JP2000507092A - 外来ｄｎａを含むパラポックスウイルス、それらの製造及びワクチンにおけるそれらの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、外来遺伝情報の形態で欠失または挿入をゲノム中に有し、且つ他の遺伝情報を含む組み換えにより製造されたパラポックスウイルスに関する。また、本発明はそのような構築物の製造及びワクチンにおけるそれらの使用にも関する。

Description

【発明の詳細な説明】 外来ＤＮＡを含むパラポックスウイルス、それらの製造及びワクチンにおけるそ れらの使用 本発明は、組み換えパラポックスウイルス（Ｐａｒａｐｏｘｖｉｒｕｓｅｓ） 、それらの製造並びにそれらを含むワクチン及び免疫調節剤に関する。 新規な、組み換えにより改変されたパラポックスウイルスは、それらのゲノム 中に欠失及び／または挿入を保有する。パラポックスウイルスのゲノムのセグメ ントの欠失及び／または外来ＤＮＡの挿入は、それらの病原性の減少または喪失 をもたらすことができる（弱毒化）。病原体または生物学的に活性のある物体か らの遺伝情報が、挿入によりパラポックスウイルスのゲノム中に組み込まれる。 この外来遺伝情報は、組み換えパラポックスウイルスの構成成分として、例えば 細胞培養、組織または完全な生物中で発現される。 本発明に従って調製される組み換えパラポックスウイルスは、例えばワクチン または免疫調節剤に用いられる。パラポックスウイルスのゲノム中の外来ＤＮＡ の発現は、例えば予防接種を受けた個体において、外来遺伝情報により提示され る病原体に対する防御反応を引き出す。また、予防接種を受けた個体の非特異的 な抵抗性も刺激することができる（以下、パラポックスウイルスという用語をＰ ＰＶと略す）。 ＰＰＶは生物において病原体非特異的な免疫反応を刺激するので、それら自体 が免疫調節作用を有する可能性がある。従って、パラポックスウイルスの調製物 は、例えば、一般的な抵抗性を増すために獣医学においてうまく用いられている 。 病原体特異的な作用を有するワクチンは防御を確立するために抗原により数日 ないし数週を必要とするが、その場合これらは何カ月ないし何年もの間持続する 長期間の防御を与える。 その結果、組み換えパラポックスウイルスに基づいて調製されるワクチンは、 生物中で長く持続する病原体特異的な免疫を確立し、且つ非常に迅速に起こる病 原体非特異的な防御も誘導するので、これらを感染性疾病の改善された制御のた めの生物学的生成物として用いることができる。 ＰＰＶの免疫刺激特性並びに同種起源及び／または異種起源の病原体に特異的 な防御を誘導する外来抗原の発現の組み合わせは新規である。これにより、感染 に対して迅速に始まる広い病原体非特異的な防御をもたらし、且つ感染に対して 長く持続する病原体特異的な防御も与える生成物の製造が可能となる。 脊椎動物ポックスウイルスのファミリー（コルドポックスウイルス亜科（Ｃｈ ｏｒｄｏｐｏｘｖｉｒｉｎａｅ））は、個々の独立した属に分けられる。本発明 はＰＰＶの属に関し、これらは他のポックスウイルスと構造及び遺伝子の両方で 異なる。ＰＰＶは３つの異なる種、 ‐パラポックスウイルス オビス（Ｐａｒａｐｏｘｖｉｒｕｓ ｏｖｉｓ）（感 染性膿瘡ウイルス（ｅｃｔｈｙｍａ ｃｏｎｔａｇｉｏｓｕｍ ｖｉｒｕｓ） 、感染性膿疱性皮膚炎ウイルス（ｃｏｎｔａｇｉｏｕｓ ｐｕｓｔｕｌａｒ ｄｅｒｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）またはｏｒｆウイルス（ｏｒｆ ｖｉｒ ｕｓ）とも呼ばれる）、これはこの属の原始型とみなされる、 ‐パラポックスウイルス ボビス１（Ｐａｒａｐｏｘｖｉｒｕｓ ｂｏ ｖｉｓ １）（ウシ丘疹性口内炎ウイルス（ｂｏｖｉｎｅ ｐａｐｕｌａｒ ｓｔｏｍａｔｉｔｉｓ ｖｉｒｕｓ）または口内炎丘疹ウイルス（ｓｔｏｍａ ｔｉｔｉｓ ｐａｐｕｌｏｓａ ｖｉｒｕｓ）とも呼ばれる）及び ‐パラポックスウイルス ボビス２（Ｐａｒａｐｏｘｖｉｒｕｓ ｂｏｖｉｓ ２）（乳腺ポックスウイルス（ｕｄｄｅｒｐｏｘｖｉｒｕｓ）、パラワクシニ アウイルス（ｐａｒａｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ）、搾乳者結節ウイルス （ｐｓｅｕｄｏｃｏｗｐｏｘ ｖｉｒｕｓ）または搾乳者結節ウイルス（ｍｉ ｌｋｅｒ’ｓ ｎｏｄｕｌｅ ｖｉｒｕｓ）とも呼ばれる） に分けられる（文献番号１）。 ラクダ、アカシカ、シャモア、アザラシ及びアシカから単離されたパラポック スウイルスの代表種も記述されている。これらのウイルスがパラポックスウイル ス属内の独立した種であるかどうか、またはこれらが上記の種の単離物であるか どうかは、まだ最終的に明らかにされていない。 ＰＰＶでの感染は動物及びヒトの両方で局所的疾病を引き起こすことができる （人畜伝染病病原体）。文献番号１は、これまでに記述されているこれらの症候 群の概要を与える。ワクチンのような予防手段をこれらの疾病を制御するために 用いることができる。しかしながら、これまでに得ることができ、そしてパラポ ックスウイルス オビスに基づいて専ら開発されているワクチンの活性は不十分 である（文献番号２）。 本発明は、発現される外来遺伝情報のベクターとしてＰＰＶを用いることに関 する。 アビポックス（ａｖｉｐｏｘ）、ラクーンポックス（ｒａｃｏｏｎｐｏｘ）、 カプリポックス（ｃａｐｒｉｐｏｘ）、スワインポックス（ｓｗｉｎｅｐｏｘ） またはワクシニアウイルス（ｖａｃｃｉｎｉａ ｖｉｒｕｓ）に基づくベクター が、外来遺伝情報を発現するためのベクターとしてすでに記述されている。これ に関連して得られている洞察をＰＰＶに移しかえることはできない。比較研究が 示しているように、ポックスウイルスの個々の属の間には形態、構造及び遺伝子 の違いがある。従って、ＰＰＶを他のポックスウイルス属から区別するために例 えば血清学的方法を用いることができ、これは、異なるタンパク質型及びこれに 関連する異なる遺伝情報に起因すると考えられる。例えば、ポックスウイルスの いくつかの代表種は赤血球を凝集する能力がある。この活性は、表面タンパク質 、いわゆるヘマグルチニン（ＨＡ）を介してもたらされる。ＰＰＶはこの活性を 持たない。 ＰＰＶゲノムの構造の知識は、現在、ゲノムの大きさ、核酸のＧＣ含有量の決 定、比較制限酵素分析、個々のゲノム断片のクローニング、並びに一部の領域の 配列分析及び個々の遺伝子の関連する予備的な記述に限られている（概説として は、文献番号１、文献番号５、文献番号６を参照）。 ワクシニアの場合で知られている挿入部位は、ＰＰＶではないかまたは示され ていないために、これらの部位を用いることは現在できない。 従って、ＰＰＶゲノムでチミジンキナーゼの遺伝子を同定する試み及びそれを 挿入部位として用いる試みは、オルトポックスウイルスの場合でのように成功し なかった。Ｍａｚｕｒ等（文献番号３）は、ワクシニアウイルス（オルトポック スウイルス）のチミジンキナーゼ遺伝子に似 ていると彼らが主張するＰＰＶゲノムのセグメントの同定を記述しているが、我 々自身の詳細な研究ではＰＰＶ中にそのような遺伝子の存在を確認することはで きなかった。また、別の著者（文献番号１）もＰＰＶにおいてチミジンキナーゼ 遺伝子を見いだすことはできなかった。ワクシニアウイルスでは外来ＤＮＡの挿 入部位としてＨＡの遺伝子が用いられる。上に記述したように、ＰＰＶはこの活 性を持たない。 １９９２年に、Ｒｏｂｉｎｓｏｎ及びＬｙｔｔｌｅは、ＰＰＶゲノム上の別の 挿入部位を記述したが（文献番号１）、しかしながら、これらの部位の説明また は正確な特性化を与えていない。さらに、ＰＰＶのベクターとしての成功した使 用のいかなる記述もいまだない。 ＰＰＶ株Ｄ１７０１からのＨｉｎｄIIIフラグメントＩの配列の我々独自の分 析研究において、我々は各種哺乳類種（例えばマウス、ラット、モルモット、ウ シ及びヒト）からの血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）とアミノ酸の相同性を有する ＯＲＦを見いだした（３６．１ないし３８．３％の同一性；５２．８ないし５８ ．６％の類似性、ＧＣＧ、ウィスコンシン パッケージ（Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｐａｃｋａｇｅ）８．１、例えばピックアップ プログラム（Ｐｉｋｕｐ Ｐｒ ｏｇｒａｍ））。配列番号１はＤ１７０１のこの遺伝子のヌクレオチド配列を示 し、一方、配列番号１５は対応するＤ１７０１タンパク質のアミノ酸配列を示す 。最近、相同遺伝子がＰＰＶ株ＮＺ２及びＮＺ７においても記述された（文献番 号６）が、しかしながら、この遺伝子の機能は知られていない。他のポックスウ イルス、例えばオルトポックスウイルスが対応する遺伝子を持つことは知られて いない。以下、この遺伝子をＶＥＧＦ遺伝子と称する。 Ｄ１７０１のＨｉｎｄIIIフラグメントＩの我々の配列分析により、オルトポ ックスウイルスのプロテインキナーゼ遺伝子と相同性を有し、そしてワクシニア においてＦ１０Ｌとして知られている別のＯＲＦが同定された。ワクシニアＦ１ ０Ｌ遺伝子との同一性は５１％であり、一方、類似性は７０％である。以下、こ の遺伝子をＰＫ遺伝子と称する。配列番号２、番号９及び番号１３はＤ１７０１ のこの遺伝子のヌクレオチド配列バージョンを示し、一方、配列番号１４は対応 するＤ１７０１タンパク質のアミノ酸配列を示す。 ＰＫ遺伝子の３’末端及びＶＥＧＦ遺伝子の５’末端と重なり合う別のＯＲＦ が見いだされた。相同性研究により、ワクシニアのＦ９Ｌ遺伝子と低い同一性（ ２８％）及び低い類似性（５１％）があること示された。配列番号５及び番号１ ０はＤ１７０１のこの遺伝子のヌクレオチド配列バージョンを示す。以下、この 遺伝子をＦ９Ｌ遺伝子と称する。 さらなるＯＲＦがＩＴＲ領域内に見いだされ、ＰＰＶ ＮＺ２のある遺伝子に 対するその類似性（同一性７６％、類似性８３％）のためにＯＲＦ３と称する。 配列番号４はＤ１７０１のこの遺伝子のヌクレオチド配列を示す。以下、この遺 伝子をＯＲＦ３遺伝子と称する。 本発明は、 １． 挿入及び／または欠失を有する組み換えにより調製されたＰＰＶ、 ２． ウイルス増殖のために必要ではないゲノムセグメント中に挿入及び／また は欠失を有する組み換えにより調製されたＰＰＶ、 ３． ウイルス増殖のために必要であるゲノムセグメント中に挿入及び／または 欠失を有する組み換えにより調製されたＰＰＶ、 ４． Ｄ１７０１のＨｉｎｄIIIフラグメントＩの発現されない領域中に 挿入及び／または欠失を含む組み換えにより調製されたＰＰＶ、 ５． Ｄ１７０１のＨｉｎｄIIIフラグメントＩの発現される領域中に挿入及び ／または欠失を含む組み換えにより調製されたＰＰＶ、 ６． 挿入及び／または欠失がＤ１７０１ ＨｉｎｄIIIフラグメントＩ中または このフラグメントに相当する他のＰＰＶからのＤＮＡ中に位置する、１な いし５に記載の組み換えにより調製されたＰＰＶ、 ７． ＶＥＧＦ遺伝子の領域中またはこの領域の近くに挿入及び／または欠失を 含む組み換えにより調製されたＰＰＶ、 ８． ＰＫ遺伝子の領域中またはこの領域の近くに挿入及び／または欠失を含む 組み換えにより調製されたＰＰＶ、 ９． ＩＴＲセグメントの領域中またはこの領域の近くに挿入及び／または欠失 を含む組み換えにより調製されたＰＰＶ、 １０．ＨＤ１Ｒ遺伝子の領域中またはこの領域の近くに挿入及び／または欠失を 含む組み換えにより調製されたＰＰＶ、 １１．Ｆ９Ｌ遺伝子の領域中またはこの領域の近くに挿入及び／または欠失を含 む組み換えにより調製されたＰＰＶ、 １２．１０ｋＤａタンパク質をコードする遺伝子の領域中またはその近くに挿入 及び／または欠失を含む組み換えにより調製されたＰＰＶ、 １３．１０ｋＤａタンパク質をコードする遺伝子が位置するＤ１７０１のＥｃｏ ＲＩフラグメントＥの領域中に挿入及び／または欠失を含む組み換えによ り調製されたＰＰＶ、 １４．Ｄ１７０１のＨｉｎｄIIIフラグメントＩまたはこのフラグメント に相当する他のＰＰＶからのＤＮＡを含むプラスミド、 １５．Ｄ１７０１のＨｉｎｄIIIフラグメントＩを含み、且つこのフラグメント のウイルス複製のために必要である領域中に欠失及び／または挿入を含む プラスミド、 １６．Ｄ１７０１のＨｉｎｄIIIフラグメントＩを含み、且つこのフラグメント のウイルス複製のために必要ではない領域中に欠失及び／または挿入を含 むプラスミド、 １７．Ｄ１７０１のＨｉｎｄIIIフラグメントＩを含み、且つこのフラグメント のウイルス複製のために必要ではなく且つ発現されない領域中に欠失及び ／または挿入を含むプラスミド、 １８．Ｄ１７０１のＨｉｎｄIIIフラグメントＩを含み、且つこのフラグメント のウイルス増殖のために必要ではなく且つ発現される領域に位置する領域 中に欠失及び／または挿入を含むプラスミド、 １９．Ｄ１７０１のＨｉｎｄIIIフラグメントＩを含み、且つこのフラグメント のＶＥＧＦ遺伝子中またはその近くに欠失及び／または挿入を含むプラス ミド、 ２０．Ｄ１７０１のＨｉｎｄIIIフラグメントＩを含み、且つこのフラグメント のＰＫ遺伝子中またはその近くに欠失及び／または挿入を含むプラスミド 、 ２１．Ｄ１７０１のＨｉｎｄIIIフラグメントＩを含み、且つこのフラグメント のＩＴＲセグメント中またはその近くに欠失及び／または挿入を含むプラ スミド、 ２２．Ｄ１７０１のＨｉｎｄIIIフラグメントＩを含み、且つＨＤ１Ｒ遺伝子及 び／またはＦ９Ｌ遺伝子中またはその近くに欠失及び／ま たは挿入を含むプラスミド、 ２３．Ｄ１７０１のＥｃｏＲＩフラグメントＥを含み、且つ１０ｋＤａタンパク 質をコードする遺伝子中またはその近くに欠失及び／または挿入を含むプ ラスミド、 ２４．１４ないし２３による欠失及び／または挿入が存在する、Ｄ１７０１のＨ ｉｎｄIIIフラグメントＩの部分を含むプラスミド、 ２５．Ｄ１７０１のＤＮＡフラグメントがこのフラグメントに相当する他のＰＰ ＶからのＤＮＡで置き換えられている、１４ないし２４に記載のプラスミ ド、 ２６．ＨｉｎｄIIIフラグメントＩの全部またはその一部のみを含む、１４ない し２５に記載のプラスミド、 ２７．配列表の配列番号８または配列番号１２の配列を有する、Ｄ１７０１ Ｈ ｉｎｄIIIフラグメントＩ、またはその一部またはこのフラグメントに相 当する他のＰＰＶからのフラグメント、 ２８．配列表の配列番号１によるＶＥＧＦタンパク質をコードする、Ｄ１７０１ ＨｉｎｄIIIフラグメントＩのＤＮＡセグメントもしくは一部またはこの セグメントに相当する他のＰＰＶからのセグメントもしくはその一部、 ２９．配列表の配列番号２、配列番号９または配列番号１３のＰＫタンパク質を コードする、Ｄ１７０１ ＨｉｎｄIIIフラグメントＩのＤＮＡセグメント もしくは一部またはこのセグメントに相当する他のＰＰＶからのセグメン トもしくはその一部、 ３０．ＰＰＶの配列表の配列番号３の配列を有するＨＤ１Ｒ遺伝子のＤＮＡセグ メントまたはその一部、 ３１．ＰＰＶの配列表の配列番号５または配列番号１０の配列を有するＦ９Ｌの ＤＮＡセグメントまたはその一部、 ３２．ＰＰＶの配列表の配列番号４の配列を有するＩＴＲ領域のＤＮＡセグメン トまたはその一部、 ３３．２７ないし３２に記載のＤＮＡセグメントの配列に基づいて調製された遺 伝子産物、 ３４．他の病原体の免疫性成分をコードする外来ＤＮＡを挿入物として含む、１ ないし１３に記載の組み換えにより調製されたＰＰＶ、 ３５．サイトカインをコードする外来ＤＮＡを挿入物として含む、１ないし１３ 及び３４に記載の組み換えにより調製されたＰＰＶ、 ３６．１４ないし２６に記載のプラスミドをそれ自体既知の方法で細胞中でＰＰ Ｖと組み換え、そして所望するウイルスを選択することを特徴とする、１ ないし１３、３４及び３５に記載のウイルスの調製方法、 ３７．１．好適なＰＰＶ株を選択し、 ２．そのゲノムを精製し、 ３．精製したゲノムを制限酵素で処理し、 ４．得られたフラグメントをプラスミド中に挿入し、そして ５．１０ｋＤａタンパク質をコードする遺伝子を含むプラスミドの選択を 実施し、 ６．場合によっては、１０ｋＤａタンパク質をコードする遺伝子中に挿入 及び／または欠失を導入し、 ７．場合によっては、（上記）４に記述したフラグメントをポリメラーゼ 連鎖反応（ＰＣＲ）またはオリゴヌクレオチド合成 のような別の方法を用いて調製することもできる、 ことを特徴とする、２３に記載のプラスミドの調製方法、 ３８．１．好適なＰＰＶ株を選択し、 ２．そのゲノムを精製し、 ３．精製したゲノムを制限酵素で処理し、 ４．得られたフラグメントをプラスミド中に挿入し、そして ５．ＨｉｎｄIIIメントＩまたはこのフラグメントに相当するフラグメン トもしくは成分を含むプラスミドの選択を実施し、 ６．そして場合によっては、得られたプラスミドのこれらのフラグメント 中に挿入及び／または欠失を導入し、 ７．場合によっては、（上記）４に記述したフラグメントをポリメラーゼ 連鎖反応（ＰＣＲ）またはオリゴヌクレオチド合成のような別の方法 を用いて調製することもできる、 ことを特徴とする、１４ないし２２及び２４ないし２６に記載のプラスミドの調 製方法、 ３９．１．好適なＰＰＶ株を選択し、 ２．そのゲノムを精製し、 ３．精製したゲノムを制限酵素で処理し、 ４．そして所望するフラグメントもしくはセグメントを選択するか、また は ５．場合によっては、得られたゲノムのフラグメントをまずプラスミドに 挿入し、そして所望するフラグメントを含んでいるプラスミドを単離 し、その後にこれらのプラスミドを増やし、 そして所望するフラグメントをそれらから単離し、 ６．場合によっては、（上記）４に記述したフラグメントをポリメラーゼ 連鎖反応（ＰＣＲ）またはオリゴヌクレオチド合成のような別の方法 を用いて調製することもできる、 ことを特徴とする、Ｄ１７０１ ＨｉｎｄIIIフラグメントＩもしくは１０ ｋＤａタンパク質をコードするＥｃｏＲＩフラグメントＥまたはこのフラ グメントもしくはセグメントに相当する他のＰＰＶからの領域またはその 一部の調製方法、 ４０．３９により得ることができるフラグメントを好適な発現系に導入し、これ らの系を用いて遺伝子を発現することを特徴とする、３３に記載の遺伝子 産物の調製方法、 ４１．１ないし１３に記載の組み換えにより調製されたＰＰＶのワクチンにおけ る使用、 ４２．１ないし１３に記載の組み換えにより調製されたＰＰＶの、免疫性を与え 且つ病原体非特異的な免疫防御を刺激する生成物における使用、 ４３．組み換えにより調製されたＰＰＶの病原体非特異的免疫防御を刺激する免 疫調節剤における使用、 ４４．組み換えにより調製されたＰＰＶの外来ＤＮＡを異種起源で発現するため の使用、 ４５．組み換えにより調製されたＰＰＶの外来ＤＮＡのベクターとしての使用、 ４６．１４ないし１６に記載のプラスミドのパラポックスに特異的なゲノムセグ メントを発現するための使用、 ４７．１４ないし２６に記載のプラスミドの診断用試薬を調製するための使用、 ４８．２７ないし３２に記載のゲノムフラグメントの診断用試薬を調製するため の使用、 ４９．配列表の配列番号６に記載のＤＮＡセグメント（ＶＥＧＦ遺伝子のプロモ ーター）、 ５０．ＤＮＡを発現するためのプロモーターとしての４９に記載のＤＮＡセグメ ントの使用、 プラスミドまたはウイルス中に挿入することができ、且つ遊離ＤＮＡセグメン トとして存在することができるＰＰＶの上記ゲノムフラグメントは、定められた ＤＮＡ配列並びにそれらの変異体及び相同物を包含する。 上に挙げた用語は以下の意味を有する。すなわち、 ‐弱毒化は、 ＰＰＶのゲノムの改変の結果として、ＰＰＶが動物またはヒトに対して病原性 が低くなるかもしくは病原性がなくなる、または毒性が低くなるかもしくは毒 性がなくなる工程である。 ‐欠失は、 ＰＰＶゲノムから欠けているＤＮＡの断片である。 ‐欠失プラスミドは、 プラスミドＤＮＡに加えて、断片が取り除かれたＰＰＶゲノムのセグメントを 保有するプラスミドである。 ‐ウイルス増殖のために必要（必須）であるゲノムセグメントは、 ＰＰＶのインビトロでの増殖のために不可欠である、すなわち、感染 性のウイルス子孫を生じるために不可欠である全ＰＰＶゲノムの部分である。 ウイルス増殖のために必須である遺伝子の妨害は、中断されるウイルス増殖 をもたらす。例えば、これらの遺伝子の一つの一部または全遺伝子が除かれる 場合、ウイルスの複製はウイルスの増殖サイクルのある特定の時点で止まる。 この性質の突然変異体での感染または処理は、その動物から感染性子孫のいか なる放出も生じない。必須遺伝子の一部または全必須遺伝子が外来ＤＮＡで置 き換えられる場合または外来ＤＮＡが必須遺伝子中に挿入される場合に、予防 接種を受けた個体中で増殖することができず、従って、感染性の病原体として 放出されないベクターワクチンを構築することができる。 ‐ウイルス増殖のために必要（必須）ではないゲノムセグメントは、 ＰＰＶのインビトロでの増殖のため、すなわち、感染性のウイルス子孫を生じ るために不要である可能性のある全ＰＰＶゲノムの部分である。 ‐外来ＤＮＡ成分（外来ＤＮＡ）は、 本発明により用いられるＰＰＶ中に本来存在していないＤＮＡ断片、 例えば外来遺伝子またはヌクレオチド配列である。 外来ＤＮＡは、以下の理由のため、すなわち、 １．外来ＤＮＡを発現するため、 ２．ＰＰＶ ＤＮＡの断片の機能を不活性化するため、 ３．ＰＰＶを標識するため にＰＰＶ中に挿入される。 これらの理由により、異なる外来ＤＮＡが挿入される。外来ＤＮＡ が（１）により発現される場合、挿入される外来ＤＮＡは、１種またはそれ以上 の所望する外来タンパク質をコードする読み枠を少なくとも保有する。場合によ っては、外来ＤＮＡはそれ自体または外来の調節配列をさらに含む。ウイルスの ゲノム中に欠失を作製することにより外来ＤＮＡを取り込む能力を増すことがで きる。通例、その長さは１ヌクレオチド及び３５，０００ヌクレオチドの間、好 ましくは１００及び約１５，０００ヌクレオチドの間である。 挙げることができる例は、 ヘルペスウイルス スイド１（Ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓ ｓｕｉｄ１）、 ウマ ヘルペスウイルス（Ｅｑｕｉｎｅ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｅｓ）、 ウシ ヘルペスウイルス（Ｂｏｖｉｎｅ ｈｅｒｐｅｓｖｉｒｕｓｅｓ）、 口蹄疫ウイルス（Ｆｏｏｔ ａｎｄ ｍｏｕｔｈ ｄｉｓｅａｓｅ ｖｉｒｕｓ ）、 ウシ ＲＳウイルス（Ｂｏｖｉｎｅ ｒｅｓｐｉｒａｔｏｒｙ ｓｙｎｃｙｔｉ ａｌ ｖｉｒｕｓ）、 ウシ パラインフルエンザウイルス３（Ｂｏｖｉｎｅ ｐａｒａｉｎｆｌｕｅｎ ｚａ ｖｉｒｕｓ ３）、 インフルエンザウイルス（Ｉｎｆｌｕｅｎｚａ ｖｉｒｕｓ）、 カリシウイルス（Ｃａｌｉｃｉｖｉｒｕｓ）、 フラヴィウイルス（Ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓｅｓ）、例えばウシウイルス下痢ウイ ルス（ｂｏｖｉｎｅ ｖｉｒｕｓ ｄｉａｒｒｈｏｅａ ｖｉｒｕｓ）または古典的ブタコレラウイルス（ｃｌａｓｓｉｃａｌｓｗｉｎｅ ｆｅｖｅｒ ｖｉｒｕｓ）、 のようなウイルス または パスツレラ種（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ ｓｐｅｃ．）、 サルモネラ種（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｓｐｅｃ．）、 アクチノバシラス種（Ａｃｔｉｎｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｅｃ．）、 クラミジア種（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｓｐｅｃ．） のようなバクテリア または トキソプラズマ（Ｔｏｘｏｐｌａｓｍａ）、 ジロフィラリア（Ｄｉｒｏｆｉｌａｒｉａ）、 エキノコックス（Ｅｃｈｉｎｏｃｏｃｃｕｓ） のような寄生虫からの遺伝子または遺伝子の一部である。 外来ＤＮＡが（２）により挿入される場合、適当な外来ヌクレオチドの挿入が ベクターウイルスのＤＮＡ配列を遮断するために原則として十分である。不活性 化のために挿入される外来ＤＮＡの最大の長さはベクターウイルスの外来ＤＮＡ を取り込む能力により決まる。通例、外来ＤＮＡの長さは１ヌクレオチド及び３ ５，０００ヌクレオチドの間、好ましくは１００及び１５，０００ヌクレオチド の間、特に好ましくは３及び１００ヌクレオチドの間である。 ＤＮＡ配列が（３）による標識化のために挿入される場合、これらの長さは標 識されたウイルスを同定するために用いる検出方法により決まる。通例、外来Ｄ ＮＡの長さは１及び２５，０００ヌクレオチド の間、好ましくは２０ヌクレオチド及び１５，０００ヌクレオチドの間、特に 好ましくは５及び１００ヌクレオチドの間である。 ‐遺伝子ライブラリーは、 複製可能なベクター中に含まれるゲノムのフラグメントの全体である。 ライブラリーは、ゲノムを断片化し、そしてこれらのフラグメントの全て、こ れらのフラグメントのいくつかまたはこれらのフラグメントの主要な部分を複 製可能なベクター、例えばプラスミド中に挿入することにより得られる。 ‐ゲノムフラグメントは、 単離された形で存在することができるか、または複製可能なベクター中に挿入 することができるゲノムの断片である。 ‐挿入による不活性化は、 挿入された外来ＤＮＡが、本来のＰＰＶゲノム配列が発現されたり、または機 能することを妨げることを意味する。 ‐挿入は、 ＰＰＶゲノム中に付加的に組み込まれているＤＮＡの断片である。挿入の理由 により、ＤＮＡ断片の長さは１ヌクレオチド及び数千ヌクレオチドの間である 可能性がある（「外来ＤＮＡ」の定義も参照）。 ‐挿入プラスミドは、 ＰＰＶ ＤＮＡ配列が隣接した、挿入される外来ＤＮＡを含むプラスミド、特 にバクテリアのプラスミドである。 ‐挿入部位は、 外来ＤＮＡを受け入れるために適しているウイルスゲノム中の部位である。 ‐クローニングは、 ＰＰＶゲノムＤＮＡが単離され、断片化されることを意味する。次に、これら のフラグメントまたはこれらのフラグメントの選択物が通常のＤＮＡベクター （バクテリアのプラスミドまたはファージベクターまたは真核生物のベクター ）中に挿入される。 文献番号１１は、ＤＮＡフラグメントの調製及びクローニング方法の選択を 与える。ＰＰＶ ＤＮＡフラグメントをインサートとして含んでいるＤＮＡベ クターが、例えば、最初に単離されたＰＰＶ ＤＮＡフラグメントの同一コピ ーを調製するために用いられる。 ‐挿入による標識化は、 挿入された外来ＤＮＡが、修飾されたＰＰＶを続いて同定することを可能にす ることを意味する。 ‐ＯＲＦ（読み枠）は、可能性のあるタンパク質のアミノ酸配列をＤＮＡレベル で特定するヌクレオチドの配列を意味すると理解される。特定するタンパク質 の大きさにより決められる数のヌクレオチドトリプレットからなり、開始コド ン（ＡＴＧ）により５’末端、そして終止コドン（ＴＡＧ）ＴＧＡまたはＴＡ Ａ）により３’末端の境界が定められる。 ‐調節配列は、 遺伝子の発現に対して影響を与えるＤＮＡ配列である。この特性の配列は文献 番号１５から既知である。 好ましくは、配列表の配列番号６に記述されるようなＶＥＧＦプロモーター を挙げることができる。 ‐組み換えＰＰＶは、 それらのゲノム中に挿入及び／または欠失を有するＰＰＶである。これに関連 して、挿入及び欠失は、分子生物学的方法を用いて調製される。 ‐反復（ＤＮＡ）配列は、 ＰＰＶゲノム中に直接相次いでかまたは異なる部位に分散して存在する同一の ヌクレオチド配列である。 ‐ベクターウイルスは、 外来ＤＮＡの挿入のために好適であり、且つそのゲノムに挿入した外来ＤＮＡ を感染した細胞または生物中に移すことができ、且つ場合によっては外来ＤＮ Ａを発現することができるＰＰＶである。 （上記）１ないし１２に記載の新規なＰＰＶは、以下のようにして調製される 。すなわち、 １． 好適なＰＰＶ株の選択 ２． 挿入部位を有するＰＰＶゲノム中のゲノムセグメントの同定 ２．ａ ウイルス増殖のために必須でない遺伝子中に挿入部位を有するＰＰＶゲ ノムセグメントの同定 ２．ｂ ウイルス増殖のために必須である遺伝子中に挿入部位を有するＰＰＶゲ ノムセグメントの同定 ２．ｃ ＰＰＶゲノムの遺伝子以外の領域及び／または遺伝子重複中に挿入部位 を有するゲノムセグメントの同定 ２．ｄ 挿入部位を有するゲノムセグメントを同定するための他の方法 ２．ｅ 挿入部位に対する要求 ２．１ 挿入部位の同定 ２．１．１ ＰＰＶゲノムの精製 ２．１．２ ゲノムフラグメントのクローニング及び遺伝子ライブラリーの樹立 ２．１．３ 遺伝子または遺伝子以外のゲノムセグメントを同定する目的のシー クエンシング ２．１．４ さらなる処理のためのＰＰＶゲノムフラグメントを含んでいるクロ ーンの選択 ２．２ 挿入部位としての、ＩＴＲ領域、ＶＥＧＦ遺伝子、ＰＫ遺伝子、１０ｋ Ｄａタンパク質をコードする遺伝子及びＰＫ遺伝子とＨＤ１Ｒ遺伝子の 間の領域 ２．２．１ ＶＥＧＦ遺伝子のクローニング ２．２．２ プロテインキナーゼ遺伝子のクローニング ２．２．３ １０ｋＤａタンパク質をコードする遺伝子領域のクローニング ２．２．４ ＩＴＲ領域（逆方向末端反復領域）またはＰＫ遺伝子とＨＤ１Ｒ遺 伝子の間に存在するゲノムセグメントのクローニング ３． 挿入される外来ＤＮＡを保有する挿入プラスミドまたは欠失プラスミドの 構築 ３．１ クローン化されたゲノムフラグメント中の１箇所だけに存在する制限酵 素認識部位、すなわち、唯一の制限部位の同定または調製及び外来ＤＮＡの挿 入 ３．２ クローン化されたゲノムフラグメント中のゲノム配列の欠失及び外来Ｄ ＮＡの挿入 ３．３ ＃３．１及び＃３．２の組み合わせ ４． （上記）１ないし１２による組み換えＰＰＶの構築 １．好適なＰＰＶ株の選択 原則として、全てのＰＰＶ種が本発明を実施するために適している。組織培養 で＞１０⁵ＰＦＵ（プラーク形成単位）／ｍｌの力価まで増殖することができ、 且つ感染した細胞の培地から細胞外の感染性ウイルスとして純粋な形態で調製す ることができるウイルス株が好ましい。好ましいとして挙げることができるＰＰ Ｖ属の種はＰＰＶ オビス（ｏｒｆウイルス）である。 特に好ましいとして挙げることができるＰＰＶ オビスの株は、登録番号ＣＮ ＣＭ Ｉ−７５１でパスツール研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔ Ｐａｓｔｅｕｒ）、 Ｃ．Ｎ．Ｃ．Ｍ．にブダペスト条約に従って１９８８年４月２８日に寄託された Ｄ１７０１並びにその変種及び突然変異体である。 これらのウイルスを哺乳類細胞のような動物細胞の組織培養において、例えば ヒツジ細胞またはウシ細胞、好ましくは永久ウシ腎臓細胞系ＢＫ ｍｍｌｉｎｇｅｎ））のようなウシ細胞または永久サル腎臓細胞ＭＡ１０４もし くはＶｅｒｏ（もしくはそれらの誘導体）ようなサル細胞において常法で増殖さ せる。 増殖は、緻密細胞凝集塊の形態または懸濁培養で静置、ローラーまたは担体培 養でそれ自体既知の方法で実施される。 ウイルスを増殖させるために用いる細胞または細胞ローン（ｌａｗｎｓ）を実 質的に融合するまでまたは最適細胞密度まで常法で増やす。これらの細胞に、あ るＭＯＩ（＝細胞当たりの感染性ウイルス粒子に相当 する、感染多重度）に相当するウイルス希釈物を感染させる。 動物血清を添加するかまたはしないでウイルスを増殖させる。血清を用いる場 合は、１−３０容量％、好ましくは１−１０容量％の濃度で増殖培地に添加する 。 感染及びウイルス増殖は、室温及び４０℃の間、好ましくは３２及び３９℃の 間、特に好ましくは３７℃の温度で、数日にわたって、好ましくは感染した細胞 が完全に破壊されるまで実施される。ウイルスを集めることに関連して、なお細 胞に結合しているウイルスを機械的にまたは超音波処理によりまたは例えばトリ プシンを用いて穏やかな酵素的タンパク質分解によりさらに遊離することができ る。 次に、感染細胞からのウイルスを含有している培地を例えば、０．２−０．４ ５μｍのような孔径を用いる濾過及び／または低速遠心分離で細胞屑を除去する ことによりさらに整えることができる。 濾過液または遠心分離上清をウイルスの濃縮及び精製のために用いることがで きる。このために、濾過液または上清をウイルス粒子が沈殿するまで高速遠心分 離に供する。場合によっては、例えば密度勾配遠心分離によりさらに精製工程を 続けることができる。 ２．ＰＰＶゲノムにおける挿入部位を有するゲノムセグメントの同定 外来ＤＮＡを挿入する場合、ＰＰＶゲノムの様々な領域を挿入部位として用い ることができる。外来ＤＮＡを ａ．インビトロ及び／またはインビボでのウイルス増殖のために必須でない遺 伝子中、 ｂ．ウイルス増殖のために必須である遺伝子中、そして／または ｃ．いかなる遺伝子機能も持たない領域中 に挿入することができる。 ２．ａ ウイルス増殖のために必須でない遺伝子中に挿入部位を有するＰＰＶゲ ノムのゲノムセグメントの同定 ｉ．ウイルスの増殖のために必須でないウイルスゲノムは、例えば、異なるＰ ＰＶ種の代表を用いて比較研究を実施することにより見いだされる。あるＰＰＶ 種の１つまたはそれ以上の単離物または株には存在しないが、他の単離物または 株に見いだされる遺伝子は、必須でない可能性がある。 ii．ウイルス増殖のために必須でない遺伝子を別の方法でも同定することがで きる。例えばクローン化されたフラグメントとして存在することができるＰＰＶ ゲノムフラグメントをシークエンスした後、これらのＤＮＡ配列を可能な「読み 枠」（ＯＲＦ）に関して調べる。ＯＲＦが見いだされる場合、このＯＲＦの遺伝 子としての機能を転写及び／または翻訳を示すことにより確かめる。見いだされ た遺伝子がウイルス増殖のために必須でないかどうかを確かめるために、分子遺 伝学的方法を用い、ＰＰＶゲノムからこの遺伝子を取り除くか、または突然変異 を導入することによりこれを部分的に破壊するかもしくはこれを遮断し、得られ たウイルスの増殖能力を次に調べる。操作した遺伝子の非存在下でもウイルスが 複製できる場合、その遺伝子は必須でない遺伝子である。 同定された挿入部位の例 ｉ．外来ＤＮＡの挿入部位として用いることができる必須でないＰＰＶ遺伝子 の例としてここではＰＰＶ オビスのＶＥＧＦ遺伝子を挙げることができる。こ の遺伝子は、調べられたパラポックスウイルス オビス株（ＮＺ−２、ＮＺ−７及びＤ１７０１）で見いだされる（文献番号６） 。このＶＥＧＦ遺伝子はいくつかのＰＰＶ株、例えばＰＰＶボビス１の代表では 示されていない。ＶＥＧＦ遺伝子を含んでいるＰＰＶゲノム上の領域を配列表の 配列番号１に示されるＤＮＡ配列を用いて同定することができる。分子生物学の 常法を用いて、ハイブリダイゼーション実験、ゲノム配列分析及び／またはポリ メラーゼ連鎖反応によりＰＰＶのゲノム上の遺伝子を見いだすことができる。 ii．必須でない可能性のあるＰＰＶ遺伝子の別の例として１０ｋＤａＰＰＶタ ンパク質の遺伝子を挙げることができる。この遺伝子は、パラポックスウイルス オビス（ＮＺ−２、ＮＺ−７及びＤ１７０１）の株で見いだされる。分子生物 学の常法を用いて、例えばポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により１０ｋＤａタ ンパク質の遺伝子を含むＰＰＶゲノム上の領域を同定することができる。文献番 号８は、１０ｋＤａタンパク質遺伝子のＤＮＡ配列を示している。ＰＣＲに用い ることができるプライマーは、例えば文献番号８に特定されている。配列表の配 列番号１１は、Ｄ１７０１からの１０ｋＤａに特異的なＰＣＲ産物のＤＮＡ配列 を示している。 外来ＤＮＡを挿入する目的のために、必須でない遺伝子を部分的または完全に ＰＰＶゲノムから取り除くことができる。しかしながら、ＰＰＶ遺伝子のいかな る領域も取り除かずに必須ではない遺伝子中に外来ＤＮＡを挿入することも可能 である。例えば、挿入部位として制限酵素認識部位を用いることができる。 ２．ｂ 必須である遺伝子中に挿入部位を有するＰＰＶゲノム上のＰＰＶゲノム セグメントの同定 ｉ．例えばクローン化されたフラグメントとして存在するウイルスゲノムフラ グメントをシークエンスし、次に可能なＯＲＦを同定することにより、必須であ る遺伝子を同定することができる。 ＯＲＦが見いだされる場合、転写及び／または翻訳を示すことにより遺伝 子としてのその機能を確かめる。見いだされた遺伝子がウイルス増殖のために必 須であるかどうかを確かめるために、分子遺伝学的方法を用い、例えばこの遺伝 子の一部もしくは全遺伝子を取り除くことにより、または外来ＤＮＡを挿入する ことによりＰＰＶゲノムのこの遺伝子を破壊し、得られたウイルスの増殖能力を 次に調べる。得られたウイルス突然変異体が複製できない場合、その遺伝子は必 須遺伝子である可能性が高い。 ウイルス突然変異体が相補細胞系でのみ増殖できる場合、これはその遺伝子が 必須であることを示す。 挿入部位の例 ＰＰＶ Ｄ１７０１のプロテインキナーゼ遺伝子（ＰＫ遺伝子）を例として挙 げることができる。ＰＫ遺伝子は、ウイルスの増殖サイクルの後期に発現される 。配列表の配列番号２、配列番号９または配列番号１３に示されるＤＮＡ配列バ ージョンをＰＰＶゲノム上のＰＫ遺伝子を同定するために用いることができる。 分子生物学の常法を用いて、例えばハイブリダイゼーション実験、ゲノム配列分 析及び／またはポリメラーゼ連鎖反応によりこの遺伝子を含んでいる領域を見い だすことができる。 外来ＤＮＡを挿入する目的のために、必須遺伝子を部分的または完全にＰＰＶ ゲノムから取り除くことができる。しかしながら、ＰＰＶ遺伝子から領域を取り 除かずに必須遺伝子中に外来ＤＮＡを挿入することも 可能である。 ２．ｃ 遺伝子以外の領域及び／または遺伝子重複中に挿入部位を有するＰＰＶ ゲノム上のゲノムセグメントの同定 機能的遺伝子産物をコードせず、且ついかなる必須の調節機能も持たないゲノ ムセグメント（いわゆる遺伝子間セグメント）は、原則として、外来ＤＮＡの挿 入部位としての使用のために適している。反復配列を含んでいる領域は、領域の 一部の変化を残っている配列反復で埋め合わせることができるので特に適してい る。また、２またはそれ以上のコピーで存在する遺伝子、いわゆる遺伝子重複も この分類の範囲内に入る。 ＰＰＶゲノムのＩＴＲ領域または重複したセグメント中の遺伝子は、ウイルス ゲノム中に２コピーで存在する。そのような遺伝子の一つのコピーを除くかまた は改変し、外来ＤＮＡを挿入した後に、たとえ改変した遺伝子がウイルス増殖の ために重要であっても安定なＰＰＶ組み換え体を得ることができる。もう一つの 改変されていない遺伝子コピーがその遺伝子の機能のために十分である可能性が ある。 ｉ．遺伝子産物をコードしないゲノム配列を同定するために、ＰＰＶゲノムの 配列分析を用いる。配列分析後のＯＲＦまたはウイルス特異的な転写を示さず、 且ついかなる調節機能も持たないゲノム領域は、可能性のある挿入部位である。 特に、これらの領域中の制限酵素の切断部位は可能性のある挿入部位である。好 適な挿入部位が存在するかどうかを調べるために、既知の分子生物学的方法を用 いて外来ＤＮＡを可能性のある挿入部位中に挿入し、得られたウイルス突然変異 体の生存能力を次に調べる。可能性のある挿入部位に外来ＤＮＡを含むウイルス 突然変異体が増殖できる場合、調べている部位は好適な挿入部 位である。 ii．反復配列及び遺伝子重複を同定するために、ＤＮＡハイブリダイゼーショ ン実験及び／または配列分析を用いる。ハイブリダイゼーション実験では、ＰＰ Ｖからクローン化または単離したゲノムフラグメントをＰＰＶ ＤＮＡのフラグ メントとのハイブリダイゼーションのプローブとして用いる。全ＰＰＶゲノムの １個より多いフラグメントとハイブリダイズするＰＰＶのゲノムフラグメントは 、１つまたはそれ以上の反復配列を含む。反復配列または重複したゲノム領域を ゲノムフラグメント上に正確に位置づけるために、このフラグメントのヌクレオ チド配列を決定する。可能性のある挿入部位が全ＰＰＶゲノムの好適な挿入部位 であるかどうかを確かめるために、外来ＤＮＡを反復配列中または遺伝子重複の １コピー中に挿入しなければならず、そしてインサートを含んでいるＰＰＶゲノ ムフラグメントをウイルスゲノム中に組み込まなければならない。次に、外来Ｄ ＮＡを含んでいる組み換えウイルスの増殖能力を調べる。組み換えウイルスが増 殖する場合、同定した認識部位は挿入部位として適している。 挿入部位の例 ｉ．プロテインキナーゼの遺伝子とＨＤ１Ｒ遺伝子の間のゲノムセグメント（ 配列表の配列番号７）を遺伝子間領域の例として挙げることができる。 ii．ＩＴＲ領域（配列表の配列番号４）を反復配列の例として挙げることがで きる。 iii．（ＩＴＲ領域中の）遺伝子の可能性のある「ＯＲＦ３」及びＶＥＧＦ遺 伝子をＰＰＶ株Ｄ１７０１の遺伝子重複の例として挙げること ができる。ハイブリダイゼーション試験では、ＶＥＧＦ遺伝子を含んでいる領域 が、前述の株Ｄ１７０１で複製されウイルスゲノムのもう一方の末端に転位され ていて、従って２コピーのＶＥＧＦ遺伝子が存在することが示された。 配列表の配列番号４（「ＯＲＦ３」遺伝子を含むＩＴＲ配列）及び配列番号 ７（ＰＫ及びＨＤ１Ｒ遺伝子間の領域）の配列を用いて、ハイブリダイゼーショ ン実験、ゲノム配列分析及び／またはポリメラーゼ連鎖反応のような分子生物学 の常法を用いて他のＰＰＶの対応するゲノム領域を見いだすことができる。 ２．ｄ 挿入部位を同定するための他の方法 通例、ＰＰＶゲノム上の可能性のある挿入部位を見いだすためにウイルスゲノ ム配列の修飾も用いることができる。ヌクレオチドの置換、欠失及び／もしくは 挿入またはこれらの組み合わせがウイルス増殖を妨げないゲノム部位は、可能性 のある挿入部位である。可能性のある挿入部位が好適な挿入部位であるかどうか を調べるために、既知の分子生物学的方法を用いて外来ＤＮＡを可能性のある挿 入部位中に挿入し、得られたウイルス突然変異体の生存能力を調べる。ウイルス 組み換え体が増殖できる場合、調べている部位は好適な挿入部位である。 ２．１ 挿入部位の同定 ２．１．１ ＰＰＶゲノムの精製 分子遺伝学を用いてＰＰＶ挿入部位をクローニングする目的のために、ＰＰＶ ゲノムをまず精製する。（上記）１に従って調製したウイルスからゲノムを単離 し、次いで精製する。好ましくは、精製したウイルス粒子を溶剤及びプロテアー ゼの水溶液で処理することにより天然のウイル スＤＮＡを抽出する。 挙げることができる溶剤は、陰イオン性、陽イオン性、両性及び非イオン性の 溶剤である。好ましくはイオン性溶剤を用いる。ドデシル硫酸ナトリウム（ラウ リル硫酸ナトリウム）が特に好ましい。 挙げることができるプロテアーゼは、プロテイナーゼＫ及びプロナーゼのよう な、溶剤の存在下で働く全てのプロテアーゼである。プロテイナーゼＫを好まし いとして挙げることができる。 溶剤は０．１−１０容量％の濃度で用いられ、０．５−３容量％が好ましい。 プロテアーゼは０．０１−１０ｍｇ／ｍｌウイルスライセートの濃度で用いら れ、０．０５−０．５ｍｇ／ｍｌウイルスライセートが好ましい。 好ましくは、ＤＮａｓｅインヒビターの存在下で緩衝水溶液中でこの反応を実 施する。挙げることができる緩衝物質は、強塩基と弱酸の塩、例えばトリス（ヒ ドロキシメチルアミノメタン）、弱塩基と強酸の塩、例えば第一リン酸塩、また はこれらの混合物である。 以下のバッファー系、すなわち、トリス（ヒドロキシメチルアミノメタン）を 好ましいとして挙げることができる。 緩衝物質または緩衝系は、ＤＮＡが変性しないｐＨ値を保証する濃度で用いら れる。５−９のｐＨ値が好ましく、６−８．５の値が特に好ましく、７−８の値 が非常に特に好ましく、特に、中性の範囲での作用を挙げることができる。 ＤＮａｓｅインヒビターの例は０．１−１０ｍＭ（ミリモル）の濃度のエチレ ンジアミン四酢酸であり、約１ｍＭが好ましい。 その後、ウイルスライセートの親油性成分を抽出する。フェノール、クロロホ ルム、イソアミルアルコールまたはこれらの混合物のような溶媒を抽出剤として 用いる。まずフェノールとクロロホルム／イソアミルアルコールの混合物を用い ることが好ましく、抽出は１回またはそれ以上の工程で実施される。 ウイルスＤＮＡを単離するための別の方法の例は、ウイルスライセートのＣａ Ｃｌ密度勾配遠心分離またはゲル電気泳動である（文献番号１４を参照）。 核酸の抽出は文献番号１３に記述されている。 好ましくは、このようにして抽出したＤＮＡを例えばアルコール、好ましくは エタノールまたはイソプロパノールを用いて、そしてアルカリ金属の塩化物また は酢酸塩、好ましくは塩化リチウム、塩化ナトリウムまたは酢酸ナトリウムもし くは酢酸カリウムのような一価の塩を添加して、水溶液から沈殿させる（上記引 用文献を参照）。 ２．１．２ ゲノムフラグメントのクローニング このようにして精製したウイルスＤＮＡを今度はＤＮＡフラグメントを調製す るために用いる。このために、例えば制限酵素で処理する。適当な制限酵素の例 はＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、ＨｉｎｄIII及びＫｐｎＩである。また、ポリメラ ーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いてゲノムフラグメントを合成することができる。 このために、すでに知られているウイルスゲノムの配列セグメントからプライマ ーを選択し、このプライマー対により境界が定められるゲノムセグメントを例え ばＴａｑポリメラーゼまたはＰｆｕポリメラーゼを用いてインビトロで合成する 。 制限消化またはＰＣＲから得られるＤＮＡフラグメントを（Ｓａｍｂ ｒｏｏｃｋ ８９）に記述された方法を用いて、ベクター系にクローン化するこ とができる。例えば、各場合でクローン化されるＤＮＡフラグメントの大きさに より、プラスミドベクター、ラムダファージベクターまたはコスミドベクターが この目的のために利用できる。 ２．１．３ シークエンシング、遺伝子の同定及び特性化、並びにそれらの発現 の確認 ベクター中にクローン化されているゲノムフラグメントをまずシークエンシン グにより分析する。異なる制限酵素を用いて、挿入されたＤＮＡフラグメントの 地図を作製し、適当なサブフラグメントをプラスミドベクター中にクローン化す る。シークエンシング反応を例えばＰｈａｒｍａｃｉａにより供給されるＴ７シ ークエンシングキットを製造業者の説明書に従って用いて実施する。このために 必要な二本鎖のプラスミドＤＮＡを好ましくはＰＥＧ法（Ｈａｔｔｏｒｉ及びＳ ａｋａｋｉ １９８５）を用いて調製する。ゲノムフラグメント中に存在する「 読み枠」（ＯＲＦ）をコンピューター分析（ＧＣＧ、上記参照）により同定する 。同定したＯＲＦの配列をデータベースに含まれている既知の機能の他の遺伝子 配列と比較することによりそれらのそれぞれの機能に関する情報を得ることがで きる。同定したＯＲＦのそれぞれの対応する転写物をウイルス感染細胞で検出す ることによりこれらを機能的に特徴づける。このために、例えばＡＧＰＣ法（Ｃ ｈｏｍｃｚｙｎｓｋｉ及びＳａｃｃｈｉ、（２０）１９８７）を用いてウイルス 感染細胞から全ＲＮＡを単離する。次に、ノーザンブロット分析またはプライマ ー伸長及びＲＮＡ保護実験により特定の転写物並びにそれらの５’及び３’末端 を同定することができる。代わりの方法として、同定したＯＲＦによりコードさ れ るウイルスタンパク質をインビトロで発現させ、次に発現産物を用いて抗血清を 得て、そしてこれらの抗血清を用いてＯＲＦの発現を示すことが可能である。 見いだされた遺伝子がウイルス増殖のために必須でないかどうかを確かめるた めに、遺伝子破壊または遺伝子欠失によりその遺伝子を壊すことができる。これ に関連して、全遺伝子またはその一部をＰＰＶゲノムから取り除くか、または外 来遺伝子配列を挿入することにより遺伝子の読み枠を遮断する。得られたウイル スの増殖能力を調べる。破壊された遺伝子の非存在下でもウイルスが複製できる 場合、この遺伝子は必須でない遺伝子である。 ２．１．４ ＰＰＶゲノムフラグメントを含んでいるクローンの選択 上で得られたＰＰＶゲノムフラグメントを含んでいるクローンのいずれを用い るかは、調製する組み換えＰＰＶが（ｉ）複製できるかまたは（ii）複製能力を 欠いているかによる。 ｉ．挿入及び／または欠失にもかかわらず複製できる組み換えＰＰＶを調製す る場合は、ウイルス増殖のために必須でない遺伝子もしくは遺伝子以外のゲノム 領域を含むかまたは遺伝子重複を含むクローン化されたウイルスゲノムフラグメ ントに対してさらなる処理を実施する。 手元にある遺伝子またはゲノム領域がウイルスゲノムの必須でない領域また は遺伝子重複であるかどうかを調べるためにウイルス突然変異体を用いる。この ために、分子生物学的方法を用いて、例えば当該領域を部分的または完全に除く ことにより調べているＰＰＶの遺伝子またはゲノム領域を不活性化し、そしてウ イルス突然変異体の増殖能力を調べる。ウイルス突然変異体が不活性化した当該 遺伝子またはゲ ノム領域にもかかわらず複製できる場合、調べている遺伝子またはゲノム領域は 必須でない領域である。 必須でない遺伝子の完全なバージョンを含むＰＰＶのクローン化されたゲノム フラグメントが好ましい。これに加えて、これらの遺伝子またはゲノム領域の両 末端に隣接するウイルスゲノム領域も存在すべきである。隣接する領域の長さは １００塩基対より多くなければならない。そのようなゲノムクローンが利用でき ない場合は、分子生物学的方法により存在する遺伝子クローンからそれらを調製 することができる。クローン化されたゲノムフラグメントが本調製のために必要 ではないゲノム領域をさらに含んでいる場合は、これらの領域をサブクローニン グにより取り除くことができる。 ii．挿入及び／または欠失の結果、感染性の子孫を生じる能力を失っている組み 換えＰＰＶを調製する場合は、ウイルス増殖のために必須である遺伝子または遺 伝子以外のゲノム領域を含むクローン化されたウイルスゲノムフラグメントをさ らなる処理に供する。 手元にある遺伝子またはゲノム領域がウイルスゲノムの必須領域であるかどう かを調べるためにウイルス突然変異体を用いることができる。このために、分子 生物学的方法を用いて、例えば当該領域を部分的または完全に除くことにより調 べているＰＰＶの遺伝子またはゲノム領域を不活性化し、そしてウイルス突然変 異体の増殖能力を調べる。当該遺伝子またはゲノム領域を不活性化した結果、ウ イルス突然変異体がもはや増殖できない場合、調べている遺伝子またはゲノム領 域は必須領域である。 必須遺伝子の完全なバージョンを含むＰＰＶのクローン化されたゲ ノムフラグメントが好ましい。これに加えて、隣接するウイルスゲノム領域も同 様にこれらの遺伝子またはゲノム領域の両末端に存在すべきである。隣接する領 域の長さは１００塩基対より多くなければならない。そのようなゲノムクローン が利用できない場合は、分子生物学的方法により存在するゲノムクローンからそ れらを調製することができる。クローン化されたゲノムフラグメントが本調製の ために必要ではないさらなるゲノム領域を含んでいる場合は、これらの領域をサ ブクローニングにより取り除くことができる。 ２．２ 挿入部位としての、ＩＴＲ領域、ＶＥＧＦ遺伝子、ＰＫ遺伝子、１０ｋ Ｄａタンパク質をコードする遺伝子及びＰＫ遺伝子とＨＤ１Ｒ遺伝子の間の領域 ＩＴＲ領域、ＶＥＧＦ遺伝子、ＰＫ遺伝子、１０ｋＤａタンパク質をコードす る遺伝子またはＰＫ遺伝子とＨＤ１Ｒ遺伝子の間の遺伝子間領域をＰＰＶにおけ る挿入部位として用いる場合、これらの挿入部位を含むＰＰＶゲノムの対応する 領域を単離しなければならない。このために、ＰＰＶゲノムの対応する領域をク ローン化する。 ２．２．１ ＶＥＧＦ遺伝子のクローニング ＶＥＧＦをコードする遺伝子をＰＰＶゲノム上に位置づけ、次にその隣接する ゲノムセグメントと共に部分的にまたはその全体を単離する。このために、好ま しくはＰＰＶを＃１に従って増やし、ゲノムを＃２．１．１に従って精製する。 ａ．ＶＥＧＦ遺伝子を好ましくはポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により増幅 する。この反応のために必要である開始配列（プライマー）を配列表の配列番 号１に示されるＶＥＧＦ遺伝子のＤＮＡ配列から得 る。次に、好ましくは、得られる増幅産物をクローン化する。 ｂ．ＶＥＧＦ遺伝子及びその隣接するゲノムセグメントを含む領域を好ましくは ＰＰＶゲノムを断片化し、対応するゲノムフラグメントを単離し、クローニング することにより得る。このために、好ましくは制限酵素ＨｉｎｄIIIを用いて、 精製したウイルスのゲノムを＃２．１．２に記述したように切断する。ＶＥＧＦ 遺伝子及びその隣接するゲノムセグメントを含むゲノムフラグメントを同定する ために、好ましくは、酵素消化後に得られるゲノムフラグメントを電気泳動また はクロマトグラフィーの方法により分画する。 アガロースまたはポリアクリルアミド中での電気泳動分画を ‐Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９８７−１９８８、Ｗｉｌｅｙ−Ｉｎｔｅｒｓ ｃｉｅｎｃｅ、１９８７． ‐Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、Ｐｅｒｂａｌ、第２版、Ｗｉｌｅｙ Ｉｎｔｅｒ ｓｃｉｅｎｃｅ、１９８８ ‐Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、上記引用 ‐Ｖｉｒｏｌｏｇｉｓｃｈｅ Ａｒｂｅｉｔｓｍｅｔｈｏｄｅｎ ［Ｐ ｒａｃｔｉｃａｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｖｉｒｏｌｏｇｙ］、 第III巻、Ｇｕｓｔａｖ Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｖｅｒｌａｇ、１９８９に記述さ れている標準的な方法を用いて実施する。 例えば、特定の核酸プローブでのハイブリダイゼーションによりＶＥＧＦ遺伝 子及びその隣接する配列を保有するゲノムフラグメントを同定する。このために 、分画したゲノムフラグメントをフィルターに 移し、サザンブロット法に従ってＶＥＧＦに特異的な標識した核酸プローブでハ イブリダイズさせる。ゲノムフラグメントの移行及びハイブリダイゼーションの 方法をＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、上記引用中の「サザンブロッティ ング」に記述されているような標準的なプロトコールに従って実施することがで きる。プローブとして用いることができるオリゴヌクレオチドまたは核酸フラグ メントを配列表の配列番号１から得ることができる。例えば、配列番号１により 同定することができるＴａｑｌサブフラグメント（３６６ｂｐ）をハイブリダイ ゼーションプローブとして用いる。 ＶＥＧＦ遺伝子及びその隣接するゲノムセグメントの一部または好ましくは全 部を含むことが示されたゲノムフラグメントを単離し、クローン化する。例えば 、電気溶出を用いるかまたは低融点アガロース法を用いることにより適切なゲノ ムフラグメントをゲルの適切な領域から電気泳動的に単離する。 ＶＥＧＦ遺伝子をクローン化するために、上で調製したゲノムフラグメントを バクテリアまたは真核生物のベクター中に挿入する。最初はプラスミドまたはフ ァージベクターが特に好ましい。ゲノムフラグメントを挿入するために、二本鎖 のプラスミドまたはファージベクターＤＮＡ分子を挿入に適した末端が生じるよ うに制限酵素で処理する。 ｐＢＲ３２２及びその誘導体、例えばｐＳＰＴ１８／１９、ｐＡＴ１５３、ｐ ＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ１８／１９及びｐＳＰ６４／６５のような既知のプラス ミドをプラスミドとして用いる。 例えば、ファージラムダＺＡＰ及びファージラムダｇｔ１０／１１またはファ ージＭ１３ｍｐ１８／１９のようなファージラムダの既知 の変種をファージベクターとして用いる。 用いることができる制限酵素は、例えばＧｅｎｅ 第９２巻（１９８９）Ｅｌ ｓｅｖｉｅｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒｓ ＢＶ Ａｍｓｔｅｒｄ ａｍから既知である。 挿入する過剰のＤＮＡフラグメントと制限酵素で処理したプラスミドまたはフ ァージベクターを例えば５：１のおおよその比率で混合し、その後、この混合物 をＤＮＡリガーゼで処理してフラグメントをベクターに連結する。プラスミドま たはファージを増やすために、連結混合物を原核または真核細胞、好ましくはバ クテリア（例えば大腸菌株Ｋ１２及びその誘導体）中に導入し、後者は複製され る。 Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ、上記引用に記述されているようにバク テリアを形質転換し、選択する。 好ましくはハイブリダイゼーション実験により、特に好ましくは配列分析によ り、外来ＤＮＡの同一性を確認する。場合によってはサブクローニングを実施す る。 ２．２．２ プロテインキナーゼ遺伝子のクローニング プロテインキナーゼをコードする遺伝子をＰＰＶゲノム上に位置づけ、次にそ の隣接するゲノムセグメントと共に部分的にまたはその全体を単離する。 ＶＥＧＦ遺伝子のクローニングのために記述したように、ＰＰＶゲノムを断片 化し（切断部位、図１を参照）、好ましくは続いてこれらのフラグメントをクロ ーニングし、ＰＰＶゲノムの隣接するＤＮＡ配列と共にＰＫ遺伝子の一部または 好ましくは全ＰＫ遺伝子を含むフラグメントまたはクローンを選択することによ り、この領域を単離することができ る。ＰＣＲのプライマーとしてまたはハイブリダイゼーションのプローブとして 用いることができるＤＮＡ分子を配列表の配列番号２または配列番号９から得る ことができる。 場合によってはサブクローニングを実施する。 ２．２．３ １０ｋＤａタンパク質をコードする遺伝子のクローニング ＶＥＧＦ遺伝子及びＰＫ遺伝子に対して詳細に記述した（上記）方法を用いて １０ｋＤａタンパク質をコードする遺伝子をＰＰＶゲノム上に位置づけ、その隣 接するＰＰＶゲノム配列と共に部分的にまたは好ましくはその全体を単離する。 この場合、好ましくはＰＣＲ及び／またはクローニング並びに好適なクローン の同定及び選択により、１０ｋＤａタンパク質の遺伝子またはその一部を含むＰ ＰＶゲノムの領域を得る。 文献番号８は、ＰＣＲのプライマーとしてまたはハイブリダイゼーションのプ ローブとして用いることができるＤＮＡ分子の詳細を与えている。場合によって はサブクローニングを実施する。 ２．２．４ 逆方向末端反復領域またはＰＫ遺伝子とＨＤＩＲ遺伝子の 間に存在するゲノムセグメントのクローニング この方法は、詳細に記述したＶＥＧＦ遺伝子のクローニング（上記）に相当す る。適切な領域を単離するためにＰＣＲのプライマーとしてまたはハイブリダイ ゼーションのプローブとして用いることができるＤＮＡ分子は、配列表の配列番 号４（ＩＴＲ領域）及び配列番号７（ＰＫ遺伝子とＨＤ１Ｒ遺伝子の間の領域） から明らかである。 ３． 挿入プラスミドまたは欠失プラスミドの構築 第２節に記述したように同定し、位置づけ、そしてクローン化するＰ ＰＶゲノムフラグメントに基づいて、ＰＰＶゲノム中に外来ＤＮＡを挿入するた めに用いることができる、いわゆる挿入プラスミドを調製する。挿入プラスミド は、ＰＰＶゲノムのセグメントが隣接した、ＰＰＶ中に挿入される外来ＤＮＡを 保有する。挿入プラスミドを調製するためには様々な選択肢があり、以下のもの を例としてここで挙げることができる。 ３．１ ２．１．４または２．２に記述したようにして得られるクローン化され たゲノムフラグメント中の唯一の制限酵素認識部位の同定または調製及び外来Ｄ ＮＡの挿入 １箇所だけに存在する、すなわち唯一の制限切断部位を例えば決定したＰＰＶ ヌクレオチド配列中に同定することができる（２．１．３を参照）。 制限酵素の新しい唯一の切断部位を保有する合成により調製したオリゴヌクレ オチドをこれらの唯一の制限部位中に組み込むことがきる。 得られたプラスミドを先に記述したように増やし、選択する。 また、ＰＰＶゲノムフラグメント中に新しい唯一の制限酵素認識部位を組み込 むために、Ｊａｃｏｂｓ等（文献番号１２）により記述されたようにＰＣＲを用 いることができる。 同定し、そして／または調製した唯一の制限酵素認識部位を外来ＤＮＡをＰＰ Ｖゲノム中に挿入するために用いる。 外来ＤＮＡを既知の方法を用いて挿入する（文献番号１１）。 ３．２ クローン化されたゲノムフラグメント中のゲノム配列の欠失及び外来Ｄ ＮＡの挿入 例えば、クローン化されたＰＰＶゲノムフラグメントを好ましくは１箇所より 多い、特に好ましくは２箇所の認識部位を有する制限酵素で処 理することにより、これらからサブフラグメントを除くことができる。酵素処理 の後に、得られたフラグメントを上記のように例えば電気泳動的に分画し、単離 し、そして適切なフラグメントをリガーゼ処理により再び一緒に連結する。得ら れたプラスミドを増やし、欠失プラスミドを選択する。 代わりに、エンドヌクレアーゼ、例えば酵素Ｂａｌ３１でフラグメントを二方 向に分解するために開始点としてＰＰＶゲノムフラグメント上の唯一の制限酵素 認識部位を用いる。酵素が作用する時間により欠失の大きさを決めることができ 、ゲル電気泳動によりこれを調べることができる。３．１（上記）に記述したよ うに、新しく生じたフラグメントの末端に合成オリゴヌクレオチドを連結する。 全ＰＰＶ集団のごくわずかな割合において、外来遺伝子がＰＰＶゲノム中に導 入される。 このために、組み換えＰＰＶを野生型ＰＰＶから分離するための選択系が必要 である（文献番号１６）。 大腸菌のグアニル−ホスホリボシルトランスフェラーゼ遺伝子に基づくｇｐｔ 選択系を用いることが好ましい。真核細胞で発現されると、この遺伝子はプリン 代謝のインヒビターであるマイコフェノール酸（ｍｙｃｏｐｈｅｎｏｌｉｃ ａ ｃｉｄ）に対する耐性を与える。組み換えベクターウイルスの構築におけその使 用はしばしば記述されている（文献番号１６／番号１７を参照）。 ４． １ないし１２による組み換えＰＰＶの構築 ａ．好適な宿主細胞に挿入または欠失プラスミドのＤＮＡをトランスフェクト し、同時にＰＰＶを感染させる ｂ．好適な宿主細胞に挿入または欠失プラスミドのＤＮＡをトランスフェクト し、次にＰＰＶを感染させる ｃ．好適な宿主細胞にＰＰＶを感染させ、次に挿入または欠失プラスミドのＤ ＮＡをトランスフェクトする ことにより外来ＤＮＡをＰＰＶゲノム中に挿入する。 この目的のために適している処置方法は既知である。リン酸カルシウム技術、 リポソームが媒介するトランスフェクションまたはエレクトロポレーションのよ うな既知の方法を用いてトランスフェクションを実施することができる（文献番 号１８を参照）。 １．ＰＰＶでの感染： 外来ＤＮＡを含んでいるＰＰＶを調製するためには、十分なウイルス増殖及 び効率のよいトランスフェクションが可能である細胞培養物、例えば永久ウシ腎 臓細胞系ＢＫ−ＫＬ−３Ａが好ましい。 ２．挿入または欠失プラスミドＤＮＡの調製 先に記述した方法により得られ、そして挿入または欠失プラスミドを保有す る形質転換細胞、例えばバクテリアを増やし、これらの細胞から既知の方法でプ ラスミドを単離し、さらなる精製に供する。例えば、ＣｓＣｌ等の密度勾配中の 等密度遠心法により、または市販されているシリカ粒子でのアフィニティー精製 により精製を実施する。 ３．トランスフェクション 好ましくは、精製した環状または直鎖状プラスミドＤＮＡをトランスフェク ションのために用いる。例えば、第２項（上記）に示したように精製を実施する 。 ４．トランスフェクトされ、且つ感染した細胞の培養 上記の方法を用いて細胞を培養する。細胞変性効果が現れると培養培地を取 り出し、場合によっては遠心分離または濾過により細胞屑を除き、場合によって は保存し、そしてまたウイルスの単一プラーク精製のための常法を用いて整える 。 組み換えＰＰＶを調製する場合、以下の方法を用いる。 融合するまで生育したＢＫ−ＫＬ−３Ａ細胞を０．００１から５まで、好まし くは０．１のＭＯＩ（感染多重度）である感染量で感染させる。２時間後に、Ｃ ａＰＯ₄−グリセロールショック法を用いるか、またはトランスフェクションキ ット（ＤＯＳＰＥＲ、Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ-Ｍａｎｎｈｅｉｍ）を製造業者の 説明書に従って用いて、例えば、プラスミドｐＭＴ−１０のＤＮＡ（２−１０μ ｇ）で感染細胞をトランスフェクトする。次に、これらの細胞培養物を培地と共 に３７℃で５％ＣＯ₂大気下で３から６日までの間ｃｐｅまたはプラーク形成が 肉眼で見えるようになるまでインキュベートする。 挿入した外来ＤＮＡにより、 ａ．例えばＤＮＡ／ＤＮＡハイブリダイゼーションを用いて外来ＤＮＡを検出 する ｂ．ＰＣＲを用いて外来ＤＮＡを増幅する ｃ．組み換えウイルスを用いて外来ＤＮＡを発現する ことで組み換えＰＰＶを同定する。 ａ．に関して、 このために、当該ウイルスからＤＮＡを単離し、そして挿入した外来ＤＮＡ と少なくとも部分的に同一である核酸を用いてハイブリダイズさせる。 好ましくは、単一プラーク精製し、そして組み換え体として同定したＰＰＶ を外来ＤＮＡの存在及び／または発現に関してもう一度調べる。外来ＤＮＡを安 定に含み、且つ／または発現する組み換えＰＰＶがさらなる用途のために使用で きる。 ｃ．に関して、 例えば、細胞にウイスルを感染させ、次に外来ＤＮＡによりコードされるタ ンパク質に対する特異的な抗体を用いる免疫蛍光分析を実施するか、または感染 した細胞のライセートを用いて外来ＤＮＡによりコードされるタンパク質に対す る抗体を用いる免疫沈降もしくはウェスタンブロッティングを実施することによ り、タンパク質レベルで外来ＤＮＡの発現を検出することができる。 特定の転写物を同定することによりＲＮＡレベルで外来ＤＮＡの発現を検出 することができる。このために、ウイルスが感染した細胞からＲＮＡを単離し、 挿入した外来ＤＮＡと少なくとも部分的に同一であるＤＮＡプローブを用いてハ イブリダイズさせる。実施例 以下の実施例に、同種起源及び異種起源の遺伝子またはそれらの一部の挿入及 び発現のために適しているＰＰＶゲノムの領域を記述する。好適なゲノムフラグ メントは、ＰＰＶオビス株Ｄ１７０１（及びその各誘導体）のＨｉｎｄIIIフラ グメントＩに含まれている（配列表の配列番号８及び配列番号１２）。１．ＨｉｎｄIIIフラグメントＩのクローニング 精製したウイルスＤＮＡを制限酵素ＨｉｎｄIIIで切断した後、得られたＤＮ Ａフラグメントをアガロースゲル電気泳動で分離し、約５．６ｋ ｂｐの大きさであるフラグメントＩを切り出し、Ｑｉａｅｘ^R法（商標）（Ｑｉ ａｇｅｎ）を用いて単離し、精製した。標準的な技術（Ｍａｎｉａｔｉｓ等）を 用いて、このＤＮＡフラグメントをＨｉｎｄIIIで切断してＣＩＰ（子ウシ腸ホ スファターゼ）で処理したベクタープラスミドｐＳＰＴ１８（Ｂｏｅｈｒｉｎｇ ｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｍ）中にクローン化した。得られた組み換えプラスミド、 ｐＯＲＦ−１及びｐＯＲＦ−２はインサートの方向のみが異なる。制限地図の構 築により、図１に示されるようなさらなるサブクローニングを実施することがで きた。全ての組み換えプラスミドＤＮＡの同一性及びウイルス起源を確かめるた めに、サザンブロットハイブリダイゼーションを用いてこれらを制限酵素で消化 したウイルスまたはプラスミドのＤＮＡに関して調べた。２．ＤＮＡシークエンシング 異なる組み換えプラスミドの二本鎖ＤＮＡ並びにベクタープラスミドｐＳＰＴ １８のクローニング部位の２つの末端に結合するＳＰ−６特異的及びＴ７特異的 プライマーを用いてＤＮＡシークエンシングを実施した。サンガーのジデオキシ チェインターミネーション法を³⁵Ｓ−［α］−ｄＡＴＰ及びＴ７−ＤＮＡポリメ ラーゼの存在下で製造業者（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｂｉｏｔｅｃｈ）の推奨に従 って実施した。得られたＤＮＡ配列に合わせて非常に多数のオリゴヌクレオチド を合成し、次にＨｉｎｄIIIフラグメントＩの両鎖をシークエンシングするため に用いた。ウイルスＤＮＡインサートの比較的高いＧ＋Ｃ含有量（６４．７８％ ）によるシークエンシングの誤りまたはバンドの縮重を分離するために７−デア ザ（Ｄｅａｚａ）−ＧＴＰを用い、場合によっては、シークエンシング生成物を ホルムアミドを含有する変性ポリアクリルアミドゲルで 分離した。３．可能性のある遺伝子の同定 得られたＤＮＡ配列（配列表の配列番号８及び配列番号１２）のコンピュータ ー補助分析によりいくつかの可能性のある読み枠（ＯＲＦ）が明らかになった。 これらのＯＲＦから得られるアミノ酸配列を遺伝子相同性検索（例えばＧＣＧプ ログラム）に用いた。その結果、以下の遺伝子との顕著なアミノ酸の相同性が検 出された（図１も参照）。３．１ 異なる哺乳類種（例えばマウス、ラット、モルモット、ウシ及びヒト） の血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）並びにＰＰＶ株ＮＺ−２及びＮＺ−７で最近記 述されたＶＥＧＦ遺伝子相同物（文献番号６）ともアミノ酸の相同性を有するＯ ＲＦが見いだされた（３６．１ないし３８．３％の同一性；５２．８ないし５８ ．６％の類似性）。各種オルトポックスウイルスのような他のポックスウイルス は、対応する遺伝子相同性を有することが知られていない。ＶＥＧＦと称するこ のＯＲＦは３９９ヌクレオチドを包含し、１３２アミノ酸を含んで１４．７７ｋ Ｄａの計算された分子量を有するポリペプチドをコードする。ノーザンブロット ハイブリダイゼーション、ＲＮＡ保護実験及びプライマー伸長試験を用いた全Ｒ ＮＡまたはオリゴ（ｄｔ）で選別したＲＮＡに対する転写分析により、ＶＥＧＦ が感染後（ｐ．ｉ．）約２時間から初期遺伝子として発現されることが確かめら れた。特定のｍＲＮＡが、ワクシニアウイルス初期遺伝子のプロモーターに典型 的な共通モチーフの重要な領域と１００％の相同性を示す配列のすぐ下流で始ま り、４２２から４２５塩基までから成ることが見いだされた。ＶＥＧＦ ｍＲＮ Ａの３’末端は、例えばワクシニアウイルス遺伝子の 初期転写物が共有する共通配列中に位置づけられた。このｍＲＮＡの大きさはノ ーザンブロットハイブリダイゼーションにより約５００塩基であると概算され、 これは約１００塩基の長さを有するポリ（Ａ）セグメントを示す。３．２ いくつかのオルトポックスウイルス（例えばワクシニアウイルス、痘瘡 ウイルス（ｖａｒｉｏｌａ ｖｉｒｕｓ）またはショープ線維腫ウイルス（Ｓｈ ｏｐｅ−ｆｉｂｒｏｍａ ｖｉｒｕｓ））に存在し、Ｆ１０Ｌとして知られてい る対応する遺伝子と相同性を有するプロテインキナーゼ（ＰＫ）の可能性のある ものをコードする別のＯＲＦが見いだされた。この遺伝子相同物は、ＰＰＶ株Ｄ １７０１の感染サイクルの後期に転写される（ｐ．ｉ．１２から１６時間まで） 。転写開始点は、ワクシニアウイルス後期遺伝子の既知のプロモーターと高度の 相同性を示す領域の少し下流に位置する。３．３ 既知の遺伝子配列といかなる顕著な相同性も現在まで示していない別の 可能なＯＲＦが見いだされた。特に興味深いのは、ＨＤ１Ｒ遺伝子と称する遺伝 子の可能性のあるものである（図１）。上記のような分析により、約１．６ｋｂ の大きさを有する特定の初期ｍＲＮＡの転写が示された。３．４ 最後に、Ｆ１０Ｌの３’末端及びＶＥＧＦの５’末端と重なるＯＲＦが コンピューターにより見いだされた（Ｆ９Ｌ、図１）。配列比較により、ワクシ ニアウイルスＦ９Ｌ遺伝子との相同性が示された。３．５ ｏｒｆ株ＮＺ−２及びＮＺ−７の既知のＤＮＡ配列と比較することによ り、Ｄ１７０１ゲノムのいわゆるＩＴＲ領域の始まりをＨｉｎｄIIIフラグメン トＩのヌクレオチド位置１６１１に定めることが可 能であった。ＩＴＲ領域は、ポックスウイルスゲノムの末端に現れ、且つゲノム のもう一方の末端で逆方向に同様に存在する配列領域であり、それ故、逆方向反 復領域（ＩＴＲ）と呼ばれる（配列表配列番号４を参照）。配列比較の結果は、 ｐＯＲＦ−１中にクローン化したＤ１７０１ ＨｉｎｄIIIフラグメントＩのゲノ ムにおける位置決定の実験と一致する。このフラグメント及びおそらく同一であ るＨｉｎｄIIIフラグメントＨの地図を図２に示す。これから、Ｄ１７０１ゲノ ムのＩＴＲは約２．６ｋｂｐを包含すると結論づけることができる。 Ｄ１７０１ ＶＥＧＦ ｍＲＮＡの３’末端を決定する実験により、少なくと も１種のさらなるウイルス特異的ＲＮＡが、ＩＴＲに移ってから約４０及び２２ ０ｂｐの間のＩＴＲ中で始まることが示された。ＮＺ−２とのアミノ酸の相同性 のために、対応する遺伝子をＯＲＦ３と称した（図１）。ＯＲＦ３ ｍＲＮＡの 推定上の５’末端の前にはポックスウイルス初期プロモーターに典型的な共通配 列がある。これまでのところ他の遺伝子との相同性を見いだすことはできない。４．ＨｉｎｄIIIフラグメントＩ中へのＤＮＡ配列の導入 同種起源または異種起源のＤＮＡ配列を導入するために記述した（プラスミド ｐＯＲＦ−１及びｐＯＲＦ−２にクローン化された）ＨｉｎｄIII ＤＮＡフラグ メントを用いることができるかを調べた。以下に、この目標を達成するために３ つの異なる方法を用いた。 １１Ｋワクシニアウイルスプロモーターの制御下に大腸菌からの機能的Ｌａｃ Ｚ遺伝子を含むプラスミドｐＧＳＲＺを以下の実施例のために構築した。この目 的のために、プラスミドｐＵＣIIＬＺ（文献番号７を参照）のＤＮＡの関係する 部分を単離し、プラスミドｐＳＰＴ１８中に クローン化した。ｐＧＳＲＺから３．２ｋｂ Ｓｍａｌ／ＳａｌＩフラグメント を単離することにより、この機能的な１１Ｋ／ＬａｃＺ遺伝子の組み合わせ（以 下、ＬａｃＺカセットと称する）を得ることができる（図７）。 選択カセットの構築 図７に示すように、プラスミドｐＧＳＲＺ（ワクシニアウイルスプロモーター Ｐ_11Kの制御下にＬａｃＺ遺伝子を含む）、ｐＭＴ−１（ＰＰＶ ＶＥＧＦプロモ ーターを含む）及びｐＭＴ５（大腸菌ｇｐｔ遺伝子を含む）を用いて様々ないわ ゆる選択カセットを構築した。ＶＥＧＦプロモーター（Ｐ_VEGF）の配列に相当す る合成の相補的オリゴヌクレオチドを調製し、ｐＳＰＴ１８のＳｍａＩ切断部位 中に挿入した（ｐＭＴ−１）。次にＢａｍＨＩ切断を用いて、（ｐＧＳＲＺから のＢａｍＨＩフラグメントをｐＳＰＴ１８に挿入することにより得られた）ｐ１ ８ＺからＬａｃＺ遺伝子を、またはｐＭＴ−５からｇｐｔ遺伝子をそれぞれ取り 出し、次にｐＭＴ−１にそれらを挿入することによりプラスミドｐＭＴ−２及び ｐＭＴ−４を調製した（図７）。 機能的ｇｐｔ遺伝子をＧＰＴプラスミドｐＭＳＧ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ−Ｂｉ ｏｔｅｃｈ）からＰＣＲを用いて増幅し、次にいわゆるＴＡクローニングを製造 業者（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．）の説明書に従って用いてベクターｐＣ ＲII中にクローン化した。 続いて、図７に図式的に示されるように、１１Ｋプロモーター及び／またはＰ_VEGF の制御下にＬａｚＺ遺伝子またはｇｐｔ遺伝子をそれぞれ示した組み合わせ 及び方向で発現する二重選択カセットを構築することが可能であった。 実施例ＸＸ（ＬａｃＺ−ＶＥＧＦ欠失）またはＹＹ（遺伝子間−Ｂａ１３１） に従って、適切な制限酵素切断及び単離後に、これらの選択カセットを異なるＰ ＰＶ ｏｒｆ ＤＮＡプラスミド中に挿入することができる。ＰＰＶ Ｄ１７０１ ＶＥＧＦ遺伝子の３１２ｂｐの欠失を示す記述したプラスミドｐｄＶ−５００ 中に二重選択カセットを挿入した後にプラスミドｐＭＴ−１０が構築された。こ の構築により、欠失により取り除かれたＶＥＧＦ ＯＲＦの場所に機能的なｌａ ｃＺ及びｇｐｔ遺伝子が挿入された。一時的発現試験の後に、ＰＰＶ Ｄ１７０ １が感染した細胞においてＬａｃＺ遺伝子の活性を示すことが可能であり（示さ ない）、従って、続いてｇｐｔ及びｌａｃＺを発現しているＤ１７０１のＶＥＧ Ｆ欠失突然変異体の選択を実施した。４．１ 遺伝子間の非コーディング領域中への挿入 遺伝子間の非コーディング部分に位置する新しい唯一の制限部位を同定するか または作製した。次に、機能的で検出可能な遺伝子産物（例えば大腸菌ＬａｃＺ 遺伝子）またはそれらの一部をコードする外来ＤＮＡ配列を挿入するためにこれ らの部位を用いる。実施例４．１．１ プラスミドｐＯＲＦ−ＰＢ（図１）は、プロテインキナーゼ（Ｆ１０Ｌ）及び ＨＤ１Ｒ遺伝子間に位置する単一のＮｒｕＩ切断部位を含む。ｐＯＲＦ−ＰＢを この制限酵素で直鎖状にした後、（平滑化反応後）それにＬａｃＺカセットを平 滑末端ライゲーションにより連結した。機能的なＬａｃＺ遺伝子を含む組み換え プラスミドを例えばＢｇｌIIでの切断後に選択し、ＬａｃＺ特異的なプローブを 用いるサザンブロットハイブリダイゼーション及びＬａｃＺ／ＰＰＶＤＮＡの変 わり目の部分的 シークエンシングにより正しい挿入を示した。実施例４．１．２ 上の実施例に記述したものと同じ方法をＶＥＧＦ遺伝子の下流（ＢｓｔＥII部 位での切断、図１）及びＩＴＲ領域中の遺伝子の可能性のあるＯＲＦ３（ｐＳＰ Ｔ１８クローニング部位中のＸｂａＩ部位の切断を防ぐためにＸｂａＩでの部分 分解）に用いた。実施例４．１．３ クローン化されたＰＰＶ ＤＮＡフラグメントのあらゆる所望する位置に新し い唯一の制限部位を導入するためにＰＣＲ突然変異生成の技術を用いることがで きる（図５、文献番号１２を参照）。この目的のために、プライマー対Ｅ１＋Ｅ Ｖ２（ＰＣＲ Ａ）及びＥＶ１＋ＸＢ（ＰＣＲ Ｂ）をそれぞれ用いて２つのＰＣ Ｒ反応を別個に実施する。全てのプライマーは、定められた配列の位置でＰＰＶ ＤＮＡ配列と同一である２５ヌクレオチドから成る。プライマーＸＢは例えば ＸｂａＩ部位（図１）のまわりの本物の配列であるが、プライマーＥ１の５’末 端には新しいＥｃｏＲＩ部位を導入し、（互いに相補的である）プライマーＥＶ １及びＥＶ２には新しいＥｃｏＲＶ部位を導入した。ＬａｃＺカセットを導入す るために選んだ位置に、ｐＯＲＦ−１またはｐＯＲＦ−２の全配列中には本来存 在しないＥｃｏＲＶ部位を挿入した。反応Ａ及びＢから得られるＰＣＲ産物を精 製し、一本鎖に変性し、再会合条件下で一緒に混合し、次に最後のＰＣＲ反応、 すなわち、ＰＣＲ Ｃにこれらを用いる。この実施例では、ｐＯＲＦ−１の左側 の７９３ｂｐを伸長するために今度はＥ１及びＸＢをプライマーとして用いる。 ゲル単離及び精製後に、反応Ｃから得られるＰＣＲ産物をＥｃｏＲＩ及びＸｂａ Ｉで切断 し、次にＥｃｏＲＩ及びＸｂａＩで切断したプラスミドｐＯＲＦ−ＸＢに連結す る。その結果、プラスミドｐＯＲＦ−１ＥＶ（図５）は所望する位置にＥｃｏＲ Ｖ制限部位を含み、次にこれを直鎖状にしてＬａｃＺカセットに連結するために 用いることができる。 さらに、特定の塩基変化または単一塩基の欠失を含むミスマッチプライマーを この実施例に記述した方法に用いて、ウイルスＤＮＡ配列中のあらゆる所望する 位置に例えば翻訳終止コドンまたはアミノ酸欠失を作製することができる。４．２ ｏｒｆ配列の欠失のない遺伝子内挿入 記述したＯＲＦのいずれかのコーディング配列中に、選択した遺伝子中に１箇 所だけ存在する制限部位で切断した後に、新しいまたはさらなる配列を導入する ことができる。実施例４．２．１ プラスミドｐＯＲＦ−１を直鎖状にするために、Ｆ１０Ｌ遺伝子相同物の右側 の部分に位置する唯一のＸｃｍＩ部位を用いた。ＬａｃＺカセット及び切断した ｐＯＲＦ−１ ＤＮＡの両方をＴ４ＤＮＡポリメラーゼまたはＫｌｅｎｏｗ ＤＮ Ａポリメラーゼを用いて平滑末端にし、次にこれらを連結し、そして次に形質転 換のためにコンピテント大腸菌バクテリア（ＤＨαＦ’）を用いた。得られたバ クテリアコロニーをＬａｃＺ特異的なプローブを用いるコロニーフィルターハイ ブリダイゼーションにより陽性の組み換えプラスミドに関して調べ、対応するプ ラスミドＤＮＡを制限酵素で切断した。実施例４．２．２ ＶＥＧＦをコードする領域は単一のＳｔｙＩ部位を含み、これを上記 のようにＬａｃＺカセットを挿入するために用いた。４．３ ウイルス配列の検出 以下の実施例は、コーディング（遺伝子内欠失）及び非コーディング（遺伝子 間欠失）領域の両方の除去を記述する。実施例４．３．１ 欠失したウイルス配列を外来遺伝子またはこれらの遺伝子の一部を挿入するこ とで置き換えるために、制限酵素を用いてＨｉｎｄIII ＤＮＡフラグメントＩの 特定の部分を取り除く。プラスミドｐＯＲＦ−ＰＡを（ＩＴＲ領域中の位置の、 図１）制限酵素ＮｒｕＩで切断することによりこれを実施し、その結果、３９６ ｂｐフラグメントが除かれた。平滑化反応後に、ＬａｃＺカセットを上記のよう に連結した。図３に、ｐＯＲＦ−ＰＡからの３９６ｂｐフラグメントの欠失及び ＬａｃＺカセットの挿入を図式的に示す。図３及び４に、このようにして構築さ れ、そしてｐＯＲＦ−ＰＡに由来する欠失／挿入プラスミドｐＣＥ４及びｐＣＥ ９を示す。実施例４．３．２ 図６に図式的に略述されるように、エンドヌクレアーゼＢａｌ３１の影響下で 配列の二方向の欠失を実施するために開始点としてＨｉｎｄIII ＤＮＡフラグメ ント中の個々の制限部位を用いた。ＶＥＧＦ及びプロテインキナーゼＦ１０Ｌを それぞれコードする遺伝子を開くために、プラスミドｐＯＲＦ−ＰＡ及びプラス ミドｐＯＲＦ−１またはｐＯＲＦ−ＸＢのそれぞれの場合に、酵素ＳｔｙＩ及び ＸｃｍＩを制限分解のために用いた（図１及び６）。エンドヌクレアーゼＢａｌ ３１を添加した後、２分毎に反応物からアリコートを取り出し、次に反応を停止 した。これ らの定時試料の例えば制限酵素ＢｇｌＩでの切断及びそれに続くゲル電気泳動に より、Ｂｇｌ３１で除かれたＤＮＡセグメントの大きさを概算することが可能で あった。次に、好適な時点の試料の混合物を用いて平滑化反応によりＤＮＡ末端 を閉じた。次に、新しい唯一のＳｍａＩ、ＳａｌＩ及びＥｃｏＲＶ制限部位を構 成している２つの相補的オリゴヌクレオチドをハイブリダイズさせ、得られた二 本鎖のプライマー分子（ＥｃｏＲＶリンカーと称する）を平滑末端化したＢｇｌ ３１生成物に連結した。形質転換されたバクテリアを得た後、プラスミドＤＮＡ を単離し、ＰＰＶ ＨｉｎｄIIIフラグメントＩのＤＮＡ配列中にはいかなる認識 部位も持たないＥｃｏＲＶで切断した。それ故、ＥｃｏＲＶ部位を有する全ての プラスミドＤＮＡは挿入したリンカー配列を含み、次にこれを新しいＥｃｏＲＶ 部位中に平滑末端化したＬａｃＺカセットを連結するために用いた。一本鎖のＥ ｃｏＲＶリンカー及び適当なＬａｃＺ遺伝子特異的なプライマーを用いるシーク エンシングにより、得られた各組み換えプラスミドＤＮＡ中に作製されたＤＮＡ 欠失の正確な大きさを決定することが可能であった。５． 他のパラポックスウイルスのＶＥＧＦ遺伝子の検出及び同定 Ｄ１７０１でＶＥＧＦをコードするＤＮＡ領域が分かっているので、大きく異 なる制限特性を有する可能性のある他のパラポックスウイルス株でこの遺伝子を 同定するための特定のＤＮＡプローブ及びＰＣＲプライマーを調製することが可 能である。この目的のために以下の可能性を調べた。すなわち、（ｉ）Ｄ１７０ １ ＶＥＧＦ遺伝子の中心部分に相当するｐＯＲＦ−ＰＡのＴａｑＩサブフラグ メント（３６６ｂｐ）をハイブリダイゼーションプローブとして単離する；（ii ）適当な合成プラ イマーを用いて完全なＶＥＧＦ ＯＲＦを増幅し、次にそのＰＣＲ産物をプラス ミド中にクローニングする；（iii）ＶＥＧＦ遺伝子の異なる部分から成るプラ イマーを鋳型としてＰＰＶ ＤＮＡの存在下でＰＣＲに用い、そしてこれらを特 定のハイブリダイゼーションプローブとしても用いた。 放射性標識した後に、これらのプローブをパラポックス オビス、パラポック ス ボビス１（ウシ丘疹状口内炎；ＢＰＳ）及びパラポックスボビス２（搾乳者 結節）の様々な単離物及び株のゲノムＤＮＡとのサザン及びドット／スポットブ ロットハイブリダイゼーションにうまく用いた。サザンブロットハイブリダイゼ ーションは特定のＰＰＶ ＤＮＡフラグメントでＶＥＧＦに陽性のシグナルを示 し、これにより各種ＰＰＶのＶＥＧＦ遺伝子をさらに詳細に位置づけることが可 能になる。 さらに、他のＰＰＶ株の可能性のあるＶＥＧＦ遺伝子の発現を調べるために、 ノーザンブロットハイブリダイゼーションのような比較ＲＮＡ分析に同じプロー ブを用いることができる。６． Ｄ１７０１組み換え体の製造 融合するまで生育したＢＫ−ＫＬ−３Ａ細胞を０．１のｍｏｉ（感染多重度） である感染量で感染させた。２時間後に、ＣａＰｏ₄−グリセロールショック法 を用いるか、またはトランスフェクションキット（ＤＯＳＰＥＲ、Ｂｏｅｈｒｉ ｎｇｅｒ−Ｍａｎｎｈｅｉｎ）を製造業者の説明書に従って用いて、感染した細 胞を例えばプラスミドｐＭＴ−１０のＤＮＡ（２から１０μｇまで）でトランス フェクトした。次に、これらの細胞培養物を選択培地（ＨＡＴ培地＋ＭＰＡマイ コフェノール酸−キサンチン−５％ＦＣＳ）を用いて３７℃で３から６日までの 間５ ％ＣＯ₂大気下でｃｐｅまたはプラーク形成が肉眼で見えるようになるまでイン キュベートした。ウイルスが誘導するｃｐｅの程度により、 （ａ）細胞ライセートを得て、希釈シリーズを調製し、プラーク試験をＢＫ−Ｋ Ｌ−３Ａ細胞で実施した。ＬａｃＺを発現し、ＭＰＡに耐性であるＤ１７０１組 み換え体を含む青色プラークを同定するために、添加したアガロース培地混合物 は０．３ｍｇ／ｍｌのＢｌｕｏ−Ｇａｌ（ＧＩＢＣＯ−ＢＲＬＬｉｆｅ Ｓｃｉ ｅｎｃｅｓ）を含んだ。 （ｂ）個々のプラークが生じた後に、（ａ）に記述したアガロース／Ｂｌｕｏ Ｇａｌ混合物を添加し、青色の個々のプラークを選んだ。 以下に記述するように、（ａ）または（ｂ）で得られるウイルスをＢＫ−ＫＬ −３Ａに感染させるために用い、１００％均質な組み換えウイルス集団が得られ るまで少なくとも２回のさらなるプラーク力価測定及び精製に供する。７． ＶＥＧＦプロモーター ３．１章に略述したように、Ｄ１７０１のＶＥＧＦ遺伝子は初期遺伝子であり 、Ｄ１７０１ウイルスが感染した細胞で感染後２ないし４時間から感染の比較的 後期まで特定のｍＲＮＡが大量に転写される。このために、同定したＤ１７０１ ＶＥＧＦプロモーター領域は、組み換えＰＰＶウイルスで外来遺伝子またはこ れらの遺伝子の一部の発現を制御するために非常に有用であるはずである。ＶＥ ＧＦプロモーターを包含する配列（３５ないし４０ヌクレオチド；配列表の配列 番号６）を（ｉ）プロモーター領域に隣接する適切なプライマーを用いるＰＣＲ 、（ii）適切なＤＮＡ断片のサブクローニングまたは（iii）プロモーター配列 をオリゴヌクレオチドとして合成することにより単離することができる。 ＶＥＧＦプロモーターを目的のあらゆる遺伝子またはＤＮＡ配列に連結した後、 得られた遺伝子カセットを先の章に記述したあらゆる方法に従って組み換えＰＰ Ｖを調製するために用いることができる。８． １０ｋＤａ遺伝子 ＰＰＶ株ＮＺ−２の１０ｋＤａ遺伝子の公表されたＤＮＡ配列（文献番号８） に基づいてＰＰＶ １０ｋＤａ遺伝子を検出するための特異的ＰＣＲを確立した 。合成で調製したプライマー１０Ｋ−ｕｐ（５−ＣＡＡＴＡＴＧＧＡＴＧＡＡＡ ＡＴＧＡＣＧＧ−３）及び１０ｋ−ｄｏｗｎ（５−ＣＡＧＡＣＧＧＣＡＡＣＡＣ ＡＧＣＧ−３）を用いてＰＣＲを実施した後に、２９７塩基対の大きさの特定の 産物を増幅することに成功した。続いてクローニング（ＴＡクローニングキット 、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｉｎｃ．）により、２９７ｂｐのＰＣＲ産物をＥｃｏ ＲＩフラグメントとして含むプラスミドｐＪＳ−１が得られた。ｐＪＳ−１の挿 入の２本のＤＮＡ鎖のＤＮＡシークエンシングにより、１０ｋＤａに特異的な配 列が存在することが示された。この配列によると、Ｄ１７０１は９１アミノ酸の １０ｋＤａタンパク質をコードし、これはＮＺ−２ＰＰＶ株と９３．３％のアミ ノ酸の同一性及び９６．７％のアミノ酸の類似性を有する。 放射性標識したｐＪＳ−１でのサザンブロットハイブリダイゼーションを用い て、１０ｋＤａ遺伝子をＤ１７０１ゲノムのＥｃｏＲＩフラグメントＥ（４．２ ５ｋｂｐ）に位置づけた。従って、この遺伝子は、ＮＺ−２の場合でのように、 ウイルスゲノムの右側の部分に位置し、ＨｉｎｄIIIフラグメントＫ及びＧの切 断部位を含む（図２）。 １０ｋＤａ遺伝子が（原則として先に記述したように）挿入または欠 失を含むプラスミドを調製するために、４．２５ｋｂｐのＤ１７０１ＥｃｏＲＩ フラグメントＥを含むプラスミドｐＤＥ−Ｅ１及びｐＲＺ−Ｅ１を用いる。Ｄ１ ７０１ １０ｋＤａ遺伝子のＮ末端セグメントのＨｉｎｄIII切断部位（フラグメ ントＫ−Ｇ）（（＃１２４−＃１２９）配列番号１１）を外来ＤＮＡを直接挿入 するため及び１０ｋＤａ遺伝子を除くため（Ｂａｌ３１を用いた二方向消化を参 照）の両方に用いることができる。後者の構築物では、もう一つのＨｉｎｄIII 切断部位（ベクタープラスミドｐＳＰＴ１８のマルチクローニング部位）をプラ スミドｐＤＥ−Ｅ１から取り除いた。このために、ｐＳＰＴ１８ ＤＮＡをＨｉ ｎｄIIIで切断し、その後、Ｋｌｅｎｏｗで処理することによりＨｉｎｄIII切断 部位を壊し、プラスミドを再連結した。次に、この新しいベクタープラスミドｐ ＳＰＴ１８ｄＨのＥｃｏＲＩ制限部位に４．２５ｋｂｐのＤ１７０１ ＥｃｏＲ ＩフラグメントＥをクローン化した。得られたプラスミドのｐＲＺ−Ｅ１（図８ ）は今や１０ｋＤａ遺伝子中に唯一のＨｉｎｄIII切断部位を有し、この部位に よりさらに簡単な操作が可能となる。 放射性標識したプローブとしてｐＤＥ−Ｅ１及びｐＪＳ−１を用いるサザンブ ロットハイブリダイゼーション並びにＰＣＲ研究も、異なるＰＰＶボビス１株の ゲノムがいかなる１０ｋＤａ特異的な配列も含まないことを示す。これは、１０ ｋＤａ ＰＰＶ遺伝子が必須ではないことを 配列番号１ 本出願の配列番号１は、ＰＰＶ Ｄ１７０１株のＨｉｎｄIIIフラグメントＩ上 に位置するＶＥＧＦ遺伝子を示す。 さらなる情報： 初期プロモーター： ヌクレオチド５０ないし６４ ｍＲＮＡ開始： ヌクレオチド７８または８０ ｍＲＮＡ終止： ヌクレオチド４９８ないし５００ 翻訳開始： ヌクレオチド９２ないし９４ 翻訳終止： ヌクレオチド４８８ないし４９０配列番号２ 本出願の配列番号２は、ＰＰＶ Ｄ１７０１株のＨｉｎｄIIIフラグメントＩ上 に位置するプロテインキナーゼ遺伝子Ｆ１０Ｌ（バージョン１）を示す。 さらなる情報： 後期プロモーター： ヌクレオチド４８ないし６６ ｍＲＮＡ開始： ヌクレオチド７４ないし７８ 翻訳開始： ヌクレオチド９４ないし９６ 翻訳終止： ヌクレオチド１７３８ないし１７４０配列番号３ 本出願の配列番号３は、ＰＰＶ Ｄ１７０１株のＨｉｎｄIIIフラグメントＩ上 に位置するＨＤ１Ｒ遺伝子セグメントを示す。配列番号４ 本出願の配列番号４は、ＰＰＶ Ｄ１７０１株のＨｉｎｄIIIフラグメントＩ上 に位置するＩＴＲ領域及びこの領域中に見いだされるＯＲＦ３ 遺伝子を示す。 さらなる情報： ＩＴＲ領域の始まり： ヌクレオチド７ 初期プロモーター： ヌクレオチド１８ないし３３ ＯＲＦ３ ｍＲＮＡ開始： ヌクレオチド４０ないし４１ ＯＲＦ３ ｍＲＮＡ終止： ヌクレオチド６７３ないし６７９ ＯＲＦ３翻訳開始： ヌクレオチド１１１ないし１１３ ＯＲＦ３翻訳終止： ヌクレオチド５６２ないし５６４配列番号５ 本出願の配列番号５は、ＰＰＶ Ｄ１７０１株のＨｉｎｄIIIフラグメントＩ上 に位置するＦ９Ｌ遺伝子相同物（バージョン１）を示す。 さらなる情報： 開始コドン： ヌクレオチド４８ないし５０ 終止コドン： ヌクレオチド８６１ないし８６３配列番号６ 本出願の配列番号６は、ＰＰＶ Ｄ１７０１株のＨｉｎｄIIIフラグメントＩ上 に位置するＶＥＧＦプロモーター領域を示す。配列番号７ 本出願の配列番号７は、ＨＤ１Ｒ及びＰＫＦ１０Ｌ遺伝子間に位置し、且つＰ ＰＶ Ｄ１７０１株のＨｉｎｄIIIフラグメントＩ上に位置する遺伝子間領域を示 す。 推定上のＨＤ１Ｒ翻訳終止： ヌクレオチド２５ないし２７ ＰＫＦ１０Ｌ翻訳開始： ヌクレオチド２２３ないし２２５配列番号８ 本出願の配列番号８は、ＰＰＶ Ｄ１７０１株のＨｉｎｄIIIフラグメントＩ（ バージョン１）の完全なヌクレオチド配列を示す。配列番号９ 本出願の配列番号９は、ＰＰＶ Ｄ１７０１株のＨｉｎｄIIIフラグメントＩ上 に位置するプロテインキナーゼＦ１０Ｌ遺伝子のバージョン２を示す。 さらなる情報： 後期プロモーター： ヌクレオチド４８ないし６６ ＲＮＡ開始シグナル： ヌクレオチド７２ないし８０ ｍＲＮＡ開始： ヌクレオチド７４ないし７８ 翻訳開始： ヌクレオチド９４ないし９６ 翻訳終止： ヌクレオチド１５８５ないし１５８８配列番号１０ 本出願の配列番号１０は、ＰＰＶ Ｄ１７０１株のＨｉｎｄIIIフラグメントＩ 上に位置するＦ９Ｌ遺伝子相同物のバージョン２を示す。 さらなる情報： 翻訳開始： ヌクレオチド５０ないし５２ 翻訳終止： ヌクレオチド７２２ないし７２４配列番号１１ 本出願の配列番号１１は、ＰＰＶ Ｄ１７０１株のＥｃｏＲＩフラグメントＥ 上に位置する１０ｋＤａ遺伝子を示す。 さらなる情報： 翻訳開始： ヌクレオチド５ないし７ 翻訳終止： ヌクレオチド２７５ないし２７７配列番号１２ 本出願の配列番号１２は、ＰＰＶ Ｄ１７０１株のＨｉｎｄIIIフラグメントＩ のバージョン２の完全なヌクレオチド配列を示す。配列番号１３ 本出願の配列番号１３は、ＰＰＶ Ｄ１７０１株のＨｉｎｄIIIフラグメントＩ 上に位置するプロテインキナーゼＦ１０Ｌ遺伝子のバージョン３を示す。 さらなる情報： 後期プロモーター： ヌクレオチド４８ないし６６ ＲＮＡ開始シグナル： ヌクレオチド７２ないし８０ ｍＲＮＡ開始： ヌクレオチド７４ないし７８ 翻訳開始： ヌクレオチド９４ないし９６ 翻訳終止： ヌクレオチド１５８５ないし１５８８配列番号１４ 配列番号１４は、（配列番号１３から推定される）ＰＰＶ Ｄ１７０１プロテ インキナーゼＦ１０Ｌ相同物のアミノ酸配列を示す。配列番号１５ 配列番号１５は、（配列番号１から推定される）ＰＰＶ Ｄ１７０１ＶＥＧＦ 相同物のアミノ酸配列を示す。配列番号１６ 配列番号１６は、（配列番号１０から推定される）ＰＰＶ Ｄ１７０１ Ｆ９Ｌ 相同物のアミノ酸配列を示す。 図面のリスト 図１は、プラスミドｐＯＲＦ−１／−２中のｏｒｆ Ｄ１７０１Ｈｉｎ ｄIIIフラグメントＩの物理的地図を示す。細い矢印は同定され たｍＲＮＡを示し、一方、太い矢印はＯＲＦを示す。 図２は、Ｄ１７０１ゲノム上のＨｉｎｄIII認識部位の物理的地図及びＨ ｉｎｄIIIフラグメントＩ上に同定された遺伝子、並びに逆方向 末端反復領域の一部を示す。 図３は、プラスミドｐＣＥ４を示す。ＮｒｕＩでの切断後、３９６ｂｐ フラグメントをＬａｃＺカセットで置き換えた。 図４は、ＸｃｍＩでの切断により直鎖状にした後にＬａｃＺカセットを 挿入したプラスミドｐＣＥ９を示す。 図５は、本文中に記述するように、新しい唯一の切断部位を作製するた めにＰＣＲを用いる方法を図式的に示す。 図６は、ヌクレアーゼＢａｌ３１を用いた二方向への欠失をそれに続く ＥｃｏＲＶリンカー及びＬａｃＺカセットの挿入と共に図式的 に示す。 図７は、ＬａｃＺ／ｇｐｔ選択カセット： Ｐ１１_K：ワクシニア１１Ｋプロモーター Ｐ_VEGF：ＰＰＶ ＶＥＧＦプロモーター Ｓｍ：ＳｍａＩ Ｂ：ＢａｍＨＩ の調製方法を示す。 図８は、（本文中に記述したような）１０ｋＤａ遺伝子を含むＰＰＶ Ｄ１７０１ＥｃｏＲＩフラグメントＥのクロ−ニング方法を 図式的に示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 39/00 Ａ６１Ｋ 48/00 48/00 Ｃ０７Ｋ 14/065 Ｃ０７Ｋ 14/065 Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｃ１２Ｎ 7/00 Ｇ０１Ｎ 33/569 Ｌ Ｇ０１Ｎ 33/569 Ａ６１Ｋ 37/02 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:92） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ， ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＨＵ，ＩＬ，ＪＰ，ＫＲ，ＫＺ，Ｌ Ｋ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＫ，ＴＲ ，ＵＡ，ＵＳ (72)発明者 ルツイハ，ハンス―ヨアヒム ドイツ連邦共和国デー―50858ケルン・バ イハーシユトラーセ45

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．挿入及び／または欠失を含んでいる組み換えにより調製されたＰＰＶ。 ２．ウイルスの増殖のために必要ではないゲノムセグメント中に挿入及び／ま たは欠失を含んでいる組み換えにより調製されたＰＰＶ。 ３．ウイルスの増殖のために必要であるゲノムセグメント中に挿入及び／また は欠失を含んでいる組み換えにより調製されたＰＰＶ。 ４．Ｄ１７０１ ＨｉｎｄIIIフラグメントＩの発現されない領域中に挿入及び ／または欠失を含む組み換えにより調製されたＰＰＶ。 ５．Ｄ１７０１ ＨｉｎｄIIIフラグメントＩの発現される領域中に挿入及び／ または欠失を含む組み換えにより調製されたＰＰＶ。 ６．挿入及び／または欠失がＤ１７０１ ＨｉｎｄIIIフラグメントＩ中または このフラグメントに相当する他のＰＰＶからのＤＮＡ中に位置する、請求の範囲 １ないし５に記載の組み換えにより調製されたＰＰＶ。 ７．ＶＥＧＦ遺伝子の領域中またはこの領域の近くに挿入及び／または欠失を 含む組み換えにより調製されたＰＰＶ。 ８．ＰＫ遺伝子の領域中またはこの領域の近くに挿入及び／または欠失を含む 組み換えにより調製されたＰＰＶ。 ９．ＩＴＲセグメントの領域中またはこの領域の近くに挿入及び／または欠失 を含む組み換えにより調製されたＰＰＶ。 １０．ＨＤ１Ｒ遺伝子の領域中またはこの領域の近くに挿入及び／または欠失 を含む組み換えにより調製されたＰＰＶ。 １１．Ｆ９Ｌ遺伝子の領域中またはこの領域の近くに挿入及び／または欠失を 含む組み換えにより調製されたＰＰＶ。 １２．１０ｋＤａタンパク質をコードする遺伝子の領域中またはその近くに挿 入及び／または欠失を含む組み換えにより調製されたＰＰＶ。 １３．１０ｋＤａタンパク質をコードする遺伝子が位置するＤ１７０１Ｅｃｏ ＲＩフラグメントＥの領域中に挿入及び／または欠失を含む組み換えにより調製 されたＰＰＶ。 １４．Ｄ１７０１ ＨｉｎｄIIIフラグメントＩまたはこのフラグメントに相当 する他のＰＰＶからのＤＮＡを含んでいるプラスミド。 １５．Ｄ１７０１ ＨｉｎｄIIIフラグメントＩを含んでいるプラスミドで、ウ イルスの複製のために必要であるこのフラグメントの領域中に欠失及び／または 挿入を含むプラスミド。 １６．Ｄ１７０１ ＨｉｎｄIIIフラグメントＩを含んでいるプラスミドで、ウ イルスの複製のために必要ではないこのフラグメントの領域中に欠失及び／また は挿入を含むプラスミド。 １７．Ｄ１７０１ ＨｉｎｄIIIフラグメントＩを含んでいるプラスミドで、ウ イルスの複製のために必要ではなく、且つ発現されない領域に位置するこのフラ グメントの領域中に欠失及び／または挿入を含むプラスミド。 １８．Ｄ１７０１ ＨｉｎｄIIIフラグメントＩを含んでいるプラスミドで、ウ イルスの複製のために必要ではなく、且つ発現される領域に位置するこのフラグ メントの領域中に欠失及び／または挿入を含むプラスミド。 １９．Ｄ１７０１ ＨｉｎｄIIIフラグメントＩを含んでいるプラスミドで、こ のフラグメントのＶＥＧＦ遺伝子中またはその近くに欠失及び／または挿入を含 むプラスミド。 ２０．Ｄ１７０１ ＨｉｎｄIIIフラグメントＩを含んでいるプラスミドで、こ のフラグメントのＰＫ遺伝子中またはその近くに欠失及び／または挿入を含むプ ラスミド。 ２１．Ｄ１７０１ ＨｉｎｄIIIフラグメントＩを含んでいるプラスミドで、こ のフラグメントのＩＴＲセグメント中またはその近くに欠失及び／または挿入を 含むプラスミド。 ２２．Ｄ１７０１ ＨｉｎｄIIIフラグメントＩを含んでいるプラスミドで、Ｈ Ｄ１Ｒ遺伝子及び／またはＦ９Ｌ遺伝子中またはその近くに欠失及び／または挿 入を含むプラスミド。 ２３．Ｄ１７０１ ＥｃｏＲＩフラグメントＥを含んでいるプラスミドで、１ ０ｋＤａタンパク質をコードする遺伝子中またはその近くに欠失及び／または挿 入を含むプラスミド。 ２４．Ｄ１７０１ ＨｉｎｄIIIフラグメントＩの一部を含んでいるプラスミド で、その部分が請求の範囲１４ないし２３に記載の欠失及び／または挿入を含む プラスミド。 ２５．Ｄ１７０１ ＤＮＡフラグメントがこのフラグメントに相当する他のＰ ＰＶからのＤＮＡで置き換えられている、請求の範囲１４ないし２４に記載のプ ラスミド。 ２６．完全なＨｉｎｄIIIフラグメントＩまたはこのフラグメントの一部のみ が存在する、請求の範囲１４ないし２５に記載のプラスミド。 ２７．配列表の配列番号８に記載の配列を有するＤ１７０１ゲノムフラグメン トＨｉｎｄIIIフラグメントＩまたはこのフラグメントの一部またはこのフラグ メントに相当する他のＰＰＶからのフラグメント。 ２８．配列表の配列番号１に記載のＶＥＧＦタンパク質をコードする Ｄ１７０１ ＨｉｎｄIIIフラグメントＩのＤＮＡセグメントもしくはその一部ま たはこのセグメントに相当する他のＰＰＶからのセグメントもしくはその一部。 ２９．配列表の配列番号２に記載のＰＫタンパク質をコードするＤ１７０１ ＨｉｎｄIIIフラグメントＩのＤＮＡセグメントもしくはその一部またはこのセ グメントに相当する他のＰＰＶからのセグメントもしくはその一部。 ３０．配列表の配列番号３に記載の配列を有するＰＰＶ ＨＤ１Ｒ遺伝子のＤ ＮＡセグメントまたはその一部。 ３１．配列表の配列番号５に記載の配列を有するＰＰＶ Ｆ９ＬのＤＮＡセグ メントまたはその一部。 ３２．配列表の配列番号４に記載の配列を有するＰＰＶ ＩＴＲ領域のＤＮＡ セグメントまたはその一部。 ３３．請求の範囲２７ないし３２に記載のＤＮＡセグメントの配列に基づいて 調製される遺伝子産物。 ３４．他の病原体の免疫性成分をコードする外来ＤＮＡを挿入物として含む、 請求の範囲１ないし１３に記載の組み換えにより調製されたＰＰＶ。 ３５．サイトカインをコードする外来ＤＮＡを挿入物として含む、請求の範囲 １ないし１３及び３４に記載の組み換えにより調製されたＰＰＶ。 ３６．請求の範囲１４ないし２６に記載のプラスミドをそれ自体既知の方法で 細胞中でＰＰＶと組み換え、そして所望するウイルスを選択することを特徴とす る、請求の範囲１ないし１３、３４及び３５に記載の ウイルスの調製方法。 ３７．１．好適なパラポックスウイルス株を選択し、 ２．そのゲノムを精製し、 ３．精製したゲノムを制限酵素で処理し、 ４．得られたフラグメントをプラスミド中に挿入し、そして ５．１０ｋＤａタンパク質をコードする遺伝子を含むプラスミドの選択を 実施し、 ６．場合によっては、１０ｋＤａタンパク質をコードする遺伝子中に挿入 及び／または欠失を導入し、 ７．場合によっては、（上記）４に記述したフラグメントをポリメラーゼ 連鎖反応（ＰＣＲ）またはオリゴヌクレオチド合成のような別の方法 を用いて調製することもできる ことを特徴とする、請求の範囲２３に記載のプラスミドの調製方法。 ３８．１．好適なパラポックスウイルス株を選択し、 ２．そのゲノムを精製し、 ３．精製したゲノムを制限酵素で処理し、 ４．得られをフラグメントをプラスミド中に挿入し、そして ５．ＨｉｎｄIIIフラグメントＩまたはこのフラグメントに相当するフラ グメントもしくはその成分を含むプラスミドの選択を実施し、 ６．場合によっては、得られたプラスミドのこれらのフラグメント中に挿 入及び／または欠失を導入し、 ７．場合によっては、（上記）４に記述したフラグメントをポリ メラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）またはオリゴヌクレオチド合成のような 別の方法を用いて調製することもできる ことを特徴とする、請求の範囲１４ないし２２及び２４ないし２６に記載のプラ スミドの調製方法。 ３９．１．好適なパラポックスウイルス株を選択し、 ２．そのゲノムを精製し、 ３．精製したゲノムを制限酵素で処理し、 ４．そして所望するフラグメントもしくはセグメントを選択するか、また は ５．場合によっては、得られたゲノムのフラグメントをまずプラスミド中 に挿入し、次に所望するフラグメントを含んでいるプラスミドを単離 し、これらのプラスミドを増やし、そしてそれらから所望するフラグ メントを単離し、 ６．場合によっては、（上記）４に記述したフラグメントをポリメラーゼ 連鎖反応（ＰＣＲ）またはオリゴヌクレオチド合成のような別の方法 を用いて調製することもできる ことを特徴とする、Ｄ１７０１ ＨｉｎｄIIIフラグメントＩもしくは１０ｋＤａ タンパク質をコードするＤ１７０１ ＥｃｏＲＩフラグメントＥ、またはこのフ ラグメントもしくはセグメントに相当する他のＰＰＶからの領域、またはそれら の一部の調製方法。 ４０．請求の範囲３９により得ることができるフラグメントを好適な発現系に 導入し、これらの系を用いて遺伝子を発現することを特徴とする、請求の範囲３ ３に記載の遺伝子産物の調製方法。 ４１．請求の範囲１ないし１３に記載の組み換えにより調製されたＰ ＰＶのワクチンにおける使用。 ４２．請求の範囲１ないし１３に記載の組み換えにより調製されたＰＰＶの、 免疫性を与え、且つ病原体非特異的な免疫防御も刺激する生成物における使用。 ４３．組み換えにより調製されたＰＰＶの病原体非特異的な免疫防御を刺激す る免疫調節剤における使用。 ４４．組み換えにより調製されたＰＰＶの外来ＤＮＡの異種発現のための使用 。 ４５．組み換えにより調製されたＰＰＶの外来ＤＮＡのベクターとしての使用 。 ４６．請求の範囲１４ないし２６に記載のプラスミドのパラポックス特異的な ゲノムセグメントを発現するための使用。 ４７．請求の範囲１４ないし２６に記載のプラスミドの診断用試薬を調製する ための使用。 ４８．請求の範囲２７ないし３２に記載のゲノムフラグメントの診断用試薬を 調製するための使用。 ４９．配列表の配列番号６に記載のＤＮＡセグメント（ＶＥＧＦ遺伝子のプロ モーター）。 ５０．請求の範囲４９に記載のＤＮＡセグメントのＤＮＡを発現するためのプ ロモーターとしての使用。