DE69423409T2 - System zur Exprimierung von dem Lck Peptid - Google Patents
System zur Exprimierung von dem Lck PeptidInfo
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Description
- Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren zur Exprimierung von Proteinen, und Expressionsvektoren und Wirtszellen, die dafür verwendet werden.
- Das Produkt des Ick-Gens, p56Ick, ist ein Mitglied der src-Familie von Protein-Tyrosin- Kinasen. Cooper, J. A. (1990) in Peptides and Protein Phosphorylation (Kemps, B. E., ed) pp 85-113, CRC Press, Boca Raton, FL. Das Ick-Protein wird normalerweise in T-Lymphocyten und natürlichen Killerzellen exprimiert, wo es wahrscheinlich eine Reihe von Funktionen erfüllt, die sich auf Signaltransduktion durch Ligandenbindung an ausgewählte Oberflächenproteine beziehen. Bolen J. A., und Veillette, A. (1989) Trends Biochem. Sci. 14, 404-407; Rudd, C. E. (1990) Immunol. Today 11, 400-406. In T-Zellen bildet p56Ick einen nicht-kovalenten Komplex mit CD4 und CD8a. Veillette, A., Bookman, M. A., Horak, E. M., und Bolen J. A. (1988). Aus diesem Grund glaubt man, dass p56Ick bei der Übertragung von Signalen hilft, die vom T-Zell-Antigen-Rezeptor ausgehen durch Ligierung von CD4 oder CD8 an nicht-polymorphe Deteminanten auf "major histocompatibility"-Molekülen, die Antigen tragen, Shaw, A. S., Chalupny, J., Whitney, J. A., Hammond, C., Amrein, K. E., Kavathas, P., Sefton, B. M., und Rose, J. K., (1990) Mol. Cell. Biol. 10, 1853-1862; Doyle, C., und Strominger, J. L. (1987) Nature 330, 256-259; Norment, A. M., Salter, R. D., Parham, P., Engelhard, V. H., und Littman, DR. (1988) Nature 336, 79-81. Kürzlich konnte gezeigt werden, dass p56Ick eine Signal-Komponente des Interleukin-2-Rezeptors mit hoher Affinität ist. Hatakeyama, M., Kono, T., Kobayashi, N., Kawahara, A., Levin, S. D., Perlmutter, R. M., und Tanaguchi, T. (1991) Science 252, 1523-1528.
- Ein besseres Verständnis der Struktur und Regulation von p56Ick und ähnlichen Proteinen würde klar beitragen zu unserem Wissen von frühen Vorgängen bei der Signaltransduktion und eine Quelle von großen Mengen an gereinigtem p56Ick wäre von Nutzen. Während frühe Analysen der Funktion von p56Ick durch Antikörper gegen dieses Protein stark vereinfacht wurden, wurde die Reinigung über Immunoaffinität durch das Fehlen einer reichlichen Quelle des Enzyms verhindert. Diese Schwierigkeit wurde zum Teil überwunden durch Baculovirus-Expressionssysteme. Summers, M. D., und Smith, G. E. (1987). A Manual for baculovirus vectors and insect cell culture procedures, Texas A&M bulletin No. 1555, (College Station, Texas Agricultural Experimental Station and Texas A&M University), 10-39. Neuere Untersuchungen unter Verwendung eines Baculovirus-Expressionssystemes berichten von einer signifikanten Reinigung von p56Ick bei Verwendung konventioneller chromatographischer Methoden. Ramer, SE., Winkler, D. G., Carrera, A., Roberts, T. M., and Walsh, C. T. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88, 6254-6258; Watts, J. D., Wilson, G. M., Ettehadieh, E., Clark-Lewis, L, Kubanek, C., Astell, C. R., Marth, J. D., und Aebersold, R., (1991) J. Biol. Chem. 267, 901-907. Während das Ergebnis dieser Methode gereinigtes Enzym ist, ist die Reinigung des Enzyms über mehrere Säulen teuer, zeitaufwendig und verlangt große Mengen an Ausgangsmaterial.
- Glutathion-s-Transferase (Gst) ist ein Protein, von dem wohlbekannt ist, dass es an Glutathion bindet (Smith, D. B., und Johnson, K. S. (1988) Gene 67, 31-40). Glutathionharz kann für die Säulenchromatographie verwendet werden. Die ober erwähnten Baculovirus- Expressionssysteme verwenden jedoch kein Gst.
- Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Exprimierung isolierter Formen des Lck-Proteins und Expressionsvektoren und Wirtszellen, die für diese Verfahren von Nutzen sind. Insbesondere betrifft diese Erfindung einen Expressionsvektor, der umfasst:
- (a) einen ersten codierenden Bereich, der ein Polypeptid codiert, das an Glutathion binden kann, funktionell verknüpft mit einem Promotor
- (b) einen zweiten codierenden Bereich, der das Lck-Protein codiert, im Leseraster mit dem ersten codierenden Bereich, und
- (c) mindestens eine Restriktionsstelle zwischen den ersten und zweiten codierenden Bereichen;
- wobei die Expression des Vektors ein Fusionsprotein der ersten und zweiten codierenden Bereiche ergibt. Von Baculoviren abgeleitete Vektoren werden bevorzugt.
- Weiterhin betrifft diese Erfindung eine Wirtszelle, die einen solchen Vektor enthält. Die bevorzugte Wirtszelle ist eine Spodoptera frugiperda-Zelle, insbesondere eine Sf9-Zelle, obwohl auch andere Wirtszellen geeignet sind (siehe weiter unten).
- Solche Vektoren und Wirtszellen sind von Nutzen in einem Verfahren zur Exprimierung des Lck-Proteins in isolierter Form, welches umfasst:
- (a) die Behandlung solcher Wirtszellen unter Bedingungen, die die Expression des Vektors erlauben, wobei ein Fusionsprotein der ersten und zweiten codierenden Bereiche exprimiert wird,
- (b) Aussetzen der Proteine von der Wirtszelle einem Glutathionharz, wobei das Fusionsprotein an das Harz binden wird; und
- (c) Abspalten des Expressionsprodukts des zweiten codierenden Bereichs von dem harzgebundenen Fusionsprotein.
- Weiterhin betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Expression einer Nucleinsäuresequenz, die das Lck-Protein codiert, welches umfasst:
- (a) Insertion der Nucleinsäuresequenz in einen Baculovirus-Expressionsvektor im Leseraster mit einem ersten codierenden Bereich für ein Polypeptid, das an Glutathion binden kann, wobei der erste codierende Bereich funktionell mit einem Promotor verknüpft ist;
- (b) Einbringen des Vektors in eine Wirtszelle,
- (c) Behandlung der Wirtszelle unter Bedingungen, die die Expression des Vektors erlauben, wobei ein Fusionsprotein des ersten codierenden Bereichs und der in Schritt (a) inserierten Sequenz exprimiert wird;
- (d) Aussetzen der Proteine von der Wirtszelle einem Glutathionharz, wobei das Fusionsprotein an das Harz binden wird; und
- (e) Behandlung des gebundenen Fusionsproteins mit einer Protease, um das Expressionsprodukt der Nucleinsäuresequenz von dem Harz freizusetzen.
- Für den ersten codierenden Bereich bevorzugen die Erfinder eine Sequenz, die für Glutathion-s-Transferase codiert (Nucleotid-SEQ. ID. NO.: 1; Aminosäure-SEQ. ID. NO.: 2) oder ein Fragment davon, das an Glutathion binden kann. Dieses System kombiniert die Expression von fremden Proteinen auf hohem Niveau mit Baculovirus-Vektoren (z. B. in Sf9- Zellen) mit der Fähigkeit von Gst-Fusionsproteinen, an Glutathionharz zu binden. Behandlung des Glutathion-bindenden Fusionsproteins mit einer proteolytischen Substanz wie Thrombin kann so das gewünschte Protein von dem Glutathion-bindenden Teil des Fusionsproteins freisetzen. Der Glutathion-bindenden Teil bleibt an das Harz gebunden und dadurch wird das gewünschte Protein gereinigt.
- Dieses Expressionssystem offenbart Vorteile gegenüber anderen Systemen, weil es dem Praktiker erlaubt (1) große Mengen an Protein herzustellen, (2) signifikante Mengen von aktivem Protein mit einem einzigen Chromatographieschritt zu reinigen, (3) einen weiten Bereich an Extraktionsbedingungen zu verwenden, einschließlich nicht-denaturierender Detergentien, um die Proteinfunktion aufrechtzuerhalten, (4) gegen Gst gerichtete Antikörper zu verwenden, was das Durchmustern von rekombinanten Baculoviren erlaubt, die clonierte Sequenzen exprimieren, gegen die keine Antikörper gebildet wurden, oder Proteine, deren Funktion nicht gemessen werden kann, (5) eine vielfache Clonierungsstelle mit vielen Restriktionsstellen für bequeme Ligierung zu verwenden, und (6) Thrombin zu verwenden und/oder zu studieren, weil es eine Thrombin-Spaltstelle beinhaltet.
- Die folgenden Definitionen finden Anwendung auf Ausdrücke, wie sie im Verlauf dieser Beschreibung verwendet werden, außer anders beschränkt in speziellen Fällen.
- Der Ausdruck "Fusionsprotein" bezieht sich auf ein Protein oder Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz hat, die Anteile hat, die der Aminosäuresequenz von zwei oder mehreren Proteinen entspricht. Die Sequenzen von zwei oder mehreren Proteinen können vollständig oder partiell (d. h. Fragmente) von den Proteinen sein. Solche Fusionsproteine können auch verknüpfende Bereiche von Aminosäuren zwischen den Anteilen haben, die denen der Proteine entsprechen. Solche Fusionsproteine können mit rekombinanten Verfahren hergestellt werden, wobei die entsprechenden Nucleinsäuren durch Behandlung mit Nucleasen und Ligasen verknüpft und in Expressionsvektoren eingebracht werden. Die Herstellung der Fusionsprotein wird grundsätzlich so verstanden, dass sie von Durchschnittsfachleuten durchgeführt wird.
- Der Satz "Polypeptid, das in der Lage ist, an Glutathion zu binden" bezieht sich auf Proteine, Proteinfragmente und synthetische Polypeptide, die in der Lage sind, an Glutathion zu binden. Beispiele umfassen Glutathion-s-Transferase und Fragmente davon. Geeignete Fragmente können durch Gen-Amplifikation unter Verwendung von 5'- und 3'-Primern vor der Translation oder durch proteolytische Spaltung (siehe Tabelle 1) nach der Translation hergestellt werden.
- Der Ausdruck "codierende Region" bezieht sich auf einen offenes Leseraster; i. e., ein Teil der Nucleinsäure hat eine Sequenz, die translatiert würde, um eine Sequenz von Aminosäuren zu bilden. Der Ausdruck "codierende Region" umfasst Sequenzen von natürlich vorkommenden Proteinen ebenso wie Sequenzen, die sich aus Modifikationen (Insertionen, Deletionen, Mutationen, Spaltungen) ergeben, die mit rekombinanten Verfahren erhalten werden.
- Der Ausdruck "verknüpfende Region" bezieht sich auf eine Sequenz von Aminosäuren zwischen codierenden Bereichen von verschiedenen Quellen in einem Fusionsprotein. Typischerweise codieren verknüpfende Regionen für Stellen, die von Proteasen erkannt werden und die deshalb zulassen, dass die Expressionsprodukte des codierenden Bereichs voneinander getrennt werden können.
- Der Satz "funktionell verknüpft mit einem Promotor" bedeutet, dass der Promotor in der Lage ist, die Expression des verknüpften codierenden Bereichs zu steuern. Codierende Bereiche für das Fusionsprotein können auch mit anderen Steuerungselementen, wie Verstärkern, funktionell verknüpft sein.
- Die bevorzugte Ausführungsform verwendet eine Gst-Sequenz innerhalb des kommerziell erhältlichen Expressionsvektors pGEX-2T. Diese Sequenz wird von Schistosoma japonicum abgeleitet. Eine Reihe von Arten sind bekannt, die aktive Isoformen von Gst herstellen, die alle in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.
- Codierende Bereiche für das Fusionsprotein können in einen Expressionsvektor nach Verfahren eingesetzt werden, die dem Durchschnittsfachmann wohlbekannt sind. Geeignete Expressionsvektoren können nach bekannten rekombinanten DNA-Verfahren hergestellt werden, von denen viele in Sambrook et al., Molecular Cloning; A Laboratory Manual. Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) beschrieben sind.
- Geeignete Expressionsvektoren gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen einen codierenden Bereich für ein Polypeptid, das in der Lage ist, an Glutathion zu binden, zusammen mit einer Sequenz für das zu isolierende Lck-Protein im Leseraster. Der codierende Bereich für das zu isolierende Lck-Protein kann stromaufwärts oder stromabwärts von dem codierenden Bereich für das Glutathion-bindende Polypeptid liegen. Bevorzugt werden Expressionsvektoren, die eine oder mehrere regulatorische DNA-Sequenzen umfassen, die funktionell mit der DNA-Sequenz verknüpft sind, die für das gesamte oder für einen Teil von Gst codiert.
- Expressionsvektoren von Nutzen in der vorliegenden Erfindung umfassen typischerweise eine Replikationsstart, einen Promotor, der 5' (i. e. stromaufwärts) zur Gst- Fusionsproteinsequenz liegt, stromabwärts gefolgt von Transkriptionsterminationssequenzen, und dem restlichen Vektor. Kontrollbereiche von einer Reihe von Quellen können gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Geeignete Replikationsstarts umfassen zum Beispiel Col E1, den viralen SV40- und den M13-Replikationsstart. Geeignete Promotoren umfassen zum Beispiel den Cytomegalievirus-Promotor, den lac Z-Promotor, den gal 10- Promotor, und den polyhedralen Promotor vom Virus Autographa californica multiple nuclear polyhedrosis (AcMNPV). Geeignete Terminationssequenzen umfassen zum Beispiel Polyadenylierungs-Signale von SV40, lac Z und AcMNPV polyhedral. Ein Expressionsvektor, wie er für die vorliegende Erfindung in Betracht kommt, ist zumindest in der Lage, die Replikation, und vorzugsweise auch die Expression, der Nucleinsäuren, die die Fusionsproteine codieren, zu steuern.
- Die Expressionsvektoren können auch andere DNA-Sequenzen umfassen, die zum Stand der Technik gehören; zum Beispiel Stabilitäts-Leitsequenzen, die dem Expressionsprodukt Stabilität verleihen; sekretorische Leitsequenzen, die für die Sekretion der Expressionsprodukte verantwortlich sind; Sequenzen, die erlauben, dass die Expression der Strukturgene moduliert wird (z. B. durch die Anwesenheit oder Abwesenheit von Nährstoffen oder anderer induzierender Substanzen im Nährmedium); markierende Sequenzen, die in der Lage sind, eine phänotypische Selektion bei den transformierten Wirtszellen vorzunehmen (z. B. Gene für Neomycin-, Ampicillin- und Hygromycin-Resistenz und dergleichen); und Sequenzen, die Spaltstellen für Restriktionsendonucleasen bereitstellen. Alle diese Materialien sind Stand der Technik und kommerziell erhältlich.
- Die Charakteristik der tatsächlich verwendeten Expressionsvektoren muss kompatibel sein mit der angewendeten Wirtszelle. Der Vektor kann deshalb Sequenzen beinhalten, die eine Expression in verschiedenen Typen von Wirtszellen zulassen, einschließlich, aber nicht beschränkt auf, Prokaryonten, Hefen, Pilze, Pflanzen und höhere Eukaryonten. Wenn zum Beispiel DNA-Sequenzen in einem Säugetier-Zellsystem exprimiert werden, sollte der Expressionsvektor Promotoren enthalten, die aus dem Genom von Säugetierzellen isoliert wurden, (e.g. Maus-Metallothionein-Promotor), oder aus Viren, die in solchen Zellen wachsen (e.g. Baculovirus-Promotor, Vacciniavirus 7,5 K-Promotor).
- Geeignete, kommerziell erhältlich Expressionsvektoren, in die DNA-Sequenzen für die Fusionsproteine inseriert werden können, umfassen den Säugetier-Expressionsvektor pcDNAI oder pcDNA/Neo, die Baculovirus-Expressionsvektoren pBlueBac und pVL1393 (der bevorzugt wird), den prokaryontischen Expressionsvektor pcDNAII und den Hefe- Expressionsvektor pYes2, die alle von Invitrogen Corp., San Diego, CA. erhalten werden können. Bevorzugt werden kommerziell erhältliche Vektoren, in die Gst-Sequenzen bereits eingeschlossen sind, wie pGEX-2T.
- Die vorliegende Erfindung betrifft zusätzlich Wirtszellen, die einen Expressionsvektor enthalten, der eine DNA-Sequenz umfasst, die das Gst-Fusionsprotein codiert. Die Wirtszellen enthalten vorzugsweise einen Expressionsvektor, der die gesamte oder einen Teil der DNA- Sequenz für das zu isolierende Lck-Protein umfasst, zusammen mit einer DNA-Sequenz für ein Polypeptid, das an Glutathion binden kann. Siehe zum Beispiel den Expressionsvektor, der unter Experimentelle Verfahren nachstehend erscheint, der bevorzugt wird. Des weiteren bevorzugt sind Wirtszellen, die einen Expressionsvektor enthalten, der eine oder mehrere regulatorische DNA-Sequenzen umfasst, die in der Lage sind, die Replikation und/oder Expression der DNA-Sequenz zu steuern, die für das gesamte oder einen Teil des Fusionsproteins codieren, und die funktionell damit verknüpft sind. Geeignete Wirtszellen umfassen sowohl prokaryontische wie eukaryontische Zellen. Geeignete prokaryontische Wirtszellen umfassen, zum Beispiel, die E.coli-Stämme HB101, DH5a, XL 1 Blue, Y1090 und JM101. Geeignete eukaryontische Wirtszellen umfassen zum Beispiel Spodoptera frugiperda- Insektenzellen (die bevorzugt werden), COS-7-Zellen, menschliche Hautfibroblasten, und Saccharomyces cerevisiae-Zellen.
- Expressionsvektoren können in Wirtszellen nach verschiedenen Verfahren eingeführt werden, die im Fachgebiet bekannt sind. Zum Beispiel kann die Transfektion der Wirtszellen mit Expressionsvektoren nach dem Calciumphosphat-Präzipitations-Verfahren durchgeführt werden. Jedoch können auch andere Verfahren zur Einführung von Expressionsvektoren in Wirtszellen, wie zum Beispiel Elektroporation, liposomale Fusion, Injektion in den Kern, oder virale oder Phagen-Infektion angewendet werden.
- Nachdem ein Expressionsvektor in eine geeignete Wirtszelle eingeführt wurde, kann die Wirtszelle unter Bedingungen kultiviert werden, die die Expression von großen Mengen an Fusionsprotein erlauben.
- A. Überblick über das Clonierungsverfahren. Das Glutathion-s-Transferase-Gen wurde in die Bam H-1-Stelle des Sf9-Expressionsvektors pVL1393 cloniert, um den Expressionsvektor pBMS-1 für die Gst-Fusion herzustellen. Die Restriktionskarte des Polylinkers pBMS-1 und die Thrombin-Spaltstelle werden gezeigt.
- B. Schema der Verknüpfung der GstLck-Fusion. Ick wurde mit der für Gst codierenden Sequenz verknüpft unter Verwendung einer Stu-1-Stelle, die sich 24 Basenpaare stromaufwärts vom Start-Methionin-Codon von lck befindet.
- A. SDS-PAGE-Analyse und Muster der Färbung mit Coomassie. Spur 1 zeigt das Ergebnis von 50 ug Gesamtprotein von infizierten Sf-9-Zellen; Spur 2, 1 ug von gereinigtem GstLck; Spur 3, 0,5 ug von GstLck (rekombinantes p56lck) nach Spaltung mit Thrombin.
- B. SDS-PAGE-Analyse von autophosphoryliertem GstLck. Spur 1 zeigt das Ergebnis der Autophosphorylierung von GstLck; Spur 2, Autophosphorylierung von rekombinantem p56lck.
- C. Western Blot-Analyse der Probe, die in Abschnitt B verwendet wurde unter Verwendung eines polyclonalen Kaninchen-Antikörpers gegen lck. Spur 1 zeigt das Ergebnis mit GstLck; Spur 2, rekombinantes p56lck.
- A. Western Blot-Analyse von p56lck Spur 1 zeigt das Ergebnis von immunpräzipitiertem p56lck aus CEM-6-Zellen; Spuren 2-4, GstLck aus Lysaten von infizierten Sf-9-Zellen, die nach den folgenden Verfahren gereinigt waren. Spur 2, Immunpräzipitation unter Verwendung polyclonaler Antikörper gegen lck; Spur 3, Immunpräzipitation unter Verwendung polyclonaler Antikörper gegen Gst; Spur 4, Affinitätsreinigung unter Verwendung von Glutathion-Harz.
- B. Analyse der enzymatischen Aktivität von p56lck oder GstLck gereinigt wie in Abschnitt B dargestellt. Die Aktivität wurde durch Autophosphorylierung bestimmt. Die gleichen Proteinproben und -mengen wie in Abschnitt A wurden aufgebracht.
- A. Phosphorylierung von Enolase als Funktion der GstLck-Konzentration. Jede Reaktion wurde für eine Minute bei 30ºC mit 3 ug Enolase als Substrat und wechselnden Mengen von GstLck durchgeführt. Spur 1 zeigt das Ergebnis mit 0 ug GstLck; Spur 2, 0,04 ug GstLck; Spur 3, 0,08 ug GstLck; Spur 4, 0,12 ug GstLck; Spur 5, 0,2 ug GstLck; Spur 6, 0,28 ug GstLck; Spur 7, 0,36 ug GstLck; Spur 8, 0,44 ug GstLck; Spur 9, 0,52 ug GstLck.
- B. Zeitverlauf der Phosphorylierung von Enolase durch GstLck. Jede Reaktion wurde bei 30ºC mit 0,4 ug GstLck und 3 ug Enolase als Substrat durchgeführt. Spur 1 zeigt das Ergebnis nach 0 Minuten; Spur 2, 0,5 Minuten; Spur 3, 1 Minute; Spur 4, 2 Minuten; Spur 5, 3 Minuten.
- A. Phosphorylierung von Enolase als Funktion der Konzentration an rekombinantem p56lck. Jede Reaktion wurde für eine Minute bei 30ºC mit 3 ug Enolase als Substrat und verschiedenen Mengen an rekombinantem p56lck durchgeführt. Spur 1 zeigt das Ergebnis mit 0 ug p56lck, Spur 2, 0,01 ug p56lck; Spur 3, 0,02 ug p56lck Spur 4, 0,03 ug p56lck; Spur 5, 0,05 ug p56lck; Spur 6, 0,07 ug p56lck; Spur 7, 0,09 ug p56lck; Spur 8, 0,11 ug p56lck.
- B. Zeitverlauf der Phosphorylierung von Enolase mit rekombinantem p56lck. Jede Reaktion wurde bei 30ºC mit 0,01 ug an rekombinantem p56lck und 3 ug Enolase als Substrat durchgeführt. Spur 1 zeigt das Ergebnis nach 0 Minuten; Spur 2, 0,5 Minuten; Spur 3, 1 Minute; Spur 4, 2 Minuten; Spur S. 3 Minuten.
- Konstruktion des p56lck-Expressions-Vektors. Ein Stu-1-Fragment der lck-DNA der Maus (Marth, J. D., Peet, R., Krebs, E. G., und Perlmutter, R. (1985) Cell 43, 393-404) wurde in die aufgefüllte Eco-R1-Stelle des Vektors pGEX-2T (Pharmacia) cloniert. Das resultierende Plasmid pGEX-lck ist in der Lage, ein Glutathion-s-Transferase/Lck (GstLck)-Fusionsprotein zu exprimieren, wenn es in E.coli-Zellen transfiziert wird. Die für GstLck codierende Sequenz aus pGEX-lck wurde mittels PCR amplifiziert. Der 5'-PCR-Primer
- 5' TAT AAA TAT GTC CCC TAT ACT A 3'
- (SEQ. ID. NO.: 3),
- wurde auf einem Synthesizer Modell 380A von Applied Biosystems, Inc., synthetisiert. Dieser Primer hybridisiert an die 5'-Region der für Gst codierenden Sequenz und codiert die Ribosomen-Bindungsstelle für das Baculovirus-Polyhedrin-Gen. Der 3'-PCR-Primer,
- 5'CGT CAG TCA GTC ACG AT 3'
- (SEQ. ID. NO.: 4),
- hybridisiert an Sequenzen unmittelbar 3' zum Polylinker von pGEX-2T. Das Primer- Paar kann verwendet werden, um jede Sequenz zu amplifizieren, die in den Polylinker von pGEX-2T als eine Gst/Insertion-Fusion cloniert wurde. Die amplifizierte GstLck codierende Sequenz wurde in den Vektor pCR1000 (InVitrogen, Inc.) cloniert, was das Plasmid pCR1000-GstLck ergab. Der Vektor pCR1000 wurde geplant zum einfachen Clonieren von PCR-amplifizierter DNA, und wurde als intermediärer Clonierungsvektor verwendet. Ein Not- 1,Bgl-II-Fragment aus pCR1000-GstLck, das die GstLck codierende Sequenz enthielt, wurde in die Not-1, Bgl-II-Stellen von pVL 1393 cloniert. Lukow, V. A., und Summers, M. D. (1988) Virolo 167, 56-71. Das resultierende Plasmid, pVL1393-GstLck, wurde verwendet, um einen rekombinanten Baculovirus in Spodoptera frugiperda 9 (Sf9)-Zellen nach Standardverfahren herzustellen. Summers, M. D., und Smith, G. E. (1987) A Manual for baculovirus vectors and insect cell culture procedures, Texas A&M bulletin No. 1555, (College Station, Texas Agricuktural Experimental Station and Texas A&M University), 10-39. Das Clonierungsschema, das zur Konstruktion von pBMS-I verwendet wurde, ist in Fig. 1A dargestellt. Die verwendeten PCR-Primer sind die gleichen wie oben beschrieben.
- Reinigung von GstLck aus Sf9-Zellen. Eine Spinner-Kultur von 500 ml infizierten Sf9-Zellen in Excell-400-Medium (JRH Biosciences) wurde 48 Stunden nach der Infektion durch Zentrifugation bei 4ºC für S Minuten geerntet. Die Zellen wurden lysiert in 50 ml kaltem 50 mM Tris pH 8,0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 1 mM DTT, 1% (Vol/Vol) NP-40, 1 mM PMSF, 0,1 mg/ml Aprotinin, 0,1 mg/ml Leupeptin, 1 mM NaF, und 1 mM Na&sub3;VO&sub4; (Lysierungspuffer). Unlösliches Material wurde durch Zentrifugation bei 10.000 · g für 10 Minuten bei 4ºC entfernt. Unter Verwendung des Coomassie-Protein-Test-Reagenzes (Pierce) wurde bestimmt, dass das resultierende Zell-Lysat eine Protein- Konzentration von 9,5 mg/ml hatte.
- Das GstLck-Protein wurde mit einem einstufigen Affinitäts-Chromatographie- Verfahren gereinigt unter Verwendung eines Glutathion-Harzes, wie vom Hersteller beschrieben (Pharmacia). Für dieses Experiment wurden 50 mg vom Sf9-Zell-Lysat, das das GstLck-Protein enthielt, auf eine 2-ml Glutathion-Säule aufgebracht und das ungebundene Material wurde durch Waschen mit 50 ml Lysepuffer entfernt. Gebundene Proteine wurden von der Säule mit 2 Säulenvolumina Lysepuffer eluiert, der 5 mM Glutathion enthielt. Die eluierten Proteine wurden mit Lysierungspuffer auf 15 ml verdünnt und unter Verwendung einer Concentrator-Einheit Centriprep 30 (Amicon, Inc.) konzentriert. Zwei zusätzliche Verdünnungen und Konzentrierungen zur Entfernung des restlichen Glutathions wurden durchgeführt. Das konzentrierte Protein wurde auf 10% Glycerin eingestellt und bei -70ºC gelagert. Dieses Verfahren ergab 28,0 mg von mehr als 99%ig reinem GstLck, wie durch Analyse mittels SDS-PAGE und Coomassie-Blau-Färbung bestimmt wurde.
- Um das p56lck rotem ohne die Gst-Peptid-Sequenzen zu erhalten, wurde GstLck mit dem proteolytischen Enzym Thrombin verdaut, um gespaltenes p56lck (cp56lck)zu bilden. Für dieses Verfahren wurden 5 mg Thrombin zu 20 mg gereinigtem GstLck in einem Volumen von 50 ml Lysepuffer, der 2,5 mM CaCl&sub2; enthielt, für eine Stunde bei 25ºC zugegeben. Um ungespaltenes GstLck und gespaltenes Gst zu entfernen, wurden die Produkte mit 20 ml Glutathion-Harz gemischt. Das Glutathion-Harz wurde durch Zentrifugation entfernt und das cp56lck blieb im Überstand. Die Ausbeute dieses Verfahrens war ungefähr 5 mg von rekombinantem p56lck, das in 10% Glycerin bei -70ºC gelagert wurde.
- Immun-Komplex-Protein-Kinase-Test. Die Analyse auf Protein-Kinase-Aktivität, die an Immunkomplexen gemacht wurde, wurde durchgeführt wie kürzlich beschrieben. Veillette, A., Horak, LD., Horak, E. M., Bookman, M. A., und Bolen, J. A. (1988) Mol. Cell. Biol. 8, 4353-4361. Kurz gesagt, wurden Immunkomplexe, die sich aus zellulären Lysaten und den angegebenen Antiseren gebildet hatten, durch die Zugabe von Formalin-fixiertem Staphyloccocus aureus (Pansorbin, Calbiochem) gesammelt und gründlich mit Lysepuffer gewaschen. Die Reaktionen mit Protein-Kinase wurden durch die Zugabe von 30 ml Kinase- Puffer (20 mM MOPS pH 7, 5 mM MnCl&sub2;, 1 mM ATP), der 12,5 uCi [γ ³²P]-ATP (3000Ci/mmol, New England Nuclear) enthielt. Die Reaktionen wurden für 5 Minuten bei Raumtemperatur laufen gelassen und durch die Zugabe eines gleichen Volumens von 2X SDS- Beladungspuffer (0,125 M Tris-HCl pH 6,8, 4% (Gewicht/Vol) SDS, 20% (Vol/Vol) Glycerin, 10% (Vol/Vol) 2-Mercaptoäthanol) gestoppt. Die phosphorylierten Produkte im SDS-Beladungspuffer wurden 5 Minuten auf 90ºC erhitzt und dann mittels SDS-PAGE und Autoradiographie analysiert. Die ³²P-markierten Banden von Interesse wurden aus dem Gel ausgeschnitten und in einem Beckman LS6000TA Flüssig-Szintillationszähler gezählt.
- Löslicher Protein-Kinase-Test. Die enzymatische Aktivität von GstLck und cp56lck wurde durch ihre Fähigkeit bestimmt, das exogene Lck-Substrat Kaninchenmuskel-Enolase (Sigma) zu phosphorylieren. Um den Zeitverlauf der Enolase-Phosphorylierung zu bestimmen, wurden 3 ug GstLck oder 1 ug cp56lck zu 100 ul Kinase-Puffer zugegeben, der 12 ug Enolase und 25 uCi [γ-³²P]-ATP enthielt, und die Reaktionen wurden bei 30ºC für die angezeigten Zeiten durchgeführt. An jedem Punkt wurden 10 uL des Reaktionsgemisches entnommen, zu 30 uL von 2X SDS-Beladungspuffer zugegeben und 5 Minuten auf 90ºC erhitzt. Die Reaktionsprodukte wurden mittels SDS-PAGE und Autoradiographie analysiert. Die Banden, die Enolase entsprechen, wurden aus dem Gel ausgeschnitten und mittels Flüssig-Szintillations- Spektroskopie gezählt. Um den Km-Wert für Enolase zu bestimmen, wurden serielle Verdünnungen von Enolase zu Kinase-Puffer zugegeben, der 5 uCi [γ ³²P]-ATP enthielt, und entweder 0,1 ug GstLck oder 0,01 ug cp56lck wurden pro Reaktion zugegeben. Die Reaktionsbedingungen und die in Enolase eingebauten Impulse wurden bestimmt wie zuvor beschrieben. Für die Km-Bestimmung von ATP wurde eine 1 : 10-Verdünnung von [γ-³²P]-ATP zu Kinase-Puffer zugegeben, der 3 ug Enolase enthielt. Für jede ATP-Verdünnung wurde 1 ug an cp56lck in einem Gesamtvolumen von 30 uL zugegeben und 30 Sekunden bei 30ºC reagiert. Die Reaktionen wurden durch die Zugabe von 30 uL 2X SDS-Beladungspuffer gestoppt und auf 90ºC erhitzt. Die Reaktionsprodukte wurden mittels SDS-PAGE analysiert, die phosphorylierten Proteine wurden mittels Autoradiographie sichtbar gemacht, und der Einbau von ³²P wurde mittels Flüssig-Szintillations-Spektroskopie der ausgeschnittenen Banden bestimmt.
- Andere biochemische Tests und Materialien. Immun-Blot-Analyse von Lck wurde wie zuvor beschrieben mittels Kaninchen-Antiseren gegen Lck durchgeführt. Veillette, A., Bookman, M. A., Horak, EM., und Bolen, J. A. (1988) Cell 55, 301-308. Die partielle, proteolytische Peptid-Analyse unter Verwendung der V8-Protease von Staphyloccocus aureus (Pierce) wurde auch zuvor beschrieben. Veillette, A., Horak, LD., Horak, E. M., Bookman, M. A., und Bolen, J. A. (1988) Mol. Cell. Biol. 8, 4353-4361; Marth, J. D., Cooper, J. A., King, C. S., Ziegler, ST., Tinker, DA., Overell, R. A., Krebs, E. G., und Perlmutter, R. M. (1988) Mol. Cell. Biol. 8, 540-550. Die menschliche T-Zell-Lymphom-Zellinie CEM wurde in RPMI 1640-Medium, das mit 10% (Vol/Vol) fötalem Kälberserum und Antibiotika (Penicillin/Streptomycin) ergänzt war, wachsen gelassen. Für Versuche mit Immunpräzipitation wurden die Zellen in Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung gewaschen, durch Zentrifugation gesammelt, in Lysepuffer lysiert, und vor der Zugabe von Antiseren gegen Lck auf 1 mg/ml eingestellt. Gegen Gst gerichtetes Antiserum wurden durch Immunisierung von Kaninchen mit gereinigtem Gst hergestellt. Antiserum gegen die Lck-Aminosäuren 39-58 sind zuvor beschrieben worden. Veillette, A., Bookman, M. A., Horak, E,M., und Bolen, J. A. (1988) Cell 55, 301-308.
- Konstruktion von Expressionsvektoren. Fig. 1A stellt die Clonierungsstrategie zur Herstellung des Expressionsvektors pBMS-I dar. Die codierende Sequenz für Gst aus pGEX- 2T wurde durch PCR-Amplifikation cloniert, und in den Baculovirus-Expressionsvektor pVL1393 ligiert. Der 5'-PCR-Primer wurde geplant, um die Translation der codierenden Sequenz für Gst in Sf9-Zellen zu optimieren. Dies wurde erreicht, indem die Sequenz um das Start-Methionin von Gst geändert wurde, um die ribosomale Bindungsstelle des Baculovirus- Polyhedrin-Gens zu codieren. Der pBMS-I Polylinker enthält 9 einmalige Clonierungs-Stellen und kann verwendet werden, um einen rekombinanten Baculovirus herzustellen, der Insertionen als ein Gst-Fusionsprotein in Sf9-Zellen exprimiert.
- Die Fusions-Verknüpfung der codierenden Sequenz für GstLck cloniert in pVL1393, wird in Fig. 1B schematisch gezeigt. Die Thrombin-Spaltstelle wird ebenfalls angezeigt. Das Plasmid pVL1393-GstLck wurde verwendet, um einen rekombinanten Baculovirus herzustellen, der große Mengen an GstLck-Fusionsprotein in Sf9-Zellen exprimiert. Die Thrombin-Spaltung vom GstLck-Protein resultierte in einem rekombinanten p56lck- (cp56lck) Molekül, das am Amino-Ende von Lck 13 zusätzliche Aminosäuren enthält. Diese zusätzlichen Aminosäuren hatten keinen offensichtlichen Effekt auf die enzymatische Aktivität in vitro von rekombinantem p56lck. Dies wurde bestimmt durch Vergleich der Immunkomplex Protein- Kinase-Aktivität von cp56lck mit der von Wild-Typ p56lck exprimiert in Sf9-Zellen.
- Reinigung von GstLck von Sf9-Zellen. Gesamt-Detergens-Lysate wurden von Sf9- Zellen hergestellt, die das GstLck-Fusionsprotein exprimierten, wie in Experimentelle Verfahren beschrieben. Lysat, das GstLck enthielt, wurde an Glutathion-Sepharose-Säulen gebunden und mit 5 mM Glutathion in Lysepuffer eluiert. Die Glutathion-gebundenen Produkte von dieser Säule wurden mit Coomassie-Anfärbung nach Fraktionierung auf SDS- Polyacrylamid-Gelen analysiert. Wie in Fig. 2A gezeigt, wurde ein einziges Polypeptid von ungefähr 83 kDa beobachtet, was der erwarteten Größe des GstLck-Fusionsproteins entspricht. Nach Thrombin-Spaltung (Fig. 2A, Spur 3) wurde beobachtet, dass das rekombinante Lck-Protein als zwei eng beieinanderliegende Banden von ungefähr 56 kDa wanderte.
- Funktionelle Analyse von GstLck und cp56lck. Um die Kinase-Aktivität der gereinigten GstLck- und cp56lck -Proteine zu bestimmen, wurden Protein-Kinase-Tests durchgeführt. Die Ergebnisse dieser Reaktionen zeigen (Fig. 2B), dass gereinigtes GstLck und cp56lck ihre Autophosphorylierungs-Kapazität behielten. Wie erwartet wurde in gereinigten Präparationen von Gst keine Kinase-Aktivität beobachtet. Die in Fig. 2C gezeigten Ergebnisse zeigen den entsprechenden Lck-Immuno-Blot unter Verwendung von polyclonalen Kaninchen-Antikörpern gegen den einzigartigen Bereich von p56lck. Auf der Basis der relativen Mengen an Lck-Protein, die in den Kinase-Reaktionen gefunden wurde, scheint es, dass die spezifische Aktivität von cp56lck leicht höher sein kann als die vom GstLck- Fusionsprotein. Analyse mit Immunoblots mit Anti-Phosphotyrosin von ähnlichen Reaktionsprodukten, die mit nicht-radioaktivem ATP hergestellt wurden, zeigte, dass die Autophosphorylierungsprodukte (ebenso wie die Phosphorylierung von dem exogene Protein- Substrat Enolase, das in anderen Experimenten verwendet wurde) an Tyrosin-Resten phosphoryliert wurden. Zusätzlich ergab die Analyse der partiellen V8-Peptide der Autophosphorylierungsprodukte der GstLck- und cp56lck-Reaktionen hauptsächlich V8- Phosphopeptide, die nicht zu unterscheiden waren von dem T-Zell-abgeleiteten p56lck, das mittels Immunkomplex-Kinase-Tests autophosphoryliert war.
- Die Höhe der enzymatischen Aktivität von GstLck wurde ebenfalls verglichen mit der von Wild-Typ p56lck, das aus Detergentien-Lysaten von T-Zellen immunpräzipitiert wurde.
- Für diese Experimente wurde GstLck aus Detergens-Lysaten von infizierten Sfr mit Antiserum gegen Lck, Antiserum gegen Gst, oder mit Glutathion-Sepharose-Perlen präzipitiert. Das p56lck aus T-Zell-Lysaten wurde mit Antiserum gegen Lck immunopräzipitiert. Die verschiedenen Komplexe wurden gründlich mit Lysepuffer gewaschen und in zwei gleiche Mengen geteilt. Ein Teil wurde verwendet, um Protein-Kinase-Tests durchzuführen (Fig. 3B), während der andere Teil für Lck-Immunblot-Analyse verwendet wurde (Fig. 3A). Die Ergebnisse dieses Eperiments zeigen, dass die Präzipitation des GstLck-Proteins unter Verwendung von Antikörpern oder Glutathion-Perlen Molküle mit ähnlichen spezifischen Aktivitäten ergaben, wie mit Autophosphorylierung gezeigt wurde. Der Vergleich mit aus T- Zellen abgeleitetem p56lck zeigte, dass die spezifische Aktivität von GstLck-Protein, gewonnen aus Sf9-Zellen, deutlich höher war.
- Um die kinetischen Parameter von GstLck und cp56lck weiter zu charakterisieren, wurde die Kinase-Aktivität des Fusionsproteins und des gespaltenen Enzyms unter Verwendung von Kaninchenmuskel-Enolase als exogenem Substrat untersucht. Wie die in Fig. 4 gezeigten Daten zeigen, wurde gefunden, dass die Phosphorylierung von Enolase mit GstLck Zeit- und konzentrationsabhängig war. Ähnliche Ergebnisse wurden für cp56lck erhalten (Fig. 5). Die Km und Vmax-Werte für ATP und Enolase wurden mit einer Reaktionszeit von 30 Sekunden bestimmt und die Ergebnisse sind in Tabelle I zusammengefasst. Die Affinität von cp56lck für Enolase wurde ungefähr 10-fach höher gefunden als die von GstLck. Noch kritischer sind die Km- und Vmax-Werte, die für cp56lck bestimmt wurden, vergleichbar mit den Werten für andere Mitglieder der src-Familie.
- Versuche, funktionelles GstLck in E.coli herzustellen, waren nicht erfolgreich. Das resultierende Fusionsprotein wurde exprimiert, aber es hatte keine nachweisbare Protein- Kinase-Aktivität und war in Detergentien unlöslich. Die letzte Eigenschaft ist für die Expression vieler eukaryontischer Proteine in Bakterien normal. Marston, A. O. (1986) J. Biochem. 240, 1-12; Miller, D. W., Saher, P., und Miller, L. K. (1986) in Genetic Engineering, vol. 8, pp. 277-298, Plenum, New York; Miller, L. K. (1989) in Ann. Rev. Microbiol. 42, 177- 199. Zu den Vorteilen der Expression von eukaryontischen Proteinen in Sf9-Zellen gehört die Fähigkeit dieser Zellen, die Faltung des Proteins zuzulassen, und die post-translationale Modifikation, die die Löslichkeit des Proteins aufrechterhält. Im Falle von Lck hat die Expression von Wild-Typ-p56lck in Sf9-Zellen unter Verwendung von konventionellen Baculo virus-Expressionsvektoren gezeigt, dass Lck an Serin- und Threonin-Resten myristyliert und phosphoryliert wird. Thomas, J. E., Soriano, P., und Brugge, J. S. (1991) Science 254, 568-571. Da Lck in diesem System als Fusionsprotein mit Gst am Aminoterminus exprimiert wird, ist es unwahrscheinlich, dass Myristylierung erfolgt. Wir haben nicht bestimmt, ob GstLck an Serin- oder Threonin-Resten phosphoryliert wird.
- Die lck-codierenden Sequenzen wurden stromabwärts von dem Gst codierenden Bereich im Leserahmen ligiert, um ein Plasmid zu ergeben, das in der Lage ist, ein Gst-p56lck- Fusionsprotein zu codieren. Von dem auf diese Weise hergestellten p56lck wurde gefunden, dass es eine hoch aktive Protein-Kinase ist und auch die erwarteten biochemischen Eigenschaften eines Mitglieds der src-Familie zeigt.
- Analyse sowohl vom GstLck-Fusionsprotein als auch von cp56lck zeigten, dass jedes eine beträchtliche Protein-Tyrosin-Kinase-Aktivität behielt, wie mit Autophosphorylierung und Tyrosinphosphorylierung des exogenen Substrats Kaninchenmuskel-Enolase gemessen wurde. Es ist wichtig, dass Gst-Sequenzen, ob an Lck fusioniert oder nach Abspaltung von der Kinase mittels Thrombin in Immunkomplex-Kinase-Tests oder in in Lösung durchgeführten Kinase- Tests nicht phosphoryliert wurden. Es wurde gefunden, dass sowohl GstLck als auch cp56lck eine deutlich höhere spezifische Aktivität hatten als aus T-Zellen gewonnenes p56lck, wenn mittels Immunkomplex-Protein-Kinase-Tests gemessen wurde. Die geänderte spezifische Aktivität ist wahrscheinlich das Ergebnis einer verminderten Phosphorylierung des Carboxyterminalen Tyrosins (Tyrosin 505) für Lck in Sf9-Zellen, obwohl wir die Phosphorylierungsstellen von Lck in diesen Zellen nicht bestimmt haben. Veillette, A., Horak, LD., Horak, E,M., Bookman, M. A., und Bolen, J. A. (1988) Mol. Cell. Biol. 8, 4353-4361; Marth, J. D., Cooper, J. A., King, C. S., Ziegler, S. F., Tinker, D. A., Overell, R. A., Krebs, E. G., und Perlmutter, R. M. (1988) Mol. Cell. Biol. 8, 540-550. Der Mangel an Phosphorylierung von Tyrosin 505 von Lck, wie der mit pp60c-srcbeobachtete, abgeleitet aus Sf9, (Morgan, D. O., Kaplan, J. M., Bishop, J. M., und Varmus, H. E. (1989) Cell 57, 775-786) ist wahrscheinlich auf die Abwesenheit der Expression anderer Tyrosin-Protein-Kinasen wie Csk zurückzuführen, von denen man annimmt, dass sie die Src-Klasse von Kinasen an dieser Stelle phosphorylieren.
- Okada, M., und Nakagawa, H. (1989) J. Biol. Chem. 264, 20886-20893; Okada, M., und Nakagawa, H. (1988) Biochem. Biophys. Res. Comm. 154, 796-802.
- Aus 50 mg vollständigem Sf9-Protein-Lysat wurden mit dem vorstehenden Verfahren 280 mg rekombinantes p56lck gereinigt, mit einer Reinheit von mehr als 99% (mit Silber- und Coomassie-Färbung). Aus einem Liter infizierter Sf9-Zellen produzierte das System ungefähr 8-10 mg gereinigtes rekombinantes Lck.
- Die im Verlauf dieser Beschreibung verwendeten Abkürzungen werden wie folgt definiert.
- ATP Adenosintriphosphat
- DNA Desoxyribonucleinsäure
- DTT Dithiothreit
- MOPS (3-[N-Morpholino]propansulfonsäure)
- PCR Polymerasekettenreaktion
- PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese
- PMSF Phenylmethylsulfonfluorid
- SDS Natriumdodecylsulfat
- Das Gen für GST kann durch Enzyme an den in Tabelle 1 gezeigten Stellen gespalten werden. Solche Nucleinsäurefragmente können verwendet werden, um partielle Gst- Polypeptide in den Fusionsproteinen der vorliegenden Erfindung herzustellen. Tabelle 1
- (i) ANMELDER: Spana, Carl Fargnoli, Joseph Bolen, Joseph B.
- (ii) TITEL DER ERFINDUNG: PROTEINEXPRESSIONSSYSTEM
- (iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 2
- (iv) KORRESPONDENZADRESSE:
- (A) ADRESSAT: Burton Rodney
- (B) STRASSE: P. O. Box 4000
- (C) STADT: Princeton
- (D) STAAT: New Jersey
- (E) LAND: U. S. A.
- (F) ZIP: 08543-4000
- (v) COMPUTERLESBARE FORM:
- (A) MEDIUM-TYP: Floppy disk
- (B) COMPUTER: IBM PC kompatibel
- (C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
- (D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1,25
- (vi) DATEN DER VORLIEGENDEN ANMELDUNG
- (A) ANMELDENUMMER.
- (B) ANMELDEDATUM:
- (C) KLASSIFIKATION:
- (vii) INFORMATION ÜBER DEN ANWALT:
- (A) NAME: Gaul, Timothy J.
- (B) REGISTRATIONSNUMMER: 33,111
- (C) REFERENZ/AKTENNUMMER: DC25
- (viii) TELEKOMMUNIKATIONSINFORMATION:
- (A) TELEFON: (609) 252-5901
- (B) TELEFAX: (609) 252-4526
- (2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 1:
- (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
- (A) LÄNGE: 693 Basenpaare
- (B) TYP: Nucleinsäure
- (C) STRÄNGIGKEIT: Einzelstrang
- (D) TOPOLOGIE: Linear
- (ii) MOLEKÜLTYP: cDNA
- (ix) MERKMAL:
- (A) NAME/SCHLÜSSEL: CD5
- (B) LAGE 1..693 (x) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 1:
- INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 2:
- (i) SEQUENZCHARAKTERISTIK:
- (A) LÄNGE: 231 Aminosäuren
- (B) TYP: Aminosäure
- (D) TOPOLOGIE: linear
- (ii) MOLEKÜLTYP: Protein (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NO: 2:
Claims (17)
1. Expressionsvektor, umfassend:
a) einen ersten codierenden Bereich, der ein Polypeptid codiert, das an Glutathion binden
kann, funktionell verknüpft mit einem Promotor,
b) einen zweiten codierenden Bereich, der das Lck-Protein codiert, im Leseraster mit
dem ersten codierenden Bereich, und
c) mindestens eine Restriktionsstelle zwischen den ersten und zweiten codierenden
Bereichen;
wobei die Expression des Vektors ein Fusionsprotein der ersten und zweiten codierenden
Bereiche ergibt.
2. Wirtszelle, umfassend den Vektor nach Anspruch 1.
3. Verfahren zur Isolierung und Reinigung von Lck-Protein, umfassend
a) Behandlung der Wirtszelle nach Anspruch 2 unter Bedingungen, welche die
Expression des Vektors erlauben, wobei ein Fusionsprotein der ersten und zweiten
codierenden Bereiche exprimiert wird;
b) Aussetzen der Proteine von der Wirtszelle einem Glutathionharz, wobei das
Fusionsprotein an das Harz binden wird;
c) Abspalten des Expressionsprodukts des zweiten codierenden Bereichs von dem
harzgebundenen Fusionsprotein.
4. Verfahren zur Expression einer Nucleinsäuresequenz, die Lck-Protein codiert, umfassend:
a) Insertion der Nucleinsäuresequenz in einen Baculovirus-Expressionsvektor im
Leseraster mit einem ersten codierenden Bereich für ein Polypeptid, das an Glutathion
binden kann, wobei der erste codierende Bereich funktionell mit einem Promotor
verknüpft ist;
b) Einbringen des Vektors in eine Wirtszelle;
c) Behandlung der Wirtszelle unter Bedingungen, welche die Expression des Vektors
erlauben, wobei ein Fusionsprotein des ersten codierenden Bereichs und der in Schritt
(a) insertierten Sequenz exprimiert wird;
d) Aussetzen der Proteine von der Wirtszelle einem Glutathionharz, wobei das
Fusionsprotein an das Harz binden wird; und
e) Behandlung des gebundenen Fusionsproteins mit einer Protease, um das
Expressionsprodukt der Nucleinsäuresequenz von dem Harz freizusetzen.
5. Expressionsvektor nach Anspruch 1, wobei der Promotor ein Baculovirus-Promotor ist.
6. Wirtszelle nach Anspruch 2, wobei die Zelle eine Spodoptera frugiperda-Zelle ist.
7. Wirtszelle nach Anspruch 2, wobei die Zelle eine Spodoptera frugiperda-Zelle ist und der
Expressionsvektor einen Baculovirus-Promotor umfasst.
8. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Wirtszelle eine Spodoptera frugiperda-Zelle und
der Promotor ein Baculovirus-Promotor ist.
9. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Wirtszelle eine Spodoptera frugiperda-Zelle und
der Promotor ein Baculovirus-Promotor ist.
10. Wirtszelle nach Anspruch 2, wobei die Zelle eine Sf9-Zelle ist.
11. Wirtszelle nach Anspruch 2, wobei die Zelle eine Sf9-Zelle und der Promotor ein
Baculovirus-Promotor ist.
12. Verfahren nach Anspruch 3, wobei die Wirtszelle eine Sf9-Zelle und der Promotor ein
Baculovirus-Promotor ist.
13. Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Wirtszelle eine Sf9-Zelle und der Promotor ein
Baculovirus-Promotor ist.
14. Expressionsvektor nach Anspruch 1, wobei der erste codierende Bereich Glutathion-s-
Transferase codiert.
15. Wirtszelle nach Anspruch 2, wobei der erste codierende Bereich Glutathion-s-Transferase
codiert.
16. Verfahren nach Anspruch 3, wobei der erste codierende Bereich Glutathion-s-Transferase
codiert.
17. Verfahren nach Anspruch 4, wobei der erste codierende Bereich Glutathion-s-Transferase
codiert.
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