KR20130020963A - 파라폭스바이러스 벡터 - Google Patents

Abstract

본 발명은 개 디스템퍼 바이러스로부터 유래된 이종 DNA를 포함하는 재조합 파라폭스바이러스, 상기 구축물의 제조, 및 면역원성 조성물 및 백신에서의 그의 용도에 관한 것이고, 본 발명은 추가로 진단을 위한 재조합 파라폭스바이러스의 용도에 관한 것이다.

Description

파라폭스바이러스 벡터{PARAPOXVIRUS VECTORS}

본 발명은 개 디스템퍼 바이러스 (canine distemper virus; CDV)로부터 유래된 이종 DNA를 함유하는 재조합 파라폭스바이러스, 및 면역원성 조성물 및 백신에서의 그의 용도에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 CDV에 의해 유발된 질환에 대해 백신 접종하거나, 상기 질환을 치료하거나, 또는 예방하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 추가로 진단을 위한 재조합 파라폭스바이러스의 용도에 관한 것이다.

폭스비리다에(Poxviridae) 과의 바이러스는 타원형의 크기가 꽤 큰 이중 가닥 DNA 바이러스이다. 파라폭스바이러스(PPV) 속은 이들 바이러스에 포함된다. 측정한 바, 그의 길이는 약 220-300 nm이고, 폭은 140-170 nm이다. 파라폭스바이러스는 다른 폭스바이러스와 구별되는 독특한 나선형 외피를 가지고 있다.

PPV는 3가지 다른 종으로 나누어진다. 그러나, 이들 바이러스가 파라폭스바이러스 속 중에서 자율적인 종인지 여부, 또는 동일한 종인지 여부는 여전히 명확하게 밝혀지지 않은 상태이다. 제1 종인 파라폭스바이러스 오비스(Parapoxvirus ovis) (ORF 바이러스, ORFV)는 상기 속의 원형인 것으로 간주된다. 또한 이는 전염성 농창 바이러스, 전염성 농포 피부염 바이러스 또는 orf 바이러스로도 명명된다. 제2의, 파라폭스바이러스 보비스 1(Parapoxvirus bovis 1)은 또한 소 유행성 구내염 바이러스 또는 구내염 구진성 바이러스로도 명명된다. 제3의, 파라폭스바이러스 보비스 2는 또한 어더폭스바이러스, 파라백시니아 바이러스, 가성우두 바이러스 또는 착유부 결절 바이러스로도 명명된다.

파라폭스바이러스 종은 반추동물에서 토착성을 띤다. PPV는 붉은 사슴, 순록, 붉은 날다람쥐, 및 점박이 바다표범에서 발견되었다. PPV에 의한 감염은 동물과 인간, 둘 모두에서 국소성 질환을 유발할 수 있다. PPV 종의 인수공통 숙주는 양, 염소, 및 소이다. 이는 상처를 남기지 않으면서 치유되는 국소화된 표피성 병변과 반응하면서, 감염된 동물과의 직접적인 접촉을 통해 인간에서 감염을 유발한다. 백신과 같은 예방적 조치를 사용하여 상기 질환을 구제할 수 있다.

조류폭스, 라쿤폭스, 카프리폭스, 돼지폭스, 또는 백시니아 바이러스에 기초한 외래 유전자 정보를 발현하는 벡터는 앞서 기술된 바 있다 (US 5,942,235 및 US 7,094,412 참조). 파라폭스바이러스는 벡터 백신에서 사용될 수 있는 상이한 후보물질을 나타낸다. 그러나, 폭스바이러스의 개별 속들 간의 형태적, 구조적 및 유전적 차이로 인해, 이러한 폭스바이러스를 사용하는 방법은 파라폭스바이러스에 대해서는 사용될 수 있다. 상기 차이의 예로 헤마글루티닌인 표면 단백질에 의해 매개되는 적혈구 응집이 있는데, 이는 파라폭스바이러스에서는 일어나지 않는다.

PPV는 척추 동물에서 전신 (비특이) 면역 반응을 자극하기 때문에 면역조절 효과를 가질 수 있다. 이는 동물에서 일반적인 저항성을 증가시키기 위한 목적으로 수의용 의약에서 성공적으로 사용되어 왔다. 이를 동종 및/또는 이종 항원과 함께 조합함으로써 수개월 내지 수년 동안 지속되는 병원체-특이 효과 뿐만 아니라, 신속한 비-병원체-특이 효과도 갖는 백신을 제공할 수 있다.

이전에 파라폭스바이러스 오비스는 미국 특허 6,365,393; 문헌 [Rziha et al., 2000, J. Biotechnol., 83, 137-145]; WO 2004/054614; 및 [Fischer et al., 2003, J. Virol. 77, 9312-9323]에 기술된 바와 같이, 벡터로서 사용되어 왔다. 이는 벡터로서 사용될 경우, 매우 좁은 숙주 범위, 전신 감염의 부족, 단기간의 벡터-특이 면역 (이를 통해 반복적으로 면역화시킬 수 있다), 조직 백신 접종 (면역 유도는 모체 항체의 존재하에서 출발 가능하다), 및 유익한 면역 조절 특성을 비롯한, 놀라운 이점을 제공한다. 본 발명은 개 디스템퍼 바이러스로부터 유래된 이종 DNA에 대한 벡터로서 파라폭스바이러스를 사용하는 것에 관한 것이다.

파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701은 야생형 바이러스의 것과 유사한 역가를 가진, 세포 배양물에서 증식이 가능한 고도로 약독화된 균주이다. 이는 감염성 벡터 바이러스의 복제를 지원하는 숙주 (예컨대, 양 및 염소), 및 지원하지 않는 숙주 (예컨대, 개, 돼지, 말, 마우스, 및 래트), 둘 모두에서 놀라운 면역 자극성 특성을 가지고 있다. 균주 D1701로부터 유래된 것으로서, 화학적으로 불활성화된 파라폭스바이러스 오비스 제제이며, 이전에는 베이파뮨(Baypamune)?으로 공지되었던 질렉시스(Zylexis)?는 동물에서 감염성 질환의 예방, 중간치유 및 치유적 치료를 위해, 및 스트레스-유도성 질환의 예방을 위해 사용된다.

개 디스템퍼는 개 및 다른 육식 동물의 고도로 감염성인, 급성 또는 아급성의, 열성 바이러스 질환으로서, 전세계에서 발생하는 것이다. 일부 개는 주로 호흡기 징후를 보이며, 다른 개들은 장 징후를 보이고, 동물 중 30% 이상에서는 신경계 증상이 발생한다. 실험상 감염시킨 개들 모두 중추 신경계에 조직병리학적 병변을 가지고 있다. 사망률 범위는 30% 내지 80%이다. 소수 사례에서, 회복된 개는 뇌 세포에 계속하여 바이러스를 보유하고 있는데, 바이러스는 뇌 세포에서 천천히 복제되고, 최종적으로 늙은 개에서 뇌염을 유발한다. 디스템퍼로부터 생존한 개는 평생 동안 재감염에 대해 면역성을 띤다. 개에서 디스템퍼 구제를 위해서는 면역화가 권고되고; 해마다 다시 백신 접종을 실시하는 것이 권고된다.

개 디스템퍼는 파라믹소비리다에(Paramyxoviridae) 과 모르빌리바이러스(Morbillivirus) 속의 구성원인 개 디스템퍼 바이러스 (CDV)에 의해 유발된다. CDV는 홍역 및 우역을 유발하는 바이러스와 밀접한 관계에 있다. 개 디스템퍼 비리온은 외피를 보유하며, 15,616개의 뉴클레오티드로 구성된 (-) 가닥 RNA 게놈을 함유한다. 세포 배양물에 대해 적응된 온더스테푸르트(Onderstepoort) (OP-CDV) 균주에 대한 전체 게놈이 서열 분석되어 있다 (문헌 [Sidhu et al., 1993, Virology 193, 50-65]). 이 바이러스 게놈은 6개의 단백질, 즉 뉴클레오캡시드 (N) 단백질, 인단백질 (P), 기질 (M) 단백질, 융합 (F) 단백질, 헤마글루티닌 (H) 단백질, 및 큰 (L) 단백질을 코딩한다. 유전자는 게놈 RNA에서 (3'-5') N, P, M, F, H, 및 L 순으로 정렬되어 있다. 각 단백질은 (-) 가닥 RNA 주형으로부터 전사된 독특한 mRNA로부터 번역된다. H 및 F 단백질은 둘 모두 당단백질이고, 이는 바이러스 외피에 위치한다. F 단백질 전구체 (F0)는 번역 후 절단되고, 이를 통해 F1 서브유닛 단백질이 생성된다 (문헌 [Cherpillod et al., 2004, Arch. Virol. 149, 1971-1983]).

발명의 개요

본 발명은 일반적으로 개 디스템퍼 바이러스에 대한 신속한 선천성 면역 반응 뿐만 아니라, 장기간 지속되는 외래 유전자-특이 면역을 매개함에 있어서의 재조합 파라폭스바이러스의 용도, 및 특히, 파라폭스바이러스 오비스 (PPVO)의 용도에 관한 것이다.

한 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스는 개 디스템퍼 바이러스로부터 유래된 이종 DNA를 포함한다. 한 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스는 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701을 포함한다. 한 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스는 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701-V를 포함한다. 한 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스는 파라폭스바이러스 오비스 D1701-V-CDV-H이다. 또 다른 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스는 파라폭스바이러스 오비스 D1701-V-CDV-F이다. 한 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스는 개 디스템퍼 바이러스의 H 단백질을 코딩하는 유전자, 또는 그의 단편를 포함한다. 한 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스는 개 디스템퍼 바이러스의 F 단백질을 코딩하는 유전자, 또는 그의 단편를 포함한다. 한 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스는 서열 1, 또는 서열 1에 대해 98% 이상의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다. 한 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스는 서열 2, 또는 서열 2에 대해 98% 이상의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다. 한 실시양태에서, 이종 DNA는 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701의 HindIII 단편 H/H 내에 삽입된다. 또 다른 실시양태에서, 이종 DNA는 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701의 HindIII 단편 H/H 내의 VEGF 코딩 서열 또는 인접한 비-코딩 서열 내에 삽입된다.

본 발명은 이종 DNA를 파라폭스바이러스의 게놈 내로 삽입하는 단계를 포함하는, 재조합 파라폭스바이러스를 제조하는 방법을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 방법은 파라폭스바이러스 오비스를 사용하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서,본 방법은 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701을 사용하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 방법은 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701-V를 사용하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 방법은 파라폭스바이러스 오비스 D1701-V-CDV-H를 제조하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 방법은 파라폭스바이러스 오비스 D1701-V-CDV-F를 제조하는 것을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 방법에서 사용되는 이종 DNA는 개 디스템퍼 바이러스의 H 단백질를 코딩하는 유전자, 또는 그의 단편을 포함한다. 한 실시양태에서, 본 방법에서 사용되는 이종 DNA는 서열 1, 또는 서열 1에 대해 98% 이상의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다. 한 실시양태에서, 이종 DNA는 서열 2, 또는 서열 2에 대해 98% 이상의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다.

본 발명은 개 디스템퍼 바이러스로부터 유래된 이종 DNA를 포함하는 재조합 파라폭스바이러스 및 담체를 포함하는 백신 또는 면역원성 조성물을 포함한다. 한 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스는 파라폭스바이러스 오비스를 포함한다. 한 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스는 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스는 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701-V를 포함한다. 한 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스는 파라폭스바이러스 오비스 D1701-V-CDV-H이다. 한 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스는 파라폭스바이러스 오비스 D1701-V-CDV-F이다. 한 실시양태에서, 이종 DNA는 개 디스템퍼 바이러스의 H 단백질을 코딩하는 유전자, 또는 그의 단편을 포함한다. 한 실시양태에서, 이종 DNA는 개 디스템퍼 바이러스의 F 단백질을 코딩하는 유전자, 또는 그의 단편을 포함한다. 한 실시양태에서, 이종 DNA는 서열 1, 또는 서열 1에 대해 98% 이상의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다. 한 실시양태에서, 이종 DNA는 서열 2, 또는 서열 2에 대해 98% 이상의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다.

본 발명은 개 디스템퍼 바이러스로부터 유래된 이종 DNA를 포함하는 재조합 파라폭스바이러스 및 담체를 조합하는 단계를 포함하는, 백신 또는 면역원성 조성물을 제조하는 방법을 포함한다. 한 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스는 파라폭스바이러스 오비스를 포함한다. 한 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스는 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스는 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701-V를 포함한다. 한 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스는 파라폭스바이러스 오비스 D1701-V-CDV-H이다. 한 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스는 파라폭스바이러스 오비스 D1701-V-CDV-F이다. 한 실시양태에서, 이종 DNA는 개 디스템퍼 바이러스의 H 단백질을 코딩하는 유전자, 또는 그의 단편을 포함한다. 한 실시양태에서, 이종 DNA는 개 디스템퍼 바이러스의 F 단백질을 코딩하는 유전자, 또는 그의 단편을 포함한다. 한 실시양태에서, 이종 DNA는 서열 1, 또는 서열 1에 대해 98% 이상의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다. 한 실시양태에서, 이종 DNA는 서열 2, 또는 서열 2에 대해 98% 이상의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다.

본 발명은 동물 대상체에게 개 디스템퍼 바이러스로부터 유래된 이종 DNA를 포함하는 재조합 파라폭스바이러스 및 담체를 포함하는 치료 유효량의 백신 또는 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 동물 대상체에서 개 디스템퍼 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법을 포함한다. 한 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스는 파라폭스바이러스 오비스를 포함한다. 한 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스는 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스는 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701-V이다. 한 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스는 파라폭스바이러스 오비스 D1701-V-CDV-H이다. 한 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스는 파라폭스바이러스 오비스 D1701-V-CDV-F이다. 한 실시양태에서, 이종 DNA는 개 디스템퍼 바이러스의 H 단백질을 코딩하는 유전자, 또는 그의 단편을 포함한다. 한 실시양태에서, 이종 DNA는 개 디스템퍼 바이러스의 F 단백질을 코딩하는 유전자, 또는 그의 단편을 포함한다. 한 실시양태에서, 이종 DNA는 서열 1, 또는 서열 1에 대해 98% 이상의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다. 한 실시양태에서, 이종 DNA는 서열 2, 또는 서열 2에 대해 98% 이상의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다. 한 실시양태에서, 면역 반응은 CDV-특이 항체의 유도이다. 한 실시양태에서, 항-H 단백질-특이 방어 면역 반응이 유도된다. 한 실시양태에서, 항-F 단백질-특이 방어 면역 반응이 유도된다. 또 다른 실시양태에서, 면역 반응은 항-H 단백질 혈청 항체의 유도이다. 또 다른 실시양태에서, 면역 반응은 항-F 단백질 혈청 항체의 유도이다.

본 발명은 동물 대상체에게 개 디스템퍼 바이러스로부터 유래된 이종 DNA를 포함하는 재조합 파라폭스바이러스 및 담체를 포함하는 치료 유효량의 백신 또는 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 개 디스템퍼 질환에 대해 동물 대상체를 백신 접종하는 방법을 포함한다. 한 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스는 파라폭스바이러스 오비스를 포함한다. 한 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스는 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스는 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701-V를 포함한다. 한 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스는 파라폭스바이러스 오비스 D1701-V-CDV-H이다. 한 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스는 파라폭스바이러스 오비스 D1701-V-CDV-F이다. 한 실시양태에서, 이종 DNA는 개 디스템퍼 바이러스의 H 단백질을 코딩하는 유전자, 또는 그의 단편을 포함한다. 한 실시양태에서, 이종 DNA는 개 디스템퍼 바이러스의 F 단백질을 코딩하는 유전자, 또는 그의 단편을 포함한다. 한 실시양태에서, 이종 DNA는 서열 1, 또는 서열 1에 대해 98% 이상의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다. 한 실시양태에서, 이종 DNA는 서열 2, 또는 서열 2에 대해 98% 이상의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다.

본 발명은 동물 대상체에게 개 디스템퍼 바이러스로부터 유래된 이종 DNA를 포함하는 치료 유효량의 재조합 파라폭스바이러스 및 담체를 투여하는 단계를 포함하는, 개 디스템퍼 질환에 대해 동물 대상체를 치료하는 방법을 포함한다. 한 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스는 파라폭스바이러스 오비스를 포함한다. 한 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스는 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701을 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스는 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701-V를 포함한다. 한 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스는 파라폭스바이러스 오비스 D1701-V-CDV-H이다. 한 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스는 파라폭스바이러스 오비스 D1701-V-CDV-F이다. 한 실시양태에서, 이종 DNA는 개 디스템퍼 바이러스의 H 단백질을 코딩하는 유전자, 또는 그의 단편을 포함한다. 한 실시양태에서, 이종 DNA는 개 디스템퍼 바이러스의 F 단백질을 코딩하는 유전자, 또는 그의 단편을 포함한다. 한 실시양태에서, 이종 DNA는 서열 1, 또는 서열 1에 대해 98% 이상의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다. 한 실시양태에서, 이종 DNA는 서열 2, 또는 서열 2에 대해 98% 이상의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다.

본 발명은 개 디스템퍼 질환에 대해 동물을 치료하기 위한 의약의 제조에서 개 디스템퍼 바이러스로부터 유래된 이종 DNA를 포함하는 재조합 파라폭스바이러스의 용도를 포함한다. 한 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스는 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701을 포함한다. 한 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스는 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701-V를 포함한다. 한 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스는 파라폭스바이러스 오비스 D1701-V-CDV-H이다. 또 다른 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스는 파라폭스바이러스 오비스 D1701-V-CDV-F이다. 한 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스는 개 디스템퍼 바이러스의 H 단백질을 코딩하는 유전자, 또는 그의 단편을 포함한다. 한 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스는 개 디스템퍼 바이러스의 F 단백질을 코딩하는 유전자, 또는 그의 단편을 포함한다. 한 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스는 서열 1, 또는 서열 1에 대해 98% 이상의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다. 한 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스는 서열 2, 또는 서열 2에 대해 98% 이상의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다. 한 실시양태에서, 이종 DNA는 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701의 HindIII 단편 H/H 내에 삽입된다. 또 다른 실시양태에서, 이종 DNA는 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701의 HindIII 단편 H/H 내의 VEGF 코딩 서열 또는 인접한 비-코딩 서열 내에 삽입된다.

본 발명은 개 디스템퍼 질환에 대해 동물을 백신 접종하기 위한 의약의 제조에서 파라폭스바이러스의 용도를 포함한다. 한 실시양태에서, 개 디스템퍼 바이러스로부터 유래된 이종 DNA를 포함하는 재조합 파라폭스바이러스를 제공한다. 한 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스는 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701을 포함한다. 한 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스는 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701-V를 포함한다. 한 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스는 파라폭스바이러스 오비스 D1701-V-CDV-H이다. 한 실시양태에서, 재조합 파라폭스바이러스는 파라폭스바이러스 오비스 D1701-V-CDV-F이다. 또 다른 실시양태에서, 이종 DNA는 CDV의 H 단백질을 코딩하는 유전자를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 이종 DNA는 CDV의 F 단백질을 코딩하는 유전자를 포함한다. 한 실시양태에서, 이종 DNA는 서열 1, 또는 서열 1에 대해 98% 이상의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다. 한 실시양태에서, 이종 DNA는 서열 2, 또는 서열 2에 대해 98% 이상의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다.

본 발명은 동물 대상체에 존재하는 파라폭스바이러스의 기원을 확인하는 방법을 제공한다. 본원에 기술된 파라폭스바이러스는 그의 게놈 조성과 발현된 단백질 둘 모두에서 야생형 균주로부터 구별화될 수 있다. 그러한 차이를 통해 백신 접종을 받은 동물로부터 감염된 동물을 구별지을 수 있다. 재조합 파라폭스바이러스 오비스 D1701-V-CDV-H가 DIVA 검정법에서 사용될 수 있다. 재조합 파라폭스바이러스 오비스 D1701-V-CDV-F가 DIVA 검정법에서 사용될 수 있다.

상기 실시양태 및 다른 실시양태는 하기 상세한 설명에 의해 개시되고, 그에 포함된다.

첨부된 도면을 참조함으로써 본 발명을 보다 잘 이해할 수 있을 것이다:
도 1: 플라스미드 pdV - CDV -H 및 pdV - CDV -F의 구축. CDV H 뿐만 아니라, CDV F 유전자를 BamHI-KpnI 단편으로서 전달 플라스미드 pdV-Rec1 내로 클로닝하여 플라스미드 pdV-CDV-H (1A) 또는 pdV-CDV-F (1B)를 수득하였다.
도 2: D1701 -V- CDV -F 또는 D1701 -V- CDV -H로 감염된 세포의 면역 퍼옥시다제 염색 ( IPMA ). 베로 세포를 재조합체 D1701-V-CDV-F (2A) 또는 D1701-V-CDV-H (2B)로 감염시켰다. 대조군 (감염되지 않은) 베로 세포는 2C에 제시되어 있다. 검게 염색된 세포가 특이 단백질 발현을 나타내는 것이다.
도 3: 재조합체에 의해 발현된 CDV -F 또는 -H 단백질의 면역형광성 염색. 베로 세포를 8시간 (3A) 및 12시간 (3B) 동안 재조합체 D1701-V-CDV-H로 감염시키거나; 또는 24시간 동안 재조합체 D1701-V-CDV-H로 감염시켰다 (3C). (1:2,000으로 희석된) 토끼 항-CDV-H 항체 또는 (1:200으로 희석된) 토끼 항-CDV-F 항체, 및 (1:2,000으로 희석된) 항-토끼-알렉사(Alexa)-555를 사용하여 특이적으로 염색시켰다. 음성 대조군으로서 감염되지 않은 세포를 사용하였다 (D). 특이적으로 염색된 세포는 화살표로 표시되어 있다.
도 4: ORFV 재조합체로 감염된 세포에서 발현된 CDV 의 F-유전자의 웨스턴 블 롯. 감염되지 않은 베로 세포 (ni), 4 내지 72시간 동안 재조합체 D1701-V-CDV-F로 감염된 세포 (MOI = 3.0) (감염 후 4, 8, 24, 48 및 72)로부터, 및 CDV 온더스테푸르트 (참조 균주) 감염된 세포 (CDV 대조군)으로부터 단백질 용해물을 제조하였다.
도 5: D1701 -V- CDV -H의 1단계 성장 곡선 ( SSGC ). 베로 세포를 모체 바이러스 D1701-V (개방 원) 또는 재조합체 D1701-V-CDV-H (폐쇄 원)로 감염시켰다 (MOI= 3.0).
도 6. 면역형광에 의한 CDV -H 특이 항체의 검출. 재조합체 D1701-V-CDV-H (10⁷ pfu)로 면역화된 (i.m.) 마우스의 혈청 (1:1,000 희석), 도 6A-C는 CDV 균주 온더스테푸르트로 감염된 베로 세포를 나타낸다. 화살표는 마우스 항혈청과의 특이 반응을 나타낸다. 도 6D는 감염되지 않은 베로 세포를 나타낸다.
도 7: 클로닝된 H 유전자 단편의 서열. 개 디스템퍼 바이러스 H 단백질의 코딩 영역 (서열 1; 1,824 nt) + 제한 효소 클로닝 및 분석을 위한 링커 서열로서 5'-말단 상의 20 nt 및 3'-말단 상의 21 nt (BamHI 및 KpnI). ATG 출발 코돈은 밑줄로 표시되어 있다.
도 8: 클로닝된 F 유전자 단편의 서열. 개 디스템퍼 바이러스 F 단백질의 코딩 영역 (서열 2; 1,989 nt) + 제한 효소 클로닝 및 분석을 위한 링커 서열로서 5'-말단 상의 19 nt 및 3'-말단 상의 16 nt (BamHI 및 KpnI). ATG 출발 코돈은 밑줄로 표시되어 있다.

발명의 상세한 설명

본원에서 달리 정의되지 않는 한, 본 발명과 관련하여 사용되는 과학 용어 및 기술 용어는 당업자가 통상 이해하고 있는 의미를 가져야 할 것이다. 추가로, 문맥상 달리 요구되지 않는 한, 단수로 사용되는 용어는 복수의 것을 포함하여야 하며, 복수로 사용되는 용어는 단수의 것을 포함하여야 할 것이다.

하기 정의는 본 발명의 실시양태의 설명에서 사용되는 용어에 적용될 수 있다. 하기 정의는 본원에 참고로 포함된 각각의 개별 참고 문헌에 포함된 임의의 모순되는 정의를 대신한다.

측정가능한 수적 변수와 관련하여 사용될 때, "약" 또는 "대략"이라는 것은 명시된 변수값과 명시된 값의 실험상 오차 범위내 (예컨대, 평균에 대해 95% 신뢰 구간내) 또는 명시된 값의 10% 내에 있는 것으로, 어느 것이든 더 큰 범위내에 있는 모든 변수값을 의미하며, 단, 주 단위로 표시된 시간 간격과 관련하여 약이 사용되는 경우는 제외되는데, 여기서, "약 3주"는 17 내지 25일이고, 약 2 내지 약 4주는 10 내지 40일이다.

본원에서 사용되는 바, "동물" 및 "대상체"라는 용어는 사육종 및 야생종 둘 모두의, 포유동물을 비롯한, 개 디스템퍼에 감염되기 쉬운 임의의 동물을 포함한다.

본원에서 사용되는 바, "항체"는 기원, 제조 방법, 또는 다른 특징과는 상관없이, 항원-결합부를 포함하는 임의의 폴리펩티드이다. 이는 항원에 대한 면역 반응의 결과로서 상기 항원에 특이적으로 결합하는 이뮤노글로불린 분자 또는 그의 단편을 지칭한다. 이뮤노글로불린은 "불변" 및 "가변" 영역을 가진 "경쇄" 및 "중쇄" 폴리펩티드 쇄로 구성된 혈청 단백질이며, 이는 불변 영역의 조성에 기초하여 각 부류로 분류된다 (예컨대, IgA, IgD, IgE, IgG, 및 IgM). 주어진 항원에 대해 "특이적인" 항체는 항체의 가변 영역이 배타적으로 특이 항원을 인식하고, 그에 결합한다는 것을 나타낸다. 상기 용어는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 단일특이성 항체, 다중특이성 항체, 인간화된 항체, 사량체 항체, 4가 항체, 다중특이적 항체, 단일 쇄 항체, 도메인-특이 항체, 단일 도메인 항체, 도메인-결실 항체, 융합 단백질, ScFc 융합 단백질, 단일 쇄 항체, 키메라 항체, 합성 항체, 재조합 항체, 하이브리드 항체, 돌연변이화된 항체, 및 CDR-그라프팅된 항체를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 항체는 천연 공급원으로부터, 또는 재조합 공급원으로부터 유래된 무손상 이뮤노글로불린일 수 있거나, 또는 무손상 이뮤노글로불린의 면역반응성 부분일 수 있다. "항체"는 항원-결합 단백질로 전환될 수 있으며, 이는 Fab, F(ab')₂, Fab' 단편, Fv 단편, 단일 쇄 Fv (ScFv) 단편, Fd 단편, dAb 단편, 디아바디, CDR3 펩티드, 구속된 FR3-CDR3-FR4 펩티드, 나노바디, 2가 나노바디, 소형 모듈 면역제약 (SMIP), 및 미니바디 및 상기 언급된 단편 중 임의의 것 및 그의 화학적으로 또는 유전적으로 조작된 대응물을 포함하나, 이에 한정되지 않는 항체 단편 뿐만 아니라, 항원-결합 기능을 보유하는 다른 항체 단편도 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 전형적으로, 상기 단편은 항원-결합 도메인을 포함할 것이다. 당업자가 이해하는 바와 같이, 상기 분자 중 임의의 것은 그의 면역원성을 감소시키기 위해, 그의 친화도를 증가시키기 위해, 그의 특이성을 변경시키기 위해, 또는 다른 목적으로 조작될 수 있다 (예를 들어, "배선화")

본원에서 사용되는 바, "항원" 또는 "면역원"이란, 대상체에게 노출되었을 때, 상기 항원에 대해 특이적인 면역 반응을 유도하는 하나 이상의 에피토프 (선형, 입체형, 또는 그 둘 모두)를 함유하는 분자를 의미한다. 항원이라는 용어는 서브유닛 항원 - 천연 상태에서 항원과 결합하고 있는 전체 유기체로부터 분리된 별개의 항원 - 뿐만 아니라, 사멸되거나, 약독화되거나, 또는 불활성화된 박테리아, 바이러스, 진균, 기생충 또는 다른 미생물을 지칭한다. 항원이라는 용어는 또한 항체, 예로서, 항-이디오타입 항체 또는 그의 단편, 및 항원 또는 항원 결정기 (에피토프)를 모방할 수 있는 합성 펩티드 미모토프를 지칭한다. 항원이라는 용어는 또한 예로서, DNA 면역화 적용에 있어서, 생체내에서 항원 또는 항원 결정기를 발현하는 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 지칭한다.

본원에서 사용되는 바, "항원성"이란 단백질 또는 폴리펩티드에 의해 유발된 항체가 면역특이적으로 결합하도록 할 수 있는 단백질 또는 폴리펩티드의 능력을 의미한다.

"완충제"는 또 다른 화학 물질의 농도 변화를 막는 화학계를 의미한다. 양성자 공여체 및 수용체 시스템이 수소 이온 농도 (pH)의 현저한 변화를 막는 완충제로서의 역할을 한다. 완충제에 대한 추가의 예로는 약산 및 그의 염 (컨쥬게이트 염기) 또는 약염기 및 그의 염 (컨쥬게이트 산)의 혼합물을 함유하는 용액이다.

본원에서 사용되는 바, "개"는 개라고 통상 불리는 것을 포함하며, 캐니다에(Canidae) 과의 다른 구성원도 포함한다.

"개 디스템퍼 바이러스"라는 용어는 모노네가비랄레스(Mononegavirales) 목, 파라믹소비리다에 과 모르빌리바이러스 속의 구성원을 지칭한다.

본원에서 사용되는 바, "세포주" 또는 "숙주 세포"라는 용어는 바이러스 복제가 가능하거나, 바이러스가 유지될 수 있는 원핵 또는 진핵 세포를 의미한다.

"세포성 면역 반응" 또는 "세포 매개성 면역 반응"은 T-림프구 또는 다른 백혈구, 또는 그 둘 모두에 의해 매개되는 것이며, 이는 활성화된 T-세포, 백혈구, 또는 그 둘 모두에 의해 생산되는 시토카인, 케모카인, 및 유사 분자의 생산을 포함한다.

"보존적 치환"은 당업계에 정의되어 있고, 당업자에게 공지되어 있으며, 그의 관련된 물리적 특성에 따라 잔기를 분류하는 것으로 이해된다.

본원에서 사용되는 바, "배양물"이라는 용어는 다른 종 또는 유형의 것은 없는 상태하에서 성장하는 세포 또는 미생물 집단을 의미한다.

본원에서 사용되는 바, "DIVA"라는 용어는 감염된 동물을 백신 접종을 받은 동물로부터 구별지을 수 있는 백신 또는 면역원성 조성물을 지칭한다.

"용량"은 대상체에게 제공되는 백신 또는 면역원성 조성물을 의미한다. "제1 용량" 또는 "초회 감작 용량"은 0일째 제공되는 상기 조성물의 용량을 의미한다. "제2 용량" 또는 "제3 용량" 또는 "연간 용량"은 제1 용량 이후에 제공되는 상기 조성물의 양을 의미하는 것으로서, 이는 제1 용량과 동일한 백신 또는 면역원성 조성물일 수 있거나, 그렇지 않을 수도 있다.

"에피토프"는 T-세포 수용체 또는 특이 항체에 결합하는 항원의 특이 부위이며, 이는 전형적으로는 약 3개의 아미노산 잔기 내지 약 20개의 아미노산 잔기를 포함한다.

본원에서 사용되는 바, "부형제"란 항원이 아닌 백신 또는 면역원성 조성물의 임의의 성분을 의미한다.

"단편"은 단백질 또는 유전자의 말단절단된 부분을 지칭한다. "기능적 단편" 및 "생물학적 활성 단편"은 전장 단백질 또는 유전자의 생물학적 특성을 보유하는 단편을 의미한다. "면역학상 활성 단편"은 면역 반응을 유도하는 단편을 의미한다.

본원에서 사용되는 바, "F 단백질"이라는 용어는 개 디스템퍼 바이러스의 융합 단백질을 의미한다.

본원에서 사용되는 바, "H 단백질"이라는 용어는 개 디스템퍼 바이러스의 헤마글루티닌 당단백질을 의미한다.

본원에서 사용되는 바, "이종성"이란 다른 종 또는 균주로부터 유래되었다는 것을 의미한다.

본원에서 사용되는 바, "상동성"이란 같은 종 또는 균주로부터 유래되었다는 것을 의미한다.

"상동성" 또는 "상동성 (%)"은 서열을 정렬하고, 필요한 경우, 서열 상동성 (%)이 최대치에 도달하도록 하기 위해서 갭을 도입하고, 또한 임의의 보존적 치환을 서열 상동성의 일부로서 간주한 후, 비교기 서열(들)에서 잔기와 동일한 후보 서열 중의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 백분율 (%)을 의미한다.

"상동체" 또는 "종 상동체"는 실질적인 폴리뉴클레오티드 서열 상동성을 가지고, 동일하거나, 유사한 생물학적 기능 및/또는 특성을 갖는, 2가지 이상의 상이한 종에서 발견되는 유전자를 포함한다. 바람직하게, 종 상동체를 나타내는 폴리뉴클레오티드 서열은 실시예에서 본원에 기술된 바와 같이, 중간 정도의 엄격한 조건하에서 혼성화할 것이며, 이는 동일하거나, 유사한 생물학적 활성 및/또는 특성을 가질 것이다. 또 다른 측면에서, 종 상동체를 나타내는 폴리뉴클레오티드는 약 60% 초과의 서열 상동성, 약 70% 초과의 서열 상동성, 약 80% 초과의 서열 상동성, 약 90% 초과의 서열 상동성, 약 95% 초과의 서열 상동성, 약 96% 초과의 서열 상동성, 약 97% 초과의 서열 상동성, 약 98% 초과의 서열 상동성, 또는 약 99% 초과의 서열 상동성을 공유할 것이다.

"체액성 면역 반응"은 적어도 부분적으로 항체에 의해 매개되는 면역 반응을 의미한다.

"동일성" 또는 "동일성 (%)"은 두 서열 모두를 정렬하고, 필요한 경우, 서열 동일성 (%)이 최대치에 도달하도록 하기 위해서 갭을 도입하고, 또한 임의의 보존적 치환을 서열 동일성의 일부로서 간주하지 않은 후, 비교기 서열에서 잔기와 동일한 후보 서열 중의 뉴클레오티드 또는 아미노산의 백분율 (%)을 의미한다.

대상체에서 "면역 반응"은 항원에 대한 체액성 면역 반응, 세포성 면역 반응, 또는 체액성 및 세포성 면역 반응을 발생시키는 것을 의미한다. 면역 반응은 진단학적 목적 또는 다른 검사를 위한 것으로 충분할 수 있거나, 또는 질환 인자에 의한 감염에 의해 유발되는, 건강상 유해 효과 또는 그의 합병증을 비롯한, 질환의 징후 또는 증상을 예방하는 데 적절할 수 있다. 면역 반응은 당업계에 공지된, 표준 면역검정 및 중화 검정을 사용하여 측정할 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "면역원성(immunogenic)" 또는 "면역원성(immunogenicity)"은 항원에 대해 특이적으로 면역 반응을 유도할 수 있는 능력을 의미한다.

본원에서 사용되는 바, "면역원성 조성물," 또는 "면역학상 유효량," 또는 "면역 반응을 일으키는 데 효과적인 양"이라는 용어는 동물에게 단독으로 또는 제약상 허용되는 담체와 함께 투여되었을 때 결과적으로 특이 면역 반응 (즉, 면역원성 활성을 가진 반응)을 발생시키는, 면역계에 의해 인식될 수 있는 조성물 또는 항원을 의미한다.

본원에서 사용되는 바, "비내" 투여는 물질, 예컨대, 백신 또는 면역원성 조성물을 코를 통해 또는 그를 경유하여 대상체의 체내로 도입하는 것을 의미하며, 이는 주로 코 점막을 통해 상기 물질을 수송하는 것을 수반한다.

본원에서 사용되는 바, "단리된"이라는 것은 단독으로, 또는 이종성 숙주 세포, 또는 염색체 또는 벡터 (예컨대, 플라스미드, 파지 등) 등에서 그의 천연적으로 발생된 환경으로부터 제거된 것을 의미한다. 단리된 미생물이란 예로서, 그의 천연적으로 발생된 환경으로부터 분리되었을 때와 같이, 예컨대, 배양물 중 유기체에는 실질적으로 다른 미생물이 존재하지 않는 것인 조성물을 의미한다. 임의의 특별히 정의된 물질, 예로서, 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 기술하는 데 사용될 경우, "단리된"이라는 것은 물질-예로서, 폴리펩티드 또는 핵산-이 보통 발견되는 원래의 세포성 환경으로부터 분리된 물질을 의미한다. 따라서, 본원에서 사용되는 바, 단지 일례로서, 본 발명의 폴리뉴클레오티드와 함께 구축된 재조합 세포주는 "단리된" 핵산을 이용한다. 별법으로, 특정의 단백질 또는 특이 면역원성 단편이 백신 또는 면역원성 조성물로서 청구되거나 사용되는 경우, 이들은 그가 자연 상태에서 존재할 수 있는 방식과 비교되는 방식으로 확인되었고, 분리되어 있고, 어느 정도는 정제되어 있는 것이기 때문에, 단리되어 있는 것으로 간주될 것이다. 단백질 또는 그의 특이 면역원성 단편이 항원을 생산하는 재조합 박테리아 또는 진핵 생물 발현 벡터에서 제조된 것이라면, 이는 단리된 단백질 또는 핵산으로서 존재하는 것으로 간주된다. 예를 들어, 폴리뉴클레오티드로 구성된 재조합 세포주는 "단리된" 핵산을 이용한다.

"의약"은 질환의 예방, 치유, 또는 개선, 또는 일부 생리학적 병증 또는 발병의 예방에 유용한 임의의 작용제를 의미한다.

"감염 다중도" (MOI)라는 용어는 세포 1개당 유기체의 개수의 비를 언급하는 것으로, 이는 주어지는 감염에서 얼마나 많은 접종물이 사용되는지를 상세히 설명해 준다.

본원에서 사용되는 바, "모노클로날 항체"는 모두가 특정 항원상의 한 에피토프에 대해 유도된 것인, 단일 하이브리도마 세포주에 의해 생산된 항체를 의미한다. 모노클로날 항체 제조를 위해 사용되는 항원은 병원체의 단리된 단백질 또는 전체 병원체로서 제공될 수 있다. "하이브리도마"는 골수종 세포 및 특이 항체 생산 세포의 융합에 의해 형성된 하이브리드 세포로 이루어진 클론 세포주이다. 일반적으로, 모노클로날 항체는 마우스 기원의 것이다. 그러나, 모노클로날 항체는 또한 파지 디스플레이 기술, 또는 파지 디스플레이와 등가인 방법에 의해 제조된 항원의 특정 에피토프에 대하여 제조된 항체, 또는 비-마우스 기원의 하이브리드 세포로 이루어진 클론 집단을 의미한다.

본원에서 사용되는 바, "경구" 또는 "경구적" 투여는 물질, 예컨대, 백신 또는 면역원성 조성물을 입을 통해 또는 그를 경유하여 대상체의 체내로 도입하는 것을 의미하며, 이는 연하 또는 경구 점막을 통해 상기 물질을 수송하는 것 (예컨대, 설하 또는 협측 흡수), 또는 그 둘 모두를 포함한다. 기관내 투여 또한 경구 또는 경구적 투여의 한 수단이다.

본원에서 사용되는 바, "구비강" 투여는 예를 들어, 하나 이상의 소적을 비내에 배치함으로써 발생하는 것과 같이, 물질, 예로서, 면역원성 조성물 또는 백신을 코와 입을 통해 또는 그를 경유하여 대상체의 체내로 도입하는 것을 의미한다. 구비강 투여는 경구 및 비내 투여와 관련된 수송 과정을 수반한다.

본원에서 사용되는 바, "파라폭스바이러스," "파라폭스바이러스 균주"라는 용어는 폭스비리다에 과 및 파라폭스바이러스 속에 속하는 바이러스를 지칭한다.

본원에서 사용되는 바, "파라폭스바이러스 오비스" 및 "ORFV"라는 용어는 폭스비리다에 과 및 파라폭스바이러스 속, 및 파라폭스바이러스 오비스 종에 속하는 바이러스를 지칭한다. 이러한 바이러스는 또한 전염성 농창 바이러스, 전염성 농포 피부염 바이러스 또는 orf 바이러스로도 명명된다. 이는 다른 폭스바이러스와 구별되는 독특한 나선형 외피를 가지고 있다.

"파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701"이라는 라는 용어는 미국 특허 6,365,393 (본원에 참고로 포함된다)에 기술되어 있는 바이러스를 지칭한다. "파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701-V"는 원숭이 세포주 베로에 대해 적합화된 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701을 지칭한다.

"비경구 투여"는 물질, 예로서, 백신 또는 면역원성 조성물을, 소화관을 포함하지 않는 경로를 통해 또는 그를 경유하여 대상체의 체내로 도입하는 것을 의미한다. 비경구 투여는 피하, 근육내, 경피, 진피내, 복강내, 안내, 및 정맥내 투여를 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본원에서 사용되는 바, "병원체" 또는 "병원성 미생물"이라는 용어는 그의 숙주 동물에서 질환, 질병 또는 비정상적인 상태를 유도 또는 유발할 수 있는 미생물-예를 들어, 개 디스템퍼 바이러스-을 의미한다.

"제약상 허용되는"이라는 것은 타당한 의학적 판단의 범주 내에서 대상체의 조직과의 접촉시 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 등이 없이 사용하기에 적합하며, 합리적인 이익-대-위험비에 상응하고, 그의 의도된 용도에 대해 효과가 있는 물질을 언급한다.

본원에서 사용되는 바, "폴리클로날 항체"란 특정 병원체 또는 항원에 대해 제조된 혼합형 항체 집단을 의미한다. 일반적으로, 상기 집단은 다양한 항체군을 포함하는데, 각각의 군은 병원체 또는 항원의 특정 에피토프에 대하여 유도된 것이다. 폴리클로날 항체 제조를 위해, 전체 병원체, 또는 단리된 항원을 접종 또는 감염에 의해 숙주 내로 도입하면, 이는 숙주로 하여금 병원체 또는 항원에 대한 항체를 제조하도록 유도한다.

본원에서 사용되는 바, "폭스바이러스"라는 용어는 폭스비리다에 과에 속하는 바이러스를 지칭한다. 이러한 바이러스는 타원형의 크기가 꽤 큰 이중 가닥 DNA 바이러스이다.

본원에서 사용되는 바, "폴리뉴클레오티드"라는 용어는 쇄의 형태로 공유 결합되어 있는 뉴클레오티드 단량체로 구성된 유기 중합체 분자를 의미한다. DNA (데옥시리보핵산) 및 RNA (리보핵산)가 폴리뉴클레오티드의 일례이며, 이는 생물학적 기능에 있어 차이를 보인다.

본원에서 사용되는 바, "폴리펩티드"라는 용어는 쇄의 형태로 결합되어 있는 2개 이상의 아미노산으로 구성된 유기 중합체 분자를 의미한다.

본원에서 사용되는 바, "예방하다," "예방하는," 또는 "예방" 등의 용어는 미생물 복제를 억제하는 것, 미생물 전파를 억제하는 것, 또는 미생물 자기 스스로가 그의 숙주에서 확립되지 못하도록 억제하는 것을 의미한다. 본원에서 사용되는 바, 상기 용어 등은 또한 감염의 징후 또는 증상 하나 이상을 억제 또는 차단 또는 경감시키는 것을 의미할 수 있다.

백신 또는 면역원성 조성물과 관련하여 본원에서 사용되는 바, "방어," "방어하는," "방어 면역" 등은 백신 또는 면역원성 조성물에서 사용되는 항원(들)이 유래된 유기체에 의해 유발되는 질환의 증상을 백신 또는 조성물이 막거나 감소시킨다는 것을 의미한다. "방어," 및 "방어하는" 등의 용어는 또한 백신 또는 면역원성 조성물이 대상체에 이미 존재하고 있는 질환, 또는 질환의 많은 증상들 중 하나를 치유적으로 치료하는 데 사용될 수 있다는 것을 의미한다.

"재조합적으로 제조된 PPV" 또는 "재조합 PPV"는 그의 게놈 내에 삽입 및/또는 결실을 갖는 PPV이다. 삽입 및 결실은 분자생물학적 방법을 사용함으로써 제조된다.

"특이 결합," "특이적으로 결합하다" 등의 용어는 생리학적 또는 검정 조건하에서 측정이 가능하고, 선택성을 띠는 복합체를 형성하는 2개 이상의 분자로서 정의된다. 적절하게 선택된 조건하에서 특이 결합은 실질적으로 억제되지 않으면서, 동시에 비-특이 결합이 억제되었다면, 항체 또는 다른 억제제가 단백질에 "특이적으로 결합한다"라고 언급할 수 있다. 특이 결합은 고친화도를 특징으로 하며, 화합물 또는 단백질에 대해 선택성을 띤다. 비-특이 결합은 보통 낮은 친화도를 가진다. 예를 들어, IgG 항체의 결합은 일반적으로 친화도가 적어도 약 10^-7 M 이상, 예로서, 적어도 약 10^-8 M 이상, 또는 적어도 약 10^-9 M 이상, 또는 적어도 약 10^-10 이상, 또는 적어도 약 10^-11 M 이상, 또는 적어도 약 10^-12 M 이상인 것을 특징으로 한다. 상기 용어는 또한 예컨대, 항원-결합 도메인이 다수의 항원이 보유하지 않는 특정 에피토프에 대해 특이적이며, 이 경우, 항원-결합 도메인을 보유하는 항체는 일반적으로는 다른 항원에는 결합하지 않게 되는 경우에도 적용될 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "특이 면역원성 단편"은 해당 서열에 대해 특이적인 항체 또는 T 세포에 의해 인식되는 상기 서열의 일부를 지칭한다.

본원에서 사용되는 바, "실질적으로 동일한"이라는 것은 서열 동일성 정도가 약 90% 이상, 약 95% 이상, 약 96% 이상, 약 97% 이상, 약 98%, 또는 약 99% 이상인 것을 의미한다.

본원에서 사용되는 바, "치료 유효량"이라는 용어는 미생물, 또는 서브유닛 항원, 또는 폴리펩티드, 또는 폴리뉴클레오티드, 또는 그의 조합을 투여받은 대상체에서 면역 반응을 유도하기에 충분한 것인 그의 양을 의미한다.

본원에서 사용되는 바, "치료제"는 바이러스, 박테리아, 기생충, 또는 진균 감염, 그에 의해 유발되는 질환 또는 병증의 치료에 도움이 되는, 임의의 분자, 화합물, 바이러스 또는 치료법, 바람직하게, 약독화되거나 사멸된 바이러스, 또는 서브유닛 또는 화합물을 의미한다.

본원에서 사용되는 바, "치료 유효량"은 병원체, 예로서, 바이러스, 박테리아, 기생충 또는 진균 감염에 의해 유발되는, 건강상 유해 효과 또는 그의 합병증을 비롯한, 질환의 징후 또는 증상을 예방하거나 호전시키는 데 적합한 항원 또는 백신 또는 면역원성 조성물을 받은 대상체 (예컨대, 개)에서 면역 반응을 유도하는 항원 또는 백신 또는 면역원성 조성물의 양을 의미한다. 체액 면역 또는 세포 매개성 면역, 또는 체액 및 세포 매개성 면역, 그 둘 모두가 유도될 수 있다. 동물의 항원, 백신, 또는 면역원성 조성물에 대한 면역원성 반응은 항체 역가 측정, 림프구 증식 검정을 통해 간접적으로, 또는 야생형 균주에 의한 시험감염 후의 징후 및 증상의 모니터링을 통해 직접적으로 평가될 수 있다. 백신 또는 면역원성 조성물이 부여하는 방어 면역은 방출된 시험감염 유기체의 감소 및/또는 임상 징후, 예로서, 사망률, 이환율, 온도, 및 대상체의 전반적 신체 상태, 건강, 및 수행능의 감소를 측정함으로써 평가될 수 있다. 백신 또는 면역원성 조성물의 치료 유효량은 사용되는 특정 면역원, 또는 대상체의 상태에 따라 달라질 수 있고, 당업자에 의해 결정될 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "치료하다," "치료하는" 또는 "치료" 등의 용어는 미생물에 의한 감염을 예방, 감소, 또는 제거하는 것을 의미한다. 상기 용어 등은 또한 미생물 복제를 감소시키는 것, 미생물 전파를 감소시키는 것, 그의 숙주에서 미생물 자기 스스로를 확립시킬 수 있는 능력을 감소시키는 것, 또는 미생물 자기 스스로가 그의 숙주에서 확립되지 못하도록 방해하는 것을 의미한다. 본원에서 사용되는 바, 상기 용어 등은 또한 미생물에 의한 감염의 징후 또는 증상 하나 이상을 감소, 호전, 또는 제거하거나, 미생물에 의한 감염으로부터 회복을 가속화시키는 것을 의미할 수 있다.

본원에서 사용되는 바, "백신 접종하다" 및 "백신 접종하는" 등의 용어는 동물에게 백신 또는 면역원성 조성물을 투여하는 것을 의미한다.

본원에서 사용되는 바, "백신" 및 "백신 조성물"이라는 용어는 감염을 예방 또는 감소시키거나, 또는 감염의 징후 또는 증상 하나 이상을 예방하거나 감소시키는, 변형된 살아있는 상태의, 약독화된, 또는 사멸된 바이러스 또는 박테리아를 포함하는 조성물, 또는 서브유닛 백신, 또는 상기 언급된 것의 임의의 조합을 의미한다. 병원체에 대한 백신의 방어 효과는 보통 대상체에서 면역 반응을 유도함으로써 달성된다. 일반적으로 말하면, 감염 발생의 폐기 또는 감소, 징후 또는 증상의 호전, 또는 감염된 대상체로부터의 미생물 제거 가속화가 백신 조성물의 방어 효과를 나타내는 것이다. 본원에 기술된 백신은 개 디스템퍼 바이러스에 의해 유발되는 감염에 대한 방어 효과를 제공한다.

본원에서 사용되는 바, "변이체"라는 용어는 주어진 단백질 및/또는 유전자 서열의 유도물로서, 여기서, 돌연변이성 차이를 제외하면, 유도된 서열은 주어진 서열과 본질적으로 동일한 것인 것을 의미한다. 상기 차이는 천연적으로 발생되거나, 합성적으로 또는 유전적으로 생성될 수 있다.

"벡터" 또는 "벡터 바이러스"는 이종 DNA를 삽입하는 데 적합한 PPV로서, 이는 삽입되는 DNA를 세포 또는 유기체 내로 수송할 수 있고, 적절하게는, 이종 DNA가 발현될 수 있도록 하는 것이다.

본원에서 사용되는 바, "수의학상 허용되는"이라는 용어는 타당한 의학적 판단의 범주 내에서 동물의 조직과의 접촉시 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 등이 없이 사용하기에 적합하며, 합리적인 이익-대-위험비에 상응하고, 그의 의도된 용도에 대해 효과가 있는 물질을 언급한다.

본원에서 사용되는 바, "수의학상 허용되는 담체"라는 용어는 활성 성분의 생물학적 활성의 유효성을 간섭하지 않으며, 그를 투여받는 수의학상의 대상체에게 독성을 띠지 않는 담체 매질을 지칭한다.

바이러스, 면역원성 조성물, 및 백신

본 발명은 개 디스템퍼 바이러스로부터 유래된 이종 DNA를 포함하는 재조합 파라폭스바이러스의 제조를 위한 파라폭스바이러스의 용도를 포함한다.

한 실시양태에서, 개 디스템퍼 바이러스로부터 유래된 이종 DNA를 포함하는 재조합 파라폭스바이러스의 제조를 위해 파라폭스바이러스 오비스 (PPVO)가 사용된다. 또 다른 실시양태에서, 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701이 사용된다. 상기 균주는 미국 특허 6,365,393; 문헌 [Rziha et al., 2000, J. Biotechnol., 83, 137-145]; 및 [Cottone, et al., 1998, Virus Research, 56, 53-67]에 기술되어 있다. 추가의 실시양태에서, 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701-V가 사용된다.

파라폭스바이러스 내로 삽입되는 유전자 서열로는 개 디스템퍼 바이러스로부터 유래된 이종 DNA를 포함한다. 한 실시양태에서, 이종 DNA는 개 디스템퍼 바이러스의 H 단백질을 코딩하는 유전자, 또는 그의 단편을 포함한다. 한 실시양태에서, 이종 DNA는 서열 1, 또는 서열 1에 대해 98% 이상의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다. 개 디스템퍼 바이러스의 H 유전자를 함유하는 클로닝된 단편의 완전한 서열 (서열 1)은 도 7에 제시되어 있다. 이는 전장 코딩 영역 (1,824 nt)과 함께, 제한 효소 클로닝 및 분석을 위한, 5'-말단 (20 nt) 및 3'-말단 (21 nt) 상의 링커 서열 (BamHI 및 KpnI)을 포함한다. 한 실시양태에서, 이종 DNA는 개 디스템퍼 바이러스의 F 단백질을 코딩하는 유전자, 또는 그의 단편을 포함한다. 한 실시양태에서, 이종 DNA는 서열 2, 또는 서열 2에 대해 98% 이상의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 분자를 포함한다. 개 디스템퍼 바이러스의 F 유전자를 함유하는 클로닝된 단편의 완전한 서열 (서열 2)은 도 8에 제시되어 있다. 이는 전장 코딩 영역 (1,989 nt)과 함께, 제한 효소 클로닝 및 분석을 위한, 5'-말단 (19 nt) 및 3'-말단 (16 nt) 상의 링커 서열 (BamHI 및 KpnI)을 포함한다.

폴리뉴클레오티드 서열에 관해 알고 있다면, 이용될 수 있는, 상기 폴리뉴클레오티드의 모든 가능한 단편들을 쉽게 제조할 수 있다. 따라서, 본 발명은 H 단백질의 단편을 제공한다. 따라서, 본 발명은 F 단백질의 단편을 제공한다. 한 실시양태에서, 기능적 단편을 제공한다. 또 다른 실시양태에서, 생물학적 활성 단편을 제공한다. 단편은 종래 방법, 예로서, 여과 또는 크로마토그래피에 의해 정제될 수 있다. 단편은 당업자에게 공지된 방법에 의해 재조합에 의해서 제조될 수 있다.

재조합 파라폭스바이러스를 제조할 때, 이종 DNA를 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701의 HindIII 단편 H/H 내로 삽입한다. 또 다른 실시양태에서, 이종 DNA를 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701의 HindIII 단편 H/H 내의 VEGF 코딩 서열 또는 인접한 비-코딩 서열 내에 삽입한다. 이종 DNA를 파라폭스바이러스 내로 삽입하는 데 사용되는 방법은 표준 방법으로 당업자에게 공지되어 있다. 이는 미국 특허 6,365,393에 기술되어 있다.

한 실시양태에서, 개 디스템퍼 바이러스로부터 유래된 이종 DNA를 포함하는 재조합 파라폭스바이러스는 파라폭스바이러스 오비스 D1701-V-CDV-H 또는 파라폭스바이러스 오비스 D1701-V-CDV-F이다. 이들 바이러스는 특허 절차상의 미생물 기탁의 국제적 승인에 관한 부다페스트 조약에 따라 영국 보건국 배양물 기탁소(Health Protection Agency Culture Collections: HPA 배양물 기탁소)의 일부인 유럽 세포 배양물 기탁소(European Collection of Cell Cultures: ECACC, 영국 SP4 0JG 윌트셔주 솔즈베리 포튼 다운)에 기탁되어 있다.

플라스미드 pdV-CDV-H (7,975 nt)의 서열은 서열 3이며, 이는 서열 목록에 제시되어 있다.

플라스미드 pdV-CDV-F (8,134 nt)의 서열은 서열 4이며, 이는 서열 목록에 제시되어 있다.

본 발명은 또한 본원에 기술된 서열에 대해 약 99% 이상, 약 98% 이상, 약 97% 이상, 약 96% 이상, 약 95% 이상, 약 93% 이상, 약 90% 이상, 약 85% 이상, 약 80% 이상, 약 75% 이상, 약 70% 이상, 약 65% 이상, 약 60% 이상, 약 55% 이상 및 약 50% 이상의 동일성 및/또는 상동성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다.

본 발명은 또한 중간 정도 내지 고도 엄격성 조건하에서 본원에 기술된 서열 번호의 서열 중 어느 하나, 및 그의 종 상동체의 비-코딩 가닥, 또는 상보체와 혼성화하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함한다. 고도 엄격성 조건의 예는 65℃ 내지 75℃에서 0.2X SSC/0.1% SDS를 포함하는 완충제 중에서 최종으로 세척하는 것을 포함하는 반면, 중간 정도의 엄격성 조건의 예는 35℃ 내지 45℃에서 2X SSC/0.1% SDS를 포함하는 완충제 중에서 최종으로 세척하는 것을 포함한다. 문헌 [Ausubel, et al. (Eds.), Protocols in Molecular Biology. John Wiley & Sons (1994), pp. 6.0.3 to 6.4.10]에 기술되어 있는 바와 같이, 온도 및 완충제, 또는 염 농도를 달리함으로써 등가의 엄격성 조건을 달성할 수 있다는 것이 당업계에서는 이해된다.

재조합 PPV는 세포, 세포주 및 숙주 세포에서 증식될 수 있다. 상기 세포, 세포주 및 숙주 세포는 예를 들어, 제한하는 것은 아니지만, 포유동물 세포 및 비-포유동물 세포일 수 있다. PPV가 증식될 수 있는 세포, 세포주, 및 숙주 세포는 쉽게 공지되어 있고, 당업자에게 이용가능하다. 한 실시양태에서 베로 세포가 사용된다. 다른 실시양태에서, 소 신장 또는 양 고환 세포가 사용된다.

재조합 PPV는 면역원성 조성물 또는 백신에 사용되기 전에 추가로 약독화되거나 불활성화될 수 있다. 약독화 및 불활성화 방법은 당업자에게 주지되어 있다. 약독화 방법은 적합한 세포주 상에서 세포 배양물 중 일련의 계대배양, 자외선 조사, 및 화학적 돌연변이유발을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 불활성화 방법은 포르말린, 베타프로피오락톤 (BPL) 또는 2원 에틸렌이민 (BEI) 처리, 또는 당업자에게 공지된 다른 방법을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

포르말린에 의한 불활성화는 최종 포름알데히드의 농도가 0.05%가 될 때까지 바이러스 현탁액을 37%의 포름알데히드와 혼합함으로써 수행될 수 있다. 바이러스-포름알데히드 혼합물을 실온에서 대략 24시간 동안 일정하게 교반함으로써 혼합한다. 이어서, 적합한 세포주 상에서의 성장에 대해 검정함으로써 남은 살아있는 바이러스에 대해 불활성화된 바이러스 혼합물을 시험한다.

BEI에 의한 불활성화는 최종 BEI의 농도가 1 mM이 될 때까지 본 발명의 바이러스 현탁액을 0.1 M BEI (0.175 N NaOH 중 2-브로모-에틸아민)와 혼합함으로써 수행될 수 있다. 바이러스-BEI 혼합물을 실온에서 대략 48시간 동안 일정하게 교반함으로써 혼합한 후, 최종 농도가 0.1 mM이 될 때까지 1.0 M 나트륨 티오술페이트를 첨가한다. 추가로 2시간 동안 계속하여 혼합한다. 적합한 세포주 상에서의 성장에 대해 검정함으로써 남은 살아있는 바이러스에 대해 불활성화된 바이러스 혼합물을 시험한다.

재조합 PPV는 면역원성 조성물 및 백신 중에 사용될 수 있다.

면역원성 조성물 및 백신은 임의로 제약 비히클, 부형제, 또는 배지로서 작용하는, 액체, 반고체, 또는 고체 희석제를 비롯한, 하나 이상의 수의학상 허용되는 담체를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바, "수의학상 허용되는 담체"로는 임의의 및 모든 용매, 분산 매질, 코팅제, 아주반트, 안정화제, 희석제, 보존제, 항박테리아제, 및 항진균제, 등장화제, 흡수 지연제 등을 포함한다. 희석제로는 물, 염수, 덱스트로스, 에탄올, 글리세롤 등을 포함할 수 있다. 등장화제로는 당업자에게 공지된 것 중에서도 염화나트륨, 덱스트로스, 만니톨, 소르비톨 및 락토스를 포함한다. 안정화제로는 당업자에게 공지된 것 중에서도 알부민을 포함한다. 보존제로는 당업자에게 공지된 것 중에서도 메르티올레이트를 포함한다.

아주반트로는 당업자에게 공지된 것 중에서도 RIBI 아주반트 시스템(리비 인코포레이티드(Ribi Inc.)), 알룸, 수산화알루미늄 겔, 수중유 에멀젼, 유중수 에멀젼, 예로서, 프로인트 완전 및 불완전 아주반트, 블록 공중합체 (CytRx, 미국 조지아주 애틀랜타), SAF-M (키론(Chiron, 미국 캘리포니아주 에머리빌), 암피겐(AMPHIGEN)^? 아주반트, 사포닌, 퀼 A(Quil A), QS-21 (케임브리지 바이오테크 인코포레이티드(Cambridge Biotech Inc., 미국 매사추세츠주 케임브리지)), GPI-0100 (갈렌시아 파마슈티칼스 인코포레이티드(Galenica Pharmaceuticals, Inc., 미국 앨라배마주 버밍엄)) 또는 다른 사포닌 분획, 모노포스포릴 지질 A, 아브리딘 지질-아민 아주반트, 이. 콜라이(E. coli) (재조합체 또는 다른 것)로부터 유래된 열불안정성 내독소, 콜레라 독소, 또는 무라밀 디펩티드를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명과 관련하여 유용한 아주반트 및 첨가제의 양 및 농도는 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다. 한 실시양태에서, 본 발명은 약 50 ㎍ 내지 약 2,000 ㎍의 아주반트를 포함하는 면역원성 조성물 및 백신을 고려한다. 또 다른 실시양태에서 아주반트는 약 100 ㎍ 내지 약 1500 ㎍, 또는 약 250 ㎍ 내지 약 1,000 ㎍, 또는 약 350 ㎍ 내지 약 750 ㎍의 양으로 포함된다. 또 다른 실시양태에서, 아주반트는 면역원성 조성물 또는 백신 2 ml 용량당 약 500 ㎍의 양으로 포함된다.

면역원성 조성물 및 백신은 또한 항생제를 포함할 수 있다. 그러한 항생제로는 아미노글리코시드, 카르바페넴, 세팔로스포린, 당펩티드, 마크로리드, 페니실린, 폴리펩티드, 퀴놀론, 술폰아미드, 및 테트라시클린 부류로부터의 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 한 실시양태에서, 본 발명은 약 1 ㎍/ml 내지 약 60 ㎍/ml의 항생제를 포함하는 면역원성 조성물 및 백신을 고려한다. 또 다른 실시양태에서, 면역원성 조성물 및 백신은 약 5 ㎍/ml 내지 약 55 ㎍/ml의 항생제, 또는 약 10 ㎍/ml 내지 약 50 ㎍/ml의 항생제, 또는 약 15 ㎍/ml 내지 약 45 ㎍/ml의 항생제, 또는 약 20 ㎍/ml 내지 약 40 ㎍/ml의 항생제, 또는 약 25 ㎍/ml 내지 약 35 ㎍/ml의 항생제를 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 면역원성 조성물 및 백신은 약 30 ㎍/ml 미만의 항생제를 포함한다.

재조합 PPV 이외에도, 면역원성 조성물 및 백신은 다른 항원도 포함할 수 있다. 항원은 미생물의 불활성화된 전체 또는 부분적인 제제 형태, 또는 유전자 조작 기법 또는 화학적 합성법에 의해 수득된 항원성 분자의 형태로 존재할 수 있다. 본 발명에 따라 사용하는 데 적합한 다른 항원으로는 병원성 박테리아 또는 병원성 바이러스로부터 유래된 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

재조합 개 디스템퍼 바이러스 면역원성 조성물 및 백신은 또한 임의로 하나 이상의 추가의 개 항원, 예로서, 에를리히아 캐니스(Ehrlichia canis), 개 파르보바이러스 (CPV), 개 파라인플루엔자 바이러스 (CPI), 개 아데노바이러스 II형 (CAV-2), 개 아데노바이러스 (CAV), 개 코로나바이러스 (CCV), 렙토스피라 익테로헤모라기아에(Leptospira icterohemorrhagiae) (LI), 렙토스피라 캐니콜라(Leptospira canicola) (LC), 렙토스피라 그립포티포사(Leptospira grippotyphosa) (LG), 렙토스피라 포모나(Leptospira pomona) (LP), 보렐리아 복도페리(Borrelia burgdorferi) 등과의 혼합물을 함유할 수 있다. 항원의 한 조합물은 코로나바이러스 및 렙토스피라 (신종 혈청형 렙토스피라 그립포티포사 및 렙토스피라 포모나 포함)를 포함하거나 또는 포함하지 않는, 개 파르보바이러스, 개 아데노바이러스 및 개 파라인플루엔자의 단리물을 포함한다.

본원에 기술된 면역원성 조성물 및 백신은 CDV에 대해 유효한 면역 반응을 유도하기 위해 동물에게 투여될 수 있다. 따라서, 본원에서는 동물에게 개 디스템퍼 바이러스로부터 유래된 이종 DNA를 포함하는 재조합 파라폭스바이러스를 포함하는 치료 유효량의 면역원성 조성물 또는 백신을 투여하는 단계를 포함하는, CDV에 대해 효과적인 면역 반응을 유도하는 방법을 기술한다. 한 실시양태에서, 본 방법을 통해 결과적으로는 항-H 단백질 혈청 항체가 유도된다. 또 다른 실시양태에서, 본 방법을 통해 결과적으로는 항-F 단백질 혈청 항체가 유도된다.

본원에 기술된 면역원성 조성물 및 백신은 개 디스템퍼 질환에 대해 동물 대상체를 백신 접종하기 위해 동물에게 투여될 수 있다. 면역원성 조성물 및 백신은 동물에서 개 디스템퍼 질환을 예방 또는 치료하기 위해 동물에게 투여될 수 있다. 따라서, 본원에서는 동물에게 개 디스템퍼 바이러스로부터 유래된 이종 DNA를 포함하는 재조합 파라폭스바이러스를 포함하는 치료 유효량의 면역원성 조성물 또는 백신을 투여하는 단계를 포함하는, 개 디스템퍼 질환에 대해 동물을 백신 접종하는 방법, 및 개 디스템퍼 질환을 예방 또는 치료하는 방법을 기술한다.

투여 형태, 투여량, 투여 경로

면역원성 조성물 및 백신은 투여 경로에 따라 다양한 형태로 제조될 수 있다. 예를 들어, 면역원성 조성물 및 백신은 주사용으로 적합한 멸균 수성 용액 또는 분산액의 형태로 제조될 수 있거나, 냉동 건조 기법을 사용하여 동결건조된 형태로 제조될 수 있다. 동결건조된 면역원성 조성물 및 백신은 전형적으로 약 4℃에서 유지되고, 안정화 용액, 예컨대, 염수 또는/및 HEPES 중에서 재구성될 수 있다. 별법으로, 면역원성 조성물 및 백신은 냉동 건조에 의해 보존될 수 있다. 면역원성 조성물 및 백신은 또한 현탁액 또는 에멀젼의 형태로 제조될 수 있다.

면역원성 조성물 및 백신은 치료 유효량의 상기 기술된 재조합 PPV를 포함한다. 정제된 바이러스는 면역원성 조성물 또는 백신 중에 직접 사용될 수 있거나, 또는 추가로 약독화되거나, 또는 불활성화될 수 있다. 전형적으로, 면역원성 조성물 또는 백신은 약 1 x 10² 내지 약 1 x 10¹² PFU, 또는 약 1 x 10³ 내지 약 1 x 10¹¹ PFU, 또는 약 1 x 10⁴ 내지 약 1 x 10¹⁰ PFU, 또는 약 1 x 10⁵ 내지 약 1 x 10⁹ PFU, 또는 약 1 x 10⁶ 내지 약 1 x 10⁸ PFU로 함유한다. 방어 효과를 제공하는 데 효과적인 면역원성 조성물 또는 백신 중의 바이러스에 대한 정확한 양은 당업자에 의해 결정될 수 있다.

면역원성 조성물 및 백신은 일반적으로 수의학상 허용되는 담체를 약 0.5 ml 내지 약 5 ml 사이의 부피로 포함한다. 또 다른 실시양태에서, 담체의 부피는 약 1 ml 내지 약 4 ml 사이, 또는 약 2 ml 내지 약 3 ml 사이이다. 또 다른 실시양태에서, 담체의 부피는 약 1 ml이거나, 또는 약 2 ml이거나, 또는 3 ml이거나, 또는 약 5 ml이다. 면역원성 조성물 및 백신에 사용하기에 적합한 수의학상 허용되는 담체는 본원에 기술된 것 중 임의의 것일 수 있다.

당업자는 투여 이전에 바이러스가 약독화되어야 하는지 또는 불활성화되어야 하는지 여부를 쉽게 결정할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 재조합 PPV는 추가로 약독화될 필요없이 동물에게 직접 투여될 수 있다. 바이러스의 치료 유효량은 동물의 상태, 및 감염 정도를 비롯한, 수개의 인자들 중 임의의 것에 따라 달라질 수 있고, 이는 당업자에 의해 결정될 수 있다.

본 발명의 방법에 따라, 단일 용량이 동물에게 투여될 수 있거나, 또는 별법으로, 약 2 내지 약 10주 간격을 두고 2회 이상의 접종이 실시될 수 있다. 최적의 면역화를 위해 부스팅 요법이 요구될 수 있고, 투여량 요법이 조정될 수 있다. 당업자는 최적의 투여 요법을 쉽게 결정할 수 있다.

면역원성 조성물 및 백신은 혈류 내로, 근육 내로, 또는 내부 기관 내로 직접 투여될 수 있다. 이는 경구적으로 또는 비내로 투여될 수 있다. 비경구 투여에 적합한 수단으로는 정맥내, 동맥내, 복강내, 경막내, 뇌실내, 요도내, 흉골내, 두개내, 근육내, 및 피하를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 비경구 투여에 적합한 장치로는 바늘 (미세바늘 포함) 주사기, 무침 주사기 및 주입 기법을 포함한다.

비경구용 제제는 전형적으로 부형제, 예로서, 염, 탄수화물, 및 완충제 (바람직하게, pH 약 3 내지 약 9, 또는 약 4 내지 약 8, 또는 약 5 내지 약 7.5, 또는 약 6 내지 약 7.5, 또는 약 7 내지 약 7.5로)를 함유할 수 있는 수용액이지만, 일부 적용의 경우, 적합한 비히클, 예로서, 발열원 비함유 멸균수와 함께 사용되는 멸균 비-수성 용액으로서, 또는 건식 형태로서 더욱 적합하게 제제화될 수 있다.

예를 들어, 동결건조에 의해 멸균 조건하에서 비경구용 제제를 제조하는 것은 당업자에게 주지된 표준 제약 기법을 사용함으로써 쉽게 달성될 수 있다.

본원에 기술된 재조합 파라폭스바이러스 및 면역원성 조성물 및 백신은 개 디스템퍼 질환에 대해 동물을 백신 접종하기 위한 의약의 제조에서 사용될 수 있다.

본 발명은 동물 대상체에 존재하는 파라폭스바이러스의 기원을 확인하는 방법을 제공한다.

백신 접종을 받은 동물로부터 감염된 동물을 구별지을 수 있는 백신인 DIVA 백신을 사용하는 백신 접종은 동물 대상체에 존재하는 파라폭스바이러스의 기원을 확인시켜 줄 수 있는 수단을 제공한다. ELISA, 웨스턴 블롯팅 및 PCR을 포함하나, 이에 한정되지 않는 다양한 진단 방법 중 임의의 방법을 통해 이러한 구별을 수행할 수 있다. 상기 방법 및 기타 방법은 당업자에게 쉽게 인식되고, 그에게 공지되어 있다.

본원에 기술된 파라폭스바이러스는 그의 게놈 조성과 발현된 단백질, 둘 모두에서 야생형 균주와 구별화될 수 있다. 그러한 차이를 통해 백신 접종을 받은 동물로부터 감염된 동물을 구별지을 수 있다. 예를 들어, 특정 실험실 시험에서 파라폭스바이러스에 대해 양성인 것으로 검사된 동물이 야생형 파라폭스바이러스 균주를 보유하는지, 또는 앞서 백신 접종을 통해 수득된 재조합 파라폭스바이러스를 보유하는지 여부를 확인할 수 있다.

확인을 위해 다양한 검정법이 사용될 수 있다. 예를 들어, 바이러스는 파라폭스바이러스에 대해 양성인 것으로 검사된 동물로부터 단리될 수 있고, 핵산 기반 검정법은 백신 접종 이전을 나타내는, 파라폭스바이러스 게놈의 존재를 측정하는 데 사용될 수 있다. 핵산 기반 검정법으로는 서던 또는 노던 블롯 분석, PCR, 및 서열분석을 포함한다. 별법으로, 단백질 기반 검정법이 사용될 수 있다. 단백질 기반 검정법에서, 감염이 의심되는 세포 또는 조직을 파라폭스바이러스에 대해 양성인 것으로 검사된 동물로부터 단리시킬 수 있다. 상기 세포 또는 조직으로부터 세포 추출물을 제조할 수 있고, 앞서 접종된 재조합 파라폭스바이러스, 또는 야생형 파라폭스바이러스의 존재를 구별하여 확인시켜 줄 수 있는, 바이러스 단백질에 대한 적절한 항체를 사용하여 예컨대, 웨스턴 블롯팅과 같은 것을 수행할 수 있다.

동물에서 유도된 면역 반응의 정도 및 성질은 다양한 기법을 사용하여 평가될 수 있다. 예를 들어, 접종받은 동물로부터 혈청을 수집하고, 예컨대, 통상의 ELISA로 파라폭스바이러스에 대해 특이적인 항체의 존재 또는 부재에 대해 시험할 수 있다. 세포성 면역 반응의 유도를 나타내는 것으로서, T 세포 증식과 같은 검정법으로 림프성 조직 중 반응성 세포독성 T-림프구 (CTL)를 검출할 수 있다. 관련 기법은 당업계에 주지되어 있으며, 예를 들어 문헌 [Coligan et al. Current Protocols in Immunology, John Wiley & Sons Inc. (1994)]가 있다.

재조합 파라폭스바이러스 오비스 D1701-V-CDV-H가 DIVA 검정법에 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 백신 접종을 받은 동물로부터 감염된 동물을 구별짓기 위해 이를 개 디스템퍼 N-유전자 또는 단백질을 검출하는 검정법에 사용할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 백신 접종을 받은 동물로부터 감염된 동물을 구별짓기 위해 이를 개 디스템퍼 P-유전자 또는 단백질을 검출하는 검정법에 사용할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 백신 접종을 받은 동물로부터 감염된 동물을 구별짓기 위해 이를 개 디스템퍼 L-유전자 또는 단백질을 검출하는 검정법에 사용할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 백신 접종을 받은 동물로부터 감염된 동물을 구별짓기 위해 이를 개 디스템퍼 M-유전자 또는 단백질을 검출하는 검정법에 사용할 수 있다.

재조합 파라폭스바이러스 오비스 파라폭스바이러스 오비스 D1701-V-CDV-F가 DIVA 검정법에 사용될 수 있다. 한 실시양태에서, 백신 접종을 받은 동물로부터 감염된 동물을 구별짓기 위해 이를 개 디스템퍼 N-유전자 또는 단백질을 검출하는 검정법에 사용할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 백신 접종을 받은 동물로부터 감염된 동물을 구별짓기 위해 이를 개 디스템퍼 P-유전자 또는 단백질을 검출하는 검정법에 사용할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 백신 접종을 받은 동물로부터 감염된 동물을 구별짓기 위해 이를 개 디스템퍼 L-유전자 또는 단백질을 검출하는 검정법에 사용할 수 있다. 또 다른 실시양태에서, 백신 접종을 받은 동물로부터 감염된 동물을 구별짓기 위해 이를 개 디스템퍼 M-유전자 또는 단백질을 검출하는 검정법에 사용할 수 있다.

본 발명은 하기의 예시적인, 비-제한적인 실시예에 의해 추가적으로 설명된다.

실시예

실시예 1. CDV H 및 CDV F 단백질을 발현하는 재조합 바이러스 D1701-V-CDV-H 및 D1701-V-CDV-F의 생성

CDV의 H 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 파라폭스바이러스 오비스 뿐만 아니라, CDV의 F 단백질을 코딩하는 유전자를 함유하는 재조합 파라폭스바이러스 오비스를 생성하였다. H 및 F 단백질의 발현을 평가하였다.

재조합 파라폭스바이러스 오비스 D1701-V-CDV-H 및 D1701-V-CDV-F를 생성하기 위해, 파라폭스바이러스 오비스 (PPVO) 벡터 시스템 (미국 특허 6,365,393; 문헌 [Rziha et al., 2000, J. Biotechnol., 83, 137-145]; [Fischer et al., 2003, J. Virol. 77, 9312-9323]; [Henkel et al., 2005, J. Virol. 79, 314-325])을 사용하였다. 바이러스 균주 록본(Rockborn)으로부터 PCR에 의해 CDV H 유전자 및 F 유전자를 수득하고, BamHI - KpnI 제한 분해, 아가로스 겔 (0.8% w/v) 전기영동, 및 퀴아엑스 II(Qiaex II) 겔 추출 (퀴아젠(Qiagen; 독일))에 의한 정제 후, 크기가 1,865 bp (H) 또는 2,024 bp (F)인 BamHI - KpnI DNA 단편으로서 클로닝하였다. 플라스미드 pdV-Rec1 (문헌 [Fischer et al., 2003])을 BamHI 및 KpnI로 이중 분해하고, 결찰을 위해 사용하였다 (패스트 결찰용 키트(Fast ligation kit), 프로메가(Promega; 독일)). 이. 콜라이 DH5αF' (인비트로젠(Invitrogen), 써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific; 독일))의 형질전환 후, 플라스미드 DNA의 BamHI - KpnI 제한 분해에 의해 삽입체-양성 콜로니를 선택하였다. 그 결과로서 전달 플라스미드 pdV-CDV-H (도 1A), 또는 전달 플라스미드 pdV-CDV-F (도 1B)를 수득하였다. 플라스미드 중의 관련된 제한 부위 및 그의 뉴클레오티드 위치는 도에 명시되어 있다. 암피실린 내성 유전자 (AmpiR) 및 T7 및 SP6 프로모터 또한 명시되어 있다. 두 전달 플라스미드는 모두 퀴아젠 플라스미드 맥시 키트(Qiagen Plasmid Maxi Kit) (퀴아젠; 독일)에 의해 제조되었고, 이는 DNA 서열 분석을 위해 사용되었다. 이를 위해, pdV-Rec1 중에서 삽입 부위 상류에 위치하는 프라이머 ORF32N (서열 5;

) 및 삽입 부위 하류에 위치하는 프라이머 ORF31N (서열 6;

) 뿐만 아니라, 내부 H-유전자-특이 프라이머 CDH-F (서열 7;

) 및 CDH-R (서열 8;

)이 각각 사용되었다. 이를 통해 삽입된 H 유전자의 완전한 서열 (서열 1)을 결정지을 수 있었다. 내부 F-유전자-특이 프라이머 CDF-F (서열 9;

) 및 CDF-R (서열 10;

)을 통해 완전한 F 유전자 서열 (서열 2)을 결정지을 수 있었다.

Bluo - Gal 염색에 의한 재조합체 선택

베로 세포 (10⁶개의 세포)를 0.1의 MOI (감염 다중도)의 lacZ-발현 바이러스 D1701-VrV로 감염시키고, 2 hr 후, 제조사의 권고에 따라 뉴클레오펙션에 의해 2 ㎍의 pdV-CDV-H 또는 pdV-CDV-F 플라스미드 DNA로 형질감염시켰다 (아막사 뉴클레오펙터(Amaxa Nucleofector); 론자(Lonza, 독일)). 3-4일 경과 후, 바이러스 용해물을 수거하고, 6-웰 플레이트 (피셔 사이언티픽(Fisher Scientific); 독일) 중 베로 세포 상에서의 역가를 위해 사용하였다. 플라크가 육안으로 관찰가능하게 되었을 때, 아가로스 함유 Bluo-Gal을 (문헌 [Fischer et al., 2003]에) 기술된 바와 같이 오버레이시켰다. 백색 외관을 갖는 바이러스 플라크를 채취하고, (포스페이트 완충처리된 염수 (PBS) 중 4℃에서 밤새) 단일 플라크 용출액을 48-웰 플레이트의 단일 웰 중에서 베로 세포 (1 x 10⁵개의 세포)를 동시 감염시키는 데 사용하였다.

플라크- PCR 에 의한 재조합체 선택

문헌 [Pasamontes et al. (J. Virol. Methods 35:137-141;1991)]의 방법을 변형하여 각 바이러스 플라크 단리물로부터 DNA를 단리시켰다. 바이러스 용해물 (0.2 ml)을 3회에 걸쳐 냉동 (-70℃) 및 해동 (37℃)하고, 20-30 sec 동안 3회에 걸쳐 얼음 상에서 초음파 처리하였다 (초음파 수조). 페놀 및 클로로포름 추출 후, 10 ㎍ 효모 tRNA 또는 3 ㎕ 글리코블루(GlycoBlue) (앰비온(Ambion; 독일))를 첨가하고, 에탄올 침전을 수행하였다. 70% (v/v) 에탄올로 2회에 걸쳐 DNA 펠릿을 세척하고, 건조시킨 후, 14 ㎕ 재증류수 중에 용해시켰다.

CDV H-특이 PCR을 위해, 4 ㎕의 DNA를 얼음 상에서, 4.0 pmol CDH-F (서열 7) 및 4.0 pmol CDH-R (서열 8) 프라이머, 및 5 ㎕ 레디믹스 2X PCR(ReddyMix 2X PCR) (Ab진(Abgene), 써모 피셔 사이언티픽; 독일)로 이루어진 1 ㎕의 프라이머 믹스와 함께 혼합하였다. 98℃에서 2 min 동안 인큐베이션시킨 후, 이어서, 96℃에서 1 min 동안, 65℃에서 30 sec 동안, 72℃에서 30 sec 동안인 것으로 구성된 40회 사이클, 및 72℃에서 2 min 동안 최종 신장 단계를 거쳐 트리오 써모블록(Trio Thermoblock) (바이오메트라(Biometra; 독일))에서 PCR을 수행하였다. 각각 프라이머 CDF-F 및 CDF-R을 사용하고, 동일한 조건을 사용하여 CDV F-특이 PCR을 수행하였는데, 단, (65℃ 대신) 68℃에서 30 sec 동안인 것은 예외적이었다. 수평 1% (w/v) 아가로스-에티디움 브로마이드 (0.3 ㎍/ml) 겔 중에서 PCR 산물을 분리하였다. 크기가 686 bp인 H 유전자-특이 PCR 단편을 나타내는, 플라크 단리물로부터의 바이러스 용해물을 희석하고, 상기 기술된 바와 같이, Bluo-Gal 아가로스 오버레이를 사용하여 3회 이상 플라크-정제를 수행하였다. 크기가 766 bp인 F 유전자-특이 PCR 단편을 보이는, 플라스미드 pdV-CDV-F에 의한 형질감염으로부터 수득된 플라크 단리물 또한 H 유전자 함유 바이러스 플라크에 대해 기술된 바와 같이 추가로 플라크-정제를 수행하였다. 마지막으로, H 유전자 또는 F 유전자에 대해 양성인 재조합 바이러스 플라크 단리물의 DNA를 4 ㎕ DNA, 3.95 pmol 프라이머 lacZ-F (서열 11;

), 및 4.13 pmol 프라이머 lacZ-R (서열 12;

)을 사용하여 LacZ 유전자-특이 PCR로 시험하였다. 5 ㎕의 아쿠프라임 수퍼믹스 II(AccuPrime SuperMix II) (인비트로젠, 피셔 사이언티픽; 독일))를 첨가한 후, 98℃에서 2 min 동안 가열한 후, 이어서, 96℃에서 1 min 동안, 62℃에서 30 sec 동안, 및 68℃에서 90 sec 동안인 것으로 구성된 40회 사이클, 및 68℃에서 2 min 동안의 최종 신장 단계를 거쳐 PCR을 수행하였다. 상기 기술된 바와 같이 PCR 산물을 분리하였다. 크기가 508 bp인 LacZ 유전자-특이 단편이 없다는 것은 3회의 플라크 정제 후, 상응하는 재조합 바이러스 플라크 단리물에 LacZ-발현 모체 바이러스 D1701-VrV가 없다는 것을 입증하였다. D1701-V-CDV-H 및 D1701-V-CDV-F의 고역가 바이러스 스톡을 제조한 후, 하기 기술하는 바와 같이 바이러스 DNA를 제조하고, CDV-PCR 및 LacZ-PCR에서 시험하는 데 사용하였다.

재조합 바이러스 플라크의 면역조직화학적 염색 ( IPMA )

삽입된 외래 유전자의 성공적인 발현을 먼저, 24-웰 플레이트 중 베로 세포 상에서 적정된 재조합 바이러스 플라크를 면역조직화학적으로 염색하는 것을 수반하는 IPMA에 의해 검정하였다. 바이러스 플라크 출현 후, 각 웰로부터 배지를 흡인시키고, 층류 후드에서 대략 10 min 동안 플레이트를 열어둔 상태로 방치하여 세포를 건조시켰다. 이후, 세포를 -20℃에서 15-20 min 동안 빙냉 무수 메탄올로 고정시켰다. PBS 중 빙냉 1% (v/v) 소 태아 혈청 (FCS)으로 2회에 걸쳐 세척한 후, 세포를 실온 (RT)에서 90 min 동안 10% (v/v) FCS를 함유하는 PBS로 차단시켰다. 1:2,000으로 희석된, F 단백질에 대한 폴리클로날 토끼 (R) 항혈청 (피. 플라테트(P. Plattet) & 에이. 주르브리겐(A. Zurbriggen) (스위스 베른 대학)으로부터 입수)) (도 2A), 또는 PBS 중의 1% FCS 중에서 1:1,000으로 희석된, 폴리클로날 H 단백질-특이 토끼 항혈청 MC711 (브이. 본 메슬링(V. von Messling) (캐나다 퀘벡 대학)으로부터 입수) (도 2B)과 함께 RT에서 60 min 동안 인큐베이션시켜 외래 유전자 발현을 검출하였다. PBS-T (0.05% (v/v) 트윈(Tween)-20 함유 PBS)로 3회에 걸쳐 세척한 후, 1:2,000으로 희석된, 퍼옥시다제-커플링된 항-토끼 2차 항체 (잭슨-이뮤노레스.(Jackson-ImmunoRes.), 디아노바(DIANOVA; 독일))를 첨가하고, RT에서 60 min 동안 인큐베이션시켰다. PBS-T 및 PBS로 철저하게 세척한 후, 적갈색 양성 염색이 육안으로 관찰될 때까지, 제조사의 설명서에서 권고된 바에 따라 기질 (벡터 노바 레드(Vector Nova Red) (악소라(Axxora; 독일))을 첨가하였다. 음성 대조군으로서 감염되지 않은 세포를 1:100으로 희석된, F 단백질에 대한 폴리클로날 토끼 항혈청과 함께 인큐베이션시켰다 (도 2C). D-1701-VrV 또는 D-1701-V로 감염된 세포를 또한 음성 대조군으로서 사용하였다. 바이러스 플라크 및 감염된 세포는 CDV의 F 단백질 (도 2A) 및 H 단백질 (도 2B)에 대해 강하게 양성을 띠는 것으로 나타났다.

실시예 2. D1701-V-CDV-H 및 D1701-V-CDV-F의 특징 규명

바이러스 스톡 제조

D1701-V-CDV-H 및 D1701-V-CDV-F의 고역가 재조합 바이러스 스톡을 수득하기 위해, 10-20 T150 배양 플라스크 (그라이너(Greiner; 독일))를 0.5의 MOI로 동시에 감염시켰다. 3일 후, 대략 80%의 세포변성 효과 (CPE)가 관찰되었고, 모든 플라스크의 세포 및 상청액을 수거하고, 수집하여 원심분리하였다 (4℃, 13,000 rpm에서 2 hr 동안). 주의하여 상청액을 제거하고, 바이러스 펠릿을 4℃에서 밤새 1-2 ml PBS 중에 용해시켰다. 10 sec 동안 3 펄스 (100 W)로 (각 펄스 사이에는 10 sec의 휴지 기간 존재) 얼음상에서 초음파 처리하여 (소닉 세포 교란기(Sonic cell disruptor), 브랜슨(Branson; 독일))) 바이러스 현탁액을 완전하게 분산시킨 후, 원심분리하여 (4℃에서 10 min 동안, 500-700 x g) 세포 잔해물을 제거하였다. 세포 펠릿을 1.0 ml PBS 중에 재현탁시키면서, 상청액을 얼음상에서 보관하고, 얼음상에서 초음파처리하였다 (20 sec 동안 2회 실시, 그 중간에는 10 sec의 휴지 기간 존재, 이어서 30 sec 동안 1회 실시). 저속으로 원심분리한 후, 상청액을 제1 상청액과 합하고, 분취량으로 분할하고, 적정하고, -70℃에서 보관하였다.

바이러스 DNA 의 특징 규명

베로 세포를 0.5의 MOI로 감염시키고, 2-3일 경과 후 (대략 80% CPE), 트립신 처리 및 4℃에서의 단기간의 저속 원심분리에 의해 수거하였다. 마스터 퓨어 DNA 단리용 키트(Master Pure DNA Isolation Kit) (에피센터 바이오테크놀러지(Epicentre Biotechnology), 바이오짐 사이언티픽(Biozym Scientific); 독일)를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 DNA를 단리시켰다.

CDV H 또는 F 유전자가 올바른 유전자좌에 삽입되었는지를 확인하기 위한 목적으로, 표준 방법에 따라 서던 블롯 혼성화를 위해 2 ㎍ DNA를 제한 효소로 분해하고, 0.8% (w/v) 아가로스 겔 중에서 분리하고, 나일론 막 (지이 헬쓰케어(GE Healthcare; 독일))로 옮겨 놓았다. CDV H 또는 F 유전자-특이 프로브 (CDV-H 또는 CDV-F PCR의 산물)를 겔-단리시키고, 레디프라임(RediPrime) (지이 헬쓰케어; 독일)을 사용하여 방사성 물질 (³²P-dCTP, 엠피 바이오메디칼스(MP Biomedicals; 독일))로 표지하였다. 이어서, 0.5% (w/v) 무지방 분유, 1.0% (w/v) 나트륨 도데실 술페이트 (SDS), 및 0.5 mg/ml 변성된 소 흉선 DNA (KT-DNA, 시그마(Sigma; 독일))를 함유하는 4 X SSPE (1X = 0.18 M NaCl, 10 mM PP, 1 mM EDTA, pH 7.4) 중 50℃인 조건하에서 수행되는 서던 블롯 혼성화에 사용하였다. X선 (코닥 X-오마트(Kodak X-Omat; 독일)) 노출 후, 45℃에서 30-60 min 동안 0.4 N NaOH 중에서 인큐베이션시킨 후, 100℃에서 단기간 동안 0.1 X SSC, 0.5% SDS, 0.2 M 트리스(Tris)-HCl (pH 7.4)에서 인큐베이션시킴으로써 프로브를 필터로부터 제거하였다. 2차 혼성화를 위해, vegF -E 유전자좌를 포함하는 D1701-V의 HindIII 단편 H를 (문헌 [Cottone et al., 1998. Virus Res. 56, 53-67]에) 기술된 바와 같이 사용하였다. 서던 블롯 결과를 통해 H 또는 F 유전자가 D1701-VrV의 게놈 내로 올바르게 삽입되었음을 확인할 수 있었다.

CDV H 또는 F 유전자-특이 RNA 검출

베로 세포를 3-5의 MOI로 감염시키고, 슈어프렙 총 RNA 추출용 키트(SurePrep Total RNA Extraction Kit) (피셔 사이언티픽; 독일)를 사용하여 감염 후 (p.i.) 상이한 시점에 총 RNA를 단리시켰다. 추가로, 시토신 아라비노시드 (AraC; 0.04 mg/ml, 시그마; 독일) 또는 시클로헥시미드 (CHX, 0.1 mg/ml, 서바(Serva; 독일)) 존재하에 감염된 세포로부터 RNA를 추출하여 삽입된 H- 또는 F-유전자의 조기 발현에 대해 시험하였다. 대조군으로서, 감염되지 않은 세포로부터 RNA를 단리시켰다. 포름알데히드를 함유하는 변성 1% 아가로스 겔 중에서 RNA를 분리시키고, (문헌 [Kroczek, R A & Siebert, E. Anal. Biochem. 184:90-95, 1990]에) 기술된 바와 같이 나일론 막으로 옮겨 놓았다. 42℃에서 울트라하이브(UltraHyb) 용액 (앰비온(Ambion; 독일)) 중 혼성화 프로브로서 방사성 물질로 표지된 CDV H 또는 CDV F PCR 단편을 사용하였다. 그 결과, CDV-H 또는 CDV-F 유전자는 ORFV의 조기 vegF -E 프로모터의 제어하에 조절되는 바, 상기 유전자는 최조기 발현되는 것이 명백하게 입증되었다 (문헌 [Rziha et al. 1999, J. Biotechnol., 73, 235-242]).

면역형광에 의한 CDV 의 H 또는 F 단백질 검출

면역형광을 위해, 4-챔버 슬라이드 (비디 팔콘(BD Falcon; 독일)) 중에서 베로 세포 (1 X 10⁵개의 세포/ml)를 1.0의 MOI로 감염시켰다. p.i. 상이한 시점에, 세포를 배지로 세척하고, 37℃에서 15 min 동안 3.7% (v/v) 메탄올 무함유 포름알데히드 (피어스(Pierce), 써모 피셔 사이언티픽; 독일)로 고정시켰다. PBS로 3회에 걸쳐 세척한 후, 37℃에서 5 min 동안 0.2% (v/v) 트리톤(Triton) X-100으로 처리하여 세포를 투과화시켰다. PBS로 세척한 후, 세포를 37℃에서 30-40 min 동안 PBS 주에서 5% FCS로 차단하였다. CDV-H 또는 CDV-F 단백질 검출을 위해, 37℃에서 1 hr 동안 세포를 (1:2,000으로 희석된) 토끼 항-CDV-H 항체, 또는 (1:200으로 희석된) 토끼 항-CDV-F 항체, 및 (1:2,000으로 희석된) 항-토끼-알렉사-555와 함께 인큐베이션시켰다. PBS로 5회 세척한 후, 슬라이드를 37℃에서 30 min 동안 암실에서 1:2,000으로 희석된, 2차 항-토끼 알렉사-555 또는 항-토끼 알렉사-488 항체 (몰레큘라 프로브스(Molecular Probes; 독일))와 함께 인큐베이션시켰다. 음성 대조군으로서, 감염되지 않은 세포를 사용하였다.

루디게르 라우에(Rudiger Raue) 박사 (화이자 인코포레이티드(Pfizer Inc, 영국))로부터 입수한, ORFV-특이 토끼 항혈청 PAS2274를 사용하여 ORFV로 감염시킨 후 여러 후속 시점에 세포를 검출하였다. 혈청을 1% FCS를 사용하여 PBS 중에서 1:100으로 희석하고, 2차 항체인 항-토끼 알렉사-488은 1:2,000으로 희석하여 사용하였다.

팔로이딘(Phalloidin)-647을 사용하여 제조사의 설명서에 따라 (바이오티움(Biotium; 독일)) 액틴 세포골격 염색을 수행한 후, RT에서 20-30 min 동안 암실에서 0.04 ㎍/ml DAPI (4',6'-디아미딘-2'-페닐인돌디히드로클로라이드; 로슈 몰레큘라 바이오케미칼즈(Roche Molecular Biochemicals; 독일))로 핵을 염색하였다. PBS로 철저하게 세척한 후, 슬라이드를 모우이올-다브코(Mowiol-DABCO)로 포매시키고, 악시오비젼(Axiovision) 소프트웨어를 사용하여 자이스 아포톰(Zeiss ApoTome)으로 형광 영상화를 수행하였다. 핵은 DAPI로 염색하였다.

도 3에 제시된 결과를 통해 각각의 재조합체로 감염된 (MOI=1.0) 베로 세포에서 CDV H 단백질 또는 CDV F 단백질이 강력하게 발현되었다는 것이 명백하게 입증되었다. 추가로, 후기 감염된 세포는 항혈청 PAS2274로 특이 염색함으로써 확인할 수 있었다. 감염되지 않은 세포 또는 D1701-V 또는 D1701-VrV로 감염된 세포를 사용함으로써 염색의 특이성을 시험하였다.

웨스턴 블롯팅에 의한 CDV H 또는 F 단백질의 검출

베로 세포 (3 X 10⁵개의 세포)를 3.0의 MOI로 동시에 감염시키고, 5% CO₂ 대기하에 37℃에서 인큐베이션시켰다. p.i. 상이한 시점에 세포와 상청액을 수거하고, 원심분리하고 (4℃에서 10 min 동안 8,900 X g), 세포 침강물을 1.0 ml PBS로 3회에 걸쳐 세척하고, 1% (v/v) 트리톤 X-100을 함유하는 0.15 ml PBS 중에 재현탁시켰다. 얼음상에서 30 min 경과 후, 용해물을 4℃에서 15 min 동안 15,000 X g로 원심분리하고, SDS-PAGE (폴리아크릴아미드 겔 전기영동)를 위해 상청액을 저장하였다. 이를 위해, 용해물 3부를 1부의 4X 듀얼칼라(DualColor) 단백질 로딩 완충제 (퍼멘타스(Fermentas; 독일))와 함께 혼합하고, 5 min 동안 비등시키고, 초음파처리하고, 권고된 바에 따라 (FMC 바이오프로덕츠(FMC Bioproducts), 바이오짐; 독일) 트리스-트리신-SDS 전개 완충제(running buffer)와 함께 8% (w/v) 프로시브50(ProSieve50) 겔을 사용하여 SDS-PAGE함으로써 대략 10 ㎍의 단백질을 분리시켰다. 사전염색된 단백질 래더 (퍼멘타스; 독일)를 분자량 마커로서 사용하였다. 전기영동 후, 제조사의 설명서에 따라 (피어스, 써모 피셔 사이언티픽; 독일) 단백질을 PVDF 막으로 옮겨 놓았다. 실온에서 3시간 동안 3X 로티블록(Rotiblock) (로트(Roth; 독일)) 중에서 막을 차단한 후, 폴리클로날 토끼 항-H 또는 항-F 항혈청 (피. 플라테트 박사 & 에이. 주르브리겐 박사 (스위스 베른 대학)로부터 입수)은 1 X 로티블록 중에서 1:10,000으로 희석된 것으로 사용하였다. 4℃에서 밤새 인큐베이션시킨 후, TBS-T (0.05% v/v 트윈-20을 함유하는 트리스-완충처리된 염수) 중에서 막을 5회에 걸쳐 철저하게 세척하고, RT에서 1 hr 동안 퍼옥시다제-커플링된 항-토끼 항체 (1:20,000; 잭슨-이뮤노레스., 디아노바; 독일)와 함께 인큐베이션시켰다. TBS-T 세척 후, 권고된 바와 같이 (임모빌론 웨스턴(Immobilon Western), 밀리포어(Millipore; 독일)) ECL 기질을 사용하였다. 화학발광 X선 필름 (CL-X포져(CL-XPosure), 피어스, 써모 피셔 사이언티픽; 독일)을 사용하여 반응된 단백질을 검출하였다.

감염 후 상이한 시점에 예상 분자량 (H = 80 kDa; F0 = 60 kDa, F1 = 40 kDa)을 가진 CDV H 또는 F 단백질의 발현을 확인하였다. 도 4는 대표적으로 CDV의 F 단백질의 검출을 나타내는 것이다. 상부 패널은 절단된 (F1) CDV 유전자 산물을 검출하는, 폴리클로날 F-특이 토끼 항혈청과의 반응을 나타낸다. 중간 패널은 액틴-β 단백질 검출을 나타내는 것으로, 이를 통해 유사한 양의 단백질이 각 웰에 로딩되었음이 입증된다. 하부 패널은 후기 ORFV 주요 외피 단백질 (F13L)의 검출을 나타내는 것이다.

시험관내 바이러스 생산

CDV 유전자의 ORFV 벡터 게놈 내로의 삽입이 바이러스 성장에 영향을 줄 수 있는지 여부를 시험하기 위해, 적정 실험, 또는 1단계 바이러스 성장 곡선 (SSGC)에 의해 재조합체의 바이러스 생산을 모체 D1701-V와 비교하였다. D1701-V-CDV-H 바이러스에 대해서 도 5에 대표적으로 제시된 바와 같이, 감염 후 (p.i.) 명시된 시간에 총 세포 용해물을 수거하고, 3중으로 적정하였다. 감염성 자손 생산은 모체 D1701-V 바이러스와 구별하기가 어려웠다. 본 실험은 CDV 유전자의 삽입이 모체 벡터 바이러스와 비교하여 시험관내 성장 특징을 변경시키는 것은 아니라는 결론을 지지한다.

실시예 3. 면역형광에 의한 CDV-H 특이 항체 검출

베로 세포를 CDV 균주 온더스테푸르트 (도 6A-C)로 감염시키거나, 감염시키지 않고 (도 6D), 고정시키고, 근육내로 재조합 D1701-V-CDV-H (10⁷ PFU)로 면역화된 마우스의 혈청 (1:1,000로 희석된 것)과 함께 인큐베이션시켰다.

세포 핵을 DAPI로 염색하였다. 핵외 염색은 마우스 항혈청과의 특이 반응성의 결과였다. 패널 D는 위상차 조명을 나타내는 것이며, 세포 융합을 특징으로 하는 CDV-감염된 세포를 보다 잘 시각화한 것이다.

본 검정을 통해 CDV-H 항원을 발현하는 ORFV 재조합체로 마우스를 면역화시키면 특이 혈청 항체가 생성된다는 것이 입증되었다.

실시예 4. 면역형광에 의한 CDV -F 특이 항체의 검출

4-6주령된 Balb/C 마우스 (n = 5마리/군)를 10⁶ PFU 또는 10⁷ PFU의 D1701-V-CDV-F를 함유하는 것 0.1 ml로 1회, 2회, 또는 3회에 걸쳐 2주 간격으로 근육내로 면역화하였다. 최종 면역화 후로부터 2주가 되는 시점까지 개별 혈청 샘플을 매주 채취하였다. D1701-V-CDV-F의 면역원성을 시험하기 위해, 상기 기술된 프로토콜에 따라 면역형광 및 웨스턴 블롯팅에 의해 혈청을 분석하였다.

종합해 보면, 이들 결과를 통해 ORFV 재조합체 D1701-V-CDV-H 중 CDV H-유전자의 성공적인 발현이 입증되었다. 또한, ORFV 재조합체 D1701-V-CDV-F 중 F-유전자의 성공적인 발현도 입증되었다.

유럽 세포 배양물 기탁소 (ECACC) 11112401 20111124 유럽 세포 배양물 기탁소 (ECACC) 11112402 20111124

SEQUENCE LISTING <110> Martinon, Olivier Michel Reddy, Nanda Kumar D <120> PARAPOXVIRUS VECTORS <130> PC71700 <160> 12 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 1824 <212> DNA <213> canine distemper virus <220> <221> misc_feature <223> H gene <400> 1 atgctctcct accaagacaa ggtgggtgcc ttctataaag ataatgcaag agctaattca 60 tccaagctgt ccttagtgac agaagagcaa gggggcagga gaccacccta tttgctgttt 120 gtccttctca tcctactggt tggaatcatg gccttacttg ctatcactgg agttcgattt 180 caccaagtat caactagcaa tatggaattt agcagattgc tgaaagagga tatggagaaa 240 tcagaggccg tacatcacca agtcatagat gtcttgacac cgctcttcaa aattattgga 300 gatgagattg ggttacggtt gccacaaaaa ctaaacgaga tcaaacaatt tatccttcaa 360 aagacaaact tcttcaatcc gaacagggaa ttcgacttcc gcgatctcca ctggtgcatt 420 aacccaccta gtaagatcaa ggtgaattta actaattact gcgatacaat tgggctcaga 480 aaatctattg catcggcagc aaatcccatc cttttatcag cactctccag aggcagaggt 540 gacatattcc caccatacag atgcagtgga gctactactt cagtaggcag atttttcccc 600 ctatcagtat cattgtccat gtctttgatc tcaagaacat cagagataat caatatgcta 660 accgctatct cagacggagt gtatggtaaa acttatttgc tagtgcctga ttatattgaa 720 ggggagttcg acacgcaaaa gattcgagtc tttgagatag ggttcatcaa acggtggctg 780 aatgacatgc cattactcca gacaaccaac tatatggtcc tcccggagaa ttccaaagcc 840 aaggtatgta ctatagcagt gggcgagttg acactggctt ccttgtgtgt agatgagagc 900 accgtattgt tatatcatga cagcaatggt tcacaagatg gtattctagt agtgacgctg 960 ggaatatttg gggcaacacc tatggatcaa gttgaagagg tgatacctgt cgctcaccca 1020 tcagtagaaa aaatacatat aacaaatcac cgtgggttca taaaagattc aatagcaacc 1080 tggatggtgc ctgcattggt ctctgagaaa caagaggaac aaaaaaattg tctggagtcg 1140 gcttgtcaaa gaaaatccta ccctatgtgc aaccaaacgt catgggaacc ctttggagga 1200 ggacagttgc catcttatgg gcggttgaca ttacctctag atccaagtat tgaccttcaa 1260 cttaacatat cgtttacata cggtccggtt atactgaatg gagacggtat ggattattat 1320 gaaagcccac ttttggactc cggatggctt accattcctc ccaagaacgg aacagtcctt 1380 ggattgataa acaaagcaag tagaggagac cagttcactg taatccccca tgtgttgaca 1440 tttgcgccca gggaatcaag tggaaattgt tatttaccta ttcaaacatt 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acaccactgt cccgaggtat gttgcaacta atggttactt aatatctaat 1320 tttgatgagt catcctgtgt attcgtctca gaatcagcca tttgtagcca gaactcccta 1380 taccccatga gcccgcttct acaacaatgc attaggggcg acacttcatc ttgtgctcgg 1440 accttggtgt ctgggactat gggcaacaag tttattctgt caaaaggtaa tatcgtcgca 1500 aattgtgctt ctatactatg taagtgttat agcacaagca caattatcaa tcagagtcct 1560 gataagttgc tgacatttat tgcctccgat acctgcccac tggttgaaat agatggtgta 1620 actatccagg ttggagggag gcaataccct gatatggtat acgaaagcaa agttgcctta 1680 ggccctgcta tatcacttga gaggttagat gtaggtacaa atttaggaaa cgcccttaag 1740 aaactggatg atgctaaggt actgatagac tcctctaacc agatccttga gacggttagg 1800 cgctcttcct ttcattttgg cagtctcctc agcgttccca tattaatctg tacagccctg 1860 gctttgttgt tgctgattta ctgctgtaaa agacgctacc aacggacatt caagcagaat 1920 actaaggtcg atccgacatt taaacctgat ttgactggaa cttcgaaatc ctatgtaaga 1980 tcactctga 1989 <210> 3 <211> 7975 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> plasmid pdV-CDV-H <400> 3 tatagtgtca cctaaatcgt atgtgtatga tacataaggt tatgtattaa ttgtagccgc 60 gttctaacga caatatgtac aagcctaatt gtgtagcatc tggcttactg aagcagaccc 120 tatcatctct ctcgtaaact gccgtcagag tcggtttggt tggacgaacc ttctgagttt 180 ctggtaacgc cgtcccgcac ccggaaatgg tcagcgaacc aatcagcagg gtcatcgcta 240 gccagatcct ctacgccgga cgcatcgtgg ccggcatcac cggcgccaca ggtgcggttg 300 ctggcgccta tatcgccgac atcaccgatg gggaagatcg ggctcgccac ttcgggctca 360 tgagcgcttg tttcggcgtg ggtatggtgg caggcccgtg gccgggggac tgttgggcgc 420 catctccttg catgcaccat tccttgcggc ggcggtgctc aacggcctca acctactact 480 gggctgcttc ctaatgcagg agtcgcataa gggagagcgt cgatatggtg cactctcagt 540 acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc cagccccgac acccgccaac acccgctgac 600 gcgccctgac gggcttgtct gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc 660 gggagctgca tgtgtcagag gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag acgaaagggc 720 ctcgtgatac gcctattttt ataggttaat gtcatgataa taatggtttc ttagacgtca 780 ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat 840 tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa 900 aggaagagta tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt 960 tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag 1020 ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt 1080 tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg 1140 gtattatccc gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag 1200 aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta 1260 agagaattat gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg 1320 acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta 1380 actcgccttg atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac 1440 accacgatgc ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt 1500 actctagctt cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca 1560 cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag 1620 cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta 1680 gttatctaca cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag 1740 ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt 1800 tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat 1860 aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta 1920 gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa 1980 acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt 2040 tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag 2100 ccgtagttag gccaccactt caagaactct gtagcaccgc ctacatacct cgctctgcta 2160 atcctgttac cagtggctgc tgccagtggc gataagtcgt gtcttaccgg gttggactca 2220 agacgatagt taccggataa ggcgcagcgg tcgggctgaa cggggggttc gtgcacacag 2280 cccagcttgg agcgaacgac ctacaccgaa ctgagatacc tacagcgtga gcattgagaa 2340 agcgccacgc ttcccgaagg gagaaaggcg gacaggtatc cggtaagcgg cagggtcgga 2400 acaggagagc gcacgaggga gcttccaggg ggaaacgcct ggtatcttta tagtcctgtc 2460 gggtttcgcc acctctgact tgagcgtcga tttttgtgat gctcgtcagg ggggcggagc 2520 ctatggaaaa acgccagcaa cgcggccttt ttacggttcc tggccttttg ctggcctttt 2580 gctcacatgt tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccttt 2640 gagtgagctg ataccgctcg ccgcagccga acgaccgagc gcagcgagtc agtgagcgag 2700 gaagcggaag agcgcctgat gcggtatttt ctccttacgc atctgtgcgg tatttcacac 2760 cgcatatggt gcactctcag tacaatctgc tctgatgccg catagttaag ccagtatata 2820 cactccgcta tcgctacgtg actgggtcat ggctgcgccc cgacacccgc caacacccgc 2880 tgacgcgccc tgacgggctt gtctgctccc ggcatccgct tacagacaag ctgtgaccgt 2940 ctccgggagc tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg cgaggcccag 3000 ctggcttatc gaaattaata cgactcacta tagggagacc ggaatttgca ggatcgcgct 3060 gctgtacctg aagatatacg agctcccggg ctgcacgaac ttcctgcacg tggacctgaa 3120 gcccgacaac gtgctcatct tcgacagcgc gcgcgcgctc agcgtgactg cggccggtgc 3180 gacttttcgc ttcgaagagc ccgtgcgcgc ggcgctgaac gacttcgact tcgcgcgcgt 3240 ggccaccatc gagaaccgca agatcgcggg cagcgtccgc gtgccgcaga actggtacta 3300 cgacttccac ttcttcgcgc acacgctgct gcgcgcgtac ccgcacatcg ccgcggagga 3360 cccgggcttc cacgcgctgc tctcggagct cacggtctcg tgctcgcgcg ggacctgcga 3420 ccgcttccgg ctgcgcgtgt cctcgccgca ccccatcgag cacctcgcgc ggctggtgcg 3480 ccgcgacgtc ttctcccgct ggataaatgc cgccgcggac gcccccgacg ccgcactctc 3540 ctgagcccac gcccgcggcg ccgggctcgc tgtacgacgt cttcctcgcg cgcttcctgc 3600 gccagctggc cgcgcgcgcg gcgccggcct cggccgcctg cgccgtgcgc gtgggtgcgg 3660 tgcgcggccg cctgcggaac tgcgagctgg tggtgctgaa ccgctgccac gcggacgctg 3720 ccggcgcgct cgcgctggcc tccgcggcgc tggcggaaac gctggcggag ctgccgcgcg 3780 cggacaggct cgccgtcgcg cgcgagctgg gcgtggaccc agagcacccg gagctgacgc 3840 cggaccccgc ctgcgcgggc gagagcgcgc ttgcgcagaa catcgacatc cagacgctgg 3900 acctgggcga ctgcggcgac cccaaaggcc gccgactgcg cgtggcgctg gtgaacagcg 3960 gccacgcggc cgcaaactgc gcgctcgcgc gcgtagcgac cgcgctgacg cgccgcgtgc 4020 ccgcaagccg gcacggcctc gcggagggcg gcacgccgcc gtggacgctg ctgctggcgg 4080 tggccgcggt gacggtgctc agcgtggtgg cggtttcgct gctgcggcgc gcgctgcggg 4140 tgcgctacca attcgcgcgg ccggccgcgc tgcgcgcgta gccgcgcaaa atgtaaatta 4200 taacgcccat cccgggataa gcttgatatc tgcaggatcc caggtagtcc aacaatgctc 4260 tcctaccaag acaaggtggg tgccttctat aaagataatg caagagctaa ttcatccaag 4320 ctgtccttag tgacagaaga gcaagggggc aggagaccac cctatttgct gtttgtcctt 4380 ctcatcctac tggttggaat catggcctta cttgctatca ctggagttcg atttcaccaa 4440 gtatcaacta gcaatatgga atttagcaga ttgctgaaag aggatatgga gaaatcagag 4500 gccgtacatc accaagtcat agatgtcttg acaccgctct tcaaaattat tggagatgag 4560 attgggttac ggttgccaca aaaactaaac gagatcaaac aatttatcct tcaaaagaca 4620 aacttcttca atccgaacag ggaattcgac ttccgcgatc tccactggtg cattaaccca 4680 cctagtaaga tcaaggtgaa tttaactaat tactgcgata caattgggct cagaaaatct 4740 attgcatcgg cagcaaatcc catcctttta tcagcactct ccagaggcag aggtgacata 4800 ttcccaccat acagatgcag tggagctact acttcagtag gcagattttt ccccctatca 4860 gtatcattgt ccatgtcttt gatctcaaga acatcagaga taatcaatat gctaaccgct 4920 atctcagacg gagtgtatgg taaaacttat ttgctagtgc ctgattatat tgaaggggag 4980 ttcgacacgc aaaagattcg agtctttgag atagggttca tcaaacggtg gctgaatgac 5040 atgccattac tccagacaac caactatatg gtcctcccgg agaattccaa agccaaggta 5100 tgtactatag cagtgggcga gttgacactg gcttccttgt gtgtagatga gagcaccgta 5160 ttgttatatc atgacagcaa tggttcacaa gatggtattc tagtagtgac gctgggaata 5220 tttggggcaa cacctatgga tcaagttgaa gaggtgatac ctgtcgctca cccatcagta 5280 gaaaaaatac atataacaaa tcaccgtggg ttcataaaag attcaatagc aacctggatg 5340 gtgcctgcat tggtctctga gaaacaagag gaacaaaaaa attgtctgga gtcggcttgt 5400 caaagaaaat cctaccctat gtgcaaccaa acgtcatggg aaccctttgg aggaggacag 5460 ttgccatctt atgggcggtt gacattacct ctagatccaa gtattgacct tcaacttaac 5520 atatcgttta catacggtcc ggttatactg aatggagacg gtatggatta ttatgaaagc 5580 ccacttttgg actccggatg gcttaccatt cctcccaaga acggaacagt ccttggattg 5640 ataaacaaag caagtagagg agaccagttc actgtaatcc cccatgtgtt gacatttgcg 5700 cccagggaat caagtggaaa ttgttattta cctattcaaa cattccagat tatggataaa 5760 gatgtcctta ctgagtccaa tttagtggtg ttgcctacac agaattttag atatgtcata 5820 gcaacatatg atatatcccg ggacgatcat gcgattgttt attatgttta tgacccaatc 5880 cggaagattt cttttacgta cccatttaga ctaactacca agggtagacc tgatttccta 5940 aggattgaat gttttgtgtg ggatgacgat ttgtggtgtc accaatttta ccgattcgag 6000 gctgacatca ccaactttac aaccagtgtt gagaatttag tccgtataag attctcatgt 6060 aaccgttcaa aaccttgaca gtatgatgat acaggtaccg aattcatcgt cgacttcgag 6120 agcttagaat gcgtccccac ggaagaggca aacgtaacga tgcaactcat gggagcgtcg 6180 gtctccggtg gtaacgggat gcaacatctg agcttcgtag agcataagaa atgcgattgt 6240 aaaccaccac tcacgaccac gccaccgacg accacaaggc cgcccagaag acgccgctag 6300 aactttttat ggaccgcata tccaaacgat gatgcgatca ggtcatgcgg aaggaggctc 6360 cacggagcaa agtgaaaaag gaccgcctag agtcgagacc cctccctccc gcctcgggca 6420 aacccacagc cgccgcaaac accacacccg ccgacctacc atgcacccct cgccgcgccg 6480 gctgctcggc gcgctcgcgc tgctggcgct gggcttcgct cggcgcgctc ttcgccccgc 6540 ggcgccgctc gtgccggccg ccttcctgga ggtggggcac gtgcgcgcga acccgtccgc 6600 ctcggtgacc tgcctcacgg tgggcggcga cgggcggcac atggcggcgg tcgcgcacgg 6660 cggcgggacg ctctcgccgg tgtacccgct ggccgccggc atgcacgcga ccttctcctc 6720 cgcgcgcaag ggcgcgctgc tgctgaacgt cgcgaccgtg actgtgtacg acgtgcgcgc 6780 gctcgccccc gagttcgagc tcgtctgcat cgcggtggtc ggcggctaca actcggccgc 6840 ggccgccacg cggcccgcgg ccgagtggca ccgccagctg gagctgcgcc gctcggagct 6900 gtgacccctc cctccccggt ctccctctgt ctttgtaatc ggccttagag attagacatc 6960 atcctccacg cctctttgtc cgccgccctt cttcgcggac ggatgaacca attaattaat 7020 tatttttgtc gctcgcccgc tcactccggc aagggaacga gtgacgttaa ctctctcacc 7080 ctcacgcaca agaacaagaa ccgctcactc accgggcaag ggaacacggt taaggtcaac 7140 tcactcgcga gaacaagttg accctcactc tagagaacga ggaacgggca acaagcaacc 7200 gtcaactcac ttaccacgag aacaagttga ccgccactca aagggaacag agaacagtaa 7260 ccgttctcgc tcgctcggaa caatagaaca agttaacgtc aactcgctcg ctcggtgtaa 7320 gagaacaaca gaacaagcaa ctgttgacca ctcaaccccc ggagaagaga acaagagagc 7380 agtcaactca cccactcagt cttggatgag aggaggacga gttaacgagt actcgcacgc 7440 agagtgagag agtgaggaca taataatagt taacgagtta atactcactc gctcactcag 7500 agtgagagag aaccagtgag cgagttaacc gcgcacacga gcgagagaac agtgaactgc 7560 tcgcgcgctc gctcggtagc agtcggcctt tcttaaaacg gttcgtaaaa cttttcccga 7620 gacagttcac cctccaaaac ttttaaaact aaactcggag gtggcctgcc ctccactctc 7680 cgtaaaactt ttgtaaaact gtcggaggtc ggtcgacttc gcaactcgtc cgcgaaaact 7740 tttcgtgggc agtgtctgcc tctctcaggc tcctcgcatc actttcgcgg agcctcgagg 7800 taggtcacct ctctccaaac ttttgtaaaa actttttcgc ggagcctctg gaggccgtcc 7860 tccctccaaa acttttcgta aaatctcttc ggaggccgtc ctccctccaa aacttttcgt 7920 aaaatctttg ggaggtcgac ctccctcaaa actttttata aagtagcttg tattc 7975 <210> 4 <211> 8134 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> plasmid pdV-CDV-F <400> 4 tatagtgtca cctaaatcgt atgtgtatga tacataaggt tatgtattaa ttgtagccgc 60 gttctaacga caatatgtac aagcctaatt gtgtagcatc tggcttactg aagcagaccc 120 tatcatctct ctcgtaaact gccgtcagag tcggtttggt tggacgaacc ttctgagttt 180 ctggtaacgc cgtcccgcac ccggaaatgg tcagcgaacc aatcagcagg gtcatcgcta 240 gccagatcct ctacgccgga cgcatcgtgg ccggcatcac cggcgccaca ggtgcggttg 300 ctggcgccta tatcgccgac atcaccgatg gggaagatcg ggctcgccac ttcgggctca 360 tgagcgcttg tttcggcgtg ggtatggtgg caggcccgtg gccgggggac tgttgggcgc 420 catctccttg catgcaccat tccttgcggc ggcggtgctc aacggcctca acctactact 480 gggctgcttc ctaatgcagg agtcgcataa gggagagcgt cgatatggtg cactctcagt 540 acaatctgct ctgatgccgc atagttaagc cagccccgac acccgccaac acccgctgac 600 gcgccctgac gggcttgtct gctcccggca tccgcttaca gacaagctgt gaccgtctcc 660 gggagctgca tgtgtcagag gttttcaccg tcatcaccga aacgcgcgag acgaaagggc 720 ctcgtgatac gcctattttt ataggttaat gtcatgataa taatggtttc ttagacgtca 780 ggtggcactt ttcggggaaa tgtgcgcgga acccctattt gtttattttt ctaaatacat 840 tcaaatatgt atccgctcat gagacaataa ccctgataaa tgcttcaata atattgaaaa 900 aggaagagta tgagtattca acatttccgt gtcgccctta ttcccttttt tgcggcattt 960 tgccttcctg tttttgctca cccagaaacg ctggtgaaag taaaagatgc tgaagatcag 1020 ttgggtgcac gagtgggtta catcgaactg gatctcaaca gcggtaagat ccttgagagt 1080 tttcgccccg aagaacgttt tccaatgatg agcactttta aagttctgct atgtggcgcg 1140 gtattatccc gtattgacgc cgggcaagag caactcggtc gccgcataca ctattctcag 1200 aatgacttgg ttgagtactc accagtcaca gaaaagcatc ttacggatgg catgacagta 1260 agagaattat gcagtgctgc cataaccatg agtgataaca ctgcggccaa cttacttctg 1320 acaacgatcg gaggaccgaa ggagctaacc gcttttttgc acaacatggg ggatcatgta 1380 actcgccttg atcgttggga accggagctg aatgaagcca taccaaacga cgagcgtgac 1440 accacgatgc ctgtagcaat ggcaacaacg ttgcgcaaac tattaactgg cgaactactt 1500 actctagctt cccggcaaca attaatagac tggatggagg cggataaagt tgcaggacca 1560 cttctgcgct cggcccttcc ggctggctgg tttattgctg ataaatctgg agccggtgag 1620 cgtgggtctc gcggtatcat tgcagcactg gggccagatg gtaagccctc ccgtatcgta 1680 gttatctaca cgacggggag tcaggcaact atggatgaac gaaatagaca gatcgctgag 1740 ataggtgcct cactgattaa gcattggtaa ctgtcagacc aagtttactc atatatactt 1800 tagattgatt taaaacttca tttttaattt aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat 1860 aatctcatga ccaaaatccc ttaacgtgag ttttcgttcc actgagcgtc agaccccgta 1920 gaaaagatca aaggatcttc ttgagatcct ttttttctgc gcgtaatctg ctgcttgcaa 1980 acaaaaaaac caccgctacc agcggtggtt tgtttgccgg atcaagagct accaactctt 2040 tttccgaagg taactggctt cagcagagcg cagataccaa atactgtcct tctagtgtag 2100 ccgtagttag 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tgcatgtgtc agaggttttc accgtcatca ccgaaacgcg cgaggcccag 3000 ctggcttatc gaaattaata cgactcacta tagggagacc ggaatttgca ggatcgcgct 3060 gctgtacctg aagatatacg agctcccggg ctgcacgaac ttcctgcacg tggacctgaa 3120 gcccgacaac gtgctcatct tcgacagcgc gcgcgcgctc agcgtgactg cggccggtgc 3180 gacttttcgc ttcgaagagc ccgtgcgcgc ggcgctgaac gacttcgact tcgcgcgcgt 3240 ggccaccatc gagaaccgca agatcgcggg cagcgtccgc gtgccgcaga actggtacta 3300 cgacttccac ttcttcgcgc acacgctgct gcgcgcgtac ccgcacatcg ccgcggagga 3360 cccgggcttc cacgcgctgc tctcggagct cacggtctcg tgctcgcgcg ggacctgcga 3420 ccgcttccgg ctgcgcgtgt cctcgccgca ccccatcgag cacctcgcgc ggctggtgcg 3480 ccgcgacgtc ttctcccgct ggataaatgc cgccgcggac gcccccgacg ccgcactctc 3540 ctgagcccac gcccgcggcg ccgggctcgc tgtacgacgt cttcctcgcg cgcttcctgc 3600 gccagctggc cgcgcgcgcg gcgccggcct cggccgcctg cgccgtgcgc gtgggtgcgg 3660 tgcgcggccg cctgcggaac tgcgagctgg tggtgctgaa ccgctgccac gcggacgctg 3720 ccggcgcgct cgcgctggcc tccgcggcgc tggcggaaac gctggcggag ctgccgcgcg 3780 cggacaggct cgccgtcgcg cgcgagctgg gcgtggaccc agagcacccg gagctgacgc 3840 cggaccccgc ctgcgcgggc gagagcgcgc ttgcgcagaa catcgacatc cagacgctgg 3900 acctgggcga ctgcggcgac cccaaaggcc gccgactgcg cgtggcgctg gtgaacagcg 3960 gccacgcggc cgcaaactgc gcgctcgcgc gcgtagcgac cgcgctgacg cgccgcgtgc 4020 ccgcaagccg gcacggcctc gcggagggcg gcacgccgcc gtggacgctg ctgctggcgg 4080 tggccgcggt gacggtgctc agcgtggtgg cggtttcgct gctgcggcgc gcgctgcggg 4140 tgcgctacca attcgcgcgg ccggccgcgc tgcgcgcgta gccgcgcaaa atgtaaatta 4200 taacgcccat cccgggataa gcttgatatc tgcaggatcc acagccgagc cccatgcaca 4260 acaaaatccc caaaagatcc aaaacccaaa cacacaccca acaagacctc cccccacaac 4320 acagcaccaa atccgccgag accaagacct cccaagcacg acacagcata acatcggctc 4380 agcgatccac gcaccatggt cctcgaacat cagacaggcc cgtccactac atcatgaaca 4440 ggaccaggtc ttgcaagcaa gccagctaca gatcggataa catcccggct cacggagacc 4500 acgagggtat tatccatcac acaccagaga gtgtctccca aggagcgaga tcccggttca 4560 aaaggcggca atccaatgca accaactcag gctctcagtg cacctggtta gtcctgtggt 4620 gcatcggaat agccagtctc tttctttgtt ctaaggctca gatacattgg aataatttgt 4680 caactattgg gattatcggg actgacagtg tccattataa gatcatgact aggcccagtc 4740 accagtactt ggtcataaaa ctaatgccta atgtttcact tatagataat tgtaccaaag 4800 cagaattagg tgagtatgag aaattattaa attcagtact cgagccaatc aaccaagctt 4860 tgactctaat gaccaagaat gtgaagcccc tacagtcagt agggtcaggt aggagacaaa 4920 ggcgttttgc aggagtggtg cttgcaggtg cagccttagg agtggccaca gctgcacaaa 4980 tcactgcagg gatagcttta catcaatcca acctcaatgc tcaagcaatc caatctctga 5040 gaactagcct tgaacagtcc aacaaggcta tagaagaaat tagggaggca acccaggaaa 5100 ccgtcattgc cgttcaggga gtccaggatt acgtcaataa tgaacttgtc cctgctatgc 5160 aacatatgtc gtgtgaatta gttgggcaga gattagggtt aaaactgctt aggtattata 5220 ccgagttgtt gtcaatattt ggcccgagtt tacgtgaccc tatttcagcc gagatatcaa 5280 ttcaagcact gagttatgcc cttgggggag aaattcataa gatacttgag aagttgggat 5340 attctggaaa tgatatgatt gcaattttgg agagtcgggg gataaaaaca aaaataactc 5400 atgttgatct ccccgggaaa ctcatcatct taagtatctc atacccaact ttatcagaag 5460 tcaagggggt tatagtccac agactggaag cagtttctta taacataggg tcacaggagt 5520 ggtacaccac tgtcccgagg tatgttgcaa ctaatggtta cttaatatct aattttgatg 5580 agtcatcctg tgtattcgtc tcagaatcag ccatttgtag ccagaactcc ctatacccca 5640 tgagcccgct tctacaacaa tgcattaggg gcgacacttc atcttgtgct cggaccttgg 5700 tgtctgggac tatgggcaac aagtttattc tgtcaaaagg taatatcgtc gcaaattgtg 5760 cttctatact atgtaagtgt tatagcacaa gcacaattat caatcagagt cctgataagt 5820 tgctgacatt tattgcctcc gatacctgcc cactggttga aatagatggt gtaactatcc 5880 aggttggagg gaggcaatac cctgatatgg tatacgaaag caaagttgcc ttaggccctg 5940 ctatatcact tgagaggtta gatgtaggta caaatttagg aaacgccctt aagaaactgg 6000 atgatgctaa ggtactgata gactcctcta accagatcct tgagacggtt aggcgctctt 6060 cctttcattt tggcagtctc ctcagcgttc ccatattaat ctgtacagcc ctggctttgt 6120 tgttgctgat ttactgctgt aaaagacgct accaacggac attcaagcag aatactaagg 6180 tcgatccgac atttaaacct gatttgactg gaacttcgaa atcctatgta agatcactct 6240 gaagcactct ggggtaccga attcatcgtc gacttcgaga gcttagaatg cgtccccacg 6300 gaagaggcaa acgtaacgat gcaactcatg ggagcgtcgg tctccggtgg taacgggatg 6360 caacatctga gcttcgtaga gcataagaaa tgcgattgta aaccaccact cacgaccacg 6420 ccaccgacga ccacaaggcc gcccagaaga cgccgctaga actttttatg gaccgcatat 6480 ccaaacgatg atgcgatcag gtcatgcgga aggaggctcc acggagcaaa gtgaaaaagg 6540 accgcctaga gtcgagaccc ctccctcccg cctcgggcaa acccacagcc gccgcaaaca 6600 ccacacccgc cgacctacca tgcacccctc gccgcgccgg ctgctcggcg cgctcgcgct 6660 gctggcgctg ggcttcgctc ggcgcgctct tcgccccgcg gcgccgctcg tgccggccgc 6720 cttcctggag gtggggcacg tgcgcgcgaa cccgtccgcc tcggtgacct gcctcacggt 6780 gggcggcgac gggcggcaca tggcggcggt cgcgcacggc ggcgggacgc tctcgccggt 6840 gtacccgctg gccgccggca tgcacgcgac cttctcctcc gcgcgcaagg gcgcgctgct 6900 gctgaacgtc gcgaccgtga ctgtgtacga cgtgcgcgcg ctcgcccccg agttcgagct 6960 cgtctgcatc gcggtggtcg gcggctacaa ctcggccgcg gccgccacgc ggcccgcggc 7020 cgagtggcac cgccagctgg agctgcgccg ctcggagctg tgacccctcc ctccccggtc 7080 tccctctgtc tttgtaatcg gccttagaga ttagacatca tcctccacgc ctctttgtcc 7140 gccgcccttc ttcgcggacg gatgaaccaa ttaattaatt atttttgtcg ctcgcccgct 7200 cactccggca agggaacgag tgacgttaac tctctcaccc tcacgcacaa gaacaagaac 7260 cgctcactca ccgggcaagg gaacacggtt aaggtcaact cactcgcgag aacaagttga 7320 ccctcactct agagaacgag gaacgggcaa caagcaaccg tcaactcact taccacgaga 7380 acaagttgac cgccactcaa agggaacaga gaacagtaac cgttctcgct cgctcggaac 7440 aatagaacaa gttaacgtca actcgctcgc tcggtgtaag agaacaacag aacaagcaac 7500 tgttgaccac tcaacccccg gagaagagaa caagagagca gtcaactcac ccactcagtc 7560 ttggatgaga ggaggacgag ttaacgagta ctcgcacgca gagtgagaga gtgaggacat 7620 aataatagtt aacgagttaa tactcactcg ctcactcaga gtgagagaga accagtgagc 7680 gagttaaccg cgcacacgag cgagagaaca gtgaactgct cgcgcgctcg ctcggtagca 7740 gtcggccttt cttaaaacgg ttcgtaaaac ttttcccgag acagttcacc ctccaaaact 7800 tttaaaacta aactcggagg tggcctgccc tccactctcc gtaaaacttt tgtaaaactg 7860 tcggaggtcg gtcgacttcg caactcgtcc gcgaaaactt ttcgtgggca gtgtctgcct 7920 ctctcaggct cctcgcatca ctttcgcgga gcctcgaggt aggtcacctc tctccaaact 7980 tttgtaaaaa ctttttcgcg gagcctctgg aggccgtcct ccctccaaaa cttttcgtaa 8040 aatctcttcg gaggccgtcc tccctccaaa acttttcgta aaatctttgg gaggtcgacc 8100 tccctcaaaa ctttttataa agtagcttgt attc 8134 <210> 5 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer ORF32N <400> 5 gcgcgctgcg ggtgcgctac caattcgcgc 30 <210> 6 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer ORF31N <400> 6 gcatcccgtt accaccggag accgacgctc cc 32 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer CDH-F <400> 7 cagatgcagt ggagctacta cttc 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer CDH-R <400> 8 ggatctagag gtaatgtcaa ccgc 24 <210> 9 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer CDF-F <400> 9 ccctgctatg caacatatgt cgtgtg 26 <210> 10 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer CDF-R <400> 10 cgttatacca tatcagggta ttgcctcc 28 <210> 11 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer lacZ-F <400> 11 cgatactgtc gtcgtcccct caa 23 <210> 12 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer lacZ-R <400> 12 caactcgccg cacatctgaa ct 22

Claims (38)

1. 파라폭스바이러스 및 개 디스템퍼 바이러스(canine distemper virus)로부터 유래된 이종 DNA를 포함하는 재조합 파라폭스바이러스.
2. 제1항에 있어서, 파라폭스바이러스가 파라폭스바이러스 오비스(Parapoxvirus ovis) 바이러스 (ORFV)인 재조합 파라폭스바이러스.
3. 제2항에 있어서, 파라폭스바이러스가 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701인 재조합 파라폭스바이러스.
4. 제3항에 있어서, 파라폭스바이러스 오비스 D1701-V-CDV-H 및 파라폭스바이러스 오비스 D1701-V-CDV-F로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 재조합 파라폭스바이러스.
5. 제1항에 있어서, 이종 DNA가 개 디스템퍼 바이러스의 H 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 H 단백질을 코딩하는 유전자의 단편, 개 디스템퍼 바이러스의 F 단백질을 코딩하는 유전자, 및 상기 F 단백질을 코딩하는 유전자의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 재조합 파라폭스바이러스.
6. 제5항에 있어서, 이종 DNA가 개 디스템퍼 바이러스의 H 단백질을 코딩하는 유전자, 또는 그의 단편인 재조합 파라폭스바이러스.
7. 제5항에 있어서, 이종 DNA가 개 디스템퍼 바이러스의 F 단백질을 코딩하는 유전자, 또는 그의 단편인 재조합 파라폭스바이러스.
8. 제1항에 있어서, 이종 DNA가 서열 1, 서열 1에 대해 약 98% 이상의 동일성을 갖는 서열, 서열 2, 및 서열 2에 대해 약 98% 이상의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 재조합 파라폭스바이러스.
9. 제1항에 있어서, 이종 DNA가 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701의 HindIII 단편 H/H 내에 삽입되어 있는 것인 재조합 파라폭스바이러스.
10. 제9항에 있어서, 이종 DNA가 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701의 HindIII 단편 H/H 내의 VEGF 코딩 서열 또는 인접한 비-코딩 서열 내에 삽입되어 있는 것인 재조합 파라폭스바이러스.
11. 이종 DNA를 파라폭스바이러스의 게놈 내로 삽입하는 단계를 포함하는, 제1항의 재조합 파라폭스바이러스를 제조하는 방법.
12. 제11항에 있어서, 파라폭스바이러스가 파라폭스바이러스 오비스인 방법.
13. 제11항에 있어서, 파라폭스바이러스가 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701인 방법.
14. 제11항에 있어서, 재조합 파라폭스바이러스가 파라폭스바이러스 오비스 D1701-V-CDV-H 및 파라폭스바이러스 오비스 D1701-V-CDV-F로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
15. 제11항에 있어서, 이종 DNA가 개 디스템퍼 바이러스의 H 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 H 단백질을 코딩하는 유전자의 단편, 개 디스템퍼 바이러스의 F 단백질, 및 상기 F 단백질을 코딩하는 유전자의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
16. 제15항에 있어서, 이종 DNA가 개 디스템퍼 바이러스의 H 단백질을 코딩하는 유전자, 또는 그의 단편인 방법.
17. 제15항에 있어서, 이종 DNA가 개 디스템퍼 바이러스의 F 단백질을 코딩하는 유전자, 또는 그의 단편인 방법.
18. 제11항에 있어서, 이종 DNA가 서열 1, 서열 1에 대해 약 98% 이상의 동일성을 갖는 서열, 서열 2, 및 서열 2에 대해 약 98% 이상의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
19. 제1항의 재조합 파라폭스바이러스 및 담체를 포함하는 면역원성 조성물.
20. 제19항에 있어서, 파라폭스바이러스가 파라폭스바이러스 오비스인 면역원성 조성물.
21. 제20항에 있어서, 파라폭스바이러스가 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701인 면역원성 조성물.
22. 제19항에 있어서, 재조합 파라폭스바이러스가 파라폭스바이러스 오비스 D1701-V-CDV-H 및 파라폭스바이러스 오비스 D1701-V-CDV-F로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 면역원성 조성물.
23. 제19항에 있어서, 이종 DNA가 개 디스템퍼 바이러스의 H 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 H 단백질을 코딩하는 유전자의 단편, 개 디스템퍼 바이러스의 F 단백질, 및 상기 F 단백질을 코딩하는 유전자의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 면역원성 조성물.
24. 제23항에 있어서, 이종 DNA가 개 디스템퍼 바이러스의 H 단백질을 코딩하는 유전자, 또는 그의 단편인 면역원성 조성물.
25. 제23항에 있어서, 이종 DNA가 개 디스템퍼 바이러스의 F 단백질을 코딩하는 유전자, 또는 그의 단편인 면역원성 조성물.
26. 제19항에 있어서, 이종 DNA가 서열 1, 서열 1에 대해 약 98% 이상의 동일성을 갖는 서열, 서열 2, 및 서열 2에 대해 약 98% 이상의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 면역원성 조성물.
27. 제1항의 재조합 파라폭스바이러스를 담체와 조합하는 단계를 포함하는, 제19항의 면역원성 조성물을 제조하는 방법.
28. 제27항에 있어서, 파라폭스바이러스가 파라폭스바이러스 오비스인 방법.
29. 제28항에 있어서, 파라폭스바이러스가 파라폭스바이러스 오비스 균주 D1701인 방법.
30. 제27항에 있어서, 재조합 파라폭스바이러스가 파라폭스바이러스 오비스 D1701-V-CDV-H 및 파라폭스바이러스 오비스 D1701-V-CDV-F로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
31. 제27항에 있어서, 이종 DNA가 개 디스템퍼 바이러스의 H 단백질을 코딩하는 유전자, 상기 H 단백질을 코딩하는 유전자의 단편, 개 디스템퍼 바이러스의 F 단백질, 및 상기 F 단백질을 코딩하는 유전자의 단편으로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
32. 제27항에 있어서, 이종 DNA가 서열 1, 서열 1에 대해 약 98% 이상의 동일성을 갖는 서열, 서열 2, 및 서열 2에 대해 약 98% 이상의 동일성을 갖는 서열로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 방법.
33. 동물 대상체에게 치료 유효량의 제19항 내지 제26항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 동물 대상체에서 개 디스템퍼 바이러스에 대한 면역 반응을 유도하는 방법.
34. 제33항에 있어서, 항-H 또는 항-F 단백질-특이 방어 면역 반응이 유도되는 것인 방법.
35. 동물 대상체에게 치료 유효량의 제19항 내지 제26항 중 어느 한 항의 면역원성 조성물을 투여하는 단계를 포함하는, 개 디스템퍼 질환에 대해 동물 대상체를 치료하는 방법.
36. 개 디스템퍼 질환에 대해 동물을 치료하기 위한 의약의 제조에서의 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 재조합 파라폭스바이러스의 용도.
37. 백신 접종을 받은 동물로부터 감염된 동물을 구별짓기 위한 검정에서의 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 재조합 파라폭스바이러스의 용도.
38. 제37항에 있어서, 재조합 파라폭스바이러스가 파라폭스바이러스 오비스 D1701-V-CDV-H 및 파라폭스바이러스 오비스 D1701-V-CDV-F로 이루어진 군으로부터 선택된 것인 용도.

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