：

(a)获得细胞裂解物，制备稀释系列，在BK-KL-3A细胞上进行噬斑试验。所加的琼脂糖培养基混合物含0.3mg/ml Bluo-Gal(GIBCO-BRL生命科学)以鉴定含表达Lac Z，具有MPA抗性的D1701重组子的蓝色噬斑。

(b)形成单个噬斑后，加入(a)中所述的琼脂糖/Bluo Gal混合物。

如下所述采用(a)或(b)获得的病毒用于感染BK-KL-3A并进行至少2次进一步的噬斑滴定和纯化直至获得100％匀质的重组病毒群体。7．VEGF启动子

如3.1章所述，D1701的VEGF基因是早期基因；感染中感染到相对晚期后2至4小时在D1701病毒感染的细胞中大量转录特异性mRNA。因此，已鉴定的D1701 VEGF启动子区域对于控制重组PPV病毒中外源基因或部分这些基因的表达非常有用。含有VEGF启动子(35至40个核苷酸；序列表ID No:6)的序列可借助于(ⅰ)使用启动子区域两侧的合适引物进行PCR,(ⅱ)亚克隆合适的DNA片段，或(ⅲ)合成作为寡核苷酸的启动子序列来分离。

将VEGF启动子连接到感兴趣的任意基因或DNA序列上后，所得的基因表达盒可用于根据前面章节所述的任意方法来制备重组PPV。8．10KDa基因

根据PPV病毒株NZ-2的10KDa基因的公开的DNA序列(文献8)建立检测PPV 10KDa基因的特异性PCR。使用经合成制备的引物10K-上游(5′-CAATATGGATGAAAATGACGG-3′)和10K-下游(5′-CAGACGGCAACACAGCG-3′)进行PCR后，在扩增297个碱基对大小的特异性产物中取得了成功。随后的克隆(TA克隆试剂盒，Invitrogen Inc.)产生了质粒pJS-1，它含有作为Eco RⅠ片段的297bp的PCR产物。对pJS-1插入片段的2条DNA链的DNA测序证实存在10KDa-特异性序列。根据这一序列，D1701编码与NZ-2 PPV病毒株具有93.3％的氨基酸相同性和96.7％的氨基酸相似性的91-个氨基酸的10KDa蛋白质。

采用使用放射性标记的pJS-1的Southern印迹杂交定位D1701基因组Eco RⅠ片段E(4.25kbp)中的10KDa基因。因此，作为NZ-2的情况，该基因位于病毒基因组右侧部分且含有Hind Ⅲ片段K和G的裂解位点(图2)。

含有4.25kbp D1701 EcoRⅠ片段E的质粒pDE-E1和pRZ-E1用于制备10KDa基因含插入或缺失(基本上如前所述)的质粒。D1701 10KDa基因N端片段(#124-#129，序列ID No:11)中的Hind Ⅲ裂解位点(片段K-G)可用于直接插入外源DNA且用于缺失(见用Bal31双向消化)10KDa基因。对于后一构建体，从质粒pDE-E1中去掉第2个Hind Ⅲ裂解位点(载体质粒pSPT18的多克隆位点)。为此，用Hind Ⅲ裂解pSPT18 DNA，随后经过用Klenow处理破坏Hind Ⅲ裂解位点并重新连接质粒。然后将4.25kbp D1701 EcoRⅠ片段E克隆进新载体质粒pSPT18dH的EcoRⅠ限制性位点。现在所得的质粒pRZ-E1(图8)在10KDa基因中具有单个Hind Ⅲ裂解位点，该位点允许进一步进行简单的操作。

使用pDE-E1和pJS-1作为放射性标记的探针进行的Southern印迹杂交及PCR研究证实不同的牛副痘病毒1的病毒株的基因组不含任何10KDa特异性序列。这表明10KDa PPV基因是非必需的(Biitter M.等，1996，文献#10)。参考文献：1．Robinson,A.J.和Lyttle,D,J.1992。

副痘病毒：其生物学及作为重组疫苗的可能性。在：重组痘病毒中，编辑，M.M.Binns和G.L.Smith,CRC出版公司。2．Mayr,A.1990.

第7章(深脓疱(口疮)病毒)在：脊椎动物的病毒感染，第3卷：反应类的病毒感染，1990,Elsevier科学出版社B.V.,TheNetherlands。3．Magur,C.,Rangel Filho,F.B＞和Galler,R.1991.

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使用变性质粒模板的双脱氧测序方法。生物化学年鉴，152,232-238。20．Chomobynski,P.和Sacchi,N.1987。

以硫氰酸胍-酚-氯仿提取分离RNA的单步方法。生物化学年鉴，162,156-159。ID No:1

本申请的序列ID No:1显示了位于病毒株PPV D1701的HindⅢ片段I中的VEGF基因。

其它信息：

早期启动子：核苷酸50至64，

mRNA起点：核苷酸78或80

mRNA终点：核苷酸498至500

翻译起点：核苷酸92至94

翻译终点：核苷酸488至490ID No:2

本申请的序列ID No:2显示了位于病毒株PPV D1701的HindⅢ片段I上的蛋白质激酶基因F10L(1型)。

其它信息：

晚期启动子：核苷酸48至66

mRNA起点：核苷酸74至78

翻译起点：核苷酸94至96

翻译终点：核苷酸1738至1740ID No:3

本申请的序列ID No:3显示了位于病毒株PPV D1701的HindⅢ片段I上的HDIR基因片段。ID No:4

本申请的序列ID No:4显示了位于病毒株PPV D1701的HindⅢ片段I上的ITR区和在该区域中发现的ORF3基因。

其它信息：

ITR区域起点：核苷酸7

早期启动子：核苷酸18至33

ORF3 mRNA起点：核苷酸40至41

ORF3 mRNA终点：核苷酸673至679

ORF3翻译起点：核苷酸111至113

ORF3翻译终点：核苷酸562至564ID No:5

本申请的序列ID No:5显示了位于病毒株PPV D1701的HindⅢ片段I上的F9L基因同源物(1型)。

其它信息：

起始密码子：核苷酸48至50

终止密码子：核苷酸861至863ID No:6

本申请的序列ID No:6显示了位于病毒株PPV D1701 HindⅢ片段I上的VEGF启动子区。ID No:7

本申请的序列ID No:7显示了位于HD1R和PKF10L基因之间且位于病毒株PPV D1701的Hind Ⅲ片段I上的基因间区域。

推断的HD1R翻译终点：核苷酸25至27，

PKF10L翻译起点：核苷酸223至225ID No:8

本申请的序列ID No:8显示了位于病毒株PPV D1701的HindⅢ片段I(1型)的完整核苷酸序列。ID No:9

本申请的序列ID No:9显示了位于病毒株PPV D1701的HindⅢ片段I上的蛋白质激酶F10L基因的2型。

其它信息：

晚期启动子：核苷酸48至66

RNA起始信号：核苷酸72至80

mRNA起点：核苷酸74至78，

翻译起点：核苷酸94至96，

翻译终点：核苷酸1585至1588ID No:10

本申请的序列ID No:10显示了位于病毒株PPV D1701的HindⅢ片段I上的F9L基因同源物的2型。

其它信息：

翻译起点：核苷酸50至52

翻译终点：核苷酸722至724ID No:11

本申请的序列ID No:11显示了位于病毒株PPV D1701 EcoRⅠ片段E上的10KDa基因。

其它信息：

翻译起点：核苷酸5至7

翻译终点：核苷酸275至277ID No:12

本申请的序列ID No:12显示了PPV病毒株D1701的Hind Ⅲ片段I2型的完整核苷酸序列。ID No:13

本申请的序列ID No:13显示了位于病毒株PPV D1701的HindⅢ片段I上的蛋白质激酶F102基因的3型。

其它信息：

晚期启动子：核苷酸48至66

RNA起始信息：核苷酸72至80

mRNA起点：核苷酸74至78

翻译起点：核苷酸94至96

翻译终点：核苷酸1585至1588ID No:14

序列ID No:14显示了PPV D1701蛋白质激酶F10L同源物的氨基酸序列(从序列ID No:13推断)。ID No:15

序列ID No:15显示了位于病毒株PPV D1701 VEGF同源物的氨基酸序列(从序列ID No:1推断)。ID No:16

序列ID No:16显示了位于病毒株PPV D1701 F9L同源物的氨基酸序列(以序列ID No:10推断)。

序列表(1)一般信息：(ⅰ)申请人：

(A)姓名：BAYER AG

(B)街道：Bayerwerk

(C)城市：Leverkusen

(E)国家：德国

(F)邮编(ZIP):D-51368

(G)电话：0214/3061285

(H)电传：0214/303482(ⅱ)发明名称：含外源DNA的副痘病毒，其制备及其在疫苗中的应用(ⅲ)序列数：16(ⅳ)计算机可读形式：

(A)媒体类型：Floppy disk

(B)计算机：IBM PC兼容机

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D)软件：PatentIn Relense#1.0,Version#1.30(EPO)(2)SEQ ID NO:1的信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：540个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑学：线型 (ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅲ)假设：无(ⅳ)反义：无(ⅵ)原始来源：

(A)生物：Parapox ovis

(B)病毒株：D1701-VEGF基因(ⅹⅰ)SEQ ID NO:1的序列描述：GGTGCGCTAC CAATTCGCGC GGCCGGCCGC GCTGCGCGCG TAGCCGCGCA AAATGTAAAT 60TATAACGCCC AACTTTTAAG GGTGAGGCGC CATGAAGTTT CTCGTCGGCA TACTGGTAGC 120TGTGTGCTTG CACCAGTATC TGCTGAACGC GGACAGCACG AAAACATGGT CCGAAGTGTT 180TGAAAACAGC GGGTGCAAGC CAAGGCCGAT GGTCTTTCGA GTACACGACG AGCACCCGGA 240GCTAACTTCT CAGCGGTTCA ACCCGCCGTG TGTCACGTTG ATGCGATGCG GCGGGTGCTG 300CAACGACGAG AGCTTAGAAT GCGTCCCCAC GGAAGAGGCA AACGTAACGA TGCAACTCAT 360GGGAGCGTCG GTCTCCGGTG GTAACGGGAT GCAACATCTG AGCTTCGTAG AGCATAAGAA 420ATGCGATTGT AAACCACCAC TCACGACCAC GCCACCGACG ACCACAAGGC CGCCCAGAAG 480ACGCCGCTAG AACTTTTTAT GGACCGCATA TCCAAACGAT GATGCGATCA GGTCATGCGG 540(2)SEQ ID NO:2的信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：1740个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(A)生物：Parapox ovis

(B)病毒株：D1701-蛋白质激酶基因(1型)(ⅹⅰ)SEQ ID NO:2的序列描述：CGAGTGACTG CCCATCCCGT TGCTGCGCGA CTCGGGACTG CCCTCTGTTT TTCTTTCCCG 60TTTCTTCTTA TTAGGTAGTT GTTGCCCACC TCCATGATCC TCGCACGCGC TGGCGGGCGA 120CCTCGCACGC CCGCGGCGGC CGCGGCGGCC GCCGAGGACG GCAAGAACAG TGATCGCCGG 180AAGCGCAAGC GCAAGACGCC CAACTGCGAA GACGCCGACA ACTCCGACGA CGAGCTAGCG 240CAGACGCCGT GCGACCGCGA GTGGCCGGAC TGTCGCGCGA GCTCGATCAC GAGCTCCGAC 300TCGGTCTCTC TCGGCGACGA GATCTACTTG CGGTACGTAG CCTCGCAGGT GGACTTCGCG 360CAGACCTGGG CCCCGCCGGT GCGGCTGCTG CGCTTCTTCG GGAACTTCTC GAAGGAAACG 420CTCAGCCGCA TGTCGCGGCG CGGGTACGTG AACCGCTCCT ACTTCCAGAT GGCGCACGCG 480CGCTTCTCGC CCACCAACGA CGACATGTAC CACATGGCCA CTGGCGGGTA CGGCATCGTG 540TTCCGCTTCG ACCGCTACGT GGTCAAGTAC GTCTTCGAGC ACCGCAACGG CATGTCCGAG 600ATGGACGCCT CTACGGAGTA CACGGTGCCG CGGTTCCTGC GCAATAACCT CAAGGGCGAC 660GAGCGCGAGT TCGTGGTCTG CGCGCTGGCC ATGGGGCTGA ACTACCGGCT GGGCTTCCTG 720CACTCGCTGT ACCGGCGCGT GCTGCACACG CTGCTGCTGC TCATGCGCGT GGAGGAAGGC 780CAGCGGCCCT CGGTAGAGAT GGCCAAGAAG CCGCTGCTGC GCTGGTTCGA GGCGCGCAAG 840GACAGCGAGT CCTTCGTGCG CCTGGTCTCG TACTTCTACC CCTCGGCCGT GCAGAGCAAC 900GTGAACCTGA TCAACAACTT CCACCACCTG GTGCACTTCT TTGAGCACGA GAAGCGCGCG 960CGGTACGTGT TCGACCGCGG GGCCGTGATC GTGTTCCCTC TGGCGCGCGG GTCCGCGGAC 1020TCGATCTCGC CGGAGGCGGC GGCAGCGCTG GGCTTCGCGC CGCACTCGGA GTTCCTCAAG 1080TTCGTGTTCC TGCAGATCGC GCTGCTGTAC CTGAAGATAT ACGAGCTCCC GGGCTGCACG 1140AACTTCCTGC ACGTGGACCT GAAGCCCGAC AACGTGCTCA TCTTCGACAG CGCGCGCGCT 1200CAGCGTGACT GCGGCCGGTG CGACTTTTCG CTTCGAAGAG CCCGTGCGCG CGGCGCTGAA 1260CGACTTCGAC TTCGCGCGCG TGGCCACCAT CGAGAACCGC AAGATCGCGG GCAGCGTCCG 1320CGTGCCGCAG AACTGGTACT ACGACTTCCA CTTCTTCGCG CACACGCTGC TGCGCGCGTA 1380CCCGCACATC GCCGCGGAGG ACCCGGGCTT CCACGCGCTG CTCTCGGAGC TCACGGTCTC 1440GTGCTCGCGC GGGACCTGCG ACCGCTTCCG GCTGCGCGTG TCCTCGCCGC ACCCCATCGA 1500GCACCTCGCG CGGCTGGTGC GCCGCGACGT CTTCTCCCGC TGGATAAATG CCGCCGCGGA 1560CGCCCCCGAC GCCGCACTCT CCTGAGCCCA CGCCCGCGGC GCCGGGCTCG CTGTACGACG 1620TCTTCCTCGC GCGCTTCCTG CGCCAGCTGG CCGCGCGCGC GGCGCCGGCC TCGGCCGCCT 1680GCGCCGTGCG CGTGGGTGCG GTGCGCGGCC GCCTGCGGAA CTGCGAGCTG GTGGTGCTGA 1740(2)SEQ ID NO：3的信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：1080个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑学：线型(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅲ)假设：无 (ⅵ)原始来源：

(A)生物：Parapox ovis

(B)病毒株：D1701-HD1R基因区域(ⅹⅰ)SEQ ID NO:3的序列描述：AAGCTTGTTG CGCGAGTACG TGGTGACCCG CGCCTACTCG GATCAGACCG AGCCGATCAT 60GGACTTGCTC ATCGGCATGG GCGCCGACGT GGACATGCAG GTCGGCGTGT GCCGCACGGC 120GCTGCACGCC TGCCTTACGG GCTTGAACAC GAACCCGTGC ATGATTCGCG CGCTGCTTCG 180GCGCGGCGCC AGCGTGACCG CAAAAGACAC CTACGAGATG ACGCCACTGG CGTGTTGCTG 240AAGTCCGCGA GCGCGACGCC GGAGCTCGTG CGCATCCTCG TGGAAGCAGG CTCCGACGTG 300AGCGCCACCG ACTTCCGCCT CAACGGCATG CTGCACCAGC ACGCAGTCCA CGCGCCCGCG 360CGCGAGCGTC ATGCGCGAGC TCATCCGGCT GGGGTGCAGC CCAGCGGCCA AAAACATGTT 420TGGGAACACG CCGATGCACA TGCTGGCCAT GGAAAGCTCC TGCCGCCGCT CGCTGATCCT 480CCCGCTGCTG GAGGCAGGGC TTTCCGTGAA CGAGGAGAAC CTGCACTACG GCACCGTGCC 540TCTGCACGTG GCCTCGGGGT ACGACAACAC GCAGGGCTGC CTCAAGCTCC TCCGGCAGGG 600AGGAGACCCC ACCGTCGTGT CAGCCGCCGG ACGCACACCG ATCTCGAACA TGCTCGTCAA 660AGCCAACCAC GTGGCGGTCG CCGGCGCGCT GTCGACGCAC CCGAGCGCGG CAGTGGTCGT 720GCAGGCTCTC GAGCAGGCTC TCGAGAACGT GCTGAACGCC GGGCCCAGCG AGGCCTCGCG 780GCTCGCCGTG GCCTTTGTGG TGGCGCGCGC CGGCGCATCC GCGCTACCGG AGGCCGTGCG 840CCGTCTTCAC GAGGGCTTCG TCGCCGACTG CGAGCGCGAA GTCGCGTTGC TTTCCCGCAG 900CATGCTCGGC ACACCGGCCG TGAGCGCGCT GGTCGTGCTG GTCAGCAAGG AGGTCTTTGG 960CACTGTTATC TCCTCGCGTG CGCTGCGCGT CGCGCGGGAG GTCCGCGTGT ACGCAAGGCC 1020GCTCCGCGAG GCGCTCATAA ATCTGCGCCA CAAATGCCGC TTAGTTTCCA GCCTTAAAAG 1080(2)SEQ ID NO：4的信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：1616个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑学：线型(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅲ)假设：无(ⅳ)反义：无(ⅵ)原始来源：

(A)生物：Parapox ovis

(B)病毒株：D1701-ITR和ORF3基因(ⅹⅰ)SEQ ID NO:4的序列描述：AAGGAGGCTC CACGGAGCAA AGTGAAAAAG GACCGCCTAG AGTCGAGACC CCTCCCTCCC 60GCCTCGGGCA AACCCACAGC CGCCGCAAAC ACCACACCCG CCGACCTACC ATGCACCCCT 120CGCCGCGCCG GCTGCTCGGC GCGCTCGCGC TGCTGGCGCT GGGCTTCGCT CGGCGCGCTC 180TTCGCCCCGC GGCGCCGCTC GTGCCGGCCG CCTTCCTGGA GGTGGGGCAC GTGCGCGCGA 240ACCCGTCCGC CTCGGTGACC TGCCTCACGG TGGGCGGCGA CGGGCGGCAC ATGGCGGCGG 300TCGCGCACGG CGGCGGGACG CTCTCGCCGG TGTACCCGCT GGCCGCCGGC ATGCACGCGA 360CCTTCTCCTC CGCGCGCAAG GGCGCGCTGC TGCTGAACGT CGCGACCGTG ACTGTGTACG 420ACGTGCGCGC GCTCGCCCCC GAGTTCGAGC TCGTCTGCAT CGCGGTGGTC GGCGGCTACA 480ACTCGGCCGC GGCCGCCACG CGGCCCGCGG CCGAGTGGCA CCGCCAGCTG GAGCTGCGCC 540GCTCGGAGCT GTGACCCCTC CCTCCCCGGT CTCCCTCTGT CTTTGTAATC GGCCTTAGAG 600ATTAGACATC ATCCTCCACG CCTCTTTGTC CGCCGCCCTT CTTCGCGGAC GGATGAACCA 660ATTAATTAAT TATTTTTGTC GCTCGCCCGC TCACTCCGGC AAGGGAACGA GTGACGTTAA 720CTCTCTCACC CTCACGCACA AGAACAAGAA CCGCTCACTC ACCGGGCAAG GGAACACGGT 780TAAGGTCAAC TCACTCGCGA GAACAAGTTG ACCCTCACTC TAGAGAACGA GGAACGGGCA 840ACAAGCAACC GTCAACTCAC TTACCACGAG AACAAGTTGA CCGCCACTCA AAGGGAACAG 900AGAACAGTAA CCGTTCTCGC TCGCTCGGAA CAATAGAACA AGTTAACGTC AACTCGCTCG 960CTCGGTGTAA GAGAACAACA GAACAAGCAA CTGTTGACCA CTCAACCCCC GGAGAAGAGA 1020ACAAGAGAGC AGTCAACTCA CCCACTCAGT CTTGGATGAG AGGAGGACGA GTTAACGAGT 1080ACTCGCACGC AGAGTGAGAG AGTGAGGACA TAATAATAGT TAACGAGTTA ATACTCACTC 1140GCTCACTCAG AGTGAGAGAG AACCAGTGAG CGAGTTAACC GCGCACACGA GCGAGAGAAC 1200AGTGAACTGC TCGCGCGCTC GCTCGGTAGC AGTCGGCCTT TCTTAAAACG GTTCGTAAAA 1260CTTTTCCCGA GACAGTTCAC CCTCCAAAAC TTTTAAAACT AAACTCGGAG GTGGCCTGCC 1320CTCCACTCTC CGTAAAACTT TTGTAAAACT GTCGGAGGTC GGTCGACTTC GCAACTCGTC 1380CGCGAAAACT TTTCGTGGGC AGTGTCTGCC TCTCTCAGGC TCCTCGCATC ACTTTCGCGG 1440AGCCTCGAGG TAGGTCACCT CTCTCCAAAC TTTTGTAAAA ACTTTTTCGC GGAGCCTCTG 1500GAGGCCGTCC TCCCTCCAAA ACTTTTCGTA AAATCTCTTC GGAGGCCGTC CTCCCTCCAA 1560AACTTTTCGT AAAATCTTTG GGAGGTCGAC CTCCCTCAAA ACTTTTTATA AAGCTT 1616(2)SEQ ID NO:5的信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：900个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(A)生物：Parapox ovis

(B)病毒株：D1701-F9L基因(1型)(ⅹⅰ)SEQ ID NO:5的序列描述：GCACCTCGCG CGGCTGGTGC GCCGCGACGT CTTCTCCCGC TGGATAAATG CCGCCGCGGA 60CGCCCCCGAC GCCGCACTCT CCTGAGCCCA CGCCCGCGGC GCCGGGCTCG CTGTACGACG 120TCTTCCTCGC GCGCTTCCTG CGCCAGCTGG CCGCGCGCGC GGCGCCGGCC TCGGCCGCCT 180GCGCCGTGCG CGTGGGTGCG GTGCGCGGCC GCCTGCGGAA CTGCGAGCTG GTGGTGCTGA 240ACCGCTGCCA CGCGGACGCT GCCGGCGCGC TCGCGCTGGC CTCCGCGGCG CTGGCGGAAA 300CGCTGGCGGA GCTGCCGCGC GCGGACAGGC TCGCCGTCGC GCGCGAGCTG GGCGTGGACC 360CAGAGCACCC GGAGCTGACG CCGGACCCCG CCTGCGCGGG CGAGAGGCGC GCTTGCGCAG 420AACATCGACA TCCAGACGCT GGACCTGGGC GACTGCGGCG ACCCCAAAGG CCGCCGACTG 480CGCGTGGCGC TGGTGAACAG CGGCCACGCG GCCGCAAACT GCGCGCTCGC GCGCGTAGCG 540ACCGCGCTGA CGCGCCGCGT GCCCGCAAGC CGGCACGGCC TCGCGGAGGG CGGCACGCCG 600CCGTGGACGC TGCTGCTGGC GGTGGCCGCG GTGACGGTGC TCAGCGTGGT GGCGGTTTCG 660CTGCTGCGGC GCGCGCTGCG GGTGCGCTAC CAATTCGCGC GGCCGGCCGC GCTGCGCGCG 720TAGCCGCGCA AAATGTAAAT TATAACGCCC AACTTTTAAG GGTGAGGCGC CATGAAGTTT 780CTCGTCGGCA TACTGGTAGC TGTGTGCTTG CACCAGTATC TGCTGAACGC GGACAGCACG 840AAAACATGGT CCGAAGTGTT TGAAAACAGC GGGTGCAAGC CAAGGCCGAT GGTCTTTCGA 900(2)SEQ ID NO:6的信息：(ⅰ)序列特征：

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(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(A)生物：Parapox ovis

(B)病毒株：D1701-VEGF启动子(ⅹⅰ)SEQ ID NO:6的序列描述：CCGCGCTGCG CGCGCGTAGC CGCGCAAAAT GTAAATTATA ACGCCCAACT TTTAAGGGTG 60AGGCGCCATG AAGTTTCTCG TCGGCATACT GGTA 94(2)SEQ ID NO:7的信息：(ⅰ)序列特征：

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(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑学：线型(ⅱ)分子类型：DNA(基因组) (ⅲ)假设：无(ⅳ)反义：无(ⅵ)原始来源：

(A)生物：Parapox ovis

(B)病毒株：D1701-HD1R和蛋白质激酶基因之间的基因间区域(ⅹⅰ)SEQ ID NO:7的序列描述：CAAATGCCGC TTAGTTTCCA GCCTTAAAAG GCAAGTGGGA CCCTGCTCGC TGCCCGGCGA 60ACTGGTGGAG CGCGTGCTCG CGACCGTGCC ACTGGCCGAC TTGCGCCGCT CGTGCAGCCG 120CCGCGCGCCC GAGTGACTGC CCATCCCGTT GCTGCGCGAC TCGGGACTGC CCTCTGTTTT 180TCTTTCCCGT TTCTTCTTAT TAGGTAGTTG TTGCCCACCT CCATGATCCT CGCACGCGCT 240GGCGGGCGAC 250(2)SEQ ID NO:8的信息：(ⅰ)序列特征：

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(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(D)拓扑学：线型(ⅱ)分子类型：DNA(基因组)(ⅲ)假设：无(ⅳ)反义：无 (ⅵ)原始来源：

(A)生物：Parapox ovis

(B)病毒株：D1701-HindⅢ片段I(1型)(ⅹⅰ)SEQ ID NO:8的序列描述：AAGCTTGTTG CGCGAGTACG TGGTGACCCG CGCCTACTCG GATCAGACCG AGCCGATCAT 60GGACTTGCTC ATCGGCATGG GCGCCGACGT GGACATGCAG GTCGGCGTGT GCCGCACGGC 120GCTGCACGCC TGCCTTACGG GCTTGAACAC GAACCCGTGC ATGATTCGCG CGCTGCTTCG 180GCGCGGCGCC AGCGTGACCG CAAAAGACAC CTACGAGATG ACGCCACTGG CGTGTTGCTG 240AAGTCCGCGA GCGCGACGCC GGAGCTCGTG CGCATCCTCG TGGAAGCAGG CTCCGACGTG 300AGCGCCACCG ACTTCCGCCT CAACGGCATG CTGCACCAGC ACGCAGTCCA CGCGCCCGCG 360CGCGAGCGTC ATGCGCGAGC TCATCCGGCT GGGGTGCAGC CCAGCGGCCA AAAACATGTT 420TGGGAACACG CCGATGCACA TGCTGGCCAT GGAAAGCTCC TGCCGCCGCT CGCTGATCCT 480CCCGCTGCTG GAGGCAGGGC TTTCCGTGAA CGAGGAGAAC CTGCACTACG GCACCGTGCC 540TCTGCACGTG GCCTCGGGGT ACGACAACAC GCAGGGCTGC CTCAAGCTCC TCCGGCAGGG 600AGGAGACCCC ACCGTCGTGT CAGCCGCCGG ACGCACACCG ATCTCGAACA TGCTCGTCAA 660ACGCAACCAC GTGGCGGTCG CCGGCGCGCT GTCGACGCAC CCGAGCGCGG CAGTGGTCGT 720GCAGGCTCTC GAGCAGGCTC TCGAGAACGT GCTGAACGCC GGGCCCAGCG AGGCCTCGCG 780GCTCGCCGTG GCCTTTGTGG TGGCGCGCGC CGGCGCATCC GCGCTACCGG 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(A)长度：1620个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(A)生物：Parapox ovis

(B)病毒株：D1701-蛋白质激酶基因F10L(2型)(ⅹⅰ)SEQ ID NO:9的序列描述：CGAGTGACTG CCCATCCCGT TGCTGCGCGA CTCGGGACTG CCCTCTGTTT TTCTTTCCCG 60TTTCTTCTTA TTAGGTAGTT GTTGCCCACC TCCATGATCC TCGCACGCGC TGGCGGGCGA 120CCTCGCACGC CCGCGGCGGC CGCGGCGGCC GCCGAGGACG GCAAGAACAG TGATCGCCGG 180AAGCGCAAGC GCAAGACGCC CAACTGCGAA GACGCCGACA ACTCCGACGA CGAGCTAGCG 240CAGACGCCGT GCGACCGCGA GTGGCCGGAC TGTCGCGCGA GCTCGATCAC GAGCTCCGAC 300TCGGTCTCTC TCGGCGACGA GATCTACTTG CGGTACGTAG CCTCGCAGGT GGACTTCGCG 360CAGACCTGGG CCCCGCCGGT GCGGCTGCTG CGCTTCTTCG GGAACTTCTC GAAGGAAACG 420CTCAGCCGCA TGTCGCGGCG CGGGTACGTG AACCGCTCCT ACTTCCAGAT GGCGCACGCG 480CGCTTCTCGC CCACCAACGA CGACATGTAC CACATGGCCA CTGGCGGGTA CGGCATCGTG 540TTCCGCTTCG ACCGCTACGT GGTCAAGTAC GTCTTCGAGC ACCGCAACGG CATGTCCGAG 600ATGGACGCCT CTACGGAGTA CACGGTGCCG CGGTTCCTGC GCAATAACCT CAAGGGCGAC 660GAGCGCGAGT TCGTGGTCTG CGCGCTGGCC ATGGGGCTGA ACTACCGGCT GGGCTTCCTG 720CACTCGCTGT ACCGGCGCGT GCTGCACACG CTGCTGCTGC TCATGCGCGT GGAGGAAGGC 780CAGCGGCCCT CGGTAGAGAT GGCCAAGAAG CCGCTGCTGC GCTGGTTCGA GGCGCGCAAG 840GACAGCGAGT CCTTCGTGCG CCTGGTCTCG TACTTCTACC CCTCGGCCGT GCAGAGCAAC 900GTGAACCTGA TCAACAACTT CCACCACCTG GTGCACTTCT TTGAGCACGA GAAGCGCGCG 960CGGTACGTGT TCGACCGCGG GGCCGTGATC GTGTTCCCTC TGGCGCGCGG GTCCGCGGAC 1020TCGATCTCGC CGGAGGCGGC GGCAGCGCTG GGCTTCGCGC GGCACTCGGA GTTCCTCAAG 1080TTCGTGTTCC TGCAGATCGC GCTGCTGTAC CTGAAGATAT ACGAGCTCCC GGGCTGCACG 1140AACTTCCTGC ACGTGGACCT GAAGCCCGAC AACGTGCTCA TCTTCGACAG CGCGCGCGCG 1200CTCAGCGTGA CTGCGGCCGG TGCGACTTTT CGCTTCGAAG AGCCCGTGCG CGCGGCGCTG 1260AACGACTTCG ACTTCGCGCG CGTGGCCACC ATCGAGAACC GCAAGATCGC GGGCAGCGTC 1320CGCGTGCCGC AGAACTGGTA CTACGACTTC CACTTCTTCG CGCACACGCT GCTGCGCGCG 1380TACCCGCACA TCGCCGCGGA GGACCCGGGC TTCCACGCGC TGCTCTCGGA GCTCACGGTC 1440TCGTGCTCGC GCGGGACCTG CGACCGCTTC CGGCTGCGCG TGTCCTCGCC GCACCCCATC 1500GAGCACCTCG CGCGGCTGGT GCGCCGCGAC GTCTTCTCCC GCTGGATAAA TGCCGCCGCG 1560GACGCCCCCG ACGCCGCACT CTCCTGAGCC CACGCCCGCG GCGCCGGGCT CGCTGTACGA 1620(2)SEQ ID NO:10的信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：780个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(A)生物：Parapox ovis

(B)病毒株：D1701-F9L基因，2型(ⅹⅰ)SEQ ID NO:10的序列描述：GAGCACCTCG CGCGGCTGGT GCGCCGCGAC GTCTTCTCCC GCTGGATAAA TGCCGCCGCG 60GACGCCCCCG ACGCCGCACT CTCCTGAGCC CACGCCCGCG GCGCCGGGCT CGCTGTACGA 120CGTCTTCCTC GCGCGCTTCC TGCGCCAGCT GGCCGCGCGC GCGGCGCCGG CCTCGGCCGC 180CTGCGCCGTG CGCGTGGGTG CGGTGCGCGG CCGCCTGCGG AACTGCGAGC TGGTGGTGCT 240GAACCGCTGC CACGCGGACG CTGCCGGCGC GCTCGCGCTG GCCTCCGCGG CGCTGGCGGA 300AACGCTGGCG GAGCTGCCGC GCGCGGACAG GCTCGCCGTC GCGCGCGAGC TGGGCGTGGA 360CCCAGAGCAC CCGGAGCTGA CGCCGGACCC CGCCTGCGCG GGCGAGAGCG CGCTTGCGCA 420GAACATCGAC ATCCAGACGC TGGACCTGGG CGACTGCGGC GACCCCAAAG GCCGCCGACT 480GCGCGTGGCG CTGGTGAACA GCGGCCACGC GGCCGCAAAC TGCGCGCTCG CGCGCGTAGC 540GACCGCGCTG ACGCGCCGCG TGCCCGCAAG CCGGCACGGC CTCGCGGAGG GCGGCACGCC 600GCCGTGGACG CTGCTGCTGG CGGTGGCCGC GGTGACGGTG CTCAGCGTGG TGGCGGTTTC 660GCTGCTGCGG CGCGCGCTGC GGGTGCGCTA CCAATTCGCG CGGCCGGCCG CGCTGCGCGC 720GTAGCCGCGC AAAATGTAAA TTATAACGCC CAACTTTTAA GGGTGAGGCG CCATGAAGTT 780(2)SEQ ID NO:11的信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：297个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(A)生物：Parapox ovis

(B)病毒株：D1701-10kD基因(ⅹⅰ)SEQ ID NO:11的序列描述：CAATATGGAG GAAAATGACG GAGAAAACCT ATTGGCTCAG CCTGATGATG ATACAGACAA 60TTTAACCAAC GGAGTGTACG CGGCTGGAGC TCCAACTAAA GAAAGTGTGG AAGAGCGTCT 120CGTAAGCTTG TTAGACGGTT ACAAAAATAT AACTGATTGC TGCAGAGAAA CAGGTAACCG 180GTTAGACAGA CTAGAAAGAC ACTTGGAGAG TCTACGTAAA GCTCTTCTTG ATCTCAACAG 240AAAAATAGAT GTACAGACAG GATACAGCAG ATATTAGATA CCGCTGTGTT GCGTCTG 297(2)SEQ ID NO:12的信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：5519个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(A)生物：Parapox ovis

(B)病毒株：D1701,HindⅢ片段I,2型(ⅹⅰ)SEQ ID NO:12的序列描述：AAGCTTGTTG CGCGAGTACG TGGTGACCCG CGCCTACTCG GATCAGACCG AGCCGATCAT 60GGACTTGCTC ATCGGCATGG GCGCCGACGT GGACATGCAG GTCGGCGTGT GCCGCACGGC 120GCTGCACGCC TGCCTTACGG GCTTGAACAC GAACCCGTGC ATGATTCGCG CGCTGCTTCG 180GCGCGGCGCC AGCGTGACCG CAAAAGACAC CTACGAGATG ACGCCACTGG CGGTGTTGCT 240GAAGTCCGCG AGCGCGACGC CGGAGCTCGT GCGCATCCTC GTGGAAGCAG GCTCCGACGT 300GAGCGCCACC GACTTCCGCC TCAACGGCAT GCTGCACCAG CACGCGCAGT CCACGCGCCC 360GCGCGCGAGC GTCATGCGCG AGCTCATCCG GCTGGGGTGC AGCCCAGCGG CCAAAAACAT 420GTTTGGGAAC ACGCCGATGC ACATGCTGGC CATGGAAAGC TCCTGCCGCC GCTCGCTGAT 480CCTCCCGCTG CTGGAGGCAG GGCTTTCCGT GAACGAGGAG AACCTGCACT ACGGCACCGT 540GCCTCTGCAC GTGGCCTCGG GGTACGACAA CACGCAGGGC TGCCTCAAGC TCCTCCGGCA 600GGGAGGAGAC CCCACCGTCG TGTCAGCCGC CGGACGCACA CCGATCTCGA ACATGCTCGT 660CAAACGCAAC CACGTGGCGG TCGCCGGCGC GCTGTCGACG CACCCGAGCG CGGCAGTGGT 720CGTGCAGGCT CTCGAGCAGG CTCTCGAGAA CGTGCTGAAC GCCGGGCCCA GCGAGGCCTC 780GCGGCTCGCC GTGGCCTTTG TGGTGGCGCG CGCCGGCGCA TCCGCGCTAC CGGAGGCCGT 840GCGCCGTCTT CACGAGGGCT TCGTCGCCGA CTGCGAGCGC GAAGTCGCGT TGCTTTCCCG 900CAGCATGCTC GGCACACCGG CCGTGAGCGC GCTGGTCGTG CTGGTCAGCA AGGAGGTCTT 960TGGCACTGTT ATCTCCTCGC GTGCGCTGCG CGTCGCGCGG GAGGTCCGCG TGTACGCAAG 1020GCCGCTCCGC GAGGCGCTCA TAAATCTGCG CCACAAATGC CGCTTAGTTT CCAGCCTTAA 1080AAGGCAAGTG GGACCCTGCT CGCTGCCCGG CGAACTGGTG GAGCGCGTGC TCGCGACCGT 1140GCCACTGGCC GACTTGCGCC GCTCGTGCAG CCGCCGCGCG CCCGAGTGAC TGCCCATCCC 1200GTTGCTGCGC GACTCGGGAC TGCCCTCTGT TTTTCTTTCC CGTTTCTTCT TATTAGGTAG 1260TTGTTGCCCA CCTCCATGAT CCTCGCACGC GCTGGCGGGC GACCTCGCAC GCCCGCGGCG 1320GCCGCGGCGG CCGCCGAGGA CGGCAAGAAC AGTGATCGCC GGAAGCGCAA GCGCAAGACG 1380CCCAACTGCG AAGACGCCGA CAACTCCGAC GACGAGCTAG CGCAGACGCC GTGCGACCGC 1440GAGTGGCCGG ACTGTCGCGC GAGCTCGATC ACGAGCTCCG ACTCGGTCTC TCTCGGCGAC 1500GAGATCTACT TGCGGTACGT AGCCTCGCAG GTGGACTTCG CGCAGACCTG GGCCCCGCCG 1560GTGCGGCTGC TGCGCTTCTT CGGGAACTTC TCGAAGGAAA CGCTCAGCCG CATGTCGCGG 1620CGCGGGTACG TGAACCGCTC CTACTTCCAG ATGGCGCACG CGCGCTTCTC GCCCACCAAC 1680GACGACATGT ACCACATGGC CACTGGCGGG TACGGCATCG TGTTCCGCTT CGACCGCTAC 1740GTGGTCAAGT ACGTCTTCGA GCACCGCAAC GGCATGTCCG AGATGGACGC CTCTACGGAG 1800TACACGGTGC CGCGGTTCCT GCGCAATAAC CTCAAGGGCG ACGAGCGCGA GTTCGTGGTC 1860TGCGCGCTGG CCATGGGGCT GAACTACCGG CTGGGCTTCC TGCACTCGCT GTACCGGCGC 1920GTGCTGCACA CGCTGCTGCT GCTCATGCGC GTGGAGGAAG GCCAGCGGCC CTCGGTAGAG 1980ATGGCCAAGA AGCCGCTGCT GCGCTGGTTC GAGGCGCGCA AGGACAGCGA GTCCTTCGTG 2040CGCCTGGTCT CGTACTTCTA CCCCTCGGCC GTGCAGAGCA ACGTGAACCT GATCAACAAC 2100TTCCACCACC TGGTGCACTT CTTTGAGCAC GAGAAGCGCG CGCGGTACGT GTTCGACCGC 2160GGGGCCGTGA TCGTGTTCCC TCTGGCGCGC GGGTCCGCGG ACTCGATCTC GCCGGAGGCG 2220GCGGCAGCGC TGGGCTTCGC GCCGCACTCG GAGTTCCTCA AGTTCGTGTT CCTGCAGATC 2280GCGCTGCTGT ACCTGAAGAT ATACGAGCTC CCGGGCTGCA CGAACTTCCT GCACGTGGAC 2340CTGAAGCCCG ACAACGTGCT CATCTTCGAC AGCGCGCGCG CGCTCAGCGT GACTGCGGCC 2400GGTGCGACTT TTCGCTTCGA AGAGCCCGTG CGCGCGGCGC TGAACGACTT CGACTTCGCG 2460CGCGTGGCCA CCATCGAGAA CCGCAAGATC GCGGGCAGCG TCCGCGTGCC GCAGAACTGG 2520TACTACGACT TCCACTTCTT CGCGCACACG CTGCTGCGCG CGTACCCGCA CATCGCCGCG 2580GAGGACCCGG GCTTCCACGC GCTGCTCTCG GAGCTCACGG TCTCGTGCTC GCGCGGGACC 2640TGCGACCGCT TCCGGCTGCG CGTGTCCTCG CCGCACCCCA TCGAGCACCT CGCGCGGCTG 2700GTGCGCCGCG ACGTCTTCTC CCGCTGGATA AATGCCGCCG CGGACGCCCC CGACGCCGCA 2760CTCTCCTGAG CCCACGCCCG CGGCGCCGGG CTCGCTGTAC GACGTCTTCC TCGCGCGCTT 2820CCTGCGCCAG CTGGCCGCGC GCGCGGCGCC GGCCTCGGCC GCCTGCGCCG TGCGCGTGGG 2880TGCGGTGCGC GGCCGCCTGC GGAACTGCGA GCTGGTGGTG CTGAACCGCT GCCACGCGGA 2940CGCTGCCGGC GCGCTCGCGC TGGCCTCCGC GGCGCTGGCG GAAACGCTGG CGGAGCTGCC 3000GCGCGCGGAC AGGCTCGCCG TCGCGCGCGA GCTGGGCGTG GACCCAGAGC ACCCGGAGCT 3060GACGCCGGAC CCCGCCTGCG CGGGCGAGAG CGCGCTTGCG CAGAACATCG ACATCCAGAC 3120GCTGGACCTG GGCGACTGCG GCGACCCCAA AGGCCGCCGA CTGCGCGTGG CGCTGGTGAA 3180CAGCGGCCAC GCGGCCGCAA ACTGCGCGCT CGCGCGCGTA GCGACCGCGC TGACGCGCCG 3240CGTGCCCGCA AGCCGGCACG GCCTCGCGGA GGGCGGCACG CCGCCGTGGA CGCTGCTGCT 3300GGCGGTGGCC GCGGTGACGG TGCTCAGCGT GGTGGCGGTT TCGCTGCTGC GGCGCGCGCT 3360GCGGGTGCGC TACCAATTCG CGCGGCCGGC CGCGCTGCGC GCGTAGCCGC GCAAAATGTA 3420AATTATAACG CCCAACTTTT AAGGGTGAGG CGCCATGAAG TTTCTCGTCG GCATACTGGT 3480AGCTGTGTGC TTGCACCAGT ATCTGCTGAA CGCGGACAGC ACGAAAACAT GGTCCGAAGT 3540GTTTGAAAAC AGCGGGTGCA AGCCAAGGCC GATGGTCTTT CGAGTACACG ACGAGCACCC 3600GGAGCTAACT TCTCAGCGGT TCAACCCGCC GTGTGTCACG TTGATGCGAT GCGGCGGGTG 3660CTGCAACGAC GAGAGCTTAG AATGCGTCCC CACGGAAGAG GCAAACGTAA CGATGCAACT 3720CATGGGAGCG TCGGTCTCCG GTGGTAACGG GATGCAACAT CTGAGCTTCG TAGAGCATAA 3780GAAATGCGAT TGTAAACCAC CACTCACGAC CACGCCACCG ACGACCACAA GGCCGCCCAG 3840AAGACGCCGC TAGAACTTTT TATGGACCGC ATATCCAAAC GATGATGCGA TCAGGTCATG 3900CGGAAGGAGG CTCCACGGAG CAAAGTGAAA AAGGACCGCC TAGAGTCGAG ACCCCTCCCT 3960CCCGCCTCGG GCAAACCCAC AGCCGCCGCA AACACCACAC CCGCCGACCT ACCATGCACC 4020CCTCGCCGCG CCGGCTGCTC GGCGCGCTCG CGCTGCTGGC GCTGGGCTTC GCTCGGCGCG 4080CTCTTCGCCC CGCGGCGCCG CTCGTGCCGG CCGCCTTCCT GGAGGTGGGG CACGTGCGCG 4140CGAACCCGTC CGCCTCGGTG ACCTGCCTCA CGGTGGGCGG CGACGGGCGG CACATGGCGG 4200CGGTCGCGCA CGGCGGCGGG ACGCTCTCGC CGGTGTACCC GCTGGCCGCC GGCATGCACG 4260CGACCTTCTC CTCCGCGCGC AAGGGCGCGC TGCTGCTGAA CGTCGCGACC GTGACTGTGT 4320ACGACGTGCG CGCGCTCGCC CCCGAGTTCG AGCTCGTCTG CATCGCGGTG GTCGGCGGCT 4380ACAACTCGGC CGCGGCCGCC ACGCGGCCCG CGGCCGAGTG GCACCGCCAG CTGGAGCTGC 4440GCCGCTCGGA GCTGTGACCC CTCCCTCCCC GGTCTCCCTC TGTCTTTGTA ATCGGCCTTA 4500GAGATTAGAC ATCATCCTCC ACGCCTCTTT GTCCGCCGCC CTTCTTCGCG GACGGATGAA 4560CCAATTAATT AATTATTTTT GTCGCTCGCC CGCTCACTCC GGCAAGGGAA CGAGTGACGT 4620TAACTCTCTC ACCCTCACGC ACAAGAACAA GAACCGCTCA CTCACCGGGC AAGGGAACAC 4680GGTTAAGGTC AACTCACTCG CGAGAACAAG TTGACCCTCA CTCTAGAGAA CGAGGAACGG 4740GCAACAAGCA ACCGTCAACT CACTTACCAC GAGAACAAGT TGACCGCCAC TCAAAGGGAA 4800CAGAGAACAG TAACCGTTCT CGCTCGCTCG GAACAATAGA ACAAGTTAAC GTCAACTCGC 4860TCGCTCGGTG TAAGAGAACA ACAGAACAAG CAACTGTTGA CCACTCAACC CCCGGAGAAG 4920AGAACAAGAG AGCAGTCAAC TCACCCACTC AGTCTTGGAT GAGAGGAGGA CGAGTTAACG 4980AGTACTCGCA CGCAGAGTGA GAGAGTGAGG ACATAATAAT AGTTAACGAG TTAATACTCA 5040CTCGCTCACT CAGAGTGAGA GAGAACCAGT GAGCGAGTTA ACCGCGCACA CGAGCGAGAG 5100AACAGTGAAC TGCTCGCGCG CTCGCTCGGT AGCAGTCGGC CTTTCTTAAA ACGGTTCGTA 5160AAACTTTTCC CGAGACAGTT CACCCTCCAA AACTTTTAAA ACTAAACTCG GAGGTGGCCT 5220GCCCTCCACT CTCCGTAAAA CTTTTGTAAA ACTGTCGGAG GTCGGTCGAC TTCGCAACTC 5280GTCCGCGAAA ACTTTTCGTG GGCAGTGTCT GCCTCTCTCA GGCTCCTCGC ATCACTTTCG 5340CGGAGCCTCG AGGTAGGTCA CCTCTCTCCA AACTTTTGTA AAAACTTTTT CGCGGAGCCT 5400CTGGAGGCCG TCCTCCCTCC AAAACTTTTC GTAAAATCTC TTCGGAGGCC GTCCTCCCTC 5460CAAAACTTTT CGTAAAATCT TTGGGAGGTC GACCTCCCTC AAAACTTTTT ATAAAGCTT 5519(2)SEQ ID NO:13的信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：1742个碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：双链

(A)生物：Parapox ovis

(B)病毒株：D1701-蛋白质激酶基因F10L(3型) (ⅹⅰ)SEQ ID NO:13的序列描述：CGAGTGACTG CCCATCCCGT TGCTGCGCGA CTCGGGACTG CCCTCTGTTT TTCTTTCCCG 60TTTCTTCTTA TTAGGTAGTT GTTGCCCACC TCCATGATCC TCGCACGCGC TGGCGGGCGA 120CCTCGCACGC CCGCGGCGGC CGCGGCGGCC GCCGAGGACG GCAAGAACAG TGATCGCCGG 180AAGCGCAAGC GCAAGACGCC CAACTGCGAA GACGCCGACA ACTCCGACGA CGAGCTAGCG 240CAGACGCCGT GCGACCGCGA GTGGCCGGAC TGTCGCGCGA GCTCGATCAC GAGCTCCGAC 300TCGGTCTCTC TCGGCGACGA GATCTACTTG CGGTACGTAG CCTCGCAGGT GGACTTCGCG 360CAGACCTGGG CCCCGCCGGT GCGGCTGCTG CGCTTCTTCG GGAACTTCTC GAAGGAAACG 420CTCAGCCGCA TGTCGCGGCG CGGGTACGTG AACCGCTCCT ACTTCCAGAT GGCGCACGCG 480CGCTTCTCGC CCACCAACGA CGACATGTAC CACATGGCCA CTGGCGGGTA CGGCATCGTG 540TTCCGCTTCG ACCGCTACGT GGTCAAGTAC GTCTTCGAGC ACCGCAACGG CATGTCCGAG 600ATGGACGCCT CTACGGAGTA CACGGTGCCG CGGTTCCTGC GCAATAACCT CAAGGGCGAC 660GAGCGCGAGT TCGTGGTCTG CGCGCTGGCC ATGGGGCTGA ACTACCGGCT GGGCTTCCTG 720CACTCGCTGT ACCGGCGCGT GCTGCACACG CTGCTGCTGC TCATGCGCGT GGAGGAAGGC 780CAGCGGCCCT CGGTAGAGAT GGCCAAGAAG CCGCTGCTGC GCTGGTTCGA GGCGCGCAAG 840GACAGCGAGT CCTTCGTGCG CCTGGTCTCG TACTTCTACC CCTCGGCCGT GCAGAGCAAC 900GTGAACCTGA TCAACAACTT CCACCACCTG GTGCACTTCT TTGAGCACGA GAAGCGCGCG 960CGGTACGTGT TCGACCGCGG GGCCGTGATC GTGTTCCCTC TGGCGCGCGG GTCCGCGGAC 1020TCGATCTCGC CGGAGGCGGC GGCAGCGCTG GGCTTCGCGC CGCACTCGGA GTTCCTCAAG 1080TTCGTGTTCC TGCAGATCGC GCTGCTGTAC CTGAAGATAT ACGAGCTCCC GGGCTGCACG 1140AACTTCCTGC ACGTGGACCT GAAGCCCGAC AACGTGCTCA TCTTCGACAG CGCGCGCGCG 1200CTCAGCGTGA CTGCGGCCGG TGCGACTTTT CGCTTCGAAG AGCCCGTGCG CGCGGCGCTG 1260AACGACTTCG ACTTCGCGCG CGTGGCCACC ATCGAGAACC GCAAGATCGC GGGCAGCGTC 1320CGCGTGCCGC AGAACTGGTA CTACGACTTC CACTTCTTCG CGCACACGCT GCTGCGCGCG 1380TACCCGCACA TCGCCGCGGA GGACCCGGGC TTCCACGCGC TGCTCTCGGA GCTCACGGTC 1440TCGTGCTCGC GCGGGACCTG CGACCGCTTC CGGCTGCGCG TGTCCTCGCC GCACCCCATC 1500GAGCACCTCG CGCGGCTGGT GCGCCGCGAC GTCTTCTCCC GCTGGATAAA TGCCGCCGCG 1560GACGCCCCCG ACGCCGCACT CTCCTGAGCC CACGCCCGCG GCGCCGGGCT CGCTGTACGA 1620CGTCTTCCTC GCGCGCTTCC TGCGCCAGCT GGCCGCGCGC GCGGCGCCGG CCTCGGCCGC 1680CTGCGCCGTG CGCGTGGGTG CGGTGCGCGG CCGCCTGCGG AACTGCGAGC TGGTGGTGCT 1740GA 1742(2)SEQ ID NO:14的信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：497氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑学：线型(ⅱ)分子类型：蛋白质(ⅲ)假设：无(ⅳ)反义：无(ⅵ)原始来源：

(A)生物：Parapox ovis

(B)病毒株：D1701-蛋白质激酶F10L(ⅹⅰ)SEQ ID NO:14的序列描述：Met Ile Leu Ala Arg Ala Gly Gly Arg Pro Arg Thr Pro Ala Ala Ala1 5 10 15Ala Ala Ala Ala Glu Asp Gly Lys Asn Ser Asp Arg Arg Lys Arg Lys

20 25 30Arg Lys Thr Pro Asn Cys Glu Asp Ala Asp Asn Ser Asp Asp Glu Leu

35 40 45Ala Gln Thr Pro Cys Asp Arg Glu Trp Pro Asp Cys Arg Ala Ser Ser

50 55 60Ile Thr Ser Ser Asp Ser Val Ser Leu Gly Asp Glu Ile Tyr Leu Arg65 70 75 80Tyr Val Ala Ser Gln Val Asp Phe Ala Gln Thr Trp Ala Pro Pro Val

85 90 95Arg Leu Leu Arg Phe Phe Gly Asn Phe Ser Lys Glu Thr Leu Ser Arg

100 105 110Met Ser Arg Arg Gly Tyr Val Asn Arg Ser Tyr Phe Gln Met Ala His

115 120 125Ala Arg Phe Ser Pro Thr Asn Asp Asp Met Tyr His Met Ala Thr Gly

130 135 140Gly Tyr Gly Ile Val Phe Arg Phe Asp Arg Tyr Val Val Lys Tyr Val145 150 155 160Phe Glu His Arg Asn Gly Met Ser Glu Met Asp Ala Ser Thr Glu Tyr

165 170 175Thr Val Pro Arg Phe Leu Arg Asn Asn Leu Lys Gly Asp Glu Arg Glu

180 185 190Phe Val Val Cys Ala Leu Ala Met Gly Leu Asn Tyr Arg Leu Gly Phe

195 200 205Leu His Ser Leu Tyr Arg Arg Val Leu His Thr Leu Leu Leu Leu Met

210 215 220Arg Val Glu Glu Gly Gln Arg Pro Ser Val Glu Met Ala Lys Lys Pro225 230 235 240Leu Leu Arg Trp Phe Glu Ala Arg Lys Asp Ser Glu Ser Phe Val Arg

245 250 255Leu Val Ser Tyr Phe Tyr Pro Ser Ala Val Gln Ser Asn Val Asn Leu

260 265 270Ile Asn Asn Phe His His Leu Val His Phe Phe Glu His Glu Lys Arg

275 280 285Ala Arg Tyr Val Phe Asp Arg Gly Ala Val Ile Val Phe Pro Leu Ala

290 295 300Arg Gly Ser Ala Asp Ser Ile Ser Pro Glu Ala Ala Ala Ala Leu Gly305 310 315 320Phe Ala Pro His Ser Glu Phe Leu Lys Phe Val Phe Leu Gln Ile Ala

325 330 335Leu Leu Tyr Leu Lys Ile Tyr Glu Leu Pro Gly Cys Thr Asn Phe Leu

340 345 350His Val Asp Leu Lys Pro Asp Asn Val Leu Ile Phe Asp Ser Ala Arg

355 360 365Ala Leu Ser Val Thr Ala Ala Gly Ala Thr Phe Arg Phe Glu Glu Pro

370 375 380Val Arg Ala Ala Leu Asn Asp Phe Asp Phe Ala Arg Val Ala Thr Ile385 390 395 400Glu Asn Arg Lys Ile Ala Gly Ser Val Arg Val Pro Gln Asn Trp Tyr

405 410 415Tyr Asp Phe His Phe Phe Ala His Thr Leu Leu Arg Ala Tyr Pro His

420 425 430Ile Ala Ala Glu Asp Pro Gly Phe His Ala Leu Leu Ser Glu Leu Thr

435 440 445Val Ser Cys Ser Arg Gly Thr Cys Asp Arg Phe Arg Leu Arg Val Ser

450 455 460Ser Pro His Pro Ile Glu His Leu Ala Arg Leu Val Arg Arg Asp Val465 470 475 480Phe Ser Arg Trp Ile Asn Ala Ala Ala Asp Ala Pro Asp Ala Ala Leu

485 490 495Ser(2)SEQ ID NO:15的信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：132氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(A)生物：Parapox ovis

(B)病毒株：D1701-VEGF蛋白质(ⅹⅰ)SEQ ID NO:15的序列描述：Met Lys Phe Leu Val Gly Ile Leu Val Ala Val Cys Leu His Gln Tyr1 5 10 15Leu Leu Asn Ala Asp Ser Thr Lys Thr Trp Ser Glu Val Phe Glu Asn

20 25 30Ser Gly Cys Lys Pro Arg Pro Met Val Phe Arg Val His Asp Glu His

35 40 45Pro Glu Leu Thr Ser Gln Arg Phe Asn Pro Pro Cys Val Thr Leu Met

50 55 60Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Ser Leu Glu Cys Val Pro Thr65 70 75 80Glu Glu Ala Asn Val Thr Met Gln Leu Met Gly Ala Ser Val Ser Gly

85 90 95Gly Asn Gly Met Gln His Leu Ser Phe Val Glu His Lys Lys Cys Asp

100 105 110Cys Lys Pro Pro Leu Thr Thr Thr Pro Pro Thr Thr Thr Arg Pro Pro

115 120 125Arg Arg Arg Arg

130(2)SEQ ID NO:16的信息：(ⅰ)序列特征：

(A)长度：224氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(A)生物：Parapox oVis

(B)病毒株：D1701-蛋白质F9L(ⅹⅰ)SEQ ID NO:16的序列描述：Met Pro Pro Arg Thr Pro Pro Thr Pro His Ser Pro Glu Pro Thr Pro1 5 10 15Ala Ala Pro Gly Ser Leu Tyr Asp Val Phe Leu Ala Arg Phe Leu Arg

20 25 30Gln Leu Ala Ala Arg Ala Ala Pro Ala Ser Ala Ala Cys Ala Val Arg

35 40 45Val Gly Ala Val Arg Gly Arg Leu Arg Asn Cys Glu Leu Val Val Leu

50 55 60Asn Arg Cys His Ala Asp Ala Ala Gly Ala Leu Ala Leu Ala Ser Ala65 70 75 80Ala Leu Ala Glu Thr Leu Ala Glu Leu Pro Arg Ala Asp Arg Leu Ala

85 90 95Val Ala Arg Glu Leu Gly Val Asp Pro Glu His Pro Glu Leu Thr Pro

100 105 110Asp Pro Ala Cys Ala Gly Glu Ser Ala Leu Ala Gln Asn Ile Asp Ile

115 120 125Gln Thr Leu Asp Leu Gly Asp Cys Gly Asp Pro Lys Gly Arg Arg Leu

130 135 140Arg Val Ala Leu Val Asn Ser Gly His Ala Ala Ala Asn Cys Ala Leu145 150 155 160Ala Arg Val Ala Thr Ala Leu Thr Arg Arg Val Pro Ala Ser Arg His

165 170 175Gly Leu Ala Glu Gly Gly Thr Pro Pro Trp Thr Leu Leu Leu Ala Val

180 185 190Ala Ala Val Thr Val Leu Ser Val Val Ala Val Ser Leu Leu Arg Arg

195 200 205Ala Leu Arg Val Arg Tyr Gln Phe Ala Arg Pro Ala Ala Leu Arg Ala

210 215 220附图描述：图1．显示了质粒PORF-1/-2中orfD1701 Hind Ⅲ片段I的物理图谱。细箭头表示鉴定的mRNA，而粗箭头表示ORF。图2．显示了D1701基因组上Hind Ⅲ识别位点和在Hind Ⅲ片段I上鉴定的基因以及部分颠倒末端重复区的物理图谱。图3．显示了质粒pCE4。用NruⅠ裂解后，用LacZ表达盆取代396 bp的片段。图4．显示了质粒pCE9．其中经过用XcmⅠ裂解线型化后插入LacZ表达盒。图5．如说明书所述图示了使用PCR产生新的单一裂解位点的策略。图6．图示了使用核酸酶Bal 31双向截短后插入Eco RⅤ接头和LacZ表达盒。图7．显示了制备LacZ/gpt选择表达盒的策略：

Pirk：牛痘病毒11K启动子

PVEGF:PPV VEGF启动子

Sm:SmaⅠ

B:Bam H1图8．图示了克隆含10 KDa基因的PPV D1701 Eco RⅠ片段E的策略(如说明书所述)。

Claims

1．含有插入和/或缺失的重组制备的PPV。

2．在对病毒复制为非必需的基因组片段中含有插入和/或缺失的重组制备的PPV。

3．在为病毒复制所必需的基因组片段中含有插入和/或缺失的重组制备的PPV。

6．根据权利要求1至5的重组制备的PPV，其中插入和/或缺失位于D1701 Hind Ⅲ片段I中或位于来自其它PPV的相应于该片段的DNA中。

9．在ITR片段的区域或其邻近区域中含有插入和/或缺失的重组制备的PPV。

10．在HDlR基因区域或其邻近区域中含有插入和/或缺失的重组制备的PPV。

11．在F9L基因区域或其邻近区域中含有插入和/或缺失的重组制备的PPV。

13．在编码10 KDa蛋白质的基因位于其中的D1701 Eco RⅠ片段E的区域中含有插入和/或缺失的重组制备的PPV。

14．含有D1701 Hind Ⅲ片段I或来自其它PPV的相应于该片段的DNA的质粒。

15．一种含有D1701的Hind Ⅲ片段I的质粒，该质粒在为病毒复制所必需的该片段的区域中含有缺失和/或插入。

16．一种含有D1701的Hind Ⅲ片段I的质粒，该质粒在对病毒复制为非必需的该片段区域中含有缺失和/或插入。

17．一种含有D1701的Hind Ⅲ片段I的质粒，该质粒在对病毒复制为非必需的且位于不表达的区域中的片段区域含有缺失和/或插入。

18．一种含有D1701的Hind Ⅲ片段I的质粒，该质粒在对病毒繁殖为非必需的且位于表达区域中的该片段的区域中含有缺失和/或插入。

19．一种含有D1701的Hind Ⅲ片段I的质粒，该质粒在该片段的VEGF基因中或其邻近区域含有缺失和/或插入。

20．一种含有D1701的Hind Ⅲ片段I的质粒，该质粒在该片段的PK基因中或相邻于该基因含有缺失和/或插入。

21．一种含有D1701的Hind Ⅲ片段I的质粒，该质粒在该片段的ITR片段中或相邻于该片段含有缺失和/或插入。

22．一种含有D1701的Hind Ⅲ片段I的质粒，该质粒在HD1R基因和/或F9L基因中或与其相邻的区域中含有缺失和/或插入。

23．一种含有D1701的Eco RⅠ片段E的质粒，该质粒在编码10KDa蛋白质的基因中或相邻于该基因含有缺失和/或插入。

24．一种含有D1701的部分Hind Ⅲ片段I的质粒，其中该部分含有根据权利要求14至23的缺失和/或插入。

25．根据权利要求14至24的质粒，其中D1701的DNA片段被相应于该片段的来自于其它PPV的DNA取代。

26．根据权利要求14至25的质粒，其中含有完整的Hind Ⅲ片段I或只含有其一部分。

27．具有根据序列表ID No:8的序列的D1701基因组片段HindⅢ片段I或其部分或相应于该片段的来自其它PPV的片段。

29．D1701 Hind Ⅲ片段I的DNA片段或其部分，或相应于该片段或其部分的来自其它PPV的片段，它编码根据序列表IDNo:2,No:9的PK蛋白质。

30．具有根据序列表ID No:3的序列的PPV基因HD1R的DNA片段或其部分。

31．PPV F9L的DNA片段或其部分，具有根据序列表ID No:5的序列。

32．PPV ITR区域的DNA片段或其部分，具有根据序列表IDNo:4的序列。

33．以根据权利要求27至32的DNA片段的序列为基础制备的基因产物。

34．根据权利要求1至13的重组制备的PPV，它含有作为插入片段的，编码其它病原体致免疫成份的外源DNA。

35．根据权利要求1至13和34的重组制备的PPV，它含有作为插入片段的，编码细胞因子的外源DNA。

36．制备根据权利要求1至13,34和35的病毒的方法，其特征在于将根据权利要求14至26的质粒与PPV以已知的方式在细胞中重组并选择所需的病毒。

37．制备根据权利要求23的质粒的方法，其特征在于：

1．选择合适的副痘病毒病毒株，

2．纯化其基因组，

3．用限制性酶处理纯化的基因组，

4．将所得的片段插入质粒中，

5．对含有编码10KDa蛋白质的基因的质粒进行选择，且

6．如果合适，将插入片段和/或缺失导入编码10KDa蛋白质的基因中。

38．制备根据权利要求14至22和24至26的质粒的方法，其特征在于：

1．选择合适的副痘病毒病毒株，

2．纯化其基因组，

3．用限制性酶处理纯化的基因组，

4．将所得的片段插入质粒，和

5．对含有编码Hind Ⅲ片段I或相应于该片段的片段或部分的质粒进行选择，

39．制备编码10KDa蛋白质的D1701 Hind Ⅲ片段I或D1701Eco RⅠ片段E，或相应于该片段或链段的来自其它PPV的区域或其部分的方法，其特征在于：

1．选择合适的副痘病毒病毒株，

2．纯化其基因组，

3．用限制性酶处理纯化的基因组，

4．选择所需的片段或链段，或

5．如果合适，所得的基因组片段首先插入质粒中，然后分离含有

所需片段的质粒并繁殖这些质粒，从中分离所需的片段。

6．4中所述的片段(上文)如果合适，也可使用诸如聚合酶链式反应(PCR)或寡核苷酸合成的可供选择的方法来制备。

40．制备根据权利要求33的基因产物的方法，其特征在于根据权利要求39可获得的片段转移进合适的表达系统中且使用这些系统表达基因。

41．根据权利要求1至13的重组制备的PPV在疫苗中的用途。

42．根据权利要求1至13的重组制备的PPV在免疫和刺激非病原体特异性免疫防御的产品中的应用。

44．重组制备的PPV在异源表达外源DNA中的应用。

45．重组制备的PPV作为外源DNA的载体的应用。

46．根据权利要求14至16的质粒用于表达副痘特异性基因组片段的应用。

47．根据权利要求14至26的质粒用于制备诊断试剂的应用。

48．根据权利要求27至32的基因组片段用于制备诊断试剂的应用。

49．根据序列表ID No:6的DNA片段(VEGF基因的启动子)。

50．根据权利要求49的DNA片段用作表达DNA的启动子的应用。