WO2016074942A1 - Herstellung von rekombinanten expressionsvektoren - Google Patents

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WO2016074942A1
WO2016074942A1 PCT/EP2015/075152 EP2015075152W WO2016074942A1 WO 2016074942 A1 WO2016074942 A1 WO 2016074942A1 EP 2015075152 W EP2015075152 W EP 2015075152W WO 2016074942 A1 WO2016074942 A1 WO 2016074942A1
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gene product
binding molecule
vector
cells
cell
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PCT/EP2015/075152
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Ralf Amann
Hans-Joachim Rziha
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Eberhard Karls Universitaet Tuebingen Medizinische Fakultaet
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    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Definitions

  • the present invention relates to a process for the production of recombinant
  • Expression vectors a kit adapted for carrying out the method, a vector used in the method, a cell containing this vector and the use of the vector.
  • a central object of molecular cloning is the production of
  • a desired nucleic acid molecule usually a DNA fragment or a gene
  • a vector or a "gene shuttle" such as, for example, a plasmid or a viral vector.
  • One goal of cloning is to propagate the integrated DNA fragment or gene to examine its properties or to continue to use it in subsequent processes. After duplication, the vector can be isolated and a multiple of the initial DNA fragment recovered.
  • cells into which a DNA fragment has been introduced via a vector by cloning may include a gene product encoded by the DNA fragment, e.g. a protein or peptide.
  • a vector is also referred to as an expression vector.
  • Standardized experiments for cloning any DNA fragment essentially comprise the following seven steps: (1) selection of the host organism and cloning vector, (2) production of the vector, (3) production of the DNA to be mated, (4) generation recombinant DNA, (5) introduction of the recombinant DNA into the host organism, (6) selection of organisms containing the recombinant DNA, (7) screening for clones with the desired cloned DNA and / or the desired biological properties.
  • One of the time limiting factors in the production of recombinant (expression) vectors relates to the selection of those clones expressing the introduced gene product.
  • One of the commonly used methods is the so-called blue-white selection.
  • the goal of blue-white selection is to identify cells that express the desired gene introduced.
  • certain plasmids are generally used as vectors which are of interest at the position for insertion of the gene of interest. ses ("gene of interest") in the plasmid at the so-called 'Multiple Cloning Site' the gene for a ß-galactosidase, the so-called. / acZ gene included.
  • the gene for galactosidase is used as a reporter gene.
  • the insertion of the gene of interest into the multiple cloning site inactivates galactosidase.
  • the galactosidase can cleave the yellow dye 'X-Gal' into a blue dye and galactose.
  • a blue dye is formed about half an hour after induction by the galactosidase contained in the cells.
  • the galactosidase is inactivated, leaving them undyed and can be isolated by their lack of color.
  • This selection method is very time consuming and labor intensive. Not infrequently, in particular for the production of recombinant virus-based expression vectors up to 6 to 12 months needed, which is, for example, unfavorable for the production of seasonally benötig th or individualized vaccines.
  • step (2) Incubating the cell population obtained from step (2) under conditions permitting replacement of the coding nucleotide sequence for the first gene product for the coding nucleotide sequence for the second gene product by homologous recombination of the first and second recombination nucleotide sequences and formation of a recombinant expression vector;
  • step (3) Incubating the cell population obtained from step (3) under conditions which allow the expression of the second gene product, optionally in such a way that it is accessible to a second binding molecule binding to the second gene product,
  • step (4) contacting the cell population obtained from step (4) with the first binding molecule which binds to the first gene product under conditions permitting the formation of complexes of the first binding molecule and the first gene product;
  • step (4) contacting the cell population obtained from step (4) with the second binding molecule binding to the second gene product under conditions which allow the formation of complexes of second binding molecule and second gene product;
  • a "recombinant expression vector” is understood to mean a vector which contains the
  • Coding nucleotide sequence for a desired gene product such as the second gene product, constructed so that the coding nucleotide sequence is transcribable into mRNA and subsequently translatable into a gene product.
  • the expression vector according to the invention is produced by recombination events, via which the coding nucleotide sequence for the desired gene product is introduced into the expression vector.
  • expression vectors include so-called plasmid vectors, viral vectors or, according to alternative embodiments, if appropriate also bacteriophage vectors, cosmids, phagemides, bacmids and bacs. Plasmid vectors are vectors obtained from plasmids.
  • Viral vectors are modified viruses that can transduce eukaryotic cells and thereby introduce foreign genes into the cells.
  • Bacteriophages are viruses that infect bacteria. By incorporating cos sites from ⁇ phage into plasmids, so-called cosmids are obtained.
  • a phage- mid is a plasmid carrying an origin of replication for the single-stranded replication of F1 phage.
  • a bacmid is a "shuttle vector” for bacteria and insect cells.
  • Bacs or "Bacterial Artificial Chromosomes" are replicable complete virus genomes in bacteria.
  • the invention is particularly suitable for the production of recombinant viral vectors or recombinant viruses, such as recombinant poxviruses, including the parapoxviruses (ORFV).
  • the invention therefore also relates to a process for the production or selection of recombinant viral vectors or recombinant viruses with the steps indicated.
  • the "preparation” or the “preparation” also includes the selection or the selection.
  • the invention therefore also relates to a method for the selection of recombinant expression vectors with the steps indicated.
  • starting vector is meant an expression or cloning vector encoding the first gene product that can be expressed in the cell of the cell population of the invention. Therefore, according to the invention, the starting vector can also be referred to as an initial expression vector or an output cloning vector.
  • the starting vector may be a linear or circular, a single or double stranded, a DNA or RNA vector.
  • cell population is meant a group of cells of the same kind which are transfectable with the starting and transfer vectors according to the invention.
  • the "cells” comprise biological cells of animal, plant or bacterial origin. Alternatively, artificial or minimal cells are also suitable, such as nanoparticles, liposomes, polymerosomes, microcapsules etc. According to the invention, it is preferable to use those cells which naturally do not express the first gene product. It is understood that the output vector can also be provided in several different cell populations. In this respect, the invention comprises the provision of "at least one" cell population containing an initial vector.
  • a “gene product” is understood according to the invention to mean a nucleic acid-coded molecule. Examples are amino acid sequences, peptides, proteins or protein fragments.
  • the "first” gene product is preferably an entity suitable as a selection marker, for example a foreign or a transgene, but optionally also a starting vector-specific gene product which is not essential for the function of the vector. Preferably, the first gene product is one which the cells naturally do not express.
  • the "second” gene product is preferably a "gene of interest", a foreign or a transgene.
  • binding molecule is understood as meaning a molecule which binds selectively and specifically to the gene product and forms a complex with it can.
  • binding molecules suitable according to the invention are antibodies or
  • Immunoglobulins aptamers and fragments thereof.
  • the accessibility of the first and second gene products for a binding molecule can be realized in various ways.
  • the first and / or second gene product is located on the surface of cells aligned with the outside of the cell, for example as a transmembrane protein.
  • the first and / or second gene product is localized on the surface of a virus particle with orientation in the exterior of the virus, for example as a virus coat protein.
  • the first and / or second gene product are soluble in the cell, the cell is permeabilized or lysed so that the first or second binding molecule can contact the first and / or gene product.
  • Upstream means according to the invention that the recombination nucleotide sequences are located in the direction of the respective 5 'end relative to the coding nucleotide sequences for the first and the second gene product.
  • Downstream in the invention means that the recombination nucleotide sequences are located relative to the coding nucleotide sequences for the first and second gene products towards the respective 3 'end.
  • the coding nucleotide sequences for the first and second gene products are thus bounded on both sides by recombination nucleotide sequences.
  • Transfecting generally means the introduction of a vector, eg.
  • Transfecting therefore also involves the transduction or introduction of a vector into prokaryotic cells, for example into bacterial cells, such as the cells of Escherichia coli.
  • prokaryotic cells for example into bacterial cells, such as the cells of Escherichia coli.
  • viral vectors or recombinant viruses are used as starting vectors, instead of transfecting, they also refer to "infect” and instead of "transfection” also to "infection”.
  • a "transfer vector” is a transport vehicle or a transport vehicle
  • Gene ferry for introducing the genetic information for the second gene product in the Understood cells of the cell population.
  • the transfer vector may, for example, order
  • RNA vector a linear or, according to an alternative embodiment, a circular, a single or double-stranded, a DNA or RNA vector.
  • homologous means that the first recombination nucleotide sequence is identical or complementary to the second recombination nucleotide sequence to such an extent that homologous recombination can take place.
  • the homology between the first and second recombination nucleotide sequence is in one embodiment of the invention at least 90%, more preferably at least 95%, more preferably at least 99% and most preferably 100%.
  • a "separation" in steps (6) and (6 ') comprises the spatial separation of
  • Complexes of first or second binding molecule and first and / or second gene product from the cell population or remaining cell population can be carried out by means of physical, chemical and biological methods known to those skilled in the art. Includes flow cytometric methods, the "magnetic cell separation” or “magnetic activated cell sorting” (MACS), as well as the immunoprecipitation. Alternatively, a separation can take place via the density. For this purpose, a heavy particle, such as, for example, gold or lead, or alternatively a light particle, is bound to the complex via the first and / or second binding molecule and subsequently separated from the non-complexed cells by density separation. Also a separation over the size is possible.
  • the first and / or second binding molecule is bound to a large entity, such as a sphere.
  • the complexes or cells are placed on a sieve.
  • the large complexes can not pass the sieve and are separated from the small complexes or cells.
  • Such a system is sold under the name pluriBead ®.
  • the use of affinity chromatography methods using a column matrix or the separation in the electric field is also encompassed according to the invention, in which case the first and / or second binding molecules have an electrically charged particle.
  • the inventive method can be carried out with the steps (1), (2), (3), (4), (5), (6) and (7).
  • a so-called “negative selection” takes place.
  • the selection is called “negative” because after losing a property is selected, namely after the loss of the first gene product.
  • step (5) of this process branch complexes of the first binding molecule and the first gene product can form.
  • step (6) these complexes are separated from the cell population.
  • those cells or (initial) vectors are separated from the remaining cell population, in which no recombination and thus no exchange of the coding nucleotide sequence for the first against the second gene product has taken place.
  • the separated cells largely correspond to those from step (1).
  • the cells of the remaining "purified" or depleted cell population no longer express the first gene product, thus can not form a complex with the first binding molecule.
  • homologous recombination has resulted in an exchange of the coding nucleotide sequence for the first gene product for the coding nucleotide sequence for the second gene product and thus the formation of the desired recombinant expression vector.
  • the desired recombinant expression vector is isolated from the cells of the remaining cell subpopulation in step (7) by methods known to the person skilled in the art, which comprise the disruption of the cells and the release of the vector.
  • the method according to the invention can alternatively be carried out with the steps (1), (2), (3), (4), (5 '), (6') and (7 ').
  • a so-called "positive selection” takes place.
  • the selection is referred to as "positive” because selection is made after one property is obtained, namely after the second gene product.
  • step (5 ') of this process branch complexes of the second binding molecule and the second gene product may form.
  • step (6 ') the cells of the cell population are separated in which no homologous recombination has occurred and therefore the second gene product is not expressed.
  • the complexes of the second binding molecule and the second gene product contain the desired recombinant expression vector, which is isolated in step (7 ').
  • the complexes have, for example, recombinant virus particles if, for example, a viral vector is used as starting vector and the second gene product has been incorporated into the virus particle, from which the recombinant expression vector can be isolated in step (7 ').
  • the complexes have cells in or on which the second gene product is present and from which the recombinant expression vector can be isolated in step (7 ').
  • step (4) If a "positive selection" is to be dispensed with entirely, it is not necessary that in step (4) the expression of the second expression product takes place in such a way that it is accessible to the second binding molecule. Accessibility is therefore unnecessary, which is indicated by the expression "if necessary”. or 'where appropriate'. Insofar, the steps (5 ') - (7') take place only if in step (4) the expression of the second expression product takes place in such a way that it is accessible to the second binding molecule.
  • the new production method also allows the production of recombinant bacteria or recombinant cells, for example, when the expressed gene product in the cell performs a specific function.
  • the first gene product is a protein or
  • Protein fragment preferably a membrane protein, more preferably a cell surface protein and most preferably CD4.
  • a “protein” or “protein fragment” also includes a peptide or a
  • a membrane protein is an entity which is particularly suitable as a selection marker.
  • the cells By means of the first binding molecules, which bind selectively and specifically to the membrane protein, the cells can be separated in which no homologous recombination and no formation of the desired recombinant expression vector has taken place. After these cells are removed, the remaining ones can be removed not binding to the first binding molecule cells of the desired recombinant expression vector can be isolated. It has been found that "CD4" (cluster of differentiation 4) is a particularly suitable selection marker.
  • the first gene product is a protein detectable by means of an imaging method, for example a fluorescence protein.
  • an imaging method for example a fluorescence protein.
  • the accessibility of a first binding molecule is unnecessary in step (1), since the negative selection takes place on the loss of the detectable by means of imaging protein, for example. On the loss of fluorescence ("loss-of-fluorescence").
  • the requirement that the first gene product is expressed such that it is accessible to a first binding molecule that binds to the first gene product is then eliminated. Whatever kind of expression results in a functional first gene product is sufficient. Also steps (5) to (7) are omitted since a first binding molecule is not used.
  • step (5 * ) supplying the cell population obtained from step (4) to a fluorescence-activated cell sorting (FACS; fluorescence-activated cell sorting); (6 * ) separating the fluorescent cells from the cell population, and (7 * ) isolating the recombinant expression vectors from the cell population.
  • FACS fluorescence-activated cell sorting
  • 6 * separating the fluorescent cells from the cell population
  • 7 * isolating the recombinant expression vectors from the cell population.
  • cell population in step (7 * ) is meant the "remaining" cell population reduced by the separated cells.
  • step (4) contacting the cell population obtained from step (4) with the binding binding molecule to the first gene product under conditions permitting the formation of first binding molecule-cell complexes, and in step
  • the first binding molecule-cell complexes are separated from cells not bound to the first binding molecule (negative cells), and in step
  • the recombinant expression vectors are isolated from the negative cells.
  • the first gene product is in complex with the cells into which the starting vector has been introduced, so that in step (6) via the binding of the first binding molecule to the first gene product, which takes place in step (5). even the "negative" cells can be separated.
  • the first gene product is therefore, for example, a cell-associated gene product that is accessible from outside the cell for the binding molecule.
  • the first gene product is a membrane protein.
  • the desired recombinant expression vectors can be isolated from the remaining cell subpopulation.
  • step (6) the following further steps take place after step (6) and before step (7):
  • step (6.2) Incubation of the cell lysate from step (6.1) with untransfected cells under
  • step (6.3) contacting the transfected cell population of step (6.2) with the first binding molecule binding to the first gene product under conditions that allow the formation of first binding molecule-cell complexes
  • step (6.5) an "at least" two, three, four, five times repetition means that steps (6.1) to (6.4) also six, seven, eight, nine, ten times or can be repeated more often.
  • the first and / or second binding molecule is an antibody. This measure therefore has the advantage that such binding molecules are used
  • the first and / or second binding molecule is bound to a magnetic entity.
  • Magnetic activated cell sorting (MACS) is called.
  • the MACS technology has traditionally been used to isolate cells that express a specific surface molecule or antigen.
  • the binding molecules such as antibodies, are bound to magnetic particles according to a preferred embodiment. This is i.d.R. about 50 nm so-called “MicroBeads", which are routinely used in the context of MACS. They consist of iron oxide and a coating of polysaccharides, to which the binding molecules are bound.
  • the cells expressing the first and / or second gene product are incubated with the magnetized binding molecules or the MicroBeads.
  • the binding molecules recognize the first or second gene products, which are possibly cell-associated, that is in complex with the cells.
  • the binding molecules thus ensure the binding of the MicroBeads to the corresponding cell population. As the entire cell population flows through a column surrounded by a strong magnetic field, the cells complexed with the MicroBeads are retained. In this way, when rinsing the column only uncomplexed cells are obtained, so that the complexed cell population was removed from the original cell population. If magnetic first binding molecules are used in the context of the MACS system, the uncomplexed cells are the target cells and one speaks of "negative selection" or depletion or depletion. If, on the other hand, magnetic second binding molecules are used, the complexed cells are the target cells and one speaks of a "positive selection". The MACS system is well established and easy to use and requires little technical expertise.
  • Gene product an antigen preferably a viral antigen, more preferably a tumor antigen or tumor-associated antigen, more preferably a viral tumor anti- gene or viral tumor-associated antigen, and most preferably an HPV-selective viral tumor antigen or HPV-selective viral tumor-associated antigen.
  • an "antigen" is any nucleic acid-encoded substance to which antibodies or lymphocyte receptors can bind.
  • those antigens are included which are related to diseases, such as infectious diseases or cancers.
  • Cottontail rabbit papillomavirus (CRPV) or human papillomavirus (HPV) antigens are also of particular interest, especially those that can cause tumors in an infected host.
  • the starting vector is selected from:
  • Virus-derived vectors including those derived from: poxviruses, in particular parapoxvirus ovis viruses (Orf viruses, ORFV), including the D1701 strain; Adeno-associated viruses (AAV); adenoviruses; Vaccinia viruses; Baculoviruses; togaviruses; Alpha viruses; arteriviruses; rubiviruses; Influenza viruses; Human papillomaviruses; Herpesviruses, including CMV and RhCMV; Arenaviruses, including LCMV;
  • poxviruses in particular parapoxvirus ovis viruses (Orf viruses, ORFV), including the D1701 strain
  • bacterial vectors including those derived from: Salmonella sp., Shigella sp., L. monocytogenes, S. gordonii;
  • the starting vector is a viral vector
  • permissive cells ie cells in which the introduction of the virus vector or the infection by the virus, the complete reproductive cycle of the virus can proceed with the production of infectious progeny viruses.
  • ORFV Orf virus
  • kidney cells from the green monkey such as, for example, Vero cells
  • plasmid vectors or plasmids are used, bacterial cells, for example those of Escherichia coli, can be used according to the invention.
  • a further subject of the present invention relates to a kit for the selection of recombinant expression vectors, comprising: a starting vector coding for a first gene product, wherein the coding nucleotide sequence for the first gene product is flanked upstream and downstream of first recombination nucleotide sequences;
  • a transfer vector having a cloning site, wherein the cloning site is flanked upstream and downstream of second recombination nucleotide sequences homologous to the first recombination nucleotide sequences.
  • the first gene product is preferably a protein or
  • Protein fragment more preferably a membrane protein, more preferably a cell surface protein, and most preferably CD4.
  • the kit preferably further comprises a binding molecule binding to the first gene product, more preferably an antibody, more preferably an antibody bound to a magnetic entity, and, optionally, a magnetic field column.
  • the kit according to the invention assembles the objects required for carrying out the method according to the invention and thus ensures correct execution even by untrained personnel. It goes without saying that the kit according to the invention can also contain instructions for carrying out the method according to the invention and optionally chemicals, salts, reagents, buffers, etc. The properties, features and advantages of the method according to the invention apply correspondingly to the kit according to the invention.
  • a further object of the present invention relates to a vector comprising a coding nucleotide sequence coding for a first gene product, flanked upstream and downstream of first recombination nucleotide sequences, wherein the first gene product in a cell is expressible such that it is attached to the one first gene product binding first binding molecule is accessible.
  • the first gene product is a protein or protein fragment, more preferably a membrane protein, more preferably a cell surface protein, and most preferably CD4.
  • Another object of the present invention also relates to a cell containing the vector of the invention.
  • Method used cell or cell population apply equally to the cell according to the invention.
  • Another object of the present invention relates to the use of the
  • a vector according to the invention as the starting vector and / or the cell according to the invention, for producing a recombinant expression vector comprising an antigen, preferably a viral antigen, more preferably a tumor antigen or tumor-associated antigen, more preferably a viral tumor antigen or viral tumor-associated antigen, and most preferably an HPV selective viral tumor antigen or HPV-selective viral tumor-associated antigen.
  • an antigen preferably a viral antigen, more preferably a tumor antigen or tumor-associated antigen, more preferably a viral tumor antigen or viral tumor-associated antigen, and most preferably an HPV selective viral tumor antigen or HPV-selective viral tumor-associated antigen.
  • Fig. 1 schematic representation of the MACS-based selection
  • FIG. 2 schematic representation of the transfer plasmid pdV-CD4
  • Fig. 5 MACS-based selection of the recombinants D1701 -V-RabG-P2Cherry.
  • recombinant viruses such as, for example, poxviruses
  • the transfer plasmid contains homologous, viral sequence regions flanking the foreign DNA to be inserted. Since recombination events occur very rarely, the recombination frequencies are usually between 1: 1000 and 1: 10,000, the selection of new recombinant viruses usually represents a relatively cumbersome, expensive and lengthy process, which also requires a high level of technical know-how.
  • an exchangeable marker gene is incorporated into the transfer plasmid and integrated into the viral genome together with the foreign gene or gene of interest ("gene-of-interest").
  • This technique has the distinct disadvantage that, in addition to the foreign gene, the marker gene is also expressed simultaneously in the recombinant virus. Potential dangers due to an undesired influence of the marker gene can not be excluded and thus preclude a use subject to authorization. Therefore, the production of marker-free recombinants is desirable.
  • Various methods such as visual selection by expression of ⁇ -galactosidase, ⁇ -glucuronidase or fluorescent proteins, as well as transient "host-range” selection, transient dominant selection, or removable marker systems are described in the prior art.
  • the conventional blue-white selection is used for the production of recombinant Orf viruses, which is based on the hydrolysis of X-gal by the ⁇ -galactosidase of the lacZ gene.
  • this method is very time-consuming and labor-intensive, so that the establishment of a new simpler selection method is desirable.
  • the MACS technology is normally used to isolate cells that express a specific surface molecule or antigen. In doing so, one makes use of the property that antibodies conjugated to magnetic particles, so-called MACS beads, bind specifically to cells and are retained in a strong magnetic field, whereby they can be separated from unbound cells.
  • MACS beads antibodies conjugated to magnetic particles
  • the recombinant D1701-V-CD4 was developed, which expresses the human CD4 antigen (hCD4) and should serve as an initial recombinant for MACS-based selection.
  • D1701-V-CD4 infected cells can be characterized by surface expression of hCD4 and separated from uninfected cells using MACS technology. In recombinants to be newly generated, replacement of the hCD4 by a foreign gene can now take place. This allows the new hCD4-free recombinants to be easily separated from the parental hCD4-expressing viruses in infected Vero cells. This allows a technically essential simpler, faster and more efficient selection of the desired new ORFV recombinants.
  • the first gene product or selection marker is hCD4 and the second gene product or gene-of-interest is Rabies virus glycoprotein (RabG).
  • a fluorescence protein called "Cherry” is used: the selection is based on a cell mixture obtained after transfection which contains uninfected Vero cells (medium gray), with the starting recombinant D1701-V-CD4-P2Cherry-infected and hCD4- expressing Vero cells (light gray), as well as containing the newly formed recombinant D1701 -V-RabG-P2Cherry-infected Vero cells (dark gray) (FIG.
  • the resulting transfer plasmid pdV-CD4 is shown schematically in FIG.
  • the hCD4 gene is white marked. It is under the control of the original early promoter PVEGF-
  • the flanking regions darkened by the hCD4 gene are downstream homologous to the ORFV genome region ORF-3 and upstream homologous to the ORFV genome region F9L-F10L. These regions ensure targeted integration of the hCD4 gene into the VEGF locus of the D1701 V genome via homologous recombination.
  • the restriction sites HindIII and EcoRI used for cloning the Pox-specific early transcription stop motif T5NT are shown.
  • the newly formed transfer plasmid pdV-CD4 was then transfected into D1701 -V-GFP-P2Cherry-infected Vero cells, see Fig. 3.
  • the restriction map of the D1701 -V genome is shown in the partial FIG. 3A. As shown in the partial FIG.
  • AcGFP "Aequorea coerulescens green fluorescent protein”
  • mCherry "mCherry fluorescent protein”
  • the transfer plasmid pdV-CD4 Figure 2 was transfected into the cells by nucleofection as shown in the partial FIG. 3C, the generation of the starting vector D1701 -V-CD4-P2Cherry is accomplished by integration of the hCD4 gene in exchange with the AcGFP gene via homologous recombination.
  • New D1701-V CD4-P2Cherry virus starting vectors can be differentiated and selected from the GFP-Cherry-expressing parental virus vectors via the loss of GFP fluorescence. This is shown in FIG. 4A: "Loss-of-fluorescence": Selection of D1701-V-CD4-P2Cherry by means of fluorescence microscopy. Non-green fluorescent plaques (circled) were identified, picked and the virus grown from the plaques. After five plaque purifications, homogeneity of D1701-V-CD4-P2Cherry was confirmed by PCR analysis.
  • FIG. 4B Exemplary PCR analyzes after the fourth PIaque purification. Recombinant D1701 -V-CD4-P2Cherry is positive for the hCD4 gene and negative for the AcGFP gene contained in the parent recombinant. The detection was carried out via the specified specific PCRs. Samples Pos.
  • # 1-3 show a homogeneous recombinant virus starting vector with a specific hCD4 signal (amplicon: 857 bp); Neg. # 1 shows a mixture of parental GFP-containing (amplicon: 575 bp) and recombinant CD4-containing parent virus vectors. The presence of the mCherry fluorescent gene was detected by a specific PCR (Amplicon: 1 .103 bp).
  • the starting virus vector or the resulting recombinant virus was propagated in Vero cells and enriched by ultracentrifugation to high Virustitern.
  • Correct, early expression of hCD4 in infected Vero cells was detected by Western blot analysis, immunohistochemical staining and immunofluorescence analyzes, as shown in Figure 4C: immunofluorescence of D1701-V-CD4-P2Cherry-infected Vero cells. Vero cells were infected with the starting vector D1701 -V-CD4-P2Cherry. Twenty hours after infection, the hCD4 protein was detected with a FITC-conjugated anti-CD4 antibody (Miltenyi).
  • Fluorescence microscopy allows expression of hCD4 surface expression ("anti-CD4"), cherry expression (“mCherry”), as well as both fluorescences in a cell after being "merged”.
  • Anti-CD4 surface expression
  • mCherry cherry expression
  • Both fluorescences in a cell after being "merged”.
  • the magnitude and timing of surface expression of CD4 in relation to cell viability were determined by flow cytometry. It was found that hCD4 is expressed at the surface of the cells early in the transfection and the intensity increases with continuous duration. After about 20 to 24 hours the first cytopathic effects can be seen and cell viability decreases. Since released virus particles can not be bound by MACS beads for lack of CD4 incorporation, an infection duration of 18 to 20 hours was determined.
  • the coding nucleotide sequence for CD4 is to be exchanged for the coding nucleotide sequence of a gene-of-interest by homologous recombination in the starting vector.
  • the rabies virus glycoprotein (RabG) is the major antigen of the rabies virus (RV). RabG is expressed on the surface of RV and RV-infected cells and is the target of virus-neutralizing antibodies (VNA). Protection of an individual against rabies correlates with the level of VNA titer. Therefore, a recombinant virus or a recombinant expression vector expressing RabG is a suitable tool for the production of a vaccine against rabies virus. In this embodiment, RabG is chosen as the second gene product or "gene-of-interest".
  • D1701 -V-CD4-P2Cherry-infected Vero cells were transfected with the transfer plasmid pdV-RabG and incubated for 72 h. After disruption of the virus from the cell lysate It was used to infect fresh Vero cells overnight. The cells were then incubated with CD4-specific MACS beads (Miltenyi) and separated on a magnetic column. In the process, hCD4-expressing cells infected with the starting vector D1701 -V-CD4-P2Cherry remained in the magnetic field, whereas the remaining cells passed through the column and collected in the flow.
  • CD4-specific MACS beads Miltenyi
  • Fig. 5A Schematic representation of the experimental setup. After transfection of D1701-V-CD4-P2Cherry-infected Vero cells with the transfer plasmid pdV-RabG, cells were incubated with the transfection lysate for 20 h.
  • CD4-negative cells (negative cell population) were isolated via MACS selection and incubated for an additional 20 h after addition of uninfected Vero cells. At the same time, part of the negative cell population was used to quantify the selection efficiency. A total of 5 MACS selection rounds were performed.
  • Recombinant D1701 -V-RabG-P2Cherry was detected by single-well PCR, fluorescence analysis and flow cytometry, as shown in the Figures 5A-5D.
  • Fig. 5B Determination of the selection efficiency by means of hCD4 and RabG-specific immunofluorescence staining.
  • cells of the negative population (FIG. 1C) were seeded in 6-well plates after each round of selection and 48 h later either with hCD4 (exemplary mapping after the fourth MACS selection round) or 48 h later RabG-specific (exemplary picture after the fifth MACS round of selection) of FITC-coupled antibodies stained.
  • Fig. 5D Identification of new MACS-selected recombinants by PCR analysis. After each of the five MACS rounds of selection (S # 1- S # 5), cells of the negative population ( Figure 1C) were mixed in different ratios with uninfected Vero cells and seeded in 384-well plates. 72 h after sowing, wells in which 1-5 individual plaques could be identified were harvested and the DNA was isolated.
  • the selection process for the production of recombinant expression vectors by the method according to the invention could be accelerated many times, which in addition to the time savings even with lower Costs that is.
  • Due to the accelerated selection process of the invention now also provides excellent conditions for the generation of vaccines, which require rapid adaptation and / or production, such as seasonal vaccines, eg influenza virus vaccines, or individualized vaccines, such as tumor vaccines.
  • Another advantage is that the MACS system is well-established and user-friendly and therefore requires little technical expertise.
  • the described selection principle is not limited only to the orf virus used by way of example, but also facilitates and accelerates the production of other recombinant expression vectors.
  • the new method can be used to positively select new recombinants expressing a surface-associated antigen by using specific MACS beads. The ability to combine negative and positive selection as needed is another promising option.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Expressionsvektoren, ein zur Durchführung des Verfahrens angepasstes Kit, ein im Rahmen des Verfahrens eingesetzten Vektor, eine diesen Vektor enthaltende Zelle sowie die Verwendung des Vektors.

Description

Herstellung von rekombinanten Expressionsvektoren
[0001 ] Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanten
Expressionsvektoren, ein zur Durchführung des Verfahrens angepasstes Kit, ein im Rahmen des Verfahrens eingesetzten Vektor, eine diesen Vektor enthaltende Zelle sowie die Verwendung des Vektors.
[0002] Ein zentraler Gegenstand der molekularen Klonierung ist die Herstellung von
rekombinanten Nukleinsäuremolekülen. Dazu wird ein gewünschtes Nukleinsäuremolekül, in der Regel ein DNA-Fragment oder ein Gen, in einen sogenannten Vektor oder eine "Genfähre", wie bspw. ein Plasmid oder einen viralen Vektor, integriert. Ein Ziel der Klonierung besteht darin, das integrierte DNA-Fragment oder Gen zu vermehren, um seine Eigenschaften zu untersuchen oder in Folgeprozessen weiter zu verwenden. Nach einer Vervielfältigung kann der Vektor isoliert und ein Vielfaches des anfangs eingesetzten DNA-Fragments gewonnen werden. Alternativ können Zellen, in die mittels Klonierung ein DNA-Fragment über einen Vektor eingebracht wurde, ein von dem DNA-Fragment codiertes Genprodukt, z.B. ein Protein oder Peptid, exprimieren. Ein solcher Vektor wird auch als Expressionsvektor bezeichnet.
[0003] Standardisierte Experimente zur Klonierung eines beliebigen DNA-Fragments umfassen im Wesentlichen die folgenden sieben Schritte: (1 ) Auswahl des Wirtsorganismus und des Klonierungsvektors, (2) Herstellung des Vektors, (3) Herstellung der zu Monierenden DNA, (4) Erzeugung von rekombinanter DNA, (5) Einbringung der rekombinanten DNA in den Wirtsorganismus, (6) Selektion von Organismen, die die rekombinante DNA enthalten, (7) Screening nach Klonen mit der gewünschten klonierten DNA und/oder den gewünschten biologischen Eigenschaften.
[0004] Einer der zeitlimitierenden Faktoren bei der Herstellung von rekombinanten (Expressions- )Vektoren betrifft die Selektion solcher Klone, die das eingebrachte Genprodukt exprimieren. Eine der häufig eingesetzten Methoden ist die sog. Blau-Weiß-Selektion. Ziel der Blau-Weiß-Selektion ist die Identifizierung von Zellen, welche das gewünschte eingebrachte Gen exprimieren. Für die Blau-Weiß-Selektion werden in der Regel bestimmte Plasmide als Vektoren verwendet, die an der Position zur Insertion des Gen von Interes- ses ("gene of interest") in das Plasmid an der sog. 'Multiple Cloning Site' das Gen für eine ß-Galactosidase, das sog. /acZ-Gen, enthalten. Das Gen für die Galactosidase wird als Reportergen verwendet. Durch die Einfügung des Gens von Interesse in die Multiple Cloning Site wird die Galactosidase inaktiviert. Dadurch enthalten nach einer Transformation der Plasmide die transgenen Organismen, im Gegensatz zu den nicht transgenen Organismen, keine funktionsfähige Galactosidase. Die Galactosidase kann den gelben Farbstoff 'X-Gal' in einen blauen Farbstoff und Galactose spalten. Bei Verwendung von X-Gal-Kulturmedium entsteht etwa eine halbe Stunde nach der Induktion durch die in den Zellen enthaltene Galactosidase ein blauer Farbstoff. Bei den transgenen Zellen ist dagegen die Galactosidase inaktiviert, wodurch diese ungefärbt bleiben und anhand ihrer fehlenden Färbung isoliert werden können.
Diese Selektionsmethode ist sehr zeit- und arbeitsaufwändig. Nicht selten werden insbesondere für die Herstellung von rekombinanten Virus-basierenden Expressionsvektoren bis zu 6 bis 12 Monate benötigt, was bspw. für die Herstellung von saisonal benötig ten oder individualisierten Impfstoffen ungünstig ist.
Andere derzeit im Stand der Technik verwendete Verfahren zur Herstellung bzw.
Selektion von rekombinanten Vektoren sind ebenfalls zeit- und arbeitsaufwändig.
Vor diesem Hintergrund liegt der Erfindung die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Expressionsvektoren bereitzustellen, das weniger arbeitsaufwändig ist und schneller zu den gewünschten rekombinanten Vektoren führt, als dies bei den derzeit verwendeten Verfahren der Fall ist.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Expressionsvektoren, das folgende Schritte aufweist:
Bereitstellen einer einen Ausgangsvektor enthaltenden Zellpopulation, die ein von dem Ausgangsvektor codiertes erstes Genprodukt derart exprimiert, dass es einem an das erste Genprodukt bindenden ersten Bindemolekül zugänglich ist, wobei in dem Ausgangsvektor die Codierungsnukleotidsequenz für das erste Gen- produkt stromauf- und stromabwärts von ersten Rekombinationsnukleotid- sequenzen flankiert ist;
Transfizieren der aus Schritt (1 ) erhaltenen Zellpopulation mit einem für ein zweites Genprodukt codierenden Transfervektor, wobei in dem Transfervektor die Codierungsnukleotidsequenz für das zweite Genprodukt stromauf- und stromabwärts von zweiten Rekombinationsnukleotidsequenzen flankiert ist, die zu den ersten Rekombinationsnukleotidsequenzen homolog sind;
Inkubation der aus Schritt (2) erhaltenen Zellpopulation unter Bedingungen, die einen Austausch der Codierungsnukleotidsequenz für das erste Genprodukt gegen die Codierungsnukleotidsequenz für das zweite Genprodukt durch homologe Rekombination der ersten und zweiten Rekombinationsnukleotidsequenzen und die Bildung eines rekombinanten Expressionsvektors ermöglichen;
Inkubation der aus Schritt (3) erhaltenen Zellpopulation unter Bedingungen, die die Expression des zweiten Genprodukts ermöglichen, ggf. derart, dass es einem an das zweite Genprodukt bindenden zweiten Bindemolekül zugänglich ist,
(5) Inkontaktbringen der aus Schritt (4) erhaltenen Zellpopulation mit dem an das erste Genprodukt bindenden ersten Bindemolekül unter Bedingungen, die die Bildung von Komplexen aus erstem Bindemolekül und erstem Genprodukt ermöglichen;
(6) Abtrennen der Komplexe aus erstem Bindemolekül und erstem Genprodukt von der Zellpopulation, und
(7) Isolierung der rekombinanten Expressionsvektoren aus der Zellpopulation. oder/und ggf.
(5') Inkontaktbringen der aus Schritt (4) erhaltenen Zellpopulation mit dem an das zweite Genprodukt bindenden zweiten Bindemolekül unter Bedingun- gen, die die Bildung von Komplexen aus zweitem Bindemolekül und zweitem Genprodukt ermöglichen;
(6') Abtrennen der Komplexe aus zweitem Bindemolekül und zweitem Genprodukt, und
(7') Isolierung der rekombinanten Expressionsvektoren aus den Komplexen aus zweitem Bindemolekül und zweitem Genprodukt. Unter einem "rekombinanten Expressionsvektor" wird ein Vektor verstanden, der die
Codierungsnukleotidsequenz für ein gewünschtes Genprodukt, wie bspw. für das zweite Genprodukt aufweist und so konstruiert ist, dass die Codierungsnukleotidsequenz in mRNA transkribierbar und nachfolgend in ein Genprodukt translatierbar ist. Der erfindungsgemäße Expressionsvektor entsteht durch Rekombinationsereignisse, über die die Codierungsnukleotidsequenz für das gewünschte Genprodukt in den Expressionsvektor eingebracht wird. Erfindungsgemäß umfassen "Expressionsvektoren" sog. Plasmidvekto- ren, virale Vektoren, oder nach jeweils alternativen Ausgestaltungen ggf. auch Bakterio- phagenvektoren, Cosmide, Phagemide, Bacmide und Bacs. Plasmidvektoren sind Vektoren, die aus Plasmiden gewonnen werden. Als virale Vektoren werden modifizierte Viren bezeichnet, die eukaryotische Zellen transduzieren und dabei fremde Gene in die Zellen einschleusen können. Bakteriophagen sind Viren, welche Bakterien befallen. Durch das Einbauen von cos-sites aus λ-Phagen in Plasmide erhält man sog. Cosmide. Ein Phage- mid ist ein Plasmid, welche einen Origin of Replication zur einzelsträngigen Replikation von F1 -Phagen trägt. Ein Bacmid ist ein "Shuttle-Vektor" für Bakterien und Insektenzellen. Bacs bzw. "Bacterial Artificial Chromosome" sind in Bakterien vermehrbare komplette Virusgenome. Die Erfindung ist insbesondere zur Herstellung von rekombinanten viralen Vektoren bzw. rekombinanten Viren, wie bspw. rekombinanten Pockenviren, einschließlich den Parapoxviren (ORFV), geeignet. Die Erfindung betrifft deshalb auch ein Verfahren zur Herstellung bzw. Selektion von rekombinanten viralen Vektoren oder rekombinanten Viren mit den angegebenen Schritten. [0010] In dem erfindungsgemäßen Verfahren umfasst die "Herstellung" oder das "Herstellen" auch die Selektion oder das Selektieren. Die Erfindung betrifft deshalb auch ein Verfahren zur Selektion von rekombinanten Expressionsvektoren mit den angegebenen Schritten.
Unter "Ausgangsvektor" wird ein Expressions- oder Klonierungsvektor verstanden, der für das erste Genprodukt codiert, das in der Zelle der erfindungsgemäßen Zellpopulation exprimiert werden kann. Der Ausgangsvektor lässt sich erfindungsgemäß deshalb auch als Ausgangsexpressionsvektor oder Ausgangsklonierungsvektor bezeichnen. Bei dem Ausgangsvektor kann es sich um einen linearen oder zirkulären, einen einzel- oder doppelsträngigen, einen DNA- oder RNA-Vektor handeln.
Unter "Zellpopulation" wird eine Gruppe von Zellen gleicher Art verstanden, die mit den erfindungsgemäßen Ausgangs- und Transfervektoren transfizierbar sind. Erfindungsgemäß umfassen die "Zellen" biologische Zellen tierischen, pflanzlichen oder bakteriellen Ursprungs. Alternativ kommen auch künstliche bzw. Minimalzellen infrage, wie Nanoparti- kel, Liposomen, Polymersome, Mikrokapseln etc. Vorzugsweise kommen erfindungsgemäß solche Zellen zum Einsatz, die das erste Genprodukt natürlicherweise nicht expri- mieren. Es versteht sich, dass der Ausgangsvektor auch in mehreren verschiedenen Zellpopulationen bereitgestellt werden kann. Insofern ist erfindungsgemäß die Bereitstellung von "zumindest einer" einen Ausgangsvektor enthaltenden Zellpopulation umfasst.
Unter einem "Genprodukt" wird erfindungsgemäß ein Nukleinsäure-codiertes Molekül verstanden. Beispiele sind Aminosäureabfolgen, Peptide, Proteine oder Proteinfragmente. Das "erste" Genprodukt ist vorzugsweise eine als Selektionsmarker geeignete Entität, bspw. ein Fremd- oder ein Transgen, ggf. aber auch ein Ausgangsvektor-eigenes Genprodukt, das für die Funktion des Vektors nicht essentiell ist. Vorzugsweise handelt es sich bei dem ersten Genprodukt um ein solches, das die Zellen natürlicherweise nicht exprimieren. Das "zweite" Genprodukt ist vorzugsweise ein "Gen von Interesse" (engl.: gene-of-interest), ein Fremd- oder ein Transgen.
[0014] Unter einem "Bindemolekül" wird erfindungsgemäß ein solches Molekül verstanden, das selektiv und spezifisch an das Genprodukt binden und mit diesem einen Komplex bilden kann. Beispiele für erfindungsgemäß geeignete Bindemoleküle sind Antikörper bzw.
Immunglobuline, Aptamere und Fragmente hiervon.
Die Zugänglichkeit des ersten und zweiten Genproduktes für ein Bindemolekül kann auf verschiedene Arten realisiert werden. Beispielsweise ist das erste und/oder zweite Genprodukt auf der Oberfläche der Zellen mit Ausrichtung in das Zelläußere lokalisiert, bspw. als Transmembranprotein. Nach einer weiteren alternativen Ausführungsform ist das erste und/oder zweite Genprodukt auf der Oberfläche eines Viruspartikels mit Ausrichtung in das Virusäußere lokalisiert, bspw. als Virushüllprotein. Nach einer noch weiteren alternativen Ausgestaltung liegen das erste und/oder zweite Genprodukt löslich in der Zelle vor, die Zelle wird permeabilisiert oder lysiert, so dass das erste oder zweite Bindemolekül mit dem ersten und/oder Genprodukt in Kontakt treten kann.
[0016] "Stromaufwärts" bedeutet erfindungsgemäß, dass die Rekombinationsnukleotidsequen- zen relativ zu den Codierungsnukleotidsequenzen für das erste und das zweite Genprodukt in Richtung des jeweiligen 5'-Endes lokalisiert sind. "Stromabwärts" bedeutet erfindungsgemäß, dass die Rekombinationsnukleotidsequenzen relativ zu den Codierungsnukleotidsequenzen für das erste und das zweite Genprodukt in Richtung des jeweiligen 3'-Endes lokalisiert sind. Die Codierungsnukleotidsequenzen für das erste und das zweite Genprodukt sind folglich auf beiden Seiten von Rekombinationsnukleotidsequenzen begrenzt bzw. eingerahmt.
[0017] "Transfizieren" bedeutet erfindungsgemäß allgemein das Einbringen eines Vektors, bspw.
des Transfervektors, in die Zellen der Zellpopulation. Dies ist erfindungsgemäß nicht auf eukaryotische Zellen begrenzt. Transfizieren umfasst deshalb auch das Transduzieren bzw. das Einbringen eines Vektors in prokaryotische Zellen, bspw. in Bakterienzellen, wie in die Zellen von Escherichia coli. Bei der Verwendung von viralen Vektoren oder rekom- binanten Viren als Ausgangsvektoren wird anstatt von transfizieren auch von "infizieren" und anstelle von Transfektion auch von "Infektion" gesprochen.
[0018] Unter einem "Transfervektor" wird erfindungsgemäß ein Transportvehikel bzw. eine
"Genfähre" zur Einbringung der genetischen Information für das zweite Genprodukt in die Zellen der Zellpopulation verstanden. Bei dem Transfervektor kann es sich bspw. um
einen linearen oder nach einer alternativen Ausgestaltung um einen zirkulären, einen einzel- oder doppelsträngigen, einen DNA- oder RNA-Vektor handeln.
[0019] "Homolog" bedeutet erfindungsgemäß, dass die erste Rekombinationsnukleotidsequenz in einem solchen Maß mit der zweiten Rekombinationsnukleotidsequenz identisch oder zu dieser komplementär ist, dass eine homologe Rekombination stattfinden kann. Die Homologie zwischen der ersten und zweiten Rekombinationsnukleotidsequenz beträgt dabei nach einer Ausführungsform der Erfindung zumindest 90 %, weiter vorzugsweise zumindest 95 %, weiter vorzugsweise zumindest 99 % und höchst vorzugsweise 100 %.
[0020] Ein "Abtrennen" in den Schritten (6) und (6') umfasst das räumliche Trennen der
Komplexe aus erstem bzw. zweitem Bindemolekül und erstem und/oder zweitem Genprodukt von der Zellpopulation bzw. verbliebenen Zellpopulation. Diese Abtrennung kann mittels dem Fachmann bekannter physikalischer, chemischer und biologischer Methoden erfolgen. Umfasst sind durchflusszytometrische Methoden, die "magnetic cell Separation", bzw. "magnetic activated cell sorting" (MACS), sowie die Immunpräzipitation. Alternativ kann eine Auftrennung über die Dichte erfolgen. Hierzu wird über das erste und/oder zweite Bindemolekül ein schweres Teilchen, wie bspw. Gold oder Blei, oder alternativ ein leichtes Teilchen an den Komplex gebunden und anschließend über Dichteauftrennung von den nicht-komplexierten Zellen abgetrennt. Auch eine Auftrennung über die Größe ist möglich. Das erste und/ oder zweite Bindemolekül wird dabei an eine große Entität, wie bspw. eine Kugel, gebunden. Die Komplexe bzw. Zellen werden auf ein Sieb gegeben. Die großen Komplexe können das Sieb nicht passieren und werden von den kleinen Komplexen bzw. Zellen abgetrennt. Ein solches System wird unter der Bezeichnung PluriBead® angeboten. Auch der Einsatz affinitätschromatographischer Methoden unter Verwendung einer Säulenmatrix oder die Auftrennung im elektrischen Feld ist erfindungsgemäß umfasst, wobei hier die ersten und/oder zweiten Bindemoleküle ein elektrisch geladenes Teilchenaufweisen.
[0021 ] Das erfindungsgemäße Verfahren kann mit den Schritten (1 ), (2), (3), (4), (5), (6) und (7) durchgeführt werden. In diesem Verfahrenszweig erfolgt eine sog. "negative Selektion". Die Selektion wird als "negativ" bezeichnet, da nach dem Verlust einer Eigenschaft selektiert wird, nämlich nach dem Verlust des ersten Genproduktes. In Schritt (5) dieses Verfahrenszweigs können sich Komplexe aus erstem Bindemolekül und erstem Genprodukt bilden. In Schritt (6) werden diese Komplexe von der Zellpopulation abgetrennt. Damit werden von der verbleibenden Zellpopulation jene Zellen oder (Ausgangs- )Vektoren abgetrennt, bei denen keine Rekombination und damit kein Austausch der Codierungsnukleotidsequenz für das erste gegen das zweite Genprodukt stattgefunden hat. Die abgetrennten Zellen entsprechen weitgehend jenen aus Schritt (1 ). Die Zellen der verbliebenen "bereinigten" bzw. depletierten Zellpopulation hingegen exprimieren das erste Genprodukt nicht mehr, können demnach keinen Komplex mit dem ersten Bindemolekül bilden. In den verbliebenen depletierten Zellen hat durch homologe Rekombination ein Austausch der Codierungsnukleotidsequenz für das erste Genprodukt gegen die Codierungsnukleotidsequenz für das zweite Genprodukt und damit die Bildung des gewünschten rekombinanten Expressionsvektors stattgefunden. Der gewünschte rekom- binante Expressionsvektor wird in Schritt (7) mittels dem Fachmann bekannten Methoden, die das Aufschließen der Zellen und das Freisetzen des Vektors umfassen, aus den Zellen der verbliebenen Zellsubpopulation isoliert.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann alternativ mit den Schritten (1 ), (2), (3), (4), (5'), (6') und (7') durchgeführt werden. In diesem Verfahrenszweig erfolgt eine sog. "positive Selektion". Die Selektion wird als "positiv" bezeichnet, da eine Selektion nach dem Erhalt einer Eigenschaft erfolgt, nämlich nach dem zweiten Genprodukt. In Schritt (5') dieses Verfahrenszweigs können sich Komplexe aus zweitem Bindemolekül und zweitem Genprodukt bilden. Von diesen Komplexen werden in Schritt (6') die Zellen der Zellpopulation abgetrennt, in denen keine homologe Rekombination stattgefunden hat und deshalb das zweite Genprodukt nicht exprimiert wird. Die Komplexe aus zweitem Bindemolekül und zweitem Genprodukt enthalten den gewünschten rekombinanten Expressionsvektor, der in Schritt (7') isoliert wird. Nach einer bevorzugten Ausgestaltung weisen die Komplexe bspw. rekombinante Viruspartikel auf, wenn bspw. als Ausgangsvektor ein viraler Vektor verwendet wird und das zweite Genprodukt in das Viruspartikel inkorporiert wurde, aus denen sich in Schritt (7') der rekombinante Expressionsvektor isolieren lässt. Nach einer weiteren alternativen Ausgestaltung weisen die Komplexe Zellen auf, in oder auf denen das zweite Genprodukt vorliegt und aus denen sich in Schritt (7') der rekombinante Expressionsvektor isolieren lässt. [0023] Nach den Schritten (1 ), (2), (3) und (4) können die Schritte (5), (6) und (7) und die (5'), (6') und (7') auch parallel durchgeführt werden. Alternativ können auch zunächst die Schritte (5), (6) und (7) und dann die Schritte (5'), (6') und (7') oder umgekehrt durchgeführt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren ermöglicht also eine Kombination aus negativer und positiver Selektion.
[0024] Wenn auf eine "positive Selektion" gänzlich verzichtet werden soll, ist es nicht erforderlich, dass in Schritt (4) die Expression des zweiten Expressionsproduktes derart erfolgt, dass es dem zweiten Bindemolekül zugänglich ist. Die Zugänglichkeit ist also entbehrlich, was durch den Ausdruck "ggf." bzw. "gegebenenfalls" klargestellt wird. Insofern erfolgen die Schritte (5')-(7') nur dann, wenn in Schritt (4) die Expression des zweiten Expressionsproduktes derart erfolgt, dass es dem zweiten Bindemolekül zugänglich ist.
[0025] Mit dem neuen erfindungsgemäßen Herstellungsverfahren lassen sich nunmehr
rekombinante Expressionsvektoren innerhalb von nur 1 bis 2 Wochen kostengünstig herstellen. Dies ist insbesondere für die Herstellung von therapeutisch nutzbaren Genprodukten, die innerhalb kürzester Zeit zur Verfügung gestellt werden müssen, von Vorteil.
[0026] Das neue Herstellungsverfahren ermöglicht auch die Herstellung rekombinanter Bakterien oder rekombinanter Zellen, bspw. wenn das exprimierte Genprodukt in der Zelle eine spezifische Funktion ausübt.
[0027] Nach einer Ausführungsform der Erfindung ist das erste Genprodukt ein Protein oder
Proteinfragment, vorzugsweise ein Membranprotein, weiter vorzugsweise ein Zelloberflächenprotein und höchst vorzugsweise CD4.
[0028] Dabei umfasst ein "Protein" oder "Proteinfragment" auch ein Peptid oder eine
Aminosäureabfolge. Ein Membranprotein ist eine als Selektionsmarker besonders geeignete Entität. Mittels der ersten Bindemoleküle, die selektiv und spezifisch an das Membranprotein binden, können die Zellen abgetrennt werden, in denen keine homologe Rekombination und keine Bildung des gewünschten rekombinanten Expressionsvektors stattgefunden hat. Nachdem diese Zellen entfernt werden, kann aus den verbleibenden nicht an das erste Bindemolekül bindenden Zellen der gewünschte rekombinante Expressionsvektor isoliert werden. Dabei hat sich herausgestellt, dass es sich bei "CD4" (Cluster of differentiation 4) um einen besonders geeigneten Selektionsmarker handelt.
[0029] Nach einer erfindungsgemäßen Variante handelt es sich bei dem ersten Genprodukt um ein mittels bildgebenden Verfahren detektierbares Protein, bspw. ein Fluoreszenzprotein. In einem solchen Fall ist in Schritt (1 ) die Zugänglichkeit eines ersten Bindemoleküls entbehrlich, da die negative Selektion auf dem Verlust des mittels bildgebender Verfahren detektierbaren Proteins erfolgt, bspw. auf dem Verlust der Fluoreszenz ("loss-of- fluorescence"). In Schritt (1 ) entfällt dann das Erfordernis, wonach das erste Genprodukt derart exprimiert wird, dass es einem an das erste Genprodukt bindenden ersten Bindemolekül zugänglich ist. Eine wie auch immer geartete Exprimierung, die in einem funktionellen ersten Genprodukt resultiert, ist ausreichend. Auch die Schritte (5) bis (7) entfallen, da ein erstes Bindemolekül nicht zum Einsatz kommt. Stattdessen werden die folgenden Schritte (5*) bis (7*) durchgeführt: (5*) Zuführen der aus Schritt (4) erhaltenen Zellpopulation einer Fluoreszenz-aktivierten Zellsortierung (FACS; "fluorescence-activated cell sorting"); (6*) Abtrennen der fluoreszierenden Zellen von der Zellpopulation, und (7*) Isolierung der rekombinanten Expressionsvektoren aus der Zellpopulation. Unter "Zellpopulation" in Schritt (7*) ist die "verbliebene" Zellpopulation, vermindert um die abgetrennten Zellen, zu verstehen. Die in der Anmeldung im Zusammenhang mit den Schritten (5)- (7) und (5')-(7') offenbarten Vorteile, Merkmale und Eigenschaften des Verfahrens gelten für diese alternative Ausgestaltung entsprechend.
[0030] Nach einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens wird in Schritt
(5) die aus Schritt (4) erhaltene Zellpopulation mit dem an das erste Genprodukt bindenden Bindemolekül unter Bedingungen in Kontakt gebracht, die die Bildung von erstem Bindemolekül-Zell-Komplexen ermöglichen, und in Schritt
(6) werden die erste Bindemolekül-Zell-Komplexe von nicht an das erste Bindemolekül gebundenen Zellen (negative Zellen) abgetrennt, und in Schritt
(7) werden die rekombinanten Expressionsvektoren aus den negativen Zellen isoliert. [0031 ] Bei dieser Ausführungsform liegt das erste Genprodukt im Komplex mit den Zellen vor, in die der Ausgangsvektor eingebracht wurde, so dass über die Bindung des ersten Bindemoleküls an das erste Genprodukt, die in Schritt (5) stattfindet, im Schritt (6) auch die "negativen" Zellen abgetrennt werden können. Das erste Genprodukt ist deshalb bspw. ein zellassoziiertes Genprodukt, das von außerhalb der Zelle für das Bindemolekül zugänglich ist. Vorzugsweise ist das erste Genprodukt ein Membranprotein. In Schritt (7) können aus der verbleibenden Zellsubpopulation die gewünschten rekombinanten Expressionsvektoren isoliert werden.
[0032] Nach einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens erfolgen nach Schritt (6) und vor Schritt (7) folgende weitere Schritte:
(6.1 ) Aufschließen der negativen Zellen zum Erhalt eines die rekombinanten Expressionsvektoren enthaltenden Zelllysats;
(6.2) Inkubation des Zelllysats aus Schritt (6.1 ) mit nicht transfizierten Zellen unter
Bedingungen, die eine Transfektion der Zellen mit den rekombinanten Expressionsvektoren ermöglichen, zum Erhalt einer transfizierten Zellpopulation;
(6.3) Inkontaktbringen der transfizierten Zellpopulation aus Schritt (6.2) mit dem an das erste Genprodukt bindenden ersten Bindemolekül unter Bedingungen, die die Bildung von erstes Bindemolekül-Zell-Komplexen ermöglichen, und
(6.4) Abtrennen der erste Bindemolekül-Zell-Komplexe von nicht an das Bindemolekül gebundenen Zellen (negative Zellen), und optional
(6.5) Wiederholen der Schritte (6.1 ) bis (6.4) zumindest einmal, weiter bevorzugt
zumindest zweimal, weiter bevorzugt zumindest dreimal, weiter bevorzugt zumindest viermal, und höchst bevorzugt zumindest fünfmal.
[0033] Diese Maßnahme im Rahmen der "negativen Selektion" erfolgt zur Anreicherung der
Zellen, in denen durch homologe Rekombination ein Austausch der Codierungsnukleo- tidsequenz für das erste Genprodukt gegen die Codierungsnukleotidsequenz für das zweite Genprodukt stattgefunden hat. Wie die Erfinder feststellen konnten, werden durch die wiederholte Durchführung der Schritte (6.1 ) bis (6.4) die Zellen, die den rekombinan- ten Expressionsvektor enthalten, in nur kurzer Zeit erheblich angereichert, so dass das Verhältnis von rekombinierten Expressionsvektoren zu nicht-rekombinierten Ausgangsvektoren zugunsten der rekombinierten Expressionsvektoren verschoben wird. In diesem Zusammenhang bedeutet in Schritt (6.5) eine "zumindest" zwei-, drei-, vier-, fünfmalige Wiederholung, dass die Schritte (6.1 ) bis (6.4) auch sechs-, sieben-, acht-, neun-, zehnmal oder noch häufiger wiederholt werden können.
[0034] Nach einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens folgen nach dem Schritt
(7) folgende weitere Schritte:
(8) Inkubation der rekombinanten Expressionsvektoren mit nicht transfizierten Zellen unter Bedingungen, die eine Transfektion der Zellen mit den rekombinanten Expressionsvektoren ermöglichen, zum Erhalt einer weiteren transfizierten Zellpopulation;
(9) Inkontaktbringen der weiteren transfizierten Zellpopulation mit dem an das zweite Genprodukt bindenden Bindemolekül unter Bedingungen, die die Bildung von Komplexen aus zweitem Bindemolekül und zweitem Genprodukt ermöglichen, und
(10) Abtrennen der Komplexe aus zweitem Bindemolekül und zweitem Genprodukt, und optional
(1 1 ) Wiederholen der Schritte (8) bis (10) zumindest einmal, weiter bevorzugt zumindest zweimal, weiter bevorzugt zumindest dreimal, weiter bevorzugt zumindest viermal, und höchst bevorzugt zumindest fünfmal.
[0035] Diese Maßnahme im Rahmen der "positiven" Selektion ist gezielt auf die Anreicherung der Zellen ausgerichtet, in denen durch homologe Rekombination ein Austausch der Codierungsnukleotidsequenz für das erste Genprodukt gegen die Codierungsnukleotidsequenz für das zweite Genprodukt stattgefunden hat. Hier gilt das für die Anreicherungsschritte (6.1 ) bis (6.4) im Rahmen der "negativen Selektion" Gesagte entsprechend.
[0036] Nach einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens handelt es sich bei dem ersten und/oder zweiten Bindemolekül um einen Antikörper. Diese Maßnahme hat daher den Vorteil, dass solche Bindemoleküle zum Einsatz
kommen, die sich für das erfindungsgemäße Verfahren besonders gut eignen.
[0038] Nach einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das erste und/oder zweite Bindemolekül an eine magnetische Entität gebunden.
[0039] Diese Maßnahme erlaubt die Anwendbarkeit der "magnetic cell Separation", die auch als
"magnetic activated cell sorting" (MACS) bezeichnet wird. Die MACS-Technologie wird traditionell dazu verwendet, um Zellen zu isolieren, die ein spezifisches Oberflächenmolekül oder -antigen exprimieren. Die Bindemoleküle, wie bspw. Antikörper, werden dabei nach einer bevorzugten Ausführungsvariante an Magnetpartikel gebunden. Dabei handelt es sich i.d.R. um ca. 50 nm große sog. "MicroBeads", die routinemäßig im Rahmen von MACS eingesetzt werden. Sie bestehen aus Eisenoxid und einer Umhüllung aus Polysacchariden, an welche die Bindemoleküle gebunden werden. Die das erste und/oder zweite Genprodukt exprimierenden Zellen werden mit den magnetisierten Bindemolekülen bzw. den MicroBeads inkubiert. Die Bindemoleküle erkennen die ersten bzw. zweiten Genprodukte, die ggf. zellassoziiert sind, also im Komplex mit den Zellen vorliegen. Die Bindemoleküle sorgen damit für die Bindung der MicroBeads an die entsprechende Zellpopulation. Beim Durchfluss der gesamten Zellpopulation durch eine Säule, die von einem starken Magnetfeld umgeben ist, werden die mit den MicroBeads komplexierten Zellen zurückgehalten. Auf diese Weise erhält man beim Spülen der Säule nur nicht-komplexierte Zellen, so dass aus der ursprünglichen Zellpopulation die komplexierte Zellpopulation entfernt wurde. Werden im Rahmen der MACS-Systems magnetische erste Bindemoleküle eingesetzt, handelt es sich bei den nicht-komplexierten Zellen um die Zielzellen und man spricht von "negativer Selektion" oder Abreicherung bzw. Depletion. Werden hingegen magnetische zweite Bindemoleküle eingesetzt, handelt es sich bei den komplexierten Zellen um die Zielzellen und man spricht von einer "positiven Selektion". Das MACS- System ist gut etabliert und benutzerfreundlich und benötigt wenig technische Expertise.
[0040] Nach einer Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das zweite
Genprodukt ein Antigen, vorzugsweise ein virales Antigen, weiter vorzugsweise ein Tumorantigen oder tumorassoziiertes Antigen, weiter vorzugsweise ein virales Tumoranti- gen oder virales tumorassoziiertes Antigen, und höchst vorzugsweise ein HPV-selektives virales Tumorantigen oder HPV-selektives virales tumorassoziiertes Antigen.
[0041 ] Wegen der kurzen Selektionsdauer bzw. des schnellen Herstellungsprozesses bietet das erfindungsgemäße Verfahren optimale Voraussetzungen, um bspw. saisonale Impfstoffe, wie Influenzaimpfstoffe, oder individualisierte Impfstoffe, wie Tumorimpfstoffe, herzustellen. Unter einem "Antigen" wird dabei erfindungsgemäß jeder Nukleinsäure-codierte Stoff verstanden, an den sich Antikörper oder Lymphozyten-Rezeptoren binden können.
Erfindungsgemäß sind vorzugsweise solche Antigene umfasst, die im Zusammenhang mit Erkrankungen stehen, wie Infektionskrankheiten oder Krebserkrankungen. Von besonderem Interesse sind auch Antigene der Cottontail-Rabbit-Papillomaviren (CRPV) oder der humanen Papillomviren (HPV), insbesondere solche, die bei einem infizierten Wirt Tumoren auslösen können.
[0042] Nach einer Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist der Ausgangsvektor ausgewählt aus:
- Virus-abgeleiteten Vektoren, einschließlich solchen, die sich ableiten von: Pockenviren, insbesondere Parapoxvirus ovis- Viren (Orf Viren; ORFV), einschließlich dem D1701 -Stamm; Adeno-assoziierten Viren (AAV); Adenoviren; Vaccinia-Viren; Ba- culoviren; Togaviren; Alphaviren; Arteriviren; Rubiviren; Influenzaviren; Humane Papillomviren; Herpesviren, einschließlich CMV und RhCMV; Arenaviren, einschließlich LCMV;
- bakteriellen Vektoren, einschließlich solchen, die stammen aus: Salmonella sp., Shigella sp., L. monocytogenes, S. gordonii;
- Plasmiden.
[0043] Diese Maßnahme hat den Vorteil, dass solche Ausgangsvektoren zum Einsatz kommen, die sich für das erfindungsgemäße Verfahren besonders gut eignen. Aus dem verwendeten Ausgangsvektor resultiert die zu verwendende Zelle, in die der Ausgangsvektor eingebracht wird. Wenn es sich bei dem Ausgangsvektor um einen viralen Vektor handelt, werden erfindungsgemäß sog. permissive Zellen eingesetzt, also Zellen, in denen nach der Einbringung des Virusvektors bzw. der Infektion durch das Virus der vollständige Vermehrungszyklus des Virus mit Bildung von infektiösen Nachkommenviren ablaufen kann. Wenn bspw. ein Orf Virus (ORFV) als Ausgangsvektor eingesetzt wird, können vorzugsweise Nierenzellen von der grünen Meerkatze, wie bspw. Vero-Zellen, als permis- sive eingesetzt werden. Werden Plasmidvektoren bzw. Plasmide eingesetzt, so können erfindungsgemäß bakterielle Zellen, wie bspw. solche von Escherichia coli zum Einsatz kommen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Kit zur Selektion von rekombinanten Expressionsvektoren, das folgendes aufweist: einen für ein erstes Genprodukt codierenden Ausgangsvektor, wobei die Codie- rungsnukleotidsequenz für das erste Genprodukt stromauf- und stromabwärts von ersten Rekombinationsnukleotidsequenzen flankiert ist;
- einen eine Klonierungsstelle aufweisenden Transfervektor, wobei die Klonierungs- stelle stromauf- und stromabwärts von zweiten Rekombinationsnukleotid- sequenzen flankiert ist, die zu den ersten Rekombinationsnukleotidsequenzen homolog sind.
Bei dem ersten Genprodukt handelt es sich vorzugsweise um ein Protein oder
Proteinfragment, weiter vorzugsweise um ein Membranprotein, weiter vorzugsweise um ein Zelloberflächenprotein, und höchst vorzugsweise um CD4.
Das Kit weist vorzugsweise ferner ein an das erste Genprodukt bindendes Bindemolekül, weiter vorzugsweise einen Antikörper, weiter vorzugsweise einen an eine magnetische Entität gebunden Antikörper, und - optional - eine Magnetfeldsäule auf.
Das erfindungsgemäße Kit stellt die für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens erforderlichen Gegenstände zusammen und sichert so eine korrekte Durchführung auch durch ungeschultes Personal. Es versteht sich, dass das erfindungsgemäße Kit auch eine Anleitung zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sowie ggf. Chemikalien, Salze, Reagenzien, Puffer etc. enthalten kann. [0048] Die Eigenschaften, Merkmale und Vorteile des erfindungsgemäßen Verfahrens gelten für das erfindungsgemäße Kit entsprechend.
[0049] Ein weiterer Gegenstand des vorliegenden Verfahrens betrifft einen Vektor, der eine für ein erstes Genprodukt codierende Codierungsnukleotidsequenz aufweist, die stromauf- und stromabwärts von ersten Rekombinationsnukleotidsequenzen flankiert ist, wobei das erste Genprodukt in einer Zelle derart exprimierbar ist, dass es einem an das erste Genprodukt bindenden ersten Bindemolekül zugänglich ist. Dabei ist es bevorzugt, wenn das erste Genprodukt ein Protein oder Proteinfragment, weiter vorzugsweise ein Membranprotein, weiter vorzugsweise ein Zelloberflächenprotein, und höchst vorzugsweise CD4 ist.
[0050] Gegenstand der Erfindung ist folglich auch der im Rahmen des erfindungsgemäßen
Verfahrens eingesetzte Ausgangsvektor, so dass die Merkmale, Vorteile und Eigenschaften des erfindungsgemäßen Verfahrens, insbesondere des Ausgangsvektors, für den erfindungsgemäßen Vektor entsprechend gelten.
[0051 ] Vor diesem Hintergrund betrifft ein weiterer Gegenstand des vorliegenden Verfahrens auch eine Zelle, die den erfindungsgemäßen Vektor enthält.
[0052] Die Eigenschaften, Merkmale und Vorteile der im Rahmen des erfindungsgemäßen
Verfahrens verwendeten Zelle bzw. Zellpopulation gelten für die erfindungsgemäße Zelle gleichermaßen.
[0053] Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung des
erfindungsgemäßen Vektors als Ausgangsvektor und/oder der erfindungsgemäßen Zelle, zur Herstellung eines rekombinanten Expressionsvektors, der ein Antigen, vorzugsweise ein virales Antigen, weiter vorzugsweise ein Tumorantigen oder tumorassoziiertes Antigen, weiter vorzugsweise ein virales Tumorantigen oder virales tumorassoziiertes Antigen, und höchst vorzugsweise ein HPV-selektives virales Tumorantigen oder HPV- selektives virales tumorassoziiertes Antigen exprimiert. [0054] Die Merkmale, Vorteile und Eigenschaften des erfindungsgemäßen Verfahrens gelten für die erfindungsgemäße Verwendung entsprechend.
[0055] Es versteht sich, dass die vorstehend genannten und die nachstehend noch zu
erläuternden Merkmale nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in anderen Kombinationen oder in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
[0056] Die Erfindung wird nun anhand von Ausführungsbeispielen näher illustriert, aus denen sich weitere Merkmale, Eigenschaften und Vorteile der Erfindung ergeben. Die Ausführungsbeispiele schränken die Reichweite der Erfindung nicht ein. Es versteht sich, dass einzelne Merkmale der Ausführungsbeispiele isoliert zur Spezifizierung, Klarstellung, Weiterbildung oder Verallgemeinerung der Erfindung herangezogen werden können. In den Ausführungsbeispielen wird Bezug genommen auf die beigefügten Figuren, in denen Folgendes dargestellt ist:
Fig. 1 schematische Darstellung der MACS-basierten Selektion;
Fig. 2 schematische Darstellung des Transferplasmids pdV-CD4;
Fig. 3 Herstellung der Rekombinante D1701 -V-CD4-P2Cherry;
Fig. 4 Selektion der Rekombinante D1701 -V-CD4-P2Cherry;
Fig. 5 MACS-basierte Selektion der Rekombinanten D1701 -V-RabG-P2Cherry.
Ausführunqsbeispiele
1 . Neue Selektionsmethode zur Isolierung von rekombinanten Orf Viren [0057] Üblicherweise werden rekombinante Viren, wie bspw. Pockenviren, in permissiven Zellen mittels homologer Rekombination eines Transferplasmids und dem Genom des replizierenden Virus generiert. Um sicherzustellen, dass die Fremd-DNA an die gewünschte Stelle des viralen Genoms integriert wird, enthält das Transferplasmid homologe, virale Sequenzbereiche, die die zu inserierende Fremd-DNA flankieren. Da sich Rekombinationsereignisse sehr selten ereignen, die Rekombinationsfrequenzen liegen i.d.R. zwischen 1 :1000 und 1 :10.000, stellt die Selektion neuer rekombinanter Viren meist einen relativ mühsamen, teuren und langwierigen Prozess dar, welcher auch ein hohes Maß an technischem Know-how erfordert. Infolgedessen wurden unterschiedliche Strategien entwickelt, um die gezielte Selektion rekombinanter Viren zu erleichtern. Häufig wird ein austauschbares Markergen in das Transferplasmid eingebaut und zusammen mit dem Fremdgen bzw. Gen von Interesse ("gene-of-interest") in das virale Genom integriert. Diese Technik hat den entscheidenden Nachteil, dass neben dem Fremdgen gleichzeitig auch das Markergen im rekombinanten Virus exprimiert wird. Potentielle Gefahren durch einen unerwünschten Einfluss des Markergens können nicht ausgeschlossen werden und stehen somit einem genehmigungspflichtigen Einsatz entgegen. Daher ist die Herstellung markerfreier Rekombinanten wünschenswert. Unterschiedliche Verfahren wie z.B. eine visuelle Selektion mittels Expression der ß-Galactosidase, ß- Glucuronidase oder von Fluoreszenzproteinen, sowie eine transiente "Host-Range"-Selektion, eine transiente dominante Selektion, oder entfernbare Markersysteme, sind im Stand der Technik beschrieben.
[0058] Häufig wird zur Herstellung von rekombinanten Orf Viren die herkömmliche Blau-Weiß- Selektion verwendet, die auf der Hydrolyse von X-Gal durch die ß-Galactosidase des lacZ-Gens beruht. Diese Methode ist allerdings sehr zeit- und arbeitsaufwändig, so dass die Etablierung einer neuen einfacheren Selektionsmethode wünschenswert ist.
[0059] Deshalb wurde zunächst eine fluoreszenzbasierte Selektionsmethode erarbeitet, wobei das lacZ-Gen durch ein Fluoreszenzgen ersetzt wurde. Neue Rekombinanten sollten durch den Austausch des Fluoreszenzgens gegen ein Fremdgen generiert und durch den Verlust an Fluoreszenz ("loss-of-fluorescence") visuell selektioniert werden. [0060] Ferner wurde das erfindungsgemäße Verfahren entwickelt, das nach einer bevorzugten Weiterbildung den Einsatz der MACS-Technologie zur Grundlage hat.
[0061 ] Die MACS-Technologie wird normalerweise dazu verwendet, um Zellen zu isolieren, die ein spezifisches Oberflächenmolekül oder -antigen exprimieren. Hierbei macht man sich die Eigenschaft zunutze, dass mit magnetischen Partikeln konjugierte Antikörper, sog. MACS-Beads, spezifisch an Zellen binden und in einem starken magnetischen Feld zurückgehalten werden, wodurch sie von ungebundenen Zellen getrennt werden können. In den im Rahmen der Erfindung zugrundeliegenden Arbeiten wurde die Rekombinante D1701 -V-CD4 entwickelt, die das humane CD4-Antigen (hCD4) exprimiert, und als Ausgangsrekombinante für eine MACS-basierte Selektion dienen sollte. Da für ORFV permissive Vero-Zellen (Affennierenzellen) kein hCD4 exprimieren, lassen sich D1701 -V- CD4 infizierte Zellen durch die Oberflächenexpression des hCD4 charakterisieren und mit Hilfe der MACS-Technologie von nicht-infizierten Zellen separieren. In neu zu generierenden Rekombinanten kann nun der Austausch des hCD4 durch ein Fremdgen erfolgen. Dadurch lassen sich in infizierten Vero-Zellen die neuen, hCD4-freien Rekombinanten leicht von den parentalen hCD4-exprimierenden Viren trennen. Dies ermöglicht eine technisch wesentliche einfachere, schnellere und effizientere Selektion der gewünschten neuen ORFV-Rekombinanten.
[0062] Wichtige Schritte der erfindungsgemäßen MACS-basierten "negativen" Selektion sind schematisch in der Fig. 1 dargestellt. In dieser Ausführungsform ist das erste Genprodukt bzw. der Selektionsmarker hCD4 und das zweite Genprodukt bzw. das "gene-of-interest" ist das Rabies- Virus Glycoprotein (RabG). Ferner kommt ein als "Cherry" bezeichnetes Fluoreszenzprotein zum Einsatz: Die Selektion geht aus von einem nach der Transfektion erhaltenen Zellgemisch, das nicht-infizierte Vero-Zellen (mittelgrau), mit der Ausgangsrekombinante D1701 -V-CD4-P2Cherry-infizierte und hCD4-exprimierende Vero-Zellen (hellgrau), sowie mit der neu entstandenen Rekombinante D1701 -V-RabG-P2Cherry- infizierte Vero-Zellen (dunkelgrau) enthält (Fig. 1 , linker Teil). Nach Zugabe von mit magnetischen Partikeln konjugierten, hCD4-spezifischen MACS-Beads, binden die Antikörper an Zellen, die hCD4 an ihrer Oberfläche exprimieren (Fig. 1 , mittlerer Teil). Die Auftrennung des Zellgemischs erfolgt durch eine Säule in einem magnetischen Feld. MACS-Beads-gekoppelte Zellen werden im Magnetfeld festgehalten, während nicht gebundene Zellen das Magnetfeld passieren. Im Durchfluss befinden sich daher nicht- infizierte und die gewünschten D1701 -V-RabG-P2Cherry-infizierten Zellen (hCD4- negative Zellpopulation: unten, eingekreist), wohingegen in der Säule im Magnetfeld D1701 -V-hCD4-P2Cherry-infizierte Zellen akkumulieren (hCD4-positive Zellpopulation: oben, eingekreist), die verworfen werden (Fig. 1 , rechter Teil).
2. Herstellung und Charakterisierung des Ausqanqsvektors D1701 -V-CD4-P2Cherry
[0063] Die hCD4-Gensequenz, aus pMACS 4.1 (Miltenyi), wurde von der Firma Mr. Gene,
Regensburg, Deutschland, chemisch synthetisiert und über die Restriktionsschnittstellen EcoRI und Hindill in das Plasmid pdV-Red kloniert. Das entstandene Transferplasmid pdV-CD4 ist schematisch in der Fig. 2 dargestellt. Dort ist das hCD4-Gen weiß gekennzeichnet. Es steht unter der Kontrolle des originären frühen Promotors PVEGF- Die das hCD4-Gen dunkel dargestellten flankierenden Bereiche sind stromabwärts homolog zu dem ORFV-Genombereich ORF-3 und stromaufwärts homolog zu dem ORFV- Genombereich F9L-F10L. Diese Bereiche gewährleisten eine zielgerichtete Integration des hCD4-Gens in den VEGF-Lokus des D1701 -V-Genoms über homologe Rekombination. Die zur Klonierung genutzten Restriktionsschnittstellen Hindill und EcoRI das Pox- spezifische frühe Transkriptionsstoppmotiv T5NT sind dargestellt.
[0064] Das neu entstandene Transferplasmid pdV-CD4 wurde anschließend in D1701 -V-GFP- P2Cherry-infizierte Vero-Zellen transfiziert, siehe Fig. 3. Dort ist in der Teilabbildung Fig. 3A die Restriktionskarte des D1701 -V-Genoms dargestellt. Wie in der Teilabbildung Fig. 3B dargestellt, wurde als Ausgangsvirus die doppel-fluoreszierende Rekombinante D1701 -V-GFP-P2Cherry eingesetzt (AcGFP = "Aequorea coerulescens green fluorescent protein"); (mCherry = "mCherry fluorescent protein). Nach der Infektion von Vero-Zellen mit der Rekombinante D1701 -V-GFP-P2Cherry wurde das Transferplasmid pdV-CD4 (Fig. 2) mittels Nukleofektion in die Zellen transfiziert. Wie in der Teilabbildung Fig. 3C dargestellt, erfolgt die Generierung des Ausgangsvektors D1701 -V-CD4-P2Cherry durch Integration des hCD4-Gens im Austausch mit dem AcGFP-Gen über homologe Rekombination. [0065] Neue D1701 -V-CD4-P2Cherry-Ausgangsvirusvektoren können von den GFP-Cherry- exprimierenden parentalen Virusvektoren über den Verlust von GFP-Fluoreszenz unterschieden und selektiert werden. Dies ist in der Fig. 4A dargestellt: "Loss-of-fluorescence": Selektion von D1701 -V-CD4-P2Cherry mittels Fluoreszenzmikroskopie. Nicht-grün fluoreszierende Plaques (eingekreist) wurden identifiziert, gepickt und das Virus aus den Plaques angezogen. Nach fünf Plaque-Reinigungen konnte die Homogenität von D1701 - V-CD4-P2Cherry über PCR-Analysen sichergestellt werden.
[0066] Der Nachweis der korrekten Integration des hCD4-Gens im Austausch mit dem AcGFP- Gen in den VEGF-Lokus konnte über spezifische PCR-Analysen nachgewiesen und die genetische Homogenität von hCD4-positiven und GFP-negativen ORFV-Rekombinanten sichergestellt werden, wie dargestellt in der Fig. 4B: Exemplarische PCR-Analysen nach der vierten PIaque-Reinigung. Rekombinantes D1701 -V-CD4-P2Cherry ist positiv für das hCD4-Gen und negativ für das in der Ausgangsrekombinante enthaltene AcGFP-Gen. Der Nachweis erfolgte über die angegebenen spezifischen PCRs. Die Proben Pos. #1 -3 zeigen homogen rekombinanten Ausgangsvirusvektor mit einem spezifischen hCD4- Signal (Amplikon: 857 bp); Neg. #1 zeigt ein Gemisch aus parentalen GFP-enthaltenden (Amplikon: 575 bp) und rekombinanten CD4-enthaltenden Ausgangsvirusvektoren. Die Anwesenheit des mCherry-Fluoreszenzgens wurde über eine spezifische PCR nachgewiesen (Amplikon: 1 .103 bp).
[0067] Anschließend wurde der Ausgangsvirusvektor bzw. das resultierende rekombinante Virus in Vero-Zellen vermehrt und mittels Ultrazentrifugation zu hohen Virustitern angereichert. Die korrekte, frühe Expression von hCD4 in infizierten Vero-Zellen wurde über Western Blot-Analysen, immunhistochemische Färbung und Immunfluoreszenzanalysen nachgewiesen, wie in Fig. 4C dargestellt: Immunfluoreszenz von D1701 -V-CD4-P2Cherry- infizierten Vero-Zellen. Vero-Zellen wurden mit dem Ausgangsvektor D1701 -V-CD4- P2Cherry infiziert. 20 Stunden nach der Infektion wurde das hCD4-Protein mit einem FITC-konjugierten anti-CD4-Antikörper (Miltenyi) detektiert. Die Fluoreszenzmikroskopie erlaubt die Darstellung der hCD4-Oberflächenexpression ("anti-CD4"), die Cherry- Expression ("mCherry"), sowie beide Fluoreszenzen in einer Zelle nach Überlagerung ("merged"). Wachstumskinetiken der Zellen, die mit dem Ausgangsvektor D1701 -V-CD4-P2Cherry transfiziert waren, zeigten, dass die Integration des CD4-Gens zu keinen Veränderungen der Wachstumseigenschaften der Zellen führt. Die Stärke und der zeitliche Verlauf der Oberflächenexpression von CD4 in Relation zur Zellviabilität wurden mittels Durchflusszy- tometrie bestimmt. Dabei konnte festgestellt werden, dass bereits früh nach der Transfek- tion hCD4 an der Oberfläche der Zellen exprimiert wird und die Intensität mit fortlaufender Dauer zunimmt. Nach ca. 20 bis 24 Std. sind erste zytopathische Effekte zu erkennen und die Zellviabilität nimmt ab. Da freigesetzte Viruspartikel mangels CD4-lnkorporation nicht durch MACS-Beads gebunden werden können, wurde eine Infektionsdauer von 18 bis 20 Stunden festgelegt.
Um eine möglichst effiziente Auftrennung von hCD4-positiven und hCD4-negativen Zellen zu erreichen, wurden zusätzlich in mehreren Vorversuchen unterschiedliche Beadsmen- gen, Inkubationszeiten, -temperaturen und MACS-Säulchen getestet und die optimalen Selektionsbedingungen ermittelt.
3. Generierunq eines neuen RabG-exprimierenden Expressionsvektors D1701 -V- RabG-P2Cherry mittels MACS-Selektion
In einem nächsten Schritt soll durch homologe Rekombination in dem Ausgangsvektor die Codierungsnukleotidsequenz für CD4 gegen die Codierungsnukleotidsequenz eines "gene-of-interest" ausgetauscht werden. Das Rabies- Virus-Glycoprotein (RabG) ist das Hauptantigen des Tollwutvirus bzw. Rabies Virus (RV). RabG wird auf der Oberfläche von RV und RV-infizierten Zellen exprimiert und stellt das Ziel virusneutralisierender Antikörper (VNA) dar. Der Schutz eines Individuums gegen Tollwut korreliert dabei mit der Höhe des VNA-Titers. Ein rekombinantes Virus bzw. ein rekombinanter Expressionsvektor, das bzw. der RabG exprimiert, stellt deshalb ein geeignetes Werkzeug zur Herstellung eines Impfstoffes gegen das Tollwutvirus dar. In diesem Ausführungsbeispiel wird deshalb als zweites Genprodukt bzw. "gene-of-interest" RabG gewählt.
D1701 -V-CD4-P2Cherry-infizierte Vero-Zellen wurden mit dem Transferplasmid pdV- RabG transfiziert und für 72 Std. inkubiert. Nach Aufschluss der Viren aus dem Zelllysat wurden damit über Nacht frische Vero-Zellen infiziert. Die Zellen wurden anschließend mit CD4-spezifischen MACS-Beads (Miltenyi) inkubiert und über eine magnetische Säule aufgetrennt. Dabei verblieben mit dem Ausgangsvektor D1701 -V-CD4-P2Cherry infizierte hCD4-exprimierende Zellen im magnetischen Feld, wohingegen die restlichen Zellen die Säule passierten und sich im Durchfluss sammelten. Anschließend wurde die hCD4- negative Zellpopulation für weitere 20 Std. bei 37 °C inkubiert und die MACS-Selektion wurde wiederholt. Insgesamt wurden fünf solcher MACS-Selektionsrunden durchgeführt, wobei nach jeder Runde ein Teil der negativen Zellpopulation zur Quantifizierung der Anreicherungseffizienz neuer hCD4-negativer Rekombinanten verwendet wurde; vgl. Fig. 5A: Schematische Darstellung des Versuchsaufbaus. Nach der Transfektion von D1701 - V-CD4-P2Cherry-infizierten Vero-Zellen mit dem Transferplasmid pdV-RabG wurden Zellen mit dem Transfektionslysat für 20 Std. inkubiert. CD4-negative Zellen (negative Zellpopulation) wurden über MACS-Selektion isoliert und nach Zugabe von nicht infizierten Vero-Zellen für weitere 20 Std. inkubiert. Gleichzeitig wurde ein Teil der negativen Zellpopulation zur Quantifizierung der Selektionseffizienz eingesetzt. Insgesamt wurden 5 MACS-Selektionsrunden durchgeführt.
Das Verhältnis von parentalen D1701 -V-CD4-P2Cherry- und neu generierten
Rekombinanten D1701 -V-RabG-P2Cherry wurde über Einzelwell-PCR, Fluoreszenzanalysen und Durchflusszytometrie ermittelt, wie in den Teilabbildungen Fig. 5A bis 5D dargestellt. Fig. 5B: Bestimmung der Selektionseffizienz mittels hCD4- und RabG- spezifischer Immunfluoreszenzfärbung. Um das Verhältnis von rekombinantem und parentalem Virus zu bestimmen, wurden nach jeder Selektionsrunde Zellen der negativen Population (Fig. 1 C) in 6-Wellplatten ausgesät und 48 Std. später entweder mit hCD4- (exemplarische Abbildung nach der vierten MACS-Selektionsrunde) bzw. RabG- spezifischen (exemplarische Abbildung nach der fünften MACS-Selektionsrunde) FITC- gekoppelten Antikörpern gefärbt. Da alle Viren das Cherry-Fluoreszenzprotein exprimie- ren, ist eine einfache Unterscheidung zwischen parentalen und rekombinanten Viren im Fluoreszenzmikroskop möglich. So erscheinen in der oberen Reihe (S#4 CD4-FITC) alle parentalen Viren rot-grün (durchgezogen eingekreist), wohingegen die rekombinanten Viren nur rot leuchten (gestrichelt eingekreist); in der unteren Reihe (S#5 RabG-FITC) erscheinen dagegen rekombinante Viren rot-grün (gestrichelt eingekreist) und parentale Viren rot. Fig. 5C: Tabellarische Übersicht der Selektionseffizienz. Die Tabelle zeigt beispielhaft den jeweiligen Anteil parentaler und rekombinanter Viruspiaques nach jeder der fünf durchgeführten MACS-Selektionsrunden (S#1 - S#5). Zusätzlich wurde das Verhältnis von rekombinanten zu parentalen Viruspiaques ermittelt (Ratio Rek./Par.) und der daraus resultierende prozentuale Anteil an rekombinanten Viren errechnet (Rek. in %). Fig. 5D: Identifizierung neuer MACS-selektionierter Rekombinanten mittels PCR- Analyse. Nach jeder der fünf MACS-Selektionsrunden (S#1 - S#5) wurden Zellen der negativen Population (Fig. 1 C) in unterschiedlichen Verhältnissen mit nicht-infizierten Vero-Zellen gemischt und in 384-Well-Platten ausgesät. 72 Std. nach Aussaat wurden Wells, in denen 1-5 Einzelplaques identifiziert werden konnten, geerntet und die DNA isoliert. Mittels hCD4- und RabG-spezifischen PCRs wurde analysiert, ob in den untersuchten Einzelwells homogen rekombinantes D1701 -V-RabG-P2Cherry (z.B. S#5, Spur 2; mit Pfeil gekennzeichnet), homogen parentales D1701 -V-CD4-P2Cherry (z.B. S#3 Spur 15) oder eine Mischung aus beiden Virusexpressionsvektoren (z.B. S#1 Spur 8) vorliegt. Die Pfeile repräsentieren Wells, die die neue Rekombinante homogen enthalten. Die Größen der jeweiligen PCR-Amplikons sind rechts in Basenpaaren (bp) angegeben.
[0073] Bereits nach der dritten MACS-Selektionsrunde ließen sich Einzelwells finden, in der die
Rekombinante und damit der rekombinante Expressionsvektor homogen vorlag; vgl. Fig. 5D. Eine Virusanzucht aus diesen homogen D1701 -V-RabG-P2Cherry-infiierten Einzelwells ermöglicht somit die Herstellung rekombinanter Vektoren bereits innerhalb von einer Woche. Nach der vierten Selektionsrunde lag D1701 -V-RabG-P2Cherry gegenüber dem Ausgangsvirusvektor erstmals in der Überzahl vor und eine weitere Selektionsrunde führte dazu, dass knapp 95 % aller Viren die neue homogene Rekombinante darstellten, die das RabG- anstelle des hCD4-Gens exprimieren; vgl. Fig. 5B und 5C. Diese Ergebnisse konnten durch zwei weitere Rekombinanten, die auf Basis der MACS- Selektionssystems innerhalb von 7 bis 10 Tagen generiert wurden, bestätigt werden.
4. Fazit
[0074] Verglichen mit der im Stand der Technik üblicherweise genutzten Blau-Weiß-Selektion, die ca. 3 Monate dauert, konnte der Selektionsprozess zur Herstellung von rekombinanten Expressionsvektoren mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens um ein Vielfaches beschleunigt werden, was neben der Zeiteinsparung auch mit geringeren Kosten verbun- den ist. Aufgrund der beschleunigten Selektion bietet das erfindungsgemäße Verfahren nun auch exzellente Voraussetzungen zur Generierung von Impfstoffen, die eine schnelle Anpassung und/oder Herstellung voraussetzen, wie bspw. saisonale Impfstoffe, z.B. Influenzavirusimpfstoffe, oder individualisierte Impfstoffe, z.B. Tumorimpfstoffe. Ein weiterer Vorteil besteht darin, dass das MACS-System gut etabliert und benutzerfreundlich ist und daher wenig technische Expertise erfordert. Das beschriebene Selektionsprinzip ist nicht nur auf das beispielhaft eingesetzte Orf Virus beschränkt, sondern erleichtert und beschleunigt auch die Herstellung anderer rekombinanter Expressionsvektoren. Weiterhin kann das neue Verfahren dazu genutzt werden, um neue Rekombinanten, die ein Oberflächen-assoziiertes Antigen exprimieren, mittels der Verwendung spezifischer MACS-Beads positiv zu selektieren. Die Möglichkeit negative und positive Selektion je nach Bedarf zu kombinieren, stellt eine weitere erfolgsversprechende Option dar.

Claims

Patentansprüche
1 . Verfahren zur Herstellung von rekombinanten Expressionsvektoren, das folgende Schritte aufweist:
(1 ) Bereitstellen einer einen Ausgangsvektor enthaltenden Zellpopulation, die ein von dem Ausgangsvektor codiertes erstes Genprodukt derart expri- miert, dass es einem an das erste Genprodukt bindenden ersten Bindemolekül zugänglich ist, wobei in dem Ausgangsvektor die Codierungsnukleo- tidsequenz für das erste Genprodukt stromauf- und stromabwärts von ersten Rekombinationsnukleotidsequenzen flankiert ist;
(2) Transfizieren der aus Schritt (1 ) erhaltenen Zellpopulation mit einem für ein zweites Genprodukt codierenden Transfervektor, wobei in dem Transfervektor die Codierungsnukleotidsequenz für das zweite Genprodukt stromauf- und stromabwärts von zweiten Rekombinationsnukleotid- sequenzen flankiert ist, die zu den ersten Rekombinationsnukleotid- sequenzen homolog sind;
(3) Inkubation der aus Schritt (2) erhaltenen Zellpopulation unter Bedingungen, die einen Austausch der Codierungsnukleotidsequenz für das erste Genprodukt gegen die Codierungsnukleotidsequenz für das zweite Genprodukt durch homologe Rekombination der ersten und zweiten Rekombinations- nukleotidsequenzen und die Bildung eines rekombinanten Expressionsvektors ermöglichen;
(4) Inkubation der aus Schritt (3) erhaltenen Zellpopulation unter Bedingungen, die die Expression des zweiten Genprodukts ermöglichen, ggf. derart, dass es einem an das zweite Genprodukt bindenden zweiten Bindemolekül zugänglich ist, und
(5) Inkontaktbringen der aus Schritt (4) erhaltenen Zellpopulation mit dem an das erste Genprodukt bindenden ersten Bindemolekül unter Bedingungen, die die Bildung von Komplexen aus erstem Bindemolekül und erstem Genprodukt ermöglichen;
Abtrennen der Komplexe aus erstem Bindemolekül und erstem Genprodukt von der Zellpopulation, und
Isolierung der rekombinanten Expressionsvektoren aus der Zellpopulation. oder/und ggf.
Inkontaktbringen der aus Schritt (4) erhaltenen Zellpopulation mit dem an das zweite Genprodukt bindenden zweiten Bindemolekül unter Bedingungen, die die Bildung von Komplexen aus zweitem Bindemolekül und zweitem Genprodukt ermöglichen;
Abtrennen der Komplexe aus zweitem Bindemolekül und zweitem Genprodukt, und
(7') Isolierung der rekombinanten Expressionsvektoren aus den Komplexen aus zweitem Bindemolekül und zweitem Genprodukt.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass das erste Genprodukt ein Protein oder Proteinfragment, vorzugsweise ein Membranprotein, weiter vorzugsweise ein Zelloberflächenprotein, und höchst vorzugsweise CD4 ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt die aus Schritt (4) erhaltene Zellpopulation mit dem an das erste Genprodukt bindenden Bindemolekül unter Bedingungen in Kontakt gebracht wird, die die Bildung von erstes-Bindemolekül-Zell-Komplexen ermöglichen, und in Schritt (6) die erstes-Bindemolekül-Zell-Komplexe von nicht an das erste Bindemolekül gebundenen Zellen (negative Zellen) abgetrennt werden, und in Schritt
(7) die rekombinanten Expressionsvektoren aus den negativen Zellen isoliert werden.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet dass nach Schritt (6) und vor Schritt (7) folgende weitere Schritte erfolgen:
(6.1 ) Aufschließen der negativen Zellen zum Erhalt eines die rekombinanten Expressionsvektoren enthaltenden Zelllysats;
(6.2) Inkubation des Zelllysats aus Schritt (6.1 ) mit nicht transfizierten Zellen unter Bedingungen, die eine Transfektion der Zellen mit den rekombinanten Expressionsvektoren ermöglichen, zum Erhalt einer transfizierten Zellpopulation;
(6.3) Inkontaktbringen der transfizierten Zellpopulation aus Schritt (6.2) mit dem an das erste Genprodukt bindenden ersten Bindemolekül unter Bedingungen, die die Bildung von erstes-Bindemolekül-Zell-Komplexen ermöglichen, und
(6.4) Abtrennen der erstes-Bindemolekül-Zell-Komplexe von nicht an das Bindemolekül gebundenen Zellen (negative Zellen), und optional
(6.5) Wiederholen der Schritte (6.1 ) bis (6.4) zumindest einmal, weiter bevorzugt zumindest zweimal, weiter bevorzugt zumindest dreimal, weiter bevorzugt zumindest viermal, und höchst bevorzugt zumindest fünfmal.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass nach Schritt (7) folgende weitere Schritte erfolgen: (8) Inkubation der rekombinanten Expressionsvektoren mit nicht transfizierten Zellen unter Bedingungen, die eine Transfektion der Zellen mit den rekombinanten Expressionsvektoren ermöglichen, zum Erhalt einer weiteren transfizierten Zellpopulation;
(9) Inkontaktbringen der weiteren transfizierten Zellpopulation mit dem an das zweite Genprodukt bindenden Bindemolekül unter Bedingungen, die die Bildung von Komplexen aus zweitem Bindemolekül und zweitem Genprodukt ermöglichen, und
(10) Abtrennen der Komplexe aus zweitem Bindemolekül und zweitem Genprodukt, und optional
(1 1 ) Wiederholen der Schritte (8) bis (10) zumindest einmal, weiter bevorzugt zumindest zweimal, weiter bevorzugt zumindest dreimal, weiter bevorzugt zumindest viermal, und höchst bevorzugt zumindest fünfmal.
6. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das erste und/oder zweite Bindemolekül ein Antikörper ist.
7. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das erste und/oder zweite Bindemolekül an eine magnetische Entität gebunden ist.
8. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das zweite Genprodukt ein Antigen, vorzugsweise ein virales Antigen, weiter vorzugsweise ein Tumorantigen oder tumorassoziiertes Antigen, weiter vorzugsweise ein virales Tumorantigen oder virales tumorassoziiertes Antigen, und höchst vorzugsweise ein HPV-selektives virales Tumorantigen oder HPV-selektives virales tumorassoziiertes Antigen, ist.
9. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Ausgangsvektor ausgewählt ist aus: Virus-abgeleiteten Vektoren, einschließlich solchen, die sich ableiten von: Pockenviren, insbesondere Parapoxvirus ovis- Viren (ORFV), einschließlich dem D1701 -Stamm; Adeno-assoziierten Viren (AAV); Adenoviren; Vaccini- a- Viren; Baculoviren; Togaviren; Alphaviren; Arteriviren; Rubiviren; Influenzaviren; Humane Papillomviren; Herpesviren, einschließlich CMV und RhCMV; Arenaviren, einschließlich LCMV; bakteriellen Vektoren, einschließlich solchen, die stammen aus: Salmonella sp., Shigella sp., L. monocytogenes, S. gordonii;
Plasmiden.
10. Kit zur Selektion von rekombinanten Expressionsvektoren, das folgendes aufweist: einen für ein erstes Genprodukt codierenden Ausgangsvektor, wobei die Codierungsnukleotidsequenz für das erste Genprodukt stromauf- und stromabwärts von ersten Rekombinationsnukleotidsequenzen flankiert ist; einen eine Klonierungsstelle aufweisenden Transfervektor, wobei die Klo- nierungsstelle stromauf- und stromabwärts von zweiten Rekombinations- nukleotidsequenzen flankiert ist, die zu den ersten Rekombinations- nukleotidsequenzen homolog sind.
1 1 . Kit nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Genprodukt ein Protein oder Proteinfragment, vorzugsweise ein Membranprotein, weiter vorzugsweise ein Zelloberflächenprotein, und höchst vorzugsweise CD4 ist.
12. Kit nach Anspruch 10 oder 1 1 , dadurch gekennzeichnet, dass es ferner ein an das erste Genprodukt bindendes Bindemolekül, vorzugsweise einen Antikörper, weiter vorzugsweise einen an eine magnetische Entität gebunden Antikörper, und - optional - eine Magnetfeldsäule aufweist.
13. Vektor, der eine für ein erstes Genprodukt codierende Codierungsnukleotidse- quenz aufweist, die stromauf- und stromabwärts von ersten Rekombinations- nukleotidsequenzen flankiert ist, wobei das erste Genprodukt in einer Zelle derart exprimierbar ist, dass es einem an das erste Genprodukt bindenden ersten Bindemolekül zugänglich ist.
14. Vektor nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass das erste Transgenprodukt ein Protein oder Proteinfragment, vorzugsweise ein Membranprotein, weiter vorzugsweise ein Zelloberflächenprotein, und höchst vorzugsweise CD4 ist.
15. Zelle, die den Vektor nach einem der Ansprüche 13 oder 14 enthält.
16. Verwendung des Vektors nach Anspruch 13 oder 14 als Ausgangsvektor, und/oder der Zelle nach Anspruch 15, zur Herstellung eines rekombinanten Expressionsvektors, der ein Antigen, vorzugsweise ein virales Antigen, weiter vorzugsweise ein Tumorantigen oder tumorassoziiertes Antigen, weiter vorzugsweise ein virales Tumorantigen oder virales tumorassoziiertes Antigen, und höchst vorzugsweise ein HPV-selektives virales Tumorantigen oder HPV-selektives virales tumorassoziiertes Antigen exprimiert.
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