JP2000507092A

JP2000507092A - 外来ｄｎａを含むパラポックスウイルス、それらの製造及びワクチンにおけるそれらの使用

Info

Publication number: JP2000507092A
Application number: JP9530549A
Authority: JP
Inventors: シユメーア，ノルベルト; シユトルベ，バルター; ビユツトナー，マテイアス; ルツイハ，ハンス―ヨアヒム
Original assignee: バイエル・アクチエンゲゼルシヤフト
Priority date: 1996-02-28
Filing date: 1997-02-17
Publication date: 2000-06-13
Also published as: DE59712852D1; PL328870A1; ES2287949T3; PL190401B1; US6365393B1; AU1725797A; NO983946D0; EP0886679A1; NO983946L; ATE364090T1; NZ331556A; CA2247336C; HUP9901035A3; HUP9901035A2; CA2247336A1; BR9707785A; CN1217027A; AU718141B2; IL125797A0; TR199801702T2

Abstract

(57)【要約】本発明は、外来遺伝情報の形態で欠失または挿入をゲノム中に有し、且つ他の遺伝情報を含む組み換えにより製造されたパラポックスウイルスに関する。また、本発明はそのような構築物の製造及びワクチンにおけるそれらの使用にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】外来ＤＮＡを含むパラポックスウイルス、それらの製造及びワクチンにおけるそれらの使用本発明は、組み換えパラポックスウイルス（Ｐａｒａｐｏｘｖｉｒｕｓｅｓ）、それらの製造並びにそれらを含むワクチン及び免疫調節剤に関する。新規な、組み換えにより改変されたパラポックスウイルスは、それらのゲノム中に欠失及び／または挿入を保有する。パラポックスウイルスのゲノムのセグメントの欠失及び／または外来ＤＮＡの挿入は、それらの病原性の減少または喪失をもたらすことができる（弱毒化）。病原体または生物学的に活性のある物体からの遺伝情報が、挿入によりパラポックスウイルスのゲノム中に組み込まれる。この外来遺伝情報は、組み換えパラポックスウイルスの構成成分として、例えば細胞培養、組織または完全な生物中で発現される。本発明に従って調製される組み換えパラポックスウイルスは、例えばワクチンまたは免疫調節剤に用いられる。パラポックスウイルスのゲノム中の外来ＤＮＡの発現は、例えば予防接種を受けた個体において、外来遺伝情報により提示される病原体に対する防御反応を引き出す。また、予防接種を受けた個体の非特異的な抵抗性も刺激することができる（以下、パラポックスウイルスという用語をＰＰＶと略す）。ＰＰＶは生物において病原体非特異的な免疫反応を刺激するので、それら自体が免疫調節作用を有する可能性がある。従って、パラポックスウイルスの調製物は、例えば、一般的な抵抗性を増すために獣医学においてうまく用いられている。病原体特異的な作用を有するワクチンは防御を確立するために抗原により数日ないし数週を必要とするが、その場合これらは何カ月ないし何年もの間持続する長期間の防御を与える。その結果、組み換えパラポックスウイルスに基づいて調製されるワクチンは、生物中で長く持続する病原体特異的な免疫を確立し、且つ非常に迅速に起こる病原体非特異的な防御も誘導するので、これらを感染性疾病の改善された制御のための生物学的生成物として用いることができる。ＰＰＶの免疫刺激特性並びに同種起源及び／または異種起源の病原体に特異的な防御を誘導する外来抗原の発現の組み合わせは新規である。これにより、感染に対して迅速に始まる広い病原体非特異的な防御をもたらし、且つ感染に対して長く持続する病原体特異的な防御も与える生成物の製造が可能となる。脊椎動物ポックスウイルスのファミリー（コルドポックスウイルス亜科（Ｃｈｏｒｄｏｐｏｘｖｉｒｉｎａｅ））は、個々の独立した属に分けられる。本発明はＰＰＶの属に関し、これらは他のポックスウイルスと構造及び遺伝子の両方で異なる。ＰＰＶは３つの異なる種、 ‐パラポックスウイルスオビス（Ｐａｒａｐｏｘｖｉｒｕｓｏｖｉｓ）（感染性膿瘡ウイルス（ｅｃｔｈｙｍａｃｏｎｔａｇｉｏｓｕｍｖｉｒｕｓ）、感染性膿疱性皮膚炎ウイルス（ｃｏｎｔａｇｉｏｕｓｐｕｓｔｕｌａｒｄｅｒｍａｔｉｔｉｓｖｉｒｕｓ）またはｏｒｆウイルス（ｏｒｆｖｉｒｕｓ）とも呼ばれる）、これはこの属の原始型とみなされる、 ‐パラポックスウイルスボビス１（Ｐａｒａｐｏｘｖｉｒｕｓｂｏｖｉｓ１）（ウシ丘疹性口内炎ウイルス（ｂｏｖｉｎｅｐａｐｕｌａｒｓｔｏｍａｔｉｔｉｓｖｉｒｕｓ）または口内炎丘疹ウイルス（ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓｐａｐｕｌｏｓａｖｉｒｕｓ）とも呼ばれる）及び ‐パラポックスウイルスボビス２（Ｐａｒａｐｏｘｖｉｒｕｓｂｏｖｉｓ２）（乳腺ポックスウイルス（ｕｄｄｅｒｐｏｘｖｉｒｕｓ）、パラワクシニアウイルス（ｐａｒａｖａｃｃｉｎｉａｖｉｒｕｓ）、搾乳者結節ウイルス（ｐｓｅｕｄｏｃｏｗｐｏｘｖｉｒｕｓ）または搾乳者結節ウイルス（ｍｉｌｋｅｒ’ｓｎｏｄｕｌｅｖｉｒｕｓ）とも呼ばれる）に分けられる（文献番号１）。ラクダ、アカシカ、シャモア、アザラシ及びアシカから単離されたパラポックスウイルスの代表種も記述されている。これらのウイルスがパラポックスウイルス属内の独立した種であるかどうか、またはこれらが上記の種の単離物であるかどうかは、まだ最終的に明らかにされていない。ＰＰＶでの感染は動物及びヒトの両方で局所的疾病を引き起こすことができる（人畜伝染病病原体）。文献番号１は、これまでに記述されているこれらの症候群の概要を与える。ワクチンのような予防手段をこれらの疾病を制御するために用いることができる。しかしながら、これまでに得ることができ、そしてパラポックスウイルスオビスに基づいて専ら開発されているワクチンの活性は不十分である（文献番号２）。本発明は、発現される外来遺伝情報のベクターとしてＰＰＶを用いることに関する。アビポックス（ａｖｉｐｏｘ）、ラクーンポックス（ｒａｃｏｏｎｐｏｘ）、カプリポックス（ｃａｐｒｉｐｏｘ）、スワインポックス（ｓｗｉｎｅｐｏｘ）またはワクシニアウイルス（ｖａｃｃｉｎｉａｖｉｒｕｓ）に基づくベクターが、外来遺伝情報を発現するためのベクターとしてすでに記述されている。これに関連して得られている洞察をＰＰＶに移しかえることはできない。比較研究が示しているように、ポックスウイルスの個々の属の間には形態、構造及び遺伝子の違いがある。従って、ＰＰＶを他のポックスウイルス属から区別するために例えば血清学的方法を用いることができ、これは、異なるタンパク質型及びこれに関連する異なる遺伝情報に起因すると考えられる。例えば、ポックスウイルスのいくつかの代表種は赤血球を凝集する能力がある。この活性は、表面タンパク質、いわゆるヘマグルチニン（ＨＡ）を介してもたらされる。ＰＰＶはこの活性を持たない。ＰＰＶゲノムの構造の知識は、現在、ゲノムの大きさ、核酸のＧＣ含有量の決定、比較制限酵素分析、個々のゲノム断片のクローニング、並びに一部の領域の配列分析及び個々の遺伝子の関連する予備的な記述に限られている（概説としては、文献番号１、文献番号５、文献番号６を参照）。ワクシニアの場合で知られている挿入部位は、ＰＰＶではないかまたは示されていないために、これらの部位を用いることは現在できない。従って、ＰＰＶゲノムでチミジンキナーゼの遺伝子を同定する試み及びそれを挿入部位として用いる試みは、オルトポックスウイルスの場合でのように成功しなかった。Ｍａｚｕｒ等（文献番号３）は、ワクシニアウイルス（オルトポックスウイルス）のチミジンキナーゼ遺伝子に似ていると彼らが主張するＰＰＶゲノムのセグメントの同定を記述しているが、我々自身の詳細な研究ではＰＰＶ中にそのような遺伝子の存在を確認することはできなかった。また、別の著者（文献番号１）もＰＰＶにおいてチミジンキナーゼ遺伝子を見いだすことはできなかった。ワクシニアウイルスでは外来ＤＮＡの挿入部位としてＨＡの遺伝子が用いられる。上に記述したように、ＰＰＶはこの活性を持たない。１９９２年に、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ及びＬｙｔｔｌｅは、ＰＰＶゲノム上の別の挿入部位を記述したが（文献番号１）、しかしながら、これらの部位の説明または正確な特性化を与えていない。さらに、ＰＰＶのベクターとしての成功した使用のいかなる記述もいまだない。ＰＰＶ株Ｄ１７０１からのＨｉｎｄIIIフラグメントＩの配列の我々独自の分析研究において、我々は各種哺乳類種（例えばマウス、ラット、モルモット、ウシ及びヒト）からの血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）とアミノ酸の相同性を有するＯＲＦを見いだした（３６．１ないし３８．３％の同一性；５２．８ないし５８．６％の類似性、ＧＣＧ、ウィスコンシンパッケージ（ＷｉｓｃｏｎｓｉｎＰａｃｋａｇｅ）８．１、例えばピックアッププログラム（ＰｉｋｕｐＰｒｏｇｒａｍ））。配列番号１はＤ１７０１のこの遺伝子のヌクレオチド配列を示し、一方、配列番号１５は対応するＤ１７０１タンパク質のアミノ酸配列を示す。最近、相同遺伝子がＰＰＶ株ＮＺ２及びＮＺ７においても記述された（文献番号６）が、しかしながら、この遺伝子の機能は知られていない。他のポックスウイルス、例えばオルトポックスウイルスが対応する遺伝子を持つことは知られていない。以下、この遺伝子をＶＥＧＦ遺伝子と称する。Ｄ１７０１のＨｉｎｄIIIフラグメントＩの我々の配列分析により、オルトポックスウイルスのプロテインキナーゼ遺伝子と相同性を有し、そしてワクシニアにおいてＦ１０Ｌとして知られている別のＯＲＦが同定された。ワクシニアＦ１０Ｌ遺伝子との同一性は５１％であり、一方、類似性は７０％である。以下、この遺伝子をＰＫ遺伝子と称する。配列番号２、番号９及び番号１３はＤ１７０１のこの遺伝子のヌクレオチド配列バージョンを示し、一方、配列番号１４は対応するＤ１７０１タンパク質のアミノ酸配列を示す。ＰＫ遺伝子の３’末端及びＶＥＧＦ遺伝子の５’末端と重なり合う別のＯＲＦが見いだされた。相同性研究により、ワクシニアのＦ９Ｌ遺伝子と低い同一性（２８％）及び低い類似性（５１％）があること示された。配列番号５及び番号１０はＤ１７０１のこの遺伝子のヌクレオチド配列バージョンを示す。以下、この遺伝子をＦ９Ｌ遺伝子と称する。さらなるＯＲＦがＩＴＲ領域内に見いだされ、ＰＰＶＮＺ２のある遺伝子に対するその類似性（同一性７６％、類似性８３％）のためにＯＲＦ３と称する。配列番号４はＤ１７０１のこの遺伝子のヌクレオチド配列を示す。以下、この遺伝子をＯＲＦ３遺伝子と称する。本発明は、１．挿入及び／または欠失を有する組み換えにより調製されたＰＰＶ、２．ウイルス増殖のために必要ではないゲノムセグメント中に挿入及び／または欠失を有する組み換えにより調製されたＰＰＶ、３．ウイルス増殖のために必要であるゲノムセグメント中に挿入及び／または欠失を有する組み換えにより調製されたＰＰＶ、４．Ｄ１７０１のＨｉｎｄIIIフラグメントＩの発現されない領域中に挿入及び／または欠失を含む組み換えにより調製されたＰＰＶ、５．Ｄ１７０１のＨｉｎｄIIIフラグメントＩの発現される領域中に挿入及び／または欠失を含む組み換えにより調製されたＰＰＶ、６．挿入及び／または欠失がＤ１７０１ＨｉｎｄIIIフラグメントＩ中またはこのフラグメントに相当する他のＰＰＶからのＤＮＡ中に位置する、１ないし５に記載の組み換えにより調製されたＰＰＶ、７．ＶＥＧＦ遺伝子の領域中またはこの領域の近くに挿入及び／または欠失を含む組み換えにより調製されたＰＰＶ、８．ＰＫ遺伝子の領域中またはこの領域の近くに挿入及び／または欠失を含む組み換えにより調製されたＰＰＶ、９．ＩＴＲセグメントの領域中またはこの領域の近くに挿入及び／または欠失を含む組み換えにより調製されたＰＰＶ、１０．ＨＤ１Ｒ遺伝子の領域中またはこの領域の近くに挿入及び／または欠失を含む組み換えにより調製されたＰＰＶ、１１．Ｆ９Ｌ遺伝子の領域中またはこの領域の近くに挿入及び／または欠失を含む組み換えにより調製されたＰＰＶ、１２．１０ｋＤａタンパク質をコードする遺伝子の領域中またはその近くに挿入及び／または欠失を含む組み換えにより調製されたＰＰＶ、１３．１０ｋＤａタンパク質をコードする遺伝子が位置するＤ１７０１のＥｃｏＲＩフラグメントＥの領域中に挿入及び／または欠失を含む組み換えにより調製されたＰＰＶ、１４．Ｄ１７０１のＨｉｎｄIIIフラグメントＩまたはこのフラグメントに相当する他のＰＰＶからのＤＮＡを含むプラスミド、１５．Ｄ１７０１のＨｉｎｄIIIフラグメントＩを含み、且つこのフラグメントのウイルス複製のために必要である領域中に欠失及び／または挿入を含むプラスミド、１６．Ｄ１７０１のＨｉｎｄIIIフラグメントＩを含み、且つこのフラグメントのウイルス複製のために必要ではない領域中に欠失及び／または挿入を含むプラスミド、１７．Ｄ１７０１のＨｉｎｄIIIフラグメントＩを含み、且つこのフラグメントのウイルス複製のために必要ではなく且つ発現されない領域中に欠失及び／または挿入を含むプラスミド、１８．Ｄ１７０１のＨｉｎｄIIIフラグメントＩを含み、且つこのフラグメントのウイルス増殖のために必要ではなく且つ発現される領域に位置する領域中に欠失及び／または挿入を含むプラスミド、１９．Ｄ１７０１のＨｉｎｄIIIフラグメントＩを含み、且つこのフラグメントのＶＥＧＦ遺伝子中またはその近くに欠失及び／または挿入を含むプラスミド、２０．Ｄ１７０１のＨｉｎｄIIIフラグメントＩを含み、且つこのフラグメントのＰＫ遺伝子中またはその近くに欠失及び／または挿入を含むプラスミド、２１．Ｄ１７０１のＨｉｎｄIIIフラグメントＩを含み、且つこのフラグメントのＩＴＲセグメント中またはその近くに欠失及び／または挿入を含むプラスミド、２２．Ｄ１７０１のＨｉｎｄIIIフラグメントＩを含み、且つＨＤ１Ｒ遺伝子及び／またはＦ９Ｌ遺伝子中またはその近くに欠失及び／または挿入を含むプラスミド、２３．Ｄ１７０１のＥｃｏＲＩフラグメントＥを含み、且つ１０ｋＤａタンパク質をコードする遺伝子中またはその近くに欠失及び／または挿入を含むプラスミド、２４．１４ないし２３による欠失及び／または挿入が存在する、Ｄ１７０１のＨｉｎｄIIIフラグメントＩの部分を含むプラスミド、２５．Ｄ１７０１のＤＮＡフラグメントがこのフラグメントに相当する他のＰＰＶからのＤＮＡで置き換えられている、１４ないし２４に記載のプラスミド、２６．ＨｉｎｄIIIフラグメントＩの全部またはその一部のみを含む、１４ないし２５に記載のプラスミド、２７．配列表の配列番号８または配列番号１２の配列を有する、Ｄ１７０１ＨｉｎｄIIIフラグメントＩ、またはその一部またはこのフラグメントに相当する他のＰＰＶからのフラグメント、２８．配列表の配列番号１によるＶＥＧＦタンパク質をコードする、Ｄ１７０１ＨｉｎｄIIIフラグメントＩのＤＮＡセグメントもしくは一部またはこのセグメントに相当する他のＰＰＶからのセグメントもしくはその一部、２９．配列表の配列番号２、配列番号９または配列番号１３のＰＫタンパク質をコードする、Ｄ１７０１ＨｉｎｄIIIフラグメントＩのＤＮＡセグメントもしくは一部またはこのセグメントに相当する他のＰＰＶからのセグメントもしくはその一部、３０．ＰＰＶの配列表の配列番号３の配列を有するＨＤ１Ｒ遺伝子のＤＮＡセグメントまたはその一部、３１．ＰＰＶの配列表の配列番号５または配列番号１０の配列を有するＦ９ＬのＤＮＡセグメントまたはその一部、３２．ＰＰＶの配列表の配列番号４の配列を有するＩＴＲ領域のＤＮＡセグメントまたはその一部、３３．２７ないし３２に記載のＤＮＡセグメントの配列に基づいて調製された遺伝子産物、３４．他の病原体の免疫性成分をコードする外来ＤＮＡを挿入物として含む、１ないし１３に記載の組み換えにより調製されたＰＰＶ、３５．サイトカインをコードする外来ＤＮＡを挿入物として含む、１ないし１３及び３４に記載の組み換えにより調製されたＰＰＶ、３６．１４ないし２６に記載のプラスミドをそれ自体既知の方法で細胞中でＰＰＶと組み換え、そして所望するウイルスを選択することを特徴とする、１ないし１３、３４及び３５に記載のウイルスの調製方法、３７．１．好適なＰＰＶ株を選択し、２．そのゲノムを精製し、３．精製したゲノムを制限酵素で処理し、４．得られたフラグメントをプラスミド中に挿入し、そして５．１０ｋＤａタンパク質をコードする遺伝子を含むプラスミドの選択を実施し、６．場合によっては、１０ｋＤａタンパク質をコードする遺伝子中に挿入及び／または欠失を導入し、７．場合によっては、（上記）４に記述したフラグメントをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはオリゴヌクレオチド合成のような別の方法を用いて調製することもできる、ことを特徴とする、２３に記載のプラスミドの調製方法、３８．１．好適なＰＰＶ株を選択し、２．そのゲノムを精製し、３．精製したゲノムを制限酵素で処理し、４．得られたフラグメントをプラスミド中に挿入し、そして５．ＨｉｎｄIIIメントＩまたはこのフラグメントに相当するフラグメントもしくは成分を含むプラスミドの選択を実施し、６．そして場合によっては、得られたプラスミドのこれらのフラグメント中に挿入及び／または欠失を導入し、７．場合によっては、（上記）４に記述したフラグメントをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはオリゴヌクレオチド合成のような別の方法を用いて調製することもできる、ことを特徴とする、１４ないし２２及び２４ないし２６に記載のプラスミドの調製方法、３９．１．好適なＰＰＶ株を選択し、２．そのゲノムを精製し、３．精製したゲノムを制限酵素で処理し、４．そして所望するフラグメントもしくはセグメントを選択するか、または５．場合によっては、得られたゲノムのフラグメントをまずプラスミドに挿入し、そして所望するフラグメントを含んでいるプラスミドを単離し、その後にこれらのプラスミドを増やし、そして所望するフラグメントをそれらから単離し、６．場合によっては、（上記）４に記述したフラグメントをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはオリゴヌクレオチド合成のような別の方法を用いて調製することもできる、ことを特徴とする、Ｄ１７０１ＨｉｎｄIIIフラグメントＩもしくは１０ｋＤａタンパク質をコードするＥｃｏＲＩフラグメントＥまたはこのフラグメントもしくはセグメントに相当する他のＰＰＶからの領域またはその一部の調製方法、４０．３９により得ることができるフラグメントを好適な発現系に導入し、これらの系を用いて遺伝子を発現することを特徴とする、３３に記載の遺伝子産物の調製方法、４１．１ないし１３に記載の組み換えにより調製されたＰＰＶのワクチンにおける使用、４２．１ないし１３に記載の組み換えにより調製されたＰＰＶの、免疫性を与え且つ病原体非特異的な免疫防御を刺激する生成物における使用、４３．組み換えにより調製されたＰＰＶの病原体非特異的免疫防御を刺激する免疫調節剤における使用、４４．組み換えにより調製されたＰＰＶの外来ＤＮＡを異種起源で発現するための使用、４５．組み換えにより調製されたＰＰＶの外来ＤＮＡのベクターとしての使用、４６．１４ないし１６に記載のプラスミドのパラポックスに特異的なゲノムセグメントを発現するための使用、４７．１４ないし２６に記載のプラスミドの診断用試薬を調製するための使用、４８．２７ないし３２に記載のゲノムフラグメントの診断用試薬を調製するための使用、４９．配列表の配列番号６に記載のＤＮＡセグメント（ＶＥＧＦ遺伝子のプロモーター）、５０．ＤＮＡを発現するためのプロモーターとしての４９に記載のＤＮＡセグメントの使用、プラスミドまたはウイルス中に挿入することができ、且つ遊離ＤＮＡセグメントとして存在することができるＰＰＶの上記ゲノムフラグメントは、定められたＤＮＡ配列並びにそれらの変異体及び相同物を包含する。上に挙げた用語は以下の意味を有する。すなわち、 ‐弱毒化は、ＰＰＶのゲノムの改変の結果として、ＰＰＶが動物またはヒトに対して病原性が低くなるかもしくは病原性がなくなる、または毒性が低くなるかもしくは毒性がなくなる工程である。 ‐欠失は、ＰＰＶゲノムから欠けているＤＮＡの断片である。 ‐欠失プラスミドは、プラスミドＤＮＡに加えて、断片が取り除かれたＰＰＶゲノムのセグメントを保有するプラスミドである。 ‐ウイルス増殖のために必要（必須）であるゲノムセグメントは、ＰＰＶのインビトロでの増殖のために不可欠である、すなわち、感染性のウイルス子孫を生じるために不可欠である全ＰＰＶゲノムの部分である。ウイルス増殖のために必須である遺伝子の妨害は、中断されるウイルス増殖をもたらす。例えば、これらの遺伝子の一つの一部または全遺伝子が除かれる場合、ウイルスの複製はウイルスの増殖サイクルのある特定の時点で止まる。この性質の突然変異体での感染または処理は、その動物から感染性子孫のいかなる放出も生じない。必須遺伝子の一部または全必須遺伝子が外来ＤＮＡで置き換えられる場合または外来ＤＮＡが必須遺伝子中に挿入される場合に、予防接種を受けた個体中で増殖することができず、従って、感染性の病原体として放出されないベクターワクチンを構築することができる。 ‐ウイルス増殖のために必要（必須）ではないゲノムセグメントは、ＰＰＶのインビトロでの増殖のため、すなわち、感染性のウイルス子孫を生じるために不要である可能性のある全ＰＰＶゲノムの部分である。 ‐外来ＤＮＡ成分（外来ＤＮＡ）は、本発明により用いられるＰＰＶ中に本来存在していないＤＮＡ断片、例えば外来遺伝子またはヌクレオチド配列である。外来ＤＮＡは、以下の理由のため、すなわち、１．外来ＤＮＡを発現するため、２．ＰＰＶＤＮＡの断片の機能を不活性化するため、３．ＰＰＶを標識するためにＰＰＶ中に挿入される。これらの理由により、異なる外来ＤＮＡが挿入される。外来ＤＮＡが（１）により発現される場合、挿入される外来ＤＮＡは、１種またはそれ以上の所望する外来タンパク質をコードする読み枠を少なくとも保有する。場合によっては、外来ＤＮＡはそれ自体または外来の調節配列をさらに含む。ウイルスのゲノム中に欠失を作製することにより外来ＤＮＡを取り込む能力を増すことができる。通例、その長さは１ヌクレオチド及び３５，０００ヌクレオチドの間、好ましくは１００及び約１５，０００ヌクレオチドの間である。挙げることができる例は、ヘルペスウイルススイド１（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｓｕｉｄ１）、ウマヘルペスウイルス（Ｅｑｕｉｎｅｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｅｓ）、ウシヘルペスウイルス（Ｂｏｖｉｎｅｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｅｓ）、口蹄疫ウイルス（Ｆｏｏｔａｎｄｍｏｕｔｈｄｉｓｅａｓｅｖｉｒｕｓ）、ウシＲＳウイルス（Ｂｏｖｉｎｅｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙｓｙｎｃｙｔｉａｌｖｉｒｕｓ）、ウシパラインフルエンザウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ３）、インフルエンザウイルス（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａｖｉｒｕｓ）、カリシウイルス（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｕｓ）、フラヴィウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓｅｓ）、例えばウシウイルス下痢ウイルス（ｂｏｖｉｎｅｖｉｒｕｓｄｉａｒｒｈｏｅａｖｉｒｕｓ）または古典的ブタコレラウイルス（ｃｌａｓｓｉｃａｌｓｗｉｎｅｆｅｖｅｒｖｉｒｕｓ）、のようなウイルスまたはパスツレラ種（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａｓｐｅｃ．）、サルモネラ種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａｓｐｅｃ．）、アクチノバシラス種（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｐｅｃ．）、クラミジア種（Ｃｈｌａｍｙｄｉａｓｐｅｃ．）のようなバクテリアまたはトキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）、ジロフィラリア（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ）、エキノコックス（Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ）のような寄生虫からの遺伝子または遺伝子の一部である。外来ＤＮＡが（２）により挿入される場合、適当な外来ヌクレオチドの挿入がベクターウイルスのＤＮＡ配列を遮断するために原則として十分である。不活性化のために挿入される外来ＤＮＡの最大の長さはベクターウイルスの外来ＤＮＡを取り込む能力により決まる。通例、外来ＤＮＡの長さは１ヌクレオチド及び３５，０００ヌクレオチドの間、好ましくは１００及び１５，０００ヌクレオチドの間、特に好ましくは３及び１００ヌクレオチドの間である。ＤＮＡ配列が（３）による標識化のために挿入される場合、これらの長さは標識されたウイルスを同定するために用いる検出方法により決まる。通例、外来ＤＮＡの長さは１及び２５，０００ヌクレオチドの間、好ましくは２０ヌクレオチド及び１５，０００ヌクレオチドの間、特に好ましくは５及び１００ヌクレオチドの間である。 ‐遺伝子ライブラリーは、複製可能なベクター中に含まれるゲノムのフラグメントの全体である。ライブラリーは、ゲノムを断片化し、そしてこれらのフラグメントの全て、これらのフラグメントのいくつかまたはこれらのフラグメントの主要な部分を複製可能なベクター、例えばプラスミド中に挿入することにより得られる。 ‐ゲノムフラグメントは、単離された形で存在することができるか、または複製可能なベクター中に挿入することができるゲノムの断片である。 ‐挿入による不活性化は、挿入された外来ＤＮＡが、本来のＰＰＶゲノム配列が発現されたり、または機能することを妨げることを意味する。 ‐挿入は、ＰＰＶゲノム中に付加的に組み込まれているＤＮＡの断片である。挿入の理由により、ＤＮＡ断片の長さは１ヌクレオチド及び数千ヌクレオチドの間である可能性がある（「外来ＤＮＡ」の定義も参照）。 ‐挿入プラスミドは、ＰＰＶＤＮＡ配列が隣接した、挿入される外来ＤＮＡを含むプラスミド、特にバクテリアのプラスミドである。 ‐挿入部位は、外来ＤＮＡを受け入れるために適しているウイルスゲノム中の部位である。 ‐クローニングは、ＰＰＶゲノムＤＮＡが単離され、断片化されることを意味する。次に、これらのフラグメントまたはこれらのフラグメントの選択物が通常のＤＮＡベクター（バクテリアのプラスミドまたはファージベクターまたは真核生物のベクター）中に挿入される。文献番号１１は、ＤＮＡフラグメントの調製及びクローニング方法の選択を与える。ＰＰＶＤＮＡフラグメントをインサートとして含んでいるＤＮＡベクターが、例えば、最初に単離されたＰＰＶＤＮＡフラグメントの同一コピーを調製するために用いられる。 ‐挿入による標識化は、挿入された外来ＤＮＡが、修飾されたＰＰＶを続いて同定することを可能にすることを意味する。 ‐ＯＲＦ（読み枠）は、可能性のあるタンパク質のアミノ酸配列をＤＮＡレベルで特定するヌクレオチドの配列を意味すると理解される。特定するタンパク質の大きさにより決められる数のヌクレオチドトリプレットからなり、開始コドン（ＡＴＧ）により５’末端、そして終止コドン（ＴＡＧ）ＴＧＡまたはＴＡＡ）により３’末端の境界が定められる。 ‐調節配列は、遺伝子の発現に対して影響を与えるＤＮＡ配列である。この特性の配列は文献番号１５から既知である。好ましくは、配列表の配列番号６に記述されるようなＶＥＧＦプロモーターを挙げることができる。 ‐組み換えＰＰＶは、それらのゲノム中に挿入及び／または欠失を有するＰＰＶである。これに関連して、挿入及び欠失は、分子生物学的方法を用いて調製される。 ‐反復（ＤＮＡ）配列は、ＰＰＶゲノム中に直接相次いでかまたは異なる部位に分散して存在する同一のヌクレオチド配列である。 ‐ベクターウイルスは、外来ＤＮＡの挿入のために好適であり、且つそのゲノムに挿入した外来ＤＮＡを感染した細胞または生物中に移すことができ、且つ場合によっては外来ＤＮＡを発現することができるＰＰＶである。（上記）１ないし１２に記載の新規なＰＰＶは、以下のようにして調製される。すなわち、１．好適なＰＰＶ株の選択２．挿入部位を有するＰＰＶゲノム中のゲノムセグメントの同定２．ａウイルス増殖のために必須でない遺伝子中に挿入部位を有するＰＰＶゲノムセグメントの同定２．ｂウイルス増殖のために必須である遺伝子中に挿入部位を有するＰＰＶゲノムセグメントの同定２．ｃＰＰＶゲノムの遺伝子以外の領域及び／または遺伝子重複中に挿入部位を有するゲノムセグメントの同定２．ｄ挿入部位を有するゲノムセグメントを同定するための他の方法２．ｅ挿入部位に対する要求２．１挿入部位の同定２．１．１ＰＰＶゲノムの精製２．１．２ゲノムフラグメントのクローニング及び遺伝子ライブラリーの樹立２．１．３遺伝子または遺伝子以外のゲノムセグメントを同定する目的のシークエンシング２．１．４さらなる処理のためのＰＰＶゲノムフラグメントを含んでいるクローンの選択２．２挿入部位としての、ＩＴＲ領域、ＶＥＧＦ遺伝子、ＰＫ遺伝子、１０ｋＤａタンパク質をコードする遺伝子及びＰＫ遺伝子とＨＤ１Ｒ遺伝子の間の領域２．２．１ＶＥＧＦ遺伝子のクローニング２．２．２プロテインキナーゼ遺伝子のクローニング２．２．３１０ｋＤａタンパク質をコードする遺伝子領域のクローニング２．２．４ＩＴＲ領域（逆方向末端反復領域）またはＰＫ遺伝子とＨＤ１Ｒ遺伝子の間に存在するゲノムセグメントのクローニング３．挿入される外来ＤＮＡを保有する挿入プラスミドまたは欠失プラスミドの構築３．１クローン化されたゲノムフラグメント中の１箇所だけに存在する制限酵素認識部位、すなわち、唯一の制限部位の同定または調製及び外来ＤＮＡの挿入３．２クローン化されたゲノムフラグメント中のゲノム配列の欠失及び外来ＤＮＡの挿入３．３＃３．１及び＃３．２の組み合わせ４．（上記）１ないし１２による組み換えＰＰＶの構築１．好適なＰＰＶ株の選択原則として、全てのＰＰＶ種が本発明を実施するために適している。組織培養で＞１０⁵ＰＦＵ（プラーク形成単位）／ｍｌの力価まで増殖することができ、且つ感染した細胞の培地から細胞外の感染性ウイルスとして純粋な形態で調製することができるウイルス株が好ましい。好ましいとして挙げることができるＰＰＶ属の種はＰＰＶオビス（ｏｒｆウイルス）である。特に好ましいとして挙げることができるＰＰＶオビスの株は、登録番号ＣＮＣＭＩ−７５１でパスツール研究所（ＩｎｓｔｉｔｕｔＰａｓｔｅｕｒ）、Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．にブダペスト条約に従って１９８８年４月２８日に寄託されたＤ１７０１並びにその変種及び突然変異体である。これらのウイルスを哺乳類細胞のような動物細胞の組織培養において、例えばヒツジ細胞またはウシ細胞、好ましくは永久ウシ腎臓細胞系ＢＫｍｍｌｉｎｇｅｎ））のようなウシ細胞または永久サル腎臓細胞ＭＡ１０４もしくはＶｅｒｏ（もしくはそれらの誘導体）ようなサル細胞において常法で増殖させる。増殖は、緻密細胞凝集塊の形態または懸濁培養で静置、ローラーまたは担体培養でそれ自体既知の方法で実施される。ウイルスを増殖させるために用いる細胞または細胞ローン（ｌａｗｎｓ）を実質的に融合するまでまたは最適細胞密度まで常法で増やす。これらの細胞に、あるＭＯＩ（＝細胞当たりの感染性ウイルス粒子に相当する、感染多重度）に相当するウイルス希釈物を感染させる。動物血清を添加するかまたはしないでウイルスを増殖させる。血清を用いる場合は、１−３０容量％、好ましくは１−１０容量％の濃度で増殖培地に添加する。感染及びウイルス増殖は、室温及び４０℃の間、好ましくは３２及び３９℃の間、特に好ましくは３７℃の温度で、数日にわたって、好ましくは感染した細胞が完全に破壊されるまで実施される。ウイルスを集めることに関連して、なお細胞に結合しているウイルスを機械的にまたは超音波処理によりまたは例えばトリプシンを用いて穏やかな酵素的タンパク質分解によりさらに遊離することができる。次に、感染細胞からのウイルスを含有している培地を例えば、０．２−０．４５μｍのような孔径を用いる濾過及び／または低速遠心分離で細胞屑を除去することによりさらに整えることができる。濾過液または遠心分離上清をウイルスの濃縮及び精製のために用いることができる。このために、濾過液または上清をウイルス粒子が沈殿するまで高速遠心分離に供する。場合によっては、例えば密度勾配遠心分離によりさらに精製工程を続けることができる。２．ＰＰＶゲノムにおける挿入部位を有するゲノムセグメントの同定外来ＤＮＡを挿入する場合、ＰＰＶゲノムの様々な領域を挿入部位として用いることができる。外来ＤＮＡをａ．インビトロ及び／またはインビボでのウイルス増殖のために必須でない遺伝子中、ｂ．ウイルス増殖のために必須である遺伝子中、そして／またはｃ．いかなる遺伝子機能も持たない領域中に挿入することができる。２．ａウイルス増殖のために必須でない遺伝子中に挿入部位を有するＰＰＶゲノムのゲノムセグメントの同定ｉ．ウイルスの増殖のために必須でないウイルスゲノムは、例えば、異なるＰＰＶ種の代表を用いて比較研究を実施することにより見いだされる。あるＰＰＶ種の１つまたはそれ以上の単離物または株には存在しないが、他の単離物または株に見いだされる遺伝子は、必須でない可能性がある。 ii．ウイルス増殖のために必須でない遺伝子を別の方法でも同定することができる。例えばクローン化されたフラグメントとして存在することができるＰＰＶゲノムフラグメントをシークエンスした後、これらのＤＮＡ配列を可能な「読み枠」（ＯＲＦ）に関して調べる。ＯＲＦが見いだされる場合、このＯＲＦの遺伝子としての機能を転写及び／または翻訳を示すことにより確かめる。見いだされた遺伝子がウイルス増殖のために必須でないかどうかを確かめるために、分子遺伝学的方法を用い、ＰＰＶゲノムからこの遺伝子を取り除くか、または突然変異を導入することによりこれを部分的に破壊するかもしくはこれを遮断し、得られたウイルスの増殖能力を次に調べる。操作した遺伝子の非存在下でもウイルスが複製できる場合、その遺伝子は必須でない遺伝子である。同定された挿入部位の例ｉ．外来ＤＮＡの挿入部位として用いることができる必須でないＰＰＶ遺伝子の例としてここではＰＰＶオビスのＶＥＧＦ遺伝子を挙げることができる。この遺伝子は、調べられたパラポックスウイルスオビス株（ＮＺ−２、ＮＺ−７及びＤ１７０１）で見いだされる（文献番号６）。このＶＥＧＦ遺伝子はいくつかのＰＰＶ株、例えばＰＰＶボビス１の代表では示されていない。ＶＥＧＦ遺伝子を含んでいるＰＰＶゲノム上の領域を配列表の配列番号１に示されるＤＮＡ配列を用いて同定することができる。分子生物学の常法を用いて、ハイブリダイゼーション実験、ゲノム配列分析及び／またはポリメラーゼ連鎖反応によりＰＰＶのゲノム上の遺伝子を見いだすことができる。 ii．必須でない可能性のあるＰＰＶ遺伝子の別の例として１０ｋＤａＰＰＶタンパク質の遺伝子を挙げることができる。この遺伝子は、パラポックスウイルスオビス（ＮＺ−２、ＮＺ−７及びＤ１７０１）の株で見いだされる。分子生物学の常法を用いて、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により１０ｋＤａタンパク質の遺伝子を含むＰＰＶゲノム上の領域を同定することができる。文献番号８は、１０ｋＤａタンパク質遺伝子のＤＮＡ配列を示している。ＰＣＲに用いることができるプライマーは、例えば文献番号８に特定されている。配列表の配列番号１１は、Ｄ１７０１からの１０ｋＤａに特異的なＰＣＲ産物のＤＮＡ配列を示している。外来ＤＮＡを挿入する目的のために、必須でない遺伝子を部分的または完全にＰＰＶゲノムから取り除くことができる。しかしながら、ＰＰＶ遺伝子のいかなる領域も取り除かずに必須ではない遺伝子中に外来ＤＮＡを挿入することも可能である。例えば、挿入部位として制限酵素認識部位を用いることができる。２．ｂ必須である遺伝子中に挿入部位を有するＰＰＶゲノム上のＰＰＶゲノムセグメントの同定ｉ．例えばクローン化されたフラグメントとして存在するウイルスゲノムフラグメントをシークエンスし、次に可能なＯＲＦを同定することにより、必須である遺伝子を同定することができる。ＯＲＦが見いだされる場合、転写及び／または翻訳を示すことにより遺伝子としてのその機能を確かめる。見いだされた遺伝子がウイルス増殖のために必須であるかどうかを確かめるために、分子遺伝学的方法を用い、例えばこの遺伝子の一部もしくは全遺伝子を取り除くことにより、または外来ＤＮＡを挿入することによりＰＰＶゲノムのこの遺伝子を破壊し、得られたウイルスの増殖能力を次に調べる。得られたウイルス突然変異体が複製できない場合、その遺伝子は必須遺伝子である可能性が高い。ウイルス突然変異体が相補細胞系でのみ増殖できる場合、これはその遺伝子が必須であることを示す。挿入部位の例ＰＰＶＤ１７０１のプロテインキナーゼ遺伝子（ＰＫ遺伝子）を例として挙げることができる。ＰＫ遺伝子は、ウイルスの増殖サイクルの後期に発現される。配列表の配列番号２、配列番号９または配列番号１３に示されるＤＮＡ配列バージョンをＰＰＶゲノム上のＰＫ遺伝子を同定するために用いることができる。分子生物学の常法を用いて、例えばハイブリダイゼーション実験、ゲノム配列分析及び／またはポリメラーゼ連鎖反応によりこの遺伝子を含んでいる領域を見いだすことができる。外来ＤＮＡを挿入する目的のために、必須遺伝子を部分的または完全にＰＰＶゲノムから取り除くことができる。しかしながら、ＰＰＶ遺伝子から領域を取り除かずに必須遺伝子中に外来ＤＮＡを挿入することも可能である。２．ｃ遺伝子以外の領域及び／または遺伝子重複中に挿入部位を有するＰＰＶゲノム上のゲノムセグメントの同定機能的遺伝子産物をコードせず、且ついかなる必須の調節機能も持たないゲノムセグメント（いわゆる遺伝子間セグメント）は、原則として、外来ＤＮＡの挿入部位としての使用のために適している。反復配列を含んでいる領域は、領域の一部の変化を残っている配列反復で埋め合わせることができるので特に適している。また、２またはそれ以上のコピーで存在する遺伝子、いわゆる遺伝子重複もこの分類の範囲内に入る。ＰＰＶゲノムのＩＴＲ領域または重複したセグメント中の遺伝子は、ウイルスゲノム中に２コピーで存在する。そのような遺伝子の一つのコピーを除くかまたは改変し、外来ＤＮＡを挿入した後に、たとえ改変した遺伝子がウイルス増殖のために重要であっても安定なＰＰＶ組み換え体を得ることができる。もう一つの改変されていない遺伝子コピーがその遺伝子の機能のために十分である可能性がある。ｉ．遺伝子産物をコードしないゲノム配列を同定するために、ＰＰＶゲノムの配列分析を用いる。配列分析後のＯＲＦまたはウイルス特異的な転写を示さず、且ついかなる調節機能も持たないゲノム領域は、可能性のある挿入部位である。特に、これらの領域中の制限酵素の切断部位は可能性のある挿入部位である。好適な挿入部位が存在するかどうかを調べるために、既知の分子生物学的方法を用いて外来ＤＮＡを可能性のある挿入部位中に挿入し、得られたウイルス突然変異体の生存能力を次に調べる。可能性のある挿入部位に外来ＤＮＡを含むウイルス突然変異体が増殖できる場合、調べている部位は好適な挿入部位である。 ii．反復配列及び遺伝子重複を同定するために、ＤＮＡハイブリダイゼーション実験及び／または配列分析を用いる。ハイブリダイゼーション実験では、ＰＰＶからクローン化または単離したゲノムフラグメントをＰＰＶＤＮＡのフラグメントとのハイブリダイゼーションのプローブとして用いる。全ＰＰＶゲノムの１個より多いフラグメントとハイブリダイズするＰＰＶのゲノムフラグメントは、１つまたはそれ以上の反復配列を含む。反復配列または重複したゲノム領域をゲノムフラグメント上に正確に位置づけるために、このフラグメントのヌクレオチド配列を決定する。可能性のある挿入部位が全ＰＰＶゲノムの好適な挿入部位であるかどうかを確かめるために、外来ＤＮＡを反復配列中または遺伝子重複の１コピー中に挿入しなければならず、そしてインサートを含んでいるＰＰＶゲノムフラグメントをウイルスゲノム中に組み込まなければならない。次に、外来ＤＮＡを含んでいる組み換えウイルスの増殖能力を調べる。組み換えウイルスが増殖する場合、同定した認識部位は挿入部位として適している。挿入部位の例ｉ．プロテインキナーゼの遺伝子とＨＤ１Ｒ遺伝子の間のゲノムセグメント（配列表の配列番号７）を遺伝子間領域の例として挙げることができる。 ii．ＩＴＲ領域（配列表の配列番号４）を反復配列の例として挙げることができる。 iii．（ＩＴＲ領域中の）遺伝子の可能性のある「ＯＲＦ３」及びＶＥＧＦ遺伝子をＰＰＶ株Ｄ１７０１の遺伝子重複の例として挙げることができる。ハイブリダイゼーション試験では、ＶＥＧＦ遺伝子を含んでいる領域が、前述の株Ｄ１７０１で複製されウイルスゲノムのもう一方の末端に転位されていて、従って２コピーのＶＥＧＦ遺伝子が存在することが示された。配列表の配列番号４（「ＯＲＦ３」遺伝子を含むＩＴＲ配列）及び配列番号７（ＰＫ及びＨＤ１Ｒ遺伝子間の領域）の配列を用いて、ハイブリダイゼーション実験、ゲノム配列分析及び／またはポリメラーゼ連鎖反応のような分子生物学の常法を用いて他のＰＰＶの対応するゲノム領域を見いだすことができる。２．ｄ挿入部位を同定するための他の方法通例、ＰＰＶゲノム上の可能性のある挿入部位を見いだすためにウイルスゲノム配列の修飾も用いることができる。ヌクレオチドの置換、欠失及び／もしくは挿入またはこれらの組み合わせがウイルス増殖を妨げないゲノム部位は、可能性のある挿入部位である。可能性のある挿入部位が好適な挿入部位であるかどうかを調べるために、既知の分子生物学的方法を用いて外来ＤＮＡを可能性のある挿入部位中に挿入し、得られたウイルス突然変異体の生存能力を調べる。ウイルス組み換え体が増殖できる場合、調べている部位は好適な挿入部位である。２．１挿入部位の同定２．１．１ＰＰＶゲノムの精製分子遺伝学を用いてＰＰＶ挿入部位をクローニングする目的のために、ＰＰＶゲノムをまず精製する。（上記）１に従って調製したウイルスからゲノムを単離し、次いで精製する。好ましくは、精製したウイルス粒子を溶剤及びプロテアーゼの水溶液で処理することにより天然のウイルスＤＮＡを抽出する。挙げることができる溶剤は、陰イオン性、陽イオン性、両性及び非イオン性の溶剤である。好ましくはイオン性溶剤を用いる。ドデシル硫酸ナトリウム（ラウリル硫酸ナトリウム）が特に好ましい。挙げることができるプロテアーゼは、プロテイナーゼＫ及びプロナーゼのような、溶剤の存在下で働く全てのプロテアーゼである。プロテイナーゼＫを好ましいとして挙げることができる。溶剤は０．１−１０容量％の濃度で用いられ、０．５−３容量％が好ましい。プロテアーゼは０．０１−１０ｍｇ／ｍｌウイルスライセートの濃度で用いられ、０．０５−０．５ｍｇ／ｍｌウイルスライセートが好ましい。好ましくは、ＤＮａｓｅインヒビターの存在下で緩衝水溶液中でこの反応を実施する。挙げることができる緩衝物質は、強塩基と弱酸の塩、例えばトリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）、弱塩基と強酸の塩、例えば第一リン酸塩、またはこれらの混合物である。以下のバッファー系、すなわち、トリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）を好ましいとして挙げることができる。緩衝物質または緩衝系は、ＤＮＡが変性しないｐＨ値を保証する濃度で用いられる。５−９のｐＨ値が好ましく、６−８．５の値が特に好ましく、７−８の値が非常に特に好ましく、特に、中性の範囲での作用を挙げることができる。ＤＮａｓｅインヒビターの例は０．１−１０ｍＭ（ミリモル）の濃度のエチレンジアミン四酢酸であり、約１ｍＭが好ましい。その後、ウイルスライセートの親油性成分を抽出する。フェノール、クロロホルム、イソアミルアルコールまたはこれらの混合物のような溶媒を抽出剤として用いる。まずフェノールとクロロホルム／イソアミルアルコールの混合物を用いることが好ましく、抽出は１回またはそれ以上の工程で実施される。ウイルスＤＮＡを単離するための別の方法の例は、ウイルスライセートのＣａＣｌ密度勾配遠心分離またはゲル電気泳動である（文献番号１４を参照）。核酸の抽出は文献番号１３に記述されている。好ましくは、このようにして抽出したＤＮＡを例えばアルコール、好ましくはエタノールまたはイソプロパノールを用いて、そしてアルカリ金属の塩化物または酢酸塩、好ましくは塩化リチウム、塩化ナトリウムまたは酢酸ナトリウムもしくは酢酸カリウムのような一価の塩を添加して、水溶液から沈殿させる（上記引用文献を参照）。２．１．２ゲノムフラグメントのクローニングこのようにして精製したウイルスＤＮＡを今度はＤＮＡフラグメントを調製するために用いる。このために、例えば制限酵素で処理する。適当な制限酵素の例はＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄIII及びＫｐｎＩである。また、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてゲノムフラグメントを合成することができる。このために、すでに知られているウイルスゲノムの配列セグメントからプライマーを選択し、このプライマー対により境界が定められるゲノムセグメントを例えばＴａｑポリメラーゼまたはＰｆｕポリメラーゼを用いてインビトロで合成する。制限消化またはＰＣＲから得られるＤＮＡフラグメントを（Ｓａｍｂｒｏｏｃｋ８９）に記述された方法を用いて、ベクター系にクローン化することができる。例えば、各場合でクローン化されるＤＮＡフラグメントの大きさにより、プラスミドベクター、ラムダファージベクターまたはコスミドベクターがこの目的のために利用できる。２．１．３シークエンシング、遺伝子の同定及び特性化、並びにそれらの発現の確認ベクター中にクローン化されているゲノムフラグメントをまずシークエンシングにより分析する。異なる制限酵素を用いて、挿入されたＤＮＡフラグメントの地図を作製し、適当なサブフラグメントをプラスミドベクター中にクローン化する。シークエンシング反応を例えばＰｈａｒｍａｃｉａにより供給されるＴ７シークエンシングキットを製造業者の説明書に従って用いて実施する。このために必要な二本鎖のプラスミドＤＮＡを好ましくはＰＥＧ法（Ｈａｔｔｏｒｉ及びＳａｋａｋｉ１９８５）を用いて調製する。ゲノムフラグメント中に存在する「読み枠」（ＯＲＦ）をコンピューター分析（ＧＣＧ、上記参照）により同定する。同定したＯＲＦの配列をデータベースに含まれている既知の機能の他の遺伝子配列と比較することによりそれらのそれぞれの機能に関する情報を得ることができる。同定したＯＲＦのそれぞれの対応する転写物をウイルス感染細胞で検出することによりこれらを機能的に特徴づける。このために、例えばＡＧＰＣ法（Ｃｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ及びＳａｃｃｈｉ、（２０）１９８７）を用いてウイルス感染細胞から全ＲＮＡを単離する。次に、ノーザンブロット分析またはプライマー伸長及びＲＮＡ保護実験により特定の転写物並びにそれらの５’及び３’末端を同定することができる。代わりの方法として、同定したＯＲＦによりコードされるウイルスタンパク質をインビトロで発現させ、次に発現産物を用いて抗血清を得て、そしてこれらの抗血清を用いてＯＲＦの発現を示すことが可能である。見いだされた遺伝子がウイルス増殖のために必須でないかどうかを確かめるために、遺伝子破壊または遺伝子欠失によりその遺伝子を壊すことができる。これに関連して、全遺伝子またはその一部をＰＰＶゲノムから取り除くか、または外来遺伝子配列を挿入することにより遺伝子の読み枠を遮断する。得られたウイルスの増殖能力を調べる。破壊された遺伝子の非存在下でもウイルスが複製できる場合、この遺伝子は必須でない遺伝子である。２．１．４ＰＰＶゲノムフラグメントを含んでいるクローンの選択上で得られたＰＰＶゲノムフラグメントを含んでいるクローンのいずれを用いるかは、調製する組み換えＰＰＶが（ｉ）複製できるかまたは（ii）複製能力を欠いているかによる。ｉ．挿入及び／または欠失にもかかわらず複製できる組み換えＰＰＶを調製する場合は、ウイルス増殖のために必須でない遺伝子もしくは遺伝子以外のゲノム領域を含むかまたは遺伝子重複を含むクローン化されたウイルスゲノムフラグメントに対してさらなる処理を実施する。手元にある遺伝子またはゲノム領域がウイルスゲノムの必須でない領域または遺伝子重複であるかどうかを調べるためにウイルス突然変異体を用いる。このために、分子生物学的方法を用いて、例えば当該領域を部分的または完全に除くことにより調べているＰＰＶの遺伝子またはゲノム領域を不活性化し、そしてウイルス突然変異体の増殖能力を調べる。ウイルス突然変異体が不活性化した当該遺伝子またはゲノム領域にもかかわらず複製できる場合、調べている遺伝子またはゲノム領域は必須でない領域である。必須でない遺伝子の完全なバージョンを含むＰＰＶのクローン化されたゲノムフラグメントが好ましい。これに加えて、これらの遺伝子またはゲノム領域の両末端に隣接するウイルスゲノム領域も存在すべきである。隣接する領域の長さは１００塩基対より多くなければならない。そのようなゲノムクローンが利用できない場合は、分子生物学的方法により存在する遺伝子クローンからそれらを調製することができる。クローン化されたゲノムフラグメントが本調製のために必要ではないゲノム領域をさらに含んでいる場合は、これらの領域をサブクローニングにより取り除くことができる。 ii．挿入及び／または欠失の結果、感染性の子孫を生じる能力を失っている組み換えＰＰＶを調製する場合は、ウイルス増殖のために必須である遺伝子または遺伝子以外のゲノム領域を含むクローン化されたウイルスゲノムフラグメントをさらなる処理に供する。手元にある遺伝子またはゲノム領域がウイルスゲノムの必須領域であるかどうかを調べるためにウイルス突然変異体を用いることができる。このために、分子生物学的方法を用いて、例えば当該領域を部分的または完全に除くことにより調べているＰＰＶの遺伝子またはゲノム領域を不活性化し、そしてウイルス突然変異体の増殖能力を調べる。当該遺伝子またはゲノム領域を不活性化した結果、ウイルス突然変異体がもはや増殖できない場合、調べている遺伝子またはゲノム領域は必須領域である。必須遺伝子の完全なバージョンを含むＰＰＶのクローン化されたゲノムフラグメントが好ましい。これに加えて、隣接するウイルスゲノム領域も同様にこれらの遺伝子またはゲノム領域の両末端に存在すべきである。隣接する領域の長さは１００塩基対より多くなければならない。そのようなゲノムクローンが利用できない場合は、分子生物学的方法により存在するゲノムクローンからそれらを調製することができる。クローン化されたゲノムフラグメントが本調製のために必要ではないさらなるゲノム領域を含んでいる場合は、これらの領域をサブクローニングにより取り除くことができる。２．２挿入部位としての、ＩＴＲ領域、ＶＥＧＦ遺伝子、ＰＫ遺伝子、１０ｋＤａタンパク質をコードする遺伝子及びＰＫ遺伝子とＨＤ１Ｒ遺伝子の間の領域ＩＴＲ領域、ＶＥＧＦ遺伝子、ＰＫ遺伝子、１０ｋＤａタンパク質をコードする遺伝子またはＰＫ遺伝子とＨＤ１Ｒ遺伝子の間の遺伝子間領域をＰＰＶにおける挿入部位として用いる場合、これらの挿入部位を含むＰＰＶゲノムの対応する領域を単離しなければならない。このために、ＰＰＶゲノムの対応する領域をクローン化する。２．２．１ＶＥＧＦ遺伝子のクローニングＶＥＧＦをコードする遺伝子をＰＰＶゲノム上に位置づけ、次にその隣接するゲノムセグメントと共に部分的にまたはその全体を単離する。このために、好ましくはＰＰＶを＃１に従って増やし、ゲノムを＃２．１．１に従って精製する。ａ．ＶＥＧＦ遺伝子を好ましくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅する。この反応のために必要である開始配列（プライマー）を配列表の配列番号１に示されるＶＥＧＦ遺伝子のＤＮＡ配列から得る。次に、好ましくは、得られる増幅産物をクローン化する。ｂ．ＶＥＧＦ遺伝子及びその隣接するゲノムセグメントを含む領域を好ましくはＰＰＶゲノムを断片化し、対応するゲノムフラグメントを単離し、クローニングすることにより得る。このために、好ましくは制限酵素ＨｉｎｄIIIを用いて、精製したウイルスのゲノムを＃２．１．２に記述したように切断する。ＶＥＧＦ遺伝子及びその隣接するゲノムセグメントを含むゲノムフラグメントを同定するために、好ましくは、酵素消化後に得られるゲノムフラグメントを電気泳動またはクロマトグラフィーの方法により分画する。アガロースまたはポリアクリルアミド中での電気泳動分画を ‐ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ１９８７−１９８８、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、１９８７． ‐ＡＰｒａｃｔｉｃａｌＧｕｉｄｅｔｏＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、Ｐｅｒｂａｌ、第２版、ＷｉｌｅｙＩｎｔｅｒｓｃｉｅｎｃｅ、１９８８ ‐ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、上記引用 ‐ＶｉｒｏｌｏｇｉｓｃｈｅＡｒｂｅｉｔｓｍｅｔｈｏｄｅｎ［ＰｒａｃｔｉｃａｌＭｅｔｈｏｄｓｉｎＶｉｒｏｌｏｇｙ］、第III巻、ＧｕｓｔａｖＦｉｓｃｈｅｒＶｅｒｌａｇ、１９８９に記述されている標準的な方法を用いて実施する。例えば、特定の核酸プローブでのハイブリダイゼーションによりＶＥＧＦ遺伝子及びその隣接する配列を保有するゲノムフラグメントを同定する。このために、分画したゲノムフラグメントをフィルターに移し、サザンブロット法に従ってＶＥＧＦに特異的な標識した核酸プローブでハイブリダイズさせる。ゲノムフラグメントの移行及びハイブリダイゼーションの方法をＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、上記引用中の「サザンブロッティング」に記述されているような標準的なプロトコールに従って実施することができる。プローブとして用いることができるオリゴヌクレオチドまたは核酸フラグメントを配列表の配列番号１から得ることができる。例えば、配列番号１により同定することができるＴａｑｌサブフラグメント（３６６ｂｐ）をハイブリダイゼーションプローブとして用いる。ＶＥＧＦ遺伝子及びその隣接するゲノムセグメントの一部または好ましくは全部を含むことが示されたゲノムフラグメントを単離し、クローン化する。例えば、電気溶出を用いるかまたは低融点アガロース法を用いることにより適切なゲノムフラグメントをゲルの適切な領域から電気泳動的に単離する。ＶＥＧＦ遺伝子をクローン化するために、上で調製したゲノムフラグメントをバクテリアまたは真核生物のベクター中に挿入する。最初はプラスミドまたはファージベクターが特に好ましい。ゲノムフラグメントを挿入するために、二本鎖のプラスミドまたはファージベクターＤＮＡ分子を挿入に適した末端が生じるように制限酵素で処理する。ｐＢＲ３２２及びその誘導体、例えばｐＳＰＴ１８／１９、ｐＡＴ１５３、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ１８／１９及びｐＳＰ６４／６５のような既知のプラスミドをプラスミドとして用いる。例えば、ファージラムダＺＡＰ及びファージラムダｇｔ１０／１１またはファージＭ１３ｍｐ１８／１９のようなファージラムダの既知の変種をファージベクターとして用いる。用いることができる制限酵素は、例えばＧｅｎｅ第９２巻（１９８９）ＥｌｓｅｖｉｅｒＳｃｉｅｎｃｅＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓＢＶＡｍｓｔｅｒｄａｍから既知である。挿入する過剰のＤＮＡフラグメントと制限酵素で処理したプラスミドまたはファージベクターを例えば５：１のおおよその比率で混合し、その後、この混合物をＤＮＡリガーゼで処理してフラグメントをベクターに連結する。プラスミドまたはファージを増やすために、連結混合物を原核または真核細胞、好ましくはバクテリア（例えば大腸菌株Ｋ１２及びその誘導体）中に導入し、後者は複製される。ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ、上記引用に記述されているようにバクテリアを形質転換し、選択する。好ましくはハイブリダイゼーション実験により、特に好ましくは配列分析により、外来ＤＮＡの同一性を確認する。場合によってはサブクローニングを実施する。２．２．２プロテインキナーゼ遺伝子のクローニングプロテインキナーゼをコードする遺伝子をＰＰＶゲノム上に位置づけ、次にその隣接するゲノムセグメントと共に部分的にまたはその全体を単離する。ＶＥＧＦ遺伝子のクローニングのために記述したように、ＰＰＶゲノムを断片化し（切断部位、図１を参照）、好ましくは続いてこれらのフラグメントをクローニングし、ＰＰＶゲノムの隣接するＤＮＡ配列と共にＰＫ遺伝子の一部または好ましくは全ＰＫ遺伝子を含むフラグメントまたはクローンを選択することにより、この領域を単離することができる。ＰＣＲのプライマーとしてまたはハイブリダイゼーションのプローブとして用いることができるＤＮＡ分子を配列表の配列番号２または配列番号９から得ることができる。場合によってはサブクローニングを実施する。２．２．３１０ｋＤａタンパク質をコードする遺伝子のクローニングＶＥＧＦ遺伝子及びＰＫ遺伝子に対して詳細に記述した（上記）方法を用いて１０ｋＤａタンパク質をコードする遺伝子をＰＰＶゲノム上に位置づけ、その隣接するＰＰＶゲノム配列と共に部分的にまたは好ましくはその全体を単離する。この場合、好ましくはＰＣＲ及び／またはクローニング並びに好適なクローンの同定及び選択により、１０ｋＤａタンパク質の遺伝子またはその一部を含むＰＰＶゲノムの領域を得る。文献番号８は、ＰＣＲのプライマーとしてまたはハイブリダイゼーションのプローブとして用いることができるＤＮＡ分子の詳細を与えている。場合によってはサブクローニングを実施する。２．２．４逆方向末端反復領域またはＰＫ遺伝子とＨＤＩＲ遺伝子の間に存在するゲノムセグメントのクローニングこの方法は、詳細に記述したＶＥＧＦ遺伝子のクローニング（上記）に相当する。適切な領域を単離するためにＰＣＲのプライマーとしてまたはハイブリダイゼーションのプローブとして用いることができるＤＮＡ分子は、配列表の配列番号４（ＩＴＲ領域）及び配列番号７（ＰＫ遺伝子とＨＤ１Ｒ遺伝子の間の領域）から明らかである。３．挿入プラスミドまたは欠失プラスミドの構築第２節に記述したように同定し、位置づけ、そしてクローン化するＰＰＶゲノムフラグメントに基づいて、ＰＰＶゲノム中に外来ＤＮＡを挿入するために用いることができる、いわゆる挿入プラスミドを調製する。挿入プラスミドは、ＰＰＶゲノムのセグメントが隣接した、ＰＰＶ中に挿入される外来ＤＮＡを保有する。挿入プラスミドを調製するためには様々な選択肢があり、以下のものを例としてここで挙げることができる。３．１２．１．４または２．２に記述したようにして得られるクローン化されたゲノムフラグメント中の唯一の制限酵素認識部位の同定または調製及び外来ＤＮＡの挿入１箇所だけに存在する、すなわち唯一の制限切断部位を例えば決定したＰＰＶヌクレオチド配列中に同定することができる（２．１．３を参照）。制限酵素の新しい唯一の切断部位を保有する合成により調製したオリゴヌクレオチドをこれらの唯一の制限部位中に組み込むことがきる。得られたプラスミドを先に記述したように増やし、選択する。また、ＰＰＶゲノムフラグメント中に新しい唯一の制限酵素認識部位を組み込むために、Ｊａｃｏｂｓ等（文献番号１２）により記述されたようにＰＣＲを用いることができる。同定し、そして／または調製した唯一の制限酵素認識部位を外来ＤＮＡをＰＰＶゲノム中に挿入するために用いる。外来ＤＮＡを既知の方法を用いて挿入する（文献番号１１）。３．２クローン化されたゲノムフラグメント中のゲノム配列の欠失及び外来ＤＮＡの挿入例えば、クローン化されたＰＰＶゲノムフラグメントを好ましくは１箇所より多い、特に好ましくは２箇所の認識部位を有する制限酵素で処理することにより、これらからサブフラグメントを除くことができる。酵素処理の後に、得られたフラグメントを上記のように例えば電気泳動的に分画し、単離し、そして適切なフラグメントをリガーゼ処理により再び一緒に連結する。得られたプラスミドを増やし、欠失プラスミドを選択する。代わりに、エンドヌクレアーゼ、例えば酵素Ｂａｌ３１でフラグメントを二方向に分解するために開始点としてＰＰＶゲノムフラグメント上の唯一の制限酵素認識部位を用いる。酵素が作用する時間により欠失の大きさを決めることができ、ゲル電気泳動によりこれを調べることができる。３．１（上記）に記述したように、新しく生じたフラグメントの末端に合成オリゴヌクレオチドを連結する。全ＰＰＶ集団のごくわずかな割合において、外来遺伝子がＰＰＶゲノム中に導入される。このために、組み換えＰＰＶを野生型ＰＰＶから分離するための選択系が必要である（文献番号１６）。大腸菌のグアニル−ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子に基づくｇｐｔ選択系を用いることが好ましい。真核細胞で発現されると、この遺伝子はプリン代謝のインヒビターであるマイコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃａｃｉｄ）に対する耐性を与える。組み換えベクターウイルスの構築におけその使用はしばしば記述されている（文献番号１６／番号１７を参照）。４．１ないし１２による組み換えＰＰＶの構築ａ．好適な宿主細胞に挿入または欠失プラスミドのＤＮＡをトランスフェクトし、同時にＰＰＶを感染させるｂ．好適な宿主細胞に挿入または欠失プラスミドのＤＮＡをトランスフェクトし、次にＰＰＶを感染させるｃ．好適な宿主細胞にＰＰＶを感染させ、次に挿入または欠失プラスミドのＤＮＡをトランスフェクトすることにより外来ＤＮＡをＰＰＶゲノム中に挿入する。この目的のために適している処置方法は既知である。リン酸カルシウム技術、リポソームが媒介するトランスフェクションまたはエレクトロポレーションのような既知の方法を用いてトランスフェクションを実施することができる（文献番号１８を参照）。１．ＰＰＶでの感染：外来ＤＮＡを含んでいるＰＰＶを調製するためには、十分なウイルス増殖及び効率のよいトランスフェクションが可能である細胞培養物、例えば永久ウシ腎臓細胞系ＢＫ−ＫＬ−３Ａが好ましい。２．挿入または欠失プラスミドＤＮＡの調製先に記述した方法により得られ、そして挿入または欠失プラスミドを保有する形質転換細胞、例えばバクテリアを増やし、これらの細胞から既知の方法でプラスミドを単離し、さらなる精製に供する。例えば、ＣｓＣｌ等の密度勾配中の等密度遠心法により、または市販されているシリカ粒子でのアフィニティー精製により精製を実施する。３．トランスフェクション好ましくは、精製した環状または直鎖状プラスミドＤＮＡをトランスフェクションのために用いる。例えば、第２項（上記）に示したように精製を実施する。４．トランスフェクトされ、且つ感染した細胞の培養上記の方法を用いて細胞を培養する。細胞変性効果が現れると培養培地を取り出し、場合によっては遠心分離または濾過により細胞屑を除き、場合によっては保存し、そしてまたウイルスの単一プラーク精製のための常法を用いて整える。組み換えＰＰＶを調製する場合、以下の方法を用いる。融合するまで生育したＢＫ−ＫＬ−３Ａ細胞を０．００１から５まで、好ましくは０．１のＭＯＩ（感染多重度）である感染量で感染させる。２時間後に、ＣａＰＯ₄−グリセロールショック法を用いるか、またはトランスフェクションキット（ＤＯＳＰＥＲ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ-Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を製造業者の説明書に従って用いて、例えば、プラスミドｐＭＴ−１０のＤＮＡ（２−１０μ ｇ）で感染細胞をトランスフェクトする。次に、これらの細胞培養物を培地と共に３７℃で５％ＣＯ₂大気下で３から６日までの間ｃｐｅまたはプラーク形成が肉眼で見えるようになるまでインキュベートする。挿入した外来ＤＮＡにより、ａ．例えばＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーションを用いて外来ＤＮＡを検出するｂ．ＰＣＲを用いて外来ＤＮＡを増幅するｃ．組み換えウイルスを用いて外来ＤＮＡを発現することで組み換えＰＰＶを同定する。ａ．に関して、このために、当該ウイルスからＤＮＡを単離し、そして挿入した外来ＤＮＡと少なくとも部分的に同一である核酸を用いてハイブリダイズさせる。好ましくは、単一プラーク精製し、そして組み換え体として同定したＰＰＶを外来ＤＮＡの存在及び／または発現に関してもう一度調べる。外来ＤＮＡを安定に含み、且つ／または発現する組み換えＰＰＶがさらなる用途のために使用できる。ｃ．に関して、例えば、細胞にウイスルを感染させ、次に外来ＤＮＡによりコードされるタンパク質に対する特異的な抗体を用いる免疫蛍光分析を実施するか、または感染した細胞のライセートを用いて外来ＤＮＡによりコードされるタンパク質に対する抗体を用いる免疫沈降もしくはウェスタンブロッティングを実施することにより、タンパク質レベルで外来ＤＮＡの発現を検出することができる。特定の転写物を同定することによりＲＮＡレベルで外来ＤＮＡの発現を検出することができる。このために、ウイルスが感染した細胞からＲＮＡを単離し、挿入した外来ＤＮＡと少なくとも部分的に同一であるＤＮＡプローブを用いてハイブリダイズさせる。実施例以下の実施例に、同種起源及び異種起源の遺伝子またはそれらの一部の挿入及び発現のために適しているＰＰＶゲノムの領域を記述する。好適なゲノムフラグメントは、ＰＰＶオビス株Ｄ１７０１（及びその各誘導体）のＨｉｎｄIIIフラグメントＩに含まれている（配列表の配列番号８及び配列番号１２）。１．ＨｉｎｄIIIフラグメントＩのクローニング精製したウイルスＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断した後、得られたＤＮＡフラグメントをアガロースゲル電気泳動で分離し、約５．６ｋｂｐの大きさであるフラグメントＩを切り出し、Ｑｉａｅｘ^R法（商標）（Ｑｉａｇｅｎ）を用いて単離し、精製した。標準的な技術（Ｍａｎｉａｔｉｓ等）を用いて、このＤＮＡフラグメントをＨｉｎｄIIIで切断してＣＩＰ（子ウシ腸ホスファターゼ）で処理したベクタープラスミドｐＳＰＴ１８（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）中にクローン化した。得られた組み換えプラスミド、ｐＯＲＦ−１及びｐＯＲＦ−２はインサートの方向のみが異なる。制限地図の構築により、図１に示されるようなさらなるサブクローニングを実施することができた。全ての組み換えプラスミドＤＮＡの同一性及びウイルス起源を確かめるために、サザンブロットハイブリダイゼーションを用いてこれらを制限酵素で消化したウイルスまたはプラスミドのＤＮＡに関して調べた。２．ＤＮＡシークエンシング異なる組み換えプラスミドの二本鎖ＤＮＡ並びにベクタープラスミドｐＳＰＴ１８のクローニング部位の２つの末端に結合するＳＰ−６特異的及びＴ７特異的プライマーを用いてＤＮＡシークエンシングを実施した。サンガーのジデオキシチェインターミネーション法を³⁵Ｓ−［α］−ｄＡＴＰ及びＴ７−ＤＮＡポリメラーゼの存在下で製造業者（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｂｉｏｔｅｃｈ）の推奨に従って実施した。得られたＤＮＡ配列に合わせて非常に多数のオリゴヌクレオチドを合成し、次にＨｉｎｄIIIフラグメントＩの両鎖をシークエンシングするために用いた。ウイルスＤＮＡインサートの比較的高いＧ＋Ｃ含有量（６４．７８％）によるシークエンシングの誤りまたはバンドの縮重を分離するために７−デアザ（Ｄｅａｚａ）−ＧＴＰを用い、場合によっては、シークエンシング生成物をホルムアミドを含有する変性ポリアクリルアミドゲルで分離した。３．可能性のある遺伝子の同定得られたＤＮＡ配列（配列表の配列番号８及び配列番号１２）のコンピューター補助分析によりいくつかの可能性のある読み枠（ＯＲＦ）が明らかになった。これらのＯＲＦから得られるアミノ酸配列を遺伝子相同性検索（例えばＧＣＧプログラム）に用いた。その結果、以下の遺伝子との顕著なアミノ酸の相同性が検出された（図１も参照）。３．１異なる哺乳類種（例えばマウス、ラット、モルモット、ウシ及びヒト）の血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）並びにＰＰＶ株ＮＺ−２及びＮＺ−７で最近記述されたＶＥＧＦ遺伝子相同物（文献番号６）ともアミノ酸の相同性を有するＯＲＦが見いだされた（３６．１ないし３８．３％の同一性；５２．８ないし５８．６％の類似性）。各種オルトポックスウイルスのような他のポックスウイルスは、対応する遺伝子相同性を有することが知られていない。ＶＥＧＦと称するこのＯＲＦは３９９ヌクレオチドを包含し、１３２アミノ酸を含んで１４．７７ｋＤａの計算された分子量を有するポリペプチドをコードする。ノーザンブロットハイブリダイゼーション、ＲＮＡ保護実験及びプライマー伸長試験を用いた全ＲＮＡまたはオリゴ（ｄｔ）で選別したＲＮＡに対する転写分析により、ＶＥＧＦが感染後（ｐ．ｉ．）約２時間から初期遺伝子として発現されることが確かめられた。特定のｍＲＮＡが、ワクシニアウイルス初期遺伝子のプロモーターに典型的な共通モチーフの重要な領域と１００％の相同性を示す配列のすぐ下流で始まり、４２２から４２５塩基までから成ることが見いだされた。ＶＥＧＦｍＲＮＡの３’末端は、例えばワクシニアウイルス遺伝子の初期転写物が共有する共通配列中に位置づけられた。このｍＲＮＡの大きさはノーザンブロットハイブリダイゼーションにより約５００塩基であると概算され、これは約１００塩基の長さを有するポリ（Ａ）セグメントを示す。３．２いくつかのオルトポックスウイルス（例えばワクシニアウイルス、痘瘡ウイルス（ｖａｒｉｏｌａｖｉｒｕｓ）またはショープ線維腫ウイルス（Ｓｈｏｐｅ−ｆｉｂｒｏｍａｖｉｒｕｓ））に存在し、Ｆ１０Ｌとして知られている対応する遺伝子と相同性を有するプロテインキナーゼ（ＰＫ）の可能性のあるものをコードする別のＯＲＦが見いだされた。この遺伝子相同物は、ＰＰＶ株Ｄ１７０１の感染サイクルの後期に転写される（ｐ．ｉ．１２から１６時間まで）。転写開始点は、ワクシニアウイルス後期遺伝子の既知のプロモーターと高度の相同性を示す領域の少し下流に位置する。３．３既知の遺伝子配列といかなる顕著な相同性も現在まで示していない別の可能なＯＲＦが見いだされた。特に興味深いのは、ＨＤ１Ｒ遺伝子と称する遺伝子の可能性のあるものである（図１）。上記のような分析により、約１．６ｋｂの大きさを有する特定の初期ｍＲＮＡの転写が示された。３．４最後に、Ｆ１０Ｌの３’末端及びＶＥＧＦの５’末端と重なるＯＲＦがコンピューターにより見いだされた（Ｆ９Ｌ、図１）。配列比較により、ワクシニアウイルスＦ９Ｌ遺伝子との相同性が示された。３．５ｏｒｆ株ＮＺ−２及びＮＺ−７の既知のＤＮＡ配列と比較することにより、Ｄ１７０１ゲノムのいわゆるＩＴＲ領域の始まりをＨｉｎｄIIIフラグメントＩのヌクレオチド位置１６１１に定めることが可能であった。ＩＴＲ領域は、ポックスウイルスゲノムの末端に現れ、且つゲノムのもう一方の末端で逆方向に同様に存在する配列領域であり、それ故、逆方向反復領域（ＩＴＲ）と呼ばれる（配列表配列番号４を参照）。配列比較の結果は、ｐＯＲＦ−１中にクローン化したＤ１７０１ＨｉｎｄIIIフラグメントＩのゲノムにおける位置決定の実験と一致する。このフラグメント及びおそらく同一であるＨｉｎｄIIIフラグメントＨの地図を図２に示す。これから、Ｄ１７０１ゲノムのＩＴＲは約２．６ｋｂｐを包含すると結論づけることができる。Ｄ１７０１ＶＥＧＦｍＲＮＡの３’末端を決定する実験により、少なくとも１種のさらなるウイルス特異的ＲＮＡが、ＩＴＲに移ってから約４０及び２２０ｂｐの間のＩＴＲ中で始まることが示された。ＮＺ−２とのアミノ酸の相同性のために、対応する遺伝子をＯＲＦ３と称した（図１）。ＯＲＦ３ｍＲＮＡの推定上の５’末端の前にはポックスウイルス初期プロモーターに典型的な共通配列がある。これまでのところ他の遺伝子との相同性を見いだすことはできない。４．ＨｉｎｄIIIフラグメントＩ中へのＤＮＡ配列の導入同種起源または異種起源のＤＮＡ配列を導入するために記述した（プラスミドｐＯＲＦ−１及びｐＯＲＦ−２にクローン化された）ＨｉｎｄIII ＤＮＡフラグメントを用いることができるかを調べた。以下に、この目標を達成するために３つの異なる方法を用いた。１１Ｋワクシニアウイルスプロモーターの制御下に大腸菌からの機能的ＬａｃＺ遺伝子を含むプラスミドｐＧＳＲＺを以下の実施例のために構築した。この目的のために、プラスミドｐＵＣIIＬＺ（文献番号７を参照）のＤＮＡの関係する部分を単離し、プラスミドｐＳＰＴ１８中にクローン化した。ｐＧＳＲＺから３．２ｋｂＳｍａｌ／ＳａｌＩフラグメントを単離することにより、この機能的な１１Ｋ／ＬａｃＺ遺伝子の組み合わせ（以下、ＬａｃＺカセットと称する）を得ることができる（図７）。選択カセットの構築図７に示すように、プラスミドｐＧＳＲＺ（ワクシニアウイルスプロモーターＰ_11Kの制御下にＬａｃＺ遺伝子を含む）、ｐＭＴ−１（ＰＰＶＶＥＧＦプロモーターを含む）及びｐＭＴ５（大腸菌ｇｐｔ遺伝子を含む）を用いて様々ないわゆる選択カセットを構築した。ＶＥＧＦプロモーター（Ｐ_VEGF）の配列に相当する合成の相補的オリゴヌクレオチドを調製し、ｐＳＰＴ１８のＳｍａＩ切断部位中に挿入した（ｐＭＴ−１）。次にＢａｍＨＩ切断を用いて、（ｐＧＳＲＺからのＢａｍＨＩフラグメントをｐＳＰＴ１８に挿入することにより得られた）ｐ１８ＺからＬａｃＺ遺伝子を、またはｐＭＴ−５からｇｐｔ遺伝子をそれぞれ取り出し、次にｐＭＴ−１にそれらを挿入することによりプラスミドｐＭＴ−２及びｐＭＴ−４を調製した（図７）。機能的ｇｐｔ遺伝子をＧＰＴプラスミドｐＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｂｉｏｔｅｃｈ）からＰＣＲを用いて増幅し、次にいわゆるＴＡクローニングを製造業者（ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＩｎｃ．）の説明書に従って用いてベクターｐＣＲII中にクローン化した。続いて、図７に図式的に示されるように、１１Ｋプロモーター及び／またはＰ_VEGF の制御下にＬａｚＺ遺伝子またはｇｐｔ遺伝子をそれぞれ示した組み合わせ及び方向で発現する二重選択カセットを構築することが可能であった。実施例ＸＸ（ＬａｃＺ−ＶＥＧＦ欠失）またはＹＹ（遺伝子間−Ｂａ１３１）に従って、適切な制限酵素切断及び単離後に、これらの選択カセットを異なるＰＰＶｏｒｆＤＮＡプラスミド中に挿入することができる。ＰＰＶＤ１７０１ＶＥＧＦ遺伝子の３１２ｂｐの欠失を示す記述したプラスミドｐｄＶ−５００中に二重選択カセットを挿入した後にプラスミドｐＭＴ−１０が構築された。この構築により、欠失により取り除かれたＶＥＧＦＯＲＦの場所に機能的なｌａｃＺ及びｇｐｔ遺伝子が挿入された。一時的発現試験の後に、ＰＰＶＤ１７０１が感染した細胞においてＬａｃＺ遺伝子の活性を示すことが可能であり（示さない）、従って、続いてｇｐｔ及びｌａｃＺを発現しているＤ１７０１のＶＥＧＦ欠失突然変異体の選択を実施した。４．１遺伝子間の非コーディング領域中への挿入遺伝子間の非コーディング部分に位置する新しい唯一の制限部位を同定するかまたは作製した。次に、機能的で検出可能な遺伝子産物（例えば大腸菌ＬａｃＺ遺伝子）またはそれらの一部をコードする外来ＤＮＡ配列を挿入するためにこれらの部位を用いる。実施例４．１．１プラスミドｐＯＲＦ−ＰＢ（図１）は、プロテインキナーゼ（Ｆ１０Ｌ）及びＨＤ１Ｒ遺伝子間に位置する単一のＮｒｕＩ切断部位を含む。ｐＯＲＦ−ＰＢをこの制限酵素で直鎖状にした後、（平滑化反応後）それにＬａｃＺカセットを平滑末端ライゲーションにより連結した。機能的なＬａｃＺ遺伝子を含む組み換えプラスミドを例えばＢｇｌIIでの切断後に選択し、ＬａｃＺ特異的なプローブを用いるサザンブロットハイブリダイゼーション及びＬａｃＺ／ＰＰＶＤＮＡの変わり目の部分的シークエンシングにより正しい挿入を示した。実施例４．１．２上の実施例に記述したものと同じ方法をＶＥＧＦ遺伝子の下流（ＢｓｔＥII部位での切断、図１）及びＩＴＲ領域中の遺伝子の可能性のあるＯＲＦ３（ｐＳＰＴ１８クローニング部位中のＸｂａＩ部位の切断を防ぐためにＸｂａＩでの部分分解）に用いた。実施例４．１．３クローン化されたＰＰＶＤＮＡフラグメントのあらゆる所望する位置に新しい唯一の制限部位を導入するためにＰＣＲ突然変異生成の技術を用いることができる（図５、文献番号１２を参照）。この目的のために、プライマー対Ｅ１＋ＥＶ２（ＰＣＲＡ）及びＥＶ１＋ＸＢ（ＰＣＲＢ）をそれぞれ用いて２つのＰＣＲ反応を別個に実施する。全てのプライマーは、定められた配列の位置でＰＰＶＤＮＡ配列と同一である２５ヌクレオチドから成る。プライマーＸＢは例えばＸｂａＩ部位（図１）のまわりの本物の配列であるが、プライマーＥ１の５’末端には新しいＥｃｏＲＩ部位を導入し、（互いに相補的である）プライマーＥＶ１及びＥＶ２には新しいＥｃｏＲＶ部位を導入した。ＬａｃＺカセットを導入するために選んだ位置に、ｐＯＲＦ−１またはｐＯＲＦ−２の全配列中には本来存在しないＥｃｏＲＶ部位を挿入した。反応Ａ及びＢから得られるＰＣＲ産物を精製し、一本鎖に変性し、再会合条件下で一緒に混合し、次に最後のＰＣＲ反応、すなわち、ＰＣＲＣにこれらを用いる。この実施例では、ｐＯＲＦ−１の左側の７９３ｂｐを伸長するために今度はＥ１及びＸＢをプライマーとして用いる。ゲル単離及び精製後に、反応Ｃから得られるＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで切断し、次にＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで切断したプラスミドｐＯＲＦ−ＸＢに連結する。その結果、プラスミドｐＯＲＦ−１ＥＶ（図５）は所望する位置にＥｃｏＲＶ制限部位を含み、次にこれを直鎖状にしてＬａｃＺカセットに連結するために用いることができる。さらに、特定の塩基変化または単一塩基の欠失を含むミスマッチプライマーをこの実施例に記述した方法に用いて、ウイルスＤＮＡ配列中のあらゆる所望する位置に例えば翻訳終止コドンまたはアミノ酸欠失を作製することができる。４．２ｏｒｆ配列の欠失のない遺伝子内挿入記述したＯＲＦのいずれかのコーディング配列中に、選択した遺伝子中に１箇所だけ存在する制限部位で切断した後に、新しいまたはさらなる配列を導入することができる。実施例４．２．１プラスミドｐＯＲＦ−１を直鎖状にするために、Ｆ１０Ｌ遺伝子相同物の右側の部分に位置する唯一のＸｃｍＩ部位を用いた。ＬａｃＺカセット及び切断したｐＯＲＦ−１ＤＮＡの両方をＴ４ＤＮＡポリメラーゼまたはＫｌｅｎｏｗＤＮＡポリメラーゼを用いて平滑末端にし、次にこれらを連結し、そして次に形質転換のためにコンピテント大腸菌バクテリア（ＤＨαＦ’）を用いた。得られたバクテリアコロニーをＬａｃＺ特異的なプローブを用いるコロニーフィルターハイブリダイゼーションにより陽性の組み換えプラスミドに関して調べ、対応するプラスミドＤＮＡを制限酵素で切断した。実施例４．２．２ＶＥＧＦをコードする領域は単一のＳｔｙＩ部位を含み、これを上記のようにＬａｃＺカセットを挿入するために用いた。４．３ウイルス配列の検出以下の実施例は、コーディング（遺伝子内欠失）及び非コーディング（遺伝子間欠失）領域の両方の除去を記述する。実施例４．３．１欠失したウイルス配列を外来遺伝子またはこれらの遺伝子の一部を挿入することで置き換えるために、制限酵素を用いてＨｉｎｄIII ＤＮＡフラグメントＩの特定の部分を取り除く。プラスミドｐＯＲＦ−ＰＡを（ＩＴＲ領域中の位置の、図１）制限酵素ＮｒｕＩで切断することによりこれを実施し、その結果、３９６ｂｐフラグメントが除かれた。平滑化反応後に、ＬａｃＺカセットを上記のように連結した。図３に、ｐＯＲＦ−ＰＡからの３９６ｂｐフラグメントの欠失及びＬａｃＺカセットの挿入を図式的に示す。図３及び４に、このようにして構築され、そしてｐＯＲＦ−ＰＡに由来する欠失／挿入プラスミドｐＣＥ４及びｐＣＥ９を示す。実施例４．３．２図６に図式的に略述されるように、エンドヌクレアーゼＢａｌ３１の影響下で配列の二方向の欠失を実施するために開始点としてＨｉｎｄIII ＤＮＡフラグメント中の個々の制限部位を用いた。ＶＥＧＦ及びプロテインキナーゼＦ１０Ｌをそれぞれコードする遺伝子を開くために、プラスミドｐＯＲＦ−ＰＡ及びプラスミドｐＯＲＦ−１またはｐＯＲＦ−ＸＢのそれぞれの場合に、酵素ＳｔｙＩ及びＸｃｍＩを制限分解のために用いた（図１及び６）。エンドヌクレアーゼＢａｌ３１を添加した後、２分毎に反応物からアリコートを取り出し、次に反応を停止した。これらの定時試料の例えば制限酵素ＢｇｌＩでの切断及びそれに続くゲル電気泳動により、Ｂｇｌ３１で除かれたＤＮＡセグメントの大きさを概算することが可能であった。次に、好適な時点の試料の混合物を用いて平滑化反応によりＤＮＡ末端を閉じた。次に、新しい唯一のＳｍａＩ、ＳａｌＩ及びＥｃｏＲＶ制限部位を構成している２つの相補的オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、得られた二本鎖のプライマー分子（ＥｃｏＲＶリンカーと称する）を平滑末端化したＢｇｌ３１生成物に連結した。形質転換されたバクテリアを得た後、プラスミドＤＮＡを単離し、ＰＰＶＨｉｎｄIIIフラグメントＩのＤＮＡ配列中にはいかなる認識部位も持たないＥｃｏＲＶで切断した。それ故、ＥｃｏＲＶ部位を有する全てのプラスミドＤＮＡは挿入したリンカー配列を含み、次にこれを新しいＥｃｏＲＶ部位中に平滑末端化したＬａｃＺカセットを連結するために用いた。一本鎖のＥｃｏＲＶリンカー及び適当なＬａｃＺ遺伝子特異的なプライマーを用いるシークエンシングにより、得られた各組み換えプラスミドＤＮＡ中に作製されたＤＮＡ欠失の正確な大きさを決定することが可能であった。５．他のパラポックスウイルスのＶＥＧＦ遺伝子の検出及び同定Ｄ１７０１でＶＥＧＦをコードするＤＮＡ領域が分かっているので、大きく異なる制限特性を有する可能性のある他のパラポックスウイルス株でこの遺伝子を同定するための特定のＤＮＡプローブ及びＰＣＲプライマーを調製することが可能である。この目的のために以下の可能性を調べた。すなわち、（ｉ）Ｄ１７０１ＶＥＧＦ遺伝子の中心部分に相当するｐＯＲＦ−ＰＡのＴａｑＩサブフラグメント（３６６ｂｐ）をハイブリダイゼーションプローブとして単離する；（ii ）適当な合成プライマーを用いて完全なＶＥＧＦＯＲＦを増幅し、次にそのＰＣＲ産物をプラスミド中にクローニングする；（iii）ＶＥＧＦ遺伝子の異なる部分から成るプライマーを鋳型としてＰＰＶＤＮＡの存在下でＰＣＲに用い、そしてこれらを特定のハイブリダイゼーションプローブとしても用いた。放射性標識した後に、これらのプローブをパラポックスオビス、パラポックスボビス１（ウシ丘疹状口内炎；ＢＰＳ）及びパラポックスボビス２（搾乳者結節）の様々な単離物及び株のゲノムＤＮＡとのサザン及びドット／スポットブロットハイブリダイゼーションにうまく用いた。サザンブロットハイブリダイゼーションは特定のＰＰＶＤＮＡフラグメントでＶＥＧＦに陽性のシグナルを示し、これにより各種ＰＰＶのＶＥＧＦ遺伝子をさらに詳細に位置づけることが可能になる。さらに、他のＰＰＶ株の可能性のあるＶＥＧＦ遺伝子の発現を調べるために、ノーザンブロットハイブリダイゼーションのような比較ＲＮＡ分析に同じプローブを用いることができる。６．Ｄ１７０１組み換え体の製造融合するまで生育したＢＫ−ＫＬ−３Ａ細胞を０．１のｍｏｉ（感染多重度）である感染量で感染させた。２時間後に、ＣａＰｏ₄−グリセロールショック法を用いるか、またはトランスフェクションキット（ＤＯＳＰＥＲ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｎ）を製造業者の説明書に従って用いて、感染した細胞を例えばプラスミドｐＭＴ−１０のＤＮＡ（２から１０μｇまで）でトランスフェクトした。次に、これらの細胞培養物を選択培地（ＨＡＴ培地＋ＭＰＡマイコフェノール酸−キサンチン−５％ＦＣＳ）を用いて３７℃で３から６日までの間５％ＣＯ₂大気下でｃｐｅまたはプラーク形成が肉眼で見えるようになるまでインキュベートした。ウイルスが誘導するｃｐｅの程度により、（ａ）細胞ライセートを得て、希釈シリーズを調製し、プラーク試験をＢＫ−ＫＬ−３Ａ細胞で実施した。ＬａｃＺを発現し、ＭＰＡに耐性であるＤ１７０１組み換え体を含む青色プラークを同定するために、添加したアガロース培地混合物は０．３ｍｇ／ｍｌのＢｌｕｏ−Ｇａｌ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ）を含んだ。（ｂ）個々のプラークが生じた後に、（ａ）に記述したアガロース／ＢｌｕｏＧａｌ混合物を添加し、青色の個々のプラークを選んだ。以下に記述するように、（ａ）または（ｂ）で得られるウイルスをＢＫ−ＫＬ −３Ａに感染させるために用い、１００％均質な組み換えウイルス集団が得られるまで少なくとも２回のさらなるプラーク力価測定及び精製に供する。７．ＶＥＧＦプロモーター３．１章に略述したように、Ｄ１７０１のＶＥＧＦ遺伝子は初期遺伝子であり、Ｄ１７０１ウイルスが感染した細胞で感染後２ないし４時間から感染の比較的後期まで特定のｍＲＮＡが大量に転写される。このために、同定したＤ１７０１ＶＥＧＦプロモーター領域は、組み換えＰＰＶウイルスで外来遺伝子またはこれらの遺伝子の一部の発現を制御するために非常に有用であるはずである。ＶＥＧＦプロモーターを包含する配列（３５ないし４０ヌクレオチド；配列表の配列番号６）を（ｉ）プロモーター領域に隣接する適切なプライマーを用いるＰＣＲ、（ii）適切なＤＮＡ断片のサブクローニングまたは（iii）プロモーター配列をオリゴヌクレオチドとして合成することにより単離することができる。ＶＥＧＦプロモーターを目的のあらゆる遺伝子またはＤＮＡ配列に連結した後、得られた遺伝子カセットを先の章に記述したあらゆる方法に従って組み換えＰＰＶを調製するために用いることができる。８．１０ｋＤａ遺伝子ＰＰＶ株ＮＺ−２の１０ｋＤａ遺伝子の公表されたＤＮＡ配列（文献番号８）に基づいてＰＰＶ１０ｋＤａ遺伝子を検出するための特異的ＰＣＲを確立した。合成で調製したプライマー１０Ｋ−ｕｐ（５−ＣＡＡＴＡＴＧＧＡＴＧＡＡＡＡＴＧＡＣＧＧ−３）及び１０ｋ−ｄｏｗｎ（５−ＣＡＧＡＣＧＧＣＡＡＣＡＣＡＧＣＧ−３）を用いてＰＣＲを実施した後に、２９７塩基対の大きさの特定の産物を増幅することに成功した。続いてクローニング（ＴＡクローニングキット、ＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎＩｎｃ．）により、２９７ｂｐのＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩフラグメントとして含むプラスミドｐＪＳ−１が得られた。ｐＪＳ−１の挿入の２本のＤＮＡ鎖のＤＮＡシークエンシングにより、１０ｋＤａに特異的な配列が存在することが示された。この配列によると、Ｄ１７０１は９１アミノ酸の１０ｋＤａタンパク質をコードし、これはＮＺ−２ＰＰＶ株と９３．３％のアミノ酸の同一性及び９６．７％のアミノ酸の類似性を有する。放射性標識したｐＪＳ−１でのサザンブロットハイブリダイゼーションを用いて、１０ｋＤａ遺伝子をＤ１７０１ゲノムのＥｃｏＲＩフラグメントＥ（４．２５ｋｂｐ）に位置づけた。従って、この遺伝子は、ＮＺ−２の場合でのように、ウイルスゲノムの右側の部分に位置し、ＨｉｎｄIIIフラグメントＫ及びＧの切断部位を含む（図２）。１０ｋＤａ遺伝子が（原則として先に記述したように）挿入または欠失を含むプラスミドを調製するために、４．２５ｋｂｐのＤ１７０１ＥｃｏＲＩフラグメントＥを含むプラスミドｐＤＥ−Ｅ１及びｐＲＺ−Ｅ１を用いる。Ｄ１７０１１０ｋＤａ遺伝子のＮ末端セグメントのＨｉｎｄIII切断部位（フラグメントＫ−Ｇ）（（＃１２４−＃１２９）配列番号１１）を外来ＤＮＡを直接挿入するため及び１０ｋＤａ遺伝子を除くため（Ｂａｌ３１を用いた二方向消化を参照）の両方に用いることができる。後者の構築物では、もう一つのＨｉｎｄIII 切断部位（ベクタープラスミドｐＳＰＴ１８のマルチクローニング部位）をプラスミドｐＤＥ−Ｅ１から取り除いた。このために、ｐＳＰＴ１８ＤＮＡをＨｉｎｄIIIで切断し、その後、Ｋｌｅｎｏｗで処理することによりＨｉｎｄIII切断部位を壊し、プラスミドを再連結した。次に、この新しいベクタープラスミドｐＳＰＴ１８ｄＨのＥｃｏＲＩ制限部位に４．２５ｋｂｐのＤ１７０１ＥｃｏＲＩフラグメントＥをクローン化した。得られたプラスミドのｐＲＺ−Ｅ１（図８）は今や１０ｋＤａ遺伝子中に唯一のＨｉｎｄIII切断部位を有し、この部位によりさらに簡単な操作が可能となる。放射性標識したプローブとしてｐＤＥ−Ｅ１及びｐＪＳ−１を用いるサザンブロットハイブリダイゼーション並びにＰＣＲ研究も、異なるＰＰＶボビス１株のゲノムがいかなる１０ｋＤａ特異的な配列も含まないことを示す。これは、１０ｋＤａＰＰＶ遺伝子が必須ではないことを配列番号１本出願の配列番号１は、ＰＰＶＤ１７０１株のＨｉｎｄIIIフラグメントＩ上に位置するＶＥＧＦ遺伝子を示す。さらなる情報：初期プロモーター：ヌクレオチド５０ないし６４ｍＲＮＡ開始：ヌクレオチド７８または８０ｍＲＮＡ終止：ヌクレオチド４９８ないし５００翻訳開始：ヌクレオチド９２ないし９４翻訳終止：ヌクレオチド４８８ないし４９０配列番号２本出願の配列番号２は、ＰＰＶＤ１７０１株のＨｉｎｄIIIフラグメントＩ上に位置するプロテインキナーゼ遺伝子Ｆ１０Ｌ（バージョン１）を示す。さらなる情報：後期プロモーター：ヌクレオチド４８ないし６６ｍＲＮＡ開始：ヌクレオチド７４ないし７８翻訳開始：ヌクレオチド９４ないし９６翻訳終止：ヌクレオチド１７３８ないし１７４０配列番号３本出願の配列番号３は、ＰＰＶＤ１７０１株のＨｉｎｄIIIフラグメントＩ上に位置するＨＤ１Ｒ遺伝子セグメントを示す。配列番号４本出願の配列番号４は、ＰＰＶＤ１７０１株のＨｉｎｄIIIフラグメントＩ上に位置するＩＴＲ領域及びこの領域中に見いだされるＯＲＦ３遺伝子を示す。さらなる情報：ＩＴＲ領域の始まり：ヌクレオチド７初期プロモーター：ヌクレオチド１８ないし３３ＯＲＦ３ｍＲＮＡ開始：ヌクレオチド４０ないし４１ＯＲＦ３ｍＲＮＡ終止：ヌクレオチド６７３ないし６７９ＯＲＦ３翻訳開始：ヌクレオチド１１１ないし１１３ＯＲＦ３翻訳終止：ヌクレオチド５６２ないし５６４配列番号５本出願の配列番号５は、ＰＰＶＤ１７０１株のＨｉｎｄIIIフラグメントＩ上に位置するＦ９Ｌ遺伝子相同物（バージョン１）を示す。さらなる情報：開始コドン：ヌクレオチド４８ないし５０終止コドン：ヌクレオチド８６１ないし８６３配列番号６本出願の配列番号６は、ＰＰＶＤ１７０１株のＨｉｎｄIIIフラグメントＩ上に位置するＶＥＧＦプロモーター領域を示す。配列番号７本出願の配列番号７は、ＨＤ１Ｒ及びＰＫＦ１０Ｌ遺伝子間に位置し、且つＰＰＶＤ１７０１株のＨｉｎｄIIIフラグメントＩ上に位置する遺伝子間領域を示す。推定上のＨＤ１Ｒ翻訳終止：ヌクレオチド２５ないし２７ＰＫＦ１０Ｌ翻訳開始：ヌクレオチド２２３ないし２２５配列番号８本出願の配列番号８は、ＰＰＶＤ１７０１株のＨｉｎｄIIIフラグメントＩ（バージョン１）の完全なヌクレオチド配列を示す。配列番号９本出願の配列番号９は、ＰＰＶＤ１７０１株のＨｉｎｄIIIフラグメントＩ上に位置するプロテインキナーゼＦ１０Ｌ遺伝子のバージョン２を示す。さらなる情報：後期プロモーター：ヌクレオチド４８ないし６６ＲＮＡ開始シグナル：ヌクレオチド７２ないし８０ｍＲＮＡ開始：ヌクレオチド７４ないし７８翻訳開始：ヌクレオチド９４ないし９６翻訳終止：ヌクレオチド１５８５ないし１５８８配列番号１０本出願の配列番号１０は、ＰＰＶＤ１７０１株のＨｉｎｄIIIフラグメントＩ上に位置するＦ９Ｌ遺伝子相同物のバージョン２を示す。さらなる情報：翻訳開始：ヌクレオチド５０ないし５２翻訳終止：ヌクレオチド７２２ないし７２４配列番号１１本出願の配列番号１１は、ＰＰＶＤ１７０１株のＥｃｏＲＩフラグメントＥ上に位置する１０ｋＤａ遺伝子を示す。さらなる情報：翻訳開始：ヌクレオチド５ないし７翻訳終止：ヌクレオチド２７５ないし２７７配列番号１２本出願の配列番号１２は、ＰＰＶＤ１７０１株のＨｉｎｄIIIフラグメントＩのバージョン２の完全なヌクレオチド配列を示す。配列番号１３本出願の配列番号１３は、ＰＰＶＤ１７０１株のＨｉｎｄIIIフラグメントＩ上に位置するプロテインキナーゼＦ１０Ｌ遺伝子のバージョン３を示す。さらなる情報：後期プロモーター：ヌクレオチド４８ないし６６ＲＮＡ開始シグナル：ヌクレオチド７２ないし８０ｍＲＮＡ開始：ヌクレオチド７４ないし７８翻訳開始：ヌクレオチド９４ないし９６翻訳終止：ヌクレオチド１５８５ないし１５８８配列番号１４配列番号１４は、（配列番号１３から推定される）ＰＰＶＤ１７０１プロテインキナーゼＦ１０Ｌ相同物のアミノ酸配列を示す。配列番号１５配列番号１５は、（配列番号１から推定される）ＰＰＶＤ１７０１ＶＥＧＦ相同物のアミノ酸配列を示す。配列番号１６配列番号１６は、（配列番号１０から推定される）ＰＰＶＤ１７０１Ｆ９Ｌ相同物のアミノ酸配列を示す。図面のリスト図１は、プラスミドｐＯＲＦ−１／−２中のｏｒｆＤ１７０１ＨｉｎｄIIIフラグメントＩの物理的地図を示す。細い矢印は同定されたｍＲＮＡを示し、一方、太い矢印はＯＲＦを示す。図２は、Ｄ１７０１ゲノム上のＨｉｎｄIII認識部位の物理的地図及びＨｉｎｄIIIフラグメントＩ上に同定された遺伝子、並びに逆方向末端反復領域の一部を示す。図３は、プラスミドｐＣＥ４を示す。ＮｒｕＩでの切断後、３９６ｂｐフラグメントをＬａｃＺカセットで置き換えた。図４は、ＸｃｍＩでの切断により直鎖状にした後にＬａｃＺカセットを挿入したプラスミドｐＣＥ９を示す。図５は、本文中に記述するように、新しい唯一の切断部位を作製するためにＰＣＲを用いる方法を図式的に示す。図６は、ヌクレアーゼＢａｌ３１を用いた二方向への欠失をそれに続くＥｃｏＲＶリンカー及びＬａｃＺカセットの挿入と共に図式的に示す。図７は、ＬａｃＺ／ｇｐｔ選択カセット：Ｐ１１_K：ワクシニア１１ＫプロモーターＰ_VEGF：ＰＰＶＶＥＧＦプロモーターＳｍ：ＳｍａＩＢ：ＢａｍＨＩの調製方法を示す。図８は、（本文中に記述したような）１０ｋＤａ遺伝子を含むＰＰＶＤ１７０１ＥｃｏＲＩフラグメントＥのクロ−ニング方法を図式的に示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 39/00 Ａ６１Ｋ 48/00 48/00 Ｃ０７Ｋ 14/065 Ｃ０７Ｋ 14/065 Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｇ０１Ｎ 33/569 ＬＧ０１Ｎ 33/569 Ａ６１Ｋ 37/02 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:92） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＨＵ，ＩＬ，ＪＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＫ，ＴＲ，ＵＡ，ＵＳ (72)発明者ルツイハ，ハンス―ヨアヒムドイツ連邦共和国デー―50858ケルン・バイハーシユトラーセ45

Claims

【特許請求の範囲】１．挿入及び／または欠失を含んでいる組み換えにより調製されたＰＰＶ。２．ウイルスの増殖のために必要ではないゲノムセグメント中に挿入及び／または欠失を含んでいる組み換えにより調製されたＰＰＶ。３．ウイルスの増殖のために必要であるゲノムセグメント中に挿入及び／または欠失を含んでいる組み換えにより調製されたＰＰＶ。４．Ｄ１７０１ＨｉｎｄIIIフラグメントＩの発現されない領域中に挿入及び／または欠失を含む組み換えにより調製されたＰＰＶ。５．Ｄ１７０１ＨｉｎｄIIIフラグメントＩの発現される領域中に挿入及び／または欠失を含む組み換えにより調製されたＰＰＶ。６．挿入及び／または欠失がＤ１７０１ＨｉｎｄIIIフラグメントＩ中またはこのフラグメントに相当する他のＰＰＶからのＤＮＡ中に位置する、請求の範囲１ないし５に記載の組み換えにより調製されたＰＰＶ。７．ＶＥＧＦ遺伝子の領域中またはこの領域の近くに挿入及び／または欠失を含む組み換えにより調製されたＰＰＶ。８．ＰＫ遺伝子の領域中またはこの領域の近くに挿入及び／または欠失を含む組み換えにより調製されたＰＰＶ。９．ＩＴＲセグメントの領域中またはこの領域の近くに挿入及び／または欠失を含む組み換えにより調製されたＰＰＶ。１０．ＨＤ１Ｒ遺伝子の領域中またはこの領域の近くに挿入及び／または欠失を含む組み換えにより調製されたＰＰＶ。１１．Ｆ９Ｌ遺伝子の領域中またはこの領域の近くに挿入及び／または欠失を含む組み換えにより調製されたＰＰＶ。１２．１０ｋＤａタンパク質をコードする遺伝子の領域中またはその近くに挿入及び／または欠失を含む組み換えにより調製されたＰＰＶ。１３．１０ｋＤａタンパク質をコードする遺伝子が位置するＤ１７０１ＥｃｏＲＩフラグメントＥの領域中に挿入及び／または欠失を含む組み換えにより調製されたＰＰＶ。１４．Ｄ１７０１ＨｉｎｄIIIフラグメントＩまたはこのフラグメントに相当する他のＰＰＶからのＤＮＡを含んでいるプラスミド。１５．Ｄ１７０１ＨｉｎｄIIIフラグメントＩを含んでいるプラスミドで、ウイルスの複製のために必要であるこのフラグメントの領域中に欠失及び／または挿入を含むプラスミド。１６．Ｄ１７０１ＨｉｎｄIIIフラグメントＩを含んでいるプラスミドで、ウイルスの複製のために必要ではないこのフラグメントの領域中に欠失及び／または挿入を含むプラスミド。１７．Ｄ１７０１ＨｉｎｄIIIフラグメントＩを含んでいるプラスミドで、ウイルスの複製のために必要ではなく、且つ発現されない領域に位置するこのフラグメントの領域中に欠失及び／または挿入を含むプラスミド。１８．Ｄ１７０１ＨｉｎｄIIIフラグメントＩを含んでいるプラスミドで、ウイルスの複製のために必要ではなく、且つ発現される領域に位置するこのフラグメントの領域中に欠失及び／または挿入を含むプラスミド。１９．Ｄ１７０１ＨｉｎｄIIIフラグメントＩを含んでいるプラスミドで、このフラグメントのＶＥＧＦ遺伝子中またはその近くに欠失及び／または挿入を含むプラスミド。２０．Ｄ１７０１ＨｉｎｄIIIフラグメントＩを含んでいるプラスミドで、このフラグメントのＰＫ遺伝子中またはその近くに欠失及び／または挿入を含むプラスミド。２１．Ｄ１７０１ＨｉｎｄIIIフラグメントＩを含んでいるプラスミドで、このフラグメントのＩＴＲセグメント中またはその近くに欠失及び／または挿入を含むプラスミド。２２．Ｄ１７０１ＨｉｎｄIIIフラグメントＩを含んでいるプラスミドで、ＨＤ１Ｒ遺伝子及び／またはＦ９Ｌ遺伝子中またはその近くに欠失及び／または挿入を含むプラスミド。２３．Ｄ１７０１ＥｃｏＲＩフラグメントＥを含んでいるプラスミドで、１０ｋＤａタンパク質をコードする遺伝子中またはその近くに欠失及び／または挿入を含むプラスミド。２４．Ｄ１７０１ＨｉｎｄIIIフラグメントＩの一部を含んでいるプラスミドで、その部分が請求の範囲１４ないし２３に記載の欠失及び／または挿入を含むプラスミド。２５．Ｄ１７０１ＤＮＡフラグメントがこのフラグメントに相当する他のＰＰＶからのＤＮＡで置き換えられている、請求の範囲１４ないし２４に記載のプラスミド。２６．完全なＨｉｎｄIIIフラグメントＩまたはこのフラグメントの一部のみが存在する、請求の範囲１４ないし２５に記載のプラスミド。２７．配列表の配列番号８に記載の配列を有するＤ１７０１ゲノムフラグメントＨｉｎｄIIIフラグメントＩまたはこのフラグメントの一部またはこのフラグメントに相当する他のＰＰＶからのフラグメント。２８．配列表の配列番号１に記載のＶＥＧＦタンパク質をコードするＤ１７０１ＨｉｎｄIIIフラグメントＩのＤＮＡセグメントもしくはその一部またはこのセグメントに相当する他のＰＰＶからのセグメントもしくはその一部。２９．配列表の配列番号２に記載のＰＫタンパク質をコードするＤ１７０１ＨｉｎｄIIIフラグメントＩのＤＮＡセグメントもしくはその一部またはこのセグメントに相当する他のＰＰＶからのセグメントもしくはその一部。３０．配列表の配列番号３に記載の配列を有するＰＰＶＨＤ１Ｒ遺伝子のＤＮＡセグメントまたはその一部。３１．配列表の配列番号５に記載の配列を有するＰＰＶＦ９ＬのＤＮＡセグメントまたはその一部。３２．配列表の配列番号４に記載の配列を有するＰＰＶＩＴＲ領域のＤＮＡセグメントまたはその一部。３３．請求の範囲２７ないし３２に記載のＤＮＡセグメントの配列に基づいて調製される遺伝子産物。３４．他の病原体の免疫性成分をコードする外来ＤＮＡを挿入物として含む、請求の範囲１ないし１３に記載の組み換えにより調製されたＰＰＶ。３５．サイトカインをコードする外来ＤＮＡを挿入物として含む、請求の範囲１ないし１３及び３４に記載の組み換えにより調製されたＰＰＶ。３６．請求の範囲１４ないし２６に記載のプラスミドをそれ自体既知の方法で細胞中でＰＰＶと組み換え、そして所望するウイルスを選択することを特徴とする、請求の範囲１ないし１３、３４及び３５に記載のウイルスの調製方法。３７．１．好適なパラポックスウイルス株を選択し、２．そのゲノムを精製し、３．精製したゲノムを制限酵素で処理し、４．得られたフラグメントをプラスミド中に挿入し、そして５．１０ｋＤａタンパク質をコードする遺伝子を含むプラスミドの選択を実施し、６．場合によっては、１０ｋＤａタンパク質をコードする遺伝子中に挿入及び／または欠失を導入し、７．場合によっては、（上記）４に記述したフラグメントをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはオリゴヌクレオチド合成のような別の方法を用いて調製することもできることを特徴とする、請求の範囲２３に記載のプラスミドの調製方法。３８．１．好適なパラポックスウイルス株を選択し、２．そのゲノムを精製し、３．精製したゲノムを制限酵素で処理し、４．得られをフラグメントをプラスミド中に挿入し、そして５．ＨｉｎｄIIIフラグメントＩまたはこのフラグメントに相当するフラグメントもしくはその成分を含むプラスミドの選択を実施し、６．場合によっては、得られたプラスミドのこれらのフラグメント中に挿入及び／または欠失を導入し、７．場合によっては、（上記）４に記述したフラグメントをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはオリゴヌクレオチド合成のような別の方法を用いて調製することもできることを特徴とする、請求の範囲１４ないし２２及び２４ないし２６に記載のプラスミドの調製方法。３９．１．好適なパラポックスウイルス株を選択し、２．そのゲノムを精製し、３．精製したゲノムを制限酵素で処理し、４．そして所望するフラグメントもしくはセグメントを選択するか、または５．場合によっては、得られたゲノムのフラグメントをまずプラスミド中に挿入し、次に所望するフラグメントを含んでいるプラスミドを単離し、これらのプラスミドを増やし、そしてそれらから所望するフラグメントを単離し、６．場合によっては、（上記）４に記述したフラグメントをポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはオリゴヌクレオチド合成のような別の方法を用いて調製することもできることを特徴とする、Ｄ１７０１ＨｉｎｄIIIフラグメントＩもしくは１０ｋＤａタンパク質をコードするＤ１７０１ＥｃｏＲＩフラグメントＥ、またはこのフラグメントもしくはセグメントに相当する他のＰＰＶからの領域、またはそれらの一部の調製方法。４０．請求の範囲３９により得ることができるフラグメントを好適な発現系に導入し、これらの系を用いて遺伝子を発現することを特徴とする、請求の範囲３３に記載の遺伝子産物の調製方法。４１．請求の範囲１ないし１３に記載の組み換えにより調製されたＰＰＶのワクチンにおける使用。４２．請求の範囲１ないし１３に記載の組み換えにより調製されたＰＰＶの、免疫性を与え、且つ病原体非特異的な免疫防御も刺激する生成物における使用。４３．組み換えにより調製されたＰＰＶの病原体非特異的な免疫防御を刺激する免疫調節剤における使用。４４．組み換えにより調製されたＰＰＶの外来ＤＮＡの異種発現のための使用。４５．組み換えにより調製されたＰＰＶの外来ＤＮＡのベクターとしての使用。４６．請求の範囲１４ないし２６に記載のプラスミドのパラポックス特異的なゲノムセグメントを発現するための使用。４７．請求の範囲１４ないし２６に記載のプラスミドの診断用試薬を調製するための使用。４８．請求の範囲２７ないし３２に記載のゲノムフラグメントの診断用試薬を調製するための使用。４９．配列表の配列番号６に記載のＤＮＡセグメント（ＶＥＧＦ遺伝子のプロモーター）。５０．請求の範囲４９に記載のＤＮＡセグメントのＤＮＡを発現するためのプロモーターとしての使用。