DE19628894A1

DE19628894A1 - Verfahren zum Nachweis für Effektoren intra- und/oder interzellulärer Protein-Protein-Wechselwirkungen

Info

Publication number: DE19628894A1
Application number: DE19628894A
Authority: DE
Inventors: Susanne Dr Hagenmaier; Hanspaul Prof Dr Hagenmaier; Dieter Dr Dr Schrenk
Original assignee: HAGENMAIER HANS PAUL
Current assignee: HAGENMAIER HANS PAUL
Priority date: 1996-07-17
Filing date: 1996-07-17
Publication date: 1998-01-22
Also published as: WO1998003676A1

Description

Die Erfindung betrifft ein genetisches Nachweisverfahren für Effektoren intra- und/oder interzellulärer Protein-Protein- Wechselwirkungen. Es ist insbesondere anwendbar im Rahmen des sogenannten Belastungs-Screenings für Effektoren intra- und/ oder interzellulärer Protein-Protein-Wechselwirkungen. Das er findungsgemäße Nachweisverfahren ist auch einsetzbar bei der Suche nach und Isolierung von unbekannten Effektoren bereits bekannter intra- und/oder interzellulärer Wechselwirkungen auf Proteinebene. Gegenstand der Erfindung sind außerdem Nuklein säuresequenzen und Analysen-Kits, welche zur Durchführung des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens benötigt werden.

Aus dem Stand der Technik ist seit langem bekannt, daß Protein- Protein-Wechselwirkungen und die dabei gebildeten stabilen oder transienten Proteinkomplexe von entscheidender Bedeutung in der gesamten Biosphäre sind. Entstehung, Entwicklung und Reproduk tion von Organismen der unterschiedlichsten Entwicklungsstufen wäre ohne Protein-Protein-Wechselwirkungen nicht denkbar. Pro tein-Protein-Wechselwirkungen stellen in biochemischen Prozes sen, wie DNA-Replikation, -Transkription und -Translation, se kretorischen Vorgängen, Signaltransduktion, Zellstoffwechsel und Zellzyklus, zentrale Schnitte dar.

Diese Schlüsselfunktion von Protein-Protein-Wechselwirkungen bringt es mit sich, daß Effektoren, welche, meist hoch spezi fisch, eine bestimmte Wechselwirkung fördern oder inhibieren, einen wesentlichen Einfluß auf den betreffenden Organismus aus zuüben vermögen.

Die Beeinflußbarkeit von Protein-Protein-Wechselwirkungen durch Effektoren kann z. B. anhand des Cytoskeletts eukaryotischer Zellen erläutert werden. Das Cytoskelett trägt nicht nur zur Stabilität eukaryotischer Zellen bei, sondern übernimmt auch andere wichtige Funktionen, wie den Transport von Vesikeln, Veränderungen der Zellform sowie die Bewegung von Zellen. Diese dynamische Struktur wird durch drei Klassen filamentöser Zusam menlagerungen gebildet: den Mikrofilamenten, den Intermediär filamenten und den Mikrotubuli. Mikrofilamente werden durch Polymerisation eines Proteins, des sogenannten Aktins gebildet. Die für die Polymerisation erforderliche Protein-Protein-Wech selwirkung von Aktinproteinen kann beispielsweise durch das Pilz-Alkaloid Cytochalasin B inhibiert werden. Cytochalasin stört den Zusammenbau der Aktinfilamente durch die Bindung (Ca pping) an das für die weitere Polymerisation wichtige freie Ende des letzten Aktinproteins.

Ein Verständnis des Zusammenspiels der an einer Protein- Protein-Wechselwirkung beteiligten Protein-Faktoren einerseits und der positiven oder negativen Effektoren andererseits ermög licht die Nutzung dieser Erkenntnis in verschiedener Hinsicht. Versteht man nämlich, wie eine Protein-Protein-Wechselwirkung unter normalen Umständen, das heißt physiologisch verläuft, oder hat man physiologische Effektoren der Wechselwirkung analysiert, so besteht die Möglichkeit, diese Wechselwirkung gezielt zu manipulieren. Diese Manipulation kann darin beste hen, bekannte Effektoren durch gezielt modifizierte Effektoren zu ersetzen oder erstmals Effektoren für eine bekannte Protein- Protein-Wechselwirkung bereitzustellen. Darüber hinaus eröffnet ein Verständnis der Protein-Protein-Wechselwirkungen unter phy siologischen Bedingungen die Möglichkeit, Störungen des Orga nismus durch äußere Einflüsse zu verstehen und diesen gegebe nenfalls vorzubeugen.

Eine Umsetzung der grundlegenden Erkenntnisse über das Zusam menspiel von Proteinen auf zellulärer Ebene in praktischen Nut zen wird bisher dadurch behindert, daß die damit verbundenen Untersuchungen hohen zeitlichen und/oder experimentellen Auf wand erfordern. Dies gilt insbesondere dann, wenn die Notwen digkeit besteht, Effektoren einer bekannten Protein-Protein- Wechselwirkung nachzuweisen. Handelt es sich beispielsweise um künstlich erzeugte Effektoren, wie zum Beispiel Umweltschad stoffe, welche bereits in geringsten Mengen eine physiologische Protein-Protein-Wechselwirkung beeinflussen und in der Folge einen Organismus schädigen können, besteht hierbei das Problem, den künstlichen Effektor zunächst einmal um mehrere Zehnerpo tenzen anzureichern, um ihn dann chromatographisch, spektrome trisch oder enzymatisch nachweisen zu können. Ein klassisches Beispiel für einen derartigen Effektoren stellt Dioxin, das heißt 2,3,7,8-Tetrachlordibenzo-p-dioxin (TCDD) dar. Es ist mittlerweile bekannt, daß TCDD und andere Dioxine auf molekula rer Ebene wirksame Induktoren der Transkription einer Reihe von Target-Genen darstellen, die für metabolische Enzyme, wie zum Beispiel Glutathion-S-Transferase Ya, Aldehyd-Dehydrogenase und Chinon-Oxidoreduktase kodieren (Landers, J.P. und Bunce, N. J. (1991) Biochem. J. 276, 273 bis 287). Mittlerweile ist auch bekannt, daß diese Dioxineffekte über den sogenannten intrazel lulären Dioxinrezeptor, den sogenannten Ah (Arylhydrocarbon)- Rezeptor verlaufen. Es wurde festgestellt, daß dieser Rezeptor unter dem Einfluß von Dioxin an einen zweiten Proteinfaktor, das sogenannte Arnt-Protein bindet. Der auf diese Weise gebil dete Komplex gelangt dann in den Zellkern, bindet an die Tar get-DNA und induziert auf diese Weise die oben beschriebene Transkription verschiedener weiterer biologischer Faktoren (vgl. Whitelaw, M. et al. (1993) Molecular and Cellular Biolo gy, 2504 bis 2514; Mason, G.G.F., et al. (1994), J. Biol. Chem. Band 269, Nr. 6, 4438 bis 4449). Gerade auf dem Gebiet der Un tersuchung von Umweltschadstoffen besteht ein großer Bedarf an geeigneten Screening-Methoden, um im Rahmen von dringend erfor derlichen epidemiologischen Studien die Umweltbelastung, an weit größeren Populationen als bisher, im Rahmen eines sogenannten Belastungs-Screenings durchführen zu können.

Die potentielle Nutzbarkeit von Erkenntnissen über Effektoren spezieller Protein-Protein-Wechselwirkungen kann anhand einiger Beispiele aus dem Gebiet der Virologie weiter veranschaulicht werden. Viren sind bekanntlich Krankheitserreger für Mensch, Tier und Pflanzen. Sie können relativ harmlose Erkrankungen, wie Erkältungen, aber auch lebensbedrohliche Krankheiten, wie Polyo oder AIDS, verursachen. Ein Virus ist ein intrazellulärer Parasit, der innerhalb und außerhalb einer Zelle in zwei fun damental unterschiedlichen Formen existieren kann. Die extra zelluläre Form wird Virion oder Viruspartikel genannt. Virione bestehen aus dem viralen Genom, welches mit Proteinen und zu weilen auch mit anderen chemischen Substanzen, wie Lipiden, assoziiert ist. Die Proteine schützen das Genom vor Zerstörung im extrazellulärem Raum, ermöglichen den Eintritt in die Wirts zelle und üben oftmals einleitende Schritte beim viralen Repli kationszyklus aus. Während der Infektion wird die Virionstruk tur größtenteils oder komplett zerstört, so daß das Genom in der Zelle frei zur Transkription und Replikation vorliegt.

Auf den ersten Blick erscheinen Virione von tierischen Viren eine hohe Variablität zu besitzen. Bei näherer Betrachtung sind jedoch wesentliche Gemeinsamkeiten erkennbar. Der Teil des Vi ruspartikels, welcher von Virus-kodierenden Proteinen aufgebaut wird, das Capsid, muß aus einem oder wenigen verschiedenen, sich wiederholenden Proteinbausteinen aufgebaut sein. Diese Beschränkung ist dem Virus durch die limitierte Größe seines Genoms vorgegeben und führt dazu, daß die Virion-Capside einen Grundbauplan mit folgenden zwei Eigenschaften besitzen: a) eine enge Helix undefinierter Länge mit dem Genom im Zentrum und b) eine quasi-sphärische ikosaidrische Struktur. Virione tieri scher Viren können sich durch An- bzw. Abwesenheit eines äuße ren Membranmantels zusätzlich unterscheiden. Virione, welche diese Membranhülle nicht besitzen, werden als "nackt" bezeich net. Viren, die diesen, auch Envelope genannten, Membranmantel aufweisen, erwerben diesen aus der Membran des Wirts über einen 2-Schritt-Prozeß, der "budding" genannt wird. Zunächst werden virale Glykoproteine in die Membran insertiert, welche durch Wechselwirkung mit Capsid-Proteinen das Capsid mit der Membran umhüllen und das nun fertige Viruspartikel nach außen freiset zen.

Es zeigt sich also, daß bei viralen Prozessen Protein-Protein- Wechselwirkungen eine entscheidende Funktion besitzen: Es asso ziieren Capsid-Proteine unter gegenseitiger Wechselwirkung zum Capsid; während des "budding"-Prozesses wechselwirken virale Glykoproteine aus der Membran der infizierten Zelle mit viralen Capsidproteinen; Virion-Proteine wechselwirken mit Zelloberflä chenantigenen der zu infizierenden Wirtszelle.

Dieses Wissen über zentrale Schlüsselereignisse könnten dazu dienen, Viren auf eben dieser Basis zu bekämpfen, indem man nämlich diese wichtigen Protein-Protein-Wechselwirkungen durch Inhibitoren gezielt unterbindet. Die modernen Methoden der Mo lekularbiologie machten es möglich, die cDNA- bzw. Proteinse quenz viraler Proteine aufzuklären. Bisher fehlt es jedoch an geeigneten Testverfahren, um systematisch und mit vertretbarem experimentellem Aufwand nach geeigneten Effektoren dieser vira len Protein-Protein-Wechselwirkungen suchen zu können. Ein schnelles, nachweisempfindliches in-vivo-Screeningverfahren, für diesen Zweck wäre äußerst wünschenswert.

Aus dem Stand der Technik ist seit einigen Jahren die sogenann te Two-Hybrid-Technik bekannt, welche auf Arbeiten von Fields, S. und Song, O., veröffentlicht in Nature (1989), 340, S. 245 bis 246, zurückgeht. Die Two-Hybrid-Technik wurde entwickelt, um Wechselwirkungen zwischen bekannten Proteinen besser unter suchen zu können oder um bisher unbekannte Proteine zu identi fizieren, welche mit einem bestimmten bekannten Protein in Wechselwirkung treten.

Die Two-Hybrid-Technik ist eine genetische Methode, mit welcher eine Protein-Protein-Wechselwirkung über die transkriptionale Aktivität eines in Zellkultur produzierten Hybridprotein-Kom plexes bestimmt wird. Die Technik beruht auf dem modularen Auf bau vieler ortsspezifischer Transkriptionsfaktoren (Transkrip tionsaktivatoren), bestehend aus einer DNA-Bindungsdomäne und einer Aktivierungsdomäne. Die Two-Hybrid-Technik basiert auf der Beobachtung, daß eine direkte kovalente Verbindung zwischen diesen beiden Domänen nicht erforderlich ist, sondern daß eine räumliche Nähe, bewirkt durch Wechselwirkung zweier beliebiger anderer Proteine, ausreicht, um Transkription zu induzieren.

Zur Durchführung des Verfahrens ist es erforderlich, zwei Hy bridproteine zu konstruieren und diese in einem geeigneten Wirtszellsystem, wie z. B. in Hefezellen, gemeinsam zu exprimie ren. Eine Sequenz, die für ein erstes an einer Protein-Protein- Wechselwirkung beteiligten Protein kodiert, wird unter Beibe haltung des Leserahmens mit der kodierenden Sequenz der DNA- Bindungsdomäne des Transkriptionsfaktors, wie z. B. des Hefe- Transkriptionsfaktors GAL4, fusioniert, wobei man die kodieren de Sequenz für ein erstes Hybridprotein erhält. Die kodierende Sequenz für ein zweites Hybridprotein stellt man her, indem man die kodierende Sequenz für das zweite an der Wechselwirkung beteiligte Protein mit der kodierenden Sequenz für die Aktiva tor-Domäne des Transkriptionsfaktors im gleichen Leserahmen fusioniert. Ein funktionaler Aktivator wird nach Co-Expression in dem Wirtsystem erzeugt, wenn DNA-Bindungsdomäne und Aktivie rungs-Domäne aufgrund der physikalischen Wechselwirkungen zwi schen den beiden Fremd-Proteinkomponenten miteinander in räum liche Nähe treten. Ist dies der Fall, so wird ein Reportergen exprimiert, das unter der genetischen Kontrolle einer stromaufwärts gelegenen Aktivierungssequenz, wie zum Beispiel GAL1 UAS steht, an welche die DNA-Bindungsdomäne des Transkrip tionsfaktors bindet. Die durch die Wechselwirkung der beiden Fremdproteine bedingte Rekonstitution der Funktion des Trans kriptionsfaktors bewirkt somit die Transkription des Reporter gens (wie zum Beispiel lac Z oder HIS 3). Dessen Genprodukt, wie zum Beispiel β-Galactosidase, kann dann in herkömmlicher Weise nachgewiesen werden.

Die eben beschriebene Two-Hybrid-Technik wurde bisher aus schließlich bei der Identifizierung und Untersuchung verschie dener Protein-Protein-Wechselwirkungen erfolgreich eingesetzt. Staudinger et al. beschreiben in J. Biol. Chem. (1993), Bd. 268, S. 4608 bis 4611 die Verwendung der GAL4-Two-Hybrid-Tech nik zum Screening auf neue Zelltyp-spezifische Bindungspartner für das Helix-Loop-Helix (HLH)-Protein E12. Vojtek, A.B. et al. beschreiben in Cell (1993), Bd. 74, S. 205 bis 214 die Identi fikation neuer, mit H-Ras wechselwirkenden Proteinen unter Ver wendung der Two-Hybrid-Technik, wobei eine Maus-cDNA-Genbank gescreent wurde. Yang, X., et al. schlagen in Science (1992), Bd. 257, S. 680 bis 682 die Verwendung der Two-Hybrid-Technik zum Nachweis physikalischer Wechselwirkungen zwischen Protein- Kinasen und funkionell verwandten Substrat-Proteinen vor. Li, B. und Fields, S. berichten in The FASEB Journal (1993) Bd. 7, S. 957 bis 963 über Untersuchungen des Einflusses von Mutatio nen im Tumorsuppressor-Protein p53 auf dessen Wechselwirkung mit dem T-Antigen, einem viralen Oncogenprodukt aus SV 40. Chardin, P. et al. berichten in Science (1993), Bd. 260, S. 1338 bis 1343 über die Verwendung der Two-Hybrid-Technik zum Nachweis der Wechselwirkung des Proteins hSos1 mit dem Wachs tumsfaktorrezeptor-gebundenen Protein 2 (GRB2). Hardy, C. F. J. et al. beschreiben in Jens & Development (1992) Bd. 6, S. 801 bis 814 eine Mutante des Proteins RIF 1, welche mit einer Mu tante des Sequenz-spezifischen DNA-Bindungsproteins RAP 1 wechselwirkt. Der oben beschriebene Stand der Technik benutzt somit die Two-Hybrid-Technik ausschließlich in der von Fields und Song bereits 1989 vorgeschlagenen Art und Weise, nämlich zum Screening einer DNA-Genbank um neue Protein-Bindungspartner eines bereits bekannten Proteins ausfindig zu machen, und um bekannte Protein-Protein-Bindung näher zu charakterisieren.

Als weitere Anwendungsmöglichkeit wurde von Fiels und Song (1989, a.a.O.) die Anwendung der Two-Hybrid-Technik im Rahmen des Designs therapeutisch wirksamer Peptide vorgeschlagen, die mit Proteinen bakteriellen oder viralen Ursprungs wechselwir ken. Ausführungsbeispiele zu ihren Vorschlag liefern die Auto ren jedoch nicht.

Eine gewisse Erweiterung des klassischen Anwendungsgebietes der Two-Hybrid-Technik stellen die Arbeiten von Luban et al. sowie von Chiu et al. dar. Luban, J. et al. beschreiben in Cell, (1993) Bd. 73, S. 1068 bis 1078 die Verwendung des GAL4-Two-Hy brid-Systems zum Screening einer cDNA-Bank und die Identifika tion von Cyclophilin A und B als Proteine, die mit dem Gag Po lyprotein Pr55^gag aus HIV-1 wechselwirken. Es wurde weiterhin festgestellt, daß die Gag-Cyclophilin A Wechselwirkung durch Cyclosporin A unterbunden werden kann, wobei jedoch bereits aus früheren Arbeiten bekannt war, daß Cyclosporin A an Cyclophili ne bindet.

Chiu, M.I. et al. beschreiben in Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1994), Bd. 91, S. 12574 bis 12578 die Suche nach einem Bin dungsprotein, das mit dem FKBP12/Rapamycin-Komplex wechsel wirkt. Rapamycin ist ein bekanntes Immunsuppressivum, das mit seinem Rezeptorprotein FKBP12 einen Komplex bildet, der, wie von Chiu et al. festgestellt, an ein weiteres bis dahin nicht bekanntes Protein, nämlich RAPT 1 bindet. Die Arbeiten von Lu ban et al. bzw. Chiu et al. haben somit gezeigt, daß die Two- Hybrid-Technik auch zum Nachweis solcher Protein-Protein-Wech selwirkungen eingesetzt werden kann, welche in Gegenwart eines bekannten niedermolekularen Liganden unterbunden werden (wie z. B. im Falle von Cyclosporin A) oder erst in Gegenwart des Liganden beobachtet werden können (wie im Falle von Rapamycin) Beiden Arbeiten gemeinsam ist jedoch die Suche nach einem bis her nicht bekannten Protein-Bindungspartner. Ohne konkrete Bei spiele zu liefern, spekulieren Chiu et al. daß die Two-Hybrid- Technik für Tests mit und das Design von niedermolekularen Mo dulatoren einer Protein-Protein-Wechselwirkung eingesetzt wer den könnte, wobei die untersuchten Modulatoren potentiellen therapeutischen Wert besitzen sollten. Voraussetzung für solche Untersuchungen wäre jedoch, den zu testenden Modulator in iso lierter Form, d. h. als Reinsubstanz und vor allem in ausrei chender Menge, zur Verfügung zu haben, um ihn dann zur Unter suchung seines Einflusses auf die Protein-Protein-Wechselwir kung im Test einsetzen zu können.

Zusammenfassend ist somit festzustellen, daß der diskutierte Stand der Technik keinerlei brauchbare Hinweise enthält, daß die Two-Hybrid-Technik erfolgreich bei der Suche nach niedermo lekularen, bekannten oder unbekannten, Effektoren definierter Protein-Protein-Wechselwirkungen eingesetzt werden kann. Ins besondere gibt es keinen Hinweis im Stand der Technik, die Two- Hybrid-Technik im Rahmen echter Screeningverfahren für nieder molekulare Effektoren von Protein-Protein-Wechselwirkungen ein zusetzen. Screeningverfahren sind in der Regel dadurch gekenn zeichnet, daß der potentielle Effektor nicht als Reinsubstanz sondern im Gemisch mit anderen Verbindungen und in äußerst ge ringer Konzentration vorliegt. Dies ist insbesondere der Fall, wenn man neue Ressourcen auf unbekannte Effektoren hin unter sucht oder in identischer Weise gewonnene Proben gleichen Typs auf einen bekannten Effektor screent.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist somit die Bereitstellung eines Nachweisverfahrens für niedermolekulare Effektoren intra- und/oder interzellulärer Protein-Protein-Wechselwirkungen mit dessen Hilfe insbesondere Substanzgemische schnell und mit ho her Nachweisempfindlichkeit auf das Vorhandensein eines bekann ten oder unbekannten Effektors für ein vorgegebenes Protein- Protein-Wechselwirkungssystem untersucht werden können. Das erfindungsgemäße Verfahren soll insbesondere anwendbar sein für sogenannte Belastungsscreeningsverfahren, die im Rahmen epide miologischer Untersuchungen eingesetzt werden können. Das er findungsgemäße Verfahren soll außerdem geeignet sein zur Durch führung sogenannter Naturstoffscreeningsverfahren, um neuartige therapeutische Wirksubstanzen lokalisieren und anschließend analysieren zu können.

Überraschenderweise gelöst wird die erfindungsgemäße Aufgabe durch Bereitstellung eines genetischen Nachweisverfahrens für Effektoren intra- und/oder intrazellulärer Protein-Protein- Wechselwirkungen, wobei man

a) in einer Wirtszelle in Gegenwart eines Analyten, in dem man die Effektorfunktion vermutet, zwei Polypeptid-Hybride A₁A₂ und B₁B₂ exprimiert, deren Domänen A₁ und B₁ zusammen einen funktio nellen Transkriptions-Aktivator-Komplex bilden, wenn die Domä nen A₂ und B₂, welche die intra- und/oder interzelluläre Wech selwirkung, so wie sie beispielsweise unter physiologischen Bedingungen abläuft, imitieren, miteinander wechselwirken, wo bei die Wechselwirkung zwischen den Polypeptiddomänen A₂ und B₂ nur bei Fehlen oder Vorliegen der Effektorfunktion, d. h. wenigstens eines Effektors, in dem Analyten zu beobachten ist; und
b) auf Expression eines Reporter-Gens analysiert, das unter der genetischen Kontrolle einer stromaufwärts gelegenen Transkrip tions-Aktivierungssequenz steht, an welche der (in situ gebil dete) Transkriptions-Aktivator-Komplex bindet, wobei Expression des Reportergen-Produkts auf Vorliegen oder Fehlen der Effekt orfunktion im Analyten hinweist.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung der auf diese Weise nachgewiesenen Effektoren sowie die unter Anwendung dieses Verfahrens isolier ten neuen Effektoren von Protein-Protein-Wechselwirkungen.

Gegenstand der Erfindung sind außerdem Nukleinsäuresequenzen, welche für die im erfindungsgemäßen Nachweisverfahren verwende te Hybridproteine oder Polypeptidhybride A₁A₂ und B₁B₂ kodieren.

Schließlich ist Gegenstand der Erfindung ein Analysenkit zur Durchführung des erfindungsgemäßen Nachweisverfahrens.

Kurze Beschreibung der Figuren

Fig. 1 zeigt das Konstruktionsschema zweier erfindungsgemäß anwendbarer Expressionsvektoren vor Insertion der kodierenden Sequenz für die zweite Hybridprotein-Kom ponente: (A) zeigt das 5523 bp Plasmid pGBT9, das die kodierende Sequenz für die DNA-Bindungsdomäne (bd) des eukaryotischen Transkriptionsaktivators GAL4 enthält. (B) zeigt das 6659 bp Plasmid pGAD424, das die kodierende Sequenz für die Transkriptions-Akti vierungsdomäne (ad) von GAL4 enthält. In den Fig. 1(A) und 1(B) steht "MSC" für die Multiple Klo nierungsstelle, "p" für die Promotor, "T" für die Transkriptions-Terminationssequenz und "▲" für das SV40 Kernlokalisierungssignal.

Fig. 2 zeigt das Konstruktionsschema der Expressionsvektoren von Fig. 1 nach Insertion der kodierenden Sequenz für die zweite Hybridprotein-Komponente: (A) veran schaulicht die Insertion der kodierenden Sequenz für das ARNT-Protein in die BamHI-Schnittstelle der MSC von pGBT9. (B) zeigt die Insertion der kodierenden Sequenz für das Ah-Protein in die SalI Schnittstelle der MSC von pGAD424.

Die Erfindung wird in den nun folgenden Abschnitten näher er läutert.

Das erfindungsgemäße Nachweisverfahren bietet den überraschen den Vorteil, daß Effektoren einer vorgegebenen Protein-Protein- Wechselwirkung in effizienter Weise, das heißt schnell und, in der Regel ohne Abtrennung der in dem untersuchten Analyten vor handenen weiteren nieder- oder hochmolekularen Komponenten qua litativ erfaßt werden können. Eine Auftrennung des Analyten bzw. eine weitere Eingrenzung des Effektors ist nur dann ange sagt, wenn sich zeigen sollte, daß mehr als ein Effektor der betreffenden Protein-Protein-Wechselwirkung in dem Analyten enthalten ist oder einzelne Komponenten der Analyten das Testsystem stören. Letzteres kann der Fachmann durch wenige Kontrollversuche leicht feststellen.

Die im erfindungsgemäßen Testsystem künstlich induzierte Pro tein-Protein-Wechselwirkung "imitiert" die natürliche, bzw. physiologische Wechselwirkung insofern, als zumindest die Bin dungsspezifität der wechselwirkenden Proteinkomponenten im we sentlichen erhalten bleibt. Die Stärke der Wechselwirkung im Testsystem kann im Vergleich zum physiologischen Prozeß variie ren.

Die gemäß vorliegender Erfindung vorgegebene Protein-Protein- Wechselwirkung ist natürlich nicht beschränkt auf reine Protei ne oder Polypeptide. Die Erfindung ist ebenfalls anwendbar auf solche Wechselwirkungen, an denen z. B. Glykoproteine oder Lipo proteine beteiligt sind. Erfindungsgemäß brauchbare Testsyste me sind außerdem nicht nur mit vollständigen Proteinen als Bin dungspartner etablierbar. Vielmehr sind auch funktionale Äqui valente von an der nativen Protein-Protein-Wechselwirkung be teiligten Faktoren brauchbar. Solche funktionalen Fragmente können Teilsequenzen, wie z. B. bestimmte Domänen, des Faktors umfassen, auf welche die zur Wechselwirkung benötigte Bindungs funktion lokalisiert ist. Geeignete Fragmente können z. B. gen technisch oder in klassischer Weise durch enzymatische oder chemische Fragmentierung erzeugt werden. Erfindungsgemäße funk tionelle Äquivalente umfassen außerdem durch Aminsosäure-Sub stitution, -Addition und/oder -Deletion unter Beibehaltung der Bindungsspezifität, z. B. gentechnisch, erzeugte Derivate der Bindungspartner.

Der nachzuweisende Effektor ist vorzugsweise eine niedermoleku lare Komponente, welche die Protein-Protein-Wechselwirkung sti muliert oder inhibiert. Es kann sich also um einen positiven oder negativen Effektor der Wechselwirkung handeln.

Die vorgegebene intra- und/oder interzelluläre Protein-Protein- Wechselwirkung ist ein Vorgang, der unter physiologischen Be dingungen in prokariotischen, wie z. B. bakteriellen Zellsyste men, in eukaryotischen Zellen, wie z. B. Hefezellen oder mensch lichen Zellen, oder in viralen Mikroorganismen oder bei der Wechselwirkung verschiedener dieser Zellsysteme untereinander, wie z. B. eine Wechselwirkung viraler Proteine mit eukaryoti schen Proteinen, abläuft. Durch geeignete Wahl des Testsystems, insbesondere der zu transformierenden Wirtszellen, kann die Protein-Protein-Wechselwirkung unter möglichst physiologischen Bedingungen nachgeahmt werden.

Es sind unterschiedliche Arten von Protein-Protein-Wechselwir kungen anwendbar. Ein erster Typ betrifft Wechselwirkungen, die nur dann zustande kommen, wenn ein Effektor im Analyten anwe send ist. Ein positiver Nachweis der Protein-Protein-Wechsel wirkung ist somit gleichbedeutend mit einem positiven Effektor- Nachweis. Ein zweiter Typ betrifft Wechselwirkungen, die in Gegenwart eines Effektors unterbunden werden. Ein positiver Nachweis der Protein-Protein-Wechselwirkung ist dann gleichbe deutend mit einem negativen Effektor-Nachweis.

Das erfindungsgemäße Verfahren wird vorzugsweise so durchge führt, daß man ein geeignetes prokaryotisches oder eukaryoti sches Wirtszellsystem mit einer ersten und einer zweiten Nu kleinsäure-Sequenz transformiert, wobei die erste Nukleinsäu resequenz für das Polypeptid-Hybrid A₁A₂ kodiert, welches die Transkriptions-Aktivierungsdomäne A₁ des Transkriptionsfaktors, wie z. B. Gal4, und die Polypeptid-Domäne A₂ umfaßt; und die zweite Nukleinsäuresequenz für das Polypeptid-Hybrid B₁B₂ kodiert, welches die DNA-Bindungsdomäne B₁ eines Transkriptions faktors, wie z. B. GAL4, und die Polypeptid-Domäne B₂ umfaßt.

Der durch Wechselwirkung die Hybridprotein-Domänen A₂ und B₂ induzierte "funktionelle Transkriptionsaktivatorkomplex" (A₁A₂/B₁B₂) entspricht hinsichtlich seiner Funktion im wesent lichen dem nativen Transkriptionsaktivator, von dem die Hybridprotein-Domänen A₁ und B₁ abgeleitet sind. Ebenfalls an wendbar sind funktionelle Äquivalente dieser Domänen, die man durch Aminosäure-Addition, -Deletion und/oder -Substitution un ter Beibehaltung der charakteristischen Eigenschaften, wie Bin dungsspezifität und Aktivierungsspezifität, gentechnisch oder in anderer Weise, herstellen kann.

Der erfindungsgemäß zu untersuchende Analyt ist vorzugsweise ein Gemisch von Substanzen, wobei man vermutet, daß wenigstens eine dieser Substanz einen positiven oder negativen Einfluß auf die vorgegebene Protein-Protein-Wechselwirkung ausübt. Insbe sondere bevorzugt ist diese wirksame Substanz eine niedermole kulare anorganische, vorzugsweise organische Verbindung.

Der erfindungsgemäß untersuchte Analyt ist beispielsweise aus gewählt unter Körperflüssigkeitsproben, wie z. B. Gesamtblut, Muttermilch, Liquor, Speichel und Urin. Außerdem sind mit dem erfindungsgemäßen Verfahren Extrakte oder Homogenate prokario tischer oder eukariotischer Zellen, wie z. B. bakterielle Homo genate, Homogenate aus Pflanzenzellen oder Homogenate aus nie deren Eukaryoten, wie zum Beispiel Hefen, oder höheren Eukaryo ten, wie zum Beispiel tierischen oder menschlichen Zellen un tersuchbar. Bevor man die oben beschriebenen Analyten im erfin dungsgemäßen Verfahren einsetzt, kann es von Vorteil sein, hö hermolekulare Komponenten, wie z. B. Zellfragmente, Organellen, oder Makromoleküle, wie Proteine und Nukleinsäuren, abzutren nen.

Erfindungsgemäß untersuchbar sind ebenfalls umweltanalytische Proben, wie z. B. Wasser-, Luft- und Bodenproben, Rückstände aus Industrieanlagen, wie z. B. flüssiger oder fester Sondermüll, Filterstäube aus Rauchgasfilteranlagen. Außerdem sind erfin dungsgemäß analysierbar Lebensmittelproben. Auch für die Unter suchung von Bodenproben, Rückständen aus Industrieanlagen sowie Lebensmittelproben ist es zweckmäßig, vor der Untersuchung ei nen geeigneten Extrakt herzustellen.

Schließlich besteht die Möglichkeit mit Hilfe des erfindungs gemäßen Verfahrens Reaktionsgemische chemischer Synthesen, ge gebenenfalls nach geeigneter Aufbereitung, wie z. B. Austausch von Lösungsmittel, Aufkonzentrieren oder Verdünnen, auf Effekt orfunktion zu untersuchen.

Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren sind insbesondere Effekto ren zellphysiologischer Wechselwirkungen zwischen Proteinen nachweisbar, die in oder zwischen eukaryotischen oder prokaryo tischen Zellen, in Viruspartikeln oder zwischen Viruspartikeln und eukaryotischen Zellen ablaufen. Bei dem Effektor dieser Wechselwirkung kann es sich prinzipiell um eine wohl charakte risierte, bekannte Substanz oder um eine bisher in der Fachwelt nicht beschriebene Substanz handeln.

Als Beispiel für einen Effektor der einen zellphysiologischen Prozeß beeinflußt, welcher in eukaryotischen Zellen abläuft, kann 2,3,7,8-Tetrachlordibenzo-p-dioxin (TCDD) genannt werden. Das zelluläre Dioxin-Rezeptor-System stellt ein typisches Bei spiel für eine Signal-kontrollierte Dimerisierung von basischen Helix-Loup-Helix (bHLH)-Faktoren dar. Der Ablauf der durch Dio xin vermittelten zellulären Signaltransduktion läßt sich fol gendermaßen zusammenfassen: Vor der Bindung eines Dioxinmole küls setzt sich das zytosolische Rezeptormolekül aus drei Un tereinheiten zusammen: dem Dioxin-bindenden Ah-Rezeptor und zwei Molekülen des 90 kDa-Hitzeschockproteins HSP90. Den HSP90- Untereinheiten kommt dabei die Funktion zu, den Ah-Rezeptor in Abwesenheit eines Liganden in einem inaktiven Zustand zu hal ten. Nach Bindung eines Dioxin-Moleküls an den Ah-Rezeptor dis soziieren die beiden HSP90-Moleküle vom Ah-Rezeptor ab, wodurch dieser aktiviert und zur Bindung an das sogenannte Arnt-Protein befähigt wird. Der so gebildete Dioxin-beladene Komplex ist dann zur Translokation aus dem Zytosol in den Zellkern befähigt. Wie die Deletionsversuche zeigten, erfolgt die Proteindiinerisierung über Wechselwirkung der beiden basischen Helix-Loup-Helix-Domänen im Ah-Rezeptor und im Arnt-Protein. Der Dioxin-beladene heterodimäre Rezeptorkomplex erkennt eine spezifische DNA-Sequenz, nämlich das sogenannte Xenobiotic Re sponsible Element (XRE). Die Bindung an das XRE führt zur In duktion einer Reihe von Zielgenen, u. a. des Gens für das Enzym Aryl Hydrocarbon Hydroxylase (AHH) das am Metabolismus polycy clischer aromatischer Kohlenwasserstoffe beteiligt ist. Die durch die Metabolisierung polychlorierten polycyclischen Aroma te, wie TCDD, ausgelösten Pathomechanismen, die z. B. zu Immun suppression oder Tumorpromotion führen können, sind noch nicht vollständig aufgeklärt.

Es bietet sich nunmehr an, ein Two-Hybrid-Testsystem des oben beschriebenen allgemeinen Typs zu etablieren, worin man als erste Hybridproteindomäne A₂ den Ah-Rezeptor oder ein Bindungs fragment davon verwendet und als zweite Hybridproteindomäne B₂ entweder HSP 90 oder das Arnt-Protein oder ein bindendes Frag ment eines der beiden Faktoren verwendet. Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen des Ah-Rezeptors, des HSP 90 sowie des Arnt-Proteins sind aus dem Stand der Technik bekannt, so daß die zur Durchführung des Tests erforderlichen Nukleinsäurese quenzen für die Herstellung der beiden Polypeptid-Hybride A₁A₂ und B₁B₂ leicht zur Verfügung gestellt werden können.

Für den Dioxinnachweis mit Hilfe der Two-Hybrid-Technik sind somit grundsätzlich zwei verschiedene Testsysteme denkbar. Im ersten Fall, das heißt bei Verwendung von HSP 90 und dem Ah- Rezeptor als Bindungspartner, wird durch die Bindung des Dio xin-Moleküls an den Ah-Rezeptor eine Protein-Protein-Wechsel wirkung aufgehoben, was zur Folge hat, daß im Two-Hybrid-Test die Expression des Reporter-Gens unterbunden wird. Im zweiten Fall, das heißt bei Verwendung von Arnt-Protein und Ah-Rezeptor als Bindungspartner, wird durch die Bindung des Dioxinmoleküls an den Ah-Rezeptor eine Protein-Protein-Wechselwirkung aufge baut, so daß im Two-Hybrid-Test die Expression eines Reporter- Gens nachgewiesen werden kann. Für die Durchführung des Dioxin nachweises bietet es sich an, auf Two-Hybrid-Testsysteme zu rückzugreifen, welche für Protein-Protein-Bindungstests bereits etabliert wurden. So wird beispielsweise unter der Handelsbe zeichnung MATCHMAKER Two-Hybrid-System von der Firma Clontech Laboratories Inc., Paolo Alto, USA, ein geeignetes Testsystem vertrieben. Auf die Angaben der Herstellerfirma, insbesondere auf das dem vertriebenen Testsystem beigefügten Versuchsproto koll wird hiermit voll inhaltlich Bezug genommen.

Die Durchführung des Dioxinnachweises unter Verwendung des MATCHMAKER-Systems läßt sich wie folgt zusammenfassen: Das System umfaßt zwei verschiedene Expressionsvektoren (pGBT9 und pGAD424), welche Gene für die DNA-Bindungsdomäne (pGBT9) bzw. für die Aktivierungsdomäne (pGAD424) des Hefe-Transkriptions faktors GAL4 tragen.

Der pGBT-Vektor wird zur Herstellung einer ersten Nukleinsäure sequenz verwendet, welche für ein Hybrid aus Gal4-DNA-Bindungs domäne und Arnt-Protein besteht. Um diesen Hybridvektor zu kon struieren wird eine PCR (Polymerase Chain Reaction) mit den spezifischen Oligonukleotiden H3 und H4 folgender Sequenz:

H3: 5′CGGGATCCCCGAAATGACATCAGATGT (SEQ ID NO:3)
H4: 5′CGGGATCCACCTGCTGGGCAGAAAAG (SEQ ID NO:4)

mit der Arnt-cDNA als Matrix durchgeführt. Die spezifischen Primer erlauben Amplifikation des Arnt-Leserasters mit BamHI- Schnittstellen an dessen 5′- und 3′-Ende. Über die BamHI- Schnittstellen erfolgt die Ligation mit dem BamHI-behandelten pGBT9-Vektor.

Der pGAD424-Expressionsvektor des Matchmaker-Systems wird ver wendet zur Herstellung einer zweiten Nucleinsäuresequenz, wel che für ein Hybrid aus GAL4-Aktivierungsdomäne und dem Ah-Re zeptor dient. Der Leseraster des Ah-Rezeptors wird ausgehend von der Ah-cDNA mit Hilfe der spezifischen Oligonukleotide H1 und H2

H1: 5′AGGTCGACACTCTGCACCTTGCTTAGGAAT (SEQ ID NO:1)
H2: 5′AGGTCGACTTATGAGCAGCGGCGCCAACAT (SEQ ID NO: 2)

durch PCR amplifiziert. Diese Oligonucleotide versehen den Le seraster des Ah-Rezeptor mit SalI-Schnittstellen. Die auf diese Weise modifizierte Ah-Sequenz kann mit dem SalI-geschnittenen pGAD424-Vektor ligiert werden.

Die beiden auf diese Weise hergestellten Hybridvektoren pGBT9- Arnt und pGAD424-Ah werden zunächst in E. coli transformiert, vermehrt und gereinigt. Zeigen die isolierten Plasmide die ge wünschten Konstrukte, werden pGBT9-Arnt und pGAD424-Ah in SFY526-Hefewirtszellen cotransformiert. Ist Dioxin im Wachs tumsmedium anwesend, so ist eine Dimerisierung der beiden ex primierten Fusionsproteine die Folge. Die Dimerisierung der beiden GAL4-Domänen in den beiden Hybrid-Proteine führt zur Aktivierung der Transkription des Reportergens β-Galactosidase, dessen Bildung in üblicher Weise mittels Farbreaktion nachge wiesen wird. Die Nachweisempfindlichkeit für 2,3,7,8-TCDD liegt pro Ansatz im unteren Femtomol- bis oberem Atomol-Bereich und somit im Bereich der Nachweisgrenze der derzeit auf dem Markt erhältlichen empfindlichsten Massenspektrometer.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird ein Nach weisverfahren für Effektoren viraler Protein-Protein-Wechsel wirkungen bereitgestellt. Dieses kann in völliger Analogie zu dem oben beschriebenen Dioxintest durchgeführt werden. Insbe sondere werden gemäß dieser Ausführungsform Wechselwirkungen zwischen den Poliovirus-Capsidproteinen VP1 und VP3 sowie zwi schen zwei p18-Capsidproteinen bzw. zwei p24-Capsidproteinen aus HIV-1 getestet. Beispiele für die Zusammensetzung in einem die erfindungsgemäßen Verfahren zum Nachweis viraler Protein- Protein-Wechselwirkungen anwendbarer Hybrid-Konstrukte A₁A₂ und B₁B₂ sind in folgender Tabelle 1 angegeben.

Tabelle 1

VP1 und VP3 können in den obengenannten Hybriden auch gegenei nander vertauscht sein.

Wie oben für den Dioxin-Test beschrieben, können die kodieren den und mit geeigneten Restriktionsschnittstellen versehenen DNA-Sequenzen für die viralen Hybridproteinkomponenten A2 und B2 hergestellt und in die oben beschriebenen Vektoren pGBT9 bzw. pGAD424 insertiert werden. Die Durchführung des Two-Hy brid-Tests zum Nachweis eines Effektors der viralen Protein- Protein-Wechselwirkung erfolgt dann in Analogie zum oben be schriebenen Dioxin-Test. Dieses Testsystem ist auch auf alle anderen Protein-Protein-Wechselwirkungen unter Beteiligung vi raler Proteine übertragbar.

Viren, welche neben dem Proteincapsid zusätzlich über einen Envelope mit Glykoproteinen verfügen, können ebenfalls als Grundlage für ein erfindungsgemäßes Verfahren verwendet werden. Die Glykoproteine des Envelopes wechselwirken bekanntlich mit den Capsidproteinen. Diese Wechselwirkung ist notwendig, um das Virus mit der Envelope-Struktur auszustatten und gleichzeitig aus der Zelle auszuschleusen. So zeigt beispielsweise der Sem liki-Forest-Virus zwei Spike-Glykoproteine E1 und E2, die, wie viele andere virale Hüll-Glykoproteine, aus drei Domänen beste hen: einer externen, einer Transmembran- und einer internen Do mäne. Die interne, C-terminale Domäne tritt in Wechselwirkung mit den Capsid-Proteinen. Ein Two-Hybrid-Test zum Nachweis von Effektoren dieser Wechselwirkung kann in der Weise etabliert werden, daß man die kodierende Sequenz für das Capsid-Protein und das Envelope-Glykoprotein, oder bevorzugt die DNA-Sequenz wechselwirkender Fragmente dieser beiden Proteine in die oben beschriebenen Vektoren insertiert und die auf den Vektoren ent haltene genetische Information in Gegenwart eines Analyten ex primiert. Ein Two-Hybrid Verfahren zum Nachweis von Effektoren der Wechselwirkung zwischen viralen Capsiden und Envelope-Pro teinen stellt somit eine weitere bevorzugte Ausführungsform dar.

Für den Fachmann wird aus obigen Ausführungen ersichtlich, daß die vorliegende Erfindung nicht auf die oben beschriebenen kon kreten Ausführungsformen und die beiliegenden Beispiele be schränkt ist. Vielmehr können unter Anwendung des erfindungs gemäßen Testprinzips weitere Testsysteme etabliert werden, wel che auf definierten Protein-Protein-Wechselwirkungen unter Be teiligung eukaryotischer, prokaryotischer, und/oder viraler Proteine beruhen. Die Erfindung ist außerdem nicht auf die Ver wendung der oben beschriebenen konkreten Vektoren und Wirtszel len beschränkt, vielmehr sind auch alle anderen vergleichbaren Testsysteme, wie z. B. die bisher in der Fachliteratur beschrie benen Expressionsvektoren und Wirtszellen anwendbar.

Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung neuer Effektoren intra- und/oder in terzellulärer Protein-Protein-Wechselwirkungen, wobei man

a) einen Analyten einem Nachweisverfahren gemäß obiger De finition unterzieht;
b) bei positivem Nachweis einer Effektorfunktion in dem Analyten diese mit herkömmlichen präparativen Methoden, gegebenenfalls durch weitere Auftrennung des Analyten, eingrenzt und den Effektor, gegebenenfalls mit Hilfe des Nachweisverfahrens gemäß obiger Definition, oder in an derer Weise, wie z. B. durch Spektroskopie, Hochdrucks flüssigkeitschromatographie, Dünnschichtchromatographie, lokalisiert und mit herkömmlichen präparativen Methoden, wie z. B. Chromatographie, isoliert.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft Nucleinsäurese quenzen, welche für Polypeptid-Hybride kodieren, die Polypep tid-Domänen gemäß obiger Definition enthalten. Bevorzugte Bei spiele für Nucleinsäuresequenzen sind die für die Polypeptid- Hybride GAL4-Bindungsdomäne/Arnt und GAL4-Aktivierungsdomäne/Ah kodierenden Sequenzen.

Gegenstand der Erfindung ist außerdem ein Analysenkit zur Durchführung eines der oben beschriebenen Nachweisverfahren. Der erfindungsgemäße Analysenkit ist dadurch gekennzeichnet, daß er in getrennten Kompartimenten

a) einen ersten Transformationsvektor, kodierend für ein Polypeptid-Hybrid A₁A₂,
b) einen zweiten Transformationsvektor, kodierend für ein Polypeptid-Hybrid B₁B₂ und gegebenenfalls
c) eine Wirtszellkultur umfaßt, die die genetische Informa tion für ein Reporter-Gen enthält, das unter der geneti schen Kontrolle einer stromaufwärts gelegenen Transkrip tions-Aktivierungssequenz steht, an welche, nach Trans formation der Wirtszelle mit dem ersten und dem zweiten Transformationsvektor der Transkriptions-Aktivator-Kom plex A₁B₁ bindet, wenn die Hybridprotein-Domänen A₂ und B₂ in Gegenwart oder in Abwesenheit eines Effektors mit einander wechselwirken.

Die vorliegende Erfindung wird nun anhand der folgenden Ausfüh rungsbeispiele, welche die Etablierung eines Dioxin-Screening- Systems betreffen, näher erläutert.

Beispiel 1 Bereitstellung eines Testsystems für den genetischen Dioxin-Nachweis 1. Herstellung der Plasmidkonstrukte pGAD424-Ah und pGBT9-Arnt 1.1 Allgemeine Vorschrift für die Durchführung der Polymerase Chain Reaction (PCR)

Es wurden folgende Primer synthetisiert:

Oligonucleotid H1: 5′AGGTCGACACTCTGCACCTTGCTTAGGAAT
Oligonucleotid H2: 5′AGGTCGACTTATGAGCAGCGGCGCCAACAT
Oligonucleotid H3: 5′CGGGATCCCCGAAATGACATCAGATGT
Oligonucleotid H4: 5′CGGGATCCACCTGCTGGGCAGAAAAG

Das PCR-Protokoll wurde in etwas veränderter Form ent sprechend den Angaben von Perkin-Elmer-Cetus (Protokoll für DNA Amplifikation) durchgeführt. Für die Amplifika tion eines DNA-Fragments mit Hilfe der PCR wurde folgen der Reaktionsansatz pipettiert:

Die Reaktion erfolgte in 100 µl Endvolumen in siliconi sierten, autoklavierten Reaktionsgefäßen. Die PCR wurde im DNA Thermocycler 1 min bei 95°C, 3 min bei 60°C und 2,5 min bei 72°C durchgeführt. Der 72°C-Schritt wurde pro Zyklus um 2 s verlängert. Insgesamt umfaßte die PCR 30 Zyklen. Die PCR wurde mit einem "Hot start" (zu Beginn 5 min 95°C) gestartet und nach 10 min bei 72°C beendet.

1.2 Synthese der Plasmidkonstrukte pGAD424-Ah und pGBT9-Arnt 1.2.1 Materialen

Die Plasmide pGAD424 und pGBT9 (Fig. 1 (A) und (B)) sind von der Firma Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA, USA erhältlich. Ah-cDNA und Arnt-cDNA können in her kömmlicher Weise aus Ah- und Arnt-Protein exprimierenden Zellen isoliert werden.

Die cDNA Klonierung sowie DNA- und Aminosäuresequenz von murinen Ah-Protein werden beispielsweise beschrieben von Ema, M. et al., in Biochem. Biophys. Res. Communications (1992), Bd. 184, 246-253, auf dessen Inhalt hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird. Das murine Ah-Protein stellt ein Polypeptid aus 805 Aminosäuren mit einem be rechneten Molekulargewicht von 90380 Dalton dar.

Die cDNA Klonierung des humanen Arnt-Proteins wird bei spielsweise beschrieben von Hoffman, E.C. et al. in Science (1991), Bd. 252, 954-958, auf dessen Inhalt hiermit ausdrücklich Bezug genommen wird. Das humane Arnt Protein umfaßt 789 Aminosäuren und besitzt ein be rechnetes Molekulargewicht von 86637 Dalton.

Da die kodierenden DNA-Sequenzen außerdem aus dem Stand der Technik bekannt sind, können die zur Durchführung der folgenden Beispiele erforderlichen DNA-Moleküle auch auf synthetischem Weg bereitgestellt werden.

1.2.2 Allgemeine Vorschrift für Restriktionsverdau und Ligation zur Herstellung der Plasmidkonstrukte

Zu ca. 2 mg DNA in bidestilliertem Wasser wurden 2 ml Restriktionsenzympuffer (10×) und 10-20 U der betreffen den Restriktionsenzyme gegeben, mit bidestilliertem Was ser auf 20 ml aufgefüllt, vorsichtig gemischt und bei 37°C 1-2 Stunden inkubiert. Die entsprechend behandelte DNA wurde auf einem 0,8% Agarose-TBE Gel aufgetrennt und mit dem QIAEX-Gel-Extraction-Kit (QIAGEN) nach An gaben des Herstellers aufgereinigt.

Die Ligation der isolierten DNA-Fragmente erfolgte in 1×Ligasepuffer in einem Volumen von maximal 20 µl mit 1 U T4-Ligase bei 16°C über Nacht. In der Regel lagen Vek tor und Insert in einem stöchiometrischen Verhältnis von 1 : 3 vor.

1.2.3 Herstellung von pGAD424-Ah

Mit Hilfe der PCR-Methode wurde unter Verwendung der spezifischen Oligonucleotide H1 und H2, ausgehend von der Ah-cDNA-Matrix, die codierende Sequenz des Ah-Rezep tors amplifiziert. Die synthetischen Oligonucleotide wurden so konstruiert, daß in das amplifizierte Ah-Frag ment am 3′- und 5′-Ende SalI Schnittstellen eingeführt wurden. Das gereinigte PCR-Ah-Fragment wurde einem SalI- Restriktionsverdau unterworfen und in den ebenfalls mit SalI geschnittenen pGAD424-Vektor ligiert (Fig. 2(B)). Die nach Transformation in den E. coli Stamm MC4lrF′ er haltenen Klone (Selektion auf Amp-Resistenz) wurden hin sichtlich ihrer Plasmide untersucht. Anhand eines EcoRI Restriktionsverdaus konnte bestimmt werden, welche Bak terienklone das gewünschte Konstrukt pGAD424-Ah enthiel ten. Der entsprechende Bakterienklon wurde vermehrt und die Plasmid-pGAD424-Ah-DNA isoliert. Für die Plasmid- Isolierung aus transformierten E.coli Zellen wurde der QIAGEN-Plasmid-Kit in Kombination mit QIAGEN-Tip-200 Säulen verwendet. Die Isolierung der Plasmid-DNA erfolg te nach den Angaben des Herstellers. Für die Plasmidis olierung wurde eine 150 ml Übernachtkultur der transfor mierten E.coli Zellen verwendet. Die Plasmidausbeute einer Isolierung lag für Plasmid pGAD424-Ah zwischen 0,5 und 1 mg/ml.

1.2.4 Herstellung von pGBT9-Arnt

Mit Hilfe der PCR-Methode wurde unter Verwendung der spezifischen Oligonucleotide H3 und H4, ausgehend von der Arnt-cDNA-Matrix (SEQ ID NO:5), die codierende Sequenz des Arnt-Rezeptors (SEQ ID NO:6) amplifiziert. Die synthetischen Oligonucleotide wurden so konstruiert, daß in das amplifizierte Arnt-Fragment am 3′- und 5′- Ende BamHI Schnittstellen eingeführt wurden. Das gerei nigte PCR-Arnt-Fragment wurden einem BamHI-Restriktions verdau unterworfen und in den ebenfalls mit BamHI geschnittenen pGBT9-Vektor ligiert (Fig. 2(A)). Die nach Transformation in den E. coli Stamm MC41rF′ erhaltenen Klone (Selektion auf Amp-Resistenz) wurden hinsichtlich ihrer Plasmide untersucht. Anhand eines EcoRI Restrik tionsverdaus konnte bestimmt werden, welche Bakterien klone das gewünschte Konstrukt pGBT9-Arnt enthielten. Der entsprechende Bakterienklon wurde vermehrt und die Plas mid-pGBT9-Arnt-DNA isoliert. Für die Plasmid-Isolierung aus transformierten E.coli Zellen wurde der QIAGEN-Plas mid-Kit in Kombination mit QIAGEN-Tip-200 Säulen verwen det. Die Isolierung der Plasmid-DNA erfolgte nach den Angaben des Herstellers. Für die Plasmidisolierung wurde eine 150 ml Übernachtkultur der transformierten E.coli Zellen verwendet. Die Plasmidausbeute einer Isolierung lag für pGBT9-Arnt zwischen 0,5 und 1 mg/ml.

1.3. Transformation der Plasmide pGAD424-Ah und pGBT9-Arnt in dem Hefestamm SFY526 1.3.1 Herstellung kompetenter Hefezellen

20 ml YPD Medium wurden mit einer Hefe-Einzelkolonie angeimpft und über Nacht bei 30°C geschüttelt. Die 20 ml Übernachtkultur sollte nach dieser Zeit die stationäre Phase erreicht haben, d. h. eine OD < 1,5 zeigen. Die Übernachtkultur wurde verwendet, um 300 ml frisches YPD Medium anzuimpfen; diese 300 ml Kultur mit einer OD₆₀₀ von 0,2-0,3 wurde 3 Stunden bei 30°C geschüttelt. Die Zellen wurden abzentrifugiert, das Pellet in 50 ml ste rilem, bidestilliertem Wasser zweimal gewaschen und in 1,5 ml frischem, sterilem 1×TE/LiAC-Puffer (unmittelbar vor Verwendung hergestellt aus 10×TE-Puffer (0,1 M Tris- HCl, 10 mM EDTA, pH 7,5) und 10×LiAC-Puffer (1 M Lithium acetat, pH 7,5)) resuspendiert. Die kompetenten Hefezel len wurden sofort für die Transformation verwendet.

1.3.2 Transformation kompetenter Hefezellen

Zu 0,1 µg Plasmid-DNA und 100 µg Carrier DNA ("herring testes carrier DNA") wurden 0,1 ml kompetente Hefezellen pipettiert sowie 0,6 ml PEG/LiAc Lösung (40% PEG 4000, 1×TE, 1× LiAC, frisch hergestellt). Der Ansatz wurde gut gemischt und bei 30°C 30 min geschüttelt. Nach der Zug abe von 70 µl DMSO folgte ein 15 min Hitzeschock bei 42°C. Die Zellen wurden anschließend auf Eis abgekühlt, abzentrifugiert und das Pellet in 0,5 ml TE-Puffer re suspendiert. 0,25 ml der transformierten Zellen wurden auf SD-Platten (-Leu, -Trp) ausplattiert und die Platten 2-4 Tage bei 30°C inkubiert, bis sich die ersten Kolo nien zeigten.

1.3.3 Cotransformationen

Zusätzlich zur Cotransformation mit den Plasmiden pGAD424-Ah und pGBT9-Arnt wurden als negative bzw. posi tive Kontrollen folgende Plasmidkombinationen ebenfalls in SFY526 transformiert.

a) pGAD424/pGBT9-Arnt
b) pGAD424-Ah/pGBT9
c) pLAM 5′/pTD1
d) pLAM 5′/pCL1

pLAM 5′ kodiert für ein Hybrid aus GAL4 Bindungsdomäne und humanem Lamin C;
pTD1 kodiert für ein Hybrid aus GAL4 Aktivatordomäne und SV40 large T-Antigen;
pCL1 kodiert für ein full-length GAL4.

Die Plasmide pLAM5′, pTD1 und pCL1 sind ebenfalls von der Fa. Clontech Laboratories Inc. erhältlich.

1.4 Dioxin-Nachweis durch Bestimmung der Interaktion des Gal4-DNA-Bindungsdomäne/Arnt-Fusionsproteins (kodiert von pGBT9-Arnt) mit dem Gal4-Transkriptions-Akti vierungsdomäne/Ah-Fusionsprotein (kodiert von pGAD424-Ah) 1.4.1 Nachweis auf Agarplatten

Die erfolgreich transformierten SFY 526 Hefen wurden auf SSX-Indikator-Platten ausgestrichen.

Die SSX-Indikator-Platten (Chien et al. 1991) weisen folgende Zusammensetzung auf:
Yeast-Nitrogen-Base: 6,7 g
Agar: 14 g
1 M NaP_i pH 7,0: 100 ml
10×Aminosäuren (-Leu-Trp): 100 ml
20% Sucrose: 100 ml
5-Brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galaktosid (X-Gal): 40 mg
H₂O bidest.: ad 1 l

Die SSX Platten enthalten die Substanz X-Gal, welche nach Interaktion der Fusionsproteine zu einem blauen Farbstoff umgesetzt wird. Während die Kontroll-Hefen (pLAM5′/pcL1) nach Wachstum (o/n) auf SSX Platten eine eindeutige Blaufärbung zeigten, war dies bei den anderen Plasmidkombinationen nicht der Fall.

Die pGAD424-Ah/pGBT9-Arnt SFY5426 Hefen ließen nach Auf legen von 2,3,7,8-Tetrachlordibenzo-p-dioxin (TCDD) ent haltenden Pads (TCDD wurde in 10% DMSO auf die Pads aufgetragen) auf die SSX-Platten eine spezifische, kon zentrationsabhängige Blaufärbung im Bereich der Kontakt flächen erkennen, nicht jedoch die Kontroll-Hefen (pGAD424/pGBT9-Arnt; pGAD424-Ah/pGBT9, pLAM 5′/pTD1). Die Nachweisgrenze für 2,3,7,8-TCDD lag im Bereich von 0,1 ng pro Pad.

1.4.2 Nachweis in Flüssigkultur

Die Effektorwirkung des Dioxinliganden auf die Interak tion von Ah- und Arnt-Protein konnte auch mit Hilfe des β-Galaktosidase-Aktivitätstests in Flüssigkultur nachge wiesen werden. Folgendes Protokoll wurde verwendet:

Der mit pGAD424-Ah und pGBT9-Arnt cotransformierte He festamm SFY526 wurde über Nacht bei 30°C in SD-Medium -Leu, -Trp kultiviert. Als Kontrolle dienten die unter 1.3.3 genannten Cotransformationen a) bis d).

Jeweils 2 ml der Übernachtkultur wurden in 8 ml YPD Flüssigmedium (20 g/l Difco Pepton, 10 g/l Hefeextrakt) pipettiert und 3-5 Stunden bei 30°C geschüttelt, bis sie eine OD₆₀₀ von 0,5-0,7 aufwies. 1,5 ml der Kultur wurden im folgenden mit verschiedenen Dioxinmengen bei 30°C 3 Stunden unter Schütteln inkubiert. Nach der Inkubations zeit wurden die Zellen abzentrifugiert in 1,5 ml Z-Puf fer (16,1 g/l Na₂HPO₄ · 7H₂O, 5,5 g/l NaH₂PO₄ · H₂O, 0,75 g/l KCl, 0,246 g/l MgSO₄ · 7H₂O, pH 7,0) gewaschen, erneut abzentrifugiert und in 0,3 ml Z-Puffer Endvolumen aufge nommen. 0,1 ml dieser Zellsuspension wurden für den β- Galaktosidase-Aktivitätstest verwendet. Die Zellsuspen sion wurde zu diesem Zweck in Trockeneis schockgefroren und sofort auf 37°C wieder aufgetaut. Zu der Zellsuspen sion wurden anschließend 0,7 ml Z-Puffer pipettiert. Die Enzymreaktion wurde durch Zugabe von 0,16 ml ONPG-Lösung (4 mg/ml o-Nitrophenyl-β-D-galactopyranosid in Z-Puffer) gestartet. Die Freisetzung von ONP ist im Bereich von 50 bis 500 fg 2,3,7,8-TCDD konzentrationsabhängig. Der Flüssigtest erwies sich als sehr sensitiv für den Nach weis des Dioxinliganden. In den Kontrollen, die ohne Dioxin inkubiert worden waren (nur mit dem Lösungsmittel 5% DMSO), war keine Aktivität des Reporterproteins β- Gal zu beobachten.

Bezüglich weiterer Details zur Durchführung des Two-Hy brid-Tests wird auf die Produktbeschreibung zum MATCHMA KER Two-Hybrid System der Firma Clontech Laboratories, Inc., Palo Alto, CA, USA verwiesen.

Beispiel 2 Screening von Bodenproben auf Dioxinkontamination

3 Bodenproben, deren Dioxingehalt bereits zuvor mittels GC/MS ermittelt worden war, wurden einem Screeningtest nach dem beschriebenen Verfahren unterworfen. Probe 1 hatte einen PCDD/PCDF-Gehalt von 25 ng I-TEQ/kg, Probe 2 von 457 ng I-TEQ/kg und Probe 3 von 1950 ng I-TEQ/kg. Jeweils 1 g der Probe wurde mit 2 ml Benzol 5 min im Ultraschallbad extrahiert. Der Extrakt wurde mit 0,5 ml konzentrierter Schwefelsäure bei 70°C 10 min behandelt. Der klare Überstand wurde in ein Probengläschen mit 100 mg K₂CO₃ transferiert, geschüttelt und in ein weiteres Probengläschen überführt. Das Lösungsmittel wurde im Stickstoffstrom entfernt und der "Rückstand" in 300 µl Hexan aufgenommen. Die Probe wurde in 3 Aliquote aufge teilt, das Lösungsmittel im Stickstoffstrom entfernt und der Rückstand in den 3 Gläschen mit 10 µl, 30 µl und 100 µl 5% DMSO in Wasser aufgenommen. 5 µl der jeweiligen Probe wurde in den oben unter 1.4.2 beschriebenen Test in Flüssigkultur eingeschleust.

Die erhaltenen Gelbfärbungen waren proportional zu den zuvor bestimmten I-TEQ-Werten. Allerdings wurde bei den beiden Proben mit der höchsten Konzentration ein Inhibi tionseffekt beobachtet. In der Praxis ist deshalb eine noch stärkere Abstufung der Konzentrationen für die ein zelnen Aliquote einer Probe erforderlich, damit man stets in einem Bereich bleibt, in dem keine Inhibition erfolgt.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

1. Nachweisverfahren für Effektoren intra- und/oder interzel lulärer Protein-Protein-Wechselwirkungen, wobei man

a) in einer Wirtszelle in Gegenwart eines Analyten, in dem man die Effektorfunktion vermutet, zwei Polypep tid-Hybride A₁A₂ und B₁B₂ exprimiert, deren Domänen A₁ und B₁ zusammen einen funktionellen Transkriptions aktivator-Komplex bilden, wenn die Domänen A₂ und B₂, welche die intra- und/oder interzelluläre Wechselwir kung imitieren, miteinander wechselwirken, wobei die Wechselwirkung zwischen den Polypeptiddomänen A₂ und B₂ nur bei Fehlen oder Vorliegen der Effektorfunktion in dem Analyten zu beobachten ist; und
b) auf Expression eines Reportergens analysiert, das unter der genetischen Kontrolle einer stromaufwärts gelegenen Transkriptions-Aktivierungssequenz steht, an welche der funktionelle Transkriptionsaktivator- Komplex bindet, wobei Expression des Reportergen-Pro dukts auf Vorliegen oder Fehlen der Effektorfunktion im Analyten hinweist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei man die Wirtszelle mit einer ersten und einer zweiten Nukleinsäure-Sequenz trans formiert, wobei die erste Nukleinsäuresequenz für das Po lypeptid-Hybrid A₁A₂ kodiert, welches die Transkriptions- Aktivierungsdomäne A₁ des Transkriptionsaktivators und die Polypeptid-Domäne A₂ umfaßt; und die zweite Nukleinsäure sequenz für das Polypeptid-Hybrid B₁B₂ kodiert, welches die DNA-Bindungsdomäne B₁ des Transkriptionsaktivators und die Polypeptid-Domäne B₂ umfaßt.

3. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Analyt ausgewählt ist unter Körperflüssigkeitsproben, umweltanalytischen Proben, Reaktionsgemischen chemischer Synthesen, Lebensmittelproben, Extrakten obiger Proben, und Extrakten oder Homogenaten prokaryotischer oder euka ryotischer menschlicher, tierischer oder pflanzlicher Zel len.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Analyt ein Gemisch von Substanzen oder eine Einzelsub stanz umfaßt, für die man die Effektorfunktion vermutet.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der Effektor zellphysiologische Wechselwirkungen eukaryo tischer oder prokaryotischer Zellen oder virale Prozesse beeinflußt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Effektor ein Schad stoff, wie insbesondere Dioxin, ist.

7. Verfahren nach Anspruch 5, wobei der Effektor den Zusam menbau von Viruspartikeln oder die Bindung von Virus partikeln an zelluläre Rezeptoren beeinflußt.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Wirtssystem ein prokaryotisches oder eukaryotisches Wirtssystem ist.

9. Verfahren nach Anspruch 8, wobei als Wirtssystem ein Hefe- Wirtsstamm, ausgewählt unter SFY526 und HF7c, verwendet wird.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei Aktivierungs-Domäne A₁ abgeleitet ist vom Transkriptions aktivator GAL4 aus Hefe oder VP16 aus Herpes Simplex vi rus.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die DNA-Bindungsdomäne B₁ abgeleitet ist vom Transkrip tionsaktivator GAL4 aus Hefe oder LexA aus E. coli.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Reportergen ausgewählt ist unter lacZ aus E. coli oder HIS3 und LEU2 aus Hefe.

13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Hybrid A₁A₂-kodierende Nukleinsäure abgeleitet ist von Plasmid pGAD424.

14. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Hybrid B₁B₂-kodierende Nukleinsäure abgeleitet ist von Plasmid pGBT9.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Polypeptid-Domäne A₂ ausgewählt ist unter dem Ah-Rezeptor oder einem funktionalen Äquivalent davon; und die Polypep tid-Domäne B₂ ausgewählt ist unter dem Arndt-Protein und HSP90 und den funktionalen Äquivalenten davon.

16. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 14, wobei die Polypeptid-Domänen A₂ und B₂ ausgewählt sind unter viralen Capsid-Proteinen und viralen Envelope-Gykoproteinen und den funktionalen Äquivalenten davon; wobei die Domänen so gewählt sind, daß sie eine intermolekulare Bindung einge hen können.

17. Verfahren nach Anspruch 16, wobei die Kombinationen von A₂ und B₂ ausgewählt ist unter folgenden Polypeptid-Kombina tionen VP1/VP3, VP3/VP1, p18/p18 und p24/p24.

18. Verfahren zur Isolierung eines Effektors intra- und/oder interzellulärer Protein-Protein-Wechselwirkungen, wobei man

a) einen Analyten einem Nachweisverfahren gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17 unterzieht;
b) bei positivem Nachweis einer Effektorfunktion in dem Analyten diese mit herkömmlichen präparativen Metho den, gegebenenfalls durch weitere Auftrennung des Analyten, eingrenzt und den Effektor gegebenenfalls mit Hilfe des Nachweisverfahrens gemäß einem der An sprüche 1 bis 17 lokalisiert und dann mit herkömmli chen präparativen Methoden isoliert.

19. Nukleinsäure-Sequenz, kodierend für ein Polypeptid-Hy brid, das Polypeptid-Domänen gemäß der Definition in einem der Ansprüche 13 und 17 umfaßt.

20. Nukleinsäure-Sequenz kodierend für ein Polypeptid-Hybrid ausgewählt unter GAL4-Bindungsdomäne/Arnt und GAL4-Akti vierungsdomäne/Ah.

21. Analysen-Kit zur Durchführung eines Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17, umfassend in getrennten Komparti menten

a) einen ersten Transformationsvektor, kodierend für eine Polypeptid-Hybrid A₁A₂,
b) einen zweiten Transformationsvektor, kodierend für eine Polypeptid-Hybrid B₁B₂, und gegebenenfalls
c) eine Wirtszelle, enthaltend die genetische Informa tion für ein Reportergen, das unter der genetischen Kontrolle einer stromaufwärts gelegenen Transkrip tions-Aktivierungssequenz steht, an welche, nach Transformation der Wirtszelle mit dem ersten und dem zweiten Transformationsvektor, der Transkriptionsak tivator-Komplex A₁B₁ bindet, wenn die Hybridprotein- Domänen A₂ und B₂ in Gegenwart oder Abwesenheit eines Effektors miteinander wechselwirken.