CN111849990B - Orf016基因缺失型山羊痘病毒株及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种gRNA，所述gRNA序列如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示，本发明还公开了重组质粒、ORF016基因缺失型山羊痘病毒株及其制备方法和应用。本发明首次通过基因敲除方法获得了ORF016基因缺失型山羊痘病毒株，该方法是首次将CRISPR技术在山羊痘病毒中进行应用，同时本发明采用了反向转染方法对ORF016基因进行了敲除，该方法的敲除效率达到了31.6%，远远高于现有技术中的敲除效率。同时，本发明所获得的SDLVDUORF016毒株是一株仅缺失ORF016的毒株，基因的缺失对其生长特性没有影响，该毒株可用于山羊痘疫苗、检测试剂、山羊痘病毒鉴定等用途。

Description

ORF016基因缺失型山羊痘病毒株及其制备方法和应用

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体涉及ORF016基因缺失型山羊痘病毒株及其制备方法和应用。

背景技术

山羊痘病毒是一种急性的高度接触性传染病，近年来在我国多个地区流行。该病发病率和死亡率高，病羊发热，全身皮肤，特别是身体无毛部分或粘膜出现典型痘疮。山羊痘病毒可以感染所有品种、性别和年龄的山羊，羔羊最为易感，感染率可达100％，死亡率可达100％。该病的暴发给我国养羊产业和皮毛业的发展造成了巨大的经济损失，还严重影响了国家畜牧业的发展和国际贸易。

自2002年以来，人们陆续开展了山羊痘病毒和绵羊痘病毒的基因组序列研究，获得了多株病毒流行株、疫苗株的全基因序列，为深入开展羊痘病毒分子机制研究提供了重要的信息资源。值得注意的是，山羊痘病毒的流行毒株和疫苗毒株之间的差异很小，使弱毒疫苗具有潜在的致病性和毒力返强的危险性，事实上近来越来越多的报道显示，在我国应用很广的山羊痘疫苗能够引起危险的并发症，包括引起皮肤结节、孕羊的流产等，为有效防控羊痘带来了隐患，不利于彻底消灭羊痘。因此，有必要进一步探讨病毒基因组中的毒力相关蛋白具有怎样的功能，其变化对病毒毒力的减弱是否起到关键性的作用，才有可能使疫病的监测和疫苗质量的控制更加准确、可靠、快捷，能明显提高我国应对该病的防控能力和水平。

另外，山羊痘病毒是人们继痘苗病毒和禽痘病毒之后开发的又一种重要的痘苗载体，具有多个方面的优势：山羊痘病毒基因组结构研究较为深入，其遗传稳定性好，背景清晰明确，基因组容量大，可以插入多个、大片段外源基因；目前国内外已经有多个山羊痘弱毒疫苗被广泛用于绵羊痘和山羊痘的预防，且具有终身免疫力，给重组载体疫苗提供了良好的载体；山羊痘病毒利用病毒自身编码的聚合酶进行复制与转录，不会整合到宿主基因组中，使用起来更为安全。以山羊痘病毒作为载体，可以用于开发多种羊用重组疫苗。

综上所述，建立快速、高效的基因编辑方法，对山羊痘病毒致病机制研究、病毒与宿主相互作用研究、疫苗与防控技术研究等研究领域的发展具有非常重要的意义。

现有的基因编辑方法主要是同源重组法。同源重组法依靠位于待敲除基因两侧的100-1000bp的序列作为同源重组臂，中间串联目的基因和/或报告基因如绿色荧光蛋白作为示踪蛋白，构建转移载体转染至细胞内，通过细胞的同源重组修复机制将病毒基因组中同源臂序列内侧的序列替换为目的基因和/或报告基因，从而实现基因的插入或敲除。

同源重组法的局限性：(1)需要扩增同源重组臂，通过酶切连接的方法构建供体质粒，需要一周甚至更长的时间。(2)需要依赖细胞的同源重组修复模式，通过同源重组用供体序列替换靶序列，而同源重组修复模式在真核细胞中仅发生于细胞周期的G2期和S期末期，其发生几率远远低于非同源末端连接修复模式(发生于G1，S，G2期)，效率相对较低，有时甚至需要进行多轮重组。(3)携带报告基因等外源序列。重组病毒的筛选主要依赖报告基因，即便获得纯合子病毒后敲除报告基因，也会留下至少几十个碱基的外源序列，这些基因工程操作引入的外源序列，可能给未来开展基因水平研究、疫苗研发留下潜在问题。

CRISPR/Cas9技术可以克服上述方法带来的问题。该技术可以通过单一位点的剪切，造成1个或几个碱基的Indel，使蛋白功能丧失，或通过靶序列两端的同时剪切，造成靶序列的完全缺失，操作简便，方法灵活。与同源重组方法相比，该技术具有多个方面的优势：(1)CRISPR/Cas9技术可以灵活实现靶位点的双链断裂，无需提供供体。(2)CRISPR/Cas9技术可以借助非同源末端连接修复模式，该修复模式可以在细胞周期的多个阶段进行(发生于G1，S，G2期)，修复效率高。(3)该方法不引入外源序列。(4)该方法编辑效率较高，可以直接通过PCR方法辅助筛选，无需额外增加多轮噬斑筛选。

但是，尽管CRISPR/Cas9技术已经在多种病毒的编辑中得到了应用，国外2016年也已经报道了痘苗病毒(Vaccinia)的基因编辑方法(A Simple and Efficient Approach toConstruct Mutant Vaccinia Virus Vectors[J].J Vis Exp，2016，2016(116).)，该方法却一直未能在山羊痘病毒属病毒中得到有效应用。与痘苗病毒相比较，山羊痘病毒缺乏高效细胞系、基因组序列GC含量过低(仅28％)，以及增殖周期的差异等等，都是可能是阻碍CRISPR/Cas9技术在山羊痘病毒上应用的原因。

发明内容

发明目的：本发明通过多方面尝试，打破细胞和病毒限制，建立快速、高效、简便的山羊痘病毒CRISPR/Cas9基因敲除方法，并获得了一株ORF016基因缺失型山羊痘病毒株，该基因敲除方法还可以在其他可增殖山羊痘病毒的细胞或细胞系上实现山羊痘病毒的基因敲除，但敲除效率可能需要进一步优化。该方法不仅可以应用于山羊痘病毒，也可以应用于绵羊痘病毒和结节性皮肤病病毒等其他山羊痘病毒属成员。

技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种gRNA，所述gRNA序列如SEQID NO：1或SEQ ID NO：2所示。

本发明还包括含有所述的gRNA的重组质粒。

其中，作为优选地，所述重组质粒是将gRNA与质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro(以下简称pX459)相连得到。

本发明还包括采用所述的gRNA获得的ORF016缺失型基因，其核苷酸序列如SEQ IDNO：9所示。

该ORF016基因缺失型病毒株的ORF016基因序列如SEQ ID NO：9所示，该序列反向存在于病毒基因组中，其中1-391bp与YW14株的ORF016基因1-391bp序列相同，392-1006bp与YW14株ORF016基因1075-1689bp序列相同。

所述ORF016基因缺失型基因序列如下：SEQ ID NO：9

本发明还包括采用所述的gRNA获得的ORF016基因缺失型蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示。

该基因编码209aa的蛋白序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示；与其原毒株相比，该缺失毒株的ORF016蛋白1-205aa与YW14株ORF016编码蛋白(562aa)的前1-205aa相同，自第206aa位置开始因碱基缺失而发生移码突变。

所述ORF016基因缺失型蛋白的氨基酸序列如下：

本发明还包括所述的gRNA、所述的重组质粒在基因敲除方面的应用。

本发明还包括含有所述的ORF016基因缺失型的山羊痘病毒株，所述病毒株采用含有所述的重组质粒转染后得到，命名为SDLVDUORF016毒株。

其中，所述转染方法包括常规脂质体转染感染法、反向转染法或先感染后转染法中的一种。

本发明还包括一种ORF016基因缺失型的山羊痘病毒株的制备方法，包括以下步骤：

1)、转染：构建转染体系进行细胞的转染，所述转染体系中包括所述的重组质粒；

2)、感染：向转染体系中接种山羊痘病毒；

3)、收获：当病变波及到75％以上细胞时，反复冻融各转染细胞孔，吹打分散均匀，即得ORF016基因缺失型的山羊痘病毒株。

其中，所述转染步骤为：先制备脂质体与所述的重组质粒的复合物，通过反向转染导入宿主细胞中，使该细胞开始表达Cas9蛋白，并启动gRNA的转录。

其中，所述的宿主细胞为Vero细胞或含有SAMD9基因突变的Vero细胞中的一种或两种。

其中，步骤2)在转染后18-24小时，向表达重组质粒的宿主细胞中感染了0.05MOI的山羊痘病毒，在gRNA的靶向引导下，Cas9蛋白执行对山羊痘病毒的基因编辑。

本发明还包括一种鉴定ORF016基因缺失型的山羊痘病毒株的方法，包括以下步骤：

1)提取待测山羊痘病毒株中的病毒DNA；

2)采用ORF016基因引物对病毒DNA进行PCR扩增；所述ORF016基因引物对序列如SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8所示；

3)将所得PCR产物为456bp片段时，即可鉴定为ORF016基因缺失型山羊痘病毒。

本发明内容还包括所述的病毒株在制备山羊痘疫苗、检测或鉴定山羊痘病毒试剂中的应用。

有益效果：本发明首次通过基因敲除方法获得了ORF016基因缺失型山羊痘病毒株，该方法是首次将CRISPR技术在山羊痘病毒中进行应用，同时本发明采用了反向转染方法对ORF016基因进行了敲除，该方法的敲除效率达到了31.6％，远远高于现有技术中的敲除效率。同时，本发明所获得的SDLVDUORF016毒株是一株仅缺失ORF016的毒株，基因的缺失对其生长特性没有影响，可用于山羊痘疫苗、检测试剂、山羊痘病毒鉴定等用途。

附图说明

图1、为转染后细胞单克隆PCR鉴定结果，M为DNAmarker，F0为转染后的细胞培养物，D6～A2为第一轮单克隆后挑选的单细胞团孔，各泳道中出现的1430bp条带为未编辑的扩增产物，275bp大小条带为编辑后的突变基因扩增产物，500bp条带为非特异性扩增条带。其中A3克隆表现出明亮而浓厚的275bp突变基因条带，仅出现少量的1430bp未编辑基因，表明A3克隆中出现了较大比例的SAMD9基因缺失细胞。

图2、为VeroSAMD9和Vero的测序峰图。2A为VeroSAMD9细胞株SAMD9基因160～200bp处序列图；2B为亲本Vero细胞160～200bp处序列图，其中160～180bp与VeroSAMD9细胞160～180bp序列相同；Vero2C为亲本Vero细胞1324～1365bp区域的序列图，其中1345～1365bp与VeroSAMD9细胞181～200bp序列一致；

图3、为构建的pX459-016g1、pX459-016g2质粒测序结果(灰色阴影区域为插入的016g1、016g2序列)；

图4、转染后PCR检测到的缺失片段(M：2000bp DNAmarker；1为转染组的病毒液样品；2为对照组的病毒液样品；3为空白细胞样品对照)；

图5、基因缺失后的ORF016序列峰图(红色竖线处为016g1和016g2引起双链断裂、基因缺失后的连接处，峰图上方序列分别为连接处两侧序列在野生型山羊痘病毒基因组中的位置)；

图6、三种不同转染方法敲除山羊痘病毒基因的效果(M为2000bp DNAmarker，1为常规转染法，2为脂质体反向转染法，3为先感染后转染法，+为转染pX459-016g1和pX459-016g2质粒组，-为对照组)；

图7、应用三种不同细胞敲除山羊痘病毒基因的效果(M为DNAmarker，1为次代羊睾丸细胞，2为Vero细胞，3为VeroSAMD9细胞(以下简称VeroSAMD9)，+为转染pX459-016g1和pX459-016g2质粒组，-为对照组)；

图8、PCR鉴定第一次亚克隆的基因编辑情况(M：2000bp DNA marker；1-20：第一次亚克隆过程中挑取的20个噬斑样品；neg：阴性对照)；

图9、ORF016缺失毒株与亲本株的生长曲线(红色方块：野生型山羊痘病毒；蓝色菱格：ORF016缺失型山羊痘病毒)。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明。

实施例1 VeroSAMD9细胞的构建

1.1sgRNA设计

根据GenBank中所登录的非洲绿猴基因组SAMD9基因序列(Genbank登录号XM_007982155)，选择其外显子近N端160～420bp序列和1300～1550bp序列，应用设计网站http：//crispr.mit.edu/在线设计两组引导RNA序列，命名为AlbA_g1和AlbA_g2(表1)，并与人、猴、羊基因组进行比对分析脱靶效应。设计并合成AlbA_g1和AlbA_g2体外转录引物，按照商品化的一步法sgRNA体外转录试剂盒(Inovogen科技)说明书进行PCR扩增和sgRNA转录得到转录后的两种sgRNA，并将RNA浓度调整为400ng/μL。

表1试验所用sgRNA及体外转录引物

1.2转染

Vero细胞来源于ATCC细胞库(编号ATCC CCL-81)，培养细胞使其处于对数生长期，传代至24孔板中制备长满90％孔底的细胞单层。各取1.25μl的1.1中转录后的两种sgRNA，分别与2.5μl的商品化Cas9蛋白(Genescript公司，5μM)先后加入到第一个1.5ml管中，等体积混匀，室温反应10分钟后加入20μLBuffer CRISPR缓冲液得到Cas9/gRNA复合物。按照商品化CRISPR RNP转染试剂盒(Viromer，Origene)配置转染试剂25μL(0.4μL Viromer+24.6μLBuffer CRISPR缓冲液)，并与第一个管中的Cas9/gRNA复合物迅速等体积混匀，室温孵育15分钟后加入到24孔板中，培养72小时。

1.3基因缺失细胞系的克隆筛选

转染后72小时，将24孔板中的转染细胞消化重悬成单个细胞，以96孔板有限稀释法进行亚克隆。挑选长出单一细胞克隆的孔，以建立的PCR方法(引物SAMDF1和SAMDR1见表2)筛选SAMD9基因缺失的细胞克隆。

表2试验所用缺失鉴定引物与测序引物

经过第一轮细胞亚克隆培养和PCR鉴定，获得了一株PCR出现275bp左右缺失条带的克隆(见图1中A3泳道)，选择该克隆株进行第二次亚克隆纯化，获得生长良好、PCR鉴定只出现275bp条带的细胞孔，为100％纯净的基因缺失的细胞克隆株，连续传代扩大，保存4代及以上细胞，命名为VeroSAMD9。

1.4VeroSAMD9株SAMD9基因测序鉴定

根据Genbank登录的非洲绿猴(Chlorocebus sabaeus)基因组SAMD9基因(XM_007982155)序列设计引物，对VeroSAMD9株的SAMD9基因编码区进行全长扩增并测序(测序引物SAMDF和SAMDR见表2)。

将选育的VeroSAMD9细胞以PBS清洗3次后，按照10000个细胞/ml的密度以PBS重悬，取200μL上清，利用DNA/RNA抽提试剂盒提取核酸。以提取细胞DNA作为模板，使用设计的引物SAMDF和SAMDR扩增样品的SAMD9全长mRNA，目的片段送生工生物工程(上海)有限公司测序，测序结果与GenBank登录的Chlorocebus sabaeus基因组中相关序列进行比对。

测序比较发现，VeroSAMD9细胞的SAMD9基因编码区全长为3603bp，CRISPR系统在AlbA_g1的近PAM位点3bp前发生了双链断裂，同时在AlbA_g2的近PAM位点3bp前发生双链断裂，产生双切口，切口处经随机修复重新连接，形成基因突变型。与亲本Vero细胞相比，突变型细胞VeroSAMD9株缺失了181～1344bp区域共计1164bp碱基序列(见图2)。和推导其氨基酸序列并与亲本Vero细胞进行比对，VeroSAMD9细胞的SAMD9基因编码1200aa蛋白，与亲本细胞相比，缺失了61-448aa处共388aa，覆盖整个AlbA_2结构域，以及SAM结构域C末端和SIR2结构域N末端少数残基。VeroSAMD9株的SAMD9基因编码序列如SEQ ID NO：11和氨基酸序列见SEQ ID NO：12。

将VeroSAMD9细胞连续传代20代以上，取第20代样品，按照实验1.4所用引物及实验步骤，扩增SAMD9编码区全长约4800bp目的片段，送生工生物工程(上海)有限公司测序，测序结果与实验1.4所得序列进行比对，其序列同源性100％，未出现任何回复突变，VeroSAMD9株的遗传较为稳定。因此，VeroSAMD9细胞连续传代1～20代细胞简称VeroSAMD9细胞。

1.5VeroSAMD9株增殖山羊痘病毒效果比较

分别以相同数量(2000000个)的Vero细胞及VeroSAMD9细胞制备细胞单层，按照1∶50体积比接种相等剂量山羊痘病毒YW14株(该病毒系本发明单位自羊胎儿组织分离而得的山羊痘病毒YW14株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NO：V202037，保藏日期为2020年7月2日)，培养7天或有75％左右细胞出现病变时收获细胞培养物，反复冻融收获的病毒液，继续按照1∶50体积比接种相应细胞，连续传代5代，将第1、3和5代病毒液分别以药典所规定方法测定病毒效价。

在传代中观察发现，VeroSAMD9和Vero细胞在接种山羊痘病毒YW14株后4天均观察到细胞病变，6天时病变细胞超过50％。但是此后传代过程中，VeroSAMD9细胞接种的病毒其病变程度逐渐趋于稳定，病毒效价可达10^7.0TCID₅₀/ml以上，而山羊痘病毒YW14株在Vero细胞中传代过程中，病变时间逐渐增长，至第5代时，培养7天仍然仅能观察到少数几个病变灶，效价低至10^2.25TCID₅₀/ml。效价测定结果见表3。

表3山羊痘病毒在VeroSAMD9与Vero细胞上的传代效果比较

综上，本实施例将Vero细胞经过敲除SAMD9基因AlbA_2结构域筛选而得的一株可以高效增殖山羊痘病毒的细胞克隆，该细胞的分子特征是其SAMD9蛋白缺少AlbA_2结构域及两侧388aa片段，简称VeroSAMD9细胞。

实施例2 ORF016基因序列的引导RNA序列设计及质粒构建

根据GenBank中所登录的山羊痘病毒FZ株病毒的ORF016基因序列(Genbank登录号KC951854.1)，分别选择近N端和近C端约250bp序列，应用设计网站http：//crispr.mit.edu/在线设计两组gRNA，并与人、猴、羊基因组进行比对分析脱靶效应。选择不易发生脱靶效应的gRNA，去除PAM序列，加上限制内切酶BbsI位点后分别为016g1-F和016g2-F，并通过Lasergene软件获得反向互补序列，反向互补序列分别命名为016g1-R、016g2-R(见表4)，送赛默飞生物公司合成。

其中，C端设计gRNA的参考序列为：SEQ ID NO：1

N端设计gRNA的参考序列为：SEQ ID NO：2

表4试验所用gRNA及其互补序列

名称	Sequence序列(5’-3’)
		016g1-F	CACCGGTTAGTAAATGACGCTGTA(SEQ ID NO：3)
016g1-R	AAACTACAGCGTCATTTACTAACC(SEQ ID NO：4)
		016g2-F	CACCGATACCATCTATGTTATTGG(SEQ ID NO：5)
016g2-R	AAACCCAATAACATAGATGGTATC(SEQ ID NO：6)

通过酶切连接构建Cas9与gRNA共表达的工作质粒。将合成的各组gRNAoligos按照说明书稀释后，配置退火反应体系：正向序列(100μM)2μl，反向序列(100μM)2μl，PCR缓冲液(10×)2μl，加去离子水补足体积至20μl。90℃3min，37℃60min退火后放置4℃保存。

BbsI酶切回收Addgene购买的Cas9表达质粒pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)V2.0(简称pX459，Addgene公司购买，货号#62988)，37℃酶切60min后，电泳分离并纯化约9kb条带。将退火后的互补序列016g1、016g2分别取1μl，与35ng酶切处理后的pX459按照常规方法进行T4连接酶连接，取5μl连接产物转化DH5α感受态后挑取菌落继续培养，用质粒提取试剂盒按照说明书方法提取质粒，命名为pX459-016g1、pX459-016g2并测序验证。应用U6启用子序列测序证明，两对引导序列均已经正确插入到载体中(图3)。图3构建的pX459-016g1、pX459-016g2质粒测序结果(灰色阴影区域为插入的016g1、016g2序列)

实施例2不同转染方法对山羊痘病毒基因敲除效果的影响

分别用(1)常规脂质体转染感染法(按照试剂说明书中所述步骤及细胞、试剂用量转染)、(2)反向转染法、(3)先感染后转染法在6孔板中进行转染，接种相同剂量(0.01MOI)山羊痘病毒YW14(该病毒系本发明单位自羊胎儿组织分离而得的山羊痘病毒YW14株，该菌株保藏于CCTCC，保藏号为CCTCC NO.V202037)，接种72h后同上收获病毒，进行PCR检测，比较各种方法的基因敲除情况。

(1)常规脂质体转染感染法

准备细胞单层：将实施例1新鲜制备的基因突变型Vero细胞VeroSAMD9按照每孔1.0×10⁶个细胞的量接种到孔中，补加培养基到3ml，37℃培养过夜后，次日形成90％以上的细胞单层。

转染：以lipofectamine2000为转染介质，分别配制转染体系：将10μl脂质体lipofectamine2000加入到100μl Opti-MEM培养液中，混匀后静置5分钟；将质粒pX459-16g1和pX459-16g2各1μg，加入到100μl Opti-MEM培养液中混匀，室温孵育5分钟；将两管混合，室温孵育15分钟得到DNA-脂质体复合物，将DNA-脂质体复合物加入到上述细胞单层中，每孔200μl，同时设置一个不感染病毒的对照孔，继续37℃5％CO₂培养24小时。

感染：24小时后，向各细胞孔中接种0.05MOI山羊痘病毒YW14；

收获：各样品孔应该在转染后72小时左右出现因病变引起的病变斑。当病变波及到75％以上细胞时，反复冻融各细胞孔，吹打分散均匀，分别将病毒液转移至冻存管中，-80℃中保存。

(2)反向转染方法

反向转染方法是将感染提前至细胞加入后18-24小时。此时细胞生长活跃，Cas9蛋白大量表达，在细胞质中与病毒相遇，能够更好的发挥剪切作用。

转染：以lipofectamine2000为转染介质，同上述第一种方法配置转染体系，将DNA-脂质体复合物加入到空白6孔板中，每孔200μl，同时设置一个只感染病毒的对照孔。再将实施例1新鲜制备的VeroSAMD9细胞按照每孔1.5×10⁶VeroSAMD9细胞的比例接种到孔中，补加培养基到3ml，37℃培养过夜后，次日应该形成90％以上的细胞单层。

感染：转染18小时后，根据病毒效价，按照0.05MOI的量向每孔接种山羊痘病毒YW14，37℃继续培养。

收获：各样品孔应该在转染后72h左右出现因病变引起的病变斑。当病变波及到75％以上细胞时，反复冻融各转染细胞孔，吹打分散均匀，分别将病毒液转移至冻存管中，-80℃中保存。

(3)先感染后转染

将实施例1新鲜制备的VeroSAMD9细胞按照每孔1.0×10⁶个细胞的量接种到孔中，补加培养基到3ml，37℃培养过夜后，次日形成90％以上的细胞单层。

感染：根据病毒效价情况，按照0.05MOI的量向每孔接种山羊痘病毒YW14，同时设置一个不感染病毒的对照孔。

转染：感染后3-6小时，以lipofectamine2000为转染介质，分别配制转染体系：将10μl脂质体lipofectamine2000加入到100μl Opti-MEM培养液中，混匀后静置5分钟；将质粒pX459-16g1和pX459-16g2各1μg，加入到100μl Opti-MEM培养液中混匀，室温孵育5分钟；将两管混合，室温孵育15分钟，将DNA-脂质体复合物加入到已经感染的细胞中，每孔200μl，同时同样加入200μl DNA-脂质体复合物到不感染病毒的对照孔中，继续37℃5％CO₂培养。

收获：各样品孔应该在转染后72h左右出现因病变引起的病变斑。当病变波及到75％以上细胞时，反复冻融各转染细胞孔，吹打分散均匀，分别将病毒液转移至冻存管中，-80℃中保存。

从三种转染方法转染及感染后的PCR结果参见图6可以看出，脂质体反向转染组、先感染后转染组均出现了敲除ORF016基因而形成的短扩增片段(456bp)，条带较为明亮，证明其编辑效率较高。而常规转染方法组仅出现野生型病毒ORF016基因的目的条带(1139bp)。反向转染组相对另两种方法，在细胞传代当天即可同步转染，步骤相对较少，更易于操作。

实施例3 ORF016基因缺失型山羊痘病毒的鉴定

因山羊痘病毒GC含量很低，核酸结构复杂，PCR扩增需要进行优化：

收集实施实例2中第二种方法产生的病毒液样品收集50μl，以病毒DNA提取试剂盒按照常规方法提取DNA。提取后的DNA在进行PCR扩增前需经过一步处理：DNA50μl，95℃10分钟，迅速转移至冰上冷却4分钟(先解链再PCR是特殊的条件，可以降低二级结构带来的影响)，尽快配置PCR体系。

优化PCR体系为：5×PCR缓冲液10μl，10mM dNTP 2.5μl，10μmol上下游引物各1μl，DMSO 5μl，模板DNA 50ng，适用于GC含量高、二级结构复杂的商品化Taq酶(如pfu类)5units，加入去离子水补足体积至50μl，在冰上完成加样操作。

优化PCR反应条件为：94℃2分钟预变性；94℃30秒，55℃30秒，72℃60秒，反复进行35个循环；72℃10分钟，4℃冷却。

ORF016基因引物序列为：上游引物：5’-TCTTGGCTGATTCAGACACG-3’，(SEQ ID NO：7)下游引物5’-ACGATGTGTACGATGTTGCAG-3’(SEQ ID NO：8)。

电泳观察基因编辑情况，双位点切除的基因缺失病毒应能够扩增出456bp条带，而未编辑的病毒则只出现1139bp的条带(见图4)。

YW14株的ORF016基因序列：SEQ ID NO：21

YW14株的ORF016基因编码的氨基酸序列：SEQ ID NO：22

紫外光下切下PCR产物中456bp大小条带，经凝胶纯化试剂盒回收后，送赛默飞世尔生物公司测序，将所得序列在NCBI数据库中应用Blast软件进行比对分析，所得的基因敲除病毒，其序列缺失了两个引导RNA靶序列内侧683bp的核酸序列(见图5)，其敲除后的ORF016基因序列如SEQ ID NO：9所示，该序列反向存在于病毒基因组中，其中1-391bp与YW14株的ORF016基因1-391bp序列相同，392-1006bp与YW14株ORF016基因1075-1689bp序列相同。该基因编码209aa的蛋白序列，其氨基酸序列如SEQ ID NO：10所示；与其原毒株相比，该缺失毒株的ORF016蛋白1-205aa与YW14株ORF016编码蛋白(562aa)的前1-205aa相同，自第206aa位置开始因碱基缺失而发生移码突变。

实验例4不同细胞对山羊痘病毒基因敲除效果的影响

分别用(1)次代绵羊睾丸细胞(由健康绵羊的睾丸组织无菌分离、传代1代而成)，(2)Vero细胞(编号ATCC CCL-81，绿都生物科技有限公司细胞中心保存，对数生长期的细胞)，(3)实施例1制备的VeroSAMD9细胞，按照实施例2中所述反向转染法，转染相同量的pX459-16g1和pX459-16g2质粒，次日感染相同剂量(0.05MOI)病毒，培养72小时后收获病毒液，进行PCR鉴定。

从三种细胞转染和感染后的PCR结果(图7)可以看出，VeroSAMD9细胞组出现了最为明亮的短片段条带(456bp)，初步证明其编辑效率最高。而Vero细胞组也出现了短片段条带，证明细胞中也发生了基因编辑，但是其总体病毒含量低于VeroSAMD9细胞，编辑率也相对较低，该细胞的增殖山羊痘病毒能力较低，容易导致一些生长较难的基因缺失病毒株因无法充分复制增殖而消失，不易满足下一步克隆筛选对编辑效率的需求，不宜作为首选细胞。原代细胞组仅出现野生型病毒ORF016基因的目的条带(1139bp)。

实验例5 ORF016基因缺失型病毒的噬斑纯化

将实施例4中从第3组细胞处理组中收获的病毒液按照10^-1，10^-2，……10^-5的稀释度分别接种到长有90％单层的VeroSAMD9细胞6孔板中，每个稀释度设2个重复，每孔0.2ml，吸附2h后弃去上清，覆盖1％低熔点琼脂，培养3-5天直至可以观察到明显病变灶。

将铺有琼脂的细胞板置于显微镜下，挑选并标记独立、单一的病变灶，将移液器调整至60μl，装上带滤芯吸头，在显微镜下轻轻挑取噬斑部分琼脂和少量细胞，转移至离心管中。向各离心管中加500μl培养液，冻融3次，分别吸取200μl依次接种于长有细胞单层的24孔板中，待出现病变后，分别取50μl病毒液，按照实施例3所述方法提取DNA并进行PCR扩增，电泳判断各克隆的阳性情况。鉴定结果参见图8，从第一次纯化过程中挑取的20个噬斑中，有19个在24孔中有病毒生长，有6个出现阳546bp性编辑条带，因此本方法的基因敲除效率为31.6％。

将PCR鉴定为阳性的病毒样品再次接种到2个6孔中，进行第二轮、第三轮筛选和PCR鉴定，获得100％阳性的病毒克隆，命名SDLVDUORF016毒株。

实验例6 ORF016基因缺失型病毒的生长特性比较

铺设3个12孔板，待VeroSAMD9细胞长满90％单层后，将SDLVDUORF016毒株与亲本病毒YW14分别以培养液稀释至1000TCID₅₀/ml，按照每孔0.1ml的量接种到12孔板中，吸附2小时后换维持液继续培养，收集第0、12、24、48、72、96和120小时的样品，分别接种长有细胞单层的96孔板，测定TCID₅₀浓度，以收获时间为横坐标，TCID₅₀浓度为纵坐标，绘制生长曲线，并比较重组病毒与亲本株的生长差异。从图9的结果表明，敲除ORF016基因对山羊痘病毒的增殖影响不显著。

实验例7 ORF016基因缺失型病毒的安全性与有效性

用12月龄健康山羊3只，用灭菌生理盐水分别将SDLVDUORF016毒株病毒稀释成每毫升病毒含4×10^3.5TCID₅₀，分别于腹部皮内注射山羊3只，每只注射2点，每点0.5ml，观察15日，判定接种部位痘疹情况。整个观察期间，3只山羊体温均无明显波动、精神佳、采食正常。接种3天后，山羊相继出现痘肿反应，6d时痘斑达到最大(直径3.2cm)，呈微红色或无色，此后开始逐渐消退，至16天后痘斑完全消失。结果表明SDLVDUORF016大剂量接种不引起山羊的全身性反应，局部反应温和，安全性符合疫苗要求。

用12月龄健康山羊3只，用灭菌生理盐水分别将SDLVDUORF016病毒稀释成每毫升病毒含63.25TCID₅₀，分别于腹部皮内注射山羊3只，每只注射2点，每点0.5ml，观察15日，判定接种部位痘疹情况。整个观察期间，3只山羊体温均无明显波动、精神佳、采食正常。接种5天后，3只山羊相继出现痘肿反应，痘斑最小1.1cm，最大直径2.2cm，呈微红色或无色，此后开始逐渐消退，12天后痘斑完全消失。结果表明接种0.02头份SDLVDUORF016毒株仍然能够产生痘斑，其效力符合疫苗要求。

序列表

<110> 山东省滨州畜牧兽医研究院 山东绿都生物科技有限公司

<120> ORF016缺失型山羊痘病毒株、基因敲除方法及其应用

<160> 22

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 250

<212> DNA

<213> C端设计gRNA(Artificial Sequence)

<400> 1

ataaagttga aagttggtca tttggagaaa gtgtttggag agaagaacca aatttactat 60

atcctagata caatccatgt gttgttaatg tcaatgatac catctatgtt attggaggaa 120

tatctgaata tgataaatca gtagaagtgt ataatttgaa atataataaa tggtcattgg 180

gtgagtgtac aaaatattct cattatggtg gatgcactat ataccatcat ggtttaatat 240

atgttgttgg 250

<210> 2

<211> 250

<212> DNA

<213> N端设计gRNA(Artificial Sequence)

<400> 2

cttaaaagac tttgtaaatt tgtcactatt aataaattct ttatttttat aattacatcg 60

tggtgttatg tgtttatcac tatttttgtt aaaatcataa ggtttttttt taaatctgga 120

cgaccacgcc agtaaccttt tttttccttg ttctgttaaa aaggtgaacc ttacagcgtc 180

atttactaac ttcatcgtat taagcctatt agttttttta acagttcccc acttaattat 240

aaaattaaga 250

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> 016g1-F(Artificial Sequence)

<400> 3

caccggttag taaatgacgc tgta 24

<210> 4

<211> 24

<212> DNA

<213> 016g1-R(Artificial Sequence)

<400> 4

aaactacagc gtcatttact aacc 24

<210> 5

<211> 24

<212> DNA

<213> 016g2-F(Artificial Sequence)

<400> 5

caccgatacc atctatgtta ttgg 24

<210> 6

<211> 24

<212> DNA

<213> 016g2-R(Artificial Sequence)

<400> 6

aaacccaata acatagatgg tatc 24

<210> 7

<211> 20

<212> DNA

<213> ORF016基因上游引物(Artificial Sequence)

<400> 7

tcttggctga ttcagacacg 20

<210> 8

<211> 21

<212> DNA

<213> ORF016基因下游引物(Artificial Sequence)

<400> 8

acgatgtgta cgatgttgca g 21

<210> 9

<211> 1006

<212> DNA

<213> ORF016 基因缺失型基因序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atgactttaa aaaggtatat caataaagaa tatgtagaag aactaaagta catgttatta 60

aaaaatgatt atgataaaat tttaatattt acaattggag gtatatcaca aacaaggaaa 120

gatatttttg agatatcatc taattacttt aaaaaagcta ttaaaaaata tagtaacgaa 180

gttacgttac cttttaaata taagccattt acgtatgtgt tagagtatat taatactggt 240

tatattacat tgaatagcaa aaatgttgtt gacatttttt caatttcaaa cgtaatcgaa 300

attacgttta taatggatgc atgtactgat tttatgataa attatattga tgatagtatt 360

tgtgttgata tctttagaaa atcttatatg tatggttgtt acgatgtgta cgatgttgca 420

gataaatata ttaaaaaaag gtttatgtat ataagcaacg atttaattaa attaagagtt 480

aatgaattaa ggcccatatt aaaaagtagt gatttagttg ttgatactga agattttgtt 540

cttaatttta taattaagtg gggaactgtt aaaaaaacta ataggcttaa tacgatgaag 600

ttagtaaatg acgcttggag gaatatctga atatgataaa tcagtagaag tatataattt 660

gaaatataat aaatggtcat tgggtgagtg tacaaaatat tctcattatg gtggatgcac 720

tatataccat catggtttaa tatatgttgt tggtggaatt tcatatataa ataatataaa 780

agtttttaac atggtagaaa gctttaatcc tatgtcttgt aaatggagaa ttgagtcgtg 840

tctgaatcag ccaagattta atgcatcaat atgtattttt gatgattgta ttatgatcgt 900

tggaggtttt cattatggaa gatatatacg tgaaatagaa ctatttgatg ataaaacaaa 960

aggatggaac gttataggag cattagacat agatagtgtt ttttaa 1006

<210> 10

<211> 209

<212> PRT

<213> ORF016 基因缺失型蛋白(Artificial Sequence)

<400> 10

Met Thr Leu Lys Arg Tyr Ile Asn Lys Glu Tyr Val Glu Glu Leu Lys

1 5 10 15

Tyr Met Leu Leu Lys Asn Asp Tyr Asp Lys Ile Leu Ile Phe Thr Ile

20 25 30

Gly Gly Ile Ser Gln Thr Arg Lys Asp Ile Phe Glu Ile Ser Ser Asn

35 40 45

Tyr Phe Lys Lys Ala Ile Lys Lys Tyr Ser Asn Glu Val Thr Leu Pro

50 55 60

Phe Lys Tyr Lys Pro Phe Thr Tyr Val Leu Glu Tyr Ile Asn Thr Gly

65 70 75 80

Tyr Ile Thr Leu Asn Ser Lys Asn Val Val Asp Ile Phe Ser Ile Ser

85 90 95

Asn Val Ile Glu Ile Thr Phe Ile Met Asp Ala Cys Thr Asp Phe Met

100 105 110

Ile Asn Tyr Ile Asp Asp Ser Ile Cys Val Asp Ile Phe Arg Lys Ser

115 120 125

Tyr Met Tyr Gly Cys Tyr Asp Val Tyr Asp Val Ala Asp Lys Tyr Ile

130 135 140

Lys Lys Arg Phe Met Tyr Ile Ser Asn Asp Leu Ile Lys Leu Arg Val

145 150 155 160

Asn Glu Leu Arg Pro Ile Leu Lys Ser Ser Asp Leu Val Val Asp Thr

165 170 175

Glu Asp Phe Val Leu Asn Phe Ile Ile Lys Trp Gly Thr Val Lys Lys

180 185 190

Thr Asn Arg Leu Asn Thr Met Lys Leu Val Asn Asp Ala Trp Arg Asn

195 200 205

Ile

<210> 11

<211> 3603

<212> DNA

<213> SAMD9突变型基因(Artificial Sequence)

<400> 11

atggcaaagc aactgaacct tccacaaaat acagatgatt ggaccaaaga ggatgtaaat 60

aggtggttag aaagtcacaa gattgaccaa aaacacaggg aaattttgac tggacaagat 120

gtgaatggag cagtgttgaa gtggttaaaa aaagaacatc ttgttgatat gggcatcacc 180

aatggagtgg tccaagatta caaagcaagc cgagtagcaa accttcactt tccaagtatg 240

tatgtagaag ggaaaaccac accaaatgag aagatttcta ctctgaatct ttaccatcaa 300

ccaagctgga ttttctgcaa tggcaggtca gaccttgaca gtgaaaaata taaacccttt 360

gatccaagtt cctggcaaag agaaagagct tctgatgtca ggaaactgat ttcatttctt 420

acccatgaag acataatgcc aagagggaag tttttggtgg tgtttctatt actatcctct 480

gtggatgacc caagagatcc cctcattgag actttctgtg ctttctacca ggatctcaaa 540

ggaatagaaa atatactgtg tatttgtgta cagccacaca tatttcaggg atggaaagat 600

ctacttgaag caagattaat aaaacaccaa gatgaaattt caagccaatg tatttctgct 660

ttaagccttg aagagatcaa tggcactatt cttaaactaa aatctgtgac tcaatcttca 720

aaaagacttt taccatctat tggcttatcg actgtccttc tgaaaaaaga agaagatatc 780

atgacttctc tggaaattat ctgtgaaaat gaatgtgagg gtacactgtt agagacggac 840

aaaaataaat tccttgaatt caaggcatca aaagaggaag acttctatcg aggtggcaaa 900

gtgtcatggt ggaacttcta cttctcttct gaaagttatt cttcaccttt tgtcaaaagg 960

gataaatatg aaagacttga agcaatgatt caaaactgcg cagattcttc taaaccaaca 1020

tgtaccaaaa ttattcacct gtaccatcat ccaggctgtg ggggaactac cttggctatg 1080

ccaattctct gggacctaag gaaaaaattc agatgtgctg tgctaaaaaa caagacagtg 1140

gatttttctg aaattggaga acaggtaacc aatttaatca cctatggggc aatgaaccga 1200

caggaatatg tacctgtact gctccttgtt gatgattttg aagaacaaga taatgtctat 1260

cttctgcagt actctattca aacagttata gctaaaaagt acattcgata tgaaaaacct 1320

ctggtgatta tcctaaattg tatgagatca caaaatcctg aaaaaagtgc aaggatccca 1380

gacagcattg ccgtaataca gcaactctct cccaaagaac agagagcttt cgagcttaaa 1440

ttgaaagaaa tcaaagaaca gcataaaaat tttgaggatt tttattcctt tatgatcatg 1500

aaaaccaatt ttaataaaga atacatagaa aatgtggtcc ggaatatcct gaaagggcag 1560

aatattttta ccaaggaagc aaagctcttt tcttttctgg ctcttcttaa ttcatatgtg 1620

cctgatacca ccatttcact atcacagtgt gaaagattct taggaattgg aaacaagaag 1680

gctttctggg ggacagaaaa atttgaagac aagatgggca cctactctac aattctgata 1740

aaaacagagg tcatcgaatg tgggaactac tgtggagtac gcatcattca ctctttgatt 1800

gcaaagttct cactggaaga attgaagaaa agctatcacc tgaataaaag tcaaattatg 1860

ttggatatgc taactgagaa tttgttcttc gatactggta tgggaaaaag caaatttttg 1920

caagatatgc acacactcct actcacaaga caccgcaatg aacatgaagg tgaaacagga 1980

aattggtttt ccccatttat tgaagcatta cataaagatg aaggaaatga agcagttgaa 2040

gctgtattgc ttgaaggtat ccatcgattc aacccaaatg cattcatatg ccaagcgttg 2100

gcaagacatt tctacattaa aaagaaggac tttggcaatg ctctaaactg ggcaaaacaa 2160

gcaaaaatca tagaacctga caattcttat atctcagata cactgggtca agtctacaaa 2220

agtaaaataa gatggtggat agaggaaaac ggaagaaaca gaaacatttc agttgatgat 2280

ctaactgctc ttttgaattt agcagaacag gcctcaagtg cattcaaaga atctcaacag 2340

caaagtgaat atagagagta tgaagtgaag gaaaggttgt atcagaagtc aaaaaggagg 2400

tatgatactt acaatatcgc tggttatcaa ggagagatag aagttgggct ttacacaatc 2460

caaattctcc agctcattcc tttttttgat aataaaaatg agctatctaa aagagatatg 2520

gtcaattttg tatcaggaag tggtgatatt ccaggggatc aaaatgatga atataaatta 2580

gccctcaaaa actatattcc ttatttaact aaattgaaat tttctttgaa aaagtccttt 2640

gatttttttg atgaatactt tgtcctgcta aaacccagga acaacattaa gcaaaatgaa 2700

aaggccaaaa ctcggagaaa ggtggccgta tattttaaga aatatacaga tatattttgt 2760

ctcttagaag aatcacaaga cataggtctt ggatcaaagt tcagtgagcc acttcaaata 2820

gagagatgcc ggaaaagcgt agtagcttta aaagcagaca agtgttctgg gctcttggaa 2880

tatcttatca aaagtcaaga ggatgctata agcactatgg aatatatagt gaacaaatat 2940

gcttttctct tagaacaatg cactgtcaaa atccaggcaa aagaaaagtt aaatttcatc 3000

ttggccaaca ttattctctc ctgtatcaaa cctacctcga cattagtaaa gccagttgaa 3060

aaactaaaag atcagcttcg agaagtcttg caaccaatag gactgactta ccggttttca 3120

gaaccttatt ttctagcttc cctcttattc tggccagaaa atcaacaact agatcaacat 3180

tctcaaaaaa tgaaagagta tgctcaagca ctggaaaatt ctttcaaggg gcaatataaa 3240

catatgcatc gtacaaagca accaattgcg tatttctttc ttggaaaagg taaaagactg 3300

aaaagacttg ttcacaaagg aaaaattgat cagtgctttg aaaagacact agatattaat 3360

tccttgtggc agagtggaga tgtgtggaag gaggaaaaag tccaagaact tttgcttcgt 3420

ttacaaggtc gagctgaaaa taattgttta tacatagagt atggaatcaa tgaaaaaatc 3480

acaataccca ttactcccac ttttttaggt caacttagaa gtggcagaag catagaaaag 3540

gtgtcttttt acctgggatt ttccattgga ggcccacttg cttatgacat tgaaattgtt 3600

taa 3603

<210> 12

<211> 1200

<212> PRT

<213> SAMD9突变型蛋白(Artificial Sequence)

<400> 12

Met Ala Lys Gln Leu Asn Leu Pro Gln Asn Thr Asp Asp Trp Thr Lys

1 5 10 15

Glu Asp Val Asn Arg Trp Leu Glu Ser His Lys Ile Asp Gln Lys His

20 25 30

Arg Glu Ile Leu Thr Gly Gln Asp Val Asn Gly Ala Val Leu Lys Trp

35 40 45

Leu Lys Lys Glu His Leu Val Asp Met Gly Ile Thr Asn Gly Val Val

50 55 60

Gln Asp Tyr Lys Ala Ser Arg Val Ala Asn Leu His Phe Pro Ser Met

65 70 75 80

Tyr Val Glu Gly Lys Thr Thr Pro Asn Glu Lys Ile Ser Thr Leu Asn

85 90 95

Leu Tyr His Gln Pro Ser Trp Ile Phe Cys Asn Gly Arg Ser Asp Leu

100 105 110

Asp Ser Glu Lys Tyr Lys Pro Phe Asp Pro Ser Ser Trp Gln Arg Glu

115 120 125

Arg Ala Ser Asp Val Arg Lys Leu Ile Ser Phe Leu Thr His Glu Asp

130 135 140

Ile Met Pro Arg Gly Lys Phe Leu Val Val Phe Leu Leu Leu Ser Ser

145 150 155 160

Val Asp Asp Pro Arg Asp Pro Leu Ile Glu Thr Phe Cys Ala Phe Tyr

165 170 175

Gln Asp Leu Lys Gly Ile Glu Asn Ile Leu Cys Ile Cys Ala Gln Pro

180 185 190

His Ile Phe Gln Gly Trp Lys Asp Leu Leu Glu Ala Arg Leu Ile Lys

195 200 205

His Gln Asp Glu Ile Ser Ser Gln Cys Ile Ser Ala Leu Ser Leu Glu

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Glu Ile Asn Gly Thr Ile Leu Lys Leu Lys Ser Val Thr Gln Ser Ser

225 230 235 240

Lys Arg Leu Leu Pro Ser Ile Gly Leu Ser Thr Val Leu Leu Lys Lys

245 250 255

Glu Glu Asp Ile Met Thr Ser Leu Glu Ile Ile Cys Glu Asn Glu Cys

260 265 270

Glu Gly Thr Leu Leu Glu Thr Asp Lys Asn Lys Phe Leu Glu Phe Lys

275 280 285

Ala Ser Lys Glu Glu Asp Phe Tyr Arg Gly Gly Lys Val Ser Trp Trp

290 295 300

Asn Phe Tyr Phe Ser Ser Glu Ser Tyr Ser Ser Pro Phe Val Lys Arg

305 310 315 320

Asp Lys Tyr Glu Arg Leu Glu Ala Met Ile Gln Asn Cys Ala Asp Ser

325 330 335

Ser Lys Pro Thr Cys Thr Lys Ile Ile His Leu Tyr His His Pro Gly

340 345 350

Cys Gly Gly Thr Thr Leu Ala Met His Ile Leu Trp Asp Leu Arg Lys

355 360 365

Lys Phe Arg Cys Ala Val Leu Lys Asn Lys Thr Val Asp Phe Ser Glu

370 375 380

Ile Gly Glu Gln Val Thr Asn Leu Ile Thr Tyr Gly Ala Met Asn Arg

385 390 395 400

Gln Glu Tyr Val Pro Val Leu Leu Leu Val Asp Asp Phe Glu Glu Gln

405 410 415

Asp Asn Val Tyr Leu Leu Gln Tyr Ser Ile Gln Thr Val Ile Ala Lys

420 425 430

Lys Tyr Ile Arg Tyr Glu Lys Pro Leu Val Ile Ile Leu Asn Cys Met

435 440 445

Arg Ser Gln Asn Pro Glu Lys Ser Ala Arg Ile Pro Asp Ser Ile Ala

450 455 460

Val Ile Gln Gln Leu Ser Pro Lys Glu Gln Arg Ala Phe Glu Leu Lys

465 470 475 480

Leu Lys Glu Ile Lys Glu Gln His Lys Asn Phe Glu Asp Phe Tyr Ser

485 490 495

Phe Met Ile Met Lys Thr Asn Phe Asn Lys Glu Tyr Ile Glu Asn Val

500 505 510

Val Arg Asn Ile Leu Lys Gly Gln Asn Ile Phe Thr Lys Glu Ala Lys

515 520 525

Leu Phe Ser Phe Leu Ala Leu Leu Asn Ser Tyr Val Pro Asp Thr Thr

530 535 540

Ile Ser Leu Ser Gln Cys Glu Arg Phe Leu Gly Ile Gly Asn Lys Lys

545 550 555 560

Ala Phe Trp Gly Thr Glu Lys Phe Glu Asp Lys Met Gly Thr Tyr Ser

565 570 575

Thr Ile Leu Ile Lys Thr Glu Val Ile Glu Cys Gly Asn Tyr Cys Gly

580 585 590

Val Arg Ile Ile His Ser Leu Ile Ala Lys Phe Ser Leu Glu Glu Leu

595 600 605

Lys Lys Ser Tyr His Leu Asn Lys Ser Gln Ile Met Leu Asp Met Leu

610 615 620

Thr Glu Asn Leu Phe Phe Asp Thr Gly Met Gly Lys Ser Lys Phe Leu

625 630 635 640

Gln Asp Met His Thr Leu Leu Leu Thr Arg His Arg Asn Glu His Glu

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Gly Glu Thr Gly Asn Trp Phe Ser Pro Phe Ile Glu Ala Leu His Lys

660 665 670

Asp Glu Gly Asn Glu Ala Val Glu Ala Val Leu Leu Glu Gly Ile His

675 680 685

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690 695 700

Tyr Ile Lys Lys Lys Asp Phe Gly Asn Ala Leu Asn Trp Ala Lys Gln

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Ala Lys Ile Ile Glu Pro Asp Asn Ser Tyr Ile Ser Asp Thr Leu Gly

725 730 735

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740 745 750

Asn Arg Asn Ile Ser Val Asp Asp Leu Thr Ala Leu Leu Asn Leu Ala

755 760 765

Glu Gln Ala Ser Gly Ala Phe Lys Glu Ser Gln Gln Gln Ser Glu Tyr

770 775 780

Arg Glu Tyr Glu Val Lys Glu Arg Leu Tyr Gln Lys Ser Lys Arg Arg

785 790 795 800

Tyr Asp Thr Tyr Asn Ile Ala Gly Tyr Gln Gly Glu Ile Glu Val Gly

805 810 815

Leu Tyr Thr Ile Gln Ile Leu Gln Leu Ile Pro Phe Phe Asp Asn Lys

820 825 830

Asn Glu Leu Ser Lys Arg Asp Met Val Asn Phe Val Ser Gly Ser Gly

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Asp Ile Pro Gly Asp Gln Asn Asp Glu Tyr Lys Leu Ala Leu Lys Asn

850 855 860

Tyr Ile Pro Tyr Leu Thr Lys Leu Lys Phe Ser Leu Lys Lys Ser Phe

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Asp Phe Phe Asp Glu Tyr Phe Val Leu Leu Lys Pro Arg Asn Asn Ile

885 890 895

Lys Gln Asn Glu Glu Ala Lys Thr Arg Arg Lys Val Ala Val Tyr Phe

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Lys Lys Tyr Thr Asp Ile Phe Cys Leu Leu Glu Glu Ser Gln Asp Ile

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Gly Leu Gly Ser Lys Phe Ser Glu Pro Leu Gln Ile Glu Arg Cys Arg

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Lys Ser Leu Val Ala Leu Lys Ala Asp Lys Phe Ser Gly Leu Leu Glu

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Val Asn Lys Tyr Ala Phe Leu Leu Glu Gln Cys Thr Val Lys Ile Gln

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Ala Lys Glu Lys Leu Asn Phe Ile Leu Ala Asn Ile Ile Leu Ser Cys

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Gln Leu Arg Glu Val Leu Gln Pro Ile Gly Leu Thr Tyr Arg Phe Ser

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Glu Pro Tyr Phe Leu Ala Ser Leu Leu Phe Trp Pro Glu Asn Gln Gln

1045 1050 1055

Leu Asp Gln His Ser Gln Lys Met Lys Glu Tyr Ala Gln Ala Leu Glu

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Asn Ser Phe Lys Gly Gln Tyr Lys His Met His Arg Thr Lys Gln Pro

1075 1080 1085

Ile Ala Tyr Phe Phe Leu Gly Lys Gly Lys Arg Leu Lys Arg Leu Val

1090 1095 1100

His Lys Gly Lys Ile Asp Gln Cys Phe Glu Lys Thr Leu Asp Ile Asn

1105 1110 1115 1120

Ser Leu Trp Gln Ser Gly Asp Val Trp Lys Glu Glu Lys Val Gln Glu

1125 1130 1135

Leu Leu Leu Arg Leu Gln Gly Arg Ala Glu Asn Asn Cys Leu Tyr Ile

1140 1145 1150

Glu Tyr Gly Ile Asn Glu Lys Ile Thr Ile Pro Ile Thr Pro Thr Phe

1155 1160 1165

Leu Gly Gln Leu Arg Ser Gly Arg Ser Ile Glu Lys Val Ser Phe Tyr

1170 1175 1180

Leu Gly Phe Ser Ile Gly Gly Pro Leu Ala Tyr Asp Ile Glu Ile Val

1185 1190 1195 1200

<210> 13

<211> 23

<212> DNA

<213> AlbA_g1(Artificial Sequence)

<400> 13

gttgatatgg gcatcacaca tgg 23

<210> 14

<211> 58

<212> DNA

<213> AlbA_g1引物(Artificial Sequence)

<400> 14

taatacgact cactataggg gttgatatgg gcatcacaca gttcagagct atgctgga 58

<210> 15

<211> 23

<212> DNA

<213> AlbA_g2(Artificial Sequence)

<400> 15

gatcctgagt ctaacatcaa tgg 23

<210> 16

<211> 58

<212> DNA

<213> AlbA_g2(Artificial Sequence)

<400> 16

taatacgact cactataggg gatcctgagt ctaacatcaa gttcagagct atgctgga 58

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> SAMDF1(Artificial Sequence)

<400> 17

ggcaaagcaa ctgaaccttc c 21

<210> 18

<211> 22

<212> DNA

<213> SAMDF1(Artificial Sequence)

<400> 18

tctcatttgg tgtggttttc cc 22

<210> 19

<211> 22

<212> DNA

<213> SAMDF(Artificial Sequence)

<400> 19

tatcagaatg gcaaagcaac tg 22

<210> 20

<211> 23

<212> DNA

<213> SAMDR(Artificial Sequence)

<400> 20

aggtggtact gagaccaaat tct 23

<210> 21

<211> 1689

<212> DNA

<213> YW14株的ORF016基因(Artificial Sequence)

<400> 21

atgactttaa aaaggtatat caataaagaa tatgtagaag aactaaagta catgttatta 60

aaaaatgatt atgatagaat tttaatattt acaattggag gtatatcaca aacaaggaaa 120

gatatttttg agatatcatc taattacttt aaaaaagcta ttaaaaaata tagtaacgaa 180

gttacgttac cttttaaata taagccattt acgtatgtgt tagagtatat taatactggt 240

tatattacat tgaatagcaa aaatgttgtt gacatttttt caatttcaaa cgtaatcgaa 300

attacgttta taatggatgc atgtactgat tttatgataa aatacattga tgatagtatt 360

tgtgttgata tctttagaaa atcttatatg tatggttgtt acgatttgta cgatgttgca 420

gataaatata ttaaaaaaag gtttatgtat ataagcaacg atttaattaa attaagagtt 480

aatgaattaa ggcccatatt aaaaagtagt gatttagttg ttgatactga agattttgtt 540

cttaatttta taattaagtg gggaactgtt aaaaaaacta ataggcttaa tacgatgaag 600

ttagtaaatg acgctgtaag gttcaccttt ttaacagaac aaggaaaaaa aaggttactg 660

gcgtggtcgt ccagatttaa aaaaaaacct tatgatttta acaaaaatag tgataaacac 720

ataacaccac gatgtaatta taaaaataaa gaatttatta atagtgacaa atttacaaag 780

tcttttaagt ttaaggtata taatgataac ttaacaaaaa tactgtttac aaataatata 840

atggatataa atataataga tgaaagtgtt tatgataatg aactattgta tgaaaaaaaa 900

acattaaatg aaaccattca acaacccagt aacttaagta aattaagcaa cataatagat 960

gaaaatttta agttttgtac ttcaattgct attggtaata atatttactt tttaggtggg 1020

gtggataaat actcacgatc agtaaatagt gtattcacaa tcaatgcaaa aacttttgaa 1080

agagaaaact taccttcatt aatttatcca agaaaatgtc caggtgtcac ttattttaat 1140

aatagaatat atgttattgg tggtatatat aataattgta tagttaataa agttgaaagt 1200

tggtcatttg gagaaagtgt ttggagagaa gaaccaaatt tactatatcc tagatacaat 1260

ccatgtgttg ttaatgtcaa tgataccatc tatgttattg gaggaatatc tgaatatgat 1320

aaatcagtag aagtgtataa tttgaaatat aataaatggt cattgggtga gtgtacaaaa 1380

tattctcatt atggtggatg cactatatac catcatggtt taatatatgt tgttggtgga 1440

atttcatata taaataatat aaaagttttt aacatggtag aaagctttaa tcctatgtct 1500

tgtaaatgga gaattgagtc gtgtctgaat cagccaagat ttaatgcatc aatatgtatt 1560

tttgatgatt gtattatgat cgttggaggt tttcattatg gaagatatat acgtgaaata 1620

gaactatttg atgataaaac aaaaggatgg aacgttatag gagcattaga catagatagt 1680

gttttttaa 1689

<210> 22

<211> 562

<212> PRT

<213> YW14株的ORF016蛋白(Artificial Sequence)

<400> 22

Met Thr Leu Lys Arg Tyr Ile Asn Lys Glu Tyr Val Glu Glu Leu Lys

1 5 10 15

Tyr Met Leu Leu Lys Asn Asp Tyr Asp Arg Ile Leu Ile Phe Thr Ile

20 25 30

Gly Gly Ile Ser Gln Thr Arg Lys Asp Ile Phe Glu Ile Ser Ser Asn

35 40 45

Tyr Phe Lys Lys Ala Ile Lys Lys Tyr Ser Asn Glu Val Thr Leu Pro

50 55 60

Phe Lys Tyr Lys Pro Phe Thr Tyr Val Leu Glu Tyr Ile Asn Thr Gly

65 70 75 80

Tyr Ile Thr Leu Asn Ser Lys Asn Val Val Asp Ile Phe Ser Ile Ser

85 90 95

Asn Val Ile Glu Ile Thr Phe Ile Met Asp Ala Cys Thr Asp Phe Met

100 105 110

Ile Lys Tyr Ile Asp Asp Ser Ile Cys Val Asp Ile Phe Arg Lys Ser

115 120 125

Tyr Met Tyr Gly Cys Tyr Asp Leu Tyr Asp Val Ala Asp Lys Tyr Ile

130 135 140

Lys Lys Arg Phe Met Tyr Ile Ser Asn Asp Leu Ile Lys Leu Arg Val

145 150 155 160

Asn Glu Leu Arg Pro Ile Leu Lys Ser Ser Asp Leu Val Val Asp Thr

165 170 175

Glu Asp Phe Val Leu Asn Phe Ile Ile Lys Trp Gly Thr Val Lys Lys

180 185 190

Thr Asn Arg Leu Asn Thr Met Lys Leu Val Asn Asp Ala Val Arg Phe

195 200 205

Thr Phe Leu Thr Glu Gln Gly Lys Lys Arg Leu Leu Ala Trp Ser Ser

210 215 220

Arg Phe Lys Lys Lys Pro Tyr Asp Phe Asn Lys Asn Ser Asp Lys His

225 230 235 240

Ile Thr Pro Arg Cys Asn Tyr Lys Asn Lys Glu Phe Ile Asn Ser Asp

245 250 255

Lys Phe Thr Lys Ser Phe Lys Phe Lys Val Tyr Asn Asp Asn Leu Thr

260 265 270

Lys Ile Leu Phe Thr Asn Asn Ile Met Asp Ile Asn Ile Ile Asp Glu

275 280 285

Ser Val Tyr Asp Asn Glu Leu Leu Tyr Glu Lys Lys Thr Leu Asn Glu

290 295 300

Thr Ile Gln Gln Pro Ser Asn Leu Ser Lys Leu Ser Asn Ile Ile Asp

305 310 315 320

Glu Asn Phe Lys Phe Cys Thr Ser Ile Ala Ile Gly Asn Asn Ile Tyr

325 330 335

Phe Leu Gly Gly Val Asp Lys Tyr Ser Arg Ser Val Asn Ser Val Phe

340 345 350

Thr Ile Asn Ala Lys Thr Phe Glu Arg Glu Asn Leu Pro Ser Leu Ile

355 360 365

Tyr Pro Arg Lys Cys Pro Gly Val Thr Tyr Phe Asn Asn Arg Ile Tyr

370 375 380

Val Ile Gly Gly Ile Tyr Asn Asn Cys Ile Val Asn Lys Val Glu Ser

385 390 395 400

Trp Ser Phe Gly Glu Ser Val Trp Arg Glu Glu Pro Asn Leu Leu Tyr

405 410 415

Pro Arg Tyr Asn Pro Cys Val Val Asn Val Asn Asp Thr Ile Tyr Val

420 425 430

Ile Gly Gly Ile Ser Glu Tyr Asp Lys Ser Val Glu Val Tyr Asn Leu

435 440 445

Lys Tyr Asn Lys Trp Ser Leu Gly Glu Cys Thr Lys Tyr Ser His Tyr

450 455 460

Gly Gly Cys Thr Ile Tyr His His Gly Leu Ile Tyr Val Val Gly Gly

465 470 475 480

Ile Ser Tyr Ile Asn Asn Ile Lys Val Phe Asn Met Val Glu Ser Phe

485 490 495

Asn Pro Met Ser Cys Lys Trp Arg Ile Glu Ser Cys Leu Asn Gln Pro

500 505 510

Arg Phe Asn Ala Ser Ile Cys Ile Phe Asp Asp Cys Ile Met Ile Val

515 520 525

Gly Gly Phe His Tyr Gly Arg Tyr Ile Arg Glu Ile Glu Leu Phe Asp

530 535 540

Asp Lys Thr Lys Gly Trp Asn Val Ile Gly Ala Leu Asp Ile Asp Ser

545 550 555 560

Val Phe

Claims (2)

1.靶向山羊痘病毒ORF016基因的gRNA组合，其特征在于，所述gRNA组合的序列分别如SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：5所示。

2.权利要求1所述的gRNA组合在山羊痘病毒ORF016基因敲除中的应用。

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