PL178330B1 - Sposób wytwarzania antygenu H11OD lub jego fragmentu o podobnej aktywności enzymatycznej i/lub antygenowej - Google Patents

Abstract

1. Sposób wytwarzania antygenu H110D, który jest aminopeptydaza, lub jego fragmentu o podobnej aktywnosci enzymatycznej i/lub antygenowej, w którym komórki gospodarza transfekuje sie wektorem zaadaptowanym do ekspresji tego antygenu enzymatycznego lub jego fragmentu i hoduje sie transfekowane komórki, w których wprowadzony DNA ulega ekspresji, znamienny tym, ze jako komórki gospodarza, które poddaje sie transfekcji, stosuje sie ssacze komórki, które przed transformacja sa zasadniczo wolne od enzymów endogennych wykazujacych (a) te sama funkcje i (b) to samo powiazanie lub brak powiazania z blona komórkowa, jak enzymatyczny antygen H110D lub jego fragment. PL PL PL PL PL PL PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania antygenu H110D lub jego fragmentu o podobnej aktywności enzymatycznej i/lub antygenowej.

Pasożyty odpowiedzialne są za wiele chorób ludzi i zwierząt domowych. Były one dotychczas leczone chemioterapią, ale ostatnio znajdują zastosowanie metody immunologiczne. Jakkolwiek pasożyty na większości etapów ich cyklu życiowego są względnie duże i gospodarz nie jest w stanie wpływać na nie układem odporności komórkowej, mogą być wrażliwe na przeciwciała inaktywujące ich podstawowe funkcje życiowe. W szczególności, okazało się, że możliwa jest immunizacja gospodarza antygenami związanymi z błoną powierzchni jelita pasożyta, tak że wytworzone przeciwciała zwiążą się z antygenami na tych wewnętrznych błonach, gdy płyny organizmu zawierające te przeciwciała zostaną wchłonięte przez pasożyta. Antygeny można nazywać „antygenami ukrytymi” ponieważ nie powodują powstania naturalnej odporności przeciwko pasożytowi.

Stwierdziliśmy, że szczególnie efektywnym „antygenem ukrytym” jest antygen przeciwrobaczy H110D pochodzący z Haemonchus contortus, jak opisany w W088/00835 i 90/11086. W W093/23542 opisano dalsze odkrycie, że H110D jest związaną z błoną aminopeptydazą jelita robaka. Enzym ten wydaje się być niezbędnym do przemiany białka z pożywienia w aminokwasy wchłaniane z jelita, zaś jego inaktywacja przez przeciwciało anty-H11OD powoduje śmierć pasożyta z powodu zaburzenia wchłaniania substancji odżywczych. Stwierdziliśmy dalej, że olbrzymia liczba pasożytów wrażliwa jest na tę samą strategię „ukrytego antygenu”, ponieważ enzymy związane z błonąjelita są niezbędne do przetwarzania

178 330 białka z pożywienia. Do enzymów tych zalicza się proteazy aspartylowe (jak to opisano w PCT/GB93/01521 i proteazy tiolowe jak katepsyna. Obecne są one w jelicie szerokiej rzeszy pasożytów jak robaki, np. różne gatunki rodzin Haemonchus, Ostertagia, Trichostrongylus, Nematodirus, Dictyocaulus, Cooperia, Ascaris, Dirofilaria, Trichuris, Strongylus i Fasciola; oraz gatunków⁷ stawonogów, a zwłaszcza klasy pajęczaków i owadów, zaś w szczególności ektopasożytów takich jak owady żywiące się krwią (np. należące do exopterygota i endopterygota), muchy jak mucha mięsna (Lucilia), muszyce, wszy, roztocze, pchły i pluskwy.

W W093/23542 opisano produkcję fragmentów antygenowych H1l0D techniką rekombinacji DNA. W pracy tej, gen kodujący H110D poddawano ekspresji w E.coli przy użyciu wektora pGEX i po podaniu owcy wzbudzano przeciwciała anty-H11OD. W trakcie dalszych prac z użyciem bakulowirusa w komórkach owadziego gospodarza (Sf9) pomyślnie ekspresjonowano klon genu H11OD o wielkości 3,5 Kb. Jego sekwencja nukleotydowa. przedstawiona jest na figurze 1 (Identyfikator Sekw. Nr 1). Odpowiednia translacja przedstawiona została na figurze 2 (Identyfikator Sekw. Nr 2).

Jednakże, przy produkcji szczepionek do zastosowania u zwierząt korzystna jest ekspresja antygenu w komórkach ssaka. Powoduje to dobre odtworzenie postaci natywnej i epitopów ochronnych antygenu, ponieważ eukariotyczny układ ekspresyjny powoduje bardziej zbliżony wzorzec glikozylacji, mostkowania dwusiarczkowego i innych modyfikacji potranslacyjnych w porównaniu z E.coli produkującą białko nierozpuszczalne wymagające ponownego fałdowania i słabo oddające postać natywną.

Dodatkowo, glikozylacja ssacza nie powinna wywołać odpowiedzi odpornościowej odbiegającej od ochronnej odpowiedzi na białko, co może wystąpić w przypadku materiału uzyskanego z linii owadziej, z powodu bardzo odmiennego wzorca glikozylacji. Zatem, do ochrony ludzi i zwierząt domowych, korzystne jest zastosowanie ludzkich lub zwierzęcych linii komórkowych fibroblastów lub szpiczaka, jak HeLa - ludzkiej linii komórkowej; BHK komórek nerki płodowej chomika; VERO i COS, linii komórek nerki małpy; FR3T3, fibroblastów szczura Fishera; NIH3T3, linii mysich fibroblastów; C127I, linii raka sutka myszy; CV-1, fibroblastów nerki afykańskiej małpy zielonej; 3T6, mysich fibroblastów płodowych; komórek L, mysiej linii komórkowej; CHO, linii komórek jajnika chomika chińskiego; NSO NSI, SP2 i innych linii mysiego szpiczaka oraz linii szczurzego szpiczaka jak YB2/O i Y3.

Ponieważ produkowane antygeny ukryte są niezbędne do przetwarzania przez pasożyta substancji odżywczych, enzymy i inne białka fbnkcyjne posiadające tę samą aktywność są wspólne dla szerokiej rzeszy dostępnych eukariotycznych linii komórkowych i nie tylko przeszkadzaj ą w selekcji klonów produkujących pożądany antygen, ale czynią trudnym oczyszczanie pożądanego antygenu z materiałów komórkowych. Dodatkowo, wybrana linia komórkowa gospodarza będzie nieuchronnie genetycznie bliska, w sensie sekwencji białkowej, zwierzęciu które ma być chronione, tak że zanieczyszczenie pożądanego obcego ukrytego antygenu wspomnianymi antygenami endogennymi może zwiększyć prawdopodobieństwo niepożądanych reakcji autoimmunologicznych. Dodatkowo, kontrola jakości ekspresjonowanych antygenów ukrytych może być trudniejsza.

Niniejszy wynalazek oparty jest na pomyśle przeprowadzenia ekspresji DNA pożądanego obcego enzymatycznego ukrytego antygenu” w transformowanej linii komórkowej gospodarza, która w przypadku gdy oba enzymy związane są z błoną komórkową lub oba są cytoplazmatyczne, co wyklucza rozdział fizyko-chemiczny, jest zasadniczo wolna od endogennych antygenów, posiadających te samą funkcję enzymatyczną jak obcy „ukryty antygen”.

Zgodnie z niniejszym wynalazkiem dostarczyliśmy sposobu wytwarzania antygenu H110D, który jest aminopeptydazą, lub jego fragmentu o podobnej aktywności enzymatycznej i/lub antygenowej, w którym komórki gospodarza transfekuje się wektorem zaadaptowanym do ekspresji tego antygenu enzymatycznego lub jego fragmentu i hoduje się transfekowane komórki, w których wprowadzony DNA ulega ekspresji, przy czym jako komórki gospodarza, które poddaje się transfekcji, stosuje się ssacze komórki, które przed transformacją są zasadniczo wolne od enzymów endogennych wykazujących (a) tę samą funkcję i (b) te same powiązanie lub brak powiązania z błoną komórkową, jak enzymatyczny antygen H110D lub jego fragment.

Stąd, gdy komórka gospodarza zawiera endogenny enzym, jak aminopeptydaza w cytoplazmie, a obcy enzym ekspresjonowany jest z sekwencją śródbłonową, która lokuje się w błonie komórki gospodarza, nie ma trudności w rozdzieleniu endogennego i obcego enzymu przez obróbkę komórek, w celu oddzielenia fragmentów błon np. przez wirowanie. Z drugiej strony, obcy antygen może być modyfikowany w celu wytworzenia fragmentów pozbawionych regionu związanego z błoną i, jeśli komórka gospodarza posiada endogenny enzym posiadający tę samą aktywność co obce enzymy, byłoby również możliwe przeprowadzenie rozdzielenia przez usunięcie materiału związanego z błoną; stąd sekwencja kodująca region śródbłonowy enzymu pasożyta może być zastąpiona w genie, który ma ulegać ekspresji, przez sekwencję sygnałową powodującą wydzielenie.

Antygen H110D, który stanowi aminopeptydazę robaków i jego fragmenty można wytworzyć na drodze ekspresji w wielu ssacznych komórkach gospodarzy, przy użyciu odpowiednich wektorów. Do ekspresji antygenu H110D H.contortus, który przejawia głównie aktywność aminopeptydazy typu A i typu M, i stąd przecina głównie wiązania peptydowe metioninowe i leucynowe, stwierdzono, że komórki COS-1 są szczególnie użyteczne, ze względu na brak znaczącej aktywności aminopeptydazowej typu A i typu M. Wydają się one posiadać enzym aminopeptydazę przecinającą wiązania peptydowe alaniny, który jest słabo związany z błoną komórkową, tak, że nie ma trudności z rozdzieleniem enzymu endogennego od ekspresjonowanego H110D, który lokuje się w błonie komórkowej.

Wykazano, że enzymy proteolityczne, jak trypsyna, odcin^j^ antygen pasożyta H110D od błony tworząc rozpuszczalny H110D (H11S). Enzymy te mogą więc być użyte do cięcia różnicującego obcy antygen ukryty od endogennego enzymu o podobnej aktywności.

Odpowiednie linie komórkowe do zastosowania zgodnie z wynalazkiem mogą być wybrane z istniejących szczepów, bądź przez przeglądanie ich profilu w kierunku odpowiedniej aktywności enzymatycznej i/lub położenia odpowiadającego enzymu w stosunku do błony komórkowej lub cytoplazmy. W tym ostatnim przypadku związek z błoną komórkową może być stworzony przez ekstrakcję rozłożonej komórki najpierw detergentem jak Tween, który nie powoduje ekstrakcji białek integralnych błony, a następnie detergentem jak Triton, który może uwalniać takie enzymy.

Jest również możliwe stworzenie linii komórek ssaczych o niskiej zawartości szczególnego enzymu. Jeden ze sposobów, w jaki może to być zrobione wygląda następująco: indukuje się przeciwciała przeciwko enzymowi, który ma być usunięty. Linie komórkowe modyfikuje się przez napromienienie lub czynniki chemiczne w celu wywołania mutacji punktowej. Komórki hoduje się w pożywce uzupełnionej w substancje kompensujące brak enzymatyczny. Komórki znaczy się przeciwciałem znakowanym fluorescencyjnie i przepuszcza się przez sorter komórkowy aktywowany fluorescencyjnie (FACS). Komórki nie wyznakowane klonuje się i ponownie selekcjonuje oraz monitoruje się stabilną utratę enzymu.

Komórki mogą być również modyfikowane przez delecję genu lub racjonalną (kierowaną) mutagenezę w celu usunięcia lub zmutowania genu odpowiedniego enzymu endogennego.

Wektory odpowiednie dla różnych klas linii komórek ssaczych są dobrze znane w dziedzinie wiedzy. Ogólnie, zawierać one winny promotor i/lub wzmacniacz połączony operacyjnie z genem ekspresjonującym antygen enzymatyczny lub jego fragment. Stąd, w szczególności, fragment genu H110, wielkości 3,5 kb, może być połączony w jednej ramce odczytu z odpowiednim promotorem. Odpowiednie promotory obejmują wczesny i późny promotor SV40, np. wektor PSVL, promotor wirusa cytomegalii (CMV), promotor mysiej metalotioneiny I i sekwencje LTR wirusa mysiego raka sutka. Wektor korzystnie zawiera odpowiednie znaczniki jak gen reduktazy dihydrofolianowej lub syntazy glutaminy. Wektory tych typów opisane są w W086/05807, W087/04462, W089/01036 i W089/10404.

178 330

Transfekcja komórki gospodarza może być wykonana przy użyciu standardowych technik, przykładowo z użyciem fosforanu wapnia, DEAE-dekstranu, polibrenu, fuzji protoplastu, liposomów, bezpośredniej mikroiniekcji, techniki „gene cannon” lub elektroporacji. Ta ostatnia technika jest najkorzystniejsza zaś sposoby transfekcji komórek ssaków przy użyciu elektroporacji opisane są w Andreason G.L. i Evans G.A., Introduction and expresjion of DNA molecules in eucariotic cells by electroporation, Biotechniques 6, 650, 1980. Ogólnie, liniowy DNA wprowadzany jest łatwiej niż kolisty DNA. Antygen H110D wykazuje aktywność aminopeptydazy leucynowej (typ M) i metioninowej (typ A) i jest korzystne gdy komórki gospodarza wolne są od przynajmniej tych typów aktywności aminopeptydazowej.

Następujące przykłady dane są w celu wyłącznie zobrazowania. W przykładach tych figury przedstawiają:

Figura 1 przedstawia sekwencję DNA fragmentu wielkości 3,5 kb klonu 2 (Identyfikator Sekw. Nr 1); i

Figura 2 przedstawia translację aminokwasową fragmentu wielkości 3,5 kb klonu 2 (Identyfikator Sekw. Nr 2).

Przykład 1. Test Enzymatyczny Komórek COS-1

Komórki COS-1 uzyskano z University of Surrey w 5 ml pożywki DMEM, komórki rozdzielono do dwóch 200 ml butelek hodowlanych, z których każda zawierała 11 ml pożywki, gdzie hodowane były do fazy wzrostu zlewnego. Komórki COS rosną przylegając do podłoża, stąd pobierano je z powierzchni butelki przez aspirację szklaną pipetą pasterowską do 10 ml buforu PBS. Gdy wszystkie komórki były w zawiesinie, przeniesiono je do probówki uniwersalnej i ochłodzono do -20°C. Komórki kilkakrotnie odmrożono i zamrożono w ciekłym azocie aby rozerwać komórki, po czym odwirowano uzyskując nadsącz PBS (PLS). Następnie ekstrahowano je przy użyciu 500 pl PBS z 0,1% Tween i PBS z 2% Tritonem uzyskując nadsącze TwLS i TrLS. Wszystkie nadsącze zagęszczano do 200 pl przy użyciu mikrofiltrów f-my Millipore. Sam PBS wydobywał enzymy znajdujące się w postaci wolnej w cytoplazmie, Tween enzymy luźno związane z błoną komórkową, zaś Triton białka integralne błony komórkowej. ,

Supernatanty badano w stosunku do 25 mM substratów pNA: fenyloalaninowego, y-glutaminowego, leucynowego, lizynowego, metioninowego, alaninowego, oc-glutaminowego, Gly-Pro i asparaginianowego w buforze dwuwęglanu HEPES o pH 7,0. Nie było zauważalnej aktywności po 30 min. inkubacji w 37°C, o więc test przedłużono do 18 h w celu określenia obecności aktywności enzymatycznej. Aktywności właściwe oznaczono i przedstawiono w tabeli 1.

Większość aktywności obecna była w ekstrakcji Tweenem, gdzie występowała największa aktywność w stosunku do pNA alaninowego, nieco aktywności obserwowano w stosunku do substratów pNA Phe, γ-Ga, Leu, Lys i Met. PSL i TrLS zawierały małą aktywność sugerującą obecność yGTP i szczątkową aktywność aminopeptydazy lizynowej i alaninowej.

1718330

Tabela 1

Aktywności właściwe (OD/min/ąg białka) nadsączy komórek COS

	Preparat
Substrat pNA	PLS	TwLS	TrLS
fenyloalaninowy	0,0000	0,089x10'’	0,0000
y-glutaminowy	0,0015x10°	0,165x10°	0,033x10°
leucynowy	0,0012x10°	0,066x10'’	0,0000
lizynowy	0,0029x10·’	0,273xl0°	0,010x10°
metioninowy	0,001 1x10°	0,083x10°	0,0000
alaninowy	0,0270x10°	1,110x 10°	0,159x10°
α-glutaminowy	0,0000	0,0000	0,0000
Gly-Pro	0,0007x10’	0,0000	0,0000

μΐ każdego z nadsączy komórek COS-1 dodawano do 25 mM substratu p-nitroanilidowego w 250 μ] buforu dwuwęglanu HEPES o pH 7,0 i inkubowano w 37°C przez 18 godzin.

Test Enzymatyczny Komórek Jajnika Chomika Chińskiego (CHO) i NSO

Przygotowano ekstrakty hodowanych komórek CHO i NSO w sposób opisany dla komórek COS-1. Ekstrakty badano w stosunku do następujących substratów paranitroanilidowych: alaninowego, argininowego, glicynowego, α-glutaminowego, y-glutaminowego, leucynowego, lizynowego, metioninowego, fenyloalaninowego, prolinowego i Gly-Pro w stężeniach 25 mM, w buforze dwuwęglanu HEPES o pH 7,0. Test prowadzono przez 30 min. w 37°C, gdy to oznaczono końcową OD i oznaczono aktywności właściwe.

Tabela 2 pokazuje, że ekstrakt rozpuszczalny i związany z błoną komórkową komórek CHO zawiera niskie poziomy aktywności enzymatycznych, z wyjątkiem aktywności TwLS w stosunku do substratu Gly-Pro. W przeciwieństwie do powyższego, ekstrakt TrLS posiadał niską aktywność we wszystkich przypadkach z wyjątkiem substratu argininowego. Ta ostatnia aktywność była różna od aktywności aminopeptydazy H110D.

Tabela 2

Aktywności właściwe (OD/min^g białka) nadsączy komórek CHO.

	Preparat
Substrat pNa	PLS	TwLS	TrLS
leucynowy	0,070x10°	0,147x10°	0,106x10°
fenyloalaninowy	0,059x10°	0,052x10°
lizynowy	0,178x10°	0,123x10°	0,106x10°
metioninowy	0,130x10°	0,118x10°	0,106x10°
alaninowy	0,148x10°	0,169x10°	0,137x10°
glicynowy	0	0,052x10°	0,068x10°
argininowy	0,078x10°	0,118x10°	0,889x10°
prolinowy	0,024x10°	0,030x10°	0,046x10°
Arg-Pro	0,024x10°	0,052x10°	0,061x10°
Gly-Pro	0,074x10°	0,405x10°	0,068x10°
y-glutaminowy	0,011x10°	0,052x10°	0,144x10°
α-glutaminowy	0,030x10°	0	0,053x10

1718330

Ekstrakty PLS i TwLS komórek NSO posiadały nieco aktywności aminopeptydazowej zwłaszcza w stosunku do substratu leucynowego i metioninowego (tabela 3). W przeciwieństwie do powyższego, TrLS posiadał niskie poziomy tej aktywności co wskazuje, że protokół oczyszczania z wykorzystaniem ekstrakcji Tritonem, tak jak to jest stosowane dla H110D, powinno powodować bardzo słabe zanieczyszczenie aktywnością endogennego enzymu.

Tabela 3

Aktywności właściwe (OD/min/pg białka) nadsączy komórek NSO

	Preparat
Substrat pNA	PLS	TwLS	TrLS
leucynowy	0,640x10°	1,840x10°	0,137x10°
fenyloalaninowy	0,108x10°	0,205x10°	0,087x10°
lizynowy	0,136xl0°	0,188x10°	0,093x10°
metioninowy	0,280x10°	0,764x10°	0,099x10°
alaninowy	0,047x10°	0,150x10°	0,067x10°
glicynowy	0,014x10'3	0,045x10°	0,019x10°
a^^inb^^-wy	0,110x10°	0,114x10°	0,081x10°
prolinowy	0,014x10°	0,034x10°	0,019x10°
Arg-Pro	0,043x10°	0,085x10°	0,050x10°
Gly-Pro	0,058x10°	0,063x10°	0,050x10°
y-glutaminowy	0,017x10°	0,270x10°	0,019x10°
α-glutaminowy	0,017x10°	0,040x10°	0,019x10°

Przykłady Porównawcze

Komórki BHK przygotowano tą samą metodą co komórki COS-1, opisane w przykładzie 1, jednakże w znacznie większej ilości (2 butelki typu „roller” o pojemności 1 1, każda ze 100 ml pożywki). Nadsącza badano w stosunku do substratów pNa: Phe, y-Ga, Leu, Ala, Arg, Asp, Lys, Met, Gly-Pro i a-Ga w pH 7,0. Test prowadzono przez 30 min. w 37°C, gdy to oznaczono końcową OD.

Ekstrakty komórek BHK zawierały znaczne aktywności enzymów, obecne we wszystkich nadsączach (tabela 4). Pomijalna była aktywność substratów γ-Ga, Asp i a-Ga. Wszystkie nadsącza wykazywały dobrą aktywność w stosunku do pNa Lys (która była największa w PLS), Leu, Ala i Gly-Pro. Aktywność w stosunku do pNa Met, pomijalna w PLS była największa w nadsączu TrLS. Dało się również zauważyć, że komórki BHK nie będą odpowiednie do ekspresji H110D ponieważ obserwowany jest wysoki poziom aktywności aminopeptydazy typu A i typu M zarówno w cytoplazmie jak i w błonie komórkowej.

178 330

Tabela 4

Aktywności właściwe (OD/min/pg białka) nadsączy komórek BHK

	Preparat
Substrat pNA	PLS	TwLS	TrLS
fenyloalaninowy	0,102x10·’	0,080x10·’	0,113x10·’
leucynowy	0,320x10'3	0,’40x10·’	0/^103
y-glutaminowy	0,006x10·’	0,0000	0,004x10·’
alaninowy	0,260x10‘3	0,220x10·’	0,328x10’
argininowy	0,150x10·’	0,200x10·’	0,344x10·3
asparaginianowy	0,017x10’	0,015x10’	0,008x10’
lizynowy	0,330x10·’	0,259x10J	0,420x10·’
metioninowy	0,020x10'’	0,185x10·’	0,85^^10^1
Gly-Pro	0,312x10’	0,’18x10·’	0,225x10’
α-glutaminowy	0,014x10'-	0,008x10·’	0,008x10·’

pl każdego z nadsączy komórek BHK dodawano do 25 mM substratu p-nitroanilidowego w 250 pl buforu dwuwęglanu HEPES o pH 7,0 i inkubowano w 37°C przez 18 godzin.

Przykład 2. Klonowanie sekwencji H110D do ssaczego wektora ekspresyjnego

Klonowano DNA opisany w W093/23542 jako klon 2 genu H110D będący produktem PCR wielkości 3,5 kb. Sekwencja DNA (Identyfikator Sekw. Nr 1) tej wstawki, uzyskana przez reakcję łańcuchową polimerazy (PCR), przedstawiona jest w figurze 1, zaś jej translacja aminokwasowa (Identyfikator Sekw. Nr 2) w figurze 2. DNA wycięto z wektora pT7Blue-T Vector (Novagene) trawieniem BamHI i wklonowano w miejsce BamHI miejsca klonowania wektora pSPT18 (Boehringer Mannheim) uzyskując klon pSPT18-3,5-2. Wykonano częściowe trawienie klonu pSPT18-3,5-2 BamHI i dwukrotnie oczyszczano liniowy DNA przez elektroforezę na żelu. „Lepkie końce” wypełniano dNTP przy użyciu enzymu Klenowa (fragment większy polimerazy DNA) oraz łącznika Ncol zawierającego ATG (Boehringer Mannheim, Nr Kat. 1171 160) i wklonowano do plazmidu. Klony przeglądano analizą restrykcyjną w kierunku posiadania wspomnianego łącznika na końcu 5' wstawki 3,5 kb, co dawało im miejsce startu ATG w ramce odczytu pod kontrolą promotora T7. Zmodyfikowaną wstawkę

3.5 kb z jednego z klonów (klon pSPT18-3,5-2N44) wycięto i wklonowano do wektora ekspresyjnego dla komórek ssaków pRC/CMV przy pomocy następującej strategii:

1. DNA klonu klon pSPT18(T7)-3,5-2N44 trawiono enzymem restrykcyjnym Smal.

2. Łącznik Notl wprowadzono do zmodyfikowanego miejsca Smal w celu uzyskania klonów z miejscem Notl na końcu 5' wstawki, poprzedzającym łącznik Ncol zawierający miejsce startu ATG.

3. Oczyszczony DNA z odpowiedniego klonu trawiono Notl i Xbal w celu uwolnienia

3.5 kb wstawki. Do mieszaniny inkubacyjnej dodano enzymu Pvul w celu przecięcia DNA wektora pSPT18 na połowy, z powodu podobnej wielkości wektora i wstawki, co czyniło oczyszczanie trudnym.

4. 3,5 kb wstawkę oczyszczono na 0,6-0,7% żelu agarozowym.

5. Wektor ekspresyjny dla komórek ssaczych pRC/CMV trawiono Notl i Xbal i oczyszczano prążek linearyzowanego wektora na żelu agarozowym.

6. Wykonano ligacje 3,5 kb wstawki i linearyzowanego wektora.

7. Wybrano odpowiednie klony, na podstawie posiadania wstawki 3,5 kb po trawieniu Notl i Xbal. Klony nazwano pRC/CMV-3,5-2.

178 330

Transfekcja komórek COS-1

DNA ssaczego wektora ekspresyjnego ze wstawką H110D klonu pRC/CMV-3,5-2 oczyszczono przez wirowanie na gradiencie chlorku cezu (Sambrook J., Fritsch E.F. i Maniatis

T. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition. Cold Spring Harbor Press, 1989).

Przejściową ekspresję H110D uzyskać można przez użycie tego oczyszczonego DNA klonu pRC/CMV-3,5-2 do transfekcji komórek COS-1 (możliwych do uzyskania z ECACC, Porton). Transfekcję wykonuje się przy użyciu DEAE-dekstranu (Cullen B.R., Use of Eucariotic Expression Genes, Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques, wyd. S.L. Berger i A.R. Kimmal, Academic Press, 1987, str. 684-704). Komórki hodowano w pożywce Eagla zmodyfikowanej przez Dulbecco (DMEM, Gibco BRL) i analizowano ekspresję po 48-72 godzinach inkubacji.

Transfekcja Komórek Jajnika Chomika Chińskiego (CHO)

DNA wektora transfekowano do komórek CHO (możliwych do uzyskania z ECACC, Porton) przy użyciu fosforanu wapnia (jak to opisano w Cullen B.R. Use of Eucariotic Compression technology in the Functional Analysis of Cloned Genes, Methods in Enzymology: Guide to Molecular Cloning Techniques, wyd. S.L. Berger i A.R. Kimmal, Academic Press, 1987, str. 684-704). Transformowane komórki hodowano w DMEM z dodatkiem 10% FCS (Gibco BRL). Geneticin (G418) w stężeniu do 800 pg/ml powodowała, że dobrze rosły wyłącznie komórki transformowane podczas gdy nietransformowane nie rosły. Transformowane komórki klonowano wówczas przez rozcieńczanie graniczne w płytkach microtitre.

Analiza transfekowanych komórek ssaczych

Komórki CHO transformowane i nietransformowane mogą być przeniesione w celu wzrostu na szkiełku nakrywkowym do analizy immunofluorescencyjnej. Komórkom umożliwia się wzrost w postaci małych kolonii, utrwala się metanolem i poddaje działaniu owczego przeciwciała anty-H110D, a następnie przeciwciałem przeciwko owczym immunoglobulinom, sprzężonym z barwnikiem fluorescencyjnym (np. FITC). Do obserwacji klonów pozytywnych używa się mikroskopu fluorescencyjnego.

Transformowane komórki niszczone są buforem RIPA (150 mM chlorek sodu, 1% Nonidet P40, 0,5% dezoksycholan, 0,1% siarczan sodowy dodecylu, 50 mM Tris-HCl o pH 8,0) przez usunięcie pożywki i delikatne mieszanie komórek przez 5 minut w buforze RIPA. Komórki przenoszone są wówczas do probówki i odwirowane przy pełnej prędkości przez 15 minut w celu uzyskania czystego lizatu, który przenoszony jest do czystej probówki. Porcje lizatu, odpowiadające 2x10⁵ komórek poddawane są elektroforezie na żelu SDS-poliakrylamidowym (SDS-PAGE) zaś białka z żelu przenoszone są na błonę nitrocelulozową metodą „Western biot”. Błona poddawana jest obróbce, ewentualnie obejmującej etap działania nadjodanem, i analizowana z użyciem antysurowic indukowanych przeciwko różnym postaciom antygenu H110D. Działanie nadjodanem niszczy epitopy węglowodanowe; epitopy węglowodanowe ssaków mogą być znacząco różne od natywnych węglowodanów robaków. Błony analizowane metodą „Western biot” transformowanych komórek wykazują obecność białka rozpoznawanego przez surowice specyficzne w stosunku do H11OD.

Ekstrakty transformowanych i nietransformowanych komórek wykonane jak to opisano w przykładzie 1 i lizaty uzyskane z użyciem RIPA badane są na aktywność enzymatyczną dokładnie jak to opisano w przykładzie 1. Komórki transformowane H11 OD wykazują wyższe poziomy aktywności aminopeptydazy w porównaniu z nietransformowanymi.

Obecność DNA transfekowanego wektora zawierającego klon 2 3,5 kb w opornych na Geneticinę liniach komórek CHO określana jest analizą Southema preparatów DNA z tych linii komórkowych. DNA pozyskuje się z tych komórek przy użyciu metod opisanych w Sambrook J., Fritsch E.F. i Maniatis T. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition. Cold Spring Harbor Press, 1989. 10-20 pg DNA poddaje się trawieniu enzymami restrykcyjnymi i poddaje się elektroforezie na żelu agarozowym, a następnie przenosi na błonę nitrocelulozową metodą „Southern biot” (Southern E. Detection of specific sequences among DNA fragments separated by gel electrophoresis. J. Mol. Biol. 98, 503, 1975). Błonę poddaje

178 330 się hybrydyzacji z sondą kodującą 3,5 kb klon 2 i po płukaniu w surowych warunkach wykonuje się autoradiografię błony. Prążki specyficzne dla 3,5 kb klonu 2 obecne są w transformowanych komórkach.

Ekspresję 3,5 kb klonu 2 na poziomie RNA w transfekowanych komórkach ssawczych oznacza się analizą Northern RNA wyizolowanego z tych komórek. RNA izoluje się przy użyciu RNAzolu (Cinna/Biotecx, Texas), zgodnie ze wskazówkami producenta, po czym do 20 pm poddaje się elektroforezie na żelu agarozowym i przenosi na błonę metodą „Northern blot” (Sambrook J., Fritsch E.F. i Maniatis T. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition. Cold Spring Harbor Press, 1989). Błonę poddaje się hybrydyzacji z sondą kodującą 3,5 kb klon 2 i po płukaniu w surowych warunkach wykonuje się autoradiografię błony. Specyficzny prążek hybrydyzacyjny widoczny jest w transformowanych komórkach ekspresjonujących 3,5 kb klon 2.

LISTA SEKWENCJI (1) INFORMACJE OGÓLNE (i) ZGŁASZAJĄCY:

(A) NAZWA: PITTMAN-MOORE, INC., (B) ULICA: 421 EAST HAWLEY STREET (C) MIASTO: MOUNDELEIN (D) STAN: ILLINOIS (E) KRAJ: USA (F) KOD POCZTOWY (ZIP): 60062 (A) NAZWA: THE AGRICULTURAL AND FOOD RESEARCH COUNCIL (B) LICA: BABRAHAM HALL, BABRAHAM (C) MIASTO: CAMBRIDGE (E) KRAJ: WIELKA BRYTANIA (F) KOD POCZTOWY (ZIP): CB2 4AT (A) NAZWISKO: EDWARD ALBERT MUNN (B) ULICA: 72 STATION ROAD, FULBOURN (C) MIASTO: CAMBRIDGE (E) KRAJ: WIELKA BRYTANIA (F) KOD POCZTOWY: (ZIP): CB15ES (A) NAZWISKO: MARGARET GRAHAM (B) ULICA: 17 BAWTREE CRESCENT, LINTON (C) MIASTO: CAMBRIDGE (E) KRAJ: WIELKA BRYTANIA (F) KOD POCZTOWY (ZIP): CB1 6XQ (A) NAZWISKO: TREVOR STANLEY SMITH (B) ULICA: 14 GROVE, LINTON (C) MIASTO: CAMBRIDGE (E) KRAJ: WIELKA BRYTANIA (F) KOD POCZTOWY (ZIP): CB1 6UQ (A) NAZWISKO: TIMOTHY PETER ROLPH (B) ULICA: 42 LITTLEWORTH (C) MIASTO: WHEATLEY (D) STAN: OXON (E) KRAJ: WIELKA BRYTANIA (F) KOD POCZTOWY (ZIP): 0X33 ITR (A) NAZWISKO: SUSAN ELISABETH NEWTON (B) ULICA: 3 LEBANON STREET (C) MIASTO: STRATHMORE (D) STAN: VICTORIA (E) : KRAJ: AUSTRALIA (F) KOD POCZTOWY (ZIP): 3401

178 330 (ii) TYTUŁ WYNALAZKU: EKSPRESJA ANTYGENÓW OCHRONNYCH (iii) LICZBA SEKWENCJI: 2 (iv) POSTAĆ MOŻLIWA DO ODCZYTANIA PRZEZ KOMPUTER:

(A) TYP NOŚNIKA: Dyskietka (B) KOMPUTER: kompatybilny z IBM PC (C) SYSTEM OPERACYJNY: PC-DOS/MS-DOS (D) OPROGRAMOWANIE: Patentln Release #1,0, wersja #1,25 (EPO) (v) DANE DOTYCZĄCE PIERWSZEŃSTWA (A) NUMER SPRAWY: GB 9302302,6 (B) DATA ZGŁOSZENIA: 5 LUTEGO 1993 (2) INFORMACJE DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR 1:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 3303 pary zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: cDNA (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR 1:

GCTGAATCTA 60	ACTCCAATCC	GTCTTATTGT	CCCATTATTT	CTAGTAGCTG	CTGCAGTCGG
CCTCTCTATT 120	GGTCTCACCT	ATTACTTTAC	TCGCAAAGCG	TTCGATACCT	CAGAAAAGCC
AGGGAAGGAT 180	GATACTGGTG	GCAAGGACAA	AGACAATTCT	CCCTCTGCGG	CGGAACTACT
CCTTCCAAGT 240	AATATAAAAC	CATTGTCTTA	CGACTTGACG	ATCAAAACAT	ATCTACCTGG
TTATGTGGAC 300	TTCCCACCGG	AGAAAAACCT	CACATTCGAT	GGGCGTGTGG	AAATATCAAT
GGTTGTAATT	GAGCCAACAA	AGAGTATCGT	ACTCAATTCA	AAGAAGATCT	CTGTAATACC

360

178 330

CCAAGAATGT 420	GAACTGGTAT	CGGGCGATAA	AAAACTCGAA	ATTGAAAGTG	TAAAGGAGCA
CCCAAGACTG 480	GAAAAGGTTG	AGTTTCTTAT	CAAAAGCCAA	CTGGAAAAAG	ATCAACAAAT
CTTGCTCAAG 540	GTCGGCTACA	TCGGTCTCAT	CAGCAACAGC	TTTGGTGGAA	TCTACCAGAC
CACTTATACC 600	ACCCCGGATG	GCACCCCTAA	GATCGCTGCA	GTTTCACAAA	ATGAGCCCAT
AGATGCTCGT 660	CGAATGGTAC	CATGCATGGA	TGAACCGAAA	TACAAAGCAA	ACTGGACCGT
TACTGTCATT	CATCCAAAAG	GCACCAAACC	CGTCTCGAAT	GGAATCGAAG	TGAACGGAGA

720

TGGAGAGATC 780	AGTGGTGATT	GGATCACATC	GAAGTTCTTG	ACTACTCCAC	GGATGTCATC
CTACTTGTTG 840	GCAGTTATGG	TTTCAGAATT	TGAATACATC	GAAGGTGAAA	CAAAGACGGG
TGTTCGGTTC 900	CGTATATGGT	CACGCCCAGA	GGCAAAGAAG	ATGACACAAT	ATGCTCTGCA
ATCTGGTATC 960	AAGTGCATAG	AATTCTACGA	AGATTTCTTT	GATATCAGAT	TCCCTCTGAA
GAAACAAGAT 1020	ATGATTGCCC	TTCCTGATTT	CTCTGCCGGT	GCCATGGAGA	ATTGGGGCCT
CATCACTTAC 1080	AGGGAAACT	CTTTGTTGTA	CGATGACAGA	TTCTATGCAC	CGATGAATAA

ACAGCGAATT GCTCGCATTG TTGCTCATGA GCTTGCTCAT CAGTGGTTCG GCGACTTGGT 1140

TACGATGAAG 1200	TGGTGGGATA	ATTTCTGCTT	CAATGAAGCT	TTTGCAAGAT	TCACAGAATT
TATTGGAGCT 1260	GGTCAGATAA	CTCAAGATGA	CGCCAGAATG	AGGAACTACT	TCCTGATTGA
TGTACTTGAA 1320	cgcgctttga	AAGCTGATTC	GGTAGCGTCA	AGCCATCCAC	TTTCCTTCAG
AATCGACAAA 1380	GCTGCAGAAG	TTGAAGAAGC	CTTTGATGAT	ATCACATACG	CCAAAGGAGC
TTCTGTTCTT 1440	ACTATGCTGA	GAGCCTTGAT	TGGAGAAGAA	AAACATAAGC	ATGCAGTATC
GCAGTACCTC 1500	AAGAAGTTCT	CGTATAGCAA	TGCAGAAGCG	ACTGATCTAT	GGGCAGTTTT
TGATGAAGTT 1560	GTCACTGACG	TCGAAGGTCC	AGACGGCAAA	CCTATGAAAA	CCACAGAGTT
TGCAAGTCAG 1620	TGGACGACTC	AGATGGGCTT	CCCAGGTATT	TCCGTAGCAG	AGTTTAACTC
GACTACTTTG 1680	AAATTAACGC	AAAGTCGATA	TGAGGCGAAT	AAAGACGCTG	TGGAGAAAGA
GAAGTACCGT 1740	CACCCGAAAT	ACGGATTTAA	ATGGGATATT	CCACTGTGGT	ATCAGGAAGG
CGATAAGAAG 1800	GAGATAAAGC	GAACATGGTT	GAGAAGAGAT	GAACCGCTTT	ACTTGCATGT
TAGTGATGCT 1860	GGCGCTCCCT	TTGTGGTGAA	CGCAGACCGC	TATGGATTTT	ATCGACAAAA

TCATGACGCT AATGGTTCGA AAAAGATAAT CAACCAGCTC AAGGATAATC ATGAGGTTTA 1920

178 330

CACTCCCCGG 1980	ACAACAAATG	CCATCATTAG	CCATGCCTTT	GCTGCCGCTG	CAACTGACCC
AATTGAGTAT 2040	GAGACTGTAT	ttgaacttct	GAATTATGCC	caaaaagaaa	CGGAATATCT
ACCATTAGAA 2100	ATCGCAATGT	CCGGGATCTC	TTCCATTTTC	AAATACTTCG	GTACCGAGCC
AGAGGCAAAG 2160	CCAGCTCAAA	CATACATGAT	GAACATATTG	AAACCCATGT	ATGAAAAAAG
CAGTATCGAC 2220	TTCATTGCCA	ATAACTACAG	AAATCACAAG	CTGTTTTTCC	AAATCAACCT
CCAAAAAGAT 2280	GTCATTGATA	TGTTCTGCGC	CCTCGGATCG	CAAGACTGCA	CGAAGAAATA
TAAAAAACTT 2340	TTCGATGACG	AAGTCATGAA	CAAATGCAGG	GATCCTCAAG	CACCAACCGA
ATGCGTAAGA 2400	ATCGCCGCTC	CTCTCCGATC	aagtctttat	TGTTATGGTC	TGAACCAAGG
CGGTCATTAT 2460	GCTTCCGACA	aggtgatgga	CCTTTATACG	GCCGAAACAC	TCGCCCTAGA
AAAAGACTTC 2520	CTACGCCTAG	CATTGGGATG	TCATAAAGAT	GTTACTGCTT	TGAAAGGACT
TCTCTTGCGG 2580	GCTCTGGACA	GGAATTCGTC	CTTCCTACCT	ATGCAGGATA	TCCCAACTGC
TTTCAATGAT 2640	GTAGCAGCAA	ATCCTATCGG	CCCACAATTC	ATTTTCAATT	TCCTTATTGA

AAGATGGCCA GATATCATTG AAAGTATAGG AACGAAGCAC ACATACGTTG AGAAAGTGAT 2700

178 330

ACCAGCCTGC 2760	ACTTCAGCAA	TCCGCTCACA	ACAGCAGATT	CACCAGCTGA	AGAATCTGCA
GAAAAATGGC 2820	ATGAACGCTC	GTCAATTCGG	TGCATTCGAT	AAAGCAATCG	AACGAGCACA
AAATAGGGTG 2880	GATTGGATTA	AAAAACATTT	CCAAAAATTA	GCGGCTTTCT	TCAAGAAAGC
CACCTTGTAA 2940	TTCGAATTAC	ATTGCCAGTA	ATCCAGATCT	TAAAGTTCAT	GAAGGAATAT
GACAGGGAAC 3000	TGACTGTCTG	TTGGTCACTG	TTCCACTGAA	TGGAAGTTTT	TACCTACAAA
AATTTTTATC 3060	GTTATATTTG	CCTTCCGTGA	GGGGTCATTG	TTGTCACTTG	AATAGTAAAC
AAAGCTCAGT 3120	ATTGCAACCA	GTGAACAATA	TTACTTTCGC	TTCATCAAAT	TGTrATCTTC
CCTATACTCT 3180	CTTCCTAACT	GAATTCGGAA	ATTTGTTCAT	ATTCGTTTGT	AGTCTGTTGC
TCAGAACACT 3240	TTCTCCTCAA	TAGCTTCTTG	TTTGTTTTTT	TTTGATTGTA
TACAATTGTA	TAGATTAGTT	ATCTTATAAA	TATTGATGGT	TAAAAAAAAA	AAAAAAAAAA

3300

AAA

3303

178 220 (2) INFORMACJE DLA IDENTYFIKATORA SEKW. NR 2:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 962 aminokwasy (b) TYP: aminokwas C) NICIOWOŚĆ: pojedyncza (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (xi) OPIS SEKWENCJI: IDENTYFIKATOR SEKW. NR 2:

Leu Asn Leu 1

Thr Pro 5

Ilu

Arg

Leu Ile

Val 10

Ala

Leu Phu Leu

Val 11

Ala

Ala

Ala

Val

Gly

Luu

Sst

Ilu

Gly

Luu

Thr

TTr

Tyr

PPh

TTh

Arg

Lls

20

25

30

Ala

Phe

AAp

Thr

Sur

Glu

Lys

Pro

Gly

Lys

Aas>

Asp

TTh

dy

dy

Lyy

’5

40

45

Asp

Lys

Asp

Aas

Ser

Pro

Ser

Ala

Ala

Glu

Leu

Leu

Llu

Pm

Sst

Aas

50

5l

(50

Ile

Lys

Pro

Llu

Ssu

Tyr

Asp

Leu

TTr

IIu

Lys

Thr

Tyr

Llu

Pm

dy

65

70

75

80

Tyr

Val

AAp

PPh

Ppo

Pro

Glu

Lys

AAn

Llu

Thr

Phe

Asp

dl

AAg

Vv1

85

90

99

du

Ile

Sse

Mec

Val

Val

Ile

Glu

Poo

Thr

Lls

Ser

Ile

Vv1

Leu

Aasi

100

10 5

110

Ser

Lys

Lvs

Ile

Sur

Val

ll e

Pro

Gin

du

Cys

Gło

Llu

Vv1

Ss r

dy

115

120

125

Asp

Lys

Lls

Llu

Glu

il e

G1 u

Ser

aal

Ls s

Glu

Hi s

Pm

Arg

Leu

du

1’0

1’5

140

Lys

Val

Glu

Piat;

Llu

Ile

Lys

lr o

Gin

Llu

Glu

Lys

Aso

Gin

dn

Ile

145 150 155 160

178 330

Leu

Leu

Lys

Val

Gly 165

Ty r

Us Gly Leu Ile 170

Ser Asn

Ser Phe Gly 175

Gly

Ile

Tyr

Gin

Thr

Thr

Tys

Ths

Ths

Pro

Asp

Gly

Thr

Pro

Lys

Ile

Ala

180

115

110

Ala

Val

Ser

Gin

Asg

C lu

Asn

lle

Asp

APa

AAr

Arg

Mee

Val

Ppo

Cyy

195

200

225

Met

Asp

Glu

Pro

Lys

Tyy

Lys

Ala

A^n

TTP

Thr

Val

Thr

Vaa

He

His

210

215

220

Pro

Lls

Gly

Thr

Lys

AAa

Vaa

Ser

Asn

Gly

Ile

Glu

Vaa

Asn

Gly

Aap

225

230

223

220

Hy

Glu

Ile

Ser

Gly

AAp

Trp

Ile

Thr

Ser

Lls

Phe

Leu

Thr

Thr

Ppo

245

220

225

Arg

Met

Ser

Ser

Tyy

Ilsu

Leu

Ala

Val

Mee

Val

Ser

Gll

Phe

Glu

Tyy

260

225

220

Ile

Glu

Gly

Gly

ThG

Uss

Thr

¢:1)7

Val

Arg

ghe

Arg

IIl

Trp

Ser

Arg

275

220

228

Pro

Glu

Ala

Lys

yys

Met

Thr

Gin

Tyr

Ala

Le u

Gin

Ser

Gly

Ile

LLy

290

295

300

Cys

Ile

Glu

Phe

Tyr

Glu

Asp

Phs

Phe

Asp

Ile

Arg

Phs

Pro

L^u

Lls

305

330

33.5

330

Lys

Gin

Asp

Met

Ile:

Ala

Leu

Poo

Asp

hhs

Ser

Ala

Gly

Ala

Mes

Glu

325

330

335

Asn

TrP

Gly

Leu

Ile

Thr

Tys

Arg

Glu

Asn

Ser

Leu

Leu

Tyr

Asp

Asp

340

345

350

Arg

Phe

Tyr

Ala

Pro

Met

Asn

Lys

Gin

Arg

Ile

Ala

Arg

Ile

Val

Ala

355

360

365

178 330

His Glu Leu Ala His Gin Trp	Phe Gly	Asp	Leu	Val 380	Thr Mt	Lys	Trp
	370	375
Trp	Asp	Asn Leu Trp Leu Asn	Hu Gly	Phu	Ala	Arg	Phe Thr	Glu	Phe
385		390			395				400
He	Gly	Ala Gly Gin Ile Thr	Gin Asp	Asp	Ala	Arg	Mc Arg	Asn	Trr
		405		440				415
Phu	Llu	Ile Aisp Val Leu Glu	AAg Ala	Leu	Lys	AM	Asp Ser	Val	AAa
		420	442				440
Ser	SSe	His Pro Leu Ser Phe	AAr Ilu	Asp	Lys	AM	AAa Glu	Val	GGu
		435	444				U44
Glu	Ala	lhe Asp Asp Ile Thr	TTr Ala	LLy	Gly	AM	Tsu Val	Ilu	TM
	450	455				446
Met	Leu	Arg Ala Leu lie Gly	Glu Glu	Lys	His	Lys	His Ala	Val	Sur
465		470			475				480
Gin	Tyr	Leu Lys Lys Phe Ser	Tyr Ser	Asn	Ala	Hu	Ala Thr	Asp	^u
		485		490				495
Trp	Ala	Val Phe Asp Glu Val	Val Thr	Asp	Val	Hu	Gly Pro	AHJ	dy
		500	505				550
Lys	Pro	Mul Lys Thi Thi Glu	PPh Ala	Sur	Gin	Trp	TM Thr	Gin	Meu
		515	520				555
Gly	Php	PPr Val Ile Sur Val	Ala Glu	Phe	Asn	Seu	Thi? Thr	Leu	Lys
	530	533				554
Leu	Thr	Gin Ser Arg Tyr Hu	Ala Asn	Lys	Asp	Ala	Val Glu	Lys	Glu
545		550			005				560
Lys	Tyr	Arg His Pro Lys Tyr	Gly Phu	Lys	Trp	Asp	Ile Pro	Luu	Trp
		565		570				575

178 330

Tyr

Gin Glu

Gy Asp 580

Lys

Lys

Glu

Ile 585

Ss s

Are

T1r

Trr

Lye 559

Asa

Asg

Asp

Glu

U pr

Leu

Tvr

Ge u

His

url

Sei

Asp

Ala

eiy

Ala

Puo

Phe

SIaP

595

660

605

Val

Asn

A1a

Asp

Arg

Tyr

GGy

Phe

Tyr

Arg

Gin

Ass

His

Asp

ASu

Asn

610

611

660

Gly

Trp

Lys

Lys

Ile

Ile

Lls

GGn

Leu

Lys

AAs

Asn

His

GGu

Gal

Trs

625

630

663

660

Ser

Pro

AAg

Thr

Arg

Asn

ASa

Ile

Ile

Ser

AAs

AAa

PPr

ASa

ASa

ASa

645

660

665

Ala

Thr

A sp

Ala

IIA

Alu

Gyr

GGu

T1r

Val

Phr

Glu

Llu

Leu

Asn

Trs

660

666

670

Ala

G1g

Lys

Glu

Thr

GGu

ryr

Ilu

Pro

Leu

Glu

He

Ala

Met:

Ser

GGy

675

680

655

Ile

Ser

Ser

Ile

Leu

Lys

Tyr

Phe

Gly

Thr

Glu

Pito

Glu

a1a

Lys

Ppo

690

695

700

Ala

Gin

THr

Tyr

Mer

Mec

Asn

Ile

Leu

Lys

Pito

Mec

Trs

GGu

Lys

Ssh

705

710

715

720

Ser

Ile

Asp

hhe

ih e

a1a

Asn

Asn

Tyr

Arg

Asn

Asp

Lys

Llu

Phr

Phr

725

770

735

Gin

Ile

Gsn

Leu

Gin

Lys

Asp

Va1

Ili!

Asp

Mec

Phe

Cys

a1a

Leu

GGy

740

775

750

Ser

G1 n

ns p

Ss s

Arg

Lys

Lys

Tyr

Lys

Lys

Lu u

Phe

Asp

Asp

Glu

Val

755

760

765

178 330

Mit

Asn Lls Cys 770

Arg Asp Gly 775

G1u Ala Ala Thr Glu Cys Val Arg Ile 780

Ala

Ala

Pro

Leu

Arg

Ser

Ser

Val

Tyr

Cys

Tyr

Gly

Val

Lys

Llu

Gly

785

790

795

800

Gly

Asp

Tyr

Ala

Ser

Asp

Lls

Val

Mr r

LL·

Lu a

Lyr

Thr

Ala

Llu

Thr

805

810

811

Leu

Ala

Leu

Leu

Lyi

A sp

LSs

Len

p tg

Phe

Al a

Leu

Gin

Cli

Lie

Sus

820

822

880

Asp

Val

Thr

Tla

Len

Lys

Leu

LeL

Leu

Lee

Arg

Ala

Lun

Anp

Aru

A^a

835

880

884

Ser

Ser

PPh

Val

Arg

Mer

Gln

Ans

Ole

Pito

Ser

AAa

Phe

Asn

Asp

Val

850

885

880

Ale

Ala

Asn

P Pr

Ile

Gly

Gly

Glu

Phe

He

PPh

Ann

Phe

Llu

Ile

Glu

865

870

887

888

Arg

Trp

Pro

Ans

He

Ile

Glu

Sei·

lle

Gly

TTh

Lys

His

TTi

Tts

Val

885

880

889

Llu

Lls

Val

aie

Pro

A la

Pys

Th n

i er

CSs

I1t

Ary

Seo

U Air

Sir

GUl

900

90 5

990

lir

As;

Gin

Geu

LyL

u sn

Leu

Gin

nys

Aru

l 1_l

Met

Asn

Ale

Arg

Gln

915

920

995

Phe

Gly

AAa

Phe

Asr

Lys

AAa

Ile

Glu

Arg

AL·

Gln

Asn

Arg

Val

Asp

930

9235

990

Trp

lle

Lys

Lls

His

Phe

Glu

Lys

Leu

Ala

AAa

Phe

Phr

Lls;

Lls

Ala

945

950

995

9(S6)

Thr Leu

178 330

Figura 1

GCTGAATCTA ACTCCAATCC GTCTTATTGT CGCATTATTT CTAGTAGCTG CTGCAGTCGG CCTCTCTATT GGTCTCACCT ATTACTTTAC TCGCAAAGCG TTCGATACCT CAGAAAAGCC AGGGAAGGAT GATACTGGTG GCAAGGACAA AGACAATTCT CCCTCTGCGG CGGAACTACT CCTTCCAAGT AATATAAAAC CATTGTCTTA CGACTTGACG ATCAAAACAT ATCTACCTGG TTATGTGGAC TTCCCACCGG AGAAAAACCT CACATTCGAT GGGCGTGTGG AAATATCAAT GGTTGTAATT GAGCCAACAA AGAGTATCGT ACTCAATTCA AAGAAGATCT CTGTAATACC CCAAGAATGT GAACTGGTAT CGGGCGATAA AAAACTCGAA ATTGAAAGTG TAAAGGAGCA CCCAAGACTG GAAAAGGTTG AGTTTCTTAT CAAAAGCCAA CTGGAAAAAG ATCAACAAAT CTTGCTCAAG GTCGGCTACA TCGGTCTCAT CAGCAACAGC TTTGGTGGAA TCTACCAGAC CACTTATACC ACCCCGGATG GCACCCCTAA GATCGCTGCA GTTTCACAAA ATGAGCCCAT AGATGCTCGT CGAATGGTAC CATGCATGGA TGAACCGAAA TACAAAGCAA ACTGGACCGT TACTGTCATT CATCCAAAAG GCACCAAAGC CGTCTCGAAT GGAATCGAAG TGAACGGAGA TGGAGAGATC AGTGGTGATT GGATCACATC GAAGTTCTTG ACTACTCCAC GGATGTCATC CTACTTGTTG GCAGTTATGG TTTCAGAATT TGAATACATC GAAGGTGAAA CAAAGACGGG TGTTCGGTTC CGTATATGGT CACGCCCAGA GGCAAAGAAG ATGACACAAT ATGCTCTGCA ATCTGGTATC AAGTGCATAG AATTCTACGA AGATTTCTTT GATATCAGAT TCCCTCTGAA GAAACAAGAT ATGATTGCCC TTCCTGATTT CTCTGCCGGT GCCATGGAGA ATTGGGGCCT CATCACTTAC AGGGAAAACT CTTTGTTGTA CGATGACAGA TTCTATGCAC CGATGAATAA ACAGCGAATT GCTCGCATTG TTGCTCATGA GCTTGCTCAT CAGTGGTTCG GCGACTTGGT TACGATGAAG TGGTGGGATA ATTTGTGGTT GAATGAAGGT TTTGCAAGAT TCACAGAATT TATTGGAGCT GGTCAGATAA CTCAAGATGA CGCCAGAATG AGGAACTACT TCCTGATTGA TGTACTTGAA CGCGCTTTGA AAGCTGATTC GGTAGCGTCA AGCCATCCAC TTTCCTTCAG AATCGACAAA GCTGCAGAAG TTGAAGAAGC CTTTGATGAT ATCACATACG CCAAAGGAGC TTCTGTTCTT ACTATGCTGA GAGCCTTGAT TGGAGAAGAA AAACATAAGC ATGCAGTATC GCAGTACCTC AAGAAGTTCT CGTATAGCAA TGCAGAAGCG ACTGATCTAT GGGCAGTTTT TGATGAAGTT GTCACTGACG TCGAAGGTCC AGACGGCAAA CCTATGAAAA CCACAGAGTT TGCAAGTCAG TGGACGACTC AGATGGGCTT CCCAGTTATT TCCGTAGCAG AGTTTAACTC GACTACTTTG AAATTAACGC AAAGTCGATA TGAGGCGAAT AAAGACGCTG TGGAGAAAGA GAAGTACCGT CACCCGAAAT ACGGATTTAA ATGGGATATT CCACTGTGGT ATCAGGAAGG CGATAAGAAG

178 330

GAGATAAAGC

TACTCATCCT

ATCGACAAAA

AAGGATAATC

CGATGCGTTT

TTGAACTTCT

ATCGCAATGT

AGAGGCAAAG

ATGAAAAAAG

CTGTTTTTCC

CCTCGGATCG

AAGTCATGAA

ATCGCCGCTC

CGGTCATTAT

TGCGCCATAA

GGTGAAGGAT

GGAGCGGACA

AACCCATCGG

GAATAAAATG

AACCACCCGA

AAGA.ACTGCA

TAAAGCCAATCG

CCCAAAAATA

ATTGCCAGTA

TGACTGTCTG aaatttttatc

TAATAGTAAAC

TTCATCAAAT

ATTTGTTCAT

TAGCTTCTTG

TAGATTAGTT

AAA

GAACAAGGTG

GGCGCTCCCG

TCATAACCCA

ATAAAGTTTA

ACTGCAACTA

AAATAAAGCC

CCGGGATCTC

CCAGCTCAAA

CACTATCAAC

AAATCAACCT

CAAGACTGCA

CAAATCCAGC

CTCTCCCATC

GCTTCCGACA

AAAAAGACTG

TGAAAAGAAC

AAGGAAGAAG

CCGAAGAAGG

AAAAAATAGG

AACTCAGGGA

GCAAAAATGGC

JAkCGAGGCCA

GCCGGCGTCT

ATCCAGATCT

TTGGTCACTG

GATATATTTG

AAAGCTCAGT

TGTTATCTTC

ATTCGCGTTGT

TTTGTTTTTT atcttataaa

GAGAAGAGAA

AACACCACAA

AAGGGATGGA

CACACCCCGC

CAACAGACGC

CAAAAAGAAA

GTCGATTTTG

CATACATGAT

TTCATTGCCA

CCAAAAAGAT

GGAAGCAAATA

GAGGGTCAAG

AACTCCTTAT

AGGTGATGGA

CAGACACATA

TCCCTTGCGG

TCCCCAAAGC

AAGGGGCAAG

JAACCAACAC

TCCCCCCACA

ATGCAACGTC

TAAATAGGGTG

TCCAAGJAAAGC

TTAAAGGTCAT

TTCCAACTGCAA

CCTTTCCGTGA

ATTGCCAACCA

CCTATACTCT

AGTCTGTTCC

TGGGATTGTA

AATGCATGCT

GAACCGCTTG

CGCAGACCGC

AAAAAATAAA

ACAAAAAATG

AATTGAGTAT

CGGAATATCT

AAATACTACA

AAACATAAAG

ATAACTACAG

GTCATTGATA

TAAAAAACTT

CAGCAACCCA

TCATAAGGAG gctataaacc

CAATGGGATG

GGCCTGGACC

ITTCCAATGAA

TCCCTATTGA

ACATACGTTG

ACAGCAGAAT

GTCCAATTCGG

GATTGGATTA

CACCTTGTTAA

GCAAGGGATAT

TGGAAGTTTGT

GGGGACATTG

GTGCAACCAATA

CTTCCTAACT

TCAGAACACT

TGGATCGTTT

AAAAAAAAAA ciąg dalszy figury 1

ACTTGCATGG

TATGGATGTG

CAAGCAGCTC

CCATCATTAG

GAGACTGTAT

ACCATTAGAA

GTACCGAGCC

AAACCAAGGG

AAATAACAAG

TGTTCTGCGC

TTCGATGACG atgcataaGa

TGAAAGAAGG

GCCGAAACAC

TGAAGAAAAA

GGAAAAGCGG

GGTAGAAGCA

AAAATGGGCA

AAGAAAGGAA

GGACAGCCGA

TGGAATCGAA

CAAAACCATG

TTCGCAATTAC

GACAGGGCAAC

TACCTACCAAA

TTGTCACTTG

TTACTTTCGC

GCAATTCGGCAA

TTCTCCTCAA

TACAAATGTA

AAAAAAAAAA

178 ’Ί

Figura 2

LNLNPIRLIL

DNDNSAAELL

WIEPPK^l^S^ kskioldkdi

DTDLHHZPCMD KFLEP’PIRISS SGIKCIEFYE DDRFYAPMNK ICGGOIOODD FDDITTGLKA DE\EHDE(3G ETFIKDAVEKE SDAGAPAPWI DAFAFAAATDA EAKK.^ADTMH LGSDDCIKKY GGYASDKKEE FVEIQDIPSA PACTSGIRIS QD^L^^1VVKK

ALWLEAATC

LPRSNKYRPS

LLNKKISWP

LPPKEYIGGV

EPP^K^NN^H

YGWIEMSEF

DKVVKRIPLK

QDIALIVALE

AIYRNYFLID

SSLPILPQLV

DKEYRKKIIE

KYRHEP^Y^G^

ALKYGGVRQD

IEYETVFELL

NILKPMYRKY

YYWKKFWIN

LPRIAFIL\LE

FNDPaLANPG

QDI1P3 LKN NLD

TL*

Ι^υΟΙΡΥΥΓΤ

DPPIKTYLPG

QDFELVEGDK

SNSFGGGYQT

TVIEPKGT!YA

EYIEGETKTG

KYDPIALPDF

IVAHQWIVEDV t/LEHLUDD

GEEIKiKYELE asdhhmgf

WIPPLIYpEG

KOPANGI^!

NYAEIKErEYL

SIKFILNNRR

KCRDGQDATE

KDFLRLALGC

GEFIFNFLIF

KNGMNARQFG

RHAIEDTEKK

YGEDEPEHN

KKLFESIKEH

Τ^ΤΡ^^Κ

VENGGEVNGD

MYRIWSRPE

SAGAMEWIG

TMIKA7IKNPA

VAASHPLSFR

QDLKKYEYRN

PVESEAEFNS

DIKUKRTWL

KKDKDNNEVE

PLEILMSGGS

NDKLFFQINL

CCEHIAAPLRS

HKDVTALKGL

RWIRPIESIG

AFDiKLIFHID

GEYPDIEGYP

TIEPGYEESM

PRYPFYEFVL

IIALESDNFP

GEESGDDITT

AAKKlTIDGIP

ITYRENNLLY

NNEGELHETF

IDULLF/EEA

AEATDLWALE

ΊT]P<LTQDRY

IQDKPLYGPHI

SPRYTHNIIS

SILKYFGTEP ęi^E^D^ai^l^I^E^A

SVY<CY<^A^^(^

LVLQIPPQNS

THEYGEIWa

NRYDWIKIUF

Depćutnnent Wydawnictw UP RP. Nćk^ład 70 egz. Cena 4,00 zł.

Claims (5)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania antygenu H110D, który jest aminopeptydazą, lub jego fragmentu o podobnej aktywności enzymatycznej i/lub antygenowej, w którym komórki gospodarza transfekuje się wektorem zaadaptowanym do ekspresji tego antygenu enzymatycznego lub jego fragmentu i hoduje się transfekowane komórki, w których wprowadzony DNA ulega ekspresji, znamienny tym, że jako komórki gospodarza, które poddaje się transfekcji, stosuje się ssacze komórki, które przed transformacją są zasadniczo wolne od enzymów endogennych wykazujących (a) tę samą funkcję i (b) to samo powiązanie lub brak powiązania z błoną komórkową, jak enzymatyczny antygen H110D lub jego fragment.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że transfekcji poddaje się komórki gospodarza, które nie mają znaczącej aktywności aminopeptydazy typu A lub typu M.
3. 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że jako komórki gospodarza stosuje się komórki COS-1 albo CHO.
4. 4. Sposób według zastrz. 1 albo 2 albo 3, znamienny tym, że w celu otrzymania antygenu H110D lub jego fragmentu związanego z błoną komórkową, komórki gospodarza transformuje się wektorem zawierającym niezmodyfikowany gen antygenu H110D lub jego fragmentu.
5. 5. Sposób według zastrz. 1 albo 2 albo 3, znamienny tym, że w celu otrzymania aminopeptydazy - antygenu H110D lub jego fragmentu w postaci rozpuszczalnego enzymu cytoplazmatycznego, komórki gospodarza transformuje się wektorem zawierającym gen antygenu H110D lub jego fragmentu, pozbawiony sekwencji kodującej region wiążący z błoną komórkową.