DE10113042B4

DE10113042B4 - HIV-Inhibitor Screening-System

Info

Publication number: DE10113042B4
Application number: DE2001113042
Authority: DE
Inventors: Michael Dr. Schreiber; Annette Seifert; Bernd Prof. Dr. Meyer
Original assignee: BERNHARD NOCHT INST fur TROPE; Bernhard-Nocht-Institut fur Tropenmedizin
Current assignee: BERNHARD NOCHT INST fur TROPE; Bernhard-Nocht-Institut fur Tropenmedizin
Priority date: 2001-03-09
Filing date: 2001-03-09
Publication date: 2006-12-21
Anticipated expiration: 2021-03-10
Also published as: DE10113042A1

Abstract

Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, die die Wechselwirkung des gp120-Proteins von HIV oder Teilen desselben mit dem Korezeptor CXCR4, CCR5 und/oder einem anderen 7-Helix-Transmembranrezeptor für HIV beeinflussen, dadurch gekennzeichnet, daß man
a) Liganden für den Korezeptor CXCR4, CCR5 und/oder einen anderen 7-Helix-Transmembranrezeptor für HIV an einer Goldoberfläche immobilisiert, man
b) suspendierte Zellen, die CXCR4, CCR5 und/oder einen anderen 7-Helix-Transmembranrezeptor für HIV exprimieren, mit diesen Liganden in Kontakt bringt, man
c) die Hemmung der Bindung von Ligand und Korezeptor durch die Substanz durch Messung des Brechungsindex mit Hilfe der Plasmonen Resonanz bestimmt,
man in einem weiteren Ansatz die Stufen a) bis c) wiederholt (Stufen a') bis c')), wobei man vor Stufe b') die Zellen mit der zu testenden Substanz vorinkubiert, bevor man sie mit den Liganden in Kontakt bringt,
wobei die verwendeten Liganden offenkettige oder cyclische Peptide oder Glycopeptide sind, die die Aminosäuresequenz eines HIV-1 V3...

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, die die Wechselwirkung des gp120-Proteins von HIV oder Teilen desselben mit dem Korezeptor CXCR4, CCR5 und/oder einem anderen 7-Helix-Transmembranrezeptor für HIV beeinflussen, sowie Verfahren zur Identifizierung von Substanzen zur Prophylaxe und/oder Therapie von HIV-Infektionen.
Im folgenden werden Methoden zur Messung einer Protein-Protein-Wechselwirkung bei der Infektion von Zellen mit HIV beschrieben, insbesondere die Wechselwirkung des gp120-Proteins (vgl. SEQ ID NO: 2, entsprechend numerische Kennzahl <400> 2 gemäß WIPO Standard ST.25) oder Teilen des gp120 mit den Korezeptoren. Die Methode kann zur Messung von Inhibitoren dieser Protein-Protein-Wechselwirkung benutzt werden. Sie dient ebenfalls zur Identifizierung neuer Substanzen, die die Protein-Protein-Wechselwirkung inhibieren können und zum diagnostischen Nachweis der Korezeptoren und von inhibitorischen Faktoren, insbesondere von Wirkstoffen zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung von HIV-Infektionen.
HIV infiziert Zellen, die CD4 und einen der Kofaktoren CXCR4 oder CCR5 tragen. Zusätzlich zu CCR5 und CXCR4 sind weitere Kofaktoren für die HIV-Infektion beschrieben worden. Alle bisher bekannten HIV Varianten nutzen CXCR4 und/oder CCR5 allein oder in Kombination. Die Benutzung anderer Kofaktoren, wie z.B. CCR3, wurde bisher nur im Zusammenhang mit der Eigenschaft beobachtet, CCR5 oder CXCR4 zu nutzen. Viren, die nur CCR3 oder CCR2 nutzen, wurden bisher nicht identifiziert.

Bei der Anlagerung des Virus an die Wirtszellen bindet das Viruspartikel mit seinem gp120-Protein am zellulären CD4-Protein. Dabei kommt es zu einer Umfaltung des gp120 und die Korezeptorinteragierenden Bereiche werden exponiert. Als Korezeptorinteragierende Bereiche wurden die variablen Loops des gp120, der V1-, V2- und der V3-Loop, identifiziert. Der V3-Loop spielt die bedeutendste Rolle bei der Wechselwirkung des gp120 mit den Korezeptoren (F. Cochi et al., Nat. Med., 2 (1996) 1244-1247). Die Aminosäuresequenz des V3-Loop hat einen entscheidenden Einfluss auf die Benutzung von CXCR4 oder CCR5.

In der asymptomatischen Phase der Erkrankung spielen die Viren mit CCR5 Nutzung (sogenannte R5-trope Viren) eine besondere Rolle. Alle HIV-Infizierten besitzen zu Beginn der Infektion Viren vom CCR5-Typ. Daraus entwickelt sich eine Schar von Virusvarianten, die sich vor allen Dingen in den variablen Bereichen des gp120 unterscheiden. Dabei werden besonders Mutationen im Bereich des V3-Loop identifiziert. Alle diese HIV-Varianten lassen sich anhand der Aminosäuresequenz im V3-Loop des gp120 (entsprechend Aminosäuren 294 bis 329 in SEQ ID NO: 2, vgl. auch 1, 2, 3 und 6) unterscheiden und -zeigen aufgrund der unterschiedlichen Sequenzen verschiedene Reaktivität mit HIV-positiven Seren oder monoklonalen neutralisierenden Antikörpern. Antikörper, die am V3-Loop binden, können die Infektion von Zellen verhindern. Daher wird der V3-Loop auch als die wichtigste Neutralisationsdomäne von HIV-1 bezeichnet.

Die Infektion von Zellen kann auch durch die natürlichen Liganden der Chemokinrezeptoren inhibiert werden. CCR5 bindet die Chemokine RANTES, Mip-1α und Mip-1β (vgl. F. Cocchi F, et al., Science 270 (1995) 1811-1815; Owais M. et al., J. Hum. Virol. 2(5) (1999) 270-82; Czaplewski L.G. et al., J. Biol. Chem. 274(23) (1999) 16077-84; Skelton N.J. et al., Biochemistry 34(16) (1995) 5329-42; Proost P. et al., Eur. Cytokine Netw. 9(3 Suppl) (1998) 73-5; Proost P. et al., Methods 10(1) (1996) 82-92). Alle drei Chemokine zeigen HIV-neutralisierende Eigenschaften. Das gleiche gilt für das Chemokin SDF-1 (vgl. Oberlin E. et al., Nature 382 (1996) 833-835; Bleul C.C. et al., Nature 382 (1996) 829-833), das den natürlichen Liganden des CXCR4 Korezeptors darstellt und CXCR4 nutzende Viren (X4-trope Viren) inhibiert.

Zusätzlich zu den vier beschriebenen Chemokinen ist das Chemokin MDC (vgl. Pal R. et al., Science 278 (1997) 695-698) in der Lage die HIV Infektion von R5-tropen und X4-tropen Viren zu verhindern.

Im Stand der Technik ist auch eine Wechselwirkung zwischen HIV und anderen 7-Helix-Transmembranrezeptoren des Menschen und/oder des Affen diskutiert worden, weshalb auch sie, neben CXCR4 und CCR5, in diesem Zusammenhang von Bedeutung sind.

Da bislang noch keine zufriedenstellenden Wirkstoffe zur Behandlung von HIV-Infektionen bzw. HIV-Erkrankungen zur Verfügung stehen, besteht die der vorliegenden Erfindung zugrundeliegende Aufgabe daher darin, ein Verfahren zu entwickeln, mit dem sich zuverlässig Substanzen (Wirkstoffe) identifizieren lassen, die die Wechselwirkung zwischen dem gp120-Protein und dem Korezeptor CXCR4, CCR5 und/oder einem anderen 7-Helix-Transmembranrezeptor für HIV beeinflussen, insbesondere beeinträchtigen bzw. hemmen, und die neue Aspekte bei der Bekämpfung von HIV oder AIDS eröffnen.

Die Aufgabe wird erfindungsgemäß durch ein Verfahren gelöst, mit dem Substanzen identifiziert werden, die die Wechselwirkung des gp120-Proteins von HIV oder Teilen desselben mit dem Korezeptor CXCR4, CCR5 und/oder einem anderen 7-Helix-Transmembranrezeptor für HIV beeinflussen, wobei man

a) Liganden für den Korezeptor CXCR4, CCR5 und/oder einen anderen 7-Helix-Transmembranrezeptor für HIV an einer Goldoberfläche immobilisiert, man
b) suspendierte Zellen, die CXCR4, CCR5 und/oder einen anderen 7-Helix-Transmembranrezeptor für HIV exprimieren, mit diesen Liganden in Kontakt bringt, man
c) die Hemmung der Bindung von Ligand und Korezeptor durch die Substanz mit Hilfe der Plasmonen Resonanz (Oberflächenplasmonenresonanz) – d.h. durch Änderung des Brechungsindexes in sogenannten Resonanzeinheiten (RU) – mißt,

man in einem weiteren Ansatz die Stufen a) bis c) wiederholt (Stufen a') bis c')), wobei man vor Stufe b') die Zellen mit der zu testenden Substanz vorinkubiert, bevor man sie mit den Liganden in Kontakt bringt, die Substanz kontinuierlich bei der Messung zuführt, oder die Substanz mit dem Liganden vorinkubiert,
wobei die verwendeten Liganden offenkettige oder cyclische Peptide oder Glycopeptide sind, die die Aminosäuresequenz eines HIV-1 V3 Loop einschließlich der flankierenden Cysteine, wie in 1-3 gezeigt, aufweisen. Weitere in Betracht kommende Sequenzen sind die V3-Loop Sequenzen der Patientenisolate aus 2, der V3-Loop Sequenzen B30 aus 4 und 5, der V3-Loop Sequenzen C4 (SEQ ID NO: 12) und C7 (SEQ ID NO: 13), die ebenfalls Bindung als GST-V3 Fusionsprotein zeigen, sowie Peptide und Glykopeptide mit der Aminosäuresequenz der V3-Loop Sequenzen A2-20, A-07, A2-15, B2-01, B2-02, B2-19, B2-11, C2-07, C2-03, C2-18, D1-01, D2-01, D2-05, D2-07, D2-14, E3-11, E2-14, F1-01, F2- 05, E1-01, F2-06 und F2-21 (Schreiber et al., J. Virol. 68 (1994) 3908), ferner die in 6 dargestellten Peptide. Darin eingeschlossen sind Sequenzvarianten der V3-Loops (einschließlich der dem Fachmann bekannten Deletions- und Insertionsmutanten) mit Aminosäure-Austauschen in der g15 Glykosylierungsstelle, insbesondere NL4-3 an Position 298-301 (NNNT ausgetauscht gegen GSTT, NQNT, NNNI, NNNK, NNNT oder NNNA). Bevorzugt werden solche V3 Loop-Sequenzen eingesetzt, die aus Viren stammen, die besonders gut an CCR5 binden, wie z.B. die V3-Sequenz des Patientenisolates PI-918 (siehe 2). Diese V3-Sequenz wurde für die Synthese der linearen, cyclischen und glycosylierten Peptide für die Messung der CCR5-Bindung im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet. Eine Sequenzvariante dieses V3-Loop (V3-B30: CTRPNNNTRKRIPIGPGRAFYTTENIIGDIRQAHC; SEQ ID NO: 14) wurde als GST-V3-Fusionsprotein für die Messung der CCR5 Bindung im FACS eingesetzt (4).

Bei dem Test von Substanzen können generell zwei verschiedene Substanzklassen getestet werden. Substanzen, die die Bindung V3-Loop-Korezeptor inhibieren, da sie an dem Korezeptor binden (z.B. Chemokine) und Substanzen die hemmen, da sie am V3-Loop binden (z.B. Antikörper).

Für die Messung der Hemmung durch Testsubstanzen, die am Korezeptor binden wie z.B. RANTES, werden die Zellen mit der Testsubstanz vorinkubiert. Der gemessene RU Wert ist dann niedriger als bei Korezeptor-haltigen Zellen allein, wenn die Testsubstanz die Korezeptor-V3-Loop Interaktion hemmt.

Gleiches gilt, wenn die Testsubstanz kontinuierlich zugegeben wird und die Konzentration der Testsubstanz über den Zeitraum der Messung konstant. Auch in diesem Fall zeigen kleinere RU-Werte eine Hemmung an.

Für die Messung der Hemmung durch Testsubstanzen die am V3-Loop binden, werden die Liganden mit der Testsubstanz vorinkubiert und diese Testsubstanz auch kontinuierlich im Laufpuffer mitgeführt.

Die Änderung des Brechungsindex durch die Testsubstanz ist der Referenzwert 1. Als Referenzwert 2 wird der Wert verwendet, bei dem die Korezeptor-haltigen Zellen über die Chipoberfläche geführt werden. Sollte sich dieser Brechungsindex bei der Messung mit Korezeptor-haltigen Zellen in Gegenwart der Testsubstanz gegenüber dem Referenzwert 2 verändern und ist auch nicht gleich dem Referenzwert 1, so hat die Testsubstanz einen hemmenden Einfluss auf die Bindung der V3-Loop an den Korezeptor. Hat die Testsubstanz einen Masseneffekt, der kleiner ist als der der Zelle bei der Bindung an den Liganden, dann wird eine Zunahme des Brechungsindexes gemessen. Ist der Masseneffekt der Testsubstanz größer als der der Zelle, so wird durch Binden bzw. durch Verdrängen der Testsubstanz eine Abnahme des Brechungsindex beobachtet.

Eine Übersicht die die Methode der Messung von Ligand-Rezeptor-Interaktionen mit Hilfe optischer Biosensoren beschreibt ist zu finden unter: Canziani G et al. 1999 Exploring biomolecular recognition using optical biosensors. Methods 19:253.

Die Oberflächenplasmonenresonanz wird vorliegend auch als Plasmonenresonanz oder Biacore-Verfahren bezeichnet. Bei Biacore handelt es sich um den Namen eines Herstellers, es gibt aber auch andere Hersteller (z.B. Iasys). Alle Geräte basieren auf der Oberflächenplasmonenresonanz, teilweise in Durchflusstechnik, teilweise stationär. Die Verwendung des Begriffes "Biacore" soll daher nicht als Einschränkung verstanden werden sondern sich vielmehr auf alle Oberflächenplasmonenresonanz-Verfahren beziehen.

Bei der Plasmonenresonanz (Biacore-Verfahren; vgl. Jonsson U. et al., Biotechniques 11 (1991) 620-7; Karlsson R. et al., J. Immunol. Methods 145 (1991) 229-40) wird polarisiertes Licht von der Rückseite auf eine Goldfolie gestrahlt, so dass Reflexion entsteht. Im Bereich der Totalreflexion entsteht eine Interaktion mit Plasmonen, die sich in der Goldfolie bilden. Diese Inter aktion ist um so intensiver, je größer die Masse auf der Vorderseite der Goldfolie ist. Die Effizienz dieser Interaktion der Plasmonen mit den Substanzen auf der Vorderseite der Goldfolie fällt exponentiell mit dem Abstand von der Goldfolie ab und ist im Bereich einer Wellenlänge des verwendeten Lichts relevant. Um nur starke Interaktionen zu beobachten, werden auf der Vorderseite nur Substanzen innerhalb einer Schicht von maximal 100 nm angeknüpft. Modifiziert man die Vorderseite der Goldfolie mit Proteinen oder mit Liganden für Proteine, ändert sich die Masse an der Vorderseite, so dass sich eine Änderung des Brechungsindexes für das Licht ergibt, mit dem die Goldfolie auf der Rückseite angestrahlt wird. Diese Änderung wird nicht als Brechungsindex gemessen, sondern in relativen Einheiten angegeben, den sogenannten Responseeinheiten. Eine Responseeinheit entspricht dabei der Änderung der Masse auf der Vorderseite der Folie von etwa 1 picogramm (pg). Bei der Verknüpfung (Konjugierung) der zu untersuchenden Substanzen ("Liganden") an der Vorderseite der Goldfolie entsteht eine Änderung der Masse innerhalb der Reichweite der Plasmonen. Dadurch ergibt sich bereits hier eine Änderung der Responseeinheiten. Da dieses Verfahren hochempfindlich ist, werden die Responseeinheiten immer relativ zu einer Vergleichszelle bestimmt, in der sich an der Goldfolie keine zu untersuchenden Substanzen (Liganden) befinden. Die Konjugierung der Liganden an die Goldfläche kann nach verschiendenen Prinzipien erfolgen, wobei man z.B. die Substanzen direkt an die Goldfolie knüpfen kann, indem man diese wiederum mit einem Rest verknüpft, der Thiolgruppen enthält, oder man kann die Substanz an die Goldfolie über eine an ihr immobilisierte Dextranmatrix verknüpfen, wobei im Regelfall eine höhere Kupplungsdichte erzielt werden kann, da sich diese Dextranmatrix einige nm bis zu 100 nm von der Goldoberfläche erstreckt. Die Vorderseite der Goldfolie und damit die Matrix und die Liganden sind z.B. in einer Flusszelle eingebettet, so dass man auf dieser Vorderseite der Goldfolie jetzt eine Lösung mit einer zweiten Substanz (d.h. einer Substanz, die daraufhin untersucht werden soll, ob sie die Wechselwirkung des gp120-Proteins von HIV oder Teilen desselben mit dem Korezeptor CXCR4, CCR5 und/oder einem anderen 7-Helix-Transmembranrezeptore für HIV beeinflußt) planieren kann, die – falls eine Wechselwirkung mit der an der festen Phase gebundenen Substanz erfolgt – wiederum die Masse in der Nähe der Goldfolie ändert und damit zu einer Änderung der Responseeinheiten führt. Wiederum ist diese Änderung massenabhängig, so dass aus dieser Information der Änderung der Responseeinheiten direkt der Bindungsvorgang analysiert werden kann. Dabei lassen sich sowohl kinetische Daten zur Bindung wie die Geschwindigkeiten von Bindung und Dissoziation als auch der Bindungskonstanten ermitteln, wenn die Konzentration der gelösten Substanz bekannt ist.

Das Plasmonenresonanz-Verfahren eignet sich zur Messung verschiedenster Kombinationen von Ligand-Rezeptor Interaktionen. Die bekanntesten Anwendungen von SPR-Messungen (Surface Plasmon Resonance) sind die Bestimmung von Bindungen zwischen Proteinen wie z.B. Antikörper-Antigen Interaktion und die Messung von Bindungskinetiken (vgl. Abraham R. et al., J. Immunol. Methods 183(1) (1995) 119-25).

Die SPR-Messung wurde im Bereich der HIV-Forschung z.B. zur Charakterisierung der Bindung zwischen dem HIV Nucleokapsid (NCp7) und der genomischen HIV RNA eingesetzt (Fisher et al., J. Virol. 72 (1998) 1902).

Soweit bei dem erfindungsgemäßen Verfahren die in Stufe c') gemessene Differenz (Testsubstanz zu Kontrolle ohne Testsubstanz, gemessen in Response Units, RUs) kleiner ist als die in Stufe c) gemessene Differenz, handelt es sich bei der eingesetzten, zu testenden Substanz um eine Substanz, die die Wechselwirkung des gp120-Proteins von HIV oder Teilen desselben mit den Korezeptoren CXCR4 und/oder CCR5 hemmt oder beeinträchtigt. Dies kann dadurch erklärt werden, daß infolge der Beeinträchtigung bzw. Hemmung der Wechselwirkung weniger (oder keine) Zellen an die auf der Goldoberfläche fixierten Liganden binden. Da der beim Biacore- Verfahren (siehe unten) gemessene Brechungsindex proportional zu der an der Oberfläche befindlichen Masse ist, weist der Vergleich der Plasmonen-Resonanz mit und ohne Testsubstanz unmittelbar auf den Einfluß dieser Substanz auf die Wechselwirkung zwischen Zellen und Liganden hin. Dementsprechend ist eine Substanz, bei der die in der Stufe c') gemessene Differenz in RUs (response units) gleich oder größer als der in Stufe c) gemessene Wert ist, als eine Substanz zu bezeichnen, die die Wechselwirkung zwischen gp120 bzw. V3-Loop und den Korezeptoren nicht beeinträchtigt oder sogar fördert.

Gemäß einer besonderen Ausführungsform kann das erfindungsgemäße Verfahren auch modifiziert werden, indem man nicht die Zellen mit den zu testenden Substanzen vor Stufe b') vorinkubiert, sondern man vor Stufe b') die an der Goldoberfläche immobilisierten Liganden mit der zu testenden Substanz in Kontakt bringt. In diesem Fall ist aber vor Stufe b') der Brechungsindex zu messen, und die Substanz hemmt oder beeinträchtigt die Wechselwirkung, wenn

i) der in Stufe c') gemessene Brechungsindex niedriger ist als der, der in Stufe c) gemessen wurde, wenn der Masseneffekt der Testsubstanz größer als der der Zellen ist oder
ii) wenn der in Stufe c') gemessene Brechungsindex höher ist als der, der in Stufe c) gemessen wurde, wenn der Masseneffekt der Testsubstanz kleiner als der der Zellen ist.

Die RU Werte und RU-Differenzen ergeben sich aus den Änderungen des Brechungsindex an der Grenzfläche von Goldfolie und Flüssigphase und sind Messwerte, die die Menge an gebundenen Liganden angeben (pg/mm²).

Selbstverständlich kann das Verfahren auch mit Erfolg angewandt werden, indem man zunächst die Stufen a') bis c') und man erst anschließend die Stufen a) bis c) durchführt, d.h. erst mit der zu testenden Substanz und erst danach ohne Substanz.

Im vorliegenden Verfahren sind die Liganden vorzugsweise an eine Dextranmatrix gebunden, die auf der Oberfläche einer Goldfolie aufgebracht ist. Gemäß einer Ausführungsform enthält die Dextranmatrix Carboxyethylgruppen, an die die Liganden gebunden sind. Üblicherweise werden etwa 20 fmol bis 300 fmol Peptid oder Glycopeptid pro mm2 immobilisiert, vorzugsweise 88 fmol pro mm².

Es hat sich als vorteilhaft erwiesen, wenn die suspendierten Zellen in einer Dichte von 36 bis 3600 Zellen/μl vorliegen. Vorzugsweise werden Zellen aus der Gruppe bestehend aus T-Zellen, Makrophagen, GHOST Hi5 Zellen, GHOST-CCR5 Zellen, GHOST-CXCR4 Zellen, U87-CCR5 Zellen, U87-CXCR4 Zellen und HOS-CD4 Zellen verwendet. Neben den aufgeführten Zellen die sowohl Korezeptoren und den HIV-Rezeptor CD4 exprimieren, können auch beliebig andere Zellen, die z.B. nur die Korezeptoren exprimieren, und daher normalerweise nicht von HIV infiziert werden können, verwendet werden, um die V3-Loop-Korezeptor Bindung für Messungen zu nutzen. Solche Zellen sind z. B. A2.01 und A2.01-CCR5 (ARP090 und ARP091, AIDS Reagents Project, Mondor et al. J. Virol. 72 (1998) 3623).

Die eingesetzten Liganden werden bevorzugt aus der Gruppe bestehend aus dem cyclischen Peptid gemäß SEQ ID NO: 9 mit einer Disulfidbrücke zwischen den terminalen Cystein-Resten, dem Glycopeptid mit der in SEQ ID NO: 9 dargestellten Aminosäuresequenz mit einer Disulfidbrücke zwischen den terminalen Cystein-Resten und einer an Asn-6 gebundenen Chitobiose, dem linearen Peptid mit dem in SEQ ID NO: 10 dargestellten Aminosäuresequenz und dem Peptid mit der in SEQ ID NO: 11 dargestellten Aminosäuresequenz ausgewählt.

Generell haben V3-Loop Sequenzen, die für die Messungen benutzt werden können, folgende Eigenschaften:

– Sie verursachen als Bestandteil des gp120 env in einem HIV-Virus die Infektion von Zellen, die CCR5 tragen.
– Die Infektion mit CCR5 Zellen ist im Vergleich zu anderen R5-tropen Viren besonders effizient.
– Die Effizienz der CCR5-spezifischen-Infektion lässt sich mit einem Infektionstest messen und wird in "foci forming units" gemessen (Polzer et al., Glycobiology 11 (2001) 11-19).

Es gibt eine Vielzahl von Glycosylierungen, die im Rahmen der vorliegenden Erfindung an dieser Stelle innerhalb der V3-Loops verwendet werden können. So sind biantennäre, triantennäre, und tetraantennäre Strukturen bekannt. Diese können z.B. mit Polylactosaminketten, und/oder Fucosen oder Sialinsäuren modifiziert sein (vgl. Holschbach C. et al., Biochem. J. 267 (1990) 759-66; Mizuochi T. et al., J. Biol. Chem. 265 (1990) 8519-24; Liedtke S. et al., Glycoconj. J. 14 (1997) 785-93). Allen gemeinsam ist die in dem Glycopeptid verwendete Struktur der Chitobiose.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung führt man vor dem genannten Verfahren eine Vorselektion der zu identifizierenden Substanzen durch, indem man mit den genannten Zellen eine Durchflußzytometrie mit einem Fusionsprotein aus einem Peptid mit der V3-Sequenz (s.o.), wie z.B. die Sequenz des V3-Loop PI-918 oder B30 (vgl. 2 und 5), oder einem Fragment desselben einschließlich der flankierenden Cysteine mit einem beliebigen, als Trägerprotein bezeichneten Protein oder Peptid (z.B. Glutathion-S-Transferase; GST) durchführt, wobei man die Bindung des Fusionsproteins an die Zellen mit einem anti-Trägerprotein-Antikörper, der mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert ist, nachweist, wobei man die Durchflußzytometrie

a) in Gegenwart und
b) in Abwesenheit

der zu testenden Substanz durchführt, wobei die Verringerung der Intensität des Fluoreszenzsignals in Messung b) gegenüber Messung a) auf eine Hemmung der Bindung zwischen dem Fusionsprotein und den Zellen hinweist. Die Markierung ist beispielsweise ein über Biotin gekoppelter Avidin-Phycoerythrin-Komplex (Avidin-PE-Komplex).

Die FRCS Vorselektion ist am Beispiel von GST-V3 mit B30 Sequenz in 4 exemplarisch gezeigt.

Die genannte Vorselektion kann auch als eigenständiges Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, die Wechselwirkung des gp120-Proteins von HIV oder Teilen desselben mit den Korezeptoren CXCR4 und/oder CCR5 beeinflussen, verwendet werden.

Generell zeigen die V3-Loop-Sequenzen von R5-tropen Viren eine geringe Anzahl von positiv geladenen Aminosäuren wie Lysin und Arginin. Die Ladung des V3-Loops R5-troper Viren liegt im Bereich von +1 bis +4, wohingegen die X4-tropen Viren V3-Loop-Sequenzen mit einer positiven Ladung zwischen +4 und +7 besitzen. Die Ladung des V3-Loops sowie die Position definierter Aminosäuren im V3-Loop bestimmen, welcher der beiden Korezeptoren genutzt werden kann. Im Verlauf der HIV-Infektion mutiert das Virus und entwickelt die Fähigkeit beide Korezeptoren zu nutzen. Man spricht dann von dualtropen R5X4 Viren, im Unterschied zu den monotropen X4 bzw. R5 Viren.

Bei der Analyse von Virusvarianten hat sich gezeigt, dass zusätzlich zu den Veränderungen im V3-Loop auch die Sequenzbereiche mutiert werden, welche für die Glycosylierung des gp120 verantwortlich sind. Die Erkennungssequenzen für die Glycosylierung der Aminosäure Asparagin sind NXT oder NXS. Wird entweder die erste oder dritte Aminosäure in dieser Sequenz verändert, so ist eine Glycosylierung an dieser Stelle innerhalb des Proteins nicht möglich. Insgesamt befinden sich im gp120 ca. 24 solcher Erkennungsstellen für die N-Glycosylierung. Von den 24 möglichen Glycosylierungsstellen befinden sich 5 in der V3-Region des gp120.

Die Zuckerstrukturen im V3-Bereich spielen eine wichtige Rolle für den Schutz des Virus vor neutralisierenden Antikörpern. Die Anwesenheit des Zuckers g15 an der Position NNT (..CTRPNNNTRK..) im V3-Loop verhindert das Binden neutralisierender Antikörper. In Laboruntersuchungen wurde gezeigt, dass sich Viren mit einer mutierten Glycosylierungsstelle NNT>QNT (g15 fehlt) besser neutralisieren lassen als die Viren, die den g15-Zucker tragen. Auch in Affenversuchen wurde die Bedeutung des g15-Zuckers für den Schutz des HIV vor der humoralen Immunantwort gezeigt. Affen entwickelten eine neutralisierende Immunantwort gegen ein Virus mit fehlendem g15 Zucker. Das Virus wurde neutralisiert und die nachweisbare Virusmenge war gering. Nach 3 Monaten wurde aber ein Anstieg der Virusmenge im Affen beobachtet. Das Virus, das diesen Anstieg verursachte, war mit dem Affenserum nicht mehr neutralisierbar und besaß eine N-Glycosylierungsstelle für g15. Durch diese Rückmutation und den dadurch wieder vorhandenen g15-Zucker war das Virus vor der Immunabwehr des Affen geschützt und konnte sich in vivo vermehren. Diese Experimente zeigen, wie wichtig der g15 Zucker für die Abwehr neutralisierender Antikörper ist. Generell kann gesagt werden, dass sich das Virus mit Zuckerstrukturen tarnt, die identisch mit Zuckern sind, die sich auf allen anderen humanen Proteinen und Lipiden befinden und daher vom Immunsystem toleriert werden. Dieser Schutzmantel aus Zuckerstrukturen gehört zur Verteidigungsstrategie des HIV im Schutz gegen das menschliche Immunsystem, das diese Tarnung nur schwer erkennen kann.

Die Maskierung des gp120 zum Schutz vor neutralisierenden Antikörpern beeinflusst aber auch die Wechselwirkung mit den Korezeptoren. Bei X4-tropen Viren beobachtet man Virusvarianten, die alle fünf V3-Glycosylierungsstellen besitzen. Es finden sich aber auch Varianten der X4-tropen Viren, denen bis zu vier dieser N-Glycosylierungsstellen fehlen. Vergleicht man die Replikation dieser Viren, so finden sich Unterschiede in der Effizienz der viralen Replikation. Viren mit einem vollständig glycosylierten V3-Loop wachsen langsamer als die Viren, denen der Zucker g15 fehlt. Besonders effizient ist die virale Replikation in Abwesenheit der Zucker g15 und g17, sowie der Kombination aus g15/g13 und g17 oder g14 und g15. Alle diese Varianten besitzen einen V3-Loop der nicht durch Zuckerstrukturen maskiert ist. Bei CXCR4-spezifischer Infektion scheint daher der Zucker die Infektion zu behindern.

Bei der CCR5-spezifischen Infektion wurde das Gegenteil beobachtet. Untersuchung an einem R5X4-dualtropen Virus (im folgenden PI-952 genannt) zeigten, dass die Nutzung des CCR5-Korezeptors durch den g15-Zucker moduliert wird. War der g15-Zucker im V3-Loop des PI-952 Virus vorhanden, so konnte das Virus Zellen mit CCR5 und Zellen mit CXCR4 infizieren. Wurde die Glycosylierungsstelle für g15 mutiert und dadurch die Glycosylierung im V3-Loop verhindert, so konnte das Virus nur noch den CXCR4-Korezeptor nutzen. Die Eigenschaft CCR5 zu nutzen ging verloren. Diese Experimente zeigen, dass bei dem V3 Loop des dualtropen Patientenisolates PI-952 die Eigenschaft, den CCR5 Korezeptor zu nutzen, von der Anwesenheit des g15 Zuckers abhängt. Bei dem PI-952 Virus ist der Zucker g15 an der Bindung des V3-Loop mit CCR5 beteiligt.

Allgemein wird davon ausgegangen, dass die Zuckerstrukturen am V3-Loop das Binden von neutralisierenden Antikörpern verhindern. Durch Maskieren des gp120 wird auch der V3-Loop maskiert. Dadurch wird die Bindung an CXCR4 behindert, aber bei der Bindung des V3 Loop an CCR5 wird der Zucker toleriert. Wie in 8 und 9 gezeigt, kann der Zucker sogar die Bindung des V3 Loop an CCR5 verstärken.

Viren, die CCR5 als Kofaktor benutzen, werden bevorzugt zu Beginn der HIV-Infektion nachgewiesen. Diese Viren dominieren die asymptomatische Phase der HIV-Infektion. Durch die Immunantwort der Patienten wird die Replikation der R5-tropen Viren gemindert. In der asymptomatischen Phase finden sich daher geringe Virusmengen. Zusätzlich wird unter dem Einfluss der antiviralen Therapie eine Reduktion der Viruslast bis unter die technische Nachweisgrenze beobachtet. Wird die medikamentöse Behandlung in dieser Phase abgesetzt kommt es zu einem Anstieg der Viruslast im Verlauf von 2-3 Wochen. Eine sehr geringe Virusvermehrung ist offensichtlich auch unter Therapie nicht zu verhindern.

Die Blockade der Korezeptoren mit Chemokinen oder Chemokinanalogen Stoffen ist im Laborversuch erfolgreich. R5-trope Viren lassen sich mit RANTES, Mip-1α oder Mip-1β neutralisieren. HIV-Patientenisolate entwickeln aber Resistenzen gegen diese natürlich vorkommenden Hemmstoffe. Die Viren lasen sich nicht mehr oder nur mit sehr hohen Dosen neutralisieren. Resistenzen sind ebenfalls gegen die Inhibition mit einem CXCR4 Liganden, dem Chemokin SDF-1, beobachtet worden.

Die Erfindung stellt u.a. ein Verfahren zur Messung der Bindung des HIV-1 V3-Loop (ein Bereich von gp120) und seiner Sequenzvarianten an die HIV-1 Korezeptoren zur Verfügung. Dieses Verfahren kann benutzt werden für:

(i) die Messung der Bindungseigenschaften zwischen V3-Loop und Korezeptor
(ii) die Suche nach neuen Korezeptor-Liganden
(iii) die Suche nach neuen HIV-Hemmstoffen
(iv) die Bestimmung der Korezeptor Konzentration in Lösung und auf Zellen
(v) die Messung von Hemmstoffen in z.B. Patientenseren
(vi) die Messung von V3-Loop-spezifischen Antikörpern.

Erfindungsgemäß kann das oben genannte Identifizierungsverfahren (entweder mit oder ohne Vorselektion) zur Identifizierung von Substanzen zur Prophylaxe und/oder Therapie von HIV-Infektionen verwendet werden.

Es versteht sich von selbst, daß man das Verfahren weiter abwandeln bzw. optimieren kann, wenn man anstelle der oben beschriebenen Liganden andere (z.B. nicht-peptidische) Liganden einsetzt, die erst infolge der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens gefunden wurden und die sich als besonders effektive Inhibitoren der Wechselwirkung mit den Korezeptoren erwiesen haben.

Gegenstand der Erfindung ist ferner ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneimittels zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung von HIV-Infektionen, dadurch gekennzeichnet, daß man das oben genannte Identifizierungsverfahren (mit oder ohne Vorselektion) durchführt und man die Substanzen, die die Wechselwirkung beeinträchtigen/hemmen mit pharmazeutisch annehmbaren Hilfs- und/oder Trägerstoffen formuliert.

Die Erfindung betrifft ferner Peptide und Glykopeptide mit der Aminosäuresequenz der V3-Loop Sequenzen der Patientenisolate aus 2, der V3-Loop Sequenzen B30 aus 4 und 5, der V3-Loop Sequenzen C4 (SEQ ID NO: 12) und C7 (SEQ ID NO: 13), die ebenfalls Bindung als GST-V3 Fusionsprotein zeigen, sowie Peptide und Glykopeptide mit der Aminosäuresequenz der V3-Loop Sequenzen A2-20, A-07, A2-15, B2-01, B2-02, B2-19, B2-11, C2-07, C2-03, C2-18, D1-01, D2-01, D2-05, D2-07, D2-14, E3-11, E2-14, F1-01, F2-05, E1-01, F2-06 und F2-21 (Schreiber et al., J. Virol. 68 (1994) 3908), ferner die in 7 dargestellten Peptide. Darin eingeschlossen sind Sequenzvarianten der V3-Loops mit Aminosäure-Austauschen in der g15 Glykosylierungsstelle, insbesondere NL4-3 an Position 298-301 (NNNT ausgetauscht gegen GSTT, NQNT, NNNI, NNNK, NNNT oder NNNA). Die Glycosylierungsstelle g15 im V3 Loop (Aminosäuren 299-301) kann die Sequenz NXT oder NXS sein, wobei X jede beliebige Aminosäure sein kann. An diese Glykosylierungsstelle können verschiedene Zuckerstrukturen chemisch angeheftet werden. Bei der Expression der V3-Loops bzw. V3-Loop Fusionsproteine in humanen Zellen werden alle natürlich vorkommenden Zuckerstrukturen, wie sie in den entsprechenden Zellen vorhanden sind, angeheftet. Eine Übersicht über die möglichen Zuckerstrukturen, die in humanen Zellen an das HIV gp120 und den V3-Loop angeheftet werden, findet sich in T. Mizuochi et al., J. Biol. Chem. 265(15) (1990) 8519-24.

Im Rahmen der Erfindung werden erstmals Kits zur Durchführung des Identifizierungsverfahrens bereitgestellt, die

– lineare V3-Loop Peptide, beispielsweise mit der Sequenz des PI-918 oder B30 V3 Loop, und/oder
– cyclische Peptide dieser V3-Loops mit und/oder ohne Glycosylierung an der Aminosäure Asparagin, Position 299 (bezogen auf HIV NL4-3 gp120 Sequenz)

enthalten.

Ein Kit zur Durchführung eines Identifizierungsverfahrens, bei dem das genannte Vorselektionsverfahren durchgeführt wird enthält vorzugsweise ferner

– Loop Fusionsproteine mit entsprechender V3 Loop Sequenz,
– Inhibitoren als Kontrolle (wie z.B. RANTES), und/oder
– Antiseren gegen gp120 (insbesondere monoklonale Antikörper gegen den V3 Loop).

Die Abk. "M", "mM" und "μM" stehen im Folgenden für die Einheiten mol/l, mmol/l bzw. μmol/l.

Herstellung von V3-Loop Peptiden
Herstellung von V3-Loop Fusionsproteinen
Der V3-Loop des HIV env Gens wird mit Hilfe der PCR oder mit Hilfe chemisch synthetiserter DNA (DNA Oligonukleotide) gewonnen. Der Bereich des gp120 der die fünf Glycosylierungsstellen g13-g17 beinhaltet (1) wird dabei berücksichtigt. Bevorzugt wird der V3-Loop, der Bereich von Cystein bis Cystein, kloniert. Die Klonierung erfolgt in Vektoren die den V3-Loop als Bestandteil eines bakteriellen (z.B. β-Galaktosidase) oder nicht-bakteriellen (z.B. Glutathion-S-Transferase aus S. japonicum, GST) Proteins exprimieren. Prinzipiell kann im Rahmen der vorliegenden Erfindung jedes beliebige Fusionsprotein verwendet werden, solange die exprimierte V3-Loop-Sequenz zwei terminale Cystein-Reste enthält. Bevorzugt wird die Klonierung des V3-Loop als Bestandteil eines GST-Fusionsproteins. Dabei entsteht ein GST-V3 Fusionsprotein, welches den HIV-1 V3-Loop als C-terminales Ende trägt. Die Klonierung erfolgt in Plasmide, wie z.B. den Vektor pGEX-3x oder Varianten dieses Vektors (Pharmacia Amersham) für die Expression des unglycosylierten GST-V3 Fusionsproteins in E.coli. Die Klonierung kann auch in anderen GST Expressionsvektoren für die Expression in Hefe, Baculoviren oder eukaryotischen bzw. humanen Zelllinien erfolgen. Mit synthetischen Primern (Übersicht der verwendeten Primer findet sich in: Oram J.D. et al., AIDS Res. Hum. Retroviruses 7 (1991) 605-14) lassen sich die V3-Loop Bereiche aus infizierten Zellen, Patientenmaterial (Serum, Liquor, PBMC, FDC, Dendritischen Zellen) amplifizieren. Nach Sequenzanalyse kann mit V3-Loop sequenzspezifischen Primern der V3-Loop amplifiziert werden, wobei die Primer an ihrem 5'-Ende Sequenzen für die Restriktionsenzyme BamHI und EcoRI tragen. Dabei ist auf die Beibehaltung des Leserasters zu achten. Das Leseraster für die Klonierung in die BamHI und EcoRI Schnittstellen ist exemplarisch für den Vektor pGEX-3x in 5 gezeigt. Durch Klonierung der V3-Loop kodierenden DNA in die BamHI und EcoRI Schnittstellen des pGEX-3x Vektors kann der V3-Loop als Fusion mit GST in E. coli exprimiert werden und als Fusionsprotein isoliert werden. Dabei wird der V3-Loop in der nicht-glycosylierten Form gewonnen.
Die Herstellung glycosylierter Fusionsproteine erfolgt in Vektoren wie z.B. Baculo-GEX (Davies et al., 1993). Das Klonierungsverfahren der V3-Loop DNA. Fragmente in Baculo-GEX ist vergleichbar mit der Klonierung in die E. coli Vektoren. Die Expression der GST-V3 Fusionsproteine erfolgt dabei in Schmetterlings-Zellen. Dies führt zur Glycosylierung und damit zur Herstellung von GST-V3 Fusionsproteinen die einen glycosylierten V3-Loop besitzen.
Ähnliche Verfahren stehen auch für die Expression in humane Zelllinien zur Verfügung. Auf diese Weise lassen sich mit entsprechenden Vektoren glycosylierte Proteine erhalten. Dabei kann der V3-Loop als Fusionsprotein aber auch als His-Tag Fusion exprimiert und aus den Zellen gereinigt werden. Für His-Tag Fusionen wird die Metallchelatchromatographie (komplexierte, immobilisierte Nickel-Ionen) verwendet.
Die Isolierung, chromatographische Reinigung der GST-V3 Fusionsproteine erfolgt nach dem Prinzip der Affinitätschromatographie. Als Affinitätsmatrix dient Glutathione Agarose oder Glutathione immobilisiert an einer indifferenten Matrix. GST-V3 Fusionsproteine binden an immobilisiertem Glutathion und können so von anderen Zellbestandteilen abgetrennt werden. Durch Zugabe löslichen Glutathions wird das Fusionsprotein von der Matrix gelöst und kann so in reiner Form isoliert werden.
Korezeptoren für HIV
Es werden die bisher bekannten HIV-Korezeptoren, bevorzugt aber die beiden wichtigsten Korezeptoren: CCR5 und CXCR4, für Messungen der V3-Loop-Korezeptor-Bindung verwendet. CXCR4 wird auf T-Zellen, CCR5 wird auf Makrophagen und T-Zellen gefunden. Gentechnisch hergestellte Zellen die Korezeptoren wie CCR5 und CXCR4 exprimieren werden bevorzugt eingesetzt, da sich auf diesen Zellen höhere Mengen der entsprechenden Korezeptoren nachweisen lassen. Auf GHOST Hi5 Zellen (AIDS Reagent #ARP074.086) finden sich mehr CCR5 Korezeptoren als auf GHOST-CCR5 Zellen (ARP074.078). Die GHOST Zellen (ARP074.082) tragen kein CCR5. Auf GHOST-CXCR4 Zellen befindet sich ca. 10-20 mal mehr Korezeptor als auf GHOST Zellen. Weitere Korezeptor exprimierende Zelllinien sind z.B. U87-CCR5 und U87-CXCR4 (ARP069. 073 und 069.072) sowie das HOS-CD4 Zellsystem (ARP-065.1-6). GHOST Indikator Zellen (ARP, AIDS Reagent Project EVA) sind erhältlich von der Centralised Facility for AIDS Reagents, National Institute for Biological Standards and Controls, Blanche lane, South Mimms, Potters Bar, Hertfordshire, EN6 3QG, UK (vgl. auch Cecilia D. et al., J. Virol. 72(9) (1998) 6988-96; Deng H. et al., Nature 381(6584) (1996) 661-6).
Da es sich bei den Korezeptoren um Membranproteine (7-Transmembranproteine) handelt ist die Isolierung der Korezeptoren schwierig und nur als Bestandteil der Zellmembran liegen diese Proteine aktiv und korrekt gefaltet vor. Die Messung der Bindung erfolgt daher direkt mit den Korezeptoren die Bestandteil von Zellmembranen sind. Daher werden Korezeptoren in der Membran von lebenden, inaktivierten oder fixierten Zellen bevorzugt für die Messungen eingesetzt. Korezeptoren können ebenfalls in Membranfragmenten, Membranvesikeln oder in virusähnlichen-Partikeln vorliegen sowie in partiell- oder hochgereinigter Form mit und ohne Membran-, Lipid- oder Glycolipidestandteilen. Das gleiche gilt für Varianten der Korezeptoren die sich in ihrer Aminsäuresequenz im allgemeinen, in der Aminosäuresequenz anhand anderer Korezeptor-Sequenzen (Maus-Mensch Chimären) oder der Glycosylierung (N- oder O-Glycosylierung) unterscheiden und natürliche oder künstliche Sequenzvarianten oder Chimären der Korezeptoren darstellen. Die Korezeptoren können sich auch in der Anzahl und der Position der Erkennungsstellen für die N-Glycosylierung unterscheiden.
Messung der Bindung des V3 loop an Korezeptoren im FACS
Die Methode der Durchflusszytometrie, auch bezeichnet als "fluorescence activated cell sorting" (FACS), erlaubt die Messung von Protein-Protein Bindungen. Dabei werden normalerweise spezifische Antikörper eingesetzt die an einem zellulären Membranprotein binden. Die Markierung dieser Antikörper mit einem Fluoreszenzfarbstoff lässt die Zellen nach Anregung im z.B. UV-Bereich leuchten. Die Intensität der Leuchtreaktion der einzelnen Zelle wird im FACS gemessen. Die Intensität der Färbung stellt einen Wert für die Stärke der Bindung und die Anzahl vorhandener Membranproteine dar.
Anstelle von Antikörpern zur Korezeptor-spezifischen Färbung von Zellen haben wir den V3-Loop, einen Teil des HIV-1 gp120 verwendet. Der V3-Loop wurde als Fusionsprotein mit GST hergestellt. An Korezeptor gebundenes Fusionsprotein wird z.B. mit einem anti-GST-biotinyliertem-Antikörper und Avidin-PE markiert. Der Nachweis gebundenen Fusionsproteins kann auf verschiedene Weise erfolgen. Das V3-Loop-GST Fusionsprotein kann direkt mit einem Fluoreszenzfarbstoff wie z.B. FITC oder PE markiert oder direkt mit Biotin markiert werden. GHOST-Hi5 Zellen werden in physiologischer Kochsalzlösung (z.B. PBS) gewaschen und es werden 10⁵ Zellen in 50μl PBS mit dem GST-V3 Fusionsprotein (0,1μg/μl) inkubiert (1h, 4°C). Die Detektion erfogt mit einem anti-GST-Antikörper der mit Biotin gekoppelt ist. An Biotin wird dann ein Avidin-PE Komplex gebunden der bei 575 nm fluoresziert. Die Anregung des PE erfolgt bei 488 nm. Eine gesteigerte Intensität des Fluoreszenzsignales einer Zelle zeigt die Bindung des V3-Loop Fusionsproteins an die Zelle. GHOST Zellen ohne Korezeptoren dienen zur Kontrolle der Messung.
Inhibition der Bindung durch Antikörper
Die Bindung des V3-Loop an den Korezeptor kann durch Antikörper oder Stoffe die am V3-Loop binden, blockiert werden. Die anti-V3-Loop gerichtetet Inhibitoren können Peptide, Proteine, Lectine, Zucker oder andere synthetische/natürliche chemische Verbindungen darstellen. Prinzipiell kann in diesem Test jede beliebige Verbindung auf eine Hemmung der V3-Loop-Korezeptor Bindung getestet werden. Bevorzugt sollen neutralisierende Antikörper untersucht und getestet werden. Solche Antikörper können sein: Seren von Patienten, Seren von Immunisierten Menschen, Seren aus Impfstoffexperimenten mit Tieren, monoklonale Antikörper, rekombinante Antikörper und Teile von Antikörpern.
Das V3-Loop GST Fusionsprotein wird zuerst mit dem zu testenden Inhibitor inkubiert und dann für die Färbung der Korezeptor tragenden Zellen verwendet.
Inhibition der Bindung durch Chemokine oder Liganden der Korezeptoren
Im Unterschied zu antiviralen Substanzen, die gegen den V3-Loop gerichtet sind und am V3-Loop binden, lassen sich auch Substanzen testen die an den Korezeptoren binden. Bekannt ist, dass die natürlichen Liganden der Korezeptoren wie z.B. RANTES die Infektion mit R5-tropen HIV-1 Viren verhindern kann. Viren können aber gegen RANTES und andere natürliche und synthetische Chemokine resistent werden. Entweder müssen sehr hohe Dosen der Chemokine verwendet werden oder die Chemokine zeigen keinerlei Wirkung mehr. Daher ist die Suche nach Korezeptor Hemmstoffen sinnvoll. Zu untersuchende Substanzen werden zuerst mit den Korezeptor tragenden Zellen inkubiert und anschliessend wird die Färbereaktion mit dem GST-V3 Fusionsprotein durchgeführt. Die Messung erfolgt im FACS oder dem im folgenden beschriebenen Biacore-Test.
Biacore-Test
Es wurde gezeigt, dass die hypervariable Schleife (Loop) V3 des GP120 direkt einen wesentlichen Teil der Bindung trägt. Hierfür wurde ein neues Verfahren entwickelt, mit dem es gelingt, die Plasmonen-Resonanz (vgl. K. Nagata und H. Handa, Real time analysis of Biomolecular Interactions. Applications of Biacore. Springer Verlag, Tokyo, 2000; Jonsson U. et al., Biotechniques 11 (1991) 620-7; Karlsson R. et al., J. Immunol. Methods 145 (1991) 229-40) für die Analyse von Rezeptoren einzusetzen, die sich in den Membranen von Zellen lokalisiert sind. Hierbei werden suspendierte Zellen benutzt, die in einer Messzelle über immobilisierte Liganden geströmt werden. Die Liganden sind typischerweise an eine Dextranmatrix konjugiert, die wiederum auf die Oberfläche einer Goldfolie aufgebracht ist. In jedem Fall muss die zu testende Substanz direkt oder indirekt an die Goldoberfläche verknüpft sein. Für die Analyse der Bindung wird die sogenannte Plasmonen-Resonanz eingesetzt, bei der die Änderung des Brechungsindex proportional zur Änderung der Masse auf der Goldfolie ist. Diese Änderung kann typischerweise in einer Strömungszelle (K. Nagata und H. Handa, loc. cit.; Jonsson U. et al., loc. cit.; Karlsson R. et al., loc. cit.) gemessen werden, ist aber auch mit einem stationären System (Savelkoul H. F. J. und Pathak S. S.: The IAsys Biosensor for Affinity Measurements of Antibodies in Immune Response; Fusion 7 (1994) 10-11) bestimmbar. Da die Plasmonen in etwa 100 nm in die Lösung hineinreichen, sind Massenänderungen nur in diesem Bereich für die Änderung des Brechungsindexes bedeutsam. Daher ist bei ganzen Zellen nur ein kleiner Teil der Zelle bei einer Bindung an die Oberfläche aktiv, da typische Zelldurchmesser sich im Bereich einiger Mikrometer bewegen. Die Änderung des Brechungsindexes ist zusätzlich abhängig von der Änderung der Dichte des Mediums, das an die Oberfläche gebunden wird. Daher ist bei der Bindung von Zellen an die Goldoberfläche keine grosse Änderung des Brechungsindexes zu erwarten. Der Brechungsindex wird beim Biacoregerät zwischen 1.33 bis 1.4 gemessen, wird allerdings nicht als Brechungsindex ausgegeben sondern als sogenannte Resonanzeinheiten (Response Units, RU), wobei eine Resonanzeinheit in etwa der Massenänderung auf dem Chip von 1 pg entspricht.
Für die Infektion humaner Zellen mit dem HIV sind zwei Interaktionen des viralen Proteins GP120 notwendig, Zuerst bindet das virale GP120 an das humane CD4. Dieses führt laut konventioneller Interpretation zu einer Änderung der Konformation des GP120 und befähigt dieses damit an den zweiten Rezeptor, einen sogenannten Korezeptor zu binden, um dann in die Zelle einzudringen. Die Interaktion zwischen dem CD4 und dem GP120 konnte zum Teil durch eine Röntgenstruktur eines ternären Komplexes bestehend aus einem Teil des CD4 einem Teil eines Antikörpers und einem Teil des GP120 aufgeklärt werden. Sowohl für das CD4 als auch für das GP120 sind molekularbiologische Konstrukte in der Röntgenstruktur benutzt worden, die nur etwa jeweils die Hälfte der jeweiligen Moleküle repräsentieren. Hierbei zeigte sich, dass die Kontakte zwischen den beiden Proteinen durch diskontinuierliche Epitope gebildet werden.
Cyclische und offenkettige V3-Peptide und V3-Glycopeptide
Es wurden Peptide und Glycopeptide nach beschriebenen Verfahren synthetisiert, die dem V3 Loop des Glycoproteins GP120 des HIV entsprechen (7). Hierbei wurden die V3 Loops als Peptid bestehend aus 35 Aminosäuren als lineares Molekül und als cyclisiertes Molekül hergestellt, wobei der Ringschluss über eine Disulfidbrücke realisiert wurde. In dem linearen Peptid wurden die Cysteine durch Threonine ersetzt. Zusätzlich wurde eine Disulfid-cyclisierte V3 Loop mit einem Kohlenhydrat am Asparagin 6 hergestellt. Als Kohlenhydrat wurde ein allen natürlich glycosylierten Proteinen gemeinsames Fragment, die Chitobiose, eingesetzt. Zusätzlich wurde als Kontrolle ein Peptid aus dem Fibrinogen hergestellt, das keine Bindungsaffinität an den Korezeptor haben sollte.
Die Peptide wurden auf der Membran eines Biacorechips F1 fixiert, der mit einer kurzkettigen Dextranmatrix (weniger als 100 nm) belegt ist, die wiederum mit Carboxyethylgruppen derivatisiert ist. Hieran werden in je einer Messzelle die Peptide und das Glycopeptid sowie als weitere Kontrolle das GP120 mit einem Standardprotokoll (Savelkoul H.F.J. und Pathak S.S., loc. cit.) mittels Ethyl-dimethylaminopropylcarbodiimid Ligation geknüpft. Es wurden zwischen 20 fmol und 300 fmol pro mm² Peptid oder Protein an die Matrix geknüpft. Es wurden Belegungsdichten zwischen 20 bis 300 fmol pro mm² benutzt. Es zeigte sich, dass bei hohen Belegungsdichten leicht Verstopfungen der Kapillaren des Messgeräts die Messungen uninterpretierbar machen. Daher wurde als Standardmenge 88 fmol zur Belegung der Dextranmatrix verwendet. Über diese so derivatisierten Oberflächen, die die Peptide respektive das Glycopeptid oder das Protein enthalten, werden Zellen in einer Suspension geströmt. Bei HI5 Zellen, die den Korezeptor exprimieren und in der Membran verankert haben, findet man eine Änderung des Brechungsindexes des Systems ausgedrückt durch die so genannten Response Units (RU). Die Höhe dieses Messparameters ist ein Mass für die Menge gebundener Zellen. Wenn man verschiedene Zelldichten über die Membran strömen lässt, erhält man eine konzentrationsabhängige Zunahme an RUs (8). Es zeigt sich, dass hier eine sättigbare Bindung vorliegt. Verwendet wurden Zelldichten von 36, 360, 1800 und 3600 Zellen/μL. Höhere Zellkonzentrationen sind auf dem verwendeten System nicht anzuwenden, da schon bei 5400 Zellen/μL die Messzellen verstopfen.
Es zeigt sich hier, dass die Bindung des Glycopeptids an die CCR5 exprimierenden Zellen etwa 34% stärker ist als die Bindung des unglycosylierten Referenzpeptids. Die Bindung des cyclischen Peptids ist ungefähr 2.8 mal stärker als die Bindung des offenkettigen V3-Peptids. Das Fibrinogenpeptid zeigt als negative Kontrolle nur etwa 10% der Bindungsstärke des Glycopeptids. Als positive Kontrolle wurde zusätzlich das Glycoprotein GP120 verwendet, mit dem eine Bindungsstärke erreicht wurde, die zwischen der des offenkettigen V3-Peptids und des cyclischen Peptids liegt. Die relativ geringe Bindung des GP120 an die Zellen basiert vermutlich auf dem bekannten Fakt, dass zur Bindung des GP120 an den Korezeptor zusätzlich das CD4 vonnöten ist. Allerdings liefert auch die Zugabe von CD4 keine nennenswerte Verbesserung der Bindung an die CCR5 exprimierenden Zellen. Dies beruht auf der schlechten Zugänglichkeit der Bindungsepitope am immobilisierten GP120, das durch die Immobilisierung an der Oberfläche in statistischen Orientierungen vorliegt, so dass die grossen Zellen von etwa 20 μm Durchmesser mit ihrem Oberflächenprotein CCR5 nicht optimal an das GP120 binden können. Es liegt hier ein so genanntes partiell maskiertes Epitop vor.
In der Kontrolle, bei der die parentalen GHOST Zellen benutzt wurden, die keine CCR5 Rezeptoren auf der Oberfläche haben, zeigte sich erwartungsgemäss keine Interaktion zwischen den Zellen und der Chipoberfläche.
Die Erfindung wird nachfolgend anhand von Abbildungen, Beispielen sowie einem Sequenzprotokoll erläutert.
Beschreibung der Abbildungen:
1: Schematische Darstellung des HIV-1 gp120.
Die Abbildung zeigt das HIV gp120 Glycoprotein am Beispiel des HIV-Stammes NL4-3. Der V3 Loop des NL4-3 besteht aus 34 Aminosäuren und es befinden sich 5 N-Glycosylierungsstellen im Bereich des V3-Loop. Glycosylierungsstellen sind markiert durch Quadrate oder Dreiecke. Die fünf Glycosylierungsstellen im V3 Bereich sind hervorgeboben als g13-g17.
2: V3-Loop Sequenzdaten von HIV-1 Patientenisolaten.
Die Abbildung zeigt die Variation des V3-Loop von Viren die als Escapevarianten aus Patienten isoliert wurden. A zeigt den V3-Loop von Viren die CCR5 benutzen können und B zeigt V3-Loop Sequenzen von Viren die nur CXCR4 nutzen können. Die Glycosylierungsstelle im V3-Loop NNT ist fett unterstrichen dargestellt. PI = Patienenisolat (primary isolate)
3: V3-Loop Variation.
Gezeigt ist die Variation des V3-Loop für den HIV Subtyp A und B basierend auf vorhandenen V3-Sequenzen. Es wurden 539 V3-Sequenzen für Subtyp A und 1912 V3-Sequenzen für den Subtyp B verglichen. Ähnliche Analysen wurden für alle anderen HIV Subtypen durchgeführt, die zeigen, dass der V3 Loop bei allen HIV-Typen sehr variabel ist (aus: HIV Sequence Database, Human Retroviruses and AIDS. Los Alamos National Laboratory, LA-UR 00-2179B. Korber and Editors).
4: Bindung des V3-Loop an CCR5 und Inhibition der Bindung durch anti-gp120-Antikörper und RANTES.
Verwendet wurden GHOST-Hi5 Zellen. Diese Zellen exprimieren den Korezeptor CCR5. (A) Gebundenes GST-V3-Loop Fusionsprotein wurde mit biotinylierten anti-GST-Antikörpern und Avidin-PE (Phycoerythrin) detektiert. Die Inhibition der Bindung erfolgte durch Zugabe von (B) anti-gp120 Antikörpern (1:100 Verd.; ARP3036, ARP3037, ARP3038, ARP3039) oder durch Zugabe von (C) 1000ng Rantes (Antikörper Ref.: McKeating et al., 1993, J Virol 67:4937).
5: Expressionsvektor pGEX-3X für die Herstellung von Glutathione-S-Transferase--V3 Loop-Fusionsproteinen (GST-V3).
Die V3-Loop kodierenden DNA Fragmente wurden mit Hilfe der Schnittstellen BamHI und EcoRI in den Vektor pGEX-3x kloniert. Das GST-V3 Fusionsprotein mit dem V3-Loop B30 hat am C-Terminus des GST-Proteins die Aminosäuresequenz Sequenz:
(N-Terminus-GST-Protein)-PKSDLIEGRGI-(V3 Loop)-CTRPNNNTRKRIPIGPGRAFYTTENIIGDIRQAHCNSS-C-Terminus.
6: HIV gp120 V3-Loop Sequenz und Numerierung.
PI = Patientenisolate, PI-918 ist identisch zur Sequenz der linearen und cyclischen Peptide/Glycopeptide. Die Glycosylierungsstelle ist NNT (fett unterstrichen) an Position 299-301 (des gp120) bzw. 6-8 (des V3-Loop), N = Asparagin an Position 299 bzw. 6 trägt im glycosylierten Peptid den Zuckerrest. Die Numerierung bezieht sich auf die Sequenz des NL4-3 gp120 (SEQ ID NO: 2). as = Aminosäuren; C, Cys = Cystein; TGT = Codon für die Aminosäure Cystein.
7: Peptidstrukturen; oben: cyclische V3-Loop-Peptide mit der in SEQ ID NO: 9 dargestellten Sequenz, darunter: lineare Peptide mit den in SEQ ID NO: 10 und 11 gezeigten Sequenzen.
8: Biacore Response Kurven, die erhalten werden, indem man eine Lösung von CCR5-haltigen GHOST Zellen über die Oberfläche eines Biacore F1 Chips strömen lässt, der mit einem immobilisierten cyclischen glycosylierten V3-loop Peptid belegt ist. Zelldichten: a) 3600 Zellen/μl, b) 1800 Zellen/μl, c) 360 Zellen/μl, und d) 36 Zellen/μl.
9: Konzentrationsabhängigkeit der Bindung von cyclischem glycosyliertem V3 Peptid, cyclischem V3 Peptid, GP120 und dem linearen V3 Peptid sowie dem Fibrinogen Peptid as negative Kontrolle für ein nicht bindendes Peptide.
X-Achse: Zelldichte in Zellen/μl; Y-Achse: Response Einheiten (RU) des Biacore Geräts.
10: Negative Kontrolle: Parentale GHOST Zellen, die nicht den Korezeptor auf ihrer Oberfläche exprimieren, werden nicht auf dem Biacorechip zurückgehalten, der mit 290 fmol glycosyliertem V3 Peptid belegt ist.
Herstellung von V3-Loop Fusionsproteinen und Messung der Bindung des V3-Loop an HIV-Corezeptoren.
Inhalt

1. Allgemeine Beschreibung der Methode
1.1 Klonierung von V3-loop Fusionsproteinen
1.2 Bindung an Zellen und Nachweis durch Immunfluoreszenz
1.3 Bindungsstudien und Messung durch FACS
1.4 Inhibition der Bindung durch Antikörper oder Korezeptor Liganden.
2. Material und Methoden
2.1 Abkürzungen
2.1.1 Allgemeine Abkürzungen
2.1.2 Aminosäuren
2.1.3 Nukleinsäuren
2.2 Bakterienstämme
2.3 Plasmide
2.4 Enzyme
2.5 Chemikalien
2.6 Oligonukleotide
2.7 Molekulargewichtsstandards
2.8 Verwendete Reagenzien-Kits
2.9 Medien
2.10 Sterilisieren von Lösungen
2.11 Anzucht und Lagerung von Bakterien
2.12 Herstellung Kompetenter Zellen
2.13 Transformation in E.coli
2.14 Plasmid-DNA Präparation
2.15 Auftrennung von DNA in Agarosegelen
2.16 Reinigung von DNA aus Agarosegelen
2.17 Auftrennung von DNA in Polyacrylamidgelen
2.18 Schneiden von DNA
2.19 Ligation von DNA
2.20 DNA-Sequenzierung
2.21 Polymerasekettenraktion (PCR)
2.22 Bestimmung der Proteinkonzentration
2.23 Expression von GST-Fusionsproteinen
2.24 Aufschluß von Bakterien
2.25 Affinitätschromatographische Reinigung von GST-Fusionsproteinen
2.26 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE).
2.27 Expression von GST-V3-Loop Fusionsproteinen in Eukaryotischen Zellen
2.28 Immunfluoreszenzfärbung
2.29 Durchflusscytometrie (FACS-Analyse)
2.30 Synthese von offenkettigen und cyclischen Peptiden und Glycopeptiden
2.31 Manuelle Peptidsynthese
2.32 Automatisierte Peptidsynthese
2.33 Einbau des Nγ-Chitobiosylasparaginbausteins in die Peptidkette
2.34 Einbau des Nγ-Decasaccharidasparaginbausteins in die Peptidkette
2.35 O-Deacetylierung der Glycopeptide an der Festphase
2.36 Abspaltung der Peptide bzw. Glycopeptide von der Festphase
2.37 Abspaltung der Cys-haltigen Peptide und Zyklisierung einer Disulfidbrücke
2.38 O-Deacetylierung der Glycopeptide in Lösung
2.39 Reinigung der Peptide bzw. Glycopeptide mittels HPLC
2.40 Aufnahme der MRLDI-TOF-Spektren
2.41 Aufnahme und Interpretation der NMR-Spektren
2.42 Biacore-Messung

1. Allgemeine Beschreibung des Herstellungsverfahrens
1.1 Klonierung von V3-Loop Fusionsproteinen
Der V3-loop des gp120 wird am N- und C-Terminus durch zwei Cysteine begrenzt. Diese beiden Aminosäuren und der dazwischenliegende Bereich von 33-36 Aminosäuren wird als Fusion mit Glutathione-S-Transferase (GST) exprimiert. DNA-Fragmente die für diesen V3-Loop Bereich kodieren werden entweder mit Hilfe der PCR aus Blut, Serum oder infizierten Zellen gewonnen oder werden anhand von existierenden Sequenzdaten chemisch synthetisiert. Durch Einfügen von Sequenzen für Restriktionsenzyme (z.B. BamHI und EcoRI) an das 5'- und 3'-Ende der DNA-Fragmente lassen sich die DNA-Fragmente in entsprechender Orientierung und dem entsprechenden Leseraster in Expressionsvektoren klonieren und exprimieren.
Die Reinigung der Fusionsproteine erfolgt aufgrund der Substratspezifität des Trägerproteins. So bindet GST an imobilisiertes Glutathion (GST-Agarose-Matrix) und kann dadurch aus E. coli Extrakten isoliert werden. Neben GST eignen sich auch andere Proteine zur Herstellung von Fusionsproteinen wie z.B. β-Gal-aktosidase, Protein A oder auch kleine Peptide wie z.B. Histidin polymere (His₆-Tag).
GST-V3-Loop Fusionsproteine lassen sich auch in eukaryotischen Systemen exprimieren. Dies führt dazu, dass an den potentiellen N-Glycosylierungsstellen des Fusionsproteins die Zuckerstrukturen angeheftet werden. Dadurch lassen sich die GST-V3 Fusionsproteine in glykosyliertem Zustand herstellen.
Die Herstellung in Stichworten:

a) Chemische Synthese der V3-Loop kodierenden DNA-Fragmente
b) Ligation der DNA-Fragmente in die BamHI und EcoRI Schnittstellen des pGEX-3x Vektors
c) Überprüfung der rekombinanten Klone durch DNA Sequenzierung
d) Expression in Bakteriens Herstellung des nicht-glykosylierten V3-Loop
e) Expression in Zellen: Herstellung des glycosylierten V3-Loop
f) Affinitätschromatographische Reinigung des GST-V3-Loop Fusionsproteins
g) Analyse Reinheit und Menge der isolierten V3-Loop Fusionsproteine

1.2 Bindung an Zellen und Nachweis durch Immunfluoreszenz
Humane Zellen und gentechnisch veränderte Zellen exprimieren HIV-Korezeptoren die sich in die äußere Membran der Zellen einlagern. Diese Korezeptoren können z.B. mit Hilfe Korezeptor-spezifischer Antikörper markiert werden. Die bebundenen Antikörper werden dann mit Hilfe von anti-Antikörpern markiert an die ein Fluoreszenz Farbstoff gekoppelt ist. Korezeptor tragende Zellen zeigen dann eine spezifische Fluoreszenz-Färbung bei Betrachtung der Zellen im Fluoreszenz-Mikroskop.
Anstelle von Korezeptor-spezifischen Antikörpern werden nun die GST-V3-Loop Fusionsproteine zur Färbung der Zellen eingesetzt. Nach Inkubation der Zellen mit den V3-Loop Fusionsproteinen werden die gebundenen Fusionsproteine mit Trägerprotein-spezifischen Antikörpern markiert. Bei GST-V3 Fusionsproteinen verwendet man anti-GST-Antikörper die mit Biotin markiert sind. Ein Avidin-Biotin-Fluoreszenzfarbstoff Komplex wird eingesetzt um die gebundenen anti-GST-Antikörper mit einem Fluoreszenzsignal zu markieren. Bei Betrachtung der Zellen unter dem Fluoreszenzmikro skop zeigt sich die für die Korezeptoren spezifische Anfärbung der Zellen.
Die Messung in Stichworten:

a) Ausstreichen von Zellen auf Objektträger (Cytospinns)
b) Inkubation der immobilisierten Zellen mit GST-V3-Loop Fusionsproteinen
c) Inkubation mit Detektions-Antikörpern (Anti-GST-Biotin gekoppelt)
d) Inkubation mit Avidin-Biotin-Fluoreszenzfarbstoff-Komplexen
e) Betrachtung der gefärbten Zellen im Fluoreszenz-Mikroskop

1.3 Bindungsstudien und Messung durch FACS
Die Bindung des V3-Loop an Korezeptoren kann auch mit Immuncytometrisch gemessen werden. Wie bei der unter 1.2 beschrieben Anfärbetechnik werden die Zellen mit GST-V3 Fusionsproteinen inkubiert und gebundenes GST-V3 mit anti-GST Antikörpern und einem Fluoreszenzfarbstoff markiert. Zellen mit gebundenem GST-V3 zeigen ein Fluoreszenz. Diese Zellen werden im FACS gezählt und die Intensität der Fluoreszenz gemessen. Aus der intensität und Anzahl fluoreszierender Zellen kann auf die Stärke der V3-Loop--Korezeptor Bindung geschlossen werden. Als Kontrolle dient GST und Zellen ohne Korezeptor Expression.
Die Messung in Stichworten:

a) Herstellen von Zellsuspensionen
b) Inkubation von Zellen mit GST-V3-Loop Fusionsproteinen
c) Inkubation mit Detektions-Antikörpern (Anti-GST-Biotin gekoppelt)
d) Inkubation mit Avidin-Biotin-Fluoreszenzfarbstoff-Komplexen
e) Messung der Anzahl und der Intensität von fluoreszierenden Zellen in der Durchflusscytometrie (FACS).

1.4 Inhibition der Bindung durch Antikörper oder Korezeptor Liganden.
Die in 1.2 und 1.3 verwendeten Methoden zum Nachweis und zur Messung der V3-Loop-Korezeptor Bindung können benutzt werden um die Wirkung von Substanzen zu testen die in der Lage sind die Bindung zwischen Korezeptor und V3-Loop zu inhibieren.
Solche Substanzen sind (i) Substanzen (z.B. neutralisierende Antikörper) die an den V3 Loop binden oder (ii) Substanzen die an die Korezeptoren binden (z.B. HIV inhibierende Chemokine). Die zu testenden Substanzen werden mit den Zellen bzw. den GST-V3 Loop Fusionsproteinen inkubiert. Danach wird die Differenz der Korezeptor-spezifischen Fluoreszenz-Färbung gemessen. Das Maß für die Inhibition der Bindung errechnet sich aus der Differenz der Messung mit Inhibitor zu dem Messwert ohne Inhibitor. Zur Bestimmung der Korezeptorspezifität stehen unterschiedliche Zellen mit und ohne Korezeptor zur Verfügung.
2. Material und Methoden
2.1 Abkürzungen
2.1.1 Allgemeine Abkürzungen

μg

Mikrogramm

μl

Mikroliter

μmol

Mikromol

bp

Basenpaare

dNTP

Desoxynukleosidtriphosphat

DNA

Desoxyribonukleinsäure

DTT

Dithiothreitol

EDTA

Ethylendiamintetraessigsäure

g

Gramm

gp

Glykoprotein

h

Stunde

HIV

Humanes Immunodefizienz Virus

IPTG

Isopropyl-β-D-thiogalaktopyranosid

PAGE

Polyacrylamidgelelektrophorese

PCR

Polymerase-Ketten-Reaktion

RT

Raumtemperatur

SDS

Natriumdodecylsulfat

U/min

Umdrehungen pro Minute

2.1.2 Aminosäuren
2.1.3 Nukleinsäuren

A

Adenin

C

Cytosin

G

Guanin

T

Thymidin

2.2 Bakterienstämme

Escherichia coli DH5α: F-, endAl, hsdrl7, (rk-mk+), supE44, recAl, λ-, gyrA96, relAl, ϕ80d lac z ΔÄM15

2.3 Plasmide

pGEX-3x Pharmacia
2.4 Enzyme

BamHI MBI-Fermentas

EcoRI MBI-Fermentas

Taq-Polymerase MBI-Fermentas

T4-DNA-Ligase MBI-Fermentas

2.5 Chemikalien

Agarose, ultra pure	GIBCO BRL
Glutathione-Agarose	Sigma
Ammoniumpersulfat	Merck
Ampicillin	US Biochemical
Bacto-Agar	Becton Dickinson
Bacto-Trypton	Becton Dickinson
Borsäure	Merck
Bromphenolblau	Merck
Calciumchlorid	Merck
Desoxyribonukleotide	MBI-Fermentas
Dithiothreitol	Biotechnik, St. Leon-Rot
Eisessig	Merck
Ethidiumbromid	Sigma
Ethylendiamintetraessigsäure	Merck
Glycerin	Merck
Harnstoff	ICN Biomedicals
Hefeextrakt	Becton Dickinson
Kaliumchlorid	Merck
Kaliumdihydrogenphosphat	Merck
Magnesiumchlorid	Merck
Acrylamid-Mix	Roth
Natriumacetat	Merck
Natriumchlorid	Merck
di-Natriumhydrogenphosphat	Merck
Natriumdihydrogenphosphat	Merck
2-Propanol	Merck
Sigmacote (Chloriertes Polysiloxan)	Sigma
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan	GIBCO BRL

2.6 Oligonukleotide
Für die Klonierung von V3-Loop Fusionsproteinen wurden Oligonukleotide verwendet mit BamHI und EcoRI kompatiebelen Enden verwendet. Für die Klonierung des V3-Loop wurde die DNA-Sequenz für die Expression in E. coli optimiert. Am Beispiel der Klonierung zweier V3-Loops sind die Sequenzen der Oligonukleotide aufgeführt. Alle aufgeführten Oligonukleotide wurden mit dem Expedite^TM Nucleic Acid Synthesis System der Firma PE Biosystems (Weiterstadt) hergestellt. V3-Aminosäuresequenz: CTRPNNNTRKGIHIGPGRAFHTTEEIIGEIRQAHC (SEQ ID NO: 3)
V3-Aminosäuresequenz: CTRPNNNTRKRIHIGPGRAFHTTKKIIGDIRQAHC (SEQ ID NO: 6)
2.7 Molekulargewichtsstandards

1 kb-Leiter MBI-Fermentas

100 bp Leiter MBI Fermentas

2.8 Verwendete Reagenzien-Kits

Qiaquick PCR Purification Kit Qiagen

Qiagen Plasmid Kit Qiagen

2.9 Medien für die Anzucht von Bakterien

YT-Medium:

10 g Trypton

5 g Hefeextrakt

5 g NaCl

dYT-Medium:

16 g Trypton

10 g Hefeextrakt

5 g NaCl

dYT-Agarplatten:

10 g Trypton

5 g Hefeextrakt

5 g NaCl

15 g Agar
Die angegebenen Mengen beziehen sich auf jeweils 1000 ml deionisiertes Wasser. Autoklaviert wurden die Ansätze bei 121°C und 1,5 bar für 20 min. Sollten die Medien Antibiotika oder andere hitzeempfindliche Reagenzien enthalten, wurden die entsprechenden Mengen sterilfiltriert und nach dem Abkühlen des Mediums zugegeben.

Ampicillin 3,3 ml/l (60 mg/ml)

IPTG 3 ml/l (100 mM)

xgal 3 ml/l (2% in DMF, nicht filtrieren)
2.10 Sterilisieren von Lösungen und Geräten
Lösungen und Medien sowie Pipettenspitzen, Eppendorfgefäße und Glasgeräte wurden 20-40 min bei 121°C und 1,5 bar autoklaviert. Hitzeempfindliche Lösungen wie z.B. Antibiotika- und IPTG-Lösungen wurden sterilfiltriert.
2.11 Anzucht und Lagerung von Bakterien
Bakterienkulturen wurden jeweils mit einer einzelnen Kolonie angeimpft. Zur Isolierung einer Einzelkolonie wurden Zellen einer Flüssigkultur auf einer Agarplatte ausgestrichen. Nach Inkubation bei 37°C über Nacht sind vereinzelte Kolonien gewachsen. Zur kurzfristigen Aufbewahrung der Bakterien wurden die Agar-Platten mit Parafilm versiegelt und bei 4°C gelagert. Für eine dauerhafte Lagerung von Bakterienstämmen wurden 0,75 ml einer YT-Übernacht kultur mit 0,25 ml sterilem Glycerin vermischt, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei –70°C aufbewahrt.
2.12 Herstellung kompetenter Zellen
100 ml YT-Medium wurden mit 100 μl einer Übernachtkultur angeimpft. Die Bakterien wurden bis zum Erreichen einer OD₅₆₀=0,4 bei 37°C im Schüttelinkubator inkubiert und anschließend 8 min bei 4°C und 1000 × g zentrifugiert. Alle anschließenden Arbeiten erfolgten auf Eis unter Verwendung vorgekühlter Gefäße und 4°C kalter Lösungen. Die Zellen wurden in 50 ml 50 mM CaCl₂ resuspendiert und 30 min auf Eis inkubiert. Nach erneutem Zentrifugieren wurden die Bakterien in 2,5 ml sterilem TFBII-Puffer aufgenommen und in Portionen von jeweils 100 μl aufgeteilt. Die 100 μl Portionen der kompetenten Zellen konnten, soweit sie nicht für eine sofortige Transformation benötigt wurden, nach dem Schockgefrieren in flüssigem Stickstoff bei –70°C gelagert werden. TFBII-Puffer:

10 mM MOPS pH 7,0

75 mM CaCl₂

10 mM KCl

15% Glycerin
2.13 Transformation von E. coli
Eine 100 μl Portion kompetenter Zellen wurde im Eisbad aufgetaut und mit 1-100ng Plasmid-DNA für 30 min bei 0°C inkubiert. Anschließend wurde der Transformationsansatz 1 min bei 42°C inkubiert. Danach wurde 1 ml YT-Medium zugegeben und bei 37°C für eine Stunde geschüttelt. Um eine Selektion der transformierten Zellen zu ermöglichen, wurden 100-500 μl des Ansatzes auf antibiotikahaltigen YT-Agarplatten ausgestrichen. Nach Inkubation über Nacht bei 37°C sind nur Kolonien gewachsen, die das plasmid- kodierte Resistenzgen tragen. Bei einer Transformation von Zellen, die keine funktionsfähige β-Galaktosidase enthalten (lacZΔM15 Mutation, z.B. DH5α), ermöglichen Vektoren wie der verwendete pUC über eine plasmid-kodierte β-Galaktosidase eine direkte Selektion (blue white screening) rekombinanter Bakterien. Für die Blau-Weiß-Selektion wurden die Bakterien auf Amp/IPTG/-Xgal-YT-Agarplatten ausgestrichen. Das Substrat Xgal wird durch die β-Galaktosidase in einen blauen Farbstoff gespalten. Aufgrund der Zerstörung des Leserasters des lacZ-Gens durch die Insertion eines fremden DNA-Fragments in das lacZ-Gen werden weiße Kolonien erzeugt. Dagegen bedeuten blaue Kolonien, daß das lacZ-Gen bei der Klonierung und Ligation funktionsfähig geblieben ist und keine DNA inseriert wurde.
2.14 Plasmid-DNA Präparation
Für eine Übernachtkultur wurden 5 ml YT-Medium (100 μg/ml Amp), mit den Plasmid tragenden Wirtszellen angeimpft und bei 37°C unter Schütteln inkubiert. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren bei 13.000 U/min in einer Eppendorf-Tischzentrifuge geerntet und in 200 μl eiskalter Lösung 1 resuspendiert. Durch Zugabe von 400 μl Lösung 2 wurden die Zellen aufgeschlossen (5 min, 0°C). Der Ansatz wurde zur Fällung von Membranen und zellulären Proteinen mit 300 μl eiskalter Lösung 3 versetzt und weitere 5 min im Eisbad inkubiert. Die Proteine, Membranen und daran haftende chromosomale DNA wurden abzentrifugiert (15 min, 4°C, Eppendorfzentrifuge). Der Überstand wurde mit 30 μl Glasmilch versetzt. Aufgrund der NaCl-Konzentration wird der DNA die Hydrathülle entzogen und damit die Bindung der DNA an die Glaspartikel ermöglicht. Der Ansatz wurde 5 min bei RT inkubiert. Nach zweimaligem Waschen der Glasmilch mit NEW WASH und anschließendem Trocknen wurde die Plasmid-DNA mit 50 μl Wasser eluiert (2 min, 65°C). Lösung 1:

25 mM Tris-HCl pH 8,0

10 mM EDTA

50 mM Glucose

Lösung 2:

0,2 M NaOH

1% SDS

Lösung 3:

3 M Kaliumacetat pH 4,8

NEW WASH:

10 mM Tris-HCl pH 7,5

0,05 mM EDTA

50 mM NaCl

in 1:1 Ethanol/H₂O
2.15 Auftrennung von DNA in Agarosegelen
Die Trennung von DNA erfolgte durch Gelelektrophorese in Agarosegelen. In Abhängigkeit von der Größe der untersuchten Fragmente wurden 0,8-2% Agarose in TBE-Puffer (für analytische Agarosegele) oder TAE-Puffer (für präparative Agarosegele) durch Aufkochen gelöst. Nach dem Abkühlen auf ca. 60°C wurde die Gelflüssigkeit mit 1 μl Ethidiumbromid (10 mg/ml) versetzt und in ein vorbereitetes Gelbett mit eingesetztem Kamm gegossen. Das vollständig abgekühlte Gel wurde in einer Elektrophoresekammer mit TBE-, bzw. TAE-Puffer überschichtet und der Kamm entfernt. Die DNA-Proben wurden mit 1/5 Vol. Auftragspuffer gemischt und in die Probentaschen pipettiert. Die Fragmente wurden bei 5-10 Volt/cm Gellänge 0,5-2 h aufgetrennt. Zur Detektion wurde das Gel nach der Elektrophorese im UV-Durchlicht photographiert. Die Molekulargewichte der DNA-Banden wurden im Vergleich zu mitlaufenden DNA-Molekulargewichtsmarkern bestimmt. TBE-Puffer:

100 mM Tris

100 mM Borsäure

3 mM EDTA

TAE-Puffer:

40 mM Tris

2 mM EDTA

0,114 Eisessig

Auftragspuffer:

0,25 Bromphenolblau

O,25% Xylencyanol

30% Glycerin

50 mM EDTA
2.16 Reinigung von DNA aus Agarosegelen
Die Extraktion von DNA aus Agarosegelen wurde unter Verwendung des Qiaquick-Gel-Extraction-Kits nach Anleitung des Herstellers (Qiagen, Hilden) durchgeführt. Die gewünschte DNA-Bande wurde dazu aus dem Gel ausgeschnitten, der Agaroseblock aufgelöst und die Suspension über eine Säule gegeben, deren Filter DNA absorbiert. Eluiert wurde die DNA mit Wasser oder TE-Puffer. TE-Puffer:

10 mM Tris-HCl pH 8,0

1 mM EDTA
2.17 Auftrennung von DNA in Polyacrylamidgelen
Die Trennung von radioaktiv markierten DNA-Fragmenten zur DNA-Sequenzierung wurde unter Verwendung von denaturierenden Polyacrylamidgelen durchgeführt. Zwei gereinigte Glasplatten wurden mit Ethanol von Fettresten befreit und mit 1 ml Sigmacote pro Platte beschichtet, um eine hydrophobe Oberfläche zu erhalten. Durch die Beschichtung sollte ein späteres Zerreißen des Gels beim Abziehen von der Glasplatte vermieden werden. Zwischen die beiden Glasplatten wurden Abstandshalter (Spacer) gelegt, welche gleichzeitig zum seitlichen Abdichten dienten. Die ganze Apparatur wurde mit mehreren Klammern fixiert. Zur Herstellung des Sequenzgels wurden 21 g Harnstoff in etwa 20 ml Wasser gelöst. Nach Zugabe von 7,5 ml Acrylamid-Mix und 5 ml 10 × TBE-Puffer (siehe 2.12) wurde der Ansatz mit Wasser auf 50 ml aufgefüllt. Die Polymerisation des Gels wurde durch Zugabe von 300 μl APS und 100 μl TEMED gestartet. Sofort danach wurde die Gellösung in die vorbereitete Gelapparatur gegossen, und durch Einsetzen des flachen Rückens des Sägezahnkamms der Taschenboden geformt. Bis zur vollständigen Polymerisation wurde das Gel waagerecht bei RT gelagert. Nach dem Einsetzen des Gels in die Gelkammer wurde diese mit TBE-Puffer gefüllt. Durch Umdrehen des Sägezahnkammes wurden die Auftragstaschen gebildet. Um das Gel auf die optimale Betriebstemperatur zu erwärmen, wurde ein Vorlauf von 20 min durchgeführt. Die Taschen wurden gründlich mit TBE-Puffer gespült und anschließend mit 4-5 μl der Proben gefüllt. Die Elektrophorese erfolgte bei 2 kV (150 Watt) für etwa 2-3 h. Das Gel wurde nach Beenden der Elektrophorese aus der Gelkammer genommen und eine der Glasplatten vorsichtig abgehoben. Durch Auflegen und leichtes Andrücken wurde das Gel auf Schleicher & Schuell-Papier (Whatman, England) übertragen. Nach dem Trocknen bei 80°C unter Vakuum wurde das Gel 1-3 Tage bei RT auf einem Röntgen-Film (Kodak BioMax MR-1, Sigma Deisenhofen) exponiert. Acrylamid-Mix:

40% Polyacrylamid

0,8% Bisacrylamid
2.18 Schneiden von DNA
Restriktionsendonukleasen erkennen und hydrolysieren enzymspezifische palindrome DNA-Sequenzen von meist 4-8 Nukleotiden Länge. Bei der Hydrolyse entstehen je nach Art des Enzyms stumpfe (blunt ends) oder überhängende Enden einzelsträngiger DNA (sticky ends). Für einen Restriktionsverdau wurden 0,1-60 μg DNA mit 2-120 Einheiten (Units) eines Restriktionsenzyms in dem vom Hersteller angegebenen Puffer für 2-5 h bei 37°C inkubiert. Das Gesamtvolumen betrug zwischen 10 μl für analytische und 300 μl für präparative Änsätze. Für Restriktionen mit zwei verschiedenen Enzymen wurde ein Puffer gewählt in dem beide Enzyme eine ausreichende Aktivität besitzen z.B. den EcoR I-Puffer für einen EcoR I/BamH I-Verdau, oder es wurden nach Inkubation mit dem ersten Enzym die Bedingungen für das zweite Enzym eingestellt.
2.19 Ligation von DNA
DNA-Ligasen katalysieren die Verknüpfung von DNA-Molekülen unter Verbrauch von NAD⁺ oder ATP durch Bildung einer Phosphodiesterbindung zwischen einer freien 5'-Phosphatgruppe und einer 3'-Hydroxylgruppe. Ein drei- bis fünffacher Überschuß an DNA-Fragment wurde mit 100-500 ng geschnittenen Plasmids und 5 Einheiten T4-DNA-Ligase sowie 10 nmol ATP über Nacht bei 12°C in Ligationspuffer inkubiert. Es wurden nur Ligationen kohäsiver Enden durchgeführt. Ligationspuffer:

40 mM Tris-HCl pH 7,8

10 mM MgCl₂

10 mM DTT

0,5 mM ATP
2.20 DNA-Sequenzierung
Die Sequenzierung von DNA wurde nach der Kettenabbruchmethode durchgeführt. Als Substrat diente doppelsträngige Plasmid-DNA. Aus Einzelstrang-DNA kann ausgehend von einem Oligonukleotidprimer in Anwesenheit von dNTPs durch eine DNA-Polymerase doppelsträngige DNA synthetisiert werden. Ist im Nukleotidgemisch ein geringer Anteil Didesoxynukleotide (ddNTPs) enthalten, führt dies zu einem zufällig verteiltem Einbau des ddNTPs, da die DNA-Polymerase nicht zwischen dNTPs und ddNTPs unterscheiden kann. Der Einbau führt aufgrund der fehlenden 3'-Hydroxylgruppe der ddNTPs zu einem Abbruch der Doppelstrangsynthese und, da er statistisch verteilt erfolgt, zu unterschiedlich langen DNA-Einzelsträngen. Da der Syntheseansatz viergeteilt ist und in jeder Probe nur eines der vier ddNTPs vorhanden ist, kommt es in den jeweiligen Ansätzen zu basenspezifischen Kettenabbrüchen. Zur Markierung des synthetisierten Einzelstranges wird der Reaktion α-³⁵S-dATP zugegeben. Nach Denaturierung und Trennung der DNA über Polyacrylamidgelelek-trophorese lassen sich die Banden autoradiographisch detektieren und die Sequenz des DNA-Stranges direkt ablesen.
Durchgeführt wurden die Sequenzierungen mit dem T7-Sequenzier-Kit (Pharmacia) nach der Anleitung des Herstellers. Als Oligonukleotidprimer wurde dabei entweder der M13-Universal-Primer (Pharmacia) oder Primer 136 verwendet. 32 μl (ca. 2 μg) gereinigter doppelsträngiger Plasmid-DNA wurden mit 8 μl 2 M NaOH für 10 min bei RT denaturiert. Nach Zugabe von 7 μl 3 M Natriumacetat pH 4, 8, 4 μl H₂O und 120 μl –20°C Ethanol wurde die DNA 20 min bei –70°C gefällt. Durch Zentrifugieren (15 min, 4°C) wurde die DNA isoliert, zweimal mit –20°C kaltem 70% Ethanol gewaschen und in einer Vakuumzentrifuge getrocknet. Das DNA-Sediment wurde anschließend in 10 μl H₂O resuspendiert und nach Zugabe von 2 μl Annealing-Puffer und 2 μl Primerlösung (10 pmol in Wasser) bei 65°C für 5 min, 37°C für 10 min und 5min bei RT mit dem Oligonukleotidprimer hybridisiert. Direkt darauf wurden zwecks Primerelongation und radioaktiver Markierung 3 μl Labelling-Mix, 1 μl α-³⁵S-dATP (1000 Ci/mmol, 10 μCi/μl) und 2 μl T7-Polymeraselösung (mit Enzyme Dilution Puffer 1:5 verdünnt) zugegeben und 5 min bei RT inkubiert. Jeweils 4,5 μl dieses Ansatzes wurden auf eine, auf 37°C vorgewärmte MicroSample Plate (Greiner) gegeben, in der je 2,5 μl der vier verschiedenen dNTP/ddNTP-Mixe vorlagen. Nach fünfminütiger Inkubation bei 37°C, die der weiteren Elongation und basenspezifischen Termination diente, wurden die Reaktionen durch Zugabe von 5 μl Stoplösung beendet. Vor dem Auftrag auf das Polyacrylamidgel wurden die Proben für 2 min bei 80°C denaturiert. Gelagert wurden die Proben bei –20°C. Annealing-Puffer:

1 M Tris-HCl pH 7,6

100 mM MgCl₂

160 mM DTT

Labelling-Mix:

1,375 μM dCTP

1,375 μM dGTP

1,375 μM dTTP

333,5 mM NaCl

Enzyme Dilution Puffer:

20 mM Tris-HCl pH 7,5

5 mM DTT

100 μg/ml BSA

5% Glycerin

Stoplösung:

10 mM EDTA

97,5% Formamid

0,3% Bromphenolblau

0,3% Xylencyanol
2.21 Polymerasekettenreaktion (PCR)
Doppelsträngige DNA wird durch hohe Temperaturen zu Einzelstrang-DNA-Molekülen aufgeschmolzen. Eine hitzestabile DNA-Polymerase kann dann die Einzelstrang-DNA in Anwesenheit von dNTPs und einem Oligonukleotidprimer in doppelsträngige DNA umschreiben. Unter Verwendung von zwei flankierenden Oligonukleotidprimern können, durch zyklische Wiederholung von Denaturierung, Primerhybridisierung und DNA-Synthese, in n Zyklen 2^n-2 Amplifikate des DNA-templates erzeugt werden. Da nur jene DNA-Bereiche amplifiziert werden, die zwischen den flankierenden Oligonukleotidprimern liegen, ist die Wahl der Primer ausschlaggebend für das Ergebnis der PCR. Als DNA-Polymerasen wurden sowohl Taq-Polymerase (MBI-Fermentas) als auch Elongase (GIBCO, BRL) verwendet. Im Gegensatz zur Taq-Polymerase besitzt Elongase eine Korrekturlese-Fähigkeit. Damit sinkt die Wahrscheinlichkeit des Einbaus falscher Nukleotide. Für die Suche nach Klonen mit inserierter DNA wurde eine PCR unter folgenden Bedingungen verwendet.
Als PCR-template wurden Bakterienklone verwendet. Olignukleotidprimer wurden bei allen durchgeführten PCR-Reaktionen in einer Endkonzentration von 0,1 pmol/μl eingesetzt. Sowohl von der Elongase als auch Taq-Polymerase wurden 1 Unit pro 50 μl des Reaktionsansatzes benutzt. Die Konzentration der dNTPs im PCR-Ansatz wurde auf 0,1 mM eingestellt.
2.22 Bestimmung der Proteinkonzentration
Proteinkonzentrationen wurden nach der von M. Bradford beschriebenen Methode photometrisch bestimmt, wobei die Proben mit Wasser auf 100 μl aufgefüllt, und mit der gleichen Menge Coomassie brilliant blue Lösung versetzt wurden. Die Ansätze wurden in 96-Loch Mikrotiterplatten pipettiert und innerhalb von 30 min mittels eines Mikrotiterplatten-Photometers bei 595 nm vermessen. Eine definierte BSA-Verdünnungsreihe diente dabei als Proteinstandard zur Herstellung einer Eichgeraden. Coomassie brilliant blue Lösung:

50 ml Ethanol (95%)

100 mg Coomassie brilliant blue G 250

100 ml Phosphorsäure (87%)

850 ml Aqua dest.
2.23 Expression von GST-Fusionsproteinen
Die Expression von V3- und V2-Peptiden in E. coli erfolgte mit Hilfe eines Expressionsvektors (pGEX3X), bei dem das klonierte Gen als Fusionsprotein mit GST (Glutathion-S-Transferase) exprimiert wurde. Die Transkription der mRNA steht unter der Kontrolle des lac-Repressors (Produkt des auf pGEX3X befindlichen lacI Gens), welcher durch Bindung an den lac-Operator den P(tac)-Promotor blockiert. Durch Zugabe von IPTG löst sich der lac-Repressor vom lac-Operator und die GST-Fusionsproteine werden transkribiert. Als Wirtsstamm der Vektoren wurde DH5α verwendet. Das Plasmid trägt als Selektionsmarker ein Ampicillin-Resistenz gen. Um zu verhindern, daß Zellen sich während des Wachstums ihres Plasmids entledigen und dennoch weiter teilungsfähig bleiben, wurde die Expression in Antibiotikum-haltigem Medium durchgeführt. 500 ml DYT-Medium mit einer Ampicillinkonzentration von 100 μg/ml wurden mit 5 ml einer Übernachtkultur des zu exprimierenden Klones angeimpft und im Schüttler (220 U/min) bei 37°C inkubiert. Nach Erreichen einer Zelldichte von OD₅₆₀ = 0.8 wurde die Expression durch Zugabe von IPTG zu einer Endkonzentration von 0,3 mM induziert. Drei Stunden nach Induktion wurden die Zellen abzentrifugiert (10 min, 5000 × g, 4°C). Die Expression wurde hinsichtlich der Parameter Medium, IPTG-Konzentration, Zelldichte bei der Induktion und Wachstumsdauer optimiert.
2.24 Aufschluß von Bakterien
Zur Aufreinigung der rekombinanten Proteine wurden die Bakterien mit Lysozym aufgeschlossen. Nach der Ernte der Bakterien wurde das Zellsediment aus 100 ml Kulturvolumen in 5 ml Lysispuffer resuspendiert und für mindestens 12 h bei –20°C gelagert, um die Lyse der Bakterien zu unterstützen. Zum Schutz der exprimierten Proteine vor Proteasen-vermittelter Degradation wurde dem Lysispuffer PMSF als Proteaseinhibitor zugefügt und das Auftauen der gefrorenen Bakteriensuspension auf Eis über einen Zeitraum von 3-5 h durchgeführt. Lysispuffer:

16 mM Na₂HPO₄

10 mM MgCl₂

4 mM NaH₂PO₄

150 mM NaCl

0,1 mM PMSF

0,5% Triton X-100

10 mg/ml DNAse I

5 mg/ml Lysozym
2.25 Affinitätschromatographische Reinigung von GST-Fusionsproteinen
Die GST-V3-Fusionsproteine wurden affinitätschromatographisch über eine Glutathion-Agarose Matrix (Sigma, Deisenhofen) von den übrigen löslichen Zellbestandteilen getrennt. Falls nicht gesondert im Text angegeben, wurden alle nachfolgenden Schritte auf Eis durchgeführt. Nach der Lyse wurde durch Zentrifugieren (20 000 × g, 4°C) eine Trennung in feste- und lösliche Zellbestandteile erzielt. Die gesuchten Proteine befanden sich zum überwiegenden Teil im Überstand. Für die Affinitätschromatographie wurden ca. 300 μl Glutathion-Agarose Lösung pro 500 ml Kulturvolumen dreimal mit GST-Puffer gewaschen, um den Stabilisator Lactose zu entfernen. Anschließend wurden 5 ml des Überstands der lysierten Bakterien (siehe Meth. 2.25) zugegeben. Das Gemisch wurde 15 min bei 0°C geschüttelt, um eine Bindung der GST-Fusionsproteine an die Glutathion-Agarose zu erreichen. Nach dreimaligem Waschen der Glutathion-Agarose mit dem doppelten Volumen GST-Puffer wurden die gebundenen GST-Fusionsproteine mit 2 × 300 μl 10 mM Glutathionlösung durch 10-minütige Inkubation bei RT eluiert. GST-Puffer (pH 7,6):

16 mM Na₂HPO₄

4 mM NaH₂PO₄

150 mM NaCl

0,1% Triton X-100.
2.26 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE).
Die elektrophoretische Auftrennung von Proteinen nach ihrem Molekulargewicht erfolgte durch eine diskontinuierliche SDS-PAGE. Die verwendeten Gele hatten eine Dicke von 0, 8 mm bei einer Länge des Trenngels von 5 cm und einer Breite von 10 cm. Sie wurden nach ihrer vollständigen Polymerisation in eine Elektrophorese-Kammer (Bio-Rad, Mini-Protean II) gespannt. Die Kammer wurde mit SDS-Laufpuffer gefüllt. Die Protein-Proben wurden mit 1/5 Vol.
Auftragspuffer versetzt, 5 min bei 95°C inkubiert und in die Taschen des Sammelgels pipettiert. Die Auftrennung erfolgte bei 150 V und etwa 50 mA für 1-2 h. Die Gele wurden mit Coomassie-Lösung für 30 min gefärbt und anschließend mind. 24 h mit Entfärber gewaschen.
Die Gele hatten folgende Zusammensetzung: Sammelgel:

5% Acrylamid-Mix

0,125 M Tris-HCl pH 6,8

0,1% SDS

0,05% APS

0,1% TEMED

Trenngel:

12,5-15% Acrylamid-Mix

0,375 M Tris-HCl pH 8,8

0,1% SDS

0,033% APS

0,067% TEMED

Acrylamid-Mix:

30% Acrylamid

0,8% Bisacrylamid

SDS-Laufpuffer:

25 mM Tris

0,2 M Glycin

0,1% SDS

Auftragspuffer:

1 g SDS

0,93 g DTT

2 mg Bromphenol Blau

3 ml Glycerin

7 ml 4 × Tris-HCl/SDS pH 6,8

4 x Tris-HCl/SDS pH 6,8:

0,5 M Tris-HCl

0,4% SDS

Coomassie-Lösung:

1,75 g Serva blue R-250

454 ml Methanol

454 ml H₂O

92 ml Eisessig

Entfärber:

33 ml Methanol

10 ml Eisessig

57 ml H₂O
2.27 Expression von GST-V3-Loop Fusionsproteinen in Eukaryotischen Zellen
Die Expression der V3-Loop DNA-Fragmente erfolgt z.B. in Insektenzellen oder in humanen Zelllinien. In beiden System werden die Proteine glycosyliert. Dabei werden an die entsprechenden Asparagine der Erkennungsstelle N × T/S Zuckerstrukturen angeheftet. In Insektenzellen werden sehr grosse Zuckerstrukturen angeheftet. In humanen Zelllinien werden die Zucker angeheftet wie sie auch bei den im Menschen vorkommenden HIV-Varianten vorzufinden sind. Für die Expression der GST-V3 Fusionsproteine eigenen sich z.B. die Vektoren Baculo-GEX oder Standardexpressionsvektoren wie z.B. pcDNA3.1 oder pVAX (Invitrogen). Nach Schneiden der Vektoren mit den entsprechenden Restriktionsenzymen, abhängig von der jeweiligen Polylinkerregion des Expressionsvektors, können entsprechende V3-Loop DNA-Fragmente inseriert werden. Auch hier können PCR amplifizierte DNA-Fragmente oder chemisch synthetisierte DNA-Fragmente für die Klonierung eingesetzt werden. Die Transfektion der Vektor-V3-Loop-DNA in Zellen erfolgt nach Standardmethoden mit Hilfe von CaPO₄ oder anderer Transfektions-Hilfsmittel (Lipofectin, Cellfectin (Invitrogen)). Die Aufreinigung erfolgt in gleicher Weise wie bei der Expression der V3-Loop Proteine in E. coli.
2.28 Immunfluoreszenzfärbung
Lebende oder fixierte Zellen werden zur Färbung direkt mit V3-Loop Peptiden, V3-Loop Fusionsproteinen oder mit V3-Loop His-Tag Proteinen in Standardpuffer (z.B. PBS, 1 × RPMI) inkubiert. Nach Inkubation 1h bei 0-4°C werden die Zellen in Puffer gewaschen und mit einem Detektionsantikörper inkubiert. Bei der Verwendung von GST-V3-Loop Fusionsproteinen erfolgt eine Inkubation mit einem z.B. Kaninchen anti-GST-Antikörper-Biotin-Konjugat. Nach einer Inkubationszeit von 1h bei 0-4°C werden die Zellen gewaschen. Nun erfolgt die eigentliche Färbung der Zellen mit Hilfe eines Avidin-Biotin-PE Komplexes. Der PE (Phycoerythrin) Fluoreszenzfarbstoff dient zur Detektion des gebundenen V3-Loop. Die Zellen werden anschließend in einer Zentrifuge auf Glasobjektträger zentrifugiert (Cytospinns). Gefärbte Zellen werden im Fluoreszenzmikroskop ausgezählt. Die Färbung der Zellen wird im Vergleich zu einer direkten Färbung der Zellen mit einem Korezeptor-spezifischen Antikörper ausgewertet.
2.29 Durchflusscytometrie (FACS-Analyse)
Für die Messung der Zellen mit gebundenem V3-Loop in der Durchflusscytometrie erfolgt die Färbung in gleicher Weise wie unter 2.28 beschrieben. Insgesamt werden ca. 10⁵ Zellen für eine Messung eingesetzt und nach einem Standardverfahren in einem Durchflusscytometer und aufgrund der Signal-Intensität gemessen. Dabei wird die Anzahl der Zellen die eine bestimmte Fluoreszenz-Intensität zeigen gemessen. Die Messungen erfolgen nach Standardverfahren laut Angaben des Herstellers mit z.B. einem FACScan Gerät von Becton Dickinson.
2.30 Synthese von offenkettigen und cyclischen Peptiden und Glycopeptiden
Liste verwendeter Abkürzungen

1D, 2D, 3D

ein-, zwei-, dreidimensional

AIDS

acquired immune deficiency syndrome

Acm

Acetamidomethyl

AS

Aminosäure

Boc

t-Butyloxycarbonyl

CD

circular dichroism

COSY

correlated spectroscopy

DCC

Dicyclohexylcarbodiimid

DMF

N,N-Dimethylformamid

DIEA

Diisopropylethylamin

Fmoc

9-Fluorenylmethoxycarbonyl

GlcNAc

N-Acetyl-Glucosamin

HATU

O-(Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphat

TBTU

O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluroniumtetrafluoroborat

HIV

human immunodeficiency virus

HMQC

heteronuclear multiple quantum coherence

MALDI-TOF

matrix assisted laser desorption ionisation – time of flight

MD

molecular dynamics

Mtr

4-Methoxy-2,3,6-trimethylbenzylsulfonyl

NMR

nuclear magnetic resonance

NOE

nuclear Overhauser enhancement

NOESY

nuclear Overhauser and exchange spectroscopy

OtBu

t-Butylester

PAL

5-(Aminomethyl-3,5-dimethoxyphenoxy)-valeriansäure

Pbf

2,2,5,6,7-Pentamethyldihydrobenzofuran-5-sulfonyl

Pmc

2,2,5,7,8-Pentamethylchroman-6-sulfonyl

PND

prinzipiell neutralisierende Domäne

ppm

parts per million

REDAC

redundant dihedral angle constraints

TBTU

O-(Benzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluroniumtetrafluoroborat

THF

Tetrahydrofuran

TFA

Trifluoressigsäure

TOCSY

Total correlated spectroscopy

TIPS

Triisopropylsilan

Trt

Trityl

Herkunft der verwendeten Chemikalien

PerSeptive Biosystems: Fmoc-Ala-COOH, Fmoc-Asn(Trt)-COOH, Fmoc-Asn(OtBu)-COOH, Fmoc-Asp(OtBu)-COOH, Fmoc-Arg(Pbf)-COOH, Fmoc-Cys(Trt)-COOH, Fmoc-Gln(Trt)-COOH, Fmoc-Glu(OtBu)-COOH, Fmoc-Gly-COOH, Fmoc-Ile-COOH, Fmoc-Leu-COOH, Fmoc-Phe-COOH, Fmoc-Thr(tBu)-COOH, Fmoc-Tyr(tBu)-COOH, Fmoc-Ser(tBu)-COOH, Fmoc-PAL-PEG-PS-Harz, DMF, HATU, TBTU, DIEA, Piperidin/DMF (1:4),
Merck: Essigsäureanhydrid, Methanol, Chloroform
Sigma: Trypsin, Fibrinogen (Bovine Plasma), Trifluoressigsäure Boehringer Mannheim: P1-Glycosidase F, Neuraminidase
Fluka: Acetonitril (gradient grade) für HPLC, Methanol (gradient grade) für HPLC, Chloroform (gradient grade) für HPLC_
Aldrich: D₂O, CDCl₃, DMSO-d₆, 99.9%, Triisopropylsilan

2.31 Manuelle Peptidsynthese
Vorarbeiten:
Ein Äquivalent des benötigten Harzes wird für eine Stunde in DMF gequollen.
Zyklus: Die Fmoc-geschützten Aminogruppen werden mit Piperidin/DMF (1:4) entschützt (1 × 10 min), Die Menge an gelöstem Methylenfluoren läßt sich durch Messung der UV-Absorption bei 301 nm (ε = 7950 [J. Eichler et al., Peptide Res. 4 (1991), 296-299; H.G.Chao et al., J. Org. Chem. 58 (1993) 2640-2647]) ermitteln, anschließend wird solange mit DMF gespült, bis die Waschlösung neutral ist. Die Kupplung der Aminosäure erfolgt mit 4 eq des Bausteins Fmoc-AS-COOH, 8 eq DIEA und 8 eq HATU gelöst in DMF (gerade soviel, daß das Harz bedeckt ist). Es folgt ein Acetylierungsschritt mit Ac₂O/ DMF (1:10) für 5 Min., nach dem achtmal mit DMF gewaschen wird.
Man wiederholt diesen Zyklus bis zur Fertigstellung der gewünschten Sequenz und acetyliert den freien N-Terminus des Peptids mit Ac₂O/ DMF (1:10). Das Harz wird mehrfach mit Et₂O gewaschen und getrocknet. Durch Abspaltung mit TFA/H₂O (19:1) für 2 h bei Raumtemperatur erhält man ein Rohprodukt des ungeschützten Peptids als Lösung, diese wird gefriergetrocknet und mittels HPLC gereinigt.
2.32 Automatisierte Peptidsynthese
Die Automatisierte Peptidsynthese erfolgte an einem Peptidsynthesizer (Pioneer Peptide Synthesis System) der Firma PerSeptive Biosystems.
278 mg (50 μmol geschützte Aminofunktionen) Fmoc-PAL-PEG-PS-Harz (0.18 mmol/g) werden in eine Stempelsäule mit Frittenboden eingewogen. Die gewünschte Abfolge an Aminosäuren wird mit Hilfe von Doppelkupplungen (je 4 eq Aminosäurebaustein) angeknüpft. Als Aktivator wird HATU (12 eq) in Gegenwart der Base DIEA (12 eq), bei Reaktionszeiten von 0.5 und 1 h, eingesetzt. Nach jeder Kupplung wird zur Blockierung nicht reagierter Aminofunktionen mit Ac₂O in DMF (1:10) 5 Min. acetyliert. Die Abspaltung der jeweils endständigen Fmoc-Schutzgruppe erfolgt mit Piperidin in DMF (1:4) innerhalb von 10 Min.. Die terminale Fmoc-Schutzgruppe wird, zur Bestimmung der Rohausbeute am Harz, am Peptid belassen. Die Menge an gelöstem Methylenfluoren läßt sich durch Messung der UV-Absorption bei 301 nm (ε = 7950 [J. Eichler et al., Peptide Res. 4 (1991), 296-299; H.G.Chao et al., J. Org. Chem. 58 (1993) 2640-2647 ]) ermitteln. Anschließend wird das Harz 5 Min. mit Ac₂O in DMF (1:10) bedeckt und 5x mit Methanol gewaschen. Man erhält so das am N-Terminus acetylierte, voll geschützte Peptid am Harz.
Verwendete Bausteine: Fmoc-AS-COOH (AS = Ala, Asn(Trt), Asn(Ot-Bu), Asp(OtBu), Arg(Pbf), Cys(Trt), Gln(Trt), Glu(OtBu), Gly, Ile, Leu, Phe, Thr(tBu), Tyr(tBu), Ser(tBu)).
2.33 Einbau des Nγ-Chitobiosylasparaginbausteins in die Peptidkette
Bezogen auf die am Harz verfügbaren freien Aminofunktionen werden 1.2 eq Fmoc-Asn(ß-D-GlcNAc-(1-4)-β-D-GlcNAc)-COOH 10, 1.2 eq TBTU und 1.2 eq DIEA in getrocknetem DMF gelöst und für 12 h am Schüttler auf dem Harz belassen. Zunächst wird der Aktivator mit der Base in DMF gelöst und diese Lösung dann zum Glycosylaminosäurebaustein gegeben. Der aktivierte Baustein sollte schnell auf das Harz gebracht werden, da dieser sonst intramolekular reagiert.
2.34 Einbau des Nγ-Decasaccharidasparaginbausteins in die Peptidkette
Bezogen auf die am Harz verfügbaren freien Aminofunktionen werden 0.5 eq Fmoc-Asn(Decasaccharid)-COOH, 0.5 eq TBTU und 0.5 eq DIEA in getrocknetem DMF gelöst und auf das Harz gebracht. Zunächst wird der Aktivator mit der Base in DMF gelöst und diese Lösung dann zum Glycosylaminosäurebaustein gegeben. Der aktivierte Baustein sollte schnell auf das Harz gebracht werden, da dieser sonst intramolekular reagiert. Nach 2 h werden erneut 0.5 eq TBTU und 0.5 eq DIEA in wenig DMF gelöst und auf das Harz gegeben. Die Lösung wird 12 h am Schüttler auf dem Harz belassen.
2.35 O-Deacetylierung der Glycopeptide an der Festphase
Das an der Festphase befindliche, am Saccharidanteil peracetylierte Glycopeptid wird fünfmal mit abs. Methanol gewaschen und anschließend mit Hydrazinhydrat/abs. Methanol (1:5) deacetyliert. Hierzu wird das Harz mit dem vorgemischten Reagenz bedeckt und für 6 h am Schüttler belassen. Abschließend wird das Produkt an der Festphase fünfmal mit abs. Methanol gewaschen und getrocknet.
2.36 Abspaltung der Peptide bzw. Glycopeptide von der Festphase
Zur Abspaltung der Peptide bzw. Glycopeptide wird das getrocknete Harz, in einer Glasfritte (G2) mit einer Mischung aus TFA/TIPS/-Wasser (95:5:2) bedeckt und für 90 Min. geschüttelt. Die Lösung wird abgesaugt, das Harz 5x mit TFA/TIPS/Wasser (95:5:2) gewaschen und die vereinigten Fraktionen im Vakuum eingeengt.
2.37 Abspaltung der Cys-haltigen Peptide und Zyklisierung einer Disulfidbrücke
Sämtliche Arbeiten werden in einer Stickstoffatmosphäre durchgeführt. Das noch am Harz befindliche, voll geschützte Peptid wird 30 min im Vakuum getrocknet. Die Abspaltlösung (TFA/H2O/TIPS (95:2:5)) wird fünfmal evakuiert und mit Stickstoff gespült. Das Harz wird mit der Abspaltlösung bedeckt und für 90 Min. geschüt telt. Es wird viermal mit TFA gewaschen, die vereinigten Abspalt- und Waschlösungen werden in die 20fache Menge entgasten, –18°C kalten tert-Butylmethylether getropft. Das ausgefallene Rohprodukt läßt sich nach einer Zentrifugation von den hydrophoben, im Ether gelösten Verunreinigungen abtrennen. Man wäscht noch zweimal mit entgastem, –18°C kalten tert-Butylmethylether und löst dann das zu zyklisierende, offenkettige, vollständig entschützte Peptid in entgaster, 0.1 M Ammoniumhydrogencarbonatlösung (1 μmol Peptid/50 mL). Durch diese Lösung wird durch starkes Rühren für 12 h Sauerstoff geleitet. Mit Hilfe einer Ultrafiltration (cut off 1000 D) läßt sich die Lösung entsalzen, von kurzen Abbruchpeptiden abtrennen und auf 50 mL einengen. Das erhaltene Rohprodukt wird gefriergetrocknet und mittels HPLC gereinigt.
2.38 O-Deacetylierung der Glycopeptide in Lösung
2 μmol Glycopeptid werden in 10 mL Methanolatlöung (pH = 11) gelöst, 12 h gerührt, mit TFA neutralisiert und anschließend im Vakuum getrocknet.
2.39 Reinigung der Peptide bzw. Glycopeptide mittels HPLC
Die Reinigung der Peptide bzw. Glycopeptide erfolgte an einer HPLC (Sprint Chromatography Workstation) der Firma PerSeptive Biosystems.
10 – 20 mg des Rohproduktes werden in 1 mL Wasser (0.1% TFA) gelöst, unlösliche Verunreinigungen abfiltriert und das Filtrat in die 2 mL Probenschleife injiziert. Als stationäre Phase dient eine RP18-Phase (analytische Säule: ET 250/4 Nucleosil 100-5 C18; präparative Säule: ET 250/21 Nucleosil 100-5 C18 der Firma Macherey-Nagel), wobei als mobile Phase unterschiedliche Gradienten zwischen Eluent A (95% H₂O/5% Acetonitril/0.1% T-FA) und Eluent B (95% Acetvnitril/5% H₂O/0.1% TFA) verwendet wurden. Die Fraktionen wurden gefriergetrocknet und mittels MALDI-TOF-MS und NMR identifiziert.
2.40 Aufnahme der MALDI-TOF-Spektren
Die Aufnahme der MALDI-TOF-Spektren erfolgte an einem Finnigan MAT VISION 2000 MALDI-TOF-Spektrometer Biflex III der Firma Bruker.
Die Saccharidverbindungen wurden in einer 2,5-Dihydroxybenzoesäure(DHB)-Matrix mit einer Konzentration von 10 pmol/μL, die Peptide in einer Sinapinsäure-Matrix mit einer Konzentration von 1 pmol/μL und die Glycopeptide in einer 3-Hydroxypicolinsäure- oder DHB-Matrix mit einer Konzentration von 10 pmol/μL vermessen.
2.41 Aufnahme und Interpretation der NMR-Spektren
Die Aufnahme der NMR-Spektren erfolgte an einem DRX-500-Spektrometer der Firma Bruker (Larmorfrequenz für ¹H: 499.87 MHz).
Alle Experimente wurden mit einem TXI ¹H-¹³C/¹⁵N-D-Probenkopf für 5 mm NMR-Röhrchen durchgeführt. Die der Peptide und Glycopeptide wurden in H₂O/D₂O (9:1) bei einem pH-Wert von 3.0 bis 3.5 bei 300 K aufgenommen. Sämtliche zweidimensionalen Spektren wurden phasensensitiv durch TPPI (time proportional phase increment) aufgenommen. Bei den H₂O-Experimenten erfolgte die Wasserunterdrückung durch eine Vorsättigung (53 dB) des Resonanzsignals oder in Form einer Watergate-Pulssequenz. Die Kalibrierung der Spektren erfolgte auf das jeweilige Lösungsmittelsignal (H₂O: δ = 4.75 ppm; CDCl₃: δ = 7.28 ppm; DMSO: δ = 2.53 ppm). Der Phasenfehler aller Spektren wurde korrigiert. Die Basislinie aller Spektren wurde anschließend automatisch mit einem Polynom fünften Grades korrigiert.
Die Prozessierung der Spektren erfolgte mit der Software XWINNMR (Version 2.0), während die Auswertung mit dem Programm AURELIA (Version 2.13) der Firma Bruker auf einer O₂-Silicon-Graphics-Workstation durchgeführt wurde.
Die Zuordnung der ¹H-Signale erfolgte mit Hilfe des TOCSY-, NOESY- und HMQC-Experiments, während die ¹³C-chemischen Verschiebungen aus den HMQC-Spektren ermittelt wurden. Die Bestimmung der Kopplungskonstanten erfolgte aus den DQF-COSY-Spektren.
Die sequentielle Zuordnung der Spinsysteme gelang mit Hilfe der NOESY-Experimente.
2.42 Verwendete Software

XWINNMR, Version 2.0, Firma Bruker
AURELIA, Version 2.13, Firma Bruker
DYANA, Version 1.4, P. Güntert und C. Mumenthaler.
SYBYL, Version 6.3, Tripos.
GEGOP, Version 2.7.
MATLAB, Version 5.0, The MathWorks Inc.

2.43 Darstellung des Nγ-Chitobiosylasparaginbausteins 10
Synthese von 2-N-Acetyl-4-(2-N-acetyl-3,4,6-tri-O-acetyl-2-amino-2-desoxy-β-D-glucosyl)-1,3,6-tri-O-acetyl-β-D-glucose (1).
Eine Lösung aus 500 mL Essigsäureanhydrid und 40 mL konz. Schwefelsäure wird auf 53°C temperiert, unter starker KPG-Rührung werden 60 g fein gemahlenes Chitin (141.8 mmol Dimereinheiten) in kleinen Portionen zugegeben, wobei sich die zunächst hellgelbe Lösung tiefbraun verfärbt. Nach einer Reaktionszeit von 3 h wird auf 35°C abgekühlt und unter Einwirkung von Ultraschall 38 h gespalten. Die erkaltete Lösung wird vorsichtig in 800 mL Eiswasser gegeben, mit 750 g Natriumacetat versetzt und für 30 Min. gerührt. Man extrahiert mit Chloroform, wäscht mehrfach zunächst mit ges. Natriumhydrogensulfatlösung, anschließend mit Wasser und trocknet die organische Phase über Natriumsulfat. Das Lösungsmittel wird bei maximal 30°C unter vermindertem Druck entfernt. Eine Auftrennung des Oligomerengemischs erfolgt mit Hilfe einer Mitteldruckpumpe über eine Kieselgelsäule (Laufmittel: CHCl₃/MeOH (100:1) RF-Werte (CHCl₃/MeOH (9:1)):Monomer = 0.69, Dimer = 0.53, Trimer = 0.35). Das Rohprodukt wird aus Ethanol umkristallisiert.
Ausbeute und Charakterisierung: C₂₈H₄₀N₂O₁₇; MW = 676.6 g mol^–1
Es wurden 4.24 g (6.266 mmol) Chitobioseoctaacetat (1) als weiße Kristalle erhalten, was einer Ausbeute von 4% bezogen auf die eingesetzte Menge Dimer im polymeren Chitin entspricht. Die berechnete Molmasse konnte mittels MALDI-TOF-MS bestätigt werden [M+Na]⁺= 699.4.
Synthese von 2-N-Acetyl-4-(2-N-acetyl-2-amino-2-desoxy-β-D-glucosyl)-β-D-glycopyranose (2).
502 mg (0.742 mmol) Chitobioseoctaacetat (1) werden in 100 mL abs. Methanol gelöst und der pH-Wert der Lösung mit frisch hergestellter 1%iger Natriummethanolatlösung auf pH 9 eingestellt. Das Gemisch läßt man bei Raumtemperatur rühren, korrigiert gegebenenfalls den pH-Wert der Lösung und überwacht die Deacetylierung dünnschichtchromatographisch (RF-Wert (Chloroform/Methanol (1:1)) = 0.31). Nach vollständiger Reaktion (ca. 24 h) wird durch Zugabe von Trockeneis neutralisiert. Das Produkt wird über eine Sephadex-Säule (LH 20, Laufmittel Chloroform/-Methanol (1:1)) von den Salzen getrennt, getrocknet und aus Ethanol umkristallisiert.
Ausbeute und Charakterisierung: C₁₆H₂₈N₂O₁₁; MW = 424.4 g mol^–1
Es wurden 263 mg (620 μmol) Chitobiose (2) als weiße Kristalle erhalten, was einer Ausbeute von 84% bezogen auf das eingesetzte Chitobioseoctaacetat (1) entspricht. Die berechnete Molmasse konnte mittels MALDI-TOF-MS bestätigt werden [M+Na]⁺= 447.2.
Synthese von 1-β-Amino-2-N-acetyl-4-(2-N-acetyl-2-amino-2-desoxy-β-D-glucosyl)-β-D-glycopyranose (3).
263 mg (620 μmol) Chitobiose (2) werden in 19 mL gesättigter Ammoniumhydrogencarbonatlösung gelöst. Die Reaktion ist nach 24 h bei 50°C (DC-Kontrolle RF-Wert (EtOAc/MeOH/H₂O (4:3:2)) = 0.52) abgeschlossen. Anschließend wird das Gemisch getrocknet und die Hauptmenge an Ammoniumhydrogencarbonat, mit einer Gelfiltration (Sephadex G 15, 0.1 M Ammoniumhydrogencarbonatlösung) abgetrennt. Anschließende Gefriertrocknung bis zur Gewichtskonstanz liefert das Glycosylamin (3).
Ausbeute und Charakterisierung: C₁₆H₂₉N₃O₁₀; MW = 423.4 g mol^–1
Es wurden 257 mg (608 μmol) (3) als weiße Kristalle erhalten. Was einer Ausbeute von 98% bezogen auf die eingesetzte Chitobiose (2) entspricht. Die berechnete Molmasse konnte mittels MALDI-TOF-MS bestätigt werden [M+Na]⁺= 446.1.
¹H-NMR Daten (s. Tabelle 1), Kopplungskonstanten (s. Tabelle 2) und ¹³C-NMR Daten (s. Tabelle 3).
Synthese von C^α-tert-butyl-N^α-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)-N^α-[1-Amino-2-N-acetyl-4-(2-N-acetyl-3,4,6-tri-O-acetyl-2-amino-2-desoxy-β-D-glucosyl)-3,6-di-O-acetyl-β-D-glycopyranose]-asparagin (4).
1.2 eq (110 mg, 266 μmol) Fmoc-Asp-OtBu, 1.2 eq (85 mg, 266 μmol) TBTU und 1.2 eq (45 μL, 266 μmol) DIEA werden in 1 mL DMF gelöst und für 15 Min. gerührt, diese Lösung wird langsam bei 10°C zu 94 mg (222 μmol) Glycosylamin (3), gelöst in 0.5 mL DMF, getropft. Die Lösung wird 3 h gerührt, mit 50 mL abs. Pyridin/-Ac₂O (3:2) versetzt, 12 h gerührt und anschließend im Vakuum getrocknet. Das Rohprodukt wird dreimal mit 10 mL Toluol kodestilliert und säulenchromatographisch (Laufmittel CHCl₃/MeOH (30:1)) gereinigt (RF-Wert (CHCl₃/MeOH (9:1)) = 0.54).
Ausbeute: Es wurden 185 mg (180 μmol) Fmoc-Asn(β-D-GlcNAc-(1-4)-β-D-GlcNAc)-OtBu (4) als weiße Kristalle erhalten, was einer Ausbeute von 81% bezogen auf das Glycosylamin (3) entspricht.
Charakterisierung: C₄₉H₆₂N₄O₂₀; MW = 1027.0 g μmol^–1
Die berechnete Molmasse konnte mittels MALDI-TOF-MS bestätigt werden [M+Na]⁺= 1040.4. ¹H-NMR Daten (s. Tabelle 1), Kopplungskonstanten (s. Tabelle 2) und ¹³C-NMR Daten (s. Tabelle 3).
Synthese von N^α-(9-fluorenylmethoxycarbonyl)-N^α-[1-Amino-2-N-acetyl-4-(2-N-acetyl-3,4,6-tri-O-acetyl-2-amino-2-desoxy-β-D-glucosyl)-3,6-di-O-acetyl-β-D-glycopyranose]-asparagin (5).
150 mg (146 μmol) Fmoc-Asn(β-D-GlcNAc-(1-4)-β-D-GlcNAc)-OtBu (4) werden in 5 mL TFA/H₂O (19:1) gelöst und für 10 Min. gerührt und anschließend im Vakuum getrocknet.
Ausbeute und Charakterisierung: C₄₅H₅₄N₄O₂₀; MW = 970.0 g mol^–1
Es wurden 142 mg (146 μmol) Fmoc-Asn(β-D-GlcNAc-(1-4)-β-D-GlcNAc)-COOH (5) als weiße Kristalle erhalten, was einer Ausbeute von 100% bezogen auf Fmoc-Asn(β-D-GlcNAc-(1-4)-β-D-GlcNAc)-OtBu (4) entspricht. Die berechnete Molmasse konnte mittels MALDI-TOF-MS bestätigt werden [M+Na]⁺= 994.1. ¹H-NMR Daten (s. Tabelle 1), Kopplungskonstanten (s. Tabelle 2) und ¹³C-NMR Daten (s. Tabelle 3).
Darstellung von Peptiden und Glycopeptiden
Synthese von R-I-H-I-G-P-G-R-A-F (6)
Die Synthese des Peptids 6 erfolgt nach der oben (Abschnitt 2.32 "Automatisierte Peptidsynthese") beschriebenen automatisierten Festphasensynthese. Die Abspaltung der endständigen Fmoc-Schutzgruppe ergibt eine Belegung von 33 μmol. Das Peptid wurde vom Harz abgespalten und mittels HPLC gereinigt (siehe Abschnitt "Reinigung der Peptide bzw. Glycopeptide mittels HPLC"). Der Gradient zwischen Eluent A und Eluent B betrug: 100:0 nach 0 Min., 80:20 nach 5 Min., 65:35 nach 35 Min. und 0:100 nach 45 Min., die Retentionszeit der Verbindung 6beträgt 32.2 Min.
Ausbeute und Charakterisierung: C₅₃H₈₅N₁₉O₁₁; = 1164.4 g mol^–1
Es wurden 6 mg (5 μmol) Decapeptid 6 als weißes Pulver erhalten. Was einer Ausbeute von 10% bezogen auf die Belegung des ein gesetzten Harzes entspricht. Die berechnete Molmasse konnte mittels MALDI-TOF-MS bestätigt werden [M+H]⁺= 1166.0. Die NMR Daten sind in Tabelle 4 dargestellt.
Synthese von T-R-P-S-N-N-T-R-K-S 7
Die Synthese des Peptids 7 erfolgt nach der in Abschnitt 2.32 beschriebenen automatisierten Festphasensynthese. Die Abspaltung der endständigen Fmoc-Schutzgruppe ergibt eine Belegung von 33 μmol. Das Peptid wurde vom Harz abgespalten und mittels HPLC gereinigt (siehe oben) Der Gradient zwischen Eluent A und Eluent B betrug: 100:0 nach 0 Min., 80:20 nach 5 Min., 65:35 nach 35 Min. und 0:100 nach 45 Min., die Retentionszeit der Verbindung 7 beträgt 29.7 Min.
Ausbeute und Charakterisierung: C₄₇H₈₄N₂₀O₁₇; MW = 1201.3 g mol^–1
Es wurden 14 mg (12 μmol) Decapeptid 7 als weißes Pulver erhalten, was einer Ausbeute von 23% bezogen auf die Belegung des eingesetzten Harzes entspricht. Die berechnete Molmasse konnte mittels MALDI-TOF-MS bestätigt werden [M+Na]⁺= 1201.7. Die NMR Daten werden in Tabelle 5 dargestellt.
Synthese von I-H-I-G-P-G-R-A-F-Y-A-T-G 8
Die Synthese des Peptids 8 erfolgt nach der oben beschriebenen automatisierten Festphasensynthese (100 μmol-Ansatz). Die Abspaltung der endständigen Fmoc-Schutzgruppe ergibt eine Belegung von 61 μmol. Nach der Abspaltung des Peptids vom Harz wird dieses mittels HPLC gereinigt (siehe oben). Der Gradient zwischen Eluent A und Eluent B betrug 100:0 nach 0 Min., 80:20 nach 5 Min., 60:40 nach 35 Min. und 0:100 nach 45 Min., die Retensionszeit der Verbindung 8 beträgt 25.0 Min.
Ausbeute und Charakterisierung: C₆₅H₉₇N₁₉O₁₆; MW = 1400.6 g mol^–1
Es wurden 45 mg (32 μmol) Tridecapeptid 8 als weißes Pulver erhalten, was einer Ausbeute von 32% bezogen auf die Belegung des eingesetzten Harzes entspricht. Die berechnete Molmasse konnte mittels MALDI-TOF-MS bestätigt werden [M+Na]⁺= 1401.2. Die NMR-Daten sind in Tabelle 6 dargestellt.
Synthese von E-I-I-G-D-I-R-O-A-H 9
Die Synthese des Peptids 9 erfolgt nach der oben beschriebenen automatisierten Festphasensynthese. Die Abspaltung der endständigen Fmoc-Schutzgruppe ergibt eine Belegung von 24 μmol. Nach der Abspaltung des Peptids vom Harz wird dieses mittels HPLC (siehe oben) gereinigt. Der Gradient zwischen Eluent A und Eluent B betrug 100:0 nach 0 Min., 80:20 nach 5 Min., 60:40 nach 35 Min. und 0:100 nach 45 Min., die Retensionszeit der Verbindung 9 beträgt 33 Min.
Ausbeute und Charakterisierung: C₅₁H₈₅N₁₇O₁₆ MW = 1192.4 g mol^–1
Es wurden 5 mg (4 μmol) Decapeptid 9 als weißes Pulver erhalten, was einer Ausbeute von 8% bezogen auf die Belegung des eingesetzten Harzes entspricht. Die berechnete Molmasse konnte mittels MALDI-TOF-MS bestätigt werden [M+Na]⁺= 1193.9.
Synthese von V-H-L-N-E-S-V 10
Die Synthese des Peptids 10 erfolgt nach der oben beschriebenen automatisierten Festphasensynthese. Die Abspaltung der endständigen Fmoc-Schutzgruppe ergibt eine Belegung von 35 μmol. Das Peptid wurde vom Harz abgespalten und mittels HPLC gereinigt (siehe oben). Der Gradient zwischen Eluent A und Eluent B betrug: 100:0 nach 0 Min., 80:20 nach 5 Min., 50.50 nach 35 Min. und 0:100 nach 45 Min., die Retentionszeit der Verbindung 10 beträgt 31.7 Min.
Ausbeute und Charakterisierung: C₃₆H₅₉N₁₁O₁₂; MW = 837.4 g mol^–1
Es wurden 9 mg (11 μmol) Heptapeptid 10 als weißes Pulver erhalten, was einer Ausbeute von 21% bezogen auf die Belegung des eingesetzten Harzes entspricht. Die NMR-Daten sind in Tabelle 7 dargestellt.
Synthese von V-H-L-N(β-D-GlcNAc-1-4-β-D-GlcNAc)-E-S-V 11
Die Anknüpfung der ersten drei Aminosäuren des Glycopeptids 11 erfolgte nach der oben beschriebenen automatisierten Festphasensynthese. Die Abspaltung der endständigen Fmoc-Schutzgruppe von etwa ¼ des beladenen Harzes ergab eine Belegung mit dem Tripeptid von 7 μmol. Nun wurden 5 eq, 7.1 mg (34.5 μmol) DCC und 5 eq, 4.7 mg (34.5 μmol) HOBT in 1 mL abs. DMF aufgenommen. Diese Lösung wurde zu 1.5 eq 10.0 mg (10.35 μmol) Fmoc-Asn(β-D-GlcNAc-(1-4)-β-D-GlcNAc)-COOH 5 gegeben und auf das Harz pipettiert. Die Kupplungszeit betrug 12 h. Die Abspaltung der endständigen Fmoc-Schutzgruppe ergab eine Belegung von 4 μmol (das entspricht einer Ausbeute für den Glycosylierungsschritt von 54%). Die Anknüpfung der letzten drei Aminosäuren erfolgte nach der oben beschriebenen manuellen Festphasensynthese. Die Abspaltung der endständigen Fmoc-Schutzgruppe ergab eine Belegung von 3 μmol. Das Glycopeptid wurde vom Harz abgespalten, in Lösung mit Methanolat deacetyliert, und mittels HPLC gereinigt (siehe oben). Der Gradient zwischen Eluent A und Eluent B betrug: 100:0 nach 0 Min., 35:65 nach 60 Min. und 0:100 nach 70 Min., die Retentionszeit der Verbindung 11 beträgt 42.2 Min.
Ausbeute und Charakterisierung: C₅₂H₈₆N₁₄O₂₁; MW = 1242.8 g mol^–1
Es wurden 3 mg (2 μmol) glycosyliertes Heptapeptid 11 weißes Pulver erhalten, was einer Ausbeute von 16% bezogen auf die Belegung des eingesetzten Harzes entspricht. Die NMR-Daten sind in Tabelle 8 dargestellt.
Synthese von S-N-N-T-R-K-S-I-H-I-G-P-G-R-A-F 12
Die Synthese des Peptids 12 erfolgte nach der oben beschriebenen automatisierten Festphasensynthese. Die Abspaltung der endständigen Fmoc-Schutzgruppe ergab eine Belegung von 36 μmol. Das Peptid wurde vom Harz abgespalten (siehe oben) und mittels HPLC gereinigt. Der Gradient zwischen Eluent A und Eluent B betrug: 100:0 nach 0 Min., 80:20 nach 5 Min., 60:35 nach 35 Min. und 0:100 nach 45 Min., die Retentionszeit der Verbindung 12 beträgt 32 Min.
Ausbeute und Charakterisierung: C₇₇H₁₂₆N₂₈O₂₂; MW = 1796.0 g mol^–1
27 mg (15 μmol) Peptid 7 weißes Pulver, das entspricht einer Ausbeute von 30% bezogen auf die Belegung des eingesetzten Harzes. Die berechnete Molmasse konnte mittels MALDI-TOF-MS bestätigt werden [M+H]⁺= 1797.8. Die NMR-Daten sind in Tabelle 9 dargestellt.
Synthese von S-N(β-D-GlcNAc-1-4-β-D-GlcNAc)-N-T-R-K-S-I-H-I-G-P-G-R-A-F (13)
Die Anknüpfung der ersten 14 Aminosäuren des Glycopeptids 13 erfolgte nach der oben beschriebenen automatisierten Festphasensynthese. Die Abspaltung der endständigen Fmoc-Schutzgruppe ergab eine Belegung, mit dem Tetradecapeptid von 29 μmol. Die Anknüpfung des Chitobiosyl-bausteins (5) erfolgte mit 1.2 eq 34 mg (35 μmol) Fmoc-Asn(β-D-GlcNAc-(1-4)-β-D-GlcNAc)-COOH 5, 1.2 eq 11 mg (35 μmol) TBTU und 1.2 eq 6 μL (35 μmol) DIEA in 2 mL DMF mit einer Kupplungszeit von 12 h. Die Abspaltung der endständigen Fmoc-Schutzgruppe ergab eine Belegung von 21 μmol (das entspricht einer Ausbeute für den Glycosylierungsschritt von 72%). Die Anknüpfung von Ser erfolgte mit 4 eq 32 mg (84 μmol) Fmoc-Ser(tBu)-COOH, 12 eq 96 mg (252 μmol) HATU und 12 eq 41 μL (252 μmol) DIEA. Die Abspaltung der endständigen Fmoc-Schutzgruppe ergab eine Belegung von 16 μmol. Das Glycopeptid wurde an der Festphase mit Hydrazinhydrat/abs. Methanol deacetyliert, vom Harz abgespalten und mittels HPLC gereinigt (siehe oben). Der Gradient zwischen Eluent A und Eluent B betrug: 100:0 nach 0 Min., 80:20 nach 5 Min., 60:35 nach 35 Min. und 0:100 nach 45 Min., die Retentionszeit der Verbindung 13 beträgt 29 Min.
Ausbeute und Charakterisierung: C₉₃H₁₅₃N₃₁O₃₁ MW = 2201.4 g mol^–1
Es wurden 23 mg (10 μmol) Glycopeptid 13 als weißes Pulver erhalten, was einer Ausbeute von 20% bezogen auf die Belegung des eingesetzten Harzes entspricht. Die berechnete Molmasse konnte mittels MALDI-TOF-MS bestätigt werden [M+H]⁺= 2201.6. Die NMR-Daten sind in Tabelle 10 dargestellt.
Synthese von T-T-R-P-S-N-N-T-R-K-S-I-H-I-G-P-G-R-A-F-Y-A-T-G-E-I-I-G-D-I-R-O-A-H-T (14)
Die Synthese des Peptids 14 erfolgte nach der oben beschriebenen automatisierten Festphasensynthese. Die Abspaltung der endständigen Fmoc-Schutzgruppe ergab eine Belegung von 32 μmol. Das Peptid wurde vom Harz abgespalten (siehe oben) und mittels HPLC gereinigt. Der Gradient zwischen Eluent A und Eluent B betrug: 100:0 nach 0 Min., 80:20 nach 5 Min., 60:35 nach 45 Min. und 0:100 nach 55 Min., die Retentionszeit der Verbindung 14 beträgt 36 Min.
Ausbeute und Charakterisierung: C₁₆₇H₂₇₀N₅₆O₅₁; MW = 3878.4 g mol^–1
21 mg (5 μmol) offenkettige V3-Loop 14 als weißes Pulver, das entspricht einer Ausbeute von 10% bezogen auf die Belegung des eingesetzten Harzes. MALDI-TOF [M+H]⁺= 3879.8. Die NMR-Daten sind in Tabelle 11 dargestellt.
Synthese von C-T-R-P-S-N-N-T-R-K-S-I-H-I-G-P-G-R-A-F-Y-A-T-G-E-I-I-G-D-I-R-O-A-H-C (15)
Die Synthese des Peptids 15 erfolgte nach der oben beschriebenen automatisierten Festphasensynthese. Die Abspaltung der endständigen Fmoc-Schutzgruppe ergab eine Belegung von 29 μmol. Das Peptid wurde vom Harz abgespalten, unter Ausschluß von Sauerstoff zyklisiert (siehe oben) und mittels HPLC gereinigt. Der Gradient zwischen Eluent A und Eluent B betrug: 100:0 nach 0 Min., 80:20 nach 5 Min., 60:35 nach 45 Min. und 0:100 nach 55 Min., die Retentionszeit der Verbindung 15 beträgt 32 Min.
Ausbeute und Charakterisierung: C₁₆₅H₂₆₄N₅₆O₄₉S₂; MW = 3880.4 g mol^–1
Es wurden 18 mg (5 μmol) zyklisierte V3-Loop 15 als weißes Pulver erhalten, was einer Ausbeute von 10% bezogen auf die Belegung des eingesetzten Harzes entspricht. Die berechnete Molmasse konnte mittels MALDI-TOF-MS bestätigt werden M⁺ = 3881.3. Die NMR-Daten sind in Tabelle 12 dargestellt.
Synthese von C-T-R-P-S-N(β-D-GlcNAc-1-4-β-D-GlcNAc)-N-T-R-K-S-I-H-I-G-P-G-R-A-F-Y-A-T-G-E-I-I-G-D-I-R-O-A-H-C (16)
Die Anknüpfung der ersten 29 Aminosäuren des Glycopeptids 16 erfolgte nach der oben beschriebenen automatisierten Festphasensynthese (40 μmol Ansatz, Dreifachkupplungen 0.5, 1 und 2 h). Die Abspaltung der endständigen Fmoc-Schutzgruppe ergab eine Belegung mit dem Nonaeicosapeptid von 26 μmol. Die Anknüpfung des Chitobiosylbausteins erfolgte mit 1.2 eq 30 mg (31 μmol) Fmoc-Asn(β-D-GlcNAc-(1-4)-β-D-GlcNAc)-COOH (5), 1.2 eq 10 mg (31 μmol) TBTU und 1.2 eq 5 μL (31 μmol) DIEA in 2 mL DMF mit einer Kupplungszeit von 12 h. Die Abspaltung der endständigen Fmoc-Schutzgruppe ergab eine Belegung von 20 μmol (das entspricht einer Ausbeute für den Glycosylierungsschritt von 77%). Die Anknüpfung der restlichen 5 Aminosäuren erfolgte automatisiert jeweils mit Dreifachkupplungen 0.5, 1 und 2 h, 4 eq (80 μmol) Fmoc-AS-COOH, 12 eq (240 μmol) HATU und 12 eq (240 μmol) DIEA. Die Abspaltung der endständigen Fmoc-Schutzgruppe ergab eine Belegung von 16 μmol. Das Glycopeptid wurde an der Festphase mit Hydrazinhydrat/abs. Methanol deacetyliert, vom Harz abgespalten, unter Ausschluß von Sauerstoff zyklisiert (siehe oben) und mittels HPLC gereinigt. Der Gradient zwischen Eluent A und Eluent B betrug 100:0 nach 0 Min., 80:20 nach 5 Min., 60:35 nach 45 Min. und 0:100 nach 55 Min., die Retentionszeit der Verbindung 16 beträgt 36 Min.
Ausbeute und Charakterisierung: C₁₈₁H₂₉₃N₅₉O₅₈S₂; MW = 4285.8 g mol^–1
Es wurden 17 mg (4 μmol) glycosylierte V3-Loop 16 als weißes Pulver erhalten, was einer Ausbeute von 10% bezogen auf die Belegung des eingesetzten Harzes entspricht. Die berechnete Molmasse konnte mittels MALDI-TOF-MS bestätigt werden [M+H]⁺= 4287.9. Die NMR-Daten sind in Tabelle 13 dargestellt.
Liste der im Rahmen der vorliegenden Erfindung synthetisierten Peptide und Glycopeptides
Peptide:

R-I-H-I-G-P-G-R-A-F (SEQ ID NO: 15)
T-R-P-S-N-N-T-R-K-S (SEQ ID NO: 16)
I-H-I-G-P-G-R-A-F-Y-A-T-G (SEQ ID NO: 17)
E-I-I-G-D-I-R-Q-A-H (SEQ ID NO: 18)
V-H-L-N-E-S-V (SEQ ID NO: 19)
S-N-N-T-R-K-S-I-H-I-G-P-G-R-A-F (SEQ ID NO: 20)
T-T-R-P-S-N-N-T-R-K-S-I-H-I-G-P-G-R-A-F-Y-A-T-G-E-I-I-G-D-I-R-Q A-H-T (SEQ ID NO: 10)
cyclo-C-T-R-P-S-N-N-T-R-K-S-I-H-I-G-P-G-R-A-F-Y-A-T-G-E-I-I-G-D-I-R-Q-A-H-C (SEQ ID NO: 9)

Glycopeptide:

V-H-L-N(β-D-GlcNAc-(1-4)-β-D-GlcNAc)-E-S-V (SEQ ID NO: 19)
S-N(β-D-GlcNAc-(1-4)-β-D-GlcNAc)-N-T-R-K-S-I-H-I-G-P-G-R-A-F (SEQ ID NO: 20)
cyclo C-T-R-P-S-N(β-D-GlcNAc-(1-4)-β-D-GlcNAc)-N-T-R-K-S-I-H-I-G-P-G-R-A-F-Y-A-T-G-E-I-I-G-D-I-R-Q-A-H-C (SEQ ID NO: 9)
cyclo C-T-R-P-S-N(Komplex-Typ-Decasaccharid)-N-T-R-K-S-I-H-I-G-P-G-R-A-F-Y-A-T-G-E-I-I-G-D-I-R-Q-A-H-C (SEQ ID NO: 9)

2.31 Biacore-Messung
HI5 Zellen wurden aus einem bei –80°C eingefrorenen Zellpellet in Gibco Medium aufgetaut und auf 37°C gebracht, wonach sie dreimal mit PBS Puffer gewaschen wurden. Die Zellen wurden auf Konzentrationen von 36, 360, 1800 und 3600 Zellen/μl in PBS Puffer gebracht. Der F1 Chip der Firma Biacore wurde durch Kupplung mit N-Hydroxysuccimid (0.05 M) und Ethyl-diisopropylcarbodiimid (0.2 M) für 30 min in der Flusszelle mit einer Flussrate von 5 μl/min in 150 mM PBS Puffer aktiviert. Die Peptide und das Protein wurden dann in 50 μg/ml in 10mM Natriumacetat bei pH 5.5 mit der aktivierten Oberfläche bei einer Flussrate von 2 μl/min zur Reaktion gebracht. Die Kontaktzeiten wurden von 5 bis 40 Minuten variiert, um die Belegungsdichte zu kontrollieren. Nachfolgend wurden freie aktivierte Säurefunktionen mit Ethanolamin (1 M) bei pH 8.5 und einer Flussrate von 5 μl/min blockiert. Die HI5 Zellen wurden direkt vor der Injektion resuspendiert. Jede Injektion wurde für 600 Sekunden registriert. Die folgende Dissoziationsphase mit PBS Puffer betrug 120 sec. Nachfolgend wurde der Chip mit 0.1 mM SDS in PBS Puffer mit einer Flussrate von 20 μl/min für 15 sec regeneriert.
NMR-Daten der Peptide und Gtycopeptide:
Tabelle 1: ¹H-NMR-Daten der Verbindungen 1 bis 5 angegeben in [ppm]. Die chemischen Verschiebungen der Acetatgruppen lagen im Bereich von 1.900 bis 2.100 ppm.
Tabelle 2: Kopplungskonstanten der Verbindungen 2 bis 5 angegeben in Hz.
Tabelle 3: ¹³C-NMR-Daten der Verbindungen 1 bis 5 angegeben in ppm.
Tabelle 4: ¹H-Chemische Verschiebung der Verbindung 6 in [ppm].
Tabelle 5: ¹H-Chemische Verschiebung der Verbindung 7 in [ppm].
Tabelle 6: ¹H-Chemische Verschiebung der Verbindung 8 in [ppm].
Tabelle 7: ¹H-Chemische Verschiebung der Verbindung 10 in (ppm] mit den Kopplungskonstanten J(NH/H_α) in runden Klammern in (Hz], gemessen in DMSO.
Tabelle 8: ¹H Chemische Verschiebung der Verbindung 11 in [ppm] mit den Kopplungskonstanten J(NH/H_α) in runden Klammern in [Hz]. Mit pr. gekennzeichnete Protonen waren durch die Wasserunterdrückung unsichtbar.
Tabelle 9: ¹H-Chemische Verschiebung der Verbindung 12 in [ppm].
Tabelle 10: ¹H-Chemische Verschiebung der Verbindung 13 in [ppm].
Tabelle 11: ¹H-Chemische Verschiebung der Verbindung 14 in [ppm] mit den Kopplungskonstanten J(NH/H_α) in runden Klammern in [Hz].
Tabelle 12: ¹H-Chemische Verschiebung der Verbindung 15 in [ppm] mit den Kopplungskonstanten J(NH/H_α) in runden Klammern in [Hz].
Tabelle 13: ¹H-Chemische Verschiebung der Verbindung 16 in [ppm] mit den Kopplungskonstanten J(NH/H_α) in runden Klammern in [Hz].
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, die die Wechselwirkung des gp120-Proteins von HIV oder Teilen desselben mit dem Korezeptor CXCR4, CCR5 und/oder einem anderen 7-Helix-Transmembranrezeptor für HIV beeinflussen, dadurch gekennzeichnet, daß man a) Liganden für den Korezeptor CXCR4, CCR5 und/oder einen anderen 7-Helix-Transmembranrezeptor für HIV an einer Goldoberfläche immobilisiert, man b) suspendierte Zellen, die CXCR4, CCR5 und/oder einen anderen 7-Helix-Transmembranrezeptor für HIV exprimieren, mit diesen Liganden in Kontakt bringt, man c) die Hemmung der Bindung von Ligand und Korezeptor durch die Substanz durch Messung des Brechungsindex mit Hilfe der Plasmonen Resonanz bestimmt, man in einem weiteren Ansatz die Stufen a) bis c) wiederholt (Stufen a') bis c')), wobei man vor Stufe b') die Zellen mit der zu testenden Substanz vorinkubiert, bevor man sie mit den Liganden in Kontakt bringt, wobei die verwendeten Liganden offenkettige oder cyclische Peptide oder Glycopeptide sind, die die Aminosäuresequenz eines HIV-1 V3 Loop einschließlich der flankierenden Cysteine aufweisen, und wobei die Substanz die Wechselwirkung hemmt oder beeinträchtigt, wenn der in Stufe c') gemessene Brechungsindex niedriger ist als der in Stufe c) gemessene Brechungsindex.
Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, die Wechselwirkung des gp120-Proteins von HIV oder Teilen desselben mit dem Korezeptor CXCR4, CCR5 und/oder einem anderen 7-Helix-Transmembranrezeptor für HIV beeinflussen, dadurch gekennzeichnet, daß man a) Liganden für den Korezeptor CXCR4, CCR5 und/oder einen anderen 7-Helix-Transmembranrezeptor für HIV an einer Goldoberfläche immobilisiert, man b) suspendierte Zellen, die CXCR4, CCR5 und/oder einen anderen 7-Helix-Transmembranrezeptor für HIV exprimieren, mit diesen Liganden in Kontakt bringt, man c) die Hemmung der Bindung von Ligand und Korezeptor durch die Substanz durch Messung des Brechungsindex mit Hilfe der Plasmonen-Resonanz bestimmt, man in einem weiteren Ansatz die Stufen a) bis c) wiederholt (Stufen a') bis c')), wobei man vor Stufe b') die an der Goldoberfläche immobilisierten Liganden mit der zu testenden Substanz in Kontakt bringt und man vor Stufe b') den Brechungsindex mißt, wobei die verwendeten Liganden offenkettige oder cyclische Peptide oder Glycopeptide sind, die die Aminosäuresequenz eines HIV-1 V3 Loop einschließlich der flankierenden Cysteine aufweisen, und wobei die Substanz die Wechselwirkung hemmt oder beeinträchtigt, wenn i) der in Stufe c') gemessene Brechungsindex niedriger ist als der, der in Stufe c) gemessen wurde, wenn der Masseneffekt der Testsubstanz größer als der der Zellen ist oder ii) wenn der in Stufe c') gemessene Brechungsindex höher ist als der, der in Stufe c) gemessen wurde, wenn der Massen effekt der Testsubstanz kleiner als der der Zellen ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man zunächst die Stufen a') bis c') und man erst anschließend die Stufen a) bis c) durchführt.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Liganden an eine Dextranmatrix gebunden sind, die auf der Oberfläche einer Goldfolie aufgebracht ist.
Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Dextranmatrix Carboxyethylgruppen enthält, an die die Liganden gebunden sind.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß 20 fmol bis 300 fmol Peptid oder Glycopeptid pro mm² immobilisiert sind.
Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß 88 fmol pro cm² immobilisiert sind.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die suspendierten Zellen in einer Dichte von 36 bis 3600 Zellen/μl vorliegen.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen aus der Gruppe bestehend aus T-Zellen, Makrophagen, GHOST Hi5 Zellen, GHOST-CCR5 Zellen, GHOST-CXCR4 Zellen, U87-CCR5 Zellen, U87-CXCR4 Zellen und HOS-CD4 Zellen ausgewählt sind.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Liganden aus der Gruppe bestehend aus R-I-H-I-G-P-G-R-A-F (SEQ ID NO: 15), T-R-P-S-N-N-T-R-K-S (SEQ ID NO: 16), I-H-I-G-P-G-R-A-F-Y-A-T-G (SEQ ID NO: 17), E-I-I-G-D-I-R-Q-A-H (SEQ ID NO: 18), V-H-L-N-E-S-V (SEQ ID NO: 19), S-N-N-T-R-K-S-I-H-I-G-P-G-R-A-F (SEQ ID NO: 20), T-T-R-P-S-N-N-T-R-K-S-I-H-I-G-P-G-R-A-F-Y-A-T-G-E-I-I-G-D-I-R-Q A-H-T (SEQ ID NO: 10), A-D-S-G-E-G-D-F-L-A-E-G-G-G-V-R (SEQ ID NO: 11), cyclo-C-T-R-P-S-N-N-T-R-K-S-I-H-I-G-P-G-R-A-F-Y-A-T-G-E-I-I-G-D-I-R-Q-A-H-C (SEQ ID NO: 9), V-H-L-N(β-D-GlcNAc-(1-4)-β-D-GlcNAc)-E-5-V (SEQ ID NO: 19), S-N(β-D-GlcNAc-(1-4)-β-D-GlcNAc)-N-T-R-K-S-I-H-I-G-P-G-R-A-F (SEQ ID NO: 20), cyclo C-T-R-P-S-N(β-D-GlcNAc-(1-4)-β-D-GlcNAc)-N-T-R-K-S-I-H-I-G-P-G-R-A-F-Y-A-T-G-E-I-I-G-D-I-R-Q-A-H-C (SEQ ID NO: 9) und cyclo C-T-R-P-S-N(Komplex-Typ-Decasaccharid)-N-T-R-K-S-I-H-I-G-P-G-R-A-F-Y-A-T-G-E-I-I-G-D-I-R-Q-A-H-C (SEQ ID NO: 9) ausgewählt sind.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß man zuvor eine Vorselektion der zu identifizierenden Substanzen durchführt, in dem man eine Durchflußzytometrie mit Zellen, die CXCR4, CCR5 und/oder einen anderen 7-Helix-Transmembranrezeptor für HIV exprimieren, und einem Fusionsprotein, das aus einem Peptid mit der Aminosäuresequenz eines HIV-1 V3 Loop oder einem Fragment desselben einschließlich der flankierenden Cysteine mit einem Trägerprotein besteht, durchführt, wobei man die Bindung des Fusionsproteins an die Zellen mit einem anti-Trägerprotein-Antikörper, der mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert ist, nachweist, wobei man die Durchflußzytometrie a) in Gegenwart und b) in Abwesenheit der zu testenden Substanz durchführt, wobei die Verringerung der Intensität des Fluoreszenzsignals in Messung b) gegenüber Messung a) auf eine Hemmung der Bindung zwischen dem Fusionsprotein und den Zellen hinweist.
Verfahren zur Identifizierung von Substanzen, die die Wechselwirkung des gp120-Proteins von HIV oder Teilen desselben mit dem Korezeptor CXCR4, CCR5 und/oder einem anderen 7-Helix-Transmembranrezeptor für HIV beeinflussen, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Durchflußzytometrie mit Zellen, die CXCR4, CCR5 und/oder einem anderen 7-Helix-Transmembranrezeptor für HIV exprimieren, und einem Fusionsprotein, das aus einem Peptid mit der Aminosäuresequenz eines HIV-1 V3 Loop oder einem Fragment desselben einschließlich der flankierenden Cysteine mit einem Trägerprotein besteht, durchführt, wobei man die Bindung des Fusionsproteins an die Zellen mit einem anti-Trägerprotein-Antikörper, der mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert ist, nachweist, wobei man die Durchflußzytometrie a) in Gegenwart und b) in Abwesenheit der zu testenden Substanz durchführt, wobei die Verringerung der Intensität des Fluoreszenzsignals in Messung b) gegenüber Messung a) auf eine Hemmung der Bindung zwischen dem Fusionsprotein und den Zellen hinweist.
Verfahren nach Anspruch 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Zellen aus der Gruppe bestehend aus T-Zellen, Makrophagen, GHOST Hi5 Zellen, GHOST-CCR5 Zellen, GHOST-CXCR4 Zellen, U87-CCR5 Zellen, U87-CXCR4 Zellen und HOS-CD4 Zellen ausgewählt sind.
Verfahren zur Identifizierung von Substanzen zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung von HIV-Infektionen, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 13 durchführt, wobei eine nach diesem Verfahren identifizierte Substanz zur prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlung von HIV-Infektionen geeignet ist, wenn sie die in Anspruch 1 bis 13 genannte Wechselwirkung beeinträchtigt oder hemmt.
Verwendung des Verfahrens nach den Ansprüchen 1 bis 13 zur Identifizierung von Substanzen zur Prophylaxe und/oder Therapie von HIV-Infektionen.
Peptid mit einer der in SEQ ID NO: 3, 6, 11-14 und 19 dargestellten Aminosäuresequenzen oder kodiert durch die in SEQ ID NO: 4 und 5 dargestellten Nukleinsäuresequenzen.
Peptid nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß es glykosyliert ist.
Peptid nach den Ansprüchen 16 und 17, dadurch gekennzeichnet, daß es offenkettig oder cyclisiert ist.
Kit zur Durchführung des Verfahrens nach den Ansprüchen 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß es lineare V3-Loop Peptide und/oder cyclische V3-Loop Peptide dieser V3-Loops mit und/oder ohne Glycosylierung an der Aminosäure Asparagin, Position 299 (bezogen auf HIV HL4-3 gp120 Sequenz) enthält.
Kit zur Durchführung des Verfahrens nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß es zusätzlich zum Kit nach Anspruch 19 V3-Loop Fusionsproteine, Inhibitoren der Wechselwirkung zwischen gp120 und den Korezeptoren als Kontrolle, und/oder Antiseren gegen gp120 enthält.