KR19990087208A - 외래 디엔에이를 함유하는 파라폭스바이러스, 이들의 제조 방법및 이들의 백신으로의 용도 - Google Patents
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Abstract
외래 DNA를 함유하는 파라폭스바이러스, 이들의 제조 방법 및 백신에 있어서 이들의 용도
본 발명은 이들의 게놈에 외래 유전 정보의 형태의 결실 또는 삽입부를 가지고, 유전 정보를 함유하는 재조합에 의해 제조된 파라폭스바이러스, 이러한 구조물의 제조 및 이들의 백신에서의 용도에 관한 것이다.
Description
신규한, 제조합에 의해 변경된 파라폭스바이러스는 이들의 게놈에서 결실 및(또는) 삽입부를 갖는다. 파라폭스바이러스의 게놈의 세그먼트의 결실 및(또는) 외래 DNA의 삽입은 이들의 병원성을 감소 또는 상실을 초래할 수 있다(약독화). 병원체 또는 생물학적으로 활성인 물질로부터의 유전 정보는 삽입의 수단에 의해 파라폭스바이러스의 게놈 내로 조입된다. 이 외래 유전 정보는 재조합 파라폭스바이러스의 성분으로서 예를 들면 세포 배양물, 조직 또는 온전한 생물체 내에서 발현된다.
본 발명에 따라 제조된 재조합 파라폭스바이러스는 예를 들면 백신 또는 면역 조절약으로 사용된다. 파라폭스바이러스의 게놈에서 외래의 DNA의 발현은 예를 들면 백신화된 개체에서 외래 유전 정보에 의해 나타낸어지는 병원체에 대한 방어 작용을 유발시킨다. 백신화된 개체의 비특이적 내성이 또한 자극될 수 있다. (이하, 용어 파라폭스바이러스는 PPV로 약칭한다.)
PPV는 이들이 생물체내에서 비병원체-특이성 면역 반응을 자극하기 때문에 스스로 면역조절 효과를 가진다. 따라서, 파라폭스바이러스의 제제는 예를 들면 일반적인 내성을 증가시키기 위한 수의 약품으로 성공적으로 사용된다.
비병원체-특이성 효과를 가지는 백신은 방어를 확립하는데 항원에 따라서 몇일 내지 몇주를 요하는 반면, 이들은 수개월 내지 몇 년 동안 지속되는 오랜 방어를 제공한다.
결과적으로, 재조합 파라폭스바이러스를 기초로 제조된 백신은 이들이 생물체 내에서 오래 지속되는 병원체-특이성 면역성을 구축하고 또한 매우 신속하게 개시되는 비병원체-특이성 방어를 유발하기 때문에 감염성 질환의 개선된 제어를 위한 생물학적 제품으로서 사용될 수 있다.
PPV의 면역조절제 특성 및 상동성 및(또는) 이형의 병원체-특이성 방어를 유발하는 외래 항원의 발현의 조합은 신규한 것이다. 이는 감염에 대한 신속하게 개시되고, 넓은 비병원체 특이성을 갖는 방어를 중재하고 또한 감염에 대하여 오래 지속되고, 병원체-특이성인 방어를 제공하는 제품의 제조를 허용한다.
척추동물의 파라폭스바이러스과 (Chordopoxvirinae)는 개별적인, 독립된 속으로 세분된다. 본 발명은 구조적으로 및 유전적으로 모두 상이한 다른 폭스바이러스인 PPV의 속에 관련된다. PPV는 3개의 다른 종으로 나누어진다.(참고문헌: 1).
- 이 속의 원형으로 간주되는 파라폭스바이러스 오비스(Parapoxvirus ovis, 또한 접촉감염성 농창 바이러스, 접촉성 농포 피부염 바이러스 또는 orf 바이러스라고도 함)
- 파라폭스바이러스 보비스 1(Parapoxvirus bovis 1, 소 구진 위염 바이러스 또는 위염 구진 바이르스라고도 부름) 및
- 파라폭스바이러스 보비스 2(Parapoxvirus bovis 2, 우더폭스바이러스, 파라백시니아 바이러스, 슈도콕스바이러스 또는 밀커스 노들(milker's nodule) 바이러스라고도 부름).
낙타, 붉은 사슴, 샤무아, 바다표범 및 바다사자로부터 단리된 파라폭스바이러스 유사체도 또한 기술되었다. 이들 바이러스가 파라폭스바이러스 속 내의 자율적인 종인가 또는 이들이 상기 종들의 격리체인가 하는 것은 아직 최종적으로 해명되지 않고 있다.
PPV로의 감염은 동물 및 사람 모두에 있어서 국소 질환을 유발한다(동물원성 병원체). 참고문헌 1은 지금까지 기술된 증후군의 개요를 제공한다. 백신 등의 예방적 수단은 이 질환을 제어하는데 사용할 수 있다. 그러나, 지금까지 얻을 수 있었고 전적으로 파라폭스바이러스 오비스를 기초하여 개발해왔던 백신의 활성은 만족스럽지 못하다 (참고문헌 2).
본 발명은 발현되는 외래 유전 정보에 대한 백터로서 PPV를 사용하는 것에 관련된다.
아비폭스, 라쿤폭스, 카프리폭스, 스윈폭스 또는 백시니아 바이러스에 기초한 벡터들은 이미 외래 유전 정보를 발현시키기 위한 벡터로서 기술되어 있다. 이와 관련하여 얻어진 통찰력은 PPV로 전용될 수 없다. 비교 연구에 의해서 밝혀진 바와 같이, 형태학적, 구조적 및 유전적 차이가 폭스바이러스의 개별 종 사이에 존재한다. 따라서, 혈청학적 방법이 예를 들면 다른 단백질 패턴 및 이와 연관된 다른 유전 정보에 기인하는 사실을 기초로 PPV를 다른 폭스바이러스 속으로부터 구분하는데 사용될 수 있다. 예를 들면, 폭스바이러스의 일부 유사체는 적혈구를 응집하는 능력을 갖는다. 이 활성은 소위, 해마글루티닌(HA)이라고 하는 표면 단백질에 의해 매개된다. PPV는 이 활성을 가지지 않는다.
PPV 게놈의 구성의 지식은 현재 게놈의 크기의 측정, 핵산의 GC 함량, 비교 제한 효소 분석, 개별 게놈 단편의 클로닝, 부분 영역들의 서열 분석 및 개별 유전자의 관련된 예비 기재 사항에 제한되어 있다 (참고문헌: 1, 5, 및 6 참조).
현재 백시니아의 경우에 알려진 삽입 부위를 사용하는 것은 가능하지 않은데 이는 이들 부위가 결핍되거나 또는 PPV에서 입증되지 않은 사실에 기인한다.
따라서, PPV 게놈에 있어서 티미딘 키나아제에 대한 유전자를 동정하고 이것을 오르도폭스바이러스의 경우에서와 같이 삽입 부위로서 사용하려는 시도는 성공하지 못했다. 마주르(Mazur) 및 그의 동료들(참고문헌 3)은 백시니아 바이러스(오르토폭스바이러스)의 티미딘 키나아제 유전자를 닮은 것으로 주장하는 PPV 게놈 세그먼트의 동정에 관하여 기술하고 있는데, 본 발명자들의 광범위한 연구에 의하여 PPV에서 그러한 유전자의 존재를 확인할 수 없었다. 다른 저자들(참고문헌: 1)도 또한 PPV에서 티미딘 키나아제 유전자를 발견할 수 없었다. HA에 대한 유전자는 백시니아 바이러스에서 외래 DNA에 대한 삽입 부위로서 사용된다. 상기한 바와 같이, PPV는 이 활성을 갖지 않는다.
1992년에, 로빈슨 및 리틀(Robinson and Lyttle)은 PPV 게놈에 있어서 별도의 삽입 부위를 언급(참고문헌: 1)하였으나 이들 부위의 기재 또는 정확한 특성화는 제공하지 않았다. PPV의 백터로서의 성공적인 기재는 아직까지도 없다.
PPV 균주 D1701로부터 HindIII 단편 I의 서열에 대한 본 발명자들 자신의 분석 연구 결과에서, 본 발명자들은 다양한 포유류종(예컨대, 마우스, 쥐, 기니아피그, 젖소 및 사람)에 있어서 혈관 내피 성장 인자(VEGF)를 사용하여 아미노산 상동성(36.1 내지 38.3% 동일성; 52.8 내지 56.8% 유사성, GCG, Wisconsin Package 8.1, 즉 Pickup Program)을 가진 ORF를 발견하였다. 서열 확인 번호 1은 D1701에서 유전자의 뉴클레오티드 서열을 나타내고, 서열 확인 번호 15는 대응하는 D1701 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다. 최근, 상동성 유전자가 PPV 균주 NZ2 및 NZ7(참고문헌: 6)에서도 기술되었다; 그러나 이 유전자의 기능은 알려지지 않았다. 다른 폭스바이러스, 예컨대 오르도폭스바이러스는 대응 유전자를 가진 것으로 알려지지 않고 있다. 이후의 기재에 있어서 유전자는 VEGF 유전자를 의미한다.
D1701로부터 HindIII 단편 I에 대한 본 발명자들의 서열 분석에 의하여 오르토폭스바이러스 단백질 키나아제 유전자와 상동성을 가지고 백시니아에서 F10L로서 알려진 또다른 ORF를 동정하였다. 백시니아 F10L과의 동일성은 51%인 반면 유사성은 70%이다. 본 출원의 이후의 기재에 있어서, 이 유전자는 PK 유전자로 명명한다. 서열 확인 번호 2, 번호 9 및 13은 D1701에서 유전자의 뉴클레오티드 서열의 버전들을 나타내고 서열 확인 번호 14는 대응 D1701 단백질의 아미노산 서열을 나타낸다.
PK 유전자의 3' 말단 및 VEGF 유전자의 5' 말단과 중첩되는 추가의 ORF가 발견되었다. 상동성 조사에 의하면 백시니아의 F9L 유전자와 낮은 동일성 (28%) 및 낮은 유사성 (51%)이 있었다. 서열 확인 번호 5 및 10은 D1701에서 유전자의 뉴클레오티드 서열의 버전을 나타낸다. 본 명세서의 이후의 기재에 있어서, 이 유전자는 F9L 유전자라고 한다.
PPV NZ2에 대한 유사성(동일성 76%, 유사성 83%)에 기인하여 ORF3으로 명명된 또다른 ORF는 ITR영역 내에서 발견되었다. 서열 확인 번호 4는 D1701에서 유전자의 뉴클레오티드 서열의 버전을 나타낸다. 본 명세서의 이후의 기재에 있어서, 이 유전자는 ORF3으로 정의한다.
본 발명은 다음의 것에 관한 것이다.
1. 삽입 및(또는) 결실부를 가진, 재조합 기술에 의해 제조된 PPV.
2. 바이러스 증식에 필요하지 않은 게놈 세그먼트에서 삽입 및(또는) 결실부를 가진, 재조합 기술에 의해 제조된 PPV.
3. 바이러스 증식에 필요한 게놈 세그먼트에서 삽입 및(또는) 결실부를 가진, 재조합 기술에 의해 제조된 PPV.
4. 발현되지 않는 D1701로부터의 Hind III 단편 I의 영역에서 삽입 및(또는) 결실부를 가진, 재조합 기술에 의해 제조된 PPV.
5. 발현되는 D1701로부터의 Hind III 단편 I의 영역에서 삽입 및(또는) 결실부를 가진, 재조합 기술에 의해 제조된 PPV.
6. 삽입 및(또는) 결실부가 D1701 Hind III 단편 I에 또는 이 단편에 대응하는 다른 PPV로부터의 DNA에 위치한 제 1 내지 5에 따른 재조합 기술에 의해 제조된 PPV.
7. VEGF 유전자 또는 이 영역에 인접한 영역에서 삽입 및(또는) 결실부를 가진, 재조합 기술에 의해 제조된 PPV.
8. PK 유전자 또는 이 영역에 인접한 영역에서 삽입 및(또는) 결실부를 가진, 재조합 기술에 의해 제조된 PPV.
9. ITR 세그먼트 또는 이 영역에 인접한 영역에서 삽입 및(또는) 결실부를 가진, 재조합 기술에 의해 제조된 PPV.
10. HDIR 유전자 또는 이 영역에 인접한 영역에서 삽입 및(또는) 결실부를 가진, 재조합 기술에 의해 제조된 PPV.
11. F9L 유전자 또는 이 영역에 인접한 영역에서 삽입 및(또는) 결실부를 가진, 재조합 기술에 의해 제조된 PPV.
12. 10kDa 단백질을 코드하는 유전자의 영역 또는 그 근처에서 삽입 및(또는) 결실부를 가진, 재조합 기술에 의해 제조된 PPV.
13. 10 kDa 단백질을 코드하는 유전자가 위치한 D1701로 부터의 EcoRI 단편 E의 영역에서 삽입 및(또는) 결실부를 가진, 재조합 기술에 의해 제조된 PPV.
14. D1701로부터의 Hind III 단편 I 또는 이 단편에 대응하는 다른 PPV로부터의 DNA를 포함하는 플라스미드.
15. D1701로부터의 Hind III 단편 I을 포함하고 이 단편에서 바이러스 증식에 필요한 영역에서 결실 및(또는) 삽입부를 함유하는 플라스미드.
16. D1701로부터의 Hind III 단편 I을 포함하고 이 단편에서 바이러스 증식에 필요하지 않는 영역에서 결실 및(또는) 삽입부를 함유하는 플라스미드.
17. D1701로부터의 Hind III 단편 I을 포함하고 이 단편에서 바이러스 증식에 필요하지 않고 발현되지 않는 영역에서 결실 및(또는) 삽입부를 함유하는 플라스미드.
18. D1701로부터의 Hind III 단편 I을 포함하고 이 단편에서 바이러스 증식에 필요하지 않고 발현되는 영역에서 결실 및(또는) 삽입부를 함유하는 플라스미드.
19. D1701로부터의 Hind III 단편 I을 포함하고 이 단편의 VEGF 유전자 또는 이것에 인접한 곳에서 결실 및(또는) 삽입부를 함유하는 플라스미드.
20. D1701로부터의 Hind III 단편 I을 포함하고 이 단편의 PK 유전자 또는 이것에 인접한 곳에서 결실 및(또는) 삽입부를 함유하는 플라스미드.
21. D1701로부터의 Hind III 단편 I을 포함하고 이 단편의 ITR 세그먼트 또는 이것에 인접한 곳에서 결실 및(또는) 삽입부를 함유하는 플라스미드.
22. D1701로부터의 Hind III 단편 I을 포함하고 HDIR 유전자 또는 F9L 유전자 또는 이것에 인접한 곳에서 결실 및(또는) 삽입부를 함유하는 플라스미드.
23. D1701로부터의 EcoRI 단편 E를 포함하고 10kDa 단백질을 코드하는 유전자 또는 이것에 인접한 곳에서 결실 및(또는) 삽입부를 함유하는 플라스미드.
24. 14 내지 23에 따른 결실 및(또는) 삽입부가 존재하는 D1701로부터의 Hind III 단편 I의 일부를 포함하는 플라스미드.
25. D1701로부터의 DNA 단편이 이 단편에 대응하는 다른 PPV로부터의 DNA로 대체된 14 내지 24에 따른 플라스미드.
26. Hind III 단편 I의 전체 또는 단지 그의 일부를 포함하는 14 내지 25에 따른 플라스미드.
27. 서열 확인 번호 8 또는 번호 12의 서열 목록에 따른 서열을 갖는, D1701 Hind III 단편 I, 또는 그의 일부, 또는 이 단편에 대응하는 다른 PPV로부터의 단편.
28. 서열 확인 번호 1의 서열 목록에 따른 VEGF 단백질을 코드하는, D1701 Hind III 단편 I, 또는 이 단편에 대응하는 다른 PPV로부터의 세그먼트 또는 그의 일부.
29. 서열 확인 번호 2, 번호 9 또는 번호 13의 서열 목록에 따른 PK 단백질을 코드하는, D1701 Hind III 단편 I의 DNA 세그먼트 또는 그의 일부, 또는 이 단편에 대응하는 다른 PPV로부터의 세그먼트 또는 그의 일부.
30. PPV의 서열 확인 번호 3의 서열 목록에 따른 서열을 갖는 HDIR 유전자에 대한 DNA 세그먼트 또는 그의 일부.
31. PPV의 서열 확인 번호 5 또는 서열 확인 번호 10의 서열 목록에 따른 서열을 갖는 HDIR 유전자에 대한 DNA 세그먼트 또는 그의 일부.
32. PPV의 서열 확인 번호 4의 서열 목록에 따른 서열을 갖는 ITR 영역에 대한 DNA 세그먼트 또는 그의 일부.
33. 27 내지 32에 따른 DNA 세그먼트의 서열을 기초로 제조된 유전자 산물.
34. 삽입체로서 다른 병원체로부터의 면역 성분을 코드하는 외래 DNA를 포함하는 1 내지 13에 따른, 재조합에 의해 제조된 PPV.
35. 삽입체로서 사이토킨을 코드하는 외래 DNA를 포함하는 1 내지 13 및 14에 따른, 재조합에 의해 제조된 PPV.
36. 14 내지 26에 따른 플라스미드를 그 자체로 공지된 방식으로 세포 중에서 PPV로 재조합시키고 목적하는 바이러스를 선별하는 것을 특징으로 하는 1 내지 13, 34 및 35에 따른 바이러스의 제조 방법.
37. 1. 적합한 PPV 균주를 선별하고,
2. 그의 게놈을 정제하고,
3. 정제된 게놈을 제한 효소들로 처리하고,
4. 얻어진 단편들을 플라스미드 내에 삽입하고,
5. 10 kDa 단백질을 코드하는 유전자를 포함하는 플라스미드에 대하여 선별을 수행하고,
6. 필요에 따라서, 삽입 및(또는) 결실부를 10 kDa 단백질을 코드하는 유전자 내에 도입시키고,
7. 상기 4에 기재된 단편을, 필요에 따라, 폴리머라제 사슬 반응 (PCR) 또는 올리고뉴클레이티드 합성 등의 별법을 사용하여 제조하는 것을 특징으로하는
23에 따른 플라스미드의 제조 방법.
38. 1. 적합한 PPV 균주를 선별하고,
2. 그의 게놈을 정제하고,
3. 정제된 게놈을 제한 효소들로 처리하고,
4. 얻어진 단편들을 플라스미드 내에 삽입하고,
5. Hind III 단편 I 또는 이 단편에 대응하는 단편들 또는 성분들을 포함하는 플라스미드에 대하여 선별을 수행하고,
6. 필요에 따라서, 삽입 및(또는) 결실부를 얻어진 플라스미드의 이들 단편 내에 도입시키고,
7. 상기 4에 기재된 단편을, 필요에 따라, 폴리머라제 사슬 반응 (PCR) 또는 올리고뉴클레이티드 합성 등의 별법을 사용하여 제조하는 것을 특징으로하는
14 내지 22, 및 24 내지 26에 따른 플라스미드의 제조 방법.
39. 1. 적합한 PPV 균주를 선별하고,
2. 그의 게놈을 정제하고,
3. 정제된 게놈을 제한 효소들로 처리하고,
4. 목적하는 단편들 또는 세그먼트들을 선별고,
5. 필요에 따라서, 얻어진 게놈의 단편들을 먼저 플라스미드의 내에 삽입하고 목적하는 단편들을 함유하는 플라스미드들을 단리하고, 그후 플라스미드를 증식시키고 목적하는 단편들을 이들로부터 단리하고,
6. 상기 4에 기재된 단편들을, 필요에 따라, 폴리머라제 사슬 반응 (PCR) 또는 올리고뉴클레이티드 합성 등의 별법을 사용하여 제조하는 것을 특징으로하는
10 kDa 단백질을 코드하는 D1701 Hind III 단편 I 또는 EcoRI 단편 E, 또는 이 단편 또는 세그먼트에 대응하는 다른 PPV의 영역 또는 그 일부를 제조하는 방법.
40. 39에 따라 얻을 수 있는 단편을 적합한 발현계 내로 전이시키고 유전자를 이들 계를 사용하여 발현시키는 것을 특징으로 하는 제33에 따른 유전자 제품의 제조 방법.
41. 1 내지 13에 따른 재조합에 의해 제조된 PPV의 백신으로의 용도.
42. 1 내지 13에 따른 재조합에 의해 제조된 PPV의 면화시키고 비병원체-특이성 면역 방어를 자극하는 제품에서의 용도.
43. 재조합에 의해 제조된 PPV의 비병원체-특이성 면역 방어를 자극하는 면역조절제로의 용도.
44. 재조합에 의해 제조된 PPV의 외래 DNA를 이종 발현시키기 위한 용도.
45. 재조합에 의해 제조된 PPV의 외래의 DNA에 대한 백터로서의 용도.
46. 파라폭스-특이성 게놈 세그먼트를 발현시키기 위한 14 내지 26에 따른 플라스미드의 용도.
47. 진단제를 제조하기 위한 14 내지 26에 따른 플라스미드의 용도.
48. 진단제를 제조하기 위한 27 내지 32에 따른 게놈 단편의 용도.
49. 서열 확인 번호: 6에 따른 DNA 서열 (VEGF 유전자의 프로모터).
50. DNA를 발현시키기 위한 프로모터로서 49에 따른 DNA 세그먼트의 용도.
유리 DNA 단편으로서 존재할 수 있는 플라스미드 또는 바이러스 내로 삽입될 수 있는 PPV의 상기한 게놈 단편은 주어진 DNA 서열 및 이들의 변이체 및 동족체를 포괄한다.
상기 열거한 용어들은 다음의 의미를 갖는다:
- 약독화는 이들의 게놈의 변경의 결과로서 PPV가 동물 또는 사람에 있어서 덜 변원성이거나 비병원성이거나 덜 약독성이거나 약독성이 아닌 것으로 되는 과정이다.
- 결실은 DNA의 조각이 PPV 게놈으로부터 없어지는 것이다.
- 결실 플라스미드는 플라스미드 DNA 이외에 조각이 제거된 PPV의 게놈의 세그먼트를 가지는 플라스미드이다.
- 바이러스 증식에 필요한 (필수적인) 게놈 세그먼트는 PPV의 시험관내 증식에 필수불가결한, 즉 감염성 바이러스 자손을 형성하는데 필수적인 전제 PPV 게놈의 일부이다.
바이러스 증식에 필수적인 유전자를 사용한 방해는 바이러스 증식이 방해받는 결과를 초래한다. 예를 들면, 이들 유전자 중 하나의 일부 또는 전체 유전자가 제거된다면, 바이러스의 복제는 바이러스의 증식 주기의 어떤 한정된 점에서 종료한다. 이러한 성질의 돌연변이로의 감염 또는 처리는 동물로부터의 감염성 후손의 어떠한 방출을 초래하지 않는다. 필수적인 유전자의 일부 또는 전체 필수 유전자가 외래 DNA로 대체되거나 또는 외래 DNA가 필수 유전자 내로 삽입되면, 백신화된 개체에서 증식할 수 없고 따라서 감염성 병원체로서 배된되지 않는 백터 백신을 작제하는 것이 가능하다.
- 바이러스 증식에 필요하지 않는 (비필수적인) 게놈 세그먼트는 예건대 감염성 바이러스 후손을 형성하기 위한 PPV의 시험관내 증식에 불필요한 전체 PPV 게놈의 부분들이다.
- 외래 DNA 요소 (외래 DNA)는 본 발명에 따라 사용되는 PPV에 원래 존재하지 않은 DNA 조각, 즉 외래 유전자 또는 뉴클레오티드 서열들이다.
외래 DNA는 다음의 이유로 PPV 내로 삽입된다:
1. 외래 DNA를 발현시키기 위하여
2. PPV DNA의 조각이 기능을 불활성화시키기 위하여
3. PPV를 표지시키기 위하여
이들 이유에 따라서, 상이한 외래 DNA는 삽입된다. 외래 DNA가 (1)에 따라 발현되어야 한다면, 삽입된 외래 DNA는 적어도 하나 이상의 목적하는 외래 단백질(들)을 코드하는 개방 해독 프레임을 가질 것이다. 필요한 경우, 외래 DNA는 추가로 그의 자신 또는 외래의 조절 서열들을 함유한다. 외래 DNA를 수용하는 능력은 바이러스의 게놈에서 결실부를 생성시킴으로써 증가시킬 수 있다. 일반적으로, 그 길이는 1 뉴클레오티드 내지 35,000 뉴클레오티드이며, 바람직하게는 100 내지 약 15,000 뉴클레오티드이다.
열거할 수 있는 예로는
허피스바이러스 수이드(Herpesvirus suid) 1,
말 허피스바이러스,
소 허피스바이러스,
구제역 바이러스,
소 호흡 합포 바이러스,
소 파라인플루엔자 바이러스 3,
인플루엔자 바이러스,
칼리시바이러스(Calicivirus),
플라비바이러스(Flavivirus)(예, 소 설사 바이러스 또는 고전적 돼지 열 바이러스 등의 바이러스, 또는
파스테우렐라 종,
살모넬라 종,
악티노바실러스 종,
클라미디아 종, 등의 세균, 또는
톡소플라스마,
디로필라리아,
에키노코커스 등이 기생충으로부터의 유전자, 또는 유전자의 일부이다.
외래 DNA가 (2)에 따라 삽입되어야 한다면, 적합한 외래 뉴클레오티드의 삽입은 원칙적으로 벡터 바이러스의 DNA 서열을 방해하기에 충분하다. 불활성화를 위해 삽입되는 외래 DNA의 최대 길이는 외래 DNA를 수용하는 벡터 바이러스의 능력에 의존한다. 일반적으로 외래 DNA의 길이는 1 뉴클레오티드 내지 35,000 뉴클레오티드이며, 바람직하게는 100 내지 약 15,000 뉴클레오티드, 특히 바람직하게는 3 내지 100 뉴클레오티드이다.
DNA가 (3)에 따라 표지를 위해 삽입되어야 한다면 이들의 길이는 표지된 바이러스를 동정하는데 사용되는 검출 방법에 따른다. 일반적으로 외래 DNA의 길이는 1 뉴클레오티드 내지 25,000 뉴클레오티드이며, 바람직하게는 20 내지 약 15,000 뉴클레오티드, 특히 바람직하게는 5 내지 100 뉴클레오티드이다.
- 유전자 라이브러리는 복제할 수 있는 벡터 내에 포함되는 게놈의 단편의 전체이다. 이 라이브러리는 게놈을 단편화하고 모든 단편, 다수의 단편 또는 단편의 주된 부분을 복제가능한 벡터, 예컨대 플라스미드 내로 삽입시킴으로써 얻는다.
-게놈 단편은 단리된 형태로 존재할 수 있거나 또는 복제 가능한 벡터 내로 삽입될 수 있는 게놈의 조각이다.
- 삽입의 불활성화는 삽입된 외래 DNA가 천연 PPV 서열이 발현되거나 기능하는 것을 방해하는 것을 의미한다.
- 삽입은 PPV 게놈 내로 추가로 혼입된 DNA의 조각이다. 삽입하려는 이유에 따라서, DNA 조각의 길이는 1 뉴클레오티드 내지 수천 뉴클레오티드일 수 있다("외래 DNA"의 정의도 참조하기 바람).
- 삽입 플라스미드는 PPV DNA 서열에 의해 플랭킹되어 삽입되는 외래 DNA를 포함하는 플라스미드, 특히 세균성 플라스미드이다.
- 삽입 부위는 외래 DNA를 수용하기에 적합한 바이러스의 게놈의 부위이다.
- 클로닝은 PPV 게놈성 DNA가 단리되고 단편화되는 것을 의미한다. 단편들 또는 단편들의 선별체는 이어서 통상의 DNA 벡터(세균성 플라스미드 또는 파지 벡터 또는 진핵성 벡터) 내로 삽입된다.
참고문헌 11은 DNA 단편들을 제조하고 클로닝하기 위한 방법의 선택을 제공한다. PPV DNA 단편들을 함유하는 DNA 벡터들은 예를 들면 원래 단리된 PPV DNA 단편들의 동일한 복제수를 제조하는데 사용된다.
- 삽입에 의한 표지화는 삽입된 외래 DNA가 변형된 PPV로 하여금 후속적으로 동정되게 하는 것을 의미한다.
- ORF(개방 해독 프레임)은 잠재적인 단백질의 아미노산 서열을 규정하는 DNA 수준에서 뉴클레오티드의 서열을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 이는, 이것이 규정하는 단백질의 크기에 의해 결정되는, 출발 코돈(ATG)에 의해 5' 말단 및 종결 코돈(ATG, TGA 또는 TAA)에 의해 3' 말단에 의해 범위가 정해지는 다수의 뉴클레오티드 삼합체로 이루어진다.
- 조절 서열들은 유전자의 발현에 효과를 발휘하는 DNA 서열들이다. 이러한 성질의 서열들은 참고문헌 5에 알려져 있다.
바람직한 것으로는 서열 확인 번호 6에 기술된 VEGF 프로모터를 언급할 수 있다.
- 재조합 PPV는 이들의 게놈 내에 삽입 및(또는) 결실부를 가진 PPV이다. 이와 관련하여, 삽입 및 결실은 분자 생물학적 방법을 사용하여 제조된다.
- 반복 (DNA) 서열들은 다른 것의 뒤에 직접적으로 존재하거나 또는 상이한 부위에서 분산된 PPV 게놈에 발생하는 동일한 뉴클레오티드 서열들이다.
-벡터 바이러스는 외래 DNA의 삽입에 적합하고, 삽입된 외래 DNA를 그의 게놈에서 감염된 세포 또는 생물체 내로 운송시키고 필요하다면 외래 DNA가 발현되게 하는 PPV이다.
(상기) 1 내지 12에 따른 신규한 PPV는 다음과 같이 제조된다:
1. 적합한 PPV 균주의 선별
2. 삽입 부위를 가진 PPV 게놈에서 게놈 세그먼트의 동정
2a. 바이러스 증식에 비필수적인 유전자에서 삽입 부위를 가지는 PPV 게놈 세그먼트의 동정,
2b. 바이러스 증식에 필수적인 유전자에서 삽입 부위를 가지는 PPV 게놈 세그먼트의 동정
2c. PPV 게놈에서 및(또는) 유전자 복제부에 유전자를 가지지 않는 영역에서 삽입 부위를 가진 게놈 세그먼트의 동정
2d. 삽입 부위를 가지는 게놈 세그먼트를 동정하기 위한 다른 방법
2e. 삽입 부위 상에 위치된 필요사항
2.1 삽입 부위의 동정
2.1.1 PPV 게놈의 정제
2.1.2 게놈 단편의 클로닝 및 유전자 라이브러리의 확립
2.1.3 유전자 또는 유전자가 없는 게놈 세그먼트를 동정하기 위한 목적의 서열화
2.1.4 추가의 처리를 위한 PPV 게놈 단편를 포함하는 클론의 선별
2.2 삽입 부위로서의 ITR 영역, VEGF 유전자, PK 유전자, 10 kDa 단백질을 코드하는 유전자 및 PK 유전자 및 HDIR 유전자 사이의 영역
2.2.1 VEGF 유전자의 클로닝
2.2.2 단백질 키나제 유전자의 클로닝
2.2.3 10 kDa 단백질을 코드하는 유전자의 클로닝
2.2.4 ITR 영역(도립 말단 반복 영역) 또는 PK 유전자 및 HDIR 유전자 사이에 위치하는 게놈 세그먼트의 클로닝
3. 삽입되는 외래 DNA를 포함하는 삽입 플라스미드 또는 결실 플라스미드의 작제
3.1 클로닝된 게놈 단편에서 일회만 발생하는 제한 효소 인식 부위, 즉 유일한 제한 부위의 동정 및 외래 DNA의 삽입
3.2 클로닝된 게놈 단편에서 게놈 서열의 결실 및 및 외래 DNA의 삽입
3.3 번호 3.1 및 3.2의 조합
4. (상기) 1 내지 12에 따른 재조합 PPV의 작제
1. 적합한 PPV 균주의 선별
원칙적으로 모든 PPV 종들이 본 발명을 실행하는데 적합하다. 바이러스 균주들은 조직 배양시 >105PFU(플라그 형성 단위)/ml의 역가로 증식될 수 있고 감염된 세포로부터 세포외, 감염성 바이러스로서 순수한 형태로 제조될 수 있는 것이 바람직하다. 바람직한 것으로 언급할 수 있는 PPV 속으로부터의 종은 PPV ovis (orf 바이러스)이다.
특히 바람직한 것으로 언급할 만한 PPV ovis의 균주는 D1701인데, 이것은 부다페스트 조약에 따라서 1988. 4. 24자로 파스퇴르 연구소, C.N.C.M.에 기탁번호 CNCM I-751로서 기탁되었으며, D1701의 변이체 및 돌연변이체도 바람직하다.
바이러스들은 포유류 세포, 예컨대 양 세포 또는 소 세포, 바람직하게는 영구 소 신장 세포주 BK-K1-3A(또는 그의 후손) 등의 소 세포 또는 영구 원숭이 신장 세포 MA104 또는 Vero (또는 그의 후손) 등의 원숭이 세포 등의 동물 세포의 조직 배양물에서 통상의 방식으로 증식시킨다.
증식은 그 자체로 공지된 방식으로 밀착 세포 응집체 또는 현탁 배양물의 형태로 정지상, 롤러 또는 캐리어 배양으로 수행한다.
바이러스를 증식하기 위하여 사용된 세포 또는 세포 잔디(lawn)는 통상의 방식으로 궁극적으로는 밀착(confluence)되거나 최적 세포 밀도에 이를 때까지 증식한다. 세포들은 MOI (multiplicity of infection, 세포당 감염 바이러스 입자들에 해당함)에 해당하는 바이러스의 희석물로 감염시킨다.
바이러스들은 동물 혈청의 추가 또는 추가 없이 증식시킨다. 혈청이 사용될 경우, 이는 1-30 부피%, 바람직하게는 1-10부피%의 농도로 증식 배지에 가한다.
감염 및 바이러스 증식은 실온 내지 40 ℃의 온도, 바람직하게는 32 내지 39℃, 특히 바람직하게는 37 ℃의 온도에서, 몇일간에 걸쳐서, 바람직하게는 감염된 세포들이 완전히 파괴될 때까지 수행한다. 바이러스의 수확과 관련해서는, 여전히 세포에 결합된 바이러스는 기계적으로 또는 초음파 처리의 수단에 의하거나 또는 온화한 효소적 단백질가수분해의 수단, 예컨대 트립신을 사용하여 추가로 방출시킬 수 있다.
감염된 세포들로부터의 바이러스-함유 배지는 이어서 예를 들면 0.2-0.45 ㎛의 공극을 사용한 여과의 수단 및(또는) 저속 원심분리의 수단에 의해 세포 파쇄물을 제거함으로써 더 처리할 수 있다.
여액 또는 원심분리 상층액은 바이러스 강화(enrichment) 및 정제에 사용될 수 있다. 이를 위해서, 여과물 또는 상층액을 바이러스 입자가 침강할 때까지 고속 원심분리한다. 필요에 따라서,추가의 정제 단계가 예컨대 밀도 구배 원심분리의 수단에 의해 후속될 수 있다.
2. PPV 게놈에서 삽입 부위를 가진 게놈 세그먼트의 동정
PPV 게놈의 다양한 영역들이 외래 DNA를 삽입할 때 삽입 부위로서 사용될 수 있다. 외래 DNA는
1. 시험관 및(또는) 생체내에서 바이러스 증식에 비필수적인 유전자 내로
2. 바이러스 증식에 필수적인 유전자 내로 및(또는)
3. 어떠한 유전자 기능을 가지지 않은 영역 내로 삽입될 수 있다.
2a. 바이러스 증식에 비필수적인 유전자에서 삽입 부위를 가지는 PPV 게놈 세그먼트의 동정,
i. 바이러스 증식에 필수적이 아닌 바이러스 유전자는 예를 들면 상이한 PPV 종들의 유사물들을 사용하여 비교 연구를 수행하는 수단에 의해 발견한다. PPV 종들의 하나 이상의 단리물 또는 균주에서 생성되지 않으나 다른 단리물 또는 균주에서 발견되는 유전자는 잠재적으로 비필수적이다.
ii. 바이러스 증식에 필수적이 아닌 유전자들은 또한 별도의 방식으로 동정할 수 있다. 예를 들면 클론된 단편에 존재할 수 있는 PPV 게놈 단편들을 서열화한 후, 이들 DNA 서열 가능한 "개방 해독 프레임(ORF)"에 대하여 검사한다. ORF가 발견되면, 이 ORF의 유전자로서의 기능은 전사 및(또는) 번역을 입증함으로써 확인한다. 발견된 유전자가 바이러스 증식에 비필수적인가를 확립하기 위해서는, 분자 유전학적 방법을 사용하여 PPV 게놈으로부터 유전자를 제거하거나 또는 이것을 부분적으로 파괴하거나 또는 이것을 (a)돌연변이(들)을 도입하는 수단에 의해 방해하고 이어서 얻어진 바이러스가 증식하는 능력을 조사한다. 바이러스가 증식된 유전자의 존재 없이도 증식할 수 있다면, 이는 비필수적인 유전자이다.
동정된 삽입 부위의 예
i. PPV ovis의 VEGF 유전자는 이점에 있어서 외래 DNA의 삽입 부위로서 사용될 수 있는 비필수적 PPV 유전자의 예로서 언급할 수 있다. 이 유전자는 연구된(참조문헌 6) 파라폭스바이러스 오비스 균주(NZ-2, NZ-7 및 D1701)에서 발견된다. 이 VEGF 유전자는 일부 PPV 게놈, 예를 들면 PPV bovis 1의 유사체에서 입증되지 않았다. VEGF 유전자를 함유하는 PPV 게놈의 영역은 서열 확인 번호 1에 나타낸 DNA 서열의 도움으로 확인할 수 있다. 분자 생물학의 통상적인 방법을 이용하여 혼성화 실험, 게놈 서열 분석 및(또는) 폴리머라제 사슬 반응의 수단에 의해 PPV의 게놈 상의 유전자를 발견할 수 있다.
ii. 10 kDa PPV 단백질에 대한 유전자는 잠재적으로 비필수적인 PPV 유전자의 다른 예로서 언급할 수 있다. 이 유전자는 파라폭스바이러스 오비스의 균주 (NZ-2, NZ-7 및 D1701)에서 발견된다. 통상의 분자 생물학적 방법을 사용하여 10 kDa 단백질에 대한 유전자를 포함하는 PPV 게놈의 영역을 예를 들면 폴리머라제 사슬 반응(PCR)에 의해 동정할 수 있다. 참고문헌 8은 10 kDa 단백질 유전자의 DNA 서열을 나타낸다. PCR에 사용될 수 있는 프라이머는 예를 들면 참고문헌 8에 규정되어 있다. 서열 확인 번호 11은 D1701로부터 10 kDa-특이성 PCR 생성물의 DNA 서열을 나타낸다.
외래 DNA를 삽입할 목적으로, 비필수적인 유전자는 부분적으로 또는 전체적으로 PPV 게놈으로부터 제거할 수 있다. 그러나, 또한 외래 DNA를 PPV 유전자의 임의의 영역을 제거하지 않고 비필수적인 유전자 내로 삽입시키는 것도 가능하다. 제한 효소 인식 부위가 예컨대 삽입 부위로 사용된다.
2b. PPV 게놈 상에서 바이러스 증식에 필수적인 유전자에서 삽입 부위를 가지는 PPV 게놈 세그먼트의 동정
ORF가 발견되면, 유전자로서의 그의 기능은 전사 및(또는) 번역을 입증함으로써 확인한다. 발견된 유전자가 바이러스 증식에 비필수적인가를 확립하기 위해서는, 분자 유전학적 방법을 사용하여 유전자의 일부 또는 전체 유전자를 제거함으로써 또는 외래 DNA를 삽입시키는 수단에 의해 PPV 게놈에서 유전자를 제거하거나 이어서 얻어진 바이러스가 증식하는 능력을 조사한다. 생성된 바이러스 돌연변이체가 증식할 수 없다면, 이는 필수적인 유전자일 것이다.
이 바이러스 돌연변이체가 보충 세포주 상에서만 성장할 수 있다면, 이는 이 유전자가 필수적임을 입증한다.
삽입 부위의 예
PPVD1701의 단백질 키나제 유전자(PK 유전자)를 일례로 언급할 수 있다. PK 유전자는 바이러스의 증식 주기에 있어서 나중에 발현된다. 서열 확인 번호 2, 번호 9 또는 번호 13에 나타낸 서열의 버전이 PPV 게놈 상의 PK 유전자를 동정하는데 사용된다. 분자 생물학의 통상의 방법을 사용하여 예를 들면 혼성화 실험, 게놈 서열 분석 및(또는) 폴리머라제 사슬 반응의 수단에 의해 유전자를 함유하는 영역을 발견할 수 있다.
외래 DNA를 삽입시킬 목적으로 필수 유전자를 PPV 유전자로부터 부분적으로 또는 전체적으로 제거할 수 있다. 그러나, 또한 외래 DNA를 PPV로부터의 영역을 제거함이 없이 필수 유전자 내로 삽입시키는 것도 가능하다.
2c. 유전자를 갖지 않은 영역 및(또는) 유전자 복제부에 삽입 부위를 가진 PPV 게놈 상에서 게놈 세그먼트의 동정
기능적인 유전자 생성을 코드하지 않고 임의의 필수 조절 기능(소위, 인터제닉 세그먼트)를 갖지 않는 게놈 세그먼트는 원칙적으로 외래 DNA의 삽입 부위로서 사용하기에 적합하다. 반복 서열을 함유하는 영역이 특히 적합한데, 어떤 영역의 부분들에 있어서 변화들은 남아있는 서열 반복부에 의해 상쇄될 수 있기 때문이다. 둘 이상의 복제수로 발생하는 유전자, 소위 유전자 복제는 또한 이 범주 내에 있다.
ITR 영역에 있어서 또는 PPV 게놈의 복제된 세그먼트에 있어서 유전자는 바이러스 게놈에서 두 복제수로 존재한다. 한 복제수의 그러한 유전자가 제거되거나 변경되고 외래 DNA가 삽입된 후, 적합한 PPV 재조합체를 변경된 유전자가 바이러스 증식에 중요하다 하더라도 얻을 수 있다. 두 번째, 비변경된 유전자 복제수는 유전자의 기능에 적합할 수 있다.
i. PPV 게놈의 서열 분석을 사용하여 유전자 생성물을 코드하지 않는 게놈 서열을 동정할 수 있다. 서열 분석 후 ORF 또는 바이러스-특이성 전자를 나타내지 않고 임의의 조절 기능을 갖지 않은 게놈 영역은 잠재적인 삽입 부위이다. 특히, 이들 영역에서 제한 효소에 대한 절단 부위는 잠재적인 삽입 부위를 나타낸다. 적합한 삽입 부위가 존재하는지를 검사하기 위하여 공지의 분자 생물학적 방법을 사용하여 외래 DNA를 잠재적인 삽입 부위에 삽입하고, 생성된 바이러스 돌연변이체의 생존성을 연구한다. 가능한 삽입 부위에서 외래 DNA를 가지는 바이러스 돌연변이체가 증식 가능하다면, 연구된 이 부위는 적합한 삽입 부위이다.
ii. DNA 혼성화 실험 및(또는) 서열 분석을 사용하여 반복 서열 및 유전자 복제를 동정한다. 혼성화 실험에 있어서, PPV 로부터의 클론된 또는 단리된 게놈 단편을 PPV DNA의 단편을 사용한 혼성화의 프로브로서 사용한다. 전체 PPV 게놈의 한 단편 이상과 혼성화되는 PPV의 게놈 단편들은 하나 이상의 반복 서열을 함유한다. 게놈 단편 상에서 반복 서열 또는 복제된 게놈 영역을 정확하게 찾아내기 위해서는 이 단편의 뉴클레오티드 서열을 결정한다. 잠재적인 삽입 부위가 전체 PPV 게놈에서 적합한 삽입 부위인지를 확인하기 위해서는, 외래 DNA를 반복 서열내로 또는 한 복제수의 유전자 복제부 내에 삽입시키고 이 삽입체를 함유하는 PPV 게놈 단편을 바이러스 게놈 내로 조입시켜야 한다. 외래 DNA를 포함하는 재조합 바이러스가 증식하는 능력을 이어서 검사한다. 재조합 바이러스가 증식한다면, 동정된 인식 부위는 삽입 부위로서 적합하다.
삽입 부위의 예
i. 단백질 키나제에 대한 유전자 및 HDIR 유전자(서열 확인 번호 7) 사이의 게놈 세그먼트는 인터제닉 유전자의 예로서 언급할 수 있다.
ii. ITR 유전자(서열 확인 번호 4)는 반복 서열의 예로서 언급할 수 있다.
iii. 잠재적인 유전자 "ORF 3" (ITR 영역에서) 및 VEGF 유전자는 PPV 균주 D1701에서 유전자 복제의 예로서 언급할 수 있다. 혼성화 연구에 의하여 VEGF 유전자를 함유하는 영역이 본 균주 D1701에서 복제되고 바이러스 게놈의 다른 말단으로 전좌되어서 두 복제수의 VEGF 유전자가 존재함이 확인되었다.
서열 확인 번호: 1 ("ORF3"을 갖진 ITR 서열) 및 서열 확인 번호: 7 (PK 및 HDIR 유전자 사이의 영역)의 서열들의 도움으로, 혼성화 실험, 게놈 서열 분석 및(또는) 폴리머라제 사슬 반응 등의 통상의 분자 생물학적 방법을 사용하여 다른 PPV에서 대응하는 게놈 영역을 발견할 수 있다.
2d. 삽입 부위를 동정하기 위한 다른 방법
일반적으로, 바이러스 게놈 서열의 변형은 또한 PPV 게놈 상에서 가능한 삽입 부위를 발견하는데 사용될 수 있다. 뉴클레오티드 치환, 결실 및(또는) 삽입, 또는 이들의 조합이 바이러스 증식을 차단하지 않는 게놈 부위는 가능한 삽입 부위를 구성한다. 잠재적인 삽입 부위가 적합한 삽입 부위 인지를 검사하기 위해서는 공지의 분자생물학적인 방법을 사용하여 외래 DNA를 잠재적인 삽입 부위로 삽입하고 얻어진 바이러스 돌연변이체의 생존성을 연구한다. 바이러스 재조합체가 증식 가능하다면, 조사된 부위는 적합한 삽입 부위이다.
2.1 삽입 부위의 동정
2.1.1 PPV 게놈의 정제
분자유전학적 수단에 의하여 PPV 삽입 부위를 클로닝할 목적으로 PPV 유전자를 먼저 정제한다. 이 게놈은 (상기) 1에 따라 제조된 바이러스로부터 단리하여 정제한다. 천연 바이러스 DNA를 바람직하게는 세제 및 프로테아제의 수용액을 사용하여 정제된 비리온들을 처리함으로서 추출한다.
언급할 수 있는 세제로서는 음이온, 양이온, 양쪽이온 및 비이온성 세제가 있다. 이온성 세제를 사용하는 것이 바람직하다. 황산 도데실 나트륨(황산 라우릴 나트륨)이 특히 바람직하다.
언급할 수 있는 프로테아제는 프로테아제 K, 및 프로나아제 등의 세제의 존재하에서 기능할 수 있는 모든 세제이다. 프로나아제 K가 바람직한 것으로 들 수 있다.
세제는 0.1 - 10.0 부피%의 농도로 사용되며, 0.5 내지 3 부피%가 바람직하다.
프로테아제는 0.01-10 mg/바이러스 용헤물 ml의 농도로 사용되며, 0.05-0.5 mg/바이러스 용헤물 ml의 농도가 바람직하다.
반응을 DNase 억제제의 존재하여 완충 수용액 중에서 수행하는 것이 바람직하다. 언급할 수 있는 완충 물질로는 강염기를 가진 약산의 염, 예컨대 트리스(히드록시메틸아미노메탄), 약염기를 가진 강산의 염, 예컨대 일급 포스페이트, 또는 이들의 혼합물을 들 수 있다.
다음의 완충계: 트리스(히드록시메틸아미노메탄)을 바람직한 것으로 들 수 있다.
완충 물질 또는 완충계는 DNA가 변성하지 않는 pH 값을 보장하는 농도로 이용된다. 5-9의 pH값이 바람직하고, 6-8.5의 값이 특히 바람직하여 7-8의 값이 아주 특히 바람직하며; 중성 범위에서 조작하는 것을 특히 열거할 수 있다.
DNase 억제제의 예로는 0.1-10 mM(밀리몰)의 농도의 에틸렌디아민테트라아세트산이 있으며, 약 1 mM이 바람직하다.
그후, 바이러스 용해물의 친지성 성분들을 추출한다. 페놀, 클로로포름, 이소아밀 알코올 또는 이들의 혼합물 등의 용매를 추출제로서 사용한다. 페놀 및 클로로포름/이소아밀 알콜의 혼합물로 먼저 사용하여 추출을 1회 이상의 단계로 수행하는 것이 바람직하다.
바이러스 DNA를 단리하기 위한 다른 방법의 예는 바이러스 용해물의 Cscl 밀도 구배에서 원심분리 또는 겔 전기영동이다(참고문헌 4 참조).
핵산의 추출은 참고문헌 13에 기술되어 있다.
이러한 방식으로 추출한 DNA는 바람직하게는 수용액, 예컨대 알코올, 바람직하게는 에탄올 또는 이소프로판올로부터 알칼리 금속 염화물 또는 아세테이트, 바람직하게는 염화 리튬, 염화나트륨 또는 소듐 아세테이트 또는 포타슘 아세테이트 등의 일가 염의 첨가의 존재하에 침전시킨다.
2.1.2 게놈 단편의 클로닝
이 방식으로 정제된 바이러스 DNA는 이제 DNA 단편을 제조하는데 사용한다. 이를 위해, 이것을 예를 들면 제한 효소로 처리한다. 적합한 제한 효소의 예로는 EcoRI, BamHI, Hind III 및 KpnI가 있다. 별법으로, 게놈 단편들은 폴리머라제 사슬 반응(PCR)의 수단에 의해 합성할 수 있다. 이를 위해, 프라이머들을 이미 알려진 바이러스 게놈의 서열 세그먼트로부터 선별하고 이 프라이머 쌍에 의해 범위가 정해지는 게놈 세그먼트를 예를 들면 Taq 폴리머라제 또는 Pfu 폴리머라제를 사용하여 합성한다.
제한 분해 또는 PCR로부터 초래된 DNA 단편들을 문헌(Sambrook 89)에 기술된 방법을 사용하여 클로닝시킨다. 예를 들면, 각 경우에 클로닝되는 DNA 단편의 크기에 따라서 플라스미드 벡터, 람다 파지 벡터 또는 코스미드 베터가 이 목적에 유용하다.
2.1.3 유전자의 서열화, 동정 및 특성화 및 이들의 발현의 확인
벡터 내로 클로닝되는 게놈 단편은 먼저 서열화에 의해 분석한다. 삽입된 DNA 단편은 상이한 제한 효소를 사용하여 지도를 작성하고 서열화 반응을 예를 들면 파마시아사(Pharmacia)에 의해 제공되는 T7 서열화 킷트를 사용하여 제조원의 지시에 따라서 수행한다. 이를 위해 필요한 이중 가닥 플라스미드 DNA는 PEG법(Hattori and Sakaki 1985)을 사용하여 바람직하게 제조한다. 게놈 단편 내에 존재하는 "개방 해독 프레임(ORF)"는 컴퓨터 분석(GCG, 상기함)의 수단에 의해 확인한다. 확인된 ORF의 각각의 기능에 대한 정보는 데이터 베이스에 포함된 공지의 기능의 다른 유전자 서열과 이들 서열을 비교하는 수단에 의해 얻을 수 있다. 확인된 ORF은 바이러스 감염된 세포에서 이들 각각의 대응하는 전사물을 검출함으로써 기능적으로 특성화시킨다. 이를 위해서, AGPC법 (Chomczynski and Sacchi, (20) 1987)을 사용하여 예를 들면 바이러스 감염된 세포로부터의 전체 RNA를 단리한다. 특이적 전사물, 및 이들의 5' 및 3' 말단을 이어서 노던 블랏 분석 또는 프라이머 연장 및 RNA 보호 실험의 수단에 의하여 확인한다. 별법으로서, 시험관 내에서 확인된 ORF에 의해 코드되는 바이러스 단백질을 발현시키고 이어서 발현된 산물을 항혈청을 얻는데 사용하고 이들 항혈청을 사용하여 ORF의 발현을 입증하는 것이 가능하다.
발견된 유전자가 바이러스 증식에 비필수적인가를 확인하기 위해서, 유전자를 유전자 파열 또는 유전자 결실의 수단에 의해 파괴시킬 수 있다. 이 의미에 있어서, 전체 유전자 또는 그의 일부 중 하나를 PPV 게놈으로부터 제거하거나 또는 이 유전자의 해독 프레임을 외래 유전자 서열을 삽입함으로써 방해한다. 생성된 바이러스의 증식하는 능력으르 검사한다. 만일 바이러스가 파괴된 유전자의 존재 없이도 복제한다면 이 유전자는 비필수적 유전자이다.
2.1.4 PPV 게놈 단편를 포함하는 클론의 선별
앞서 얻은 어느 PPV 게놈 단편-함유 클론을 사용할 것인가는 제조되어야 할 재조합 PPV가 (i) 복제 가능한 것 또는 (ii) 이들의 복제에 있어서 결손인 것인가에 달려있다.
i. 삽입 및(또는) 결실에도 불구하고 복제 가능한 재조합 PPV를 제조할 경우, 추가의 처리를 바이러스 증식에 대해 비필수적인 유전자가 없는 유전자 또는 게놈을 포함하거나 또는 유전자 복제부를 함유하는 클로닝된 바이러스 게놈 단편 상에서 수행한다.
바이러스 돌연변이체를 사용하여 유전자 또는 게놈 영역이 바이러스 게놈 또는 유전자 복제의 비필수적 영역인가를 시험한다. 이를 위해, 분자 생물학적 방법을 사용하여 연구하고자 하는 PPV에서 유전자 또는 게놈 영역을 예를 들면 문제의 영역을 부분적으로 또는 완전히 결실시킴으로써 불활성화시키고, 바이러스 돌연변이체가 증식하는 능력을 검사한다. 이 바이러스 돌연변이체가 유전자 또는 게놈 영역이 불활성화되었음에도 불구하고 증식할 수 있다면, 연구 중인 유전자 또는 게놈 영역은 비필수적 영역이다.
비필수적 유전자의 완전한 버전을 함유하는 PPV의 클로닝된 게놈 단편이 바람직하다. 이외에도, 유전자 또는 게놈 영역의 양 말단에서 플랭킹된 바이러스 게놈이 또한 존재해야 한다. 플랭킹 영역의 길이는 100 염기쌍 이상이어야 한다. 그러한 게놈 클론이 유용하지 않다면, 이들은 분자 생물학적 방법의 수단에 의해 기존의 유전자 클론으로부터 제조할 수 있다. 클로닝된 게놈 단편이 본 제조에 필요하지 않은 게놈 영역을 추가로 포함한다면 이들 영역은 서브클로닝의 수단에 의해 제거할 수 있다.
ii. 삽입 및(또는) 결실의 결과로 감염성 자손을 형성하는 능력을 잃은 재조합 PPV를 제조할 경우, 바이러스 증식에 필수적인 유전자가 없는 유전자 또는 게놈 영역을 포함하는 클로닝된 바이러스 게놈 단편을 추가로 처리한다.
바이러스 돌연변이체를 사용하여 유전자 또는 게놈 영역이 바이러스 게놈의 필수적 영역인가를 시험한다. 이를 위해, 분자 생물학적 방법을 사용하여 연구하고자 하는 PPV에서 유전자 또는 게놈 영역을 예를 들면 문제의 영역을 부분적으로 또는 완전히 결실시킴으로써 불활성화시키고, 바이러스 돌연변이체가 증식하는 능력을 검사한다. 바이러스 돌연변이체가 문제의 게놈이 불활성화된 결과로서 더 이상 증식할 수 없다면 연구 중인 유전자 또는 게놈 영역은 필수적 영역이다.
필수적 유전자의 완전한 버전을 함유하는 PPV의 클로닝된 게놈 단편이 바람직하다. 이외에도, 플랭킹 바이러스의 게놈 영역은 마찬가지로 유전자 또는 게놈 영역의 양 말단에서 존재해야 한다. 플랭킹 영역의 길이는 100 염기쌍 이상이어야 한다. 그러한 게놈 클론이 유용하지 않다면, 이들은 분자 생물학적 방법의 수단에 의해 기존의 유전자 클론으로부터 제조할 수 있다. 클로닝된 게놈 단편이 본 제조에 필요하지 않은 게놈 영역을 추가로 포함한다면 이들 영역은 서브클로닝의 수단에 의해 제거할 수 있다.
2.2 삽입 부위로서의 ITR 영역, VEGF 유전자, PK 유전자, 10 kDa 단백질을 코드하는 유전자 및 PK 유전자 및 HDIR 유전자 사이의 영역
ITR 영역, VEGF 유전자, PK 유전자, 10 kDa 단백질을 코드하는 유전자 및 PK 유전자 및 HDIR 유전자 사이의 인터제닉 영역이 PPV 내에서 삽입 부위로서 사용된다면, 삽입 부위를 함유하는 PPV 게놈의 대응 영역을 단리해야 한다. 이를 위해서, PPV의 대응 영역을 클로닝시킨다.
2.2.1 VEGF 유전자의 클로닝
VEGF를 코드하는 유전자를 PPV 게놈 상에 위치시키고 이어서 그의 플랭킹 게놈 세그먼트와 함께 부분적으로 또는 전체적으로 단리한다. 이를 위하여, PPV는 바람직하게는 번호 1에 따라 바람직하게 증식시키고 게놈을 번호 2.1.1에 따라 정제한다.
a. VEGF 유전자는 바람직하게는 폴리머라제 사슬 반응(PCR)의 수단에 의해 증식시킨다. 이 반응에 필요한 출발 서열(프라이머)는 서열 확인 번호 1에 나타낸 VEGF 유전자의 DNA 서열로부터 유도한다. 얻어진 증폭물은 이어서 클로닝하는 것이 바람직하다.
b. VEGF 유전자 및 그의 플랭킹 게놈 세그먼트를 포함하는 영역은 바람직하게는 PPV 게놈을 분획화하고 대응하는 게놈 단편들을 단리하고 클로닝함으로써 얻는다. 이를 위해서, 바이러스의 정제된 게놈을 번호 2.1.2에 기술된 바와 같이, 바람직하게는 제한 효소 Hind III를 사용하여 절단시킨다. 효소 분해 후 얻어진 게놈 단편들은 VEGF 유전자 또는 그의 플랭킹 게놈 세그먼트를 가지는 게놈 단편을 동정하기 위하여 전기영동법 또는 크로마트그래피법의 수단에 의하여 바람직하게 분획화시킨다.
아가로스 또는 폴리아크릴아미드 중의 전기영동 분획화는 다음에 기술된 표준 방법을 사용하여 수행한다.
- 문헌 [Current Protocol in Molecular Biology 1987-1988, Wiley-Interscience, 1987].
- 문헌 [ A Practical Guide to Molecular Cloning, Perbal, 2nd edition, Wiley-Interscience, 1988].
- 문헌 [Molecular Coning, 상기함].
- 문헌 [Virologische Arbeitsmethoden [Practical Methods in Virology], Volume III, Gustav Fischer Verlag, 1989]/
VEGF 유전자 또는 그의 플랭킹 서열을 가지는 게놈 단편은 예를 들면 규정된 핵산 프로브를 사용한 혼성화 수단에 의해 확인한다. 이를 위해, 분획화된 게놈 단편들을 필터로 전이시키고 서던 블롯법에 따라 VEGF-특이성 표지된 핵산 프로브로 혼성화시킨다. 게놈 단편을 전이시키고 혼성화시키기 위한 방법들은 상기한 Molecular Cloning의 "서던 블롯팅" 하에 기재된 바와 같이 표준 프로토컬에 따라 수행할 수 있다. 프로브로 사용되는 올리고뉴클레오티드 또는 핵산 단편들은 서열 확인 번호: 1의 서열로부터 유도할 수 있다. 예를 들면, 서열 확인 번호: 1에 의해 확인될 수 있는 TaqI 소단편(366 염기쌍)을 혼성화 프로브로서 이용한다.
VEGF 유전자 또는 그의 플랭킹 게놈 세그먼트의 부분들 또는 바람직하게는 전체를 함유하는 것으로 입증된 게놈 단편들을 단리하고 클로닝한다. 적합한 게놈 단편들을 전기영동에 의해 예를 들면 전기용출의 수단에 의해 또는 저용융 아가로스법을 사용하여 겔의 적절한 영역으로부터 단리한다.
VEGF 유전자를 클로닝하기 위하여, 상기 제조한 게놈 단편들을 세균 또는 진핵성 벡터 내에 삽입한다. 플라스미드 또는 파아지 벡터가 처음에 특히 바람직하다. 게놈 단편을 삽입시키기 위하여, 이중 가닥 플라스미드 또는 파아지 벡터 DNA 분자를 제한 효소로 처리하여 삽입에 적합한 말단들을 생성시킨다.
pBR322 또는 그의 유도체, 예컨대 pSPT18/19, pAT153, pACY184, pUC18/19 및 pSP64/65 등의 공지의 플라스미드가 플라스미드로서 유용하다.
파아지 람다 ZAP, 파아지 람다 gt10/11, 또는 파아지 M13mp18/19 등의 공지의 파아지 람다 변이체가 파아지 벡터로서 사용된다.
사용될 수 있는 제한 효소는 예를 들면 문헌 [Gene volume 92 (1989) Elsever Science Publishers BV Amsterdam]에 공지되어 있다.
제한 효소로 처리된 플라스미드 또는 파아지 벡터는 삽입하고자 하는 과량의 DNA 단편과 예를 들면 5:1의 적절한 비율로 혼합시키고 이어서 혼합물을 DNA 리가제로 처리하여 단편을 벡터 내로 연결시킨다. 플라스미드 또는 파아지를 증식시키기 위하여, 연결 혼합물을 원핵 또는 진핵 세포, 바람직하게는 세균 (예, E. coli 균주 K12 및 그의 유도체) 내로 도입시키고, 후자를 복제시킨다.
세균을 상기한 Molecular Cloning에 기술된 바와 같이 형질전환시키고 선별한다.
외래 DNA의 실체는 바람직하게는 혼성화 실험의 수단에 의하여 특히 바람직하게는 서열 분석의 수단에 의하여 확인한다. 서브클로닝은 필요한 경우 수행한다.
2.2.2 단백질 키나제 유전자의 클로닝
단백질 키나제를 코드하는 유전자를 PPV 게놈 상에 위치시키고 이어서 그의 플랭킹 게놈 세그먼트와 함께 부분적으로 또는 전체적으로 단리한다.
VEGF 유전자의 클로닝에 대해 기술한 바와 같이, 이 영역은 PPV 게놈을 분획화함으로써(절단 부위, 도 1 참조), 바람직하게는 단편들을 클로닝하고 PPV 게놈의 플랭킹 DNA 서열과 함께 PK 유전자의 부분 또는 바람직하게는 전체의 PK 유전자를 함유하는 단편 또는 클론들을 선별함으로써 단리시킬 수 있다. PCR에 대한 프라이머로서 또는 혼성화를 위한 프로브로서 이용될 수 있는 DNA 분자들은 서열 확인 번호: 2 또는 서열 확인 번호: 9로부터 유도할 수 있다.
서브클로닝은 필요에 따라 수행한다.
2.2.3 10 kDa 단백질을 코드하는 유전자의 클로닝
10 kDa 단백질을 코드하는 유전자를 VEGF 유전자 및 PK 유전자에 대해 상기한 방법을 사용하여 PPV 게놈 상에 위치시키고 이어서 그의 플랭킹 게놈 세그먼트와 함께 부분적으로 또는 바람직하게는 전체적으로 단리한다.
이 경우, 10 kDa 단백질 또는 그의 일부에 대한 유전자를 함유하는 PPV 게놈의 영역은 바람직하게는 PCR의 수단 및(또는) 적합한 클론의 클로닝 및 동정 및 선별에 의해 얻는다.
참고문헌 8은 PCR에 대한 프라이머로서 또는 혼성화에 대한 프로브로서 사용되는 DNA 분자들의 세부사항을 기술하고 있다. 서브클로닝은 필요에 따라 수행한다.
2.2.4 PK 유전자 및 HDIR 유전자 사이에 위치하는 게놈 세그먼트에 대한 도립 말단 반복 영역의 클로닝
이 방법은 상기 자세히 나타낸 VEGF 유전자의 클로닝에 상당한다. 적절한 영역을 단리하기 위해 PCR에 대한 프라이머로서 또는 혼성화에 대한 프로브로서 사용되는 DNA 분자들은 서열 확인 번호: 4 (ITR 영역) 및 번호: 7 (PK 유전자 및 HDIR 영역 사이의 영역)으로부터 명백하다.
3. 삽입 플라스미드 또는 결실 플라스미드의 작제
외래 DNA를 PPV 게놈 내로 삽입하기 위하여 사용되는 소위 삽입 플라스미드는 섹션 2에 기술된 바와 같이 동정되고, 위치되고 클로닝된 PPV 게놈 단편을 기초로하여 제조한다. 삽입 DNA는 PPV 게놈의 세그먼트에 의해 플랭킹된, PPV 내로 삽입하여야 할 외래 DNA를 갖는다. 삽입 플라스미드를 제조하는 다양한 옵션이 있다; 다음은 예로서 본 명세서에 언급한다.
3.1 상기 2.1.4. 또는 2.2에 기술된 클로닝된 게놈 단편에서 유일한 제한 효소 인식 부위의 동정 및 제조 및 외래 DNA의 삽입
일회만 발생하는, 즉 유일한 제한 절단 부위는 예를 들면 (2.1.3 참조) 결정된 PPV 뉴클레오티드 서열에서 확인한다.
새로운 유일한 제한 효소 절단 부위를 가진, 합성에 의해 제조한 올리고뉴클레오티드를 이들 유일한 제한 부위 내로 혼입시킬 수 있다.
제조된 플라스미드들을 상기한 바와 같이 증식시키고 선별한다.
별법으로, PCR을 문헌 [Jacobs et al (참고문헌 12)]에 기술된 바와 같이 사용하여 새로운 유일한 제한 효소 인식 부위를 PPV 게놈 단편 내로 혼입시킬 수 있다.
확인되고 및(또는) 제조된 유일한 제한 효소 인식 부위는 외래 DNA를 PPV 게놈 내에 삽입시키는데 사용한다.
외래 DNA는 공지의 방법(참고문헌 11)을 사용하여 삽입시킨다.
3.2 클로닝된 게놈 단편에서 게놈 서열의 결실 및 및 외래 DNA의 삽입
소단편들은 예를 들면 클로닝된 PPV 게놈 단편을 이것을 바람직하게는 하나 이상, 특히 바람직하게는 2 개의 인식 부위를 가지는 제한 효소로 처리함으로써 결실시킬 수 있다. 효소 처리후, 생성된 단편을 상기한 바와 같이 바람직하게는 전기영동에의해 분획화시키고, 단리하고, 적절한 단편들을 리가제 처리의 수단에 의해 다시 한 번 연결시킨다. 얻어진 플라스미드들을 증식시키고 결실된 플라스미드들을 선별한다.
별법으로, PPV 게놈 단편 상의 유일한 제한 효소 인식 부위를 엔도뉴클레아제, 예를 들면 효소 Bal31으로 양방향으로 분획을 분해시키기 위한 출발점으로서 사용한다. 결실의 크기는 효소가 작용하는 동안의 기간에 의해 결정하여 겔 전기영동의 수단에 의해 확인할 수 있다. 합성 올리고뉴클레오티드들을 상기 3.1 하에 기술된 바와 같이 새로이 생성된 단편에 연결시킨다.
외래 유전자는 전체 PPV 집단의 작은 비율만으로 PPV 게놈 내로 전이시킨다.
이러한 이유로, 선별 시스템이 재조합 PPV를 야생형 PPV (참고문헌: 16)로부터 분리하는데 필요하다.
대장균 구아닐-포스포리보실 트랜스퍼라제 유전자에 기초한 gpt 선별계를 사용하는 것이 바람직하다. 진핵 세포 내에서 발현시킬 때, 이 유전자는 퓨린 대사의 억제제인 마이크페놀산에 내성을 부여한다. 재조합 벡터의 작제에 있어서 그의 용도는 여러번 기술되었다(참고문헌: 16 및 17).
4. (상기) 1 내지 12에 따른 재조합 PPV의 작제
외래 DNA는
a. 삽입 또는 결실 플라스미드의 DNA를 적합한 숙주 세포 내에서 동시에 형질감염시키고 및 PPV로 감염시킴으로서,
b. 삽입 또는 결실 플라스미드의 DNA를 적합한 숙주 세포 내에서 형질감염시키고 이어서 PPV로 감염시킴으로써,
c. PPV를 적합한 숙주 세포 내에 감염시키고 이어서 삽입 또는 결실 플라스미드의 DNA를 형질감염시킴으로써 PPV 게놈 내로 삽입시킨다.
이 목적에 적합한 절차에 대한 방법들은 공지되어 있다. 형질감염은 인산칼슘 기술, 리포좀-매개 형질감염 또는 저기천공 등의 공지의 기술을 사용하여 수행할 수 있다(참고문헌: 18).
1. PPV로의 감염
양호한 바이러스 증식 및 효율적인 형질감염을 허용하는 세포 배양물, 예를 들면 영구 소 신장 세포주 BK-Ki-3A가 외래 DNA를 함유하는 PPV를 제조하는데 바람직하다.
2. 삽입 또는 결실 플라스미드 DNA의 제조
앞서 기술한 방법에 의해 얻고 삽입 또는 결실 플라스미드를 가지는 형질전환된 세포, 예컨대 세균을 공지의 방식으로 세포들로부터 단리하고 더 정제한다. 정제는 밀도 구배, 예컨대 Cscl의 밀도구배의 등밀도 원심분리의 수단에 의하거나 또는 상업적으로 입수 가능한 실리카 입자 상의 친화성 크로마토그래피의 수단에 의하여 수행한다.
3. 형질감염
정제된 환상의 또는 선형 플라스미드 DNA가 형질감염에 바람직하게 사용된다. 정제는 예를 들면 상기 섹션 2하에 나타낸 바와 같이 수행한다.
4. 형질감염 및 감염된 세포의 배양
세포들을 상기한 방법들을 사용하여 배양시킨다. 세포변성 효과가 나타나면 배양 배지를 제거하고, 필요에 따라 원심분리 또는 여과에 의해 세포 파쇄물로부터 제거하고, 필요에 따라 저장하고 또한 바이러스의 단일 플라그 정제를 위한 통상의 방법을 사용하여 후처리한다.
재조합 PPV를 제조할 때 다음의 방법들을 이용한다:
융착될 때까지 성장시킨 BK-KL-3A 세포들을 0.001 내지 5, 바람직하게는 0.1의 MOI(multiplicity of infection)를 가지는 감염 투여량으로 감염시킨다. 두 시간 후, 감염된 세포들을 예를 들면 CaPO4-글리세롤 쇼크법을 사용하거나 또는 트랜스팩션 킷트를 사용하여 제조원의 지시에 따라(DOSPER, Boehringer-Mannheim) 플라스미드 pMT-10의 DNA (2-10 ㎍)으로 형질감염시킨다. 이들 세포 배양물들은 이어서 세포변성 효과 또는 플라그 형성이 보일 때까지 3 내지 6일 동안 37℃에서 및 5% CO2분위기에서 배양시킨다.
삽입된 외래 DNA에 따라서, 재조합 PPV를
a. 외래 DNA를 예컨대 DNA/DNA 혼성화의 수단에 의해 검출
b. 외래 DNA를 PCR 수단에 의해 증폭
c. 외래 DNA를 재조합 바이러스의 도움을 받아 발현시킴으로써 동정한다.
a.에 관련하여
이를 위해서, DNA를 문제의 바이러스로부터 단리하고 적어도 부분적으로 삽입된 외래 DNA와 동일한 핵산으로 혼성화시킨다.
단일-플라그 정제되고 재조합체로서 동정된 PPV를 바람직하게는 외래 DNA의 존재 및(또는) 발현에 대하여 재차 시험한다. 외래 DNA를 안정되게 함유하고 및(또는) 발현시키는 재조합 PPV가 추가의 사용에 적합하다.
c.에 관련하여
외래 DNA의 발현은 단백질 수준에서, 예를 들면 세포를 바이러스로 감염시키고 이어서 외래 DNA에 의해 코드된 단백질에 대하여 특이 항체를 사용하여 면역 형광 분석을 수행하거나 또는 면역침전법 또는 감염된 세포의 용해물을 사용하는 외래 DNA에 의해 코드되는 단백질에 대한 항체를 사용하여 웨스턴 블롯팅을 수행함으로써 검출할 수 있다.
외래 DNA의 발현은 RNA 수준에서 특정 전사물을 확인함으로써 검출될 수 있다. 이를 위해, RNA를 바이러스-감염된 세포로부터 단리하고 적어도 부분적으로 삽입된 외래 DNA와 동일한 DNA 프로브로 혼성화시킨다.
실시예
하기 실시예는 상동성 및 이종성 유전자의 삽입 및 발현에 적당한 PPV 게놈의 영역, 또는 그의 부분들을 기술한다. 적당한 게놈 단편은 PPV 오비스(ovis) 균주 D1701(및 각각의 그의 유도체)의 HindIII 단편 I에 함유되어 있다(서열 목록 ID No. 8 및 ID No. 12).
1. HindIII 단편 I의 클로닝:
정제된 바이러스 DNA를 제한 효소 HindIII로 절단한 후, 생성된 DNA 단편을 아가로즈 겔 전기영동에 의해 분리하고, 크기가 대략 5.6 kbp인 단편 I을 자르고 단리하여 QiaexR방법(Qiagen)을 사용하여 정제하였다. 표준 기술(Miniatis et al.)을 사용하여 상기 DNA 단편을 HindIII로 절단하고 CIP(송아지 장 포스파타제)로 처리한 벡터 플라스미드 pSPT18(Boehringer, Mannheim)에 클로닝시켰다. 생성된 재조합 플라스미드, pORF-1 및 pORF-2는 오직 삽입물의 배향에서만 다르다. 제한지도의 작성에 의해 도 1에 나타난 추가의 서브클로닝을 수행하는 것이 가능하였다. 이들의 실체와 바이러스 기원을 확인하기 위하여 제한 효소-분해된 바이러스 또는 플라스미드 DNA에 대해 모든 재조합 플라스미드 DNA를 시험하는데 서던 블롯 혼성화을 사용하였다.
2. DNA 서열화
상이한 재조합 플라스미드의 이중 가닥 DNA 및 벡터 플라스미드 pSPT18의 클로닝 부위의 두말단에 결합하는 SP6-특이 및 T7-특이 프라이머를 사용하여 DNA 서열화를 수행하였다. 생거(Sanger)의 디데옥시 쇄 종결 방법을 제조원(Pharmacia-Biotech)의 권유에 따라35S-[α]-dATP 및 T7-DNA 폴리머라제의 존재하에서 수행하였다. 얻어진 DNA 서열을 유지하면서 많은 수의 올리고뉴클레오타이드를 합성하고 이어서 HindIII 단편 I의 양가닥을 서열화하는데에 사용하였다. 바이러스 DNA 삽입물의 비교적 높은 G+C 함량(64.78%) 때문에 7-Deaza-GTP를 사용하여 서열화 구조물 또는 밴드 압축물을 분해시키고 서열화 생성물들은 필요시 포름알데히드 함유 변성 폴리아크릴아미드 겔 중에서 분리시켰다.
3. 잠재적 유전자의 동정
생성된 DNA 서열(서열 목록 확인 번호 8 및 확인 번호 12)의 컴퓨터 보조 분석은 몇 개의 가능한 개방 해독 프레임(ORFs)을 밝혀냈다. 이들 ORF로 부터 유도된 아미노산 서열은 유전자 상동성 조사(예, GCG 프로그램)에 사용하였다. 하기 유전자와의 유의적인 아미노산 상동성이 결과로서 검출되었다(또한 도 1 참조).
3.1 한 ORF는 상이한 포유동물 종(예, 마우스, 래트, 기니아 피그, 소 및 인간)의 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 및 또한 PPV 균주 NZ-2 및 NZ-7(참고문헌 6)에 최근에 기술된 VEGF 유전자 동족체와의 아미노산 상동성(36.1 내지 38.3% 동일성; 52.8 내지 58.6% 유사성)을 갖는 것으로 밝혀졌다. 다양한 오르토폭스바이러스와 같은 다른 폭스바이러스는 상응하는 유전자 상동성을 갖는 것으로 알려지지 않았다. VEGF라 명명된 ORF는 399개의 뉴클레오타이드를 포함하고 132개의 아미노산을 함유하며 14.77 kDa의 계산된 분자량을 갖는 폴리펩타이드를 코딩한다. 노던 블롯 혼성화, RNA 보호 실험 및 프라이머 연장 시험을 사용하는 전체 또는 올리고(dt)-선택된 RNA에 대한 전사 분석에 의하여 VEGF가 감염(p.i.) 진행후 약 2시간 부터 초기 유전자로서 발현된다는 것을 밝혀냈다. 특정 mRNA는 초기 백시니아 바이러스 유전자의 프로모터에 대해 전형적인 공통 모티프(consensus motif)의 중요 영역과 100%의 상동성을 나타내는 서열의 직접적인 하류단에서 시작하여, 422 내지 425개의 염기를 커버하는 것으로 밝혀졌다. VEGF mRNA의 3' 말단을 예를들어 백시니아 바이러스 유전자의 초기 전사물에 의해 공동으로 포함되는 공통 서열에서 지도화하였다. 이 mRNA의 크기는 노던 블롯 혼성화에 의해 약 500개의 염기로 측정되었고, 이는 약 100개 염기의 길이를 갖는 폴리(A) 세그먼트를 나타낸다.
3.2 몇 개의 오르토폭스바이러스(예, 백시니아 바이러스, 바리올라 바이러스 또는 쇼프-피브로마(Shope-fibroma) 바이러스)에 존재하고 F10L로 알려져 있는 상응하는 유전자와 상동성을 갖는 잠재적인 단백질 키나제(PK)를 코딩하는 또다른 ORF가 밝혀졌다. 이 유전자 동족체는 PPV 균주 D1701(12 내지 16시간 p.i.)의 감염 사이클에서 후기에 전사된다. 전사 개시점은 후기(late) 백시니아 바이러스 유전자의 공지된 프로모터와 고도의 상동성을 나타내는 영역의 짧은 거리의 하류단에 위치한다.
3.3 지금까지 알려진 유전자 서열과 어떠한 뚜렷한 상동성을 나타내지 않는 다른 가능성 있는 ORF 가 밝혀졌다. 특히 흥미로운 것은 유전자 HD1R(도 1)라 명명된 잠재적 유전자이다. 상기한 바와 같은 분석에 의해 대략 1.6 kb 크기의 특정 초기 mRNA의 전사가 입증되었다.
3.4 마지막으로, F10L의 3' 말단과 VEGF의 5' 말단과 겹치는 ORF가 컴퓨터에 의해 밝혀졌다(F9L, 제 1 도). 서열 비교는 백시니아 바이러스 F9L 유전자와 상동성을 나타냈다.
3.5 orf 균주 NZ-2 및 NZ-7의 공지된 DNA 서열을 비교하여, D1701 게놈내의 소위 ITR 영역의 개시를 HindIII 단편 I의 뉴클레오타이드 위치 1611에 고정시키는 것이 가능하였다. ITR 영역은 폭스바이러스 게놈의 말단에 나타나고 게놈의 다른 말단에 역 방향으로 유사하게 존재하여 도립 반복 영역(ITR)(서열 목록 확인 번호:4 참조)이라 명명된 서열 영역이다. 서열 비교에 의한 발견은 pORF-1에 클론된 D1701 HindIII 단편 I의 게놈내의 위치 설정에 대한 실험과 일치한다. 상기 단편, 및 추측상 동일한 HindIII의 지도가 도 2에 기술되어 있다. 이로 부터 D1701 게놈 ITR이 대략 2.6 kbp를 포함한다고 결론지을 수 있다.
D1701 VEGF mRNA의 3' 말단을 결정하는 실험에 의해 적어도 하나의 추가의 바이러스-특이 RNA가 ITR내에서 ITR로의 전이후 대략 40 및 220 bp사이에서 개시되는 것이 밝혀졌다. NZ-2 와의 아미노산 상동성 때문에, 상응하는 유전자는 ORF3(도 1)이라 명명되었다. ORF3 mRNA의 추정상의 5' 말단앞에, 초기 폭스바이러스 프로모터에 전형적인 공통 서열이 있다. 다른 유전자와의 상동성을 밝견하는 것은 지금까지 가능하지 않았다.
4. HindIII 단편 I에 DNA 서열의 도입
상동성 또는 이종성 DNA 서열의 도입을 위해 기술된 HindIII DNA 단편(플라스미드 pORF-1 및 pORF-2에 클로닝된)을 사용하는 것에 대한 가능성을 연구했다. 이 목적을 위해서 세개의 상이한 전략을 사용했다.
11K 백시니아 바리러스 프로모터의 조절하에 대장균으로 부터의 기능성 LacZ 유전자를 함유하는 플라스미드 pGSRZ을 하기 실시예를 위하여 제작하였다. 이 목적을 위해서, 플라스미드 pUCIILZ(참고문헌 7)의 DNA의 관련 부분을 단리하고 플라스미드 pSPT18에 클로닝시켰다. 이 기능성 11K/LacZ 유전자 조합물(이하, LacZ 카세트라 부름)을 pGSRZ(도 3)으로 부터 3.2 kb SmaI/SaII 단편을 단리하여 수득할수 있다.
선별 카세트의 제작
다양한 소위 선별 카세트를 도 7에 기술된 바와 같이 플라스미드 pGSSRZ(백시니아 바이러스 프로모터 P11K를 함유), pMT-1(PPV VEGF 프로모터 함유) 및 pMT5(대장균 gpt 유전자 함유) 를 사용하여 제작하였다. VEGF 프로모터(PVEGF)의 서열을 나타내는 합성 상보적 올리고뉴클레오타이드를 제조하여 pSPT18(pMT-1)의 SmaI 절단부위에 삽입시켰다. 이어서, 플라스미드 pMT-2 및 pMT-4를 BamHI 절단에 의해 각각 p18Z(pGSRZ으로 부터의 BamHI 단편을 pSPT18에 삽입에 의해 수득)으로 부터 LacZ 유전자를 제거하거나, pMT-5로 부터 gpt 유전자를 제거하고 이어서 이들을 pMT-1에 삽입시켜(도 7) 제조하였다.
기능성 gpt 유전자를 PCR에 의해 GPT 플라스미드 pMSG(Pharmacia-Biotech)로 부터 증폭시키고, 제조원(Invitron Inc.)의 지시에 따라 소위 TA 클로닝에 의해 벡터 pCRII에 클로닝시켰다.
이어서, 도 7에 도식적으로 나타낸 바와 같이 조합 및 배향에서 11K 프로모터 및/또는 PVEGF조절하에 각각 LacZ 유전자, 또는 gpt 유전자를 발현하는 이중 선별 카세트를 제작하는 것이 가능하였다.
실시예 XX(LacZ-VEGF 결실) 또는 YY(인터제닉-Bal31)에 따라, 이들 선별 카세트를, 적절한 제한 효소 절단과 단리후, 상이한 PPV orf DNA 플라스미드에 삽입시킬 수 있다. 이중 선별 카세트를 PPV D1701 VEGF 유전자의 312 bp 결실을 나타내는 기술된 플라스미드 pdV-500 에 삽입한후 제작하였다. 상기 제작에 의해 기능성 lacZ 및 gpt 유전자를 결실에 의해 제거된 VEG ORF 대신에 삽입시켰다. 일시적인 발현 시험후, PPV D1701-감염된 세포(나타나지 않음)내에서 LacZ 유전자의 활성을 입증하는 것이 가능하여 gpt 및 lacZ를 발현하는 D1701의 VEGF 결실 돌연변이체에 대한 선택을 이어서 수행하였다.
4.1 인터제닉, 비코딩 영역에의 삽입
인터제닉, 비-코딩 부분에 위치한 새로운 유일한 제한 부위의 동정 또는 제조. 이들 부위들을 이어서 기능성 및 검출가능한 유전자 생성물을 외부 DNA 서열을 코딩하는 외부 DNA 서열(예, 대장균 LacZ 유전자) 또는 그의 부분을 삽입시키는데에 사용한다.
실시예 4.1.1
플라스미드 pORF-PB(도 1)는 단백질 키나제(F10L) 및 HD1R 유전자 사이에 위치하는 단일 NruI 절단 부위를 함유한다. pORF-PB를 상기 제한 효소로 선형화시킨후, LacZ 카세트를 평활-말단 결합에 의해 이것에 연결시켰다(충전(filling-in) 반응후). 기능성 LacZ 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드들을 예를 들면 BglI으로 절단 후 선별하고, 정확한 삽입 여부를 LacZ-특이성 프로브를 사용한 서던 블롯 혼성화의 수단에 의하거나 또는 LacZ/PPV DNA 전이부를 부분적으로 서열화하는 수단에 의하여 입증하였다.
실시예 4.1.2
상기 실시예에 기술된 바와 동일한 접근법을 VEGF 유전자의 하류단(BstEII 부위에서 절단, 도 1) 및 ITR영역에서 잠재적인 유전자 ORF 3(pSPT18 클로닝 부위에서 XbaI 부위의 절단을 막기 위하여 XbaI으로 부분 분해시킴)에 사용하였다.
실시예 4.1.2
PCR 돌연변이유발의 기술을 사용하여 클로닝된 PPV DNA 단편에서 목적하는 점에 새로운, 유일한 제한 부위를 도입시켰다(도 10, 참고문헌 12). 이를 위하여, 두 PCR 반응을 각각 프라이머 쌍 E1+EV2 (PCR A) 및 EV1+XB (PCR B)을 사용하여 개별적으로 수행하였다. 모든 프라이머는 주어진 서열 위치에서 PPV DNA 서열과 동일한 25 뉴클레오티드를 커버한다. 프라이머 B는 진짜 서열, 예컨대 XbaI 부위 주위 (도 1)로 구성된 반면, 새로운 EcoRI 부위가 프라이머 E1의 5' 말단에 도입되었고, 새로운 EcoRV 부위가 프라이머 EV1 및 EV2(이들은 서로 상보성임) 내로 도입되었다. pORF-1 또는 pORF-2의 전체 서열에 존재하는 에 원래 존재하지 않은 EcoRV 부위는 LacZ 카세트를 도입하기 위하여 선택된 지점에서 삽입되었다. 반응물 A 및 B로부터 얻은 PCR 생성물을 정제하고 단일 가닥으로 변성시키고 재결합 조건 하에서 함께 혼합하고; 이어서 이들을 최종 PCR 반응에 이용하고; 즉 PCR C. E1 및 XB를 예를 들면 pORF-1의 왼쪽 793 염기쌍을 연장시키기 위하여 프라이머로서 사용한다. 겔 단리 및 정제 후, 반응 C로부터 초래된 PCR 생성물을 EcoRI 및 XbaI으로 절단하였다. 그 결과, 플라스미드 pORF-1EV (도 5)는 목적하는 위치에서 EcoRV 제한 부위를 함유하는데; 이는 이어서 선형화시키고 LacZ 카세트 내로 연결시키는데 사용될 수 있다.
또한, 규정된 염기 변화 또는 단일 염기의 결실을 포함하는 오정합 프라이머를 예를 들면 바이러스 DNA 서열에서 임의의 목적하는 지점에서 번역 종결 코돈 또는 아미노산 결실을 생성시키기 위하여 본 실시예에서 기술한 방법에 사용할 수 있다.
4.2 orf 서열의 결실이 없는 인트라제닉 삽입
새롭거나 또는 추가의 서열들을 선별된 유전자에서 단 한 번만 발생하는 제한 부위에서 절단한 후 상기한 ORF의 하나의 코딩 서열 내로 도입시킬 수 있다.
실시예 4.2.1
F10L 유전자 동족체의 우측부에 위치한 유일한 XbaI 부위를 사용하여 플라스미드 pORF-1을 선형화시켰다. 두 LacZ 카세트 및 절단된 pORF-1 DNA를 T4 DNA 폴리머라제 또는 클레나우 DNA 단편을 사용하여 평활 말단으로 제공하고 이어서 연결시켰다; 적격 대자균 박테리아 (DHαF')을 이어서 형질전환에 사용하였다. 생성된 세균 콜로니들을 LacZ-특이성 프로브를 사용하여 콜로니 필터 혼성화의 수단에 의해 양성의 재조합 플라스미드에 대하여 시험하고 대응하는 플라스미드 DNA를 제한 효소로 절단하였다.
실시예 4.2.2
VEGF-코딩 영역은 단일 Styl 부위를 함유하는데 이것을 상기한 바와 같이 LacZ 카셋트를 삽입하는데 사용하였다.
4.3 바이러스 서열의 결실
다음의 실시예들은 두 코딩(인트라제닉 결실 및 비코딩 인트라제닉 결실) 영역의 제거에 대하여 기술한다.
실시예 4.3.1
외래 유전자 또는 이들 유전자의 일부를 삽입시킴으로써 결실된 바이러스 서열을 대체하기 위하여 제한 효소들을 사용하여 HindIII DNA 단편 I의 규정된 부분을 제거하였다. 이는 플라스미드 pORF-PA를 제한 효소 NruI (ITR 영역에서의 한 점에서, 도 1)로 절단시킴으로써 수행하고 그 결과 396 염기쌍 단편을 결실시켰다. 충전(filling-in) 반응 후, LacZ 카세트를 상기한 바와 같이 연결하였다. 도 4는 pORF-PA로부터 396 염기쌍 단편의 결실 및 LacZ 카셋트의 삽입을 도식적으로 나타낸다. 도 5 및 6은 이 방식으로 작제되고 pORF-PA로부터 유도된 삽입 및(또는) 결실 플라스미드 pCE4 및 pCE9를 나타낸다.
실시예 4.3.2
HindIII DNA 단편의 개별 제한 부위를 도 6에 도식적으로 나타낸 바와 같이 엔도뉴클레아제 Bal31의 영향하에 서열들의 양방향성 결실을 수행하기 위한 출발점으로서 사용하였다. VEGF 및 단백질 키나제 F10L을 각각 코드하는 유전자를 개방시키기 위하여 효소 StyI 및 XcmI을 사용하여 플라스미드 pORF-PA 및 플라스미드 pORF-1 또는 pORF-XB의 경우에 제한 분해시켰다(도 1 및 6). 엔도뉴클레아제 Bal31을 첨가한 후, 정제수를 매 2 분 마다 반응물로부터 제거하고 이어서 반응을 정지시켰다. 시간에 따른 시료의 예를 들면 제한 효소 BglI을 사용한 절단 및 후속적인 전기영동에 의하여 Bal31에 의하여 결실된 DNA 세그먼트의 크기를 측정하는 것이 가능하였다. 이어서 적절한 시점의 시료들의 혼합물을 사용하여 충전(fill-in) 반응의 수단에 의해 DNA 말단을 연결하였다. 새로운 유일한 SmaI, SalI 및 EcoRV 제한 부위들을 포함하는 두 상보성 올리고뉴클레오티드들을 이어서 혼성화시키고 생성된 이중 가닥 프라어머 분자(EcoRI 링커라고 한다)들을 평활 말단의 Bal31 생성물에 연결시켰다. 세균을 형질전환시킨 후, 플라스미드 DNA를 단리하고 EcoRV로 절단하였는데 이는 PPV Hind III 단편 I의 DNA 서열에서 어떠한 인식 부위도 갖지 않았다. 따라서 EcoRV 부위를 가지는 모든 플라스미드 DNA는 삽입된 링커를 함유하였으며 이어서 평활 말단의 LacZ 카세트를 새로운 EcoRI 부위 내로 연결하는데 사용하였다. 각각의 생성된 재조합 플라스미드 DNA에서 생성된 DNA 결실의 정확한 크기를 단일 가닥 EcoRV 링커를 사용하고 적합한 LacZ 유전자 특이성 프라이머를 사용하는 서열화의 수단에 의하여 결정하는 것이 가능하였다.
5. 다른 파라폭스바이러스에서 VEGF 유전자의 결실 및 동정
D1701에서 VEGF를 코드하는 DNA 영역에 대한 지식으로 인하여 광범위하게 상이한 제한 프로필을 가질 수도 있는 다른 파라폭스바이러스 균주에서 이 유전자를 동정하기 위한 특수한 DNA 프로프 및 PCR 프라이머를 제조하는 것이 가능하다. 이를 위하여 다음의 가능성들을 시험하였다: (i) D1701 VEGF 유전자의 중심부를 나타내는 혼성화 프로브로서 pORF-PA의 TaqI 소단편 (366 bp)를 단리하고; (ii) 적합한 합성 프라이머를 사용하여 적격 VEGF ORF를 증폭시키고 이어서 PCR 생성물을 플라스미드 내로 클로닝시키고; (iii) 다른 부위의 VEGF 유전자를 커버하는 프라이머들을 주형 및 특수한 혼성화 프로브로서 PPV DNA의 존재하에 PCR에 사용하였다.
방사성 동위원소로 표지시킨 후, 이들 프로브들을 다양한 단리물의 게놈 DNA및 파라폭스 오비스, 파라폭스 보비스 1 (소 유행성 위염; BPS) 및 파라폭스 보비스 2 (밀커스 노들)의 균주를 사용하여 서던 및 돗/스폿(dot/spot) 블롯 혼성화에 성공적으로 사용하였다.
또한, 다른 PPV 균주에서 잠재적인 VEGF 유전자를 시험하기 위하여 동일한 프로브들을 사용하여 노던 블롯 혼성화 등의 비교 RNA 분석을 수행하였다.
6. D1701 재조합체의 생산
융착에 이를 때까지 성장한 BK-KL-3A 세포들을 0.1의 MOI(multiplicity of infection)을 갖는 감염 투여량으로 감염시켰다. 두시간 후, 감염된 세포들을 예를 들면 CaPO4-글리세롤 쇼크법을 사용하거나 또는 트랜스팩션 킷트를 사용하여 제조원의 지시에 따라(DOSPER, Boehringer-Mannheim) 플라스미드 pMT-10의 DNA (2-10 ㎍)으로 형질감염시켰다. 이들 세포 배양물들은 이어서 세포변성 효과 또는 플라그 형성이 보일 때까지 3 내지 6일 동안 37℃에서 및 5% CO2분위기에서 선별배지 (HAT 배지 + MPA 마이코페놀산 -잔탄-5% FCS) 배양시켰다. 바이러스 유발된 세포독성 효과의 정도에 따라서:
(a) 세포 용해물을 얻고, 희석 시리즈를 제조하고 플라그 시험을 BK-KL-3A 세포 상에서 수행하였다. LacZ-발현, MPA-체류 D1701 재조합체를 함유하는 청색 플라그를 동정하기 위하여 첨가된 아가로스 배지 혼합물은 0.3 mg/ml Bluo-Gal (GIBCO-BRL Life Science)를 함유하였다.
(b) 개별 플라그들이 형성된 후, (a)에 기술된 아가로스/Blue Gal 혼합물을 첨가하고 청색 개별 플라그를 선택하였다.
BK-KL-3A를 감염시키기 위해 (a) 또는 (b)에서 얻은 바이러스들을 후술하는 바와 같이 이용하고 100% 상동성 재조합 바이러스 집단이 얻어질 때까지 2회 이상 추가의 플라그 적정 및 정제를 수행하였다.
7. VEGF 프로모터
3.1 장에서 개략적으로 나타낸 바와 같이, D1701의 VEGF 유전자는 초기 유전자인데; 특정 mRNA를 감염에 있어서 비교적 늦은 시간까지 감염시킨 후 2 내지 4 시간 동안 D1701 바이러스 감염된 세포 중에서 대량으로 전사시켰다. 이러한 이유로, 동정된 D1701 VEGF 프로모터 영역은 재조합 PPV 바이러스에서 외래 유전자 또는 이들 유전자의 일부의 발현을 조절하는데 매우 유용하여야 한다. VEGF 프로모터 (35 내지 40 뉴클레오티드; 서열 확인 번호: 6)를 포괄하는 서열은 (i) 프로모터 영역의 측면에 위치한 적절한 프라이머를 사용한 PCR, (ii) 적절한 DNA 단편의 서브클로닝, 또는 (iii) 올리고뉴클레오티드로서 프로모터 서열을 합성하는 수단에 의해 단리할 수 있다. VEGF 프로모터를 목적하는 임의의 유전자 또는 DNA 서열에 연결시킨 후, 결과의 유전자 카세트는 선행 장에서 기술한 특정 방법에 따라 재조합 PPV를 제조하는데 사용할 수 있다.
8. 10 kDa 유전자
PPV 10 kDa 유전자를 검출하기 위한 특수한 PCR을 PPV 균주 NZ-2로 부터의 10 kDa 유전자의 공개된 DNA 서열을 기초로 하여 수행하였다. 합성에 의해 제조한 프라이머 10K-up (5'-CAATATGGATGAAAATGACGG'3) 및 10K-down (5'-CAGACGGCACACAGCG-3)을 사용하여 PCR을 수행한 후, 크기가 297 염기쌍인 특정 생성물을 증폭시켰다. 후속적인 클로닝 (TA Cloning kit, Invitrogen Inc.)에 의해 EcoRI 단편으로서 297 bp PCR 생성물을 함유한 플라스미드 pJS-1이 초래되었다. pJS-1 감염의 두 DNA 가닥의 DNA 서열화에 의해 10 kDa 유전자가 존재하는 것으로 확인되었다. 이 서열에 따라, D1701은 NZ-2 PPV와 93.3% 아미노산 동일성 및 96.7% 아미노산 유사성을 가진 91-아미노산 10 kDa 단백질을 코드한다.
방사성 동위원소 표지된 pJS-1을 사용한 서던 블롯 혼성화를 사용하여 D1701 게놈의 EcoRI 단편 E (4.25 kbp)에서의 10 kDa 유전자를 찾아내었다. 따라서, 이 유전자는 NZ-2에서와 같이, 바이러스 게놈의 우측부에 위치하고 HindIII 단편 K 및 G의 절단 부위를 함유한다(도 2).
4.25 kbp D1701 EcoRI 단편 E를 함유하는 플라스미드 pDE-E1을 사용하여 10 kDa 유전자가 삽입 또는 결실부(원칙적으로 상기한 바와 같음)을 포함한 플라스미드를 제조하였다. D1701 10 kDa 유전자 (번호 124-129, 서열 확인 번호 11)의 N-말단 세그먼트에서 HindIII 절단 부위 (단편 K-G)를 직접적으로 외래 DNA를 삽입시키고 10 kDa 유전자를 결실(Bal31을 사용한 양방향성 절단을 참조)시키는데 모두 사용할 수 있다. 후자의 구성에 대하여, 두 번재 HindIII 절단 부위(벡터 플라스미드 pSPT18의 다클로닝 부위)를 플라스미드 pDE-E1으로부터 제거하였다. 이를 위하여, pSPT18 DNA를 HindIII로 절단하고, 그 후 HindIII 절단 부위를 클레나우로 처리하여 파괴시키고 플라스미드를 재연결시켰다. 4.25 kbp D1701 EcoRI 단편 E를 이어서 이 새로운 벡터 플라스미드 pSPT18의 EcoRI 제한 부위 내로 클로닝시켰다. 얻어진 플라스미드, pRZ-E1 (도 8)은 이제 10 kDa 유전자의 유일한 HindIII 절단 부위를 가지며, 이 부위는 추가의 단순 조작을 허용한다.
방사성 동위원소로 표지된 프로브로서 pDE-E1 및 pJS-1을 사용한 서던 블롯 혼성화 및 또한 PCR 연구에 의해 상이한 PPV 보이스 1 균주의 게놈은 10 kDa-특이성 서열을 함유하지 않는다. 이는 10 kDa PPV 유전자가 필수적이 아님을 나타낸다(Buettner et al. 1996, 참고문헌 10).
참고문헌
서열 확인 번호: 1
본원 발명의 서열 확인 번호: 1은 균주 PPV D1701의 Hind III 단편 I에 위치한 VEGF 유전자를 나타낸다.
추가의 정보:
초기 프로모터: 뉴클레오티드 50 내지 64
mRNA 개시: 뉴클레오티드 78 또는 80
mRNA 정지: 뉴클레오티드 498 내지 500
번역 개시: 뉴클레오티드 92 내지 94
번역 정지: 뉴클레오티드 488 내지 490
서열 확인 번호: 2
본원 발명의 서열 확인 번호: 2는 균주 PPV D1701의 Hind III 단편 I에 위치한 단백질 키나제 유전자 F10L(버젼 1)을 나타낸다.
추가의 정보:
후기 프로모터: 뉴클레오티드 48 내지 66
mRNA 개시: 뉴클레오티드 74 내지 78
번역 개시: 뉴클레오티드 94 내지 96
번역 정지: 뉴클레오티드 1738 내지 1740
서열 확인 번호: 3
본원 발명의 서열 확인 번호: 3은 균주 PPV D1701의 Hind III 단편 I에 위치한 HDIR 유전자를 나타낸다.
서열 확인 번호: 4
본원 발명의 서열 확인 번호: 4는 균주 PPV D1701의 Hind III 단편 I에 위치한 ITR 유전자 및 이 영역에서 발견되는 ORF3을 나타낸다.
추가의 정보:
ITR 영역의 시작: 뉴클레오티드 7
초기 프로모터: 뉴클레오티드 18 내지 33
OFR3 mRNA 개시: 뉴클레오티드 40 또는 41
OFR3 mRNA 정지: 뉴클레오티드 673 내지 679
OFR3 번역 개시: 뉴클레오티드 111 내지 113
OFR3 번역 정지: 뉴클레오티드 562 내지 564
서열 확인 번호: 5
본원 발명의 서열 확인 번호: 5는 균주 PPV D1701의 Hind III 단편 I에 위치한 F9L 유전자 동족체 (버변 1)을 나타낸다.
추가의 정보:
출발 코돈: 뉴클레오티드 48 내지 50
정지 코돈: 뉴클레오티드 861 내지 863
서열 확인 번호: 6
본원 발명의 서열 확인 번호: 6은 균주 PPV D1701의 Hind III 단편 I에 위치한 VEGF 프로모터를 나타낸다.
서열 확인 번호: 7
본원 발명의 서열 확인 번호: 7은 HDIR 및 PK10L 사이에 위치하고 균주 PPV D1701의 Hind III 단편 I에 위치한 인터제닉 영역을 나타낸다.
추정 HDIR 번역 정지: 뉴클레오티드 25 내지 27
PK10L 번역 개시: 뉴클레오티드 223 내지 225
서열 확인 번호: 8
본원 발명의 서열 확인 번호: 8은 균주 PPV D1701의 Hind III 단편 I(버젼 1)의 완전한 뉴클레오티드 서열을 나타낸다.
서열 확인 번호: 9
본원 발명의 서열 확인 번호: 9는 균주 PPV D1701의 Hind III 단편 I에 위치한 단백질 키나제 F10L의 버전 2를 나타낸다.
추가의 정보:
후기 프로모터: 뉴클레오티드 48 내지 66
mRNA 개시 신호: 뉴클레오티드 72 또는 80
mRNA 개시: 뉴클레오티드 74 내지 78
번역 개시: 뉴클레오티드 94 내지 96
번역 정지: 뉴클레오티드 1585 내지 1588
서열 확인 번호: 10
본원 발명의 서열 확인 번호: 10은 균주 PPV D1701의 Hind III 단편 I에 위치한 F9L 유전자 동족체의 버전 2를 나타낸다.
추가의 정보:
번역 개시: 뉴클레오티드 50 내지 52
번역 정지: 뉴클레오티드 722 내지 724
서열 확인 번호: 11
본원 발명의 서열 확인 번호: 11은 균주 PPV D1701의 EcoRI 단편 E에 위치한 10kDa 유전자를 나타낸다.
추가의 정보:
번역 개시: 뉴클레오티드 5 내지 7
번역 정지: 뉴클레오티드 275 내지 277
서열 확인 번호: 12
본원 발명의 서열 확인 번호: 12는 균주 PPV D1701의 Hind III 단편 I의 버전 2의 완전한 뉴클레오트드 서열을 나타낸다.
서열 확인 번호: 13
본원 발명의 서열 확인 번호: 13은 균주 PPV D1701의 Hind III 단편 I에 위치한 단백질 키나제 F10L 유전자의 버전 3을 나타낸다.
추가의 정보:
후기 프로모터: 뉴클레오티드 48 내지 66
mRNA 개시 신호: 뉴클레오티드 72 또는 80
mRNA 개시: 뉴클레오티드 74 내지 78
번역 개시: 뉴클레오티드 94 내지 96
번역 정지: 뉴클레오티드 1585 내지 1588
서열 확인 번호: 14
본원 발명의 서열 확인 번호: 14는 PPV D1701 단백질 키나제 F10L 동족체 의 아미노산 서열(서열 확인 번호: 13으로부터 추정함)을 나타낸다.
서열 확인 번호: 15
본원 발명의 서열 확인 번호: 15는 PPV D1701 VEGF 동족체의 아미노산 서열(서열 확인 번호: 1로부터 추정함)을 나타낸다.
서열 확인 번호: 16
본원 발명의 서열 확인 번호: 16은 PPV D1701 F9L 동족체의 아미노산 서열(서열 확인 번호: 10으로부터 추정함)을 나타낸다.
(1) 일반적 정보:
(i) 출원인:
(A) 명칭: 바이엘 악티엔게젤샤프트
(B) 거리: 바이엘베르크
(C) 도시: 레버쿠젠
(E) 국가: 독일
(F) 우편 번호 (ZIP): D-51368
(A) 전화 번호: 0214/3061285
(B) 팩스: 0214/30 3482
(ii) 발명의 명칭: 외래 DNA를 함유하는 파라폭스바이러스, 이들의 제조 방법 및 백신에 있어서 이들의 용도
(iii) 서열 수: 16
(iv) 컴퓨터 판독형:
(A) 매체 형태: 플로피 디스크
(B) 컴퓨터: IBM PC 호환성
(C) 운영 체계: PC-DOS/MS-DOS
(D) 소프트웨어: PatentIn Release #1.0, 버전 # 1.30 (EPO)
(2) SEQ ID NO: 1에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 118 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥: 이중
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자형태: DNA (게놈)
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티센스: 없음
(vi) 원기원:
(A) 생물체: Parapox ovis
(B) 균주: D1701-VEGF-Gen
(xi) 서열의 기재: SEQ ID NO: 1:
GGTGCGCTAC CAATTCGCGC GGCCGGCCGC GCTGCGCGCG TAGCCGCGCA AAATGTAAAT 60
TATAACGCCC AACTTTTAAG GGTGAGGCGC CATGAAGTTT CTCGTCGGCA TACTGGTAGC 120
TGTGTGCTTG CACCAGTATC TGCTGAACGC GGACAGCACG AAAACATGGT CCGAAGTGTT 180
TGAAAACAGC GGGTGCAAGC CAAGGCCGAT GGTCTTTCGA GTACACGACG AGCACCCGGA 240
GCTAACTTCT CAGCGGTTCA ACCCGCCGTG TGTCACGTTG ATGCGATGCG GCGGGTGCTG 300
CAACGACGAG AGCTTAGAAT GCGTCCCCAC GGAAGAGGCA AACGTAACGA TGCAACTCAT 360
GGGAGCGTCG GTCTCCGGTG GTAACGGGAT GCAACATCTG AGCTTCGTAG AGCATAAGAA 420
ATGCGATTGT AAACCACCAC TCACGACCAC GCCACCGACG ACCACAAGGC CGCCCAGAAG 480
ACGCCGCTAG AACTTTTTAT GGACCGCATA TCCAAACGAT GATGCGATCA GGTCATGCGG 540
(2) SEQ ID NO: 2에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 1740 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥: 이중
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자형태: DNA (게놈)
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티센스: 없음
(vi) 원기원:
(A) 생물체: Parapox ovis
(B) 균주: D1701-단백질 키나제 유전자(버젼 1)
(xi) 서열의 기재: SEQ ID NO: 2:
CGAGTGACTG CCCATCCCGT TGCTGCGCGA CTCGGGACTG CCCTCTGTTT TTCTTTCCCG 60
TTTCTTCTTA TTAGGTAGTT GTTGCCCACC TCCATGATCC TCGCACGCGC TGGCGGGCGA 120
CCTCGCACGC CCGCGGCGGC CGCGGCGGCC GCCGAGGACG GCAAGAACAG TGATCGCCGG 180
AAGCGCAAGC GCAAGACGCC CAACTGCGAA GACGCCGACA ACTCCGACGA CGAGCTAGCG 240
CAGACGCCGT GCGACCGCGA GTGGCCGGAC TGTCGCGCGA GCTCGATCAC GAGCTCCGAC 300
TCGGTCTCTC TCGGCGACGA GATCTACTTG CGGTACGTAG CCTCGCAGGT GGACTTCGCG 360
CAGACCTGGG CCCCGCCGGT GCGGCTGCTG CGCTTCTTCG GGAACTTCTC GAAGGAAACG 420
CTCAGCCGCA TGTCGCGGCG CGGGTACGTG AACCGCTCCT ACTTCCAGAT GGCGCACGCG 480
CGCTTCTCGC CCACCAACGA CGACATGTAC CACATGGCCA CTGGCGGGTA CGGCATCGTG 540
TTCCGCTTCG ACCGCTACGT GGTCAAGTAC GTCTTCGAGC ACCGCAACGG CATGTCCGAG 600
ATGGACGCCT CTACGGAGTA CACGGTGCCG CGGTTCCTGC GCAATAACCT CAAGGGCGAC 660
GAGCGCGAGT TCGTGGTCTG CGCGCTGGCC ATGGGGCTGA ACTACCGGCT GGGCTTCCTG 720
CACTCGCTGT ACCGGCGCGT GCTGCACACG CTGCTGCTGC TCATGCGCGT GGAGGAAGGC 780
CAGCGGCCCT CGGTAGAGAT GGCCAAGAAG CCGCTGCTGC GCTGGTTCGA GGCGCGCAAG 840
GACAGCGAGT CCTTCGTGCG CCTGGTCTCG TACTTCTACC CCTCGGCCGT GCAGAGCAAC 900
GTGAACCTGA TCAACAACTT CCACCACCTG GTGCACTTCT TTGAGCACGA GAAGCGCGCG 960
CGGTACGTGT TCGACCGCGG GGCCGTGATC GTGTTCCCTC TGGCGCGCGG GTCCGCGGAC 1020
TCGATCTCGC CGGAGGCGGC GGCAGCGCTG GGCTTCGCGC CGCACTCGGA GTTCCTCAAG 1080
TTCGTGTTCC TGCAGATCGC GCTGCTGTAC CTGAAGATAT ACGAGCTCCC GGGCTGCACG 1140
AACTTCCTGC ACGTGGACCT GAAGCCCGAC AACGTGCTCA TCTTCGACAG CGCGCGCGCT 1200
CAGCGTGACT GCGGCCGGTG CGACTTTTCG CTTCGAAGAG CCCGTGCGCG CGGCGCTGAA 1260
CGACTTCGAC TTCGCGCGCG TGGCCACCAT CGAGAACCGC AAGATCGCGG GCAGCGTCCG 1320
CGTGCCGCAG AACTGGTACT ACGACTTCCA CTTCTTCGCG CACACGCTGC TGCGCGCGTA 1380
CCCGCACATC GCCGCGGAGG ACCCGGGCTT CCACGCGCTG CTCTCGGAGC TCACGGTCTC 1440
GTGCTCGCGC GGGACCTGCG ACCGCTTCCG GCTGCGCGTG TCCTCGCCGC ACCCCATCGA 1500
GCACCTCGCG CGGCTGGTGC GCCGCGACGT CTTCTCCCGC TGGATAAATG CCGCCGCGGA 1560
CGCCCCCGAC GCCGCACTCT CCTGAGCCCA CGCCCGCGGC GCCGGGCTCG CTGTACGACG 1620
TCTTCCTCGC GCGCTTCCTG CGCCAGCTGG CCGCGCGCGC GGCGCCGGCC TCGGCCGCCT 1680
GCGCCGTGCG CGTGGGTGCG GTGCGCGGCC GCCTGCGGAA CTGCGAGCTG GTGGTGCTGA 1740
(2) SEQ ID NO: 3에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 1080 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥: 이중
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자형태: DNA (게놈)
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티센스: 없음
(vi) 원기원:
(A) 생물체: Parapox ovis
(B) 균주: D1701-HDIR-유전자 영역
(xi) 서열의 기재: SEQ ID NO: 3:
AAGCTTGTTG CGCGAGTACG TGGTGACCCG CGCCTACTCG GATCAGACCG AGCCGATCAT 60
GGACTTGCTC ATCGGCATGG GCGCCGACGT GGACATGCAG GTCGGCGTGT GCCGCACGGC 120
GCTGCACGCC TGCCTTACGG GCTTGAACAC GAACCCGTGC ATGATTCGCG CGCTGCTTCG 180
GCGCGGCGCC AGCGTGACCG CAAAAGACAC CTACGAGATG ACGCCACTGG CGTGTTGCTG 240
AAGTCCGCGA GCGCGACGCC GGAGCTCGTG CGCATCCTCG TGGAAGCAGG CTCCGACGTG 300
AGCGCCACCG ACTTCCGCCT CAACGGCATG CTGCACCAGC ACGCAGTCCA CGCGCCCGCG 360
CGCGAGCGTC ATGCGCGAGC TCATCCGGCT GGGGTGCAGC CCAGCGGCCA AAAACATGTT 420
TGGGAACACG CCGATGCACA TGCTGGCCAT GGAAAGCTCC TGCCGCCGCT CGCTGATCCT 480
CCCGCTGCTG GAGGCAGGGC TTTCCGTGAA CGAGGAGAAC CTGCACTACG GCACCGTGCC 540
TCTGCACGTG GCCTCGGGGT ACGACAACAC GCAGGGCTGC CTCAAGCTCC TCCGGCAGGG 600
AGGAGACCCC ACCGTCGTGT CAGCCGCCGG ACGCACACCG ATCTCGAACA TGCTCGTCAA 660
AGCCAACCAC GTGGCGGTCG CCGGCGCGCT GTCGACGCAC CCGAGCGCGG CAGTGGTCGT 720
GCAGGCTCTC GAGCAGGCTC TCGAGAACGT GCTGAACGCC GGGCCCAGCG AGGCCTCGCG 780
GCTCGCCGTG GCCTTTGTGG TGGCGCGCGC CGGCGCATCC GCGCTACCGG AGGCCGTGCG 840
CCGTCTTCAC GAGGGCTTCG TCGCCGACTG CGAGCGCGAA GTCGCGTTGC TTTCCCGCAG 900
CATGCTCGGC ACACCGGCCG TGAGCGCGCT GGTCGTGCTG GTCAGCAAGG AGGTCTTTGG 960
CACTGTTATC TCCTCGCGTG CGCTGCGCGT CGCGCGGGAG GTCCGCGTGT ACGCAAGGCC 1020
GCTCCGCGAG GCGCTCATAA ATCTGCGCCA CAAATGCCGC TTAGTTTCCA GCCTTAAAAG 1080
(2) SEQ ID NO: 4에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 1616 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥: 이중
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자형태: DNA (게놈)
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티센스: 없음
(vi) 원기원:
(A) 생물체: Parapox ovis
(B) 균주: D1701-ITR 및 ORF-3 유전자
(xi) 서열의 기재: SEQ ID NO: 4:
AAGGAGGCTC CACGGAGCAA AGTGAAAAAG GACCGCCTAG AGTCGAGACC CCTCCCTCCC 60
GCCTCGGGCA AACCCACAGC CGCCGCAAAC ACCACACCCG CCGACCTACC ATGCACCCCT 120
CGCCGCGCCG GCTGCTCGGC GCGCTCGCGC TGCTGGCGCT GGGCTTCGCT CGGCGCGCTC 180
TTCGCCCCGC GGCGCCGCTC GTGCCGGCCG CCTTCCTGGA GGTGGGGCAC GTGCGCGCGA 240
ACCCGTCCGC CTCGGTGACC TGCCTCACGG TGGGCGGCGA CGGGCGGCAC ATGGCGGCGG 300
TCGCGCACGG CGGCGGGACG CTCTCGCCGG TGTACCCGCT GGCCGCCGGC ATGCACGCGA 360
CCTTCTCCTC CGCGCGCAAG GGCGCGCTGC TGCTGAACGT CGCGACCGTG ACTGTGTACG 420
ACGTGCGCGC GCTCGCCCCC GAGTTCGAGC TCGTCTGCAT CGCGGTGGTC GGCGGCTACA 480
ACTCGGCCGC GGCCGCCACG CGGCCCGCGG CCGAGTGGCA CCGCCAGCTG GAGCTGCGCC 540
GCTCGGAGCT GTGACCCCTC CCTCCCCGGT CTCCCTCTGT CTTTGTAATC GGCCTTAGAG 600
ATTAGACATC ATCCTCCACG CCTCTTTGTC CGCCGCCCTT CTTCGCGGAC GGATGAACCA 660
ATTAATTAAT TATTTTTGTC GCTCGCCCGC TCACTCCGGC AAGGGAACGA GTGACGTTAA 720
CTCTCTCACC CTCACGCACA AGAACAAGAA CCGCTCACTC ACCGGGCAAG GGAACACGGT 780
TAAGGTCAAC TCACTCGCGA GAACAAGTTG ACCCTCACTC TAGAGAACGA GGAACGGGCA 840
ACAAGCAACC GTCAACTCAC TTACCACGAG AACAAGTTGA CCGCCACTCA AAGGGAACAG 900
AGAACAGTAA CCGTTCTCGC TCGCTCGGAA CAATAGAACA AGTTAACGTC AACTCGCTCG 960
CTCGGTGTAA GAGAACAACA GAACAAGCAA CTGTTGACCA CTCAACCCCC GGAGAAGAGA 1020
ACAAGAGAGC AGTCAACTCA CCCACTCAGT CTTGGATGAG AGGAGGACGA GTTAACGAGT 1080
ACTCGCACGC AGAGTGAGAG AGTGAGGACA TAATAATAGT TAACGAGTTA ATACTCACTC 1140
GCTCACTCAG AGTGAGAGAG AACCAGTGAG CGAGTTAACC GCGCACACGA GCGAGAGAAC 1200
AGTGAACTGC TCGCGCGCTC GCTCGGTAGC AGTCGGCCTT TCTTAAAACG GTTCGTAAAA 1260
CTTTTCCCGA GACAGTTCAC CCTCCAAAAC TTTTAAAACT AAACTCGGAG GTGGCCTGCC 1320
CTCCACTCTC CGTAAAACTT TTGTAAAACT GTCGGAGGTC GGTCGACTTC GCAACTCGTC 1380
CGCGAAAACT TTTCGTGGGC AGTGTCTGCC TCTCTCAGGC TCCTCGCATC ACTTTCGCGG 1440
AGCCTCGAGG TAGGTCACCT CTCTCCAAAC TTTTGTAAAA ACTTTTTCGC GGAGCCTCTG 1500
GAGGCCGTCC TCCCTCCAAA ACTTTTCGTA AAATCTCTTC GGAGGCCGTC CTCCCTCCAA 1560
AACTTTTCGT AAAATCTTTG GGAGGTCGAC CTCCCTCAAA ACTTTTTATA AAGCTT 1616
(2) SEQ ID NO: 5에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 900 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥: 이중
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자형태: DNA (게놈)
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티센스: 없음
(vi) 원기원:
(A) 생물체: Parapox ovis
(B) 균주: D1701-9FL 유전자 (버젼 10
(xi) 서열의 기재: SEQ ID NO: 5:
GCACCTCGCG CGGCTGGTGC GCCGCGACGT CTTCTCCCGC TGGATAAATG CCGCCGCGGA 60
CGCCCCCGAC GCCGCACTCT CCTGAGCCCA CGCCCGCGGC GCCGGGCTCG CTGTACGACG 120
TCTTCCTCGC GCGCTTCCTG CGCCAGCTGG CCGCGCGCGC GGCGCCGGCC TCGGCCGCCT 180
GCGCCGTGCG CGTGGGTGCG GTGCGCGGCC GCCTGCGGAA CTGCGAGCTG GTGGTGCTGA 240
ACCGCTGCCA CGCGGACGCT GCCGGCGCGC TCGCGCTGGC CTCCGCGGCG CTGGCGGAAA 300
CGCTGGCGGA GCTGCCGCGC GCGGACAGGC TCGCCGTCGC GCGCGAGCTG GGCGTGGACC 360
CAGAGCACCC GGAGCTGACG CCGGACCCCG CCTGCGCGGG CGAGAGGCGC GCTTGCGCAG 420
AACATCGACA TCCAGACGCT GGACCTGGGC GACTGCGGCG ACCCCAAAGG CCGCCGACTG 480
CGCGTGGCGC TGGTGAACAG CGGCCACGCG GCCGCAAACT GCGCGCTCGC GCGCGTAGCG 540
ACCGCGCTGA CGCGCCGCGT GCCCGCAAGC CGGCACGGCC TCGCGGAGGG CGGCACGCCG 600
CCGTGGACGC TGCTGCTGGC GGTGGCCGCG GTGACGGTGC TCAGCGTGGT GGCGGTTTCG 660
CTGCTGCGGC GCGCGCTGCG GGTGCGCTAC CAATTCGCGC GGCCGGCCGC GCTGCGCGCG 720
TAGCCGCGCA AAATGTAAAT TATAACGCCC AACTTTTAAG GGTGAGGCGC CATGAAGTTT 780
CTCGTCGGCA TACTGGTAGC TGTGTGCTTG CACCAGTATC TGCTGAACGC GGACAGCACG 840
AAAACATGGT CCGAAGTGTT TGAAAACAGC GGGTGCAAGC CAAGGCCGAT GGTCTTTCGA 900
(2) SEQ ID NO: 6에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 94 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥: 이중
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자형태: DNA (게놈)
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티센스: 없음
(vi) 원기원:
(A) 생물체: Parapox ovis
(B) 균주: D1701-VEGF 프로모터
(xi) 서열의 기재: SEQ ID NO: 6:
CCGCGCTGCG CGCGCGTAGC CGCGCAAAAT GTAAATTATA ACGCCCAACT TTTAAGGGTG 60
AGGCGCCATG AAGTTTCTCG TCGGCATACT GGTA 94
(2) SEQ ID NO: 7에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 250 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥: 이중
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자형태: DNA (게놈)
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티센스: 없음
(vi) 원기원:
(A) 생물체: Parapox ovis
(B) 균주: HDIR 및 단백질 키나제 유전자 사이의 D1701-인트라제닉 영역
(xi) 서열의 기재: SEQ ID NO: 7:
CAAATGCCGC TTAGTTTCCA GCCTTAAAAG GCAAGTGGGA CCCTGCTCGC TGCCCGGCGA 60
ACTGGTGGAG CGCGTGCTCG CGACCGTGCC ACTGGCCGAC TTGCGCCGCT CGTGCAGCCG 120
CCGCGCGCCC GAGTGACTGC CCATCCCGTT GCTGCGCGAC TCGGGACTGC CCTCTGTTTT 180
TCTTTCCCGT TTCTTCTTAT TAGGTAGTTG TTGCCCACCT CCATGATCCT CGCACGCGCT 240
GGCGGGCGAC 250
(2) SEQ ID NO: 8에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 5515 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥: 이중
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자형태: DNA (게놈)
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티센스: 없음
(vi) 원기원:
(A) 생물체: Parapox ovis
(B) 균주: D1701-HindIII 단편 I (버젼 1)
(xi) 서열의 기재: SEQ ID NO: 8:
AAGCTTGTTG CGCGAGTACG TGGTGACCCG CGCCTACTCG GATCAGACCG AGCCGATCAT 60
GGACTTGCTC ATCGGCATGG GCGCCGACGT GGACATGCAG GTCGGCGTGT GCCGCACGGC 120
GCTGCACGCC TGCCTTACGG GCTTGAACAC GAACCCGTGC ATGATTCGCG CGCTGCTTCG 180
GCGCGGCGCC AGCGTGACCG CAAAAGACAC CTACGAGATG ACGCCACTGG CGTGTTGCTG 240
AAGTCCGCGA GCGCGACGCC GGAGCTCGTG CGCATCCTCG TGGAAGCAGG CTCCGACGTG 300
AGCGCCACCG ACTTCCGCCT CAACGGCATG CTGCACCAGC ACGCAGTCCA CGCGCCCGCG 360
CGCGAGCGTC ATGCGCGAGC TCATCCGGCT GGGGTGCAGC CCAGCGGCCA AAAACATGTT 420
TGGGAACACG CCGATGCACA TGCTGGCCAT GGAAAGCTCC TGCCGCCGCT CGCTGATCCT 480
CCCGCTGCTG GAGGCAGGGC TTTCCGTGAA CGAGGAGAAC CTGCACTACG GCACCGTGCC 540
TCTGCACGTG GCCTCGGGGT ACGACAACAC GCAGGGCTGC CTCAAGCTCC TCCGGCAGGG 600
AGGAGACCCC ACCGTCGTGT CAGCCGCCGG ACGCACACCG ATCTCGAACA TGCTCGTCAA 660
ACGCAACCAC GTGGCGGTCG CCGGCGCGCT GTCGACGCAC CCGAGCGCGG CAGTGGTCGT 720
GCAGGCTCTC GAGCAGGCTC TCGAGAACGT GCTGAACGCC GGGCCCAGCG AGGCCTCGCG 780
GCTCGCCGTG GCCTTTGTGG TGGCGCGCGC CGGCGCATCC GCGCTACCGG AGGCCGTGCG 840
CCGTCTTCAC GAGGGCTTCG TCGCCGACTG CGAGCGCGAA GTCGCGTTGC TTTCCCGCAG 900
CATGCTCGGC ACACCGGCCG TGAGCGCGCT GGTCGTGCTG GTCAGCAAGG AGGTCTTTGG 960
CACTGTTATC TCCTCGCGTG CGCTGCGCGT CGCGCGGGAG GTCCGCGTGT ACGCAAGGCC 1020
GCTCCGCGAG GCGCTCATAA ATCTGCGCCA CAAATGCCGC TTAGTTTCCA GCCTTAAAAG 1080
GCAAGTGGGA CCCTGCTCGC TGCCCGGCGA ACTGGTGGAG CGCGTGCTCG CGACCGTGCC 1140
ACTGGCCGAC TTGCGCCGCT CGTGCAGCCG CCGCGCGCCC GAGTGACTGC CCATCCCGTT 1200
GCTGCGCGAC TCGGGACTGC CCTCTGTTTT TCTTTCCCGT TTCTTCTTAT TAGGTAGTTG 1260
TTGCCCACCT CCATGATCCT CGCACGCGCT GGCGGGCGAC CTCGCACGCC CGCGGCGGCC 1320
GCGGCGGCCG CCGAGGACGG CAAGAACAGT GATCGCCGGA AGCGCAAGCG CAAGACGCCC 1380
AACTGCGAAG ACGCCGACAA CTCCGACGAC GAGCTAGCGC AGACGCCGTG CGACCGCGAG 1440
TGGCCGGACT GTCGCGCGAG CTCGATCACG AGCTCCGACT CGGTCTCTCT CGGCGACGAG 1500
ATCTACTTGC GGTACGTAGC CTCGCAGGTG GACTTCGCGC AGACCTGGGC CCCGCCGGTG 1560
CGGCTGCTGC GCTTCTTCGG GAACTTCTCG AAGGAAACGC TCAGCCGCAT GTCGCGGCGC 1620
GGGTACGTGA ACCGCTCCTA CTTCCAGATG GCGCACGCGC GCTTCTCGCC CACCAACGAC 1680
GACATGTACC ACATGGCCAC TGGCGGGTAC GGCATCGTGT TCCGCTTCGA CCGCTACGTG 1740
GTCAAGTACG TCTTCGAGCA CCGCAACGGC ATGTCCGAGA TGGACGCCTC TACGGAGTAC 1800
ACGGTGCCGC GGTTCCTGCG CAATAACCTC AAGGGCGACG AGCGCGAGTT CGTGGTCTGC 1860
GCGCTGGCCA TGGGGCTGAA CTACCGGCTG GGCTTCCTGC ACTCGCTGTA CCGGCGCGTG 1920
CTGCACACGC TGCTGCTGCT CATGCGCGTG GAGGAAGGCC AGCGGCCCTC GGTAGAGATG 1980
GCCAAGAAGC CGCTGCTGCG CTGGTTCGAG GCGCGCAAGG ACAGCGAGTC CTTCGTGCGC 2040
CTGGTCTCGT ACTTCTACCC CTCGGCCGTG CAGAGCAACG TGAACCTGAT CAACAACTTC 2100
CACCACCTGG TGCACTTCTT TGAGCACGAG AAGCGCGCGC GGTACGTGTT CGACCGCGGG 2160
GCCGTGATCG TGTTCCCTCT GGCGCGCGGG TCCGCGGACT CGATCTCGCC GGAGGCGGCG 2220
GCAGCGCTGG GCTTCGCGCC GCACTCGGAG TTCCTCAAGT TCGTGTTCCT GCAGATCGCG 2280
CTGCTGTACC TGAAGATATA CGAGCTCCCG GGCTGCACGA ACTTCCTGCA CGTGGACCTG 2340
AAGCCCGACA ACGTGCTCAT CTTCGACAGC GCGCGCGCTC AGCGTGACTG CGGCCGGTGC 2400
GACTTTTCGC TTCGAAGAGC CCGTGCGCGC GGCGCTGAAC GACTTCGACT TCGCGCGCGT 2460
GGCCACCATC GAGAACCGCA AGATCGCGGG CAGCGTCCGC GTGCCGCAGA ACTGGTACTA 2520
CGACTTCCAC TTCTTCGCGC ACACGCTGCT GCGCGCGTAC CCGCACATCG CCGCGGAGGA 2580
CCCGGGCTTC CACGCGCTGC TCTCGGAGCT CACGGTCTCG TGCTCGCGCG GGACCTGCGA 2640
CCGCTTCCGG CTGCGCGTGT CCTCGCCGCA CCCCATCGAG CACCTCGCGC GGCTGGTGCG 2700
CCGCGACGTC TTCTCCCGCT GGATAAATGC CGCCGCGGAC GCCCCCGACG CCGCACTCTC 2760
CTGAGCCCAC GCCCGCGGCG CCGGGCTCGC TGTACGACGT CTTCCTCGCG CGCTTCCTGC 2820
GCCAGCTGGC CGCGCGCGCG GCGCCGGCCT CGGCCGCCTG CGCCGTGCGC GTGGGTGCGG 2880
TGCGCGGCCG CCTGCGGAAC TGCGAGCTGG TGGTGCTGAA CCGCTGCCAC GCGGACGCTG 2940
CCGGCGCGCT CGCGCTGGCC TCCGCGGCGC TGGCGGAAAC GCTGGCGGAG CTGCCGCGCG 3000
CGGACAGGCT CGCCGTCGCG CGCGAGCTGG GCGTGGACCC AGAGCACCCG GAGCTGACGC 3060
CGGACCCCGC CTGCGCGGGC GAGAGGCGCG CTTGCGCAGA ACATCGACAT CCAGACGCTG 3120
GACCTGGGCG ACTGCGGCGA CCCCAAAGGC CGCCGACTGC GCGTGGCGCT GGTGAACAGC 3180
GGCCACGCGG CCGCAAACTG CGCGCTCGCG CGCGTAGCGA CCGCGCTGAC GCGCCGCGTG 3240
CCCGCAAGCC GGCACGGCCT CGCGGAGGGC GGCACGCCGC CGTGGACGCT GCTGCTGGCG 3300
GTGGCCGCGG TGACGGTGCT CAGCGTGGTG GCGGTTTCGC TGCTGCGGCG CGCGCTGCGG 3360
GTGCGCTACC AATTCGCGCG GCCGGCCGCG CTGCGCGCGT AGCCGCGCAA AATGTAAATT 3420
ATAACGCCCA ACTTTTAAGG GTGAGGCGCC ATGAAGTTTC TCGTCGGCAT ACTGGTAGCT 3480
GTGTGCTTGC ACCAGTATCT GCTGAACGCG GACAGCACGA AAACATGGTC CGAAGTGTTT 3540
GAAAACAGCG GGTGCAAGCC AAGGCCGATG GTCTTTCGAG TACACGACGA GCACCCGGAG 3600
CTAACTTCTC AGCGGTTCAA CCCGCCGTGT GTCACGTTGA TGCGATGCGG CGGGTGCTGC 3660
AACGACGAGA GCTTAGAATG CGTCCCCACG GAAGAGGCAA ACGTAACGAT GCAACTCATG 3720
GGAGCGTCGG TCTCCGGTGG TAACGGGATG CAACATCTGA GCTTCGTAGA GCATAAGAAA 3780
TGCGATTGTA AACCACCACT CACGACCACG CCACCGACGA CCACAAGGCC GCCCAGAAGA 3840
CGCCGCTAGA ACTTTTTATG GACCGCATAT CCAAACGATG ATGCGATCAG GTCATGCGGA 3900
AGGAGGCTCC ACGGAGCAAA GTGAAAAAGG ACCGCCTAGA GTCGAGACCC CTCCCTCCCG 3960
CCTCGGGCAA ACCCACAGCC GCCGCAAACA CCACACCCGC CGACCTACCA TGCACCCCTC 4020
GCCGCGCCGG CTGCTCGGCG CGCTCGCGCT GCTGGCGCTG GGCTTCGCTC GGCGCGCTCT 4080
TCGCCCCGCG GCGCCGCTCG TGCCGGCCGC CTTCCTGGAG GTGGGGCACG TGCGCGCGAA 4140
CCCGTCCGCC TCGGTGACCT GCCTCACGGT GGGCGGCGAC GGGCGGCACA TGGCGGCGGT 4200
CGCGCACGGC GGCGGGACGC TCTCGCCGGT GTACCCGCTG GCCGCCGGCA TGCACGCGAC 4260
CTTCTCCTCC GCGCGCAAGG GCGCGCTGCT GCTGAACGTC GCGACCGTGA CTGTGTACGA 4320
CGTGCGCGCG CTCGCCCCCG AGTTCGAGCT CGTCTGCATC GCGGTGGTCG GCGGCTACAA 4380
CTCGGCCGCG GCCGCCACGC GGCCCGCGGC CGAGTGGCAC CGCCAGCTGG AGCTGCGCCG 4440
CTCGGAGCTG TGACCCCTCC CTCCCCGGTC TCCCTCTGTC TTTGTAATCG GCCTTAGAGA 4500
TTAGACATCA TCCTCCACGC CTCTTTGTCC GCCGCCCTTC TTCGCGGACG GATGAACCAA 4560
TTAATTAATT ATTTTTGTCG CTCGCCCGCT CACTCCGGCA AGGGAACGAG TGACGTTAAC 4620
TCTCTCACCC TCACGCACAA GAACAAGAAC CGCTCACTCA CCGGGCAAGG GAACACGGTT 4680
AAGGTCAACT CACTCGCGAG AACAAGTTGA CCCTCACTCT AGAGAACGAG GAACGGGCAA 4740
CAAGCAACCG TCAACTCACT TACCACGAGA ACAAGTTGAC CGCCACTCAA AGGGAACAGA 4800
GAACAGTAAC CGTTCTCGCT CGCTCGGAAC AATAGAACAA GTTAACGTCA ACTCGCTCGC 4860
TCGGTGTAAG AGAACAACAG AACAAGCAAC TGTTGACCAC TCAACCCCCG GAGAAGAGAA 4920
CAAGAGAGCA GTCAACTCAC CCACTCAGTC TTGGATGAGA GGAGGACGAG TTAACGAGTA 4980
CTCGCACGCA GAGTGAGAGA GTGAGGACAT AATAATAGTT AACGAGTTAA TACTCACTCG 5040
CTCACTCAGA GTGAGAGAGA ACCAGTGAGC GAGTTAACCG CGCACACGAG CGAGAGAACA 5100
GTGAACTGCT CGCGCGCTCG CTCGGTAGCA GTCGGCCTTT CTTAAAACGG TTCGTAAAAC 5160
TTTTCCCGAG ACAGTTCACC CTCCAAAACT TTTAAAACTA AACTCGGAGG TGGCCTGCCC 5220
TCCACTCTCC GTAAAACTTT TGTAAAACTG TCGGAGGTCG GTCGACTTCG CAACTCGTCC 5280
GCGAAAACTT TTCGTGGGCA GTGTCTGCCT CTCTCAGGCT CCTCGCATCA CTTTCGCGGA 5340
GCCTCGAGGT AGGTCACCTC TCTCCAAACT TTTGTAAAAA CTTTTTCGCG GAGCCTCTGG 5400
AGGCCGTCCT CCCTCCAAAA CTTTTCGTAA AATCTCTTCG GAGGCCGTCC TCCCTCCAAA 5460
ACTTTTCGTA AAATCTTTGG GAGGTCGACC TCCCTCAAAA CTTTTTATAA AGCTT 5515
(2) SEQ ID NO: 9에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 1620 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥: 이중
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자형태: DNA (게놈)
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티센스: 없음
(vi) 원기원:
(A) 생물체: Parapox ovis
(B) 균주: D1701-단백질 키나제 유전자 F10L (버젼 2)
(xi) 서열의 기재: SEQ ID NO: 9:
CGAGTGACTG CCCATCCCGT TGCTGCGCGA CTCGGGACTG CCCTCTGTTT TTCTTTCCCG 60
TTTCTTCTTA TTAGGTAGTT GTTGCCCACC TCCATGATCC TCGCACGCGC TGGCGGGCGA 120
CCTCGCACGC CCGCGGCGGC CGCGGCGGCC GCCGAGGACG GCAAGAACAG TGATCGCCGG 180
AAGCGCAAGC GCAAGACGCC CAACTGCGAA GACGCCGACA ACTCCGACGA CGAGCTAGCG 240
CAGACGCCGT GCGACCGCGA GTGGCCGGAC TGTCGCGCGA GCTCGATCAC GAGCTCCGAC 300
TCGGTCTCTC TCGGCGACGA GATCTACTTG CGGTACGTAG CCTCGCAGGT GGACTTCGCG 360
CAGACCTGGG CCCCGCCGGT GCGGCTGCTG CGCTTCTTCG GGAACTTCTC GAAGGAAACG 420
CTCAGCCGCA TGTCGCGGCG CGGGTACGTG AACCGCTCCT ACTTCCAGAT GGCGCACGCG 480
CGCTTCTCGC CCACCAACGA CGACATGTAC CACATGGCCA CTGGCGGGTA CGGCATCGTG 540
TTCCGCTTCG ACCGCTACGT GGTCAAGTAC GTCTTCGAGC ACCGCAACGG CATGTCCGAG 600
ATGGACGCCT CTACGGAGTA CACGGTGCCG CGGTTCCTGC GCAATAACCT CAAGGGCGAC 660
GAGCGCGAGT TCGTGGTCTG CGCGCTGGCC ATGGGGCTGA ACTACCGGCT GGGCTTCCTG 720
CACTCGCTGT ACCGGCGCGT GCTGCACACG CTGCTGCTGC TCATGCGCGT GGAGGAAGGC 780
CAGCGGCCCT CGGTAGAGAT GGCCAAGAAG CCGCTGCTGC GCTGGTTCGA GGCGCGCAAG 840
GACAGCGAGT CCTTCGTGCG CCTGGTCTCG TACTTCTACC CCTCGGCCGT GCAGAGCAAC 900
GTGAACCTGA TCAACAACTT CCACCACCTG GTGCACTTCT TTGAGCACGA GAAGCGCGCG 960
CGGTACGTGT TCGACCGCGG GGCCGTGATC GTGTTCCCTC TGGCGCGCGG GTCCGCGGAC 1020
TCGATCTCGC CGGAGGCGGC GGCAGCGCTG GGCTTCGCGC GGCACTCGGA GTTCCTCAAG 1080
TTCGTGTTCC TGCAGATCGC GCTGCTGTAC CTGAAGATAT ACGAGCTCCC GGGCTGCACG 1140
AACTTCCTGC ACGTGGACCT GAAGCCCGAC AACGTGCTCA TCTTCGACAG CGCGCGCGCG 1200
CTCAGCGTGA CTGCGGCCGG TGCGACTTTT CGCTTCGAAG AGCCCGTGCG CGCGGCGCTG 1260
AACGACTTCG ACTTCGCGCG CGTGGCCACC ATCGAGAACC GCAAGATCGC GGGCAGCGTC 1320
CGCGTGCCGC AGAACTGGTA CTACGACTTC CACTTCTTCG CGCACACGCT GCTGCGCGCG 1380
TACCCGCACA TCGCCGCGGA GGACCCGGGC TTCCACGCGC TGCTCTCGGA GCTCACGGTC 1440
TCGTGCTCGC GCGGGACCTG CGACCGCTTC CGGCTGCGCG TGTCCTCGCC GCACCCCATC 1500
GAGCACCTCG CGCGGCTGGT GCGCCGCGAC GTCTTCTCCC GCTGGATAAA TGCCGCCGCG 1560
GACGCCCCCG ACGCCGCACT CTCCTGAGCC CACGCCCGCG GCGCCGGGCT CGCTGTACGA 1620
(2) SEQ ID NO: 10에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 780 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥: 이중
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자형태: DNA (게놈)
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티센스: 없음
(vi) 원기원:
(A) 생물체: Parapox ovis
(B) 균주: D1701-9FL 유전자 버전 2
(xi) 서열의 기재: SEQ ID NO: 10:
GAGCACCTCG CGCGGCTGGT GCGCCGCGAC GTCTTCTCCC GCTGGATAAA TGCCGCCGCG 60
GACGCCCCCG ACGCCGCACT CTCCTGAGCC CACGCCCGCG GCGCCGGGCT CGCTGTACGA 120
CGTCTTCCTC GCGCGCTTCC TGCGCCAGCT GGCCGCGCGC GCGGCGCCGG CCTCGGCCGC 180
CTGCGCCGTG CGCGTGGGTG CGGTGCGCGG CCGCCTGCGG AACTGCGAGC TGGTGGTGCT 240
GAACCGCTGC CACGCGGACG CTGCCGGCGC GCTCGCGCTG GCCTCCGCGG CGCTGGCGGA 300
AACGCTGGCG GAGCTGCCGC GCGCGGACAG GCTCGCCGTC GCGCGCGAGC TGGGCGTGGA 360
CCCAGAGCAC CCGGAGCTGA CGCCGGACCC CGCCTGCGCG GGCGAGAGCG CGCTTGCGCA 420
GAACATCGAC ATCCAGACGC TGGACCTGGG CGACTGCGGC GACCCCAAAG GCCGCCGACT 480
GCGCGTGGCG CTGGTGAACA GCGGCCACGC GGCCGCAAAC TGCGCGCTCG CGCGCGTAGC 540
GACCGCGCTG ACGCGCCGCG TGCCCGCAAG CCGGCACGGC CTCGCGGAGG GCGGCACGCC 600
GCCGTGGACG CTGCTGCTGG CGGTGGCCGC GGTGACGGTG CTCAGCGTGG TGGCGGTTTC 660
GCTGCTGCGG CGCGCGCTGC GGGTGCGCTA CCAATTCGCG CGGCCGGCCG CGCTGCGCGC 720
GTAGCCGCGC AAAATGTAAA TTATAACGCC CAACTTTTAA GGGTGAGGCG CCATGAAGTT 780
(2) SEQ ID NO: 11에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 297 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥: 이중
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자형태: DNA (게놈)
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티센스: 없음
(vi) 원기원:
(A) 생물체: Parapox ovis
(B) 균주: D1701-10kD 유전자
(xi) 서열의 기재: SEQ ID NO: 11:
CAATATGGAG GAAAATGACG GAGAAAACCT ATTGGCTCAG CCTGATGATG ATACAGACAA 60
TTTAACCAAC GGAGTGTACG CGGCTGGAGC TCCAACTAAA GAAAGTGTGG AAGAGCGTCT 120
CGTAAGCTTG TTAGACGGTT ACAAAAATAT AACTGATTGC TGCAGAGAAA CAGGTAACCG 180
GTTAGACAGA CTAGAAAGAC ACTTGGAGAG TCTACGTAAA GCTCTTCTTG ATCTCAACAG 240
AAAAATAGAT GTACAGACAG GATACAGCAG ATATTAGATA CCGCTGTGTT GCGTCTG 297
(2) SEQ ID NO: 12에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 5519 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥: 이중
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자형태: DNA (게놈)
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티센스: 없음
(vi) 원기원:
(A) 생물체: Parapox ovis
(B) 균주: D1701, Hind III 단편 I, 버전 2
(xi) 서열의 기재: SEQ ID NO: 12:
AAGCTTGTTG CGCGAGTACG TGGTGACCCG CGCCTACTCG GATCAGACCG AGCCGATCAT 60
GGACTTGCTC ATCGGCATGG GCGCCGACGT GGACATGCAG GTCGGCGTGT GCCGCACGGC 120
GCTGCACGCC TGCCTTACGG GCTTGAACAC GAACCCGTGC ATGATTCGCG CGCTGCTTCG 180
GCGCGGCGCC AGCGTGACCG CAAAAGACAC CTACGAGATG ACGCCACTGG CGGTGTTGCT 240
GAAGTCCGCG AGCGCGACGC CGGAGCTCGT GCGCATCCTC GTGGAAGCAG GCTCCGACGT 300
GAGCGCCACC GACTTCCGCC TCAACGGCAT GCTGCACCAG CACGCGCAGT CCACGCGCCC 360
GCGCGCGAGC GTCATGCGCG AGCTCATCCG GCTGGGGTGC AGCCCAGCGG CCAAAAACAT 420
GTTTGGGAAC ACGCCGATGC ACATGCTGGC CATGGAAAGC TCCTGCCGCC GCTCGCTGAT 480
CCTCCCGCTG CTGGAGGCAG GGCTTTCCGT GAACGAGGAG AACCTGCACT ACGGCACCGT 540
GCCTCTGCAC GTGGCCTCGG GGTACGACAA CACGCAGGGC TGCCTCAAGC TCCTCCGGCA 600
GGGAGGAGAC CCCACCGTCG TGTCAGCCGC CGGACGCACA CCGATCTCGA ACATGCTCGT 660
CAAACGCAAC CACGTGGCGG TCGCCGGCGC GCTGTCGACG CACCCGAGCG CGGCAGTGGT 720
CGTGCAGGCT CTCGAGCAGG CTCTCGAGAA CGTGCTGAAC GCCGGGCCCA GCGAGGCCTC 780
GCGGCTCGCC GTGGCCTTTG TGGTGGCGCG CGCCGGCGCA TCCGCGCTAC CGGAGGCCGT 840
GCGCCGTCTT CACGAGGGCT TCGTCGCCGA CTGCGAGCGC GAAGTCGCGT TGCTTTCCCG 900
CAGCATGCTC GGCACACCGG CCGTGAGCGC GCTGGTCGTG CTGGTCAGCA AGGAGGTCTT 960
TGGCACTGTT ATCTCCTCGC GTGCGCTGCG CGTCGCGCGG GAGGTCCGCG TGTACGCAAG 1020
GCCGCTCCGC GAGGCGCTCA TAAATCTGCG CCACAAATGC CGCTTAGTTT CCAGCCTTAA 1080
AAGGCAAGTG GGACCCTGCT CGCTGCCCGG CGAACTGGTG GAGCGCGTGC TCGCGACCGT 1140
GCCACTGGCC GACTTGCGCC GCTCGTGCAG CCGCCGCGCG CCCGAGTGAC TGCCCATCCC 1200
GTTGCTGCGC GACTCGGGAC TGCCCTCTGT TTTTCTTTCC CGTTTCTTCT TATTAGGTAG 1260
TTGTTGCCCA CCTCCATGAT CCTCGCACGC GCTGGCGGGC GACCTCGCAC GCCCGCGGCG 1320
GCCGCGGCGG CCGCCGAGGA CGGCAAGAAC AGTGATCGCC GGAAGCGCAA GCGCAAGACG 1380
CCCAACTGCG AAGACGCCGA CAACTCCGAC GACGAGCTAG CGCAGACGCC GTGCGACCGC 1440
GAGTGGCCGG ACTGTCGCGC GAGCTCGATC ACGAGCTCCG ACTCGGTCTC TCTCGGCGAC 1500
GAGATCTACT TGCGGTACGT AGCCTCGCAG GTGGACTTCG CGCAGACCTG GGCCCCGCCG 1560
GTGCGGCTGC TGCGCTTCTT CGGGAACTTC TCGAAGGAAA CGCTCAGCCG CATGTCGCGG 1620
CGCGGGTACG TGAACCGCTC CTACTTCCAG ATGGCGCACG CGCGCTTCTC GCCCACCAAC 1680
GACGACATGT ACCACATGGC CACTGGCGGG TACGGCATCG TGTTCCGCTT CGACCGCTAC 1740
GTGGTCAAGT ACGTCTTCGA GCACCGCAAC GGCATGTCCG AGATGGACGC CTCTACGGAG 1800
TACACGGTGC CGCGGTTCCT GCGCAATAAC CTCAAGGGCG ACGAGCGCGA GTTCGTGGTC 1860
TGCGCGCTGG CCATGGGGCT GAACTACCGG CTGGGCTTCC TGCACTCGCT GTACCGGCGC 1920
GTGCTGCACA CGCTGCTGCT GCTCATGCGC GTGGAGGAAG GCCAGCGGCC CTCGGTAGAG 1980
ATGGCCAAGA AGCCGCTGCT GCGCTGGTTC GAGGCGCGCA AGGACAGCGA GTCCTTCGTG 2040
CGCCTGGTCT CGTACTTCTA CCCCTCGGCC GTGCAGAGCA ACGTGAACCT GATCAACAAC 2100
TTCCACCACC TGGTGCACTT CTTTGAGCAC GAGAAGCGCG CGCGGTACGT GTTCGACCGC 2160
GGGGCCGTGA TCGTGTTCCC TCTGGCGCGC GGGTCCGCGG ACTCGATCTC GCCGGAGGCG 2220
GCGGCAGCGC TGGGCTTCGC GCCGCACTCG GAGTTCCTCA AGTTCGTGTT CCTGCAGATC 2280
GCGCTGCTGT ACCTGAAGAT ATACGAGCTC CCGGGCTGCA CGAACTTCCT GCACGTGGAC 2340
CTGAAGCCCG ACAACGTGCT CATCTTCGAC AGCGCGCGCG CGCTCAGCGT GACTGCGGCC 2400
GGTGCGACTT TTCGCTTCGA AGAGCCCGTG CGCGCGGCGC TGAACGACTT CGACTTCGCG 2460
CGCGTGGCCA CCATCGAGAA CCGCAAGATC GCGGGCAGCG TCCGCGTGCC GCAGAACTGG 2520
TACTACGACT TCCACTTCTT CGCGCACACG CTGCTGCGCG CGTACCCGCA CATCGCCGCG 2580
GAGGACCCGG GCTTCCACGC GCTGCTCTCG GAGCTCACGG TCTCGTGCTC GCGCGGGACC 2640
TGCGACCGCT TCCGGCTGCG CGTGTCCTCG CCGCACCCCA TCGAGCACCT CGCGCGGCTG 2700
GTGCGCCGCG ACGTCTTCTC CCGCTGGATA AATGCCGCCG CGGACGCCCC CGACGCCGCA 2760
CTCTCCTGAG CCCACGCCCG CGGCGCCGGG CTCGCTGTAC GACGTCTTCC TCGCGCGCTT 2820
CCTGCGCCAG CTGGCCGCGC GCGCGGCGCC GGCCTCGGCC GCCTGCGCCG TGCGCGTGGG 2880
TGCGGTGCGC GGCCGCCTGC GGAACTGCGA GCTGGTGGTG CTGAACCGCT GCCACGCGGA 2940
CGCTGCCGGC GCGCTCGCGC TGGCCTCCGC GGCGCTGGCG GAAACGCTGG CGGAGCTGCC 3000
GCGCGCGGAC AGGCTCGCCG TCGCGCGCGA GCTGGGCGTG GACCCAGAGC ACCCGGAGCT 3060
GACGCCGGAC CCCGCCTGCG CGGGCGAGAG CGCGCTTGCG CAGAACATCG ACATCCAGAC 3120
GCTGGACCTG GGCGACTGCG GCGACCCCAA AGGCCGCCGA CTGCGCGTGG CGCTGGTGAA 3180
CAGCGGCCAC GCGGCCGCAA ACTGCGCGCT CGCGCGCGTA GCGACCGCGC TGACGCGCCG 3240
CGTGCCCGCA AGCCGGCACG GCCTCGCGGA GGGCGGCACG CCGCCGTGGA CGCTGCTGCT 3300
GGCGGTGGCC GCGGTGACGG TGCTCAGCGT GGTGGCGGTT TCGCTGCTGC GGCGCGCGCT 3360
GCGGGTGCGC TACCAATTCG CGCGGCCGGC CGCGCTGCGC GCGTAGCCGC GCAAAATGTA 3420
AATTATAACG CCCAACTTTT AAGGGTGAGG CGCCATGAAG TTTCTCGTCG GCATACTGGT 3480
AGCTGTGTGC TTGCACCAGT ATCTGCTGAA CGCGGACAGC ACGAAAACAT GGTCCGAAGT 3540
GTTTGAAAAC AGCGGGTGCA AGCCAAGGCC GATGGTCTTT CGAGTACACG ACGAGCACCC 3600
GGAGCTAACT TCTCAGCGGT TCAACCCGCC GTGTGTCACG TTGATGCGAT GCGGCGGGTG 3660
CTGCAACGAC GAGAGCTTAG AATGCGTCCC CACGGAAGAG GCAAACGTAA CGATGCAACT 3720
CATGGGAGCG TCGGTCTCCG GTGGTAACGG GATGCAACAT CTGAGCTTCG TAGAGCATAA 3780
GAAATGCGAT TGTAAACCAC CACTCACGAC CACGCCACCG ACGACCACAA GGCCGCCCAG 3840
AAGACGCCGC TAGAACTTTT TATGGACCGC ATATCCAAAC GATGATGCGA TCAGGTCATG 3900
CGGAAGGAGG CTCCACGGAG CAAAGTGAAA AAGGACCGCC TAGAGTCGAG ACCCCTCCCT 3960
CCCGCCTCGG GCAAACCCAC AGCCGCCGCA AACACCACAC CCGCCGACCT ACCATGCACC 4020
CCTCGCCGCG CCGGCTGCTC GGCGCGCTCG CGCTGCTGGC GCTGGGCTTC GCTCGGCGCG 4080
CTCTTCGCCC CGCGGCGCCG CTCGTGCCGG CCGCCTTCCT GGAGGTGGGG CACGTGCGCG 4140
CGAACCCGTC CGCCTCGGTG ACCTGCCTCA CGGTGGGCGG CGACGGGCGG CACATGGCGG 4200
CGGTCGCGCA CGGCGGCGGG ACGCTCTCGC CGGTGTACCC GCTGGCCGCC GGCATGCACG 4260
CGACCTTCTC CTCCGCGCGC AAGGGCGCGC TGCTGCTGAA CGTCGCGACC GTGACTGTGT 4320
ACGACGTGCG CGCGCTCGCC CCCGAGTTCG AGCTCGTCTG CATCGCGGTG GTCGGCGGCT 4380
ACAACTCGGC CGCGGCCGCC ACGCGGCCCG CGGCCGAGTG GCACCGCCAG CTGGAGCTGC 4440
GCCGCTCGGA GCTGTGACCC CTCCCTCCCC GGTCTCCCTC TGTCTTTGTA ATCGGCCTTA 4500
GAGATTAGAC ATCATCCTCC ACGCCTCTTT GTCCGCCGCC CTTCTTCGCG GACGGATGAA 4560
CCAATTAATT AATTATTTTT GTCGCTCGCC CGCTCACTCC GGCAAGGGAA CGAGTGACGT 4620
TAACTCTCTC ACCCTCACGC ACAAGAACAA GAACCGCTCA CTCACCGGGC AAGGGAACAC 4680
GGTTAAGGTC AACTCACTCG CGAGAACAAG TTGACCCTCA CTCTAGAGAA CGAGGAACGG 4740
GCAACAAGCA ACCGTCAACT CACTTACCAC GAGAACAAGT TGACCGCCAC TCAAAGGGAA 4800
CAGAGAACAG TAACCGTTCT CGCTCGCTCG GAACAATAGA ACAAGTTAAC GTCAACTCGC 4860
TCGCTCGGTG TAAGAGAACA ACAGAACAAG CAACTGTTGA CCACTCAACC CCCGGAGAAG 4920
AGAACAAGAG AGCAGTCAAC TCACCCACTC AGTCTTGGAT GAGAGGAGGA CGAGTTAACG 4980
AGTACTCGCA CGCAGAGTGA GAGAGTGAGG ACATAATAAT AGTTAACGAG TTAATACTCA 5040
CTCGCTCACT CAGAGTGAGA GAGAACCAGT GAGCGAGTTA ACCGCGCACA CGAGCGAGAG 5100
AACAGTGAAC TGCTCGCGCG CTCGCTCGGT AGCAGTCGGC CTTTCTTAAA ACGGTTCGTA 5160
AAACTTTTCC CGAGACAGTT CACCCTCCAA AACTTTTAAA ACTAAACTCG GAGGTGGCCT 5220
GCCCTCCACT CTCCGTAAAA CTTTTGTAAA ACTGTCGGAG GTCGGTCGAC TTCGCAACTC 5280
GTCCGCGAAA ACTTTTCGTG GGCAGTGTCT GCCTCTCTCA GGCTCCTCGC ATCACTTTCG 5340
CGGAGCCTCG AGGTAGGTCA CCTCTCTCCA AACTTTTGTA AAAACTTTTT CGCGGAGCCT 5400
CTGGAGGCCG TCCTCCCTCC AAAACTTTTC GTAAAATCTC TTCGGAGGCC GTCCTCCCTC 5460
CAAAACTTTT CGTAAAATCT TTGGGAGGTC GACCTCCCTC AAAACTTTTT ATAAAGCTT 5519
(2) SEQ ID NO: 13에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 1742 염기쌍
(B) 형태: 핵산
(C) 가닥: 이중
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자형태: DNA (게놈)
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티센스: 없음
(vi) 원기원:
(A) 생물체: Parapox ovis
(B) 균주: D1701-단백질 키나제 유전자 F10L (버젼 3)
(xi) 서열의 기재: SEQ ID NO: 13:
CGAGTGACTG CCCATCCCGT TGCTGCGCGA CTCGGGACTG CCCTCTGTTT TTCTTTCCCG 60
TTTCTTCTTA TTAGGTAGTT GTTGCCCACC TCCATGATCC TCGCACGCGC TGGCGGGCGA 120
CCTCGCACGC CCGCGGCGGC CGCGGCGGCC GCCGAGGACG GCAAGAACAG TGATCGCCGG 180
AAGCGCAAGC GCAAGACGCC CAACTGCGAA GACGCCGACA ACTCCGACGA CGAGCTAGCG 240
CAGACGCCGT GCGACCGCGA GTGGCCGGAC TGTCGCGCGA GCTCGATCAC GAGCTCCGAC 300
TCGGTCTCTC TCGGCGACGA GATCTACTTG CGGTACGTAG CCTCGCAGGT GGACTTCGCG 360
CAGACCTGGG CCCCGCCGGT GCGGCTGCTG CGCTTCTTCG GGAACTTCTC GAAGGAAACG 420
CTCAGCCGCA TGTCGCGGCG CGGGTACGTG AACCGCTCCT ACTTCCAGAT GGCGCACGCG 480
CGCTTCTCGC CCACCAACGA CGACATGTAC CACATGGCCA CTGGCGGGTA CGGCATCGTG 540
TTCCGCTTCG ACCGCTACGT GGTCAAGTAC GTCTTCGAGC ACCGCAACGG CATGTCCGAG 600
ATGGACGCCT CTACGGAGTA CACGGTGCCG CGGTTCCTGC GCAATAACCT CAAGGGCGAC 660
GAGCGCGAGT TCGTGGTCTG CGCGCTGGCC ATGGGGCTGA ACTACCGGCT GGGCTTCCTG 720
CACTCGCTGT ACCGGCGCGT GCTGCACACG CTGCTGCTGC TCATGCGCGT GGAGGAAGGC 780
CAGCGGCCCT CGGTAGAGAT GGCCAAGAAG CCGCTGCTGC GCTGGTTCGA GGCGCGCAAG 840
GACAGCGAGT CCTTCGTGCG CCTGGTCTCG TACTTCTACC CCTCGGCCGT GCAGAGCAAC 900
GTGAACCTGA TCAACAACTT CCACCACCTG GTGCACTTCT TTGAGCACGA GAAGCGCGCG 960
CGGTACGTGT TCGACCGCGG GGCCGTGATC GTGTTCCCTC TGGCGCGCGG GTCCGCGGAC 1020
TCGATCTCGC CGGAGGCGGC GGCAGCGCTG GGCTTCGCGC CGCACTCGGA GTTCCTCAAG 1080
TTCGTGTTCC TGCAGATCGC GCTGCTGTAC CTGAAGATAT ACGAGCTCCC GGGCTGCACG 1140
AACTTCCTGC ACGTGGACCT GAAGCCCGAC AACGTGCTCA TCTTCGACAG CGCGCGCGCG 1200
CTCAGCGTGA CTGCGGCCGG TGCGACTTTT CGCTTCGAAG AGCCCGTGCG CGCGGCGCTG 1260
AACGACTTCG ACTTCGCGCG CGTGGCCACC ATCGAGAACC GCAAGATCGC GGGCAGCGTC 1320
CGCGTGCCGC AGAACTGGTA CTACGACTTC CACTTCTTCG CGCACACGCT GCTGCGCGCG 1380
TACCCGCACA TCGCCGCGGA GGACCCGGGC TTCCACGCGC TGCTCTCGGA GCTCACGGTC 1440
TCGTGCTCGC GCGGGACCTG CGACCGCTTC CGGCTGCGCG TGTCCTCGCC GCACCCCATC 1500
GAGCACCTCG CGCGGCTGGT GCGCCGCGAC GTCTTCTCCC GCTGGATAAA TGCCGCCGCG 1560
GACGCCCCCG ACGCCGCACT CTCCTGAGCC CACGCCCGCG GCGCCGGGCT CGCTGTACGA 1620
CGTCTTCCTC GCGCGCTTCC TGCGCCAGCT GGCCGCGCGC GCGGCGCCGG CCTCGGCCGC 1680
CTGCGCCGTG CGCGTGGGTG CGGTGCGCGG CCGCCTGCGG AACTGCGAGC TGGTGGTGCT 1740
GA 1742
(2) SEQ ID NO: 14에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 497 아미노산
(B) 형태: 아미노산
(C) 가닥: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자형태: 단백질
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티센스: 없음
(vi) 원기원:
(A) 생물체: Parapox ovis
(B) 균주: D1701-단백질 키나제 F10L
(xi) 서열의 기재: SEQ ID NO: 14:
Met Ile Leu Ala Arg Ala Gly Gly Arg Pro Arg Thr Pro Ala Ala Ala
1 5 10 15
Ala Ala Ala Ala Glu Asp Gly Lys Asn Ser Asp Arg Arg Lys Arg Lys
20 25 30
Arg Lys Thr Pro Asn Cys Glu Asp Ala Asp Asn Ser Asp Asp Glu Leu
35 40 45
Ala Gln Thr Pro Cys Asp Arg Glu Trp Pro Asp Cys Arg Ala Ser Ser
50 55 60
Ile Thr Ser Ser Asp Ser Val Ser Leu Gly Asp Glu Ile Tyr Leu Arg
65 70 75 80
Tyr Val Ala Ser Gln Val Asp Phe Ala Gln Thr Trp Ala Pro Pro Val
85 90 95
Arg Leu Leu Arg Phe Phe Gly Asn Phe Ser Lys Glu Thr Leu Ser Arg
100 105 110
Met Ser Arg Arg Gly Tyr Val Asn Arg Ser Tyr Phe Gln Met Ala His
115 120 125
Ala Arg Phe Ser Pro Thr Asn Asp Asp Met Tyr His Met Ala Thr Gly
130 135 140
Gly Tyr Gly Ile Val Phe Arg Phe Asp Arg Tyr Val Val Lys Tyr Val
145 150 155 160
Phe Glu His Arg Asn Gly Met Ser Glu Met Asp Ala Ser Thr Glu Tyr
165 170 175
Thr Val Pro Arg Phe Leu Arg Asn Asn Leu Lys Gly Asp Glu Arg Glu
180 185 190
Phe Val Val Cys Ala Leu Ala Met Gly Leu Asn Tyr Arg Leu Gly Phe
195 200 205
Leu His Ser Leu Tyr Arg Arg Val Leu His Thr Leu Leu Leu Leu Met
210 215 220
Arg Val Glu Glu Gly Gln Arg Pro Ser Val Glu Met Ala Lys Lys Pro
225 230 235 240
Leu Leu Arg Trp Phe Glu Ala Arg Lys Asp Ser Glu Ser Phe Val Arg
245 250 255
Leu Val Ser Tyr Phe Tyr Pro Ser Ala Val Gln Ser Asn Val Asn Leu
260 265 270
Ile Asn Asn Phe His His Leu Val His Phe Phe Glu His Glu Lys Arg
275 280 285
Ala Arg Tyr Val Phe Asp Arg Gly Ala Val Ile Val Phe Pro Leu Ala
290 295 300
Arg Gly Ser Ala Asp Ser Ile Ser Pro Glu Ala Ala Ala Ala Leu Gly
305 310 315 320
Phe Ala Pro His Ser Glu Phe Leu Lys Phe Val Phe Leu Gln Ile Ala
325 330 335
Leu Leu Tyr Leu Lys Ile Tyr Glu Leu Pro Gly Cys Thr Asn Phe Leu
340 345 350
His Val Asp Leu Lys Pro Asp Asn Val Leu Ile Phe Asp Ser Ala Arg
355 360 365
Ala Leu Ser Val Thr Ala Ala Gly Ala Thr Phe Arg Phe Glu Glu Pro
370 375 380
Val Arg Ala Ala Leu Asn Asp Phe Asp Phe Ala Arg Val Ala Thr Ile
385 390 395 400
Glu Asn Arg Lys Ile Ala Gly Ser Val Arg Val Pro Gln Asn Trp Tyr
405 410 415
Tyr Asp Phe His Phe Phe Ala His Thr Leu Leu Arg Ala Tyr Pro His
420 425 430
Ile Ala Ala Glu Asp Pro Gly Phe His Ala Leu Leu Ser Glu Leu Thr
435 440 445
Val Ser Cys Ser Arg Gly Thr Cys Asp Arg Phe Arg Leu Arg Val Ser
450 455 460
Ser Pro His Pro Ile Glu His Leu Ala Arg Leu Val Arg Arg Asp Val
465 470 475 480
Phe Ser Arg Trp Ile Asn Ala Ala Ala Asp Ala Pro Asp Ala Ala Leu
485 490 495
Ser
(2) SEQ ID NO: 15에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 132 아미노산
(B) 형태: 아미노산
(C) 가닥: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자형태: 단백질
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티센스: 없음
(vi) 원기원:
(A) 생물체: Parapox ovis
(B) 균주: D1701-VEGF 단백질
(xi) 서열의 기재: SEQ ID NO: 15:
Met Lys Phe Leu Val Gly Ile Leu Val Ala Val Cys Leu His Gln Tyr
1 5 10 15
Leu Leu Asn Ala Asp Ser Thr Lys Thr Trp Ser Glu Val Phe Glu Asn
20 25 30
Ser Gly Cys Lys Pro Arg Pro Met Val Phe Arg Val His Asp Glu His
35 40 45
Pro Glu Leu Thr Ser Gln Arg Phe Asn Pro Pro Cys Val Thr Leu Met
50 55 60
Arg Cys Gly Gly Cys Cys Asn Asp Glu Ser Leu Glu Cys Val Pro Thr
65 70 75 80
Glu Glu Ala Asn Val Thr Met Gln Leu Met Gly Ala Ser Val Ser Gly
85 90 95
Gly Asn Gly Met Gln His Leu Ser Phe Val Glu His Lys Lys Cys Asp
100 105 110
Cys Lys Pro Pro Leu Thr Thr Thr Pro Pro Thr Thr Thr Arg Pro Pro
115 120 125
Arg Arg Arg Arg
130
(2) SEQ ID NO: 16에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 224 아미노산
(B) 형태: 아미노산
(C) 가닥: 단일
(D) 토폴로지: 선형
(ii) 분자형태: 단백질
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티센스: 없음
(vi) 원기원:
(A) 생물체: Parapox ovis
(B) 균주: D1701-단백질 F9L
(xi) 서열의 기재: SEQ ID NO: 16:
Met Pro Pro Arg Thr Pro Pro Thr Pro His Ser Pro Glu Pro Thr Pro
1 5 10 15
Ala Ala Pro Gly Ser Leu Tyr Asp Val Phe Leu Ala Arg Phe Leu Arg
20 25 30
Gln Leu Ala Ala Arg Ala Ala Pro Ala Ser Ala Ala Cys Ala Val Arg
35 40 45
Val Gly Ala Val Arg Gly Arg Leu Arg Asn Cys Glu Leu Val Val Leu
50 55 60
Asn Arg Cys His Ala Asp Ala Ala Gly Ala Leu Ala Leu Ala Ser Ala
65 70 75 80
Ala Leu Ala Glu Thr Leu Ala Glu Leu Pro Arg Ala Asp Arg Leu Ala
85 90 95
Val Ala Arg Glu Leu Gly Val Asp Pro Glu His Pro Glu Leu Thr Pro
100 105 110
Asp Pro Ala Cys Ala Gly Glu Ser Ala Leu Ala Gln Asn Ile Asp Ile
115 120 125
Gln Thr Leu Asp Leu Gly Asp Cys Gly Asp Pro Lys Gly Arg Arg Leu
130 135 140
Arg Val Ala Leu Val Asn Ser Gly His Ala Ala Ala Asn Cys Ala Leu
145 150 155 160
Ala Arg Val Ala Thr Ala Leu Thr Arg Arg Val Pro Ala Ser Arg His
165 170 175
Gly Leu Ala Glu Gly Gly Thr Pro Pro Trp Thr Leu Leu Leu Ala Val
180 185 190
Ala Ala Val Thr Val Leu Ser Val Val Ala Val Ser Leu Leu Arg Arg
195 200 205
Ala Leu Arg Val Arg Tyr Gln Phe Ala Arg Pro Ala Ala Leu Arg Ala
210 215 220
<도면의 목록>
도 1은 플라스미드 pORF-1/-2의 D1701 Hind III 단편 I의 물리 지도를 나타낸다. 엷은 화살표는 동정된 mRNA이고, 두꺼운 화살표는 ORF를 나타낸다.
도 2는 D1701 게놈 상의 Hind III 인식 부위 및 Hind III 단편 I 상에서 확인된 유전자 및 도립 말단 반복 영역의 일부의 물리 지도를 나타낸다.
도 3은 플라스미드 pCE4를 나타낸다. NruI으로 절단 후, 396 bp 단편을 LacZ 카세트로 대체하였다.
도 4는 XcmI로 절단 후 선형화시킨 후 LacZ 카세트가 삽입된 플라스미드 pCE9를 나타낸다.
도 5는 명세서에 기재된 바와 같이 PCR을 사용하여 새로운 유일한 절단 부위를 발생시키는 전략을 개략적으로 나타낸다.
도 6은 뉴클레아제 Bsa31을 사용하여 양방향 절두시키고 이어서 EcoRV 링커 및 LacZ 카세트의 후속적인 삽입을 나타낸다.
도 7은 LacZ/gpt 선별 카세트의 제조 전략을 나타낸다.
P11K: 백시니아 11k 프로모터
PVEGF: PPV VEGF 프로모터
Sm: SmaI
B: BamH1
도 8은 (명세서에 기재된 바와 같이) 10 kDa 유전자를 포함하는 PPV D1701 EcoRI 단편 E를 클로닝하는 전략을 개략적으로 나타낸다.
본 발명은 재조합 파라폭스바이러스, 이들의 제조 방법 및 백신 및 이들을 포함하는 면역조절약에 관한 것이다.
Claims (50)
- 삽입 및(또는) 결실부를 가진, 재조합 기술에 의해 제조된 PPV.
- 바이러스 증식에 필요하지 않은 게놈 세그먼트에서 삽입 및(또는) 결실부를 가진, 재조합 기술에 의해 제조된 PPV.
- 바이러스 증식에 필요한 게놈 세그먼트에서 삽입 및(또는) 결실부를 가진, 재조합 기술에 의해 제조된 PPV.
- 발현되지 않는 D1701 Hind III 단편 I의 영역에서 삽입 및(또는) 결실부를 가진, 재조합 기술에 의해 제조된 PPV.
- 발현되는 D1701 Hind III 단편 I의 영역에서 삽입 및(또는) 결실부를 가진, 재조합 기술에 의해 제조된 PPV.
- 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 삽입 및(또는) 결실부가 D1701 Hind III 단편 I에 또는 이 단편에 대응하는 다른 PPV로부터의 DNA에 위치한 재조합 기술에 의해 제조된 PPV.
- VEGF 유전자 또는 이 영역에 인접한 영역에서 삽입 및(또는) 결실부를 가진, 재조합 기술에 의해 제조된 PPV.
- PK 유전자 또는 이 영역에 인접한 영역에서 삽입 및(또는) 결실부를 가진, 재조합 기술에 의해 제조된 PPV.
- ITR 세그먼트 또는 이 영역에 인접한 영역에서 삽입 및(또는) 결실부를 가진, 재조합 기술에 의해 제조된 PPV.
- HDIR 유전자 또는 이 영역에 인접한 영역에서 삽입 및(또는) 결실부를 가진, 재조합 기술에 의해 제조된 PPV.
- F9L 유전자 또는 이 영역에 인접한 영역에서 삽입 및(또는) 결실부를 가진, 재조합 기술에 의해 제조된 PPV.
- 10kDa 단백질을 코드하는 유전자의 영역 또는 그 근처에서 삽입 및(또는) 결실부를 가진, 재조합 기술에 의해 제조된 PPV.
- 10 kDa 단백질을 코드하는 유전자가 위치한 D1701로 부터의 EcoRI 단편 E의 영역에서 삽입 및(또는) 결실부를 가진, 재조합 기술에 의해 제조된 PPV.
- D1701 Hind III 단편 I 또는 이 단편에 대응하는 다른 PPV로부터의 DNA를 포함하는 플라스미드.
- D1701 Hind III 단편 I을 포함하고, 바이러스 증식에 필요한 이 단편의 영역에서 결실 및(또는) 삽입부를 함유하는 플라스미드.
- D1701 Hind III 단편 I을 포함하고, 바이러스 증식에 필요하지 않는 이 단편의 영역에서 결실 및(또는) 삽입부를 함유하는 플라스미드.
- D1701 Hind III 단편 I을 포함하고, 바이러스 증식에 필요하지 않고 발현되지 않는 영역에 위치한 이 단편의 영역에서 결실 및(또는) 삽입부를 함유하는 플라스미드.
- D1701 Hind III 단편 I을 포함하고, 이 단편에서 바이러스 증식에 필요하지 않고 발현되는 영역에 위치한 이 단편의 영역에서 결실 및(또는) 삽입부를 함유하는 플라스미드.
- D1701 Hind III 단편 I을 포함하고, 이 단편의 VEGF 유전자 또는 이것에 인접한 곳에서 결실 및(또는) 삽입부를 함유하는 플라스미드.
- D1701 Hind III 단편 I을 포함하고 이 단편의 PK 유전자 또는 이것에 인접한 곳에서 결실 및(또는) 삽입부를 함유하는 플라스미드.
- D1701 Hind III 단편 I을 포함하고 이 단편의 ITR 세그먼트 또는 이것에 인접한 곳에서 결실 및(또는) 삽입부를 함유하는 플라스미드.
- D1701 Hind III 단편 I을 포함하고 HDIR 유전자 및(또는) F9L 유전자 또는 이것에 인접한 곳에서 결실 및(또는) 삽입부를 함유하는 플라스미드.
- D1701 EcoRI 단편 E를 포함하고 10kDa 단백질을 코드하는 유전자 또는 이것에 인접한 곳에서 결실 및(또는) 삽입부를 함유하는 플라스미드.
- 제14항 내지 제23항 중 어느 한 항에 따른 결실 및(또는) 삽입부가 존재하는 D1701 Hind III 단편 I의 일부를 포함하는 플라스미드.
- 제14항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, D1701 DNA 단편이 이 단편에 대응하는 다른 PPV로부터의 DNA로 대체된 플라스미드.
- 제14항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서, Hind III 단편 I의 전체 또는 단지 그의 일부가 존재하는 플라스미드.
- 서열 확인 번호 8에 따른 서열을 갖는, D1701 게놈 단편 Hind III 단편 I, 또는 이 단편의 일부, 또는 이 단편에 대응하는 다른 PPV로부터의 단편.
- 서열 확인 번호 1의 서열 목록에 따른 VEGF 단백질을 코드하는, D1701 Hind III 단편 I의 DNA 세그먼트, 또는 이 세그먼트에 대응하는 다른 PPV로부터의 세그먼트 또는 그의 일부.
- 서열 확인 번호 2의 서열에 따른 PK 단백질을 코드하는, D1701 Hind III 단편 I의 DNA 세그먼트 또는 그의 일부, 또는 이 세그먼트에 대응하는 다른 PPV로부터의 세그먼트 또는 그의 일부.
- 서열 확인 번호 3의 서열에 따른 서열을 갖는 PPV 유전자 HDIR에 대한 DNA 세그먼트 또는 그의 일부.
- 서열 확인 번호 5의 서열에 따른 서열을 갖는 PPV F9L에 대한 DNA 세그먼트 또는 그의 일부.
- 서열 확인 번호 4의 서열에 따른 서열을 갖는 PPL ITR 영역에 대한 DNA 세그먼트 또는 그의 일부.
- 제27항 내지 제32항 중 어느 한 항에 따른 DNA 세그먼트의 서열을 기초로 제조된 유전자 산물.
- 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 삽입체로서 다른 병원체로부터의 면역 성분을 코드하는 외래 DNA를 포함하는 재조합에 의해 제조된 PPV.
- 제1항 내지 제13항 및 제34항 중 어느 한 항에 있어서, 삽입체로서 사이토킨을 코드하는 외래 DNA를 포함하는 재조합에 의해 제조된 PPV.
- 제14항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 플라스미드를 그 자체로 공지된 방식으로 세포 중에서 PPV로 재조합시키고 목적하는 바이러스에 대해 선별하는 것을 특징으로 하는 제1항 내지 제13항, 제34항 및 제35항에 따른 바이러스의 제조 방법.
- 1. 적합한 파라폭스바이러스 균주를 선별하고,2. 그의 게놈을 정제하고,3. 정제된 게놈을 제한 효소들로 처리하고,4. 얻어진 단편들을 플라스미드 내에 삽입하고,5. 10 kDa 단백질을 코드하는 유전자를 포함하는 플라스미드에 대하여 선별을 수행하고,6. 필요에 따라서, 삽입 및(또는) 결실부를 10 kDa 단백질을 코드하는 유전자 내에 도입시키고,7. 상기 4에 기재된 단편을, 필요에 따라, 폴리머라제 사슬 반응 (PCR) 또는 올리고뉴클레이티드 합성 등의 별법을 사용하여 제조하는 것을 특징으로하는제23항에 따른 플라스미드의 제조 방법.
- 1. 적합한 파라폭스바이러스 균주를 선별하고,2. 그의 게놈을 정제하고,3. 정제된 게놈을 제한 효소들로 처리하고,4. 얻어진 단편들을 플라스미드 내에 삽입하고,5. Hind III 단편 I 또는 이 단편에 대응하는 단편들 또는 성분들을 포함하는 플라스미드에 대하여 선별을 수행하고,6. 필요에 따라서, 삽입 및(또는) 결실부를 얻어진 플라스미드의 이들 단편 내에 도입시키고,7. 상기 4에 기재된 단편을, 필요에 따라, 폴리머라제 사슬 반응 (PCR) 또는 올리고뉴클레이티드 합성 등의 별법을 사용하여 제조하는 것을 특징으로하는제14항 내지 제22항, 및 제24항 내지 제26항에 따른 플라스미드의 제조 방법.
- 1. 적합한 파라폭스바이러스 균주를 선별하고,2. 그의 게놈을 정제하고,3. 정제된 게놈을 제한 효소들로 처리하고,4. 목적하는 단편들 또는 세그먼트들을 선별고,5. 필요에 따라서, 얻어진 게놈의 단편들을 먼저 플라스미드의 내에 삽입하고 목적하는 단편들을 함유하는 플라스미드를 단리하고, 그후 플라스미드를 증식시키고 목적하는 단편들을 이들로부터 단리하고,6. 상기 4에 기재된 단편들을, 필요에 따라, 폴리머라제 사슬 반응 (PCR) 또는 올리고뉴클레이티드 합성 등의 별법을 사용하여 제조하는 것을 특징으로하는10 kDa 단백질을 코드하는 D1701 Hind III 단편 I 또는 EcoRI 단편 E, 또는 이 단편 또는 세그먼트에 대응하는 다른 PPV의 영역 또는 그 일부를 제조하는 방법.
- 제39항에 따라 얻을 수 있는 단편을 적합한 발현계 내로 전이시키고 유전자를 이들 계를 사용하여 발현시키는 것을 특징으로 하는 제33항에 따른 유전자 제품의 제조 방법.
- 제1항 내지 제13항에 따른 재조합에 의해 제조된 PPV의 백신으로서 용도.
- 제1항 내지 제13항에 따른 재조합에 의해 제조된 PPV의 면화시키고 비병원체-특이성 면역 방어를 자극하는 제품에서의 용도.
- 재조합에 의해 제조된 PPV의 비병원체-특이성 면역 방어를 자극하는 면역조절제로서의 용도.
- 재조합에 의해 제조된 PPV의 외래 DNA를 이종 발현시키기 위한 용도.
- 재조합에 의해 제조된 PPV의 외래의 DNA에 대한 백터로서의 용도.
- 파라폭스-특이성 게놈 세그먼트를 발현시키기 위한 제14항 내지 제26항에 따른 플라스미드의 용도.
- 진단제를 제조하기 위한 제14항 내지 제26항에 따른 플라스미드의 용도.
- 진단제를 제조하기 위한 제27항 내지 제32항에 따른 게놈 단편의 용도.
- 서열 확인 번호: 6에 따른 DNA 서열 (VEGF 유전자의 프로모터).
- DNA를 발현시키기 위한 프로모터로서 제49항에 따른 DNA 세그먼트의 용도.
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