CN117646032B - Bhv-1的反向遗传操作系统及其在病毒拯救中的应用 - Google Patents
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Abstract
BHV‑1的反向遗传操作系统及其在病毒拯救中的应用,属于病毒遗传操作技术领域。为解决现有BHV‑1的基因编辑方法存在效率低、耗时长、重组病毒纯化困难等问题,本发明通过将BHV‑1基因组剪切后分段克隆入Fosmid粘粒载体pCC1Fos,构建了BHV‑1基因组Fosmid文库;在对该文库进行基因组测序的基础上,从中挑选出5个克隆有BHV‑1基因组片段,且相互含有重叠区域,并可以拼接覆盖BHV‑1全基因组的重组粘粒;用这5个粘粒共转染人胚胎肾细胞,成功拯救BHV‑1,获得了BHV‑1的反向遗传操作系统。
Description
技术领域
本发明属于病毒遗传操作技术领域,具体涉及BHV-1的反向遗传操作系统及其在病毒拯救中的应用。
背景技术
牛传染性鼻气管炎(Infectious bovine rhinotracheitis,IBR)是由牛疱疹病毒I型(Bovine herpes virus type I,BHV-1)引起的一种牛呼吸道接触性传染病。该病通常为潜伏感染,除了直接致病外还会引起牛的免疫抑制导致继发感染,是引起牛呼吸系统综合征的主要病原之一。当前IBR主要防治措施为疫苗接种,尚无有效的干预性治疗药物。
引起牛传染性鼻气管炎的病原为牛疱疹病毒I型,BHV-1属于疱疹病毒科,α疱疹病毒亚科,水痘病毒属,其基因组为双链DNA,全长约为135.5 kb。病毒粒子呈球形核衣壳,为对称的二十面体。BHV-1基因组中,已经鉴定的编码蛋白质的开放阅读框有73个,共编码33种结构蛋白和15种非结构蛋白(Muylkens B, Thiry J, Kirten P, Schynts F, Thiry E.Bovine herpesvirus 1 infection and infectious bovine rhinotracheitis. VetRes. 2007 Mar-Apr;38(2):181-209. doi: 10.1051/vetres:2006059. Epub 2007 Jan25. PMID: 17257569.)。
BHV-1作为α疱疹病毒亚科中的一员,其庞大的病毒基因组为病毒的基因编辑提供了巨大的空间。近年来BHV-1重组病毒作为疫苗载体被广泛研究,同时由于BHV-1可以感染和杀死多种组织来源的肿瘤细胞,其重组病毒在肿瘤治疗方面也被广泛研究。总之,BHV-1重组病毒的构建及基因编辑无论是对于BHV-1本身的研究还是其他方面的研究都具有重要意义。
BHV-1的基因编辑方法主要是同源重组和基于CRISPR-Cas9的同源重组法,而由于BHV-1的基因组十分庞大,这些方法都存在同源臂载体构建困难以及需要进行多轮噬斑纯化等问题。无论何种方法,对于BHV-1的基因编辑都还存在一个困难点,就是BHV-1的经典易感细胞牛肾细胞(MDBK),转染效率很低,所以导致在MDBK上进行BHV-1的基因编辑十分困难。因此,亟需获得一种应用于BHV-1的效率高、耗时短且不存在纯化困难的基因编辑方法。
稳定的大片段基因组文库是生物基因组学研究的材料平台。基因文库是将某一生物的全基因或某部分基因以大小不同的片段克隆到不同的载体,并转移到宿主中。当需要某一基因片段时,可通过某种筛选方法获得包含所需的基因片段的克隆,并可通过宿主的增殖大量获得所需的基因。按载体可插入片段的大小,可将基因文库分为质粒文库、噬菌体文库、Fosmid文库、BAC文库和YAC文库等。
Fosmid文库是应用广泛的大片段基因组文库,具有稳定性高、随机性好、拷贝数可控等特点,主要用于基因的克隆、基因组序列测定、物理图谱构建以及比较基因组研究。Fosmid基因组文库是应用Fosmid克隆载体构建而成的文库。Fosmid克隆载体是Kim等将pBAC引入pUCcos而构建的载体系统(Birren BW, Tachi-iri Y, Kim UJ, Nguyen M,Shizuya H, Korenberg J, Simon, MI. A human chromosome 22Fosmid resource:mapping and analysis of 96clones. Genomics. 1996, 34:97-106.)。Fosmid以大肠杆菌F-因子为基础,以氯霉素抗性基因为选择标记,同时含有λ噬菌体DNA的cos序列,可以包装外源DNA片段。插入外源片段的粘粒一般为30~40 kb。尽管Fosmid文库插入的片段小,但是Fosmid文库具有稳定性好、没有偏向性、构建周期短以及操作简便等优点,为快速构建突变病毒提供了良好的平台。因此,将Fosmid文库用于BHV-1重组病毒的构建及基因编辑具有重要意义。应用Fosmid构建BHV-1的反向遗传操作系统并用其进行重组病毒的拯救,可以为BHV-1疫苗的研究奠定坚实的基础,具有重要的应用前景。
发明内容
为了解决现有的BHV-1基因编辑方法存在效率低、耗时长、重组病毒纯化困难等问题,本发明通过将BHV-1基因组剪切后分段克隆入Fosmid粘粒载体pCC1Fos,构建了BHV-1基因组Fosmid文库;在对该文库进行基因组测序的基础上,从中挑选出5个克隆有BHV-1基因组片段,且相互含有重叠区域,并可以拼接覆盖BHV-1全基因组的重组粘粒;用这5个粘粒共转染人胚胎肾细胞(HEK293T),成功拯救出与原BHV-1生物学特性相同的病毒。
为解决上述技术问题并达到相应的技术效果,本发明提供了如下技术方案:
本发明的第一个目的是提供一种BHV-1的反向遗传操作系统,所述反向遗传操作系统包含分别含有BHV-1基因组1-41592 nt,54764-91064 nt,99753-135460 nt,22588-61504 nt和65620-102129 nt核苷酸序列的5个重组粘粒,所述BHV-1全基因组序列的GeneBank登录号为NC001847。
在本发明的一种实施方式中,所述5个重组粘粒是通过将BHV-1基因组1-41592nt,54764-91064 nt,99753-135460 nt,22588-61504 nt和65620-102129 nt核苷酸序列分别与pCC1Fos载体连接获得的。
本发明的第二个目的是提供一种构建上述反向遗传操作系统的方法,所述方法包括如下步骤:
S1、提取BHV-1基因组DNA;
S2、BHV-1基因组Fosmid文库的构建:将BHV-1基因组DNA片段末端补平修饰,经脉冲场电泳验证,回收30-45 kb之间的DNA片段,取回收后DNA片段与pCC1FOS载体连接获得重组DNA,将重组DNA包装后感染大肠杆菌,经培养后随机挑取单克隆,提取粘粒并进行末端测序,将测序正确的粘粒进行序列拼接,获得覆盖BHV-1全长基因组的Fosmid文库;
S3、BHV-1的拯救:从S2中获得的含有30-45 kb基因组DNA片段的粘粒中选取组合,每种组合含有4-5个粘粒,每个粘粒的BHV-1 DNA片段两端都能相互重叠,每组粘粒能够覆盖BHV-1全基因组,对各组的粘粒进行纯化,将纯化后的粘粒组合分别转染至汇合度为70%的HEK293T细胞中,转染后72 h,将细胞反复冻融,将上清接种于MDBK细胞,待细胞病变后反复冻融细胞,收获拯救病毒。
在本发明的一种实施方式中,S2所述基因组DNA片段是将S1提取的BHV-1基因组DNA通过物理剪切方式获得的随机断裂的基因组DNA片段。
在本发明的一种实施方式中,S2中用噬菌体包装蛋白包装重组DNA。
在本发明的一种实施方式中,S3所述转染每个粘粒转染剂量为2 μg。
在本发明的一种实施方式中,S3成功获得拯救病毒所用粘粒组合由分别含有BHV-1基因组1-41592 nt,54764-91064 nt,99753-135460 nt,22588-61504 nt和65620-102129nt核苷酸序列的5个重组粘粒组成,所述BHV-1全基因组序列的GeneBank登录号为NC001847。
本发明的第三个目的是提供上述的反向遗传操作系统在拯救BHV-1中的应用。
本发明的第四个目的是提供上述的反向遗传操作系统在构建BHV-1突变体或对BHV-1基因组进行修饰中的应用。
本发明的第五个目的是提供上述的反向遗传操作系统在用于制备牛传染性鼻气管炎重组疫苗中的应用。
本发明的有益效果:
本发明通过将BHV-1基因组剪切后分段克隆入Fosmid粘粒载体pCC1Fos,构建了BHV-1基因组Fosmid文库。用Fosmid构建BHV-1粘粒文库在国内外尚属首次。本发明在对该文库进行基因组测序的基础上,从中挑选出5个克隆有BHV-1基因组片段,且相互含有重叠区域,并可以拼接覆盖BHV-1全基因组的重组粘粒。用这5个粘粒共转染人胚胎肾细胞(HEK293T),转染72 h后感染MDBK,成功拯救BHV-1。经过PCR、生长曲线比较等鉴定方法发现拯救病毒与原BHV-1生物学特性相同。以上结果表明BHV-1的反向遗传操作系统构建成功。
利用BHV-1的反向遗传操作系统对BHV-1基因进行编辑能够避免利用同源重组法对BHV-1基因进行编辑需要构建同源臂载体的问题,在不需要纯化的情况下即可得到重组病毒。同时在本发明中,我们利用HEK293T细胞进行BHV-1的病毒基因组编辑,也解决了细胞转染效率低等问题。本发明提供的BHV-1反向遗传操作系统能够用于拯救BHV-1、构建BHV-1突变体、修饰BHV-1基因组及牛传染性鼻气管炎重组疫苗的制备,具有很高的应用价值。
附图说明
图1为BHV-1基因组及多片段拯救系统各粘粒相对位置图;
图2为拯救病毒Fosmid-BHV-1对MDBK细胞的感染情况图;其中,图2中的A为粘粒转染HEK293T细胞后72 h的结果图,图2中的B为粘粒转染HEK293T细胞后的上清感染MDBK细胞48 h后的结果图,箭头指向的位置为发生细胞病变的位置;
图3为拯救病毒Fosmid-BHV-1的间接免疫荧光实验鉴定结果图;其中,图3中的A为正常MDBK细胞间接免疫荧光鉴定结果图,图3中的B为Fosmid-BHV-1感染MDBK细胞后的间接免疫荧光鉴定结果图;
图4为拯救病毒Fosmid-BHV-1与BHV-1的PCR鉴定结果图;
图5为拯救病毒Fosmid-BHV-1与BHV-1的生长曲线图;
图6为拯救病毒Fosmid-BHV-1与BHV-1的蚀斑鉴定结果图,其中,图6中的A为BHV-1的蚀斑鉴定结果图,图6中的B为Fosmid-BHV-1的蚀斑鉴定结果图。
具体实施方式
以下结合具体实施例和附图,对本发明作进一步地详细说明,所述实施例仅是意图举例说明本发明,而不是意图限制本发明的范围。本领域技术人员应该理解的是,在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换,但这些修改和替换均在本发明的保护范围之内。实施本发明的过程、条件、实验方法及试剂等,除以下专门提及的内容之外,均为本领域的普遍知识和市场常规产品,本发明没有特别限制内容。
BHV-1毒株由本实验室分离、鉴定和保存;人胚胎肾细胞(HEK293T),胎牛肾细胞(MDBK)由本实验室保存,用含有10%胎牛血清(Sigma)的DMEM培养基(Gibco)于37℃、5% CO2培养箱中培养。
CopyControl Fosmid Library Production Kit(CCFOS110)、pCC1FOSTM-T1RE.coli Plating Strain、包装蛋白MaxplaxTM Lambda Packaging Extracts均购自Lucigen公司、脉冲场电泳琼脂糖购自Bio-Rad公司(Pulsed Field Certified Agarose,1620137)、Midrange PFG Marker购自Neb公司(Cat.No.N0342S)、玻璃奶法凝胶回收试剂盒购自MP公司(Cat.No.111102200)、氯霉素抗生素购自Solarbio公司(Cat.No.238883182)、质粒小提试剂盒购自ZYMO公司(ZR BAC DNA Miniprep Kit,D4049)、质粒中提试剂盒购自Qiagen公司(QIAfilter Plasmid Midi Kit,12243)、X-tremeGENE HP DNA TransfectionReagent(Cat.No.6366546001)。
实施例1:BHV-1反向遗传操作系统的构建
(1)BHV-1基因组提取
将MOI=0.1的BHV-1接种于MDBK细胞,当100%细胞出现细胞病变(CPE)时,将细胞冻融三次后3000 rpm离心15 min,取上清加入30%蔗糖铺底,4℃ 30000 rpm超速离心2 h。使用4.75 mL TNE缓冲液重悬沉淀,250 μL 10% SDS,1 mg蛋白酶K消化,室温作用3 min。使用等体积平衡酚抽提一次,酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)溶液抽提两次。然后加入两倍体积的无水乙醇,置于-20℃沉淀30 min,最后用去离子水溶解基因组。
(2)BHV-1 Fosmid文库的构建
取提取的BHV-1基因组DNA,应用物理法(使用200 μL枪头反复吹打)获得随机断裂的BHV-1 DNA片段,剪切片段末端按照CopyControl Fosmid Library Production Kit的使用说明对DNA进行末端补平修饰,并进行脉冲场电泳验证。然后利用玻璃奶法凝胶回收试剂盒直接回收大小为40 kb左右的DNA片段。取0.25 μg纯化回收的DNA片段连接至pCC1FOS,用噬菌体包装蛋白包装重组DNA,转导至大肠杆菌EPI300宿主细胞中,将转导产物均匀涂布于含12.5 μg/mL氯霉素的LB平板上,37℃过夜培养。随机挑选20个单克隆,提取质粒,并进行末端测序鉴定。将测序正确的粘粒进行序列拼接,获得覆盖BHV-1全长基因组的Fosmid文库。
经末端测序证实,共获得了插入BHV-1基因组片段的粘粒120个,分析表明,120个粘粒覆盖了BHV-1全基因组。但其中包含UL区片段的粘粒相对偏多,说明文库存在一定的偏嗜性。从上述120个粘粒中筛选出基因组插入片段大小约为30 kb~45 kb的16个粘粒用于后续研究(见表1)。
表1 BHV-1株基因组及多片段拯救系统各粘粒插入的片段大小以及基因组的相对位置
(3)病毒的拯救
从16个BHV-1基因组插入片段大小约为30 kb~45 kb的克隆中选取6种组合(见表2),其中每种组合含有4-5个粘粒,每个粘粒的BHV-1 DNA片段两端都能相互重叠,每组粘粒能够覆盖BHV-1全基因组。
表2 拯救病毒的粘粒组合
注:a、b、c等字母与表1中的粘粒相对,分别代表不同的粘粒
将6种组合的可以覆盖BHV-1全长基因组的粘粒纯化后,按照X-tremeGENE HP DNATransfection Reagent转染试剂说明书,分别转染至汇合度为70%的10 cm细胞培养皿HEK293T细胞中,每个粘粒转染剂量为2 μg,转染后96 h,将细胞反复冻融,将上清接种于MDBK细胞,待细胞病变后反复冻融细胞,收获病毒。
其中第一组粘粒组合(I+j+k+h+l)(见图1)转染HEK293T细胞72 h后,反复冻融三次后感染MDBK细胞48 h内出现细胞病变(见图2)。将病变细胞反复冻融,上清接种MDBK细胞,均能产生典型的细胞病变,表明拯救病毒成功,将拯救的病毒命名为Fosmid-BHV-1。而第三组粘粒组合(a+e+m+o+h)和第四组粘粒组合(b+g+l+h)转染HEK293T细胞72 h后,反复冻融三次后感染MDBK细胞96 h后才出现细胞病变效率相较于第一组粘粒偏低。同时其他三组粘粒在进行相同实验操作后,不能成功拯救病毒。因此我们选择第一组粘粒进行后续实验。
(4)间接免疫荧光实验(IFA)
将拯救的病毒接种至密度为90%的MDBK细胞中,48 h后进行IFA实验。具体操作如下:弃掉培养基,用PBS清洗细胞两次,然后用4%的多聚甲醛固定细胞15 min,0.2%TritonX-100透膜作用15 min,之后加入含1% BSA,2%山羊血清的封闭液室温封闭,1 h后加入鼠源BHV-1 VP8单抗。
IFA结果显示,拯救病毒Fosmid-BHV-1能与BHV-1单克隆抗体VP8反应(见图3)。
(5)拯救病毒的鉴定
1、PCR鉴定
将拯救病毒Fosmid-BHV-1于-80℃/37℃条件下反复冻融后,在MDBK细胞上连续传代20代,提取毒株第20代病毒的DNA,应用特异性引物扩增TK、gI-gE基因片段,并对扩增片段进行测序分析。经分析拯救病毒Fosmid-BHV-1与BHV-1均能扩增出BHV-1 TK、gI-gE基因(见图4)。
2、拯救病毒Fosmid-BHV-1与BHV-1生长曲线比较
将BHV-1与Fosmid-BHV-1以MOI=0.01的接毒量分别在24孔板中感染MDBK细胞,分别收取感染后0 h,12 h,24 h,36 h,48 h,72 h,96 h病毒,测定病毒TCID50,绘制病毒多步生长曲线(见图5)。由图5可知,拯救病毒Fosmid-BHV-1与BHV-1的多步生长曲线没有明显区别。
3、拯救病毒Fosmid-BHV-1与BHV-1蚀斑大小比较
将BHV-1与Fosmid-BHV-1以MOI=0.001的接毒量感染MDBK细胞,1 h后弃去上清,PBS洗三次,加入2×DMEM与2%低熔点琼脂糖混合液。室温放置20分钟,凝固后倒置于5%CO2,37℃培养箱中培养。通过对培养结果的观察可知BHV-1(图6中的A)与拯救病毒Fosmid-BHV-1(图6中的B)的蚀斑大小无明显区别。
上述实验结果表明BHV-1的反向遗传操作系统构建成功。
虽然本发明已以较佳的实施例公开如上,但其并非用以限定本发明,任何熟悉此技术的人,在不脱离本发明精神和范围内,都可以做各种的改动与修饰,因此,本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Claims (4)
1.一种BHV-1的反向遗传操作系统,其特征在于,包含分别含有BHV-1病毒基因组1-41592 nt,54764-91064 nt,99753-135460 nt,22588-61504 nt和65620-102129 nt核苷酸序列的5个重组粘粒,所述5个重组粘粒是通过将BHV-1基因组1-41592 nt,54764-91064nt,99753-135460 nt,22588-61504 nt和65620-102129 nt核苷酸序列分别与pCC1Fos载体连接获得的,所述BHV-1全基因组序列的GeneBank登录号为NC001847。
2.权利要求1所述反向遗传操作系统的应用,其特征在于,是将反向遗传操作系统用于拯救BHV-1。
3.权利要求1所述反向遗传操作系统的应用,其特征在于,是将反向遗传操作系统用于构建BHV-1突变体或对BHV-1基因组进行修饰。
4.权利要求1所述反向遗传操作系统的应用,其特征在于,是将反向遗传操作系统用于制备牛传染性鼻气管炎重组疫苗。
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