DE102018110834A1

DE102018110834A1 - Rekombinantes adenovirales Reportervirus

Info

Publication number: DE102018110834A1
Application number: DE102018110834.6A
Authority: DE
Inventors: Helga Hofmann-Sieber; Thomas Dobner; Britta Wilkens
Original assignee: Heinrich Pette Inst Leibniz Inst fur Experimentelle Virologie; Heinrich Pette Institute of Leibniz Institute for Experimental Virology
Current assignee: Leibniz Institut Fuer Virologie Stiftung Buer De
Priority date: 2018-05-04
Filing date: 2018-05-04
Publication date: 2019-11-07

Abstract

Die Erfindung stellt eine Möglichkeit bereit, um die Identifikation von anti-adenoviralen Wirkstoffen zu erleichtern. Hierzu stellt die Erfindung in einem Aspekt einen Adenovirus-Vektor bereit, umfassend eine rekombinanteNukleotidsequenz, die folgendes umfasst:
a) eine Nukleotidsequenz, die für ein Fusionsprotein aus einem adenoviralen Protein E2A-72K/DBP und einem Reporter-Protein kodiert,
b) einen adenoviralen E2A-72K/DBP-Promotor, der mit der für das Fusionsprotein kodierenden Nukleotidsequenz funktional verbunden ist, und
c) eine Nukleotidsequenz, die für ein adenovirales E3-ADP-Protein kodiert.

Description

Die Erfindung betrifft ein adenovirales Reportervirus sowie ein Verfahren und ein Kit zur Identifikation eines potentiell anti-adenoviralen Wirkstoffs.
Adenovirus-Infektionen sind weitverbreitet und umfassen überwiegend okuläre, respiratorische und gastrointestinale Infektionen. Während sie bei gesunden Individuen selten lebensbedrohliche Erkrankungen verursachen, können sie im Fall von immunsupprimierten Personen, beispielsweise Patienten, die in Vorbereitung einer Organ- oder hämatopoetischen Stammzelltransplantation einer immunsupprimierenden Therapie unterzogen werden müssen oder aufgrund beispielsweise einer HIV-Infektion immunsupprimiert sind, auch einen schwerwiegenden Verlauf nehmen (s. z.B. Guo L, Wu C, Zhou H, Wu C, Paranhos-Baccalä G, et al. (2013) Identification of a Nonstructural DNA-Binding Protein (DBP) as an Antigen with Diagnostic Potential for Human Adenovirus. PLOS ONE 8(3): e56708.
doi: 10. 1371/journal.pone.0056708; Hoeben RC, Uil TG, (2013) Adenovirus DNA Replication. Cold Spring Harbor Perspectives in Biology, 5(3):a013003. doi: 10.1101/cshperspect.a013003; Ghebremedhin B. (2014) Human adenovirus: Viral pathogen with increasing importance, European Journal of Microbiology & Immunology 4(1):26-33. doi: 10.1556/EuJMI.4.2014.1.2). Bei Kindern, die einer Knochenmarkstransplantationen unterzogen wurden, ist beispielsweise im Falle von disseminierten Adenovirusinfektionen, die vorwiegend auf Adenoviren der Spezies C zurückgehen, nach wie vor mit einer Mortalität von bis zu 80% zu rechnen.
Eine wirksame antivirale Therapie existiert bislang nicht. Insbesondere mangelt es an wirksamen antiviralen Wirkstoffen.
Die Erfindung macht es sich daher zur Aufgabe, eine Möglichkeit bereit zu stellen, um die Identifikation von anti-adenoviralen Wirkstoffen zu erleichtern.
Zur Lösung der Aufgabe stellt die Erfindung in einem ersten Aspekt ein adenovirales Reportervirus bereit, umfassend eine rekombinante Nukleotidsequenz, die folgendes umfasst:

a) eine Nukleotidsequenz, die für ein Fusionsprotein aus einem adenoviralen Protein E2A-72K/DBP und einem Reporter-Protein kodiert,
b) einen adenoviralen E2A-72K/DBP-Promotor, der mit der für das Fusionsprotein kodierenden Nukleotidsequenz funktional verbunden ist, und
c) eine Nukleotidsequenz, die für ein adenovirales E3-ADP-Protein kodiert.

Mit dem erfindungsgemäßen adenoviralen Reportervirus stellt die vorliegende Erfindung ein Reportersystem bereit, mit dessen Hilfe anti-adenovirale Wirkstoffe identifiziert werden können. Bei dem erfindungsgemäßen Reportervirus handelt es sich um ein Adenovirus, dessen Genom in einer Weise gentechnisch verändert wurde, dass die vollständige Virusreplikation unter natürlichen Bedingungen anhand der Bildung eines Reporter-Proteins beobachtet werden kann. Mit Hilfe des erfindungsgemäßen Reportervirus kann eine Nukleinsäure zielgerichtet in eine Zielzelle eingebracht werden, die für ein Fusionsprotein aus einem adenoviralen Protein E2A-72K/DBP und einem Reporter-Protein kodiert, so dass mittels des Reporter-Proteins die Herstellung des adenoviralen Proteins E2A-72K/DBP durch die Zielzelle beobachtet werden kann. Durch die transkriptionelle Kopplung von E2A-72K/DBP und Reporter-Protein, die beide unter Kontrolle desselben Promotors stehen, wird die direkte Detektion und Überwachung der Virusreplikation ermöglicht. Bei dem erfindungsgemäßen Reportervirus ist das adenovirale E3-ADP-Protein, das für die Virusfreisetzung aus der Zelle erforderlich ist, nicht deletiert oder nach Deletion wieder eingeführt, so dass der natürliche Virusreplikationsmechanismus einschließlich der Lyse der infizierten Zelle und der Freisetzung des Virus daraus beobachtet werden kann.
Unter einem „Adenovirus“ wird hier ein Virus der Familie Adenoviridae verstanden. Bei den Adenoviren handelt es sich um unbehüllte („nackte“) Viren, deren Genom in Form einer doppelsträngigen linearen DNA in einem ikosaedrischen aus Penton- und Hexon-Kapsomeren aufgebauten Kapsid vorliegt. Die Familie umfasst Atadenoviren, Aviadenoviren, Ichtadenoviren, Siadenoviren und Mastadenoviren, wobei letztere bei Säugetieren vorkommen und auch die humanen Adenoviren (HAdV), d.h. menschliche Zellen infizierende Adenoviren, umfassen. Humane Adenoviren werden weiter in Spezies (derzeit A-G) und Serotypen unterteilt, (s. z.B. Ghebremedhin B. (2014) Human adenovirus: Viral pathogen with increasing importance, European Journal of Microbiology & Immunology 4(1):26-33. doi: 10.1556/EuJMI.4.2014.1.2). Zum humanen Adenovirus der Spezies C gehören beispielsweise Viren der Serotypen 1, 2, 5 und 6.
Unter einem „Reportervirus“ wird hier ein Virus, beispielsweise ein Adenovirus, verstanden das beispielsweise hinsichtlich seines Genoms so modifiziert wurde, dass seine Replikation bzw. Bildung durch eine Zelle anhand der Bildung einer signalgebenden Verbindung detektiert werden kann. Bei der signalgebenden Verbindung kann es sich um eine mittels Färbung direkt oder indirekt nachweisbare Verbindung, beispielsweise , z.B. eine fluoreszierende Verbindung handeln. Beispielsweise kann es sich um ein fluoreszierendes Protein handeln, das vom Virusgenom kodiert und während der Virusreplikation von der Wirtszelle gebildet wird.
Die Formulierung, dass das adenovirale Reportervirus eine rekombinante Nukleotidsequenz umfasst, bedeutet, dass das Kapsid des Reportervirus eine rekombinante, d.h. artifizielle in vitro mittels gentechnologischer Verfahren neu zusammengesetzte, Nukleinsäure enthält, beispielsweise ein doppelsträngiges DNA-Molekül.
Der Ausdruck „ein Fusionsprotein aus einem adenoviralen Protein E2A-72K/DBP und einem Reporter-Protein“ bedeutet nicht, dass das E2A-72K/DBP und das Reporter-Protein bzw. deren Aminosäuresequenzen in dem Fusionsprotein unmittelbar aufeinander folgen müssen. Vielmehr bedeutet der Ausdruck lediglich, dass das Fusionsprotein die Aminosäuresequenz für ein adenovirales Protein E2A-72k/DBP und die Aminosäuresequenz für ein Reporterprotein enthält, mit der Maßgabe, dass das adenovirale Protein E2A-72k/DBP und das Reporterprotein in einer von dem Reportervirus infizierten Zelle unter Kontrolle des E2A-72K/DBP-Promotors hergestellt werden. E2A-72k/DBP und Reporterprotein können in dem Fusionsprotein beispielsweise durch einen Peptidlinker aus einigen Aminosäuren getrennt sein.
Unter einem „Reporter-Protein“ wird hier ein signalgebendes Protein verstanden, beispielsweise Protein, welches direkt oder indirekt an der Bildung eines Farbstoffs beteiligt ist oder Licht abstrahlt, so dass die Bildung des Proteins auf einfache Weise mittels geeigneter Methoden nachgewiesen werden kann. Unter einem „Fluorophor-Protein“ wird ein Protein verstanden, dass unter geeigneten Bedingungen fluoresziert, d.h. nach Anregung Licht einer bestimmten Wellenlänge abgibt.
Unter einem „adenoviralen Protein E2A-72K/DBP“, abgekürzt „Ad-DBP“ oder „DBP“, wird ein adenovirales Protein verstanden, das von der E2-Transkriptionseinheit des Adenovirus-Genoms transkribiert und im Stand der Technik als „E2A-72K“ („Early region 2A encoded protein of 72K molecular weight“) oder „DBP“ („DNA binding protein“) bezeichnet wird. Das Protein ist erforderlich für die virale DNA-Replikation. Die 529 Aminosäuren umfassende Aminosäuresequenz eines vom E2A-Gen kodierten E2A-72K/DBP-Proteins eines humanen Adenovirus C Serotyp 5 ist unter der UniProt-Zugriffsnummer Q6VGU4-1 angegeben.
Unter einem „adenoviralen E2A-72K/DBP-Promotor“, auch kurz „E2-Promotor“, wird hier der natürliche adenovirale Promotor verstanden, unter dessen Kontrolle die das adenovirale Protein E2A-72K/DBP kodierende Nukleotidsequenz transkribiert wird. Der Ausdruck, wonach der Promotor mit der für das Fusionsprotein kodierenden Nukleotidsequenz „funktional verbunden“ ist, bedeutet, dass die für das Fusionsprotein kodierende Nukleotidsequenz unter Kontrolle des Promotors transkribiert wird.
Unter einem „Peptidlinker“ versteht man eine kurze Aminosäuresequenz (z.B. 8-50 Aminosäuren), die zum Beispiel aus unpolaren Aminosäuren bestehen kann und als Abstandshalter zwischen zwei aneinander fusionierten Proteinsequenzen fungiert. Ein solcher Peptidlinker kann beispielsweise ein Octapeptid mit der Sequenz ALGAAAGG (SEQ ID NO: 14) sein. Der Begriff wird hier gegebenenfalls auch stellvertretend für eine Nukleotidsequenz verwendet, die für eine Aminosäuresequenz eines solchen Peptidlinkers kodiert.
Unter einem „adenoviralen E3-ADP-Protein“, hier abgekürzt auch als „ADP“ oder „E3-ADP bezeichnet, wird ein Protein verstanden, das von der adenoviralen E3-Transkriptionseinheit transkribiert wird und im Stand der Technik auch als „Adenovirus Death Protein“ (ADP), E3-10.5K oder „E3-11.6K“ bezeichnet wird. Das Protein ist für eine effiziente Zelllysis und die Freisetzung des Virus erforderlich.
Unter einer „E3-Region“ oder „E3-Transkriptionseinheit“ wird hier eine Region des adenoviralen Genoms verstanden, die gemeinsam in einer frühen Phase des viralen Reproduktionszyklus transkribiert wird und die kodierende Sequenz des „Adenovirus Death Protein“, ADP, umfasst. Im Falle des humanen Adenovirus der Spezies C, Serotyp 5, abgekürzt Ad5, sind beispielsweise die Genprodukte E3-12.5, E3-7.1K, E3-gp19K, E3-ADP (E3-10.5K), RIDα (E3 10.4K), RIDß (E3 14.5K) und E3-14.7K in der E3-Region kodiert.
Unter einem „potentiell anti-adenoviralen Wirkstoff“ wird eine Substanz, beispielsweise eine niedermolekulare Verbindung, verstanden, die die Replikation eines Adenovirus in einer Zelle im Vergleich zu einer Kontrolle ohne die Substanz verhindert oder hemmt. „Hemmt“ kann beispielsweise bedeuten, dass die Anzahl der von der infizierten Zelle gebildeten Viren vermindert ist und/oder die Replikation zeitlich verzögert abläuft.
Unter einer „niedermolekularen Verbindung“ wird eine Verbindung mit einem Molekulargewicht von ≤800 g·mol^-1 verstanden.
Unter „mCherry“ (auch „mRFP2“, monomeric red fluorescent protein 2) wird ein rot fluoreszierendes Protein verstanden (s. z.B. US 7687614 B2 ; GenBank-Zugriffsnummer für die Aminosäuresequenz: AAV52164.1). Es handelt sich um eine monomere Variante des aus der Seeanemone Discosoma isolierten Proteins drFP583 (DsRed), die 236 Aminosäuren umfasst und ein Molekulargewicht von 28,8 kDa aufweist. Die Exzitationswellenlänge liegt bei 587 nm und die Emissionswellenlänge bei 610 nm.
In einer bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen adenoviralen Reportervirus ist das Reporter-Protein ein Fluorophor-Protein. Ein Flurophor-Protein ist ein fluoreszierendes Protein, d.h. ein Polypeptid, das zumindest unter bestimmten Bedingungen, z.B. nach Anregung mit Licht einer bestimmten Wellenlänge, Licht abgibt, das detektiert werden kann. Fluorophor-Proteine sind dem Fachmann grundsätzlich bekannt. Beispiele sind das grün fluoreszierende Protein (green fluorescent protein, GFP) und Varianten davon, wie beispielsweise EGFP (enhanced green fluorescent protein) oder Superfolder GFP. Auch in anderen Farben, beispielsweise gelb, blau oder rot fluoreszierende Fluorophor-Proteine sind bekannt. Ein Beispiel ist das rot fluoreszierende Fluorophor-Protein mCherry (auch mRFP2, monomeric red fluorescent protein 2).
Das Reporter-Protein, bevorzugt Fluorophor-Protein, ist in einer besonders bevorzugten Ausführungsform des adenoviralen Reportervirus durch einen Peptidlinker (PL) mit DBP verbunden. Der Peptidlinker kann beispielsweise ein Octapeptid der Sequenz ALGAAAGG (SEQ ID NO: 14) sein. Vorzugsweise ist das Reporter-Protein, beispielsweise mCherry, über den Peptidlinker mit dem N-Terminus von DBP verbunden. Die Reihenfolge in Bezug auf das Fusionsprotein ist dann wie folgt: N-Reporterprotein-PL-DBP-C, wobei „N-“ und „C“ für den N-Terminus oder C-Terminus des Fusionsproteins stehen, und „PL“ für den Peptidlinker, der die Reporterprotein-Sequenz und die DBP-Sequenz untereinander verbindet. Auf Nukleinsäureebene, d.h. auf Ebene der für das Fusionsprotein kodierenden Nukleotidsequenz, gilt entsprechendes, wobei die Reihenfolge hier wie folgt ist: 5'-Reporterprotein-PL-DBP-3'.
Es ist weiter besonders bevorzugt, dass das adenovirale Reportervirus ein humanes Adenovirus (HAdV) ist, besonders bevorzugt ein humanes Adenovirus der Species C vom Serotyp 5 (HAdV-C5). Dies bedeutet, dass das Reportervirus bevorzugt ein rekombinantes humanes Adenovirus ist, besonders bevorzugt ein rekombinantes humanes Adenovirus der Species C vom Serotyp 5, dessen Genom in erfindungsgemäßer Weise gentechnisch dahingehend verändert ist, dass in einer von dem Virus infizierten lebenden Zelle ein Fusionsprotein aus dem adenoviralen Protein E2A -72K/DBP und einem Reporter-Protein, vorzugsweise einem Fluorophor-Protein, gebildet wird.
In einer weiteren besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die E3-Region bei dem Reportervirus außer E3-12.5K und E3-ADP keine weiteren vollständigen kodierenden Sequenzen. Das bedeutet, dass mit Ausnahme von E3-12.5K und E3-ADP alle anderen für E3-Genprodukte kodierende Produkte der E3-Transkriptionseinheit deletiert sind, d.h. aus der E3-Region entfernt sind. Das kann auch bedeuten, dass die E3-Region zunächst bis auf E3-12.5K vollständig deletiert wurde, gegebenenfalls mit Ausnahme von Resten kodierender Sequenzen an den Flanken des deletierten Bereichs, und ADP nachträglich wieder in die E3-Region insertiert wurde.
In anderen Ausführungsformen eines erfindungsgemäßen adenoviralen Reportervirus kann zusätzlich aber auch E3-12.5K entfernt sein. Bei einer solchen Ausführungsform umfasst die E3-Region außer E3-ADP keine weitere vollständige kodierende Sequenz.
Besonders bevorzugt ist eine Ausführungsform eines adenoviralen Reportervirus, bei dem (a) es sich um ein rekombinantes Adenovirus vom Typ C5 (Ad5) handelt, (b) die E3-Region wie oben beschrieben bis auf E3-12.5K und E3-ADP deletiert ist, und (c) mCherry als Reporterprotein mittels eines Octapeptid-Peptidlinkers N-terminal an DBP fusioniert ist.
Es ist bevorzugt, dass ein erfindungsgemäßes adenovirales Reportervirus mit Ausnahme der oben beschriebenen Veränderungen (Deletion der E3-Region mit Ausnahme von E3-12.5K und E3-ADP, und Insertion einer Nukleotidsequenz kodierend für ein Fusionsprotein aus E2A-72K/DBP und Reporter-Protein) sein jeweiliges Wildtyp-Genom aufweist.
Ein erfindungsgemäßes Reportervirus kann beispielsweise eine rekombinante Nukleotidsequenz mit der Sequenz gemäß SEQ ID NO: 15 aufweisen. Bei der rekombinanten Nukleotidsequenz gemäß SEQ ID NO: 15 ist die E3-Region mit Ausnahme von E3-12.5K und E3-ADP deletiert und eine Nukleotidsequenz kodierend für ein Fusionsprotein aus E2A-72K/DBP und dem Reporterprotein mCherry insertiert, wobei E2A-72K/DBP und mCherry über ein Oktapeptid verbunden sind.
In einem zweiten Aspekt wird die Aufgabe gelöst durch ein Verfahren zur Identifikation eines potentiell anti-adenoviralen Wirkstoffs, umfassend die Schritte des:

a) Inkontaktbringens mindestens einer Zelle mit einem adenoviralen Reportervirus nach dem ersten Aspekt der Erfindung in vitro in Gegenwart des potentiell anti-adenoviralen Wirkstoffs, und
b) Detektierens der Bildung des Reporter-Proteins.

Das Verfahren ist einfach durchzuführen und kann zur Testung einer großen Anzahl potenziell anti-adenoviraler Wirkstoffe eingesetzt werden. Das Verfahren wird vorzugsweise automatisiert durchgeführt und ist damit zum Hochdurchsatz-Screening („High-Throughput-Screening“, HTS) von anti-adenoviralen Wirkstoffen geeignet. Vorzugsweise wird die Bildung des Reporter-Proteins, im Falle eines Fluorophor-Proteins beispielsweise durch Fluoreszenzmessung, detektiert und in bekannter Weise mit einer Negativ- und/oder Positivkontrolle verglichen.
Das Inkontaktbringen des Adenovirus-Vektors mit mindestens einer lebenden Zelle erfolgt in vitro unter geeigneten Bedingungen für die Virusreplikation. Derartige Bedingungen, z.B. hinsichtlich Temperatur, Zellmedium etc, sind dem Fachmann bekannt. Eine bestimmte Reihenfolge, in der Reportervirus, Zelle und Testsubstanz, d.h. ein potentiell anti-adenoviraler Wirkstoff, zusammengebracht werden, ist nicht erforderlich und kann je nach Bedarf angepasst werden. Es ist aber bevorzugt, dass das Reportervirus zunächst mit der Testsubstanz gemischt wird und anschließend zu der Zelle in ein geeignetes Reaktionsgefäß gegeben wird.
Das Verfahren ist zur Identifikation beliebiger anti-adenoviraler Wirkstoffe geeignet. Beispielsweise können niedermolekulare Verbindungen auf ihre potenziell anti-adenovirale Wirkung getestet werden.
Die Detektion der Bildung des Reporter-Proteins hängt von der Art des verwendeten Reporter-Proteins ab und kann beispielsweise die Detektion einer Färbung, einer Fluoreszenz oder dergleichen beinhalten. Die Bildung des Reporter-Proteins kann dabei sowohl zu definierten Zeitpunkten punktuell festgestellt als auch kontinuierlich überwacht werden, beispielsweise anhand der Entwicklung einer Fluoreszenz. Die Bildung des Reporter-Proteins kann rein qualitativ oder quantitativ detektiert werden.
Als Zellen sind alle adenoviral permissiven Zellen geeignet. Bevorzugt handelt es sich um menschliche Zellen. Es ist bevorzugt, wenn eine möglichst einheitliche Population adenoviral permissiver Zellen eingesetzt wird.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens ist das Reporter-Protein ein Fluorophor-Protein und es wird die Fluoreszenz detektiert. Bei dem Fluorophor-Protein kann es sich beispielsweise um das grün fluoreszierende Protein (GFP) oder Abwandlungen davon handeln. Bevorzugt ist das Fluorophor-Protein das monomere rot fluoreszierende Protein 2 (mRFP2 oder „mCherry“).
In einem dritten Aspekt betrifft die Erfindung die Verwendung eines adenoviralen Reportervirus nach dem ersten Aspekt der Erfindung zur Identifikation eines potentiell anti-adenoviralen Wirkstoffs. Bevorzugt ist die Verwendung als Reportervirus zur automatisierten Identifikation eines potentiell anti-adenoviralen Wirkstoffs in einem Hochdurchsatz-Screening.
In einem vierten Aspekt betrifft die Erfindung auch ein Testkit zur Identifikation eines potentiell anti-adenoviralen Wirkstoffs, wobei das Testkit einen geeigneten Behälter mit dem adenoviralen Reportervirus nach dem ersten Aspekt der Erfindung umfasst. Weitere Bestandteile des Testkits können beispielsweise ein oder mehrere Reaktionsgefäße mit oder ohne Zellen, Pufferlösungen etc. sein. Die Bestandteile des erfindungsgemäßen Kits können von dem verwendeten Reporterprotein abhängen. Im Falle eines fluoreszierenden Reporterproteins kann das Kit beispielsweise einen Behälter mit dem Virus und eine für die Fluoreszenzdetektion geeignete Multiwell-Platte mit einer darauf aufgebrachten definierten Anzahl von Adenovirus-permissiven Zellen (z.B. 10.000 A549-Zellen/96-Well-Platte) umfassen. Weiterhin kann das Kit einen Behälter mit Zellkulturmedium und phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS-Puffer) beinhalten.
Die Erfindung wird im Folgenden rein zu Veranschaulichungszwecken anhand von Figuren und der nachfolgenden Ausführungsbeispiele näher beschrieben.

1. Vereinfachte schematische Darstellung eines adenoviralen Genoms am Beispiel des Adenovirus Species C, Serotyp 5 (Ad5). In 1b) sind Details der E3-Region der Ad5-Grundstruktur aus 1a) dargestellt.
2. Vereinfachte schematische Darstellung eines Ad5-Genoms mit deletierter E3-Region. In 2b) sind Details der E3-Region der Struktur aus 2a) dargestellt.
3. Vereinfachte schematische Darstellung einer Ausführungsform eines erfindungsgemäßen adenoviralen Reportervirus, abgeleitet von Ad5. In 3b) und 3c) sind Details der E3-Region sowie der E2A-Region der Struktur aus 3a) dargestellt.
4. Vereinfachte schematische Darstellung der Herstellung des in 3 dargestellten erfindungsgemäßen adenoviralen Reportervirus.

Eine Ausführungsform eines adenoviralen Reportervirus, basierend auf dem Adenovirus Species C, Serotyp 5 (Ad5), wurde mittels homologer Rekombination mittels im Stand der Technik bekannter Verfahren (s. s. Wang, H., et al., 2014, Improved seamless mutagenesis by recombineering using ccdB for counterselection, Nucleic Acids Research 42, Pages e37, https://doi.org/10.1093/nar/gkt1339) hergestellt.
Das Ad5-Genom ist schematisch in 1 dargestellt. 1a) zeigt die Grundstruktur, 2b) Details der E3-Region. Flankiert von terminalen invertierten Wiederholungseinheiten (inverted terminal repeats, ITR) umfasst das auf einer linearen doppelsträngigen DNA liegende Genom verschiedene Transkriptionseinheiten, die nach dem Zeitpunkt der Transkription ihrer entsprechenden Genprodukte in frühe („E“ für „early“) und späte („L“ für „late“) eingeteilt werden. Die Transkriptionsrichtung ist mit einem Pfeil gekennzeichnet. Die E3-Region, die in der 1b detaillierter dargestellt ist, kodiert im Falle des Ad5 neben ADP auch weitere Genprodukte, die häufig anhand des Molekulargewichts bezeichnet werden, z.B. E3-12.5K, E3-gp19K oder E3-14.7K.
Zur Herstellung des Reportervirus wurde ein Klonierungsplasmid (p15A-Ad5) verwendet, der das komplette adenovirale Genom in einem enthält, und das in Bakterien vermehrt und mutiert werden kann (Zhang, W. et al., 2017, An Engineered Virus Library as a Resource for the Spectrum-wide Exploration of Virus and Vector Diversity, Cell Reports 19, 1698-1709, DOI: 10.1016/j.celrep.2017.05.008). Die Sequenz für das adenovirale Ad5-Genom basiert auf der unter der Gen-Bank-Zugriffsnummer AY339865.1 hinterlegten Sequenz, in der die Nukleotide 28592..30471 aus der E3-Region der viralen Sequenz deletiert wurden. Das Plasmidrückgrat p15A-cm enthält einen low copy p15A ori und eine Chlorampenicol-Resistenz. Die E3-Region umfasste damit lediglich noch E3-12.5 sowie einen Teil des folgenden E3-7.1K und einen Teil von E3-14.7K, jedoch weder gp19K noch ADP, RIDα oder RIDβ (s. 2, in der dies mit ΔE3 bezeichnet ist).
Die Mutation des adenoviralen Plasmids basiert auf einem zweistufigen Lambda-REDvermittelten homologen Rekombinationsprozess (s. Wang, H., et al., 2014, Improved seamless mutagenesis by recombineering using ccdB for counterselection, Nucleic Acids Research 42, Pages e37, https://doi.org/10.1093/nar/gkt1339; s. 4a, 4b). Dabei wurden die jeweils zweistufigen Lambda-RED-Rekombinationsprozesse insgesamt zweimal durchgeführt, einmal zur Einführung der für das Fusionsprotein (DBP-PL-Reporterprotein) kodierenden DNA und ein weiteres Mal zur Einführung der für ADP kodierenden DNA.
Dabei wird in einem ersten Schritt in vivo ein lineares doppelsträngiges DNA-Transferkonstrukt in die Plasmidsequenz insertiert (s. 4a). Dieses Transferkonstrukt besteht aus Expressionskassetten für das Bakterientoxin ccdB und für eine Ampicillinresistenz (s. Zhang, W. et al., 2017, oben) sowie terminalen Flanken (~50 bp). Die terminalen Flanken sind homolog zur umgebenden Sequenz einer beliebig wählbaren Insertionsstelle im Plasmid und sorgen für die gerichtete Insertion des Transferkonstrukts während des ersten Rekombinationsschrittes.
Die ccdB-amp-Kassette wird mittels PCR amplifiziert. Die dafür verwendeten Primer enthalten zum einen einen spezifischen Sequenzanteil zur Amplifikation der ccdB-amp Kassette, zum anderen aber auch noch jeweils einen 50 bp langen homologen Überhang an ihrem 5'-Ende.
Das Transferkonstrukt wird gemeinsam mit dem p15A-Ad5 Plasmid (p15A-cm-Ad5) in den Bakterienstamm E. coli GBred gyr462A elektroporiert (1. Lambda-RED Rekombination), s. 4a. Dieser rekombinante Bakterienstamm (beschrieben in Wang, H., et al., 2014, oben) ist resistent gegen das Toxin ccdB und codiert unter einem Arabinose-induzierbaren Promotor für die Rekombinationsgene alpha, beta und gam aus dem Lambda-Phagen.
Dadurch wird eine homologe Rekombination zwischen Transferkonstrukt und adenoviralem Plasmid begünstigt. Durch Selektion auf Chloramphenicol und Ampicillin erhält man Transformanden, bei denen das Transferkonstrukt erfolgreich in das adenovirale Plasmid integriert wurde (p15A-cm-Ad5-ccdB-amp).
Im zweiten Rekombinationsschritt (2. Lambda-RED-Rekombination) wird die ccdB-amp-Selektionskassette durch das gewünschte Zielgen ersetzt. Dafür wird das Zielgen mittels PCR amplifiziert. Wie bereits im ersten Rekombinationsschritt werden auch dafür Primer verwendet, die neben einem spezifischen Sequenzanteil 50 bp lange homologe Überhänge an ihrem 5'-Ende besitzen. Anschließend wird das PCR Produkt zusammen mit dem rekombinanten adenoviralen Plasmid aus der 1. Lambda-RED-Rekombination in den Bakterienstamm E. coli GB Red05 elektroporiert. Dieser rekombinante Bakterienstamm (beschrieben in Wang, H., et al., 2014, oben) ist sensitiv bezüglich des ccdB-Toxins, so dass Transformanden nur überleben, wenn die ccdB-amp-Kassette durch das Zielgen ersetzt wird.
Um von dem final mutierten adenoviralen Plasmid Viruspartikel zu produzieren, wird aus dem adenoviralen Plasmid über die Schnittstellen SwaI und PacI das Plasmidrückgrat entfernt und die lineare DNA in eukrayontische HEK293-Zellen transfiziert.
Herstellung eines p15A Ad5-N-DBP-mCherry-Virus

Ausgehend von dem p15A-Ad5-Plasmid wurde nach dem oben beschriebenen Verfahren an den N-Terminus des DBP open reading frames (zwischen nt 24032 und nt 24033, s. GenBank-Nr. AY339865.1) ein Peptidlinker (ALGAAAGG) sowie der mCherry open readingframe fusioniert (s. 4a). Hierzu wurden das Plasmid p15A-cm-Ad5 und das Transferkonstrukt DBP-ccdB-amp, das mit überhängenden Enden versehen wurde, die homolog zu entsprechenden Ad5-DBP-Sequenzen sind, in E. coli GBred gyr462A elektroporiert. Nach der ersten λRED-Rekombination wurde die DBP-ccdB-amp-Selektionskassette durch das Zielgen, ein Fusionsprodukt aus Peptidlinker (PL) und mCherry-Sequenz, ersetzt. Das fertige isolierte Plasmid (p15A-cm-Ad5-N-DBP-mCherry) mit integrierter Fusionsprotein-DNA wurde eingesetzt, um in einer weiteren Runde mit dem oben beschriebenen zweistufigen Rekombinationsverfahren die E3-ADP-Sequenz einzuführen (s. unten, 4b). Tabelle 1: Primer für die Amplifikation der DBP-ccdB-amp Kassette (Fett: Ad5-DBP-homologe Überhänge, Kursiv: ccdB-amp-spezifische Sequenz):

N-DBP fw	CGTCCGCGCTCGGGGGTGGTTTCGCGCTGCTCCTCTTCCCGAC TGGCCAT TTTGTTTATTTTTCTAAATAC (SEQ ID NO: 1)
SM
N-DBP rev	CCTTCTTCTCGACTGACTCCATGATCTTTTTCTGCCTATAGGAG AAGGAA TTTGTTCAAAAAAAAGCCCGCTC (SEQ ID NO:2)
SM

Sequenz der ccdB-amp-Selektionskassette (SEQ ID NO: 3)


 TTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAGACAATAACCCT
 GATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGT
 GTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAA
 CGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACAT
 CGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTT
 TTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTG
 ACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTT
 GAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAAT
 TATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGACA
 ACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGATCATGT
 AACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACCAAACGACGAG
 CGTGACACCACGATGCCTGCAGCAATGGCAACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGG
 CGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATA
 AAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATA
 AATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGAT
 GGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGA
 TGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAAC
 CATGGATCCATGGTTAGCCCTCCCACACATAACCAGGAGGTCAGATTATGCAGTTT
 AAGGTTTACACCTATAAAAGAGAGAGCCGTTATCGTCTGTTTGTGGATGTACAGAG
 TGATATTATTGACACGCCCGGGCGACGGATGGTGATCCCCCTGGCCAGTGCACGTC
 TGCTGTCAGATAAAGTCTCCCGTGAACTTTACCCGGTGGTGCATATCGGGGATGAA
 AGCTGGCGCATGATGACCACCGATATGGCCAGTGTGCCGGTCTCCGTTATCGGGGA
 AGAAGTGGCTGATCTCAGCCACCGCGAAAATGACATCAAAAACGCCATTAACCTG
 ATGTTCTGGGGAATATAACCCAGCCCGCCTAATGAGCGGGCTTTTTTTTGAACAAA

Tabelle 2: Primer für die Amplifikation des mCherry orf und des Peptidlinkers (Fett: Ad5-DBP-homologe Überhänge, Kursiv: mCherry-spezifische Sequenz, Unterstrichen: Sequenz Peptidlinker):

N-DBP mCherry	CCTTCTTCTCGACTGACTCCATGATCTTTTTCTGCCTATAGG AGAAGGAA ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGGA (SEQ ID NO: 4)
fw
N-DBP mCherry	CGTCCGCGCTCGGGGGTGGTTTCGCGCTGCTCCTCTTCCCG
rev	ACTGGCCAT ATCACCGGCGGCAGCACCTAGCGC CTTGTACAGCT CGTCCATGCCGCC (SEQ ID NO: 5)

Sequenz Peptidlinker (SEQ ID NO: 6):


 gcgctaggtgctgccgccggtggt

Sequenz mCherry orf (SEQ ID NO: 7)

Herstellung eines p15A-Ad5N-DBP-mCherryADP-Virus

Ausgehend von dem wie oben beschrieben hergestellten p15A-cm-Ad5-N-DBP-mCherry-Plasmid wurden die trunkierten orfs der E3-Proteine E3-7.1 K und E3-14.7K (nt 29273- 29687, bezogen auf eine Ad5-Sequenz, in die der offene Leserahmen, orf, von mCherry, mit Ausnahme des Stopcodons taa, und der Peptidlinker bereits insertiert sind) durch den open reading frame des E3-Adenovirus-Death-Proteins (ADP) ersetzt (s. 4b). Dies geschah mittels einer zweiten Runde des oben beschriebenen zweistufigen Rekombinationsverfahrens. Ein E3-ccdB-amp-Transferkonstrukt mit Überhängen, die homolog waren zu den trunkierten E3-Proteinen E3-7.1 K und E3-14.7K, wurde zusammen mit dem obigen p15A-cm-Ad5-N-DBP-mCherry-Plasmid in E. coli GBred gyr462A elektroporiert und das erhaltene und isolierte Konstrukt p15A-cm-Ad5-N-DBP-mCherry-ccdB-amp zusammen mit einem Konstrukt umfassend die ADP-Sequenz, flankiert von entsprechenden homologen Überhängen, in E. coli GB Red05 elektroporiert. Aus dem erhaltenen Plasmid p15A-cm-Ad5-N-DBP-mCherry-ADP wurde die Virus-DNA wie oben beschrieben freigesetzt. Tabelle 3: Primer für die Amplifikation der E3-ccdB-amp-Kassette (Fett: E3-homologe Überhänge, Kursiv: ccdB-amp-spezifische Sequenz):

E3 ccdB amp	GCTTAGAAAACCCTTAGGGTATTAGGCCAAAGGCGCAGCTAC TGTGGGGTTT GCCAGTATACACTCCGCTAG (SEQ ID NO: 8)
fw
E3 ccdBamp	GGACAGAAATTTGCTAACTGATTTTAAGTAAGTGATGCTTTAT TATTTTTTTTTA CAGCCCCATACGATATAAGTTG (SEQ ID NO: 9)
rev

Amplifizierte E3-ccdB-amp-Kassette (SEQ ID NO: 10):


 GCCAGTATACACTCCGCTAGCGCTTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTA
 TCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGA
 GTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCT
 TCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGATCAGT
 TGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAAGATCCTTGAG
 AGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGT
 GGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACA
 CTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGG
 ATGGCATGACAGTAAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACT
 GCGGCCAACTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTT
 GCACAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATG
 AAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGCAGCAATGGCAACAAC
 GTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAA
 TAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCTTCCG
 GCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTCTCGCGGTAT
 CATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGA
 CGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGC
 CTCACTGATTAAGCATTGGTAACCATGGATCCATGGTTAGCCCTCCCACACATAAC
 CAGGAGGTCAGATTATGCAGTTTAAGGTTTACACCTATAAAAGAGAGAGCCGTTAT
 CGTCTGTTTGTGGATGTACAGAGTGATATTATTGACACGCCCGGGCGACGGATGGT
 GATCCCCCTGGCCAGTGCACGTCTGCTGTCAGATAAAGTCTCCCGTGAACTTTACCC
 GGTGGTGCATATCGGGGATGAAAGCTGGCGCATGATGACCACCGATATGGCCAGT
 GTGCCGGTCTCCGTTATCGGGGAAGAAGTGGCTGATCTCAGCCACCGCGAAAATGA 
 CATCAAAAACGCCATTAACCTGATGTTCTGGGGAATATAACCCAGCCCGCCTAATG
 AGCGGGCTTTTTTTTGAACAAAACAACTTATATCGTATGGGGCTG

Tabelle 4: Primer für die Amplifikation ADP orf (Fett: E3-homologe Überhänge, Kursiv: ADPspezifische Sequenz):

ADP fw	GCTTAGAAAACCCTTAGGGTATTAGGCCAAAGGCGCAGCTACT GTGGGGTTT ATGACCAACACAACCAACG (SEQ ID NO: 11)
ADP rev	GGACAGAAATTTGCTAACTGATTTTAAGTAAGTGATGCTTTATT ATTTTTTTTTA TCATACTGTAAGAGAAAAGAACATGTG (SEQ ID NO: 12)

ADP orf (SEQ ID NO: 13)


 ATGACCAACACAACCAACGCGGCCGCCGCTACCGGACTTACATCTACCACAAATAC
 ACCCCAAGTTTCTGCCTTTGTCAATAACTGGGATAACTTGGGCATGTGGTGGTTCTC
 CATAGCGCTTATGTTTGTATGCCTTATTATTATGTGGCTCATCTGCTGCCTAAAGCG
 CAAACGCGCCCGACCACCCATCTATAGTCCCATCATTGTGCTACACCCAAACAATG
 ATGGAATCCATAGATTGGACGGACTGAAACACATGTTCTTTTCTCTTACAGTATGA

Ein wie oben beschrieben hergestelltes erfindungsgemäßes Reportervirus kann beispielsweise die in SEQ ID NO: 15 wiedergegebene Nukleotidsequenz aufweisen.

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG

Diese Liste der vom Anmelder aufgeführten Dokumente wurde automatisiert erzeugt und ist ausschließlich zur besseren Information des Lesers aufgenommen. Die Liste ist nicht Bestandteil der deutschen Patent- bzw. Gebrauchsmusteranmeldung. Das DPMA übernimmt keinerlei Haftung für etwaige Fehler oder Auslassungen.

Zitierte Patentliteratur

US 7687614 B2 [0019]

Zitierte Nicht-Patentliteratur

Zhang, W. et al., 2017, An Engineered Virus Library as a Resource for the Spectrum-wide Exploration of Virus and Vector Diversity, Cell Reports 19, 1698-1709 [0040]
Wang, H., et al., 2014, Improved seamless mutagenesis by recombineering using ccdB for counterselection, Nucleic Acids Research 42, Pages e37, https://doi.org/10.1093/nar/gkt1339 [0041]

Claims

Adenovirales Reportervirus, umfassend eine rekombinante Nukleotidsequenz, die folgendes umfasst: a) eine Nukleotidsequenz, die für ein Fusionsprotein aus einem adenoviralen Protein E2A-72K/DBP und einem Reporter-Protein kodiert, b) einen adenoviralen E2A-72K/DBP-Promotor, der mit der für das Fusionsprotein kodierenden Nukleotidsequenz funktional verbunden ist, und c) eine Nukleotidsequenz, die für ein adenovirales E3-ADP-Protein kodiert.
Adenovirales Reportervirus nach Anspruch 1, wobei das Reporter-Protein ein Fluorophor-Protein ist.
Adenovirales Reportervirus nach Anspruch 2, wobei das Fluorophor-Protein mCherry ist.
Adenovirales Reportervirus nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das adenovirale Reportervirus ein rekombinantes humanes Adenovirus ist.
Adenovirales Reportervirus nach Anspruch 4, wobei das adenovirale Reportervirus ein rekombinantes Spezies-C-Adenovirus, bevorzugt ein Spezies-C-Adenovirus vom Serotyp 5 ist.
Adenovirales Reportervirus nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nukleotidsequenz außer einer für das adenovirale E3-ADP-Protein kodierenden Nukleotidsequenz und einer für E3-12.5K kodierenden Nukleotidsequenz keine Nukleotidsequenz enthält, die für ein vollständiges Genprodukt einer adenoviralen E3-Region kodiert.
Adenovirales Reportervirus nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Nukleotidsequenz für ein Fusionsprotein kodiert, bei dem E2A-72K/DBP und das Reporter-Protein über einen Peptidlinker miteinander verbunden sind.
Adenovirales Reportervirus nach Anspruch 7, wobei die Nukleotidsequenz für ein Fusionsprotein kodiert, bei dem das Reporter-Protein über den Peptidlinker mit dem N-Terminus von E2A-72K/DBP verbunden ist.
Adenovirales Reportervirus nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die rekombinante Nukleotidsequenz die Sequenz gemäß SEQ ID NO: 15 aufweist.
Verfahren zur Identifikation eines potentiell anti-adenoviralen Wirkstoffs, umfassend die Schritte des: a) Inkontaktbringens mindestens einer Zelle mit einem adenoviralen Reportervirus nach einem der Ansprüche 1 bis 9 in vitro in Gegenwart des potentiell anti-adenoviralen Wirkstoffs, und b) Detektierens der Bildung des Reporter-Proteins.
Verfahren nach Anspruch 10, wobei das Reporter-Protein ein Fluorophor-Protein ist und die Fluoreszenz detektiert wird.
Verwendung eines adenoviralen Reportervirus nach einem der Ansprüche 1 bis 9 zur Identifikation eines potentiell anti-adenoviralen Wirkstoffs.
Testkit zur Identifikation eines potentiell anti-adenoviralen Wirkstoffs, umfassend einen Behälter mit einem adenoviralen Reportervirus nach einem der Ansprüche 1 bis 9.