SK120098A3

SK120098A3 - Parapoxviruses containing foreign dna, their production and their use in vaccines

Info

Publication number: SK120098A3
Application number: SK1200-98A
Authority: SK
Inventors: Norbert Schmeer; Walter Strube; Mathias Buttner; Hans-Joachim Rziha
Original assignee: Bayer Ag
Priority date: 1996-02-28
Filing date: 1997-02-17
Publication date: 1999-03-12
Also published as: AU718141B2; ATE364090T1; BR9707785A; IL125797A0; HUP9901035A3; NO983946D0; TR199801702T2; HUP9901035A2; NZ331556A; ES2287949T3; DK0886679T3; CN1217027A; US6365393B1; AU1725797A; EP0886679A1; DE59712852D1; EP0886679B1; JP2000507092A; NO983946L; CA2247336C

Description

Oblasť techniky

Predkladaný vynález sa týka rekombinantných parapoxvírusov, ich prípravy ako i vakcín a imunomodulátorov, ktoré ich obsahujú.

Nové, rekombinantne zmenené parapoxvírusy nesú vo svojom genóme delécie a/alebo inzercie. Delécia úsekov genómu parapoxvírusov a/alebo inzercia cudzorodej DNA môže viesť k redukcii alebo strate ich patogenity (atenuácia). Dedičná informácia sa z patogénov alebo biologicky aktívnych častíc inkorporuje do genómu parapoxvírusov pomocou inzercií. Táto cudzorodá dedičná informácia je, ako súčasť rekombinantných parapoxvírusov, exprimovaná napríklad v bunkových kultúrach, tkanivách alebo v intaktných organizmoch.

Rekombinantné parapoxvírusy, ktoré sa pripravili podľa tohto vynálezu, sa použijú napríklad vo vakcínach alebo imunomodulátoroch. Expresia cudzorodej DNA v genóme parapoxvírusov vyvoláva, napríklad u očkovaných jedincov, obrannú reakciu proti patogénom, ktoré sú reprezentované cudzorodou dedičnou informáciou. U očkovaných jedincov sa môže stimulovať taktiež nešpecifická odolnosť. (V nasledovnom texte sa termín parapoxvírusy skracuje na PPV).

Samotné PPV môžu mať imunomodulačný efekt, keďže v organizme stimulujú nešpecifické imunitné reakcie. Takže prípravky obsahujúce parapoxvírusy sa napríklad úspešne používajú vo veterinárnej medicíne na zvýšenie všeobecnej odolnosti.

Kým vakcíny, ktoré majú patogén-špecifický účinok si na vytvorenie ochrany vyžadujú niekoľko dní až týždňov, v závislosti od antigénu, a potom poskytujú dlhodobú ochranu, ktorá trvá mesiace až roky.

Preto sa vakcíny, ktoré sa pripravili na základe rekombinantných parapoxvírusov, môžu následne použiť ako biologické produkty na zlepšenú kontrolu

31049/H infekčných chorôb, keďže vytvárajú dlhodobú patogén-špecifickú imunitu organizmu a taktiež indukujú nešpecifickú ochranu, ktorá sa prejavuje veľmi rýchlo.

Kombinácia imunostimulačných vlastností PPV a expresia cudzorodých antigénov, ktoré indukujú homológnu a/alebo heterológnu patogén-špecifickú ochranu je nová. Toto umožňuje prípravu produktov, ktoré sprostredkujú jednak rýchly začiatok, širokú nešpecifickú ochranu pred infekciami a taktiež poskytujú dlhotrvajúcu patogén-špecifickú ochranu pred infekciou.

Doterajší stav techniky

Čeľaď poxvírusov napádajúcich stavovce (ChordopoxviriJae) sa delí na jednotlivé nezávislé rody. Predkladaný vynález sa týka rodu PPV, ktorý sa od ostatných poxvírusov líši štrukturálne ako i geneticky. PPV sa delia na štyri odlišné druhy (citácia č. 1):

Parapoxvirus ovis (nazývaný taktiež vírus kontagióznej ektymy, vírus kontagióznej pustulárnej dermatitídy alebo orf vírus), ktorý sa považuje za prototyp tohoto rodu,

Parapoxvirus bovis 1 (nazývaný taktiež vírus bovinnej papulóznej stomatitídy alebo stomatitis papulosa vírus) a

Parapoxvirus bovis 2 (nazývaný taktiež udderpoxvírus, vírus paravakcínie, vírus pseudovarioly alebo vírus uzlíkov dojičov kráv).

Opísali sa taktiež zástupcovia parapoxvírusov, ktorí sa izolovali z tiav, jeleňov, kamzíkov, tuleňov a mrožov. Zatiaľ sa neujasnilo úplne, či tieto vírusy predstavujú autonómne druhy v rámci rodu parapoxvírusov, alebo či ide o izoláty vyššie opísaných druhov.

Infekcie spôsobené PPV môžu vyvolať miestne ochorenia zvierat, ako i človeka (zoonózne patogény). Citácia č. 1 poskytuje prehľad syndrómov, ktoré sa doposiaľ opísali. Na zvládnutie ochorenia sa môžu použiť profylaktické opatrenia, akými sú očkovania. Avšak doposiaľ dosiahnuteľná aktivita vakcín, ktoré sa vyvinuli výlučne na báze Parapoxvirus ovis, je nedostatočná (citácia č. 2).

31049/H

Vynález sa týka použitia PPV ako vektora cudzorodej genetickej informácie, ktorá sa exprimuje.

Vektory založené na avipoxvírusoch, ortopoxvírusoch, kapripoxvírusoch, suipoxvírusoch alebo vírusoch vakcínie sa už opísali ako vektory expresie cudzorodej genetickej informácie. Informácie, ktoré sa v tejto spojitosti získali nemôžu byť však aplikované pre PPV. Ako sa dokázalo v porovnávacích štúdiách, medzi jednotlivými rodmi poxvírusov existujú morfologické, štrukturálne a genetické rozdiely. Takže je napríklad možné použiť serologické metódy na odlíšenie PPV od ostatných rodov poxvírusov, čo je prisudzované odlišným proteínovým zloženiam a odlišnej dedičnej informácii, ktorá je s tým spojená. Napríklad niektorí zástupcovia poxvírusov majú schopnosť aglutinácie erytrocytov. Táto aktivita je sprostredkovaná prostredníctvom povrchového proteínu, tzv. hemaglutinínu (HA). PPV nemajú túto aktivitu.

Znalosť organizácie PPV genómu je momentálne obmedzená na zistenia veľkosti genómu, obsahu GC v nukleovej kyseline, porovnávacie analýzy pôsobenia reštrikčných enzýmov, klonovanie individuálnych fragmentov genómu, sekvenčné analýzy čiastkových oblastí a stým spojený predbežný opis jednotlivých génov (prehľad viď citácia č. 1, citácia č. 5, citácia č. 6).

Momentálne nie je možné použiť inzerčné miesta, ktoré sú známe v prípade vírusu vakcínie z toho dôvodu, že tieto miesta buď chýbajú, alebo sa u PPV nedokázali.

Takže snahy identifikovať gén pre tymidínkinázu v PPV genóme a použiť ho ako inzerčné miesto, ako v prípade ortopoxvírusov, neboli úspešné. Kým Mazur so spolupracovníkmi (citácia č. 3) opísali identifikáciu úseku PPV genómu, ktorý, ako tvrdia, pripomína gén pre tymidínkinázu vírusu vakcínie (ortopoxvírus), naše vlastné rozsiahle pozorovania neboli schopné potvrdiť existenciu tymidínkinázového génu u PPV. Ani iní autori (citácia č. 1) neboli schopní nájsť gén pre tymidínkinázu u PPV. U vírusov vakcínie sa ako inzerčné miesto pre cudzorodú DNA používa gén pre HA. Ako sa vyššie opísalo, PPV túto aktivitu nemajú.

V roku 1992 sa Robinson a Lyttle zmienili o alternatívnych inzerčných miestach v PPV genóme (citácia č. 1), avšak neposkytli opis, alebo presnú

31049/H charakterizáciu týchto miest. Doposiaľ sa nepopísalo žiadne úspešné použitie PPV ako vektorov.

Našimi vlastnými analytickými skúmaniami sekvencie Hindlll fragmentu I PPV kmeňa D1701 sme našli ORF, ktorý obsahuje aminokyselinovú homológiu (36,1 po 38,3% totožnosť; 52,8 po 58,6% podobnosť, GCG, Wisconsin Package 8.1, napríklad Pikup Program) s vaskulárnym endoteliálnym rastovým faktorom (VEGF) z rôznych cicavčích druhov (napríklad myš, potkan, morča, krava a človek). Sekvencia ID č. 1 ukazuje nukleotidovú sekvenciu génu v D1701, kým sekvencia ID č. 15 ukazuje aminokyselinovú sekvenciu zodpovedajúceho D1701 proteínu. V súčasnosti sa homológny gén popísal taktiež v PPV kmeňoch NZ2 a NZ7 (citácia č. 6); avšak funkcia tohto génu je neznáma. Nie je známe, či ostatné poxvírusy, napríklad ortopoxvírusy, majú zodpovedajúci gén. V zvyšnom texte sa tento gén označuje ako VEGF gén.

Naša sekvenčná analýza Hindlll fragmentu I D1701 viedla k identifikácii ďalšieho ORF, ktorý obsahuje homológiu s proteínkinázovými génmi ortopoxvírusov a u vakcínie je známy ako D10L. Totožnosť s D10L génom vakcínie je 51%, kým podobnosť je 70%. Vo zvyšku prihlášky sa tento gén označuje ako PK gén. Sekvencie ID č. 2, č. 9 a č. 13 ukazujú verzie nukleotidovej sekvencie tohoto génu u D1701, kým sekvencia ID č. 14 ukazuje aminokyselinovú sekvenciu zodpovedajúceho D1701 proteínu.

Našiel sa ďalší ORF, ktorý prekrýva 3’ koniec PK génu a 5’ koniec VEGF génu. Skúmania homológie ukázali nízku totožnosť (28%) a nízku podobnosť (51%) s F9L génom vakcínie. Sekvencie ID č. 5 a č. 10 ukazujú verzie nukleotidovej sekvencie tohoto génu u D1701. V zvyšnom texte sa tento gén označuje ako F9L gén.

Ďalší ORF, ktorý sa pomenoval ORF3 z dôvodu jeho podobnosti s PPV NZ2 (totožnosť 76%, podobnosť 83%), sa našiel vnútri ITR regiónu. Sekvencia ID č. 4 ukazuje nukleotidovú sekvenciu tohoto génu u D1701. V zvyšnom texte sa tento gén označuje ako ORF3 gén.

31049/H

Podstata vynálezu

Predkladaný vynález sa týka

1. Rekombinantne pripravených PPV obsahujúcich inzercie a/alebo delécie.

2. Rekombinantne pripravených PPV obsahujúcich inzercie a/alebo delécie v genómových úsekoch, ktoré nie sú potrebné na rozmnožovanie vírusu.

3. Rekombinantne pripravených PPV obsahujúcich inzercie a/alebo delécie v genómových úsekoch, ktoré sú potrebné na rozmnožovanie vírusu.

4. Rekombinantne pripravené PPV, ktoré obsahujú inzercie a/alebo delécie v úsekoch HindlII fragmentu I D1701, ktoré sa neexprimujú.

5. Rekombinantne pripravené PPV, ktoré obsahujú inzercie a/alebo delécie v úsekoch HindlII fragmentu I D1701, ktoré sa exprimujú.

6. Rekombinantne pripravené PPV podľa 1 až 5, v ktorých sú inzercie a/alebo delécie lokalizované v HindlII fragmente I D1701, alebo v DNA z iných PPV, ktorá zodpovedá tomuto fragmentu.

7. Rekombinantne pripravené PPV, ktoré obsahujú inzercie a/alebo delécie v oblasti VEGF génu alebo v susedstve tejto oblasti.

8. Rekombinantne pripravené PPV, ktoré obsahujú inzercie a/alebo delécie v oblasti PK génu alebo v susedstve tejto oblasti.

9. Rekombinantne pripravené PPV, ktoré obsahujú inzercie a/alebo delécie v oblasti ITR úseku alebo v susedstve tejto oblasti.

10. Rekombinantne pripravené PPV, ktoré obsahujú inzercie a/alebo delécie v oblasti HD1R génu alebo v susedstve tejto oblasti.

11. Rekombinantne pripravené PPV, ktoré obsahujú inzercie a/alebo delécie v oblasti F9L génu alebo v susedstve tejto oblasti.

12. Rekombinantne pripravené PPV, ktoré obsahujú inzercie a/alebo delécie v oblasti, alebo v susedstve génu, ktorý kóduje 10kD proteín.

31049/H

13. Rekombinantne pripravené PPV, ktoré obsahujú inzercie a/alebo delécie v oblasti EcoRI fragmentu E D1701, v ktorom sa nachádza gén kódujúci 10kD proteín.

14. Plazmid, ktorý obsahuje HindlII fragment I D1701, alebo DNA z iných PPV, ktorá zodpovedá tomuto fragmentu.

15. Plazmid, ktorý obsahuje HindlII fragment I D1701, a ktorý v tomto fragmente obsahuje delécie a/alebo inzercie v oblastiach, ktoré sú potrebné pre replikáciu vírusu.

16. Plazmid, ktorý obsahuje HindlII fragment I D1701, a ktorý v tomto fragmente obsahuje delécie a/alebo inzercie v oblastiach, ktoré nie sú potrebné pre replikáciu vírusu.

17. Plazmid, ktorý obsahuje HindlII fragment I D1701, a ktorý v tomto fragmente obsahuje delécie a/alebo inzercie v oblastiach, ktoré nie sú potrebné pre replikáciu vírusu, a ktoré nie sú exprimované.

18. Plazmid, ktorý obsahuje HindlII fragment I D1701, a ktorý v tomto fragmente obsahuje delécie a/alebo inzercie v oblastiach, ktoré nie sú potrebné na rozmnožovanie vírusu, a ktoré ležia v oblastiach, ktoré sú exprimované.

19. Plazmid, ktorý obsahuje HindlII fragment I D1701, a ktorý v tomto fragmente obsahuje delécie a/alebo inzercie vo VEGF géne tohoto fragmentu, alebo v jeho susedstve.

20. Plazmid, ktorý obsahuje HindlII fragment I D1701, a ktorý v tomto fragmente obsahuje delécie a/alebo inzercie v PK géne tohoto fragmentu, alebo v jeho susedstve.

21. Plazmid, ktorý obsahuje HindlII fragment I D1701, a ktorý v tomto fragmente obsahuje delécie a/alebo inzercie v ITR úseku tohoto fragmentu, alebo v jeho susedstve.

22. Plazmid, ktorý obsahuje HindlII fragment I D1701, a ktorý v tomto fragmente obsahuje delécie a/alebo inzercie v HD1R géne a/alebo F9L géne, alebo v ich susedstve.

31049/H

23. Plazmid, ktorý obsahuje EcoRI fragment E D1701, a ktorý v tomto fragmente obsahuje delécie a/alebo inzercie v géne, ktorý kóduje 10 kDa proteín, alebo v jeho susedstve.

24. Plazmid, ktorý obsahuje HindlII fragment I D1701, v ktorom sú prítomné delécie a/alebo inzercie podľa 14 až 23.

25. Plazmid podľa 14 až 24, v ktorom je DNA D1701 nahradená DNA z iných PPV, ktorá zodpovedá tomuto fragmentu.

26. Plazmid podľa 14 až 25, ktorý obsahuje buď celý HindlII fragment I, alebo iba jeho časť.

27. D1701 HindlII fragment I, alebo jeho časti, alebo fragmenty z iných PPV, ktoré zodpovedajú tomuto fragmentu, a ktoré majú sekvenciu podľa sekvencie v zozname ako ID č. 8 alebo č. 12.

28. Úsek DNA, alebo časti D1701 HindlII fragmentu I, alebo úsek z iných PPV, ktorý zodpovedá tomuto fragmentu, alebo jeho častiam, a ktorý kóduje VEGF proteín v súlade so sekvenciou v zozname ako ID č. 1.

29. Úsek DNA, alebo časti D1701 HindlII fragmentu I, alebo úsek z iných PPV, ktorý zodpovedá tomuto fragmentu, alebo jeho častiam, a ktorý kóduje PK proteín podľa sekvencie v zozname ako ID č. 8 alebo č. 2, č. 9 alebo č. 13.

30. Úsek DNA HD1R génu, alebo jeho časti, so sekvenciou podľa sekvencie v zozname ako ID č. 3 pre PPV.

31. Úsek DNA F9L génu, alebo jeho časti, so sekvenciou podľa sekvencie v zozname ako ID č. 5 alebo ID č. 10 pre PPV.

32. Úsek DNA ITR oblasti, alebo jeho časti, so sekvenciou podľa sekvencie v zozname ako ID č. 4 pre PPV.

33. Génové produkty, ktoré sa pripravili na základe sekvencií úsekov DNA podľa 27 až 32.

34. Rekombinantne pripravené PPV podľa 1 až 13, ktoré ako inzercie obsahujú cudzorodú DNA, ktorá kóduje imunogénne zložky iných patogénov.

35. Rekombinantne pripravené PPV podľa 1 až 13 a 34, ktoré ako inzercie obsahujú cudzorodú DNA, ktorá kóduje cytokíny.

31049/H

36. Spôsob prípravy vírusov podľa 1 až 13, 34 a 35, vyznačujúci sa tým, že plazmidy podľa 1 až 26 sa rekombinujú s PPV v bunkách známym spôsobom a požadované vírusy sa vyselektujú.

37. Spôsob prípravy vírusov podľa 1 až 13, 34 a 35, vyznačujúci sa tým, že

1. vybraný je vhodný PPV kmeň,

2. jeho genóm sa purifikuje,

3. na purifikovaný genóm sa pôsobí reštrikčnými enzýmami,

4. výsledné fragmenty sa včlenia do plazmidov a

5. vykoná sa selekcia plazmidov, ktoré obsahujú gén, ktorý kóduje 10 kDa proteín a

6. tam, kde je to vhodné, sa do génu kódujúceho 10 kDa proteín zavedú inzercie a/alebo delécie,

7. tam, kde je to vhodné, sa fragmenty opísané v bode 4 (vyššie) môžu pripraviť taktiež alternatívnymi spôsobmi, ako sú polymerázová reťazová reakcia (PCR) alebo syntéza oligonukleotidov.

38. Proces prípravy plazmidov podľa bodov 1 až 13, 34 a 35, vyznačujúci sa tým, že

1. vybraný je vhodný PPV kmeň,

2. jeho genóm sa purifikuje,

3. na purifikovaný genóm sa pôsobí reštrikčnými enzýmami,

4. výsledné fragmenty sa včlenia do plazmidov a

5. vykoná sa selekcia plazmidov, ktoré obsahujú D1701 HindlII fragment I, alebo fragmenty, alebo zložky, ktoré zodpovedajú tomuto fragmentu,

6. a tam, kde je to vhodné, sa do týchto fragmentov vo výsledných plazmidoch zavedú inzercie a/alebo delécie,

31049/H

39. Proces prípravy D1701 Hindlll fragmentu I, alebo EcoRI fragmentu E, ktorý kóduje 10 kDa proteín, alebo oblasť z iných PPV, ktorá zodpovedá tomuto fragmentu alebo úseku, alebo ich častiam, vyznačujúci sa tým, že

1. vybraný je vhodný PPV kmeň,

2. jeho genóm sa purifikuje,

3. na purifikovaný genóm sa pôsobí reštrikčnými enzýmami,

4. a vyselektujú sa požadované fragmenty alebo úseky, alebo

5. tam, kde je to vhodné, sa výsledné fragmenty genómu na začiatku včlenia do plazmidov a plazmidy obsahujúce požadované fragmenty sa potom izolujú, následne sa tieto plazmidy pomnožia a požadované fragmenty sa z nich izolujú.

6. tam, kde je to vhodné, sa fragmenty opísané v bode 4 (vyššie) môžu pripraviť taktiež alternatívnymi spôsobmi, ako je PCR alebo syntéza oligonukleotidov.

40. Proces prípravy génových produktov podľa 33, vyznačujúci sa tým, že sa fragmenty, ktoré sa môžu získať podľa 39, prenesú do vhodných expresných systémov a gény sa exprimujú s použitím týchto systémov.

41. Použitie rekombinantne pripravených PPV podľa 1 až 13 vo vakcínach.

42. Použitie rekombinantne pripravených PPV podľa 1 až 13 v produktoch, ktoré imunizujú, ako aj stimulujú nešpecifickú imunitnú obranu.

43. Použitie rekombinantne pripravených PPV v imunomodulátoroch, ktoré stimulujú nešpecifickú imunitnú obranu.

44. Použitie rekombinantne pripravených PPV pre heterológnu expresiu cudzorodej DNA.

45. Použitie rekombinantne pripravených PPV ako vektorov pre cudzorodú DNA.

46. Použitie plazmidov podľa 14 až 16 na expresiu parapox-špecifických genómových úsekov.

47. Použitie plazmidov podľa 14 až 26 na prípravu diagnostických činidiel.

48. Použitie fragmentov genómu podľa 27 až 32 na prípravu diagnostických činidiel.

31049/H

49. Úseky DNA podľa sekvencie v zozname ako ID č. 6 (promótor VEGF génu).

50. Použitie úsekov DNA podľa 49 ako promótora expresie DNA.

Vyššie opísané genómové fragmenty PPV, ktoré sa môžu vnášať do plazmidov alebo vírusov, a ktoré môžu byť prítomné ako voľné úseky DNA, zahrňujú dané sekvencie DNA a ich varianty a homológy.

Vyššie uvedené termíny majú nasledujúci význam:

- Atenuácia je proces, v ktorom sa PPV, ako výsledok zmeny ich genómu, stávajú menej patogénnymi alebo nepatogénnymi, alebo menej virulentnými alebo nevirulentnými pre zvieratá alebo človeka.

- Delécie sú časti DNA, ktoré chýbajú v genóme PPV.

- Delečné plazmidy sú plazmidy, ktoré, okrem plazmidovej DNA, nesú úseky genómu PPV, časti ktorého sa odstránili.

- Genómové úseky, ktoré sú nevyhnutné (esenciálne) na rozmnožovanie vírusu sú časti celého genómu PPV, ktoré sú nepostrádateľné pre in vitro rozmnožovanie PPV, t. j. sú nepostrádateľné pre tvoriace sa infekčné vírusové potomstvo.

Zásah do génov, ktoré sú esenciálne na rozmnožovanie vírusu vedie k prerušeniu rozmnožovania vírusu. Ak sa napríklad odstránia časti jedného z týchto génov, alebo celý gén, replikácia vírusu sa ukončí v definovanom bode rozmnožovacieho cyklu vírusu. Infekcia alebo liečba mutantmi s týmito vlastnosťami nevedú k nijakému uvoľneniu infekčného potomstva zo zvieraťa. Ak sa časti esenciálneho génu, alebo celý esenciálny gén vymení za cudzorodú DNA, alebo ak sa cudzorodá DNA včlení do esenciálnych génov, je možné skonštruovať vektor vakcín, ktoré nie sú schopné množiť sa v očkovanom jedincovi, a ktoré nie sú následne vylúčené ako infekčné patogény.

31049/H

II

- Genómové úseky, ktoré nie sú potrebné (neesenciálne) na rozmnožovanie vírusu sú časti celého PPV genómu, ktoré môžu byť postrádané pre in vitro rozmnožovanie PPV, t. j. pre tvorbu infekčného vírusového potomstva.

- Cudzorodé DNA elementy (cudzorodá DNA) sú časti DNA, napríklad cudzorodé gény alebo sekvencie nukleotidov, ktoré nie sú pôvodne prítomné v PPV, ktoré sa používajú v súlade s týmto vynálezom.

Cudzorodá DNA sa vkladá do PPV z nasledovných dôvodov:

1. kvôli expresii cudzorodej DNA

2. kvôli inaktivácii funkcií častí DNA PPV

3. kvôli značeniu PPV.

V závislosti na týchto dôvodoch, sa vkladá odlišná cudzorodá DNA. Ak sa má cudzorodá DNA exprimovať podľa bodu (1), vložená cudzorodá DNA bude niesť aspoň otvorený čítací rámec, ktorý kóduje jeden alebo viacero požadovaných cudzorodých proteínov. Tam, kde je to vhodné, obsahuje cudzorodá DNA ešte navyše svoje vlastné, alebo cudzie regulačné sekvencie. Schopnosť prijatia cudzorodej DNA sa môže zvýšiť vytvorením delécií v genóme vírusu. Vo všeobecnosti je jej dĺžka medzi 1 nukleotidom až 35000 nukleotidov, prednostne medzi 100 a približne 15000 nukleotidov.

Príklady, ktoré sa môžu spomenúť sú gény, alebo časti génov, z vírusov ako sú

Herpesvirus suid 1, herpesvírusy koní herpesvírusy hovädzieho dobytka vírus slintačky a krívačky respiračný syncyciálny vírus hovädzieho dobytka, vírus parachrípky hovädzieho dobytka 3, vírus chrípky

31049/H kalicivírus flavivírusy, napríklad vírus hnačky hovädzieho dobytka alebo klasický vírus horúčok ošípaných alebo z baktérií, ako sú druhy rodu Pasteurella, druhy rodu Salmonella, druhy rodu Actinobacillus, druhy rodu Chlamydia, alebo z parazitov, ako sú

Toxoplazma,

Dirofilaria,

Echinococcus.

Ak sa má cudzorodá DNA vnášať v súlade s bodom (2), inzercia vhodných cudzorodých nukleotidov je v zásade dostatočná pre prerušenie sekvencie DNA vektorového vírusu. Maximálna dĺžka cudzorodej DNA, ktorá sa vkladá z dôvodu inaktivácie, závisí od schopnosti vektorového vírusu prijať cudzorodú DNA. Vo všeobecnosti je dĺžka cudzorodej DNA medzi 1 nukíeotidom až 35000 nukleotidov, prednostne medzi 100 a približne 15000 nukleotidov, obzvlášť prednostne medzi 3 a 100 nukleotidmi.

Ak sa sekvencie DNA majú vnášať kvôli značeniu v súlade s bodom (3), ich dĺžka závisí od detekčnej metódy použitej pre identifikáciu značeného vírusu. Vo všeobecnosti je dĺžka cudzorodej DNA medzi 1 nukleotidom až 25000 nukleotidov, prednostne medzi 20 a približne 15000 nukleotidov, obzvlášť prednostne medzi 5 a 100 nukleotidmi.

31049/H

- Génová knižnica je úplná suma fragmentov genómu, ktoré sa nachádzajú vo vektoroch, ktoré sú schopné replikácie. Knižnica sa získava fragmentáciou genómu a vložením všetkých fragmentov, niekoľkých fragmentov alebo hlavnej časti fragmentov do vektorov, ktoré sú schopné replikácie, napríklad do plazmidov.

- Genómový fragment je časť genómu, ktorá môže byť prítomná v izolovanej forme, alebo môže byť vložená do vektora, ktorý je schopný replikácie.

- Inaktivácia inzerciou znamená že vložená cudzorodá DNA zabráni expresii alebo fungovaniu pôvodných sekvencií genómu PPV.

- Inzercie sú časti DNA, ktoré sa dodatočne včlenili do PPV genómu. Dĺžka týchto časti DNA môže byť medzi 1 nukleotidom a niekoľkými tisíckami nukleotidov, v závislosti od dôvodu inzercie (viď taktiež definíciu „cudzorodej DNA,,).

- Inzerčné plazmidy sú plazmidy, obzvlášť bakteriálne plazmidy, ktoré obsahujú cudzorodú DNA, ktorá sa má vložiť, obklopenú sekvenciami DNA PPV.

- Inzerčné miesta sú miesta vo vírusovom genóme, ktoré sú vhodné na prijatie cudzorodej DNA

- Klonovanie znamená že genomová DNA PPV sa izoluje a fragmentuje. Fragmenty, alebo vybrané fragmenty sa potom včlenia do obvyklých DNA vektorov (bakteriálne plazmidy alebo fágové vektory alebo eukaryotické vektory).

Citácia č. 11 poskytuje výber spôsobov prípravy a klonovania DNA fragmentov. DNA vektory obsahujúce fragmenty DNA PPV v podobe inzercií, sa používajú napríklad na prípravu identických kópií pôvodne izolovaných fragmentov DNA PPV.

- Značenie inzerciou znamená

31049/H že vložená cudzorodá DNA umožňuje následnú identifikáciu modifikovaných PPV.

- ORF (otvorený čítací rámec) sa chápe ako sekvencia nukleotidov na úrovni DNA, ktorá určuje aminokyselinovú sekvenciu potenciálneho proteínu. Pozostáva z čísla, ktoré je určené veľkosťou proteínu, ktorý ORF definuje, z nukleotidových tripletov, ktoré sú ohraničené na 5’ konci štartovacím kodónom (ATG) a na 3’ konci stop kodónom (TAG, TGA alebo TAA).

- Regulačné sekvencie sú sekvencie DNA, ktoré vykazujú vplyv na expresiu génov. Sekvencie s týmito vlastnosťami sú známe z citácie č. 15.

Prednosť sa môže dať spomínanému VEGF promótoru tak, ako sa opísalo v zozname sekvencií ID č. 6.

- Rekombinantné PPV sú

PPV obsahujúce inzercie a/alebo delécie vo svojom genóme. V tejto súvislosti sa inzercie a delécie pripravujú s použitím metód molekulárnej biológie.

- repetitívne (DNA) sekvencie sú identické nukleotidové sekvencie, ktoré sa vyskytujú v PPV genóme buď priamo jedna za druhou, alebo roztrúsené na rôznych miestach.

- vektorový vírus je

PPV, ktorý je vhodný na vloženie cudzorodej DNA, a ktorý môže preniesť vloženú cudzorodú DNA vo svojom genóme do infikovaných buniek alebo do organizmov, a ktorý, tam kde je to vhodné, umožňuje expresiu cudzorodej DNA.

Nové PPV podľa 1 až 12 (vyššie) sa pripravili nasledovne:

1. Výber vhodného PPV kmeňa

2. Identifikácia genómových úsekov PPV genómu, ktoré obsahujú inzerčné miesta

2.a Identifikácia úsekov PPV genómu obsahujúcich inzerčné miesta v génoch, ktoré sú neesenciálne na rozmnožovanie vírusu,

31049/H

2.b Identifikácia úsekov PPV genómu obsahujúcich inzerčné miesta v génoch, ktoré sú esenciálne na rozmnožovanie vírusu,

2.c Identifikácia genómových úsekov obsahujúcich inzerčné miesta v oblastiach outwith génov PPV genómu a/alebo v génových duplikáciách

2.d Iné spôsoby identifikácie genómových úsekov obsahujúcich inzerčné miesta

2. e Nároky kladené na inzerčné miesto

2.1 Identifikácia inzerčných miest

2.1.1 Purifikácia PPV genómu

2.1.2 Klonovanie genómových fragmentov a založenie génovej knižnice

2.1.3 Sekvenovanie za účelom identifikácie génov alebo génových úsekov outwith génov

2.1.4 Selekcia klonov obsahujúcich fragmenty PPV genómu pre ďalšie spracovanie

2.2 ITR oblasť, VEGF gén, PK gén, gén kódujúci 10 kDa proteín a oblasť medzi PK génom a HD1R génom ako inzerčné miesta

2.2.1 Klonovanie VEGF génu

2.2.2 Klonovanie proteínkinázového génu

2.2.3 Klonovanie génovej oblasti, ktorá kóduje 10 kDa proteín

2.2.4 Klonovanie ITR oblasti (obrátená terminálna opakujúca sa oblasť), alebo genómového úseku, ktorý leží medzi PK génom a HD1R génom

3. Konštrukcia inzerčných plazmidov alebo delečných plazmidov, ktoré obsahujú cudzorodú DNA, ktorá sa bude vkladať,

3.1 Identifikácia alebo príprava rozpoznávacích miest pre reštrikčné enzýmy, ktoré sa vyskytujú iba raz, t. z. unikátnych reštrikčných miest, v klonovaných genómových fragmentoch a vkladanie cudzorodej DNA

3.2 Deletovanie genómových sekvencií v klonovaných genómových fragmentoch a vkladanie cudzorodej DNA

31049/H

3.3 Kombinácia č. 3.1 a č. 3.2

4. Konštrukcia rekombinantných PPV podľa 1 až 12 (vyššie).

1. Výber vhodného PPV kmeňa

Na uskutočnenie predkladaného vynálezu sú v podstate vhodné všetky druhy PPV. Uprednostnené sú tie vírusové kmene, ktoré sa môžu množiť až po titre >10⁵PFU (jednotka tvoriaca plak)/ml tkanivovej kultúry, a ktoré sa môžu pripraviť v čistej forme ako extracelulárne, infekčné vírusy z média infikovaných buniek. PPV ovis (orf vírusy) je druh, o ktorom sa je možné zmieniť ako o uprednostňovanom druhu PPV rodu.

Kmeň PPV ovis, o ktorom sa je možné zmieniť ako o obzvlášť uprednostňovanom je D1701, ktorý bol uložený 28.4.1988 spolu s jeho variantmi a mutantmi, podľa Budapeštianskej dohody, v Pasteurovom Ústave, C.N.C.M. pod registračným číslom CNCM 1-751.

Vírusy sa rozmnožujú obvyklým spôsobom v tkanivových kultúrach živočíšnych buniek, ako sú cicavčie bunky, napríklad ovčie bunky, alebo bovinné bunky, prednostne v bovinných bunkách, ako je stabilizovaná bunková línia BK-K13A bovinných obličkových buniek (alebo z nej pochádzajúce línie), alebo opičie bunky, ako je stabilizovaná kultúra obličkových buniek MA104 alebo VERO (alebo z nich pochádzajúce línie).

Rozmnožovanie známym spôsobom je vykonané v stacionárnych kultúrach, v kultúrach v otáčavých bubnoch alebo v kultúrach na nosičoch vo forme kompaktných bunkových zhlukov alebo suspenzných kultúr.

Bunky alebo bunkové vrstvy použité na rozmnožovanie vírusov sa znásobujú obvyklým spôsobom prakticky až do ich zahustenia, alebo po optimálnu bunkovú hustotu. Bunky sa infikujú vírusom v riedeniach, ktoré zodpovedajú MOI (= násobok infekcie, zodpovedá počtu infekčných vírusových častíc na jednu bunku).

Vírusy sa rozmnožujú bez pridania, alebo s pridaním živočíšneho séra. Ak sa použije sérum, pridáva sa do rozmnožovacieho média v koncentrácii 1-30 objemových %, prednostne 1-10 objemových %.

31049/H

Infekcia a vírusové rozmnožovanie sa vykonáva pri teplotách medzi laboratórnou teplotou a 40°C, prednostne medzi 32 a 39°C, obzvlášť prednostne pri 37°C, počas niekoľkých dní, prednostne do vtedy, kým sa infikované bunky úplne nezničia. Pri zbieraní vírusov, sa môžu vírusy, ktoré sú stále vnútri buniek, uvoľniť mechanicky, alebo pomocou ultrazvuku, alebo pomocou miernej enzymatickej proteolýzy, napríklad s použitím trypsínu.

Médium obsahujúce vírus z infikovaných buniek sa môže potom ďalej spracovať, napríklad odstránením zvyškov buniek pomocou filtrácie s použitím veľkosti pórov napríklad 0,2-0,45 pm a/alebo centrifugáciou pri nízkych otáčkach.

Filtráty alebo centrifugačné supernatanty sa môžu použiť na zakoncentrovanie vírusov a ich purifikáciu. Z tohto dôvodu sa filtráty alebo supernatanty podrobia centrifugácii pri vysokých otáčkach, až kým nedôjde k sedimentácii vírusových častíc. Tam, kde je to vhodné, môžu nasledovať ďalšie purifikačné kroky, napríklad centrifugácia v hustotnom gradiente.

Rôzne oblasti PPV genómu sa môžu použiť ako inzerčné miesta pri vnášaní cudzorodej DNA. Cudzorodá DNA sa môže vnášať

a) do génov, ktoré sú neesenciálne pre vírusové rozmnožovanie in vitro a/alebo in vivo,

b) do génov, ktoré sú esenciálne pre vírusové rozmnožovanie a/alebo

c) do oblastí, ktoré nemajú žiadnu génovú funkciu.

2.a Identifikácia genómových úsekov PPV genómu obsahujúcich inzerčné miesta v génoch, ktoré sú neesenciálne pre rozmnožovanie vírusu

i. Vírusové gény, ktoré nie sú esenciálne pre vírusové rozmnožovanie sa nájdu napríklad pomocou vykonania porovnávacích sledovaní s použitím zástupcov rôznych druhov PPV. Gény, ktoré sa nevyskytujú v jednom, alebo viacerých druhoch

31049/H

PPV, ale ktoré sa nachádzajú v iných izolátoch alebo kmeňoch sú potenciálne neesenciálne.

ii. Gény, ktoré nie sú esenciálne pre vírusové rozmnožovanie sa môžu identifikovať taktiež alternatívnym spôsobom. Po sekvenovaní genómových fragmentov PPV, ktoré môžu byť napríklad prítomné ako klonované fragmenty, sa v týchto sekvenciách DNA skúma možná prítomnosť „otvorených čítacích rámcov,, (ORF). Ak sa nájde ORF, funkcia tohoto ORF ako génu sa verifikuje dôkazom transkripcie a/alebo translácie. Aby sa stanovilo, či gén, ktorý sa našiel je neesenciálny pre vírusové rozmnožovanie, na odstránenie tohoto génu z PPV genómu, alebo na jeho čiastočné porušenie, alebo na jeho prerušenie pomocou vloženia mutácie (mutácií) sa použijú molekulárno-biologické metódy a potom sa sleduje schopnosť výsledného vírusu rozmnožovať sa. Ak je vírus schopný replikovať sa dokonca i bez existencie pozmeneného génu, tento gén je neesenciálny.

Príklady identifikovaných inzerčných miest

i. Na tomto mieste sa možno zmieniť o VEGF géne PPV ovis ako o príklade neesenciálneho PPV génu, ktorý sa môže použiť ako inzerčné miesto pre cudzorodú DNA. Tento gén sa nachádza v skúmaných kmeňoch Parapoxvirus ovis (NZ-2, NZ-7 a D1701) (citácia č. 6). Tento VEGF gén sa nedokázal u niektorých PPV kmeňov, napríklad u zástupcov PPV bovis 1. Tento úsek PPV genómu, ktorý obsahuje VEGF gén sa môže identifikovať pomocou sekvencie DNA zobrazenej ako sekvencia v zozname ID č. 1. Pri hľadaní tohoto génu v genóme PPV pomocou hybridizačných experimentov, sekvenčných analýz genómu a/alebo polymerázových reťazových reakcií sa môžu použiť známe molekulárno-biologické metódy.

ii. Ako ďalší príklad potenciálne neesenciálneho PPV génu sa môže spomenúť gén pre 10 kDa PPV proteín. Tento gén sa nachádza v kmeňoch Parapoxvirus ovis (NZ-2, NZ-7 a D1701). Pri identifikácii oblasti v genóme PPV, ktorá obsahuje gén pre 10 kDa PPV proteín napríklad pomocou polymerázových reťazových reakcií (PCR) sa môžu použiť obvyklé molekulárno-biologické metódy. Citácia č. 8 uvádza sekvenciu DNA génu pre 10 kDa proteín. Primery, ktoré sa môžu použiť pre PCR sú špecifikované napríklad v citácii č. 8. Sekvencia v zozname ID č. 11 ukazuje sekvenciu DNA 10 kDa špecifického PCR produktu z D1701.

31049/H

Kvôli vloženiu cudzorodej DNA sa neesenciálny gén môže odstrániť z PPV genómu buď po častiach, alebo v celku. Je však taktiež možné vložiť cudzorodú DNA do neesenciálneho génu bez odstránenia akýchkoľvek oblastí PPV génu. Ako inzerčné miesta sa napríklad môžu použiť rozpoznávacie miesta reštrikčných enzýmov.

2.b Identifikácia úsekov PPV genómu obsahujúcich inzerčné miesta v génoch, ktoré sú esenciálne

i. Esenciálne gény sa môžu identifikovať sekvenovaním vírusových genómových fragmentov, ktoré sú napríklad prítomné ako klonované fragmenty a potom identifikovaním možných ORF.

Ak sa nájde ORF, jeho funkcia ako génu sa verifikuje dôkazom transkripcie a/alebo translácie. Na rozrušenie tohoto génu v PPV genóme, napríklad odstránením častí tohoto génu, alebo celého génu, alebo vložením cudzorodej DNA, sa použijú molekulárne biologické metódy a následným sledovaním rozmnožovacej schopnosti výsledného vírusu sa stanoví, či gén, ktorý sa našiel je esenciálny pre vírusové rozmnožovanie. Ak je výsledný vírus neschopný replikovať sa, tento gén je potom veľmi pravdepodobne esenciálnym génom.

Ak je vírusový mutant schopný rásť iba na komplementačných bunkových líniách, to potom potvrdzuje, že tento gén je esenciálny.

Príklady inzerčných miest

Ako príklad sa môže spomenúť gén pre proteínkinázu (PK gén) PPV D1701. PK gén sa exprimuje v neskorej fáze rozmnožovacieho cyklu vírusu. Verzie sekvencie DNA uvedené v zozname sekvencií ako ID č. 2, č. 9 alebo č: 13 sa môžu použiť pri identifikácii PK génu v PPV genóme. Pre hľadanie oblasti obsahujúcej tento gén, napríklad pomocou hybridizačných experimentov, sekvenčných analýz genómu a/alebo polymerázových reťazových reakcií sa môžu použiť obvyklé molekulárno-biologické metódy.

31049/H

Kvôli vloženiu cudzorodej DNA sa môže esenciálny gén odstrániť z PPV genómu buď po častiach, alebo úplne. Je však taktiež možné vnášať cudzorodú DNA do esenciálneho génu bez odstránenia oblastí PPV génu.

Genómové úseky, ktoré nekódujú funkčné génové produkty, a ktoré neobsahujú žiadne esenciálne regulačné funkcie (tzv. medzigénové úseky) sú v podstate vhodné pre použitie ako inzerčné miesta pre cudzorodú DNA. Oblasti obsahujúce repetitívne sekvencie sú obzvlášť vhodné, keďže zmeny v častiach oblasti sa môžu vyrovnávať sekvenčnými repetíciami, ktoré zostávajú. Do tejto kategórie spadajú taktiež gény, ktoré sa vyskytujú v dvoch alebo viacerých kópiách, tzv. génové duplikácie.

Gény v ITR oblasti alebo v duplikovaných úsekoch genómu PPV existujú vo vírusovom genóme v dvoch kópiách. Potom, čo sa jedna kópia takéhoto génu odstránila alebo zmenila, a vložila sa cudzorodá DNA, môžu sa získať stabilné PPV rekombinanty, dokonca i vtedy, ak je zmenený gén dôležitý pre rozmnoženie vírusu. Druhá, nezmenená kópia génu môže byť dostačujúca pre funkciu tohoto génu.

i. Na identifikáciu genómových sekvencii, ktoré nekódujú génové produkty sa používajú sekvenčné analýzy genómu PPV. Genómové oblasti, ktoré nevykazujú ani po sekvenčnej analýze ORF, ani pre vírus špecifickú transkripciu, a ktoré nemajú žiadnu regulačnú funkciu, predstavujú potenciálne inzerčné miesta. Potenciálnymi inzerčnými miestami sú v týchto oblastiach obzvlášť štiepiace miesta pre reštrikčné enzýmy. Na zistenie, či je prítomné vhodné inzerčné miesto na vloženie cudzorodej DNA do potenciálneho inzerčného miesta, sa použijú známe molekulárno-biologické metódy, a potom sa skúma životaschopnosť výsledného vírusového mutanta. Ak je vírusový mutant nesúci cudzorodú DNA v možnom inzerčnom mieste schopný rozmnožovať sa, skúmané miesto je vhodným inzerčným miestom.

ii. Na identifikáciu repetitívnych sekvencii a génových duplikácií sa používajú experimenty hybridizácie DNA a/alebo sekvenčné analýzy. Klonované, alebo izolované genómové fragmenty z PPV sa v hybridizačných experimentoch použijú

31049/H ako sondy pre hybridizáciu s fragmentmi DNA PPV. Genómové fragmenty PPV, ktoré sa hybridizujú s viacej ako jedným fragmentom celkového PPV genómu, obsahujú jednu, alebo viacero repetitívnych sekvencií. Na lokalizovanie repetitívnej sekvencie alebo duplikovaných genómových oblastí presne na genómovom fragmente, sa zisťuje nukleotidová sekvencia tohoto fragmentu. Aby sa stanovilo, či potenciálne inzerčné miesto je vhodným inzerčným miestom v rámci celkového PPV genómu, cudzorodá DNA sa musí vložiť do repetitívnej sekvencie, alebo do kópie génovej duplikácie a PPV genómový fragment obsahujúci túto inzerciu sa musí včleniť do vírusového genómu. Potom sa skúma schopnosť rekombinantného vírusu, obsahujúceho cudzorodú DNA, rozmnožovať sa. Ak sa rekombinantný vírus rozmnožuje, potom je identifikované rozpoznávacie miesto vhodným inzerčným miestom.

Príklady inzerčných miest

1. Ako príklad medzigénovej oblasti sa môže spomenúť genómový úsek medzi génom pre proteínkinázu a HD1R génom (zoznam sekvencií ID č. 7).

ii. ITR oblasť (zoznam sekvencií ID č. 4) sa môže spomenúť ako príklad repetitívnej sekvencie.

iii. Potenciálny gén „ORF 3„ (v ITR oblasti) a VEGF gén sa môžu spomenúť ako príklady génových duplikácií v PPV kmeni D1701. Hybridizačné štúdie ukázali, že oblasť obsahujúca VEGF gén sa duplikovala v uvedenom kmeni D1701 a preniesla sa na opačný koniec vírusového genómu, takže sú prítomné dve kópie VEGF génu.

S pomocou sekvencií zo zoznamu sekvencií ID č. 4 (ITR sekvencia s „ORF 3„ génom) a ID č. 7 (oblasť medzi PK a HD1R génmi), je možné použiť obvyklé molekulárno-biologické metódy ako sú hybridizačné experimenty, sekvenčné analýzy genómu a/alebo polymerázové reťazové reakcie, a nájsť zodpovedajúce genómové oblasti u iných PPV.

2. d Iné spôsoby identifikácie inzerčných miest

31049/H

Vo všeobecnosti sa modifikácie sekvencii vírusového genómu môžu použiť taktiež na hľadanie možných inzerčných miest v PPV genóme. Miesta genómu, v ktorých nukleotidové substitúcie, delécie a/alebo inzercie, alebo ich kombinácie, neblokujú vírusové rozmnožovanie, vytvárajú možné inzerčné miesta. Aby sa skontrolovalo, či potenciálne inzerčné miesto je vhodným inzerčným miestom, na vloženie cudzorodej DNA do potenciálneho inzerčného miesta sa použijú známe molekulárno-biologické metódy a skúma sa životaschopnosť výsledného vírusového mutantu. Ak je vírusový rekombinant schopný rozmnožovania, skúmané miesto je vhodným inzerčným miestom.

2.1 Identifikácia inzerčných miest

2.1.1 Purifikácia PPV genómu

Za účelom klonovania inzerčných miest PPV pomocou molekulárnej genetiky sa zo všetkého najprv musí PPV genóm purifikovať. Genóm sa izoluje z vírusu pripraveného podľa 1 (vyššie) a potom sa purifikuje. Natívna vírusová DNA sa extrahuje prednostne pôsobením vodných roztokov detergentov a proteáz na purifikované virióny.

Detergenty, o ktorých sa možno zmieniť sú aniónové, katiónové, amfotérne a neiónové detergenty. Prednosť sa dáva použitiu iónových detergentov. Dodecylsulfát sodný (laurylsulfát sodný) je obzvlášť preferovaný.

Proteázy, o ktorých sa možno zmieniť sú všetko proteázy, ktoré fungujú v prítomnosti detergentov, ako sú proteináza K a pronáza. O proteináze K možno hovoriť ako o uprednostňovanej.

Detergenty sa používajú v koncentráciách 0,1-10 objemových %, stým, že uprednostňované sú 0,5-3 objemové %.

Proteázy sa používajú v koncentráciách 0,01-10 mg/ml vírusového lyzátu, s tým, že je uprednostňované 0,05-0,5 mg/ml vírusového lyzátu.

31049/H

Prednosť sa dáva vykonaniu reakcie vo vodnom tlmivom roztoku v prítomnosti DNázových inhibítorov. Tlmivé látky, o ktorých sa možno zmieniť sú: soli slabých kyselín so silnými zásadami, napríklad tris(hydroxymetylaminometán), soli silných kyselín so slabými zásadami, napríklad primárne fosforečnany, alebo ich zmesi.

O nasledujúcom tlmivom systéme sa možno zmieniť ako o uprednostňovanom: tris(hydroxymetylaminometán).

Tlmivé látky, alebo tlmivé systémy sa používajú v koncentráciách, ktoré zaisťujú pH hodnoty, pri ktorých DNA nedenaturuje. Prednosť sa dáva pH hodnotám

5-9, obzvlášť sa uprednostňujú hodnoty 6-8,5 a maximálne sa uprednostňujú hodnoty 7-8; pracovanie v neutrálnom rozsahu sa môže obzvlášť spomenúť.

Príkladom DNázového inhibítoru je kyselina etyléndiamíntetraoctová v koncentráciách 0,1-10 mM (milimólov), s uprednostnenou koncentráciou približne 1 mM.

Potom sa z vírusového lyzátu extrahujú lipofilné zložky. Ako extrakčné látky sa používajú rozpúšťadlá ako je fenol, chloroform, izoamylalkohol, alebo ich zmesi. Prednosť sa dáva počiatočnému použitiu zmesi fenolu a chloroform/izoamylalkoholu, pričom sa extrakcia deje v jednom, alebo vo viacerých štádiách.

Príkladmi iných spôsobov izolácie vírusovej DNA je ceritrifugácia vírusového lyzátu v hustotnom gradiente CsCI, alebo gélová elektroforéza (viď citácia č. 14).

Extrakcia nukleových kyselín je opísaná v citácii č. 13.

DNA, ktorá sa extrahovala týmto spôsobom sa prednostne precipitovala z vodného roztoku napríklad s alkoholom, prednostne s etanolom alebo izopropanolom a v prítomnosti pridaných jednomocných solí, ako sú chloridy alebo acetáty alkalických kovov, prednostne chlorid lítny, chlorid sodný alebo acetát sodný alebo acetát draselný (tu citované).

2.1.2 Klonovanie genómových fragmentov

Vírusová DNA, ktorá sa týmto spôsobom purifikovala sa teraz použije na prípravu DNA fragmentov. Z tohto dôvodu sa napríklad pôsobí reštrikčnými enzýmami. Príkladmi vhodných reštrikčných enzýmov sú EcoR1, BamHI, HindlII a

31049/H

Kpnl. Alebo sa genómové fragmenty môžu syntetizovať pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR). Za týmto účelom sa primery vyberú z úsekov sekvencií vírusového genómu, ktoré sú už známe, a genómový úsek, ktorý je ohraničený primerovým párom sa syntetizuje in vitro s použitím napríklad Taq polymerázy alebo Pfu polymerázy.

DNA fragmenty, ktoré sú výsledkom reštrikčného rozrušenia alebo PCR sa môžu klonovať do vektorových systémov s použitím opísaných spôsobov (Sambroock 1989). Pre tento účel sú napríklad k dispozícii plazmidové vektory, lambda fág vektory alebo kozmidové vektory, v závislosti od veľkosti DNA fragmentu, ktorý sa v danom prípade má klonovať.

2.1.3 Sekvenovanie, identifikácia a charakterizácia génov a verifikácia ich expresie

Genómové fragmenty, ktoré sú klonované do vektorov sú zo všetkého najskôr sekvenované. Vložené DNA fragmenty sa mapujú s použitím odlišných reštrikčných enzýmov a vhodné subfragmenty sa klonujú do plazmidových vektorov. Sekvenačná reakcia sa zrealizovala napríklad použitím sekvenačnej súpravy T7 dodávanej firmou Pharmacia podľa výrobcových inštrukcií. Dvojvláknová plazmidová DNA, ktorá je na to potrebná, sa pripravuje prednostne s použitím PEG metódy (Hattori a Sakaki 1985). „Otvorené čítacie rámce (ORF),„ ktoré sú prítomné vgenómových fragmentoch sa identifikovali pomocou počítačovej analýzy (GCG, viď vyššie). Informácia o funkcii jednotlivých identifikovaných ORF sa môže získať pomocou porovnávania ich sekvencií s inými génovými sekvenciami so známou funkciou, ktoré sa nachádzajú v databáze. Jednotlivé identifikované ORF sa funkčne charakterizujú detekciou ich zodpovedajúcich transkriptov v bunkách infikovaných vírusom. Z tohoto dôvodu sa napríklad AGPC metóda (Chomczynski a Sacchi, (20) 1987) použila na izolovanie celkovej RNA z buniek infikovaných vírusom. Špecifické transkripty a ich 3’ a 5’ konce sa potom môžu identifikovať pomocou Nothern blot analýzy alebo pomocou primér extension a RNA protection experimentov. Alebo je možné exprimovať vírusový proteín, ktorý je kódovaný identifikovaným ORF in vitro a následné použiť produkt expresie na získanie antiséra a použiť tieto antiséra na dokázanie expresie ORF.

31049/H

Aby sa stanovilo, či gén, ktorý sa našiel, je neesenciálny pre vírusové rozmnožovanie, môže sa tento gén rozrušiť pomocou génového prerušenia alebo génovej delécie. V tejto súvislosti sa z PPV genómu odstráni buď celý gén, alebo jeho časti, alebo vložením sekvencii cudzieho génu sa preruší čítací rámec tohoto génu. Sleduje sa schopnosť výsledného vírusu rozmnožovať sa. Ak sa vírus môže replikovať dokonca i bez prítomnosti rozrušeného génu, tento gén je potom neesenciálnym génom.

2.1.4 Selekcia klonov obsahujúcich fragmenty PPV genómu

To, ktoré z vyššie získaných klonov obsahujúcich fragmenty PPV genómu sa použijú, závisí na tom, či rekomblnantné PPV, ktoré sa majú pripraviť budú (i) schopné replikácie alebo (ii) neschopné replikovať sa.

i. Ak sa majú pripraviť rekomblnantné PPV, ktoré sú schopné replikácie napriek inzercii a/alebo delécii, vykoná sa ďalšie spracovanie klonovaných vírusových genómových fragmentov, ktoré obsahujú gény alebo genómové oblasti outwith génov, ktoré sú neesenciálne pre vírusové rozmnožovanie, alebo ktoré obsahujú génové duplikácie.

Na testovanie, či gén, alebo genomová oblasť, ktorá sa použije je neesenciálnou oblasťou vírusového genómu, alebo génovou duplikáciou, sa použijú vírusové mutanty.

Prednosť sa dáva tým klonovaným genómovým fragmentom PPV, ktoré obsahujú úplné verzie neesenciálnych génov. Okrem tohoto by sa mali na oboch koncoch génov, alebo genómových oblastí nachádzať pričlenené oblasti vírusového genómu. Dĺžka pričlenených oblastí by mala byť väčšia ako 100 bázových párov. Ak nie sú dostupné takéto genómové klony, môžu sa pripraviť z existujúcich génových klonov pomocou molekulárno-biologických metód. Ak klonované genómové fragmenty navyše obsahujú genómové oblasti, ktoré sa nevyžadujú pre opísanú prípravu, tieto oblasti sa môžu odstrániť pomocou subklonovaní.

ii. Ak sa majú pripraviť rekomblnantné PPV, ktoré stratili schopnosť vytvárať infekčné potomstvo ako výsledok inzercie a/alebo delécie, predmetom ďalšieho spracovávania sú klonované vírusové genómové fragmenty, ktoré obsahujú gény,

31049/H alebo genómové oblasti outwith génov, ktoré sú esenciálne pre vírusové rozmnožovanie.

Na testovanie, či gén, alebo genómová oblasť, ktorá sa použije je esenciálnou oblasťou vírusového genómu, sa môžu použiť vírusové mutanty. Z tohoto dôvodu sa na inaktivovanie génu, alebo genómovej oblasti v PPV, ktorá sa skúma, napríklad čiastočnou alebo úplnou deléciou analyzovanej oblasti, použijú molekulárnobiologické metódy, a potom sa sleduje schopnosť výsledného vírusu rozmnožovať sa. Ak sa vírusový mutant nemôže ďalej rozmnožovať, ako výsledok inaktivácie analyzovaného génu, alebo genómovej oblasti, tento skúmaný gén alebo genómová oblasť je esenciálnou oblasťou.

Prednosť sa dáva tým klonovaným genómovým fragmentom PPV, ktoré obsahujú úplné verzie esenciálnych génov. Okrem tohoto by sa mali zhodne na oboch koncoch génov, alebo genómových oblastí nachádzať pričlenené oblasti vírusového genómu. Dĺžka pričlenených oblastí by mala byť väčšia ako 100 bázových párov. Ak nie sú dostupné takého genómové klony, môžu sa pripraviť z existujúcich génových klonov pomocou molekulárno-biologických metód. Ak klonované genómové fragmenty obsahujú dodatočné genómové oblasti, ktoré sa nevyžadujú pre opísanú prípravu, tieto oblasti sa môžu odstrániť pomocou subklonovaní.

Ak sa má ITR oblasť, VEGF gén, PK gén, gén, ktorý kóduje 10 kDa proteín alebo medzigénová oblasť medzi PK génom a HD1R génom použiť ako inzerčné miesto v PPV, musia sa izolovať zodpovedajúce oblasti PPV genómu, ktoré obsahujú tieto inzerčné miesta. Z tohoto dôvodu sa klonujú zodpovedajúce oblasti PPV genómu.

31049/H

2.2.1 Klonovanie VEGF génu

Gén, ktorý kóduje VEGF sa lokalizuje na PPV genóme a potom sa izoluje po častiach, alebo ako celok spolu s pričlenenými genómovými úsekmi. Z tohoto dôvodu sa PPV prednostne rozmnožuje podľa č. 1 a genóm sa purifikuje podľa č. 2.1.1.

a. VEGF gén sa prednostne amplifikuje pomocou polymerázovej reťazovej reakcie (PCR). Štartovacie sekvencie (primery), ktoré sa vyžadujú na túto reakciu sú odvodené zo sekvencie DNA VEGF génu, ktorá je zobrazená ako sekvencia v zozname ID č: 1. Potom sa prednostne klonuje výsledný amplifikovaný gén.

b. Oblasť, ktorá obsahuje VEGF gén a jeho pričlenené genómové úseky sa prednostne získava fragmentáciou PPV genómu a izoláciou a klonovaním príslušného genómového fragmentu (fragmentov). Z tohoto dôvodu sa purifikovaný genóm vírusu štiepi tak, ako sa opísalo v č. 2.1.2, s prednostným použitím reštrikčného enzýmu HindlII. Genómové fragmenty, ktoré sa získali po enzymatickom rozrušení sa prednostne frakcionujú pomocou elektroforetických alebo chromatografických metód, aby sa identifikoval genómový fragment (fragmenty), ktorý nesie/nesú VEGF gén a jeho pričlenené genómové úseky.

Elektroforetické frakcionácie v agaróze alebo polyakrylamide sa vykonávajú podľa štandardných metód, ktoré sú opísané v

- Current Protocols in Molecular Biology 1987-1988, Wiley-lnterscience, 1987.

- A Practical Guide to Molecular Cloning, Perbal, 2nd edition, Wileylnterscience, 1988.

- Molecular Cloning, tu citované.

- Virologische Arbeitsmethoden [Praktické metódy vo virológii], Volume III, Gustáv Fischer Verlag, 1989.

Genómové fragmenty, ktoré nesú VEGF gén a jeho pričlenené sekvencie sa identifikujú napríklad pomocou hybridizácie s definovanými sondami nukleovej kyseliny. Z tohoto dôvodu sa frakcionované genómové fragmenty prenesú na filtre a hybridizujú sa s VEGF-špecifickými, značenými sondami nukleovej kyseliny podľa Southern blot metódy. Metódy prenosu fragmentov genómu a hybridizácie sa môžu

31049/H vykonať podľa štandardných protokolov, ako je opísané v časti „Southern Blotting,, z tu citovanej Molecular Cloning. Oligonukleotidy alebo fragmenty nukleovej kyseliny, ktoré sa môžu použiť ako sondy, sa môžu odvodiť zo sekvencie v zozname sekvencií ako ID č: 1. Napríklad Taq subfragment (366 bp), ktorý sa môže identifikovať pomocou sekvencie v zozname ako ID č: 1, sa použije ako hybridizačná sonda.

Genómové fragmenty, u ktorých sa dokázalo, že obsahujú časti, alebo prednostne celý VEGF gén a pričlenené genómové úseky, sa izolujú a klonujú. Vhodný genómový fragment (fragmenty) sa elektroforeticky izoluje napríklad z vhodnej oblasti gélu pomocou elektroelúcie, alebo použitím metódy používajúcej agarózu s nízkym bodom topenia.

Kvôli klonovaniu VEGF génu sa genómové fragmenty, ktoré sa pripravili vyššie, včlenia do bakteriálnych alebo eukaryotických vektorov. Plazmidové alebo fágové vektory sú spočiatku obzvlášť uprednostňované. Kvôli inzercii fragmentov genómu sa na dvojvláknové plazmidové alebo fágové vektorové DNA molekuly pôsobí reštrikčnými enzýmami tak, aby sa vytvorili vhodné konce pre vloženie.

Ako plazmidy sa používajú známe plazmidy ako sú pBR322 a jeho deriváty, napríklad pSPT18/19, pAT153, pACYC184, pUC18/19 a pSP64/65.

Ako fágové vektory sa používajú známe varianty lambda fágu ako sú napríklad lambda fág ZAP a lambda fág gt10/11, alebo fág M13mp18/19.

Reštrikčné enzýmy, ktoré sa môžu použiť sú známe napríklad z Gene zväzok 92 (1989) Elsevier Science Publishers BV Amsterdam.

Plazmid alebo fágový vektor, na ktorý sa pôsobilo reštrikčným enzýmom sa zmieša s nadbytkom DNA fragmentu, ktorý sa má vnášať, napríklad v približnom pomere 5:1, potom sa kvôli spojeniu fragmentu s vektorom na zmes pôsobí DNA ligázou. Kvôli rozmnoženiu plazmidu alebo fágov sa ligačná zmes vniesla do prokaryotických alebo eukaryotických buniek, prednostne do baktérií (napríklad Escherichia coli kmeň K12 a jeho deriváty) a tie sa replikovali.

Baktérie sa transformujú a selektujú tak, ako sa opisuje v tu citovanej Molecular Cloning.

31049/H

Identita cudzorodej DNA sa prednostne verifikuje pomocou hybridizačných experimentov a obzvlášť prednostne pomocou sekvenčných analýz. Kde bolo vhodné, vykonalo sa subklonovanie.

2.2.2 Klonovanie proteínkinázového génu

Gén, ktorý kóduje proteínkinázu sa lokalizuje na PPV genóme a potom sa izoluje po častiach, alebo vcelku spolu s jeho pričlenenými genómovými úsekmi.

Ako sa opísalo pre klonovanie VEGF génu, táto oblasť sa môže izolovať fragmentáciou PPV genómu (štiepne miesta viď Obr. 1), prednostne nasledovanej klonovaním fragmentov a selekciou fragmentov alebo klonov, ktoré obsahujú časti PK génu, alebo prednostne celý PK gén spolu s pričlenenými DNA sekvenciami PPV genómu. DNA molekuly, ktoré sa môžu použiť ako primery pre PCR alebo ako sondy pre hybridizáciu sa môžu odvodiť zo sekvencie v zozname ako ID č: 2 alebo ID č: 9.

Tam, kde to bolo vhodné, sa vykonali subklonovania.

2.2.3 Klonovanie génu, ktorý kóduje 10 kDa proteín

Gén, ktorý kóduje 10 kDa proteín sa lokalizuje na PPV genóme s použitím metód detailne opísaných pre VEGF gén a PK gén (vyššie) a izoluje sa po častiach, alebo prednostne vcelku spolu s jeho pričlenenými PPV genómovými sekvenciami.

V tomto prípade sa získava oblasť PPV genómu, ktorá obsahuje gén pre 10 kDa proteín, alebo jeho časti, prednostne pomocou PCR a/alebo klonovaním a identifikáciou a selekciou vhodných klonov.

Citácia č. 8 poskytuje detaily o DNA molekulách, ktoré sa môžu použiť ako primery pre PCR, alebo ako sondy pre hybridizáciu. Tam, kde to bolo vhodné, sa vykonali subklonovania.

2.2.4 Klonovanie obrátenej terminálnej repetitívnej oblasti pre genómový úsek, ktorý leží medzi PK génom a HD1R génom

31049/H

Prístup sa zhoduje s klonovaním VEGF génu, ktorý sa podrobne opísal (vyššie). DNA molekuly, ktoré sa môžu použiť ako primery pre PCR, alebo ako sondy pre hybridizáciu, pre izoláciu vhodných oblastí sú zjavné zo sekvencii v zozname ako ID č: 4 (ITR oblasť) a ID č: 7 (oblasť medzi PK génom a HD1R génom).

3. Konštrukcia inzerčných plazmidov alebo deiečných plazmidov

Tzv. inzerčné plazmidy, ktoré sa môžu použiť na vloženie cudzorodej DNA do PPV genómu sa pripravujú na základe fragmentov PPV genómu, ktoré sa identifikujú, lokalizujú a klonujú tak, ako sa opísalo v časti 2. Inzerčné plazmidy nesú cudzorodú DNA, ktorá sa má vložiť do PPV, obklopenú úsekmi PPV genómu. Existujú rôzne možnosti prípravy inzerčných plazmidov: tie nasledujúce sa tu môžu spomenúť ako príklady:

3.1 Identifikácia, alebo príprava unikátnych rozpoznávacích miest pre reštrikčné enzýmy v klonovaných genómových fragmentoch, ktoré sa získali tak, ako sa opísalo v 2.1.4 alebo 2.2 a vloženie cudzorodej DNA

Reštrikčné štiepne miesta, ktoré sa vyskytujú iba raz, t.j. sú unikátne, sa môžu napríklad (viď 2.1.3) identifikovať v PPV nukleotidových sekvenciách, ktoré sa predtým zistili.

Synteticky pripravené oligonukleotídy, ktoré nesú nové unikátne štiepiace miesta pre reštrikčné enzýmy sa môžu včleniť do týchto unikátnych reštrikčných miest.

Výsledné plazmidy sa rozmnožia a selektujú tak, ako sa opísalo predtým.

Alebo sa na začlenenie nových unikátnych rozpoznávacích miest reštrikčných enzýmov do genómových fragmentov PPV môže použiť PCR, ako opísali Jacobs a kol. (citácia č. 12).

Unikátne rozpoznávacie miesta reštrikčných enzýmov, ktoré sa identifikovali a/alebo pripravili, sa použijú na vloženie cudzorodej DNA do PPV genómu.

Cudzorodá DNA sa vkladá s použitím známych metód (citácia č. 11).

31049/H

3.2 Deletovanie genómových sekvencii v klonovaných genómových fragmentoch a vloženie cudzorodej DNA

Z fragmentov klonovaného PPV genómu sa napríklad môžu deletovať subfragmenty pôsobením reštrikčných enzýmov na tieto fragmenty, ktoré prednostne obsahujú viac ako jedno, obzvlášť prednostne 2 rozpoznávacie miesta. Po pôsobení enzýmov sa výsledné fragmenty frakcionujú tak, ako sa opísalo vyššie, napríklad elektroforeticky, a izolujú sa a vhodné fragmenty sa spájajú opäť dokopy pomocou pôsobenia ligázy. Výsledné plazmidy sa rozmnožia a vyselektujú sa delečné plazmidy.

V opačnom prípade sa unikátne rozpoznávacie miesto reštrikčných enzýmov na fragmente PPV genómu môže použiť ako východiskový bod pre obojsmernú degradáciu fragmentu endonukleázou, napríklad enzýmom Bal31. Veľkosť delécie sa môže určiť pomocou obdobia, počas ktorého tento enzým pôsobí a môže byť skontrolovaný pomocou gélovej elektroforézy. Syntetické oligonukleotidy sa pripoja ligázou k novo vytvoreným koncom fragmentov tak, ako sa opísalo v 3.1 (vyššie).

Cudzorodý gén sa prenesie iba do malého percenta PPV genómu z celkovej PPV populácie.

Z tohoto dôvodu sa na oddelenie rekombinantných PPV od PPV „divokého typu,, vyžadujú selekčné systémy (citácia č. 16).

Prednosť sa dáva použitiu gpt selekčného systému, ktorý je založený na guanyl-fosforibozyltransferázovom géne z E. coli. Pri expresii v eukaryotickej bunke tento gén sprostredkuje rezistenciu na kyselinu mykofenolovú, ktorá je inhibítorom purínového metabolizmu. Jej použitie pri konštrukcii rekombinantných vektorových vírusov sa popísalo už mnohokrát (viď citácia č. 16 / č. 17).

4. Konštrukcia rekombinantného PPV podľa 1 až 12

Cudzorodá DNA sa vložila do PPV genómu:

a. súčasnou transfekciou DNA inzerčného alebo delečného plazmidu a infekciou vhodných hostiteľských buniek s PPV,

31049/H

b. transfekciou DNA inzerčného alebo delečného plazmidu a následnou infekciou vhodných hostiteľských buniek s PPV,

c. infekciou s PPV a následnou transfekciou s DNA inzerčného alebo delečného plazmidu vo vhodných hostiteľských bunkách.

Metódy postupov, ktoré sú vhodné pre tento účel sú známe. Transfekcia sa môže vykonať s použitím známych metód ako je technika s fosforečnanom vápenatým, lipozómami sprostredkovaná transfekcia alebo elektroporácia (viď citáciu č. 18).

1. Infekcia s PPV:

Pre prípravu PPV obsahujúcich cudzorodú DNA sa uprednostňujú bunkové kultúry, ktoré umožňujú dobré rozmnožovanie vírusu a efektívnu transfekciu, napríklad stabilizovaná bunková línia BK-K1-3A bovinných obličiek.

2. Príprava inzerčnej alebo delečnej plazmidovej DNA:

Transformované bunky, napríklad baktérie, ktoré sa získali predtým opísanými metódami, a ktoré prechovávajú inzerčné alebo delečné plazmidy, sa pomnožia a plazmidy sa izolujú z buniek známym spôsobom a podrobia sa ďalšej purifikácii. Purifikácia sa vykonáva napríklad pomocou izopyknickej centrifugácie v hustotnom gradiente napríklad CsCI, alebo pomocou afinitnej purifikácie na komerčne dostupných časticiach siliky.

3. Transfekcia:

Pre transfekciu sa prednostne používajú purifikované kruhové alebo linearizované plazmidové DNA. Purifikácia sa vykonáva tak, ako sa naznačilo napríklad v časti 2 (vyššie).

4. Kultivovanie buniek po transfekcii a infikovaných buniek.

Bunky sa kultivujú s použitím vyššie opísaných metód. Kultivačné médium sa odstráni, keď sa objaví cytopatický efekt, a tam, kde je vhodné, sa zbaví zvyškov buniek centrifugáciou alebo filtráciou a tam, kde je to vhodné, sa taktiež spracuje bežnými metódami pre purifikáciu vírusov z jedného plaku.

Nasledujúci spôsob sa použije pri príprave rekombinantného PPV:

31049/H

BK-KL-3A bunky, ktoré sa pestovali až do zahustenia, sa infikovali s infekčnou dávkou, ktorej MOI (násobok infekcie) bol od 0,001 po 5, prednostne 0,1. Dve hodiny neskôr sa infikované bunky vystavili transfekcii napríklad s DNA (2-10 μρ) plazmidu pMT-10, buď s použitím CaPO4-glycerolovej šokovej metódy, alebo s použitím transfekčnej súpravy podľa inštrukcií výrobcu (DOSPER, EBoehringer-Mannheim). Tieto bunkové kultúry sa potom inkubovali s médiom pri 37°C a v atmosfére 5% CO₂po dobu od troch po šesť dní pokiaľ sa nestalo viditeľným CPE alebo tvorba plakov.

V závislosti od vloženej cudzorodej DNA, sa rekombinantné PPV identifikovali pomocou:

a. detekcie cudzorodej DNA, napríklad pomocou DNA/DNA hybridizácií

b. amplifikáciou cudzorodej DNA pomocou PCR

c. expresie cudzorodej DNA s pomocou ŕekombinantných vírusov

Ohľadom a.

DNA sa izoluje zo skúmaného vírusu a hybridizuje sa s nukleovou kyselinou, ktorá je aspoň čiastočne identická s vloženou cudzorodou DNA.

PPV, ktoré sa purifikovali zo samostatných plakov, a ktoré sa identifikovali ako rekombinantné, sa prednostne testujú opätovne na prítomnosť a/alebo expresiu cudzorodej DNA. Rekombinantné DNA, ktoré stabilne obsahujú a/alebo exprimujú cudzorodú DNA sú k dispozícii pre ďalšie použitie.

Ohľadom c.

Expresia cudzorodej DNA sa môže zistiť na úrovni proteínov napríklad pomocou infekcie buniek vírusom a následným vykonaním imunofluorescenčnej analýzy s použitím špecifických protilátok proti proteínu kódovanému cudzorodou DNA, alebo vykonaním imunoprecipitácie alebo Western blot analýzy s použitím protilátok proti proteínu kódovanému cudzorodou DNA s použitím lyzátov infikovaných buniek.

Expresia cudzorodej DNA sa môže zistiť na úrovni RNA identifikáciou špecifických transkriptov. Z tohoto dôvodu sa RNA izoluje z buniek infikovaných vírusom a hybridizuje sa s DNA sondou, ktorá je aspoň čiastočne identická s vloženou cudzorodou DNA.

31049/H

Príklady uskutočnenia vynálezu

Nasledujúce príklady opisujú oblasť PPV genómu, ktorá je vhodná na integráciu a expresiu homológnych a heterológnych génov, alebo ich častí. Vhodné genómové fragmenty sú obsiahnuté v HindlII fragmente I PPV ovis kmeňa D1701 (a jeho príslušných derivátov) (zoznam sekvencií ID č: 8 a ID č: 12).

Príklad 1

Klonovanie HindlII fragmentu I:

Po štiepení purifikovanej vírusovej DNA s reštrikčným enzýmom HindlII, sa výsledné fragmenty DNA separovali elektroforézou na agarózovom géli a fragment I, ktorého veľkosť je približne 5,6 kbp, sa odstránil a izoloval a purifikoval s použitím Qiaex® metódy (Qiagen). Štandardné techniky (Maniatis a kol.) sa použili na klonovanie tohoto fragmentu DNA do vektorového plazmidu pSPT18 (BoehringerMannheim), ktorý sa štiepil s HindlII a pôsobilo sa naň s CIP (teľacou črevnou fosfatázou). Výsledné rekombinantné plazmidy, pORF-1 a pORF-2, sa odlišovali iba v orientácii inzercie. Konštrukcia reštrikčnej mapy umožnila vykonať ďalšie subklonovanie tak, ako je ukázané na Obr. 1. Southern blot hybridizácia sa použila na testovanie všetkých rekombinantných plazmidových DNA s reštrikčnými enzýmami degradovanou vírusovou alebo plazmidovou DNA, kvôli kontrole ich identity a vírusového pôvodu.

Príklad 2

Sekvenovanie DNA

Sekvenovanie DNA sa vykonalo s použitím dvojvláknovej DNA odlišných rekombinantných plazmidov a SP6-špecifických a T7-špecifických primerov, ktoré sa viažu k obom koncom klonovacieho miesta vektorového plazmidu pSPT18. Sangersova dideoxy reťazová terminačná metóda sa vykonala v prítomnosti ³⁵S-[a]dATP a T7-DNA polymerázy podľa doporučení výrobcu (Pharmacia-Biotech). Veľký počet oligonukleotidov sa syntetizoval podľa sekvencie DNA, ktorá sa získala a potom sa použila na sekvenovanie oboch vlákien HindlII fragmentu I. 7-Deaza-GTP sa použil na rozriešenie sekvenčných artefaktov alebo kompresií pruhov

31049/H spôsobených relatívne vysokým G+C obsahom vírusovej DNA inzercie (64,78%) a sekvenčné produkty sa, ak bolo nevyhnutné, separovali v denaturujúcich polyakrylamidových géloch obsahujúcich formamid.

Príklad 3

Identifikácia potenciálnych génov

Počítačom riadená analýza výslednej sekvencie DNA (zoznam sekvencii ID č: 8 a ID č: 12) odhalila niekoľko možných otvorených čítacích rámcov (ORF). Aminokyselinové sekvencie odvodené z týchto ORF sa použili na hľadania génovej homológie (napríklad GCG program). Ako výsledok sa zistila prítomnosť významných aminokyselinových homológií u nasledujúcich génov (viď taktiež obrázok č. 1).

Príklad 3.1

Našiel sa ORF, ktorý mal aminokyselinovú homológiu (36,1 po 38,3% zhodnosť; 52,8 po 58,6% podobnosť) svaskulárnym endoteliálnym rastovým faktorom (VEGF) z rôznych druhov cicavcov (napríklad myš, potkan, morča, krava a človek) a taktiež s homológom VEGF génu, ktorý sa nedávno popísal v PPV kmeňoch NZ-2 a NZ-7 (citácia č. 6). U iných poxvírusov, ako sú rôzne ortopoxvírusy, je nie známe, že by mali zodpovedajúcu génovú homológiu. Tento ORF, ktorý sa označuje VEGF, zahrňuje 399 nukleotidov a kóduje polypeptid, ktorý obsahuje 132 aminokyselín, a ktorý má vypočítanú molekulovú hmotnosť 14,77 kDa. Transkripčné analýzy celkovej alebo oligo(dt)-selektovanej RNA s použitím Nothern blot hybridizácie, RNA protection experimentov a primer extension testov potvrdili, že VEGF sa exprimoval ako skorý gén počínajúc od približne 2 hodín po infekcii (p.i.). Zistilo sa, že špecifická mRNA zahrňuje od 422 po 425 báz, začínajúc priamo downstream od sekvencie, ktorá vykazuje 100% homológiu s kritickou oblasťou konsenzus motívu, ktorý je typický pre promótory skorých génov vírusu vakcínie. 3’ koniec VEGF mRNA sa mapoval v konsenzus sekvencii, ktorá je všeobecne rozšírená u skorých transkriptov, napríklad génov vírusu vakcínie. Veľkosť tejto mRNA sa odhadla pomocou Nothern blot hybridizácie na približne 500 báz, čo poukazuje na poly(A) úsek s dĺžkou okolo 100 báz.

31049/H

Príklad 3.2

Našiel sa ďalší ORF, ktorý kóduje potenciálnu proteínkinázu (PK), ktorá má homológiu s príslušným génom, ktorý sa nachádza u niekoľkých ortopoxvírusov (napríklad vírus vakcínie, vírus varioly alebo Shopeho vírus fibrómu) a je známy ako F10L. Tento génový homológ sa transkribuje v neskorom štádiu infekčného cyklu PPV kmeňa D1701 (od 12 po 16 hodín p.i.). Štartovací bod transkripcie sa nachádza krátku vzdialenosť downstream od oblasti, ktorá vykazuje vysoký stupeň homológie so známym promótorom neskorých génov vírusu vakcínie.

Príklad 3.3

Našli sa ďalšie možné ORF, ktoré doposiaľ nevykazujú žiadnu podozrivú homológiu so známymi génovými sekvenciami. Obzvlášť zaujímavý je potenciálny gén, ktorý sa označuje HD1R gén (Obrázok 1). Analýzy, také ako sa opísali vyššie, dokázali transkripciu špecifickej skorej mRNA s veľkosťou približne 1,6 kb.

Príklad 3.4

A napokon sa pomocou počítača našiel ORF, ktorý prekrýva 3’ koniec F10L a 5’ koniec VEGF (F9L, Obrázok 1). Porovnanie sekvencii ukázalo jeho homológiu s génom F9L vírusu vakcínie.

Príklad 3.5

Porovnanie so známymi sekvenciami orf kmeňov NZ-2 a NZ-7 umožnilo upraviť začiatok tzv. ITR oblasti genómu D1701 na nukleotidovú polohu 1611 HindlII fragmentu I. ITR oblasť je sekvenčná oblasť, ktorá sa nachádza na konci poxvírusového genómu, a ktorá je podobným spôsobom prítomná, v obrátenej orientácii, na druhom konci genómu a preto sa nazýva inverzná repetitívna oblasť (ITR) (viď zoznam sekvencii ID č. 4). Zistenie porovnávania sekvencii súhlasí s experimentmi skúmajúcimi lokalizáciu HindlII fragmentu I klonovaného do pORF-1

31049/H v genóme D1701. Mapa tohto fragmentu, a pravdepodobne identického Hindlll fragmentu H, je znázornená na Obrázku 2. Z tohoto je možné urobiť záver, že ITR zaberá približne 2,6 kbp D1701 genómu.

Experimenty na určenie 3’ konca D1701 VEGF mRNA ukázali, že aspoň jedna ďalšia pre vírus špecifická RNA začína v ITR medzi približne 40 a 220 bp po prechode do ITR. Príslušný gén sa označil ORF3 (Obrázok 1) z dôvodu aminokyselinovej homológie s NZ-2. Pred predpokladaným 5’ koncom ORF3 mRNA, sa nachádza konsenzus sekvencia, ktorá je typická pre včasné poxvírusové promótory. Doposiaľ nebolo možné nájsť homológiu s inými génmi.

Príklad 4

Vloženie DNA sekvencii do Hindlll fragmentu I

Študovala sa možnosť použitia opísaného Hindlll DNA fragmentu (klonovaného v plazmidoch pORF-1 a pORF-2) na vloženie homológnych alebo heterológnych sekvencii DNA. V nasledujúcom texte sa použili tri odlišné stratégie na dosiahnutie tohoto cieľa.

Pre nasledujúce príklady sa skonštruoval plazmid pGSRZ, ktorý obsahuje funkčný LacZ gén z E. coli pod kontrolou 11K promótoru vírusu vakcínie. Doteraz sa izolovali relevantné časti DNA plazmidu pUCHLZ (viď citáciu č. 7) a klonovali sa do plazmidu pSPT18. Táto funkčná TIK/LacZ génová kombinácia (nižšie označovaná ako LacZ kazeta) sa môže získať izoláciou 3,2 kb Smal/Sall fragmentu z pGSRZ (Obrázok 3).

Konštrukcia selekčných kaziet

Rôzne tzv. selekčné kazety sa skonštruovali s použitím plazmidov pGSRZ (obsahujú LacZ gén pod kontrolou promótoru Puk vírusu vakcínie), pMT-1 (obsahuje PPV VEGF promótor) a pMT5 (obsahuje gpt gén E. coli), ako je znázornené na obrázku č. 7. Syntetické komplementárne oligonukleotidy, ktoré predstavujú sekvenciu VEGF promótoru (Pvegf) sa pripravili a vložili do Smal štiepneho miesta pSPT18 (pMT-1). Plazmidy pMT-2 a pMT-4 sa potom pripravili, buď odstránením LacZ génu zp18Z (získaného inzerciou BamHI fragmentu z pGSRZ do pSPT18)

31049/H v prípade pMT-2, alebo odstránením gpt génu z pMT-5 v prípade pMT-4, pomocou BamHI štiepenia, a ich následným zavedením do pMT-1 (obrázok 7).

Funkčný gpt gén sa rozmnožil z GPT plazmidu pMSG (Pharmacia-Biotech) pomocou PCR a potom sa klonoval do pCRII vektoru pomocou tzv. TA klonovania podľa výrobcových (Invitrogen Inc.) inštrukcií.

Následne bolo možné, ako je znázornené na diagrame na obrázku č. 7, skonštruovať kazety s dvojitou selekciou, ktoré exprimujú LacZ gén, alebo gpt gén pod kontrolou 11K promótora a/alebo Pvegf v zobrazených kombináciách a orientáciách.

V súlade s príkladom XX (LacZ-VEGF delécia) alebo YY (mezdigénovýBal31), sa môžu tieto selekčné kazety vnášať, po vhodnom štiepení reštrikčnými enzýmami a po izolácii, do odlišných PPV orf DNA plazmidov. Plazmid pMT-10 sa skonštruoval po inzercii kazety s dvojitou selekciou do opísaného plazmidu pdV-500. ktorý vykazuje 312 bp deléciu PPV D1701 VEGF génu. Pomocou tejto konštrukcie sa vložili funkčné lacZ a gpt gény na miesto VEGF ORF, ktorý sa odstránil deléciou. Po prechodných testoch expresie, bolo možné dokázať aktivitu LacZ génu v bunkách infikovaných s PPV D1701 (neukázané), takže sa následne vykonala selekcia VEGF delečných mutantov D1701, ktoré exprimovali gpt a lacZ.

Príklad 4.1

Inzercia do medzigénových, nekódujúcich oblastí

Identifikácia alebo vytváranie nových unikátnych reštrikčných miest, ktoré sú lokalizované v medzigénovej, nekódujúcej časti. Tieto miesta sa potom použijú na vnesenie cudzorodých DNA sekvencií, ktoré kódujú funkčné a detegovateľné génové produkty (napríklad LacZ gén E. coli), alebo ich časti.

Príklad 4.1.1

Plazmid pORF-PB (Obrázok 1) obsahuje jedno Nrul štiepne miesto, ktoré sa nachádza medzi proteínkinázovým génom (F10L) a HD1R génom. Potom, čo sa pORF-PB linearizoval týmto reštrikčným enzýmom, ligázou sa k nemu pridala LacZ

31049/H kazeta (po doplňovacej reakcii) pomocou ligácie tupých koncov. Rekombinantné plazmidy, ktoré obsahujú funkčný Lacz gén sa vyselektovali po štiepení, napríklad s Bgll, a správne vloženie sa dokázalo pomocou Southern blot hybridizácie s použitím LacZ-špecifickej sondy a pomocou čiastočného sekvenovania DNA prechodu LacZ/PPV.

Príklad 4.1.2

Ten istý prístup ako sa opísal v hore uvedenom príklade sa použil downstream VEGF génu (štiepenie v BstEII mieste, obrázok 1) a v potenciálnom géne ORF3 v ITR oblasti (čiastočná degradácia s Xbal, aby sa zabránilo štiepeniu Xbal miesta v pSPT18 klonovacom mieste).

Príklad 4.1.3

Na vloženie nového, unikátneho reštrikčného miesta do ktoréhokoľvek požadovaného bodu v klonovaných fragmentoch PPV DNA (viď obrázok 10, citáciu č. 12) sa môže použiť technika PCR mutagenézy. Potiaľto sa dve PCR reakcie vykonávali oddelene s použitím primerových párov E1+EV2 v jednom prípade (PCR A) a EV1+XB v druhom prípade (PCR B). Všetky tieto primery zaberali 25 nukleotidov, ktoré sú identické s PPV DNA sekvenciou v daných sekvenčných pozíciách. Kým primer XB tvorí autentickú sekvenciu, napríklad okolo Xbal miesta (obrázok 1), nové EcoRI miesto sa vložilo do 5’ konca primeru E1 a nové EcoRV miesto sa vložilo do primerov EV1 a EV2 (ktoré sú navzájom komplementárne). EcoRV miesto, ktoré nie je pôvodne prítomné v celej sekvencii pORF-1 alebo pORF2, sa vložilo v bode, ktorý sa vybral pre vloženie LacZ kazety. PCR produkty, ktoré sa získali z reakcií A a B sa purifikovali, denaturovali sa na jednovláknové formy a zmiešali sa dokopy za reasociačných podmienok; potom sa použijú na poslednú PCR reakciu; t.j. PCR C. E1 a XB sa teraz použijú ako primery, aby v tomto príklade došlo k extenzii pORF-1 793 bp vľavo. Po gólovej izolácii a purifikácii, sa PCR produkt, ktorý je výsledkom reakcie C, štiepi s EcoRI a Xbal a potom sa spojí ligázou s plazmidom pORF-XB, ktorý sa štiepil EcoRI a Xbal. Ako výsledok obsahuje

31049/H plazmid pORF-1 EV (obrázok 5) EcoRV reštrikčné miesto v požadovanej pozícií; potom sa môže použiť na linearizáciu a ligáciu ku LacZ kazete.

Nevhodne spárované primery, ktoré obsahujú definované bázové zmeny, alebo deléciu jednej bázy, sa môžu navyše použiť pre spôsob opísaný v tomto príklade tak, aby sa vytvorili napríklad translačné stop kodóny alebo aminokyselinové delécie v ktoromkoľvek požadovanom bode vírusovej DNA sekvencie.

Príklad 4.2

Vnútrogénová inzercia bez delécie orf sekvencií

Nové alebo dodatočné sekvencie sa môžu vniesť do kódujúcich sekvencií jedného z opísaných ORF po štiepení v reštrikčných miestach, ktoré sa vyskytujú iba raz vo vybranom géne.

Príklad 4.2.1

Unikátne Xcml miesto, ktoré sa nachádza v pravej časti génového homológu F10L, sa použilo na linearizáciu plazmidovej pORF-1. Tak LacZ kazeta, ako aj štiepená pORF-1 DNA sa opatrili tupými koncami s použitím T4 DNA polymerázy, alebo Klenow DNA polymerázy a potom sa spojili ligázou; na transformáciu sa potom použili kompetentné baktérie E. coli (DHaF’). Výsledné bakteriálne kolónie sa testovali na pozitívne rekombinantné plazmidy pomocou kolóniovej hybridizácie s použitím LacZ-špecifickej sondy a zodpovedajúce plazmidové DNA sa štiepili reštrikčnými enzýmami.

Príklad 4.2.2

VEGF kódujúca oblasť obsahuje jedno Styl miesto, ktoré sa použilo na vloženie LacZ kazety tak, ako sa opísalo vyššie.

Príklad 4.3

Delécia vírusových sekvencií

31049/H

Nasledujúce príklady opisujú odstránenie tak kódujúcich oblastí (vnútrogénové delécie), ako aj nekódujúcich oblastí (medzigénové delécie):

Príklad 4.3.1

Kvôli nahradeniu deletovaných vírusových sekvencií vložením cudzorodých génov, alebo častí týchto génov, sa z HindlII DNA fragmentu I odstránili definované časti s použitím reštrikčných enzýmov. Toto sa vykonalo štiepením plazmidu pORFPA reštrikčným enzýmom Nrul (v bode v ITR oblasti, obrázok 1), výsledkom čoho je delécia 396 bp fragmentu. Po doplňovacej reakcii sa ligázou pripojila LacZ kazeta tak, ako sa opísalo vyššie. Na obrázku 4 je schematicky zobrazená delécia 396 bp fragmentu z pORF-PA a vloženie LacZ kazety. Na obrázkoch 5 a 6 sú zobrazené delečné/inzerčné plazmidy pCE4 a pCE9, ktoré sa skonštruovali týmto spôsobom, a ktoré sú odvodené od pORF-PA.

Príklad 4.3.2

Jednotlivé reštrikčné miesta v HindlII DNA fragmente sa použili ako východiskové body pre uskutočnenie obojsmernej delécie sekvencií pôsobením endonukleázy Bal31, ako je schematicky zvýraznené na obrázku 6. Na reštrikčnú degradáciu sa v prípade plazmidu pORF-PA použil enzým Styl a pre plazmid pORF1 alebo pORF-XB enzým Xcml, z dôvodu otvorenia génu, ktorý v prvom prípade kóduje VEGF a v druhom prípade proteínkinázu F10L (obrázky 1 a 6). Po pridaní endonukleázy Balí31 sa z reakcie odoberali rovnaké diely každé 2 minúty a potom sa reakcia zastavila. Štiepenie časovo odlišných vzoriek, napríklad reštrikčným enzýmom Bgll, a následná gélová elektroforéza, umožnili odhadnúť veľkosť DNA úseku deletovaného Bal31. Na uzatvorenie DNA koncov pomocou doplňovacej reakcie sa potom použili zmesi vzoriek z vhodných reakčných časov. Potom sa hybridizovali dva komplementárne oligonukleotídy tvoriace nové unikátne Smal, Sali a EcoRV reštrikčné miesta a výsledné dvojvláknové primerové molekuly (označené EcoRV linkery) sa ligázou pripojili k Bal31 produktom s tupými koncami. Po získaní transformovaných baktérií sa izolovala plazmidová DNA a štiepila sa EcoRV, pre

31049/H ktorú sa nenachádzajú v DNA sekvencii PPV HindlII fragmentu I žiadne rozpoznávacie miesta. Každá plazmidová DNA, ktorá má EcoRV miesto preto obsahuje vloženú linkerovú sekvenciu a použije sa potom na ligáciu LacZ kazety s tupými koncami do nového EcoRV miesta. Presnú veľkosť delécie DNA, vytvorenej v každej výslednej rekombinantnej plazmidovej DNA, bolo možné stanoviť pomocou sekvenovania s použitím jednovláknových EcoRV linkerov a s použitím vhodných primerov špecifických pre LacZ gén.

Príklad 5.

Delécia a identifikácia VEGF génu u iných parapoxvírusov

Vedomosti o úseku DNA, ktorý kóduje VEGF v D1701 umožňujú pripraviť špecifické DNA sondy a PCR primery pre identifikáciu tohoto génu u iných parapoxvírusových kmeňov, ktoré sa môžu výrazne líšiť svojimi reštrikčnými profilmi. Doposiaľ sa testovali nasledujúce možnosti: (i) izolácia Taql subfragmentu (366 bp) zpORF-PA ako hybridizačnej sondy predstavujúcej centrálnu časť D1701 VEGF génu; (ii) amplifikácia kompletného VEGF ORF s použitím vhodných syntetických primerov a s následným klonovaním produktu PCR do plazmidov; (iii) použitie primerov, ktoré zahrňujú odlišné časti VEGF génu ako matríc a taktiež ako špecifických hybridizačných sond pre PCR v prítomnosti PPV DNA.

Po rádioaktívnom označení sa tieto sondy s úspechom použili pre Southern a dot/spot blot hybridizáciu s genómovou DNA rôznych izolátov a kmeňov Parapox ovis, Parapox bovis (vírusu bovinnej papulóznej stomatitídy; BPS) a Parapox bovis 2 (vírusu uzlíkov dojičov kráv). Southern blot hybridizácia s definovanými fragmentmi PPV DNA ukázala VEGF-pozitívne signály, čo umožnilo podrobnejšie mapovanie VEGF génov z rôznych PPV.

Navyše, tieto isté sondy sa môžu použiť pre porovnávacie RNA analýzy, ako je Nothern blot hybridizácia, kvôli testovaniu expresie potenciálnych VEGF génov u iných PPV kmeňov.

31049/H

Príklad 6

Tvorba D1701 rekombinantov

BK-KL-3A bunky pestované do zahustenia sa infikovali infekčnou dávkou s MOI (násobok infekcie) 0,1. Dve hodiny neskôr sa infikované bunky podrobili transfekcii s DNA (od 2 po 10 pg), napríklad plazmidu pMT-10, buď pomocou metódy CaPO₄-glycerolového šoku, alebo s použitím transfekčnej súpravy (DOSPER, Boehringer-Mannheim) podľa výrobcových inštrukcií. Tieto bunkové kultúry sa potom inkubovali na selekčnom médiu (HAT médium + MPA kyselina mykofenolová - xantín - 5% FCS) pri 37°C po dobu od troch po šesť dní a v atmosfére 5% CO2 až pokým nebola viditeľná CPE alebo tvorba plakov. V závislosti od stupňa CPE indukovaného vírusom:

(a) Získal sa bunkový lyzát, pripravila sa séria riedení a na BK-KL-3A bunkách sa vykonal plakový test. Pridala sa zmes agarózového média obsahujúca 0,3 mg/ml Bluo-Gal (GIBCO-BRL Life Sciences), aby sa identifikovali modré plaky, ktoré obsahovali LacZ exprimujúce, MPA-rezistentné D1701 rekombinanty.

(b) Potom, čo sa vytvorili jednotlivé plaky sa pridala agaróza/Bluo Gal zmes opísaná v bode (a) a vybrali sa jednotlivé modré plaky.

Vírusy získané v bode (a) alebo (b) sa použili na infikovanie BK-KL-3A buniek tak, ako je opísané nižšie a vykonali sa aspoň ďalšie dve titrácie plakov a purifikácie, až kým sa nezískala 100% homogénna rekombinantná vírusová populácia.

Príklad 7

VEGF promótor

Ako sa načrtlo v Kapitole 3.1, VEGF gén D1701 je skorý gén; špecifická mRNA sa transkribuje vo veľkých množstvách vo vírusom D1701 infikovaných bunkách v čase od dvoch do štyroch hodín po infekcií až po relatívne neskorý čas infekcie. Z tohoto dôvodu by mala byť identifikovaná D1701 VEGF promótorová oblasť veľmi užitočnou pre kontrolu expresie cudzorodých génov, alebo častí týchto génov v rekombinantných PPV vírusoch. Sekvencia, ktorá zahrňuje VEGF promótor (35 až 40 nukleotidov; sekvencia v zozname ID č. 6) sa môže izolovať pomocou (i)

31049/H

PCR s použitím vhodných primerov, ktoré obklopujú promótorovú oblasť, (ii) subklonovaním vhodných DNA fragmentov, alebo (iii) syntézou promótorovej sekvencie vo forme oligonukleotídu.

Potom, čo sa VEGF promótor naviazal ku ktorémukoľvek sledovanému génu alebo k DNA sekvencii, výsledná génová kazeta sa môže použiť pre prípravu rekombinantných PPV podľa ktoréhokoľvek spôsobu opísaného v predchádzajúcich kapitolách.

Príklad 8 kDa gén

Špecifická PCR pre detekciu 10 kDa génu PPV sa stanovila na základe publikovanej sekvencie DNA 10 kDa génu PPV kmeňa NZ-2 (citácia č.8). Po uskutočnení PCR s použitím synteticky pripravených primerov 10k-up (5CAATATGGATAAAATGACGG-3) a 10k-down (5-CAGACGGCAACACAGCG-3), sa dosiahol úspech pri amplifikácii špecifického produktu s veľkosťou 297 bázových párov. Výsledkom následného klonovania (TA klonovacia súprava, Invitrogen Inc.) je plazmid pJS-1, ktorý obsahuje 297 bp CPR produkt ako EcoRI fragment. Sekvenovaním DNA dvoch DNA reťazcov pJS-1 inzercie sa dokázalo, že D1701 kóduje 91-aminokyselinový 10 kDa proteín, ktorý vykazuje 93,3% aminokyselinovú identitu a 96,7% aminokyselinovú podobnosť s NZ-2 PPV kmeňom.

Southern blot hybridizácia s použitím rádioaktívne značeného pJS-1 sa použila na lokalizáciu 10 kDa génu v EcoRI fragmente E (4,25 kbp) D1701 genómu. Obdobne ako v prípade NZ-2 sa tento gén nachádza v pravej časti vírusového genómu a obsahuje štiepne miesto HindlII fragmentov K a G (obrázok 2).

Plazmidy pDE-E1 a pRZ-E1, ktoré obsahujú 4,25 kbp Dl 701 EcoRI fragment E, sa použili pre prípravu plazmidov, v ktorých 10 kDa gén obsahuje inzercie alebo delécie (v podstate tak, ako sa už doteraz opísalo). HindlII štiepne miesto (fragmenty K-G) v N-terminálnom úseku D1701 10 kDa génu (č. 124-č. 129) sekvencia ID č. 11) sa môže použiť tak pre priame vloženie cudzorodej DNA ako i pre deléciu 10 kDa génu (viď dvojsmerná degradácia s Bal31). V prípade posledne menovaného produktu sa zplazmidu pDE-E1 odstránilo druhé HindlII štiepne miesto

31049/H (mnohonásobné klonovacie miesto vektorového plazmidu pSF'T18). Z tohoto dôvodu sa pSPT18 DNA štiepila Hindlll, a potom sa Hindlll štiepne miesto rozrušilo pôsobením Klenow a plazmid sa opätovne spojil ligázou. 4,25 kbp D1701 EcoRI fragment E sa potom klonoval do EcoRI reštrikčného miesta tohoto nového vektorového plazmidu pSPT18dH. Výsledný plazmid, pRZ-E:1 (obrázok 8), teraz obsahuje unikátne Hindlll štiepne miesto v 10 kDa géne, prítomnosť tohoto miesta umožňuje ďalšie jednoduché manipulácie.

Southern blot hybridizácia, s použitím pDE-E1 a pJS-1 ako rádioaktívne značených sond, ako i PCR analýzy, dokázali, že genómy odlišných kmeňov PPV bovis 1 neobsahujú žiadne 10 kDa-špecifické sekvencie. Toto naznačuje, že 10 kDa PPV gén je nie esenciálnym génom (Buttner M. a kol., 1996, citácia č. 10).

3I049/H

Zoznam literatúry

1. Robinson, AJ. and Lyttle, D J. 1992.

Parapoxviruses: Their biology and potential as recombinant vaccines. In: Recombinant poxviruses edts. M.M. Binns and G.L. Smith, CRC Press Inc.

2. Mayr, A. 1990.

Chapter 7 (Ecthyma (Qrf) Virus) in: Vírus Infections of Vertebrates, Vol. 3: Virus Infections of Ruminants, 1990, Elsevier Science Publishers B.V., The Netherlands.

3. Mazur, C., Rangel Filho, F.B. and Galler, R. 1991.

Molecular analysis of contagious pustular dermatitis virus: A simplified method for viral DNA extraction form scrab materiál. J.Virol. Methods 35, 265-272.

4. Mercer, A.A. 1994.

lOth Int. Conf. on Poxviruses and Iridoviruses 30. Apríl - 5. May 1994. Proceedings.

5. Fleming, S.B., Lyttle, D.J., Suílivan, J.T., Mercer, A.A. and Robinson, AJ. 1995.

Genomic analysis of a transposition-deletion variant of orf virus reveals a 3.3 kbp región of non-essential DNA. J. gen. Virol. 76, 2669-2678.

6. Lyttle, D.J., Fraser, K.M., Fleming, S.B., Mercer, A.A. and Robinson, AJ. 1994.

Homologues of vascular orf vírus. J. Virol. 72, 1171-1181.

7. Sutter, G. and Moss, B. 1992.

Nonreplicating vaccinia vector efficiently expresses recombinant genes. Proc.

Natl. Acad. Sci. USA 89, 10847-10851.

b endotheďial growth factor are encoded by the poxvirus

31049/H

8. Naase, M., Nicholson, B.H., Fraser, K.M., Mercer, A.A. and Robinson, AJ. 1991.

An orf vírus sequence showing homology to the 14K. fusion proteín of vaccinia vírus. J.gen. Virol. 72, 1177-1181.

9. Graham, F.L. and van der Eb, AJ. 1973.

A new technique for the assay of infectivity of human adenovirus 5 DNA. Virology 52, 456-467.

10. Biittner, M., Mclnnes, C., von Einem, C., Rziha, H.J. and Haig, D. 1996.

Molecular discrimination of parapoxviruses from different species. 1 Ith Poxvirus and Iridovirus meeting, 4.-9. May, Toledo, Spain.

11. Sambrock, J., Frisch, E.F. and Maniatis, T. 1989.

Molecular Cloning, A laboratory manual, 2nd edition. Cold Spring Harbor Laboratory Press.

12. Jacobs, L., Rziha, H.-J., Kimman, T.G., Gielkens, A.L.J. and von Oirschot, J.T. 1993.

Deleting valine-125 and cystei in glycoprotein gl of pseudorabies vírus strain NIA-3 decreases plaque size and reduces virulence for mice. Árch. Virol. 131,251-264.

13. Virologische Arbeitsmethoden, [Practical Methods in Virology], 1989.

Biochemische und Biophysikalische Methoden, [Biochemical and Biophysical Methods], VEB Fischer Verlag.

14. Sharp, P.A., Berk. AJ. and Berger, S.M. 1980.

Transcription maps of adenovirus. Meth. Enzymol. 65, 750-768.

15. Watson, J.D., Hopkins, N.H., Roberts, J.W., Seitz, J.A. and Weiner, A.M. 1987.

Molecular Biology of the Gene, Benjamin/Cummins Publishing Company,

31049/H

Menlo Park.

16.

H

F^lkner, F.G. and Moss, B. 1988.

Escherichia coli gpt gene provides dominánt selection for vaccinia virus open reading frame expression vectors. J.Virol. 62, 1849-1854

17. Boyle, D.B. and Coupar, B.E. 1988.

Construction of recombinant fowípox viruses as vectors for poultry vaccines.

Virus Res. 10, 343-356.

18. Methods in Virology, Vol. VI, 1977.

edts. Maramorosch, K. and Koprowski H. Academic Press. New York, San Francisco.

19. Hattori, M. and Sakaki Y. 1986.

Dideoxy sequencing method using denaturated plasmid templates. Anál.

Biochem. 152, 232-238.

20. Chomczynski, P. and Sacchi, N. 1987.

Single step method of RNA isólation by acid guanidinium-thiocyanate-phenolchloroform extraction. Ana. Biochem. 162, 156-159.

31049/H

ID č. 1

Sekvencia ID č. 1 tejto patentovej prihlášky ukazuje VEGF gén, ktorý je lokalizovaný na HindlII fragmente I PPV kmeňa D1701.

Ďalšie informácie:

Skorý promótor:	Nukleotidy 50 až 64
Začiatok mRNA:	Nukleotidy 78 až 80
Koniec mRNA:	Nukleotidy 498 až 500
Začiatok translácie:	Nukleotidy 92 až 94
Koniec translácie:	Nukleotidy 488 až 490

ID č. 2

Sekvencia ID č. 2 tejto patentovej prihlášky ukazuje proteínkinázový gén F10L (verzia 1), ktorý je lokalizovaný na HindlII fragmente I PPV kmeňa D1701.

Ďalšie informácie:

Neskorý promótor:	Nukleotidy 48 až 66
Začiatok mRNA:	Nukleotidy 74 až 78
Začiatok translácie:	Nukleotidy 94 až 96
Koniec translácie:	Nukleotidy 1738 až 1740

ID č. 3

Sekvencia ID č. 3 tejto patentovej prihlášky ukazuje HD1R génový úsek, ktorý je lokalizovaný na HindlII fragmente I PPV kmeňa D1701.

31049/H

ID č. 4

Sekvencia ID č. 4 tejto patentovej prihlášky ukazuje ITR oblasť, ktorá je

lokalizovaná na Hindlll fragmente 1 v tejto oblasti.

1 PPV kmeňa D1701 a gén ORF3, ktorý sa našiel

Ďalšie informácie:

Začiatok ITR oblasti:	Nukleotid 7
Skorý promótor:	Nukleotidy 18 až 33
Začiatok ORF3mRNA:	Nukleotidy 40 až 41
Koniec ORF3mRNA:	Nukleotidy 673 až 679
Začiatok translácie ORF3:	Nukleotidy 111 až 113
Koniec translácie ORF3:	Nukleotidy 562 až 564

ID č. 5

Sekvencia ID č. 5 tejto patentovej prihlášky ukazuje homológ F9L génu (verzia 1), ktorý je lokalizovaný na Hindlll fragmente I PPV kmeňa D1701.

Ďalšie informácie:

Štartovací kodón:

Stop kodón:

Nukleotidy 48 až 50

Nukleotidy 861 až 863

ID č. 6

Sekvencia ID č. 6 tejto patentovej prihlášky ukazuje VEGF promótorovú oblasť, ktorá je lokalizovaná na Hindlll fragmente I PPV kmeňa D1701.

31049/H

ID č. 7

Sekvencia ID č. 7 tejto patentovej prihlášky ukazuje medzigénovú oblasť, ktorá je umiestnená medzi génmi HD1R a PKF10L a je lokalizovaná na HindlII fragmente I PPV kmeňa D1701.

Predpokladané ukončenie translácie HD1R:	Nukleotidy 25 až 27
Začiatok translácie PKF10L:	Nukleotidy 223 až 225

IDč. 8

Sekvencia ID č. 8 tejto patentovej prihlášky ukazuje úplnú nukleotidovú sekvenciu HindlII fragmentu I (verzia 1) PPV kmeňa D1701.

ID č. 9

Sekvencia ID č. 9 tejto patentovej prihlášky ukazuje verziu 2 proteínkinázového génu F10L, ktorý je lokalizovaný na HindlII fragmente I PPV kmeňa D1701.

Ďalšie informácie:

Neskorý promótor:

RNA štartovací signál:

Začiatok mRNA:

Začiatok translácie:

Koniec translácie:

ID č. 10

Nukleotidy 48 až 66

Nukleotidy 72 až 80

Nukleotidy 74 až 78

Nukleotidy 94 až 96

Nukleotidy 1585 až 1588

Sekvencia ID č. 10 tejto patentovej prihlášky ukazuje verziu 2 homológu F9L génu, ktorý je lokalizovaný na HindlII fragmente I PPV kmeňa D1701.

Ďalšie informácie:

31049/H

Začiatok translácie:	Nukleotidy 50 až 52
Koniec translácie:	Nukleotidy 722 až 724

ID č. 11

Sekvencia ID č. 11 tejto patentovej prihlášky ukazuje 10 kDa gén, ktorý je lokalizovaný na EcoRI fragmente E PPV kmeňa D1701.

Ďalšie informácie:

Začiatok translácie:	Nukleotidy 5 až 7
Koniec translácie:	Nukleotidy 275 až 277

ID č. 12

Sekvencia ID č. 12 tejto patentovej prihlášky ukazuje úplnú nukleotidovú sekvenciu verzie 2 Hindlll fragmentu I PPV kmeňa D1701.

ID č. 13

Sekvencia ID č. 13 tejto patentovej prihlášky ukazuje verziu 3 proteínkinázového génu F10L, ktorý je lokalizovaný na Hindlll fragmente I PPV kmeňa D1701.

Ďalšie informácie:

Neskorý promótor:	Nukleotidy 48 až 66
RNA štartovací signál:	Nukleotidy 72 až 80
Začiatok mRNA:	Nukleotidy 74 až 78
Začiatok translácie:	Nukleotidy 94 až 96
Koniec translácie:	Nukleotidy 1585 až 1588

31049/H

ID č. 14

Sekvencia ID č. 14 ukazuje aminokyselinovú sekvenciu homológu proteínkinázy F10L PPV kmeňa D1701 (odvodenú zo sekvencie ID č. 13).

ID č. 15

Sekvencia ID č. 15 ukazuje aminokyselinovú sekvenciu homológu VEGF PPV kmeňa D1701 (odvodenú zo sekvencie ID č. 1).

ID č. 16

Sekvencia ID č. 16 ukazuje aminokyselinovú sekvenciu homológu F9L PPV kmeňa D1701 (odvodenú zo sekvencie ID č. 10).

31049/H

Zoznam sekvencii (1) Všeobecné informácie:

(1) Žiadateľ:

(A) Meno: Bayer AG (B) Ulica: Beyerwerk (C) Mesto: Leverkusen (D) Krajina: Nemecká Spolková Republika (E) Poštové smerovacie číslo (PSČ): D-51368 (F) Telefón: 0214/3061285 (G) Telefax: 0214/303482 (ii) Názov vynálezu: Parapockenviren die Fremd-DNA enthalten, ihre Herstellung und ihre Verwendung in Impfstoffen (Parapoxvírusy obsahujúce cudzorodú DNA, ich príprava a použitie vo vakcínach) (iii) Počet sekvencii: 16 (iv) Počítačom čitateľná forma:

(A) Typ média: Disketa (B) Počítač: IBM PC kompatibilný (C) Operačný systém: PC-DOS/MS-DOS (D) Software: Patentln uvedenie č. 1.0, verzia 1.30 (EPO) (2) Informácie pre sekvenciu ID č. 1:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 540 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: dvojvláknová (D) Usporiadanie: lineárna

31049/H (ii) Typ molekuly: DNA (genómová) (iii) Hypotetická: Nie (iv) Antizmyslová: Nie (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Organizmus: Parapox ovis (B) Kmeň: D1701-VEGF gén (xi) Popis sekvencie: Sekvencia ID č. 1:

GGTGCGCTAC	CAATTCGCGC	GGCCGGCCGC	GCTGCGCGCG	TAGCCGCGCA	AAATGTAAAT	60
TATAACGCCC	AACTTTTAAG	GGTGAGGCGC	CATGAAGTTT	CTCGTCGGCA	TACTGGTAGC	120
TGTGTGCTTG	CACCAGTATC	TGCTGAACGC	GGACAGCACG	AAAACATGGT	CCGAAGTGTT	180
TGAAAACAGC	GGGTGCAAGC	CAAGGCCGAT	GGTCTTTCGA	GTACACGACG	AGCACCCGGA	240
GCTAACTTCT	CAGCGGTTCA	ACCCGCCGTG	TGTCACGTTG	ATGCGATGCG	GCGGGTGCTG	300
CAACGACGAG	AGCTTAGAAT	GCGTCCCCAC	GGAAGAGGCA	AACGTAACGA	TGCAACTCAT	360
GGGAGCGTCG	GTCTCCGGTG	GTAACGGGAT	GCAACATCTG	AGCTTCGTAG	AGCATAAGAA	420
ATGCGATTGT	AAACCACCAC	TCACGACCAC	GCCACCGACG	ACCACAAGGC	CGCCCAGAAG	480
ACGCCGCTAG	AACTTTTTAT	GGACCGCATA	TCCAAACGAT	GATGCGATCA	GGTCATGCGG	540

31049/H (2) Informácie pre sekvenciu ID č. 2:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 1740 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: dvojvláknová (D) Usporiadanie: lineárna (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (iii) Hypotetická: Nie (iv) Antizmyslová: Nie (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Organizmus: Parapox ovis (B) Kmeň: D1701-proteínkinázový gén (verzia 1) (xi) Popis sekvencie: Sekvencia ID č. 2:

CGAGTGACTG	CCCATCCCGT	TGCTGCGCGA	CTCGGGACTG	CCCTCTGTTT	TTCTTTCCCG	60
TTTCTTCTTA	TTAGGTAGTT	GTTGCCCACC	TCCATGATCC	TCGCACGCGC	TGGCGGGCGA	120
CCTCGCACGC	CCGCGGCGGC	CGCGGCGGQC	GCCGAGGACG	GCAAGAACAG	TGATCGCCGG	180
AAGCGCAAGC	GCAAGACGCC	CAACTGCGAA	GACGCCGACA	ACTCCGACGA	CGAGCTAGCG	240
CAGACGCCGT	GCGACCGCGA	GTGGCCGGAC	TGTCGCGCGA	GCTCGATCAC	GAGCTCCGAC	300
TCGGTCTCTC	TCGGCGACGA	GATCTACTTG	CGGTACGTAG	CCTCGCAGGT	GGACTTCGCG	360
CAGACCTGGG	CCCCGCCGGT	GCGGCTGCTG	CGCTTCTTCG	GGAACTTCTC	GAAGGAAACG	420
CTCAGCCGCA	TGTCGCGGCG	CGGGTACGTG	AACCGCTCCT	ACTTCCAGAT	GGCGCACGCG	480
CGCTTCTCGC	CCACCAACGA	CGACATGTAC	CACATGGCCA	CTGGCGGGTA	CGGCATCGTG	540
TTCCGCTTCG	ACCGCTACGT	GGTCAAGTAC	GTCTTCGAGC	ACCGCAACGG	CATGTCCGAG	600
ATGGACGCCT	CTACGGAGTA	CACGGTGCCG	CGGTTCCTGC	GCAATAACCT	CAAGGGCGAC	660

31049/H

GAGCGCGAGT	TCGTGGTCTG	CGCGCTGGCC	ATGGGGCTGA	ACTACCGGCT	GGGCTTCCTG	720
CACTCGCTGT	ACCGGCGCGT	GCTGCACACG	CTGCTGCTGC	TCATGCGCGT	GGAGGAAGGC	780
CAGCGGCCCT	CGGTAGAGAT	GGCCAAGAAG	CCGCTGCTGC	GCTGGTTCGA	GGCGCGCAAG	840
GACAGCGAGT	CCTTCGTGCG	CCTGGTCTCG	TACTTCTACC	CCTCGGCCGT	GCAGAGCAAC	900
GTGAACCTGA	TCAACAACTT	CCACCACCTG	GTGCACTTCT	TTGAGCACGA	GAAGCGCGCG	960
CGGTACGTGT	TCGACCGCGG	GGCCGTGATC	GTGTTCCCTC	TGGCGCGCGG	GTCCGCGGAC	1020
TCGATCTCGC	CGGAGGCGGC	GGCAGCGCTG	GGCTTCGCGC	CGCACTCGGA	GTTCCTCAAG	1080
TTCGTGTTCC	TGCAGATCGC	GCTGCTGTAC	CTGAAGATAT	ACGAGCTCCC	GGGCTGCACG	1140
AACTTCCTGC	ACGTGGACCT	GAAGCCCGAC	AACGTGCTCA	TCTTCGACAG	CGCGCGCGCT	1200
CAGCGTGACT	GCGGCCGGTG	CGACTTTTCG	CTTCGAAGAG	CCCGTGCGCG	CGGCGCTGAA	1260
CGACTTCGAC	TTCGCGCGCG	TGGCCACCAT	CGAGAACCGC	AAGATCGCGG	GCAGCGTCCG	1320
CGTGCCGCAG	AACTGGTACT	ACGACTTCCA	CTTCTTCGCG	CACACGCTGC	TGCGCGCGTA	1380
CCCGCACATC	GCCGCGGAGG	ACCCGGGCTT	CCACGCGCTG	CTCTCGGAGC	TCACGGTCTC	1440
GTGCTCGCGC	GGGACCTGCG	ACCGCTTCCG	GCTGCGCGTG	TCCTCGCCGC	ACCCCATCGA	1500
GCACCTCGCG	CGGCTGGTGC	GCCGCGACGT	CTTCTCCCGC	TGGATAAATG	CCGCCGCGGA	1560
CGCCCCCGAC	GCCGCACTCT	CCTGAGCCCA	CGCCCGCGGC	GCCGGGCTCG	CTGTACGACG	1620
TCTTCCTCGC	GCGCTTCCTG	CGCCAGCTGG	CCGCGCGCGC	GGCGCCGGCC	TCGGCCGCCT	1680
GCGCCGTGCG	CGTGGGTGCG	GTGCGCGGCC	GCCTGCGGAA	CTGCGAGCTG	GTGGTGCTGA	1740

31049/Η (2) Informácie pre sekvenciu ID č. 3:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 1080 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: dvojvláknová (D) Usporiadanie: lineárna (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (iii) Hypotetická: Nie (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Organizmus: Parapox ovis (B) Kmeň: D1701-HD1R génová oblasť (xi) Popis sekvencie: Sekvencia ID č. 3:

AAGCTTGTTG	CGCGAGTACG	TGGTGACCCG	CGCCTACTCG	GATCAGACCG	AGCCGATCAT	60
GGACTTGCTC	ATCGGCATGG	GCGCCGACGT	GGACATGCAG	GTCGGCGTGT	GCCGCACGGC	120
GCTGCACGCC	TGCCTTACGG	GCTTGAACAC	GAACCCGTGC	ATGATTCGCG	CGCTGCTTCG	180
GCGCGGCGCC	AGCGTGACCG	CAAAAGACAC	CTACGAGATG	ACGCCACTGG	CGTGTTGCTG	240
AAGTCCGCGA	GCGCGACGCC	GGAGCTCGTG	CGCATCCTCG	TGGAAGCAGG	CTCCGACGTG	300
AGCGCCACCG	ACTTCCGCCT	CAACGGCATG	CTGCACCAGC	ACGCAGTCCA	CGCGCCCGCG	360
CGCGAGCGTC	ATGCGCGAGC	TCATCCGGCT	GGGGTGCAGC	CCAGCGGCCA	AAAACATGTT	420
TGGGAACACG	CCGATGCACA	TGCTGGCCAT	GGAAAGCTCC	TGCCGCCGCT	CGCTGATCCT	480
CCCGCTGCTG	GAGGCAGGGC	TTTCCGTGAA	CGAGGAGAAC	CTGCACTACG	GCACCGTGCC	540
TCTGCACGTG	GCCTCGGGGT	ACGACAACAC	GCAGGGCTGC	CTCAAGCTCC	TCCGGCAGGG	600
AGGAGACCCC	ACCGTCGTGT	CAGCCGCCGG	ACGCACACCG	ATCTCGAACA	TGCTCGTCAA	660
AGCCAACCAC	GTGGCGGTCG	CCGGCGCGCT	GTCGACGCAC	CCGAGCGCGG	CAGTGGTCGT	720
GCAGGCTCTC	GAGCAGGCTC	TCGAGAACGT	GCTGAACGCC	GGGCCCAGCG	AGGCCTCGCG	780

31049/H

GCTCGCCGTG GCCTTTGTGG TGGCGCGCGC CGGCGCATCC GCGCTACCGG	AGGCCGTGCG	840
CCGTCTTCAC GAGGGCTTCG TCGCCGACTG CGAGCGCGAA GTCGCGTTGC	TTTCCCGCAG	900
CATGCTCGGC ACACCGGCCG TGAGCGCGCT GGTCGTGCTG GTCAGCAAGG	AGGTCTTTGG	960
CACTGTTATC TCCTCGCGTG CGCTGCGCGT CGCGCGGGAG GTCCGCGTGT	ACGCAAGGCC	1020
GCTCCGCGAG GCGCTCATAA ATCTGCGCCA CAAATGCCGC TTAGTTTCCA	GCCTTAAAAG	1080

(2) Informácie pre sekvenciu ID č. 4:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 1616 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: dvojvláknová (D) Usporiadanie: lineárna (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (iii) Hypotetická: Nie (iv) Antizmyslová: Nie (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Organizmus: Parapox ovis (B) Kmeň: D1701-ITR a ORF3 gén (xi) Popis sekvencie: Sekvencia ID č. 4:

AAGGAGGCTC	CACGGAGCAA	AGTGAAAAAG	GACCGCCTAG	AGTCGAGACC	CCTCCCTCCC	60
GCCTCGGGCA	AACCCACAGC	CGCCGCAAAC	ACCACACCCG	CCGACCTACC	ATGCACCCCT	120
CGCCGCGCCG	GCTGCTCGGC	GCGCTCGCGC	TGCTGGCGCT	GGGCTTCGCT	CGGCGCGCTC	180
TTCGCCCCGC	GGCGCCGCTC	GTGCCGGCCG	CCTTCCTGGA	GGTGGGGCAC	GTGCGCGCGA	240
ACCCGTCCGC	CTCGGTGACC	TGCCTCACGG	TGGGCGGCGA	CGGGCGGCAC	ATGGCGGCGG	300

31049/H

TCGCGCACGG	CGGCGGGACG	CTCTCGCCGG	TGTACCCGCT	GGCCGCCGGC	ATGCACGCGA	360
CCTTCTCCTC	CGCGCGCAAG	GGCGCGCTGC	TGCTGAACGT	CGCGACCGTG	ACTGTGTACG	420
ACGTGCGCGC	GCTCGCCCCC	GAGTTCGAGC	TCGTCTGCAT	CGCGGTGGTC	GGCGGCTACA	480
ACTCGGCCGC	GGCCGCCACG	CGGCCCGCGG	CCGAGTGGCA	CCGCCAGCTG	GAGCTGCGCC	540
GCTCGGAGCT	GTGACCCCTC	CCTCCCCGGT	CTCCCTCTGT	CTTTGTAATC	GGCCTTAGAG	600
ATTAGACATC	ATCCTCCACG	CCTCTTTGTC	CGCCGCCCTT	CTTCGCGGAC	GGATGAACCA	660
ATTAATTAAT	TATTTTTGTC	GCTCGCCCGC	TCACTCCGGC	AAGGGAACGA	GTGACGTTAA	720
CTCTCTCACC	CTCACGCACA	AGAACAAGAA	CCGCTCACTC	ACCGGGCAAG	GGAACACGGT	780
TAAGGTCAAC	TCACTCGCGA	GAACAAGTTG	ACCCTCACTC	TAGAGAACGA	GGAACGGGCA	840
ACAAGCAACC	GTCAACTCAC	TTACCACGAG	AACAAGTTGA	CCGCCACTCA	AAGGGAACAG	900
AGAACAGTAA	CCGTTCTCGC	TCGCTCGGAA	CAATAGAACA	AGTTAACGTC	AACTCGCTCG	960
CTCGGTGTAA	GAGAACAACA	GAACAAGCAA	CTGTTGACCA	CTCAACCCCC	GGAGAAGAGA	1020
ACAAGAGAGC	AGTCAACTCA	CCCACTCAGT	CTTGGATGAG	AGGAGGACGA	GTTAACGAGT	1080
ACTCGCACGC	AGAGTGAGAG	AGTGAGGACA	TAATAATAGT	TAACGAGTTA	ATACTCACTC	1140
GCTCACTCAG	AGTGAGAGAG	AACCAGTGAG	CGAGTTAACC	GCGCACACGA	GCGAGAGAAC	1200
AGTGAACTGC	TCGCGCGCTC	GCTCGGTAGC	AGTCGGCCTT	TCTTAAAACG	GTTCGTAAAA	1260
CTTTTCCCGA	GACAGTTCAC	CCTCCAAAAC	TTTTAAAACT	AAACTCGGAG	GTGGCCTGCC	1320
CTCCACTCTC	CGTAAAACTT	TTGTAAAACT	GTCGGAGGTC	GGTCGACTTC	GCAACTCGTC	1380
CGCGAAAACT	TTTCGTGGGC	AGTGTCTGCC	TCTCTCAGGC	TCCTCGCATC	ACTTTCGCGG	1440
AGCCTCGAGG	TAGGTCACCT	CTCTCCAAAC	TTTTGTAAAA	actttttcgc	GGAGCCTCTG	1500
GAGGCCGTCC	TCCCTCCAAA	ACTTTTCGTA	AAATCTCTTC	GGAGGCCGTC	CTCCCTCCAA	1560
AACTTTTCGT	AAAATCTTTG	GGAGGTCGAC	CTCCCTCAAA	ACTTTTTATA	AAGCTT	1616

31049/H (2) Informácie pre sekvenciu ID č. 5:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 900 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: dvojvláknová (D) Usporiadanie: lineárna (ii) Typ molekuly: DNA (genómová) (iii) Hypotetická: Nie (iv) Antizmyslová: Nie (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Organizmus: Parapox ovis (B) Kmeň: D1701-F9L gén (verzia 1) (xi) Popis sekvencie: Sekvencia ID č. 5:

GCACCTCGCG	CGGCTGGTGC	GCCGCGACGT	CTTCTCCCGC	TGGATAAATG	CCGCCGCGGA	60
CGCCCCCGAC	GCCGCACTCT	CCTGAGCCCA	CGCCCGCGGC	GCCGGGCTCG	CTGTACGACG	120
TCTTCCTCGC	GCGCTTCCTG	CGCCAGCTGG	CCGCGCGCGC	GGCGCCGGCC	TCGGCCGCCT	180
GCGCCGTGCG	CGTGGGTGCG	GTGCGCGGCC	GCCTGCGGAA	CTGCGAGCTG	GTGGTGCTGA	240
ACCGCTGCCA	CGCGGACGCT	GCCGGCGCGC	TCGCGCTGGC	CTCCGCGGCG	CTGGCGGAAA	300
CGCTGGCGGA	GCTGCCGCGC	GCGGACAGGC	TCGCCGTCGC	GCGCGAGCTG	GGCGTGGACC	360
CAGAGCACCC	GGAGCTGACG	CCGGACCCCG	CCTGCGCGGG	CGAGAGGCGC	GCTTGCGCAG	420
AACATCGACA	TCCAGACGCT	GGACCTGGGC	GACTGCGGCG	ACCCCAAAGG	CCGCCGACTG	480
CGCGTGGCGC	TGGTGAACAG	CGGCCACGCG	GCCGCAAACT	GCGCGCTCGC	GCGCGTAGCG	540
ACCGCGCTGA	CGCGCCGCGT	GCCCGCAAGC	CGGCACGGCC	TCGCGGAGGG	CGGCACGCCG	600
CCGTGGACGC	TGCTGCTGGC	GGTGGCCGCG	GTGACGGTGC	TCAGCGTGGT	GGCGGTTTCG	660
CTGCTGCGGC	GCGCGCTGCG	GGTGCGCTAC	CAATTCGCGC	GGCCGGCCGC	GCTGCGCGCG	720

31049/H

TAGCCGCGCA	AAATGTAAAT	TATAACGCCC	AACTTTTAAG	GGTGAGGCGC	CATGAAGTTT	780
CTCGTCGGCA	TACTGGTAGC	TGTGTGCTTG	CACCAGTATC	TGCTGAACGC	GGACAGCACG	840
AAAACATGGT	CCGAAGTGTT	TGAAAACAGC	GGGTGCAAGC	CAAGGCCGAT	ggtctttcga	900

(2) Informácie pre sekvenciu ID č. 6:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 94 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: dvojvláknová (D) Usporiadanie: lineárna (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (iii) Hypotetická: Nie (iv) Antizmyslová: Nie (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Organizmus: Parapox ovis (B) Kmeň: D1701-VEGF promótor (xi) Popis sekvencie: Sekvencia ID č. 6:

CCGCGCTGCG CGCGCGTAGC CGCGCAAAAT GTAAATTATA ACGCCCAACT TTTAAGGGTG 60

AGGCGCCATG AAGTTTCTCG TCGGCATACT GGTA

J

31049/H (2) Informácie pre sekvenciu ID č. 7:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 250 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: dvojvláknová (D) Usporiadanie: lineárna (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (iii) Hypotetická: Nie (iv) Antizmyslová: Nie (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Organizmus: Parapox ovis (B) Kmeň: D1701-medzigénová oblasť medzi HD1R a proteínkinázovým génom (xi) Popis sekvencie: Sekvencia ID č. 7:

CAAATGCCGC	TTAGTTTCCA	GCCTTAAAAG	GCAAGTGGGA	CCCTGCTCGC	TGCCCGGCGA	60
ACTGGTGGAG	CGCGTGCTCG	CGACCGTGCC	ACTGGCCGAC	TTGCGCCGCT	CGTGCAGCCG	120
CCGCGCGCCC	GAGTGACTGC	CCATCCCGTT	GCTGCGCGAC	TCGGGACTGC	CCTCTGTTTT	180
TCTTTCCCGT	TTCTTCTTAT	TAGGTAGTTG	TTGCCCACCT	CCATGATCCT	CGCACGCGCT	240

GGCGGGCGAC 250 (2) Informácie pre sekvenciu ID č. 8:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 5515 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina

31049/H (C) Počet vlákien: dvojvláknová (D) Usporiadanie: lineárna (ii) Typ molekuly: DNA (genómová) (iii) Hypotetická: Nie (iv) Antizmyslová: Nie (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Organizmus: Parapox ovis (B) Kmeň: D1701 -HindlII fragment I (verzia 1) (xi) Popis sekvencie: Sekvencia ID č. 8:

AAGCTTGTTG	CGCGAGTACG	TGGTGACCCG	CGCCTACTCG	GATCAGACCG	AGCCGATCAT	60
GGACTTGCTC	ATCGGCATGG	GCGCCGACGT	GGACATGCAG	GTCGGCGTGT	GCCGCACGGC	120
GCTGCACGCC	TGCCTTACGG	GCTTGAACAC	GAACCCGTGC	ATGATTCGCG	CGCTGCTTCG	180
GCGCGGCGCC	AGCGTGACCG	CAAAAGACAC	CTACGAGATG	ACGCCACTGG	CGTGTTGCTG	240

31049/H

AAGTCCGCGA	GCGCGACGCC	GGAGCTCGTG	CGCATCCTCG	TGGAAGCAGG	CTCCGACGTG	300
AGCGCCACCG	ACTTCCGCCT	CAACGGCATG	CTGCACCAGC	ACGCAGTCCA	CGCGCCCGCG	360
CGCGAGCGTC	ATGCGCGAGC	TCATCCGGCT	GGGGTGCAGC	CCAGCGGCCA	AAAACATGTT	420
TGGGAACACG	CCGATGCACA	TGCTGGCCAT	GGAAAGCTCC	TGCCGCCGCT	CGCTGATCCT	480
CCCGCTGCTG	GAGGCAGGGC	TTTCCGTGAA	CGAGGAGAAC	CTGCACTACG	GCACCGTGCC	540
TCTGCACGTG	GCCTCGGGGT	ACGACAACAC	GCAGGGCTGC	CTCAAGCTCC	TCCGGCAGGG	600
AGGAGACCCC	ACCGTCGTGT	CAGCCGCCGG	ACGCACACCG	ATCTCGAACA	TGCTCGTCAA	660
ACGCAACCAC	GTGGCGGTCG	CCGGCGCGCT	GTCGACGCAC	CCGAGCGCGG	CAGTGGTCGT	720
GCAGGCTCTC	GAGCAGGCTC	TCGAGAACGT	GCTGAACGCC	GGGCCCAGCG	AGGCCTCGCG	780
GCTCGCCGTG	GCCTTTGTGG	TGGCGCGCGC	CGGCGCATCC	GCGCTACCGG	AGGCCGTGCG	840
CCGTCTTCAC	GAGGGCTTCG	TCGCCGACTG	CGAGCGCGAA	GTCGCGTTGC	TTTCCCGCAG	900
CATGCTCGGC	ACACCGGCCG	TGAGCGCGCT	GGTCGTGCTG	GTCAGCAAGG	AGGTCTTTGG	960
CACTGTTATC	TCCTCGCGTG	CGCTGCGCGT	CGCGCGGGAG	GTCCGCGTGT	ACGCAAGGCC	1020
GCTCCGCGAG	GCGCTCATAA	ATCTGCGCCA	CAAATGCCGC	TTAGTTTCCA	GCCTTAAAAG	1080
GCAAGTGGGA	CCCTGCTCGC	TGCCCGGCGA	ACTGGTGGAG	CGCGTGCTCG	CGACCGTGCC	1140
ACTGGCCGAC	TTGCGCCGCT	CGTGCAGCCG	CCGCGCGCCC	GAGTGACTGC	CCATCCCGTT	1200
GCTGCGCGAC	TCGGGACTGC	CCTCTGTTTT	TCTTTCCCGT	TTCTTCTTAT	TAGGTAGTTG	1260
TTGCCCACCT	CCATGATCCT	CGCACGCGCT	GGCGGGCGAC	CTCGCACGCC	CGCGGCGGCC	1320
GCGGCGGCCG	CCGAGGACGG	CAAGAACAGT	GATCGCCGGA	AGCGCAAGCG	CAAGACGCCC	1380
AACTGCGAAG	ACGCCGACAA	CTCCGACGAC	GAGCTAGCGC	AGACGCCGTG	CGACCGCGAG	1440
TGGCCGGACT	GTCGCGCGAG	CTCGATCACG	AGCTCCGACT	CGGTCTCTCT	CGGCGACGAG	1500
ATCTACTTGC	GGTACGTAGC	CTCGCAGGTG	GACTTCGCGC	AGACCTGGGC	CCCGCCGGTG	1560

31049/Η

CGGCTGCTGC	GCTTCTTCGG	GAACTTCTCG	AAGGAAACGC	TCAGCCGCAT	GTCGCGGCGC	1620
GGGTACGTGA	ACCGCTCCTA	CTTCCAGATG	GCGCACGCGC	GCTTCTCGCC	CACCAACGAC	1680
GACATGTACC	ACATGGCCAC	TGGCGGGTAC	GGCATCGTGT	TCCGCTTCGA	CCGCTACGTG	1740
GTCAAGTACG	TCTTCGAGCA	CCGCAACGGC	ATGTCCGAGA	TGGACGCCTC	TACGGAGTAC	1800
ACGGTGCCGC	GGTTCCTGCG	CAATAACCTC	AAGGGCGACG	AGCGCGAGTT	CGTGGTCTGC	1860
GCGCTGGCCA	TGGGGCTGAA	CTACCGGCTG	GGCTTCCTGC	ACTCGCTGTA	CCGGCGCGTG	1920
CTGCACACGC	TGCTGCTGCT	CATGCGCGTG	GAGGAAGGCC	AGCGGCCCTC	GGTAGAGATG	1980
GCCAAGAAGC	CGCTGCTGCG	CTGGTTCGAG	GCGCGCAAGG	ACAGCGAGTC	CTTCGTGCGC	2040
CTGGTCTCGT	ACTTCTACCC	CTCGGCCGTG	CAGAGCAACG	TGAACCTGAT	CAACAACTTC	2100
CACCACCTGG	TGCACTTCTT	TGAGCACGAG	AAGCGCGCGC	GGTACGTGTT	CGACCGCGGG	2160
GCCGTGATCG	TGTTCCCTCT	GGCGCGCGGG	TCCGCGGACT	CGATCTCGCC	GGAGGCGGCG	2220
GCAGCGCTGG	GCTTCGCGCC	GCACTCGGAG	TTCCTCAAGT	TCGTGTTCCT	GCAGATCGCG	2280
CTGCTGTACC	TGAAGATATA	CGAGCTCCCG	GGCTGCACGA	ACTTCCTGCA	CGTGGACCTG	2340
AAGCCCGACA	ACGTGCTCAT	CTTCGACAGC	GCGCGCGCTC	AGCGTGACTG	CGGCCGGTGC	2400
GACTTTTCGC	TTCGAAGAGC	CCGTGCGCGC	GGCGCTGAAC	GACTTCGACT	TCGCGCGCGT	2460
GGCCACCATC	GAGAACCGCA	AGATCGCGGG	CAGCGTCCGC	GTGCCGCAGA	ACTGGTACTA	2520
CGACTTCCAC	TTCTTCGCGC	ACACGCTGCT	GCGCGCGTAC	CCGCACATCG	CCGCGGAGGA	2580
CCCGGGCTTC	CACGCGCTGC	TCTCGGAGCT	CACGGTCTCG	TGCTCGCGCG	GGACCTGCGA	2640
CCGCTTCCGG	CTGCGCGTGT	CCTCGCCGCA	CCCCATCGAG	CACCTCGCGC	GGCTGGTGCG	2700
CCGCGACGTC	TTCTCCCGCT	GGATAAATGC	CGCCGCGGAC	GCCCCCGACG	CCGCACTCTC	2760
CTGAGCCCAC	GCCCGCGGCG	CCGGGCTCGC	TGTACGACGT	CTTCCTCGCG	CGCTTCCTGC	2820
GCCAGCTGGC	CGCGCGCGCG	GCGCCGGCCT	CGGCCGCCTG	CGCCGTGCGC	GTGGGTGCGG	2880

31049/H

TGCGCGGCCG	CCTGCGGAAC	TGCGAGCTGG	TGGTGCTGAA	CCGCTGCCAC	GCGGACGCTG	2940
CCGGCGCGCT	CGCGCTGGCC	TCCGCGGCGC	TGGCGGAAAC	GCTGGCGGAG	CTGCCGCGCG	3000
CGGACAGGCT	CGCCGTCGCG	CGCGAGCTGG	GCGTGGACCC	AGAGCACCCG	GAGCTGACGC	3060
CGGACCCCGC	CTGCGCGGGC	GAGAGGCGCG	CTTGCGCAGA	ACATCGACAT	CCAGACGCTG	3120
GACCTGGGCG	ACTGCGGCGA	CCCCAAAGGC	CGCCGACTGC	GCGTGGCGCT	GGTGAACAGC	3180
GGCCACGCGG	CCGCAAACTG	CGCGCTCGCG	CGCGTAGCGA	CCGCGCTGAC	GCGCCGCGTG	3240
CCCGCAAGCC	GGCACGGCCT	CGCGGAGGGC	GGCACGCCGC	CGTGGACGCT	GCTGCTGGCG	3300
GTGGCCGCGG	TGACGGTGCT	CAGCGTGGTG	GCGGTTTCGC	TGCTGCGGCG	CGCGCTGCGG	3360
GTGCGCTÄCC	AATTCGCGCG	GCCGGCCGCG	CTGCGCGCGT	AGCCGCGCAA	AATGTAAATT	3420
ATAACGCCCA	ACTTTTAAGG	GTGAGGCGCC	ATGAAGTTTC	TCGTCGGCAT	ACTGGTAGCT	3480
GTGTGCTTGC	ACCAGTATCT	GCTGAACGCG	GACAGCACGA	AAACATGGTC	CGAAGTGTTT	3540
GAAAACAGCG	GGTGCAAGCC	AAGGCCGATG	GTCTTTCGAG	TACACGACGA	GCACCCGGAG	3600
CTAACTTCTC	AGCGGTTCAA	CCCGCCGTGT	GTCACGTTGA	TGCGATGCGG	CGGGTGCTGC	3660
AACGACGAGA	GCTTAGAATG	CGTCCCCACG	GAAGAGGCAA	ACGTAACGAT	GCAACTCATG	3720
GGAGCGTCGG	TCTCCGGTGG	TAACGGGATG	CAACATCTGA	GCTTCGTAGA	GCATAAGAAA	3780
TGCGATTGTA	AACCACCACT	CACGACCACG	CCACCGACGA	CCACAAGGCC	GCCCAGAAGA	3840
CGCCGCTAGA	ACTTTTTATG	GACCGCATAT	CCAAACGATG	ATGCGATCAG	GTCATGCGGA	3900
AGGAGGCTCC	ACGGAGCAAA	GTGAAAAAGG	ACCGCCTAGA	GTCGAGACCC	CTCCCTCCCG	3960
CCTCGGGCAA	ACCCACAGCC	GCCGCAAACA	CCACACCCGC	CGACCTACCA	TGCACCCCTC	4020
GCCGCGCCGG	CTGCTCGGCG	CGCTCGCGCT	GCTGGCGCTG	GGCTTCGCTC	GGCGCGCTCT	4080
TCGCCCCGCG	GCGCCGCTCG	TGCCGGCCGC	CTTCCTGGAG	GTGGGGCACG	TGCGCGCGAA	4140
CCCGTCCGCC	TCGGTGACCT	GCCTCACGGT	GGGCGGCGAC	GGGCGGCACA	TGGCGGCGGT	4200

31049/Η

CGCGCACGGC	GGCGGGACGC	TCTCGCCGGT	GTACCCGCTG	GCCGCCGGCA	TGCACGCGAC	4260
CTTCTCCTCC	GCGCGCAAGG	GCGCGCTGCT	GCTGAACGTC	GCGACCGTGA	CTGTGTACGA	4320
CGTGCGCGCG	CTCGCCCCCG	AGTTCGAGCT	CGTCTGCATC	GCGGTGGTCG	GCGGCTACAA	4380
CTCGGCCGCG	GCCGCCACGC	GGCCCGCGGC	CGAGTGGCAC	CGCCAGCTGG	AGCTGCGCCG	4440
CTCGGAGCTG	TGACCCCTCC	CTCCCCGGTC	TCCCTCTGTC	TTTGTAATCG	GCCTTAGAGA	4500
TTAGACATCA	TCCTCCACGC	CTCTTTGTCC	GCCGCCCTTC	TTCGCGGACG	GATGAACCAA	4560
TTAATTAATT	ATTTTTGTCG	CTCGCCCGCT	CACTCCGGCA	AGGGAACGAG	TGACGTTAAC	4620
TCTCTCACCC	TCACGCACAA	GAACAAGAAC	CGCTCACTCA	CCGGGCAAGG	GAACACGGTT	4680
AAGGTCAACT	CACTCGCGAG	AACAAGTTGA	CCCTCACTCT	AGAGAACGAG	GAACGGGCAA	4740
CAAGCAACCG	TCAACTCACT	TACCACGAGA	ACAAGTTGAC	CGCCACTCAA	AGGGAACAGA	4800
GAACAGTAAC	CGTTCTCGCT	CGCTCGGAAC	AATAGAACAA	GTTAACGTCA	ACTCGCTCGC	4860
TCGGTGTAAG	AGAACAACAG	AACAAGCAAC	TGTTGACCAC	TCAACCCCCG	GAGAAGAGAA	4920
CAAGAGAGCA	GTCAACTCAC	CCACTCAGTC	TTGGATGAGA	GGAGGACGAG	TTAACGAGTA	4980
CTCGCACGCA	GAGTGAGAGA	GTGAGGACAT	AATAATAGTT	AACGAGTTAA	TACTCACTCG	5040
CTCACTCAGA	GTGAGAGAGA	ACCAGTGAGC	GAGTTAACCG	CGCACACGAG	CGAGAGAACA	5100
GTGAACTGCT	CGCGCGCTCG	CTCGGTAGCA	GTCGGCCTTT	CTTAAAACGG	TTCGTAAAAC	5160
TTTTCCCGAG	ACAGTTCACC	CTCCAAAACT	TTTAAAACTA	AACTCGGAGG	TGGCCTGCCC	5220
TCCACTCTCC	GTAAAACTTT	TGTAAAACTG	TCGGAGGTCG	GTCGACTTCG	CAACTCGTCC	5280
GCGAAAACTT	TTCGTGGGCA	GTGTCTGCCT	CTCTCAGGCT	CCTCGCATCA	CTTTCGCGGA	5340
GCCTCGAGGT	AGGTCACCTC	TCTCCAAACT	TTTGTAAAAA	CTTTTTCGCG	GAGCCTCTGG	5400
AGGCCGTCCT	CCCTCCAAAA	CTTTTCGTAA	AATCTCTTCG	GAGGCCGTCC	TCCCTCCAAA	5460
ACTTTTCGTA	AAATCTTTGG	GAGGTCGACC	TCCCTCAAAA	CTTTTTATAA	AGCTT	5515

31049/H (2) Informácie pre sekvenciu ID č. 9:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 1620 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: dvojvláknová (D) Usporiadanie: lineárna (ii) Typ molekuly: DNA (genómová) (iii) Hypotetická: Nie (iv) Antizmyslová: Nie (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Organizmus: Parapox ovis (B) Kmeň: D1701-proteínkinázový gén F10L (verzia 2) (xi) Popis sekvencie: Sekvencia ID č. 9:

	CGAGTGACTG	CCCATCCCGT	TGCTGCGCGA
	TTTCTTCTTA	TTAGGTAGTT	GTTGCCCACC
	CCTCGCACGC	CCGCGGCGGC	CGCGGCGGCC
	AAGCGCAAGC	GCAAGACGCC	CAACTGCGAA
	CAGACGCCGT	GCGACCGCGA	GTGGCCGGAC
i	TCGGTCTCTC	TCGGCGACGA	GATCTACTTG
	CAGACCTGGG	CCCCGCCGGT	GCGGCTGCTG
	CTCAGCCGCA	TGTCGCGGCG	CGGGTACGTG
	CGCTTCTCGC	CCACCAACGA	CGACATGTAC
	TTCCGCTTCG	ACCGCTACGT	GGTCAAGTAC
	ATGGACGCCT	CTACGGAGTA	CACGGTGCCG

CTCGGGACTG CCCTCTGTTT TTCTTTCCCG60

TCCATGATCC TCGCACGCGC TGGCGGGCGA120

GCCGAGGACG GCAAGAACAG TGATCGCCGG180

GACGCCGACA ACTCCGACGA CGAGCTAGCG240

TGTCGCGCGA GCTCGATCAC GAGCTCCGAC300

CGGTACGTAG CCTCGCAGGT GGACTTCGCG360

CGCTTCTTCG GGAACTTCTC GAAGGAAACG420

AACCGCTCCT ACTTCCAGAT GGCGCACGCG480

CACATGGCCA CTGGCGGGTA CGGCATCGTG540

GTCTTCGAGC ACCGCAACGG CATGTCCGAG600

CGGTTCCTGC GCAATAACCT CAAGGGCGAC660

31049/H

ΊΟ

GAGCGCGAGT	TCGTGGTCTG	CGCGCTGGCC	ATGGGGCTGA	ACTACCGGCT	GGGCTTCCTG	720
CACTCGCTGT	ACCGGCGCGT	GCTGCACACG	CTGCTGCTGC	TCATGCGCGT	GGAGGAAGGC	780
CAGCGGCCCT	CGGTAGAGAT	GGCCAAGAAG	CCGCTGCTGC	GCTGGTTCGA	GGCGCGCAAG	840
GACAGCGAGT	CCTTCGTGCG	CCTGGTCTCG	TACTTCTACC	CCTCGGCCGT	GCAGAGCAAC	900
GTGAACCTGA	TCAACAACTT	CCACCACCTG	GTGCACTTCT	TTGAGCACGA	GAAGCGCGCG	960
CGGTACGTGT	TCGACCGCGG	GGCCGTGATC	GTGTTCCCTC	TGGCGCGCGG	GTCCGCGGAC	1020
TCGATCTCGC	CGGAGGCGGC	GGCAGCGCTG	GGCTTCGCGC	GGCACTCGGA	GTTCCTCAAG	1080
TTCGTGTTCC	TGCAGATCGC	GCTGCTGTAC	CTGAAGATAT	ACGAGCTCCC	GGGCTGCACG	1140
AACTTCCTGC	ACGTGGACCT	GAAGCCCGAC	AACGTGCTCA	TCTTCGACAG	CGCGCGCGCG	1200
CTCAGCGTGA	CTGCGGCCGG	TGCGACTTTT	CGCTTCGAAG	AGCCCGTGCG	CGCGGCGCTG	1260
AACGACTTCG	ACTTCGCGCG	CGTGGCCACC	ATCGAGAACC	GCAAGATCGC	GGGCAGCGTC	1320
CGCGTGCCGC	AGAACTGGTA	CTACGACTTC	CACTTCTTCG	CGCACACGCT	GCTGCGCGCG	1380
TACCCGCACA	TCGCCGCGGA	GGACCCGGGC	TTCCACGCGC	TGCTCTCGGA	GCTCACGGTC	1440
TCGTGCTCGC	GCGGGACCTG	CGACCGCTTC	CGGCTGCGCG	TGTCCTCGCC	GCACCCCATC	1500
GAGCACOTCG	CGCGGCTGGT	GCGCCGCGAC	GTCTTCTCCC	GCTGGATAAA	TGCCGCCGCG	1560
GACGCCCCCG	ACGCCGCACT	CTCCTGAGCC	CACGCCCGCG	GCGCCGGGCT	CGCTGTACGA	1620

31049/H (2) Informácie pre sekvenciu ID č. 10:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 780 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: dvojvláknová (D) Usporiadanie: lineárna (ii) Typ molekuly: DNA (genómová) (iii) Hypotetická: Nie (iv) Antizmyslová: Nie (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Organizmus: Parapox ovis (B) Kmeň: D1701-F9L gén, verzia 2 (xi) Popis sekvencie: Sekvencia ID č. 10:

GAGCACCTCG	CGCGGCTGGT	GCGCCGCGAC	GTCTTCTCCC	GCTGGATAAA	TGCCGCCGCG	60
GACGCCCCCG	ACGCCGCACT	CTCCTGAGCC	CACGCCCGCG	GCGCCGGGCT	CGCTGTACGA	120
CGTCTTCCTC	GCGCGCTTCC	TGCGCCAGQT	GGCCGCGCGC	GCGGCGCCGG	CCTCGGCCGC	180
CTGCGCCGTG	CGCGTGGGTG	CGGTGCGCGG	CCGCCTGCGG	AACTGCGAGC	TGGTGGTGCT	240
GAACCGCTGC	CACGCGGACG	CTGCCGGCGC	GCTCGCGCTG	GCCTCCGCGG	CGCTGGCGGA	300
AACGCTGGCG	GAGCTGCCGC	GCGCGGACAG	GCTCGCCGTC	GCGCGCGAGC	TGGGCGTGGA	360
CCCAGAGCAC	CCGGAGCTGA	CGCCGGACCC	CGCCTGCGCG	GGCGAGAGCG	CGCTTGCGCA	420
GAACATCGAC	ATCCAGACGC	TGGACCTGGG	CGACTGCGGC	GACCCCAAAG	GCCGCCGACT	480
GCGCGTGGCG	CTGGTGAACA	GCGGCCACGC	GGCCGCAAAC	TGCGCGCTCG	CGCGCGTAGC	540
GACCGCGCTG	ACGCGCCGCG	TGCCCGCAAG	CCGGCACGGC	CTCGCGGAGG	GCGGCACGCC	600
GCCGTGGACG	CTGCTGCTGG	CGGTGGCCGC	GGTGACGGTG	CTCAGCGTGG	TGGCGGTTTC	660
GCTGCTGCGG	CGCGCGCTGC	GGGTGCGCTA	CCAATTCGCG	CGGCCGGCCG	CGCTGCGCGC	720
GTAGCCGCGC	AAAATGTAAA	TTATAACGCC	CAACTTTTAA	GGGTGAGGCG	CCATGAAGTT	780

31049/H (2) Informácie pre sekvenciu ID č. 11:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 297 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: dvojvláknová (D) Usporiadanie: lineárna (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (iii) Hypotetická: Nie (iv) Antizmyslová: Nie (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Organizmus: Parapox ovis (B) Kmeň: D1701-10 kDa gén (xi) Popis sekvencie: Sekvencia ID č. 11:

CAATATGGAG

GAAAATGACG GAGAAAACCT ATTGGCTCAG CCTGATGATG ATACAGACAA

TTTAACCAAC GGAGTGTACG CGGCTGGAGC

TCCAACTAAA GAAAGTGTGG AAGAGCGTCT

120

CGTAAGCTTG

TTAGACGGTT ACAAAAATAT AACTGATTGC TGCAGAGAAA CAGGTAACCG

180

GTTAGACAGA CTAGAAAGAC ACTTGGAGAG TCTACGTAAA GCTCTTCTTG

ATCTCAACAG

240

AAAAATAGAT GTACAGACAG GATACAGCAG ATATTAGATA CCGCTGTGTT GCGTCTG

297 (2) Informácie pre sekvenciu ID č. 12:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 5519 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: dvojvláknová

31049/H (D) Usporiadanie: lineárna (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (iii) Hypotetická: Nie (iv) Antizmyslová: Nie (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Organizmus: Parapox ovis (B) Kmeň: D1701, Hindlll fragment I, verzia 2 (xi) Popis sekvencie: Sekvencia ID č. 12:

AAGCTTGTTG	CGCGAGTACG	TGGTGACCCG	CGCCTACTCG	GATCAGACCG	AGCCGATCAT	60
GGACTTGCTC	ATCGGCATGG	GCGCCGACGT	GGACATGCAG	GTCGGCGTGT	GCCGCACGGC	120
GCTGCACGCC	TGCCTTACGG	GCTTGAACAC	GAACCCGTGC	ATGATTCGCG	CGCTGCTTCG	180
GCGCGGCGCC	AGCGTGACCG	CAAAAGACAC	CTACGAGATG	ACGCCACTGG	CGGTGTTGCT	240
GAAGTCCGCG	AGCGCGACGC	CGGAGCTCGT	GCGCATCCTC	GTGGAAGCAG	GCTCCGACGT	300
GAGCGCCACC	GACTTCCGCC	TCAACGGCAT	GCTGCACCAG	CACGCGCAGT	CCACGCGCCC	360
GCGCGCGAGC	GTCATGCGCG	AGCTCATCCG	GCTGGGGTGC	AGCCCAGCGG	CCAAAAACAT	420
GTTTGGGAAC	ACGCCGATGC	ACATGCTGGC	CATGGAAAGC	TCCTGCCGCC	GCTCGCTGAT	480
CCTCCCGCTG	CTGGAGGCAG	GGCTTTCCGT	GAACGAGGAG	AACCTGCACT	ACGGCACCGT	540
GCCTCTGCAC	GTGGCCTCGG	GGTACGACAA	CACGCAGGGC	TGCCTCAAGC	TCCTCCGGCA	600
GGGAGGAGAC	CCCACCGTCG	TGTCAGCCGC	CGGACGCACA	CCGATCTCGA	ACATGCTCGT	660
CAAACGCAAC	CACGTGGCGG	TCGCCGGCGC	GCTGTCGACG	CACCCGAGCG	CGGCAGTGGT	720
CGTGCAGGCT	CTCGAGCAGG	CTCTCGAGAA	CGTGCTGAAC	GCCGGGCCCA	GCGAGGCCTC	780
GCGGCTCGCC	GTGGCCTTTG	TGGTGGCGCG	CGCCGGCGCA	TCCGCGCTAC	CGGAGGCCGT	840
GCGCCGTCTT	CACGAGGGCT	TCGTCGCCGA	CTGCGAGCGC	GAAGTCGCGT	TGCTTTCCCG	900

31049/H

CAGCATGCTC	GGCACACCGG	CCGTGAGCGC	GCTGGTCGTG	CTGGTCAGCA	AGGAGGTCTT	960
TGGCACTGTT	ATCTCCTCGC	GTGCGCTGCG	CGTCGCGCGG	GAGGTCCGCG	TGTACGCAAG	1020
GCCGCTCCGC	GAGGCGCTCA	TAAATCTGCG	CCACAAATGC	CGCTTAGTTT	CCAGCCTTAA	1080
AAGGCAAGTG	GGACCCTGCT	CGCTGCCCGG	CGAACTGGTG	GAGCGCGTGC	TCGCGACCGT	1140
GCCACTGGCC	GACTTGCGCC	GCTCGTGCAG	CCGCCGCGCG	CCCGAGTGAC	TGCCCATCCC	1200
GTTGCTGCGC	GACTCGGGAC	TGCCCTCTGT	TTTTCTTTCC	CGTTTCTTCT	TATTAGGTAG	1260
TTGTTGCCCA	CCTCCATGAT	CCTCGCACGC	GCTGGCGGGC	GACCTCGCAC	GCCCGCGGCG	1320
GCCGCGGCGG	CCGCCGAGGA	CGGCAAGAAC	AGTGATCGCC	GGAAGCGCAA	GCGCAAGACG	1380
CCCAACTGCG	AAGACGCCGA	CAACTCCGAC	GACGAGCTAG	CGCAGACGCC	GTGCGACCGC	1440
GAGTGGCCGG	ACTGTCGCGC	GAGCTCGATC	ACGAGCTCCG	ACTCGGTCTC	TCTCGGCGAC	1500
GAGATCTACT	TGCGGTACGT	AGCCTCGCAG	GTGGACTTCG	CGCAGACCTG	GGCCCCGCCG	1560
GTGCGGCTGC	TGCGCTTCTT	CGGGAACTTC	TCGAAGGAAA	CGCTCAGCCG	CATGTCGCGG	1620
CGCGGGTACG	TGAACCGCTC	CTACTTCCAG	ATGGCGCACG	CGCGCTTCTC	GCCCACCAAC	1680
GACGACATGT	ACCACATGGC	CACTGGCGGG	TACGGCATCG	TGTTCCGCTT	CGACCGCTAC	1740
GTGGTCAAGT	ACGTCTTCGA	GCACCGCAAC	GGCATGTCCG	AGATGGACGC	CTCTACGGAG	1800
TACACGGTGC	CGCGGTTCCT	GCGCAATAAC	CTCAAGGGCG	ACGAGCGCGA	GTTCGTGGTC	1860
TGCGCGCTGG	CCATGGGGCT	GAACTACCGG	CTGGGCTTCC	TGCACTCGCT	GTACCGGCGC	1920
GTGCTGCACA	CGCTGCTGCT	GCTCATGCGC	GTGGAGGAAG	GCCAGCGGCC	CTCGGTAGAG	1980
ATGGCCAAGA	AGCCGCTGCT	GCGCTGGTTC	GAGGCGCGCA	AGGACAGCGA	GTCCTTCGTG	2040
CGCCTGGTCT	CGTACTTCTA	CCCCTCGGCC	GTGCAGAGCA	ACGTGAACCT	GATCAACAAC	2100
TTCCACCACC	TGGTGCACTT	CTTTGAGCAC	GAGAAGCGCG	CGCGGTACGT	GTTCGACCGC	2160
GGGGČCGTGA	TCGTGTTCCC	TCTGGCGCGC	GGGTCCGCGG	ACTCGATCTC	GCCGGAGGCG	2220

31049/Η

GCGGCAGCGC	TGGGCTTCGC	GCCGCACTCG	GAGTTCCTCA	AGTTCGTGTT	CCTGCAGATC	2280
GCGCTGCTGT	ACCTGAAGAT	ATACGAGCTC	CCGGGCTGCA	CGAACTTCCT	GCACGTGGAC	2340
CTGAAGCCCG	ACAACGTGCT	CATCTTCGAC	AGCGCGCGCG	CGCTCAGCGT	GACTGCGGCC	2400
GGTGCGACTT	TTCGCTTCGA	AGAGCCCGTG	CGCGCGGCGC	TGAACGACTT	CGACTTCGCG	2460
CGCGTGGCCA	CCATCGAGAA	CCGCAAGATC	GCGGGCAGCG	TCCGCG'TGCC	GCAGAACTGG	2520
TACTACGACT	TCCACTTCTT	CGCGCACACG	CTGCTGCGCG	CGTACCCGCA	CATCGCCGCG	2580
GAGGACCCGG	GCTTCCACGC	GCTGCTCTCG	GAGCTCACGG	TCTCGTGCTC	GCGCGGGACC	2640
TGCGACCGCT	TCCGGCTGCG	CGTGTCCTCG	CCGCACCCCA	TCGAGCACCT	CGCGCGGCTG	2700
GTGCGCCGCG	ACGTCTTCTC	CCGCTGGATA	AATGCCGCCG	CGGACGCCCC	CGACGCCGCA	2760
CTCTCCTGAG	CCCACGCCCG	CGGCGCCGGG	CTCGCTGTAC	GACGTCTTCC	TCGCGCGCTT	2820
CCTGCGCCAG	CTGGCCGCGC	GCGCGGCGCC	GGCCTCGGCC	GCCTGCGCCG	TGCGCGTGGG	2880
TGCGGTGCGC	GGCCGCCTGC	GGAACTGCGA	GCTGGTGGTG	CTGAACCGCT	GCCACGCGGA	2940
CGCTGCCGGC	GCGCTCGCGC	TGGCCTCCGC	GGCGCTGGCG	GAAACGCTGG	CGGAGCTGCC	3000
GCGCGCGGAC	AGGCTCGCCG	TCGCGCGCGA	GCTGGGCGTG	GACCCAGAGC	ACCCGGAGCT	3060
GACGCCGGAC	CCCGCCTGCG	CGGGCGAGAG	CGCGCTTGCG	CAGAACATCG	ACATCCAGAC	3120
GCTGGACCTG	GGCGACTGCG	GCGACCCCAA	AGGCCGCCGA	CTGCGCGTGG	CGCTGGTGAA	3180
CAGCGGCCAC	GCGGCCGCAA	ACTGCGCGCT	CGCGCGCGTA	GCGACCGCGC	TGACGCGCCG	3240
CGTGCCCGCA	AGCCGGCACG	GCCTCGCGGA	GGGCGGCACG	CCGCCGTGGA	CGCTGCTGCT	3300
GGCGGTGGCC	GCGGTGACGG	TGCTCAGCGT	GGTGGCGGTT	TCGCTGCTGC	GGCGCGCGCT	3360
GCGGGTGCGC	TACCAATTCG	CGCGGCCGGC	CGCGCTGCGC	GCGTAGCCGC	GCAAAATGTA	3420
AATTATAACG	CCCAACTTTT	AAGGGTGAGG	CGCCATGAAG	TTTCTCGTCG	GCATACTGGT	3480
AGCTGTGTGC	TTGCACCAGT	ATCTGCTGAA	CGCGGACAGC	ACGAAAACAT	GGTCCGAAGT	3540

31049/Η

GTTTGAAAAC	AGCGGGTGCA	AGCCAAGGCC	GATGGTCTTT	CGAGTACACG	ACGAGCACCC	3600
GGAGCTAACT	TCTCAGCGGT	TCAACCCGCC	GTGTGTCACG	TTGATGCGAT	GCGGCGGGTG	3660
CTGCAACGAC	GAGAGCTTAG	AATGCGTCCC	CACGGAAGAG	GCAAACGTAA	CGATGCAACT	3720
CATGGGAGCG	TCGGTCTCCG	GTGGTAACGG	GATGCAACAT	CTGAGCTTCG	TAGAGCATAA	3780
GAAATGCGAT	TGTAAACCAC	CACTCACGAC	CACGCCACCG	ACGACCACAA	GGCCGCCCAG	3840
AAGACGCCGC	TAGAACTTTT	TATGGACCGC	ATATCCAAAC	GATGATGCGA	TCAGGTCATG	3900
CGGAAGGAGG	CTCCACGGAG	CAAAGTGAAA	AAGGACCGCC	TAGAGTCGAG	ACCCCTCCCT	3960
CCCGCCTCGG	GCAAACCCAC	AGCCGCCGCA	AACACCACAC	CCGCCGACCT	ACCATGCACC	4020
CCTCGCCGCG	CCGGCTGCTC	GGCGCGCTCG	CGCTGCTGGC	GCTGGGCTTC	GCTCGGCGCG	4080
CTCTTCGCCC	CGCGGCGCCG	CTCGTGCCGG	CCGCCTTCCT	GGAGGTGGGG	CACGTGCGCG	4140
CGAACCCGTC	CGCCTCGGTG	ACCTGCCTCA	CGGTGGGCGG	CGACGGGCGG	CACATGGCGG	4200
CGGTCGCGCA	CGGCGGCGGG	ACGCTCTCGC	CGGTGTACCC	GCTGGCCGCC	GGCATGCACG	4260
CGACCTTCTC	CTCCGCGCGC	AAGGGCGCGC	TGCTGCTGAA	CGTCGCGACC	GTGACTGTGT	4320
ACGACGTGCG	CGCGCTCGCC	CCCGAGTTCG	AGCTCGTCTG	CATCGCGGTG	GTCGGCGGCT	4380
ACAACTCGGC	CGCGGCCGCC	ACGCGGCCCG	CGGCCGAGTG	GCACCGCCAG	CTGGAGCTGC	4440
GCCGCTCGGA	GCTGTGACCC	CTCCCTCCCC	GGTCTCCCTC	TGTCTTTGTA	ATCGGCCTTA	4500
GAGATTAGAC	ATCATCCTCC	ACGCCTCTTT	GTCCGCCGCC	CTTCTTCGCG	GACGGATGAA	4560
CCAATTAATT	AATTATTTTT	GTCGCTCGCC	CGCTCACTCC	GGCAAGGGAA	CGAGTGACGT	4620
TAACTCTCTC	ACCCTCACGC	ACAAGAACAA	GAACCGCTCA	CTCACCGGGC	AAGGGAACAC	4680
GGTTAAGGTC	AACTCACTCG	CGAGAACAAG	TTGACCCTCA	CTCTAGAGAA	CGAGGAACGG	4740
GCAACAAGCA	ACCGTCAACT	CACTTACCAC	GAGAACAAGT	TGACCGCCAC	TCAAAGGGAA	4800
CAGAGAACAG	TAACCGTTCT	CGCTCGCTCG	GAACAATAGA	ACAAGTTAAC	GTCAACTCGC	4860

31049/Η

TCGCTCGGTG	TAAGAGAACA	ACAGAACAAG	CAACTGTTGA	CCACTCAACC	CCCGGAGAAG	4920
AGAACAAGAG	AGCAGTCAAC	TCACCCACTC	AGTCTTGGAT	GAGAGGAGGA	CGAGTTAACG	4980
AGTACTCGCA	CGCAGAGTGA	GAGAGTGAGG	ACATAATAAT	AGTTAACGAG	TTAATACTCA	5040
CTCGCTCACT	CAGAGTGAGA	GAGAACCAGT	GAGCGAGTTA	ACCGCGCACA	CGAGCGAGAG	5100
AACAGTGAAC	TGCTCGCGCG	CTCGCTCGGT	AGCAGTCGGC	CTTTCTTAAA	ACGGTTCGTA	5160
aaacttttcc	CGAGACAGTT	CACCCTCCAA	AACTTTTAAA	ACTAAACTCG	GAGGTGGCCT	5220
GCCCTCCACT	CTCCGTAAAA	CTTTTGTAAA	ACTGTCGGAG	GTCGGTCGAC	TTCGCAACTC	5280
GTCCGCGAAA	ACTTTTCGTG	GGCAGTGTCT	GCCTCTCTCA	GGCTCCTCGC	ATCACTTTCG	5340
CGGAGCCTCG	AGGTAGGTCA	CCTCTCTCCA	AACTTTTGTA	aaaacttttt	CGCGGAGCCT	5400
CTGGAGGCCG	TCCTCCCTCC	AAAACTTTTC	GTAAAATCTC	TTCGGAGGCC	GTCCTCCCTC	5460
CAAAACTTTT	CGTAAAATCT	TTGGGAGGTC	GACCTCCCTC	AAAACTTTTT	ATAAAGCTT	5519

(2) Informácie pre sekvenciu ID č. 13:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 1742 bázových párov (B) Typ: nukleová kyselina (C) Počet vlákien: dvojvláknová (D) Usporiadanie: lineárna (ii) Typ molekuly: DNA (genomová) (iii) Hypotetická: Nie (iv) Antizmyslová: Nie (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Organizmus: Parapox ovis (B) Kmeň: D1701-proteínkinázový gén F10L (verzia 3) (xi) Popis sekvencie: Sekvencia ID č. 13:

31049/H

CGAGTGACTG	CCCATCCCGT	TGCTGCGCGA	CTCGGGACTG	CCCTCTGTTT	TTCTTTCCCG	60
TTTCTTCTTA	TTAGGTAGTT	GTTGCCCACC	TCCATGATCC	TCGCACGCGC	TGGCGGGCGA	120
CCTCGCACGC	CCGCGGCGGC	CGCGGCGGCC	GCCGAGGACG	GCAAGAACAG	TGATCGCCGG	180
AAGCGCAAGC	GCAAGACGCC	CAACTGCGAA	GACGCCGACA	ACTCCGACGA	CGAGCTAGCG	240
CAGACGCCGT	GCGACCGCGA	GTGGCCGGAC	TGTCGCGCGA	GCTCGATCAC	GAGCTCCGAC	300
TCGGTCTCTC	TCGGCGACGA	GATCTACTTG	CGGTACGTAG	CCTCGCAGGT	GGACTTCGCG	360
CAGACCTGGG	CCCCGCCGGT	GCGGCTGCTG	CGCTTCTTCG	GGAACTTCTC	GAAGGAAACG	420
CTCAGCCGCA	TGTCGCGGCG	CGGGTACGTG	AACCGCTCCT	ACTTCCAGAT	GGCGCACGCG	480
CGCTTCTCGC	CCACCAACGA	CGACATGTAC	CACATGGCCA	CTGGCGGGTA	CGGCATCGTG	540
TTCCGCTTCG	ACCGCTACGT	GGTCAAGTAC	GTCTTCGAGC	ACCGCAACGG	CATGTCCGAG	600
ATGGACGCCT	CTACGGAGTA	CACGGTGCCG	CGGTTCCTGC	GCAATAACCT	CAAGGGCGAC	660
GAGCGCGAGT	TCGTGGTCTG	CGCGCTGGCC	ATGGGGCTGA	ACTACCGGCT	GGGCTTCCTG	720
CACTCGCTGT	ACCGGCGCGT	GCTGCACACG	CTGCTGCTGC	TCATGCGCGT	GGAGGAAGGC	780
CAGCGGCCCT	CGGTAGAGAT	GGCCAAGAAG	CCGCTGCTGC	GCTGGTTCGA	GGCGCGCAAG	840
GACAGCGAGT	CCTTCGTGCG	CCTGGTCTCG	TACTTCTACC	CCTCGGCCGT	GCAGAGCAAC	900
GTGAACCTGA	TCAACAACTT	CCACCACCTG	GTGCACTTCT	TTGAGCACGA	GAAGCGCGCG	960
CGGTACGTGT	TCGACCGCGG	GGCCGTGATC	GTGTTCCCTC	TGGCGCGCGG	GTCCGCGGAC	1020
TCGATCTCGC	CGGAGGCGGC	GGCAGCGCTG	GGCTTCGCGC	CGCACTCGGA	GTTCCTCAAG	1080
TTCGTGTTCC	TGCAGATCGC	GCTGCTGTAC	CTGAAGATAT	ACGAGCTCCC	GGGCTGCACG	1140
AACTTCCTGC	ACGTGGACCT	GAAGCCCGAC	AACGTGCTCA	TCTTCGACAG	CGCGCGCGCG	1200
CTCAGCGTGA	CTGCGGCCGG	TGCGACTTTT	CGCTTCGAAG	AGCCCGTGCG	CGCGGCGCTG	1260
AACGACTTCG	ACTTCGCGCG	CGTGGCCACC	ATCGAGAACC	GCAAGATCGC	GGGCAGCGTC	1320

31049/H

CGCGTGCCGC	AGAACTGGTA	CTACGACTTC	CACTTCTTCG	CGCACACGCT	GCTGCGCGCG	1380
TACCCGCACA	TCGCCGCGGA	GGACCCGGGC	TTCCACGCGC	TGCTCTCGGA	GCTCACGGTC	1440
TCGTGCTCGC	GCGGGACCTG	CGACCGCTTC	CGGCTGCGCG	TGTCCTCGCC	GCACCCCATC	1500
GAGCACCTCG	CGCGGCTGGT	GCGCCGCGAC	GTCTTCTCCC	GCTGGATAAA	TGCCGCCGCG	1560
GACGCCCCCG	ACGCCGCACT	CTCCTGAGCC	CACGCCCGCG	GCGCCGGGCT	CGCTGTACGA	1620
CGTCTTCCTC	GCGCGCTTCC	TGCGCCAGCT	GGCCGCGCGC	GCGGCGCCGG	CCTCGGCCGC	1680
CTGCGCCGTG	CGCGTGGGTG	CGGTGCGCGG	CCGCCTGCGG	AACTGCGAGC	TGGTGGTGCT	1740

1742 (2) Informácie pre sekvenciu ID č. 14:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 497 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Počet vlákien: jednovláknová (D) Usporiadanie: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (iii) Hypotetická: Nie (iv) Antizmyslová: Nie (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Organizmus: Parapox ovis (B) Kmeň: D1701-proteínkináza F10L (xi) Popis sekvencie: Sekvencia ID č. 14:

Met íle Leu Ala Arg Ala Gly Gly Arg Pro Arg Thr Pro Ala Ala Ala.

.5 1015

Ala Ala Ala Ala Glu Asp Gly Lys Asn Ser Asp Arg Arg Lys ArgLys

2530

31049/H

Arg

Lys Thr 35

Pro

Asn

Cys

Glu

Asp Ala Asp Asn 40

Ser

Asp Asp 45

Glu Leu

Ala

Gin

Thr

Pro

Cys

Asp

Arg

Glu

Trp

Pro Asp

Cys

Arg

Ala

Ser

50

55

60 ·

íle

Thr

Ser

Asp

Ser

Val

Ser

Leu

Gly Asp

Glu

íle

Tyr

Leu

Arg

65

70

75

80

Tyr

Val

Ala

Ser

Gin

Val

Asp

Phe

Ala

Gin

Thr

Trp

Ala

Pro

Val

85

90

95

Arg

Leu

Arg

Phe

Gly

Asn

Phe

Ser

Lys

Glu

Thr

Leu

Ser

Arg

100

105

110

Met

Ser

Arg

Gly

Tyr

Val

Asn

Arg

Ser

Tyr

Phe

Gin

Met

Ala

His

115

120

125

Ala

Arg

Phe

Ser

Pro

Thr

Asn

Asp

Met

Tyr

His

Met

Ala

Thr

Gly

130

135

140

Gly

Tyr

Gly

íle

Val

Phe

Arg

Phe

Asp

Arg

Tyr

Val

Lys

Tyr

Val

145

150

155

160

Phe

Glu

His

Arg

Asn

Gly

Met

Ser

Glu

Met

Asp

Ala

Ser

Thr

Glu

Tyr

165

j

170

175

Thr

Val

Pro

Arg

Phe

Leu

Arg

Asn

Leu

Lys

Gly

Asp

Glu

Arg

Glu

180

185

190

Phe

Val

Cys

Ala

Leu

Ala

Met

Gly

Leu

Asn

Tyr

Arg

Leu

Gly

Phe

195

200

205

Leu

His

Ser

Leu

Tyr

Arg

Val

Leu

His

Thr

Leu

Met

210

215

220

Arg

Val

Glu

Gly

Gin

Arg

Pro

Ser

Val

Glu

Met

Ala

Lys

Pro

225

230

235

240

Leu

Arg

Trp

Phe

Glu

Ala

Arg

Lys

Asp

Ser

Glu

Ser

Phe

Val

Arg

245 250 255

31049/H

Leu Val Ser Tyr

Phe Tyr Pro

Ser

Ala Val Gin Ser Asn Val

Asn

Leu

260

265

270

íle

Asn

Phe

His

Leu

Val

His

Phe

Glu

His

Glu

Lys

Arg

275

280

285

Ala

Arg

Tyr

Val

Phe

Asp

Arg

Gly

Ala

Val

íle

Val

Phe

Pro

Leu

Ala

290

295

300

Arg

Gly

Ser

Ala

Asp

Ser

íle

Ser

Pro

Glu

Ala

Leu

Gly

305

310

315

320

Phe

Ala

Pro

His

Ser

Glu

Phe

Leu

Lys

Phe

Val

Phe

Leu

Gin

íle

Ala

325

330

335

Leu

Tyr

Leu

Lys

íle

Tyr

Glu

Leu

Pro

Gly

Cys

Thr

Asn

Phe

Leu

340

345

350

His

Val

Asp

Leu

Lys

Pro

Asp

Asn

Val

Leu

íle

Phe

Asp

Ser

Ala

Arg

355

360

365

Ala

Leu

Ser

Val

Thr

Ala

Gly

Ala

Thr

Phe

Arg

Phe

Glu

Pro

370

375

380

Val

Arg

Ala

Leu

Asn

Asp

Phe

Asp

Phe

Ala

Arg

Val

Ala

Thr

íle

385

390

395

400

Glu

Asn

Arg

Lys

íle

Ala

Gly

Ser

Val

Arg

Val

Pro

Gin

Asn

Trp

Tyr

405

410

415

Tyr

Asp

Phe

His

Phe

Ala

His

Thr

Leu

Arg

Ala

Tyr

Pro

His

420

425

430

íle

Ala

Glu

Asp

Pro

Gly

Phe

His

Ala

Leu

Ser

Glu

Leu

Thr

435

440

445

Val

Ser

Cys

Ser

Arg

Gly

Thr

Cys

Asp

Arg

Phe

Arg

Leu

Arg

Val

Ser

450

455

460

Ser

Pro

His

Pro

íle

Glu

His

Leu

Ala

Arg

Leu

Val

Arg

Asp

Val

465

470

475

480

_____

. —

_

-

Phe Ser Arg Trp íle Asn Ala Ala Ala Asp Ala Pro Asp Ala Ala Leu

485 490 495

Ser

31049/H (2) Informácie pre sekvenciu ID č. 15:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 132 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Počet vlákien: jednovláknová (D) Usporiadanie: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (iii) Hypotetická: Nie (iv) Antizmyslová: Nie (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Organizmus: Parapox ovis (B) Kmeň: D1701-VEGF proteín (xi) Popis sekvencie: Sekvencia ID č. 15:

Met 1

Lys

Phe

Leu Val 5

Gly íle Leu

Val Ala Val Cys Leu His Gin Tyr

10

15

Leu

Asn

Ala

Asp

Ser

Thr

Lys

Thr

Trp

Ser

Glu

Val

Phe

Glu

Asn

20

25

30

Ser

Gly

Cys

Lys

Pro

Arg

Pro

Met

Val

Phe

Arg

Val

His

Asp

Glu

His

35

40

45

Pro

Glu

Leu

Thr

Ser

Gin

Arg

Phe

Asn

Pro

Cys

Val

Thr

Leu

Met

50

55

60

Arg

Cys

Gly

Cys

Asn

Asp

Glu

Ser

Leu

Glu

Cys

Val

Pro

Thr

65

70

75

80

Glu Glu

Ala Asn

Val

Thr

Met

Gin

Leu

Met

Gly Ala

Ser

Val

Ser

Gly

85

90

95

Gly Asn

Gly Met

Gin

His

Leu

Ser

Phe

Val

Glu His

Lys

Cys

Asp

100

105

110

31049/H

Cys Lys Pro Pro Leu Thr Thr Thr Pro Pro Thr Thr Thr Arg Pro Pro

115 120 125

Arg Arg Arg Arg

130 (2) Informácie pre sekvenciu ID č. 16:

(i) Vlastnosti sekvencie:

(A) Dĺžka: 224 aminokyselín (B) Typ: aminokyselina (C) Počet vlákien: jednovláknová (D) Usporiadanie: lineárna (ii) Typ molekuly: proteín (iii) Hypotetická: Nie (iv) Antizmyslová: Nie (vi) Pôvodný zdroj:

(A) Organizmus: Parapox ovis (B) Kmeň: D1701-proteín F9L (xi) Popis sekvencie: Sekvencia ID č. 16:

Met 1

Pro

Arg

Thr 5

Pro Pro Thr

Pro His 10

Ser

Pro Glu Pro

Thr Pro 15

Ala

Pro

Gly

Ser

Leu

Tyr

Asp

Val

Phe

Leu

Ala

Arg

Phe

Leu

Arg

20

25

30

Gin

Leu

Ala

Arg

Ala

Pro

Ala

Ser

Ala

Cys

Ala

Val

Arg

35

40

45

31049/H

Val

Gly 50

Ala Val

Arg Gly

Arg Leu Arg Asn Cys Glu

Leu

Val Val Leu

55

60

Asn

Arg

Cys

His

Ala

Asp

Ala

Gly

Ala

Leu

Ala

Leu

Ala

Ser

Ala

65

70

75

80

Ala

Leu

Ala

Glu

Thr

Leu

Ala

Glu

Leu

Pro

Arg

Ala

Asp

Arg

Leu

Ala

85

90

95

Val

Ala

Arg

Glu

Leu

Gly

Val

Asp

Pro

Glu

His

Pro

Glu

Leu

Thr

Pro

100

105

110

Asp

Pro

Ala

Cys

Ala

Gly

Glu

Ser

Ala

Leu

Ala

Gin

Asn

íle

Asp

íle

115

120

125

Gin

Thr

Leu

Asp

Leu

Gly

Asp

Cys

Gly

Asp

Pro

Lys

Gly

Arg

Leu

130

135

140

Arg

Val

Ala

Leu

Val

Asn

Ser

Gly

His

Ala

Asn

Cys

Ala

Leu

145

150

155

160

Ala

Arg

Val

Ala

Thr

Ala

Leu

Thr

Arg

Val

Pro

Ala

Ser

Arg

His

165

170

175

Gly

Leu

Ala

Glu

Gly

Thr

Pro

Trp

Thr

Leu

Ala

Val

180

185

190

Ala

Val

Thr

Val

Leu

l Ser

Val

Ala

Val

Ser

Leu

Arg

195

200

205

Ala

Leu

Arg

Val

Arg

Tyr

Gin

Phe

Ala

Arg

Pro

Ala

Ala.

Leu

Arg

Ala

210 215 220

31049/Η

Zoznam obrázkov na výkresoch

Obrázok 1 zobrazuje fyzikálnu mapu ORF D1701 HindlII fragmentu I v plazmidoch pORF-1/-2. Tenké šípky označujú identifikované mRNA, kým hrubé šípky označujú ORF.

Obrázok 2 zobrazuje fyzikálnu mapu rozpoznávacích miest HindlII na D1701 genóme a gény identifikované na HindlII fragmente I a taktiež časť obrátenej terminálnej repetitívnej oblasti.

Obrázok 3 zobrazuje plazmid pCE4. Po štiepení s Nrul sa 396 bp fragment vymenil za LacZ kazetu.

Obrázok 4 zobrazuje plazmid pCE9, do ktorého sa po linearizácii štiepením s Xcml vložila LacZ kazeta.

Obrázok 5 schematicky zobrazuje stratégiu použitia PCR na vytvorenie nových jedinečných štiepiacich miest tak, ako sa opísalo v texte.

Obrázok 6 schematicky zobrazuje obojsmerné skracovanie s použitím nukleázy Bal31 s následným vložením EcoRV linkerov a LacZ kazety.

Obrázok 7 zobrazuje stratégiu prípravy LacZ/gpt selekčnej kazety:

Puk: 11 k promótor vakcínie

Pvegf: PPV VEGF promótor

Sm: Srna I

31049/H

B: BamH1

Obrázok 8 schematicky zobrazuje stratégiu klonovania PPV D1701 EcoRI fragmentu E, ktorý obsahuje 10 kDa gén (ako sa opísalo v texte).

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Rekombinantne pripravené PPV obsahujúce inzercie a/alebo delécie.
2. Rekombinantne pripravené PPV obsahujúce inzercie a/alebo delécie v genómových úsekoch, ktoré nie sú vyžadované na rozmnožovanie vírusu.
3. Rekombinantne pripravené PPV obsahujúce inzercie a/alebo delécie v genómových úsekoch, ktoré sú vyžadované na rozmnožovanie vírusu.
4. Rekombinantne pripravené PPV obsahujúce inzercie a/alebo delécie v oblastiach Hindlll fragmentu I D1701, ktoré sa neexprimujú.
5. Rekombinantne pripravené PPV obsahujúce inzercie a/alebo delécie v oblastiach, ktoré sa exprimujú.
6. Rekombinantne pripravené PPV podľa patentových nárokov 1 až 5, v ktorých sú inzercie a/alebo delécie lokalizované v D1701 Hindlll fragmente I, alebo v DNA z iných PPV, ktorá zodpovedá tomuto fragmentu.
7. Rekombinantne pripravené PPV, ktoré obsahujú inzercie a/alebo delécie v oblasti VEGF génu, alebo v susedstve tejto oblasti.
8. Rekombinantne pripravené PPV, ktoré obsahujú inzercie a/alebo delécie v oblasti PK génu alebo v susedstve tejto oblasti.
9. Rekombinantne pripravené PPV, ktoré obsahujú inzercie a/alebo delécie v oblasti ITR úseku alebo v susedstve tejto oblasti.
10. Rekombinantne pripravené PPV, ktoré obsahujú inzercie a/alebo delécie v oblasti HD1R génu alebo v susedstve tejto oblasti.
11. Rekombinantne pripravené PPV, ktoré obsahujú inzercie a/alebo delécie v oblasti F9L génu alebo v susedstve tejto oblasti.

31049/H
12. Rekombinantné pripravené PPV, ktoré obsahujú inzercie a/alebo delécie v oblasti génu, ktorý kóduje 10kD proteín, alebo v jej susedstve.
13. Rekombinantné pripravené PPV, ktoré obsahujú inzercie a/alebo delécie v oblastiach EcoRI fragmentu E D1701, v ktorom sa nachádza gén, ktorý kóduje 10kD proteín.
14. Plazmid, ktorý obsahuje HindlII fragment I D1701, alebo DNA z iných PPV, ktorá zodpovedá tomuto fragmentu.
15. Plazmid, ktorý obsahuje HindlII fragment I D17CI1, a ktorý obsahuje delécie a/alebo inzercie v oblastiach tohoto fragmentu, ktoré sú potrebné pre replikáciu vírusu.
16. Plazmid, ktorý obsahuje HindlII fragment I D1701, a ktorý obsahuje delécie a/alebo inzercie v oblastiach tohoto fragmentu, ktoré nie sú potrebné pre replikáciu vírusu.
17. Plazmid, ktorý obsahuje HindlII fragment I D1701, a ktorý obsahuje delécie a/alebo inzercie v oblastiach tohoto fragmentu, ktoré nie sú potrebné pre replikáciu vírusu, a ktoré sú umiestnené v oblastiach, ktoré nie sú exprimované.
18. Plazmid, ktorý obsahuje HindlII fragment I D1701, a ktorý obsahuje delécie a/alebo inzercie v oblastiach tohoto fragmentu, ktoré nie sú potrebné pre replikáciu vírusu, a ktoré sú umiestnené v oblastiach, ktoré sú exprimované.
19. Plazmid, ktorý obsahuje HindlII fragment I D1701, a ktorý obsahuje delécie a/alebo inzercie vo VEGF géne tohoto fragmentu, alebo v jeho susedstve.
20. Plazmid, ktorý obsahuje HindlII fragment I D1701, a ktorý obsahuje delécie a/alebo inzercie v PK géne tohoto fragmentu, alebo v jeho susedstve.
21. Plazmid, ktorý obsahuje HindlII fragment I D1701, a ktorý obsahuje delécie a/alebo inzercie v ITR úseku tohoto fragmentu, alebo v jeho susedstve.
22. Plazmid, ktorý obsahuje HindlII fragment I D1701, a ktorý obsahuje delécie a/alebo inzercie v HD1R géne a/alebo F9L géne, alebo v ich susedstve.
23. Plazmid, ktorý obsahuje EcoRI fragment E D1701, a ktorý obsahuje delécie a/alebo inzercie v géne, ktorý kóduje 10 kDa proteín, alebo v jeho susedstve.

31049/H
24. Plazmid, ktorý obsahuje časť Hindlll fragmentu I D1701, ktorá obsahuje delécie a/alebo inzercie podľa patentových nárokov 14 až 23.
25. Plazmid podľa patentových nárokov 14 až 24, v ktorom je D1701 fragment DNA nahradený DNA z iných PPV, ktorá zodpovedá tomuto fragmentu.
26. Plazmid podľa patentových nárokov 14 až 25, v ktorom sa nachádza buď úplný Hindlll fragment I, alebo iba časť tohoto fragmentu.
27. Genómový fragment D1701 Hindlll fragmentu I, alebo časť tohoto fragmentu, alebo fragmentov z iných PPV, ktoré zodpovedajú tomuto fragmentu, a ktoré majú sekvenciu podľa sekvencie v zozname ako ID č. 8.
28. DNA úsek, alebo časti D1701 Hindlll fragmentu I, alebo úsek z iných PPV, ktorý zodpovedá tomuto fragmentu, alebo jeho častiam, ktorý kóduje VEGF proteín podľa sekvencie v zozname ako ID č. 1.
29. DNA úsek, alebo časti D1701 Hindlll fragmentu I, alebo úsek z iných PPV, ktorý zodpovedá tomuto úseku, alebo jeho častiam, ktorý kóduje PK proteín podľa sekvencie v zozname ako ID č. 2.
30. DNA úsek HD1R génu PPV, alebo jeho časti, so sekvenciou podľa sekvencie v zozname ako ID č. 3.
31. DNA úsek F9L génu PPV, alebo jeho časti, so sekvenciou podľa sekvencie v zozname ako ID č. 5.
32. DNA úsek ITR oblasti PPV, alebo jeho časti, so sekvenciou podľa sekvencie v zozname ako ID č. 4.
33. Génové produkty, ktoré sa pripravujú na základe sekvencii úsekov DNA podľa patentových nárokov 27 až 32.
34. Rekombinantne pripravené PPV podľa patentových nárokov 1 až 13, ktoré ako inzercie obsahujú cudzorodú DNA, ktorá kóduje imunogénne zložky iných patogénov.
35. Rekombinantne pripravené PPV podľa patentových nárokov 1 až 13 a 34, ktoré ako inzercie obsahujú cudzorodú DNA, ktorá kóduje cytokíny.
36. Proces prípravy vírusov podľa patentových nárokov 1 až 13, 34 a 35, vyznačujúci sa tým, že plazmidy podľa patentových nárokov 1 až 26 sa

31049/H rekombinujú s PPV v bunkách známym spôsobom a vyselektujú sa požadované vírusy.
37. Spôsob prípravy vírusov podľa patentového nároku 23, vyznačujúci sa tým, že

1. vyberie sa vhodný parapoxvírusový kmeň,

2. jeho genóm sa purifikuje,

3. na purifikovaný genóm sa pôsobí reštrikčnými enzýmami,

4. výsledné fragmenty sa vložia do plazmidov a

5. vykoná sa selekcia plazmidov, ktoré obsahujú gén, ktorý kóduje 10 kDa proteín a

6. tam, kde je to vhodné, sa do génu kódujúceho 10 kDa proteín zavedú inzercie a/alebo delécie,

7. tam kde je vhodné, sa fragmenty opísané v patentovom nároku 4 (vyššie) môžu pripraviť taktiež alternatívnymi spôsobmi, ako sú polymerázová reťazová reakcia (PCR) alebo syntéza oligonukleotidov.
38. Spôsob prípravy plazmidov podľa patentových nárokov 14 až 22, a 24 až 26, vyznačujúci sa tým, že

1. vyberie sa vhodný parapoxvírusový kmeň,

2. jeho genóm sa purifikuje,

3. na purifikovaný genóm sa pôsobí reštrikčnými enzýmami,

4. výsledné fragmenty sa vložia do plazmidov a

5. vykoná sa selekcia plazmidov, ktoré obsahujú D1701 HindlII fragment I, alebo fragmenty, alebo ich zložky, ktoré zodpovedajú tomuto fragmentu,

6. a tam, kde je to vhodné, sa do týchto fragmentov vo výsledných plazmidoch zavedú inzercie a/alebo delécie,

7. tam kde je to vhodné, sa fragmenty opísané v patentovom nároku 4 (vyššie) môžu pripraviť taktiež alternatívnymi spôsobmi, ako sú polymerázová reťazová reakcia (PCR) alebo syntéza oligonukleotidov.

31049/H
39. Spôsob prípravy D1701 HindlII fragmentu l, alebo D1701 EcoRI fragmentu E, ktorý kóduje 10 kDa proteín, alebo oblasť z iných PPV, ktorá zodpovedá tomuto fragmentu alebo úseku, alebo ich častiam, vyznačujúci sa tými, že

1. vyberie sa vhodný parapoxvírusový kmeň,

2. jeho genóm sa puriflkuje,

3. na purifikovaný genóm sa pôsobí reštrikčnými enzýmami,

4. a požadované fragmenty alebo úseky sa vyselektujú, alebo

5. tam, kde je to vhodné, sa výsledné fragmenty genómu na začiatku vložia do plazmidov a plazmidy obsahujúce požadované fragmenty sa potom izolujú a tieto plazmidy sa rozmnožia a požadované fragmenty sa z nich izolujú.

6. tam, kde je to vhodné, sa fragmenty opísané v patentovom nároku 4 (vyššie) môžu pripraviť taktiež alternatívnymi spôsobmi, ako sú polymerázová reťazová reakcia (PCR) alebo syntéza oligonukleotidov.
40. Spôsob prípravy prípravy génových produktov podľa patentového nároku 33, vyznačujúci sa tým, že fragmenty, ktoré sa môžu získať podľa patentového nároku 39 sa prenesú do vhodných expresných systémov a gény sa exprimujú s použitím týchto systémov.
41. Použitie rekombinantne pripravených PPV podľa patentových nárokov 1 až 13 vo vakcínach.
42. Použitie rekombinantne pripravených PPV podľa patentových nárokov 1 až 13 v produktoch, ktoré imunizujú, ako aj stimulujú nešpecifickú imunitnú obranu.
43. Použitie rekombinantne pripravených PPV v imunomodulátoroch, ktoré stimulujú nešpecifickú imunitnú obranu.
44. Použitie rekombinantne pripravených PPV pre heterológnu expresiu cudzorodej DNA.
45. Použitie rekombinantne pripravených PPV ako vektorov pre cudzorodú DNA.
46. Použitie plazmidov podľa patentových nárokov 14 až 26 na expresiu parapox-špecifických genómových úsekov.

31049/H
47. Použitie plazmidov podľa patentových nárokov 14 až 26 na prípravu diagnostických činidiel.
48. Použitie fragmentov genómu podľa patentových nárokov 27 až 32 na prípravu diagnostických Činidiel.
49. Úsek DNA podľa sekvencie v zozname ako ID č. 6 (promótor VEGF génu).
50. Použitie úseku DNA podľa patentového nároku 49 ako promótora expresie DNA.