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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Expressionsvektoren, ein zur Durchführung des Verfahrens angepasstes Kit, ein im Rahmen des Verfahrens eingesetzten Vektor, eine diesen Vektor enthaltende Zelle sowie die Verwendung des Vektors.
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Ein zentraler Gegenstand der molekularen Klonierung ist die Herstellung von rekombinanten Nukleinsäuremolekülen. Dazu wird ein gewünschtes Nukleinsäuremolekül, in der Regel ein DNA-Fragment oder ein Gen, in einen sogenannten Vektor oder eine "Genfähre", wie bspw. ein Plasmid oder einen viralen Vektor, integriert. Ein Ziel der Klonierung besteht darin, das integrierte DNA-Fragment oder Gen zu vermehren, um seine Eigenschaften zu untersuchen oder in Folgeprozessen weiter zu verwenden. Nach einer Vervielfältigung kann der Vektor isoliert und ein Vielfaches des anfangs eingesetzten DNA-Fragments gewonnen werden. Alternativ können Zellen, in die mittels Klonierung ein DNA-Fragment über einen Vektor eingebracht wurde, ein von dem DNA-Fragment codiertes Genprodukt, z.B. ein Protein oder Peptid, exprimieren. Ein solcher Vektor wird auch als Expressionsvektor bezeichnet.
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Standardisierte Experimente zur Klonierung eines beliebigen DNA-Fragments umfassen im Wesentlichen die folgenden sieben Schritte: (1) Auswahl des Wirtsorganismus und des Klonierungsvektors, (2) Herstellung des Vektors, (3) Herstellung der zu klonierenden DNA, (4) Erzeugung von rekombinanter DNA, (5) Einbringung der rekombinanten DNA in den Wirtsorganismus, (6) Selektion von Organismen, die die rekombinante DNA enthalten, (7) Screening nach Klonen mit der gewünschten klonierten DNA und/oder den gewünschten biologischen Eigenschaften.
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Einer der zeitlimitierenden Faktoren bei der Herstellung von rekombinanten (Expressions-)Vektoren betrifft die Selektion solcher Klone, die das eingebrachte Genprodukt exprimieren. Eine der häufig eingesetzten Methoden ist die sog. Blau-Weiß-Selektion. Ziel der Blau-Weiß-Selektion ist die Identifizierung von Zellen, welche das gewünschte eingebrachte Gen exprimieren. Für die Blau-Weiß-Selektion werden in der Regel bestimmte Plasmide als Vektoren verwendet, die an der Position zur Insertion des Gen von Interesses ("gene of interest") in das Plasmid an der sog. 'Multiple Cloning Site' das Gen für eine β-Galactosidase, das sog. lacZ-Gen, enthalten. Das Gen für die Galactosidase wird als Reportergen verwendet. Durch die Einfügung des Gens von Interesse in die Multiple Cloning Site wird die Galactosidase inaktiviert. Dadurch enthalten nach einer Transformation der Plasmide die transgenen Organismen, im Gegensatz zu den nicht transgenen Organismen, keine funktionsfähige Galactosidase. Die Galactosidase kann den gelben Farbstoff 'X-Gal' in einen blauen Farbstoff und Galactose spalten. Bei Verwendung von X-Gal-Kulturmedium entsteht etwa eine halbe Stunde nach der Induktion durch die in den Zellen enthaltene Galactosidase ein blauer Farbstoff. Bei den transgenen Zellen ist dagegen die Galactosidase inaktiviert, wodurch diese ungefärbt bleiben und anhand ihrer fehlenden Färbung isoliert werden können.
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Diese Selektionsmethode ist sehr zeit- und arbeitsaufwändig. Nicht selten werden insbesondere für die Herstellung von rekombinanten Virus-basierenden Expressionsvektoren bis zu 6 bis 12 Monate benötigt, was bspw. für die Herstellung von saisonal benötigten oder individualisierten Impfstoffen ungünstig ist.
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Andere derzeit im Stand der Technik verwendete Verfahren zur Herstellung bzw. Selektion von rekombinanten Vektoren sind ebenfalls zeit- und arbeitsaufwändig.
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Vor diesem Hintergrund liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Expressionsvektoren bereitzustellen, das weniger arbeitsaufwändig ist und schneller zu den gewünschten rekombinanten Vektoren führt, als dies bei den derzeit verwendeten Verfahren der Fall ist.
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Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Expressionsvektoren, das folgende Schritte aufweist:
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(1) Bereitstellen einer einen Ausgangsvektor enthaltenden Zellpopulation, die ein von dem Ausgangsvektor codiertes erstes Genprodukt derart exprimiert, dass es einem an das erste Genprodukt bindenden ersten Bindemolekül zugänglich ist, wobei in dem Ausgangsvektor die Codierungsnukleotidsequenz für das erste Genprodukt stromauf- und stromabwärts von ersten Rekombinationsnukleotidsequenzen flankiert ist;
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(2) Transfizieren der aus Schritt (1) erhaltenen Zellpopulation mit einem für ein zweites Genprodukt codierenden Transfervektor, wobei in dem Transfervektor die Codierungsnukleotidsequenz für das zweite Genprodukt stromauf- und stromabwärts von zweiten Rekombinationsnukleotidsequenzen flankiert ist, die zu den ersten Rekombinationsnukleotidsequenzen homolog sind;
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(3) Inkubation der aus Schritt (2) erhaltenen Zellpopulation unter Bedingungen, die einen Austausch der Codierungsnukleotidsequenz für das erste Genprodukt gegen die Codierungsnukleotidsequenz für das zweite Genprodukt durch homologe Rekombination der ersten und zweiten Rekombinationsnukleotidsequenzen und die Bildung eines rekombinanten Expressionsvektors ermöglichen;
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(4) Inkubation der aus Schritt (3) erhaltenen Zellpopulation unter Bedingungen, die die Expression des zweiten Genprodukts ermöglichen, ggf. derart, dass es einem an das zweite Genprodukt bindenden zweiten Bindemolekül zugänglich ist, und
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(5) Inkontaktbringen der aus Schritt (4) erhaltenen Zellpopulation mit dem an das erste Genprodukt bindenden ersten Bindemolekül unter Bedingungen, die die Bildung von Komplexen aus erstem Bindemolekül und erstem Genprodukt ermöglichen;
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(6) Abtrennen der Komplexe aus erstem Bindemolekül und erstem Genprodukt von der Zellpopulation, und
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(7) Isolierung der rekombinanten Expressionsvektoren aus der Zellpopulation.
oder/und ggf.
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(5') Inkontaktbringen der aus Schritt (4) erhaltenen Zellpopulation mit dem an das zweite Genprodukt bindenden zweiten Bindemolekül unter Bedingungen, die die Bildung von Komplexen aus zweitem Bindemolekül und zweitem Genprodukt ermöglichen;
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(6') Abtrennen der Komplexe aus zweitem Bindemolekül und zweitem Genprodukt, und
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(7') Isolierung der rekombinanten Expressionsvektoren aus den Komplexen aus zweitem Bindemolekül und zweitem Genprodukt.
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Unter einem "rekombinanten Expressionsvektor" wird ein Vektor verstanden, der die Codierungsnukleotidsequenz für ein gewünschtes Genprodukt, wie bspw. für das zweite Genprodukt aufweist und so konstruiert ist, dass die Codierungsnukleotidsequenz in mRNA transkribierbar und nachfolgend in ein Genprodukt translatierbar ist. Der erfindungsgemäße Expressionsvektor entsteht durch Rekombinationsereignisse, über die die Codierungsnukleotidsequenz für das gewünschte Genprodukt in den Expressionsvektor eingebracht wird. Erfindungsgemäß umfassen "Expressionsvektoren" sog. Plasmidvektoren, virale Vektoren, oder nach jeweils alternativen Ausgestaltungen ggf. auch Bakteriophagenvektoren, Cosmide, Phagemide, Bacmide und Bacs. Plasmidvektoren sind Vektoren, die aus Plasmiden gewonnen werden. Als virale Vektoren werden modifizierte Viren bezeichnet, die eukaryotische Zellen transduzieren und dabei fremde Gene in die Zellen einschleusen können. Bakteriophagen sind Viren, welche Bakterien befallen. Durch das Einbauen von cos-sites aus λ-Phagen in Plasmide erhält man sog. Cosmide. Ein Phagemid ist ein Plasmid, welche einen Origin of Replication zur einzelsträngigen Replikation von F1-Phagen trägt. Ein Bacmid ist ein "Shuttle-Vektor" für Bakterien und Insektenzellen. Bacs bzw. "Bacterial Artificial Chromosome" sind in Bakterien vermehrbare komplette Virusgenome. Die Erfindung ist insbesondere zur Herstellung von rekombinanten viralen Vektoren bzw. rekombinanten Viren, wie bspw. rekombinanten Pockenviren, einschließlich den Parapoxviren (ORFV), geeignet. Die Erfindung betrifft deshalb auch ein Verfahren zur Herstellung bzw. Selektion von rekombinanten viralen Vektoren oder rekombinanten Viren mit den angegebenen Schritten.
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In dem erfindungsgemäßen Verfahren umfasst die "Herstellung" oder das "Herstellen" auch die Selektion oder das Selektieren. Die Erfindung betrifft deshalb auch ein Verfahren zur Selektion von rekombinanten Expressionsvektoren mit den angegebenen Schritten.
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Unter "Ausgangsvektor" wird ein Expressions- oder Klonierungsvektor verstanden, der für das erste Genprodukt codiert, das in der Zelle der erfindungsgemäßen Zellpopulation exprimiert werden kann. Der Ausgangsvektor lässt sich erfindungsgemäß deshalb auch als Ausgangsexpressionsvektor oder Ausgangsklonierungsvektor bezeichnen. Bei dem Ausgangsvektor kann es sich um einen linearen oder zirkulären, einen einzel- oder doppelsträngigen, einen DNA- oder RNA-Vektor handeln.
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Unter "Zellpopulation" wird eine Gruppe von Zellen gleicher Art verstanden, die mit den erfindungsgemäßen Ausgangs- und Transfervektoren transfizierbar sind. Erfindungsgemäß umfassen die "Zellen" biologische Zellen tierischen, pflanzlichen oder bakteriellen Ursprungs. Alternativ kommen auch künstliche bzw. Minimalzellen infrage, wie Nanopartikel, Liposomen, Polymersome, Mikrokapseln etc. Vorzugsweise kommen erfindungsgemäß solche Zellen zum Einsatz, die das erste Genprodukt natürlicherweise nicht exprimieren. Es versteht sich, dass der Ausgangsvektor auch in mehreren verschiedenen Zellpopulationen bereitgestellt werden kann. Insofern ist erfindungsgemäß die Bereitstellung von "zumindest einer" einen Ausgangsvektor enthaltenden Zellpopulation umfasst.
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Unter einem "Genprodukt" wird erfindungsgemäß ein Nukleinsäure-codiertes Molekül verstanden. Beispiele sind Aminosäureabfolgen, Peptide, Proteine oder Proteinfragmente. Das "erste" Genprodukt ist vorzugsweise eine als Selektionsmarker geeignete Entität, bspw. ein Fremd- oder ein Transgen, ggf. aber auch ein Ausgangsvektor-eigenes Genprodukt, das für die Funktion des Vektors nicht essentiell ist. Vorzugsweise handelt es sich bei dem ersten Genprodukt um ein solches, das die Zellen natürlicherweise nicht exprimieren. Das "zweite" Genprodukt ist vorzugsweise ein "Gen von Interesse" (engl.: gene-of-interest), ein Fremd- oder ein Transgen.
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Unter einem "Bindemolekül" wird erfindungsgemäß ein solches Molekül verstanden, das selektiv und spezifisch an das Genprodukt binden und mit diesem einen Komplex bilden kann. Beispiele für erfindungsgemäß geeignete Bindemoleküle sind Antikörper bzw. Immunglobuline, Aptamere und Fragmente hiervon.
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Die Zugänglichkeit des ersten und zweiten Genproduktes für ein Bindemolekül kann auf verschiedene Arten realisiert werden. Beispielsweise ist das erste und/oder zweite Genprodukt auf der Oberfläche der Zellen mit Ausrichtung in das Zelläußere lokalisiert, bspw. als Transmembranprotein. Nach einer weiteren alternativen Ausführungsform ist das erste und/oder zweite Genprodukt auf der Oberfläche eines Viruspartikels mit Ausrichtung in das Virusäußere lokalisiert, bspw. als Virushüllprotein. Nach einer noch weiteren alternativen Ausgestaltung liegen das erste und/oder zweite Genprodukt löslich in der Zelle vor, die Zelle wird permeabilisiert oder lysiert, so dass das erste oder zweite Bindemolekül mit dem ersten und/oder Genprodukt in Kontakt treten kann.
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"Stromaufwärts" bedeutet erfindungsgemäß, dass die Rekombinationsnukleotidsequenzen relativ zu den Codierungsnukleotidsequenzen für das erste und das zweite Genprodukt in Richtung des jeweiligen 5'-Endes lokalisiert sind. "Stromabwärts" bedeutet erfindungsgemäß, dass die Rekombinationsnukleotidsequenzen relativ zu den Codierungsnukleotidsequenzen für das erste und das zweite Genprodukt in Richtung des jeweiligen 3'-Endes lokalisiert sind. Die Codierungsnukleotidsequenzen für das erste und das zweite Genprodukt sind folglich auf beiden Seiten von Rekombinationsnukleotidsequenzen begrenzt bzw. eingerahmt.
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"Transfizieren" bedeutet erfindungsgemäß allgemein das Einbringen eines Vektors, bspw. des Transfervektors, in die Zellen der Zellpopulation. Dies ist erfindungsgemäß nicht auf eukaryotische Zellen begrenzt. Transfizieren umfasst deshalb auch das Transduzieren bzw. das Einbringen eines Vektors in prokaryotische Zellen, bspw. in Bakterienzellen, wie in die Zellen von Escherichia coli. Bei der Verwendung von viralen Vektoren oder rekombinanten Viren als Ausgangsvektoren wird anstatt von transfizieren auch von "infizieren" und anstelle von Transfektion auch von "Infektion" gesprochen.
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Unter einem "Transfervektor" wird erfindungsgemäß ein Transportvehikel bzw. eine "Genfähre" zur Einbringung der genetischen Information für das zweite Genprodukt in die Zellen der Zellpopulation verstanden. Bei dem Transfervektor kann es sich bspw. um einen linearen oder nach einer alternativen Ausgestaltung um einen zirkulären, einen einzel- oder doppelsträngigen, einen DNA- oder RNA-Vektor handeln.
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"Homolog" bedeutet erfindungsgemäß, dass die erste Rekombinationsnukleotidsequenz in einem solchen Maß mit der zweiten Rekombinationsnukleotidsequenz identisch oder zu dieser komplementär ist, dass eine homologe Rekombination stattfinden kann. Die Homologie zwischen der ersten und zweiten Rekombinationsnukleotidsequenz beträgt dabei nach einer Ausführungsform der Erfindung zumindest 90 %, weiter vorzugsweise zumindest 95 %, weiter vorzugsweise zumindest 99 % und höchst vorzugsweise 100 %.
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Ein "Abtrennen" in den Schritten (6) und (6') umfasst das räumliche Trennen der Komplexe aus erstem bzw. zweitem Bindemolekül und erstem und/oder zweitem Genprodukt von der Zellpopulation bzw. verbliebenen Zellpopulation. Diese Abtrennung kann mittels dem Fachmann bekannter physikalischer, chemischer und biologischer Methoden erfolgen. Umfasst sind durchflusszytometrische Methoden, die "magnetic cell separation", bzw. "magnetic activated cell sorting" (MACS), sowie die Immunpräzipitation. Alternativ kann eine Auftrennung über die Dichte erfolgen. Hierzu wird über das erste und/oder zweite Bindemolekül ein schweres Teilchen, wie bspw. Gold oder Blei, oder alternativ ein leichtes Teilchen an den Komplex gebunden und anschließend über Dichteauftrennung von den nicht-komplexierten Zellen abgetrennt. Auch eine Auftrennung über die Größe ist möglich. Das erste und/ oder zweite Bindemolekül wird dabei an eine große Entität, wie bspw. eine Kugel, gebunden. Die Komplexe bzw. Zellen werden auf ein Sieb gegeben. Die großen Komplexe können das Sieb nicht passieren und werden von den kleinen Komplexen bzw. Zellen abgetrennt. Ein solches System wird unter der Bezeichnung PluriBead® angeboten. Auch der Einsatz affinitätschromatographischer Methoden unter Verwendung einer Säulenmatrix oder die Auftrennung im elektrischen Feld ist erfindungsgemäß umfasst, wobei hier die ersten und/oder zweiten Bindemoleküle ein elektrisch geladenes Teilchenaufweisen.
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Das erfindungsgemäße Verfahren kann mit den Schritten (1), (2), (3), (4), (5), (6) und (7) durchgeführt werden. In diesem Verfahrenszweig erfolgt eine sog. "negative Selektion". Die Selektion wird als "negativ" bezeichnet, da nach dem Verlust einer Eigenschaft selektiert wird, nämlich nach dem Verlust des ersten Genproduktes. In Schritt (5) dieses Verfahrenszweigs können sich Komplexe aus erstem Bindemolekül und erstem Genprodukt bilden. In Schritt (6) werden diese Komplexe von der Zellpopulation abgetrennt. Damit werden von der verbleibenden Zellpopulation jene Zellen oder (Ausgangs-)Vektoren abgetrennt, bei denen keine Rekombination und damit kein Austausch der Codierungsnukleotidsequenz für das erste gegen das zweite Genprodukt stattgefunden hat. Die abgetrennten Zellen entsprechen weitgehend jenen aus Schritt (1). Die Zellen der verbliebenen "bereinigten" bzw. depletierten Zellpopulation hingegen exprimieren das erste Genprodukt nicht mehr, können demnach keinen Komplex mit dem ersten Bindemolekül bilden. In den verbliebenen depletierten Zellen hat durch homologe Rekombination ein Austausch der Codierungsnukleotidsequenz für das erste Genprodukt gegen die Codierungsnukleotidsequenz für das zweite Genprodukt und damit die Bildung des gewünschten rekombinanten Expressionsvektors stattgefunden. Der gewünschte rekombinante Expressionsvektor wird in Schritt (7) mittels dem Fachmann bekannten Methoden, die das Aufschließen der Zellen und das Freisetzen des Vektors umfassen, aus den Zellen der verbliebenen Zellsubpopulation isoliert.
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Das erfindungsgemäße Verfahren kann alternativ mit den Schritten (1), (2), (3), (4), (5'), (6') und (7') durchgeführt werden. In diesem Verfahrenszweig erfolgt eine sog. "positive Selektion". Die Selektion wird als "positiv" bezeichnet, da eine Selektion nach dem Erhalt einer Eigenschaft erfolgt, nämlich nach dem zweiten Genprodukt. In Schritt (5') dieses Verfahrenszweigs können sich Komplexe aus zweitem Bindemolekül und zweitem Genprodukt bilden. Von diesen Komplexen werden in Schritt (6') die Zellen der Zellpopulation abgetrennt, in denen keine homologe Rekombination stattgefunden hat und deshalb das zweite Genprodukt nicht exprimiert wird. Die Komplexe aus zweitem Bindemolekül und zweitem Genprodukt enthalten den gewünschten rekombinanten Expressionsvektor, der in Schritt (7') isoliert wird. Nach einer bevorzugten Ausgestaltung weisen die Komplexe bspw. rekombinante Viruspartikel auf, wenn bspw. als Ausgangsvektor ein viraler Vektor verwendet wird und das zweite Genprodukt in das Viruspartikel inkorporiert wurde, aus denen sich in Schritt (7') der rekombinante Expressionsvektor isolieren lässt. Nach einer weiteren alternativen Ausgestaltung weisen die Komplexe Zellen auf, in oder auf denen das zweite Genprodukt vorliegt und aus denen sich in Schritt (7') der rekombinante Expressionsvektor isolieren lässt.
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Nach den Schritten (1), (2), (3) und (4) können die Schritte (5), (6) und (7) und die (5'), (6') und (7') auch parallel durchgeführt werden. Alternativ können auch zunächst die Schritte (5), (6) und (7) und dann die Schritte (5'), (6') und (7') oder umgekehrt durchgeführt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht also eine Kombination aus negativer und positiver Selektion.
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Wenn auf eine "positive Selektion" gänzlich verzichtet werden soll, ist es nicht erforderlich, dass in Schritt (4) die Expression des zweiten Expressionsproduktes derart erfolgt, dass es dem zweiten Bindemolekül zugänglich ist. Die Zugänglichkeit ist also entbehrlich, was durch den Ausdruck "ggf." bzw. "gegebenenfalls" klargestellt wird. Insofern erfolgen die Schritte (5')–(7') nur dann, wenn in Schritt (4) die Expression des zweiten Expressionsproduktes derart erfolgt, dass es dem zweiten Bindemolekül zugänglich ist.
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Mit dem neuen erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren lassen sich nunmehr rekombinante Expressionsvektoren innerhalb von nur 1 bis 2 Wochen kostengünstig herstellen. Dies ist insbesondere für die Herstellung von therapeutisch nutzbaren Genprodukten, die innerhalb kürzester Zeit zur Verfügung gestellt werden müssen, von Vorteil.
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Das neue Herstellungsverfahren ermöglicht auch die Herstellung rekombinanter Bakterien oder rekombinanter Zellen, bspw. wenn das exprimierte Genprodukt in der Zelle eine spezifische Funktion ausübt.
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Nach einer Ausführungsform der Erfindung ist das erste Genprodukt ein Protein oder Proteinfragment, vorzugsweise ein Membranprotein, weiter vorzugsweise ein Zelloberflächenprotein und höchst vorzugsweise CD4.
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Dabei umfasst ein "Protein" oder "Proteinfragment" auch ein Peptid oder eine Aminosäureabfolge. Ein Membranprotein ist eine als Selektionsmarker besonders geeignete Entität. Mittels der ersten Bindemoleküle, die selektiv und spezifisch an das Membranprotein binden, können die Zellen abgetrennt werden, in denen keine homologe Rekombination und keine Bildung des gewünschten rekombinanten Expressionsvektors stattgefunden hat. Nachdem diese Zellen entfernt werden, kann aus den verbleibenden nicht an das erste Bindemolekül bindenden Zellen der gewünschte rekombinante Expressionsvektor isoliert werden. Dabei hat sich herausgestellt, dass es sich bei "CD4" (cluster of differentiation 4) um einen besonders geeigneten Selektionsmarker handelt.
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Nach einer erfindungsgemäßen Variante handelt es sich bei dem ersten Genprodukt um ein mittels bildgebenden Verfahren detektierbares Protein, bspw. ein Fluoreszenzprotein. In einem solchen Fall ist in Schritt (1) die Zugänglichkeit eines ersten Bindemoleküls entbehrlich, da die negative Selektion auf dem Verlust des mittels bildgebender Verfahren detektierbaren Proteins erfolgt, bspw. auf dem Verlust der Fluoreszenz ("loss-of-fluorescence"). In Schritt (1) entfällt dann das Erfordernis, wonach das erste Genprodukt derart exprimiert wird, dass es einem an das erste Genprodukt bindenden ersten Bindemolekül zugänglich ist. Eine wie auch immer geartete Exprimierung, die in einem funktionellen ersten Genprodukt resultiert, ist ausreichend. Auch die Schritte (5) bis (7) entfallen, da ein erstes Bindemolekül nicht zum Einsatz kommt. Stattdessen werden die folgenden Schritte (5*) bis (7*) durchgeführt: (5*) Zuführen der aus Schritt (4) erhaltenen Zellpopulation einer Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung (FACS; "fluorescence-activated cell sorting"); (6*) Abtrennen der fluoreszierenden Zellen von der Zellpopulation, und (7*) Isolierung der rekombinanten Expressionsvektoren aus der Zellpopulation. Unter "Zellpopulation" in Schritt (7*) ist die "verbliebene" Zellpopulation, vermindert um die abgetrennten Zellen, zu verstehen. Die in der Anmeldung im Zusammenhang mit den Schritten (5)–(7) und (5')–(7') offenbarten Vorteile, Merkmale und Eigenschaften des Verfahrens gelten für diese alternative Ausgestaltung entsprechend.
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Nach einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird in Schritt
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(5) die aus Schritt (4) erhaltene Zellpopulation mit dem an das erste Genprodukt bindenden Bindemolekül unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die die Bildung von erstem Bindemolekül-Zell-Komplexen ermöglichen, und in Schritt
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(6) werden die erste Bindemolekül-Zell-Komplexe von nicht an das erste Bindemolekül gebundenen Zellen (negative Zellen) abgetrennt, und in Schritt
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(7) werden die rekombinanten Expressionsvektoren aus den negativen Zellen isoliert.
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Bei dieser Ausführungsform liegt das erste Genprodukt im Komplex mit den Zellen vor, in die der Ausgangsvektor eingebracht wurde, so dass über die Bindung des ersten Bindemoleküls an das erste Genprodukt, die in Schritt (5) stattfindet, im Schritt (6) auch die "negativen" Zellen abgetrennt werden können. Das erste Genprodukt ist deshalb bspw. ein zellassoziiertes Genprodukt, das von außerhalb der Zelle für das Bindemolekül zugänglich ist. Vorzugsweise ist das erste Genprodukt ein Membranprotein. In Schritt (7) können aus der verbleibenden Zellsubpopulation die gewünschten rekombinanten Expressionsvektoren isoliert werden.
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Nach einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgen nach Schritt (6) und vor Schritt (7) folgende weitere Schritte:
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(6.1) Aufschließen der negativen Zellen zum Erhalt eines die rekombinanten Expressionsvektoren enthaltenden Zelllysats;
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(6.2) Inkubation des Zelllysats aus Schritt (6.1) mit nicht transfizierten Zellen unter Bedingungen, die eine Transfektion der Zellen mit den rekombinanten Expressionsvektoren ermöglichen, zum Erhalt einer transfizierten Zellpopulation;
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(6.3) Inkontaktbringen der transfizierten Zellpopulation aus Schritt (6.2) mit dem an das erste Genprodukt bindenden ersten Bindemolekül unter Bedingungen, die die Bildung von erstes Bindemolekül-Zell-Komplexen ermöglichen, und
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(6.4) Abtrennen der erste Bindemolekül-Zell-Komplexe von nicht an das Bindemolekül gebundenen Zellen (negative Zellen), und optional
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(6.5) Wiederholen der Schritte (6.1) bis (6.4) zumindest einmal, weiter bevorzugt zumindest zweimal, weiter bevorzugt zumindest dreimal, weiter bevorzugt zumindest viermal, und höchst bevorzugt zumindest fünfmal.
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Diese Maßnahme im Rahmen der "negativen Selektion" erfolgt zur Anreicherung der Zellen, in denen durch homologe Rekombination ein Austausch der Codierungsnukleotidsequenz für das erste Genprodukt gegen die Codierungsnukleotidsequenz für das zweite Genprodukt stattgefunden hat. Wie die Erfinder feststellen konnten, werden durch die wiederholte Durchführung der Schritte (6.1) bis (6.4) die Zellen, die den rekombinanten Expressionsvektor enthalten, in nur kurzer Zeit erheblich angereichert, so dass das Verhältnis von rekombinierten Expressionsvektoren zu nicht-rekombinierten Ausgangsvektoren zugunsten der rekombinierten Expressionsvektoren verschoben wird. In diesem Zusammenhang bedeutet in Schritt (6.5) eine "zumindest" zwei-, drei-, vier-, fünfmalige Wiederholung, dass die Schritte (6.1) bis (6.4) auch sechs-, sieben-, acht-, neun-, zehnmal oder noch häufiger wiederholt werden können.
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Nach einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens folgen nach dem Schritt (7) folgende weitere Schritte:
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(8) Inkubation der rekombinanten Expressionsvektoren mit nicht transfizierten Zellen unter Bedingungen, die eine Transfektion der Zellen mit den rekombinanten Expressionsvektoren ermöglichen, zum Erhalt einer weiteren transfizierten Zellpopulation;
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(9) Inkontaktbringen der weiteren transfizierten Zellpopulation mit dem an das zweite Genprodukt bindenden Bindemolekül unter Bedingungen, die die Bildung von Komplexen aus zweitem Bindemolekül und zweitem Genprodukt ermöglichen, und
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(10) Abtrennen der Komplexe aus zweitem Bindemolekül und zweitem Genprodukt, und optional
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(11) Wiederholen der Schritte (8) bis (10) zumindest einmal, weiter bevorzugt zumindest zweimal, weiter bevorzugt zumindest dreimal, weiter bevorzugt zumindest viermal, und höchst bevorzugt zumindest fünfmal.
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Diese Maßnahme im Rahmen der "positiven" Selektion ist gezielt auf die Anreicherung der Zellen ausgerichtet, in denen durch homologe Rekombination ein Austausch der Codierungsnukleotidsequenz für das erste Genprodukt gegen die Codierungsnukleotidsequenz für das zweite Genprodukt stattgefunden hat. Hier gilt das für die Anreicherungsschritte (6.1) bis (6.4) im Rahmen der "negativen Selektion" Gesagte entsprechend.
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Nach einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens handelt es sich bei dem ersten und/oder zweiten Bindemolekül um einen Antikörper.
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Diese Maßnahme hat daher den Vorteil, dass solche Bindemoleküle zum Einsatz kommen, die sich für das erfindungsgemäße Verfahren besonders gut eignen.
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Nach einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das erste und/oder zweite Bindemolekül an eine magnetische Entität gebunden.
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Diese Maßnahme erlaubt die Anwendbarkeit der "magnetic cell separation", die auch als "magnetic activated cell sorting" (MACS) bezeichnet wird. Die MACS-Technologie wird traditionell dazu verwendet, um Zellen zu isolieren, die ein spezifisches Oberflächenmolekül oder -antigen exprimieren. Die Bindemoleküle, wie bspw. Antikörper, werden dabei nach einer bevorzugten Ausführungsvariante an Magnetpartikel gebunden. Dabei handelt es sich i.d.R. um ca. 50 nm große sog. "MicroBeads", die routinemäßig im Rahmen von MACS eingesetzt werden. Sie bestehen aus Eisenoxid und einer Umhüllung aus Polysacchariden, an welche die Bindemoleküle gebunden werden. Die das erste und/oder zweite Genprodukt exprimierenden Zellen werden mit den magnetisierten Bindemolekülen bzw. den MicroBeads inkubiert. Die Bindemoleküle erkennen die ersten bzw. zweiten Genprodukte, die ggf. zellassoziiert sind, also im Komplex mit den Zellen vorliegen. Die Bindemoleküle sorgen damit für die Bindung der MicroBeads an die entsprechende Zellpopulation. Beim Durchfluss der gesamten Zellpopulation durch eine Säule, die von einem starken Magnetfeld umgeben ist, werden die mit den MicroBeads komplexierten Zellen zurückgehalten. Auf diese Weise erhält man beim Spülen der Säule nur nicht-komplexierte Zellen, so dass aus der ursprünglichen Zellpopulation die komplexierte Zellpopulation entfernt wurde. Werden im Rahmen der MACS-Systems magnetische erste Bindemoleküle eingesetzt, handelt es sich bei den nicht-komplexierten Zellen um die Zielzellen und man spricht von "negativer Selektion" oder Abreicherung bzw. Depletion. Werden hingegen magnetische zweite Bindemoleküle eingesetzt, handelt es sich bei den komplexierten Zellen um die Zielzellen und man spricht von einer "positiven Selektion". Das MACS-System ist gut etabliert und benutzerfreundlich und benötigt wenig technische Expertise.
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Nach einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das zweite Genprodukt ein Antigen, vorzugsweise ein virales Antigen, weiter vorzugsweise ein Tumorantigen oder tumorassoziiertes Antigen, weiter vorzugsweise ein virales Tumorantigen oder virales tumorassoziiertes Antigen, und höchst vorzugsweise ein HPV-selektives virales Tumorantigen oder HPV-selektives virales tumorassoziiertes Antigen.
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Wegen der kurzen Selektionsdauer bzw. des schnellen Herstellungsprozesses bietet das erfindungsgemäße Verfahren optimale Voraussetzungen, um bspw. saisonale Impfstoffe, wie Influenzaimpfstoffe, oder individualisierte Impfstoffe, wie Tumorimpfstoffe, herzustellen. Unter einem "Antigen" wird dabei erfindungsgemäß jeder Nukleinsäure-codierte Stoff verstanden, an den sich Antikörper oder Lymphozyten-Rezeptoren binden können. Erfindungsgemäß sind vorzugsweise solche Antigene umfasst, die im Zusammenhang mit Erkrankungen stehen, wie Infektionskrankheiten oder Krebserkrankungen. Von besonderem Interesse sind auch Antigene der Cottontail-Rabbit-Papillomaviren (CRPV) oder der humanen Papillomviren (HPV), insbesondere solche, die bei einem infizierten Wirt Tumoren auslösen können.
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Nach einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der Ausgangsvektor ausgewählt aus:
- – Virus-abgeleiteten Vektoren, einschließlich solchen, die sich ableiten von: Pockenviren, insbesondere Parapoxvirus ovis-Viren (Orf Viren; ORFV), einschließlich dem D1701-Stamm; Adeno-assoziierten Viren (AAV); Adenoviren; Vaccinia-Viren; Baculoviren; Togaviren; Alphaviren; Arteriviren; Rubiviren; Influenzaviren; Humane Papillomviren; Herpesviren, einschließlich CMV und RhCMV; Arenaviren, einschließlich LCMV;
- – bakteriellen Vektoren, einschließlich solchen, die stammen aus: Salmonella sp., Shigella sp., L. monocytogenes, S. gordonii;
- – Plasmiden.
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Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass solche Ausgangsvektoren zum Einsatz kommen, die sich für das erfindungsgemäße Verfahren besonders gut eignen. Aus dem verwendeten Ausgangsvektor resultiert die zu verwendende Zelle, in die der Ausgangsvektor eingebracht wird. Wenn es sich bei dem Ausgangsvektor um einen viralen Vektor handelt, werden erfindungsgemäß sog. permissive Zellen eingesetzt, also Zellen, in denen nach der Einbringung des Virusvektors bzw. der Infektion durch das Virus der vollständige Vermehrungszyklus des Virus mit Bildung von infektiösen Nachkommenviren ablaufen kann. Wenn bspw. ein Orf Virus (ORFV) als Ausgangsvektor eingesetzt wird, können vorzugsweise Nierenzellen von der grünen Meerkatze, wie bspw. Vero-Zellen, als permissive eingesetzt werden. Werden Plasmidvektoren bzw. Plasmide eingesetzt, so können erfindungsgemäß bakterielle Zellen, wie bspw. solche von Escherichia coli zum Einsatz kommen.
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Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Kit zur Selektion von rekombinanten Expressionsvektoren, das folgendes aufweist:
- – einen für ein erstes Genprodukt codierenden Ausgangsvektor, wobei die Codierungsnukleotidsequenz für das erste Genprodukt stromauf- und stromabwärts von ersten Rekombinationsnukleotidsequenzen flankiert ist;
- – einen eine Klonierungsstelle aufweisenden Transfervektor, wobei die Klonierungsstelle stromauf- und stromabwärts von zweiten Rekombinationsnukleotidsequenzen flankiert ist, die zu den ersten Rekombinationsnukleotidsequenzen homolog sind.
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Bei dem ersten Genprodukt handelt es sich vorzugsweise um ein Protein oder Proteinfragment, weiter vorzugsweise um ein Membranprotein, weiter vorzugsweise um ein Zelloberflächenprotein, und höchst vorzugsweise um CD4.
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Das Kit weist vorzugsweise ferner ein an das erste Genprodukt bindendes Bindemolekül, weiter vorzugsweise einen Antikörper, weiter vorzugsweise einen an eine magnetische Entität gebunden Antikörper, und – optional – eine Magnetfeldsäule auf.
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Das erfindungsgemäße Kit stellt die für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erforderlichen Gegenstände zusammen und sichert so eine korrekte Durchführung auch durch ungeschultes Personal. Es versteht sich, dass das erfindungsgemäße Kit auch eine Anleitung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sowie ggf. Chemikalien, Salze, Reagenzien, Puffer etc. enthalten kann.
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Die Eigenschaften, Merkmale und Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens gelten für das erfindungsgemäße Kit entsprechend.
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Ein weiterer Gegenstand des vorliegenden Verfahrens betrifft einen Vektor, der eine für ein erstes Genprodukt codierende Codierungsnukleotidsequenz aufweist, die stromaufund stromabwärts von ersten Rekombinationsnukleotidsequenzen flankiert ist, wobei das erste Genprodukt in einer Zelle derart exprimierbar ist, dass es einem an das erste Genprodukt bindenden ersten Bindemolekül zugänglich ist. Dabei ist es bevorzugt, wenn das erste Genprodukt ein Protein oder Proteinfragment, weiter vorzugsweise ein Membranprotein, weiter vorzugsweise ein Zelloberflächenprotein, und höchst vorzugsweise CD4 ist.
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Gegenstand der Erfindung ist folglich auch der im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens eingesetzte Ausgangsvektor, so dass die Merkmale, Vorteile und Eigenschaften des erfindungsgemäßen Verfahrens, insbesondere des Ausgangsvektors, für den erfindungsgemäßen Vektor entsprechend gelten.
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Vor diesem Hintergrund betrifft ein weiterer Gegenstand des vorliegenden Verfahrens auch eine Zelle, die den erfindungsgemäßen Vektor enthält.
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Die Eigenschaften, Merkmale und Vorteile der im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendeten Zelle bzw. Zellpopulation gelten für die erfindungsgemäße Zelle gleichermaßen.
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Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung des erfindungsgemäßen Vektors als Ausgangsvektor und/oder der erfindungsgemäßen Zelle, zur Herstellung eines rekombinanten Expressionsvektors, der ein Antigen, vorzugsweise ein virales Antigen, weiter vorzugsweise ein Tumorantigen oder tumorassoziiertes Antigen, weiter vorzugsweise ein virales Tumorantigen oder virales tumorassoziiertes Antigen, und höchst vorzugsweise ein HPV-selektives virales Tumorantigen oder HPV-selektives virales tumorassoziiertes Antigen exprimiert.
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Die Merkmale, Vorteile und Eigenschaften des erfindungsgemäßen Verfahrens gelten für die erfindungsgemäße Verwendung entsprechend.
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Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
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Die Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbeispielen näher illustriert, aus denen sich weitere Merkmale, Eigenschaften und Vorteile der Erfindung ergeben. Die Ausführungsbeispiele schränken die Reichweite der Erfindung nicht ein. Es versteht sich, dass einzelne Merkmale der Ausführungsbeispiele isoliert zur Spezifizierung, Klarstellung, Weiterbildung oder Verallgemeinerung der Erfindung herangezogen werden können. In den Ausführungsbeispielen wird Bezug genommen auf die beigefügten Figuren, in denen Folgendes dargestellt ist:
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1 schematische Darstellung der MACS-basierten Selektion;
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2 schematische Darstellung des Transferplasmids pdV-CD4;
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3 Herstellung der Rekombinante D1701-V-CD4-P2Cherry;
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4 Selektion der Rekombinante D1701-V-CD4-P2Cherry;
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5 MACS-basierte Selektion der Rekombinanten D1701-V-RabG-P2Cherry.
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Ausführungsbeispiele
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1. Neue Selektionsmethode zur Isolierung von rekombinanten Orf Viren
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Üblicherweise werden rekombinante Viren, wie bspw. Pockenviren, in permissiven Zellen mittels homologer Rekombination eines Transferplasmids und dem Genom des replizierenden Virus generiert. Um sicherzustellen, dass die Fremd-DNA an die gewünschte Stelle des viralen Genoms integriert wird, enthält das Transferplasmid homologe, virale Sequenzbereiche, die die zu inserierende Fremd-DNA flankieren. Da sich Rekombinationsereignisse sehr selten ereignen, die Rekombinationsfrequenzen liegen i.d.R. zwischen 1:1000 und 1:10.000, stellt die Selektion neuer rekombinanter Viren meist einen relativ mühsamen, teuren und langwierigen Prozess dar, welcher auch ein hohes Maß an technischem Know-how erfordert. Infolgedessen wurden unterschiedliche Strategien entwickelt, um die gezielte Selektion rekombinanter Viren zu erleichtern. Häufig wird ein austauschbares Markergen in das Transferplasmid eingebaut und zusammen mit dem Fremdgen bzw. Gen von Interesse ("gene-of-interest") in das virale Genom integriert. Diese Technik hat den entscheidenden Nachteil, dass neben dem Fremdgen gleichzeitig auch das Markergen im rekombinanten Virus exprimiert wird. Potentielle Gefahren durch einen unerwünschten Einfluss des Markergens können nicht ausgeschlossen werden und stehen somit einem genehmigungspflichtigen Einsatz entgegen. Daher ist die Herstellung markerfreier Rekombinanten wünschenswert. Unterschiedliche Verfahren wie z.B. eine visuelle Selektion mittels Expression der β-Galactosidase, β-Glucuronidase oder von Fluoreszenzproteinen, sowie eine transiente "Host-Range"-Selektion, eine transiente dominante Selektion, oder entfernbare Markersysteme, sind im Stand der Technik beschrieben.
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Häufig wird zur Herstellung von rekombinanten Orf Viren die herkömmliche Blau-Weiß-Selektion verwendet, die auf der Hydrolyse von X-Gal durch die β-Galactosidase des lacZ-Gens beruht. Diese Methode ist allerdings sehr zeit- und arbeitsaufwändig, so dass die Etablierung einer neuen einfacheren Selektionsmethode wünschenswert ist.
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Deshalb wurde zunächst eine fluoreszenzbasierte Selektionsmethode erarbeitet, wobei das lacZ-Gen durch ein Fluoreszenzgen ersetzt wurde. Neue Rekombinanten sollten durch den Austausch des Fluoreszenzgens gegen ein Fremdgen generiert und durch den Verlust an Fluoreszenz ("loss-of-fluorescence") visuell selektioniert werden.
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Ferner wurde das erfindungsgemäße Verfahren entwickelt, das nach einer bevorzugten Weiterbildung den Einsatz der MACS-Technologie zur Grundlage hat.
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Die MACS-Technologie wird normalerweise dazu verwendet, um Zellen zu isolieren, die ein spezifisches Oberflächenmolekül oder -antigen exprimieren. Hierbei macht man sich die Eigenschaft zunutze, dass mit magnetischen Partikeln konjugierte Antikörper, sog. MACS-Beads, spezifisch an Zellen binden und in einem starken magnetischen Feld zurückgehalten werden, wodurch sie von ungebundenen Zellen getrennt werden können. In den im Rahmen der Erfindung zugrundeliegenden Arbeiten wurde die Rekombinante D1701-V-CD4 entwickelt, die das humane CD4-Antigen (hCD4) exprimiert, und als Ausgangsrekombinante für eine MACS-basierte Selektion dienen sollte. Da für ORFV permissive Vero-Zellen (Affennierenzellen) kein hCD4 exprimieren, lassen sich D1701-V-CD4 infizierte Zellen durch die Oberflächenexpression des hCD4 charakterisieren und mit Hilfe der MACS-Technologie von nicht-infizierten Zellen separieren. In neu zu generierenden Rekombinanten kann nun der Austausch des hCD4 durch ein Fremdgen erfolgen. Dadurch lassen sich in infizierten Vero-Zellen die neuen, hCD4-freien Rekombinanten leicht von den parentalen hCD4-exprimierenden Viren trennen. Dies ermöglicht eine technisch wesentliche einfachere, schnellere und effizientere Selektion der gewünschten neuen ORFV-Rekombinanten.
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Wichtige Schritte der erfindungsgemäßen MACS-basierten "negativen" Selektion sind schematisch in der 1 dargestellt. In dieser Ausführungsform ist das erste Genprodukt bzw. der Selektionsmarker hCD4 und das zweite Genprodukt bzw. das "gene-of-interest" ist das Rabies-Virus Glycoprotein (RabG). Ferner kommt ein als "Cherry" bezeichnetes Fluoreszenzprotein zum Einsatz: Die Selektion geht aus von einem nach der Transfektion erhaltenen Zellgemisch, das nicht-infizierte Vero-Zellen (mittelgrau), mit der Ausgangsrekombinante D1701-V-CD4-P2Cherry-infizierte und hCD4-exprimierende Vero-Zellen (hellgrau), sowie mit der neu entstandenen Rekombinante D1701-V-RabG-P2Cherry-infizierte Vero-Zellen (dunkelgrau) enthält (1, linker Teil). Nach Zugabe von mit magnetischen Partikeln konjugierten, hCD4-spezifischen MACS-Beads, binden die Antikörper an Zellen, die hCD4 an ihrer Oberfläche exprimieren (1, mittlerer Teil). Die Auftrennung des Zellgemischs erfolgt durch eine Säule in einem magnetischen Feld. MACS-Beads-gekoppelte Zellen werden im Magnetfeld festgehalten, während nicht gebundene Zellen das Magnetfeld passieren. Im Durchfluss befinden sich daher nicht-infizierte und die gewünschten D1701-V-RabG-P2Cherry-infizierten Zellen (hCD4-negative Zellpopulation: unten, eingekreist), wohingegen in der Säule im Magnetfeld D1701-V-hCD4-P2Cherry-infizierte Zellen akkumulieren (hCD4-positive Zellpopulation: oben, eingekreist), die verworfen werden (1, rechter Teil).
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2. Herstellung und Charakterisierung des Ausgangsvektors D1701-V-CD4-P2Cherry
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Die hCD4-Gensequenz, aus pMACS 4.1(Miltenyi), wurde von der Firma Mr. Gene, Regensburg, Deutschland, chemisch synthetisiert und über die Restriktionsschnittstellen EcoRI und HindIII in das Plasmid pdV-Rec1 kloniert. Das entstandene Transferplasmid pdV-CD4 ist schematisch in der 2 dargestellt. Dort ist das hCD4-Gen weiß gekennzeichnet. Es steht unter der Kontrolle des originären frühen Promotors PVEGF. Die das hCD4-Gen dunkel dargestellten flankierenden Bereiche sind stromabwärts homolog zu dem ORFV-Genombereich ORF-3 und stromaufwärts homolog zu dem ORFV-Genombereich F9L–F10L. Diese Bereiche gewährleisten eine zielgerichtete Integration des hCD4-Gens in den VEGF-Lokus des D1701-V-Genoms über homologe Rekombination. Die zur Klonierung genutzten Restriktionsschnittstellen HindIII und EcoRI das Pox-spezifische frühe Transkriptionsstoppmotiv T5NT sind dargestellt.
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Das neu entstandene Transferplasmid pdV-CD4 wurde anschließend in D1701-V-GFP-P2Cherry-infizierte Vero-Zellen transfiziert, siehe 3. Dort ist in der Teilabbildung 3A die Restriktionskarte des D1701-V-Genoms dargestellt. Wie in der Teilabbildung 3B dargestellt, wurde als Ausgangsvirus die doppel-fluoreszierende Rekombinante D1701-V-GFP-P2Cherry eingesetzt (AcGFP = "Aequorea coerulescens green fluorescent protein"); (mCherry = "mCherry fluorescent protein). Nach der Infektion von Vero-Zellen mit der Rekombinante D1701-V-GFP-P2Cherry wurde das Transferplasmid pdV-CD4 (2) mittels Nukleofektion in die Zellen transfiziert. Wie in der Teilabbildung 3C dargestellt, erfolgt die Generierung des Ausgangsvektors D1701-V-CD4-P2Cherry durch Integration des hCD4-Gens im Austausch mit dem AcGFP-Gen über homologe Rekombination.
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Neue D1701-V-CD4-P2Cherry-Ausgangsvirusvektoren können von den GFP-Cherry-exprimierenden parentalen Virusvektoren über den Verlust von GFP-Fluoreszenz unterschieden und selektiert werden. Dies ist in der 4A dargestellt: "Loss-of-fluorescence": Selektion von D1701-V-CD4-P2Cherry mittels Fluoreszenzmikroskopie. Nicht-grün fluoreszierende Plaques (eingekreist) wurden identifiziert, gepickt und das Virus aus den Plaques angezogen. Nach fünf Plaque-Reinigungen konnte die Homogenität von D1701-V-CD4-P2Cherry über PCR-Analysen sichergestellt werden.
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Der Nachweis der korrekten Integration des hCD4-Gens im Austausch mit dem AcGFP-Gen in den VEGF-Lokus konnte über spezifische PCR-Analysen nachgewiesen und die genetische Homogenität von hCD4-positiven und GFP-negativen ORFV-Rekombinanten sichergestellt werden, wie dargestellt in der 4B: Exemplarische PCR-Analysen nach der vierten Plaque-Reinigung. Rekombinantes D1701-V-CD4-P2Cherry ist positiv für das hCD4-Gen und negativ für das in der Ausgangsrekombinante enthaltene AcGFP-Gen. Der Nachweis erfolgte über die angegebenen spezifischen PCRs. Die Proben Pos. #1–3 zeigen homogen rekombinanten Ausgangsvirusvektor mit einem spezifischen hCD4-Signal (Amplikon: 857 bp); Neg. #1 zeigt ein Gemisch aus parentalen GFP-enthaltenden (Amplikon: 575 bp) und rekombinanten CD4-enthaltenden Ausgangsvirusvektoren. Die Anwesenheit des mCherry-Fluoreszenzgens wurde über eine spezifische PCR nachgewiesen (Amplikon: 1.103 bp).
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Anschließend wurde der Ausgangsvirusvektor bzw. das resultierende rekombinante Virus in Vero-Zellen vermehrt und mittels Ultrazentrifugation zu hohen Virustitern angereichert. Die korrekte, frühe Expression von hCD4 in infizierten Vero-Zellen wurde über Western Blot-Analysen, immunhistochemische Färbung und Immunfluoreszenzanalysen nachgewiesen, wie in 4C dargestellt: Immunfluoreszenz von D1701-V-CD4-P2Cherry-infizierten Vero-Zellen. Vero-Zellen wurden mit dem Ausgangsvektor D1701-V-CD4-P2Cherry infiziert. 20 Stunden nach der Infektion wurde das hCD4-Protein mit einem FITC-konjugierten anti-CD4-Antikörper (Miltenyi) detektiert. Die Fluoreszenzmikroskopie erlaubt die Darstellung der hCD4-Oberflächenexpression ("anti-CD4"), die Cherry-Expression ("mCherry"), sowie beide Fluoreszenzen in einer Zelle nach Überlagerung ("merged").
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Wachstumskinetiken der Zellen, die mit dem Ausgangsvektor D1701-V-CD4-P2Cherry transfiziert waren, zeigten, dass die Integration des CD4-Gens zu keinen Veränderungen der Wachstumseigenschaften der Zellen führt. Die Stärke und der zeitliche Verlauf der Oberflächenexpression von CD4 in Relation zur Zellviabilität wurden mittels Durchflusszytometrie bestimmt. Dabei konnte festgestellt werden, dass bereits früh nach der Transfektion hCD4 an der Oberfläche der Zellen exprimiert wird und die Intensität mit fortlaufender Dauer zunimmt. Nach ca. 20 bis 24 Std. sind erste zytopathische Effekte zu erkennen und die Zellviabilität nimmt ab. Da freigesetzte Viruspartikel mangels CD4-Inkorporation nicht durch MACS-Beads gebunden werden können, wurde eine Infektionsdauer von 18 bis 20 Stunden festgelegt.
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Um eine möglichst effiziente Auftrennung von hCD4-positiven und hCD4-negativen Zellen zu erreichen, wurden zusätzlich in mehreren Vorversuchen unterschiedliche Beadsmengen, Inkubationszeiten, -temperaturen und MACS-Säulchen getestet und die optimalen Selektionsbedingungen ermittelt.
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3. Generierung eines neuen RabG-exprimierenden Expressionsvektors D1701-V-RabG-P2Cherry mittels MACS-Selektion
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In einem nächsten Schritt soll durch homologe Rekombination in dem Ausgangsvektor die Codierungsnukleotidsequenz für CD4 gegen die Codierungsnukleotidsequenz eines "gene-of-interest" ausgetauscht werden. Das Rabies-Virus-Glycoprotein (RabG) ist das Hauptantigen des Tollwutvirus bzw. Rabies Virus (RV). RabG wird auf der Oberfläche von RV und RV-infizierten Zellen exprimiert und stellt das Ziel virusneutralisierender Antikörper (VNA) dar. Der Schutz eines Individuums gegen Tollwut korreliert dabei mit der Höhe des VNA-Titers. Ein rekombinantes Virus bzw. ein rekombinanter Expressionsvektor, das bzw. der RabG exprimiert, stellt deshalb ein geeignetes Werkzeug zur Herstellung eines Impfstoffes gegen das Tollwutvirus dar. In diesem Ausführungsbeispiel wird deshalb als zweites Genprodukt bzw. "gene-of-interest" RabG gewählt.
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D1701-V-CD4-P2Cherry-infizierte Vero-Zellen wurden mit dem Transferplasmid pdV-RabG transfiziert und für 72 Std. inkubiert. Nach Aufschluss der Viren aus dem Zelllysat wurden damit über Nacht frische Vero-Zellen infiziert. Die Zellen wurden anschließend mit CD4-spezifischen MACS-Beads (Miltenyi) inkubiert und über eine magnetische Säule aufgetrennt. Dabei verblieben mit dem Ausgangsvektor D1701-V-CD4-P2Cherry infizierte hCD4-exprimierende Zellen im magnetischen Feld, wohingegen die restlichen Zellen die Säule passierten und sich im Durchfluss sammelten. Anschließend wurde die hCD4-negative Zellpopulation für weitere 20 Std. bei 37 °C inkubiert und die MACS-Selektion wurde wiederholt. Insgesamt wurden fünf solcher MACS-Selektionsrunden durchgeführt, wobei nach jeder Runde ein Teil der negativen Zellpopulation zur Quantifizierung der Anreicherungseffizienz neuer hCD4-negativer Rekombinanten verwendet wurde; vgl. 5A: Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus. Nach der Transfektion von D1701-V-CD4-P2Cherry-infizierten Vero-Zellen mit dem Transferplasmid pdV-RabG wurden Zellen mit dem Transfektionslysat für 20 Std. inkubiert. CD4-negative Zellen (negative Zellpopulation) wurden über MACS-Selektion isoliert und nach Zugabe von nicht infizierten Vero-Zellen für weitere 20 Std. inkubiert. Gleichzeitig wurde ein Teil der negativen Zellpopulation zur Quantifizierung der Selektionseffizienz eingesetzt. Insgesamt wurden 5 MACS-Selektionsrunden durchgeführt.
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Das Verhältnis von parentalen D1701-V-CD4-P2Cherry- und neu generierten Rekombinanten D1701-V-RabG-P2Cherry wurde über Einzelwell-PCR, Fluoreszenzanalysen und Durchflusszytometrie ermittelt, wie in den Teilabbildungen 5A bis 5D dargestellt. 5B: Bestimmung der Selektionseffizienz mittels hCD4- und RabG-spezifischer Immunfluoreszenzfärbung. Um das Verhältnis von rekombinantem und parentalem Virus zu bestimmen, wurden nach jeder Selektionsrunde Zellen der negativen Population (1C) in 6-Wellplatten ausgesät und 48 Std. später entweder mit hCD4-(exemplarische Abbildung nach der vierten MACS-Selektionsrunde) bzw. RabG-spezifischen (exemplarische Abbildung nach der fünften MACS-Selektionsrunde) FITC-gekoppelten Antikörpern gefärbt. Da alle Viren das Cherry-Fluoreszenzprotein exprimieren, ist eine einfache Unterscheidung zwischen parentalen und rekombinanten Viren im Fluoreszenzmikroskop möglich. So erscheinen in der oberen Reihe (S#4 CD4-FITC) alle parentalen Viren rot-grün (durchgezogen eingekreist), wohingegen die rekombinanten Viren nur rot leuchten (gestrichelt eingekreist); in der unteren Reihe (S#5 RabG-FITC) erscheinen dagegen rekombinante Viren rot-grün (gestrichelt eingekreist) und parentale Viren rot. 5C: Tabellarische Übersicht der Selektionseffizienz. Die Tabelle zeigt beispielhaft den jeweiligen Anteil parentaler und rekombinanter Virusplaques nach jeder der fünf durchgeführten MACS-Selektionsrunden (S#1–S#5). Zusätzlich wurde das Verhältnis von rekombinanten zu parentalen Virusplaques ermittelt (Ratio Rek./Par.) und der daraus resultierende prozentuale Anteil an rekombinanten Viren errechnet (Rek. in %). 5D: Identifizierung neuer MACS-selektionierter Rekombinanten mittels PCR-Analyse. Nach jeder der fünf MACS-Selektionsrunden (S#1–S#5) wurden Zellen der negativen Population (1C) in unterschiedlichen Verhältnissen mit nicht-infizierten Vero-Zellen gemischt und in 384-Well-Platten ausgesät. 72 Std. nach Aussaat wurden Wells, in denen 1–5 Einzelplaques identifiziert werden konnten, geerntet und die DNA isoliert. Mittels hCD4- und RabG-spezifischen PCRs wurde analysiert, ob in den untersuchten Einzelwells homogen rekombinantes D1701-V-RabG-P2Cherry (z.B. S#5, Spur 2; mit Pfeil gekennzeichnet), homogen parentales D1701-V-CD4-P2Cherry (z.B. S#3 Spur 15) oder eine Mischung aus beiden Virusexpressionsvektoren (z.B. S#1 Spur 8) vorliegt. Die Pfeile repräsentieren Wells, die die neue Rekombinante homogen enthalten. Die Größen der jeweiligen PCR-Amplikons sind rechts in Basenpaaren (bp) angegeben.
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Bereits nach der dritten MACS-Selektionsrunde ließen sich Einzelwells finden, in der die Rekombinante und damit der rekombinante Expressionsvektor homogen vorlag; vgl. 5D. Eine Virusanzucht aus diesen homogen D1701-V-RabG-P2Cherry-infiierten Einzelwells ermöglicht somit die Herstellung rekombinanter Vektoren bereits innerhalb von einer Woche. Nach der vierten Selektionsrunde lag D1701-V-RabG-P2Cherry gegenüber dem Ausgangsvirusvektor erstmals in der Überzahl vor und eine weitere Selektionsrunde führte dazu, dass knapp 95 % aller Viren die neue homogene Rekombinante darstellten, die das RabG- anstelle des hCD4-Gens exprimieren; vgl. 5B und 5C. Diese Ergebnisse konnten durch zwei weitere Rekombinanten, die auf Basis der MACS-Selektionssystems innerhalb von 7 bis 10 Tagen generiert wurden, bestätigt werden.
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4. Fazit
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Verglichen mit der im Stand der Technik üblicherweise genutzten Blau-Weiß-Selektion, die ca. 3 Monate dauert, konnte der Selektionsprozess zur Herstellung von rekombinanten Expressionsvektoren mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens um ein Vielfaches beschleunigt werden, was neben der Zeiteinsparung auch mit geringeren Kosten verbunden ist. Aufgrund der beschleunigten Selektion bietet das erfindungsgemäße Verfahren nun auch exzellente Voraussetzungen zur Generierung von Impfstoffen, die eine schnelle Anpassung und/oder Herstellung voraussetzen, wie bspw. saisonale Impfstoffe, z.B. Influenzavirusimpfstoffe, oder individualisierte Impfstoffe, z.B. Tumorimpfstoffe. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass das MACS-System gut etabliert und benutzerfreundlich ist und daher wenig technische Expertise erfordert. Das beschriebene Selektionsprinzip ist nicht nur auf das beispielhaft eingesetzte Orf Virus beschränkt, sondern erleichtert und beschleunigt auch die Herstellung anderer rekombinanter Expressionsvektoren. Weiterhin kann das neue Verfahren dazu genutzt werden, um neue Rekombinanten, die ein Oberflächen-assoziiertes Antigen exprimieren, mittels der Verwendung spezifischer MACS-Beads positiv zu selektieren. Die Möglichkeit negative und positive Selektion je nach Bedarf zu kombinieren, stellt eine weitere erfolgsversprechende Option dar.
