JPH07184663A - タンパク質発現系 - Google Patents
タンパク質発現系Info
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- JPH07184663A JPH07184663A JP6261894A JP26189494A JPH07184663A JP H07184663 A JPH07184663 A JP H07184663A JP 6261894 A JP6261894 A JP 6261894A JP 26189494 A JP26189494 A JP 26189494A JP H07184663 A JPH07184663 A JP H07184663A
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- Japan
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- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
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- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
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- C—CHEMISTRY; METALLURGY
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/14011—Baculoviridae
- C12N2710/14111—Nucleopolyhedrovirus, e.g. autographa californica nucleopolyhedrovirus
- C12N2710/14141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Abstract
(57)【要約】
【目的】 目的タンパク質の大量生産のための融合タン
パク質発現法による発現方法およびそれに用いる発現ベ
クターならびに宿主細胞を提供すること。 【構成】 (ａ)グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ
をコードし、バキュロウイルスプロモーターに有効に連
結する第１コード領域； (ｂ)第１コード領域と同じ解読枠内の第２コード領
域；および (ｃ)第１コード領域の下流にあり、第２コード領域が
挿入される、少なくともひとつの制限部位を含む制限領
域；からなる発現ベクターであって、その発現によって
第１および第２コード領域によってコードされる融合タ
ンパク質を産生する発現ベクター、該ベクターを含む宿
主細胞、該宿主細胞を用いるタンパク質の発現方法なら
びに単離方法および核酸配列の発現方法。
パク質発現法による発現方法およびそれに用いる発現ベ
クターならびに宿主細胞を提供すること。 【構成】 (ａ)グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ
をコードし、バキュロウイルスプロモーターに有効に連
結する第１コード領域； (ｂ)第１コード領域と同じ解読枠内の第２コード領
域；および (ｃ)第１コード領域の下流にあり、第２コード領域が
挿入される、少なくともひとつの制限部位を含む制限領
域；からなる発現ベクターであって、その発現によって
第１および第２コード領域によってコードされる融合タ
ンパク質を産生する発現ベクター、該ベクターを含む宿
主細胞、該宿主細胞を用いるタンパク質の発現方法なら
びに単離方法および核酸配列の発現方法。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、目的タンパク質の大量
生産のための融合タンパク質発現法による発現方法およ
びそれに用いる発現ベクターならびに宿主細胞に関す
る。
生産のための融合タンパク質発現法による発現方法およ
びそれに用いる発現ベクターならびに宿主細胞に関す
る。
【０００２】
【従来の技術】lck遺伝子産物であるｐ５６lckは、タン
パク質チロシンキナーゼのsrcファミリーのメンバーで
ある［クーパー(Cooper),J.A.の「ペプチドおよびタン
パク質リン酸化」(ケンプス(Kemps),B.E.編),８５〜１
１３頁,ＣＲＣプレス,ボカ・レイトン,フロリダ州を参
照］。通常lckタンパク質はＴリンパ球およびナチュラ
ルキラー細胞で発現し、そこでは、選択された表面タン
パク質に結合するリガンドを介するシグナル形質導入に
関する種々の機能を果しているものと思われる［ボーレ
ン(Bolen),J.A.およびヴェイレット(Veillette),A.(１
９８９年)「Trends Biochem. Sci.」,１４,４０４〜４
０７；ラッド(Rudd),C.E.(１９９０年)「Immunol. Toda
y」,１１,４００〜４０６を参照］。Ｔ細胞においてｐ
５６lckはＣＤ４およびＣＤ８ａと非共有結合的錯体を
形成する［ヴェイレット,A.、ブックマン(Bookman),M.
A.、ホラック(Horak),E.M.およびボーレン,J.A.(１９８
８年)を参照］。この理由のために、ｐ５６lckは、ＣＤ
４またはＣＤ８ａの結合を介してＴ細胞抗原受容体から
抗原結合主要組織適合性分子上の非多形決定因子へ発さ
れるシグナルの仲介を促進すると信じられている［ショ
ウ(Shaw),A.S.、チャルプニー(Chalupny),J.、ホイット
ニー(Whitney),J.A.、ハモンド(Hammond),C.、アムレイ
ン(Amrein),K.E.、カヴァサス(Kavathas),P.、セフトン
(Sefton),B.M.およびローズ(Rose),J.K.(１９９０年)
「Mol. Cell. Biol.」,１０,１８５３〜１８６２；ドイ
ル(Doyle),C.およびストロミンガー(Strominger),J.L.
(１９８７年)「Nature」,３３０,２５６〜２５９；ノー
メント(Norment),A.M.、サルター(Salter),R.D.、パー
ハム(Parham),P.、エンゲルハード(Engelhard),V.H.お
よびリットマン(Littman),D.R.(１９８８年)「Natur
e」,３３６,７９〜８１を参照］。さらに最近では、ｐ
５６lckは高親和性インターロイキン−２受容体のシグ
ナリング成分に含まれると報告されている［ハタケヤマ
(Hatakeyama),M.、コーノ(Kono),T.、コバヤシ(Kobayas
hi),N.、カワハラ(Kawahara),A.、レヴィン(Levin),S.
D.、パールムッター(Perlmutter),R.M.およびタナグチ
(Tanaguchi),T.(１９９１年)「Science」,２５２,１５
２３〜１５２８を参照］。
パク質チロシンキナーゼのsrcファミリーのメンバーで
ある［クーパー(Cooper),J.A.の「ペプチドおよびタン
パク質リン酸化」(ケンプス(Kemps),B.E.編),８５〜１
１３頁,ＣＲＣプレス,ボカ・レイトン,フロリダ州を参
照］。通常lckタンパク質はＴリンパ球およびナチュラ
ルキラー細胞で発現し、そこでは、選択された表面タン
パク質に結合するリガンドを介するシグナル形質導入に
関する種々の機能を果しているものと思われる［ボーレ
ン(Bolen),J.A.およびヴェイレット(Veillette),A.(１
９８９年)「Trends Biochem. Sci.」,１４,４０４〜４
０７；ラッド(Rudd),C.E.(１９９０年)「Immunol. Toda
y」,１１,４００〜４０６を参照］。Ｔ細胞においてｐ
５６lckはＣＤ４およびＣＤ８ａと非共有結合的錯体を
形成する［ヴェイレット,A.、ブックマン(Bookman),M.
A.、ホラック(Horak),E.M.およびボーレン,J.A.(１９８
８年)を参照］。この理由のために、ｐ５６lckは、ＣＤ
４またはＣＤ８ａの結合を介してＴ細胞抗原受容体から
抗原結合主要組織適合性分子上の非多形決定因子へ発さ
れるシグナルの仲介を促進すると信じられている［ショ
ウ(Shaw),A.S.、チャルプニー(Chalupny),J.、ホイット
ニー(Whitney),J.A.、ハモンド(Hammond),C.、アムレイ
ン(Amrein),K.E.、カヴァサス(Kavathas),P.、セフトン
(Sefton),B.M.およびローズ(Rose),J.K.(１９９０年)
「Mol. Cell. Biol.」,１０,１８５３〜１８６２；ドイ
ル(Doyle),C.およびストロミンガー(Strominger),J.L.
(１９８７年)「Nature」,３３０,２５６〜２５９；ノー
メント(Norment),A.M.、サルター(Salter),R.D.、パー
ハム(Parham),P.、エンゲルハード(Engelhard),V.H.お
よびリットマン(Littman),D.R.(１９８８年)「Natur
e」,３３６,７９〜８１を参照］。さらに最近では、ｐ
５６lckは高親和性インターロイキン−２受容体のシグ
ナリング成分に含まれると報告されている［ハタケヤマ
(Hatakeyama),M.、コーノ(Kono),T.、コバヤシ(Kobayas
hi),N.、カワハラ(Kawahara),A.、レヴィン(Levin),S.
D.、パールムッター(Perlmutter),R.M.およびタナグチ
(Tanaguchi),T.(１９９１年)「Science」,２５２,１５
２３〜１５２８を参照］。
【０００３】ｐ５６lckおよび類似タンパク質の構造お
よび調節をよりよく理解することは、初期のシグナル形
質導入イベントに関する我々の知識に明らかに貢献し、
そして大量の精製ｐ５６lck源は有用である。このタン
パク質に対する抗体によってｐ５６lckの初期分析が非
常に促進されたとはいえ、豊富な酵素源がないことがイ
ムノアフィニティー精製を妨げていた。この困難さは、
バキュロウイスル発現系においても存在する［サマーズ
(Summers),M.D.およびスミス(Smith),G.E.(１９８７年)
「バキュロウイスルベクターおよび昆虫細胞培養操作の
マニュアル」,テキサスＡ＆Ｍ公報Ｎｏ.１５５５(カレ
ッジ・ステーション、テキサス農業実験ステーションお
よびテキサスＡ＆Ｍユニバーシティ),１０〜３９を参
照］。バキュロウイスル発現系を用いる最近の研究に
は、常套のクロマトグラフィー方法論を用いるｐ５６
lckの精製の意義深い結果が報告されている［ラマー(Ra
mer),S.E.、ウィンクラー(Winkler),D.G.、カレラ(Carr
era),A.、ロバーツ(Robert),T.M.およびウォルシュ(Wal
sh),C.T.(１９９１年)「Proc. Natl. Acad. Sci. US
A」,８８,６２５４〜６２５８；ワッツ(Watts),J.D.、
ウィルソン(Wilson),G.M.、エッテハディー(Ettehadie
h),E.、クラーク−ルイス(Clark-Lewis),I.、クバネク
(Kubanek),C.、アステル(Astell),C.R.、マース(Mart
h),J.D.およびアーバーソルド(Aebersold),R.(１９９１
年)「J. Biol. Chem.」,２６７,９０１〜９０７参照］。
このアプローチによって、精製酵素が得られるとはい
え、マルチカラム酵素精製は、高価で時間がかかり、大
量の出発物質を必要とするものである。
よび調節をよりよく理解することは、初期のシグナル形
質導入イベントに関する我々の知識に明らかに貢献し、
そして大量の精製ｐ５６lck源は有用である。このタン
パク質に対する抗体によってｐ５６lckの初期分析が非
常に促進されたとはいえ、豊富な酵素源がないことがイ
ムノアフィニティー精製を妨げていた。この困難さは、
バキュロウイスル発現系においても存在する［サマーズ
(Summers),M.D.およびスミス(Smith),G.E.(１９８７年)
「バキュロウイスルベクターおよび昆虫細胞培養操作の
マニュアル」,テキサスＡ＆Ｍ公報Ｎｏ.１５５５(カレ
ッジ・ステーション、テキサス農業実験ステーションお
よびテキサスＡ＆Ｍユニバーシティ),１０〜３９を参
照］。バキュロウイスル発現系を用いる最近の研究に
は、常套のクロマトグラフィー方法論を用いるｐ５６
lckの精製の意義深い結果が報告されている［ラマー(Ra
mer),S.E.、ウィンクラー(Winkler),D.G.、カレラ(Carr
era),A.、ロバーツ(Robert),T.M.およびウォルシュ(Wal
sh),C.T.(１９９１年)「Proc. Natl. Acad. Sci. US
A」,８８,６２５４〜６２５８；ワッツ(Watts),J.D.、
ウィルソン(Wilson),G.M.、エッテハディー(Ettehadie
h),E.、クラーク−ルイス(Clark-Lewis),I.、クバネク
(Kubanek),C.、アステル(Astell),C.R.、マース(Mart
h),J.D.およびアーバーソルド(Aebersold),R.(１９９１
年)「J. Biol. Chem.」,２６７,９０１〜９０７参照］。
このアプローチによって、精製酵素が得られるとはい
え、マルチカラム酵素精製は、高価で時間がかかり、大
量の出発物質を必要とするものである。
【０００４】グルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼ
(Ｇｓｔ)はグルタチオンに結合することがよく知られて
いるタンパク質である[スミス(Smith),D.B.およびジョ
ンソン(Johnson),K.S.(１９８８年)「Gene」,６７,３１
〜４０]。グルタチオン樹脂はカラムクロマトグラフィ
ーに用いることができる。しかし、上記バキュロウイル
ス発現系ではＧｓｔを使用していない。
(Ｇｓｔ)はグルタチオンに結合することがよく知られて
いるタンパク質である[スミス(Smith),D.B.およびジョ
ンソン(Johnson),K.S.(１９８８年)「Gene」,６７,３１
〜４０]。グルタチオン樹脂はカラムクロマトグラフィ
ーに用いることができる。しかし、上記バキュロウイル
ス発現系ではＧｓｔを使用していない。
【０００５】
【発明の構成】本発明は、タンパク質の単離体の発現方
法およびその方法に用いる発現ベクターならびに宿主細
胞に関する。さらに詳しくは本発明は、 (ａ)グルタチオンに結合しうるポリペプチドをコード
し、プロモーターに有効に連結する第１コード領域； (ｂ)第１コード領域と同じ解読枠内の第２コード領域；
および (ｃ)第１および第２コード領域間にある少なくともひと
つの制限部位；からなる発現ベクターであって、その発
現によって第１および第２コード領域の融合タンパク質
が得られる発現ベクターに関する。バキュロウイルス由
来のベクターが好ましい。
法およびその方法に用いる発現ベクターならびに宿主細
胞に関する。さらに詳しくは本発明は、 (ａ)グルタチオンに結合しうるポリペプチドをコード
し、プロモーターに有効に連結する第１コード領域； (ｂ)第１コード領域と同じ解読枠内の第２コード領域；
および (ｃ)第１および第２コード領域間にある少なくともひと
つの制限部位；からなる発現ベクターであって、その発
現によって第１および第２コード領域の融合タンパク質
が得られる発現ベクターに関する。バキュロウイルス由
来のベクターが好ましい。
【０００６】さらに本発明は、このようなベクターを含
む宿主細胞に関する。その他各種の宿主細胞が適当であ
るが、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugip
erda)細胞、特にＳｆ９細胞が好ましい(後記参照)。こ
のようなベクターおよび宿主細胞は、 (ａ)請求項２に記載の宿主細胞をベクターの発現条件下
で処理して、第１および第２コード領域の融合タンパク
質を発現し； (ｂ)該宿主細胞からのタンパク質をグルタチオン樹脂で
処理して、該融合タンパク質を樹脂に接着し；ついで (ｃ)樹脂に結合した融合タンパク質から第２コード領域
の発現産物を分離すること；からなる、単離体でタンパ
ク質を発現する方法に有用である。
む宿主細胞に関する。その他各種の宿主細胞が適当であ
るが、スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugip
erda)細胞、特にＳｆ９細胞が好ましい(後記参照)。こ
のようなベクターおよび宿主細胞は、 (ａ)請求項２に記載の宿主細胞をベクターの発現条件下
で処理して、第１および第２コード領域の融合タンパク
質を発現し； (ｂ)該宿主細胞からのタンパク質をグルタチオン樹脂で
処理して、該融合タンパク質を樹脂に接着し；ついで (ｃ)樹脂に結合した融合タンパク質から第２コード領域
の発現産物を分離すること；からなる、単離体でタンパ
ク質を発現する方法に有用である。
【０００７】さらに本発明は、 (ａ)グルタチオンに結合しうるポリペプチドをコード
し、プロモーターに有効に連結する第１コード領域と同
じ解読枠になるように、バキュロウイルス発現ベクター
に核酸配列を挿入し； (ｂ)該ベクターを宿主細胞に導入し； (ｃ)該宿主細胞を該ベクターの発現条件下で処理して、
第１コード領域の融合タンパク質およびステップ(ａ)で
挿入した核酸を発現し； (ｄ)宿主細胞からのタンパク質をグルタチオン樹脂で処
理して、該融合タンパク質を樹脂に接着し；ついで (ｅ)接着した融合タンパク質をプロテアーゼで処理し
て、該核酸配列の発現産物を樹脂から遊離させる；こと
からなる核酸配列の発現方法に関する。
し、プロモーターに有効に連結する第１コード領域と同
じ解読枠になるように、バキュロウイルス発現ベクター
に核酸配列を挿入し； (ｂ)該ベクターを宿主細胞に導入し； (ｃ)該宿主細胞を該ベクターの発現条件下で処理して、
第１コード領域の融合タンパク質およびステップ(ａ)で
挿入した核酸を発現し； (ｄ)宿主細胞からのタンパク質をグルタチオン樹脂で処
理して、該融合タンパク質を樹脂に接着し；ついで (ｅ)接着した融合タンパク質をプロテアーゼで処理し
て、該核酸配列の発現産物を樹脂から遊離させる；こと
からなる核酸配列の発現方法に関する。
【０００８】第１コード領域として、本発明者らはグル
タチオン−ｓ−トランスフェラーゼ(ヌクレオチド配列
番号１；アミノ酸配列番号２)またはグルタチオンに結
合しうるそれらのフラグメントを採択する。この系はバ
キュロウイルスベクターにおいて異質タンパク質を高レ
ベルに発現し、かつ該Ｇｓｔ融合タンパク質がグルタチ
オン樹脂への結合能力を持っている。したがって、トロ
ンビンなどのタンパク質分解物質でグルタチオン結合融
合タンパク質を処理すると、融合タンパク質のグルタチ
オン結合部分から所望のタンパク質を切り離すことがで
きる。
タチオン−ｓ−トランスフェラーゼ(ヌクレオチド配列
番号１；アミノ酸配列番号２)またはグルタチオンに結
合しうるそれらのフラグメントを採択する。この系はバ
キュロウイルスベクターにおいて異質タンパク質を高レ
ベルに発現し、かつ該Ｇｓｔ融合タンパク質がグルタチ
オン樹脂への結合能力を持っている。したがって、トロ
ンビンなどのタンパク質分解物質でグルタチオン結合融
合タンパク質を処理すると、融合タンパク質のグルタチ
オン結合部分から所望のタンパク質を切り離すことがで
きる。
【０００９】この系では、他の系より多くの利点が提供
される。すなわち、実施者は(１)大量のタンパク質を産
生すること、(２)単一クロマトグラフィーによる著しい
量の有効タンパク質を精製すること、(３)タンパク質の
機能を維持するための変性を起こさない界面活性剤など
の広範囲の抽出条件を採用すること、(４)抗体が産生さ
れないクローン化された配列または機能が測定できない
タンパク質を発現する組換えバキュロウイルスのスクリ
ーニングを考慮に入れて、抗Ｇｓｔ抗体を使用するこ
と、(５)都合よくライゲーションを行うために多数の制
限部位を持つ複数のクローニング部位を使用すること、
および(６)トロンビン切断部位を持つゆえにトロンビン
を使用および／または研究することができる
される。すなわち、実施者は(１)大量のタンパク質を産
生すること、(２)単一クロマトグラフィーによる著しい
量の有効タンパク質を精製すること、(３)タンパク質の
機能を維持するための変性を起こさない界面活性剤など
の広範囲の抽出条件を採用すること、(４)抗体が産生さ
れないクローン化された配列または機能が測定できない
タンパク質を発現する組換えバキュロウイルスのスクリ
ーニングを考慮に入れて、抗Ｇｓｔ抗体を使用するこ
と、(５)都合よくライゲーションを行うために多数の制
限部位を持つ複数のクローニング部位を使用すること、
および(６)トロンビン切断部位を持つゆえにトロンビン
を使用および／または研究することができる
【００１０】本明細書中で用いる語句の定義を以下に述
べる。これらの定義は他に但し書きがない限り、本明細
書を通して適用される。 「融合タンパク質」とは、２つまたはそれ以上のタンパ
ク質のアミノ酸配列に対応する部分からなるアミノ酸配
列を持つタンパク質またはポリペプチドを意味する。２
つまたはそれ以上のタンパク質の配列は、該タンパク質
の全部または１部(すなわちフラグメント)であってよ
い。このような融合タンパク質は、各タンパク質のアミ
ノ酸に対応する部分の間に、アミノ酸の連結領域を有し
ていてもよい。このような融合タンパク質は、対応する
核酸をヌクレアーゼおよびリガーゼで処理して結合し、
発現ベクターに導入するという組換え法によって製造す
ることができる。融合タンパク質の製造は当業者には一
般的に理解されているものである。
べる。これらの定義は他に但し書きがない限り、本明細
書を通して適用される。 「融合タンパク質」とは、２つまたはそれ以上のタンパ
ク質のアミノ酸配列に対応する部分からなるアミノ酸配
列を持つタンパク質またはポリペプチドを意味する。２
つまたはそれ以上のタンパク質の配列は、該タンパク質
の全部または１部(すなわちフラグメント)であってよ
い。このような融合タンパク質は、各タンパク質のアミ
ノ酸に対応する部分の間に、アミノ酸の連結領域を有し
ていてもよい。このような融合タンパク質は、対応する
核酸をヌクレアーゼおよびリガーゼで処理して結合し、
発現ベクターに導入するという組換え法によって製造す
ることができる。融合タンパク質の製造は当業者には一
般的に理解されているものである。
【００１１】「グルタチオンに結合可能なポリペプチ
ド」とは、グルタチオンに結合可能なタンパク質、タン
パク質フラグメントおよび合成ポリペプチドを意味す
る。具体例としては、グルタチオン−ｓ−トランスフェ
ラーゼおよびそのフラグメントが挙げられる。翻訳前の
５'および３'プライマーを用いる遺伝子増幅または翻訳
後のタンパク質分解による切断によって適当なフラグメ
ントを生産することができる(表２参照)。 「コード領域」とは、転写解読枠、すなわち翻訳されて
アミノ酸配列を形成する配列を持つ核酸の部分を意味す
る。「コード領域」には、自然に存在するタンパク質の
配列および組換え法によって得られる修飾された配列
(挿入、欠失、突然変異、分断)が含まれる。
ド」とは、グルタチオンに結合可能なタンパク質、タン
パク質フラグメントおよび合成ポリペプチドを意味す
る。具体例としては、グルタチオン−ｓ−トランスフェ
ラーゼおよびそのフラグメントが挙げられる。翻訳前の
５'および３'プライマーを用いる遺伝子増幅または翻訳
後のタンパク質分解による切断によって適当なフラグメ
ントを生産することができる(表２参照)。 「コード領域」とは、転写解読枠、すなわち翻訳されて
アミノ酸配列を形成する配列を持つ核酸の部分を意味す
る。「コード領域」には、自然に存在するタンパク質の
配列および組換え法によって得られる修飾された配列
(挿入、欠失、突然変異、分断)が含まれる。
【００１２】「連結領域」とは、融合タンパク質上で由
来の異なるコード領域の間のアミノ酸配列を意味する。
連結領域の特徴は、プロテアーゼによって認識される部
位をコードし、したがって、コード領域の発現産物を相
互に分離することである。 「有効に連結する」とは、プロモーターが組み合せられ
たコード領域の発現を制御することが可能であることを
意味する。融合タンパク質のコード領域は、エンハンサ
ーなどの他の調節要素と有効に連結していてもよい。好
ましい具体例では、市販の発現ベクターｐＧＥＸ−２Ｔ
のＧｓｔ配列を使用する。この配列はシストソーマ・ヤ
ポニカム(Schistosoma japonicum)由来である。幾らか
の種がＧｓｔの活性イソ体を産生することが知られてお
り、それらのイソ体はすべて本発明に有用である。
来の異なるコード領域の間のアミノ酸配列を意味する。
連結領域の特徴は、プロテアーゼによって認識される部
位をコードし、したがって、コード領域の発現産物を相
互に分離することである。 「有効に連結する」とは、プロモーターが組み合せられ
たコード領域の発現を制御することが可能であることを
意味する。融合タンパク質のコード領域は、エンハンサ
ーなどの他の調節要素と有効に連結していてもよい。好
ましい具体例では、市販の発現ベクターｐＧＥＸ−２Ｔ
のＧｓｔ配列を使用する。この配列はシストソーマ・ヤ
ポニカム(Schistosoma japonicum)由来である。幾らか
の種がＧｓｔの活性イソ体を産生することが知られてお
り、それらのイソ体はすべて本発明に有用である。
【００１３】融合タンパク質のコード領域は、当業者に
はよく理解されている手段によってスプライスを行い、
発現ベクターに導入することができる。公知の標準的組
換えＤＮＡ技術を用いて適当な発現ベクターを構築しう
るが、それらの技術の多くがサムブルック(Sambrook)ら
の「モレキュラー・クローニング：ラボラトリー・マニ
ュアル」,第２版,コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリー,コールド・スプリング・ハーバ−,ニューヨ
ーク(１９８９年)に記載されている。本発明の適当な発
現ベクターは、グルタチオンに結合しうるポリペプチド
をコードする領域および同一解読枠内の単離されるべき
タンパク質をコードする配列からなる。単離されるべき
タンパク質をコードする領域は、グルタチオンを結合す
るポリペプチドをコードする領域の上流または下流に位
置する。Ｇｓｔの全部または部分配列をコードするＤＮ
Ａ配列に有効に連結する、ひとつまたはそれ以上の調節
ＤＮＡ配列を持つ発現ベクターが好ましい。
はよく理解されている手段によってスプライスを行い、
発現ベクターに導入することができる。公知の標準的組
換えＤＮＡ技術を用いて適当な発現ベクターを構築しう
るが、それらの技術の多くがサムブルック(Sambrook)ら
の「モレキュラー・クローニング：ラボラトリー・マニ
ュアル」,第２版,コールド・スプリング・ハーバー・ラ
ボラトリー,コールド・スプリング・ハーバ−,ニューヨ
ーク(１９８９年)に記載されている。本発明の適当な発
現ベクターは、グルタチオンに結合しうるポリペプチド
をコードする領域および同一解読枠内の単離されるべき
タンパク質をコードする配列からなる。単離されるべき
タンパク質をコードする領域は、グルタチオンを結合す
るポリペプチドをコードする領域の上流または下流に位
置する。Ｇｓｔの全部または部分配列をコードするＤＮ
Ａ配列に有効に連結する、ひとつまたはそれ以上の調節
ＤＮＡ配列を持つ発現ベクターが好ましい。
【００１４】本発明に有用な発現ベクターの特徴は、複
製起点、Ｇｓｔ融合タンパク質の配列の５'末端方向(す
なわち、上流)に位置するプロモーター(これは下流の転
写終止配列に続く)およびベクターの残部を持つことで
ある。本発明には、幾つかの源に由来する制御領域を使
用することができる。適当な複製起点としては、たとえ
ば、ＳＶ４０ウイスルおよびＭ１３の複製起点であるＣ
ｏｌＥ１が挙げられる。適当なプロモーターとしては、
たとえば、サイトメガロウイスルプロモーター、ｌａｃ
Ｚプロモーター、ｇａｌ１０プロモーターおよびアウト
グラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)マ
ルチプル核多角体ウイルス(ＡｃＭＮＰＶ)多面プロモー
ターが挙げられる。適当な終止配列としては、たとえ
ば、ＳＶ４０、ｌａｃＺおよびＡｃＭＮＰＶ多面ポリア
デニル化シグナルが挙げられる。本発明によって企図さ
れる発現ベクターは、少なくとも融合タンパク質をコー
ドする核酸の複製(好ましくは発現)を制御することが可
能である。
製起点、Ｇｓｔ融合タンパク質の配列の５'末端方向(す
なわち、上流)に位置するプロモーター(これは下流の転
写終止配列に続く)およびベクターの残部を持つことで
ある。本発明には、幾つかの源に由来する制御領域を使
用することができる。適当な複製起点としては、たとえ
ば、ＳＶ４０ウイスルおよびＭ１３の複製起点であるＣ
ｏｌＥ１が挙げられる。適当なプロモーターとしては、
たとえば、サイトメガロウイスルプロモーター、ｌａｃ
Ｚプロモーター、ｇａｌ１０プロモーターおよびアウト
グラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)マ
ルチプル核多角体ウイルス(ＡｃＭＮＰＶ)多面プロモー
ターが挙げられる。適当な終止配列としては、たとえ
ば、ＳＶ４０、ｌａｃＺおよびＡｃＭＮＰＶ多面ポリア
デニル化シグナルが挙げられる。本発明によって企図さ
れる発現ベクターは、少なくとも融合タンパク質をコー
ドする核酸の複製(好ましくは発現)を制御することが可
能である。
【００１５】該発現ベクターには、他の公知のＤＮＡ配
列も含まれる；たとえば、発現産物の安定性を付与する
安定性リーダー配列；発現産物の分泌を付与する分泌リ
ーダー配列；構造遺伝子の発現を調節する配列(たとえ
ば、成長培地中に栄養または他の誘導物質が存在するか
しないかによって調節する)；形質転換された宿主細胞
において表現型選択を付与することが可能なマーキング
配列(たとえば、ネオマイシン,アンピシリンおよびハイ
グロマイシン耐性遺伝子など)；および制限エンドヌク
レアーゼによって切断される部位を付与する配列。これ
らの材料のすべては公知であり、市販されている。
列も含まれる；たとえば、発現産物の安定性を付与する
安定性リーダー配列；発現産物の分泌を付与する分泌リ
ーダー配列；構造遺伝子の発現を調節する配列(たとえ
ば、成長培地中に栄養または他の誘導物質が存在するか
しないかによって調節する)；形質転換された宿主細胞
において表現型選択を付与することが可能なマーキング
配列(たとえば、ネオマイシン,アンピシリンおよびハイ
グロマイシン耐性遺伝子など)；および制限エンドヌク
レアーゼによって切断される部位を付与する配列。これ
らの材料のすべては公知であり、市販されている。
【００１６】実際に用いる発現ベクターの特性は、使用
される宿主細胞と適合しなければならない。したがっ
て、該ベクターは種々のタイプの宿主細胞(原核生物、
酵母、菌類、植物および高等真核生物などが挙げられる
がこれらに限定されるものではない)において発現しう
る配列を含んでいる。たとえば、哺乳類細胞系において
ＤＮＡ配列が発現する場合、発現ベクターは哺乳類細胞
のゲノムから単離されたプロモーター(たとえば、マウ
スメタロチオネインプロモーター)もしくはこれらの細
胞で成長するウイルスから単離されたプロモーター(た
とえば、バキュロウイルスプロモーター、ワクシニアウ
イルス７.５Ｋプロモーター)を持つべきである。
される宿主細胞と適合しなければならない。したがっ
て、該ベクターは種々のタイプの宿主細胞(原核生物、
酵母、菌類、植物および高等真核生物などが挙げられる
がこれらに限定されるものではない)において発現しう
る配列を含んでいる。たとえば、哺乳類細胞系において
ＤＮＡ配列が発現する場合、発現ベクターは哺乳類細胞
のゲノムから単離されたプロモーター(たとえば、マウ
スメタロチオネインプロモーター)もしくはこれらの細
胞で成長するウイルスから単離されたプロモーター(た
とえば、バキュロウイルスプロモーター、ワクシニアウ
イルス７.５Ｋプロモーター)を持つべきである。
【００１７】融合タンパク質のＤＮＡ配列を挿入する適
当な市販の発現ベクターとしては、哺乳類配列ベクター
ｐｃＤＮＡＩまたはｐｃＤＮＡ／Ｎｅｏ、バキュロウイ
ルス発現ベクターｐＢｌｕｅＢａｃおよびｐＶＬ１３９
３(これが好ましい)、原核生物発現ベクターｐｃＤＮＡ
ＩＩおよび酵母発現ベクターｐＹｅｓ２が挙げられる。
これらのすべてはインヴィトロゲン・コーポレイション
(Invitrogen Corp.)[サンディエゴ,カリフォルニア]か
ら入手しうる。ｐＧＥＸ−２ＴなどのすでにＧｓｔ配列
を内包する市販のベクターが好ましい。
当な市販の発現ベクターとしては、哺乳類配列ベクター
ｐｃＤＮＡＩまたはｐｃＤＮＡ／Ｎｅｏ、バキュロウイ
ルス発現ベクターｐＢｌｕｅＢａｃおよびｐＶＬ１３９
３(これが好ましい)、原核生物発現ベクターｐｃＤＮＡ
ＩＩおよび酵母発現ベクターｐＹｅｓ２が挙げられる。
これらのすべてはインヴィトロゲン・コーポレイション
(Invitrogen Corp.)[サンディエゴ,カリフォルニア]か
ら入手しうる。ｐＧＥＸ−２ＴなどのすでにＧｓｔ配列
を内包する市販のベクターが好ましい。
【００１８】さらに本発明は、Ｇｓｔ融合タンパク質を
コードするＤＮＡ配列を持つ発現ベクターを含む宿主細
胞に関する。宿主細胞は、単離されるべきタンパク質を
コードするＤＮＡ配列の全部または一部およびグルタチ
オンに結合しうるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列
を持つ発現ベクターを含むのが好ましい。たとえば、後
記実験操作に記載した発現ベクターを参照すべきであ
り、これが好ましい。融合タンパク質の全部または一部
をコードするＤＮＡ配列の複製および／または発現を制
御しうる、該配列に有効に連結する、ひとつまたはそれ
以上の調節ＤＮＡ配列を持つ発現ベクターを含む宿主細
胞がさらに好ましい。適当な宿主細胞としては、原核細
胞および真核細胞の両方が挙げられる。適当な原核宿主
細胞としては、たとえば、大腸菌株ＨＢ１０１、ＤＨ５
α,ＸＬ１Ｂｌｕｅ、Ｙ１０９０およびＪＭ１０１が挙
げられる。適当な真核宿主細胞としては、たとえば、ス
ポドプテラ・フルギペルダ昆虫細胞(これが好ましい)、
ＣＯＳ−７細胞、ヒト皮膚繊維芽細胞およびサッカロミ
セス・セレビシエ(Saccaromyces cerevisiae)細胞が挙
げられる。
コードするＤＮＡ配列を持つ発現ベクターを含む宿主細
胞に関する。宿主細胞は、単離されるべきタンパク質を
コードするＤＮＡ配列の全部または一部およびグルタチ
オンに結合しうるポリペプチドをコードするＤＮＡ配列
を持つ発現ベクターを含むのが好ましい。たとえば、後
記実験操作に記載した発現ベクターを参照すべきであ
り、これが好ましい。融合タンパク質の全部または一部
をコードするＤＮＡ配列の複製および／または発現を制
御しうる、該配列に有効に連結する、ひとつまたはそれ
以上の調節ＤＮＡ配列を持つ発現ベクターを含む宿主細
胞がさらに好ましい。適当な宿主細胞としては、原核細
胞および真核細胞の両方が挙げられる。適当な原核宿主
細胞としては、たとえば、大腸菌株ＨＢ１０１、ＤＨ５
α,ＸＬ１Ｂｌｕｅ、Ｙ１０９０およびＪＭ１０１が挙
げられる。適当な真核宿主細胞としては、たとえば、ス
ポドプテラ・フルギペルダ昆虫細胞(これが好ましい)、
ＣＯＳ−７細胞、ヒト皮膚繊維芽細胞およびサッカロミ
セス・セレビシエ(Saccaromyces cerevisiae)細胞が挙
げられる。
【００１９】発現ベクターは公知の種々の方法によって
宿主細胞に導入される。たとえば、発現ベクターの宿主
細胞へのトランスフェクションはリン酸カルシウム沈殿
法によって行うことができる。しかし、発現ベクターを
宿主細胞に導入する他の方法、たとえば、電気穿孔、リ
ポソーム融合、核注入およびウイルスまたはファージ感
染も用いることができる。発現ベクターを適切な宿主細
胞に導入したならすぐに、宿主細胞を大量の融合タンパ
ク質を発現させる条件下で培養する。
宿主細胞に導入される。たとえば、発現ベクターの宿主
細胞へのトランスフェクションはリン酸カルシウム沈殿
法によって行うことができる。しかし、発現ベクターを
宿主細胞に導入する他の方法、たとえば、電気穿孔、リ
ポソーム融合、核注入およびウイルスまたはファージ感
染も用いることができる。発現ベクターを適切な宿主細
胞に導入したならすぐに、宿主細胞を大量の融合タンパ
ク質を発現させる条件下で培養する。
【００２０】図１および図２はｐＢＭＳ−１の構築の模
式図である。図１：クローニング操作の概略 グルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼ遺伝子をＳｆ９
発現ベクターｐＶＬ１３９３のＢａｍＨ−１部位にクロ
ーン化してＧｓｔ融合タンパク質を製造した。ｐＢＭＳ
−１ポリリンカーの制限地図およびトロンビン切断部位
を示す。図２：ＧｓｔＬｃｋ融合連結点 ｌｃｋ開始メチオニンコドンの２４塩基対上流に位置す
るＳｔｕ−１部位を用いてｌｃｋをＧｓｔコード領域に
結合した。図３：Ｓｆ９細胞から精製されたＧｓｔＬｃｋの分析 Ａ：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析およびクーマシー着色パター
ンレーン１は感染Ｓｆ９細胞からの全タンパク質５０μ
g；レーン２は精製ＧｓｔＬｃｋ１μg；レーン３はトロ
ンビン切断ＧｓｔＬｃｋ(組換えｐ５６lck)０.５μgの
結果を示す。 Ｂ：自己リン酸化ＧｓｔＬｃｋのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析 レーン１はＧｓｔＬｃｋの自己リン酸化；レーン２は組
換えｐ５６lckの自己リン酸化の結果を示す。 Ｃ：Ｂで用いたサンプルのポリクローナルウサギ抗ｌｃ
ｋ抗体を用いるウエスタンブロット分析 レーン１はＧｓｔＬｃｋ；レーン２は組換えｐ５６lck
の結果を示す。
式図である。図１：クローニング操作の概略 グルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼ遺伝子をＳｆ９
発現ベクターｐＶＬ１３９３のＢａｍＨ−１部位にクロ
ーン化してＧｓｔ融合タンパク質を製造した。ｐＢＭＳ
−１ポリリンカーの制限地図およびトロンビン切断部位
を示す。図２：ＧｓｔＬｃｋ融合連結点 ｌｃｋ開始メチオニンコドンの２４塩基対上流に位置す
るＳｔｕ−１部位を用いてｌｃｋをＧｓｔコード領域に
結合した。図３：Ｓｆ９細胞から精製されたＧｓｔＬｃｋの分析 Ａ：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析およびクーマシー着色パター
ンレーン１は感染Ｓｆ９細胞からの全タンパク質５０μ
g；レーン２は精製ＧｓｔＬｃｋ１μg；レーン３はトロ
ンビン切断ＧｓｔＬｃｋ(組換えｐ５６lck)０.５μgの
結果を示す。 Ｂ：自己リン酸化ＧｓｔＬｃｋのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析 レーン１はＧｓｔＬｃｋの自己リン酸化；レーン２は組
換えｐ５６lckの自己リン酸化の結果を示す。 Ｃ：Ｂで用いたサンプルのポリクローナルウサギ抗ｌｃ
ｋ抗体を用いるウエスタンブロット分析 レーン１はＧｓｔＬｃｋ；レーン２は組換えｐ５６lck
の結果を示す。
【００２１】図４：ＧｓｔＬｃｋの自己リン酸化 Ａ：ｐ５６lckのウエスタンブロット分析 レーン１はＣＥＭ−６細胞から免疫沈降したｐ５
６lck；レーン２〜４は次に述べる方法を用いて精製し
た感染Ｓｆ９細胞溶解液からのＧｓｔＬｃｋの結果を示
す。レーン２は抗ｌｃｋポリクローナル抗体を用いる免
疫沈降法；レーン３は抗Ｇｓｔポリクローナル抗体を用
いる免疫沈降法；レーン４はグルタチオン樹脂を用いる
親和精製法である。 Ｂ：Ａで述べた方法で精製したｐ５６lckまたはＧｓｔ
Ｌｃｋの酵素活性の分析 活性は自己リン酸化により評価した。Ａと同じタンパク
質サンプルと量を実験に供した。図５：ＧｓｔＬｃｋによるエノラーゼのリン酸化 Ａ：ＧｓｔＬｃｋ濃度の関数としてのエノラーゼのリン
酸化 基質としてエノラーゼ３μgを用い、ＧｓｔＬｃｋの量
を変化させて３０℃で１分間、各反応を行った。レーン
１はＧｓｔＬｃｋ０μg；レーン２はＧｓｔＬｃｋ０.０
４μg；レーン３はＧｓｔＬｃｋ０.０８μg；レーン４
はＧｓｔＬｃｋ０.１２μg；レーン５はＧｓｔＬｃｋ
０.２μg；レーン６はＧｓｔＬｃｋ０.２８μg；レーン
７はＧｓｔＬｃｋ０.３６μg；レーン８はＧｓｔＬｃｋ
０.４４μg；レーン９はＧｓｔＬｃｋ０.５２μgの結果
を示す。 Ｂ：ＧｓｔＬｃｋによるエノラーゼのリン酸化の時間に
よる変化 ＧｓｔＬｃｋ０.４μg、基質としてエノラーゼ３μgを
用い、３０℃にて各反応を行った。レーン１は０分後；
レーン２は０.５分後；レーン３は１分後；レーン４は
２分後；レーン５は３分後の結果を示す。図６：トロンビン切断ＧｓｔＬｃｋによるエノラーゼの
リン酸化 Ａ：組換えｐ５６lckの濃度の関数としてのエノラーゼ
のリン酸化 基質としてエノラーゼ３μgを用い、組換えｐ５６lckの
量を変化させて３０℃で１分間、各反応を行った。レー
ン１はｐ５６lck０μg；レーン２はｐ５６lck０.０１μ
g；レーン３はｐ５６lck０.０２μg；レーン４はｐ５６
lck０.０３μg；レーン５はｐ５６lck０.０５μg；レー
ン６はｐ５６lck０.０７μg；レーン７はｐ５６lck０.
０９μg；レーン８はｐ５６lck０.１１μgの結果を示
す。Ｂ：組換えｐ５６lckによるエノラーゼのリン酸化
の時間による変化組換えｐ５６lck０.０１μg、基質と
してエノラーゼ３μgを用い、３０℃にて各反応を行っ
た。レーン１は０分後；レーン２は０.５分後；レーン
３は１分後；レーン４は２分後；レーン５は３分後の結
果を示す。
６lck；レーン２〜４は次に述べる方法を用いて精製し
た感染Ｓｆ９細胞溶解液からのＧｓｔＬｃｋの結果を示
す。レーン２は抗ｌｃｋポリクローナル抗体を用いる免
疫沈降法；レーン３は抗Ｇｓｔポリクローナル抗体を用
いる免疫沈降法；レーン４はグルタチオン樹脂を用いる
親和精製法である。 Ｂ：Ａで述べた方法で精製したｐ５６lckまたはＧｓｔ
Ｌｃｋの酵素活性の分析 活性は自己リン酸化により評価した。Ａと同じタンパク
質サンプルと量を実験に供した。図５：ＧｓｔＬｃｋによるエノラーゼのリン酸化 Ａ：ＧｓｔＬｃｋ濃度の関数としてのエノラーゼのリン
酸化 基質としてエノラーゼ３μgを用い、ＧｓｔＬｃｋの量
を変化させて３０℃で１分間、各反応を行った。レーン
１はＧｓｔＬｃｋ０μg；レーン２はＧｓｔＬｃｋ０.０
４μg；レーン３はＧｓｔＬｃｋ０.０８μg；レーン４
はＧｓｔＬｃｋ０.１２μg；レーン５はＧｓｔＬｃｋ
０.２μg；レーン６はＧｓｔＬｃｋ０.２８μg；レーン
７はＧｓｔＬｃｋ０.３６μg；レーン８はＧｓｔＬｃｋ
０.４４μg；レーン９はＧｓｔＬｃｋ０.５２μgの結果
を示す。 Ｂ：ＧｓｔＬｃｋによるエノラーゼのリン酸化の時間に
よる変化 ＧｓｔＬｃｋ０.４μg、基質としてエノラーゼ３μgを
用い、３０℃にて各反応を行った。レーン１は０分後；
レーン２は０.５分後；レーン３は１分後；レーン４は
２分後；レーン５は３分後の結果を示す。図６：トロンビン切断ＧｓｔＬｃｋによるエノラーゼの
リン酸化 Ａ：組換えｐ５６lckの濃度の関数としてのエノラーゼ
のリン酸化 基質としてエノラーゼ３μgを用い、組換えｐ５６lckの
量を変化させて３０℃で１分間、各反応を行った。レー
ン１はｐ５６lck０μg；レーン２はｐ５６lck０.０１μ
g；レーン３はｐ５６lck０.０２μg；レーン４はｐ５６
lck０.０３μg；レーン５はｐ５６lck０.０５μg；レー
ン６はｐ５６lck０.０７μg；レーン７はｐ５６lck０.
０９μg；レーン８はｐ５６lck０.１１μgの結果を示
す。Ｂ：組換えｐ５６lckによるエノラーゼのリン酸化
の時間による変化組換えｐ５６lck０.０１μg、基質と
してエノラーゼ３μgを用い、３０℃にて各反応を行っ
た。レーン１は０分後；レーン２は０.５分後；レーン
３は１分後；レーン４は２分後；レーン５は３分後の結
果を示す。
【００２２】実験操作 ｐ５６lck発現ベクターの構築 マウスｌｃｋｃＤＮＡからのＳｔｕ−１フラグメント
[マース(Marth）,J.D.、ピート(Peet）,R.、クレブス(K
rebs),E.G.およびパールムッター(Perlmutter),R.(１９
８５年）の「Cell」,４３,３９３〜４０４]をベクター
ｐＧＥＸ−２Ｔ(ファルマシア製）の充填Ｅｃｏ−Ｒ１
部位にクローン化する。得られるプラスミドｐＧＥＸ−
ｌｃｋは、大腸菌細胞にトランスフェクションすると、
グルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼ／Ｌｃｋ(Ｇｓ
ｔＬｃｋ）融合タンパク質を発現することができる。ｐ
ＧＥＸ−ｌｃｋからのＧｓｔＬｃｋコード配列をＰＣＲ
により増幅する。５'ＰＣＲプライマー：５'ＴＡＴ Ａ
ＡＡ ＴＡＴ ＧＴＣ ＣＣＣ ＴＡＴ ＡＣＴ Ａ
３' (配列番号３） をアプライド・バイオシステムズ・インコーポレイテッ
ド製のモデル３８０Ａシンセサイザーで合成する。この
プライマーはＧｓｔコード配列の５'領域にハイブリッ
ド形成し、バキュロウイルスポリヘドリン遺伝子のリボ
ソーム結合部位をコードする。３'ＰＣＲプライマー：
５'ＣＧＴ ＣＡＧ ＴＣＡ ＧＴＣ ＡＣＧ ＡＴ３' (配列番号４） は、ｐＧＥＸ−２Ｔのポリリンカーの３'配列にすばや
くハイブリッド形成する。このプライマー対は、Ｇｓｔ
／挿入物融合体としてｐＧＥＸ−２Ｔのポリリンカーに
クローン化したいずれの配列の増幅にも用いることがで
きる。増幅されたＧｓｔＬｃｋコード配列はベクターｐ
ＣＲ１０００(インビトロゲン・インコーポレイテッド
製）にクローン化して、プラスミドｐＣＲ１０００−Ｇ
ｓｔＬｃｋを得る。容易にｐＣＲ−増幅ＤＮＡをクロー
ニングするようｐＣＲ１０００ベクターを設計し、中間
体クローニングベクターとして用いる。ＧｓｔＬｃｋコ
ード配列を持つｐＣＲ１０００−ＧｓｔＬｃｋからのＢ
ｇｌ−ＩＩフラグメントであるＮｏｔ−１をｐＶＬ１３
９３のＮｏｔ−１、Ｂｇｌ−ＩＩ部位にクローン化する
［ルコウ(Lukow）,V.A.およびサマーズ(Summers),M.D.
(１９８８年)「Virology」,１６７,５６〜７１を参
照］。得られるプラスミド,ｐＶＬ１３９３−ＧｓｔＬ
ｃｋ(Ａ.Ｔ.Ｃ.Ｃ.受託番号（未詳）、アメリカン・タ
イプ・カルチュア・コレクション,１２３０１パークロ
ーン・ドライブ,ロックビル,メリーランド２０８５２−
１７７６）を用い、標準的な操作に従って、スポドプテ
ラ・フルギペルダ９(Ｓｆ９）細胞において組換えバキ
ュロウイルスを産生する［サマーズ、M.D.およびスミス
(Smith),G.E.(１９８７年)、「バキュロウイルスベクタ
ーおよび昆虫細胞培養操作のマニュアル」,テキサスＡ
＆Ｍ公報Ｎo.１５５５(カレッジ・ステーション、テキ
サス農業実験ステーションおよびテキサスＡ＆Ｍユニバ
ーシティ),１０〜３９を参照］。ｐＢＭＳ−１の構築に
用いたクローニング工程式を図１に示す。使用したＰＣ
Ｒプライマーは上記と同じである。
[マース(Marth）,J.D.、ピート(Peet）,R.、クレブス(K
rebs),E.G.およびパールムッター(Perlmutter),R.(１９
８５年）の「Cell」,４３,３９３〜４０４]をベクター
ｐＧＥＸ−２Ｔ(ファルマシア製）の充填Ｅｃｏ−Ｒ１
部位にクローン化する。得られるプラスミドｐＧＥＸ−
ｌｃｋは、大腸菌細胞にトランスフェクションすると、
グルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼ／Ｌｃｋ(Ｇｓ
ｔＬｃｋ）融合タンパク質を発現することができる。ｐ
ＧＥＸ−ｌｃｋからのＧｓｔＬｃｋコード配列をＰＣＲ
により増幅する。５'ＰＣＲプライマー：５'ＴＡＴ Ａ
ＡＡ ＴＡＴ ＧＴＣ ＣＣＣ ＴＡＴ ＡＣＴ Ａ
３' (配列番号３） をアプライド・バイオシステムズ・インコーポレイテッ
ド製のモデル３８０Ａシンセサイザーで合成する。この
プライマーはＧｓｔコード配列の５'領域にハイブリッ
ド形成し、バキュロウイルスポリヘドリン遺伝子のリボ
ソーム結合部位をコードする。３'ＰＣＲプライマー：
５'ＣＧＴ ＣＡＧ ＴＣＡ ＧＴＣ ＡＣＧ ＡＴ３' (配列番号４） は、ｐＧＥＸ−２Ｔのポリリンカーの３'配列にすばや
くハイブリッド形成する。このプライマー対は、Ｇｓｔ
／挿入物融合体としてｐＧＥＸ−２Ｔのポリリンカーに
クローン化したいずれの配列の増幅にも用いることがで
きる。増幅されたＧｓｔＬｃｋコード配列はベクターｐ
ＣＲ１０００(インビトロゲン・インコーポレイテッド
製）にクローン化して、プラスミドｐＣＲ１０００−Ｇ
ｓｔＬｃｋを得る。容易にｐＣＲ−増幅ＤＮＡをクロー
ニングするようｐＣＲ１０００ベクターを設計し、中間
体クローニングベクターとして用いる。ＧｓｔＬｃｋコ
ード配列を持つｐＣＲ１０００−ＧｓｔＬｃｋからのＢ
ｇｌ−ＩＩフラグメントであるＮｏｔ−１をｐＶＬ１３
９３のＮｏｔ−１、Ｂｇｌ−ＩＩ部位にクローン化する
［ルコウ(Lukow）,V.A.およびサマーズ(Summers),M.D.
(１９８８年)「Virology」,１６７,５６〜７１を参
照］。得られるプラスミド,ｐＶＬ１３９３−ＧｓｔＬ
ｃｋ(Ａ.Ｔ.Ｃ.Ｃ.受託番号（未詳）、アメリカン・タ
イプ・カルチュア・コレクション,１２３０１パークロ
ーン・ドライブ,ロックビル,メリーランド２０８５２−
１７７６）を用い、標準的な操作に従って、スポドプテ
ラ・フルギペルダ９(Ｓｆ９）細胞において組換えバキ
ュロウイルスを産生する［サマーズ、M.D.およびスミス
(Smith),G.E.(１９８７年)、「バキュロウイルスベクタ
ーおよび昆虫細胞培養操作のマニュアル」,テキサスＡ
＆Ｍ公報Ｎo.１５５５(カレッジ・ステーション、テキ
サス農業実験ステーションおよびテキサスＡ＆Ｍユニバ
ーシティ),１０〜３９を参照］。ｐＢＭＳ−１の構築に
用いたクローニング工程式を図１に示す。使用したＰＣ
Ｒプライマーは上記と同じである。
【００２３】Ｓｆ９細胞からのＧｓｔＬｃｋの精製 Ｅｘｃｅｌｌ−４００培地(ＪＲＨバイオサイエンシー
ズ製）中で撹拌培養した感染Ｓｆ９細胞(５００ml）
を、感染の４８時間後に４℃で５分間遠心分離して収穫
する。５０ｍＭトリス(ｐＨ８.０),１５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ,２ｍＭ ＥＤＴＡ,１ｍＭ ＤＴＴ(ジチオスレイトー
ル）,１％(ｖ／ｖ）ＮＰ−４０,１ｍＭ ＰＭＳＦ,０.１
mg/mlアプロチニン,０.１mg/mlロイペプチン,１ｍＭ Ｎ
ａＦおよび１ｍＭ Ｎａ3ＶＯ4の冷溶液(溶解緩衝液）
(５０ml)にて細胞を溶解する。４℃にて１００００×ｇ
で１０分間遠心分離して不溶物質を除去する。得られる
細胞溶解産物のタンパク質濃度をクーマシータンパク質
アッセイ試薬(Pierce製）を用いて定量し、濃度９.５mg
/mlを得る。
ズ製）中で撹拌培養した感染Ｓｆ９細胞(５００ml）
を、感染の４８時間後に４℃で５分間遠心分離して収穫
する。５０ｍＭトリス(ｐＨ８.０),１５０ｍＭ ＮａＣ
ｌ,２ｍＭ ＥＤＴＡ,１ｍＭ ＤＴＴ(ジチオスレイトー
ル）,１％(ｖ／ｖ）ＮＰ−４０,１ｍＭ ＰＭＳＦ,０.１
mg/mlアプロチニン,０.１mg/mlロイペプチン,１ｍＭ Ｎ
ａＦおよび１ｍＭ Ｎａ3ＶＯ4の冷溶液(溶解緩衝液）
(５０ml)にて細胞を溶解する。４℃にて１００００×ｇ
で１０分間遠心分離して不溶物質を除去する。得られる
細胞溶解産物のタンパク質濃度をクーマシータンパク質
アッセイ試薬(Pierce製）を用いて定量し、濃度９.５mg
/mlを得る。
【００２４】製造業者(ファルマシア）による解説に従
って、グルタチオン樹脂を用いるワンステップアフィニ
ティークロマトグラフィー操作を行ない、ＧｓｔＬｃｋ
タンパク質を精製する。この実験は、ＧｓｔＬｃｋタン
パク質を含有するＳｆ９細胞溶解産物(５０mg）を２ml
のグルタチオンカラムに加え、次いで溶解緩衝液(５０m
l)で洗浄して非結合物質を除去するものである。５ｍＭ
のグルタチオンを含有する溶解緩衝液をカラムの２倍容
用いて、結合したタンパク質をカラムから溶離する。溶
離したタンパク質を溶解緩衝液で希釈して１５mlにし、
Centriprep ３０ Concentrator Unit(アミコン・インコ
ーポレイテッド製)を用いて濃縮する。さらに２回の希
釈と濃縮を行って残留グルタチオンを除去する。濃縮し
たタンパク質を１０％グリセロール溶液に入れ、−７０
℃で保管する。この操作により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよ
びクーマシーブルー着色分析にて定量した純度９９％以
上のＧｓｔＬｃｋ(２８.０mg）が得られる。
って、グルタチオン樹脂を用いるワンステップアフィニ
ティークロマトグラフィー操作を行ない、ＧｓｔＬｃｋ
タンパク質を精製する。この実験は、ＧｓｔＬｃｋタン
パク質を含有するＳｆ９細胞溶解産物(５０mg）を２ml
のグルタチオンカラムに加え、次いで溶解緩衝液(５０m
l)で洗浄して非結合物質を除去するものである。５ｍＭ
のグルタチオンを含有する溶解緩衝液をカラムの２倍容
用いて、結合したタンパク質をカラムから溶離する。溶
離したタンパク質を溶解緩衝液で希釈して１５mlにし、
Centriprep ３０ Concentrator Unit(アミコン・インコ
ーポレイテッド製)を用いて濃縮する。さらに２回の希
釈と濃縮を行って残留グルタチオンを除去する。濃縮し
たタンパク質を１０％グリセロール溶液に入れ、−７０
℃で保管する。この操作により、ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよ
びクーマシーブルー着色分析にて定量した純度９９％以
上のＧｓｔＬｃｋ(２８.０mg）が得られる。
【００２５】Ｇｓｔペプチド配列の欠失したｐ５６lck
タンパク質を得るために、タンパク質分解酵素トロンビ
ンでＧｓｔＬｃｋを消化して切断ｐ５６lck(cｐ５
６lck）を生産する。この操作は、２.５ｍＭ ＣａＣｌ2
を含有する溶解緩衝液(５０ml)中の２０mgの精製Ｇｓｔ
Ｌｃｋにトロンビン(５mg)を加え、２５℃で１時間消化
するものである。非切断ＧｓｔＬｃｋと切断されたＧｓ
ｔを分離するために、グルタチオン樹脂(２０ml)を混合
する。遠心分離してグルタチオン樹脂を除去すると、上
清にｃｐ５６lckが残る。この操作により、組換えｐ５
６lck(約５mg)が得られ、これを１０％グリセロール
中、−７０℃で保管する。
タンパク質を得るために、タンパク質分解酵素トロンビ
ンでＧｓｔＬｃｋを消化して切断ｐ５６lck(cｐ５
６lck）を生産する。この操作は、２.５ｍＭ ＣａＣｌ2
を含有する溶解緩衝液(５０ml)中の２０mgの精製Ｇｓｔ
Ｌｃｋにトロンビン(５mg)を加え、２５℃で１時間消化
するものである。非切断ＧｓｔＬｃｋと切断されたＧｓ
ｔを分離するために、グルタチオン樹脂(２０ml)を混合
する。遠心分離してグルタチオン樹脂を除去すると、上
清にｃｐ５６lckが残る。この操作により、組換えｐ５
６lck(約５mg)が得られ、これを１０％グリセロール
中、−７０℃で保管する。
【００２６】免疫複合体タンパク質キナーゼアッセイ 免疫複合体上におけるタンパク質キナーゼ活性の分析を
次の文献に従って行う。ヴェイレット(Veillette）,
A.、ホラック(Horak）,I.D.、ホラック(Horak）,E.M.、
ブックマン(Bookman),M.A.およびボーレン(Bolen）,J.
A.(１９８８年）「Mol. Cell. Biol.」,８,４３５３〜
４３６１。簡単に述べると、ホルマリン固定したスタフ
ィロコッカス・アウレウス(Staphyloccocus aureus）(P
ansorbin,カルバイオケム製）を添加することにより、
細胞溶解産物および指示された抗血清から形成した免疫
複合体を集め、溶解緩衝液中で充分に洗浄する。１２.
５μＣｉの[γ32Ｐ]−ＡＴＰ(３０００Ｃｉ／ミリモル,
ニューイングランド・ニュクリア製）を含有するキナー
ゼ緩衝液(２０ｍＭ ＭＯＰＳ,ｐＨ７,５ｍＭ ＭｎＣ
ｌ2,１ｍＭ ＡＴＰ）(３０ml)を添加することにより、
タンパク質キナーゼ反応を開始する。室温で５分間反応
を続け、等体積の２Ｘ ＳＤＳ充填緩衝液[０.１２５Ｍ
トリス−ＨＣｌ,ｐＨ６.８,４％(ｗ／ｖ）ＳＤＳ,２０
％(ｖ／ｖ）グリセロール,１０％(ｖ／ｖ）２−メルカ
プトエタノール]を加えて反応を停止する。ＳＤＳ充填
緩衝液中のリン酸化生成物を９０℃で５分間加熱し、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィー分析を行
う。対象物の32Ｐ標識バンドをゲルから切り取り、ベッ
クマンＬＳ６０００ＴＡ液体シンチレーションカウンタ
ーで測定する。
次の文献に従って行う。ヴェイレット(Veillette）,
A.、ホラック(Horak）,I.D.、ホラック(Horak）,E.M.、
ブックマン(Bookman),M.A.およびボーレン(Bolen）,J.
A.(１９８８年）「Mol. Cell. Biol.」,８,４３５３〜
４３６１。簡単に述べると、ホルマリン固定したスタフ
ィロコッカス・アウレウス(Staphyloccocus aureus）(P
ansorbin,カルバイオケム製）を添加することにより、
細胞溶解産物および指示された抗血清から形成した免疫
複合体を集め、溶解緩衝液中で充分に洗浄する。１２.
５μＣｉの[γ32Ｐ]−ＡＴＰ(３０００Ｃｉ／ミリモル,
ニューイングランド・ニュクリア製）を含有するキナー
ゼ緩衝液(２０ｍＭ ＭＯＰＳ,ｐＨ７,５ｍＭ ＭｎＣ
ｌ2,１ｍＭ ＡＴＰ）(３０ml)を添加することにより、
タンパク質キナーゼ反応を開始する。室温で５分間反応
を続け、等体積の２Ｘ ＳＤＳ充填緩衝液[０.１２５Ｍ
トリス−ＨＣｌ,ｐＨ６.８,４％(ｗ／ｖ）ＳＤＳ,２０
％(ｖ／ｖ）グリセロール,１０％(ｖ／ｖ）２−メルカ
プトエタノール]を加えて反応を停止する。ＳＤＳ充填
緩衝液中のリン酸化生成物を９０℃で５分間加熱し、Ｓ
ＤＳ−ＰＡＧＥおよびオートラジオグラフィー分析を行
う。対象物の32Ｐ標識バンドをゲルから切り取り、ベッ
クマンＬＳ６０００ＴＡ液体シンチレーションカウンタ
ーで測定する。
【００２７】可溶性タンパク質キナーゼアッセイ ＧｓｔＬｃｋおよびｃｐ５６lckの酵素活性をＬｃｋ外
因性基質であるウサギ筋肉エノラーゼ(シグマ製）をリ
ン酸化する能力によって評価する。エノラーゼリン酸化
の時間経過を定量するために、ＧｃｔＬｃｋ３μgまた
はｃｐ５６lck１μgを、エノラーゼ１２μgおよび２５
μＣｉ[γ−32Ｐ]ＡＴＰを含有するキナーセ緩衝液(１
００μl）に加え、３０℃にて反応を行い経時変化を観
察する。各時点において、反応混合物１０μlを取り、
３０μlの２Ｘ ＳＤＳ充填緩衝液を加え、９０℃で５分
間加熱する。反応生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオー
トラジオグラフィー分析を行う。エノラーゼに対応する
バンドをゲルから切り取り、液体シンチレーション分光
機で測定する。エノラーゼのＫｍを決定するために、エ
ノラーゼの連続的な希釈液を、５μＣｉ[γ−32Ｐ]−Ａ
ＴＰを含有するキナーゼ緩衝液に加え、ＧｃｔＬｃｋ
０.１μgまたはｃｐ５６lck０.０１μgのいずれかを反
応物に加える。前述の反応条件において、エノラーゼに
結合した放射性標識のカウントを前述したように測定す
る。ＡＴＰのＫｍを決定するために、[γ−3 2Ｐ]−ＡＴ
Ｐの１：１０希釈液を、エノラーゼ３μgを含有するキ
ナーゼ緩衝液に加える。各ＡＴＰ希釈液に対し、ｃｐ５
６lck１μgを合計体積が３０μlとなるように加え、３
０℃で３０秒間反応させる。２Ｘ ＳＤＳ充填緩衝液３
０μlを加えて反応を停止し、９０℃に加熱する。ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ、オートラジオグラフィーによって視覚化
されたリン酸化タンパク質、および切り取りバンドの液
体シンチレーション分光機により定量された32Ｐ結合に
よって、反応生成物を分析する。
因性基質であるウサギ筋肉エノラーゼ(シグマ製）をリ
ン酸化する能力によって評価する。エノラーゼリン酸化
の時間経過を定量するために、ＧｃｔＬｃｋ３μgまた
はｃｐ５６lck１μgを、エノラーゼ１２μgおよび２５
μＣｉ[γ−32Ｐ]ＡＴＰを含有するキナーセ緩衝液(１
００μl）に加え、３０℃にて反応を行い経時変化を観
察する。各時点において、反応混合物１０μlを取り、
３０μlの２Ｘ ＳＤＳ充填緩衝液を加え、９０℃で５分
間加熱する。反応生成物のＳＤＳ−ＰＡＧＥおよびオー
トラジオグラフィー分析を行う。エノラーゼに対応する
バンドをゲルから切り取り、液体シンチレーション分光
機で測定する。エノラーゼのＫｍを決定するために、エ
ノラーゼの連続的な希釈液を、５μＣｉ[γ−32Ｐ]−Ａ
ＴＰを含有するキナーゼ緩衝液に加え、ＧｃｔＬｃｋ
０.１μgまたはｃｐ５６lck０.０１μgのいずれかを反
応物に加える。前述の反応条件において、エノラーゼに
結合した放射性標識のカウントを前述したように測定す
る。ＡＴＰのＫｍを決定するために、[γ−3 2Ｐ]−ＡＴ
Ｐの１：１０希釈液を、エノラーゼ３μgを含有するキ
ナーゼ緩衝液に加える。各ＡＴＰ希釈液に対し、ｃｐ５
６lck１μgを合計体積が３０μlとなるように加え、３
０℃で３０秒間反応させる。２Ｘ ＳＤＳ充填緩衝液３
０μlを加えて反応を停止し、９０℃に加熱する。ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ、オートラジオグラフィーによって視覚化
されたリン酸化タンパク質、および切り取りバンドの液
体シンチレーション分光機により定量された32Ｐ結合に
よって、反応生成物を分析する。
【００２８】他の生化学的アッセイおよび材料 先行文献の記載に従ってウサギ抗Ｌｃｋ抗血清を用いる
Ｌｃｋ免疫ブロットアッセイを行う［ヴェイレット、ブ
ックマン、ホラック,E.M.およびボーレン(１９８８年）
「Cell」,５５,３０１〜３０８。スタフィロコッカス・
アウレウスＶ８プロテアーゼ(ピアス製）を用いる部分
的タンパク質分解ペプチド分析も先行文献の記載に従っ
て行う。ヴェイレット、ホラック,I.D.、ホラック,E.
M.、ブックマンおよびボーレン(１９８８年）「Mol. Ce
ll. Biol.」,８,４３５３〜４３６１；マース(Marth),
J.D.、クーパー(Cooper）,J.A.、キング(King）,C.S.、
ジーグラー(Ziegler),S.F.、ティンカー(Tinker),D.
A,、オベレル(Overell),R.A.、クレブスおよびパールム
ッター(１９８８年)「Mol. Cell. Biol.」,８,５４０〜
５５０を参照］。ヒトＴ細胞リンパ腫セルラインＣＥＭ
を、１０％(ｖ／ｖ）ウシ胎児血清および抗生物質(ペニ
シリン／ストレプトマイシン）を追加したＲＰＭＩ１６
４０培地中で成長させる。免疫沈降実験のために、該細
胞をリン酸緩衝塩類溶液で洗浄し、遠心分離によって集
め、溶解緩衝液に溶解し、濃度１mg/mlに調節してから
抗Ｌｃｋ抗血清を加える。ウサギを精製Ｇｓｔで免疫感
作してＧｓｔに対する抗血清を調製する。Ｌｃｋアミノ
酸３９〜５８に対する抗血清が先行文献に記載されてい
る［ヴェイレット、ブックマン、ホラック,E.M.および
ボーレン(１９８８年）「Cell」,５５,３０１〜３０８
を参照］。
Ｌｃｋ免疫ブロットアッセイを行う［ヴェイレット、ブ
ックマン、ホラック,E.M.およびボーレン(１９８８年）
「Cell」,５５,３０１〜３０８。スタフィロコッカス・
アウレウスＶ８プロテアーゼ(ピアス製）を用いる部分
的タンパク質分解ペプチド分析も先行文献の記載に従っ
て行う。ヴェイレット、ホラック,I.D.、ホラック,E.
M.、ブックマンおよびボーレン(１９８８年）「Mol. Ce
ll. Biol.」,８,４３５３〜４３６１；マース(Marth),
J.D.、クーパー(Cooper）,J.A.、キング(King）,C.S.、
ジーグラー(Ziegler),S.F.、ティンカー(Tinker),D.
A,、オベレル(Overell),R.A.、クレブスおよびパールム
ッター(１９８８年)「Mol. Cell. Biol.」,８,５４０〜
５５０を参照］。ヒトＴ細胞リンパ腫セルラインＣＥＭ
を、１０％(ｖ／ｖ）ウシ胎児血清および抗生物質(ペニ
シリン／ストレプトマイシン）を追加したＲＰＭＩ１６
４０培地中で成長させる。免疫沈降実験のために、該細
胞をリン酸緩衝塩類溶液で洗浄し、遠心分離によって集
め、溶解緩衝液に溶解し、濃度１mg/mlに調節してから
抗Ｌｃｋ抗血清を加える。ウサギを精製Ｇｓｔで免疫感
作してＧｓｔに対する抗血清を調製する。Ｌｃｋアミノ
酸３９〜５８に対する抗血清が先行文献に記載されてい
る［ヴェイレット、ブックマン、ホラック,E.M.および
ボーレン(１９８８年）「Cell」,５５,３０１〜３０８
を参照］。
【００２９】結果 発現ベクターの構築 図１は発現ベクターｐＢＭＳ−１の創製に用いたクロー
ニングの組み立ての概略である。ｐＧＥＸ−２Ｔからの
Ｇｓｔコード配列をＰＣＲ増幅によってクローン化し、
バキュロウイルス発現ベクターｐＶＬ１３９３にライゲ
ートする。５'ＰＣＲプライマーはＧｓｔコード配列の
翻訳がＳｆ９細胞内で最大限に行われるように設計す
る。このことは、Ｇｓｔの開始メチオニンの周囲の配列
を、バキュロウイルスポリヘドリン遺伝子のリボソーム
結合部位をコードするように変化させることによって成
し遂げられる。ｐＢＭＳ−１ポリリンカーは９つの独特
のクローニング部位を持っており、Ｓｆ９細胞内にＧｓ
ｔ融合タンパク質としての挿入物を発現する組換えバキ
ュロウイルスの作製に用いることができる。
ニングの組み立ての概略である。ｐＧＥＸ−２Ｔからの
Ｇｓｔコード配列をＰＣＲ増幅によってクローン化し、
バキュロウイルス発現ベクターｐＶＬ１３９３にライゲ
ートする。５'ＰＣＲプライマーはＧｓｔコード配列の
翻訳がＳｆ９細胞内で最大限に行われるように設計す
る。このことは、Ｇｓｔの開始メチオニンの周囲の配列
を、バキュロウイルスポリヘドリン遺伝子のリボソーム
結合部位をコードするように変化させることによって成
し遂げられる。ｐＢＭＳ−１ポリリンカーは９つの独特
のクローニング部位を持っており、Ｓｆ９細胞内にＧｓ
ｔ融合タンパク質としての挿入物を発現する組換えバキ
ュロウイルスの作製に用いることができる。
【００３０】図２の模式図はｐＶＬ１３９３にクローン
化されたＧｓｔＬｃｋコード配列の融合連結点を描いた
ものである。トロンビン切断部位も示されている。この
プラスミドｐＶＬ１３９３−ＧｓｔＬｃｋを用いて、Ｓ
ｆ９細胞内に大量のＧｓｔＬｃｋ融合タンパク質を発現
する組換えバキュロウイルスを作製する。ＧｓｔＬｃｋ
タンパク質のトロンビン切断により、Ｌｃｋのアミノ末
端に追加の１３個のアミノ酸を持つ組換えｐ５６lck(ｃ
ｐ５６lck）分子が得られる。これらの追加のアミノ酸
は、組換えｐ５６lckのインビトロでの酵素活性におい
ては、明らかな影響は見られない。この影響は、ｃｐ５
６lckおよび野生型ｐ５６lckのＳｆ９細胞内で発現され
る免疫複合体タンパク質キナーゼ活性を比較することに
よって測定される。
化されたＧｓｔＬｃｋコード配列の融合連結点を描いた
ものである。トロンビン切断部位も示されている。この
プラスミドｐＶＬ１３９３−ＧｓｔＬｃｋを用いて、Ｓ
ｆ９細胞内に大量のＧｓｔＬｃｋ融合タンパク質を発現
する組換えバキュロウイルスを作製する。ＧｓｔＬｃｋ
タンパク質のトロンビン切断により、Ｌｃｋのアミノ末
端に追加の１３個のアミノ酸を持つ組換えｐ５６lck(ｃ
ｐ５６lck）分子が得られる。これらの追加のアミノ酸
は、組換えｐ５６lckのインビトロでの酵素活性におい
ては、明らかな影響は見られない。この影響は、ｃｐ５
６lckおよび野生型ｐ５６lckのＳｆ９細胞内で発現され
る免疫複合体タンパク質キナーゼ活性を比較することに
よって測定される。
【００３１】Ｓｆ９細胞からのＧｓｔＬｃｋの精製 実験操作のところで概略を述べたように、ＧｓｔＬｃｋ
融合タンパク質を発現するＳｆ９細胞から全界面活性剤
溶解産物を調製する。ＧｓｔＬｃｋを含む溶解産物をグ
ルタチオン−セファロースカラムに結合させ、５ｍＭの
グルタチオンの溶解緩衝液溶液で溶離する。このカラム
からのグルタチオン結合産物をクーマシー着色し、ＳＤ
Ｓアクリルアミドゲル上で画分化を行って分析する。図
３のＡに示すように、予測されるＧｓｔＬｃｋ融合タン
パク質の大きさに対応する、およそ８３ｋＤａの単一ポ
リペプチドが認められる。トロンビン切断(図３のＡ,レ
ーン３）にともなって、組換えＬｃｋタンパク質がおよ
そ５６ｋＤａの２つの接近したバンドとして移動するの
が認められる。
融合タンパク質を発現するＳｆ９細胞から全界面活性剤
溶解産物を調製する。ＧｓｔＬｃｋを含む溶解産物をグ
ルタチオン−セファロースカラムに結合させ、５ｍＭの
グルタチオンの溶解緩衝液溶液で溶離する。このカラム
からのグルタチオン結合産物をクーマシー着色し、ＳＤ
Ｓアクリルアミドゲル上で画分化を行って分析する。図
３のＡに示すように、予測されるＧｓｔＬｃｋ融合タン
パク質の大きさに対応する、およそ８３ｋＤａの単一ポ
リペプチドが認められる。トロンビン切断(図３のＡ,レ
ーン３）にともなって、組換えＬｃｋタンパク質がおよ
そ５６ｋＤａの２つの接近したバンドとして移動するの
が認められる。
【００３２】ＧｓｔＬｃｋおよびｃｐ５６lckの機能分
析 精製ＧｓｔＬｃｋとｃｐ５６lckタンパク質のキナーゼ
活性を評価するために、タンパク質キナーゼアッセイを
行う。これらの反応の結果(図３のＢ）から、精製Ｇｓ
ｔＬｃｋとｃｐ５６lckそれらの自己リン酸化能力を維
持していることがわかる。予測されるとおり、Ｇｓｔ精
製物にはキナーゼ活性が検出されない。図３のＣに示す
データは、ｐ５６lckの独特な部位に対するポリクロー
ナルウサギ抗体を用いる、対応するＬｃｋの免疫ブロッ
トを表す。キナーゼ反応で検出されるＬｃｋタンパク質
の相対量に基づいて、ｃｐ５６lckの特異的活性がＧｓ
ｔＬｃｋ融合タンパク質の活性よりも僅かに高いことが
わかる。非放射性ＡＴＰを用いて生産される、類似の反
応産物である抗ホスホチロシンの免疫ブロット分析か
ら、自己リン酸化産物(ならびに他の実験で用いられる
外因性タンパク質基質エノラーゼのリン酸化）がチロシ
ン残基でリン酸化されることがわかる。さらに、Ｇｓｔ
Ｌｃｋおよびｃｐ５６lck反応の自己リン酸化産物の部
分Ｖ８ペプチド分析から、免疫複合体のキナーゼアッセ
イで自己リン酸化されたｐ５６lck由来のＴ細胞のホス
ホペプチドと区別がつかない主要Ｖ８ホスホペプチドが
得られる。
析 精製ＧｓｔＬｃｋとｃｐ５６lckタンパク質のキナーゼ
活性を評価するために、タンパク質キナーゼアッセイを
行う。これらの反応の結果(図３のＢ）から、精製Ｇｓ
ｔＬｃｋとｃｐ５６lckそれらの自己リン酸化能力を維
持していることがわかる。予測されるとおり、Ｇｓｔ精
製物にはキナーゼ活性が検出されない。図３のＣに示す
データは、ｐ５６lckの独特な部位に対するポリクロー
ナルウサギ抗体を用いる、対応するＬｃｋの免疫ブロッ
トを表す。キナーゼ反応で検出されるＬｃｋタンパク質
の相対量に基づいて、ｃｐ５６lckの特異的活性がＧｓ
ｔＬｃｋ融合タンパク質の活性よりも僅かに高いことが
わかる。非放射性ＡＴＰを用いて生産される、類似の反
応産物である抗ホスホチロシンの免疫ブロット分析か
ら、自己リン酸化産物(ならびに他の実験で用いられる
外因性タンパク質基質エノラーゼのリン酸化）がチロシ
ン残基でリン酸化されることがわかる。さらに、Ｇｓｔ
Ｌｃｋおよびｃｐ５６lck反応の自己リン酸化産物の部
分Ｖ８ペプチド分析から、免疫複合体のキナーゼアッセ
イで自己リン酸化されたｐ５６lck由来のＴ細胞のホス
ホペプチドと区別がつかない主要Ｖ８ホスホペプチドが
得られる。
【００３３】さらに、ＧｓｔＬｃｋ酵素活性のレベル
を、Ｔ細胞界面活性剤溶解産物から免疫沈降した野生型
ｐ５６lckの酵素活性と比較する。これらの実験のため
に、感染したＳｆ９界面活性剤溶解産物からＧｓｔＬｃ
ｋを抗Ｌｃｋ抗血清、抗Ｇｓｔ抗血清またはグルタチオ
ン−セファロースビーズで沈降する。Ｔ細胞溶解産物か
らのｐ５６lckを抗Ｌｃｋ抗血清で免疫沈降する。種々
の複合体を溶解緩衝液で充分に洗浄し、等量の２つのア
リコートに分割する。ひとつのアリコートはタンパク質
キナーゼアッセイ(図４のＢ）に使用し、もう一方はＬ
ｃｋ免疫ブロット分析(図４のＡ）に使用する。この実
験の結果は、自己リン酸化によって評価されるように、
抗体またはグルタチオンビーズのいずれかを用いるＧｓ
ｔＬｃｋタンパク質の沈降により、類似した特異的活性
を持つ分子が得られることを示している。Ｔ細胞由来の
ｐ５６lckと比較すると、Ｓｆ９由来のＧｓｔＬｃｋタ
ンパク質の特異的活性が非常に高いことが示される。
を、Ｔ細胞界面活性剤溶解産物から免疫沈降した野生型
ｐ５６lckの酵素活性と比較する。これらの実験のため
に、感染したＳｆ９界面活性剤溶解産物からＧｓｔＬｃ
ｋを抗Ｌｃｋ抗血清、抗Ｇｓｔ抗血清またはグルタチオ
ン−セファロースビーズで沈降する。Ｔ細胞溶解産物か
らのｐ５６lckを抗Ｌｃｋ抗血清で免疫沈降する。種々
の複合体を溶解緩衝液で充分に洗浄し、等量の２つのア
リコートに分割する。ひとつのアリコートはタンパク質
キナーゼアッセイ(図４のＢ）に使用し、もう一方はＬ
ｃｋ免疫ブロット分析(図４のＡ）に使用する。この実
験の結果は、自己リン酸化によって評価されるように、
抗体またはグルタチオンビーズのいずれかを用いるＧｓ
ｔＬｃｋタンパク質の沈降により、類似した特異的活性
を持つ分子が得られることを示している。Ｔ細胞由来の
ｐ５６lckと比較すると、Ｓｆ９由来のＧｓｔＬｃｋタ
ンパク質の特異的活性が非常に高いことが示される。
【００３４】ＧｓｔＬｃｋおよびｃｐ５６lckの動力学
的パラメーターをさらに特徴付けるために、外因性基質
としてウサギ筋肉エノラーゼを用いて融合タンパク質お
よび切断酵素のキナーゼ活性を研究する。図５のデータ
によって示されるように、ＧｓｔＬｃｋによるエノラー
ゼのリン酸化は、時間と濃度の両方に従属することがわ
かる。ｃｐ５６lckについても同様の結果が得られる(図
６）。３０秒間の反応時間を用いてＡＴＰおよびエノラ
ーゼに対するＫｍおよびＶｍａｘ値を決定する。ｃｐ５
６lckのエノラーゼに対する親和性は、ＧｓｔＬｃｋの
エノラーゼに対する親和性より約１０倍高い。さらに重
大なことは、ｃｐ５６lckに対して決定されたＫｍおよ
びＶｍａｘ値が、他のsrcファミリーのメンバーに対し
て得られた値に匹敵することである。
的パラメーターをさらに特徴付けるために、外因性基質
としてウサギ筋肉エノラーゼを用いて融合タンパク質お
よび切断酵素のキナーゼ活性を研究する。図５のデータ
によって示されるように、ＧｓｔＬｃｋによるエノラー
ゼのリン酸化は、時間と濃度の両方に従属することがわ
かる。ｃｐ５６lckについても同様の結果が得られる(図
６）。３０秒間の反応時間を用いてＡＴＰおよびエノラ
ーゼに対するＫｍおよびＶｍａｘ値を決定する。ｃｐ５
６lckのエノラーゼに対する親和性は、ＧｓｔＬｃｋの
エノラーゼに対する親和性より約１０倍高い。さらに重
大なことは、ｃｐ５６lckに対して決定されたＫｍおよ
びＶｍａｘ値が、他のsrcファミリーのメンバーに対し
て得られた値に匹敵することである。
【００３５】大腸菌内で機能性ＧｓｔＬｃｋを産生する
という試みは失敗した。得られる融合タンパク質は発現
したが、それは検出し得るタンパク質キナーゼ活性を持
たず、界面活性剤に不溶であった。後者の特徴は、細菌
における多くの真核性タンパク質の発現に共通する［マ
ーストン(Marston）,A.O.(１９８６年）「J. Bioche
m.」,２４０,１〜１２；ミラー(Miller）,D.W.、サハー
(Saher）,P.およびミラー(Miller),L.K.(１９８６年)
「Genetic Engineering」,vol.８,２７７〜２９８頁,プ
レナム(Plenum）,ニューヨーク；ミラー,L.K.(１９８９
年）「Ann. Rev. Microbiol.」,４２,１７７〜１９９を
参照］。Ｓｆ９細胞における真核性タンパク質の発現の
利点は、タンパク質の溶解性を維持するためのタンパク
質の折りたたみおよび翻訳後修飾を行う能力をこの細胞
に与えることである。Ｌｃｋの場合、常套のバキュロウ
イルス発現ベクターを用いるＳｆ９における野生型ｐ５
６lckの発現においては、Ｌｃｋはセリンおよびスレオ
ニン残基でミリスチン酸化およびリン酸化される［トー
マス(Thomas）,J.E.、ソリアノ(Soriano）,P.およびブ
ラッジ(Brugge),J.S.(１９９１年）「Science」,２５
４,５６８〜５７１を参照］。この系においてＬｃｋは
アミノ末端でのＧｓｔとの融合タンパク質として発現す
るので、ミリスチン酸化は起こりそうにない。ＧｓｔＬ
ｃｋがセリンまたはスレオニン残基でリン酸化されるか
どうかは決定しなかった。
という試みは失敗した。得られる融合タンパク質は発現
したが、それは検出し得るタンパク質キナーゼ活性を持
たず、界面活性剤に不溶であった。後者の特徴は、細菌
における多くの真核性タンパク質の発現に共通する［マ
ーストン(Marston）,A.O.(１９８６年）「J. Bioche
m.」,２４０,１〜１２；ミラー(Miller）,D.W.、サハー
(Saher）,P.およびミラー(Miller),L.K.(１９８６年)
「Genetic Engineering」,vol.８,２７７〜２９８頁,プ
レナム(Plenum）,ニューヨーク；ミラー,L.K.(１９８９
年）「Ann. Rev. Microbiol.」,４２,１７７〜１９９を
参照］。Ｓｆ９細胞における真核性タンパク質の発現の
利点は、タンパク質の溶解性を維持するためのタンパク
質の折りたたみおよび翻訳後修飾を行う能力をこの細胞
に与えることである。Ｌｃｋの場合、常套のバキュロウ
イルス発現ベクターを用いるＳｆ９における野生型ｐ５
６lckの発現においては、Ｌｃｋはセリンおよびスレオ
ニン残基でミリスチン酸化およびリン酸化される［トー
マス(Thomas）,J.E.、ソリアノ(Soriano）,P.およびブ
ラッジ(Brugge),J.S.(１９９１年）「Science」,２５
４,５６８〜５７１を参照］。この系においてＬｃｋは
アミノ末端でのＧｓｔとの融合タンパク質として発現す
るので、ミリスチン酸化は起こりそうにない。ＧｓｔＬ
ｃｋがセリンまたはスレオニン残基でリン酸化されるか
どうかは決定しなかった。
【００３６】議論 ｌｃｋコード配列をフレーム内のＧｓｔコード領域から
下流にライゲートして、Ｇｓｔ−ｐ５６lck融合タンパ
ク質をコードしうるプラスミドを得る。この方法で産生
したｐ５６lckは、高活性タンパク質キナーゼであり、
期待されるsrcファミリーのメンバーの生化学的特性を
表す。自己リン酸化および外因性基質であるウサギ筋肉
エノラーゼのチロシンリン酸化によって測定されたよう
に、ＧｓｔＬｃｋ融合タンパク質およびｃｐ５６lckの
両方の分析から、それぞれが重要なタンパク質チロシン
キナーゼ活性を保存していることが示される。重要なこ
とは、Ｌｃｋに融合されているかまたはトロンビンによ
るキナーゼからの切断をともなっているかのいずれにせ
よ、Ｇｓｔ配列は免疫複合体キナーゼアッセイまたは溶
液中で行われるキナーゼアッセイにおいてリン酸化され
ないということである。免疫複合体タンパク質キナーゼ
アッセイで測定すると、ＧｓｔＬｃｋおよびｃｐ５６
lckの両方ともが、Ｔ細胞由来のｐ５６lckよりも実質的
に高い特異的活性をもつことがわかる。我々は、Ｓｆ９
細胞においてＬｃｋのリン酸化部位を決定しなかったけ
れども、この細胞におけるＬｃｋのカルボキシ末端チロ
シン(チロシン５０５）リン酸化が減少する結果とし
て、特異的活性が変更されるように思われる［ヴェイレ
ット、ホラック,I.D.、ホラック,E.M.、ブックマンおよ
びボーレン(１９８８年）「Mol. Cell. Biol.」,８,４
３５３〜４３６１；マース、クーパー、キング、ジーグ
ラー、ティンカー、オベレル、クレブスおよびパールム
ッター(１９８８年)「Mol. Cell. Biol.」,８,５４０〜
５５０を参照］。Ｓｆ９由来のｐｐ６０c-srcに認めら
れるように[モーガン(Morgan）,D.O.、カプラン(Kapla
n）,J.M.、ビショップ(Bichop）,J.M.およびバーマス(V
armus),H.E.(１９８９年)「Cell」,５７,７７５〜７８
６を参照]、チロシン５０５のリン酸化の不足はおそら
く、この部位でＳｒｃクラスのキナ−ゼをリン酸化する
と考えられているＣｓｋなどの他のチロシンタンパク質
キナーゼの発現がないためである［オカダ(Okada）,M.
およびナカガワ(Nakagawa),H.(１９８９年)「J. Biol.
Chem.」,２６４,２０８８６〜２０８９３；オカダおよ
びナカガワ(１９８８年）「Biochem. Biophys. Res. Co
mmn.」,１５４,７９６〜８０２を参照］。
下流にライゲートして、Ｇｓｔ−ｐ５６lck融合タンパ
ク質をコードしうるプラスミドを得る。この方法で産生
したｐ５６lckは、高活性タンパク質キナーゼであり、
期待されるsrcファミリーのメンバーの生化学的特性を
表す。自己リン酸化および外因性基質であるウサギ筋肉
エノラーゼのチロシンリン酸化によって測定されたよう
に、ＧｓｔＬｃｋ融合タンパク質およびｃｐ５６lckの
両方の分析から、それぞれが重要なタンパク質チロシン
キナーゼ活性を保存していることが示される。重要なこ
とは、Ｌｃｋに融合されているかまたはトロンビンによ
るキナーゼからの切断をともなっているかのいずれにせ
よ、Ｇｓｔ配列は免疫複合体キナーゼアッセイまたは溶
液中で行われるキナーゼアッセイにおいてリン酸化され
ないということである。免疫複合体タンパク質キナーゼ
アッセイで測定すると、ＧｓｔＬｃｋおよびｃｐ５６
lckの両方ともが、Ｔ細胞由来のｐ５６lckよりも実質的
に高い特異的活性をもつことがわかる。我々は、Ｓｆ９
細胞においてＬｃｋのリン酸化部位を決定しなかったけ
れども、この細胞におけるＬｃｋのカルボキシ末端チロ
シン(チロシン５０５）リン酸化が減少する結果とし
て、特異的活性が変更されるように思われる［ヴェイレ
ット、ホラック,I.D.、ホラック,E.M.、ブックマンおよ
びボーレン(１９８８年）「Mol. Cell. Biol.」,８,４
３５３〜４３６１；マース、クーパー、キング、ジーグ
ラー、ティンカー、オベレル、クレブスおよびパールム
ッター(１９８８年)「Mol. Cell. Biol.」,８,５４０〜
５５０を参照］。Ｓｆ９由来のｐｐ６０c-srcに認めら
れるように[モーガン(Morgan）,D.O.、カプラン(Kapla
n）,J.M.、ビショップ(Bichop）,J.M.およびバーマス(V
armus),H.E.(１９８９年)「Cell」,５７,７７５〜７８
６を参照]、チロシン５０５のリン酸化の不足はおそら
く、この部位でＳｒｃクラスのキナ−ゼをリン酸化する
と考えられているＣｓｋなどの他のチロシンタンパク質
キナーゼの発現がないためである［オカダ(Okada）,M.
およびナカガワ(Nakagawa),H.(１９８９年)「J. Biol.
Chem.」,２６４,２０８８６〜２０８９３；オカダおよ
びナカガワ(１９８８年）「Biochem. Biophys. Res. Co
mmn.」,１５４,７９６〜８０２を参照］。
【００３７】前述の操作を用いると、５０mgの全Ｓｆ９
タンパク質溶解産物から、純度９９％以上(銀およびク
ーマシー着色による）の組換えｐ５６lckが２８０mg得
られる。この系では、１リットルの感染Ｓｆ９細胞か
ら、およそ８〜１０mgの精製組換えＬｃｋが産生され
る。前述の操作はＧｓｔＬｙｎＢ、ＧｓｔＳｙｋ、Ｇｓ
ｔＢｌｋ、ＧｓｔＦｙｎおよびＧｓｔＹｅｓ融合タンパ
ク質の産生にも使用され、その結果はここに記載したＧ
ｓｔＬｃｋの結果に匹敵する。ＧＳＴのための遺伝子は
下記表に示す位置で酵素切断することができる。このよ
うな核酸フラグメントを用いて、本発明の融合タンパク
質において部分的Ｇｓｔポリペプチドを生産することが
できる。
タンパク質溶解産物から、純度９９％以上(銀およびク
ーマシー着色による）の組換えｐ５６lckが２８０mg得
られる。この系では、１リットルの感染Ｓｆ９細胞か
ら、およそ８〜１０mgの精製組換えＬｃｋが産生され
る。前述の操作はＧｓｔＬｙｎＢ、ＧｓｔＳｙｋ、Ｇｓ
ｔＢｌｋ、ＧｓｔＦｙｎおよびＧｓｔＹｅｓ融合タンパ
ク質の産生にも使用され、その結果はここに記載したＧ
ｓｔＬｃｋの結果に匹敵する。ＧＳＴのための遺伝子は
下記表に示す位置で酵素切断することができる。このよ
うな核酸フラグメントを用いて、本発明の融合タンパク
質において部分的Ｇｓｔポリペプチドを生産することが
できる。
【表１】
【表２】
【００３８】
【００３９】配列番号：１ 配列の長さ：６９３塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列の特徴： 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１..６９３ 配列：
【化１】
【化２】
【００４０】配列番号：２ 配列の長さ：２３１アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列
【化３】
【化４】
【図１】 ｐＢＭＳ−１の構築の模式図である。
【図２】 ｐＢＭＳ−１の構築の模式図である。
【図３】 Ｓｆ９細胞から精製されたＧｓｔＬｃｋの分
析結果を示す電気泳動の図面代用写真である。Ａ：ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ分析およびクーマシー着色パターン。Ｂ：
自己リン酸化ＧｓｔＬｃｋのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。
Ｃ：Ｂで用いたサンプルのポリクローナルウサギ抗ｌｃ
ｋ抗体を用いるウエスタンブロット分析。
析結果を示す電気泳動の図面代用写真である。Ａ：ＳＤ
Ｓ−ＰＡＧＥ分析およびクーマシー着色パターン。Ｂ：
自己リン酸化ＧｓｔＬｃｋのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析。
Ｃ：Ｂで用いたサンプルのポリクローナルウサギ抗ｌｃ
ｋ抗体を用いるウエスタンブロット分析。
【図４】 ＧｓｔＬｃｋの自己リン酸化の結果を示す電
気泳動の図面代用写真である。Ａ：ｐ５６lckのウエス
タンブロット分析。Ｂ：Ａで用いた方法で精製したｐ５
６lckまたはＧｓｔＬｃｋの酵素活性の分析。
気泳動の図面代用写真である。Ａ：ｐ５６lckのウエス
タンブロット分析。Ｂ：Ａで用いた方法で精製したｐ５
６lckまたはＧｓｔＬｃｋの酵素活性の分析。
【図５】 ＧｓｔＬｃｋによるエノラーゼのリン酸化の
結果を示す電気泳動の図面代用写真である。Ａ：Ｇｓｔ
Ｌｃｋ濃度の関数としてのエノラーゼのリン酸化。Ｂ：
ＧｓｔＬｃｋによるエノラーゼのリン酸化の時間による
変化。
結果を示す電気泳動の図面代用写真である。Ａ：Ｇｓｔ
Ｌｃｋ濃度の関数としてのエノラーゼのリン酸化。Ｂ：
ＧｓｔＬｃｋによるエノラーゼのリン酸化の時間による
変化。
【図６】 トロンビン切断ＧｓｔＬｃｋによるエノラー
ゼのリン酸化の結果を示す電気泳動の図面代用写真であ
る。Ａ：組換えｐ５６lckの濃度の関数としてのエノラ
ーゼのリン酸化。Ｂ：組換えｐ５６lckによるエノラー
ゼのリン酸化の時間による変化。
ゼのリン酸化の結果を示す電気泳動の図面代用写真であ
る。Ａ：組換えｐ５６lckの濃度の関数としてのエノラ
ーゼのリン酸化。Ｂ：組換えｐ５６lckによるエノラー
ゼのリン酸化の時間による変化。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成６年１１月１８日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２２
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２２】実験操作 ｐ５６lck発現ベクターの構築 マウスｌｃｋｃＤＮＡからのＳｔｕ−１フラグメント
[マース(Marth）,J.D.、ピート(Peet）,R.、クレブス(K
rebs),E.G.およびパールムッター(Perlmutter),R.(１９
８５年）の「Cell」,４３,３９３〜４０４]をベクター
ｐＧＥＸ−２Ｔ(ファルマシア製）の充填Ｅｃｏ−Ｒ１
部位にクローン化する。得られるプラスミドｐＧＥＸ−
ｌｃｋは、大腸菌細胞にトランスフェクションすると、
グルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼ／Ｌｃｋ(Ｇｓ
ｔＬｃｋ）融合タンパク質を発現することができる。ｐ
ＧＥＸ−ｌｃｋからのＧｓｔＬｃｋコード配列をＰＣＲ
により増幅する。５'ＰＣＲプライマー：５'ＴＡＴ Ａ
ＡＡ ＴＡＴ ＧＴＣ ＣＣＣ ＴＡＴ ＡＣＴ Ａ
３' (配列番号３） をアプライド・バイオシステムズ・インコーポレイテッ
ド製のモデル３８０Ａシンセサイザーで合成する。この
プライマーはＧｓｔコード配列の５'領域にハイブリッ
ド形成し、バキュロウイルスポリヘドリン遺伝子のリボ
ソーム結合部位をコードする。３'ＰＣＲプライマー：
５'ＣＧＴ ＣＡＧ ＴＣＡ ＧＴＣ ＡＣＧ ＡＴ３' (配列番号４） は、ｐＧＥＸ−２Ｔのポリリンカーの３'配列にすばや
くハイブリッド形成する。このプライマー対は、Ｇｓｔ
／挿入物融合体としてｐＧＥＸ−２Ｔのポリリンカーに
クローン化したいずれの配列の増幅にも用いることがで
きる。増幅されたＧｓｔＬｃｋコード配列はベクターｐ
ＣＲ１０００(インビトロゲン・インコーポレイテッド
製）にクローン化して、プラスミドｐＣＲ１０００−Ｇ
ｓｔＬｃｋを得る。容易にｐＣＲ−増幅ＤＮＡをクロー
ニングするようｐＣＲ１０００ベクターを設計し、中間
体クローニングベクターとして用いる。ＧｓｔＬｃｋコ
ード配列を持つｐＣＲ１０００−ＧｓｔＬｃｋからのＢ
ｇｌ−ＩＩフラグメントであるＮｏｔ−１をｐＶＬ１３
９３のＮｏｔ−１、Ｂｇｌ−ＩＩ部位にクローン化する
［ルコウ(Lukow）,V.A.およびサマーズ(Summers),M.D.
(１９８８年)「Virology」,１６７,５６〜７１を参
照］。得られるプラスミド,ｐＶＬ１３９３−ＧｓｔＬ
ｃｋを用い、標準的な操作に従って、スポドプテラ・フ
ルギペルダ９(Ｓｆ９）細胞において組換えバキュロウ
イルスを産生する［サマーズ、M.D.およびスミス(Smit
h),G.E.(１９８７年)、「バキュロウイルスベクターお
よび昆虫細胞培養操作のマニュアル」,テキサスＡ＆Ｍ
公報Ｎo.１５５５(カレッジ・ステーション、テキサス
農業実験ステーションおよびテキサスＡ＆Ｍユニバーシ
ティ),１０〜３９を参照］。ｐＢＭＳ−１の構築に用い
たクローニング工程式を図１に示す。使用したＰＣＲプ
ライマーは上記と同じである。 ─────────────────────────────────────────────────────
[マース(Marth）,J.D.、ピート(Peet）,R.、クレブス(K
rebs),E.G.およびパールムッター(Perlmutter),R.(１９
８５年）の「Cell」,４３,３９３〜４０４]をベクター
ｐＧＥＸ−２Ｔ(ファルマシア製）の充填Ｅｃｏ−Ｒ１
部位にクローン化する。得られるプラスミドｐＧＥＸ−
ｌｃｋは、大腸菌細胞にトランスフェクションすると、
グルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼ／Ｌｃｋ(Ｇｓ
ｔＬｃｋ）融合タンパク質を発現することができる。ｐ
ＧＥＸ−ｌｃｋからのＧｓｔＬｃｋコード配列をＰＣＲ
により増幅する。５'ＰＣＲプライマー：５'ＴＡＴ Ａ
ＡＡ ＴＡＴ ＧＴＣ ＣＣＣ ＴＡＴ ＡＣＴ Ａ
３' (配列番号３） をアプライド・バイオシステムズ・インコーポレイテッ
ド製のモデル３８０Ａシンセサイザーで合成する。この
プライマーはＧｓｔコード配列の５'領域にハイブリッ
ド形成し、バキュロウイルスポリヘドリン遺伝子のリボ
ソーム結合部位をコードする。３'ＰＣＲプライマー：
５'ＣＧＴ ＣＡＧ ＴＣＡ ＧＴＣ ＡＣＧ ＡＴ３' (配列番号４） は、ｐＧＥＸ−２Ｔのポリリンカーの３'配列にすばや
くハイブリッド形成する。このプライマー対は、Ｇｓｔ
／挿入物融合体としてｐＧＥＸ−２Ｔのポリリンカーに
クローン化したいずれの配列の増幅にも用いることがで
きる。増幅されたＧｓｔＬｃｋコード配列はベクターｐ
ＣＲ１０００(インビトロゲン・インコーポレイテッド
製）にクローン化して、プラスミドｐＣＲ１０００−Ｇ
ｓｔＬｃｋを得る。容易にｐＣＲ−増幅ＤＮＡをクロー
ニングするようｐＣＲ１０００ベクターを設計し、中間
体クローニングベクターとして用いる。ＧｓｔＬｃｋコ
ード配列を持つｐＣＲ１０００−ＧｓｔＬｃｋからのＢ
ｇｌ−ＩＩフラグメントであるＮｏｔ−１をｐＶＬ１３
９３のＮｏｔ−１、Ｂｇｌ−ＩＩ部位にクローン化する
［ルコウ(Lukow）,V.A.およびサマーズ(Summers),M.D.
(１９８８年)「Virology」,１６７,５６〜７１を参
照］。得られるプラスミド,ｐＶＬ１３９３−ＧｓｔＬ
ｃｋを用い、標準的な操作に従って、スポドプテラ・フ
ルギペルダ９(Ｓｆ９）細胞において組換えバキュロウ
イルスを産生する［サマーズ、M.D.およびスミス(Smit
h),G.E.(１９８７年)、「バキュロウイルスベクターお
よび昆虫細胞培養操作のマニュアル」,テキサスＡ＆Ｍ
公報Ｎo.１５５５(カレッジ・ステーション、テキサス
農業実験ステーションおよびテキサスＡ＆Ｍユニバーシ
ティ),１０〜３９を参照］。ｐＢＭＳ−１の構築に用い
たクローニング工程式を図１に示す。使用したＰＣＲプ
ライマーは上記と同じである。 ─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成６年１２月２７日
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】特許請求の範囲
【補正方法】変更
【補正内容】
【特許請求の範囲】
【手続補正２】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００５
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００５】
【発明の構成】本発明は、タンパク質の単離体の発現方
法およびその方法に用いる発現ベクターならびに宿主細
胞に関する。さらに詳しくは本発明は、 (ａ)グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼをコード
し、バキュロウイルスプロモーターに有効に連結する第
１コード領域； (ｂ)第１コード領域と同じ解読枠内の第２コード領域；
および (ｃ)第１コード領域の下流にあり、第２コード領域が挿
入される、少なくともひとつの制限部位を含む制限領
域；からなる発現ベクターであって、その発現によって
第１および第２コード領域によってコードされる融合タ
ンパク質を産生する発現ベクターに関する。バキュロウ
イルス由来のベクターが好ましい。
法およびその方法に用いる発現ベクターならびに宿主細
胞に関する。さらに詳しくは本発明は、 (ａ)グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼをコード
し、バキュロウイルスプロモーターに有効に連結する第
１コード領域； (ｂ)第１コード領域と同じ解読枠内の第２コード領域；
および (ｃ)第１コード領域の下流にあり、第２コード領域が挿
入される、少なくともひとつの制限部位を含む制限領
域；からなる発現ベクターであって、その発現によって
第１および第２コード領域によってコードされる融合タ
ンパク質を産生する発現ベクターに関する。バキュロウ
イルス由来のベクターが好ましい。
【手続補正３】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】０００７
【補正方法】変更
【補正内容】
【０００７】さらに本発明は、 (ａ)グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼをコード
し、プロモーターに有効に連結する第１コード領域と同
じ解読枠になるように、バキュロウイルス発現ベクター
に核酸配列を挿入し； (ｂ)該ベクターを宿主細胞に導入し； (ｃ)該宿主細胞を該ベクターの発現条件下で処理して、
第１コード領域の融合タンパク質およびステップ(ａ)で
挿入した核酸を発現し； (ｄ)宿主細胞からのタンパク質をグルタチオン樹脂で処
理して、該融合タンパク質を樹脂に接着し；ついで (ｅ)接着した融合タンパク質をプロテアーゼで処理し
て、該核酸配列の発現産物を樹脂から遊離させる；こと
からなる核酸配列の発現方法に関する。
し、プロモーターに有効に連結する第１コード領域と同
じ解読枠になるように、バキュロウイルス発現ベクター
に核酸配列を挿入し； (ｂ)該ベクターを宿主細胞に導入し； (ｃ)該宿主細胞を該ベクターの発現条件下で処理して、
第１コード領域の融合タンパク質およびステップ(ａ)で
挿入した核酸を発現し； (ｄ)宿主細胞からのタンパク質をグルタチオン樹脂で処
理して、該融合タンパク質を樹脂に接着し；ついで (ｅ)接着した融合タンパク質をプロテアーゼで処理し
て、該核酸配列の発現産物を樹脂から遊離させる；こと
からなる核酸配列の発現方法に関する。
【手続補正４】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００２０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００２０】図１および図２はｐＢＭＳ−１の構築の模
式図である。図１：クローニング操作の概略 グルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼ遺伝子をＳｆ９
発現ベクターｐＶＬ１３９３のＢａｍＨ−１部位にクロ
ーン化してＧｓｔ融合タンパク質を製造した。ｐＢＭＳ
−１ポリリンカーの制限地図およびトロンビン切断部位
を示す。ここに記載のＤＮＡ配列が配列番号５であり、
ここに記載のアミノ酸配列が配列番号６である。図２：ＧｓｔＬｃｋ融合連結点 ｌｃｋ開始メチオニンコドンの２４塩基対上流に位置す
るＳｔｕ−１部位を用いてｌｃｋをＧｓｔコード領域に
結合した。ここに記載のＤＮＡ配列が配列番号７であ
り、ここに記載のアミノ酸配列が配列番号８である。図３：Ｓｆ９細胞から精製されたＧｓｔＬｃｋの分析 Ａ：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析およびクーマシー着色パター
ンレーン１は感染Ｓｆ９細胞からの全タンパク質５０μ
g；レーン２は精製ＧｓｔＬｃｋ１μg；レーン３はトロ
ンビン切断ＧｓｔＬｃｋ(組換えｐ５６lck)０.５μgの
結果を示す。 Ｂ：自己リン酸化ＧｓｔＬｃｋのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析 レーン１はＧｓｔＬｃｋの自己リン酸化；レーン２は組
換えｐ５６lckの自己リン酸化の結果を示す。 Ｃ：Ｂで用いたサンプルのポリクローナルウサギ抗ｌｃ
ｋ抗体を用いるウエスタンブロット分析 レーン１はＧｓｔＬｃｋ；レーン２は組換えｐ５６lck
の結果を示す。
式図である。図１：クローニング操作の概略 グルタチオン−ｓ−トランスフェラーゼ遺伝子をＳｆ９
発現ベクターｐＶＬ１３９３のＢａｍＨ−１部位にクロ
ーン化してＧｓｔ融合タンパク質を製造した。ｐＢＭＳ
−１ポリリンカーの制限地図およびトロンビン切断部位
を示す。ここに記載のＤＮＡ配列が配列番号５であり、
ここに記載のアミノ酸配列が配列番号６である。図２：ＧｓｔＬｃｋ融合連結点 ｌｃｋ開始メチオニンコドンの２４塩基対上流に位置す
るＳｔｕ−１部位を用いてｌｃｋをＧｓｔコード領域に
結合した。ここに記載のＤＮＡ配列が配列番号７であ
り、ここに記載のアミノ酸配列が配列番号８である。図３：Ｓｆ９細胞から精製されたＧｓｔＬｃｋの分析 Ａ：ＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析およびクーマシー着色パター
ンレーン１は感染Ｓｆ９細胞からの全タンパク質５０μ
g；レーン２は精製ＧｓｔＬｃｋ１μg；レーン３はトロ
ンビン切断ＧｓｔＬｃｋ(組換えｐ５６lck)０.５μgの
結果を示す。 Ｂ：自己リン酸化ＧｓｔＬｃｋのＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析 レーン１はＧｓｔＬｃｋの自己リン酸化；レーン２は組
換えｐ５６lckの自己リン酸化の結果を示す。 Ｃ：Ｂで用いたサンプルのポリクローナルウサギ抗ｌｃ
ｋ抗体を用いるウエスタンブロット分析 レーン１はＧｓｔＬｃｋ；レーン２は組換えｐ５６lck
の結果を示す。
【手続補正５】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００３９
【補正方法】変更
【補正内容】
【００３９】配列番号：１ 配列の長さ：６９３塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列の特徴： 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１..６９３ 配列： ATG TCC CCT ATA CTA GGT TAT TGG AAA ATT AAG GGC CTT GTG CAA CCC 48 Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro 1 5 10 15 ACT CGA CTT CTT TTG GAA TAT CTT GAA GAA AAA TAT GAA GAG CAT TTG 96 Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu 20 25 30 TAT GAG CGC GAT GAA GGT GAT AAA TGG CGA AAC AAA AAG TTT GAA TTG 144 Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu 35 40 45 GGT TTG GAG TTT CCC AAT CTT CCT TAT TAT ATT GAT GGT GAT GTT AAA 192 Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys 50 55 60 TTA ACA CAG TCT ATG GCC ATC ATA CGT TAT ATA GCT GAC AAG CAC AAC 240 Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn 65 70 75 80 ATG TTG GGT GGT TGT CCA AAA GAG CGT GCA GAG ATT TCA ATG CTT GAA 288 Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu 85 90 95 GGA GCG GTT TTG GAT ATT AGA TAC GGT GTT TCG AGA ATT GCA TAT AGT 336 Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser 100 105 110 AAA GAC TTT GAA ACT CTC AAA GTT GAT TTT CTT AGC AAG CTA CCT GAA 384 Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu 115 120 125 ATG CTG AAA ATG TTC GAA GAT CGT TTA TGT CAT AAA ACA TAT TTA AAT 432 Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn 130 135 140 GGT GAT CAT GTA ACC CAT CCT GAC TTC ATG TTG TAT GAC GCT CTT GAT 480 Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp 145 150 155 160 GTT GTT TTA TAC ATG GAC CCA ATG TGC CTG GAT GCG TTC CCA AAA TTA 528 Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu 165 170 175 GTT TGT TTT AAA AAA CGT ATT GAA GCT ATC CCA CAA ATT GAT AAG TAC 576 Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr 180 185 190 TTG AAA TCC AGC AAG TAT ATA GCA TGG CCT TTG CAG GGC TGG CAA GCC 624 Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala 195 200 205 ACG TTT GGT GGT GGC GAC CAT CCT CCA AAA TCG GAT CTG GTT CCG CGT 672 Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg 210 215 220 GGA TCC CCG GGA ATT CAT CGT 693 Gly Ser Pro Gly Ile His Arg 225 230
【提出日】平成６年１２月２７日
【手続補正６】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】００４０
【補正方法】変更
【補正内容】
【００４０】配列番号：２ 配列の長さ：２３１アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列： Met Ser Pro Ile Leu Gly Tyr Trp Lys Ile Lys Gly Leu Val Gln Pro 1 5 10 15 Thr Arg Leu Leu Leu Glu Tyr Leu Glu Glu Lys Tyr Glu Glu His Leu 20 25 30 Tyr Glu Arg Asp Glu Gly Asp Lys Trp Arg Asn Lys Lys Phe Glu Leu 35 40 45 Gly Leu Glu Phe Pro Asn Leu Pro Tyr Tyr Ile Asp Gly Asp Val Lys 50 55 60 Leu Thr Gln Ser Met Ala Ile Ile Arg Tyr Ile Ala Asp Lys His Asn 65 70 75 80 Met Leu Gly Gly Cys Pro Lys Glu Arg Ala Glu Ile Ser Met Leu Glu 85 90 95 Gly Ala Val Leu Asp Ile Arg Tyr Gly Val Ser Arg Ile Ala Tyr Ser 100 105 110 Lys Asp Phe Glu Thr Leu Lys Val Asp Phe Leu Ser Lys Leu Pro Glu 115 120 125 Met Leu Lys Met Phe Glu Asp Arg Leu Cys His Lys Thr Tyr Leu Asn 130 135 140 Gly Asp His Val Thr His Pro Asp Phe Met Leu Tyr Asp Ala Leu Asp 145 150 155 160 Val Val Leu Tyr Met Asp Pro Met Cys Leu Asp Ala Phe Pro Lys Leu 165 170 175 Val Cys Phe Lys Lys Arg Ile Glu Ala Ile Pro Gln Ile Asp Lys Tyr 180 185 190 Leu Lys Ser Ser Lys Tyr Ile Ala Trp Pro Leu Gln Gly Trp Gln Ala 195 200 205 Thr Phe Gly Gly Gly Asp His Pro Pro Lys Ser Asp Leu Val Pro Arg 210 215 220 Gly Ser Pro Gly Ile His Arg 225 230 配列番号：３ 配列の長さ：２２塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列： TATAAATATG TCCCCTATAC TA 22 配列番号：４ 配列の長さ：１７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列： CGTCAGTCAG TCACGAT 17 配列番号：５ 配列の長さ：５８塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列の特徴： 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１..５７ 配列： CTG GTT CCG CGT GGA TCC CGG GTA CCT TCT AGA ATT CCG GAG CGG CCG 48 Leu Val Pro Arg Gly Ser Arg Val Pro Ser Arg Ile Pro Glu Arg Pro 1 5 10 15 CTG CAG ATC T 58 Leu Gln Ile 配列番号：６ 配列の長さ：１９アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列： Leu Val Pro Arg Gly Ser Arg Val Pro Ser Arg Ile Pro Glu Arg Pro 1 5 10 15 Leu Gln Ile 配列番号：７ 配列の長さ：５７塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｃＤＮＡ 配列の特徴： 特徴を表す記号：ＣＤＳ 存在位置：１..５７ 配列： CTG GTT CCG CGT GGA TCC CCG GGA ATT CCT CTC TAC ATT CCT TCA GGG 48 Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Gly Ile Pro Leu Tyr Ile Pro Ser Gly 1 5 10 15 ATC ATG GGC 57 Ile Met Gly 配列番号：８ 配列の長さ：１９アミノ酸 配列の型：アミノ酸 トポロジー：直鎖状 配列の種類：タンパク質 配列： Leu Val Pro Arg Gly Ser Pro Gly Ile Pro Leu Tyr Ile Pro Ser Gly 1 5 10 15 Ile Met Gly
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 ジョゼフ・ファーグノリ アメリカ合衆国ぺンシルベニア州ティニカ ム、カファーティ・ロード367番 (72)発明者 ジョゼフ・ビー・ボレン アメリカ合衆国ニュージャージー州ローレ ンスビル、ハミルトン・コート４番
Claims (21)
- 【請求項１】 (ａ)グルタチオンに結合しうるポリペプ
チドをコードし、プロモーターに有効に連結する第１コ
ード領域； (ｂ)第１コード領域と同じ解読枠内の第２コード領域；
および (ｃ)第１および第２コード領域間にある少なくともひと
つの制限部位；からなる発現ベクターであって、その発
現によって第１および第２コード領域の融合タンパク質
が得られる発現ベクター。 - 【請求項２】 請求項１に記載のベクターを含む宿主細
胞。 - 【請求項３】 (ａ)請求項２に記載の宿主細胞をベクタ
ーの発現条件下で処理して、第１および第２コード領域
の融合タンパク質を発現し； (ｂ)該宿主細胞からのタンパク質をグルタチオン樹脂で
処理して、該融合タンパク質を樹脂に接着し；ついで (ｃ)樹脂に結合した融合タンパク質から第２コード領域
の発現産物を分離する；ことを特徴とするタンパク質の
単離および精製方法。 - 【請求項４】 (ａ)グルタチオンに結合しうるポリペプ
チドをコードし、プロモーターに有効に連結する第１コ
ード領域と同じ解読枠になるように、バキュロウイルス
発現ベクターに核酸配列を挿入し； (ｂ)該ベクターを宿主細胞に導入し； (ｃ)該宿主細胞を該ベクターの発現条件下で処理して、
第１コード領域の融合タンパク質およびステップ(ａ)で
挿入した核酸を発現し； (ｄ)宿主細胞からのタンパク質をグルタチオン樹脂で処
理して、該融合タンパク質を樹脂に接着し；ついで (ｅ)接着した融合タンパク質をプロテアーゼで処理し
て、該核酸配列の発現産物を樹脂から遊離させる；こと
を特徴とする核酸配列の発現方法。 - 【請求項５】 プロモーターがバキュロウイルスプロモ
ーターである請求項１に記載の発現ベクター。 - 【請求項６】 細胞がスポドプテラ・フルギペルダ細胞
である請求項２に記載の宿主細胞。 - 【請求項７】 細胞がスポドプテラ・フルギペルダ細胞
であり、発現ベクターがバキュロウイルスプロモーター
を持つ請求項２に記載の宿主細胞。 - 【請求項８】 宿主細胞がスポドプテラ・フルギペルダ
細胞であり、プロモーターがバキュロウイルスプロモー
ターである請求項３に記載の単離および精製方法。 - 【請求項９】 宿主細胞がスポドプテラ・フルギペルダ
細胞であり、プロモーターがバキュロウイルスプロモー
ターである請求項４に記載の発現方法。 - 【請求項１０】 細胞がＳｆ９細胞である請求項２に記
載の宿主細胞。 - 【請求項１１】 細胞がＳｆ９細胞であり、プロモータ
ーがバキュロウイルスプロモーターである請求項２に記
載の宿主細胞。 - 【請求項１２】 宿主細胞がＳｆ９細胞であり、プロモ
ーターがバキュロウイルスプロモーターである請求項３
に記載の単離および精製方法。 - 【請求項１３】 宿主細胞がＳｆ９細胞であり、プロモ
ーターがバキュロウイルスプロモーターである請求項４
に記載の発現方法。 - 【請求項１４】 第２コード領域がＬｃｋ、ＬｙｎＢ、
Ｓｙｋ、Ｂｌｋ、ＦｙｎまたはＹｅｓである請求項１に
記載のベクター。 - 【請求項１５】 第２コード領域がＬｃｋ、ＬｙｎＢ、
Ｓｙｋ、Ｂｌｋ、ＦｙｎまたはＹｅｓである請求項２に
記載の宿主細胞。 - 【請求項１６】 第２コード領域がＬｃｋ、ＬｙｎＢ、
Ｓｙｋ、Ｂｌｋ、ＦｙｎまたはＹｅｓである請求項３に
記載の単離および精製方法。 - 【請求項１７】 標的タンパク質がＬｃｋタンパク質で
ある請求項４に記載の発現方法。 - 【請求項１８】 第１コード領域がグルタチオン−ｓ−
トランスフェラーゼをコードする請求項１に記載の発現
ベクター。 - 【請求項１９】 第１コード領域がグルタチオン−ｓ−
トランスフェラーゼをコードする請求項２に記載の宿主
細胞。 - 【請求項２０】 第１コード領域がグルタチオン−ｓ−
トランスフェラーゼをコードする請求項３に記載の単離
および精製方法。 - 【請求項２１】 第１コード領域がグルタチオン−ｓ−
トランスフェラーゼをコードする請求項４に記載の発現
方法。
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